WO2019184991A1 - 化合物或中药提取物在制备核酸递送试剂中的应用及其相关产品 - Google Patents

化合物或中药提取物在制备核酸递送试剂中的应用及其相关产品 Download PDF

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蒋澄宇
李晓芸
杜涧超
梁竹
王志清
王晨轩
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中国医学科学院基础医学研究所
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    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the present application relates to extracting a plurality of compounds or synthetic compounds capable of promoting nucleic acid delivery from a traditional Chinese medicine, and using the extracted compounds or a plurality of combinations to promote absorption and entry of nucleic acids such as sRNA into target cells, and to facilitate entry into a subject in need thereof The target site in the body.
  • nucleic acid molecules include RNA molecules
  • nucleic acid molecules have many properties that make it a therapeutic drug. They can be folded to form complex conformations that allow them to bind to proteins, small molecules or other nucleic acids, and some can even form catalytic centers.
  • Small interfering RNA siRNA
  • siRNA small interfering RNA
  • sRNAs small nucleic acids or small RNAs (sRNAs) indiscriminately.
  • nucleic acid molecules are easily degraded and have a relatively short half-life in vivo, they are generally considered to be a poor choice as therapeutic drugs.
  • nucleic acid molecules including small RNAs
  • the inventors have unexpectedly discovered that some Chinese medicines (including Rhodiola, dandelion, Andrographis paniculata and honeysuckle) have some lipid components, and these lipids derived from traditional Chinese medicine can promote the absorption/entry of nucleic acids such as small RNA into cells and / or target parts of the body in need of this.
  • the lipid component is synthetic.
  • the present application relates in one aspect to a compound having the following structure extracted from a traditional Chinese medicine, and the use of the compound for the preparation of a nucleic acid for delivery:
  • L1, L2, L3 are absent, or L1, L2, L3 are each independently selected from -C(O)O-CH2-, -CH(OH)-, -C(O)-NH-CH2-, -CH2 -OC(O)-, -CH2-NH-C(O)-, -C(O)O-, -C(O)NH-, -OC(O)-, -NH-C(O)-, -CH 2 -,
  • the condition is that at most two of L1, L2, and L3 do not exist
  • the dash “-" on the left side is connected to the central carbon atom, and the dash “-" on the right side is connected to Q;
  • A, B, and Q are each independently selected from the group consisting of H, -OH, C1-20 alkyl, C1-20 alkenyl, C1-20 heteroalkyl, C1-20 heteroalkenyl, -NH2, and -NR3+, and R is H. Or C1-6 alkyl; and
  • n is an integer of 0, 1, 2, 3 or 4.
  • L1 is absent, or L1 is selected from -C(O)O-CH2- and -CH(OH)-,
  • L2 is absent, or L2 is selected from -C(O)O- and -C(O)NH-,
  • L3 is absent, or L3 is selected from -C(O)O-, -CH2-OC(O)-, -CH2- and
  • A is selected from the group consisting of H, C 1-20 alkyl and C 1-20 alkenyl;
  • B is selected from the group consisting of H, -NH 2 , C 1-20 alkyl and C 1-20 alkenyl;
  • Q is selected from the group consisting of H, -OH, C 1-20 alkyl and C 1-20 alkenyl, and -NR 3 + wherein R is H or C 1-6 alkyl.
  • the compound has the formula
  • A is selected from the group consisting of H, C 10-20 alkyl and C 10-20 alkenyl
  • B is selected from the group consisting of H, -NH 2 , C 10-20 alkyl and C 10-20 alkenyl;
  • Q is selected from the group consisting of H, -OH, C 10-20 alkyl and C 10-20 alkenyl, and -NR 3 + wherein R is H or C 1-4 alkyl.
  • A is selected from the group consisting of H, a linear C 15-18 alkyl group and a linear C 15-18 alkenyl group;
  • B is selected from the group consisting of H, -NH 2 , a linear C 15-18 alkyl group and a linear C 15-18 alkenyl group;
  • Q is selected from the group consisting of H, -OH, a linear C 15-18 alkyl group and a linear C 15-18 alkenyl group, and -NR 3 + wherein R is H or a C 1-4 alkyl group;
  • the alkenyl group has 1-5 double bonds.
  • the alkenyl group in the A, B, Q of the compound structure, has 1-3 double bonds and is in the Z configuration.
  • the compound is selected from the formula:
  • A is selected from the group consisting of a linear C15-18 alkyl group and a linear C15-18 alkenyl group;
  • B is selected from the group consisting of a linear C15-18 alkyl group and a linear C15-18 alkenyl group;
  • Q is selected from the group consisting of H, -OH, a linear C15-18 alkyl group and a linear C15-18 alkenyl group, and -NR3+, wherein R is H or a methyl group; and L3 is -C(O)O-.
  • the compound is lysolecithin, ceramide, diglyceride, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, triglyceride, monogalactosyldiglyceride, (neuro)sphingosine, phosphatidyl Ethanol, monoacylglycerol, fatty acid, platelet activating factor, or dimethylphosphatidylethanolamine.
  • the compound is a lipid as shown in Table 1.
  • the compound is No. 11, No. 12, No. 41, No. 71, No. 38, No. 64, No. 40, No. 37, No. 39, No. 60, 62, 33, 35, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 , No. 51, No. 52, No. 53, No. 54, No. 55, No. 56, No. 57, No. 58, No. 59, No. 61, No. 65, No. 66, No. Lipids shown in No. 67, No. 68, No. 69, or No. 70.
  • a second aspect of the present application relates to the use of a combination comprising any one or more of the above compounds, preferably selected from any one or more of the lipids of Table 1, for the preparation of a reagent for nucleic acid delivery.
  • the composition comprises No. 11, No. 12, No. 41, No. 71, No. 38, No. 64, No. 40, No. 37, No. 39, No. 60 in Table 1.
  • a third aspect of the present application relates to the use of a Chinese medicine in the preparation of a reagent for nucleic acid delivery.
  • the traditional Chinese medicine is selected from the group consisting of Rhodiola, dandelion, honeysuckle or andrographis paniculata.
  • the agent contains a compound that is extracted from a traditional Chinese medicine.
  • the agent contains any one or more of the above compounds, preferably selected from any one or more of the lipids of Table 1.
  • the reagent comprises No. 11, No. 12, No. 41, No. 71, No. 38, No. 64, No. 40, No. 37, No. 39, No. 60 in Table 1, Or No. 62, No. 33, No. 35, No. 42, No. 43, No. 44, No. 45, No. 46, No. 47, No. 48, No. 49, No. 50, No.
  • the compound is extracted by decoction preparation of a traditional Chinese medicine.
  • the compound is concentrated by immersing the traditional Chinese medicine piece in water, followed by vigorously boiling and weakly boiling, and then decoction of the traditional Chinese medicine liquid, and then sequentially adding chloroform-methanol, chloroform and water. Stirring treatment, obtained by taking a chloroform layer.
  • the compound has the structure shown in any of the preceding.
  • the compound is selected from the group consisting of lysolecithin, ceramide, diglyceride, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, triglyceride, monogalactosyldiglyceride, (neuro)sphingosine, Phosphatidyl alcohol, monoacylglycerol, fatty acid, platelet activating factor, or dimethylphosphatidylethanolamine.
  • said delivering comprises in vitro cell delivery, or in vivo gastrointestinal delivery.
  • the use further comprises preparing a lipid nucleic acid mixture.
  • the lipid nucleic acid mixture is prepared by a boiled process, or by reverse evaporation, or by direct mixing.
  • the boiling temperature is prepared at a temperature of from about 25 ° C to about 100 ° C, preferably from about 80 ° C to about 100 ° C, and the reverse evaporation method is prepared at a temperature of from about 25 ° C to about 70 ° C, preferably About 55 ° C.
  • a fourth aspect of the present application relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the compound of the structure described in any of the foregoing and a nucleic acid.
  • the pharmaceutical composition contains any one or more of the above compounds, preferably selected from any one or more of the lipids of Table 1.
  • the pharmaceutical composition comprises No. 11, No. 12, No. 41, No. 71, No. 38, No. 64, No. 40, No. 37, No. 39, No. 60 in Table 1.
  • the lipid and nucleic acid are at least partially or wholly in the form of a mixture of lipid nucleic acids.
  • the lipid nucleic acid mixture is prepared by a boiled process, or by reverse evaporation, or by direct mixing.
  • the boiling temperature is from 25 ° C to about 100 ° C, preferably from about 80 ° C to about 100 ° C
  • the preparation temperature of the reverse evaporation method is from about 25 ° C to about 70 ° C, preferably about 55 ° C.
  • a fifth aspect of the present application relates to a kit combination comprising the lipid according to the foregoing and a nucleic acid, wherein the lipid and the nucleic acid are each independently provided in a first container and a second container, the first container Same or different from the second container.
  • the kit combination contains any one or more of the above compounds, preferably any one or more lipids selected from Table 1.
  • the package combination includes No. 11, No. 12, No. 41, No. 71, No. 38, No. 64, No. 40, No. 37, No. 39, No. 60 in Table 1. Or 62, 33, 35, 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , No. 51, No.
  • the lipid and the nucleic acid are at least partially or fully formulated into a lipid nucleic acid complex immediately prior to use.
  • the method of formulating the lipid nucleic acid complex is prepared by boiling, or by reverse evaporation, or by direct mixing.
  • the boiling temperature is from about 25 ° C to about 100 ° C, preferably about 100 ° C, and the reverse evaporation method is from about 25 ° C to about 70. °C, preferably about 55 °C.
  • a sixth aspect of the present invention relates to a method of delivering a nucleic acid to a target cell, comprising providing the nucleic acid in the form of a pharmaceutical composition according to any of the preceding claims or a combination according to any of the preceding claims.
  • a seventh aspect of the present invention relates to a method of in vivo delivery of a nucleic acid to a subject in need thereof, wherein the pharmaceutical composition according to any of the preceding claims or the kit combination of any of the foregoing is provided Said nucleic acid.
  • the subject in the above method, is a human or an animal, such as a mammal.
  • the nucleic acid is delivered in vivo to the blood circulation of the subject or to the target tissue/cell.
  • the above method comprises directly delivering the pharmaceutical composition of any of the preceding or the combination of any of the preceding combinations to the subject in need thereof through the digestive tract.
  • nucleic acid and lipid are formulated for topical and/or injection administration.
  • nucleic acid and lipid are formulated for administration via the digestive tract, via the respiratory tract and/or by injection.
  • nucleic acid and lipid are formulated for oral, inhalation and/or injection administration.
  • nucleic acid is a small RNA
  • nucleic acid has a stem-loop structure
  • RNA is 14-32 bp in length, 18-24 bp in length, for example, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 bp.
  • the pharmaceutical composition or kit combination or compound may be orally administered.
  • the nucleic acid can be used to treat a disease, such as a heart, spleen, kidney, stomach, lung, and/or intestinal disease, such as a cancer, such as gastric cancer or lung cancer.
  • a disease such as a heart, spleen, kidney, stomach, lung, and/or intestinal disease, such as a cancer, such as gastric cancer or lung cancer.
  • lipids Nos. 1 & 2, 11 & 12, or 36 & 37 can represent lipids Nos. 1 and 2, 11 and 12, or 36 and 37, respectively, in which the lipids work.
  • concentrations are shown in Table 1 and in the examples.
  • the present application also provides a compound having the structure of the formula, a combination or composition comprising the same, and a method of using the compound or combination or composition to deliver a nucleic acid, and the compound or combination or composition for preparation for nucleic acid delivery Use of reagents:
  • L 1 , L 2 , L 3 are absent, or L 1 , L 2 , L 3 are each independently selected from -C(O)O-CH 2 -, -CH(OH)-, -CH 2 -OC(O )-,-C(O)O-,-C(O)NH-;
  • the dash “-" on the left side is connected to the central carbon atom, and the dash “-" on the right side is connected to Q;
  • A, B, and Q are each independently selected from the group consisting of H, -OH, C 1-20 alkyl, C 1-20 alkenyl, -NH 2 , and -NR 3 + , and R is H or C 1-6 alkyl.
  • the compound can have the structure:
  • A is selected from a linear C 10-20 alkyl group and a linear C 10-20 alkenyl group
  • B is selected from the group consisting of a linear C 10-20 alkyl group and a linear C 10-20 alkenyl group;
  • A is selected from a linear C 15-20 alkyl group and a linear C 15-20 alkenyl group
  • B is selected from the group consisting of a linear C 15-20 alkyl group and a linear C 15-20 alkenyl group;
  • A is selected from a linear C 15-18 alkyl group and a linear C 15-18 alkenyl group
  • B is selected from the group consisting of a linear C 15-18 alkyl group and a linear C 15-18 alkenyl group;
  • the compound in another embodiment, can have the structure:
  • A is selected from a linear C 10-20 alkyl group and a linear C 10-22 alkenyl group
  • B is selected from the group consisting of a linear C 10-20 alkyl group and a linear C 10-22 alkenyl group;
  • Q is selected from a linear C 10-20 alkyl group and a linear C 10-22 alkenyl group
  • A is selected from a linear C 15-18 alkyl group and a linear C 15-22 alkenyl group
  • B is selected from the group consisting of a linear C 15-18 alkyl group and a linear C 15-22 alkenyl group;
  • Q is selected from the group consisting of a linear C 15-18 alkyl group and a linear C 15-22 alkenyl group;
  • A is selected from a linear C 15-18 alkyl group and a linear C 15-20 alkenyl group
  • B is selected from the group consisting of a linear C 15-18 alkyl group and a linear C 15-20 alkenyl group;
  • Q is selected from the group consisting of a linear C 15-18 alkyl group and a linear C 15-20 alkenyl group.
  • the compound in another embodiment, can have the structure:
  • A is selected from a linear C 10-20 alkyl group and a linear C 10-20 alkenyl group
  • B is selected from the group consisting of a linear C 10-20 alkyl group and a linear C 10-20 alkenyl group;
  • A is selected from a linear C 15-20 alkyl group and a linear C 15-18 alkenyl group
  • B is selected from the group consisting of a linear C 15-18 alkyl group and a linear C 15-18 alkenyl group;
  • A is a linear C 15-20 alkyl group
  • B is a linear C 15-18 alkyl group
  • the compound can have the structure:
  • A is selected from a linear C 10-20 alkyl group and a linear C 10-20 alkenyl group
  • A is selected from a linear C 10-20 alkyl group and a linear C 15-18 alkenyl group
  • A is a linear C 15-20 alkyl group
  • the compound can be a compound as described above.
  • the compound or extract or composition may be synthetic or naturally occurring or extracted from a traditional Chinese medicine.
  • nucleic acid delivery is nucleic acid delivery to a cell or organ.
  • the organ is selected from the group consisting of heart, spleen, kidney, stomach, lung, and intestine.
  • the highly efficient targeted delivery of the nucleic acid can be significantly improved, and the nucleic acid liposome in the prior art has the advantages of low encapsulation efficiency, poor safety, poor stability, complicated preparation process, and product inconsistency. It is difficult to reproduce, and the defects of targeting need to be further improved.
  • Table 1-1 List of 69 lipids from Chinese medicine sources
  • a single dash “-” indicates a single bond
  • a double dash indicates a double bond.
  • a single dash or double dash
  • a C1-C6 alkoxycarbonyloxy group and an -OC(O)OC1-C6 alkyl group indicate the same functional group.
  • Alkyl means a straight or branched saturated hydrocarbon chain. As described herein, an alkyl group has 1 to 20 carbon atoms (ie, a C1-20 alkyl group), 1 to 8 carbon atoms (ie, a C1-8 alkyl group), and 1 to 6 carbon atoms (ie, C1). -6 alkyl), or 1 to 4 carbon atoms (ie, C1-4 alkyl). In one embodiment, the alkyl group is a C10-20 alkyl group. In one embodiment, the alkyl group is a C15-20 alkyl group. In one embodiment, the alkyl group is a C15-18 alkyl group, ie a C15, C16, C17, C18 alkyl group.
  • Alkenyl means a bond comprising at least one carbon-carbon double bond and having 2 to 20 carbon atoms (ie, C2-20 alkenyl), 2 to 8 carbon atoms (ie, C2-8 alkenyl), 2 to An aliphatic group of 6 carbon atoms (i.e., C2-6 alkenyl) or 2 to 4 carbon atoms (i.e., C2-4 alkenyl).
  • the alkenyl group is a C10-20 alkenyl group.
  • the alkenyl group is a C15-20 alkenyl group.
  • the alkenyl group is a C15-18 alkenyl group, ie a C15, C16, C17, C18 alkenyl group.
  • Heteroalkyl and “heteroalkenyl” mean, respectively, alkyl and alkenyl as defined above, wherein one or more carbon atoms are each independently replaced by the same or different heteroatom groups.
  • 1, 2 or 3 carbon atoms may be independently replaced by the same or different hetero atom groups.
  • Heteroatom groups include, but are not limited to, -NR1-, -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, and the like, wherein R1 is H, alkyl.
  • Examples of heteroalkyl groups include -OCH3, -CH2OCH3, -SCH3, -CH2SCH3, -NR1CH3, and -CH2NR1CH3, wherein R1 is hydrogen, alkyl.
  • the reverse evaporation method described in the present application refers to adding an aqueous solution of a nucleic acid to a lipid organic solvent solution, ultrasonically, and steaming to remove the organic solvent, and then hydrating to obtain a mixture of the lipid and the nucleic acid.
  • the boiled method (also referred to as heating method) described in the present application refers to adding an organic solvent solution of a lipid to an aqueous solution of a nucleic acid and boiling at about 100 ° C for 30 minutes to obtain a mixture of a lipid and a nucleic acid; the method is not limited thereto.
  • the boiling temperature rise can also be achieved by other means of raising or heating as is known in the art.
  • Reverse evaporation and boiling are carried out under controlled temperature and mixing conditions. Suitable processing times, and temperatures can be readily determined by one skilled in the art.
  • the temperature of the reverse evaporation method preferably ranges from about 25 ° C to about 70 ° C, more preferably from about 30 ° C to about 65 ° C, and still more preferably from about 40 ° C to about 60 ° C, especially about 55 ° C.
  • the boiling temperature range is preferably from about 25 ° C to about 100 ° C, more preferably from about 50 ° C to about 100 ° C, and still more preferably from about 95 ° C to about 100 ° C, particularly preferably from about 80 ° C to 100 ° C.
  • Nucleic acids as described herein include DNA and RNA, preferably small RNAs, for example, the small RNA may be 14-32 bp, 16-28 bp, 18-24 bp in length, and in particular may be 14, 15, 16, 17, 18 in length. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 bp.
  • Figure 1 The effect of lipids on nucleic acid (HJT-sRNA-m7) uptake and entry into cells (human gastric cancer cell line NCI-N87) (reverse evaporation method).
  • Figure 2 27 lipid monomers promote nucleic acid entry into the MRC-5 cell line (reverse evaporation method).
  • Figure 3 23 lipid monomers promote nucleic acid entry into the MRC-5 cell line (boiled).
  • Figure 4 23 lipid monomers promote nucleic acid entry into the A549 cell line (boiled).
  • Figure 5 Lipid combination promotes entry of nucleic acids into the MRC-5 cell line (reverse evaporation method).
  • Figure 7 Lipid combination promotes entry of nucleic acids into the MRC-5 cell line (boiled).
  • FIG. 8 Lipid combination promotes entry of nucleic acids into the A549 cell line (boiled).
  • Figure 9 Different types of lipid combinations promote nucleic acid entry into the Caco-2 cell line (reverse evaporation method).
  • Figure 10 Different types of lipid combinations promote nucleic acid entry into the Caco-2 cell line (boiled).
  • FIG. 11A-C Lipid monomers (#11 and #12) promote the entry of nucleic acids of different sequences into different cells.
  • Figure 12 Fluorescence in situ hybridization experiments indicate that nucleic acids enter the cytosol with the aid of lipid monomer delivery.
  • Figure 13 Lipid monomers (#11 and #12) promote nucleic acid entry into cells, targeting the 3' UTR region of the gene.
  • Figure 14 Lipid monomers (#11 and #12) promote nucleic acids into the blood and lungs through the digestive tract.
  • Figure 15 The lipid composition prepared by the reverse evaporation method and the boiling method facilitates the entry of nucleic acids into the blood and lungs through the digestive tract.
  • Figure 16 Different classes of lipid combinations deliver single-stranded nucleic acids into MRC-5.
  • Lipid combination delivers single-stranded nucleic acids into MRC-5 or Caco-2 cells.
  • FIG. 18A-C Lipid combination delivers single-stranded nucleic acids into cells.
  • 19A-C Lipid combination delivers single-stranded nucleic acids into cells.
  • Lipid combination delivers single-stranded nucleic acids into cells.
  • FIG. 21 Lipid combination delivers single-stranded nucleic acids into A549 cells.
  • FIG. 22 Lipid combination delivers single-stranded nucleic acids into A549 cells.
  • FIG. 23 Lipid combination delivers single-stranded nucleic acids into A549 cells.
  • FIG. 24 Lipid combination delivers single-stranded nucleic acids into A549 cells.
  • FIG. 25 Lipid combination delivers single-stranded nucleic acids into A549 cells.
  • FIG. 26 Lipid combination delivers single-stranded nucleic acids into A549 cells.
  • FIG. 27 Lipid combination delivers single-stranded nucleic acids into A549 cells.
  • FIG. 28 Lipid combination delivers single-stranded nucleic acids into A549 cells.
  • FIG. 29 Lipid combination delivers single-stranded nucleic acids into A549 cells.
  • FIG. 30 Lipid combination delivers single-stranded nucleic acids into A549 cells.
  • FIG. 31 Lipid combination delivers single-stranded nucleic acids into A549 cells.
  • FIG. 32 Lipid combination delivers single-stranded nucleic acids into A549 cells.
  • Figure 33 Lipid combination delivery of double stranded nucleic acids into MRC-5 cells.
  • Figure 34 Lipid combination delivers double stranded nucleic acid into MRC-5 cells.
  • Figure 35 Lipid combination delivery of double stranded nucleic acids into A549 cells.
  • Figure 36 Lipid combination delivery of double stranded nucleic acids into A549 cells.
  • Figure 37 Lipid combination delivery of double stranded nucleic acids into A549 cells.
  • Figure 38 Lipid combination delivery of double stranded nucleic acids into A549 cells.
  • Figure 39 Lipid combination delivers double stranded nucleic acid into A549 cells.
  • Figure 40 Lipid combination delivers double stranded nucleic acid into A549 cells.
  • Figure 41 Lipid combination delivers double stranded nucleic acid into A549 cells.
  • Figure 42 Lipid combination delivers double stranded nucleic acid into A549 cells.
  • Figure 43 Lipid combination delivery of double stranded nucleic acids into MRC-5 cells.
  • Figure 44 Lipid combination delivery of double stranded nucleic acids into MRC-5 cells.
  • Figure 45 Lipid combination delivery of double stranded nucleic acid into MRC-5 cells.
  • Figure 46 Lipid combination delivery of double stranded nucleic acids into MRC-5 cells.
  • Figure 47 Lipid combination delivery of double stranded nucleic acids into MRC-5 cells.
  • Figure 48 Lipid combination delivers double stranded nucleic acid into MRC-5 cells.
  • Figure 49 Lipid combination delivery of double stranded nucleic acids into MRC-5 cells.
  • Figure 50 Lipid combination promotes entry of nucleic acids into the lungs through the digestive tract.
  • the lipid mixture mediates XRN2 siRNA entry into A549 cells to inhibit gene expression (boiled).
  • the lipid mixture can effectively deliver nucleic acids into cells to function.
  • PE No. 38
  • LPC LPC
  • the anti-fibrotic small RNA HJT-sRNA-3, HJT-sRNA-a2, HJT-sRNA-h3, and HJT-sRNA-m7 are introduced into MRC-5 cells (boiled method).
  • Lipid 41 delivers double-stranded RNA into A549 cells by various methods of preparation (either boiled or reverse evaporation).
  • Lipid 41 delivers double-stranded RNA into MRC-5 cells by various methods of preparation (either boiled or reverse evaporation).
  • Figure 78 Lipid 41 delivers single-stranded RNA into A549 and MRC-5 cells by boiling.
  • Figure 79 Digital PCR (ddPCR) technology detects lipid delivery nucleic acid efficiency.
  • Figure 80 Flow cytometry detects lipid delivery nucleic acid efficiency.
  • Figure 81 Confocal fluorescence microscopy to observe the localization of lipid delivery nucleic acids in cells.
  • Figure 82 The efficiency of the Western Blotting assay for detecting lipid delivery nucleic acids.
  • Figure 83 Lipid monomer No. 41 mediates anti-fibrotic HJT-sRNA-m7 entry into MRC-5 cells (boiled).
  • Lipid 38 delivers double-stranded RNA into A549 cells and MRC-5 cells by boiling.
  • Lipid 38 delivers single-stranded RNA into A549 cells and MRC-5 cells by boiling.
  • Figure 93 Digital PCR (ddPCR) technology detects lipid delivery nucleic acid efficiency.
  • Figure 94 Flow cytometry detects lipid delivery nucleic acid efficiency.
  • Figure 95 Confocal fluorescence microscopy to observe the localization of lipid delivery nucleic acids in cells.
  • Lipid 64 delivers double-stranded RNA into A549 cells by different methods of preparation (either boiled or reverse evaporation).
  • Figure 97 Flow cytometry detects lipid delivery nucleic acid efficiency.
  • Figure 98 Confocal fluorescence microscopy to observe the localization of lipid delivery nucleic acids in cells.
  • Lipid 40 delivers dsRNA into A549 cells by different methods of preparation (either boiled or reverse evaporation).
  • Figure 100 Digital PCR (ddPCR) technology detects lipid delivery nucleic acid efficiency.
  • Figure 101 Confocal fluorescence microscopy to observe the localization of lipid-delivering nucleic acids in cells
  • Figure 102 The efficiency of the Western Blotting assay for detecting lipid delivery nucleic acids.
  • Lipid 37 delivers single-stranded RNA into A549 cells and MRC-5 cells by boiling.
  • Lipid 39 delivers double-stranded RNA into A549 cells by different methods of preparation (either boiled or reverse evaporation).
  • Figure 105 Digital PCR (ddPCR) technology detects lipid delivery nucleic acid efficiency.
  • Lipid 60 delivers double-stranded RNA into A549 cells by different methods of preparation (either boiled or reverse evaporation).
  • Lipid 62 delivers double-stranded RNA into A549 cells by different methods of preparation (either boiled or reverse evaporation).
  • Lipid 41 promotes the entry of small RNA into the bloodstream, protecting it from degradation in the blood.
  • Lipid 41 promotes the entry of small RNA into the stomach cells, protecting them from degradation in the stomach.
  • Lipid 41 promotes the entry of small RNA into the small intestine cells, protecting them from degradation in the small intestine.
  • Figure 111 Lipid 41 promotes the entry of small RNA into the liver, protecting it from degradation in the liver.
  • PE monomer (No. 38) can effectively deliver sRNA single-stranded nucleic acids orally into mouse blood.
  • PE monomer (No. 40) is effective for oral delivery of sRNA single-stranded nucleic acids into mouse blood.
  • PE monomer (No. 64) is effective for oral delivery of sRNA single-stranded nucleic acids into mouse blood.
  • PE monomer (No. 71) is effective for oral delivery of sRNA single-stranded nucleic acids into mouse blood.
  • Figure 116 Lipids efficiently deliver single-stranded nucleic acids into MRC5 cells at different temperature gradients.
  • FIG. 117a-c Lipid No. 33 was orally delivered into the blood, into the heart and into the kidney.
  • FIG 118a-b Lipid No. 35 is orally delivered into the heart and into the kidney.
  • Figure 119 Lipid No. 37 oral delivery of small RNA into the intestine.
  • Figure 120a-b Lipid No. 42 orally delivers small RNA into the spleen and into the kidney.
  • Figure 121a-b Lipid No. 43 oral delivery of small RNA into the heart and into the intestine.
  • Figure 122a-b Lipid No. 44 orally delivers small RNA into the spleen and into the intestine.
  • Lipid No. 45 is orally delivered with small RNA into the heart, into the spleen, into the kidney, and into the intestine.
  • Figures 124a-d Lipid No. 46 orally delivers small RNA into the blood, into the heart, into the kidney, and into the intestine.
  • Figure 125a-c Lipid No. 47 orally delivers small RNA into the blood, into the heart and into the intestine.
  • Figure 126a-c Lipid No. 48 was orally delivered into the blood, into the heart and into the kidney.
  • Figure 127a-c Lipid No. 49 was orally delivered into the blood, into the heart and into the spleen.
  • Figures 128a-c Lipid No. 50 orally delivers small RNA into the blood, into the heart and into the spleen.
  • Figure 129a-b Lipid No. 51 orally delivers small RNA into the blood and into the heart.
  • Figure 130a-b Lipid No. 52 orally delivers small RNA into the blood and into the heart.
  • Figure 131a-c Lipid No. 53 orally delivers small RNA into the blood, into the heart and into the kidney.
  • Figure 132a-b Lipid No. 54 orally delivers small RNA into the blood and into the kidney.
  • Figure 133a-c Lipid No. 55 orally delivers small RNA into the blood, into the heart and into the kidney.
  • Figure 134a-b Lipid No. 56 orally delivers small RNA into the blood and into the heart.
  • Figure 135 Lipid No. 57 orally delivered small RNA into the kidney.
  • Figure 136a-b Lipid No. 58 orally delivered small RNA into the heart and into the intestine.
  • Figure 137 Lipid No. 59 was orally delivered with small RNA into the intestine.
  • Figure 138 Lipid No. 60 oral delivery of small RNA into the intestine.
  • Figures 139a-c Lipid No. 61 orally delivered small RNA into the heart, into the kidney, and into the intestine.
  • Figure 140 Lipid No. 62 orally delivers small RNA into the intestine.
  • Figure 141a-b Lipid No. 65 orally delivers small RNA into the kidney and into the intestine.
  • Figure 142a-c Lipid No. 66 orally delivers small RNA into the blood, into the heart and into the intestine.
  • FIG. 143a-c Lipid No. 67 was orally delivered with small RNA into the heart, into the spleen and into the intestine.
  • Figure 144a-c Lipid No. 68 was orally delivered with small RNA into the heart, into the spleen and into the intestine.
  • Figure 145a-b Lipid No. 69 oral delivery of small RNA into the spleen and kidney.
  • Figure 146a-b Lipid No. 70 by oral delivery of small RNA into the heart and into the spleen.
  • the present application extracts the fat-soluble components of traditional Chinese medicines (including Rhodiola crenulata, Taraxacum mongolicum, Andrographis paniculata and Lonicera japonica) by Bligh&Dyer method, and identifies the lipids by HPLC-MS/MS.
  • Qualitative components 138 lipid species were identified, 125 cationic species, 13 anionic models), 71 of them (see Table 1-1 to Table 1-3) were used for the preparation of lipid nucleic acid mixtures, and their energy was observed. Whether to promote cell absorption and entry of exogenous nucleic acids.
  • the lipids used in the present application are commercially or commercially synthesized, and are not directly extracted from traditional Chinese medicines.
  • lipid nucleic acid complexes that effectively promote cellular uptake and entry of nucleic acids (see Figures 1-116), and are expected to increase the efficiency of clinical delivery of nucleic acid drugs.
  • Further studies have shown that the lipid nucleic acid mixtures of the present application promote the efficiency of nucleic acid uptake and entry into cells on different cell lines, but differ in different cell lines (see Figure 1-10), which provides for drug targeted delivery. The possibility.
  • the nucleic acid delivery of such a lipid nucleic acid complex does not have sequence selectivity, and it is possible to deliver a nucleic acid fragment of a different sequence corresponding to a small RNA size (for example, about 20 bp) (see Fig.
  • FISH Fluorescence in situ hybridization
  • the lipids of the present application are capable of promoting the entry of nucleic acids, such as sRNA, into cells and modulating (e.g., inhibiting) the expression of their target sequences, while not exhibiting such regulatory effects on non-target sequences, indicating their targets.
  • Specific regulation can be used as a means of delivery of nucleic acid drugs (see Figure 13).
  • the application provides a compound for extracting nucleic acid extracted from a traditional Chinese medicine, wherein the compound is selected from the group consisting of lysolecithin, ceramide, diglyceride, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, triglyceride Monogalactosyldiglyceride, (neuro)sphingosine, phosphatidylethanol, monoacylglycerol, fatty acid, platelet activating factor, or dimethylphosphatidylethanolamine are preferably the lipids shown in Table 1. In one embodiment, the lipid is non-natural, such as synthetic, or fermentatively produced.
  • the lipid is for delivery of a nucleic acid into a target cell. In another embodiment, the lipid is used to deliver a nucleic acid into a subject in need thereof, into its blood circulation and/or target site/cell.
  • the lipid is selected from the group consisting of phosphatidylcholine, such as 1-stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC (18:0/18:2) ), ie No. 11 lipid in Table 1), and 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC (16:0/18:2), ie, Table 1 No. 12 lipid).
  • PC 1-stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • PC (16:0/18:2) 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • the lipid may be the No. 41 lipid in Table 1, ie, dihydrosphingosine (d22:0), which is capable of efficiently encapsulating nucleic acids or promoting entry of nucleic acids into cells.
  • the application provides a pharmaceutical composition comprising the above lipids and nucleic acids, preferably the nucleic acid is a small RNA.
  • the pharmaceutical compositions of the present application may be formulated for non-invasive administration (eg, topical administration) and/or injection administration, for example, for administration via the digestive tract, transgastric, and/or injection, eg, orally. Inhaled and/or administered by injection.
  • non-invasive administration eg, topical administration
  • injection administration for example, for administration via the digestive tract, transgastric, and/or injection, eg, orally.
  • Inhaled and/or administered by injection eg, it is preferred to use an invasive route of administration (eg, administration by injection, including intramuscular, subcutaneous, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intra-target injection); in other cases, non-invasive use is preferred.
  • invasive route of administration eg, administration by injection, including intramuscular, subcutaneous, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intra-target injection
  • non-invasive use is preferred. Route of administration.
  • lipids and nucleic acids in the pharmaceutical compositions of the present application can be formulated as a mixture of lipid nucleic acids.
  • a method for preparing a plurality of different lipid nucleic acid mixtures has been widely disclosed, and a preparation scheme of a suitable lipid nucleic acid complex can be selected according to actual needs.
  • the present application provides a kit comprising the lipids and nucleic acids described herein, wherein the lipids and nucleic acids are each independently provided in a first container and a second container, The first container and the second container may be the same or different.
  • the lipid and the nucleic acid are at least partially or fully formulated into a lipid nucleic acid complex just prior to use.
  • the application provides a method of delivering a nucleic acid into a target tissue/cell, wherein the nucleic acid is provided in the form of a pharmaceutical composition or kit combination as described herein.
  • the present application provides a method of delivering a nucleic acid in vivo to a subject in need thereof, wherein the nucleic acid is provided in the form of a pharmaceutical composition or kit combination as described herein, for example, the nucleic acid In vivo delivery into the blood circulation of the subject or in target tissues/cells, for example wherein the lipid and the nucleic acid are administered by non-invasive administration (eg, topical administration) and/or injection, eg, via the digestive tract, transgas And/or administration by injection, for example oral, inhalation and/or injection.
  • non-invasive administration eg, topical administration
  • injection eg, via the digestive tract, transgas And/or administration by injection, for example oral, inhalation and/or injection.
  • the present application provides a method of preventing and/or treating a disease/condition that can be prevented and/or treated with a nucleic acid, comprising providing a pharmaceutical composition described herein or a subject in need thereof Suit combinations, for example wherein the lipid and the nucleic acid are administered by non-invasive administration (e.g., topical administration) and/or injection, for example, via the digestive tract, via the respiratory tract and/or injection, such as oral, inhalation, and/or injection.
  • non-invasive administration e.g., topical administration
  • injection for example, via the digestive tract, via the respiratory tract and/or injection, such as oral, inhalation, and/or injection.
  • non-invasive modes of administration eg, via the digestive tract, through the respiratory tract, including oral, gavage, inhalation, etc.
  • the application provides a method of preparing a pharmaceutical composition or combination of the foregoing, and the use of a pharmaceutical composition and/or kit combination for use in the methods described in the above aspects. Lipids, pharmaceutical compositions and/or kit combinations for use in the various methods described above are also provided.
  • the nucleic acid may be a small RNA, for example, the small RNA may be 14-32 bp, 16-28 bp, 18-24 bp in length, and specifically, the length may be 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 bp.
  • the small RNAs described herein may be single-stranded, for example, linked by a stem-loop structure, or may be double-stranded.
  • the nucleic acid described herein can be HJT-sRNA-m7 having the sequence: ugagguagua gguugugugg uuguaagc.
  • a pharmaceutical composition or kit combination or compound of the present application can be used to treat a disease, such as a heart, spleen, kidney, stomach, lung, and/or intestinal disease, such as a cancer, such as gastric cancer, lung cancer, and the like.
  • a disease such as a heart, spleen, kidney, stomach, lung, and/or intestinal disease
  • a cancer such as gastric cancer, lung cancer, and the like.
  • the pharmaceutical composition or kit combination or compound of the present application can be used for treatment in vitro or in vivo, for example, inhibition of NCI-N87 cells (gastric cancer cells), MRC-5 cells (lung fibroblasts), A549 Growth of cells (lung cancer cells).
  • a lipid nucleic acid mixture can be obtained in a variety of ways, such as a reverse evaporation process or a boiled process.
  • a reverse evaporation method an aqueous solution of the nucleic acid is added to the lipid organic solvent solution, ultrasonically, and steamed to remove the organic solvent, and then hydrated to obtain a mixture of the lipid and the nucleic acid.
  • the boiled method described in the present application means that an organic solvent solution of a lipid is added to an aqueous solution of a nucleic acid, and boiled at about 100 ° C for 30 minutes to obtain a mixture of a lipid and a nucleic acid.
  • Reverse evaporation and boiling are carried out under controlled temperature and mixing conditions. Suitable processing times and temperatures can be readily determined by one skilled in the art.
  • the temperature of the reverse evaporation method preferably ranges from about 25 ° C to about 70 ° C, more preferably from about 30 ° C to about 65 ° C, more preferably from about 40 ° C to about 60 ° C, particularly preferably about 55 ° C.
  • the temperature of the boiling (also referred to as heating) is preferably from about 25 ° C to about 100 ° C, more preferably from about 50 ° C to about 100 ° C, more preferably from about 95 ° C to about 100 ° C, particularly preferably about 100 ° C.
  • Instrument Ultimate 3000; column: Kinetex C18 (100 ⁇ 2.1 mm, 1.9 ⁇ m); column temperature: 45 ° C; mobile phase: A: acetonitrile: water (V / V, 60: 40), solution containing 10mmol / L formic acid Ammonium, mobile phase B: acetonitrile: isopropanol (10:90, V/V), solution containing 10 mmol/L ammonium formate and 0.1% formic acid. Flow rate: 0.4 mL/min; injection amount: 4 ⁇ L.
  • Negative mode Heater Temp 300°C, Sheath Gas Flow rate, 45arb, Aux Gas Flow Rate, 15arb, Sweep Gas Flow Rate, 1arb, spray voltage, 2.5KV, Capillary Temp, 350°C, S-Lens RF Level, 60 %.Scan ranges: 200-1500.
  • the lipid components were identified by HPLC-MS/MS, and 138 kinds of lipid components derived from traditional Chinese medicine were identified, among which 125 were identified by cationic mode and 13 by anionic mode.
  • the following experiment was carried out by taking the compounds 1-32 shown in Table 1.
  • the concentration of ether in the 6/15/16/17/31 lipid group was 0.0035714 mg/mL; the lipid solution was added to a DEPC-treated aqueous solution (15 nmol) of 120 ⁇ l of HJT-sRNA-m7 single-stranded RNA in a volume ratio of 5:1. After 3 minutes of sonication, the ether was removed by evaporation at 55 ° C, and then 600 ⁇ l of DEPC-treated water was added to obtain a HJT-sRNA-m7 lipid mixture.
  • lipid chloroform solution 60 ⁇ l of a lipid chloroform solution was prepared and grouped according to the lipid number shown in Table 1, which was 1/2/4/9/14/18/19/20/21/22/23/24/25/
  • concentration of chloroform solution in the lipid group was 5 mg/mL in the 26/27/28/29/30/32 lipid group, and the concentration of the chloroform solution in the 3/8/10/11/12/13 lipid group was 10 mg/mL, 6/
  • concentration of chloroform solution in the 15/16/17/32 group was 1 mg/mL; the above lipid chloroform solution was mixed with 600 ⁇ l of HJT-sRNA-m7 (15 nmol) single-stranded RNA in DEPC treatment aqueous solution, and heated at 100 ° C for 30 min to obtain HJT. -sRNA-m7 lipid mixture.
  • NCI-N87 cells gastric cancer cells
  • MRC-5 cells lung fibroblasts
  • A549 cells lung cancer cells
  • MEM Eagle's MEM medium
  • A549 cells were cultured in Ham's F-12 medium (HyClone)
  • NCI-N87 cells were cultured in RPMI-1640 medium. (HyClone); overnight incubation at 37 ° C, after the cells were attached to the wall for subsequent experiments.
  • NC group refers to untreated cells; this group served as a negative control group.
  • RNAimax treatment group 2 ⁇ l RNAimax transfection reagent and HJT-sRNA-m7 solution were diluted with 100 ⁇ l opti-MEM medium, and the two were mixed and placed for 15min, then added to the cells and mixed, HJT-sRNA-m7 The final concentration was 200 nM; this group served as a positive control group.
  • HJT-sRNA-m7 solution (final concentration 200 nM) was directly added, and this group served as a negative control group.
  • Lipid nucleic acid mixture treatment group The lipid prepared in the step 2 and the HJT-sRNA-m7 mixture were added to the cells, mixed, and the final concentration of RNA was controlled to 200 nM.
  • RNA was washed 2-3 times with PBS, the cells were harvested with TRIzol lysate, total RNA was extracted, and the abundance of small RNAs entering the cells was detected by RT-qPCR, and fluorescence in situ hybridization was performed.
  • the method locates RNA; the steps of each detection method are as follows:
  • Reverse transcription of sRNA into cDNA by reverse transcription kit ( MicroRNA Reverse Transcription Kit, cat. no. 4366597), reverse transcription of sRNA into cDNA, reverse transcription system as follows: 100 mM dNTPs (with dTTP) 0.15 ⁇ l, MultiScribe TM reverse transcriptase, 50 U/ ⁇ L 1.00 ⁇ l, 10X RT buffer 1.5 Ll, RNase inhibitor (20U / ⁇ l) 0.19 ⁇ l, nuclease-free H 2 O 4.6 ⁇ l, mix and add 5 ⁇ l RNA template (200ng / ⁇ l), mix and add 3 ⁇ l 5xTaqman probe primer, mix and then transient The mixture was centrifuged, placed on ice for 5 min, and placed in a PCR reactor.
  • the reaction conditions were as follows: (1) 16 ° C, 30 min; (2) 42 ° C, 30 min; (3) 85 ° C, 5 min; (4) 4 ° C, the reaction was terminated. After the end of the reaction, 10 ⁇ l of RNase-free ddH 2 O was added to make up the final volume to 25 ⁇ l.
  • the Taqman probe primer used in this reverse transcription was synthesized by Invitrogen (U6: 4440887, HJT-sRNA-m7: 4398987).
  • Quantitative PCR amplification reaction the total volume of the qPCR reaction system is 10 ⁇ l, including: 5 ⁇ L 2 ⁇ Universal Master Mix II, with UNG, 0.5 ⁇ l 20x Taqman primer, 1 ⁇ l of cDNA obtained by reverse transcription, 3.5 ⁇ l of RNase-free dH 2 O.
  • the PCR reaction conditions were: 50 ° C for 2 min, 95 ° C, for 10 min pre-denaturation, began to enter the PCR amplification cycle: (1) 95 ° C, 15 s; (2) 60 ° C, 60 s; 3) 60 ° C, 60 s; a total of 40 cycles; the last 40 ° C for 10 s to cool down.
  • the Taqman probe for amplification was designed and synthesized by Invitrogen (U6: 4440887, HJT-sRNA-m7: 4398987)
  • Reverse transcription of sRNA into cDNA Reverse transcription of sRNA into cDNA by the stem-loop method by High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems, cat. no. 4368813)
  • the reverse transcription system was as follows: template RNA (150 ng/ul) 10 ⁇ l, 10 ⁇ RT buffer 2.0 ⁇ l, 25 ⁇ dNTP Mix (100 mM) 0.8 ⁇ l, U6RT stem-loop primer 2.0 ⁇ l, HJT-sRNA-m7 RT stem-loop primer 2.0 ⁇ l, MultiScribe TM reverse transcriptase 1.0 ⁇ l, RNA 1.0 l inhibitors, nuclease-free H 2 O 1.2 ⁇ l, after transient centrifugation, PCR instrument into the reaction, the reaction conditions are as follows: (1) 25 10min °C, ; (2 37 ° C, 120 min; (3) 85 ° C, 5 min; (4) 4 ° C, the reaction was terminated.
  • the stem-loop primer used in the reverse transcription process was synthesized by Beijing Qingke Xinye Biotechnology Co., Ltd. (U6RT primer: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAATATG; HJT-sRNA-m7 RT stem-loop primer: GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTACAA).
  • Quantitative PCR amplification reaction qPCR reaction system total volume 10 ⁇ l, including: 5 ⁇ L 2 ⁇ SYBR Green Master Mix, 0.5 ⁇ l forward primer (10 ⁇ M), 0.5 ⁇ l reverse primer (10 ⁇ M), 1 ⁇ l of cDNA obtained by reverse transcription, 3 ⁇ l of RNase-free dH 2 O.
  • the PCR reaction conditions were: 95 ° C, pre-denaturation for 5 min, and began to enter the PCR amplification cycle: (1) 95 ° C, 10 s; (2) 55 ° C, 10 s; (3) 72 ° C, 20s; a total of 40 cycles; the last 40 ° C for 10s to cool down.
  • the plates were placed in a hybridization cassette and pre-incubated for 1 h at room temperature in a hybridization buffer (50% formamide, 5 x SSC, 5 x Denharts, 250 ug/mL yeast RNA, 500 ug/mL herring sperm DNA).
  • a hybridization buffer 50% formamide, 5 x SSC, 5 x Denharts, 250 ug/mL yeast RNA, 500 ug/mL herring sperm DNA.
  • RNA probe HJT-sRNA-m7 probe: 5'-GCTTACAACCACACAACCTACTACCTCA-3', Scrambled probe: 5'-CAGTACTTTTGTGTAGTACAA-3', U6 probe: 5'-TTTGCGTGTCATCCTTGCG-3'
  • RNA probe concentration was 0.1-0.2 ng/ul
  • step 11 The pre-hybridization buffer of step 9) is removed, replaced with the hybridization buffer containing the RNA probe of step 10), placed in a hybridization cassette, and incubated overnight (12-16 hours) at 65 °C.
  • Figure 1-4 shows that the lipid nucleic acid mixture prepared by the reverse evaporation method can successfully deliver nucleic acid to NCI-N87, MRC-5 cells;
  • Figure 3-4 shows that the lipid nucleic acid complex prepared by boiling can be successful.
  • the nucleic acids are delivered to MRC-5 and A549 cells.
  • Figure 5-6 demonstrates that a mixture of lipid composition and nucleic acid prepared by reverse evaporation can successfully promote nucleic acid into target cells
  • Figure 7-8 demonstrates the lipid composition and nucleic acid prepared by boiling The mixture successfully promotes entry of nucleic acids into target cells.
  • Combination 1 No. 1-32 lipid combination, No. 1/2/3/4/6/8/9/10/13-32, lacking lipid #5, 7, 11, 12;
  • Combination 2 lack of lipid #29 compared to combination 1;
  • Combination 3 lack of lipid #1, 2, 3, 19 compared to combination 1;
  • Combination 4 lack of lipid #4,14 compared to combination 1;
  • Combination 5 lack of lipid #6,9,10,13,15,16,18,20-28,32 compared to combination 1;
  • Combination 6 lack of lipid #8 compared to combination 1;
  • Combination 7 lack of lipid #17, 30, 31 compared to combination 1;
  • DG combination lipid #1, 2, 3, 19 combination
  • TG combination lipid #6,9,10,13,15,16,18,20-28,32 combination;
  • PE group lipid #8
  • the experimental results are shown in Figures 9-10.
  • the results show that different types of lipid combinations (for example, a mixture of TG, a mixture of DG, etc.) can promote nucleic acid into target cells by different methods (boiling or reverse evaporation).
  • lipids #11 and #12 were selected for experiments to investigate the efficiency of lipid delivery to nucleic acid fragments of different sequences, as well as the localization of nucleic acids and targeted gene regions.
  • the experimental steps are as follows:
  • Soy lecithin Soybean PC
  • lipid #11 (18:0/18:2) and lipid #12 (16:0/18:2) were prepared by reverse evaporation method, with different small RNAs (see table below) 3)
  • A549 cell line was added (the final concentration of sRNA was 200 nM); the negative control group (control) was directly added with the same concentration of sRNA; the positive control group (RNAimax) was transfected with Lipofectamine RNAimax (6 ⁇ l/well transfection reagent).
  • the abundance of sRNA in the cells was detected by Taqman probe, and the relative expression of sRNA was calculated by 2- ⁇ Ct method.
  • FIG. 11A-C show that both lipids (lipid #11 (18:0/18:2) and lipid #12 (16:0/18:2)) can effectively promote various kinds of comparisons compared with the control.
  • Different sequences of nucleic acid molecules enter a variety of cells;
  • Figure 12 shows that nucleic acids enter the cytoplasm and are primarily localized under lipid #11 (18:0/18:2) and lipid #12 (16:0/18:2) delivery.
  • the inventors unexpectedly discovered that both lipids #11 and #12 promote the entry of small fragment nucleic acids and act on the wild-type 3'UTR of their target genes, reducing the wild-type of the target gene.
  • Lipid Nucleic Acid Mixture Refer to Steps 2.1-2.2, Prepare Lipid #11, Mixture of Lipid #12 and Nucleic Acid, and Lipid #1/2/4/9/ by Reverse Evaporation and Boiling 14/18/19/20/21/22/23/24/25/26/27/28/29/30/32, Lipid #3/8/10/11/12/13, Lipid #6/ A mixture of 15/16/17/31 and a nucleic acid.
  • Control group free intake group: no treatment or gavage to HJT-sRNA-m7;
  • mice whole blood (500 ⁇ l) and whole lung (110 mg) were taken with 1.5 mL TRIzol-LS or 3 mL TRIzol, respectively, and homogenized and frozen at -80 °C;
  • RNA extraction (1) Add TRIzol or TRIzol-LS lysate (Sigma) to the cells and allow to fully lyse for 5 minutes at room temperature (1.0 mL TRIzol lysate was added to 100 mg of tissue for mouse lung tissue) Grinding with a homogenizer, 12,000 rpm, 4 ° C, centrifugation for 10 min, to remove sufficient tissue precipitation without homogenization; for mouse whole blood, add 1.5 mL of TRIzol-LS lysate to 500 ul whole blood, 12,000 rpm, 4 ° C Centrifuge for 10 min to remove the precipitate that was not fully lysed); (2) 12,000 rpm, 4 ° C, centrifuge for 5 min, discard the precipitate; (3) Add chloroform at a ratio of 200 ul / mL TRIzol, shake well, and let stand at room temperature for 15 min.
  • RT-qPCR detection See the method implementation described in Sections 3.3.1 and 3.3.2 above.
  • lipid #11 (18:0/18:2) and lipid #12 (16:0/18:2) can be promoted.
  • Small fragments of nucleic acid enter the blood and lungs and serve as a means of delivery of nucleic acid drugs.
  • the lipid nucleic acid complex obtained by direct scouring achieves a significant delivery effect.
  • the inventors have unexpectedly discovered that through this (non-invasive) intragastric administration, the mixing of 28 lipids facilitates the entry of small fragments of nucleic acid into the bloodstream and can be used as a means of delivery of nucleic acid drugs. Surprisingly, a mixture of lipids obtained by direct boil and a mixture of nucleic acids achieves a significant delivery effect.
  • Instrument Ultimate 3000; column: Kinetex C18 (100 ⁇ 2.1 mm, 1.9 ⁇ m); column temperature: 45 ° C; mobile phase: A: acetonitrile: water (V / V, 60: 40), solution containing 10mmol / L formic acid Ammonium, mobile phase B: acetonitrile: isopropanol (10:90, V/V), solution containing 10 mmol/L ammonium formate and 0.1% formic acid. Flow rate: 0.4 mL/min; injection amount: 4 ⁇ L.
  • Negative mode Heater Temp 300°C, Sheath Gas Flow rate, 45arb, Aux Gas Flow Rate, 15arb, Sweep Gas Flow Rate, 1arb, spray voltage, 2.5KV, Capillary Temp, 350°C, S-Lens RF Level, 60 %.Scan ranges: 200-1500.
  • the lipid components were identified by HPLC-MS/MS, and 138 kinds of lipid components derived from traditional Chinese medicine were identified, among which 125 were identified by cationic mode and 13 by anionic mode.
  • the following experiment was carried out by taking the compounds 1-69 shown in Table 1. It should be noted that the lipids tested below were all commercially or commercially synthesized, and the manner of use was as described in Table 1-1.
  • lipid ether solution 100 ⁇ L was prepared and grouped according to the lipid number shown in Table 1 (lipid concentration is shown in the table below), and the lipid solution was added to 20 ⁇ L of the nucleic acid solution (HJT sRNA or siRNA in a volume ratio of 5:1). After ultrasonication for 3 min, the ether was removed by evaporation at 55 ° C, and then 100 ⁇ L of DEPC-treated water was added to hydrate to obtain a nucleic acid lipid mixture.
  • nucleic acid solution HJT sRNA or siRNA in a volume ratio of 5:1
  • nucleic acid solution HJT sRNA or siRNA
  • concentration concentration is shown in Table 1
  • RT-qPCR Real-time quantitative PCR
  • MRC-5 cells pulmonary embryonic fibroblasts
  • A549 cells human lung adenocarcinoma cells
  • Caco-2 cells human colon adenocarcinoma cells
  • MEM Eagle's MEM medium
  • A549 cells were cultured in Ham's F-12 medium (HyClone); overnight incubation at 37 ° C, and subsequent experiments were performed after the cells were attached.
  • Untreated group refers to untreated cells, and this group serves as a blank control group.
  • RNAiMAX treatment groups were diluted 2 ⁇ L Lipofectamine TM RNAiMAX reagent transfection medium with 100 ⁇ L opti-MEM (commercially available from Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) (reagent full name Lipofectamine RNAimax, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific ) and HJT-sRNA-m7 The solution was mixed and allowed to stand for 15 min, added to the cells, and mixed. The final concentration of HJT-sRNA-m7 was 100 nM, and the group was used as a positive control group.
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 solution (final concentration of 100 nM), the group served as a negative control group;
  • Lipid nucleic acid mixture treatment group The lipid prepared in the step 2 and the HJT-sRNA-m7 mixture were added to the cells and mixed, and the final concentration of HJT-sRNA-m7 was 100 nM.
  • A.12 cells cultured in cells (about 1 ⁇ 10 6 cells/well), add 1 mL of TRIzol lysate to each well, and then place on ice. After all the samples are added to TRIzol, let stand for 5 min at room temperature. Fully lysed;
  • RNA samples were dissolved with 50 ⁇ L of RNase-free H2O, and the O.D value was used to quantify the RNA concentration.
  • the stem-loop primer used in the reverse transcription process was synthesized by Beijing Qingke Xinye Biotechnology Co., Ltd. (U6RT primer, because the quantification of small RNA by RT-qPCR reaction can only be relative quantitative, so U6 is the reference gene for standard. , the relative expression amount was calculated): GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAA ATATG; HJT-sRNA-m7 RT stem-loop primer: GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTACAA).
  • Quantitative PCR amplification reaction qPCR reaction system total volume 10 ⁇ L, including: 5 ⁇ L 2 ⁇ SYBR Green Master Mix, 0.5 ⁇ L forward primer (10 ⁇ M), 0.5 ⁇ L reverse primer (10 ⁇ M), 1 ⁇ L of reverse transcription cDNA, 3 ⁇ L of RNase-free dH 2 O.
  • the PCR reaction conditions were: 95 ° C, pre-denaturation for 5 min, and began to enter the PCR amplification cycle: (1) 95 ° C, 10 s; (2) 55 ° C, 10 s; (3) 72 ° C, 20s; a total of 40 cycles; the last 40 ° C for 10s to cool down.
  • the amplification reaction forward primer and reverse primer were designed and synthesized by Beijing Qingke Xinye Biotechnology Co., Ltd.
  • U6 forward primer: GCGCGTCGTGAAGCGTTC U6 reverse primer: GTGCAGGGTCCGAGGT
  • HJT-sRNA-m7 reverse primer GTGCACGCTCCGAGGT
  • RT-qPCR Real-time quantitative PCR
  • THP-1 cells human monocytes
  • RPMI- In 1640 medium HyClone
  • Untreated group refers to untreated THP-1 cells, which served as a blank control group.
  • RNAiMAX treatment groups with 100 ⁇ L opti-MEM (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) was diluted medium 2 ⁇ L Lipofectamine TM RNAiMAX Transfection Reagent (nvitrogen, Thermo Fisher Scientific) and the nucleic acid solution (TNF- ⁇ siRNA), mixing both After standing for 15 min, the cells were added to the cells and mixed, and the final concentration of the nucleic acid was 400 nM, and the group was used as a positive control group.
  • Free uptake group direct addition of nucleic acid solution (TNF- ⁇ siRNA, final concentration of 400 nM), the group as a negative control group;
  • Lipid nucleic acid mixture treatment group The lipid and nucleic acid mixture prepared in the step 2 was added to the cells and mixed, and the final concentration of the nucleic acid was 400 nM.
  • E. coli lipopolysaccharide LPS, Escherichia coli 0111: B4, L4391, Sigma-Aldrich
  • RT-qPCR SYBR Green Dye Method detects the mRNA expression level of TNF- ⁇ (depending on the target gene of the subsequent examples, the results are shown in the figure), and the specific steps are as follows:
  • Reverse transcription of total RNA into cDNA Reverse transcription of total RNA into cDNA by High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems, cat. no. 4368813), reverse transcription system as follows: template RNA ( 150 ng/ ⁇ L) 10 ⁇ L, 10X RT buffer 2.0 ⁇ L, 25X dNTP Mix (100 mM) 0.8 ⁇ L, random primer 2.0 ⁇ L, MultiScribe TM reverse transcriptase 1.0 ⁇ L, RNase inhibitor 1.0 ⁇ L, nuclease-free H 2 O 3.2 ⁇ L After transient centrifugation, the reaction was carried out in a PCR apparatus under the following conditions: (1) 25 ° C, 10 min; (2) 37 ° C, 120 min; (3) 85 ° C, 5 min; (4) 4 ° C, the reaction was terminated. After the reaction, 20 ⁇ L of RNase-free ddH 2 O was added to make up the final volume to 40 ⁇ L.
  • Quantitative PCR amplification reaction qPCR reaction system total volume 10 ⁇ L, including: 5 ⁇ L 2 ⁇ SYBR Green Master Mix, 0.5 ⁇ L forward primer (10 ⁇ M), 0.5 ⁇ L reverse primer (10 ⁇ M), 1 ⁇ L of reverse transcription cDNA, 3 ⁇ L of RNase-free ddH 2 O.
  • the PCR reaction conditions were: 95 ° C, pre-denaturation for 5 min, and began to enter the PCR amplification cycle: (1) 95 ° C, 10 s; (2) 55 ° C, 10 s; (3) 72 ° C, 20s; a total of 40 cycles; the last 40 ° C for 10s to cool down.
  • Both the forward and reverse primers of the amplification reaction were designed and synthesized by Beijing Qingke Biotechnology Co., Ltd., primer sequence (internal reference gene UBC forward primer: CTGGAAGATGGTCGTACCCTG, internal reference gene UBC reverse primer: GGTCTTGCCAGTGAGTGTCT; target gene TNF- ⁇ forward primer: CTGCCCCAATCCCTTTATT: target gene TNF- ⁇ reverse primer: CCCAATTCTCTTTTTGAGCC).
  • MRC-5 cells lung embryonic fibroblasts
  • A549 cells human lung adenocarcinoma cells
  • MEM Eagle's MEM medium
  • A549 cells were cultured in Ham's F-12 medium (HyClone); overnight incubation at 37 ° C, and subsequent experiments were performed after the cells were attached.
  • Untreated group refers to untreated cells, and this group serves as a blank control group.
  • RNAiMAX treatment groups were diluted 2 ⁇ L Lipofectamine TM RNAiMAX Transfection Reagent (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) and was treated with a nucleic acid medium 100 ⁇ L opti-MEM (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), placed after mixing both 15min, added to the cells In the middle, the final concentration of the nucleic acid was 400 nM, and the group was used as a positive control group.
  • Free uptake group directly added nucleic acid solution (final concentration of 400 nM), the group served as a negative control group;
  • Lipid nucleic acid mixture treatment group The lipid and nucleic acid mixture prepared in the step 2 was added to the cells and mixed, and the final concentration of the nucleic acid was 400 nM.
  • the expression level of REL-A protein was detected 24 h after stimulation, and the internal reference protein was ⁇ -actin; MRC-5 cells were stimulated with TGF- ⁇ 1 for 72 h to detect the expression of fibronectin and ⁇ -SMA protein.
  • the internal reference protein was GAPDH; siRNA delivery assay detects the protein expression of the corresponding knockdown gene, and the internal reference protein is ⁇ -actin).
  • the absorbance is detected at 562 nm by an ultraviolet spectrophotometer (Synergy 4 multi-function microplate reader), and the protein concentration in the sample is calculated according to a standard curve;
  • lipid nucleic acid mixture prepared by boiling, 400 ⁇ L of HJT-sRNA-m7 (5 nmol) single-stranded RNA DEPC-treated aqueous solution, respectively added with 9 ⁇ L or 18 ⁇ L of lipid combination (lipid PE (No38) & LPC (No37) &TG (No. 32), 4:2:3, V/V/V), after mixing, heating at 100 ° C for 30 min.
  • RNA 6-8 weeks old male C57BL/6J wild type mice were intragastrically administered with RNA: a mixed solution of HJT-sRNA-m7 aqueous solution or lipid and HJT-sRNA-m7 was administered with a gavage needle, 400 ⁇ L/mouse (HJT) -sRNA-m7, 5nmol/only), grouped as follows:
  • Control group mice without any treatment
  • Negative control group 9 ⁇ L lipid combination (lipid PE (No38) & LPC (No37) & TG (No32), 4:2:3, V/V/V);
  • Lipid and Nucleic Acid Mixture Group A mixture of a lipid combination and a HJT-sRNA-m7 single-stranded RNA.
  • RT-qPCR SYBR Green universal dye method was used to detect the abundance of HJT-sRNA-m7.
  • the HJT-sRNA-m7 single-strand solution refers to a HJT-sRNA-m7 single-stranded DEPC treatment aqueous solution.
  • the HJT-sRNA-m7 double-stranded solution refers to a DEPC-treated aqueous solution of HJT-sRNA-m7 duplex.
  • Example 1-1 Different classes of lipid combinations deliver single-stranded nucleic acids into MRC-5 cells
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain DEPC aqueous solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to cells, mix, HJT-sRNA The final concentration of the -m7 single chain is 200 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-chain solution (final concentration of 200 nM);
  • Lipid-nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of the lipid monomer or lipid combination and the HJT-sRNA-m7 single-stranded nucleic acid solution were mixed with the boiled method to add the mixture to the cells, and the RNA was finally mixed. The concentration was 200 nM.
  • MG monoglyceride, monoacylglycerol
  • DG diglyceride, diglyceride: a mixture of 3 ⁇ L of No1/2/3/19/35 equal volume chloroform solution;
  • TG triglyceride, triglyceride: 3 ⁇ L No6/9/10/13/15/16/18/20/21/22/23/24/25/26/27/28/32/33 equal volume chloroform a mixture of solutions;
  • LPC Lisophosphatidylcholine, lysolecithin: a mixture of 3 ⁇ L of No36/37 equal volume of chloroform solution;
  • PC phosphatidylcholine, phosphatidylcholine: a mixture of 3 ⁇ L of No11/12 equal volume chloroform solution;
  • PE phosphatidylethanolamine, phosphatidylethanolamine: a mixture of 3 ⁇ L of No8/38 equal volume chloroform solution;
  • So (Sphingoshine, sphingosine): a mixture of 3 ⁇ L of No17/30/31 equal volume chloroform solution;
  • Example 1-2 Lipid Combination Delivery of Single-Stranded Nucleic Acids into MRC-5 Cells and Caco-2 Cells
  • test cells were MRC-5 cells and Caco-2 cells.
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to the cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the single chain is 200 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-chain solution (final concentration of 200 nM);
  • Lipid monomer and nucleic acid treatment group 3 ⁇ L of the lipid monomer (No. 1 or No. 8 or No. 12) and the mixture of HJT-sRNA-m7 single-stranded nucleic acid solution by boiled treatment were added to the cells, and mixed. The final concentration of RNA was 200 nM.
  • Lipid combination mixture and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of the lipid combination (No 1/8/12 equal volume mixture) and the mixture of HJT-sRNA-m7 single-stranded nucleic acid solution by boiled treatment were added to the cells. , mix, the final concentration of RNA is 200nM.
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of lipid combination (2 ⁇ L of lipid monomer No. 1 or No. 8 or No. 12 mixed with 1 ⁇ L of the following lipid classes (MG, DG, TG, LPC, Cer, So or FA)
  • the mixture of the single-stranded nucleic acid solution of HJT-sRNA-m7 and the boiled method was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 200 nM.
  • the treatment groups are collectively represented as No. 1 2 ⁇ L+mix 1 ⁇ L, No. 82 ⁇ L+mix 1 ⁇ L, and No.
  • MG indicates 2 ⁇ L lipid sheet.
  • Body No1 or No8 or No12 + 1 ⁇ L MG DG represents 2 ⁇ L of lipid monomer No. 1 or No. 8 or No. 12 + 1 ⁇ LDG
  • TG represents 2 ⁇ L of lipid monomer No. 1 or No. 8 or No. 12+1 LTG
  • LPC represents 2 ⁇ L of lipid monomer No. 1 or No. 8 Or No12 + 1 ⁇ LLPC
  • Cer represents 2 ⁇ L of lipid monomer No. 1 or No. 8 or No. 12 + 1 ⁇ LCer
  • So represents 2 ⁇ L of lipid monomer No. 1 or No. 8 or No. 12 + 1 ⁇ L
  • FA represents 2 ⁇ L of lipid monomer No. 1 or No. 8 or No. 12 + 1 ⁇ L.
  • MG monoglyceride, monoacylglycerol
  • DG diglyceride, diglyceride: a mixture of 2 ⁇ L of No1/2/3/19/35 equal volume chloroform solution;
  • TG triglyceride, triglyceride: 2 ⁇ L No6/9/10/13/15/16/18/20/21/22/23/24/25/26/27/28/32/33 equal volume chloroform solution mixture;
  • LPC Lisophosphatidylcholine, lysolecithin: a mixture of 2 ⁇ L of No36/37 equal volume chloroform solution;
  • Cer(Ceramides, ceramide) a mixture of 2 ⁇ L of No4/14 equal volume chloroform solution
  • So (Sphingoshine, sphingosine): a mixture of 2 ⁇ L of No17/30/31 equal volume chloroform solution;
  • the mixture (No 1/8/12 isometrically mixed), No. 1 2 ⁇ L + No. 8 1 ⁇ L, No. 1 2 ⁇ L + No. 12 1 ⁇ L, No. 1 2 ⁇ L + MG 1 ⁇ L, No. 8 2 ⁇ L +MG 1 ⁇ L, No 12 2 ⁇ L + No. 8 1 ⁇ L, No 12 2 ⁇ L + LPC 1 ⁇ L and No 12 2 ⁇ L + So 1 ⁇ L are more efficiently delivered nucleic acids.
  • Example 1-3 Lipid combination to deliver single-stranded nucleic acid into cells
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to the cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the single chain is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-chain solution (final concentration of 100 nM);
  • Lipid monomer and nucleic acid treatment group 3 ⁇ L of lipid monomer (No. 8 or No. 12) and a mixture of HJT-sRNA-m7 single-stranded nucleic acid solution by boiled treatment were added to the cells, and mixed, RNA The final concentration is 100 nM.
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of lipid combination (2.25 ⁇ L lipid combination PC (No 12) & PE (No 8) and 0.75 ⁇ L of the following lipid classes DG, TG, LPC, PC, Cer, So or FA mixed)
  • the mixture of the single-stranded nucleic acid solution of HJT-sRNA-m7 and the boiled solution was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • the treatment group encompassed by the 2.25 ⁇ L + 0.75 ⁇ L upper horizontal line is the mixture treatment group.
  • DG diglyceride, diglyceride: a mixture of 0.75 ⁇ L of No1/2 equal volume chloroform solution;
  • LPC Lisophosphatidylcholine, lysolecithin: a mixture of 0.75 ⁇ L of No36/37 equal volume chloroform solution;
  • PC Lisophosphatidylcholine, lysolecithin
  • Example 1-4 Lipid Combination Delivery of Single-Stranded Nucleic Acid into Cells
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to the cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the single chain is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-chain solution (final concentration of 100 nM);
  • Lipid monomer and nucleic acid treatment group 3 ⁇ L of the lipid monomer (No. 1 or No. 8 or No. 12) and the mixture of HJT-sRNA-m7 single-stranded nucleic acid solution by boiled treatment were added to the cells, and mixed. The final concentration of RNA was 100 nM.
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of lipid combination (2 ⁇ L of lipid combination DG (No1) & PE (No. 8) & PC (No 12) and 1 ⁇ L of the following lipid classes DG, TG, LPC, PC, Cer, The mixture of So or FA mixed with the HJT-sRNA-m7 single-stranded nucleic acid solution and the boiled solution was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • the treatment group encompassed by 2 ⁇ L of the lipid combination DG (No1) & PE (No. 8) & PC (No 12) + 1 ⁇ L upper horizontal line is the mixture treatment group.
  • DG diglyceride, diglyceride: a mixture of 1 ⁇ L of No1/2 equal volume chloroform solution;
  • TG triglyceride, triglyceride: 1 ⁇ L of No15 chloroform solution
  • LPC Lisophosphatidylcholine, lysolecithin: a mixture of 1 ⁇ L of No36/37 equal volume chloroform solution;
  • PC Lisophosphatidylcholine, lysolecithin
  • Example 1-5 Lipid Combination Delivery of Single-Stranded Nucleic Acid into Cells
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to the cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the single chain is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-chain solution (final concentration of 100 nM);
  • Lipid monomer and nucleic acid treatment group 3 ⁇ L of the lipid monomer No. 8 and HJT-sRNA-m7 single-stranded nucleic acid solution were hydrolyzed and added to the cells, and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM. ;
  • Lipid combination PE (No8) & MG (No34) and nucleic acid mixture treatment group The above 2.25 ⁇ L lipid combination (PE (No8) & MG (No34), 2:1, V/V) and HJT-sRNA-, respectively The mixture of the m7 single-stranded nucleic acid solution treated with the boiled method was added to the cells and mixed, and the final concentration of the RNA was 100 nM.
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of lipid combination (2.25 ⁇ L lipid combination PE (No8) & MG (No34) and 0.75 ⁇ L of the following lipid classes DG, TG, LPC, PC, Cer, So or FA mixed)
  • the mixture of the single-stranded nucleic acid solution of HJT-sRNA-m7 and the boiled solution was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • the treatment group encompassed by 2.25 ⁇ L of lipid-combined PE (No. 8) & MG (No34) + 0.75 ⁇ L of the upper horizontal line is the mixture treatment group.
  • DG diglyceride, diglyceride: a mixture of 0.75 ⁇ L of No1/2 equal volume chloroform solution;
  • LPC Lisophosphatidylcholine, lysolecithin: a mixture of 0.75 ⁇ L of No36/37 equal volume chloroform solution;
  • PC Lisophosphatidylcholine, lysolecithin
  • Example 1-6 Lipid Combination Delivery of Single-Stranded Nucleic Acid into A549 Cells
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to the cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the single chain is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-chain solution (final concentration of 100 nM);
  • Lipid monomer and nucleic acid treatment group a mixture of 3 ⁇ L of lipid monomer No38 and HJT-sRNA-m7 single-stranded nucleic acid solution by boiled method was added to the cells, and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM. .
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of the above lipid combination (2 ⁇ L of lipid monomer No. 38 and 1 ⁇ L of the following lipid classes MG, DG, TG, LPC, PC, PE, Cer, So or FA)
  • the mixture of the single-stranded nucleic acid solution of HJT-sRNA-m7 and the boiled solution was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • MG monoglyceride, monoacylglycerol
  • DG diglyceride, diglyceride: 1 ⁇ L of No1 chloroform solution
  • TG triglyceride, triglyceride: 1 ⁇ L of No15 chloroform solution
  • LPC Lisophosphatidylcholine, lysolecithin
  • PC phosphatidylcholine, phosphatidylcholine
  • PE phosphatidylethanolamine, phosphatidylethanolamine
  • FA fatty acid, fatty acid
  • Example 1-7 Lipid Combination Delivery of Single-Stranded Nucleic Acid into A549 Cells
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to the cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the single chain is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-chain solution (final concentration of 100 nM);
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of lipid combination (2 ⁇ L of lipid combination DG (No1) & PE (No38) & PC (No 12) and 1 ⁇ L of the following lipid classes MG, TG, LPC, PE, Cer, The mixture of So or FA mixed with the HJT-sRNA-m7 single-stranded nucleic acid solution and the boiled solution was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • MG monoglyceride, monoacylglycerol
  • TG triglyceride, triglyceride: 1 ⁇ L of No15 chloroform solution
  • LPC Lisophosphatidylcholine, lysolecithin
  • PE phosphatidylethanolamine, phosphatidylethanolamine
  • FA fatty acid, fatty acid
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to the cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the single chain is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-chain solution (final concentration of 100 nM);
  • Lipid combination PE (No38) & MG (No34) and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of the above lipid combination (PE (No38) & MG (No34), 2:1, V/V) and HJT-sRNA-m7, respectively
  • the mixture of the single-stranded nucleic acid solution treated with the boiled method was added to the cells and mixed, and the final concentration of the RNA was 100 nM.
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of lipid combination (2 ⁇ L of lipid combination PE (No38) & MG (No34) with 1 ⁇ L of the following lipid classes DG, TG, LPC, PC, PE, Cer, So or FA mixed)
  • the mixture of the single-stranded nucleic acid solution of HJT-sRNA-m7 and the boiled solution was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • DG diglyceride, diglyceride: 1 ⁇ L of No1 chloroform solution
  • TG triglyceride, triglyceride: 1 ⁇ L of No15 chloroform solution
  • LPC Lisophosphatidylcholine, lysolecithin
  • PC phosphatidylcholine, phosphatidylcholine
  • PE phosphatidylethanolamine, phosphatidylethanolamine
  • FA fatty acid, fatty acid
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to the cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the single chain is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-chain solution (final concentration of 100 nM);
  • Lipid combination PE (No38) & PC (No 12) and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of the above lipid combination (PE (No38) & PC (No 12), 2:1, V/V) and HJT-sRNA-m7, respectively
  • the mixture of the single-stranded nucleic acid solution treated with the boiled method was added to the cells and mixed, and the final concentration of the RNA was 100 nM.
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of lipid combination (2 ⁇ L of lipid combination PE (No38) & PC (No 12) and 1 ⁇ L of the following lipid classes MG, DG, TG, LPC, PE, Cer, So or FA mixed)
  • the mixture of the single-stranded nucleic acid solution of HJT-sRNA-m7 and the boiled solution was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • MG monoglyceride, monoacylglycerol
  • DG diglyceride, diglyceride: 1 ⁇ L of No1 chloroform solution
  • TG triglyceride, triglyceride: 1 ⁇ L of No15 chloroform solution
  • LPC Lisophosphatidylcholine, lysolecithin
  • PE phosphatidylethanolamine, phosphatidylethanolamine
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to the cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the single chain is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-chain solution (final concentration of 100 nM);
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of lipid combination (2.2 ⁇ L of lipid combination PE (No38) & PC (No 12) & DG (No1) & TG (No 15) and 0.8 ⁇ L of the following lipid classes MG, LPC, The mixture of Cer, So or FA mixed with the HJT-sRNA-m7 single-stranded nucleic acid solution and the boiled solution was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • MG monoglyceride, monoacylglycerol
  • LPC Lisophosphatidylcholine, lysolecithin
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to the cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the single chain is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-chain solution (final concentration of 100 nM);
  • the mixture of the single-stranded nucleic acid solution of HJT-sRNA-m7 and the boiled method was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of lipid combination (2.2 ⁇ L of lipid combination PE (No38) & MG (No34) & LPC (No37) and 0.8 ⁇ L of the following lipid classes DG, TG, PC, Cer, Or So mixed)
  • the mixture of the single-stranded nucleic acid solution of HJT-sRNA-m7 and the boiled solution was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • DG diglyceride, diglyceride: 0.8 ⁇ L of No1 chloroform solution
  • TG triglyceride, triglyceride: 0.8 ⁇ L of No15 chloroform solution
  • PC phosphatidylcholine, phosphatidylcholine
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to the cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the single chain is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-chain solution (final concentration of 100 nM);
  • the mixture of the single-stranded nucleic acid solution of HJT-sRNA-m7 and the boiled method was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of lipid combination (2.2 ⁇ L of lipid combination PE (No38) & PC (No 12) & Cer (No 4) and 0.8 ⁇ L of the following lipid classes MG, DG, TG, LPC, The mixture of So or FA mixed with the HJT-sRNA-m7 single-stranded nucleic acid solution and the boiled solution was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • MG monoglyceride, monoacylglycerol
  • DG diglyceride, diglyceride: 0.8 ⁇ L of No1 chloroform solution
  • TG triglyceride, triglyceride: 0.8 ⁇ L of No15 chloroform solution
  • LPC Lisophosphatidylcholine, lysolecithin
  • FA fatty acid, fatty acid
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to the cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the single chain is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-chain solution (final concentration of 100 nM);
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of lipid combination (PE (No38) & PC (No 12) & Cer (No4) & FA (No29) and 1 ⁇ L of each of the following lipid classes) and HJT-sRNA-m7, respectively
  • PE No38
  • PC No 12
  • Cer No 4
  • FA No29
  • MG monoglyceride, monoacylglycerol
  • DG diglyceride, diglyceride: 1 ⁇ L of No1 chloroform solution
  • TG triglyceride, triglyceride: 1 ⁇ L of No15 chloroform solution
  • LPC Lisophosphatidylcholine, lysolecithin
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to the cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the single chain is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-chain solution (final concentration of 100 nM);
  • the mixture of the single-stranded nucleic acid solution of HJT-sRNA-m7 and the boiled method was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of lipid combination (2 ⁇ L PE (No38) & PC (No 12) & So (No 31) and 1 ⁇ L of each of the following lipid classes MG, DG, TG, LPC, Cer, FA)
  • the mixture of the single-stranded nucleic acid solution of HJT-sRNA-m7 and the boiled solution was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • DG diglyceride, diglyceride: 1 ⁇ L of No1 chloroform solution
  • TG triglyceride, triglyceride: 1 ⁇ L of No15 chloroform solution
  • PC phosphatidylcholine, phosphatidylcholine
  • FA fatty acid, fatty acid
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to the cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the single chain is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-chain solution (final concentration of 100 nM);
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of lipid combination (2 ⁇ L of PE (No38) & MG (No34) & LPC (No37) & So (No31) and 1 ⁇ L of each of the following lipid classes DG, TG, PC, Cer, FA
  • the mixture after mixing with the HJT-sRNA-m7 single-stranded nucleic acid solution was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • DG diglyceride, diglyceride: 1 ⁇ L of No1 chloroform solution
  • TG triglyceride, triglyceride: 1 ⁇ L of No15 chloroform solution
  • PC phosphatidylcholine, phosphatidylcholine
  • FA fatty acid, fatty acid
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to the cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the single chain is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-strand solution (final concentration of 100 nM);
  • Lipid combination PE (No38) & LPC (No37) and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of the above lipid combination PE (No38) & LPC (No37), 2:1, V/V) and HJT-sRNA-m7, respectively
  • the mixture of the single-stranded nucleic acid solution treated with the boiled method was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of lipid combination (2 ⁇ L of PE (No38) & LPC (No37) and 1 ⁇ L of each of the following lipid classes MG, DG, TG, PC, Cer, So, FA) were respectively.
  • the mixture of the HJT-sRNA-m7 single-stranded nucleic acid solution treated with the boiled method was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • MG monoglyceride, monoacylglycerol
  • DG diglyceride, diglyceride: 1 ⁇ L of No1 chloroform solution
  • TG triglyceride, triglyceride: 1 ⁇ L of No15 chloroform solution
  • PC phosphatidylcholine, phosphatidylcholine
  • FA fatty acid, fatty acid
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 single-chain solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to the cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the single chain is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 single-chain solution (final concentration of 100 nM);
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of lipid combination (2 ⁇ L of PE (No38) & LPC (No37) & TG (No 15) and 1 ⁇ L of each of the following lipid classes (MG, DG, PC, Cer, So or FA)
  • the mixture after mixing with the HJT-sRNA-m7 single-stranded nucleic acid solution was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • MG monoglyceride, monoacylglycerol
  • DG diglyceride, diglyceride: 1 ⁇ L of No1 chloroform solution
  • PC phosphatidylcholine, phosphatidylcholine
  • FA fatty acid, fatty acid
  • Example 2-1 Lipid combination delivery of double-stranded nucleic acid into MRC-5 cells
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 double-strand solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the double strand is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 double-stranded RNA solution (final concentration of 100 nM);
  • Lipid monomer and nucleic acid treatment group 3 ⁇ L of the mixture of lipid monomer No38 and HJT-sRNA-m7 double-stranded nucleic acid solution was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM. .
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of the above lipid combination (2 ⁇ L of lipid monomer No. 38 and 1 ⁇ L of lipid chloroform solution No. 8, 1, 2, 11, 12, 34, 37, 4, 30, 31, 29, 32, 1+2 (equal volume mixing) or 11+12 (equal volume mixing) mixed with HJT-sRNA-m7 double-stranded nucleic acid solution by boiled mixture into the cells, mixed The final concentration of RNA was 100 nM.
  • Lipid monomer 38 is capable of efficiently delivering double-stranded nucleic acids into MRC-5 cells with an effect close to the transfection reagent RNAiMAX. Adding other lipids on this basis failed to further enhance this effect.
  • Example 2-2 Lipid Combination Delivery of Double-Stranded Nucleic Acid into MRC-5 Cells
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 double-strand solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the double strand is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 double-strand solution (final concentration of 100 nM);
  • RNA Lipid combination (No38 & No37, 2:1, V/V) and nucleic acid treatment group: 3 ⁇ L of the lipid combination and the mixture of HJT-sRNA-m7 double-stranded nucleic acid solution by boiled treatment were added to the cells, mixed The final concentration of RNA was 100 nM.
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of the above lipid combination (2 ⁇ L of No38 & No 37 mixture and 1 ⁇ L of lipid chloroform solution No. 8, 1, 2, 11, 12, 34, 37, 4, 30, 31, 29, 32, 1 + 2 (equal volume mixing) or 11 + 12 (equal volume mixing) mixed with HJT-sRNA-m7 double-stranded nucleic acid solution by boiled mixture added to the cells, mixed, RNA The final concentration was 100 nM.
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 double-strand solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the double strand is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 double-strand solution (final concentration of 100 nM);
  • Lipid combination (PE (No38) & PC (No. 12) & Cer (No4)) and nucleic acid treatment group: 3 ⁇ L of lipid combination (PE (No38) & PC (No 12) & Cer (No 4), 4:2:3, V /V/V)
  • the mixture of the double-stranded nucleic acid solution of HJT-sRNA-m7 after boiled was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of the above lipid combination (2.5 ⁇ L of PE (No38) & PC (No 12) & Cer (No 4) mixture and 0.5 ⁇ L of lipid (DG (2), TG (6), So ( 17), FA (29), MG (34) and LPC (37)) mixed with HJT-sRNA-m7 double-stranded nucleic acid solution after boiled mixture added to the cells, mix, the end of RNA The concentration is 100 nM.
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 double-strand solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the double strand is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 double-strand solution (final concentration of 100 nM);
  • Lipid combination and nucleic acid mixture treatment group 3 ⁇ L of the above lipid combination (2 ⁇ L of PE (No38) & DG (No 2) mixture and 1 ⁇ L of other lipid No. 37, 31, 29, 34, 12 or 4) and HJT, respectively
  • the mixture of the -sRNA-m7 double-stranded nucleic acid solution was hydrolyzed and added to the cells, and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 double-strand solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the double strand is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 double-strand solution (final concentration of 100 nM);
  • RNA The lipid combination ((PE (No38) & LPC (No37), 4:1, V/V) and the mixture of HJT-sRNA-m7 double-stranded nucleic acid solution by boiled method is added to the cells, and mixed. The final concentration of RNA was 100 nM.
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 double-strand solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the double strand is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 double-strand solution (final concentration of 100 nM);
  • RNA The lipid combination ((PE (No38) & PC (No12), 4:1, V/V) and the mixture of HJT-sRNA-m7 double-stranded nucleic acid solution by boiled method is added to the cells, and mixed. The final concentration of RNA was 100 nM.
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 double-strand solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the double strand is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 double-strand solution (final concentration of 100 nM);
  • RNA Lipid combination ((PE(No38)&PC(No12)&DG(No2), 4:1:5, V/V/V) and HJT-sRNA-m7 double-stranded nucleic acid solution after boiled The mixture was added to the cells and mixed, and the final concentration of RNA was 100 nM.
  • the lipid combination (PE(No38) & PC(No12) & DG(No2), 4:1:5, V/V/V) was superior to RNAiMAX for double-stranded nucleic acid delivery of A549 cells.
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 double-strand solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the double strand is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 double-strand solution (final concentration of 100 nM);
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 double-strand solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the double strand is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 double-strand solution (final concentration of 100 nM);
  • RNA The lipid combination ((PE(No8)&PC(No12), 1:2, V/V) and the mixture of HJT-sRNA-m7 double-stranded nucleic acid solution by boiled method is added to the cells, and mixed. The final concentration of RNA was 100 nM.
  • the lipid combination ((PE(No8) & PC(No12), 1:2, V/V) had a significantly better double-stranded nucleic acid delivery effect on A549 cells than RNAiMAX.
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 double-strand solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the double strand is 100 nM;
  • Free uptake group directly added HJT-sRNA-m7 double-strand solution (final concentration of 100 nM);
  • RNA The lipid combination ((PE(No8)&LPC(No37), 4:1, V/V) and the mixture of HJT-sRNA-m7 double-stranded nucleic acid solution by boiled method is added to the cells, and mixed. The final concentration of RNA was 100 nM.
  • RNAiMAX group dilute 2 ⁇ L of RNAiMAX transfection reagent and HJT-sRNA-m7 double-strand solution with 100 ⁇ L of opti-MEM medium, mix them for 15 min, add to cells, mix, HJT-sRNA-m7 The final concentration of the double strand is 100 nM;

Abstract

涉及从中药中提取多种能够促进核酸递送的化合物或合成的化合物，并利用所提取的化合物或多种组合促进核酸如sRNA吸收和进入靶细胞中，并能促进核酸进入有此需要的对象体内的靶部位；所述中药选自红景天、蒲公英、穿心莲和金银花中药饮片；所述核酸用于治疗疾病，例如心脏、脾、肾、胃、肺和/或肠疾病。

Description

化合物或中药提取物在制备核酸递送试剂中的应用及其相关产品
本申请要求2018年3月29日提交的申请号PCT/CN2018/081155的发明名称为“化合物或中药提取物在制备核酸递送试剂中的应用及其相关产品”的PCT申请的优先权，其全文通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及从中药中提取多种能够促进核酸递送的化合物或合成的化合物，并利用所提取的化合物或多种组合促进核酸如sRNA吸收和进入靶细胞中，并能促进进入有此需要的对象体内的靶部位。
背景技术
在过去几十年中，用核酸分子包括RNA分子作为治疗药物的理念从概念走向了临床现实。事实上，核酸分子拥有许多的属性使得它可以作为治疗药物。它们能够折叠形成复杂的构象让它们可以与蛋白质、小分子或者其他核酸相互结合，有些甚至可以形成催化中心。小干扰RNA(siRNA)作为RNAi的效应分子，其作为治疗药物具有越来越广阔的前景。目前已经有多种siRNA药物进入临床实验，预示着其良好的发展前景。通常，人们一般把siRNA，miRNA及其它非编码小RNA不加区分地称之为小核酸或小RNA(sRNA)。然而，由于核酸分子容易降解，在体内有相对较短的半衰期，因此作为治疗药物来说，其通常被认为是一个糟糕的选择。
因此，如何将核酸分子包括小RNA有效递送至体内靶器官以及靶细胞中，实现其生物活性和治疗或预防作用，是本领域技术人员需要考虑的问题。
发明内容
经过大量实验，本发明人意外发现，一些中药(包括红景天、蒲公英、穿心莲及金银花)中存在一些脂质组分，这些源自中药的脂质能够促进核酸如小RNA吸收/进入细胞和/或有此需要的对象体内靶部位。在本发明中，脂质组分是合成的。
具体的，本申请一方面涉及从中药中提取的具有如下结构的化合物，以及该化合物在制备用于核酸递送中的用途：
Figure PCTCN2019080175-appb-000001
其中，L1、L2、L3不存在，或L1、L2、L3各自独立选自-C(O)O-CH2-，-CH(OH)-，-C(O)-NH-CH2-，-CH2-O-C(O)-，-CH2-NH-C(O)-，-C(O)O-，-C(O)NH-，-O-C(O)-，-NH-C(O)-，-CH 2-，
Figure PCTCN2019080175-appb-000002
Figure PCTCN2019080175-appb-000003
条件是L1、L2、L3中至多两个不存在；
对于二价基团L 1、L 2而言，左侧的破折号“-”分别连接至基团A和B，而右侧的破折号“-”分别连接至中心碳原子；
对于二价基团L 3而言，左侧的破折号“-”连接至中心碳原子，而右侧的破折号“-”连接至Q；
A，B，Q各自独立选自H，-OH，C1-20烷基，C1-20烯基，C1-20杂烷基，C1-20杂烯基，-NH2，和-NR3+，R为H或C1-6烷基；和
n为整数0，1，2，3或4。
在一个实施方案中，在该用途中，所述化合物结构中的
L1不存在，或L1选自-C(O)O-CH2-和-CH(OH)-，
L2不存在，或L2选自-C(O)O-和-C(O)NH-，
L3不存在，或L3选自-C(O)O-，-CH2-O-C(O)-，-CH2-和
Figure PCTCN2019080175-appb-000004
A选自H，C 1-20烷基和C 1-20烯基；
B选自H，-NH 2，C 1-20烷基和C 1-20烯基；
Q选自H，-OH，C 1-20烷基和C 1-20烯基，和-NR 3 +，其中R为H或C 1-6烷基。
在一个实施方案中，所述化合物具有下式
Figure PCTCN2019080175-appb-000005
在一个实施方案中，所述化合物结构中的
A选自H，C 10-20烷基和C 10-20烯基；
B选自H，-NH 2，C 10-20烷基和C 10-20烯基；
Q选自H，-OH，C 10-20烷基和C 10-20烯基，和-NR 3 +，其中R为H或C 1-4烷基。
在一个实施方案中，所述化合物结构中的
A选自H，直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
B选自H，-NH 2，直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
Q选自H，-OH，直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基，和-NR 3 +，其中R为H或C 1-4烷基；
在A，B，Q中，所述烯基具有1-5个双键。
在一个实施方案中，在所述化合物结构的A，B，Q中，所述烯基具有1-3个双键，且呈Z构型。
在一个实施方案中，所述化合物选自下式：
Figure PCTCN2019080175-appb-000006
Figure PCTCN2019080175-appb-000007
和A——L 3—Q，
其中
A选自直链C15-18烷基和直链C15-18烯基；
B选自直链C15-18烷基和直链C15-18烯基；
Q选自H，-OH，直链C15-18烷基和直链C15-18烯基，和-NR3+，其中R为H或甲基；L3为-C(O)O-。
在一个实施方案中，所述化合物为溶血卵磷脂、神经酰胺、甘油二酯、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、甘油三酯、单半乳糖甘油二酯、(神经)鞘氨醇、磷脂酰乙醇、单酰基甘油、脂肪酸、血小板活化因子、或二甲基磷脂酰乙醇胺。
在一个实施方案中，所述化合物为表1所示的脂质。
在一个实施方案中，所述化合物为表1中第11号、第12号、第41号、第71号、第38号、第64号、第40号、第37号、第39号、第60号、第62号、第33号、第35号、第42号、第43号、第44号、第45号、第46号、第47号、第48号、第49号、第50号、第51号、第52号、第53号、第54号、第55号、第56号、第57号、第58号、第59号、第61号、第65号、第66号、第67号、第68号、第69号、或第70号所示的脂质。
本申请的第二方面涉及包含任何一种或多种上述化合物，优选选自表1的任何一种或多种脂质的组合在制备用于核酸递送试剂中的用途。优选地，所述组合物包含表1中第11号、第12号、第41号、第71号、第38号、第64号、第40号、第37号、第39号、第60号、或第62号、第33号、第35号、第42号、第43号、第44号、第45号、第46号、第47号、第48号、第49号、第50号、第51号、第52号、第53号、第54号、第55号、第56号、第57号、第58号、第59号、第61号、第65号、第66号、第67号、第68号、第69号、或第70号所示的任一种脂质，或其与表1中所示的任何一种或多种其它脂质的组合。
本申请的第三方面涉及中药在制备核酸递送的试剂中的用途。
在一个实施方案中，所述的中药选自红景天，蒲公英，金银花或穿心莲中药饮片。
在一个实施方案中，所述试剂含有从中药中提取的化合物。优选地，所述试剂含有任何一种或多种上述化合物，优选选自表1的任何一种或多种脂质。优选地，所述试剂包含表1中第11号、第12号、第41号、第71号、第38号、第64号、第40号、第37号、第39号、第60号、或第62号、第33号、第35号、第42号、第43号、第44号、第45号、第46号、第47号、第48号、第49号、第50号、第51号、第52号、第53号、第54号、第55号、第56号、第57号、第58号、第59号、第61号、第65号、第66号、第67号、第68号、第69号、或第70号所示的任一种脂质，或其与表1中所示的任何一种或多种其它脂质的组合。
在一个实施方案中，化合物通过中药的煎煮制备提取。在另一个实施方案中，化合物通过将所述中药饮片在水中浸泡，然后依次进行强火煎煮和弱火煎煮，将煎煮后的中药药液浓缩，然后依次添加氯仿-甲醇、氯仿和水搅拌处理，取氯仿层获得。
在一个实施方案中，所述的化合物具有前面所述任一项所示的结构。
在一个实施方案中，所述的化合物选自溶血卵磷脂、神经酰胺、甘油二酯、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、甘油三酯、单半乳糖甘油二酯、(神经)鞘氨醇、磷脂酰乙醇、单酰基甘油、脂肪酸、血小板活化因子、或二甲基磷脂酰乙醇胺。
在一个实施方案中，其中所述化合物选自于表1。
在一个实施方案中，其中所述的化合物为表1中第11号、第12号、第41号、第71号、第38号、第64号、第40号、第37号、第39号、第60号、或第62号、第33号、第35号、第42号、第43号、第44号、第45号、第46号、第47号、第48号、第49号、第50号、第51号、第52号、第53号、第54号、第55号、第56号、第57号、第58号、第59号、第61号、第65号、第66号、第67号、第68号、第69号、或第70号所示的脂质。
在一个实施方案中，其中所述的递送包括体外细胞递送，或体内消化道递送。
在一个实施方案中，所述用途还包括制备脂质核酸混合物。
在一个实施方案中，所述的脂质核酸混合物通过水煮法制备，或通过逆向蒸发法，或者通过直接混合制备。
在一个实施方案中，所述水煮法的制备温度为约25℃至约100℃，优选 约80℃至约100℃，所述逆向蒸发法的制备温度为约25℃至约70℃，优选约55℃。
本申请的第四方面涉及一种药物组合物，其包含前述任一项中所述结构的化合物以及核酸。优选地，所述药物组合物含有任何一种或多种上述化合物，优选选自表1的任何一种或多种脂质。优选地，所述药物组合物包含表1中第11号、第12号、第41号、第71号、第38号、第64号、第40号、第37号、第39号、第60号、或第62号、第33号、第35号、第42号、第43号、第44号、第45号、第46号、第47号、第48号、第49号、第50号、第51号、第52号、第53号、第54号、第55号、第56号、第57号、第58号、第59号、第61号、第65号、第66号、第67号、第68号、第69号、或第70号所示的任一种脂质，或其与表1中所示的任何一种或多种其它脂质的组合，或与任何一种或多种脂质及其他相关化学物质的组合。
在一个实施方案中，在所述药物组合物中，脂质和核酸至少部分地或全部以脂质核酸混合物的形式存在。
在一个实施方案中，在所述的药物组合物中，脂质核酸混合物是通过水煮法制备，或通过逆向蒸发法，或者通过直接混合制备。
在一个实施方案中，在所述的药物组合物中，水煮法的制备温度为25℃至约100℃，优选约80℃至约100℃，逆向蒸发法的制备温度为约25℃至约70℃，优选约55℃。
本申请的第五方面涉及一种套装组合，其包含根据前面所述的脂质以及核酸，其中所述脂质和核酸各自独立地提供于第一容器和第二容器中，所述第一容器和第二容器相同或不同。优选地，所述套装组合含有任何一种或多种上述化合物，优选选自表1的任何一种或多种脂质。优选地，所述套装组合包含表1中第11号、第12号、第41号、第71号、第38号、第64号、第40号、第37号、第39号、第60号、或第62号、第33号、第35号、第42号、第43号、第44号、第45号、第46号、第47号、第48号、第49号、第50号、第51号、第52号、第53号、第54号、第55号、第56号、第57号、第58号、第59号、第61号、第65号、第66号、第67号、第68号、第69号、或第70号所示的任一种脂质，或其与表1中所示的任何一种或多种其它脂质的组合，或与任何一种或多种脂质及其他相关化学物质的组合。
在一个实施方案中，在所述的药物组合物中，在临使用前将所述脂质和 所述核酸至少部分地或全部地配制成脂质核酸复合物。
在一个实施方案中，在所述的药物组合物中，所述脂质核酸复合物的配制方法是通过水煮法制备，或通过逆向蒸发法，或者通过直接混合制备。
在一个实施方案中，在所述的药物组合物中，所述水煮法的制备温度为约25℃至约100℃，优选约100℃，逆向蒸发法的制备温度为约25℃至约70℃，优选约55℃。
本申请的第六方面涉及将核酸递送至靶细胞中的方法，包括将前述任一项所述的药物组合物或者以前述任一项所述的套装组合的形式提供核酸。
本申请的第七方面涉及一种将核酸体内递送至有此需要的对象中的方法，其中以前述任一项所述的药物组合物或者以前述任一项所述的套装组合的形式提供所述核酸。
在一个实施方案中，在上述方法中，其对象是人或动物，如哺乳动物。
在一个实施方案中，本上述方法中，将核酸体内递送至所述对象的血液循环中或者靶组织/细胞中。
在一个实施方案中，本上述方法中，包括直接将前面任一项所述的药物组合物或者以前面任一项所述的套装组合通过消化道递送至有需要的对象中。
在前面任一项所述的任何方面或实施方案，例如在药物组合物或套装组合中，其中所述核酸和脂质配制成经表面施用和/或注射施用。
在前面任一项所述的任何方面或实施方案，例如在药物组合物或套装组合中，其中所述核酸和脂质配制成经消化道、经呼吸道和/或注射施用。
在前面任一项所述的任何方面或实施方案，例如在药物组合物或套装组合中，其中所述核酸和脂质配制成经口服、吸入和/或注射施用。
在前面任一项所述的任何方面或实施方案，例如在药物组合物或套装组合中，其中所述核酸是小RNA。
在前面任一项所述的任何方面或实施方案，例如在药物组合物或套装组合中，其中所述核酸具有茎环结构。
在前面任一项所述的任何方面或实施方案，例如在药物组合物或套装组合中，其中所述小RNA长度为14-32bp、18-24bp，例如长度为14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32bp。
在上述任何方面或实施方案中，药物组合物或套装组合或化合物可以是 口服的。
在上述任何方面或实施方案中，核酸可以用于治疗疾病，例如心脏、脾、肾、胃、肺和/或肠疾病，例如癌症，例如胃癌或肺癌。
在上述任何方面或实施方案中，可以使用脂质组合，所述脂质组合为下列任一项的组合：第8号:第41号＝6:1的脂质组合；第38号:第41号＝6:1的脂质组合；第39号:第41号＝6:1的脂质组合；第40号:第41号＝6:1的脂质组合；第38:12:41:29号＝1:2:1:1的脂质组合；第40:12:41号＝2:4:3的脂质组合；第12:41号＝1:6的脂质组合；第12:41号＝1:1的脂质组合；第12:41号＝6:1的脂质组合；第40:12:41号＝2:2:2的脂质组合；第4:12:41号＝1:1:1的脂质组合；第1:2:3:19:35号＝1:1:1:1:1的DG组合；第6:9:10:13:15:16:18:20:21:22:23:24:25:26:27:28:32:33号＝1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1的TG组合；第36:37号＝1:1的LPC组合；第11:12号＝1:1的PC组合；第8:38号＝1:1的PE组合；第4:14号＝1:1的Cer组合；第17:30:31号＝1:1:1的So组合；无第5、7号的第1-36号的等体积组合；无第5、7、34号的第1-36号的等体积组合；无第5、7、1、2、3、19、35号的第1-36号的等体积组合；无第5、7、6、9、10、13、15、16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、32、33号的第1-36号的等体积组合；无第5、7、36、37号的第1-36号的等体积组合；无第5、7、11、12号的第1-36号的等体积组合；无第5、7、8号的第1-36号的等体积组合；无第5、7、4、14号的第1-36号的等体积组合；无第5、7、29号的第1-36号的等体积组合；脂质第1号:第34号＝2:1；脂质第1号:所述DG组合＝2:1；脂质第1号:所述TG组合＝2:1；脂质第1号:所述LPC组合＝2:1；脂质第1号:第8号＝2:1；脂质第1号:第12号＝2:1；脂质第1号:所述Cer组合＝2:1；脂质第1号:So组合＝2:1；脂质第1号:第29号＝2:1；脂质第1号:第8号:第12号＝1:1:1；脂质第8号:第34号＝2:1；脂质第8号:DG组合＝2:1；脂质第8号:TG组合＝2:1；脂质第8号:LPC组合＝2:1；脂质第8号:第37号＝4:1；脂质第8号:第12号＝2:1；脂质第8号:Cer组合＝2:1；脂质第8号:So组合＝2:1；脂质第8号:第31号＝6:1；脂质第8号:第29号＝2:1；第12号:第34号＝2:1；第12号:DG组合＝2:1；第12号:TG组合＝2:1；第12号:LPC组合＝2:1；第12号:脂质第8号＝2:1；第12号:Cer组合＝2:1；第12号:So组合＝2:1；第12号:第29号＝2:1；第12号:脂质第8号:第1&2号＝2:1:1；第12号:脂质第8号:第15号＝2:1:1；第12号:脂质第8号:第36&37号＝2:1:1；第12号:脂质第8号:第11号＝2:1:1；第12号:脂质第8号:第12号＝2:1:1；第12号:脂质第8号:第4号＝2:1:1；第12号:脂质第 8号:第31号＝2:1:1；第12号:脂质第8号:第29号＝2:1:1；第12号:脂质第8号:第34号＝3:2:1；第12号:脂质第8号:第34号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:脂质第2号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:脂质第2号＝16:8:3；第12号:脂质第8号:第32号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:第37号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:第11号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:第38号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:第4号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:第31号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:第29号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:第29号:第31号＝2:1:1:1；第12号:脂质第8号:第29号:第31号:第34号＝4:2:2:2:5；第12号:脂质第8号:第29号:第31号:脂质第2号＝4:2:2:2:5；第12号:脂质第8号:第29号:第31号:第32号＝4:2:2:2:5；第12号:脂质第8号:第29号:第31号:第11号＝4:2:2:2:5；第12号:脂质第8号:第29号:第31号:第37号＝4:2:2:2:5；第12号:脂质第8号:第29号:第31号:第38号＝4:2:2:2:5；第12号:脂质第8号:第29号:第31号:第4号＝4:2:2:2:5；第12号:脂质第8号:第29号:第31号:第4号:脂质第1号:第16号＝2:1:1:3:2:2:3；脂质第1号:脂质第8号:第12号:脂质第1&2号＝2:2:2:3；脂质第1号:脂质第8号:第12号:第15号＝2:2:2:3；脂质第1号:脂质第8号:第12号:第36&37号＝2:2:2:3；脂质第1号:脂质第8号:第12号:第12号＝2:2:2:3；脂质第1号:脂质第8号:第12号:第4号＝2:2:2:3；脂质第1号:脂质第8号:第12号:第31号＝2:2:2:3；脂质第1号:脂质第8号:第12号:第29号＝2:2:2:3；脂质第8号:第34号:脂质第1&2号＝2:1:1；脂质第8号:第34号:第15号＝2:1:1；脂质第8号:第34号:第36&37号＝2:1:1；脂质第8号:第34号:第12号＝2:1:1；脂质第8号:第34号:第4号＝2:1:1；脂质第8号:第34号:第31号＝2:1:1；脂质第8号:第34号:第29号＝2:1:1；脂质第8号:第31号:第34号＝12:3:5；脂质第8号:第31号:脂质第2号＝12:3:5；脂质第8号:第31号:第37号＝12:3:5；脂质第8号:第31号:第11号＝12:3:5；脂质第8号:第31号:第12号＝12:3:5；脂质第8号:第31号:第4号＝12:3:5；脂质第8号:第31号:第29号＝12:3:5；脂质第8号:第31号:第32号＝12:3:5；脂质第8号:第4号:第34号＝12:3:5；脂质第8号:第4号:脂质第2号＝12:3:5；脂质第8号:第4号:第37号＝12:3:5；脂质第8号:第4号:第12号＝12:3:5；脂质第8号:第4号:第31号＝12:3:5；脂质第8号:第4号:第29号＝12:3:5；脂质第8号:第4号:第32号＝12:3:5；第38号:第34号＝2:1；第38号:脂质第1号＝2:1；第38号:脂质第2号＝2:1；第38号:第1&2号＝2:1；第38号:第15号＝2:1；第38号:第32号＝2:1；第38号:第37号＝2:1；第38号:第37号＝4:1；第38号:第11号＝2:1；第38号:第12号＝2:1；第38号:第11&12号＝2:1；第38号:第12号＝4:1；第38号:脂质第8号＝2:1；第38号:第4号＝2:1；第 38号:So(30)＝2:1；第38号:第31号＝2:1；第38号:第29号＝2:1；脂质第1号:第38号:第12号:第34号＝2:2:2:3；脂质第1号:第38号:第12号:第15号＝2:2:2:3；脂质第1号:第38号:第12号:第37号＝2:2:2:3；脂质第1号:第38号:第12号:脂质第8号＝2:2:2:3；脂质第1号:第38号:第12号:第4号＝2:2:2:3；脂质第1号:第38号:第12号:第31号＝2:2:2:3；脂质第1号:第38号:第12号:第29号＝2:2:2:3；第38号:第34号:脂质第1号＝2:1:3；第38号:第34号:第15号＝2:1:3；第38号:第34号:第37号＝2:1:3；第38号:第34号:第12号＝2:1:3；第38号:第34号:脂质第8号＝2:1:3；第38号:第34号:第4号＝2:1:3；第38号:第34号:第31号＝2:1:3；第38号:第34号:第29号＝2:1:3；第38号:第12号:脂质第1号＝2:1:3；第38号:第12号:脂质第2号＝4:1:3；第38号:第12号:第15号＝2:1:3；第38号:第12号:第37号＝2:1:3；第38号:第12号:脂质第8号＝2:1:3；第38号:第12号:第4号＝2:1:3；第38号:第12号:第31号＝2:1:3；第38号:第12号:第29号＝2:1:3；第38号:第12号:脂质第1号:第15号:第34号＝22:22:22:33:36；第38号:第12号:脂质第1号:第15号:第37号＝22:22:22:33:36；第38号:第12号:脂质第1号:第15号:第4号＝22:22:22:33:36；第38号:第12号:脂质第1号:第15号:第31号＝22:22:22:33:36；第38号:第12号:脂质第1号:第15号:第29号＝22:22:22:33:36；第38号:第34号:第37号:脂质第1号＝44:22:33:36；第38号:第34号:第37号:第15号＝44:22:33:36；第38号:第34号:第37号:第12号＝44:22:33:36；第38号:第34号:第37号:第4号＝44:22:33:36；第38号:第34号:第37号:第31号＝44:22:33:36；第38号:第12号:第4号:第34号＝44:22:33:36；第38号:第12号:第4号:脂质第1号＝44:22:33:36；第38号:第12号:第4号:第15号＝44:22:33:36；第38号:第12号:第4号:第37号＝44:22:33:36；第38号:第12号:第4号:第37号＝8:2:5:3；第38号:第12号:第4号:第31号＝44:22:33:36；第38号:第12号:第4号:第29号＝44:22:33:36；第38号:第12号:第4号:第29号:第34号＝88:44:66:72:135；第38号:第12号:第4号:第29号:脂质第1号＝88:44:66:72:135；第38号:第12号:第4号:第29号:第15号＝88:44:66:72:135；第38号:第12号:第4号:第29号:第37号＝88:44:66:72:135；第38号:第12号:第4号:第29号:第31号＝88:44:66:72:135；第38号:第12号:第4号:脂质第2号＝20:10:15:9；第38号:第12号:第4号:第6号＝20:10:15:9；第38号:第12号:第4号:第17号＝20:10:15:9；第38号:第12号:第4号:第29号＝20:10:15:9；第38号:第12号:第4号:第34号＝20:10:15:9；第38号:第12号:第4号:第37号＝20:10:15:9；第38号:第12号:第31号:第34号＝2:1:3:3；第38号:第12号:第31号:脂质第1号＝2:1:3:3；第38号:第12 号:第31号:第15号＝2:1:3:3；第38号:第12号:第31号:第37号＝2:1:3:3；第38号:第12号:第31号:第4号＝2:1:3:3；第38号:第12号:第31号:第29号＝2:1:3:3；第38号:第34号:第37号:第31号:脂质第1号＝88:44:66:72:135；第38号:第34号:第37号:第31号:第15号＝88:44:66:72:135；第38号:第34号:第37号:第31号:第12号＝88:44:66:72:135；第38号:第34号:第37号:第31号:第4号＝88:44:66:72:135；第38号:第34号:第37号:第31号:第29号＝88:44:66:72:135；第38号:第37号:第34号＝4:2:3；第38号:第37号:脂质第1号＝4:2:3；第38号:第37号:脂质第2号＝4:2:3；第38号:第37号:第1&2号＝4:2:3；第38号:第37号:脂质第2号＝32:8:5；第38号:第37号:第32号＝32:8:5；第38号:第37号:第15号＝4:2:3；第38号:第37号:第32号＝4:2:3；第38号:第37号:脂质第8号＝4:2:3；第38号:第37号:第11号＝4:2:3；第38号:第37号:第12号＝4:2:3；第38号:第37号:第11&12号＝4:2:3；第38号:第37号:第12号＝4:1:1；第38号:第37号:第4号＝4:2:3；第38号:第37号:第30号＝4:2:3；第38号:第37号:第31号＝4:2:3；第38号:第37号:第29号＝4:2:3；脂质第8号:第37号:第32号＝4:1:2；脂质第8号:第37号:脂质第2号＝4:1:2；第38号:第37号:第15号:第34号＝64:16:10:45；第38号:第37号:第15号:脂质第1号＝64:16:10:45；第38号:第37号:第15号:第12号＝64:16:10:45；第38号:第37号:第15号:第4号＝64:16:10:45；第38号:第37号:第15号:第31号＝64:16:10:45；第38号:第37号:第15号:第29号＝64:16:10:45；第38号:脂质第2号:第37号＝4:2:3；第38号:脂质第2号:第31号＝4:2:3；第38号:脂质第2号:第29号＝4:2:3；第38号:脂质第2号:第34号＝4:2:3；第38号:脂质第2号:第32号＝4:2:3；第38号:脂质第2号:第12号＝4:2:3；第38号:脂质第2号:第12号＝4:5:1；第38号:脂质第2号:第4号＝4:2:3。在一个实施方案中，脂质第1&2号、第11&12号或第36&37号可以分别表示任何比例的脂质第1和2号、第11和12号或第36和37号，其中脂质的工作浓度如表1和实施例中所示。
本申请还提供了具有下式结构的化合物、包含该化合物的组合或组合物，以及使用该化合物或组合或组合物以递送核酸的方法、以及该化合物或组合或组合物在制备用于核酸递送的试剂中的用途：
Figure PCTCN2019080175-appb-000008
其中，
其中L 1、L 2、L 3不存在，或L 1、L 2、L 3各自独立选自-C(O)O-CH 2-，-CH(OH)-，-CH 2-O-C(O)-，-C(O)O-，-C(O)NH-；
条件是L 1、L 2、L 3中至多两个不存在；
对于二价基团L 1、L 2而言，左侧的破折号“-”分别连接至基团A和B，而右侧的破折号“-”分别连接至中心碳原子；
对于二价基团L 3而言，左侧的破折号“-”连接至中心碳原子，而右侧的破折号“-”连接至Q；
A，B，Q各自独立选自H，-OH，C 1-20烷基，C 1-20烯基，-NH 2，和-NR 3 +，R为H或C 1-6烷基。
在一个实施方案中，化合物可以具有以下结构：
Figure PCTCN2019080175-appb-000009
其中，
A选自直链C 10-20烷基和直链C 10-20烯基；
B选自直链C 10-20烷基和直链C 10-20烯基；
Q为‐OH；
优选地，
A选自直链C 15-20烷基和直链C 15-20烯基；
B选自直链C 15-20烷基和直链C 15-20烯基；
Q为‐OH；
优选地，
A选自直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
B选自直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
Q为‐OH。
在另一个实施方案中，所述化合物可以具有以下结构：
Figure PCTCN2019080175-appb-000010
其中，
A选自直链C 10-20烷基和直链C 10-22烯基；
B选自直链C 10-20烷基和直链C 10-22烯基；
Q选自直链C 10-20烷基和直链C 10-22烯基；
优选地，
A选自直链C 15-18烷基和直链C 15-22烯基；
B选自直链C 15-18烷基和直链C 15-22烯基；
Q选自直链C 15-18烷基和直链C 15-22烯基；
优选地，
A选自直链C 15-18烷基和直链C 15-20烯基；
B选自直链C 15-18烷基和直链C 15-20烯基；
Q选自直链C 15-18烷基和直链C 15-20烯基。
在另一个实施方案中，化合物可以具有以下结构：
Figure PCTCN2019080175-appb-000011
其中，
A选自直链C 10-20烷基和直链C 10-20烯基；
B选自直链C 10-20烷基和直链C 10-20烯基；
Q为-OH；
优选地，
A选自直链C 15-20烷基和直链C 15-18烯基；
B选自直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
Q为-OH；
优选地，
A为直链C 15-20烷基；
B为直链C 15-18烷基；
Q为-OH。
在又一个实施方案中，化合物可以具有以下结构：
Figure PCTCN2019080175-appb-000012
其中，
A选自直链C 10-20烷基和直链C 10-20烯基；
Q为-OH；
优选地，
A选自直链C 10-20烷基和直链C 15-18烯基；
Q为-OH；
优选地，
A为直链C 15-20烷基；
Q为-OH。
在本申请的任何方面或实施方案中，化合物可以是上述的化合物。
在本申请的任何方面或实施方案中，化合物或提取物或组合物可以是合成的或天然存在的或提取自中药。
在本申请的任何方面或实施方案中，核酸递送是对细胞或器官的核酸递送。在各个实施方案中，器官选自心脏、脾、肾、胃、肺和肠。
通过本申请所提供的以上技术方案，能够显著改进核酸的高效靶向递送，克服了现有技术中核酸脂质体存在包封率低、安全性差、稳定性差、制备工艺复杂、产品不均一、难以重现、以及靶向性有待进一步提高的缺陷。
表1-1 中药来源的69种脂质列表
Figure PCTCN2019080175-appb-000013
Figure PCTCN2019080175-appb-000014
Figure PCTCN2019080175-appb-000015
Figure PCTCN2019080175-appb-000016
Figure PCTCN2019080175-appb-000017
表1-2：脂质1-32的描述
Figure PCTCN2019080175-appb-000018
Figure PCTCN2019080175-appb-000019
Figure PCTCN2019080175-appb-000020
Figure PCTCN2019080175-appb-000021
表1-2：脂质33-71的描述
Figure PCTCN2019080175-appb-000022
Figure PCTCN2019080175-appb-000023
Figure PCTCN2019080175-appb-000024
Figure PCTCN2019080175-appb-000025
Figure PCTCN2019080175-appb-000026
Figure PCTCN2019080175-appb-000027
术语定义
本申请所使用的术语可在其前面和/或后面具有单个破折号“-”(或横线)或双重破折号“＝”以表明在所提及的取代基和其母体部分之间的键的键级；单个破折号“-”(或横线)表明为单键，双重破折号表明为双键。在没有单个或双重破折号的情况下，理解为在取代基和其母体部分之间形成单键；另外，意在“从左到右”读取取代基，除非破折号表明其它含义。例如，C1-C6烷氧基羰基氧基和-OC(O)OC1-C6烷基表明相同的官能团。
“烷基”是指直链或支链的饱和烃链。如本文所述，烷基具有1至20个碳原子(即，C1-20烷基)，1至8个碳原子(即，C1-8烷基)，1至6个碳原子(即，C1-6烷基)，或1至4个碳原子(即，C1-4烷基)。在一个实施方案中，所述烷基为C10-20烷基。在一个实施方案中，所述烷基为C15-20烷基。在一个实施方案中，所述烷基为C15-18烷基，即C15，C16，C17，C18烷基。
“烯基”是指包含至少一个碳-碳双键且具有2至20个碳原子(即，C2-20烯基)，2至8个碳原子(即，C2-8烯基)，2至6个碳原子(即，C2-6烯基)，或2至4个碳原子(即，C2-4烯基)的脂族基。在一个实施方案中，所述烯基为C10-20烯基。在一个实施方案中，所述烯基为C15-20烯基。在一个实施方案中，所述烯基为C15-18烯基，即C15，C16，C17，C18烯基。
“杂烷基”和“杂烯基”分别是指如上定义的烷基和烯基，其中一个或多 个碳原子各自独立被相同或不同杂原子基团代替。作为举例，1、2或3个碳原子可独立地被相同或不同的杂原子基团代替。杂原子基团包括，但不限于，-NR1-、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-等，其中R1为H、烷基。杂烷基的实例包括-OCH3、-CH2OCH3、-SCH3、-CH2SCH3、-NR1CH3和-CH2NR1CH3，其中R1为氢、烷基。
本申请中所述的逆向蒸发法，是指将核酸的水溶液加入到脂质有机溶剂溶液中，超声，蒸发挥除有机溶剂后，水化得到脂质与核酸的混合物。
本申请所述的水煮法(也称加热法)，是指将脂质的有机溶剂溶液加到核酸的水溶液中，约100℃煮30min，得到脂质与核酸的混合物；该方法并不限于水煮升温，还可以通过其它现有技术中已知的升温或加热的方式实现。
逆向蒸发法和水煮法，在受控的温度和混合条件下进行。合适的处理时间、和温度可以由本领域技术人员容易地确定。例如，逆向蒸发法的温度的范围优选约25℃至约70℃，更优选约30℃至约65℃，并且更优选约40℃至约60℃，特别是约55℃。水煮法温度的范围优选约25℃至约100℃，更优选约50℃至约100℃，并且更优选约95℃至约100℃，特别优选为约80℃至100℃。
本申请所述的核酸包括DNA和RNA，优选小RNA，例如所述小RNA长度可以是14-32bp、16-28bp、18-24bp，具体地其长度可以是14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32bp。
附图说明
图1：12种脂质对核酸(HJT-sRNA-m7)吸收和进入细胞(人胃癌细胞系NCI-N87)的影响(逆向蒸发法)。
图2：27种脂质单体促进核酸进入MRC-5细胞系(逆向蒸发法)。
图3：23种脂质单体促进核酸进入MRC-5细胞系(水煮法)。
图4：23种脂质单体促进核酸进入A549细胞系(水煮法)。
图5：脂质组合能促进核酸进入MRC-5细胞系(逆向蒸发法)。
图6：脂质组合能促进核酸进入A549细胞系(逆向蒸发法)。
图7：脂质组合能促进核酸进入MRC-5细胞系(水煮法)。
图8：脂质组合能促进核酸进入A549细胞系(水煮法)。
图9：不同种类脂质组合促进核酸进入Caco-2细胞系(逆向蒸发法)。
图10：不同种类脂质组合促进核酸进入Caco-2细胞系(水煮法)。
图11A-C：脂质单体(#11与#12)促进不同序列的核酸进入不同细胞。
图12：荧光原位杂交实验表明核酸在脂质单体递送辅助下进入细胞质。
图13：脂质单体(#11与#12)可促进核酸进入细胞，靶向基因3’UTR区域。
图14：脂质单体(#11与#12)促进核酸通过消化道进入血和肺。
图15：逆向蒸发法和水煮法制备的脂质组合物促进核酸通过消化道进入血和肺。
图16：不同类别脂质组合递送单链核酸进入MRC-5。
图17A-F：脂质组合递送单链核酸进入MRC-5或Caco-2细胞。
图18A-C：脂质组合递送单链核酸进入细胞。
图19A-C：脂质组合递送单链核酸进入细胞。
图20A-C：脂质组合递送单链核酸进入细胞。
图21：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。
图22：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。
图23：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。
图24：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。
图25：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。
图26：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。
图27：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。
图28：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。
图29：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。
图30：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。
图31：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。
图32：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。
图33：脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞。
图34：脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞。
图35：脂质组合递送双链核酸进入A549细胞。
图36：脂质组合递送双链核酸进入A549细胞。
图37：脂质组合递送双链核酸进入A549细胞。
图38：脂质组合递送双链核酸进入A549细胞。
图39：脂质组合递送双链核酸进入A549细胞。
图40：脂质组合递送双链核酸进入A549细胞。
图41：脂质组合递送双链核酸进入A549细胞。
图42：脂质组合递送双链核酸进入A549细胞。
图43：脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞。
图44：脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞。
图45：脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞。
图46：脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞。
图47：脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞。
图48：脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞。
图49：脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞。
图50：脂质组合促进核酸通过消化道进入肺。
图51：No.8(PE)：No.12(PC)(v:v＝1:2)介导抗纤维化HJT-sRNA-m7进入MRC-5细胞。
图52：No.8(PE):No.12(PC)(v:v＝1:2)介导siRNA进入A549细胞。
图53：No.8(PE):No.12(PC)(v:v＝1:2)介导siRNA进入A549细胞。
图54：No.8(PE):No.12(PC)(v:v＝1:2)介导siRNA进入THP-1细胞。
图55：No.8(PE):No.12(PC):No.2(DG)(v:v:v＝2:4:3)介导抗纤维化HJT-sRNA-m7进入MRC-5细胞。
图56：No.8(PE):No.12(PC):No.2(DG)(v:v:v＝2:4:3)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达。
图57：No.8(PE):No.12(PC):No.4(Cer)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物介导抗纤维化HJT-sRNA-m7进入MRC-5细胞(水煮法)。
图58：No.8(PE):No.12(PC):No.4(Cer)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物介导NFκBsiRNA进入THP-1细胞抑制基因表达(水煮法)。
图59：No.8(PE):No.12(PC):No.PC(11)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达。
图60：No.8(PE):No.12(PC):No.LPC(37)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达。
图61：No.8(PE):No.12(PC):No.MG(34)(v:v:v＝2:3:1)脂质混合物介导CPSF4 siRNA进入A549细胞抑制基因表达。
图62：No.38(PE):No.37(LPC):No.32(TG)(v:v:v＝32:8:5)脂质混合物介 导抗纤维化HJT-sRNA-m7进入MRC-5细胞(水煮法)。
图63：No.38(PE):No.37(LPC):No.32(TG)(v:v:v＝32:8:5)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达。
图64：No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v:v:v:v:v:v:v＝2:1:2:2:3:1:3)介导抗纤维化HJT-sRNA-m7进入MRC-5细胞(水煮法)。
图65：No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v:v:v:v:v:v:v＝2:1:2:2:3:1:3)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法)。
图66：No.8(PE):No.12(PC):No.31(So):No.29(FA):No.4(Cer)(v:v:v:v:v＝2:4:2:2:2.5)介导具有抗纤维化效应的HJT小RNA HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3、HJT-sRNA-m7进入MRC-5细胞(水煮法)。
图67：No.8(PE):No.12(PC):No.31(So):No.29(FA):No.4(Cer)(v:v:v:v:v＝2:4:2:2:5)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。
图68：No.38(PE):No.37(LPC)(v:v＝4:1)介导具有抗纤维化效应的HJT小RNA HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3、HJT-sRNA-m7进入MRC-5细胞(水煮法)。
图69：No.38(PE):No.37(LPC)(v:v＝4:1)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法)。
图70：No.38(PE):No.12(PC):No.2(DG)(v:v:v＝4:1:3)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达。
图71：No.38(PE):No.37(LPC):No.12(PC)(v:v:v＝4:1:1)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达(逆向蒸发法)。
图72：No.4(Cer):No.12(PC):No.38(PE):No.37(LPC)(v:v:v:v＝5:2:8:3)脂质混合物介导抗纤维化小RNA HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3、HJT-sRNA-m7进入MRC-5细胞(水煮法)。
图73：No.4(Cer):No.12(PC):No.38(PE):No.37(LPC)(v:v:v:v＝5:2:8:3)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法)。
图74：No.38(PE):No.2(DG):No.31(So)(v:v:v＝4:2:3)脂质混合物介导抗纤维化小RNA HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3、HJT-sRNA-m7进入MRC-5细胞(水煮法)。
图75：No.38(PE):No.2(DG):No.31(So)(v:v:v＝4:2:3)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法)。
图76：脂质41通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞。
图77：脂质41通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入MRC-5细胞。
图78：脂质41通过水煮法法递送单链RNA进入A549及MRC-5细胞。
图79：数字PCR(ddPCR)技术检测脂质递送核酸效率。
图80：流式细胞技术检测脂质递送核酸效率。
图81：共聚焦荧光显微镜观察脂质递送核酸在细胞中的定位。
图82：Western Blotting实验检测脂质递送核酸的效率。
图83：脂质单体No.41介导抗纤维化HJT-sRNA-m7进入MRC-5细胞(水煮法)。
图84：脂质组合1(No.8+No.41＝6:1)与脂质组合2(No.38+No.41＝6:1)在核酸递送中的作用。
图85：脂质组合3(No.39+No.41＝6:1)与脂质组合4(No.40+No.41＝6:1)在核酸递送中的作用。
图86：脂质组合5(38+12+41+29＝1:2:1:1)在核酸递送中的作用。
图87：脂质组合6(40(PE)+12(PC)+41(So)＝2:4:3)在核酸递送中的作用。
图88：脂质组合7(12(PC)+41(So)＝1:6)和脂质组合8(12(PC)+41(So)＝1:1)在核酸递送中的作用。
图89：脂质组合9(12(PC)+41(So)＝6:1)和脂质组合10(40(PE)+12(PC)+41(So)＝2:2:2)在核酸递送中的作用。
图90：脂质组合11(4(Cer)+12(PC)+41(So)＝1:1:1)在核酸递送中的作用。
图91：脂质38通过水煮法递送双链RNA进入A549细胞及MRC-5细胞。
图92：脂质38通过水煮法递送单链RNA进入A549细胞及MRC-5细胞。
图93：数字PCR(ddPCR)技术检测脂质递送核酸效率。
图94：流式细胞技术检测脂质递送核酸效率。
图95：共聚焦荧光显微镜观察脂质递送核酸在细胞中的定位。
图96：脂质64通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞。
图97：流式细胞技术检测脂质递送核酸效率。
图98：共聚焦荧光显微镜观察脂质递送核酸在细胞中的定位。
图99：脂质40通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送dsRNA进入A549细胞。
图100：数字PCR(ddPCR)技术检测脂质递送核酸效率。
图101：共聚焦荧光显微镜观察脂质递送核酸在细胞中的定位
图102：Western Blotting实验检测脂质递送核酸的效率。
图103：脂质37通过水煮法递送单链RNA进入A549细胞及MRC-5细胞。
图104：脂质39通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞。
图105：数字PCR(ddPCR)技术检测脂质递送核酸效率。
图106：脂质60通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞。
图107：脂质62通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞。
图108：脂质41可以促进小RNA进入血液，保护其在血液中不被降解。
图109：脂质41可以促进小RNA进入胃部细胞，保护其在胃中不被降解。
图110：脂质41可以促进小RNA进入小肠细胞，保护其在小肠中不被降解。
图111：脂质41可以促进小RNA进入肝脏，保护其在肝脏中不被降解。
图112：PE单体(No.38)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液。
图113：PE单体(No.40)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液。
图114：PE单体(No.64)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液。
图115：PE单体(No.71)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液。
图116：脂质在不同温度梯度有效递送单链核酸进入MRC5细胞。
图117a-c：脂质No.33经口服递送小RNA入血、入心和入肾情况。
图118a-b：脂质No.35经口服递送小RNA入心和入肾情况。
图119：脂质No.37经口服递送小RNA入肠情况。
图120a-b：脂质No.42经口服递送小RNA入脾和入肾情况。
图121a-b：脂质No.43经口服递送小RNA入心和入肠情况。
图122a-b：脂质No.44经口服递送小RNA入脾和入肠情况。
图123a-d：脂质No.45经口服递送小RNA入心、入脾、入肾和入肠情况。
图124a-d：脂质No.46经口服递送小RNA入血、入心、入肾和入肠情况。
图125a-c：脂质No.47经口服递送小RNA入血、入心和入肠情况。
图126a-c：脂质No.48经口服递送小RNA入血、入心和入肾情况。
图127a-c：脂质No.49经口服递送小RNA入血、入心和入脾情况。
图128a-c：脂质No.50经口服递送小RNA入血、入心和入脾情况。
图129a-b：脂质No.51经口服递送小RNA入血和入心情况。
图130a-b：脂质No.52经口服递送小RNA入血和入心情况。
图131a-c：脂质No.53经口服递送小RNA入血、入心和入肾情况。
图132a-b：脂质No.54经口服递送小RNA入血和入肾情况。
图133a-c：脂质No.55经口服递送小RNA入血、入心和入肾情况。
图134a-b：脂质No.56经口服递送小RNA入血和入心情况。
图135：脂质No.57经口服递送小RNA入肾情况。
图136a-b：脂质No.58经口服递送小RNA入心和入肠情况。
图137：脂质No.59经口服递送小RNA入肠情况。
图138：脂质No.60经口服递送小RNA入肠情况。
图139a-c：脂质No.61经口服递送小RNA入心、入肾和入肠情况。
图140：脂质No.62经口服递送小RNA入肠情况。
图141a-b：脂质No.65经口服递送小RNA入肾和入肠情况。
图142a-c：脂质No.66经口服递送小RNA入血、入心和入肠情况。
图143a-c：脂质No.67经口服递送小RNA入心、入脾和入肠情况。
图144a-c：脂质No.68经口服递送小RNA入心、入脾和入肠情况。
图145a-b：脂质No.69经口服递送小RNA入脾和入肾情况。
图146a-b：脂质No.70经口服递送小RNA入心和入脾情况。
具体实施方式
下面对本申请作进一步的说明，但不以任何方式对本申请加以限制，基于本申请教导所作的任何变换，均落入本申请的保护范围。
本申请通过Bligh&Dyer法提取中药(包括红景天(Rhodiola crenulata)，蒲公英(Taraxacum mongolicum)，穿心莲(Andrographis paniculata)及金银花(Lonicera japonica))中的脂溶性成分，利用HPLC-MS/MS鉴定其中脂质成分(共鉴定脂质成分138种，阳离子模式125种，阴离子模式13种)，将其中71种(见表1-1到表1-3)用于脂质核酸混合物的制备，观察其能否促进外源核酸的细胞吸收与进入。需要说明的是，本申请使用的脂质均为商业购买或商业合成，并非从中药中直接提取。发明人令人惊奇地发现，多种脂质均可以形成脂质核酸复合物，有效促进核酸的细胞吸收与进入(见图1-116)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。进一步研究表明，在不同细胞系上本申请的脂质核酸混合物均能促进核酸吸收与进入细胞的效率，但在不同细胞系上存在差异(见图1-10)，这为药物靶向递送提供了可能性。而且这种脂质核酸复合物的核酸递送不具有序列的选择性，可以递送与小RNA大小对应(比如20bp左右)的不同序列的核酸片段(见图11)。此外，荧光原位杂交实验(Fluorescence in situ hybridization,FISH)证实，汤剂来源脂质形成的脂质核酸混合物可以有效促进外源核酸进入细胞质(见图12)。发明人意外地发现，通过水煮法或逆向蒸发法制备的脂质核酸混合物能够促进核酸如sRNA通过非侵入式(如经消化道或经呼吸道以及表面施用)途径进入血液循环中和目标组织中(见图14-15)。发明人还意外地发现，本申请的脂质能够促进核酸如sRNA进入细胞，并调控(如抑制)其目标序列的表达，而对非目标序列则不显示出这种调控作用，显示出其目标特异性的调控作用，可作为核酸药物的递送方式(见图13)。
基于上述的一系列意外发现，发明人从而得到了本申请。
在一个方面中，本申请提供了从中药中提取的有利于递送核酸的化合物，其中所述化合物选自溶血卵磷脂、神经酰胺、甘油二酯、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、甘油三酯、单半乳糖甘油二酯、(神经)鞘氨醇、磷脂酰乙醇、单酰基甘油、脂肪酸、血小板活化因子、或二甲基磷脂酰乙醇胺，优选自表1所示的脂质。在一个实施方案中，所述脂质是非天然的，例如合成的，或者发酵生产的。
在一个实施方案中，所述脂质用于将核酸递送至靶细胞中。在另一个实施方案中，所述脂质用于将核酸递送至有此需要的对象体内，进入其血液循环和/或目标部位/细胞中。
在一个优选的实施方案中，所述脂质选自磷脂酰胆碱，例如1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PC(18:0/18:2)，即表1中第11号脂质)，和1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PC(16:0/18:2)，即表1中第12号脂质)。这两种磷脂酰胆碱(phosphocholine,PC)能够高效地包裹核酸或促进核酸进入细胞。在一个实施方案中，脂质可以是表1中的第41号脂质，即二氢神经鞘氨醇(d22:0)，其能够高效地包裹核酸或促进核酸进入细胞。
在另一个方面中，本申请提供一种药物组合物，其包含上述脂质和核酸，优选地所述核酸为小RNA。
在一个实施方案中，可以将本申请的药物组合物配制成供非侵入式施用(如表面施用)和/或注射施用，例如配制成供经消化道、经呼吸道和/或注射施用，例如口服、吸入和/或注射施用。在一些情况下，优选使用侵入式施用途径(如注射施用，包括肌肉注射、皮下注射、静脉注射、动脉注射、腹腔注射、目标组织内注射)；而在另一些情况下，则优选使用非侵入式施用途径。
在另一个实施方案中，在本申请的药物组合物中，至少一部分或者全部所述脂质和核酸可以配制成脂质核酸混合物形式。有多种不同的脂质核酸混合物的制备方法已经广泛公开，可以根据实际需要选择合适的脂质核酸复合物的制备方案。
在第三个方面中，本申请提供一种套装组合，其包含本申请所述的脂质以及核酸，其中所述脂质和核酸各自独立地提供于第一容器和第二容器中，所述第一容器和第二容器可以相同或不同。在一些实施方案中，在临使用前将所述脂质和所述核酸至少部分地或全部地配制成脂质核酸复合物。
在第四个方面中，本申请提供一种将核酸递送至靶组织/细胞中的方法，其中以本申请所述药物组合物或者套装组合的形式提供所述核酸。
在第五个方面中，本申请提供一种将核酸体内递送至有此需要的对象中的方法，其中以本申请所述药物组合物或者套装组合的形式提供所述核酸，例如将所述核酸体内递送至所述对象的血液循环中或者靶组织/细胞中，例如其中所述脂质与所述核酸经非侵入式施用(如表面施用)和/或注射施用，例 如经消化道、经呼吸道和/或注射施用，例如口服、吸入和/或注射施用。
在第六个方面中，本申请提供一种预防和/或治疗能用核酸预防和/或治疗之疾病/病症的方法，其包括向有此需要的对象提供本申请所述的药物组合物或套装组合，例如其中所述脂质与所述核酸经非侵入式施用(如表面施用)和/或注射施用，例如经消化道、经呼吸道和/或注射施用，例如口服、吸入和/或注射施用。令人惊奇地是，这种非侵入式的施用方式(例如经消化道、经呼吸道，包括口服、灌胃、吸入等)能够显著促进核酸的进入和发挥功能。
在第七个方面中，本申请提供制备前述药物组合物或套装组合的方法，以及用于上述各方面中所述方法的药物组合物和/或套装组合的用途。此外还提供用于本申请上述各种方法的脂质、药物组合物和/或套装组合。
在本申请的各种实施方案中，所述核酸可以是小RNA，例如所述小RNA长度可以是14-32bp、16-28bp、18-24bp，具体地其长度可以是14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32bp。此外，本申请所述小RNA可以是单链的，例如通过茎环结构连接起来，也可以是双链的。例如，本申请所述核酸可以是HJT-sRNA-m7，其具有如下序列：ugagguagua gguugugugg uuguaagc。
在一个实施方案中，本申请的药物组合物或套装组合或化合物可以用于治疗疾病，例如心脏、脾、肾、胃、肺和/或肠疾病，例如癌症，例如胃癌、肺癌等。
在一个实施方案中，本申请的药物组合物或套装组合或化合物可以用于在体外或在体内处理，例如抑制NCI-N87细胞(胃癌细胞)，MRC-5细胞(肺成纤维细胞)，A549细胞(肺癌细胞)的生长。
在本申请的各种实施方案中，可以通过多种方式获得脂质核酸混合物，例如逆向蒸发法或水煮法。逆向蒸发法，将核酸的水溶液加入到脂质有机溶剂溶液中，超声，蒸发挥除有机溶剂后，水化得到脂质与核酸的混合物。本申请所述的水煮法，是指将脂质的有机溶剂溶液加到核酸的水溶液中，约100℃煮30min，得到脂质与核酸的混合物。逆向蒸发法和水煮法，在受控的温度和混合条件下进行。合适的处理时间和温度可以由本领域技术人员很容易地确定。例如，逆向蒸发法的温度的范围优选约25℃至约70℃，更优选约30℃至约65℃，更优选约40℃至约60℃，特别优选约55℃。水煮法(也称加热法)的温度范围优选约25℃至约100℃，更优选约50℃至约100℃，更优选 约95℃至约100℃，特别优选约100℃。
实施例
以下实施例结合附图仅为举例说明本文公开的发明，在任何情况下都不应解释为对所附权利要求保护范围的限制。
表2 实施例所用小RNA及其序列
Figure PCTCN2019080175-appb-000028
说明：带有“si-”前缀的符号标示为双链sRNA。
针对表1中1-32号脂质的实验例
1.中药中脂质的提取
1.1中药的煎煮制备
1)取100g中药饮片(红景天，购自宁波海曙千草生物科技有限公司；蒲公英，金银花，穿心莲，购自北京同仁堂药店)，加入1000mL ddH 2O浸泡30min。
2)中药煎煮锅强火煎煮15min，弱火煎煮20min。
3)煎煮后的中药药液400mL加入旋转蒸发仪，60℃，60rpm，30min浓缩至100mL。
1.2脂质的提取
1)向160mL根据以上1.1项所得中药汤汁(旋转蒸发仪浓缩)中加入氯仿-甲醇混合液(氯仿:甲醇＝1:2，v/v)600mL，使得氯仿:甲醇:水＝1:2:0.8，搅拌混匀10-15min。
2)向锥形瓶中加入200mL氯仿，搅拌混匀10min。
3)向锥形瓶中加入200mlddH 2OmL，使得氯仿:甲醇:水＝2:2:1.8，搅拌混匀10min。
4)除去上层液体和中间层的不溶性物质，取下层的氯仿层，-40℃冻存。
1.3 HPLC-MS/MS鉴定脂质成分
仪器条件
1)色谱条件：
仪器：Ultimate 3000；色谱柱：Kinetex C18(100×2.1mm,1.9μm)；柱温：45℃；流动相：A：乙腈:水(V/V，60:40)，溶液含10mmol/L甲酸铵，流动相B：乙腈：异丙醇(10:90，V/V)，溶液含10mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸。流速：0.4mL/min；进样量：4μL。
2)质谱参数：
a)正模式：Heater Temp 300℃,Sheath Gas Flow rate,45arb,Aux Gas Flow Rate,15arb,Sweep Gas Flow Rate,1arb,spray voltage,3.0KV,Capillary Temp,350℃,S-Lens RF Level,30％.Scan ranges：200-1500。
b)负模式：Heater Temp 300℃,Sheath Gas Flow rate,45arb,Aux Gas Flow Rate,15arb,Sweep Gas Flow Rate,1arb,spray voltage,2.5KV,Capillary Temp,350℃,S-Lens RF Level,60％.Scan ranges：200-1500。
1.4中药来源的脂质鉴定
利用HPLC-MS/MS鉴定其中的脂质成分，共鉴定中药来源的脂质成分138种，其中阳离子模式鉴定125种，阴离子模式鉴定13种。取表1中所示的化合物1-32继续进行下面的实验。
需要说明的是，下文测试的脂质均为商业购买或商业合成的，并且使用方式如表1-1所述。
2.脂质核酸复合物的制备
2.1逆向蒸发法：
制备600μl的脂质乙醚溶液，并按照表1中所示的脂质编号进行分组，其中第1/2/4/9/14/18/19/20/21/22/23/24/25/26/27/28/29/30/32脂质组中的乙醚溶液浓度为0.017857mg/mL，第3/8/10/11/12/13脂质组中乙醚浓度为0.035714mg/mL，第6/15/16/17/31脂质组中乙醚浓度为0.0035714mg/mL；以5:1的体积比将脂质溶液加入120μl HJT-sRNA-m7单链RNA的DEPC处理的水溶液(15nmol)中，超声3min后，经55℃挥发除去乙醚，然后加入600μl的DEPC处理的水水化，得到HJT-sRNA-m7脂质混合物。
2.2水煮法：
制备60μl的脂质氯仿溶液，并按照表1中所示的脂质编号进行分组，其中第1/2/4/9/14/18/19/20/21/22/23/24/25/26/27/28/29/30/32脂质组中氯仿溶液浓度为5mg/mL，第3/8/10/11/12/13脂质组中氯仿溶液浓度为10mg/mL，第6/15/16/17/32组中氯仿溶液浓度为1mg/mL；将上述脂质氯仿溶液分别与600μl HJT-sRNA-m7(15nmol)单链RNA的DEPC处理水溶液混合，100℃加热30min，获得HJT-sRNA-m7脂质混合物。
3.脂质核酸复合物的体外递送实验
3.1培养NCI-N87细胞(胃癌细胞)，MRC-5细胞(肺成纤维细胞)，A549细胞(肺癌细胞)至对数生长期，然后分别铺板到六孔板，细胞密度为1×10 6/2mL培养基/孔；其中MRC-5细胞培养于Eagle's MEM培养基(MEM,Gibco)中；A549细胞培养于Ham’s F-12培养基(HyClone)中； NCI-N87细胞培养于RPMI-1640培养基(HyClone)中；37℃过夜孵育，待细胞贴壁后进行后续实验。
3.2实验分组如下：
1)NC组：是指未经处理的细胞；该组作为阴性对照组。
2)RNAimax处理组：分别用100μl opti-MEM培养基稀释2μl RNAimax转染试剂和HJT-sRNA-m7溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7的终浓度为200nM；该组作为阳性对照组。
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7溶液(终浓度为200nM)，该组作为阴性对照组。
4)脂质核酸混合物处理组：将步骤2中制备的脂质与HJT-sRNA-m7混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度控制为200nM。
3.3小RNA与细胞共同孵育3h后，用PBS清洗细胞2-3次，用TRIzol裂解液收取细胞，提取其中总RNA，利用RT-qPCR检测进入细胞的小RNA丰度，并利用荧光原位杂交方法对RNA进行定位；其中各个检测方法的步骤具体如下：
3.3.1 RT-qPCR检测小RNA(Taqman探针法)
1)将sRNA逆转录为cDNA：通过逆转录试剂盒(
Figure PCTCN2019080175-appb-000029
MicroRNA Reverse Transcription Kit，cat.no.4366597)，将sRNA逆转录为cDNA，逆转录体系如下：100mM dNTPs(with dTTP)0.15μl，MultiScribe TM逆转录酶,50U/μL 1.00μl，10X RT缓冲液1.5μl，RNA酶抑制剂(20U/μl)0.19μl，无核酸酶H 2O 4.6μl，混匀后加入加入5μlRNA模板(200ng/μl)，混匀后加入3μl 5ⅹTaqman探针引物，混匀后瞬时离心，冰上放置5min，放入PCR仪反应，反应条件如下：(1)16℃，30min；(2)42℃，30min；(3)85℃，5min；(4)4℃，终止反应。反应结束后加入10μl无RNA酶ddH 2O，补足终体积至25μl。该逆转录过程中使用的Taqman探针引物由Invitrogen公司合成(U6：4440887，HJT-sRNA-m7：4398987)。
2)定量PCR扩增反应：qPCR反应体系总体积10μl，包括：5μL2×
Figure PCTCN2019080175-appb-000030
Universal Master Mix II,with UNG，0.5μl 20ⅹTaqman primer,1μl逆转录得到的cDNA,3.5μl无RNA酶dH 2O。使用LightCycler 480荧光定量PCR仪，PCR反应条件是：50℃持续2min，95℃，持续10min预变性，开始进入PCR扩增循环：(1)95℃，15s；(2)60℃，60s；(3)60℃， 60s；总共进行40个循环；最后40℃持续10s降温。扩增反应的Taqman探针由Invitrogen公司设计和合成(U6：4440887，HJT-sRNA-m7：4398987)
3)利用2-ΔCt法计算相对表达量。
3.3.2 RT-qPCR检测小RNA(SYBR Green染料法)
1).将sRNA逆转录为cDNA：通过逆转录试剂盒(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits，Applied Biosystems，cat.no.4368813)，用茎环法(stem-loop法)将sRNA逆转录为cDNA，逆转录体系如下：模板RNA(150ng/ul)10μl，10X RT缓冲液2.0μl，25X dNTP Mix(100mM)0.8μl，U6RT stem-loop引物2.0μl，HJT-sRNA-m7 RT stem-loop引物2.0μl，MultiScribe TM逆转录酶1.0μl，RNA酶抑制剂1.0μl，无核酸酶H 2O 1.2μl，瞬时离心后，放入PCR仪反应，反应条件如下：(1)25℃，10min；(2)37℃，120min；(3)85℃，5min；(4)4℃，终止反应。反应结束后加入20μl无RNA酶ddH 2O，补足终体积至40μl。该逆转录过程中使用的茎环法引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成(U6RT引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAATATG；HJT-sRNA-m7 RT stem-loop引物:GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTACAA)。
2)定量PCR扩增反应：qPCR反应体系总体积10μl，包括：5μL 2×SYBR Green Master Mix，0.5μl正向引物(10μM)，0.5μl反向引物(10μM),1μl逆转录得到的cDNA,3μl无RNA酶dH 2O。使用LightCycler 480荧光定量PCR仪，PCR反应条件是：95℃，持续5min预变性，开始进入PCR扩增循环：(1)95℃，10s；(2)55℃，10s；(3)72℃，20s；总共进行40个循环；最后40℃持续10s降温。扩增反应正向引物和反向引物均由北京擎科新业生物技术有限公司设计和合成(U6F引物：GCGCGTCGTGAAGCGTTC，U6R引物:：GTGCAGGGTCCGAGGT,HJT-sRNA-m7F引物：TCGCGCTGAGGTAGTAGGTT，HJT-sRNA-m7 R引物：GTGCACGCTCCGAGGT)。
3)利用2-ΔCt法计算相对表达量。
3.3.3小RNA荧光原位杂交(FISH)
1)去除培养基，用500μl/孔PBS洗3遍。
2)500μl/孔4％多聚甲醛(PBS磷酸缓冲液配置)室温固定20min。
3)500μl/孔1×PBS清洗，在新的1×PBS(500μl/孔)中浸泡5min。
4)去除PBS，PK(蛋白酶K)缓冲液室温透化细胞10min。
5)500μl/孔1×PBS清洗，500μl/孔4％多聚甲醛(PBS缓冲液配置)室温固定10min。
6)1×PBS清洗，在新的1×PBS(500μl/孔)中浸泡5min。
7)0.1M TEA室温处理细胞10min。
8)500μl/孔1×PBS清洗，在新的1×PBS(500μl/孔)中浸泡5min。
9)将培养板放于杂交盒中，杂交缓冲液(50％formamide，5×SSC，5×Denharts，250ug/mL yeast RNA，500ug/mL herring sperm DNA)中室温预孵育1h。
10)将RNA探针(HJT-sRNA-m7探针:5’-GCTTACAACCACACAACCTACTACCTCA-3’,Scrambled探针:5’-CAGTACTTTTGTGTAGTACAA-3’,U6探针:5’-TTTGCGTGTCATCCTTGCG-3’)加入杂交缓冲液(RNA探针浓度为0.1-0.2ng/ul)，85℃变性处理5min，快速放置于冰上。
11)去除步骤9)的预杂交缓冲液，换成步骤10)的含有RNA探针的杂交缓冲液，放在杂交盒中，65℃过夜孵育(12-16小时)。
12)预热0.2×SSC溶液至65℃，用0.2×SSC洗三次(1mL/孔)，每次20min。
13)加入室温的0.2×SSC溶液(1mL/孔)，静置5min。
14)吸去0.2×SSC，加入Buffer B1(0.1M Tris-HCl(pH7.4～7.5)，150mM NaCl)，室温洗两次，每次5min。
15)用PBS洗三次，每次5min。
16)共聚焦显微镜观察。
3.4中药提取物对核酸吸收与进入细胞的影响
1)实验中选取了表1中所示的30种脂质，并按照表1中所示的脂质编号进行实验分组编号，依据步骤2中所述的逆向蒸发法和水煮法制备脂质核酸混合物，依据步骤3.1-3.3项进行脂质核酸混合物的体外递送实验，并检测细 胞内RNA的丰度。
实验结果参见图1-4。其中，图1-2表明采用逆向蒸发法制备的脂质核酸混合物，能成功地向NCI-N87、MRC-5细胞递送核酸；图3-4表明用水煮法制备的脂质核酸复合物能成功地向MRC-5和A549细胞递送核酸。
2)进一步地，对表1中的多种脂质进行组合，制备200μl组合脂质的乙醚溶液(脂质第1/2/4/9/18/19/20/21/22/23/24/25/26/27/28/29组浓度为0.00326mg/mL,脂质第3/8/10/13组浓度为0.00652mg/mL,脂质第15/16/17组浓度为0.000652mg/mL)以及3μl组合脂质的氯仿溶液(脂质第1/2/4/9/18/19/20/21/22/23/24/25/26/27/28/29组的氯仿溶液浓度为5mg/mL，脂质第3/8/10/13组的氯仿溶液浓度为10mg/mL，脂质第5/16/17组的氯仿溶液浓度为1mg/mL)，将上述脂质等体积混匀成溶液，获得混合脂质并依据如下所述的逆向蒸发法和水煮法分别制备脂质核酸混合物，依据步骤3.1-3.3项进行脂质核酸复合物的体外递送实验，并检测细胞内RNA的丰度。
逆向蒸发法制备脂质组合与核酸的混合物：
200μl组合脂质的乙醚溶液，根据脂质溶液与RNA溶液5:1的体积比加入40μl HJT-sRNA-m7水溶液(5μM)，超声3min后，经55℃挥发除去乙醚，然后加入200μl的DEPC处理的水水化，得到脂质与核酸的混合物。
水煮法制备脂质组合物与核酸的混合物：
将3μl组合脂质的氯仿溶液与100μl HJT-sRNA-m7(2μM)水溶液混合，100℃加热30min。
实验结果参见图5-8。其中图5-6验证了利用逆向蒸发法制备的脂质组合物与核酸的混合物能成功地促进核酸进入靶细胞内；图7-8验证了利用水煮法制备的脂质组合物与核酸的混合物能成功地促进核酸进入靶细胞内。
3)对表1中的不同类别脂质，例如TG的混合物，DG的混合物等进行组合，并依据逆向蒸发法和水煮法步骤分别制备脂质核酸混合物，依据如上所述的步骤3.1-3.3项进行脂质核酸复合物的体外递送实验，并检测细胞内RNA的丰度、细胞内定位及其靶向区域。
不同类别脂质的组合方式：
组合1：第1-32号脂质组合，第1/2/3/4/6/8/9/10/13-32号，缺少脂质#5，7，11，12；
组合2：相较于组合1缺少脂质#29；
组合3：相较于组合1缺少脂质#1，2，3，19；
组合4：相较于组合1缺少脂质#4，14；
组合5：相较于组合1缺少脂质#6，9，10，13，15，16，18，20-28，32；
组合6：相较于组合1缺少脂质#8；
组合7：相较于组合1缺少脂质#17，30，31；
FA：脂质#29；
DG组合：脂质#1，2，3，19组合；
Cer组合：脂质#4，14组合；
TG组合：脂质#6，9，10，13，15，16，18，20-28，32组合；
PE组：脂质#8
So组合：脂质#17,30,31组合。
实验结果参见图9-10，结果表明，不同类别脂质组合(例如：TG的混合物，DG的混合物等)通过不同方法(水煮法或者逆向蒸发法)均能促进核酸进入靶细胞。
4)更进一步地，选取脂质#11和#12进行实验，探讨脂质对不同序列的核酸片段的递送效率，以及核酸的定位及靶向基因区域。实验步骤如下：
利用逆向蒸发法制备大豆卵磷脂(Soybean PC)、脂质#11(18:0/18:2)及脂质#12(16:0/18:2)，与不同的小RNA(见下表3)混合后加入A549细胞系(sRNA终浓度为200nM)；阴性对照组(control)直接加入相同浓度的sRNA；阳性对照组(RNAimax)利用Lipofectamine RNAimax进行转染(6μl/孔转染试剂)。3h后利用Taqman探针检测细胞中sRNA的丰度，利用2-ΔCt法计算sRNA相对表达量。
实验结果参见图11-13。其中图11A-C表明与对照相比，两种脂质(脂质#11(18:0/18:2)及脂质#12(16:0/18:2))均可有效促进各种不同序列的核酸分子进入多种细胞；图12表明，核酸在脂质#11(18:0/18:2)及脂质#12(16:0/18:2)递送下进入细胞质并主要定位于细胞质中；此外，参见图13，发明人意外地发现，脂质#11和#12均促进小片段核酸进入，并对其靶基因的野生型3’UTR发挥作用，降低靶基因野生型的3’UTR的Luciferase的相对表达值，而对靶基因突变后的3’UTR不发挥作用。可作为核酸药物的递送方式。
4.脂质核酸混合物的体内递送实验
4.1实验步骤：
1.脂质核酸混合物制备：参见步骤2.1-2.2，分别利用逆向蒸发法以及水煮法制备脂质#11、脂质#12与核酸的混合物，以及脂质#1/2/4/9/14/18/19/20/21/22/23/24/25/26/27/28/29/30/32，脂质#3/8/10/11/12/13，脂质#6/15/16/17/31的组合与核酸的混合物。
2. 6-8周龄雄性C57小鼠灌胃：200μl/只，分组如下：
(1)对照组(自由摄取组)：不做任何处理或者灌胃给HJT-sRNA-m7；
(2)脂质#11(18:0/18:2)组：灌胃给脂质#11(18:0/18:2)或者灌胃给脂质#11(18:0/18:2)与HJT-sRNA-m7的混合物；
(3)脂质#12(16:0/18:2)组：灌胃给脂质#12(16:0/18:2或者灌胃给脂质#12(16:0/18:2与HJT-sRNA-m7的混合物；
3.收样：灌胃给药6h后，分别用1.5mL TRIzol-LS或3mL TRIzol取小鼠全血(500μl)与全肺(110mg)，匀浆后-80℃冻存；
4.总RNA提取：(1)向细胞中加入TRIzol或者TRIzol-LS裂解液(Sigma公司)，室温放置5分钟，使其充分裂解(对于小鼠肺组织，100mg组织中加入1.0mL TRIzol裂解液，用匀浆器研磨，12,000rpm,4℃，离心10min，去除未能匀浆充分的组织沉淀；对于小鼠全血，500ul全血中加入1.5mL TRIzol-LS裂解液，12,000rpm,4℃，离心10min，去除未能充分裂解的沉淀)；(2)12,000rpm,4℃，离心5min，弃沉淀；(3)按200ul/mL TRIzol的比例加入氯仿，充分振荡混匀，室温放置15min。(4)12,000rpm,4℃，离心15min，吸取上层水相，至另一离心管中；(5)重复步骤4，按上层水相加入等量的氯仿，充分匀后室温放置10min，12,000rpm,4℃，离心15min；(6)吸取上层水相至另一新EP管中，按0.5ml/mL mL TRIzol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min；(7)12,000rpm,4℃，离心10min，弃上清；(8)加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；(9)8000g,4℃，离心5min，尽量弃上清；(10)室温晾干5-10min，用50μl DEPC处理过的H 2O溶解RNA样品。
5. RT-qPCR检测：参见如上3.3.1和3.3.2项所述方法实施。
4.2实验结果
参见图14，发明人意外发现，经过这种(非侵入式)灌胃施用，脂质#11(18:0/18:2)和脂质#12(16:0/18:2)可促进小片段核酸进入血液和肺部，可作为核酸药物的递送方式。令人意外地是，直接水煮获得的脂质核酸复合物实现了显著的递送作用。
参见图15，发明人意外发现，经过这种(非侵入式)灌胃施用，28种脂质的混合可促进小片段核酸进入血液，可作为核酸药物的递送方式。令人意外地是，直接水煮获得的脂质组合与核酸的混合物实现了显著的递送作用。
针对表1中1-71号脂质的实验例
方法
1.中药中脂质的提取
1.1中药的煎煮制备
1)取100g中药饮片(红景天，蒲公英，金银花，穿心莲，购自北京同仁堂药店)，加入1000mL ddH 2O浸泡30min。
2)中药煎煮锅强火煎煮15min，弱火煎煮20min。
3)煎煮后的中药药液400mL加入旋转蒸发仪，60℃，60rpm，30min浓缩至100mL。
1.2脂质的提取
1)向160mL根据以上1.1项所得中药汤汁(旋转蒸发仪浓缩)中加入氯仿-甲醇混合液(氯仿:甲醇＝1:2，v/v)600mL，使得氯仿:甲醇:水＝1:2:0.8，搅拌混匀10-15min。
2)向锥形瓶中加入200mL氯仿，搅拌混匀10min。
3)向锥形瓶中加入200mL ddH 2O，使得氯仿:甲醇:水＝2:2:1.8，搅拌混匀10min。
4)除去上层液体和中间层的不溶性物质，取下层的氯仿层，-40℃冻存。
1.3 HPLC-MS/MS鉴定脂质成分
仪器条件
1)色谱条件：
仪器：Ultimate 3000；色谱柱：Kinetex C18(100×2.1mm,1.9μm)；柱温：45℃；流动相：A：乙腈:水(V/V，60:40)，溶液含10mmol/L甲酸铵，流动相B：乙腈：异丙醇(10:90，V/V)，溶液含10mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸。流速：0.4mL/min；进样量：4μL。
2)质谱参数：
a)正模式：Heater Temp 300℃,Sheath Gas Flow rate,45arb,Aux Gas Flow Rate,15arb,Sweep Gas Flow Rate,1arb,spray voltage,3.0KV,Capillary  Temp,350℃,S-Lens RF Level,30％.Scan ranges：200-1500。
b)负模式：Heater Temp 300℃,Sheath Gas Flow rate,45arb,Aux Gas Flow Rate,15arb,Sweep Gas Flow Rate,1arb,spray voltage,2.5KV,Capillary Temp,350℃,S-Lens RF Level,60％.Scan ranges：200-1500。
1.4中药来源的脂质鉴定
利用HPLC-MS/MS鉴定其中的脂质成分，共鉴定中药来源的脂质成分138种，其中阳离子模式鉴定125种，阴离子模式鉴定13种。取表1中所示的化合物1-69继续进行下面的实验。需要说明的是，下文测试的脂质均为商业购买或商业合成的，并且使用方式如表1-1所述。
2.制备脂质核酸复合物
2.1逆向蒸发法：
制备100μL的脂质乙醚溶液，并按照表1中所示的脂质编号进行分组(脂质浓度见下表)，以5:1的体积比将脂质溶液加入20μL核酸溶液(HJT sRNA或siRNA)，超声3min后，经55℃挥发除去乙醚，然后加入100μL的DEPC处理的水水化，得到核酸脂质混合物。
表3
Figure PCTCN2019080175-appb-000031
Figure PCTCN2019080175-appb-000032
2.2水煮法：
100μL的核酸溶液(HJT sRNA或siRNA)加入2-5μL的脂质氯仿溶液(浓度见表1)，混匀后，80-100℃加热15-30min，获得核酸脂质混合物。
3.脂质核酸复合物的体外递送实验
3.1实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞内脂质递送核酸的表达量
3.1.1培养MRC-5细胞(肺胚胎成纤维细胞)，A549细胞(人肺腺癌细胞)，Caco-2细胞(人结肠腺癌细胞)(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)至对数生长期，然后分别铺板到12孔板，细胞密度为6×10 5/1mL培养基/孔；其中MRC-5和Caco-2细胞培养于Eagle's MEM培养基(MEM，Gibco)中；A549细胞培养于Ham’s F-12培养基(HyClone)中；37℃过夜孵育，待细胞贴壁后进行后续实验。
3.1.2实验分组如下：
1)未处理组：是指未经处理的细胞，该组作为空白对照组。
2)RNAiMAX处理组：分别用100μL opti-MEM培养基(购自Invitrogen，Thermo Fisher Scientific)稀释2μL Lipofectamine TMRNAiMAX转染试剂(试剂全称为Lipofectamine RNAimax，Invitrogen，Thermo Fisher Scientific)和HJT-sRNA-m7溶液，二者混匀后放置15min，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7的终浓度为100nM，该组作为阳性对照组。
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7溶液(终浓度为100nM)，该组作为阴性对照组；
4)脂质核酸混合物处理组：将步骤2中制备的脂质与HJT-sRNA-m7混合物加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7的终浓度为100nM。
3.1.3与细胞共同孵育12-24h后，用PBS清洗细胞2次，用TRIzol裂解液(购自Sigma-Aldrich)收取细胞，提取其中总RNA，利用RT-qPCR(SYBR Green 染料法)检测进入细胞的HJT-sRNA-m7丰度，具体步骤如下：
1)提取细胞总RNA:
A.12孔板培养的细胞(约1×10 6个细胞/孔)，每孔加入1mL TRIzol裂解液后，先置于冰上，待所有的样品都加入TRIzol后，室温放置5min，使其充分裂解；
B.4℃，12,000rpm离心5min，弃沉淀，将TRIzol转移到新的离心管中；
C.按200μL氯仿/mL TRIzol加入氯仿，充分振荡，混匀后室温放置5min；
D.4℃，12,000rpm，离心15min；
E.吸取上层水相，至另一离心管中，按0.5mL异丙醇/mL TRIzol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min；
F.4℃，12,000rpm，离心15min，弃上清，RNA沉于管底；
G.加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
H.4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
I.4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，室温晾干，用50μL RNase-free的H2O溶解RNA样品，测O.D值定量RNA浓度。
2)将总RNA逆转录为cDNA：通过逆转录试剂盒(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits，Applied Biosystems，cat.no.4368813)，用茎环法(stem-loop法)(参见例如Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR，Nucleic Acids Res.2005Nov 27；33(20):e179，通过引用并入本文)将sRNA逆转录为cDNA，逆转录体系如下：模板RNA(150ng/μL)10μL，10X RT缓冲液2.0μL，25X dNTP Mix(100mM)0.8μL，U6RT stem-loop引物2.0μL，HJT-sRNA-m7 RT stem-loop引物2.0μL，MultiScribe TM逆转录酶1.0μL，RNA酶抑制剂1.0μL，无核酸酶H 2O1.2μL，瞬时离心后，放入PCR仪反应，反应条件如下：(1)25℃，10min；(2)37℃，120min；(3)85℃，5min；(4)4℃，终止反应。反应结束后加入20μL无RNA酶ddH 2O，补足终体积至40μL。该逆转录过程中使用的茎环法引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成(U6RT引物，因为RT-qPCR反应对小RNA的定量只能是相对定量，所以以U6作为标准的参考基因，计算其相对表达量):GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAA ATATG；HJT-sRNA-m7 RT stem-loop引物:GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTACAA)。
3)定量PCR扩增反应：qPCR反应体系总体积10μL，包括：5μL 2×SYBR Green Master Mix，0.5μL正向引物(10μM)，0.5μL反向引物(10μM),1μL逆转录得到的cDNA，3μL无RNA酶dH 2O。使用LightCycler 480荧光定量PCR仪，PCR反应条件是：95℃，持续5min预变性，开始进入PCR扩增循环：(1)95℃，10s；(2)55℃，10s；(3)72℃，20s；总共进行40个循环；最后40℃持续10s降温。扩增反应正向引物和反向引物均由北京擎科新业生物技术有限公司设计和合成(U6正向引物：GCGCGTCGTGAAGCGTTC，U6反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT，HJT-sRNA-m7正向引物：TCGCGCTGAGGTAGTAGGTT，HJT-sRNA-m7反向引物：GTGCACGCTCCGAGGT)。
4)利用2-ΔCt法(基因相对表达量＝2-(Ct目的基因-Ct内参基因))计算相对进入量(单链或双链RNA)。
3.2实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测mRNA表达水平
3.2.1培养THP-1细胞(人单核细胞)至对数生长期，然后分别铺板到12孔板，细胞密度为6×10 5/1mL培养基/孔；THP-1细胞培养于RPMI-1640培养基(HyClone)中；37℃过夜孵育，待细胞贴壁后进行后续实验。
3.2.2实验分组如下：
1)未处理组：是指未经处理THP-1细胞，该组作为空白对照组。
2)RNAiMAX处理组：分别用100μL opti-MEM(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific)培养基稀释2μL Lipofectamine TM RNAiMAX转染试剂(nvitrogen，Thermo Fisher Scientific)和核酸溶液(TNF-α siRNA)，二者混匀后放置15min，加入细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM，该组作为阳性对照组。
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入核酸溶液(TNF-α siRNA，终浓度为400nM)，该组作为阴性对照组；
4)脂质核酸混合物处理组：将步骤2中制备的脂质与核酸混合物加入细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM。
3.2.3处理细胞24h后，给予1μg/mL大肠杆菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS，Escherichia coli 0111:B4，L4391，Sigma-Aldrich)刺激，9h后用TRIzol裂解液收取细胞，提取其中总RNA，利用RT-qPCR(SYBR Green染料法)检测TNF-α(后续实施例的目标基因视类型而定，结果均显示在图中)的mRNA表达水平，具体步骤如下：
1)提取细胞总RNA:，步骤同3.1.3细胞总RNA的方法。
2)将总RNA逆转录为cDNA：通过逆转录试剂盒(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits，Applied Biosystems，cat.no.4368813)，将总RNA逆转录为cDNA，逆转录体系如下：模板RNA(150ng/μL)10μL，10X RT缓冲液2.0μL，25X dNTP Mix(100mM)0.8μL，随机引物2.0μL，MultiScribe TM逆转录酶1.0μL，RNA酶抑制剂1.0μL，无核酸酶H 2O 3.2μL，瞬时离心后，放入PCR仪反应，反应条件如下：(1)25℃，10min；(2)37℃，120min；(3)85℃，5min；(4)4℃，终止反应。反应结束后加入20μL无RNA酶ddH 2O，补足终体积至40μL。
3)定量PCR扩增反应：qPCR反应体系总体积10μL，包括：5μL 2×SYBR Green Master Mix，0.5μL正向引物(10μM)，0.5μL反向引物(10μM),1μL逆转录得到的cDNA，3μL无RNA酶ddH 2O。使用LightCycler 480荧光定量PCR仪，PCR反应条件是：95℃，持续5min预变性，开始进入PCR扩增循环：(1)95℃，10s；(2)55℃，10s；(3)72℃，20s；总共进行40个循环；最后40℃持续10s降温。扩增反应正向引物和反向引物均由北京擎科新业生物技术有限公司设计和合成，引物序列(内参基因UBC正向引物：CTGGAAGATGGTCGTACCCTG，内参基因UBC反向引物：GGTCTTGCCAGTGAGTGTCT；目的基因TNF-α正向引物:CTGCCCCAATCCCTTTATT：目的基因TNF-α反向引物：CCCAATTCTCTTTTTGAGCC)。
4)利用2-ΔCt法计算相对表达量，同上。
3.3蛋白免疫印迹法检测(Western blot)蛋白表达水平
3.3.1培养MRC-5细胞(肺胚胎成纤维细胞)或A549细胞(人肺腺癌细胞)至对数生长期，然后分别铺板到12孔板，细胞密度为6×10 5/1mL培养基/孔；其中MRC-5细胞培养于Eagle's MEM培养基(MEM,Gibco)中；A549细胞培养于Ham’s F-12培养基(HyClone)中；37℃过夜孵育，待细胞贴壁后进行后 续实验。
3.3.2实验分组如下：
1)未处理组：是指未经处理的细胞，该组作为空白对照组。
2)RNAiMAX处理组：分别用100μL opti-MEM培养基(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific)稀释2μL Lipofectamine TMRNAiMAX转染试剂(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific)和核酸溶液，二者混匀后放置15min，加入细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM，该组作为阳性对照组。
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入核酸溶液(终浓度为400nM)，该组作为阴性对照组；
4)脂质核酸混合物处理组：将步骤2中制备的脂质与核酸混合物加入细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM。
3.3.3与细胞共同孵育24h后，给予刺激物(1μg/mL双链RNA病毒模拟物poly(I:C)(P1530，Sigma-Aldrich)或3ng/mL转化生长因子TGFβ1(Pepro Tech))刺激细胞，作用一定时间后，用强RIPA裂解液收取细胞，利用Western blot检测相关基因(相关基因类型视具体情况而定，均显示在相应的图中)的蛋白表达水平(A549细胞经poly(I:C)刺激后24h检测REL-A的蛋白表达水平，内参蛋白为β-肌动蛋白；MRC-5细胞经TGF-β1刺激72h后检测纤连蛋白和α-SMA蛋白的表达，内参蛋白为GAPDH；siRNA的递送实验检测相应的敲低基因的蛋白表达，内参蛋白为β-肌动蛋白)，具体步骤如下：
1)蛋白样品的收集与BCA法浓度测定
A.弃去培养基，12孔板细胞，每孔加入1mL PBS缓冲液清洗一遍，每孔加入100μL预冷的强RIPA裂解液，将细胞用枪头刮下并转移到离心管中，置冰上裂解20min；
B.4℃，12,000rpm，离心10min，转移上清至新的离心管中；
C.将BCA试剂A与B(50:1，v/v)充分混匀，配制BCA工作液；
D.分别取25μL新鲜配制的BSA标准液和待测样品，加入到96孔板中，每孔中加入200μL BCA工作液，并充分混匀；37℃孵育30min；
E.用紫外分光光度计(Synergy 4多功能酶标仪)于562nm处检测其吸光度，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度；
F.用RIPA裂解液和Loading Buffer调节样品浓度，使各样品浓度一致；
G.95℃，变性处理10min。
2)蛋白免疫印迹法检测(Western blot)
A.制胶：采用10％浓度分离胶(下层胶)和5％浓度的浓缩胶(上层胶)，15孔梳子所做泳道，每个泳道样品蛋白上样量相等；
B.蛋白电泳：加入电泳缓冲液，电泳起始电压80V；当溴酚兰染料到分离胶后，提高电压至120V继续电泳，直至溴酚兰染料达到分离胶底部或全部泳出凝胶；
C.湿法转膜：按照转膜夹板(负极)-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-转膜夹板(正极)的顺序进行组装；安装后并将整个转膜装置置于4℃冷室；恒定电流300mA，转膜120min；
D.封闭：转膜结束后置于3％BSA封闭液中，室温封闭1h；
E.一抗孵育：将封闭后的PVDF膜转移至杂交袋中，加入含有对应一抗(一抗的信息如下)的3％BSA封闭液，赶出袋中气泡，密封后4℃过夜孵育；
表4
Figure PCTCN2019080175-appb-000033
F.洗膜：将PVDF膜取出，用TBST洗膜3次，每次10min；
G.二抗孵育：弃去TBST，加入含有带有辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗兔或山羊抗小鼠的二抗(购自杭州联科生物技术有限公司)的3％BSA封闭液(二抗稀释比例1:5000)，室温孵育1小时；
H.洗膜：用TBST洗膜3次，每次10min；
I.显影：配制Western显色液(1:1，V/V，Merck Millipore，ECL化学发光显色液购自Millipore公司)，并将配制好的显色液均匀滴加于膜结合蛋白的一侧；用保鲜膜小心的将膜包好，显色后观察；
J.分析：用Image J软件进行分析。
4.脂质核酸混合物的体内递送实验
4.1实验步骤：
1)脂质核酸混合物制备：采用水煮法制备，400μL HJT-sRNA-m7(5nmol)单链RNA DEPC处理的水溶液，分别加入9μL或18μL脂质组合(脂质PE(No38)&LPC(No37)&TG(No32)，4:2:3，V/V/V)，混匀后，100℃加热30min。
2)6-8周龄雄性C57BL/6J野生型小鼠灌胃给RNA：用灌胃针分别给予HJT-sRNA-m7水溶液或脂质与HJT-sRNA-m7的混合溶液，400μL/只(HJT-sRNA-m7，5nmol/只)，分组如下：
A.对照组(未处理组)：不做任何处理的小鼠；
B.阴性对照组(lipid组)：灌胃9μL脂质组合(脂质PE(No38)&LPC(No37)&TG(No32)，4:2:3，V/V/V)；
C.自由摄食组(Free uptake)：直接灌胃HJT-sRNA-m7单链RNA溶液；
D.脂质与核酸混合物组：灌胃给脂质组合与HJT-sRNA-m7单链RNA的混合物。
3)收样：灌胃给药3h后，用3mL TRIzol裂解小鼠全肺，匀浆后-80℃冻存。
4)总RNA提取：
A.小鼠肺组织，加入3.0mLTRIzol裂解液，用匀浆器研磨，12,000rpm，4℃，离心10min，去除未能匀浆充分的组织沉淀；
B.按200μL/mLTRIzol的比例加入氯仿，充分振荡混匀，室温放置15min；
C.12,000rpm，4℃，离心15min，吸取上层水相，至另一离心管中；
D.重复上述步骤，按上层水相加入等量的氯仿，充分混匀后室温放置10min；
E.12,000rpm，4℃，离心15min；
F.吸取上层水相至另一新EP管中，按0.5mL/mLTRIzol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min；
G.12,000rpm，4℃，离心15min，弃上清；
H.加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
I.12,000rpm，4℃，离心10min尽量弃上清；
J.室温晾干5-10min，用50μL DEPC处理过的H2O溶解RNA样品。
5)RT-qPCR(SYBR Green通用染料法)检测HJT-sRNA-m7的丰度。除非另有说明，HJT-sRNA-m7单链溶液指HJT-sRNA-m7单链的DEPC处理水溶液。HJT-sRNA-m7双链溶液指HJT-sRNA-m7双链的DEPC处理水溶液。
实施例1-1：不同类别脂质组合递送单链核酸进入MRC-5细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的MRC-5细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μLRNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链的DEPC处理水溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为200nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度为200nM)；
4)脂质与核酸混合物处理组：将3μL脂质单体或脂质组合分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为200nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入3μL脂质单体或脂质组合的氯仿溶液(脂质No1/2/4/9/14/18/19/20/21/22/23/24/25/26/27/28/29/30/32氯仿溶液浓度为5mg/mL，脂质No3/8/10/11/12/13/33/34/35/36氯仿溶液浓度为10mg/mL，脂质No6/15/16/17/31氯仿溶液浓度为1mg/mL)，100℃，加热30min；
a)脂质组合：
b)MG(monoglyceride，单酰基甘油)：3μLNo34脂质；
c)DG(diglyceride，甘油二酯)：3μL No1/2/3/19/35等体积氯仿溶液的混合物；
d)TG(triglyceride，甘油三酯)：3μL No6/9/10/13/15/16/18/20/21/22/23/24/25/26/27/28/32/33等体积氯仿溶液的混合物；
e)LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：3μL No36/37等体积氯仿溶液的混合物；
f)PC(phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱)：3μL No11/12等体积氯仿溶液的混合物；
g)PE(phosphatidylethanolamine，磷脂酰乙醇胺)：3μL No8/38等体积氯仿溶液的混合物；
h)Cer(Ceramides，神经酰胺)：3μL No4/14等体积氯仿溶液的混合物；
i)So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：3μL No17/30/31等体积氯仿溶液的混合物；
j)FA(fatty acid，脂肪酸)：3μL No29
k)混合物：3μL No1-36(无No5/7)等体积氯仿溶液的混合物；
l)混合物1：3μL No1-36(无No5/7/34)等体积氯仿溶液的混合物；
m)混合物2：3μL No1-36(无No5/7/1/2/3/19/35)等体积氯仿溶液的混合物；
n)混合物3：3μL No1-36(无No5/7/6/9/10/13/15/16/18/20/21/22/23/24/25/26/27/28/32/33)等体积氯仿溶液的混合物；
o)混合物4：3μL No1-36(无No5/7/36/37)等体积氯仿溶液的混合物；
p)混合物5：3μL No1-36(无No5/7/11/12)等体积氯仿溶液的混合物；
q)混合物6：3μL No1-36(无No5/7/8)等体积氯仿溶液的混合物；
r)混合物7：3μL No1-36(无No5/7/4/14)等体积氯仿溶液的混合物；
s)混合物8：3μL No1-36(无No5/7/29)等体积氯仿溶液的混合物；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度200nM，加入细胞12h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验 方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，与自由摄取组相比，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图16)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。其中，混合物2、混合物3、混合物5、混合物7、混合物8介导核酸进入MRC-5细胞的量较高。
实施例1-2：脂质组合递送单链核酸进入MRC-5细胞和Caco-2细胞
(一)实验分组：
测试细胞为MRC-5细胞和Caco-2细胞
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为200nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度为200nM)；
4)脂质单体与核酸处理组：将3μL脂质单体(No1或No8或No12)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为200nM。
5)脂质组合混合物与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(No1/8/12等体积混合)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为200nM。
6)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μL脂质单体No1或No8或No12与1μL下述脂质类别(MG、DG、TG、LPC、Cer、So或FA)混合)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为200nM。在图17A-F中，该处理组分别共同表示为No.1 2μL+mix 1μL、No.82μL+mix 1μL、和No.12 2μL+mix 1μL，其中横向涵盖范围内，MG表示2μL脂质单体No1或No8或No12+1μL MG，DG表示2μL脂质单体No1或No8或No12+1μLDG，TG表示2μL脂质单体No1或No8或No12+1μLTG，LPC表示2μL脂质单体No1或No8或No12+1μLLPC，Cer表示2μL脂质单体No1或No8或No12+1μLCer，So表示2μL脂质单体No1或No8或 No12+1μLSo，FA表示2μL脂质单体No1或No8或No12+1μLFA。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入3μL脂质单体(脂质No1氯仿溶液浓度为5mg/mL，No8/12氯仿溶液浓度为10mg/mL)或脂质组合，100℃，加热30min；
MG(monoglyceride，单酰基甘油)：2μL No34脂质；
DG(diglyceride，甘油二酯)：2μL No1/2/3/19/35等体积氯仿溶液的混合物；
TG(triglyceride，甘油三酯)：2μL No6/9/10/13/15/16/18/20/21/22/23/24/25/26/27/28/32/33等体积氯仿溶液的混合物；
LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：2μL No36/37等体积氯仿溶液的混合物；
Cer(Ceramides，神经酰胺)：2μL No4/14等体积氯仿溶液的混合物；
So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：2μL No17/30/31等体积氯仿溶液的混合物；
FA(fatty acid，脂肪酸)：2μL No29
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度200nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的细胞进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，对于MRC-5细胞，混合物(No1/8/12等体积混合)，No.1 2μL+No.8 1μL，No.1 2μL+No.12 1μL，No.1 2μL+MG 1μL，No.8 2μL+MG 1μL，No 12 2μL+No.8 1μL以及No 12 2μL+So 1μL较为有效递送核酸。
对于Caco-2细胞，混合物(No1/8/12等体积混合)，No.1 2μL+No.8 1μL，No.1 2μL+No.12 1μL，No.1 2μL+MG 1μL，No.8 2μL+MG 1μL，No 12 2μL+No.8 1μL，No 12 2μL+LPC 1μL以及No 12 2μL+So 1μL较为有效递送核酸。
实施例1-3：脂质组合递送单链核酸进入细胞
细胞类型：A549、MRC-5和Caco-2细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质单体与核酸处理组：将3μL脂质单体(No8或No12)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合PC(No12)&PE(No8)与核酸混合物处理组：将2.25μL脂质组合(PC(No12)&PE(No8)，2:1，V/V)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
6)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2.25μL脂质组合PC(No12)&PE(No8)与0.75μL下述脂质类别DG、TG、LPC、PC、Cer、So或FA混合)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。在图18A-C中，2.25μL+0.75μL上方横线涵盖的处理组即为该混合物处理组。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入脂质单体(脂质No8/12氯仿溶液浓度为10mg/mL)或脂质组合，100℃，加热30min；
DG(diglyceride，甘油二酯)：0.75μL No1/2等体积氯仿溶液的混合物；
TG(triglyceride，甘油三酯)：0.75μL No15氯仿溶液；
LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：0.75μL No36/37等体积氯仿溶液的混合物；
PC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：0.75μL No12氯仿溶液；
Cer(Ceramides，神经酰胺)：0.75μL No4氯仿溶液；
So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：0.75μL No31氯仿溶液；
FA(fatty acid，脂肪酸)：0.75μL No29
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验 方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，与自由摄取组相比，上述脂质单体及脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图18)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。
对于A549、MRC-5和Caco-2细胞，2.25μL PC(No12)&PE(No8)+0.75μL DG(No1/2等体积氯仿溶液的混合物)取得最佳的递送效率。
实施例1-4：脂质组合递送单链核酸进入细胞
细胞类型：A549、MRC-5和Caco-2细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质单体与核酸处理组：将3μL脂质单体(No1或No8或No12)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合DG(No1)&PE(No8)&PC(No12)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(DG(No1)&PE(No8)&PC(No12)，1：1:1，V/V/V)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
6)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μL脂质组合DG(No1)&PE(No8)&PC(No12)与1μL下述脂质类别DG、TG、LPC、PC、Cer、So或FA混合)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。在图19A-C中，2μL脂质组合DG(No1)&PE(No8)&PC(No12)+1μL上方横线涵盖的处理组即为该混合物处理组。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入3μL脂质单体(脂质No1氯仿溶液浓度为5mg/mL，No8/12氯仿溶液浓度为10mg/mL)或脂质组 合，100℃，加热30min；
DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1/2等体积氯仿溶液的混合物；
TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液；
LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：1μL No36/37等体积氯仿溶液的混合物；
PC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：1μL No12氯仿溶液；
Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液；
So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：1μL No31氯仿溶液；
FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，与自由摄取组相比，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图19)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。
对于细胞类型A549、MRC-5和Caco-2细胞，2μL脂质组合DG(No1)&PE(No8)&PC(No12)与1μL TG(15)取得最佳的递送效果。
实施例1-5：脂质组合递送单链核酸进入细胞
细胞类型：A549、MRC-5和Caco-2细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质单体与核酸处理组：将3μL脂质单体No8与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM；
5)脂质组合PE(No8)&MG(No34)与核酸混合物处理组：将上述2.25μL 脂质组合(PE(No8)&MG(No34)，2:1，V/V)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
6)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2.25μL脂质组合PE(No8)&MG(No34)与0.75μL下述脂质类别DG、TG、LPC、PC、Cer、So或FA混合)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。在图20A-C中，2.25μL脂质组合PE(No8)&MG(No34)+0.75μL上方横线涵盖的处理组即为该混合物处理组。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入脂质单体(脂质No8氯仿溶液浓度为10mg/mL)或脂质组合，100℃，加热30min；
DG(diglyceride，甘油二酯)：0.75μL No1/2等体积氯仿溶液的混合物；
TG(triglyceride，甘油三酯)：0.75μL No15氯仿溶液；
LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：0.75μL No36/37等体积氯仿溶液的混合物；
PC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：0.75μL No12氯仿溶液；
Cer(Ceramides，神经酰胺)：0.75μL No4氯仿溶液；
So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：0.75μL No31氯仿溶液；
FA(fatty acid，脂肪酸)：0.75μL No29
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，与自由摄取组相比，上述脂质单体及脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图20)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。
对于细胞类型A549、MRC-5和Caco-2细胞，2.25μL PE(No8)&MG(No34)+0.75μL So(31)取得最佳的递送效果。
实施例1-6：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的A549细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质单体与核酸处理组：将3μL脂质单体No38与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(2μL脂质单体No38与1μL下述脂质类别MG、DG、TG、LPC、PC、PE、Cer、So或FA混合)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入3μL脂质单体(lipidNo38氯仿溶液浓度为10mg/mL)或脂质组合，100℃，加热30min；
MG(monoglyceride，单酰基甘油)：1μL No34脂质；
DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1氯仿溶液；
TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液；
LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：1μL No37氯仿溶液；
PC(phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱)：1μL No12氯仿溶液；
PE(phosphatidylethanolamine，磷脂酰乙醇胺)：1μL No8氯仿溶液；
Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液；
So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：1μL No31氯仿溶液；
FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29氯仿溶液。
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：对于A549细胞，与自由摄取组相比，2μL脂质单体No38与1μL LPC(37)、TG(15)、PC(12)、DG(1)可以有效递送核酸进入细胞(见图21)， 有希望提高临床上核酸药物递送的效率。
实施例1-7 脂质组合递送单链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的A549细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合DG(No1)&PE(No38)&PC(No12)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(DG(No1)&PE(No38)&PC(No12)，1:1:1，V/V/V)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μL脂质组合DG(No1)&PE(No38)&PC(No12)与1μL下述脂质类别MG、TG、LPC、PE、Cer、So或FA混合)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min；
MG(monoglyceride，单酰基甘油)：1μL No34脂质；
TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液；
LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：1μL No37氯仿溶液；
PE(phosphatidylethanolamine，磷脂酰乙醇胺)：1μL No8氯仿溶液；
Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液；
So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：1μL No31氯仿溶液；
FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29氯仿溶液。
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有 实验一式三份进行。
结论：结果表明，与自由摄取组相比，2μL脂质组合DG(No1)&PE(No38)&PC(No12)与1μL TG(15)、Cer(4)、So(31)、FA(29)、LPC(37)、PE(8)均可以有效递送核酸进入A549细胞(见图22)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。
实施例1-8 脂质组合递送单链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的A549细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合PE(No38)&MG(No34)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(PE(No38)&MG(No34)，2:1，V/V)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μL脂质组合PE(No38)&MG(No34)与1μL下述脂质类别DG、TG、LPC、PC、PE、Cer、So或FA混合)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min；
DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1氯仿溶液；
TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液；
LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：1μL No37氯仿溶液；
PC(phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱)：1μL No12氯仿溶液；
PE(phosphatidylethanolamine，磷脂酰乙醇胺)：1μL No8氯仿溶液；
Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液；
So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：1μL No31氯仿溶液；
FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29氯仿溶液。
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图23)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。其中，2μL脂质组合PE(No38)&MG(No34)与1μLLPC(37)取得最佳的递送效果。
实施例1-9 脂质组合递送单链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合PE(No38)&PC(No12)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(PE(No38)&PC(No12)，2:1，V/V)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)与1μL下述脂质类别MG、DG、TG、LPC、PE、Cer、So或FA混合)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min；
MG(monoglyceride，单酰基甘油)：1μL No34脂质；
DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1氯仿溶液；
TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液；
LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：1μL No37氯仿溶液；
PE(phosphatidylethanolamine，磷脂酰乙醇胺)：1μL No8氯仿溶液；
Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液；
So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：1μL No31氯仿溶液；
FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图24)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。其中，2μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)与1μL Cer(4)取得最佳的效果。
实施例1-10 脂质组合递送单链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合PE(No38)&PC(No12)&DG(No1)&TG(No15)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(PE(No38)&PC(No12)&DG(No1)&TG(No15)，2：2：2：3，V/V/V/V)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2.2μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)&DG(No1)&TG(No15)与0.8μL下述脂质类别MG、LPC、Cer、So或FA混合)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min；
MG(monoglyceride，单酰基甘油)：0.8μL No34脂质；
LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：0.8μL No37氯仿溶液；
Cer(Ceramides，神经酰胺)：0.8μL No4氯仿溶液；
So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：0.8μL No31氯仿溶液；
FA(fatty acid，脂肪酸)：0.8μL No29
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图25)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。其中，2.2μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)&DG(No1)&TG(No15)，以及2.2μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)&DG(No1)&TG(No15)与0.8μL LPC(37)或So(31)取得较好的递送效率。
实施例1-11 脂质组合递送单链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合PE(No38)&MG(No34)&LPC(No37)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合PE(No38)&MG(No34)&LPC(No37)，4：2：3，V/V/V)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2.2μL脂质组合PE(No38)&MG(No34)&LPC(No37)与0.8μL下述脂质类别DG、TG、PC、 Cer、或So混合)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min；
DG(diglyceride，甘油二酯)：0.8μL No1氯仿溶液；
TG(triglyceride，甘油三酯)：0.8μL No15氯仿溶液；
PC(phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱)：0.8μL No12氯仿溶液；
Cer(Ceramides，神经酰胺)：0.8μL No4氯仿溶液；
So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：0.8μL No31氯仿溶液；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图26)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。
实施例1-12 脂质组合递送单链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)，4：2：3，V/V/V)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2.2μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)与0.8μL下述脂质类别MG、DG、TG、 LPC、So或FA混合)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min；
MG(monoglyceride，单酰基甘油)：0.8μL No34脂质；
DG(diglyceride，甘油二酯)：0.8μL No1氯仿溶液；
TG(triglyceride，甘油三酯)：0.8μL No15氯仿溶液；
LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：0.8μL No37氯仿溶液；
So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：0.8μL No31氯仿溶液；
FA(fatty acid，脂肪酸)：0.8μL No29氯仿溶液。
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图27)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。其中，2.2μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)与0.8μL FA(29)递送效率最佳。
实施例1-13 脂质组合递送单链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)&FA(No29)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)&FA(No29)，44：22：33：36，V/V/V/V)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)&FA(No29)与1μL下述各脂质类别混合)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min；
MG(monoglyceride，单酰基甘油)：1μL No34脂质；
DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1氯仿溶液；
TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液；
LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：1μL No37氯仿溶液；
So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：1μL No31氯仿溶液。
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图28)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。
实施例1-14：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合PE(No38)&PC(No12)&So(No31)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)&So(No31)，2：1：3，V/V/V)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μL PE(No38)&PC(No12)&So(No31)与1μL下述各脂质类别MG、DG、TG、LPC、Cer、FA)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min；
DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1氯仿溶液；
TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液；
PC(phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱)：1μL No12氯仿溶液；
Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液；
FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29氯仿溶液。
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图29)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。其中以2μL PE(No38)&PC(No12)&So(No31)与1μL FA(29)递送效果最佳。
实施例1-15 脂质组合递送单链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合PE(No38)&MG(No34)&LPC(No37)&So(No31)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合PE(No38)&MG(No34)&LPC(No37)&So(No31)，44：22：33：36，V/V/V/V)分别与HJT-sRNA-m7 的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μLPE(No38)&MG(No34)&LPC(No37)&So(No31)与1μL下述各脂质类别DG、TG、PC、Cer、FA混合)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min；
DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1氯仿溶液；
TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液；
PC(phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱)：1μL No12氯仿溶液；
Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液；
FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29氯仿溶液。
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，与自由摄取组相比，在2μLPE(No38)&MG(No34)&LPC(No37)&So(No31)的基础上，添加1μL1ul DG(1)、TG(15)、PC(12)、Cer(4)和FA(29)均可以有效递送核酸进入细胞(见图30)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。其中添加1μLPC(12)核酸递送效率最佳能够加强核酸递送效率。
实施例1-16 脂质组合递送单链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度 为100nM)；
4)脂质组合PE(No38)&LPC(No37)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合PE(No38)&LPC(No37)，2：1，V/V)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μLPE(No38)&LPC(No37)与1μL下述各脂质类别MG、DG、TG、PC、Cer、So、FA混合)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min；
MG(monoglyceride，单酰基甘油)：1μL No34脂质；
DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1氯仿溶液；
TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液；
PC(phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱)：1μL No12氯仿溶液；
Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液；
So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：1μL No31氯仿溶液；
FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29氯仿溶液。
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，与自由摄取组相比，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图31)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。在2μL脂质组合PE(No38)&LPC(No37)基础上，添加1μLTG(15)核酸递送效果最佳。
实施例1-17 脂质组合递送单链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转 染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7单链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合PE(No38)&LPC(No37)&TG(No15)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(PE(No38)&LPC(No37)&TG(No15)，32：8：5，V/V/V)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μLPE(No38)&LPC(No37)&TG(No15)与1μL下述各脂质类别(MG、DG、PC、Cer、So或FA)混合)分别与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min；
MG(monoglyceride，单酰基甘油)：1μL No34脂质；
DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1氯仿溶液；
PC(phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱)：1μL No12氯仿溶液；
Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液；
So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：1μL No31氯仿溶液；
FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29氯仿溶液。
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法DG、检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图32)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。脂质组合PE(No38)&LPC(No37)&TG(No15)有效递送核酸进入细胞。在该脂质组合PE(No38)&LPC(No37)&TG(No15)基础上进一步添加其它脂质类别未能加强这种效果。
实施例2-1：脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链RNA溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质单体与核酸处理组：将3μL脂质单体No38与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(2μL脂质单体No38与1μL脂质氯仿溶液No.8、1、2、11、12、34、37、4、30、31、29、32、1+2(等体积混合)或11+12(等体积混合)混合)分别与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入3μL脂质单体(lipidNo38氯仿溶液浓度为10mg/mL)或脂质组合，100℃，加热30min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质单体及脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图33)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。脂质单体38能够有效递送双链核酸进入MRC-5细胞，效果接近转染试剂RNAiMAX。在此基础上增加其他脂质未能进一步加强这种效果。
实施例2-2：脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中， 混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合(No38&No37，2:1，V/V)与核酸处理组：将3μL脂质组合与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(2μLNo38&No37混合物与1μL脂质氯仿溶液No.8、1、2、11、12、34、37、4、30、31、29、32、1+2(等体积混合)或11+12(等体积混合)混合)分别与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质单体及脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图34)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。No38&No37混合物可以有效将双链核酸递送到MRC-5细胞中。在2μLNo38&No37混合物基础上增加1μL除11和34号脂质外的脂质均能够加强这种效果。此外，出乎意料的是，以2μLNo38&No37混合物基础上增加1μL脂质32取得了最佳的效果，甚至明显好于RNAiMAX的效果。
实施例2-3 脂质组合递送双链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合(PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4))与核酸处理组：将3μL脂质组合(PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)，4：2：3，V/V/V)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(2.5μLPE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)混合物与0.5μL脂质(DG(2)、TG(6)、So(17)、FA(29)、MG(34)和LPC(37))混合)分别与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质单体及脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图35)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。在LPE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)混合物的基础上添加1/5的LPC(37)能够显著增加核酸的递送效果。此外，添加DG(2)和TG(16)也可以增加进一步加强递送效果。
实施例2-4 脂质组合递送双链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合(PE(No38)&DG(No2))与核酸处理组：将3μL脂质组合(PE(No38)&DG(No2))，2：1，V/V)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶 液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)脂质组合与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(2μLPE(No38)&DG(No2)混合物与1μL其他脂质No.37、31、29、34、12或4混合)分别与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图36)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。脂质组合(2μLPE(No38)&DG(No2)混合物可以有效递送双链核酸进入A549细胞。与该脂质组合相比，以2:1的比例混合的脂质组合(2μLPE(No38)&DG(No2)和37、31、12或4可以增加递送效果。
实施例2-5 脂质组合递送双链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合((PE(No38)&LPC(No37)，4：1，V/V)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入3μL脂质组合，70℃，加热30min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图37)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率，效果接近RNAiMAX。
实施例2-6 脂质组合递送双链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合((PE(No38)&PC(No12)，4：1，V/V)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入3μL脂质组合，70℃，加热30min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图38)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率，效果好于RNAiMAX或与RNAiMAX相等。
实施例2-7 脂质组合递送双链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转 染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合((PE(No38)&PC(No12)&DG(No2)，4：1：5，V/V/V)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入2μL脂质组合，80℃，加热30min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图39)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。脂质组合((PE(No38)&PC(No12)&DG(No2)，4：1：5，V/V/V)的对A549细胞的双链核酸递送效果好于RNAiMAX。
实施例2-8 脂质组合递送双链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合((PE(No38)&LPC(No37)&DG(No2)，32：8：5，V/V/V)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入2μL脂质组合，80℃， 加热30min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图40)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率，效果接近RNAiMAX。
实施例2-9 脂质组合递送双链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合((PE(No8)&PC(No12)，1：2，V/V)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入2μL脂质组合，80℃，加热30min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图41)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。脂质组合((PE(No8)&PC(No12)，1：2，V/V)的对A549细胞的双链核酸递送效果明显好于RNAiMAX。
实施例2-10 脂质组合递送双链核酸进入A549细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合((PE(No8)&LPC(No37)，4：1，V/V)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入2μL脂质组合，80℃，加热30min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图42)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。
实施例2-11 脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合((PE(No8)&PC(No12)，1：2，V/V)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM；
5)脂质组合与HJT-sRNA-m7混合物处理组：3μL脂质组合(2μL PE(No8)&PC(No12)与1μL其他类别脂质(MG(34)、DG(2)、TG(32)、LPC(37)、PC(11)、PE(38)、Cer(4)、So(31)或FA(29))混合)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入3μL脂质组合，80℃，加热30min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图43)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。PE(No8)&PC(No12)可以有效递送核酸进入细胞，并且效果明显优于RNAiMAX。与PE(No8)&PC(No12)相比，以2:1的比率混合的PE(No8)&PC(No12)和Cer(4)或PE(38)可以增强这种效果。
实施例2-12 脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合((PE(No8)&PC(No12)&DG(No2)，8：16：3，V/V/V)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入2μL脂质组合，80℃，加热30min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，与自由摄取和RNAiMAX组相比，脂质组合((PE(No8)&PC(No12)&DG(No2)，8：16：3，V/V/V)的递送效果明显高于RNAiMAX的效果(见图44)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。
实施例2-13 脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
混合物1：PE(8):LPC(37):TG(32)-4:1:2
混合物2：PE(8):LPC(37):DG(2)-4:1:2
混合物3：PE(8):PC(12):So(31):FA(29)-1:2:1:1
5)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入2.5μL脂质组合，90℃，加热15min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图45)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。与RNAiMAX相比，混合物1：PE(8):LPC(37):TG(32)-4:1:2和混合物2：PE(8):LPC(37):DG(2)-4:1:2的递送效果是相当的，而混合物3：PE(8):PC(12):So(31):FA(29)-1:2:1:1的效果明显更好。
实施例2-14 脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链溶液(终浓度 为100nM)；
4)脂质组合混合物与HJT-sRNA-m7混合物作用组：3μL脂质组合混合物(PE(8):PC(12):So(31):FA(29)-1:2:1:1)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM；
5)脂质组合与HJT-sRNA-m7混合物作用组：3μL脂质组合(2μL脂质组合mix与1μL图46中其他类别脂质即脂质34、2、32、11、37、38或4混合)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入3μL脂质组合，90℃，加热15min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图46)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。混合物(PE(8):PC(12):So(31):FA(29)-1:2:1:1)的递送效果明显好于RNAiMAX的递送效果。与混合物(PE(8):PC(12):So(31):FA(29)-1:2:1:1)相比，以2:1的比率添加的混合物(PE(8):PC(12):So(31):FA(29)-1:2:1:1)与脂质2、38或4可以明显提高这种递送效果。
实施例2-15 脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合((PE(No8)&So(No31)，6：1，V/V)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
5)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入2μL脂质组合，90℃，加热15min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，脂质组合((PE(No8)&So(No31)，6：1，V/V)的递送效果明显好于RNAiMAX的递送效果(见图47)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。
实施例2-16 脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合(PE(8):So(31)，4:1，V/V)与HJT-sRNA-m7混合物作用组：2μL脂质组合与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM；
5)脂质组合与HJT-sRNA-m7混合物作用组：脂质组合(PE(8):So(31)，4:1，V/V)与其他类别脂质(MG(34)、DG(2)、LPC(37)、PC(12)、PC(11)、Cer(4)、FA(29)或TG(32))混合(12:3:5，V/V,图48)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入2μL脂质组合，90℃，加热15min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞12h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图48)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。PE(8):So(31)(4:1，V/V)可以有效递送核酸进入细胞，效果接近RNAiMAX。与PE(8):So(31)相比，以12:3:5的比例混合的PE(8):So(31):MG(34)、DG(2)、PC(12)、PC(11)、或TG(32)可以增加核酸递送效果，并且PE(8):So(31):)PC(11)的效果最佳，明显好于RNAiMAX。
实施例2-17 脂质组合递送双链核酸进入MRC-5细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT-sRNA-m7双链溶液(终浓度为100nM)；
4)脂质组合(PE(8):Cer(4)，4:1，V/V)与HJT-sRNA-m7混合物作用组：2μL脂质组合与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM；
5)脂质组合与HJT-sRNA-m7混合物作用组：脂质组合PE(8):Cer(4)与其他类别脂质MG(34)、DG(2)、LPC(37)、PC(12)、PC(31)、FA(29)或TG(32)混合(12:3:5，V/V,图49)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
(二)实验过程
1)水煮法条件：100μL HJT-sRNA-m7双链溶液加入2μL脂质组合，90℃，加热15min；
2)实验条件：HJT-sRNA-m7终浓度100nM，加入细胞12h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。
结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图49)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。脂质组合PE(8):Cer(4)可以有效递送核酸进入细胞，效果接近RNAiMAX。与PE(8):So(31)相比，以12:3:5的比例混合的PE(8):So(31):DG(2)、FA(29)、或TG(32)可以增加核酸递送效果，并且 FA(29)可以显著提高PE(8):So(31)的递送效果，明显好于RNAiMAX。
实施例3 脂质组合促进核酸通过消化道进入肺
脂质组合如下：
脂质PE(No38)&LPC(No37)&TG(No32)，4:2:3，V/V/V
1.脂质-核酸复合物的制备：
方法：水煮法
400μL HJT-sRNA-m7(5nmol)单链RNA的DEPC处理的水溶液，分别加入9μL或18μL脂质组合(脂质PE(No38)&LPC(No37)&TG(No32)，4:2:3，V/V/V)，混匀后，100℃加热30min。
2.核酸的消化道递送实验
6-8周龄雄性C57小鼠灌胃给RNA：用灌胃针分别给予HJT-sRNA-m7水溶液或脂质与HJT-sRNA-m7的混合溶液，400μL/只(HJT-sRNA-m7，5nmol/只)，分组如下：
(1)对照组(未处理组)：不做任何处理的小鼠；
(2)阴性对照组(脂质组)：灌胃9μL脂质组合(脂质PE(No38)&LPC(No37)&TG(No32)，4:2:3，V/V/V)；
(3)自由摄食组(Free uptake)：直接灌胃HJT-sRNA-m7单链RNA；
(4)脂质与核酸混合物组：灌胃给脂质组合与HJT-sRNA-m7单链RNA的混合物。
灌胃给药3h后，用3mL TRIzol裂解小鼠全肺，提取总RNA，RT-qPCR检测HJT-sRNA-m7的丰度。
结论：如图50所示，与自由摄食组相比，9μL或18μL脂质组合(脂质PE(No38)&LPC(No37)&TG(No32)，4:2:3，V/V/V)显著促进小片段核酸进入肺组织(*表示P值小于0.05)。经过这种(非侵入式)灌胃施用，脂质组合(脂质PE(No38)&LPC(No37)&TG(No32)，4:2:3，V/V/V)可促进小片段核酸进入肺组织，可作为核酸药物的递送方式。
实施例4 中药来源的脂质混合物介导双链核酸进入细胞的功能实验
1 No.8(PE):No.12(PC)(v:v＝1:2)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能
实验方法：蛋白免疫印迹法，具体参见上文“蛋白免疫印迹法检测蛋白表达水平”。
1)No.8(PE)：No.12(PC)(v:v＝1:2)介导抗纤维化HJT-sRNA-m7双链进入MRC-5细胞
如图51所示，通过水煮法和逆向蒸发法，No.8(PE):No.12(PC)(v:v＝1:2)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。
未处理组：是指未经处理的MRC-5细胞，即空白对照组；
TGFβG1组：MRC-5细胞加入TGFβ1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
NC组：用脂质组合No.8(PE)：No.12(PC)(v:v＝1:2)与NC mimics双链混合物加入MRC5细胞中混匀，核酸的终浓度为200nM，24h后加入TGFβ1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，TGFβ1刺激72h后收样；
M7组：脂质组合No.8(PE)：No.12(PC)(v:v＝1:2)与HJT-sRNA-m7双链混合物加入MRC5细胞中，混匀，核酸的终浓度为200nM，24h后加入TGFβ1TGFb1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样。
2)No.8(PE):No.12(PC)(v:v＝1:2)介导siRNA进入A549细胞
如图52和53所示，通过加热法，No.8(PE):No.12(PC)(v:v＝1:2)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥敲低蛋白表达作用。
图52中的未处理组：是指未经处理的细胞，即空白对照组；
si-NC：脂质组合No.8(PE)：No.12(PC)(v:v＝1:2)与si-NC(广州锐博公司合成，序列未知)混合物加入A549细胞中，混匀，终浓度400nM；48h后收取细胞，RIPA强裂解液裂解细胞收取蛋白样品。
si-CPSF30：脂质组合No.8(PE)：No.12(PC)(v:v＝1:2)与si-CPSF30混合物加入A549细胞中，混匀，终浓度400nM；48h后收取细胞，RIPA强裂解液裂解细胞收取蛋白样品。
si-LAMP1：脂质组合No.8(PE)：No.12(PC)(v:v＝1:2)与si-LAMP1混合物加入A549细胞中，混匀，终浓度400nM；48h后收取细胞，RIPA强裂解液裂解细胞收取蛋白样品。
si-LAMP2：脂质组合No.8(PE)：No.12(PC)(v:v＝1:2)与si-LAMP2混合物加入A549细胞中，混匀，终浓度400nM；48h后收取细胞，RIPA强裂解液裂解细胞收取蛋白样品。
图53中自由摄取(Free uptake)组：直接加入核酸溶液
Lipo 2000组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL Lipofectamine TM2000转染试剂(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific)和si-NFκB溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，核酸溶液终浓度为400nM；24h后加入polyI:C刺激(浓度1μg/mL1ug/mL)，6h后收取蛋白样品。
No.8(PE):No.12(PC)(1:2)：通过加热法，No.8(PE):No.12(PC)(1:2)与si-NFκB溶液混合，加入细胞中，核酸溶液终浓度为400nM；24h后加入polyI:C刺激(浓度1μg/mL)，6h后收取蛋白样品。
上述核酸的类型和序列：见表2。
3)No.8(PE):No.12(PC)(v:v＝1:2)介导siRNA进入THP-1细胞
如图54所示，通过水煮法，No.8(PE):No.12(PC)(v:v＝1:2)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。
naive组：是指未经处理的细胞，即空白对照组；
LPS组：未加入siRNA，只加入LPS刺激，终浓度1μg/mL，9h后收取RNA样品及细胞上清；
si-NC组：脂质组合No.8(PE)：No.12(PC)(v:v＝1:2)与si-NC混合物加入THP-1细胞中，混匀，终浓度400nM；24h后加入LPS，终浓度1μg/mL，刺激9h后收取细胞TRIzol裂解样品，收集上清做ELISA检测。
si-TNFα组：脂质组合No.8(PE)：No.12(PC)(v:v＝1:2)与si-TNFα双链混合物加入THP-1A549细胞中，混匀，终浓度400nM，24h后加入LPS，终浓度1μg/mL，刺激9h后收取细胞TRIzol裂解样品，收集上清做ELISA检测。
2 No.8(PE):No.12(PC):No.2(DG)(v:v:v＝2:4:3)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能
1)No.8(PE):No.12(PC):No.2(DG)(v:v:v＝2:4:3)介导抗纤维化HJT-sRNA-m7进入MRC-5细胞
如图55所示，通过水煮法，No.8(PE):No.12(PC):No.2(DG)(v:v:v＝2:4:3)可以有效递送抗纤维化HJT-sRNA-m7进入MRC-5MRC5细胞降低纤连蛋白蛋白表达。
2)No.8(PE):No.12(PC):No.2(DG)(v:v:v＝2:4:3)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达
如图56所示，通过水煮法，在No.8(PE)、No.12(PC)(v:v＝1:2)脂质混合 物基础上加入No.2(DG)(v:v:v＝2:4:3)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。
未处理组：未处理的A549细胞；
NCsiRNA组：No.8(PE):No.12(PC):No.2(DG)(v:v:v＝2:4:3)脂质混合物与si-NC经过水煮法制备的siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
XRN2siRNA组：表示No.8(PE):No.12(PC):No.2(DG)(v:v:v＝2:4:3)脂质混合物与XRN2siRNA经过水煮法制备的混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM。
3 No.8(PE):No.12(PC):No.4(Cer)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能
1)No.8(PE):No.12(PC):No.4(Cer)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物介导抗纤维化HJT-sRNA-m7进入MRC-5细胞(水煮法)
如图57所示，通过水煮法，在No.8(PE):No.12(PC)(v:v:v＝1:2)脂质混合物基础上加入No.4(Cer)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物可以有效递送抗纤维化HJT-sRNA-m7进入MRC-5MRC5细胞发挥降低纤维化蛋白表达的作用。
未处理组：未处理的细胞；
TGF-β1组：加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
NC组：用脂质组合No.38(PE):No.37(LPC):No.32(TG)(v:v:v＝32:8:5)递送NC mimics 24h后加入TGF-β1TGFb1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
m7组：脂质组合No.8(PE):No.12(PC):No.4(Cer)(v:v:v＝1:2:1)与HJT-sRNA-m7双链混合物加入MRC5细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM；24h后加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样。
2)No.8(PE):No.12(PC):No.4(Cer)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物介导NFκBsiRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法)
如图58所示，在No.8(PE)、No.12(PC)(v:v＝1:2)脂质混合物基础上加入No.4(Cer)(v:v:v＝1:2:1)可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。
未处理组：未处理的细胞；
siNC组：表示No.8(PE):No.12(PC):No.4(Cer)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物与si-NC siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
si-NFκB组：表示No.8(PE):No.12(PC):No.4(Cer)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物与NFκB siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM。
4 No.8(PE):No.12(PC):No.PC(11)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能
1)No.8(PE):No.12(PC):No.PC(11)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达
如图59所示，在No.8(PE)、No.12(PC)(v:v＝1:2)脂质混合物基础上加入No.11(PC)(v:v:v＝1:2:1)可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。
未处理组：未处理的细胞；
si-NC组：表示No.8(PE):No.12(PC):No.PC(11)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物与si-NC siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
si-XRN2组：表示No.8(PE):No.12(PC):No.PC(11)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物与XRN2siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM。
5 No.8(PE):No.12(PC):No.LPC(37)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能
1)No.8(PE):No.12(PC):No.LPC(37)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物介导XRN2siRNA双链核酸进入A549细胞抑制基因表达
如图60所示，在No.8(PE)、No.12(PC)(v:v＝1:2)脂质混合物基础上加入No.37(LPC)(v:v:v＝1:2:1)可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。
未处理组：未处理的细胞；
siNC组：表示No.8(PE):No.12(PC):No.LPC(37)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
si-XRN2组：表示No.8(PE):No.12(PC):No.LPC(37)(v:v:v＝1:2:1)脂质混合物与XRN2siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
6 No.8(PE):No.12(PC):No.MG(34)(v:v:v＝2:3:1)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能
1)No.8(PE):No.12(PC):No.MG(34)(v:v:v＝2:3:1)脂质混合物介导CPSF4siRNA进入A549细胞抑制基因表达
未处理组：未处理的细胞；
si-NC siNC组：表示No.8(PE):No.12(PC):No.MG(34)(v:v:v＝2:3:1)脂质混合物与si-NC siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
si-CPSF4组：表示No.8(PE):No.12(PC):No.MG(34)(v:v:v＝2:3:1)脂质混合物与CPSF4 siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM。
如图61所示，No.8(PE):No.12(PC):No.MG(34)(v:v:v＝2:3:1)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。
7 No.38(PE):No.37(LPC):No.32(TG)(v:v:v＝32:8:5)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能
1)No.38(PE):No.37(LPC):No.32(TG)(v:v:v＝32:8:5)脂质混合物介导抗纤维化HJT-sRNA-m7进入MRC-5细胞(水煮法)
如图62所示，与对照相比，m7明细条带变浅。M7的作用并不足以使细胞恢复到未加刺激的水平。
未处理组：是指未经处理的细胞，即空白对照组；
TGFβ1组：加入TGFβ1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
NC组：用脂质组合No.38(PE):No.37(LPC):No.32(TG)(v:v:v＝32:8:5)递送NC mimics 24h后加入TGFβ1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
m7组：脂质组合No.38(PE):No.37(LPC):No.32(TG)(v:v:v＝32:8:5)与HJT-sRNA-m7双链混合物加入MRC-5MRC5细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM；24h后加入TGFβ1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样。
2)No.38(PE):No.37(LPC):No.32(TG)(v:v:v＝32:8:5)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达
如图63所示，No.38(PE):No.37(LPC):No.32(TG)(v:v:v＝32:8:5)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。
siNC组：表示No.38(PE):No.37(LPC):No.32(TG)(v:v:v＝32:8:5)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
si-XRN2组：表示No.38(PE):No.37(LPC):No.32(TG)(v:v:v＝32:8:5)脂质混合物与XRN2siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
8 No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v:v:v:v:v:v:v＝2:1:2:2:3:1:3)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能
1)如图64所示，No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v:v:v:v:v:v:v＝2:1:2:2:3:1:3)介导抗纤维化HJT-sRNA-m7进入MRC-5细胞(水煮法)
未处理组：是指未经处理的细胞，即空白对照组；
TGF-β1组：加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
NC组：用脂质组合No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v:v:v:v:v:v:v＝2:1:2:2:3:1:3)递送NC mimics 24h后加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
M7组：脂质组合No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v:v:v:v:v:v:v＝2:1:2:2:3:1:3)与HJT-sRNA-m7单链混合物加入MRC5细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM；24h后加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
2)如图65所示，No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v:v:v:v:v:v:v＝2:1:2:2:3:1:3)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法)
No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v:v:v:v:v:v:v＝2:1:2:2:3:1:3)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。
siNC组：表示No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v:v:v:v:v:v:v＝2:1:2:2:3:1:3)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
si-XRN2组：表示No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v:v:v:v:v:v:v＝2:1:2:2:3:1:3)脂质混合物与XRN2siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
9 No.8(PE):No.12(PC):No.31(So):No.29(FA):No.4(Cer)(v:v:v:v:v＝2:4:2:2:5)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能
1)如图66所示，No.8(PE):No.12(PC):No.31(So):No.29(FA):No.4(Cer)(v:v:v:v:v＝2:4:2:2:2.5)介导具有抗纤维化效应的HJT小RNA HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3、HJT-sRNA-m7进入MRC5细胞(水煮法)
未处理组：是指未经处理的细胞，即空白对照组；
TGF-β1组：加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
NC组：用脂质组合No.8(PE):No.12(PC):No.31(So):No.29(FA):No.4(Cer)(v:v:v:v:v＝2:4:2:2:5)递送NC mimics 24h后加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
HJT-3,a2,H3组：表示脂质组合No.8(PE):No.12(PC):No.31(So):No.29(FA):No.4(Cer)(v:v:v:v:v＝2:4:2:2:5)与HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；24h后加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
HJT-M7组：脂质组合No.8(PE):No.12(PC):No.31(So):No.29(FA):No.4(Cer)(v:v:v:v:v＝2:4:2:2:5)与HJT-sRNA-m7单链混合物加入MRC5细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM；24h后加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
2)如图67所示，No.8(PE):No.12(PC):No.31(So):No.29(FA):No.4(Cer)(v:v:v:v:v＝2:4:2:2:5)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法)
No.8(PE):No.12(PC):No.31(So):No.29(FA):No.4(Cer)(v:v:v:v:v＝2:4:2:2:5)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。
siNC组：表示No.8(PE):No.12(PC):No.31(So):No.29(FA):No.4(Cer)(v:v:v:v:v＝2:4:2:2:5)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
si-XRN2组：表示No.8(PE):No.12(PC):No.31(So):No.29(FA):No.4(Cer)(v:v:v:v:v＝2:4:2:2:5)脂质混合物与XRN2siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
10 No.38(PE):No.37(LPC)(v:v＝4:1)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能
1)如图68所示，No.38(PE):No.37(LPC)(v:v＝4:1)介导具有抗纤维化效应的HJT小RNA HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3、HJT-sRNA-m7进入MRC5细胞(水煮法)
未处理组：是指未经处理的细胞，即空白对照组；
TGF-β1组：加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
NC组：用脂质组合No.38(PE):No.37(LPC)(v:v＝4:1)递送NC mimics 24h后加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
3&a2&H3组：表示No.38(PE):No.37(LPC)(v:v＝4:1)脂质混合物与HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3双链混合物加入细胞，混匀，核 酸终浓度为：400nM；24h后加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
M7组：脂质组合No.38(PE):No.37(LPC)(v:v＝4:1)与HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3、HJT-sRNA-m7加入MRC5细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM；24h后加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
2)如图69所示，No.38(PE):No.37(LPC)(v:v＝4:1)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法)
No.38(PE):No.37(LPC)(v:v＝4:1)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。
siNC组：表示No.38(PE):No.37(LPC)(v:v＝4:1)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
si-XRN2组：表示No.38(PE):No.37(LPC)(v:v＝4:1)脂质混合物与XRN2siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
11 No.38(PE):No.12(PC):No2(DG)(v:v:v＝4:1:3)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能
如图70所示，No.38(PE):No.12(PC):No2(DG)(v:v:v＝4:1:3)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达。
将No.8(PE)替换为No.38(PE)，与No.12(PC)、No.2(DG)(v:v:v＝4:1:3)混合的脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。
siNC组：表示No.38(PE):No.12(PC):No2(DG)(v:v:v＝4:1:3)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
si-XRN2组：表示No.38(PE):No.12(PC):No2(DG)(v:v:v＝4:1:3)脂质混合物与XRN2siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
12 No.38(PE):No.37(LPC):No.12(PC)(v:v:v＝4:1:1)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能
如图71所示，No.38(PE):No.37(LPC):No.12(PC)(v:v:v＝4:1:1)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达(逆向蒸发法)
在No.38(PE):No.37(LPC)(v:v＝4:1)脂质混合物基础上加入No.12(PC)(v:v:v＝4:1:1)可以有效递送核酸进入细胞发挥作用抑制基因表达。
siNC组：表示No.38(PE):No.37(LPC):No.12(PC)(v:v:v＝4:1:1)脂质混合 物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
si-RNA组：表示No.38(PE):No.37(LPC):No.12(PC)(v:v:v＝4:1:1)脂质混合物与XRN2siRNA、β-肌动蛋白siRNA、Ssu 72siRNA或CPSF4 siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
13 No.4(Cer):No.12(PC):No.38(PE):No.37(LPC)(v:v:v:v＝5:2:8:3)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能
1)如图72所示，在No.38(PE)、No.37(LPC)、No.12(PC)脂质混合物基础上加入No.4(Cer)，No.4(Cer):No.12(PC):No.38(PE):No.37(LPC)(v:v:v:v＝5:2:8:3)脂质混合物抗纤维化HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3、HJT-sRNA-m7双链RNA进入MRC5细胞发挥功能，降低纤维化蛋白纤连蛋白表达水平(水煮法)
未处理组：是指未经处理的细胞，即空白对照组；
TGF-β1组：加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
NC组：用脂质组合No.4(Cer):No.12(PC):No.38(PE):No.37(LPC)(v:v:v:v＝5:2:8:3)递送NC mimics 24h后加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
HJT-3&a2&H3组：表示No.4(Cer):No.12(PC):No.38(PE):No.37(LPC)(v:v:v:v＝5:2:8:3)脂质混合物与HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3双链核酸混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
m7：表示No.4(Cer):No.12(PC):No.38(PE):No.37(LPC)(v:v:v:v＝5:2:8:3)脂质混合物与HJT-sRNA-m7混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
2)如图73所示，No.4(Cer):No.12(PC):No.38(PE):No.37(LPC)(v:v:v:v＝5:2:8:3)脂质混合物介导XRN2siRNA，v:v:v:v＝5:2:8:3)可以有效递送核酸进入细胞发挥作用抑制基因表达。
siNC组：表示No.4(Cer):No.12(PC):No.38(PE):No.37(LPC)(v:v:v:v＝5:2:8:3)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
si-XRN2组：表示No.4(Cer):No.12(PC):No.38(PE):No.37(LPC)(v:v:v:v＝5:2:8:3)脂质混合物与XRN2混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
14 No.38(PE):No.2(DG):No.31(So)(v:v:v＝4:2:3)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能
1)如图74所示，No.38(PE):No.2(DG):No.31(So)(v:v:v＝4:2:3)脂质混合 物介导抗纤维化HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3、HJT-sRNA-m7双链RNA进入MRC5细胞发挥功能，降低纤维化蛋白纤连蛋白表达水平(水煮法)
未处理组：是指未经处理的细胞，即空白对照组；
TGF-β1组：加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
NC组：用脂质组合No.38(PE):No.2(DG):No.31(So)(v:v:v＝4:2:3)递送NC mimics 24h后加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
HJT-3&a2&H3组：表示No.38(PE):No.37(LPC)(v:v＝4:1)脂质混合物与HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
m7：表示No.38(PE):No.37(LPC)(v:v＝4:1)脂质混合物与HJT-sRNA-m7混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
2)如图75所示，No.38(PE):No.2(DG):No.31(So)(v:v:v＝4:2:3)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法)
No.38(PE):No.2(DG):No.31(So)(v:v:v＝4:2:3)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。
siNC组：表示No.38(PE):No.2(DG):No.31(So)(v:v:v＝4:2:3)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
si-XRN2组：表示No.38(PE):No.2(DG):No.31(So)(v:v:v＝4:2:3)脂质混合物与XRN2混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
实施例5：脂质41及其组合物的效果验证
(一)脂质单体通过不同制备方法(逆向蒸发法及水煮法)递送核酸(双链RNA及单链RNA)进入细胞
脂质41.Sphinganine(d22:0)
Figure PCTCN2019080175-appb-000034
1.荧光实时定量PCR(real-time PCR)检测脂质递送核酸效率
如图76所示，脂质41通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送HJT-sRNA-m7双链RNA进入A549细胞。对于A549细胞，在水煮法的情况下， 脂质41的递送效果是RNAimax的效果的约2倍，而在逆向蒸发法的情况下，脂质41的递送效果也明显高于RNAimax的效果。
如图77所示，脂质41通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送HJT-sRNA-m7双链RNA进入MRC5细胞。对于MRC5细胞，在水煮法的情况下，脂质41递送双链RNA进入MRC5细胞，而在逆向蒸发法的情况下，脂质41的递送效果明显高于RNAimax的效果。
如图78所示，脂质41通过水煮法递送HJT-sRNA-m7单链RNA进入A549及MRC5细胞。
2.数字PCR(ddPCR)技术检测脂质递送核酸效率
2.1实验材料：A549细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，TRIzol裂解液购自Sigma公司，High capacity cRNA Reverse Transcription Kit逆转录试剂盒购自美国ABI公司，数字PCR相关试剂购自Bio-rad公司。
2.3实验方法：按照前述方法用TRIzol裂解液收集并提取细胞总RNA，使用High capacity cRNA Reverse Transcription Kit逆转录为cDNA，将不同组cDNA进行数字PCR反应。具体操作步骤参考QX200 Droplet Reader and QuantaSoft Software说明书，利用QuantaSoft软件对结果进行分析。其中分组情况：(1)未处理组：不做任何处理的A549细胞；(2)自由摄取组：直接将HJT-sRNA-m7 dsRNA与细胞共同孵育6h；(3)RNAimax组：用RNAimax将HJT-sRNA-m7 dsRNA转染进入A549细胞，6h后收样检测；(4)No.41组：脂质41通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞，6h后收样检测。
实验结果与分析：如图79所示，在水煮法或逆向蒸发法中，No.41脂质均可以有效递送HJT-sRNA-m7 dsRNA进入A549细胞，水煮法的效果优于逆向蒸发法。
3.流式细胞技术检测脂质递送核酸效率
实验材料：A549细胞(购自中国医学科学院细胞中心)，FAM-sRNA(购自锐博生物科技有限公司)，脂质41，
Figure PCTCN2019080175-appb-000035
C6仪器(购自美国BD公司)
实验方法：将PGY-sRNA-6-FAM溶解于100ul水中，并与4ul脂质混合，用水煮法制备。之后将混合物丢入A549细胞中，共孵育6h后，收样检测，先用PBS清洗三遍后，用胰酶消化三分钟后，移去胰酶，再用PBS清洗后吹下来。用
Figure PCTCN2019080175-appb-000036
C6仪器测定。
如图80所示，实验结果：脂质41递送PGY-sRNA-6单链RNA效率是94.1％，比阳性对照RNAiMAX的69.4％相比，递送效率更高。同时脂质41递送PGY-sRNA-6双链RNA效率是96.7％，比阳性对照RNAiMAXd的94.9％相比，递送效率也更高，脂质41可高效递送单链及双链核酸进入A549细胞。
4.共聚焦荧光显微镜观察脂质递送核酸在细胞中的定位
实验材料：A549细胞(购自中国医学科学院细胞中心)，PGY-sRNA-6-Cy3(购自锐博生物科技有限公司)，脂质41，Zeiss LSM780(购自德国Zeiss公司)，Alexa
Figure PCTCN2019080175-appb-000037
488 phalloidin(购自美国invitrogen)，DAPI(购自美国invitrogen)，多聚甲醛(购自美国sigma公司)
实验方法：将PGY-sRNA-6-Cy3溶解于100ul水中，并与4ul脂质混合，用水煮法制备。之后将混合物丢入A549细胞中，共孵育6h后，PBS清洗三遍后，4％的多聚甲醛固定，PBS清洗三遍后，Alexa
Figure PCTCN2019080175-appb-000038
488 phalloidin染色30min，PBS清洗三遍后，Dapi染色5min，PBS清洗，后封片。
如图81所示，实验结果：共聚焦显微镜观察下，能明显观察到红色PGY-sRNA-6-Cy3的进入，脂质41可有效递送双链核酸进入A549细胞。
5.Western Blotting实验检测脂质递送核酸的效率
如图82，脂质单体No.41介导sRNAi进入MRC5A549细胞发挥敲低蛋白表达作用(逆向蒸发法)。在蛋白质水平上，脂质单体No.41介导蛋白敲低效果显著高于RNAimax介导的HJT-sRNA-m7抑制效果。
未处理：未处理的MRC5A549细胞
siNC:表示脂质单体No.41与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
siRNA:表示脂质单体No.41与LAMP2、XPN2、Ssu72、CPSF4或β肌动蛋白siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
自由摄取组：直接加入测试物
RNAimax:分别用100ul opti-MEM培养基稀释2ul RNAiMAX转染试剂和核酸溶液，二者混匀后放置15min，加入细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM。
So(41)(逆向蒸发法)：将脂质41与核酸混合物加入细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM。
如图83，脂质单体No.41介导抗纤维化HJT-sRNA-m7双链进入MRC5细胞(逆向蒸发法)。在蛋白质水平上，脂质单体No.41介导的HJT-sRNA-m7抑制效果高于RNAimax介导的HJT-sRNA-m7抑制效果。
TGFβ1组：加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
NC组：用脂质单体No.41递送NC mimics 24h后加入TGF-β1TGFb1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
HJT-3&a2&H3组：表示脂质单体No.41与HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
m7：表示脂质单体No.41与HJT-sRNA-m7混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
6.脂质41体内实验结果汇总
【实验方法】6-8周龄小鼠，22-24g，饲养于中国医学科学院基础医学研究所动物中心SPF级动物房，小鼠灌胃前禁食12h，将小鼠随机分为3组，分别为：(1)对照组，灌胃400ul DEPC处理的水；(2)自由摄取组，灌胃小RNA(PGY-sRNA-26与PGY-sRNA-32及PGY-sRNA-23，每条小RNA 1nmol/只，溶于400ulDEPC处理的水；(3)脂质41组：灌胃小RNA(PGY-sRNA-26与PGY-sRNA-32)和脂质41用加热法制备的混合物，每条小RNA 1nmol/只，脂质4110ul/只，溶于400ul DEPC处理的水。灌胃6h后收取各组织器官样品。所有的小RNA为3p末端2-O-甲基化修饰的单链RNA。
【实验结果】
如图108所示，脂质41可以促进小RNA进入血液，保护其在血液中不被降解
如图109所示，脂质41可以促进小RNA进入胃部细胞，保护其在胃中不被降解
如图110所示，脂质41可以促进小RNA进入小肠细胞，保护其在小肠中不被降解
如图111所示，脂质41可以促进小RNA进入肝脏，保护其在肝脏中不被降解
7.包含脂质41的脂质组合在核酸递送中效果
(1)脂质组合1(No.8+No.41＝6:1)与脂质组合2(No.38+No.41＝6:1)在核酸递送中的作用
如图84所示，脂质组合1(No.8+No.41＝6:1)与脂质组合2(No.38+No.41＝6:1)介导抗纤维化HJT-3&a2&H3，HJT-sRNA-m7进入MRC5细胞(加热法)，在蛋白质水平上介导的HJT-sRNA-m7抑制效果显著。
TGF：加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
NC组：表示用脂质单体No.41递送NC mimics 24h后加入TGF-β1TGFb1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
HJT-3&a2&H3组：表示脂质混合物与HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
HJT-m7：表示脂质混合物与HJT-sRNA-m7混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
(2)脂质组合3(No.39+No.41＝6:1)与脂质组合4(No.40+No.41＝6:1)在核酸递送中的作用
如图85所示，脂质组合3(No.39+No.41＝6:1)与脂质组合4(No.40+No.41＝6:1)介导抗纤维化HJT-3&a2&H3，HJT-sRNA-m7进入MRC5细胞(加热法)，在蛋白质水平上介导的HJT-sRNA-m7抑制效果显著。
TGF：加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
NC组：表示用脂质混合物递送NC mimics 24h后加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
HJT-3&a2&H3组：表示脂质混合物与HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
HJT-m7：表示脂质混合物与HJT-sRNA-m7混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
(3)脂质组合5(38+12+41+29＝1:2:1:1)在核酸递送中的作用
如图86所示，脂质组合5(38+12+41+29＝1:2:1:1)介导抗纤维化HJT-3&a2&H3，HJT-sRNA-m7进入MRC5细胞(加热法)，在蛋白质水平上介导的HJT-sRNA-m7抑制效果显著。
TGF：加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
NC组：表示用脂质混合物递送NC mimics 24h后加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
HJT-3&a2&H3组：表示脂质混合物与HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
HJT-m7：表示脂质混合物与HJT-sRNA-m7混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
(4)脂质组合6(40(PE)+12(PC)+41(So)＝2:4:3)在核酸递送中的作用
如图87所示，脂质组合6(40(PE)+12(PC)+41(So)＝2:4:3)介导抗纤维化HJT-3&a2&H3，HJT-sRNA-m7进入MRC5细胞(加热法及逆向蒸发法)，在蛋白质水平上介导的HJT-3&a2&H3，HJT-sRNA-m7抑制效果显著。
TGF：加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
3’-NC组：表示用脂质混合物递送NC mimics 24h后加入TGF-β1TGFb1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
3’-3&a2&H3组：表示脂质混合物与HJT-sRNA-3、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
3’-m7：表示脂质混合物与HJT-sRNA-m7混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
右图：通过逆向蒸发法制备脂质-RNA混合物，脂质组合6(40(PE)+12(PC)+41(So)＝2:4:3)可有效递送XRN2、Ssu72、CPSF4 siRNA进入A549细胞，在蛋白水平上显著降低表达水平。
siNC:表示脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
siRNA:表示脂质混合物与XRN2、Ssu72、CPSF4 siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
(5)脂质组合7(12(PC)+41(So)＝1:6)和脂质组合8(12(PC)+41(So)＝1:1)在核酸递送中的作用
如图88所示，采用逆向蒸发法，脂质组合7(12(PC)+41(So)＝1:6)和脂质组合8(12(PC)+41(So)＝1:1)可有效递送Ssu72、CPSF4 siRNA进入A549细胞(逆向蒸发法)，在蛋白水平上显著降低表达水平。
siNC:表示脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
siRNA:表示脂质混合物与XRN2、Ssu72、CPSF4 siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
(6)脂质组合9(12(PC)+41(So)＝6:1)和脂质组合10(40(PE)+12(PC)+41(So)＝2:2:2)在核酸递送中的作用
如图89所示，采用逆向蒸发法，脂质组合9(12(PC)+41(So)＝6:1)和脂质组合10(40(PE)+12(PC)+41(So)＝2:2:2)可有效递送XRN2、Ssu72、CPSF4siRNA进入A549细胞，在蛋白水平上显著降低表达水平。
siNC:表示脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
siRNA:表示脂质混合物与XRN2、Ssu72、CPSF4 siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
(7)脂质组合11(4(Cer)+12(PC)+41(So)＝1:1:1)在核酸递送中的作用
如图90所示，采用逆向蒸发法，脂质组合11(4(Cer)+12(PC)+41(So)＝1:1:1)可有效递送Ssu72siRNA进入A549细胞，在蛋白水平上显著降低表达水平。
siNC:表示脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
siSsu72:表示脂质混合物与Ssu72siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM。
实施例6：脂质38及其组合物的效果验证
脂质38.PE(16:0/16:1)
Figure PCTCN2019080175-appb-000039
1.荧光实时定量PCR(real-time PCR)检测脂质递送核酸效率
(1)脂质38通过水煮法递送双链RNA进入A549细胞及MRC5细胞
如图91所示，脂质38通过加热法递送双链RNA进入A549细胞及MRC5细胞。对于MRC5细胞，在加热法的情况下，脂质38对双链RNA的递送效果是RNAimax的效果的约2倍。
(1)未处理组：不做任何处理的A549细胞；
(2)自由摄取组：直接将HJT-sRNA-m7 dsRNA与细胞共同孵育12h；核酸终浓度100nM；
RNAimax组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀， HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
4)脂质与核酸处理组：将2.5μL脂质单体No.38与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法或逆向蒸发法制备混合物，加入A549细胞中，RNA的终浓度为100nM。12h后收样检测进入量。(2)脂质38通过水煮法递送HJT-sRNA-m7单链RNA进入A549细胞及MRC5细胞
如图92所示脂质38通过加热法递送HJT-sRNA-m7单链RNA进入A549细胞及MRC5细胞，递送效率远远高于RNAimax的效果。
(1)未处理组：不做任何处理的A549细胞；
(2)自由摄取组：直接将HJT-sRNA-m7单链核酸溶液与细胞共同孵育12h，核酸终浓度100nM；
(3)RNAimax组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
(4)脂质与核酸处理组：将2.5μL脂质单体No.64与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法或逆向蒸发法制备混合物，加入A549细胞中，RNA的终浓度为100nM。12h后收样检测进入量。
2.数字PCR(ddPCR)技术检测脂质递送核酸效率
2.1实验材料：A549细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，TRIzol裂解液购自Sigma公司，High capacity cRNA Reverse Transcription Kit逆转录试剂盒购自美国ABI公司，数字PCR相关试剂购自Bio-rad公司。
2.2实验方法：按照前述方法用TRIzol裂解液收集并提取细胞总RNA，使用High capacity cRNA Reverse Transcription Kit逆转录为cDNA，将不同组cDNA进行数字PCR反应。具体操作步骤参考QX200 Droplet Reader and QuantaSoft Software说明书，利用QuantaSoft软件对结果进行分析
(1)未处理组：不做任何处理的A549细胞；
(2)自由摄取组：直接将HJT-sRNA-m7 dsRNA与细胞共同孵育6h；
(3)RNAimax组：用RNAimax将HJT-sRNA-m7 dsRNA转染进入A549细胞，6h后收样检测；
(4)No.38组：脂质38通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送 双链RNA进入A549细胞，6h后收样检测。
实验结果与分析：如图93所示，在水煮法或逆向蒸发法中，No.38脂质均可以有效递送HJT-sRNA-m7 dsRNA进入A549细胞。
3.流式细胞技术检测脂质递送核酸效率
实验材料：A549cells(购自中国医学科学院细胞中心)，FAM-sRNA(购自锐博生物科技有限公司)，脂质38，
Figure PCTCN2019080175-appb-000040
C6仪器(购自美国BD公司)
实验方法：将PGY-sRNA-6-FAM溶解于100ul水中，并与4ul脂质混合，用水煮法制备脂质-sRNA混合物，加入A549细胞中，混匀，共孵育6h后收样检测。PBS清洗三遍后，用胰酶消化细胞为单个细胞，PBS重悬，利用
Figure PCTCN2019080175-appb-000041
C6仪器检测相对进入量。
如图94所示，实验结果：脂质38递送单链RNA效率是72.5％，接近阳性对照RNAiMAX递送效率。
4.共聚焦荧光显微镜观察脂质递送核酸在细胞中的定位
实验材料：A549cells(购自中国医学科学院细胞中心)，PGY-sRNA-6-Cy3(购自锐博生物科技有限公司)，脂质38，Zeiss LSM780(购自德国Zeiss公司)，Alexa
Figure PCTCN2019080175-appb-000042
488 phalloidin(购自美国invitrogen)，DAPI(购自美国invitrogen)，多聚甲醛(购自美国sigma公司)
实验方法：将PGY-sRNA-6-溶解于100ul水中，并与4ul脂质混合，用水煮法制备。之后将混合物丢入A549细胞中，共孵育6h后，PBS清洗三遍后，4％的多聚甲醛固定，PBS清洗三遍后，Alexa
Figure PCTCN2019080175-appb-000043
488 phalloidin染色30min，PBS清洗三遍后，Dapi染色5min，PBS清洗，后封片。
如图95所示，实验结果：共聚焦显微镜观察下，能明显观察到红色PGY-sRNA-6-Cy3的进入，水煮法制备No.38脂质-sRNA混合物均可以有效递送双链进入A549细胞。
实施例7：脂质64及其组合物的效果验证
脂质64.PE(15:0/24:1(15Z))
Figure PCTCN2019080175-appb-000044
1.荧光实时定量PCR(real-time PCR)检测脂质递送核酸效率
(1)脂质64通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送HJT-sRNA-m7双链RNA进入A549细胞
如图96所示，脂质64通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送HJT-sRNA-m7双链RNA进入A549细胞。对于A549细胞，在水煮法的情况下，脂质64的递送效果是RNAimax的效果的约3倍。
(3)未处理组：不做任何处理的A549细胞；
(4)自由摄取组：直接将HJT-sRNA-m7 dsRNA与细胞共同孵育12h；核酸终浓度100nM；
RNAimax组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
4)脂质与核酸处理组：将2.5μL脂质单体No.64与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法或逆向蒸发法制备混合物，加入A549细胞中，RNA的终浓度为100nM。12h后收样检测进入量。
2.流式细胞技术检测脂质递送核酸效率
实验材料：A549cells(购自中国医学科学院细胞中心)，FAM-sRNA(购自锐博生物科技有限公司)，脂质64，
Figure PCTCN2019080175-appb-000045
C6仪器(购自美国BD公司)
实验方法：将FAM-sRNA溶解于100ul水中，并与4ul脂质混合，用水煮法制备。脂质-sRNA混合物，加入A549细胞中，混匀，共孵育6h后收样检测。PBS清洗三遍后，用胰酶消化细胞为单个细胞，PBS重悬，利用
Figure PCTCN2019080175-appb-000046
C6仪器检测相对进入量。
如图97所示，实验结果：脂质64递送PGY-sRNA-6单链RNA效率可达到阳性对照RNAiMAX的约1/2。
3.共聚焦荧光显微镜观察脂质递送核酸在细胞中的定位
实验材料：A549cells(购自中国医学科学院细胞中心)，PGY-sRNA-6-Cy3 (购自锐博生物科技有限公司)，脂质64，Zeiss LSM780(购自德国Zeiss公司)，Alexa
Figure PCTCN2019080175-appb-000047
488 phalloidin(购自美国invitrogen)，DAPI(购自美国invitrogen)，多聚甲醛(购自美国sigma公司)
实验方法：将PGY-sRNA-6-溶解于100ul水中，并与4ul脂质混合，用水煮法制备。之后将混合物丢入A549细胞中，共孵育6h后，PBS清洗三遍后，4％的多聚甲醛固定，PBS清洗三遍后，Alexa
Figure PCTCN2019080175-appb-000048
488 phalloidin染色30min，PBS清洗三遍后，Dapi染色5min，PBS清洗，后封片。
如图98所示，实验结果：共聚焦显微镜观察下，能明显观察到红色PGY-sRNA-6-Cy3的进入。脂质64递送单链RNA进入A549细胞。
实施例8：脂质40及其组合物的效果验证
脂质40.PE(16:0-22:1)
Figure PCTCN2019080175-appb-000049
1.荧光实时定量PCR(real-time PCR)检测脂质递送核酸效率
脂质40通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞
如图99所示，脂质40通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞。对于A549细胞，在逆向蒸发法的情况下，脂质40的递送效果是RNAimax的效果的约1/2。
Figure PCTCN2019080175-appb-000050
组：不做任何处理的A549细胞；
自由摄取组：直接将HJT-sRNA-m7 dsRNA与细胞共同孵育12h；核酸终
浓度100nM；
RNAimax组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
4)脂质与核酸处理组：将2.5μL脂质单体No.40与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法或逆向蒸发法制备混合物，加入A549细胞中，RNA的终浓度为100nM。12h后收样检测进入量。
2.数字PCR(ddPCR)技术检测脂质递送核酸效率
2.1实验材料：A549细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，TRIzol裂解液购自Sigma公司，TaqMan TM MicroRNA Reverse Transcription KitHigh逆转录试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，数字PCR相关试剂购自Bio-rad公司。
2.3实验方法：按照前述方法用TRIzol裂解液收集并提取细胞总RNA，使用TaqMan TM MicroRNA Reverse Transcription KitHigh逆转录为cDNA，将不同组cDNA进行数字PCR反应。具体操作步骤参考QX200 Droplet Reader and QuantaSoft Software说明书，利用QuantaSoft软件对结果进行分析。
(1)
Figure PCTCN2019080175-appb-000051
组：不做任何处理的A549细胞；
(2)自由摄取组：直接将HJT-sRNA-m7 dsRNA与细胞共同孵育6h；
(3)RNAimax组：用RNAimax将HJT-sRNA-m7 dsRNA转染进入A549细胞，6h后收样检测；
(4)No.40组：脂质40通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞，6h后收样检测。
(5)实验结果与分析：如图100所示，在水煮法或逆向蒸发法中，No.40脂质均可以有效递送HJT-sRNA-m7 dsRNA进入A549细胞。
3.共聚焦荧光显微镜观察脂质递送核酸在细胞中的定位
实验材料：A549cells(购自中国医学科学院细胞中心)，PGY-sRNA-6-Cy3(购自锐博生物科技有限公司)，脂质40，Zeiss LSM780(购自德国Zeiss公司)，Alexa
Figure PCTCN2019080175-appb-000052
488 phalloidin(购自美国invitrogen)，DAPI(购自美国invitrogen)，多聚甲醛(购自美国sigma公司)
实验方法：将PGY-sRNA-6-Cy3溶解于100ul水中，并与4ul脂质混合，用水煮法制备。之后将混合物丢入A549细胞中，共孵育6h后，PBS清洗三遍后，4％的多聚甲醛固定，PBS清洗三遍后，Alexa
Figure PCTCN2019080175-appb-000053
488 phalloidin染色30min，PBS清洗三遍后，Dapi染色5min，PBS清洗，后封片观察。
如图101所示，实验结果：共聚焦显微镜观察下，能明显观察到红色PGY-sRNA-6-Cy3的进入，No.40脂质均可以有效递送HJT-sRNA-m7 dsRNA进入A549细胞。
4.Western Blotting实验检测脂质递送核酸的效率
如图102所示，磷脂酰乙醇胺类脂质单体脂质40介导抗纤维化双链RNA HJT-sRNA-m7进入MRC5细胞，下调纤连蛋白蛋白表达水平
TGF：加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
3’-NC组：表示用脂质混合物递送NC mimics 24h后加入TGF-β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样；
3’-m7：表示脂质混合物与HJT-sRNA-m7双链核酸溶液混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM；
实施例8：脂质37的效果验证
ipid 37.LPC(18:3)
Figure PCTCN2019080175-appb-000054
1.荧光实时定量PCR(real-time PCR)检测脂质递送核酸效率
脂质37通过水煮法递送单链RNA进入A549细胞及MRC5细胞
如图103所示，通过水煮法递送单链RNA进入A549细胞及MRC5细胞。
未处理组：不做任何处理的A549细胞；
自由摄取组：直接将HJT-sRNA-m7 dsRNA与细胞共同孵育3h；核酸终浓
度100nM；
RNAimax组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
脂质与核酸处理组：将2.5μL脂质单体No.39与HJT-sRNA-m7的单链核酸溶液经水煮法制备混合物，加入细胞中，RNA的终浓度为100nM。3h后收样检测进入量。
实施例9：脂质39的效果验证
脂质39.PE(16:1-18:1)
Figure PCTCN2019080175-appb-000055
1.荧光实时定量PCR(real-time PCR)检测脂质递送核酸效率
如图104所示，脂质39通过不同制备方法(水煮或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞
(5)
Figure PCTCN2019080175-appb-000056
组：不做任何处理的A549细胞；
(6)自由摄取组：直接将HJT-sRNA-m7 dsRNA与细胞共同孵育6h；核酸终浓度100nM；
RNAimax组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
4)脂质与核酸处理组：将2.5μL脂质单体No.39与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法和逆向蒸发法两种方法制备混合物，加入细胞中，RNA的终浓度为100nM。12h后收样检测进入量。
2.数字PCR(ddPCR)技术检测脂质递送核酸效率
2.1实验材料：A549细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，TRIzol裂解液购自Sigma公司，High capacity cRNA Reverse Transcription Kit逆转录试剂盒购自美国ABI公司，数字PCR相关试剂购自Bio-rad公司。
2.3实验方法：按照前述方法用TRIzol裂解液收集并提取细胞总RNA，使用High capacity cRNA Reverse Transcription Kit逆转录为cDNA，将不同组cDNA进行数字PCR反应。具体操作步骤参考QX200 Droplet Reader and QuantaSoft Software说明书，利用QuantaSoft软件对结果进行分析。
(1)未处理组：不做任何处理的A549细胞；
(2)自由摄取组：直接将HJT-sRNA-m7 dsRNA与细胞共同孵育6h；12h；
(3)RNAimax组：用RNAimax将HJT-sRNA-m7 dsRNA转染进入A549细胞，6h12h后收样检测；
(4)No.39组：脂质39通过逆向蒸发法递送双链RNA进入A549细胞，6h12h后收样检测。
如图105所示，通过逆向蒸发法，No.39脂质可以有效递送HJT-sRNA-m7双链核酸进入A549细胞。
实施例10：脂质60和612的效果验证
脂质60.dMePE(16:1/16:1)
Figure PCTCN2019080175-appb-000057
1.荧光实时定量PCR(real-time PCR)检测脂质递送核酸效率
如图106所示，脂质60通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞
(7)未处理组：不做任何处理的A549细胞；
(8)自由摄取组：直接将HJT-sRNA-m7 dsRNA与细胞共同孵育6h；核酸终浓度100nM；
RNAimax组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
4)脂质与核酸处理组：将2.5μL脂质单体No.60与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法和逆向蒸发法两种方法制备混合物，加入细胞中，RNA的终浓度为100nM。12h后收样检测。
脂质62.dMePE(16:1/18:1)
1.荧光实时定量PCR(real-time PCR)检测脂质递送核酸效率
如图107所示，脂质62通过不同制备方法(水煮或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞
(1)未处理组：不做任何处理的A549细胞；
(2)自由摄取组：直接将HJT-sRNA-m7 dsRNA与细胞共同孵育6h；核酸终浓度100nM；
(3)RNAimax组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX 转染试剂和HJT-sRNA-m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7双链的终浓度为100nM；
(4)脂质与核酸处理组：将2.5μL脂质单体No.62与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经水煮法和逆向蒸发法两种方法制备混合物，加入细胞中，RNA的终浓度为100nM。12h后收样检测。
脂质核酸复合物的体内递送实验
1.实验动物：C57小鼠，雄性，约6周龄。
2.脂质混合物制备：按照每只小鼠10ul脂质-1nmol sRNA剂量进行制备，sRNA各1nmol用500ul DEPC水于玻璃管中溶解，加入10ul相应脂质，吹打使充分混匀，90℃水浴加热15min后自然冷却，灌胃。
3.sRNA:PGY-sRNA-26,PGY-sRNA-32
4.实验分组：
1)未处理组：灌胃500ul生理盐水；
2)RNAimax处理组：每只小鼠按照10ul RNAimax-1nmol sRNA混匀，灌胃。该组作为阳性对照组。RNAimax购自Invitrogen。
3)自由摄取组：直接灌胃sRNA溶液(1nmol/只，500ul)，该组作为阴性对照组；
4)脂质核酸混合物处理组：将步骤2中制备的脂质-sRNA混合物进行灌胃。
5.相对进入量检测：
1)组织取样提取RNA：小鼠灌胃6h后，眼球取血500ul，加入1.5ml Trizol Reagent LS充分混匀裂解，组织样品取部分加入3ml Trizol Reagent(购自Invitrogen)匀浆使充分裂解，组织取样：肝/胃/小肠。
2)将sRNA逆转录为cDNA：通过逆转录试剂盒(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits，Applied Biosystems，cat.no.4368813)，将总RNA逆转录为cDNA，逆转录体系如下：模板RNA(150ng/μL)10μL，10X RT缓冲液2.0μL，25X dNTP Mix(100mM)0.8μL，随机引物2.0μL，MultiScribe TM逆转录酶1.0μL，RNA酶抑制剂1.0μL，无核酸酶H 2O 3.2μL，瞬时离心后，放入PCR仪反应，反应条件如下：(1)25℃，10min；(2)37℃，120min；(3)85℃，5min；(4)4℃，终止反应。反应结束后加入20μL无RNA酶ddH 2O，补足终体积至40μL。
3)定量PCR扩增反应：qPCR反应体系总体积10μl，包括：5μL 2×SYBR Green Master Mix，0.5μl正向引物(10μM)，0.5μl反向引物(10μM),1μl逆转录得到的cDNA,3μl无RNA酶dH2O。使用LightCycler 480荧光定量PCR仪，PCR反应条件是：95℃，持续5min预变性，开始进入PCR扩增循环：(1)95℃，10s；(2)55℃，10s；(3)72℃，20s；总共进行40个循环；最后40℃持续10s降温。扩增反应正向引物和反向引物均由北京擎科新业生物技术有限公司设计和合成(U6F引物：GCGCGTCGTGAAGCGTTC，U6R引物:：GTGCAGGGTCCGAGGT)。
3)利用2-ΔCt法计算相对表达量。
实施例11-1：脂质单体No.41递送单链核酸进入体内
1.实验动物：C57小鼠，雄性，约6周龄。
1)未处理组：灌胃500ul生理盐水；
2)RNAimax处理组：每只小鼠按照10ul RNAimax-1nmol sRNA混匀，灌胃。该组作为阳性对照组。RNAimax购自Invitrogen。
3)自由摄取(free uptake)组：直接加入sRNA单链混合溶液(各1nmol)；
4)POPC(sigma,货号：#42773)与核酸处理组：将10μL POPC与sRNA单链混合溶液(1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。
5)脂质单体与核酸处理组：将10μL脂质单体(No41)与sRNA单链混合溶液(PGY-sRNA-23，PGY-sRNA-26和PGY-sRNA-32)(各1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。
2.灌胃12h后，眼球取血，同时取各组织(肝脏/胃/小肠)，TRIzol充分裂解后提取RNA检测进入量。
结论：
如图108所示，PE单体(No.41)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液保护sRNA不受降解，且递送效果优于POPC与Lipofectamine RNAimax.如图109所示，PE单体(No.41)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠胃部，保护sRNA不受降解。
如图110所示，PE单体(No.41)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠小肠，保护sRNA不受降解。
如图111所示，PE单体(No.41)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠肝脏，保护sRNA不受降解。
实施例11-2：脂质单体No.38递送单链核酸进入体内
1.实验动物：C57小鼠，雄性，约6周龄。
1)未处理组：灌胃500ul生理盐水；
2)RNAimax处理组：每只小鼠按照10ul RNAimax-1nmol sRNA混匀，灌胃。该组作为阳性对照组。RNAimax购自Invitrogen。
3)自由摄取(free uptake)组：直接加入sRNA单链混合溶液(各1nmol)；
4)POPC与核酸处理组：将10μLPOPC与sRNA单链PGY-sRNA-32混合溶液(1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。
5)脂质单体与核酸处理组：将10μL脂质单体(No38)与sRNA单链混合溶液(PGY-sRNA-32)(1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。
2.灌胃12h后，眼球取血，TRIzol法裂解提取RNA检测进入量。
结论：如图112所示，PE单体(No.38)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液，且递送效果优于POPC与Lipofectamine RNAimax。
实施例11-3：脂质单体No.40递送单链核酸进入体内
1.实验动物：C57小鼠，雄性，约6周龄。
1)未处理组：灌胃500ul生理盐水；
2)RNAimax处理组：每只小鼠按照10ul RNAimax-1nmol sRNA混匀，灌胃。该组作为阳性对照组。RNAimax购自Invitrogen。
3)自由摄取(free uptake)组：直接加入sRNA单链混合溶液(各1nmol)；
4)POPC与核酸处理组：将10μLPOPC与sRNA单链混合溶液(各1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。
5)脂质单体与核酸处理组：将10μL脂质单体(No40)与sRNA单链混合溶液(PGY-sRNA-26和PGY-sRNA-32)(各1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。
2.灌胃12h后，眼球取血，TRIzol法裂解提取RNA检测进入量。
结论：如图113所示，PE单体(No.40)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液，且递送效果优于POPC与Lipofectamine RNAimax。
实施例11-4：脂质单体No.64递送单链核酸进入体内
1.实验动物：C57小鼠，雄性，约6周龄。
1)未处理组：灌胃500ul生理盐水；
2)RNAimax处理组：每只小鼠按照10ul RNAimax-1nmol sRNA混匀，灌胃。该组作为阳性对照组。RNAimax购自Invitrogen。
3)自由摄取(free uptake)组：直接加入sRNA单链混合溶液(各1nmol)；
4)POPC与核酸处理组：将10μL POPC与sRNA单链混合溶液(各1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。
5)脂质单体与核酸处理组：将10μL脂质单体(No64)与sRNA单链混合溶液(PGY-sRNA-32)(1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。
2.灌胃12h后，眼球取血，TRIzol法裂解提取RNA检测进入量。
结论：如图114所示，PE单体(No.64)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液，且递送效果优于POPC与Lipofectamine RNAimax。
实施例11-5：脂质单体No.71递送单链核酸进入体内
1.实验动物：C57小鼠，雄性，约6周龄。
1)未处理组：灌胃500ul生理盐水；
2)RNAimax处理组：每只小鼠按照10ul RNAimax-1nmol sRNA混匀，灌胃。该组作为阳性对照组。RNAimax购自Invitrogen。
3)自由摄取(free uptake)组：直接加入sRNA单链混合溶液(各1nmol)；
4)POPC与核酸处理组：将10μLPOPC与sRNA单链混合溶液(各1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。
5)脂质单体与核酸处理组：将10μL脂质单体(No71)与sRNA单链混合溶液(PGY-sRNA-32)(1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。
2.灌胃12h后，眼球取血，TRIzol法裂解提取RNA检测进入量。
结论：如图115所示，PE单体(No.71)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液，且递送效果优于POPC与Lipofectamine RNAimax。
实施例12：脂质在不同温度梯度有效递送单链核酸进入MRC5细胞
(一)实验分组：
1)未处理组：未经处理的细胞；
2)RNAiMAX组：分别用100μL opti-MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT-sRNA-m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT-sRNA-m7单链的终浓度为100nM；
3)脂质单体与核酸处理组：将2.5μL脂质单体(No.38)与HJT-sRNA-m7的双链核酸溶液经不同温度水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。
4℃：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入2.5μL脂质单体，4℃放置15min；加入细胞6h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的表达量。
37℃：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入2.5μL脂质单体，37℃放置15min；加入细胞6h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的表达量。
60℃：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入2.5μL脂质单体，60℃加热15min；加入细胞6h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的表达量。
80℃：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入2.5μL脂质单体，80℃加热15min；加入细胞6h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的表达量。
100℃：100μL HJT-sRNA-m7单链溶液加入2.5μL脂质单体，100℃加热15min；加入细胞6h后，经RT-qPCR法检测细胞中HJT-sRNA-m7的表达量。
结论：如图116所示，结果表明，脂质在水煮法不同温度条件下可以有效递送核酸进入细胞(统计学意义上有显著差异，p<0.01)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。
实施例13：脂质核酸复合物的体内递送实验
实验方法：
1.实验动物：C57小鼠，雄性，约6周龄，20-24g。饲养于中国医学科学院基础医学研究所动物中心SPF级动物房。小鼠灌胃前禁食12h。
2.脂质-小RNA混合物制备：按照每只小鼠100μg脂质：1nmol单链小RNA PGY-sRNA-26剂量进行制备。sRNA各1nmol用500ul DEPC水于玻璃管中溶解，加入100μg相应脂质溶液No.33,No.35,No.37,No.42,No.43,No.44,No.45,No.46,No.47,No.48,No.49,No.50,No.51,No.52,No.53,No.54,No.55,No.56,No.57,No.58,No.59,No.60,No.61,No.62,No.65,No.66,No.67,No.68,No.69或No.70(脂质氯仿溶液，使用浓度如表1-1中 所示)，吹打使充分混匀，90℃水浴加热15min后自然冷却，灌胃。
4.实验分组：
1)Native组：灌胃500ul生理盐水；
2)自由摄取组：直接灌胃sRNA溶液(1nmol/只，500ul)，该组作为阴性对照组；
3)脂质组：将步骤2中制备的脂质-sRNA混合物进行灌胃；
4)POPC(sigma,货号#42773)与核酸处理组：将10μL POPC与sRNA单链混合溶液(各1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。
5.相对进入量检测：
1)组织取样提取RNA：小鼠灌胃6h后，眼球取血500ul，加入1.5ml Trizol Reagent LS充分混匀裂解；组织取样：小鼠断颈牺牲，暴露小鼠胸腔腹腔，取下心/全脾/双肾/肠(上端约5cm)立即加入2ml Trizol Reagent(购自Invitrogen)，使用组织匀浆仪匀浆充分裂解。
2)将sRNA逆转录为cDNA：通过逆转录试剂盒(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits，Applied Biosystems，cat.no.4368813)，将总RNA逆转录为cDNA，逆转录体系如下：模板RNA(150ng/μL)10μL，10X RT缓冲液2.0μL，25X dNTP Mix(100mM)0.8μL，随机引物2.0μL，MultiScribe TM逆转录酶1.0μL，RNA酶抑制剂1.0μL，无核酸酶H 2O 3.2μL，瞬时离心后，放入PCR仪反应，反应条件如下：(1)25℃，10min；(2)37℃，120min；(3)85℃，5min；(4)4℃，终止反应。反应结束后加入20μL无RNA酶ddH 2O，补足终体积至40μL。
3)定量PCR扩增反应：qPCR反应体系总体积10μl，包括：5μL 2×SYBR Green Master Mix，0.5μl正向引物(10μM)，0.5μl反向引物(10μM),1μl逆转录得到的cDNA,3μl无RNA酶dH2O。使用LightCycler 480荧光定量PCR仪，PCR反应条件是：95℃，持续5min预变性，开始进入PCR扩增循环：(1)95℃，10s；(2)55℃，10s；(3)72℃，20s；总共进行40个循环；最后40℃持续10s降温。扩增反应正向引物和反向引物均由北京擎科新业生物技术有限公司设计和合成(U6F引物：GCGCGTCGTGAAGCGTTC，U6R引物:：GTGCAGGGTCCGAGGT；PGY-sRNA-26F引物：TCGCGCTCCGGAATGATTGGG，反向引物miR all rev：GTGCACGCTCCGAGGT)。
3)利用2-ΔCt法(如上文所述)计算相对表达量。
数据以平均值±SEM形式表示。实验组与对照组之间的参数差异通过非配对t检验进行评估。数据采用GraphPad Prism软件进行统计分析，P<0.05被认为有统计学意义。
结论
如图117a-图146b，脂质单体No.33,No.35,No.37,No.42,No.43,No.44,No.45,No.46,No.47,No.48,No.49,No.50,No.51,No.52,No.53,No.54,No.55,No.56,No.57,No.58,No.59,No.60,No.61,No.62,No.65,No.66,No.67,No.68,No.69或No.70均可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液及心脏、脾、肾、或肠等组织，效果明显高于或相当于POPC的效果。

Claims (66)

  1. 来自于任何自然的(包括中药提取物)或合成的具有下式的化合物在制备用于核酸递送的试剂中的用途，其中所述提取物具有下式结构或包含具有下式结构的化合物：
    Figure PCTCN2019080175-appb-100001
    其中L 1、L 2、L 3不存在，或L 1、L 2、L 3各自独立选自-C(O)O-CH 2-，-CH(OH)-，-C(O)-NH-CH 2-，-CH 2-O-C(O)-，-CH 2-NH-C(O)-，-C(O)O-，-C(O)NH-，-O-C(O)-，-NH-C(O)-，-CH 2-，
    Figure PCTCN2019080175-appb-100002
    Figure PCTCN2019080175-appb-100003
    条件是L 1、L 2、L 3中至多两个不存在；
    对于二价基团L 1、L 2而言，左侧的破折号“-”分别连接至基团A和B，而右侧的破折号“-”分别连接至中心碳原子；
    对于二价基团L 3而言，左侧的破折号“-”连接至中心碳原子，而右侧的破折号“-”连接至Q；
    A，B，Q各自独立选自H，-OH，C 1-20烷基，C 1-20烯基，C 1-20杂烷基，C 1-20杂烯基，-NH 2，和-NR 3 +，R为H或C 1-6烷基；和
    n为整数0，1，2，3或4；
    其中优选地，所述核酸是小核酸，优选是单链或双链的，优选地所述小核酸的长度是14-32bp、16-28bp或18-24bp；
    优选地，所述中药选自红景天，蒲公英，穿心莲和金银花中药饮片，优 选所述提取物通过Bligh&Dyer法提取脂溶性成分获得，更优选通过将所述中药饮片在水中浸泡，然后依次进行强火煎煮和弱火煎煮，将煎煮后的中药药液浓缩，然后依次添加氯仿-甲醇、氯仿和水搅拌处理，取氯仿层获得；
    优选地，所述试剂是口服试剂；优选地，所述核酸用于治疗疾病，例如心脏、脾、肾、胃、肺和/或肠疾病，例如癌症，例如胃癌或肺癌；
    优选地，核酸递送是对细胞或器官的核酸递送，优选地所述器官选自心脏、脾、肾、胃、肺和肠。
  2. 权利要求1的用途，其中所述结构中的
    L 1不存在，或L 1选自-C(O)O-CH 2-和-CH(OH)-，
    L 2不存在，或L 2选自-C(O)O-和-C(O)NH-，L 3不存在，或L 3选自-C(O)O-，-CH 2-O-C(O)-，-CH 2-和
    Figure PCTCN2019080175-appb-100004
    A选自H，C 1-20烷基和C 1-20烯基；
    B选自H，-NH 2，C 1-20烷基和C 1-20烯基；
    Q选自H，-OH，C 1-20烷基和C 1-20烯基，和-NR 3 +，其中R为H或C 1-6烷基。
  3. 权利要求1或2的用途，其中所述化合物具有下式
    Figure PCTCN2019080175-appb-100005
  4. 前述权利要求中任一项的用途，其中所述结构中的
    A选自H，C 10-20烷基和C 10-20烯基；
    B选自H，-NH 2，C 10-20烷基和C 10-20烯基；
    Q选自H，-OH，C 10-20烷基和C 10-20烯基，和-NR 3 +，其中R为H或C 1-4烷基。
  5. 权利要求4的用途，其中所述结构中的
    A选自H，直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
    B选自H，-NH 2，直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
    Q选自H，-OH，直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基，和-NR 3 +，其中R为H或C 1-4烷基；
    在A，B，Q中，所述烯基具有1-5个双键。
  6. 权利要求5的用途，其中在所述结构的A，B，Q中，所述烯基具有1-4个双键，且呈Z构型。
  7. 权利要求6的用途，其中：在A，B，Q中，所述烯基具有1-3个双键，且呈Z构型。
  8. 前述权利要求中任一项的用途，其中所述提取物选自下式或包含选自下式的化合物：
    Figure PCTCN2019080175-appb-100006
    其中
    A选自直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
    B选自直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
    Q选自H，-OH，直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基，和-NR 3 +，其中R为H或甲基；L 3为-C(O)O-。
  9. 前述权利要求中任一项的用途，其中所述提取物为或包含溶血卵磷脂、神经酰胺、甘油二酯、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、甘油三酯、单半乳糖甘油二酯、(神经)鞘氨醇、磷脂酰乙醇、单酰基甘油、脂肪酸、血小板活化因子、或二甲基磷脂酰乙醇胺。
  10. 前述任一项权利要求的用途，其中所述提取物选自表1所示的脂质或包含选自表1所示的任一种或多种脂质。
  11. 前述任一项权利要求的用途，其中所述提取物包含表1中第41号、第71号、第11号、第12号、第38号、第64号、第40号、第37号、第39号、第60 号、第62号、第33号、第35号、第42号、第43号、第44号、第45号、第46号、第47号、第48号、第49号、第50号、第51号、第52号、第53号、第54号、第55号、第56号、第57号、第58号、第59号、第61号、第65号、第66号、第67号、第68号、第69号、第70号所示的脂质中任一种，或其与表1中的任何一种或多种其它脂质的组合，或与任何一种或多种脂质及其他相关化学物质的组合。
  12. 包含选自表1所示的任一种或多种脂质的组合在制备用于核酸递送的试剂中的用途，其中优选地，所述组合包含表1中第41号、第71号、第11号、第12号、第38号、第64号、第40号、第37号、第39号、第60号、第62号、第33号、第35号、第42号、第43号、第44号、第45号、第46号、第47号、第48号、第49号、第50号、第51号、第52号、第53号、第54号、第55号、第56号、第57号、第58号、第59号、第61号、第65号、第66号、第67号、第68号、第69号、第70号所示的脂质中任一种，或其与表1中的任何一种或多种其它脂质的组合，或与任何一种或多种脂质及其他相关化学物质的组合，优选地，所述核酸是小核酸，优选是单链或双链的，优选地所述小核酸的长度是14-32bp、16-28bp或18-24bp；优选地所述试剂是口服试剂；优选地，所述核酸用于治疗疾病，例如心脏、脾、肾、胃、肺和/或肠疾病，例如癌症，例如胃癌或肺癌；
    优选地，其中核酸递送是对细胞或器官的核酸递送；
    优选地，所述器官选自心脏、脾、肾、胃、肺和肠。
  13. 中药在制备核酸递送的试剂中的用途，其中优选地，所述核酸是小核酸，优选是单链或双链的，优选地所述小核酸的长度是14-32bp、16-28bp或18-24bp；优选地所述试剂是口服试剂；优选地，所述核酸用于治疗疾病，例如心脏、脾、肾、胃、肺和/或肠疾病，例如癌症，例如胃癌或肺癌；
    优选地，其中核酸递送是对细胞或器官的核酸递送；
    优选地，所述器官选自心脏、脾、肾、胃、肺和肠。
  14. 权利要求13所述的用途，其中所述的中药选自红景天，蒲公英，穿心莲和金银花中药饮片。
  15. 权利要求13或14所述的用途，其中所述试剂含有从中药中提取的或人工合成的化合物，优选地，所述化合物通过Bligh&Dyer法提取脂溶性成分获得，或者通过中药的煎煮制备提取，更优选通过将所述中药饮片在水中 浸泡，然后依次进行强火煎煮和弱火煎煮，将煎煮后的中药药液浓缩，然后依次添加氯仿-甲醇、氯仿和水搅拌处理，取氯仿层获得。
  16. 权利要求15所述的用途，其中所述的化合物具有权利要求1至11中任一项中所示的结构，或者所述试剂包含表1中所示的任一种或多种脂质，优选表1中第41号、第71号、第11号、第12号、第38号、第64号、第40号、第37号、第39号、第60号、第62号、第33号、第35号、第42号、第43号、第44号、第45号、第46号、第47号、第48号、第49号、第50号、第51号、第52号、第53号、第54号、第55号、第56号、第57号、第58号、第59号、第61号、第65号、第66号、第67号、第68号、第69号、第70号所示的脂质中的任一种，或其与表1中的任何一种或多种其它脂质的组合，或与任何一种或多种脂质及其他相关化学物质的组合。
  17. 权利要求16所述的用途，其中所述的化合物选自溶血卵磷脂、神经酰胺、甘油二酯、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、甘油三酯、单半乳糖甘油二酯、(神经)鞘氨醇、磷脂酰乙醇、单酰基甘油、脂肪酸、血小板活化因子、或二甲基磷脂酰乙醇胺。
  18. 权利要求17所述的用途，其中所述化合物选自于表1。
  19. 权利要求18所述的用途，其中所述化合物选自表1中第41号、第71号、第11号、第12号、第38号、第64号、第40号、第37号、第39号、第60号、第62号、第33号、第35号、第42号、第43号、第44号、第45号、第46号、第47号、第48号、第49号、第50号、第51号、第52号、第53号、第54号、第55号、第56号、第57号、第58号、第59号、第61号、第65号、第66号、第67号、第68号、第69号、第70号所示的脂质。
  20. 权利要求13-18任一项所述的用途，其中所述的递送包括体外细胞递送，或体内消化道递送。
  21. 权利要求13-20任一项所述的用途，其包括制备脂质核酸混合物。
  22. 权利要求21所述的用途，其中所述的脂质核酸混合物通过水煮法制备，或通过逆向蒸发法，或者通过直接混合制备。
  23. 权利要求22所述的用途，其中所述水煮法的制备温度为约4℃至约100℃，约25℃至约100℃，优选约80℃至约100℃，例如4℃，37℃，60℃，80℃或100℃；所述逆向蒸发法的制备温度为约25℃至约70℃，优选约55℃。
  24. 一种药物组合物，其包含一种或多种权利要求1-11任一项中所述结构的脂质提取物以及核酸，优选地所述脂质选自表1中的任一种或多种，优选表1中第41号、第71号、第11号和第12号、第38号、第64号、第40号、第37号、第39号、第60号、第62号、第33号、第35号、第42号、第43号、第44号、第45号、第46号、第47号、第48号、第49号、第50号、第51号、第52号、第53号、第54号、第55号、第56号、第57号、第58号、第59号、第61号、第65号、第66号、第67号、第68号、第69号、第70号所示的脂质中的任一种，或其与表1中的任何一种或多种其它脂质的组合，或与任何一种或多种脂质及其他相关化学物质的组合，其中优选地，所述核酸是小核酸，优选是单链或双链的，优选地所述小核酸的长度是14-32bp、16-28bp或18-24bp；优选地，所述药物组合物是口服药物组合物；优选地，所述药物组合物用于治疗疾病，例如心脏、脾、肾、胃、肺和/或肠疾病，例如癌症，例如胃癌或肺癌。
  25. 根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述脂质和核酸至少部分地或全部以脂质核酸混合物的形式存在。
  26. 权利要求25所述的药物组合物，其中所述脂质核酸混合物是通过水煮法制备，或通过逆向蒸发法，或者通过直接混合制备。
  27. 权利要求26所述的药物组合物，其中所述水煮法的制备温度为约4℃至约100℃，25℃至约100℃，优选约80℃至100℃，例如4℃，37℃，60℃，80℃或100℃；所述逆向蒸发法的制备温度为约25℃至约70℃，优选约55℃。
  28. 一种套装组合，其包含一种或多种根据权利要求1-11任一项所述结构的脂质，优选地所述脂质选自表1中的任一种或多种，优选表1中第41号、第71号、第11号和第12号、第38号、第64号、第40号、第37号、第39号、第60号、第62号、第33号、第35号、第42号、第43号、第44号、第45号、第46号、第47号、第48号、第49号、第50号、第51号、第52号、第53号、第54号、第55号、第56号、第57号、第58号、第59号、第61号、第65号、第66号、第67号、第68号、第69号、第70号所示的脂质或其与表1中的任何一种或多种其它脂质的组合或其与任何一种或多种脂质及其他相关化学物质的组合以及核酸，其中所述脂质和核酸各自独立地提供于第一容器和第二容器中，所述第一容器和第二容器相同或不同，其中优选地，所述核酸是小核酸，优选是单链或双链的，优选地所述小核酸的长度是14-32bp、16-28bp或18-24bp； 优选地，所述套装组合是口服套装组合；优选地，所述套装组合用于治疗疾病，例如心脏、脾、肾、胃、肺和/或肠疾病，例如癌症，例如胃癌或肺癌。
  29. 根据权利要求28所述的套装组合，其中在临使用前将所述脂质和所述核酸至少部分地或全部地配制成脂质核酸复合物。
  30. 权利要求29所述的套装组合，其中所述脂质核酸复合物的配制方法是通过水煮法制备，或通过逆向蒸发法，或者通过直接混合制备。
  31. 权利要求30所述的套装组合，其中所述水煮法的制备温度为约4℃至约100℃，25℃至约100℃，优选约80℃至约100℃，例如4℃，37℃，60℃，80℃或100℃，所述逆向蒸发法的制备温度为约25℃至约70℃，优选约55℃。
  32. 一种将核酸递送至靶细胞中的方法，其中以权利要求24-27任一项所述的药物组合物或者以权利要求28-31任一项所述的套装组合的形式提供所述核酸，其中优选地，所述核酸是小核酸，优选是单链或双链的，优选地所述小核酸的长度是14-32bp、16-28bp或18-24bp；优选地，所述核酸用于治疗疾病，例如心脏、脾、肾、胃、肺和/或肠疾病，例如癌症，例如胃癌或肺癌。
  33. 一种将核酸体内递送至有此需要的对象中的方法，其中以权利要求24-27任一项所述的药物组合物或者以权利要求28-31任一项所述的套装组合的形式提供所述核酸，其中优选地，所述核酸是小核酸，优选是单链或双链的，优选地所述小核酸的长度是14-32bp、16-28bp或18-24bp；优选地，所述核酸用于治疗疾病，例如心脏、脾、肾、胃、肺和/或肠疾病，例如癌症，例如胃癌或肺癌。
  34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述对象是人或动物，如哺乳动物。
  35. 根据权利要求33-34中任一项所述的方法，其中将所述核酸体内递送至所述对象的血液循环中或者靶组织/细胞中，所述靶组织选自心脏、脾、肾、胃、肺和肠。
  36. 权利要求35所述的方法，其包括直接将权利要求24-27任一项所述的药物组合物或者以权利要求28-31任一项所述的套装组合通过消化道递送至有此需要的对象中。
  37. 权利要求24-27任一项的药物组合物，或权利要求28-31任一项所述 的套装组合，其中所述核酸和脂质配制成经表面施用和/或注射施用。
  38. 根据权利要求37所述的药物组合物或套装组合，其中所述核酸和脂质配制成经消化道、经呼吸道施用。
  39. 根据权利要求37或38所述的药物组合物或套装组合，其中所述核酸和脂质配制成经口服、吸入施用。
  40. 根据权利要求37-39中任一项所述的药物组合物或套装组合，其中所述核酸是小RNA。
  41. 根据权利要求37-40中任一项所述的药物组合物或套装组合，其中所述核酸具有茎环结构。
  42. 根据权利要求37-41中任一项所述的药物组合物、或套装组合，其中所述小RNA长度为14-32bp、18-24bp，例如长度为14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32bp。
  43. 提取自中药或人工合成的并能用于核酸递送的化合物，其具有如下结构：
    Figure PCTCN2019080175-appb-100007
    L 1、L 2、L 3不存在，或L 1、L 2、L 3各自独立选自-C(O)O-CH 2-，-CH(OH)-，-C(O)-NH-CH 2-，-CH 2-O-C(O)-，-CH 2-NH-C(O)-，-C(O)O-，-C(O)NH-，-O-C(O)-，-NH-C(O)-，-CH 2-，
    Figure PCTCN2019080175-appb-100008
    Figure PCTCN2019080175-appb-100009
    条件是L 1、L 2、L 3中至多两个不存在；
    对于二价基团L 1、L 2而言，左侧的破折号“-”分别连接至基团A和B，而 右侧的破折号“-”分别连接至中心碳原子；
    对于二价基团L 3而言，左侧的破折号“-”连接至中心碳原子，而右侧的破折号“-”连接至Q；
    A，B，Q各自独立选自H，-OH，C 1-20烷基，C 1-20烯基，C 1-20杂烷基，C 1-20杂烯基，-NH 2，和-NR 3 +，R为H或C 1-6烷基；和
    n为整数0，1，2，3或4，优选地所述化合物是口服化合物；优选地，所述核酸用于治疗疾病，例如心脏、脾、肾、胃、肺和/或肠疾病，例如癌症，例如胃癌或肺癌；
    优选地，核酸递送是对细胞或器官的核酸递送，优选地所述器官选自心脏、脾、肾、胃、肺和肠。
  44. 权利要求43的化合物，其中
    L 1不存在，或L 1选自-C(O)O-CH 2-和-CH(OH)-，
    L 2不存在，或L 2选自-C(O)O-和-C(O)NH-，
    L 3不存在，或L 3选自-C(O)O-，-CH 2-O-C(O)-，-CH 2-和
    Figure PCTCN2019080175-appb-100010
    A选自H，C 1-20烷基和C 1-20烯基；
    B选自H，-NH 2，C 1-20烷基和C 1-20烯基；
    Q选自H，-OH，C 1-20烷基和C 1-20烯基，和-NR 3 +，其中R为H或C 1-6烷基，其中优选所述中药选自红景天，蒲公英，穿心莲和金银花中药饮片，优选所述化合物通过Bligh&Dyer法提取脂溶性成分获得，更优选通过将所述中药饮片在水中浸泡，然后依次进行强火煎煮和弱火煎煮，将煎煮后的中药药液浓缩，然后依次添加氯仿-甲醇、氯仿和水搅拌处理，取氯仿层获得，其中优选地，所述核酸是小核酸，优选是单链或双链的，优选地所述小核酸的长度是14-32bp、16-28bp或18-24bp。
  45. 权利要求43或44的化合物，其具有下式
    Figure PCTCN2019080175-appb-100011
  46. 权利要求43-45中任一项的化合物，其中：
    A选自H，C 10-20烷基和C 10-20烯基；
    B选自H，-NH 2，C 10-20烷基和C 10-20烯基；
    Q选自H，-OH，C 10-20烷基和C 10-20烯基，和-NR 3 +，其中R为H或C 1-4烷基。
  47. 权利要求43-46中任一项的化合物，其中：
    A选自H，直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
    B选自H，-NH 2，直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
    Q选自H，-OH，直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基，和-NR 3 +，其中R为H或C 1-4烷基；
    在A，B，Q中，所述烯基具有1-5个双键。
  48. 权利要求43-47中任一项的化合物，其中：在A，B，Q中，所述烯基具有1-4个双键，且呈Z构型。
  49. 权利要求43-48中任一项的化合物，其中：在A，B，Q中，所述烯基具有1-3个双键，且呈Z构型。
  50. 权利要求43-49中任一项的化合物，其选自下式：
    Figure PCTCN2019080175-appb-100012
    其中
    A选自直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
    B选自直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
    Q选自H，-OH，直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基，和-NR 3 +，其中R为H或甲基；
    L 3为-C(O)O-。
  51. 权利要求43-50中任一项的化合物，其选自表1中所示的脂质。
  52. 权利要求43-51中任一项所述的化合物，其选自表1中第41号、第71号、第11号、第12号、第38号、第64号、第40号、第37号、第39号、第60号、或第62号、第33号、第35号、第42号、第43号、第44号、第45号、第46号、第47号、第48号、第49号、第50号、第51号、第52号、第53号、第54号、第55号、第56号、第57号、第58号、第59号、第61号、第65号、第66号、第67号、第68号、第69号、或第70号所示的脂质。
  53. 一种有助于核酸递送的方法，其包括将核酸和如权利要求1-11中任一项中所述的中药提取物或任何自然的或者合成的化合物，优选脂质进行加热或升温处理，加热或升温的温度范围优选为约4℃至约100℃，约25℃至约100℃，更优选约50℃至约100℃，更优选约95℃至约100℃，特别优选约80℃至约100℃，例如4℃，37℃，60℃，80℃或100℃，其中优选地，所述核酸是小核酸，优选是单链或双链的，优选地所述小核酸的长度是14-32bp、16-28bp或18-24bp；优选地，所述核酸递送通过口服进行；优选地，所述核酸用于治疗疾病，例如心脏、脾、肾、胃、肺和/或肠疾病，例如癌症，例如胃癌或肺癌；优选地，核酸递送是对细胞或器官的核酸递送，优选地所述器官选自心脏、脾、肾、胃、肺和肠。
  54. 权利要求53所述的方法，其中所述中药提取物包含如权利要求1-9中所示的结构的化合物。
  55. 权利要求53所述的方法，其中所述中药提取物包含表1中所示的任一种或多种脂质。
  56. 权利要求53所述的方法，其中所述中药提取物包含表1中第41号、第71号、第11号、第12号、第38号、第64号、第40号、第37号、第39号、第60号、第62号、第33号、第35号、第42号、第43号、第44号、第45号、第46号、第47号、第48号、第49号、第50号、第51号、第52号、第53号、第54号、第55号、第56号、第57号、第58号、第59号、第61号、第65号、第66号、第67号、第68号、第69号、第70号所示的脂质的任一种，或其与表1中的任何一种或多种其它脂质的组合，或与任何一种或多种脂质及其他相关化学物质的组合。
  57. 权利要求11、12或16的用途，权利要求24的药物组合物，或权利要求28的套装组合，其中所述组合为下列任一项的组合：第8号:第41号＝6:1的脂 质组合；第38号:第41号＝6:1的脂质组合；第39号:第41号＝6:1的脂质组合；第40号:第41号＝6:1的脂质组合；第38:12:41:29号＝1:2:1:1的脂质组合；第40:12:41号＝2:4:3的脂质组合；第12:41号＝1:6的脂质组合；第12:41号＝1:1的脂质组合；第12:41号＝6:1的脂质组合；第40:12:41号＝2:2:2的脂质组合；第4:12:41号＝1:1:1的脂质组合；第1:2:3:19:35号＝1:1:1:1:1的DG组合；第6:9:10:13:15:16:18:20:21:22:23:24:25:26:27:28:32:33号＝1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1的TG组合；第36:37号＝1:1的LPC组合；第11:12号＝1:1的PC组合；第8:38号＝1:1的PE组合；第4:14号＝1:1的Cer组合；第17:30:31号＝1:1:1的So组合；无第5、7号的第1-36号的等体积组合；无第5、7、34号的第1-36号的等体积组合；无第5、7、1、2、3、19、35号的第1-36号的等体积组合；无第5、7、6、9、10、13、15、16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、32、33号的第1-36号的等体积组合；无第5、7、36、37号的第1-36号的等体积组合；无第5、7、11、12号的第1-36号的等体积组合；无第5、7、8号的第1-36号的等体积组合；无第5、7、4、14号的第1-36号的等体积组合；无第5、7、29号的第1-36号的等体积组合；脂质第1号:第34号＝2:1；脂质第1号:所述DG组合＝2:1；脂质第1号:所述TG组合＝2:1；脂质第1号:所述LPC组合＝2:1；脂质第1号:第8号＝2:1；脂质第1号:第12号＝2:1；脂质第1号:所述Cer组合＝2:1；脂质第1号:So组合＝2:1；脂质第1号:第29号＝2:1；脂质第1号:第8号:第12号＝1:1:1；脂质第8号:第34号＝2:1；脂质第8号:DG组合＝2:1；脂质第8号:TG组合＝2:1；脂质第8号:LPC组合＝2:1；脂质第8号:第37号＝4:1；脂质第8号:第12号＝2:1；脂质第8号:Cer组合＝2:1；脂质第8号:So组合＝2:1；脂质第8号:第31号＝6:1；脂质第8号:第29号＝2:1；第12号:第34号＝2:1；第12号:DG组合＝2:1；第12号:TG组合＝2:1；第12号:LPC组合＝2:1；第12号:脂质第8号＝2:1；第12号:Cer组合＝2:1；第12号:So组合＝2:1；第12号:第29号＝2:1；第12号:脂质第8号:第1&2号＝2:1:1；第12号:脂质第8号:第15号＝2:1:1；第12号:脂质第8号:第36&37号＝2:1:1；第12号:脂质第8号:第11号＝2:1:1；第12号:脂质第8号:第12号＝2:1:1；第12号:脂质第8号:第4号＝2:1:1；第12号:脂质第8号:第31号＝2:1:1；第12号:脂质第8号:第29号＝2:1:1；第12号:脂质第8号:第34号＝3:2:1；第12号:脂质第8号:第34号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:脂质第2号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:脂质第2号＝16:8:3；第12号:脂质第8号:第32号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:第37号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:第11号＝4:2:3； 第12号:脂质第8号:第38号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:第4号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:第31号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:第29号＝4:2:3；第12号:脂质第8号:第29号:第31号＝2:1:1:1；第12号:脂质第8号:第29号:第31号:第34号＝4:2:2:2:5；第12号:脂质第8号:第29号:第31号:脂质第2号＝4:2:2:2:5；第12号:脂质第8号:第29号:第31号:第32号＝4:2:2:2:5；第12号:脂质第8号:第29号:第31号:第11号＝4:2:2:2:5；第12号:脂质第8号:第29号:第31号:第37号＝4:2:2:2:5；第12号:脂质第8号:第29号:第31号:第38号＝4:2:2:2:5；第12号:脂质第8号:第29号:第31号:第4号＝4:2:2:2:5；第12号:脂质第8号:第29号:第31号:第4号:脂质第1号:第16号＝2:1:1:3:2:2:3；脂质第1号:脂质第8号:第12号:脂质第1&2号＝2:2:2:3；脂质第1号:脂质第8号:第12号:第15号＝2:2:2:3；脂质第1号:脂质第8号:第12号:第36&37号＝2:2:2:3；脂质第1号:脂质第8号:第12号:第12号＝2:2:2:3；脂质第1号:脂质第8号:第12号:第4号＝2:2:2:3；脂质第1号:脂质第8号:第12号:第31号＝2:2:2:3；脂质第1号:脂质第8号:第12号:第29号＝2:2:2:3；脂质第8号:第34号:脂质第1&2号＝2:1:1；脂质第8号:第34号:第15号＝2:1:1；脂质第8号:第34号:第36&37号＝2:1:1；脂质第8号:第34号:第12号＝2:1:1；脂质第8号:第34号:第4号＝2:1:1；脂质第8号:第34号:第31号＝2:1:1；脂质第8号:第34号:第29号＝2:1:1；脂质第8号:第31号:第34号＝12:3:5；脂质第8号:第31号:脂质第2号＝12:3:5；脂质第8号:第31号:第37号＝12:3:5；脂质第8号:第31号:第11号＝12:3:5；脂质第8号:第31号:第12号＝12:3:5；脂质第8号:第31号:第4号＝12:3:5；脂质第8号:第31号:第29号＝12:3:5；脂质第8号:第31号:第32号＝12:3:5；脂质第8号:第4号:第34号＝12:3:5；脂质第8号:第4号:脂质第2号＝12:3:5；脂质第8号:第4号:第37号＝12:3:5；脂质第8号:第4号:第12号＝12:3:5；脂质第8号:第4号:第31号＝12:3:5；脂质第8号:第4号:第29号＝12:3:5；脂质第8号:第4号:第32号＝12:3:5；第38号:第34号＝2:1；第38号:脂质第1号＝2:1；第38号:脂质第2号＝2:1；第38号:第1&2号＝2:1；第38号:第15号＝2:1；第38号:第32号＝2:1；第38号:第37号＝2:1；第38号:第37号＝4:1；第38号:第11号＝2:1；第38号:第12号＝2:1；第38号:第11&12号＝2:1；第38号:第12号＝4:1；第38号:脂质第8号＝2:1；第38号:第4号＝2:1；第38号:So(30)＝2:1；第38号:第31号＝2:1；第38号:第29号＝2:1；脂质第1号:第38号:第12号:第34号＝2:2:2:3；脂质第1号:第38号:第12号:第15号＝2:2:2:3；脂质第1号:第38号:第12号:第37号＝2:2:2:3；脂质第1号:第38号:第12号:脂质第8号＝2:2:2:3；脂质第1号:第38号:第12号:第4号＝2:2:2:3；脂质第1号:第38号:第12 号:第31号＝2:2:2:3；脂质第1号:第38号:第12号:第29号＝2:2:2:3；第38号:第34号:脂质第1号＝2:1:3；第38号:第34号:第15号＝2:1:3；第38号:第34号:第37号＝2:1:3；第38号:第34号:第12号＝2:1:3；第38号:第34号:脂质第8号＝2:1:3；第38号:第34号:第4号＝2:1:3；第38号:第34号:第31号＝2:1:3；第38号:第34号:第29号＝2:1:3；第38号:第12号:脂质第1号＝2:1:3；第38号:第12号:脂质第2号＝4:1:3；第38号:第12号:第15号＝2:1:3；第38号:第12号:第37号＝2:1:3；第38号:第12号:脂质第8号＝2:1:3；第38号:第12号:第4号＝2:1:3；第38号:第12号:第31号＝2:1:3；第38号:第12号:第29号＝2:1:3；第38号:第12号:脂质第1号:第15号:第34号＝22:22:22:33:36；第38号:第12号:脂质第1号:第15号:第37号＝22:22:22:33:36；第38号:第12号:脂质第1号:第15号:第4号＝22:22:22:33:36；第38号:第12号:脂质第1号:第15号:第31号＝22:22:22:33:36；第38号:第12号:脂质第1号:第15号:第29号＝22:22:22:33:36；第38号:第34号:第37号:脂质第1号＝44:22:33:36；第38号:第34号:第37号:第15号＝44:22:33:36；第38号:第34号:第37号:第12号＝44:22:33:36；第38号:第34号:第37号:第4号＝44:22:33:36；第38号:第34号:第37号:第31号＝44:22:33:36；第38号:第12号:第4号:第34号＝44:22:33:36；第38号:第12号:第4号:脂质第1号＝44:22:33:36；第38号:第12号:第4号:第15号＝44:22:33:36；第38号:第12号:第4号:第37号＝44:22:33:36；第38号:第12号:第4号:第37号＝8:2:5:3；第38号:第12号:第4号:第31号＝44:22:33:36；第38号:第12号:第4号:第29号＝44:22:33:36；第38号:第12号:第4号:第29号:第34号＝88:44:66:72:135；第38号:第12号:第4号:第29号:脂质第1号＝88:44:66:72:135；第38号:第12号:第4号:第29号:第15号＝88:44:66:72:135；第38号:第12号:第4号:第29号:第37号＝88:44:66:72:135；第38号:第12号:第4号:第29号:第31号＝88:44:66:72:135；第38号:第12号:第4号:脂质第2号＝20:10:15:9；第38号:第12号:第4号:第6号＝20:10:15:9；第38号:第12号:第4号:第17号＝20:10:15:9；第38号:第12号:第4号:第29号＝20:10:15:9；第38号:第12号:第4号:第34号＝20:10:15:9；第38号:第12号:第4号:第37号＝20:10:15:9；第38号:第12号:第31号:第34号＝2:1:3:3；第38号:第12号:第31号:脂质第1号＝2:1:3:3；第38号:第12号:第31号:第15号＝2:1:3:3；第38号:第12号:第31号:第37号＝2:1:3:3；第38号:第12号:第31号:第4号＝2:1:3:3；第38号:第12号:第31号:第29号＝2:1:3:3；第38号:第34号:第37号:第31号:脂质第1号＝88:44:66:72:135；第38号:第34号:第37号:第31号:第15号＝88:44:66:72:135；第38号:第34号:第37号:第31号:第12号 ＝88:44:66:72:135；第38号:第34号:第37号:第31号:第4号＝88:44:66:72:135；第38号:第34号:第37号:第31号:第29号＝88:44:66:72:135；第38号:第37号:第34号＝4:2:3；第38号:第37号:脂质第1号＝4:2:3；第38号:第37号:脂质第2号＝4:2:3；第38号:第37号:第1&2号＝4:2:3；第38号:第37号:脂质第2号＝32:8:5；第38号:第37号:第32号＝32:8:5；第38号:第37号:第15号＝4:2:3；第38号:第37号:第32号＝4:2:3；第38号:第37号:脂质第8号＝4:2:3；第38号:第37号:第11号＝4:2:3；第38号:第37号:第12号＝4:2:3；第38号:第37号:第11&12号＝4:2:3；第38号:第37号:第12号＝4:1:1；第38号:第37号:第4号＝4:2:3；第38号:第37号:第30号＝4:2:3；第38号:第37号:第31号＝4:2:3；第38号:第37号:第29号＝4:2:3；脂质第8号:第37号:第32号＝4:1:2；脂质第8号:第37号:脂质第2号＝4:1:2；第38号:第37号:第15号:第34号＝64:16:10:45；第38号:第37号:第15号:脂质第1号＝64:16:10:45；第38号:第37号:第15号:第12号＝64:16:10:45；第38号:第37号:第15号:第4号＝64:16:10:45；第38号:第37号:第15号:第31号＝64:16:10:45；第38号:第37号:第15号:第29号＝64:16:10:45；第38号:脂质第2号:第37号＝4:2:3；第38号:脂质第2号:第31号＝4:2:3；第38号:脂质第2号:第29号＝4:2:3；第38号:脂质第2号:第34号＝4:2:3；第38号:脂质第2号:第32号＝4:2:3；第38号:脂质第2号:第12号＝4:2:3；第38号:脂质第2号:第12号＝4:5:1；第38号:脂质第2号:第4号＝4:2:3，脂质第1&2号、第11&12号或第36&37号分别表示任何比例的脂质第1和2号、第11和12号或第36和37号。
  58. 具有下式结构的化合物在制备用于核酸递送的试剂中的用途：
    Figure PCTCN2019080175-appb-100013
    其中，
    其中L 1、L 2、L 3不存在，或L 1、L 2、L 3各自独立选自-C(O)O-CH 2-，-CH(OH)-，-CH 2-O-C(O)-，-C(O)O-，-C(O)NH-；
    条件是L 1、L 2、L 3中至多两个不存在；
    对于二价基团L 1、L 2而言，左侧的破折号“-”分别连接至基团A和B，而右侧的破折号“-”分别连接至中心碳原子；
    对于二价基团L 3而言，左侧的破折号“-”连接至中心碳原子，而右侧的破 折号“-”连接至Q；
    A，B，Q各自独立选自H，-OH，C 1-20烷基，C 1-20烯基，-NH 2，和-NR 3 +，R为H或C 1-6烷基；优选地所述试剂是口服试剂；优选地，所述核酸用于治疗疾病，例如心脏、脾、肾、胃、肺和/或肠疾病，例如癌症，例如胃癌或肺癌；优选地，核酸递送是对细胞或器官的核酸递送，优选地所述器官选自心脏、脾、肾、胃、肺和肠。
  59. 权利要求58的用途，其中所述化合物具有以下结构：
    Figure PCTCN2019080175-appb-100014
    其中，
    A选自直链C 10-20烷基和直链C 10-20烯基；
    B选自直链C 10-20烷基和直链C 10-20烯基；
    Q为‐OH；
    优选地，
    A选自直链C 15-20烷基和直链C 15-20烯基；
    B选自直链C 15-20烷基和直链C 15-20烯基；
    Q为‐OH；
    优选地，
    A选自直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
    B选自直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
    Q为‐OH。
  60. 权利要求58的用途，其中所述化合物具有以下结构：
    Figure PCTCN2019080175-appb-100015
    其中，
    A选自直链C 10-20烷基和直链C 10-22烯基；
    B选自直链C 10-20烷基和直链C 10-22烯基；
    Q选自直链C 10-20烷基和直链C 10-22烯基；
    优选地，
    A选自直链C 15-18烷基和直链C 15-22烯基；
    B选自直链C 15-18烷基和直链C 15-22烯基；
    Q选自直链C 15-18烷基和直链C 15-22烯基；
    优选地，
    A选自直链C 15-18烷基和直链C 15-20烯基；
    B选自直链C 15-18烷基和直链C 15-20烯基；
    Q选自直链C 15-18烷基和直链C 15-20烯基。
  61. 权利要求58的用途，其中所述化合物具有以下结构：
    Figure PCTCN2019080175-appb-100016
    其中，
    A选自直链C 10-20烷基和直链C 10-20烯基；
    B选自直链C 10-20烷基和直链C 10-20烯基；
    Q为-OH；
    优选地，
    A选自直链C 15-20烷基和直链C 15-18烯基；
    B选自直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
    Q为-OH；
    优选地，
    A为直链C 15-20烷基；
    B为直链C 15-18烷基；
    Q为-OH。
  62. 权利要求58的用途，其中所述化合物具有以下结构：
    Figure PCTCN2019080175-appb-100017
    其中，
    A选自直链C 10-20烷基和直链C 10-20烯基；
    Q为-OH；
    优选地，
    A选自直链C 10-20烷基和直链C 15-18烯基；
    Q为-OH；
    优选地，
    A为直链C 15-20烷基；
    Q为-OH。
  63. 权利要求1-23中任一项的用途，权利要求24-27中任一项的药物组合物，权利要求28-31中任一项的套装组合，权利要求32-36和53-56中任一项的方法，或权利要求43的方法，其中所述脂质或化合物是具有以下结构的化合物：
    Figure PCTCN2019080175-appb-100018
    其中，
    A选自直链C 10-20烷基和直链C 10-20烯基；
    B选自直链C 10-20烷基和直链C 10-20烯基；
    Q为‐OH；
    优选地，
    A选自直链C 15-20烷基和直链C 15-20烯基；
    B选自直链C 15-20烷基和直链C 15-20烯基；
    Q为‐OH；
    优选地，
    A选自直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
    B选自直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
    Q为‐OH。
  64. 权利要求63的用途，药物组合物，套装组合，或方法，其中所述化合物具有以下结构：
    Figure PCTCN2019080175-appb-100019
    其中，
    A选自直链C 10-20烷基和直链C 10-22烯基；
    B选自直链C 10-20烷基和直链C 10-22烯基；
    Q选自直链C 10-20烷基和直链C 10-22烯基；
    优选地，
    A选自直链C 15-18烷基和直链C 15-22烯基；
    B选自直链C 15-18烷基和直链C 15-22烯基；
    Q选自直链C 15-18烷基和直链C 15-22烯基；
    优选地，
    A选自直链C 15-18烷基和直链C 15-20烯基；
    B选自直链C 15-18烷基和直链C 15-20烯基；
    Q选自直链C 15-18烷基和直链C 15-20烯基。
  65. 权利要求63的用途，药物组合物，套装组合，或方法，其中所述化合物具有以下结构：
    Figure PCTCN2019080175-appb-100020
    其中，
    A选自直链C 10-20烷基和直链C 10-20烯基；
    B选自直链C 10-20烷基和直链C 10-20烯基；
    Q为-OH；
    优选地，
    A选自直链C 15-20烷基和直链C 15-18烯基；
    B选自直链C 15-18烷基和直链C 15-18烯基；
    Q为-OH；
    优选地，
    A为直链C 15-20烷基；
    B为直链C 15-18烷基；
    Q为-OH。
  66. 权利要求63的用途，药物组合物，套装组合，或方法，其中所述化合物具有以下结构：
    Figure PCTCN2019080175-appb-100021
    其中，
    A选自直链C 10-20烷基和直链C 10-20烯基；
    Q为-OH；
    优选地，
    A选自直链C 10-20烷基和直链C 15-18烯基；
    Q为-OH；
    优选地，
    A为直链C 15-20烷基；
    Q为-OH。
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