KR20190003985A

KR20190003985A - 구형 핵산 tlr9 효능제

Info

Publication number: KR20190003985A
Application number: KR1020187034951A
Authority: KR
Inventors: 바트 앤더슨; 수바라오 날라가틀라; 리차드 강; 에캄바 칸디말라
Original assignee: 엑시큐어, 인크.
Priority date: 2016-05-06
Filing date: 2017-05-05
Publication date: 2019-01-10
Also published as: US20200255837A9; EP3452599A1; JP2019521652A; WO2017193081A1; US20190225968A1; CN109312348A; AU2017261354A1; EP3452599A4; US20220064649A1; CA3023445A1

Abstract

본 발명의 측면은 리포좀 또는 리포플렉스의 외부에 위치한 CpG 올리고뉴클레오티드을 가진 올리고뉴클레오티드 쉘을 갖는 리포좀 또는 리포플렉스 복합체로 구성된 구형 핵산 (SNA)의 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 조성물을 이용하여 대상체를 치료하고 대상체에서 사이토킨 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.

Description

구형 핵산 TLR9 효능제

관련 출원

본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2016년 5월 6일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/333,074를 우선권으로 주장하며, 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.

Toll-유사 수용체 (TLR) 9는 DNA에서 메틸화되지 않은 CG 모티프 (CpG)를 인식하여 Th1-유형 면역 반응을 자극하는 엔도솜 수용체이다. 이전에 확인된 합성 올리고뉴클레오티드 TLR9 효능제는 선형 또는 분지형 올리고뉴클레오티드이다. 선형 올리고뉴클레오티드 TLR9 효능제는 서열 특징 및 생물학적 효과의 조합을 기준으로 하여 3가지 주요 부류로 나뉘어진다. A-부류 CpG 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스테르 (PO) 백본을 갖는 중심의 자체-상보적인 영역 및 포스포로티오에이트 (PS) 연결을 갖는 5' 및 3' 말단 반복부 ≥3 G를 갖고, 높은 수준의 IFNα 생성을 자극하지만, 낮은 NF-κB 활성화를 나타낸다. B-부류 CpG 올리고뉴클레오티드는 PS 백본 및 최소의 자체 상보성을 갖고, IFNα를 낮은 수준으로 자극하지만, 높은 NF-κB 활성화를 나타낸다. C-부류 CpG 올리고뉴클레오티드는 PS 백본 및 높은 자체 상보성을 갖고, IFNα 및 NF-κB를 중간 수준으로 유도한다. 선형 올리고뉴클레오티드 TLR9 효능제는 TLR9 활성화를 위해 서열 모티프 및 길이에서 엄격한 요건을 가지며, 전형적으로 인간 TLR9의 최적 활성화를 위해 24개 뉴클레오티드 길이 및 B 및 C 부류 올리고뉴클레오티드의 경우에는 5' TCG를 필요로 한다.

일부 측면에서, 본 발명은 리포좀 또는 리포플렉스의 외부에 위치한 B-부류 CpG 올리고뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 쉘을 갖는 리포좀 또는 리포플렉스 복합체를 포함하는 구형 핵산 (SNA)이고, B-부류 CpG 올리고뉴클레오티드는 4-16개 뉴클레오티드 길이이고/거나 5'TCG 모티프를 갖지 않는다.

한 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 8-14개 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 5'TCG 모티프를 갖지 않는다.

일부 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 앵커 기를 통해 리포좀 또는 리포플렉스에 부착된다. 한 실시양태에서, 앵커 기는 지질 앵커 기이다. 또 다른 실시양태에서, 앵커 기는 콜레스테롤이다. 또 다른 실시양태에서, 앵커 기는 알파-토코페롤, 베타-토코페롤, 감마-토코페롤 또는 델타-토코페롤일 수 있는 토코페롤이다. 또 다른 실시양태에서, 앵커 기는 스테롤, 팔미토일, 디팔미토일, 스테아릴, 디스테아릴, C16 알킬 쇄, 담즙산, 콜산, 타우로콜산, 데옥시콜레이트, 올레일 리토콜산, 올레오일 콜렌산, 당지질, 인지질, 스핑고지질, 이소프레노이드, 예컨대 스테로이드, 비타민, 예컨대 비타민 E, 포화 지방산, 불포화 지방산, 지방산 에스테르, 예컨대 트리글리세리드, 피렌, 포르피린, 텍사피린, 아다만탄, 아크리딘, 비오틴, 코우마린, 플루오레세인, 로다민, 텍사스-레드, 디곡시게닌, 디메톡시트리틸, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 시아닌 염료 (예를 들어, Cy3 또는 Cy5), 획스트(Hoechst) 33258 염료, 프소랄렌, 및 이부프로펜 또는 다른 친유성 모이어티로부터 선택될 수 있다.

다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 쉘의 올리고뉴클레오티드는 방사상으로 바깥쪽으로 배향된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 쉘은 SNA당 5-1,000개 올리고뉴클레오티드의 밀도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 쉘은 SNA당 100-1,000개 올리고뉴클레오티드의 밀도를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 쉘은 SNA당 500-1,000개 올리고뉴클레오티드의 밀도를 갖는다.

일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 뉴클레오시드간 포스포로티오에이트 연결을 갖는다. 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오시드간 포스포로티오에이트 연결을 갖지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 모두 뉴클레오시드간 포스포로티오에이트 연결을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 입체적으로 풍부화된 적어도 1개의 뉴클레오시드간 포스포로티오에이트 연결을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 모두 입체적으로 풍부화된 뉴클레오시드간 포스포로티오에이트 연결을 갖는다. 입체적으로 풍부화된 포스포로티오에이트 연결은 Rp 부분입체이성질체 또는 Sp 부분입체이성질체일 수 있다.

일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 10 내지 12개 뉴클레오티드 길이를 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 적어도 25%는 SNA의 외부 표면에 노출된 5'-말단을 갖는다. 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 쉘의 모든 올리고뉴클레오티드는 SNA의 외부 표면에 노출된 5' 말단을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 쉘의 올리고뉴클레오티드의 적어도 25%는 SNA의 외부 표면에 노출된 3'-말단을 갖는다.

다른 측면에서, 본 발명은 리포좀 또는 리포플렉스의 외부에 위치한 CpG 올리고뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 쉘을 갖는 리포좀 또는 리포플렉스 복합체로 구성된 구형 핵산 (SNA)을 포함하는 조성물이고, 여기서 조성물은 몰 당량의 동일한 서열을 갖는 선형 CpG 올리고뉴클레오티드보다 유의하게 더 많은 사이토킨 생성을 자극한다.

다른 측면에서, 본 발명은 리포좀 또는 리포플렉스의 외부에 위치한 비전형적인 CpG 올리고뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 쉘을 갖는 리포좀 또는 리포플렉스 복합체로 구성된 구형 핵산 (SNA)을 포함하는 조성물이다.

일부 실시양태에서, 사이토킨은 IL 6이다. 또 다른 실시양태에서, 사이토킨은 IL-12이다. 또 다른 실시양태에서, 사이토킨은 인터페론 알파 (IFN-α), 인터페론 감마 (IFN-γ), 인터류킨 8 (IL 8), IL 18, 종양 괴사 인자 (TNF), 및 Th1-유형 또는 Th2-유형 면역 반응의 일부로서 발현되는 것으로 공지된 다른 사이토킨 중 하나 이상일 수 있다.

한 실시양태에서, 사이토킨은 시험관내에서 생성된다. 또 다른 실시양태에서, 사이토킨은 생체내에서 생성된다.

일부 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 B-부류 CpG 올리고뉴클레오티드이다. 또 다른 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 C-부류 CpG 올리고뉴클레오티드이다. 다른 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 A-부류 CpG 올리고뉴클레오티드이다. 추가의 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 A-부류 CpG 올리고뉴클레오티드, B-부류 CpG 올리고뉴클레오티드 및 C-부류 CpG 올리고뉴클레오티드의 혼합물이다.

한 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 4-16개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 5'TCG 모티프를 갖지 않는다.

또 다른 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 방사상으로 바깥쪽으로 배향된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 쉘은 SNA당 5-1,000개 올리고뉴클레오티드의 밀도를 갖는다. 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 쉘은 SNA당 100-1,000개 올리고뉴클레오티드의 밀도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 쉘은 SNA당 500-1,000개 올리고뉴클레오티드의 밀도를 갖는다.

일부 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 뉴클레오시드간 포스포로티오에이트 연결을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오시드간 포스포로티오에이트 연결을 갖지 않는다. 다른 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 모두 뉴클레오시드간 포스포로티오에이트 연결을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 10 내지 16개 뉴클레오티드 길이를 갖는다.

추가의 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드의 적어도 25%는 SNA의 외부 표면에 노출된 5'-말단을 갖는다. 일부 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드의 적어도 25%는 SNA의 외부 표면에 노출된 3'-말단을 갖는다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 리포좀 또는 리포플렉스의 외부에 위치한 A-부류 CpG 올리고뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 쉘을 갖는 리포좀 또는 리포플렉스 복합체로 구성된 구형 핵산 (SNA)을 포함하는 조성물을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 리포좀 또는 리포플렉스의 외부에 위치한 CpG 올리고뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 쉘을 갖는 리포좀 또는 리포플렉스 복합체의 구형 핵산 (SNA)을 포함하는 조성물을 IL-6 또는 IL-12 발현의 유도를 위한 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 사이토킨 발현을 유도하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, SNA는 상기 기재된 SNA 또는 조성물이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 리포좀 또는 리포플렉스의 외부에 위치한 CpG 올리고뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 쉘을 갖는 리포좀 또는 리포플렉스 복합체의 구형 핵산 (SNA)을 포함하는 조성물을 대상체의 치료를 위한 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, SNA는 상기 기재된 SNA 또는 조성물이다. 한 실시양태에서, 대상체는 암을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 감염성 질환을 갖는다. 다른 실시양태에서, 대상체는 알러지성 장애 또는 염증성 장애를 갖는다.

본 발명의 각각의 제한은 본 발명의 다양한 실시양태를 포괄할 수 있다. 따라서, 임의의 하나의 요소 또는 요소들의 조합을 포함하는 본 발명의 각각의 제한이 본 발명의 각각의 측면에 포함될 수 있는 것으로 예상된다. 본 발명은 그의 적용에 있어서 하기 설명에서 기재되거나 도면에 도시된 구성요소의 구성 및 배열의 세부사항으로 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태일 수 있고, 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다.

첨부된 도면은 일정한 비율로 그려진 것으로 의도되지 않는다. 도면에서, 다양한 수치로 도시된 각각의 동일하거나 거의 동일한 구성요소는 유사한 번호로 표시된다. 명확함을 위해, 모든 도면에서 모든 구성요소를 표지하지 않을 수 있다. 도면에서:
도 1은 인간 말초 혈액 단핵구성 세포 (PMBC)에서 올리고뉴클레오티드 흡수를 도시하는 2가지 그래프를 포함한다. 상단의 그래프는 올리고뉴클레오티드를 흡수한 hPBMC의 백분율을 도시하고, 하단의 그래프는 hPBMC에서 세포당 올리고뉴클레오티드 흡수를 도시한다.
도 2는 마우스에게 CpG 올리고뉴클레오티드를 피하 주사한 후에 생체내 사이토킨 반응을 도시하는 2가지 그래프를 포함한다. IL-12p70 수준은 상단의 그래프에서 도시되고, IL-6 수준은 하단의 그래프에서 도시된다.

CpG 올리고뉴클레오티드가 면역자극성인 것으로 확인되었지만, 생체내에서 치료적 이익을 갖는 특정한 올리고뉴클레오티드는 바람직한 길이 및 특정한 구조를 갖는 비교적 좁은 범위의 올리고뉴클레오티드로 제한된다. 낮은 시험관내 활성을 갖는 CpG 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 생체내에서 치료적으로 의미있는 면역 반응을 생성하는데 충분한 활성을 갖지 않는다. 이들 준최적의 CpG 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 24개 미만의 뉴클레오티드 길이를 갖고, 중요한 모티프, 예컨대 5'TCG를 포함하지 않는다. 본 발명에 따라, 준최적의 CpG 올리고뉴클레오티드가 구형 핵산 (SNA)으로 제형화될 때 생체내에서 치료적 면역 반응을 생성할 수 있는 것으로 발견되었다.

구형 핵산 (SNA)은 빽빽히 밀집되고 방사상으로 배향된 핵산으로 이루어진다. 이러한 구조는 스캐빈져 수용체를 통해 매개되는 SNA의 세포 흡수를 가능하게 하는 독특한 성질을 제공한다. SNA의 세포 흡수는 빠르고 효율적이며, 엔도솜 축적을 유도한다. SNA로 제형화된 CpG 올리고뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 단독에 비해 더 많은 SNA-올리고뉴클레오티드를 세포에 흡수시킴으로써 보다 양호한 세포 흡수를 갖는 것으로 발견되었다.

본 발명의 SNA는 CpG 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 CpG 올리고뉴클레오티드는 준최적의 또는 비전형적인 CpG 올리고뉴클레오티드이다. "비전형적인" CpG 올리고뉴클레오티드는, 시험관내에서는 면역자극성이지만, 생체내에서는 치료적 이익을 갖기에 충분한 면역 반응을 생성하지 않는, 메틸화되지 않은 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 비전형적인 CpG 올리고뉴클레오티드는 24개 미만의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 다른 실시양태에서, 비전형적인 CpG 올리고뉴클레오티드는 전형적인 A-부류, B-부류 또는 C-부류 CpG 올리고뉴클레오티드로부터 하나 이상의 결실 구조적 특징을 갖는다.

일부 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 24개 뉴클레오티드 길이를 갖는 공지된 치료적 올리고뉴클레오티드에 비해 짧다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 4 내지 20개 범위의 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 6 내지 16개 범위, 일부 실시양태에서 8 내지 12개, 8 내지 10개, 10 내지 12개, 6 내지 12개, 4 내지 14개, 또는 6 내지 10개 뉴클레오티드 크기를 갖는다.

CpG 올리고뉴클레오티드에는 예를 들어 A-부류, B-부류 및 C-부류 면역자극성 CpG 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역자극성 CpG 핵산" 또는 "면역자극성 CpG 올리고뉴클레오티드"는 면역 세포를 활성화시킬 수 있는 임의의 CpG-함유 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 적어도 CpG 디뉴클레오티드의 C는 전형적으로 메틸화되지 않는다. 면역자극성 CpG 올리고뉴클레오티드는 수많은 허여된 특허 및 공개된 특허 출원, 예컨대 미국 특허 번호 6,194,388; 6,207,646; 6,218,371; 6,239,116; 6,339,068; 6,406,705; 및 6,429,199에 기재되어 있으며, 이들은 본원에 참고로 포함된다.

일부 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 변형된 백본, 예컨대 포스포로티오에이트 (PS) 백본을 갖는다. 다른 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스테르 (PO) 백본을 갖는다. 여전히 다른 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 혼합된 PO 및 PS 백본을 갖는다.

CpG 올리고뉴클레오티드는 A-부류 올리고뉴클레오티드, B-부류 올리고뉴클레오티드, 또는 C-부류 올리고뉴클레오티드일 수 있다. "A-부류" CpG 면역자극성 핵산은 공개된 PCT 출원 WO 01/22990에 기재되어 있다. 이들 핵산은 높은 수준의 인터페론-알파를 유도하는 능력이 있는 반면에, B 세포 활성화에 대해서는 최소의 효과를 갖는 것을 특징으로 한다. A 부류 CpG 면역자극성 핵산은 Yamamoto 및 동료들에 의해 기재된 바와 같이 육량체 회문 GACGTC, AGCGCT, 또는 AACGTT를 함유할 수 있다. Yamamoto S et al. J Immunol 148:4072-6 (1992). 전형적인 A-부류 올리고뉴클레오티드는 폴리-G 풍부 5' 및 3' 말단 및 회문 중심 영역을 갖는다. 전형적으로, 5' 및 3' 말단에 있는 뉴클레오티드는 안정화된 뉴클레오티드간 연결을 갖고, 중심 회문 영역은 포스포디에스테르 연결을 갖는다 (키메라). 비전형적인 A-부류 올리고뉴클레오티드에는 폴리 G 말단 및 회문 중심 중 하나 이상이 결여되어 있을 수 있다. 대안적으로, 비전형적인 A-부류 올리고뉴클레오티드는 모두 포스포로티오에이트 또는 모두 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연결을 가질 수 있다.

B 부류 CpG 면역자극성 핵산은 인간 B 세포를 강력하게 활성화시키지만, 추가의 변형없이 인터페론-α를 유도하는 최소의 효과를 갖는다. 전통적으로, B-부류 올리고뉴클레오티드는 서열 5' TCN₁TX₁X₂CGX₃X₄ 3' (서열식별번호(SEQ ID NO): 77)를 포함하며, 여기서 X₁은 G 또는 A이고, X₂는 T, G 또는 A이고, X₃은 T 또는 C이고, X₄는 T 또는 C이고, N은 임의의 뉴클레오티드이고, N₁ 및 N₂는 각각 약 0-25개 N의 핵산 서열이다. 전형적으로 완전히 포스포로티에이트화되고 특정한 바람직한 염기 서열 내에서 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 B-부류 CpG 올리고뉴클레오티드는 B 세포 및 형질세포양 수지상 세포 (pDC)를 활성화시키는 데에는 강력하지만, IFN-α 및 NK 세포 활성화를 유도하는 데에는 비교적 약하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; 및 6,339,068 참고.

한 실시양태에서, 비전형적인 B 부류 CpG 올리고뉴클레오티드는 적어도 하기 화학식으로 표현된다:

5' X₁X₂CGX₃X₄ 3'

여기서, X₁, X₂, X₃ 및 X₄는 뉴클레오티드이다. 한 실시양태에서, X₂는 아데닌, 구아닌 또는 티민이다. 또 다른 실시양태에서, X₃은 시토신, 아데닌 또는 티민이다. 일부 실시양태에서, 비전형적인 B 부류 CpG 올리고뉴클레오티드에는 5'TCG가 결여되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하기 화학식으로 표현되는 단리된 B 부류 CpG 올리고뉴클레오티드를 제공한다:

5' N₁X₁X₂CGX₃X₄N₂ 3' (서열식별번호: 78)

여기서, X₁, X₂, X₃ 및 X₄는 뉴클레오티드이고, N은 임의의 뉴클레오티드이고, N₁ 및 N₂는 각각 약 0-25개 N으로 구성된 핵산 서열이다. 한 실시양태에서, X₁X₂는 GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT 및 TpG로 이루어진 군으로부터 선택된 디뉴클레오티드이고, X₃X₄는 TpT, ApT, TpG, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA 및 CpA로 이루어진 군으로부터 선택된 디뉴클레오티드이다. 바람직하게는, X₁X₂는 GpA 또는 GpT이고, X₃X₄는 TpT이다. 다른 실시양태에서, X₁ 또는 X₂ 또는 이들 둘 다는 퓨린이고, X₃ 또는 X₄ 또는 이들 둘 다는 피리미딘이거나, 또는 X₁X₂는 GpA이고, X₃ 또는 X₄ 또는 이들 둘 다는 피리미딘이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, X₁X₂는 TpA, ApA, ApC, ApG 및 GpG로 이루어진 군으로부터 선택된 디뉴클레오티드이다. 여전히 또 다른 실시양태에서, X₃X₄는 TpT, TpA, TpG, ApA, ApG, GpA 및 CpA로 이루어진 군으로부터 선택된 디뉴클레오티드이다. 또 다른 실시양태에서, X₁X₂는 TpT, TpG, ApT, GpC, CpC, CpT, TpC, GpT 및 CpG로 이루어진 군으로부터 선택된 디뉴클레오티드이고, X₃은 A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드이고, X₄는 뉴클레오티드이며, X₁X₂가 TpC, GpT 또는 CpG인 경우에는, X₃X₄는 TpC, ApT 또는 ApC가 아니다. 일부 실시양태에서, 비전형적인 B 부류 CpG 올리고뉴클레오티드에는 5'TCG가 결여되어 있다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 서열 5' TCN₁TX₁X₂CGX₃X₄ 3' (서열식별번호: 77)를 갖고, 24개 미만의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 본 발명의 일부 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 GpT, GpG, GpA 및 ApA로 이루어진 군으로부터 선택된 X₁X₂를 포함하고, X₃X₄는 TpT, CpT 및 TpC로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, B-부류 CpG 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상은 2-20, 5-20, 10-20, 15-20, 2-20, 5-30, 10-30, 15-30, 20-30, 25-30, 2-40, 5-40, 10-40, 15-40, 20-40, 25-40, 30-40, 35-40, 2-50, 5-50, 10-50, 15-50, 20-50, 25-50, 30-50, 35-50, 2-100, 5-100, 10-100, 15-100, 20-100, 25-100, 30-100, 35-100개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, B-부류 CpG 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상은 4-16개 뉴클레오티드 길이이다.

C 부류 면역자극성 핵산은 적어도 2개의 별개의 모티프를 함유하고, 면역계의 세포에 대해 독특하고 바람직한 자극 효과를 갖는다. 이들 ODN 중 일부는 전형적인 "자극성" CpG 서열 및 "GC-풍부" 또는 "B-세포 중화" 모티프를 둘 다 갖는다. 이들 조합 모티프 핵산은 B 세포 활성화 및 수지상 세포 (DC) 활성화의 강력한 유도인자인 전형적인 "부류 B" CpG ODN과 관련된 효과와 IFN-α 및 천연 킬러 (NK) 세포 활성화의 강력한 유도인자이지만 B-세포 및 DC 활성화의 비교적 불량한 유도인자인 A-부류 CpG ODN과 관련된 효과 사이에 다소 속하는 면역 자극 효과를 갖는다. Krieg AM et al. (1995) Nature 374:546-9; Ballas ZK et al. (1996) J Immunol 157:1840-5; Yamamoto S et al. (1992) J Immunol 148:4072-6 참고. 바람직한 부류 B CpG ODN은 대개 포스포로티오에이트 백본을 갖고, 바람직한 부류 A CpG ODN은 혼합된 또는 키메라 백본을 갖는 반면에, C 부류의 조합 모티프 면역 자극성 핵산은 안정화된, 예를 들어 포스포로티오에이트, 키메라 또는 포스포디에스테르 백본을 가질 수 있고, 일부 바람직한 실시양태에서, 이들은 C 및 G 뉴클레오티드 사이에 반연질 백본, 예를 들어 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연결을 갖고, 다른 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결을 갖는다.

자극성 도메인 또는 모티프는 화학식: 5' X₁DCGHX₂ 3'로 정의된다. D는 C 이외의 뉴클레오티드이다. C는 시토신이다. G는 구아닌이다. H는 G 이외의 뉴클레오티드이다.

X₁ 및 X₂는 0 내지 10개 뉴클레오티드 길이의 임의의 핵산 서열이다. X₁은 CG를 포함할 수 있고, 이러한 경우 바람직하게는 상기 CG 바로 앞에 T가 있다. 일부 실시양태에서, DCG는 TCG이다. X₁은 바람직하게는 0 내지 6개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, X₂는 임의의 폴리 G 또는 폴리 A 모티프를 함유하지 않는다. 다른 실시양태에서, 면역자극성 핵산은 5' 말단에서 또는 3' 말단에서 폴리-T 서열을 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, "폴리-A" 또는 "폴리-T"는 각각 3개 이상의 연속적인 A 또는 T의 스트레치, 예를 들어 5' AAAA 3' 또는 5' TTTT 3'를 지칭할 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "폴리-G 말단"은 핵산의 5' 말단 또는 3' 말단에 존재하는 3개 이상의 연속적인 G의 스트레치, 예를 들어 5' GGG 3'를 지칭할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "폴리-G 핵산"은 화학식 5' X₁X₂GGGX₃X₄ 3'를 갖는 핵산을 지칭할 것이고, 여기서 X₁, X₂, X₃ 및 X₄는 뉴클레오티드이고, 바람직하게는 X₃ 및 X₄ 중 적어도 하나는 G이다.

상기 화학식 하에서 B 세포 자극성 도메인에 대한 일부 바람직한 설계는 TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT, TCGTCGT를 포함한다.

핵산의 제2 모티프는 P 또는 N으로 지칭되고, X₁에 대해 바로 5' 또는 X₂에 대해 바로 3'에 위치한다.

N은 CGG 트리뉴클레오티드로 시작하고 적어도 10개 뉴클레오티드 길이를 갖는 B-세포 중화 서열이다. B-세포 중화 모티프는 CG 앞에 C가 있거나 또는 뒤에 G가 있는 적어도 1개의 CpG 서열을 포함하거나 (Krieg AM et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:12631-12636) 또는 CG의 C가 메틸화된 CG 함유 DNA 서열이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "CpG"는 5' 시토신 (C) 뒤에 포스페이트 결합에 의해 연결된 3' 구아닌 (G)가 있는 것을 지칭할 것이다. 적어도, 5' CG 3'의 C는 메틸화되지 않아야 한다. 중화 모티프는 다른 비-자극성 모티프에 존재할 때에는 어느 정도의 면역자극 능력을 갖지만, 다른 면역자극성 모티프에 존재할 때에는 나머지 모티프의 면역자극성 잠재력을 감소시키는 역할을 하는 모티프이다.

P는 적어도 10개 뉴클레오티드 길이를 갖는 GC-풍부 회문 함유 서열이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "회문" 및 동등하게 "회문 서열"은 역위 반복부, 즉, ABCDEE'D'C'B'A'와 같은 서열 (여기서, A 및 A', B 및 B' 등은 일반적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍을 형성할 수 있는 염기임)을 지칭할 것이다. P는 또한 개재된 회문, 즉, ABCDENNNNE'D'C'B'A'와 같은 서열 (여기서, A 및 A', B 및 B' 등은 일반적인 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성할 수 있는 염기이고, N은 임의의 염기임)일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "GC-풍부 회문"은 적어도 2/3의 G 및 C의 염기 조성을 갖는 회문을 지칭할 것이다. 일부 실시양태에서, GC-풍부 도메인은 바람직하게는 "B 세포 자극 도메인"에 대해 3'에 있다. 따라서, 10개 염기 길이의 GC-풍부 회문의 경우, 회문은 적어도 8개의 G 및 C를 함유한다. 12개 염기 길이의 GC-풍부 회문의 경우, 회문은 또한 적어도 8개의 G 및 C를 함유한다. 14량체 GC-풍부 회문의 경우, 회문의 적어도 10개의 염기가 G 및 C이다. 일부 실시양태에서, GC-풍부 회문은 G 및 C로만 구성된다.

일부 실시양태에서, GC-풍부 회문은 적어도 81%의 G 및 C를 갖는 염기 조성을 갖는다. 따라서, 이러한 10개 염기 길이의 GC-풍부 회문의 경우, 회문은 G 및 C로만 구성된다. 이러한 12개 염기 길이의 GC-풍부 회문의 경우, 회문의 적어도 10개의 염기 (83 %)가 G 및 C인 것이 바람직하다. 일부 바람직한 실시양태에서, 12개 염기 길이의 GC-풍부 회문은 G 및 C로만 구성된다. 14량체 GC-풍부 회문의 경우, 회문의 적어도 12개의 염기 (86 %)가 G 및 C이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 14개 염기 길이의 GC-풍부 회문은 G 및 C로만 구성된다. GC-풍부 회문의 C는 메틸화되지 않거나 또는 메틸화될 수 있다.

일반적으로, 이 도메인은 적어도 3개의 C 및 G, 더욱 바람직하게는 각각 4개, 가장 바람직하게는 각각 5개 이상을 갖는다. 이 도메인에서 C 및 G의 개수가 동일할 필요는 없다. C 및 G가 자체 상보적인 듀플렉스, 또는 회문, 예컨대 CCGCGCGG를 형성할 수 있도록 배열되는 것이 바람직하다. 여기에 A 또는 T가 개재될 수 있지만, 예를 들어 모티프 CGACGTTCGTCG (서열식별번호: 79) 또는 CGGCGCCGTGCCG (서열식별번호: 80)에서와 같이 자체 상보성이 적어도 부분적으로 보존되는 것이 바람직하다. 상보성이 보존되지 않는 경우에는, 비-상보적인 염기 쌍이 TG인 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 회문의 일부가 아닌 3개 이하의, 바람직하게는 2개 이하의, 가장 바람직하게는 단지 1개의 연속적인 염기가 있다. 일부 실시양태에서, GC-풍부 회문은 적어도 1개의 CGG 삼량체, 적어도 1개의 CCG 삼량체, 또는 적어도 1개의 CGCG 사량체를 포함한다.

일부 실시양태에서, 비전형적인 C 부류 CpG 올리고뉴클레오티드에는 전형적인 C-부류 올리고뉴클레오티드의 상기 기재된 특징 중 하나 이상이 결여되어 있고, 바람직한 길이 또는 백본 변형을 갖는 뉴클레오티드 서열이 포함된다.

구형 핵산 (SNA)은 나노입자 코어, 즉, 무기 금속성 코어 둘레에 핵산이 방사상으로 조직됨으로써 형성된 널리 정의된 거대분자의 부류이다 (Mirkin CA, et. al. (1996) A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature 382(6592):607-609.). 이들 구조는 보조적인 전달 비히클 또는 형질감염 시약의 필요없이 부류 A 스캐빈져 수용체 (SR-A) 및 지질 뗏목을 맞물리게 함으로써 세포에 진입하는 능력을 나타낸다 (Rosi NL, et. al. (2006) Oligonucleotide-modified gold nanoparticles for intracellular gene regulation. Science 312: 1027-1031; Patel PC, et al. (2010) Scavenger receptors mediate cellular uptake of polyvalent oligonucleotide-functionalized gold nanoparticles. Bioconjugate chemistry 21(12):2250-2256.). 세포의 내부에 있을 때, 전형적인 SNA의 핵산 성분은 뉴클레아제 분해에 대해 저항하여, 보다 긴 세포내 수명을 유도한다. 더욱이, SNA는 그들의 다관능성 화학 구조로 인해 다가 방식으로 그들의 표적에 결합하는 능력을 갖는다 (Choi CH, et. al. (2013) Mechanism for the endocytosis of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110(19):7625-7630; Wu XA, et. al. (2014) Intracellular fate of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society 136(21):7726-7733).

SNA 지질 기반 전달 시스템으로 제형화된 CpG 올리고뉴클레오티드가 강화된 치료 성질을 갖는 것을 본원에서 발견하였다. 빽빽히 밀집된 CpG 올리고뉴클레오티드 쉘에 지질 나노입자를 도입시킨 CpG 올리고뉴클레오티드 SNA가 본 발명에 따라 개발되었다. 이들 독특한 분자는 임의의 유형의 치료 또는 진단 시약을 세포에, 특히 효과적인 방식으로 세포에 효과적으로 전달하여 강화된 치료 반응을 일으키기 위해 사용될 수 있다. 임의적인 치료제가 도입된 리포좀 또는 리포플렉스는 지질-접합된 핵산을 그의 외부 표면에 삽입함으로써 SNA로 관능화될 수 있다. 생성된 SNA는 지질 및 외부의 방사상으로 배향된 핵산을 함유할 것이다. 상기 언급된 SNA에 포장된 분자는 스캐빈져 수용체-매개된 엔도시토시스를 통해 세포에 흡수되어, 다른 SNA보다 효율적이고 신속한 엔도솜 축적 특징을 나타낼 것이다. SNA로서 리포좀/리포플렉스의 관능화는 흡수 경로를 변화시킨다. SNA로서 리포좀/리포플렉스의 관능화는 리포좀/리포플렉스의 효율, 동역학 또는 엔도솜 축적을 증가시킨다. 리포좀/리포플렉스의 표면을 SNA로 관능화시킴으로써, 세포성 전달 경로가 스캐빈져 수용체를 통하는 것으로 지시되어, 시험관내 및 생체내 엔도솜 흡수를 강화시킨다.

본 발명의 나노구조체는 전형적으로 코어로부터 방사상으로 바깥쪽으로 향하도록 CpG 올리고뉴클레오티드를 정렬시킴으로써 형성되는 올리고뉴클레오티드 쉘을 갖는 상호교환가능한 나노입자 코어로 구성된다. 일부 측면에서, 나노입자 코어는 지질 나노입자일 수 있다. 대안적으로, 나노입자 코어는 니오좀으로 구성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드가 코어로부터 5'- 또는 3'-말단이 바깥쪽으로 향하게 배열되었는지 여부에 따라, 올리고뉴클레오티드의 5'- 또는 3'-말단에 부착된 소수성 (예를 들어, 지질) 앵커 기가 바람직하게는 올리고뉴클레오티드를 지질 나노입자에 매립시키기 위해 사용된다. 앵커는 지질 나노입자로의 삽입을 유도하여 올리고뉴클레오티드를 지질에 고정시키는 역할을 한다.

니오좀은 이중층에서 배향된 비이온성 계면활성제로부터 형성된 소포이다. 니오좀은 흔히 부형제로서 첨가된 콜레스테롤을 갖지만, 다른 지질-기반 및 비-지질-기반 구성성분 또한 포함할 수 있다. 니오좀의 제조 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 니오좀을 제조하는 동안에 또는 이후에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함시킬 수 있다. 니오좀 소포는 구조적으로 및 기능적으로 리포좀과 유사하지만, 주요 구성성분으로서 지질이 아니라 비이온성 계면활성제를 기반으로 한다. 사용되는 일반적인 비이온성 계면활성제에는 소르비탄 (스팬스(spans)) 또는 폴리소르베이트 (트윈(tween))가 포함되지만, 광범위한 비이온성 계면활성제가 니오좀의 제조에 사용될 수 있다.

지질 나노입자는 리포좀 또는 리포플렉스를 생성하는 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 매우 다양한 지질로부터 구축될 수 있다. 리포좀은 내부 구획을 둘러싸는 적어도 하나의 지질 이중층 막으로 구성된 구조체이다. 리포좀은 막 유형 및 크기에 따라 특징지워질 수 있다. 소형 단일 라멜라 소포 (SUV)는 단일 막을 가지며 전형적으로 0.02 내지 0.05 pm 범위의 직경을 갖고; 대형 단일 라멜라 소포 (LUVS)는 전형적으로 0.05 pm보다 크다. 올리고 라멜라 대형 소포 및 다중 라멜라 소포는 여러개의 보통 동심원의 막 층을 가지며, 전형적으로 0.1 pm보다 크다. 동심원이 아닌 몇개의 막을 갖는 리포좀, 즉, 대형 소포 내에 함유된 보다 소형인 몇개의 소포는 다소포성 소포로 지칭된다.

본 발명의 나노구조체는 코어를 포함할 수 있다. 코어는 중공 코어일 수 있고, 쉘 물질의 중심 영역에 적어도 일부 공간을 갖는다. 중공 코어는 리포좀성 코어를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 리포좀성 코어는 지질 이중층을 형성하는 지질 또는 인지질의 성분에 의해 형성되는 중심에 위치한 코어 구획을 지칭한다. 지질 이중층은 지질 분자의 2개의 층으로 구성된다. 층에서 각각의 지질 분자는 인접한 지질 이중층과 실질적으로 평행하게 배향되고, 이중층을 형성하는 2개의 층은 수성 상에 노출된 그들 분자의 극성 말단 및 서로 인접한 비-극성 말단을 갖는다. 리포좀성 코어의 중심 수성 영역은 비어있거나 또는 수성 에멀젼, 올리고뉴클레오티드, 또는 다른 치료제 또는 진단제로 완전히 또는 부분적으로 채워져 있을 수 있다.

리포플렉스는 지질-핵산 복합체에 핵산을 특이적으로 도입시킨 유형의 지질 나노입자이다. 핵산 지질 입자로도 지칭되는 리포플렉스는 전형적으로 양이온성 지질 또는 비-양이온성 지질 및 임의적으로 스테롤 및/또는 입자의 응집을 방지하는 지질 (예를 들어, PEG-지질 접합체)을 함유한다. 일부 예에서, 리포플렉스는 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 스테롤 및 지질을 함유한다.

다양한 목적을 위해, 예컨대 지질 산화를 방지하거나 또는 지질 나노입자 표면 상에 리간드를 부착시키기 위해 다른 지질이 지질 나노입자에 포함될 수 있다. 임의의 수많은 지질, 예컨대 양친매성, 중성, 양이온성 및 음이온성 지질이 존재할 수 있다. 이러한 지질은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 지질 나노입자에 존재할 수 있는 추가의 성분에는 이중층 안정화 성분, 예컨대 폴리아미드 올리고머, 펩티드, 단백질, 세제, 지질-유도체, 예컨대 포스파티딜에탄올아민에 커플링된 PEG 및 세라미드에 접합된 PEG가 포함된다. 지질 나노입자는 또한 제2 아미노 지질 또는 양이온성 지질, 중성 지질, 스테롤, 및 형성하는 동안 지질 입자의 응집을 감소시키도록 선택된 지질 (형성하는 동안 전하-유도된 응집을 방지하는 입자의 입체적 안정화를 유도할 수 있음) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노 지질"은 1개 또는 2개의 지방산 또는 지방 알킬 쇄, 및 생리학적 pH에서 양이온성 지질을 형성하도록 양성자화될 수 있는 아미노 헤드 기 (예컨대, 알킬아미노 또는 디알킬아미노 기)를 갖는 지질을 포함하는 것을 의미한다.

지질 나노입자 또는 니오좀은 약 10 nm 내지 약 150 nm, 더욱 전형적으로 약 60 nm 내지 약 130 nm, 더욱 전형적으로 약 70 nm 내지 약 110 nm, 가장 전형적으로 약 70 nm 내지 약 90 nm의 평균 직경을 가질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 지질 나노입자 또는 니오좀의 직경은 1 nm 내지 약 250 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 240 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 230 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 220 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 210 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 200 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 190 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 180 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 170의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 160 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 150 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 140 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 130 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 120 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 110 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 100 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 90 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 80 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 70 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 60 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 50 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 40 nm의 평균 직경, 약 1 nm 내지 약 30 nm의 평균 직경, 또는 약 1 nm 내지 약 20 nm의 평균 직경, 또는 약 1 nm 내지 약 10 nm의 평균 직경이다.

올리고뉴클레오티드는 지질 나노입자 또는 니오좀의 외부에, 코어의 벽 내에 및/또는 코어의 중심에 위치할 수 있다. 코어 상에 위치하는 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 코어에 커플링된 것으로 지칭된다. 커플링은 직접적이거나 간접적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000 또는 10,000개 올리고뉴클레오티드 또는 임의의 범위의 이들의 조합이 코어의 외부에 있다. 일부 실시양태에서, 1-1000, 10-500, 50-250 또는 50-300개 올리고뉴클레오티드가 표면에 존재한다.

지질 나노입자는 중성 지질을 포함할 수 있다. 중성 지질은 예를 들어 상업적 판매자로부터 입수가능한 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-디미리스토일-sn-포스파티딜콜린 (DMPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-포스파티딜콜린 (POPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DSPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DOPG), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 및 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE), 임의의 관련 포스파티딜콜린 또는 중성 지질일 수 있다.

지질 나노입자는 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 양이온성 지질은 예를 들어 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 (DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 (DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP), N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민 (DODMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLenDMA), 1,2-디리놀레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레이옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판 (DLin-DAC), 1,2-디리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판 (DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판 (DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판 (DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TMA.C1), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TAP.C1), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판 (DLin-MPZ), 또는 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올 (DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오 (DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판 (DLin-EG-DMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-DMA) 또는 그의 유사체, (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라히드로- -3aH-시클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민, (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기에 구체적으로 기재된 것들 외에도, 대략 생리학적 pH에서 순 양성 전하를 띄는 다른 양이온성 지질 또한 지질 나노입자에 포함될 수 있다. 이러한 양이온성 지질에는 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 ("DODAC"); N-(2,3-디올레일옥시)프로필-N,N-N-트리에틸암모늄 클로라이드 ("DOTMA"); N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 ("DDAB"); N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 ("DOTAP"); 1,2-디올레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 ("DOTAP.Cl"); 3.베타.-(N--(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일)콜레스테롤 ("DC-Chol"), N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N-2-(스퍼민카르복스아미도)에틸)-N,N-디메틸- 암모늄 트리플루오르아세테이트 ("DOSPA"), 디옥타데실아미도글리실 카르복시스퍼민 ("DOGS"), 1,2-디레오일-sn-3-포스포에탄올아민 ("DOPE"), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판 ("DODAP"), N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민 ("DODMA"), 및 N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 ("DMRIE")이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

"양친매성 지질"은 지질 물질의 소수성 부분은 소수성 상으로 배향되는 반면에, 친수성 부분은 수성 상을 향해 배향되는, 임의의 적합한 물질을 지칭한다. 이러한 화합물에는 인지질, 아미노지질, 및 스핑고지질이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 대표적인 인지질에는 스핑고미엘린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 또는 디리놀레일포스파티딜콜린이 포함된다.

본 발명에 기재된 지질 나노입자는 다양한 비로 양이온성 지질, 중성 지질, 스테롤 및 PEG-변형된 지질을 포함할 수 있다.

SNA에 치료제를 포함시킬 수 있다. 이들에는 소분자, 단백질, 핵산, 기체 (예를 들어, NO), 염료, 비타민, 영양소, 항생제, 항진균제 및 항바이러스제, 화학요법제, 스테로이드, 호르몬, 자성 또는 상자성 입자, 캡슐화된 치료 약물, 전구약물 또는 분자, 수용성 또는 수불용성 분자, 및 단백질, 예컨대 엔도솜에서 기능하는 것들, 특히 엔도솜 축적 질환과 관련된 것들이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

리포좀/리포플렉스는 또한 다른 표면 요소, 예컨대 비제한적으로 압타머, 항체, 단백질, 펩티드, 지질 유도체; 소분자, 및 자성/상자성 입자를 함유하도록 구축될 수 있다. 이들은 다양한 목적으로 사용될 수 있다.

올리고뉴클레오티드 쉘은 본원에 기재된 매우 다양한 CpG 올리고뉴클레오티드로부터 구축될 수 있다. 바람직하게는, CpG 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오티드이다. 그러나, 올리고뉴클레오티드는 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 하나의 또는 다양한 변형이 도입된 리보뉴클레오티드 및 다른 단일-가닥 올리고뉴클레오티드, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 하나의 또는 다양한 변형이 도입된 이중-가닥 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및 다른 이중-가닥 올리고뉴클레오티드, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 하나의 또는 다양한 변형이 도입된 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 도입된 올리고뉴클레오티드 트리플렉스일 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 단백질, 중합체, 또는 담체, 예컨대 프로타민과 미리 복합체화될 수 있거나 아닐 수 있다.

일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 쉘은 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000 또는 10,000개 올리고뉴클레오티드 또는 임의의 범위의 이들의 조합의 밀도를 갖는다. 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 쉘은 1-10,000, 1-9,000, 1-8,000, 1-7,000, 1-6,000, 1-5,000, 1-4,000, 1-3,000, 1-2,000, 1-1,000, 5-10,000, 5-9,000, 5-8,000, 5-7,000, 5-6,000, 5-5,000, 5-4,000, 5-3,000, 5-2,000, 5-1,000, 100-10,000, 100-9,000, 100-8,000, 100-7,000, 100-6,000, 100-5,000, 100-4,000, 100-3,000, 100-2,000,100-1,000, 500-10,000, 500-9,000, 500-8,000, 500-7,000, 500-6,000, 500-5,000, 500-4,000, 500-3,000, 500-2,000, 500-1,000, 10-10,000, 10-500, 50-10,000, 50-300 또는 50-250개의 밀도를 갖는다.

일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 쉘의 올리고뉴클레오티드는 구조적으로 동일한 올리고뉴클레오티드이다. 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 쉘의 올리고뉴클레오티드는 적어도 2가지의 구조적으로 상이한 올리고뉴클레오티드를 갖는다. 특정한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 쉘의 올리고뉴클레오티드는 2-50, 2-40, 2-30, 2-20 또는 2-10가지 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 나노구조체의 표면에 위치한다.

일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 쉘을 형성한다. 리포좀성 코어의 외부 표면의 이용가능한 표면적의 적어도 10%가 올리고뉴클레오티드를 포함할 때 올리고뉴클레오티드 쉘이 형성된다. 일부 실시양태에서, 리포좀의 외부 표면의 이용가능한 표면적의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 쉘의 올리고뉴클레오티드는 다양한 방향으로 배향될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 방사상으로 바깥쪽으로 배향된다.

일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 쉘에서 올리고뉴클레오티드의 적어도 10%가 지질 앵커 기를 통해 나노입자에 부착된다. 지질 앵커는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산을 지질 막에 삽입 및 고정시킬 수 있는 소수성 기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 쉘에서 올리고뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100%가 지질 앵커 기를 통해 지질 나노입자에 부착된다. 일부 실시양태에서, 지질 앵커 기는 콜레스테롤이다. 다른 실시양태에서, 지질 앵커 기는 스테롤, 팔미토일, 디팔미토일, 스테아릴, 디스테아릴, C16 알킬 쇄, 담즙산, 콜산, 타우로콜산, 데옥시콜레이트, 올레일 리토콜산, 올레오일 콜렌산, 당지질, 인지질, 스핑고지질, 이소프레노이드, 예컨대 스테로이드, 비타민, 예컨대 비타민 E, 포화 지방산, 불포화 지방산, 지방산 에스테르 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 지질이다.

용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"은 다중 뉴클레오티드 (즉, 치환된 피리미딘 (예를 들어, 시토신 (C), 티미딘 (T) 또는 우라실 (U)) 또는 치환된 퓨린 (예를 들어, 아데닌 (A) 또는 구아닌 (G))일 수 있는 교환가능한 유기 염기 및 포스페이트 기에 연결된 당 (예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스)을 포함하는 분자)를 의미하는 것으로서 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 상기 용어는 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드 둘 다를 포함한다. 상기 용어는 또한 폴리뉴클레오시드 (즉, 폴리뉴클레오티드에서 포스페이트를 제외한 것) 및 임의의 다른 유기 염기 함유 중합체를 포함할 것이다. 올리고뉴클레오티드는 기존 핵산 공급원 (예를 들어, 게놈 또는 cDNA)으로부터 수득될 수 있지만, 바람직하게는 합성된 것이다 (예를 들어, 핵산 합성에 의해 생성됨). 용어 "뉴클레오시드"는 당 모이어티, 바람직하게는 리보스 또는 데옥시리보스에 공유적으로 부착된 염기를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드"는 포스페이트 기 또는 포스페이트 유사체를 추가로 포함하는 뉴클레오시드를 포함한다.

본 발명과 관련된 올리고뉴클레오티드는 예컨대 당 모이어티, 포스포디에스테르 연결 및/또는 염기에서 변형될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "당 모이어티"에는 천연의 비변형된 당, 예컨대 펜토스, 리보스 및 데옥시리보스, 변형된 당 및 당 유사체가 포함된다. 당 모이어티의 변형에는 히드록실 기를 할로겐, 헤테로원자 또는 지방족 기로 교체하는 것이 포함될 수 있고, 히드록실 기를 예를 들어 에테르, 아민 또는 티올로서 관능화시키는 것이 포함될 수 있다.

당 모이어티의 변형에는 "메틸화"로 지칭되는 2'-O-메틸 뉴클레오티드가 포함될 수 있다. 일부 예에서, 본 발명과 관련된 올리고뉴클레오티드는 변형된 또는 비변형된 당 모이어티만을 함유할 수 있지만, 다른 예에서는 올리고뉴클레오티드가 변형된 일부 당 모이어티 및 변형되지 않은 일부 당 모이어티를 함유한다.

일부 예에서, 변형된 뉴클레오티드에는 당- 또는 백본-변형된 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드가 포함된다. 변형된 리보 또는 데옥시리보뉴클레오티드는 비-천연 발생 염기, 예컨대 5'-위치에서 변형된 우리딘 또는 시티딘, 예를 들어 5'-(2-아미노)프로필 우리딘 및 5'-브로모 우리딘; 8-위치에서 변형된 아데노신 및 구아노신, 예를 들어 8-브로모 구아노신; 데아자 뉴클레오티드, 예를 들어 7-데아자-아데노신; 및 N-알킬화 뉴클레오티드, 예를 들어 N6-메틸 아데노신을 함유할 수 있다. 또한, 당-변형된 리보뉴클레오티드는 H, 알콕시 (또는 OR), R 또는 알킬, 할로겐, SH, SR, 아미노 (예컨대, NH₂, NHR, NR_2,), 또는 CN 기로 교체된 2'-OH 기를 가질 수 있고, 여기서 R은 저급 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이다. 일부 실시양태에서, 변형된 리보뉴클레오티드는 변형된 기, 예컨대 포스포로티오에이트 기로 교체된 인접한 리보뉴클레오티드에 연결된 포스포디에스테르 기를 가질 수 있다.

변형된 당에는 D-리보스, 2'-O-알킬 (예컨대, 2'-O-메틸 및 2'-O-에틸), 즉, 2'-알콕시, 2'-아미노, 2'-S-알킬, 2'-할로 (예컨대, 2'-플루오로), 2'-메톡시에톡시, 2'-알릴옥시 (-OCH₂CH=CH₂), 2'-프로파르길, 2'-프로필, 2' 아민, 에티닐, 에테닐, 프로페닐 및 시아노 등이 포함될 수 있다. 당 모이어티는 또한 헥소스일 수 있다.

용어 "소수성 변형"은 전반적인 소수성을 증가시키고 염기가 여전히 규칙적인 왓슨-크릭 상호작용 형성할 수 있도록 염기를 변형시킨 것을 지칭한다. 염기 변형의 비제한적인 예에는 페닐, 4-피리딜, 2-피리딜, 인돌릴, 및 이소부틸, 페닐 (C₆H₅OH); 트립토파닐 (C₈H₆N)CH₂CH(NH₂)CO), 이소부틸, 부틸, 아미노벤질; 페닐; 및 나프틸과 같은 5-위치 우리딘 및 시티딘 변형이 포함된다.

일부 측면에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 3' 및 5' 말단을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 3' 및 5' 말단은 예를 들어 3' 또는 5' 연결을 변형시킴으로써 뉴클레아제로부터 실질적으로 보호될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,849,902 및 WO 98/13526). 올리고뉴클레오티드는 "차단기"를 포함시킴으로써 저항성으로 만들 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "차단기"는 합성을 위한 보호기 또는 커플링 기로서 (예를 들어, FITC, 프로필 (CH₂-CH₂-CH₃), 글리콜 (-O-CH₂-CH₂-O-) 포스페이트 (PO₃ ^2-), 히드로겐 포스포네이트, 또는 포스포르아미다이트) 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오단량체에 부착될 수 있는 (예를 들어, OH 기 이외의) 치환기를 지칭한다. "차단기"는 또한 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드 엑소뉴클레아제 내성 구조를 비롯하여, 올리고뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단을 보호하는 "말단 차단기" 또는 "엑소뉴클레아제 차단기"를 포함한다.

예시적인 말단-차단기에는 캡 구조 (예를 들어, 7-메틸구아노신 캡), 예를 들어 3'-3' 또는 5'-5' 말단 역위를 갖는 역위 뉴클레오단량체 (예를 들어, Ortiagao et al. 1992. Antisense Res. Dev . 2:129 참고), 메틸포스포네이트, 포스포르아미다이트, 2'→5' 뉴클레오티드간 연결 비-뉴클레오티드 기 (예를 들어, 비-뉴클레오티드 링커, 아미노 링커, 접합체) 등이 포함된다. 3' 말단 뉴클레오티드는 변형된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 3' 말단 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 3'-엑소뉴클레아제 분해를 방지하는 차단기에 의해 임의적으로 치환될 수 있는 3'-O를 포함한다. 예를 들어, 3'-히드록실은 3'→3' 뉴클레오티드간 연결을 통해 뉴클레오티드로 에스테르화될 수 있다. 예를 들어, 알킬옥시 라디칼은 메톡시, 에톡시, 또는 이소프로폭시, 및 바람직하게는 에톡시일 수 있다. 임의적으로, 3' 말단에서 3'→3' 연결된 뉴클레오티드는 치환기 연결에 의해 연결될 수 있다. 뉴클레아제 분해를 감소시키기 위해, 가장 5'쪽의 3'→5' 연결은 변형된 연결, 예를 들어 포스포로티오에이트 또는 P-알킬옥시포스포트리에스테르 연결일 수 있다. 바람직하게는, 상기 두 가지의 가장 5'쪽의 3'→5' 연결이 변형된 연결이다. 임의적으로, 5' 말단 히드록시 모이어티는 인 함유 모이어티, 예를 들어 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 P-에톡시포스페이트에 의해 에스테르화될 수 있다.

일부 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 DNA 및 RNA 둘 다 포함할 수 있다.

일부 측면에서, 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부분이 치환기 연결, 예를 들어 포스포로티오에이트 연결에 의해 연결된다. 치환기 연결의 존재는 혈청 단백질에 대한 그들의 높은 친화성으로 인해 약동학을 개선시킬 수 있다.

올리고뉴클레오티드의 표면 밀도는 코어의 크기 및 유형에 따라 및 올리고뉴클레오티드의 길이, 서열 및 농도에 따라 좌우될 수 있다. 나노입자를 안정하게 만드는데 적합한 표면 밀도, 및 나노입자 및 올리고뉴클레오티드의 원하는 조합을 위해 이를 수득하는데 필요한 조건은 실험에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 입자당 적어도 100개 올리고뉴클레오티드의 표면 밀도는 안정한 코어-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공하는데 적합할 것이다. 바람직하게는, 표면 밀도는 나노입자당 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,200, 1,400, 1,600, 1,800, 2,000, 5,000 또는 10,000개 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 대상체에서 면역 반응을 유도하는데 효과적인 양으로 대상체에게 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 SNA를 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 경구로, 국부적으로, 지속된 방출 기기에서, 점막으로, 전신으로, 비경구로, 비내로, 안내로 또는 근육내로 투여된다. CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 SNA를 점막 표면에 투여하는 경우, 이는 점막 면역 반응 또는 전신 면역 반응을 유도하는데 효과적인 양으로 전달될 수 있다.

본원에 기재된 화합물의 대상체 용량은 전형적으로 약 0.1 μg 내지 10,000 mg, 더욱 전형적으로 약 1 μg/일 내지 8000 mg, 가장 전형적으로 약 10 μg 내지 100 μg 범위이다. 대상체 체중과 관련하여 명시될 때 전형적인 투약량은 투여당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중에서부터 약 1000 mg/kg/체중 이상까지의 범위, 및 이들로부터 추론가능한 임의의 범위이다. 본원에 열거된 수치로부터 추론가능한 범위의 비제한적인 예에서, 상기 기재된 수치를 기준으로 하여 약 5 mg/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등의 범위가 투여될 수 있다. 절대적인 양은 병행 치료, 투여 횟수 및 개별 환자 변수, 예컨대 연령, 신체 상태, 크기 및 체중을 비롯한 다양한 인자에 따라 좌우될 것이다. 이들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 인자이며, 일상적인 실험만으로도 다루어질 수 있다. 일반적으로, 건전한 의학적 판단에 따라 최대 용량, 즉, 가장 높은 안전한 용량을 사용하는 것이 바람직하다.

다른 측면에서, 본 개시내용은 암을 가진 대상체에게 본원에 기재된 본 발명을 정맥내, 종양내 또는 피하 주사에 의해 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 방법은 대상체를 항원에 노출시키는 것을 포함하며, 여기서 면역 반응은 항원-특이적 면역 반응이다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 기생충 항원 및 펩티드 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드를 포함하는 SNA에 항원이 도입된다.

CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 SNA는 광범위한 면역 반응을 유발할 수 있다. 예를 들어, CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이들 SNA를 사용하여, Th2를 Th1 면역 반응으로 재지시할 수 있다. CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 또한 면역 세포, 예컨대 림프구 (예를 들어, B 및 T 세포), 수지상 세포, 및 NK 세포를 활성화시키기 위해 사용될 수 있다. 활성화는 생체내, 시험관내, 또는 생체외에서, 즉, 대상체로부터 면역 세포를 단리하고, CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 면역 세포의 활성화를 위한 유효량으로 면역 세포와 접촉시키고, 활성화된 면역 세포를 대상체에게 재투여함으로써 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포는 암 항원을 제시한다. 수지상 세포는 생체 외에서 암 항원에 노출될 수 있다.

CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 SNA에 의해 생성된 면역 반응은 또한 사이토킨 생성, 예를 들어 IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF, IFN-α, 케모카인, 및 IFN-γ의 생성을 유도할 수 있다.

여전히 또 다른 실시양태에서, CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 SNA는 암 치료에 유용하다. 본 발명의 또 다른 측면에 따라, CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 또한 암의 발병 위험이 있는 대상체에서 암 예방에 (예를 들어, 암 발병 위험의 감소에) 유용하다. 암은 담도암, 유방암, 자궁경부암, 융모암종, 결장암, 자궁내막암, 위암, 상피내 신생물, B-세포 및 T-세포 림프종, 간암, 폐암 (예를 들어, 소세포 및 비-소세포), 흑색종, 신경모세포종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 육종, 갑상선암, 및 신장암, 난소암, 뿐만 아니라 다른 암종 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 중요한 실시양태에서, 암은 골암, 뇌암 및 CNS암, 결합 조직암, 식도암, 안암, 호지킨(Hodgkin) 림프종, 비-호지킨 림프종, 후두암, 구강암, 흑색종 및 다른 피부암, 및 고환암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

임의적으로 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 항암 요법과 공동으로 투여할 때, CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 SNA는 또한 암 요법 (예를 들어, 항암 요법)에 대한 암 세포의 반응성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 항암 요법은 화학요법, 백신 (예를 들어, 시험관내 프라이밍된 수지상 세포 백신 또는 암 항원 백신) 또는 항체 기반 요법일 수 있다. 여기서 후자의 요법은 또한 예를 들어 암 세포의 세포 표면 항원에 대해 특이적인 항체를 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 면역 반응은 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 유발한다. 한 실시양태에서, 항체는 리부탁신, 헤르셉틴, 쿠아드라멧, 케이트루다, 옵디보, 벡사르, 벡티빅스, 아르제라, 예르보이, 제발린, 다르잘렉스, 에르비툭스, 아드세트리스, 아바스틴, 캄파쓰, 파노렉스, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, 온콜림, SMART M195, ATRAGEN, 오바렉스, 벡사르, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, 항-VEGF, 제나팍스, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, 프리타겟, NovoMAb-G2, TNT, 글리오맙-H, GNI-250, EMD-72000, 림포사이드, CMA 676, 모노팜-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, 항-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab, ImmuRAIT-CEA, 다른 항암 항체, 예컨대 체크포인트 억제제 또는 면역계를 자극하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 암 요법이 SNA에 도입될 수 있다.

따라서, 본 발명의 일부 측면에 따라, 암을 갖거나 암의 발병 위험이 있는 대상체에게 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드 및 항암 요법을 투여한다. 일부 실시양태에서, 항암 요법은 화학요법제, 면역요법제, 체크포인트 억제제, 면역계 효능제, 항체 단편, 이중특이적 항체, 및 암 백신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

체크포인트 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, B-7 패밀리 리간드 또는 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 체크포인트 단백질을 억제한다. 일부 실시양태에서, 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 BMS-936558 (니볼루맙)이다. 또 다른 실시양태에서, 체크포인트 억제제는 항-CTLA-4 항체이다. 다른 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙이다.

면역계 효능제는 CD27, CD28, B7.1, CD137, CD137L, OX40, OX40L, HVEN, 및 GITR을 효능화시키는 화합물로부터 선택될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 질환을 예방하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 대상체에서 질환의 예방에 대해 반응성인 면역계를 촉진시키기 위해 규칙적인 방식으로 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 SNA를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 예방적 방법을 이용하여 예방되는 질환 또는 상태의 예에는 미생물 감염 (예를 들어, 성적으로 전염된 질환) 및 음식물 알러지로 인한 아나필락시스성 쇼크가 포함된다.

다른 측면에서, 본 발명은 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 SNA를 선천성 면역 반응을 활성화시키는데 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 선천성 면역 반응을 유도하는 방법이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 바이러스 또는 레트로바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 바이러스 또는 레트로바이러스 감염을 갖거나 그의 발병 위험이 있는 대상체에게 본 발명의 임의의 조성물을 바이러스 또는 레트로바이러스 감염의 치료에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 간염 바이러스, 예를 들어 B형 간염, C형 간염, HIV, 헤르페스 바이러스, 또는 유두종바이러스에 의해 초래된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 박테리아 감염을 갖거나 그의 발병 위험이 있는 대상체에게 본 발명의 임의의 조성물을 박테리아 감염의 치료 또는 예방을 위한 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 박테리아 감염은 세포내 박테리아로 인한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 기생충 감염을 갖거나 그의 발병 위험이 있는 대상체에게 본 발명의 임의의 조성물을 기생충 감염의 치료 또는 예방을 위한 유효량으로 투여함으로써 기생충 감염을 치료 또는 예방하는 방법이다. 한 실시양태에서, 기생충 감염은 세포내 기생충으로 인한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 기생충 감염은 비구충성 기생충으로 인한 것이다.

일부 실시양태에서, 대상체는 인간이고, 다른 실시양태에서, 대상체는 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 칠면조, 염소, 어류, 원숭이, 닭, 래트, 마우스 및 양으로 이루어진 군으로부터 선택된 비-인간 척추동물이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 조성물을 Th1 면역 반응의 생성을 위한 유효량으로 대상체에게 투여함으로써 Th1 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 그의 적용에 있어서 하기 설명에서 기재되거나 도면에 도시된 구성요소의 구성 및 배열의 세부사항으로 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태일 수 있고, 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본원에서 사용된 어구 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이며, 제한되는 것으로 간주되지 않아야 한다. 본원에서 "포함하는(including)", "포함하는(comprising)" 또는 "갖는", "함유하는", "포함하는(involving)" 및 이들의 변형어는 그들 뒤에 열거된 항목들 및 그의 등가물, 뿐만 아니라 추가의 항목들을 포괄하는 것으로 의도된다.

통상의 기술자는 일상적인 실험만으로도 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 여러 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.

특허 문서를 비롯하여 본원에 개시된 모든 참고문헌은 그들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.

실시예

신규한 핵산-기반 TLR9 효능제의 특징분석

배경기술

구형 핵산 (SNA)은 구형 지질 이중층 상에 방사상으로 배향된 빽빽히 밀집된 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 이러한 구조는 선형 올리고뉴클레오티드에 비해 SNA에 대해 독특한 성질, 예컨대 강화된 세포 흡수 및 엔도솜 수용체 활성화 동역학을 제공한다.

SNA 포맷의 핵산 기반 TLR9 효능제의 특징이 기재된다. 다양한 길이 및 개수의 CpG 모티프를 갖는 올리고뉴클레오티드를 리포터 세포, 인간 PBMC 및 생체내 마우스를 이용하여 특징분석하였다. 선형 CpG 올리고뉴클레오티드와 달리, 12량체 정도로 짧은 CpG 올리고뉴클레오티드를 SNA 포맷으로 시험하였고, 이들이 TLR9를 활성화시키고 5'-TCG 모티프를 필요로 하지 않음을 발견하였다. TLR9 효능제 SNA는 선형 CpG 올리고뉴클레오티드에 비해 TLR9에 대해 높은 특이성을 보유하고, 인간 PBMC로의 흡수를 증가시키고, 증가된 Th1-유형 사이토킨을 유도한다. 마우스에게 전신 투여한 후에 강력한 사이토킨 유도가 관찰되었다. SNA 구조는 TLR9 특이성을 손상시키지 않으면서 합성 TLR9 효능제 올리고뉴클레오티드에 대한 길이 및 모티프 요건을 감소시키고, 세포 흡수를 증가시킨다. SNA의 이러한 독특한 성질은 치료적 적용을 위한 면역자극성 SNA의 유용성을 강조한다.

결과

리포터 세포에서 NF-κB 활성화

핵산의 TLR9-자극 활성을 인간 Ramos B-림프구 및 마우스 RAW 대식세포로부터 유래된 NF-κB 리포터 세포주에서 평가하였다 (표 1). SNA 구축물은 선형 포맷의 동일한 서열에 비해 강력하였다. 보다 짧은 길이 (예를 들어, 서열 6 참고) 또는 5' TCG의 결여 (예를 들어, 서열 2 및 서열 4 참고)로 인해 선형 올리고뉴클레오티드로서 불량하게 TLR9를 자극했던 서열이 SNA로서 높은 활성을 나타내었다. B-부류 및 C-부류 CpG 둘 다 SNA 포맷에서 활성이었다. NF-κB 활성화가 TLR9-의존성임을 확인하기 위해, 외인성 TLR을 발현하지 않거나 (null), 또는 인간 TLR9, 마우스 TLR9, 인간 TLR3, 인간 TLR7 또는 인간 TLR8을 발현하도록 안정하게 형질감염된 HEK 세포주에서 유사한 실험을 수행하였다. TLR9-발현 세포주만이 CpG 올리고뉴클레오티드에 의한 치료에 반응하였다.

표 1: TLR9-의존성 NF-κB 활성화

null, hTLR3, hTLR7 또는 hTLR8 리포터 세포주에서는 활성화가 나타나지 않았다.

인간 PBMC에서 사이토킨 반응

핵산에 대한 인간 사이토킨 반응은 배양물 중 인간 말초 혈액 단핵구성 세포 (hPBMC)를 이용하여 모델링하였다. 핵산 기반 TLR9 효능제로 처리한 후에, hPMBC 배양물 상청액에서 사이토킨 수준을 정량화하였다 (표 2). SNA 구축물은 선형 포맷의 동일한 서열에 비해 강력하였다. 보다 짧은 길이 (예를 들어, 서열 6, 서열 9, 및 서열 14 참고) 또는 5' TCG의 결여 (예를 들어, 서열 4 및 서열 5 참고)를 갖는 서열은 선형 올리고뉴클레오티드로서에 비해 SNA로서 더욱 활성이었다. 12 nt 정도로 짧은 서열 (서열 9 참고)은 SNA로서 매우 활성이었다. A-부류, B-부류 및 C-부류 CpG는 SNA 포맷에서 활성이었다.

표 2: 인간 PBMC에서 사이토킨 반응

인간 PBMC에서 올리고뉴클레오티드 흡수

인간 PBMC에 의한 형광-표지된 핵산의 흡수를 유세포 계측법에 의해 평가하였다 (도 1). 선형 올리고뉴클레오티드와 비교시 보다 높은 비율의 세포가 SNA를 흡수하였고, 올리고뉴클레오티드를 흡수한 세포 중에서 세포당 더 많은 SNA가 흡수되었다.

생체내 사이토킨 반응

마우스에서 CpG 올리고뉴클레오티드의 피하 주사 후에, 선형 올리고뉴클레오티드에 비해 SNA에 의해 더 높은 혈청 사이토킨 수준이 관찰되었다 (도 2).

물질 및 방법

SNA 제조. DNA 올리고뉴클레오티드를 포스포로티오에이트 (PS) 뉴클레오티드간 연결을 이용하여 합성하였다. SNA 포맷의 DNA 올리고뉴클레오티드의 경우, 콜레스테롤 모이어티 (3'-Chol)를 2개의 헥사에틸렌글리콜 (sp18) 모이어티를 통해 3'-말단에 부착시켰다. SNA 화합물을 50 nm DOPC 리포좀 (LSNA) 상에 100개 올리고뉴클레오티드 분자/리포좀의 비율로 관능화시켰다.

리포터 세포에서 NF-κB 활성화. NF-κB 리포터 세포 (인간 Ramos B-림프구, 마우스 RAW 대식세포, 인간 TLR9-HEK, 마우스 TLR9-HEK, null1-HEK, 인간 TLR3-HEK, 인간 TLR7-HEK, 및 인간 TLR8-HEK; 인비보젠(InvivoGen))를 DMEM, 4.5 g/l 글루코스, 10% (v/v) 태아 소 혈청, 50 U/mL 페니실린, 50 μg/mL 스트렙토마이신, 100 μg/mL 노르모신, 100 μg/mL 제오신, 10 μg/mL 블라스티시딘, 2 mM L-글루타민으로 구성된 성장 배지 중에서 배양하였다. 세포 배양물을 코닝(Corning)으로부터의 T75 플라스크 (비발열원성 폴리스티렌)에서 37℃ 및 5% CO2하에 보관하였다. 핵산 첨가후 24 시간째에, NF-κB 활성화를 콴티블루(QuantiBlue) 시약 (인비보젠)을 이용하여 평가하였다. 160 μL의 콴티블루를 멸균성 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 40 μL의 세포 상청액을 그들의 상응하는 웰에 첨가하여, 200 μL의 총 부피를 수득하였다. 모든 시험 화합물을 플레이팅한 후, 플레이트를 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2하에 30 분 동안 두었다. 색상 변화를 30분의 인큐베이션 기간 후에 15 분마다 검토하였다. 기준으로서 표준 곡선을 이용하여 색상의 발현 후에, 플레이트를 650 nm의 흡광도에서 형광 플레이트 판독기 (시너지(Synergy) 4)를 이용하여 판독하였다.

인간 PBMC에서 사이토킨 반응. 인간 말초 혈액 단핵구성 세포 (PBMC) 배양물의 경우, 버피 코트를 젠 바이오(Zen Bio) 및 올셀즈(AllCells)로부터 구입하였다. 버피 코트를 염화암모늄을 이용하여 추가로 가공하여 적혈구를 용해시키고 제거하였다. 세포를 수집 24 시간 이내에 신선하게 사용하였다. PBMC를 보충된 RPMI 성장 배지 (페놀 레드 (코닝), 4.5 g/l 글루코스, 10% (v/v) 태아 소 혈청, 50 U/ml 페니실린, 및 50 mg/ml 스트렙토마이신을 갖는 RPMI) 중에서 37℃ 및 5% CO2하에 배양하였다. 핵산 첨가후 24 시간째에, PBMC 배양물 상청액에서 사이토킨 수준을 멀티플렉스 사이토킨 ELISA 키트 (콴시스(Quansys))를 이용하여 평가하였다. 표준 곡선은 키트에 제공된 샘플 희석제를 이용하여 제조하였다. 형질감염된 세포로부터 수집된 상청액을 샘플 희석제를 이용하여 1:2로 희석하였다. 50 μL의 표준 및 샘플을 큐-플렉스(Q-Plex) 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 진탕기 상에서 (500 rpm 및 20℃) 1 시간 동안 두었다. 이어서, 플레이트를 세척 완충제를 이용하여 3회 세척하였다. 50 μL의 검출 혼합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 다시, 플레이트를 밀봉하고, 진탕기 상에서 (500 rpm 및 20℃) 1 시간 동안 두었다. 이어서, 플레이트를 3회 더 세척하였다. 50 μL의 스트렙타비딘-HRP 1X를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 진탕기에 (500 rpm 및 20℃) 15 분 동안 다시 두었다. 이 시간 동안 혼합된 기질을 UV광으로부터 보호하도록 주의하면서 제조하였다. 이어서, 플레이트를 6회 세척하였다. 50 μL의 기질 혼합물을 각각의 웰에 첨가하고, 15 분 내에 큐-뷰 엘에스 이미저(Q-View LS imager)를 이용하여 플레이트를 판독하였다.

인간 PBMC에서 올리고뉴클레오티드 흡수. 인간 PBMC를 상기 기재된 바와 같이 배양하였다. PBMC를 FITC-표지된 올리고뉴클레오티드로 처리하고, 24 시간 후에 유세포 계측법을 이용하여 올리고뉴클레오티드의 흡수를 평가하였다.

생체내 사이토킨 반응. 기준 B-부류 CpG (인간) 선형 올리고뉴클레오티드 또는 SNA를 10주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 피하 주사하였다. 주사 4 시간 후에, 전혈을 수집하고, 혈청으로 가공하였다. 사이토킨을 상기 기재된 바왁 같이 멀티플렉스 사이토킨 ELISA 키트를 이용하여 평가하였다.

올리고뉴클레오티드 서열

표 3.

"*"는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, "/iSp18/"은 헥사(에틸렌 글리콜) 스페이서를 나타내고, "/3CholTEG/"는 콜레스테롤 포스포로아미다이트를 나타내고, "/FluorT/"는 FITC-접합된 T를 나타낸다.

등가물

관련 기술분야의 통상의 기술자는 일상적인 실험만을 이용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 실시양태의 여러 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Exicure, Inc. <120> SPHERICAL NUCLEIC ACID TLR9 AGONISTS <130> A1107.70013WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/333,074 <151> 2016-05-06 <160> 80 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Modified with a phosphorothioate bond <220> <221> misc_feature <222> (14)..(20) <223> Modified with a phosphorothioate bond <400> 1 gggggacgat cgtcgggggg 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> Modified with a phosphorothioate bond <400> 2 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> Modified with a phosphorothioate bond <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Modified with /FluorT/ <400> 3 tcgtcgtttt 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nnnnnnnnnn nnnnnnntnn cgnn 34 <210> 78 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> n is a, c, g, t, or absent <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(56) <223> n is a, c, g, t, or absent <400> 78 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnncgn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnn 56 <210> 79 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 79 cgacgttcgt cg 12 <210> 80 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 80 cggcgccgtg ccg 13

Claims

리포좀 또는 리포플렉스의 외부에 위치한 B-부류 CpG 올리고뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 쉘을 갖는 리포좀 또는 리포플렉스 복합체를 포함하는 구형 핵산 (SNA)이며, 여기서 B-부류 CpG 올리고뉴클레오티드는 4-16개 뉴클레오티드 길이이고/거나 5'TCG 모티프를 갖지 않는 것인 구형 핵산 (SNA).
제1항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 8-14개 뉴클레오티드 길이인 SNA.
제1항 또는 제2항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 5'TCG 모티프를 갖지 않는 것인 SNA.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 지질 앵커 기를 통해 리포좀 또는 리포플렉스에 부착된 것인 SNA.
제4항에 있어서, 앵커 기가 콜레스테롤 또는 토코페롤인 SNA.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 쉘의 올리고뉴클레오티드가 방사상으로 바깥쪽으로 배향된 것인 SNA.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 리포좀 코어가 2-200 nm의 평균 직경을 갖는 것인 SNA.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 쉘이 SNA당 5-1,000개 올리고뉴클레오티드의 밀도를 갖는 것인 SNA.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 쉘이 SNA당 100-1,000개 올리고뉴클레오티드의 밀도를 갖는 것인 SNA.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 쉘이 SNA당 500-1,000개 올리고뉴클레오티드의 밀도를 갖는 것인 SNA.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 적어도 1개의 뉴클레오시드간 포스포로티오에이트 연결을 갖는 것인 SNA.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 뉴클레오시드간 포스포로티오에이트 연결을 갖지 않는 것인 SNA.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 모두 뉴클레오시드간 포스포로티오에이트 연결을 갖는 것인 SNA.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 10 내지 12개 뉴클레오티드 길이를 갖는 것인 SNA.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 적어도 25%가 SNA의 외부 표면에 노출된 5'-말단을 갖는 것인 SNA.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 쉘의 올리고뉴클레오티드가 모두 SNA의 외부 표면에 노출된 5' 말단을 갖는 것인 SNA.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 쉘의 올리고뉴클레오티드의 적어도 25%가 SNA의 외부 표면에 노출된 3'-말단을 갖는 것인 SNA.
리포좀 또는 리포플렉스의 외부에 위치한 CpG 올리고뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 쉘을 갖는 리포좀 또는 리포플렉스 복합체로 구성된 구형 핵산 (SNA)을 포함하며, 몰 당량의 동일한 서열을 갖는 선형 CpG 올리고뉴클레오티드보다 높은 수준의 1종 이상의 사이토킨 생성을 자극하는 조성물.
리포좀 또는 리포플렉스의 외부에 위치한 비전형적인 CpG 올리고뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 쉘을 갖는 리포좀 또는 리포플렉스 복합체로 구성된 구형 핵산 (SNA)을 포함하는 조성물.
제18항 또는 제19항에 있어서, 사이토킨이 IL-6인 조성물.
제18항 또는 제19항에 있어서, 사이토킨이 IL-12인 조성물.
제18항 또는 제19항에 있어서, 사이토킨이 IFN-α인 조성물.
제18항 또는 제19항에 있어서, 사이토킨이 IFN-γ인 조성물.
제18항 또는 제19항에 있어서, 사이토킨이 시험관내에서 생성되는 것인 조성물.
제18항 또는 제19항에 있어서, 사이토킨이 생체내에서 생성되는 것인 조성물.
제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 B-부류 CpG 올리고뉴클레오티드인 조성물.
제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 이차 구조가 없는 CpG 올리고뉴클레오티드인 조성물.
제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 C-부류 CpG 올리고뉴클레오티드인 조성물.
제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 이차 구조를 가진 CpG 올리고뉴클레오티드인 조성물.
제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 A-부류 CpG 올리고뉴클레오티드인 조성물.
제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 G-풍부 서열로 이루어진 CpG 올리고뉴클레오티드인 조성물.
제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 A-부류 CpG 올리고뉴클레오티드, B-부류 CpG 올리고뉴클레오티드 및 C-부류 CpG 올리고뉴클레오티드의 혼합물인 조성물.
제18항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 4-16개 뉴클레오티드 길이인 조성물.
제18항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 5'TCG 모티프를 갖지 않는 것인 조성물.
제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 방사상으로 바깥쪽으로 배향된 것인 조성물.
제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 리포좀 코어가 2-200 nm의 평균 직경을 갖는 것인 SNA.
제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 쉘이 SNA당 5-1,000개 올리고뉴클레오티드의 밀도를 갖는 것인 조성물.
제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 쉘이 SNA당 100-1,000개 올리고뉴클레오티드의 밀도를 갖는 것인 조성물.
제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 쉘이 SNA당 500-1,000개 올리고뉴클레오티드의 밀도를 갖는 것인 조성물.
제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 적어도 1개의 뉴클레오시드간 포스포로티오에이트 연결을 갖는 것인 조성물.
제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 뉴클레오시드간 포스포로티오에이트 연결을 갖지 않는 것인 조성물.
제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 모두 뉴클레오시드간 포스포로티오에이트 연결을 갖는 것인 조성물.
제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 10 내지 16개 뉴클레오티드 길이를 갖는 것인 조성물.
제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드의 적어도 25%가 SNA의 외부 표면에 노출된 5'-말단을 갖는 것인 조성물.
제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드의 적어도 25%가 SNA의 외부 표면에 노출된 3'-말단을 갖는 것인 조성물.
리포좀 또는 리포플렉스의 외부에 위치한 A-부류 CpG 올리고뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 쉘을 갖는 리포좀 또는 리포플렉스 복합체로 구성된 구형 핵산 (SNA)을 포함하는 조성물.
리포좀 또는 리포플렉스의 외부에 위치한 CpG 올리고뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 쉘을 갖는 리포좀 또는 리포플렉스 복합체의 구형 핵산 (SNA)을 포함하는 조성물을 IL-6 또는 IL-12 발현의 유도를 위한 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 사이토킨 발현을 유도하는 방법.
제47항에 있어서, SNA가 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 SNA 또는 제17항 내지 제42항 중 어느 한 항의 조성물인 방법.
리포좀 또는 리포플렉스의 외부에 위치한 CpG 올리고뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 쉘을 갖는 리포좀 또는 리포플렉스 복합체의 구형 핵산 (SNA)을 포함하는 조성물을 대상체의 치료를 위한 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체를 치료하는 방법.
제49항에 있어서, SNA가 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 SNA 또는 제18항 내지 제45항 중 어느 한 항의 조성물인 방법.
제49항에 있어서, 대상체가 암을 가진 것인 방법.
제49항에 있어서, 대상체가 감염성 질환을 가진 것인 방법.
제49항에 있어서, 대상체가 알러지성 장애를 가진 것인 방법.
제49항 또는 제51항에 있어서, 대상체에게 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제48항에 있어서, 체크포인트 억제제가 모노클로날 항체, 인간화 항체, 완전 인간 항체, 항체 단편, 이중특이적 항체, 항체 약물 접합체, 융합 단백질, 또는 이들의 조합물, 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제55항에 있어서, 체크포인트 억제제가 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, 및 B-7 패밀리 리간드 또는 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 체크포인트 단백질을 억제하는 것인 방법.
제56항에 있어서, 체크포인트 억제제가 항-PD-1 항체인 방법.
제57항에 있어서, 항-PD-1 항체가 BMS-936558 (니볼루맙)인 방법.
제57항에 있어서, 항-PD-1 항체가 펨브롤리주맙인 방법.
제56항에 있어서, 체크포인트 억제제가 항-CTLA-4 항체인 방법.
제60항에 있어서, 항-CTLA-4 항체가 이필리무맙인 방법.
제56항에 있어서, 체크포인트 억제제가 항-PD-L1 항체인 방법.
제62항에 있어서, 항-PD-L1 항체가 MPDL3280A (아테졸리주맙)인 방법.
제49항 내지 제51항 및 제54항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 담도암; 뇌암; 유방암; 자궁경부암; 융모암종; 결장암; 자궁내막암; 식도암; 위암; 상피내 신생물; B-세포 림프종; T-세포 림프종; 간암; 폐암 (예를 들어, 소세포 및 비-소세포); 흑색종; 신경모세포종; 구강암; 난소암; 췌장암; 전립선암; 직장암; 육종; 피부암; 고환암; 갑상선암; 및 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.