JP2023078392A - 核酸送達試薬の調製における化合物または伝統的漢方薬抽出物の応用およびその関連生成物 - Google Patents

核酸送達試薬の調製における化合物または伝統的漢方薬抽出物の応用およびその関連生成物 Download PDF

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ドゥ，ジャンチャオ
Jianchao Du
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リ，シャオユン
Xiaoyun Li
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Abstract

【課題】小分子ＲＮＡを含む核酸分子を標的器官および標的細胞へと効率的にｉｎ ｖｉｖｏで送達するための試薬を製造するための、化合物の使用を提供する。【解決手段】核酸送達試薬を製造するための、天然に（伝統的漢方薬抽出物を含む）または合成に由来する化合物の使用であって、例えば、下記式で示される化合物を使用する。JPEG2023078392000052.jpg25125【選択図】なし

Description

本出願は、伝統的漢方薬から抽出されたかまたは合成された、核酸送達を促進すること
が可能な種々の化合物に関し、また、ｓＲＮＡなどの核酸の標的細胞内への吸収および進
入を促進し、それを必要とする対象の標的部位内への進入をｉｎ ｖｉｖｏで促進するた
めの、抽出された化合物またはそれらの種々の化合物の使用に関する。
この数十年間で、ＲＮＡ分子を含む核酸分子を治療薬として使用するという概念は、臨
床的に現実性のある概念となっている。実際、核酸分子は、治療薬にふさわしい多数の特
性を有する。核酸分子は、タンパク質、低分子、または他の核酸との結合を可能にする複
雑な立体構造へとフォールディングすることができ、一部は、触媒中心をも形成すること
ができる。ＲＮＡｉのエフェクター分子としての低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、治
療薬としてますます広範な有望性を示している。現在、様々なｓｉＲＮＡ薬が臨床治験に
入っており、良好な開発有望性を示している。一般に、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および
他の非コード小分子ＲＮＡは、同義的に小分子核酸または小分子ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）と呼
ばれる。しかしながら、核酸分子は、容易に分解され、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が比較
的短いため、一般に、治療薬の選択肢としては不良であるとみなされている。
したがって、小分子ＲＮＡを含む核酸分子を、それらの生物学的活性および治療または
予防効果を達成するために、標的器官および標的細胞へと効率的にｉｎ ｖｉｖｏで送達
する方法は、当業者により考慮されるべき課題である。
本発明者は、広範な試験を実施した結果、意外にも、一部の伝統的漢方薬（ロディオラ
・クレヌラータ〔Rhodiola crenulata〕、モウコタンポポ〔Taraxacum mongolicum〕、ア
ンドログラフィス・パニクラータ〔Andrographis paniculata〕、およびスイカズラ〔Lon
icera japonica〕を含む）の一部の脂質成分および伝統的漢方薬に由来する脂質が、小分
子ＲＮＡなどの核酸の、それを必要とする対象の細胞および／または標的部分内への吸収
／進入を促進することができることを発見した。本発明では、脂質成分は、合成である。
具体的には、１つの態様では、本出願は、伝統的漢方薬から抽出された以下の構造を有
する化合物、および核酸送達用の試薬を製造するための化合物の使用に関する。
Figure 2023078392000001
 式中、Ｌ１、Ｌ２、もしくはＬ３は存在しないか、またはＬ１、Ｌ２、およびＬ３は、
各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２
－、－ＣＨ２－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（
Ｏ）ＮＨ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ２－、
Figure 2023078392000002
 からなる群から選択され、
但し、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の最大で２つは存在せず、
２価基Ｌ１、Ｌ２に関して、左側のダッシュ「－」は、それぞれ基ＡおよびＢに連結さ
れ、右側のダッシュ「－」は、中央の炭素原子に連結され、
２価基Ｌ３に関して、左側のダッシュ「－」は、中央の炭素原子に連結され、右側のダ
ッシュ「－」は、基Ｑに連結され、
Ａ、Ｂ、およびＱは、各々独立して、Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１～２０アルキル、Ｃ１～２０ア
ルケニル、Ｃ１～２０ヘテロアルキル、Ｃ１～２０ヘテロアルケニル、－ＮＨ２、および
－ＮＲ３ ＋からなる群から選択され、Ｒは、ＨまたはＣ１～６アルキルであり、
ｎは、整数０、１、２、３、または４である。
前記使用における一実施形態では、化合物の構造において、
Ｌ１は、存在しないか、またはＬ１は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、および－ＣＨ（ＯＨ
）－から選択され、
Ｌ２は、存在しないか、またはＬ２は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、および－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－から
選択され、
Ｌ３は、存在しないか、またはＬ３は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－
ＣＨ２－、および
Figure 2023078392000003
 から選択され、
Ａは、Ｈ、Ｃ１～２０アルキル、およびＣ１～２０アルケニルからなる群から選択され
、
Ｂは、Ｈ、－ＮＨ２、Ｃ１～２０アルキル、およびＣ１～２０アルケニルからなる群か
ら選択され、
Ｑは、Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１～２０アルキル、およびＣ１～２０アルケニル、ならびに－Ｎ
Ｒ３ ＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１～６アルキルである。
一実施形態では、化合物は、下記式を有する。
Figure 2023078392000004
一実施形態では、化合物の構造において、
Ａは、Ｈ、Ｃ１０～２０アルキルおよびＣ１０～２０アルケニルからなる群から選択さ
れ、
Ｂは、Ｈ、－ＮＨ２、Ｃ１０～２０アルキル、およびＣ１０～２０アルケニルからなる
群から選択され、
Ｑは、Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１０～２０アルキル、およびＣ１０～２０アルケニル、ならびに
－ＮＲ３ ＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１～４アルキルである。
一実施形態では、化合物の構造において、
Ａは、Ｈ、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からな
る群から選択され、
Ｂは、Ｈ、－ＮＨ２、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５～１８アルケニ
ル基からなる群から選択され、
Ｑは、Ｈ、－ＯＨ、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル
基、ならびに－ＮＲ３ ＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１～４アルキル基であ
り、
Ａ、Ｂ、Ｑのアルケニル基は、１～５個の二重結合を有する。
一実施形態では、構造のＡ、Ｂ、Ｑにおいて、アルケニル基は、１～３個の二重結合を
有し、Ｚ配置にある。
一実施形態では、前記化合物は、下記式：
Figure 2023078392000005
 から選択され、
式中、
Ａは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基から選択され
、
Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基から選択され
、
Ｑは、Ｈ、－ＯＨ、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル
基、ならびに－ＮＲ３ ＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはメチルであり、
Ｌ３は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。
一実施形態では、化合物は、リゾレシチン、セラミド、ジグリセリド、ホスファチジル
エタノールアミン、ホスファチジルコリン、トリグリセリド、モノガラクトシルジグリセ
リド、スフィンゴシン、ホスファチジルエタノール、モノアシルグリセロール、脂肪酸、
血小板活性化因子、またはジメチルホスファチジルエタノールアミンである。
一実施形態では、化合物は、表１に示されている脂質である。
一実施形態では、化合物は、番号１１、番号１２、番号４１、番号７１、番号３８、番
号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、または番号６２として表１に示され
ている脂質である。
第２の態様では、本出願は、上記化合物のいずれか１つまたは複数を含む組合せの使用
に関する。好ましくは、脂質のいずれか１つまたは複数は、核酸送達試薬を製造するため
に、表１から選択される。好ましくは、組合せは、番号１１、番号１２、番号４１、番号
７１、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、もしくは番号６
２として表１に示されている脂質のいずれか１つ、または表１の他の脂質のいずれか１つ
もしくは複数とのその組合せを含む。
第３の態様では、本出願は、核酸送達試薬を製造するための、伝統的漢方薬の使用に関
する。
一実施形態では、伝統的漢方薬は、ロディオラ・クレヌラータ、モウコタンポポ、アン
ドログラフィス・パニクラータ、およびスイカズラ漢方薬煎出片から選択される。
一実施形態では、試薬は、伝統的漢方薬から抽出された化合物を含む。好ましくは、試
薬は、上記化合物のいずれか１つまたは複数、好ましくは、表１から選択されるいずれか
１つまたは複数の脂質を含む。好ましくは、試薬は、番号１１、番号１２、番号４１、番
号７１、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、もしくは番号
６２として表１に示されている脂質のいずれか１つ、または表１に示されている他の脂質
のいずれか１つまたは複数とのその組合せを含む。
一実施形態では、化合物は、伝統的漢方薬を煎出することにより抽出される。別の実施
形態では、化合物は、伝統的漢方薬片を水に浸漬し、その後、激しい加熱およびゆっくり
とした加熱を順に実施することにより抽出し、その後、加熱した漢方薬スープを濃縮し、
その後、クロロホルム－メタノール、クロロホルムおよび水を順に添加して撹拌し、クロ
ロホルム層を得る。
一実施形態では、化合物は、上述の実施形態のいずれか１つに示されている構造を有す
る。
一実施形態では、化合物は、リゾレシチン、セラミド、ジグリセリド、ホスファチジル
エタノールアミン、ホスファチジルコリン、トリグリセリド、モノガラクトシルジグリセ
リド、（神経性）スフィンゴシン、ホスファチジルエタノール、モノアシルグリセロール
、脂肪酸、血小板活性化因子、またはジメチルホスファチジルエタノールアミンである。
一実施形態では、化合物は、表１から選択される。
一実施形態では、化合物は、番号１１、番号１２、番号４１、番号７１、番号３８、番
号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、または番号６２として表１に示され
ている脂質である。
一実施形態では、送達は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞送達またはｉｎ ｖｉｖｏ胃腸管送達
を含む。
一実施形態では、使用は、脂質核酸混合物の製造を含む。
一実施形態では、脂質核酸混合物は、煮沸法により、または逆相蒸散法により、または
直接混合により製造される。
一実施形態では、前記煮沸法での温度は、約２５℃から約１００℃まで、好ましくは約
８０℃から約１００℃までであり、逆相蒸散法での温度は、約２５℃から約７０℃まで、
好ましくは約５５℃である。
第４の態様では、本出願は、上述の実施形態のいずれか１つの構造の化合物および核酸
を含む医薬組成物に関する。好ましくは、前記医薬組成物は、上記化合物のいずれか１つ
または複数、好ましくは、表１から選択される１つまたは複数の脂質を含む。好ましくは
、医薬組成物は、番号１１、番号１２、番号４１、番号７１、番号３８、番号６４、番号
４０、番号３７、番号３９、番号６０、もしくは番号６２として表１に示されている脂質
のいずれか１つ、または表１に示されている他の脂質のいずれか１つもしくは複数および
他の関連化学物質とのその組合せを含む。
一実施形態では、前記医薬組成物では、脂質および核酸は、少なくとも部分的にはまた
は全体が、脂質核酸混合物の形態で存在している。
一実施形態では、前記医薬組成物では、脂質核酸混合物は、煮沸法により、または逆相
蒸散法により、または直接混合により製造される。
一実施形態では、前記医薬組成物では、煮沸法での温度は、２５℃から約１００℃まで
、好ましくは約８０℃から１００℃までである。逆相蒸散法での温度は、約２５℃から約
７０℃まで、好ましくは約５５℃である。
第５の態様では、本出願は、上述の実施形態の脂質および核酸を含むキットであって、
脂質および核酸は、各々独立して第１の容器および第２の容器に入れて提供されており、
第１の容器および第２の容器は、同じであってもよくまたは異なっていてもよいキットに
関する。好ましくは、キットは、上記化合物のいずれか１つまたは複数、好ましくは、表
１から選択される１つまたは複数の脂質を含む。好ましくは、キットは、番号１１、番号
１２、番号４１、番号７１、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号
６０、もしくは番号６２として表１に示されている脂質のいずれか１つ、または表１に示
されている他の脂質のいずれか１つもしくは複数とのその組合せ、またはいずれか１つも
しくは複数の脂質および他の関連化学物質とのその組合せを含む。
一実施形態では、前記医薬組成物では、脂質および核酸は、少なくとも部分的にまたは
全体が、使用直前に脂質核酸混合物へと製造される。
一実施形態では、前記医薬組成物では、脂質核酸混合物は、煮沸法により、または逆相
蒸散法により、または直接混合により製造される。
一実施形態では、前記医薬組成物では、煮沸法での温度は、２５℃から約１００℃まで
、好ましくは約１００℃であり、逆相蒸散法での温度は、約２５℃から約７０℃まで、好
ましくは約５５℃である。
第６の態様では、本出願は、核酸を標的細胞内へと送達する方法であって、上述の実施
形態のいずれか１つの医薬組成物またはキットの形態で核酸を提供することを含む方法に
関する。
第７の態様では、本出願は、核酸を、それを必要とする対象にｉｎ ｖｉｖｏで送達す
る方法であって、上述のいずれか１つの医薬組成物またはキットの形態で核酸を提供する
ことを含む方法に関する。
一実施形態では、上記方法では、対象は、ヒト、または哺乳動物などの動物である。
一実施形態では、上記方法では、核酸は、対象の血液循環または標的組織／細胞にｉｎ
ｖｉｖｏで送達される。
一実施形態では、上記方法は、上述の実施形態のいずれか１つの医薬組成物またはキッ
トを、それを必要とする対象に消化管により直接送達することを含む。
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、例えば、医薬組成物またはキットでは
、核酸および脂質は、局所投与用および／または注射用に製造される。
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、例えば、医薬組成物またはキットでは
、核酸および脂質は、消化投与用、呼吸投与用、および／または注射用に製造される。
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、例えば、医薬組成物またはキットでは
、核酸および脂質は、経口投与用、吸入投与用、および／または注射用に製造される。
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、例えば、医薬組成物またはキットでは
、核酸は、小分子ＲＮＡである。
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、例えば、医薬組成物またはキットでは
、核酸は、ステム－ループ構造を有する。
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、例えば、医薬組成物またはキットでは
、小分子ＲＮＡは、１４～３２ｂｐまたは１８～２４ｂｐの長さ、例えば、１４、１５、
１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２
９、３０、３１、および３２ｂｐの長さを有する。
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、医薬組成物、キット、または化合物は
、経口投与することができる。
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、核酸は、がん、例えば胃がんまたは肺
がんなどの疾患を処置するために使用することができる。
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、脂質組合せを使用することができ、脂
質組合せは、以下のいずれか１つである：番号８：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号
３８：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号３９：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号
４０：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４１：番号２９＝１：
１：２：１の脂質組合せ；番号４０：番号１２：番号４１＝２：４：３の脂質組合せ；番
号１２：番号４１＝１：６の脂質組合せ；番号１２：番号４１＝１：１の脂質組合せ；番
号１２：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号４０：番号１２：番号４１＝２：２：２の
脂質組合せ；番号４：番号１２：番号４１＝１：１：１の脂質組合せ；番号１：番号２：
番号３：番号１９：番号３５＝１：１：１：１：１のＤＧ組合せ；番号６：番号９：番号
１０：番号１３：番号１５：番号１６：番号１８：番号２０：番号２１：番号２２：番号
２３：番号２４：番号２５：番号２６：番号２７：番号２８：番号３２：番号３３＝１：
１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１のＴＧ組合せ；
番号３６：番号３７＝１：１のＬＰＣ組合せ；番号１１：番号１２＝１：１のＰＣ組合せ
；番号８：番号３８＝１：１のＰＥ組合せ；番号４：番号１４＝１：１のＣｅｒ組合せ；
番号１７：番号３０：番号３１＝１：１：１のＳｏ組合せ；番号５、番号７を含まない番
号１～３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号３４を含まない番号１～３６の等容積
組合せ；番号５、番号７、番号１、番号２、番号３、番号１９、番号３５を含まない番号
１～３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号６、番号９、番号１０、番号１３、番号
１５、番号１６、番号１８、番号２０、番号２１、番号２２、番号２３、番号２４、番号
２５、番号２６、番号２７、番号２８、番号３２、番号３３を含まない番号１～３６の等
容積組合せ；番号５、番号７、番号３６、番号３７を含まない番号１～３６の等容積組合
せ；番号５、番号７、番号１１、番号１２を含まない番号１～３６の等容積組合せ；番号
５、番号７、番号８を含まない番号１～３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号４、
番号１４を含まない番号１～３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号２９を含まない
番号１～３６の等容積組合せ；番号１：番号３４＝２：１の脂質組合せ；番号１：前記Ｄ
Ｇ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１：前記ＴＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１
：前記ＬＰＣ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１：番号８＝２：１の脂質組合せ；番号
１：番号１２＝２：１の脂質組合せ；番号１：前記Ｃｅｒ組合せ＝２：１の脂質組合せ；
番号１：前記Ｓｏ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１：番号２９＝２：１の脂質組合せ
；番号１：番号８：番号１２＝１：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４＝２：１の脂
質組合せ；番号８：前記ＤＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：前記ＴＧ組合せ＝２
：１の脂質組合せ；番号８：前記ＬＰＣ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：番号３７
＝４：１の脂質組合せ；番号８：番号１２＝２：１の脂質組合せ；番号８：前記Ｃｅｒ組
合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：前記Ｓｏ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：番
号３１＝６：１の脂質組合せ；番号８：番号２９＝２：１の脂質組合せ；番号１２：番号
３４＝２：１の脂質組合せ；番号１２：前記ＤＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１２
：前記ＴＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１２：前記ＬＰＣ組合せ＝２：１の脂質組
合せ；番号１２：番号８＝２：１の脂質組合せ；番号１２：前記Ｃｅｒ組合せ＝２：１の
脂質組合せ；番号１２：前記Ｓｏ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１２：番号２９＝２
：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号１＆２＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２
：番号８：番号１５＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３６＆３７＝２
：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号１１＝２：１：１の脂質組合せ；番号１
２：番号８：番号１２＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号４＝２：１：
１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３１＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番
号８：番号２９＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３４＝３：２：１の
脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３４＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８
：番号２＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２＝１６：８：３の脂質組
合せ；番号１２：番号８：番号３２＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号
３７＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号１１＝４：２：３の脂質組合せ
；番号１２：番号８：番号３８＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号４＝
４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３１＝４：２：３の脂質組合せ；番号
１２：番号８：番号２９＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号
３１＝２：１：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号３４
＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号２＝
４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号３２＝
４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号１１＝
４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号３７＝
４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号３８＝
４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号４＝４
：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号４：番号
１：番号１６＝２：１：１：３：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：
番号１＆２＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号１５＝２：
２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号３６＆３７＝２：２：２：３
の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号１２＝２：２：２：３の脂質組合せ；番
号１：番号８：番号１２：番号４＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号
１２：番号３１＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号２９＝
２：２：２：３の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号１＆２＝２：１：１の脂質組合せ
；番号８：番号３４：番号１５＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号３６
＆３７＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号１２＝２：１：１の脂質組合
せ；番号８：番号３４：番号４＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号３１
＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号２９＝２：１：１の脂質組合せ；番
号８：番号３１：番号３４＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号２＝１
２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号３７＝１２：３：５の脂質組合せ；番
号８：番号３１：番号１１＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号１２＝
１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号４＝１２：３：５の脂質組合せ；番
号８：番号３１：番号２９＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号３２＝
１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号３４＝１２：３：５の脂質組合せ；番
号８：番号４：番号２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号３７＝１２：
３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号１２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：
番号４：番号３１＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号２９＝１２：３：
５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号３２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号３８：番
号３４＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号
２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１＆２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号
１５＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号３２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号
３７＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号３７＝４：１の脂質組合せ；番号３８：番号
１１＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号
１１＆１２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１２＝４：１の脂質組合せ；番号３８
：番号８＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号４＝２：１の脂質組合せ；番号３８：Ｓ
ｏ（３０）＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号３１＝２：１の脂質組合せ；番号３８
：番号２９＝２：１の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号３４＝２：２：２
：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号１５＝２：２：２：３の脂質組合
せ；番号１：番号３８：番号１２：番号３７＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番
号３８：番号１２：番号８＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２
：番号４＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号３１＝２：
２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号２９＝２：２：２：３の脂
質組合せ；番号３８：番号３４：番号１＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４
：番号１５＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７＝２：１：３の脂
質組合せ；番号３８：番号３４：番号１２＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３
４：番号８＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号４＝２：１：３の脂質
組合せ；番号３８：番号３４：番号３１＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４
：番号２９＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１＝２：１：３の脂質
組合せ；番号３８：番号１２：番号２＝４：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：
番号１５＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３７＝２：１：３の脂質
組合せ；番号３８：番号１２：番号８＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：
番号４＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１＝２：１：３の脂質組
合せ；番号３８：番号１２：番号２９＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：
番号１：番号１５：番号３４＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：
番号１２：番号１：番号１５：番号３７＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質組合せ；
番号３８：番号１２：番号１：番号１５：番号４＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質
組合せ；番号３８：番号１２：番号１：番号１５：番号３１＝２２：２２：２２：３３：
３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１：番号１５：番号２９＝２２：２２：２
２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号１＝４４：２２：３
３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号１５＝４４：２２：３３：
３６の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号１２＝４４：２２：３３：３６
の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号４＝４４：２２：３３：３６の脂質
組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１＝４４：２２：３３：３６の脂質組合
せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３４＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番
号３８：番号１２：番号４：番号１＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：
番号１２：番号４：番号１５＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１
２：番号４：番号３７＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番
号４：番号３７＝８：２：５：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３１
＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９＝４４
：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９：番号３４＝
８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９
：番号１＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４
：番号２９：番号１５＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号
１２：番号４：番号２９：番号３７＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番
号３８：番号１２：番号４：番号２９：番号３１＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂
質
組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番
号３８：番号１２：番号４：番号６＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番
号１２：番号４：番号１７＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：
番号４：番号２９＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：
番号３４＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３７
＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号３４＝２：
１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号１＝２：１：３：３の脂
質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号１５＝２：１：３：３の脂質組合せ；番
号３８：番号１２：番号３１：番号３７＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号
１２：番号３１：番号４＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１
：番号２９＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１：
番号１＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７
：番号３１：番号１５＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号
３４：番号３７：番号３１：番号１２＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；
番号３８：番号３４：番号３７：番号３１：番号４＝８８：４４：６６：７２：１３５の
脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１：番号２９＝８８：４４：６６：
７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号３４＝４：２：３の脂質組合せ；
番号３８：番号３７：番号１＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号２＝
４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１＆２＝４：２：３の脂質組合せ；
番号３８：番号３７：番号２＝３２：８：５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号３
２＝３２：８：５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５＝４：２：３の脂質組合
せ；番号３８：番号３７：番号３２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番
号８＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１１＝４：２：３の脂質組合
せ；番号３８：番号３７：番号１２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番
号１１＆１２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１２＝４：１：１の
脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号４＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３
７：番号３０＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号３１＝４：２：３の
脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号２９＝４：２：３の脂質組合せ；番号８：番号３
７：番号３２＝４：１：２の脂質組合せ；番号８：番号３７：番号２＝４：１：２の脂質
組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号３４＝６４：１６：１０：４５の脂質組合
せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号１＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番
号３８：番号３７：番号１５：番号１２＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３
８：番号３７：番号１５：番号４＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番
号３７：番号１５：番号３１＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号３
７：番号１５：番号２９＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号２：番
号３７＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号３１＝４：２：３の脂質組合
せ；番号３８：番号２：番号２９＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号３
４＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号３２＝４：２：３の脂質組合せ；
番号３８：番号２：番号１２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号１２＝
４：５：１の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号４＝４：２：３の脂質組合せ。一実施
形態では、脂質番号１＆２、番号１１＆１２、または番号３６＆３７は、それぞれ、任意
の比率の脂質番号１および番号２、任意の比率の脂質番号１１および番号１２、任意の比
率の脂質番号３６および番号３７を表すことができる。
また、本出願は、下記式の構造を有する化合物、化合物を含む組合せまたは組成物、お
よび化合物、組合せ、または組成物を、核酸送達のために使用する方法、および核酸送達
試薬を製造するための、化合物、組合せ、または組成物の使用を提供する。
Figure 2023078392000006
 式中、
Ｌ１、Ｌ２、もしくはＬ３は、存在しないか、またはＬ１、Ｌ２、およびＬ３は、各々
独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）、－Ｃ（
Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－からなる群から選択され、
但し、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の最大で２つは存在せず、
２価基Ｌ１、Ｌ２に関して、左側のダッシュ「－」は、それぞれ基ＡおよびＢに連結さ
れ、右側のダッシュ「－」は、中央の炭素原子に連結され、
２価基Ｌ３に関して、左側のダッシュ「－」は、中央の炭素原子に連結され、右側のダ
ッシュ「－」は、基Ｑに連結され、
Ａ、Ｂ、およびＱは、Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１０～２０アルキル、Ｃ１０～２０アルケニル、
－ＮＨ２、および－ＮＲ３ ＋からなる群から選択され、Ｒは、ＨまたはＣ１～６アルキル
である。
一実施形態では、化合物は、以下の構造を有していてもよく、
Figure 2023078392000007
 式中、
Ａは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２０アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２０アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｑは－ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５～２０アルキル基および直鎖Ｃ１５～２０アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５～２０アルキル基および直鎖Ｃ１５～２０アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｑは－ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｑは－ＯＨである。
別の実施形態では、前記化合物は、以下の構造を有していてもよく、
Figure 2023078392000008
 式中、
Ａは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２２アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２２アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｑは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２２アルケニル基からなる群か
ら選択され、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２２アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２２アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｑは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２２アルケニル基からなる群か
ら選択され、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２０アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２０アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｑは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２０アルケニル基からなる群か
ら選択される。
別の実施形態では、化合物は、以下の構造を有していてもよく、
Figure 2023078392000009
 式中、
Ａは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２０アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２０アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｑは、－ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５～２０アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｑは、－ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５～２０アルキル基であり、
Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基であり、
Ｑは、－ＯＨである。
別の実施形態では、化合物は、以下の構造を有していてもよく、
Figure 2023078392000010
 式中、
Ａは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２０アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｑは、－ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
ら選択され、
Ｑは、－ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５～２０アルキル基であり、
Ｑは、－ＯＨである。
本出願の任意の態様または実施形態では、化合物は、上記に記載されている化合物であ
ってもよい。
本出願の任意の態様または実施形態では、化合物、抽出物、または組成物は、合成に由
来してもよく、天然に由来してもよく、または伝統的漢方薬から抽出してもよい。
本出願により提供される上記技術的解決法は、核酸の高効率標的送達を著しく向上させ
ることができ、低封入率、安全性不良、安定性不良、複雑な製造プロセス、生成物の不均
質性、低再現性、および標的指向性を向上させる必要があることを含む、従来技術の核酸
リポソームの欠点を克服することができる。
Figure 2023078392000011
Figure 2023078392000012
Figure 2023078392000013
Figure 2023078392000014
Figure 2023078392000015
Figure 2023078392000016
Figure 2023078392000017
Figure 2023078392000018
Figure 2023078392000019
Figure 2023078392000020
Figure 2023078392000021
Figure 2023078392000022
用語の定義
本明細書で使用されている用語は、言及されている置換基とその親部分との間の結合の
結合レベルを示すために、その前および／または後に単一ダッシュ「－」（または横線）
または二重ダッシュ「＝」を有している場合があり、単一ダッシュ「－」（または横線）
は単結合を指し、二重ダッシュは二重結合を指し、単一ダッシュまたは二重ダッシュが存
在しない場合、置換基とその親部分との間には単結合が形成されていることが理解され、
加えて、置換基は、ダッシュが別様に指示していない限り、「左から右へ」であると解釈
されるべきであり、例えば、Ｃ１～Ｃ６アルコキシカルボニルオキシ基および－ＯＣ（Ｏ
）ＯＣ１～Ｃ６アルキル基は、同じ官能基を指す。
用語「アルキル」は、本明細書で使用される場合、直鎖または分岐飽和炭化水素鎖を指
す。本明細書に記載されているように、アルキル基は、１～２０個の炭素原子（すなわち
、Ｃ１～２０アルキル）、１～８個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～８アルキル）、１～６
個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～６アルキル）、または１～４個の炭素原子（すなわち、
Ｃ１～４アルキル）を有する。一実施形態では、アルキル基は、Ｃ１０～２０アルキル基
である。一実施形態では、アルキル基は、Ｃ１５～２０アルキル基である。一実施形態で
は、アルキル基は、Ｃ１５～１８アルキル基、すなわち、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１
８アルキル基である。
用語「アルケニル」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの炭素間二重結合
を含み、２～２０個の炭素原子（すなわち、Ｃ２～２０アルケニル）、２～８個の炭素原
子（すなわち、Ｃ２～８アルケニル）、２～６個の炭素原子（すなわち、Ｃ２～６アルケ
ニル）、または２～４個の炭素原子（すなわち、Ｃ２～４アルケニル）を有する脂肪族基
を指す。一実施形態では、アルケニル基は、Ｃ１０～２０アルケニル基である。一実施形
態では、アルケニル基は、Ｃ１５～２０アルケニル基である。一実施形態では、アルケニ
ル基は、Ｃ１５～１８アルケニル基、すなわち、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８アルケ
ニル基である。
用語「ヘテロアルキル」および「ヘテロアルケニル」は、本明細書で使用される場合、
それぞれ、上記で定義されているアルキルおよびアルケニルであって、１つまたは複数の
炭素原子が、各々独立して、同じまたは異なるヘテロ原子基により置換されているアルキ
ルおよびアルケニルを指す。例えば、１、２、または３個の炭素原子が、独立して、同じ
または異なるヘテロ原子基により置換されていてもよい。ヘテロ原子基としては、これら
に限定されないが、－ＮＲ１－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、および－Ｓ（Ｏ）２－
などが挙げられ、式中Ｒ１は、Ｈ、アルキルである。ヘテロアルキル基の例としては、－
ＯＣＨ３、－ＣＨ２ＯＣＨ３、－ＳＣＨ３、－ＣＨ２ＳＣＨ３、－ＮＲ１ＣＨ３、および
－ＣＨ２ＮＲ１ＣＨ３が挙げられ、式中Ｒ１は、水素、アルキルである。
本明細書に記載の用語「逆相蒸散法」は、核酸の水溶液を、脂質の有機溶媒溶液に添加
し、超音波処理し、蒸発させて有機溶媒を除去し、その後水和して、脂質核酸混合物を得
ることを指す。
本明細書に記載の用語「煮沸法」（「加熱法」とも呼ばれる）は、脂質の有機溶媒溶液
を核酸の水溶液に添加し、約１００℃で３０分間煮沸して、脂質核酸混合物を得ることを
指す。方法は、煮沸による加熱に限定されず、当技術分野で公知の他の加熱または昇温手
段も使用することができる。
逆相蒸散法および煮沸法は、制御された温度および混合条件下で実施される。好適な処
理時間および温度は、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、逆相蒸散法
の温度は、好ましくは約２５℃から約７０℃まで、より好ましくは約３０℃から約６５℃
まで、より好ましくは約４０℃から約６０℃までの範囲であり、特に約５５℃である。煮
沸法の温度は、好ましくは約２５℃から約１００℃まで、より好ましくは約５０℃から約
１００℃まで、より好ましくは約９５℃から約１００℃まで、特に好ましくは約８０℃か
ら１００℃までの範囲である。
本明細書に記載の核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、好ましくは小分子ＲＮＡ、例えば、１
４～３２ｂｐ、１６～２８ｂｐ、１８～２４ｂｐの長さ、特に１４、１５、１６、１７、
１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３
１、３２ｂｐの長さを有する小分子ＲＮＡを含む。
細胞（ヒト胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７）内への核酸（ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７）吸収および進入に対する１２個の脂質の効果（逆相蒸散法）。 ２７個の単一脂質は、ＭＲＣ－５細胞株内への核酸の進入を促進する（逆相蒸散法）。 ２３個の単一脂質は、ＭＲＣ－５細胞株内への核酸の進入を促進する（煮沸法）。 ２３個の単一脂質は、Ａ５４９細胞株内への核酸の進入を促進する（煮沸法）。 脂質組合せは、ＭＲＣ－５細胞株内への核酸の進入を促進することができる（逆相蒸散法）。 脂質組合せは、Ａ５４９細胞株内への核酸の進入を促進することができる（逆相蒸散法）。 脂質組合せは、ＭＲＣ－５細胞株内への核酸の進入を促進することができる（煮沸法）。 脂質組合せは、Ａ５４９細胞株内への核酸の進入を促進することができる（煮沸法）。 様々なタイプの脂質組合せが、Ｃａｃｏ－２細胞株内への核酸の進入を促進する（逆相蒸散法）。 様々なタイプの脂質組合せが、Ｃａｃｏ－２細胞株内への核酸の進入を促進する（煮沸法）。 単一脂質（番号１１および番号１２）は、様々な細胞内への、様々な配列を有する核酸の進入を促進する。 単一脂質（番号１１および番号１２）は、様々な細胞内への、様々な配列を有する核酸の進入を促進する。 単一脂質（番号１１および番号１２）は、様々な細胞内への、様々な配列を有する核酸の進入を促進する。 蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験は、核酸が、単一脂質の補助により細胞質内へと進入することを示す。 単一脂質（番号１１および番号１２）は、核酸が、細胞内へと進入して、遺伝子３’ＵＴＲ領域を標的とすることを促進する。 単一脂質（番号１１および番号１２）は、核酸が、消化管により血液および肺内へ進入することを促進する。 逆相蒸散法および煮沸法により調製された脂質組合せは、核酸が、消化管により血液および肺内へと進入することを促進する。 様々なタイプの脂質組合せが、一本鎖核酸をＭＲＣ－５内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、ＭＲＣ－５またはＣａｃｏ－２細胞内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、ＭＲＣ－５またはＣａｃｏ－２細胞内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、細胞内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、細胞内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、細胞内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ－５細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ－５細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ－５細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ－５細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ－５細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ－５細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ－５細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ－５細胞内に送達する。 脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ－５細胞内に送達する。 脂質組合せは、核酸が、消化管を介して肺内に進入することを促進する。 番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）は、ＭＲＣ－５細胞内への抗線維化ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を媒介する。 番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）は、Ａ５４９細胞内へのｓｉＲＮＡの進入を媒介する。 番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）は、Ａ５４９細胞内へのｓｉＲＮＡの進入を媒介する。 番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）は、ＴＨＰ－１細胞内へのｓｉＲＮＡの進入を媒介する。 番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）は、ＭＲＣ－５細胞内への抗線維化ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を媒介する。 番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する。 番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）脂質混合物は、ＭＲＣ－５細胞内への抗線維化ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を媒介する（煮沸法）。 番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）脂質混合物は、ＮＦκＢ ｓｉＲＮＡが、ＴＨＰ－１細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する（煮沸法）。 番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＰＣ（１１）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する。 番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＬＰＣ（３７）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する。 番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＭＧ（３４）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：３：１）脂質混合物は、ＣＰＳＦ４ ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する。 番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：８：５）脂質混合物は、ＭＲＣ－５細胞内への抗線維化ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を媒介する（煮沸法）。 番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：８：５）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する。 番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：１：２：２：３：１：３）は、ＭＲＣ－５細胞内への抗線維化ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を媒介する（煮沸法）。 番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：１：２：２：３：１：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する（煮沸法）。 番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：２：５）は、ＭＲＣ－５細胞内への、抗線維化ＨＪＴ小分子ＲＮＡ ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を媒介する（煮沸法）。 番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５）脂質混合物は、核酸を細胞内へと効果的に送達することができる。 番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）は、ＭＲＣ－５細胞内への、抗線維化ＨＪＴ小分子ＲＮＡ ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を媒介する（煮沸法）。 番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する（煮沸法）。 番号３８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する。 番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：１）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する（逆相蒸散法）。 番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）脂質混合物は、ＭＲＣ－５細胞内への、抗線維化小分子ＲＮＡ ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３、およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を媒介する（煮沸法）。 番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する（煮沸法）。 番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：３）脂質混合物は、ＭＲＣ－５細胞内への抗線維化小分子ＲＮＡ ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を媒介する（煮沸法）。 番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する（煮沸法）。 脂質番号４１は、異なる調製方法（煮沸法または逆相蒸散法）により二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達する。 脂質番号４１は、異なる調製方法（煮沸法または逆相蒸散法）により二本鎖ＲＮＡをＭＲＣ－５細胞内へと送達する。 脂質番号４１は、煮沸法により、一本鎖ＲＮＡをＡ５４９およびＭＲＣ－５細胞内へと送達する。 脂質による核酸送達の効率を、デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）技術により決定する。 脂質による核酸送達の効率を、フローサイトメトリー技術により決定した。 脂質により細胞に送達された核酸の局在化を、共焦点蛍光顕微鏡法により観察する。 脂質による核酸送達の効率を、ウエスタンブロッティングアッセイにより決定した。 単一脂質番号４１は、ＭＲＣ－５細胞内への抗線維化ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を媒介する（煮沸法）。 核酸送達における、脂質組合せ１（番号８＋番号４１＝６：１）および脂質組合せ２（番号３８＋番号４１＝６：１）の効果。 核酸送達における、脂質組合せ３（番号３９＋番号４１＝６：１）および脂質組合せ４（番号４０＋番号４１＝６：１）の効果。 核酸送達における、脂質組合せ５（３８＋１２＋４１＋２９＝１：２：１：１）の効果。 核酸送達における、脂質組合せ６（４０（ＰＥ）＋１２（ＰＣ）＋４１（Ｓｏ）＝２：４：３）の効果。 核酸送達における、脂質組合せ７（１２（ＰＣ）＋４１（Ｓｏ）＝１：６）および脂質組合せ８（１２（ＰＣ）＋４１（Ｓｏ）＝１：１）の効果。 核酸送達における、脂質組合せ９（１２（ＰＣ）＋４１（Ｓｏ）＝６：１）および脂質組合せ１０（４０（ＰＣ）＋１２（ＰＣ）＋４１（Ｓｏ）＝２：２：２）の効果。 核酸送達における、脂質組合せ１１（４（Ｃｅｒ）＋１２（ＰＣ）＋４１（Ｓｏ）＝１：１：１）の効果。 脂質３８は、煮沸法により、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９およびＭＲＣ－５細胞内へと送達する。 脂質３８は、煮沸法により、一本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞およびＭＲＣ－５細胞内へと送達する。 脂質による核酸送達の効率を、デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）技術により決定した。 脂質による核酸送達の効率を、フローサイトメトリー技術により決定した。 脂質により細胞に送達された核酸の位置を、共焦点蛍光顕微鏡法により観察する。 脂質６４は、異なる調製方法（煮沸法または逆相蒸散法）により、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達する。 フローサイトメトリー技術により決定した、脂質による核酸送達の効率。 共焦点蛍光顕微鏡法により観察した、脂質により細胞に送達された核酸の局在化。 デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）技術により決定した、脂質による核酸送達の効率。 共焦点蛍光顕微鏡法により観察した、脂質により細胞に送達された核酸の位置。 ウエスタンブロッティングアッセイにより決定した、脂質による核酸送達の効率。 単一ホスファチジルエタノールアミン脂質４０は、抗線維化二本鎖ＲＮＡ ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７が、ＭＲＣ－５細胞内に進入して、フィブロネクチンタンパク質発現レベルを下方制御することを媒介する。 煮沸法により調製された脂質３８は、一本鎖ＲＮＡをＡ５４９およびＭＲＣ－５細胞内へと送達する。 異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製された脂質３９は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達する。 デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）技術により決定した、脂質による核酸送達の効率。 異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製された脂質６０は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達する。 異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製された脂質６２は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達する。 脂質番号４１は、血液中への小分子ＲＮＡの進入を促進し、血液中での分解からそれを保護する。 脂質番号４１は、胃細胞内への小分子ＲＮＡの進入を促進し、胃での分解からそれを保護する。 脂質番号４１は、小腸細胞内への小分子ＲＮＡの進入を促進し、小腸での分解からそれを保護する。 脂質番号４１は、肝臓内への小分子ＲＮＡの進入を促進し、肝臓での分解からそれを保護する。 単一ＰＥ（番号３８）は、一本鎖ｓＲＮＡ核酸を、経口投与によりマウス血液中へと効果的に送達する。 単一ＰＥ（番号４０）は、一本鎖ｓＲＮＡ核酸を、経口投与によりマウス血液中へと効果的に送達する。 単一ＰＥ（番号６４）は、一本鎖ｓＲＮＡ核酸を、経口投与によりマウス血液中へと効果的に送達する。 単一ＰＥ（番号７１）は、一本鎖ｓＲＮＡ核酸を、経口投与によりマウス血液中へと効果的に送達する。 脂質は、様々な温度勾配にて、一本鎖核酸をＭＲＣ－５細胞内へと効果的に送達する。
以下は、本出願のさらなる説明であるが、いかなる点でも本発明を限定することは意図
されておらず、本出願の教示に基づいてなされるあらゆる変更は、本出願の保護の範囲内
に入る。
本出願では、脂溶性成分を、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法により、伝統的漢方薬（ロディオ
ラ・クレヌラータ、モウコタンポポ、アンドログラフィス・パニクラータ、およびスイカ
ズラ）から抽出し、脂質成分を、ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより同定した（合計１３８個の
脂質成分を、１２５個はポジティブモードで、１３個はネガティブモードで同定した）。
それらのうち７１個（表１－１～表１－３を参照）を、脂質核酸混合物の調製に使用し、
それらが、外因性核酸の細胞吸収および進入を促進することができたか否かを観察した。
なお、本出願で使用された脂質は、商業的に購入されたか、または商業的に合成されたも
のであり、伝統的漢方薬から直接的に抽出したものではなかったことが留意されるべきで
ある。本発明者は、驚くべきことに、種々の脂質が、核酸の細胞吸収および進入を効果的
に促進する脂質核酸混合物を形成することができ（図１～１１６を参照）、臨床の場面で
核酸薬送達の効率を増加させる可能性を有することを見出した。さらなる研究は、本出願
の脂質核酸混合物が、異なる細胞株で核酸吸収および進入の効率を促進することを示した
が、異なる細胞株で差異が観察された（図１～１０を参照）。これは、標的化薬物送達の
可能性を切り開くものである。さらに、そのような脂質核酸混合物による核酸送達は、配
列特異的ではなく、異なる配列、および小分子ＲＮＡのサイズに相当するサイズ（例えば
、約２０ｂｐ）を有する核酸断片を送達することが可能である（図１１を参照）。加えて
、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により、煎出物に由来する脂
質により形成された脂質核酸混合物が、細胞質内への外因性核酸の進入を効果的に促進す
ることができることが確認された（図１２を参照）。本発明者は、意外にも、煮沸法また
は逆相蒸散法により調製された脂質核酸混合物が、血液循環および標的組織内への、非侵
襲性経路を介した（例えば、消化管、呼吸器、および局所投与による）ｓＲＮＡなどの核
酸の進入を容易にすることができることを発見した（図１４～１５を参照）。また、本発
明者は、驚くべきことに、本出願の脂質が、細胞内へのｓＲＮＡなどの核酸の進入を促進
し、それらの標的配列の発現を調節（例えば、阻害）することが可能であるが、非標的配
列に対してはそのような調節効果を示さないため、標的特異的調節であることが示唆され
、核酸薬を送達するための手段として使用することができることを発見した（図１３を参
照）。
上記の予期しない発見に基づき、本発明者らは、本出願に到達した。
一態様では、本出願は、核酸送達を容易にするための、伝統的漢方薬から抽出された化
合物であって、リゾレシチン、セラミド、ジグリセリド、ホスファチジルエタノールアミ
ン、ホスファチジルコリン、トリグリセリド、モノガラクトシルジグリセリド、スフィン
ゴシン、ホスファチジルエタノール、モノアシルグリセロール、脂肪酸、血小板活性化因
子、またはジメチルホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択され、好ましく
は、表１に示されている脂質から選択される化合物を提供する。一実施形態では、脂質は
、非天然であり、例えば、合成であるか、または発酵で製造される。
一実施形態では、脂質は、核酸を標的細胞内へと送達するために使用される。別の実施
形態では、脂質は、それを必要とする対象内へと、ならびにその血液循環および／または
標的部位／細胞内へと核酸を送達するために使用される。
好ましい実施形態では、脂質は、ホスファチジルコリン、例えば、１－ステアロイル－
２－オレオイル－ｓｎ－グリセロール－３－ホスホコリン（ＰＣ（１８：０／１８：２）
、すなわち表１の脂質番号１１）および１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリ
セロール－３－ホスホコリン（ＰＣ（１６：０／１８：２）、すなわち表１の脂質番号１
２）から選択される。これら２つのホスホコリン（ＰＣ）は、核酸を効率的に封入するこ
と、または細胞内への核酸の進入を促進することを可能にする。一実施形態では、脂質は
、表１の脂質番号４１、すなわちスフィンガニン（ｄ２２：０）であってもよく、核酸を
効率的に封入すること、または細胞内への核酸の進入を促進することが可能である。
別の態様では、本出願は、上記脂質および核酸を含む医薬組成物を提供する。好ましく
は、核酸は、小分子ＲＮＡである。
一実施形態では、本出願の医薬組成物は、非侵襲性経路（例えば、局所投与）および／
または注射による投与用に、例えば、消化管、呼吸器、および／または注射による投与用
に、例えば、経口投与、吸入、および／または注射用に調製することができる。一部の場
合では、侵襲性経路が好ましい（例えば、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内を含む
注射、および標的組織内への注射）；他の場合では、非侵襲性経路が好ましい。
別の実施形態では、本出願の医薬組成物では、脂質および核酸の少なくとも一部または
全部を、脂質核酸混合物の形態に調製することができる。脂質核酸混合物を製造するため
の種々の方法は幅広く開示されており、脂質核酸混合物の製造に好適な方法は、実際の必
要性に応じて選択することができる。
第３の態様では、本出願は、本明細書に記載の脂質および核酸を含むキットであって、
脂質および核酸は、各々独立して、第１の容器および第２の容器に入れて提供されている
キットを提供する。第１の容器および第２の容器は、同じであってもよく、または異なっ
ていてもよい。一部の実施形態では、脂質および核酸の少なくとも一部または全部は、使
用直前に脂質核酸混合物へと調製される。
第４の態様では、本出願は、核酸を標的組織／細胞内へと送達する方法であって、核酸
は、本明細書に記載の医薬組成物またはキットの形態で提供される方法を提供する。
第５の態様では、本出願は、核酸を、それを必要とする対象内にｉｎ ｖｉｖｏで送達
する方法であって、本明細書に記載の医薬組成物またはキットの形態で核酸を提供し、例
えば、核酸を対象の血液循環または標的組織／細胞内へとｉｎ ｖｉｖｏで送達し、例え
ば、脂質および核酸は、非侵襲性経路（例えば、局所投与）および／または注射により、
例えば、消化管、呼吸器、および／または注射により、例えば、経口投与、吸入、および
／または注射により投与される、方法を提供する。
第６の態様では、本出願は、核酸で予防および／または処置することができる疾患／障
害を予防および／または処置する方法であって、本明細書に記載されている医薬組成物ま
たはキットを、それを必要とする対象に提供することを含み、例えば、脂質および核酸は
、非侵襲性経路（例えば、局所投与）によりおよび／または注射により、例えば、消化管
、呼吸器、および／または注射により、例えば、経口投与、吸入、および／または注射に
より投与される、方法を提供する。驚くべきことに、非侵襲性の投与経路（例えば、経口
投与、胃管栄養、および吸入などを含む、消化管、呼吸器による）は、核酸の進入および
有効性を著しく促進することができる。
第７の態様では、本出願は、医薬組成物またはキットを製造するための方法、および上
記態様に記載されている方法における医薬組成物および／またはキットの使用を提供する
。また、上記に記載されている種々の方法に使用される脂質、医薬組成物、および／また
はキットも提供される。
本出願の種々の実施形態では、核酸は、小分子ＲＮＡであってもよく、例えば、小分子
ＲＮＡは、１４～３２ｂｐ、１６～２８ｂｐ、１８～２４ｂｐの長さ、特に、１４、１５
、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、
２９、３０、３１、３２ｂｐの長さを有していてもよい。加えて、小分子ＲＮＡは、例え
ば、ステム－ループ構造を有する一本鎖であってもよく、または二本鎖であってもよい。
例えば、核酸は、以下の配列：ｕｇａｇｇｕａｇｕａ ｇｇｕｕｇｕｇｕｇｇ ｕｕｇｕ
ａａｇｃを有するＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７であってもよい。
一実施形態では、本出願の医薬組成物またはキットまたは化合物は、がん、例えば胃が
んおよび肺がんなどの疾患を処置するために使用することができる。
一実施形態では、本出願の医薬組成物またはキットまたは化合物は、ＮＣＩ－Ｎ８７細
胞（胃がん細胞）、ＭＲＣ－５細胞（肺線維芽細胞）、およびＡ５４９細胞（肺がん細胞
）の増殖を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで処置、例えば、阻害するために使
用することができる。
本出願の種々の実施形態では、脂質核酸混合物は、様々な方法、例えば、逆相蒸散法ま
たは煮沸法により得ることができる。逆相蒸散法では、核酸の水溶液を、脂質の有機溶媒
溶液に添加し、超音波処理し、蒸発させて有機溶媒を除去し、その後水和して、脂質核酸
混合物を得る。本出願に記載されている煮沸法は、脂質の有機溶媒溶液を核酸の水溶液に
添加し、約１００℃で３０分間煮沸して、脂質核酸混合物を得ることを指す。逆相蒸散法
および煮沸法は、制御された温度および混合条件下で実施される。好適な処理時間および
温度は、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、逆相蒸散法の温度は、好
ましくは約２５℃から約７０℃まで、より好ましくは約３０℃から約６５℃まで、より好
ましくは約４０℃から約６０℃までの範囲であってもよく、特に好ましくは約５５℃であ
ってもよい。煮沸法（加熱法とも呼ばれる）の温度は、好ましくは約２５℃から約１００
℃まで、より好ましくは約５０℃から約１００℃まで、より好ましくは約９５℃から約１
００℃までの範囲であってもよく、特に好ましくは約１００℃であってもよい。
以下の実施例は、本明細書で開示された発明の例示に過ぎず、添付の特許請求の範囲を
限定するものと解釈されるべきではない。
Figure 2023078392000023
表１に番号１～３２として示されている脂質の実施例
１．伝統的漢方薬からの脂質の抽出
１．１ 伝統的漢方薬の煎出
１）１００ｇの漢方薬煎出片（Ｎｉｎｇｂｏ Ｈａｉｓｈｕ Ｑｉａｎｃａｏ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入したロディオラ・クレヌラータ；Ｂｅ
ｉｊｉｎｇ Ｔｏｎｇｒｅｎｔａｎｇ ｐｈａｒｍａｃｙから購入したモウコタンポポ、
スイカズラ、アンドログラフィス・パニクラータ）を１０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏに添加し
、３０分間浸漬した。
２）漢方薬煎出ポットを、激しく加熱して１５分間、およびゆっくりと加熱して２０分
間煮沸した。
３）４００ｍＬの加熱した漢方薬スープを、６０℃、６０ｒｐｍでロータリーエバポレ
ータに添加し、１００ｍＬに濃縮した。
１．２ 脂質抽出
１）６００ｍｌのクロロホルム－メタノール混合物（クロロホルム：メタノール＝１：
２、ｖ／ｖ）を、上記ステップ１．１から得られた漢方薬スープ（ロータリーエバポレー
タにより濃縮された）に添加して、クロロホルム：メタノール：水＝１：２：０．８にし
、１０～１５分間撹拌して混合した。
２）２００ｍＬのクロロホルムを、エルレンマイヤーフラスコに添加し、１０分間撹拌
して混合した。
３）２００ｍＬのｄｄＨ２Ｏを、エルレンマイヤーフラスコに添加して、クロロホルム
：メタノール：水＝２：２：１：８にし、１０分間撹拌して混合した。
４）上部層の液体および中間層の不溶性物質を除去し、下部クロロホルム層を得た。－
４０℃で保管した。
１．３ 脂質成分のＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ同定
機器設定
１）クロマトグラフィー設定：
機器：Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００；カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（１００×２．１
ｍｍ、１．９μｍ）；カラム温度：４５℃；移動相Ａ：アセトニトリル：水（Ｖ／Ｖ、６
０：４０）、１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウムを含む溶液、移動相Ｂ：アセトニトリル
：イソプロパノール（１０：９０、Ｖ／Ｖ）、１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウムおよび
０．１％ギ酸を含む溶液。流速：０．４ｍＬ／分；インジェクション容積：４μｌ。
２）質量分析パラメーター：
ａ）ポジティブモード：ヒーター温度３００℃、シースガス流速、４５ａｒｂ、補助ガ
ス流速、１５ａｒｂ、スイープガス流速、１ａｒｂ、スプレー電圧、３．０ｋＶ、キャピ
ラリー温度、３５０℃、Ｓ－レンズＲＦレベル、３０％。スキャン範囲：２００～１５０
０。
ｂ）ネガティブモード：ヒーター温度３００℃、シースガス流速、４５ａｒｂ、補助ガ
ス流速、１５ａｒｂ、スイープガス流速、１ａｒｂ、スプレー電圧、２．５ｋＶ、キャピ
ラリー温度、３５０℃、Ｓ－レンズＲＦレベル、６０％。スキャン範囲：２００～１５０
０。
１．４ 漢方薬に由来する脂質の同定
脂質成分をＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより同定した。伝統的漢方薬に由来する合計１３８
個の脂質成分を同定した。そのうち１２５個はポジティブモードで、１３個はネガティブ
モードで同定した。表１に示されている化合物番号１～３２に対して、以下の実験を実施
した。
なお、下記で試験した脂質はすべて、表１－１に記載されているように、商業的に購入
されたかまたは商業的に合成され、使用されたことが留意されるべきである。
２．脂質核酸混合物の製造
２．１ 逆相蒸散法：
６００μｌの脂質のジエチルエーテル溶液を調製し、表１に示されている脂質番号に従
ってグループ化した。ジエチルエーテル溶液は、脂質群番号１／２／４／９／１４／１８
／１９／２０／２１／２２／２３／２４／２５／２６／２７／２８／２９／３０／３２の
場合は０．０１７８５７ｍｇ／ｍＬ、脂質群番号３／８／１０／１１／１２／１３の場合
は０．０３５７１４ｍｇ／ｍＬ、脂質群番号６／１５／１６／１７／３１の場合は０．０
０３５７１４ｍｇ／ｍＬの濃度を有していた。脂質溶液を、１２０μｌのＨＪＴ－ｓＲＮ
Ａ－ｍ７一本鎖ＲＮＡのＤＥＰＣ処置水溶液（１５ｎｍｏｌ）に、５：１の容積比で添加
し、３分間超音波処理した。ジエチルエーテルを、５５℃での蒸発により除去し、６００
μｌのＤＥＰＣ水を水和のために添加して、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７脂質混合物を得た。
２．２ 煮沸法：
６０μｌの脂質のクロロホルム溶液を調製し、表１に示されている脂質番号に従ってグ
ループ化した。クロロホルム溶液は、脂質群番号１／２／４／９／１４／１８／１９／２
０／２１／２２／２３／２４／２５／２６／２７／２８／２９／３０／３２の場合は５ｍ
ｇ／ｍＬ、脂質群番号３／８／１０／１１／１２／１３の場合は１０ｍｇ／ｍＬ、脂質群
番号６／１５／１６／１７／３２の場合は１ｍｇ／ｍＬの濃度を有していた。上記脂質ク
ロロホルム溶液を、６００μｌのＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖ＲＮＡのＤＥＰＣ処置水
溶液（１５ｎｍｏｌ）と混合し、１００℃で３０分間加熱して、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７
脂質混合物を得た。
３．脂質核酸混合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ送達実験
３．１ ＮＣＩ－Ｎ８７細胞（胃がん細胞）、ＭＲＣ－５細胞（肺線維芽細胞）、Ａ５
４９細胞（肺がん細胞）を対数増殖期まで培養し、その後、１×１０６／２ｍＬ培地／ウ
ェルの細胞密度で６－ウェルプレートにプレーティングした。ＭＲＣ－５細胞を、イーグ
ルＭＥＭ培地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）で培養した。Ａ５４９細胞を、ハムＦ－１２培地（
ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養した。ＮＣＩ－Ｎ８７細胞をＲＰＭＩ－１６４０培地（ＨｙＣｌ
ｏｎｅ）で培養した。その後、３７℃で一晩インキュベーションし、細胞が壁面に付着し
た後、追跡実験を実施した。
３．２ 実験群は以下の通り。
１） ＮＣ群：未処置細胞を指す。この群は、負の対照群としての役目を果たした。
２）ＲＮＡｉｍａｘ処置群：２μｌ ＲＮＡｉｍａｘトランスフェクション試薬および
ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、
その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。ＨＪＴ－ｓ
ＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、２００ｎＭであった。この群は、陽性対照群としての役目を果
たした。
３）自由取込み群：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は２００ｎ
Ｍであった）。この群は陰性対照群としての役目を果たした。
４）脂質核酸混合物：ステップ２で調製した脂質およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の混合
物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度を、２００ｎＭに維持した。
３．３ 小分子ＲＮＡと共に３時間共インキュベーションした後、細胞を、ＰＢＳで２
～３回洗浄した。細胞を、ＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液を用いて回収し、全ＲＮＡを抽出した
。細胞に進入した小分子ＲＮＡの存在量を、ＲＴ－ｑＰＣＲにより検出し、ＲＮＡの局在
化を、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出した。各検出方法のプロト
コールは以下の通りであった。
３．３．１ 小分子ＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ検出（Ｔａｑｍａｎプローブ法）
１）ｓＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。逆転写キット（ＴａｑＭａｎ（登録商標）マ
イクロＲＮＡ逆転写キット、カタログ番号４３６６５９７）を使用して、ｓＲＮＡをｃＤ
ＮＡへと逆転写した。逆転写系は以下の通りであった：１００ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＴＴＰ
を有する）０．１５μｌ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（商標）逆転写酵素５０Ｕ／μｌ １
．００μｌ、１０×ＲＴ緩衝液１．５μｌ、ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ／μｌ）０．１９
μｌ、無ヌクレアーゼＨ２Ｏ ４．６μｌ、５μｌのＲＮＡ鋳型（２００ｎｇ／μｌ）を
混合した後で、添加した。３μｌの５×Ｔａｑｍａｎプローブプライマーを混合し、混合
した後で短時間遠心分離した後で添加し、その後氷上で５分間維持してから、ＰＣＲ反応
器にロードした。反応条件は以下の通りであった：（１）１６℃、３０分間；（２）４２
℃、３０分間；（３）８５℃、５分間；（４）４℃、反応停止。反応後に１０μｌの無Ｒ
Ｎａｓｅ ｄｄＨ２Ｏを添加して、最終容積を２５μｌにした。逆転写プロセスで使用し
たＴａｑｍａｎプローブプライマーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより合成された（Ｕ６：
４４４０８８７、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７：４３９８９８７）。
２）定量ＰＣＲ増幅反応：ｑＰＣＲ反応系は、ＵＮＧを含む５μｌの２×ＴａｑＭａｎ
（登録商標）ユニバーサルマスターミックスＩＩ、０．５μｌの２０×Ｔａｑｍａｎプラ
イマー、逆転写による１μｌのｃＤＮＡ、３．５μｌの無ＲＮａｓｅ ｄＨ２Ｏを含む、
１０μｌの総容積を有していた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０蛍光定量ＰＣＲ機器を使
用した。ＰＣＲ反応条件は、以下の通りであった：５０℃で２分間、プレ変性のために９
５℃で１０分間、その後ＰＣＲ増幅サイクル：（１）９５℃、１５秒間；（２）６０℃、
６０秒間；（３）６０℃、６０秒間；合計４０サイクル；最後に４０℃で１０秒間の冷却
。増幅反応用のＴａｑｍａｎプローブは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより設計および合成さ
れた（Ｕ６：４４４０８８７、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７：４３９８９８７）。
３）相対的発現レベルを、２－ΔＣｔ法により算出した。
３．３．２ 小分子ＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ検出（ＳＹＢＲグリーン色素法）
１）ｓＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。逆転写キット（高容量ｃＤＮＡ逆転写キット
、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３６８８１３）を使用して、
ステム－ループ法によりｓＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転した。逆転写系は、以下の通りであ
った：ＲＮＡ鋳型（１５０ｎｇ／μｌ）１０μｌ、１０×ＲＴ緩衝液、２．０μｌ、２５
×ｄＮＴＰミックス（１００ｍＭ）０．８μｌ、Ｕ６ ＲＴステム－ループプライマー２
．０μｌ、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ＲＴ－ｍ７ステム－ループプライマー２．０μｌ、Ｍｕｌ
ｔｉＳｃｒｉｂｅ（商標）逆転写酵素１．０μｌ、ＲＮａｓｅ阻害剤１．０μｌ、無ヌク
レアーゼＨ２Ｏ １．２μｌを、短時間遠心分離した後ＰＣＲ反応器にロードした。反応
条件は、以下の通りであった：（１）２５℃、１０分間；（２）３７℃、１２０分間；（
３）８５℃、５分間；（４）４℃、反応停止。反応後に２０μｌの無ＲＮａｓｅ ｄｄＨ
２Ｏを添加して、最終容積を４０μｌにした。逆転写プロセスに使用したステム－ループ
プライマーは、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔｓｉｎｇｋｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．
，Ｌｔｄ．により合成された（Ｕ６ ＲＴプライマー：ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡ
ＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＡＡＡＴＡＴＧ；Ｈ
ＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ ＲＴステム－ループプライマー：ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣ
ＡＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＧＣＴＴＡＣＡＡ）。
２）定量ＰＣＲ増幅反応：ｑＰＣＲ反応系は、５μＬの２×ＳＹＢＲグリーンマスター
ミックス、０．５μｌのフォワードプライマー（１０μＭ）、０．５μｌのリバースプラ
イマー（１０μＭ）、逆転写による１μｌのｃＤＮＡ、３μｌの無ＲＮａｓｅ ｄＨ２Ｏ
を含む、１０μｌの総容積を有する。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０蛍光定量ＰＣＲ機器
を使用した。ＰＣＲ反応条件は、以下の通りであった：プレ変性のために９５℃で５分間
、その後ＰＣＲ増幅サイクル：（１）９５℃、１０秒間；（２）５５℃、１０秒間；（３
）７２℃、２０秒間；合計４０サイクル；最後に４０℃で１０秒間の冷却。増幅反応のフ
ォワードおよびリバースプライマーは両方とも、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔｓｉｎｇｋｅ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により設計および合成された（Ｕ６ Ｆプラ
イマー：ＧＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧＴＴＣ、Ｕ６ Ｒプライマー：ＧＴＧＣＡＧＧ
ＧＴＣＣＧＡＧＧＴ、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ Ｆプライマー：ＴＣＧＣＧＣＴＧＡＧＧ
ＴＡＧＴＡＧＧＴＴ、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ Ｒプライマー：ＧＴＧＣＡＣＧＣＴＣＣ
ＧＡＧＧＴ）。
３）相対的発現レベルを、２－ΔＣｔ法により算出した。
３．３．３ 小分子ＲＮＡの蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
１）培地を除去し、ＰＢＳ（５００μｌ／ウェル）で３回洗浄した。
２）室温にて２０分間４％パラホルムアルデヒドで固定する（５００μｌ／ウェル、Ｐ
ＢＳ緩衝液で調製）。
３）１×ＰＢＳ（５００μｌ／ウェル）で洗浄し、新たな１×ＰＢＳ（５００μｌ／ウ
ェル）に５分間浸漬する。
４）ＰＢＳを除去し、細胞を、１０分間室温にてＰＫ（プロテイナーゼＫ）緩衝液で透
過処理した。
５）１×ＰＢＳ緩衝液（５００μｌ／ウェル）で洗浄し、室温にて１０分間４％パラホ
ルムアルデヒドで固定する（５００μｌ／ウェル、ＰＢＳ緩衝液で調製）。
６）１×ＰＢＳで洗浄し、新たな１×ＰＢＳ（５００μｌ／ウェル）に５分間浸漬する
。
７）細胞を、室温にて１０分間０．１ＭのＴＥＡで処理した。
８）１×ＰＢＳ（５００μｌ／ウェル）で洗浄し、新たな１×ＰＢＳ（５００μｌ／ウ
ェル）に５分間浸漬する。
９）培養プレートを、ハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳ
Ｃ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ、２５０μｇ／ｍＬ酵母ＲＮＡ、５００μｇ／ｍＬニシン精子Ｄ
ＮＡ）中のハイブリダイゼーションカセットに設置し、室温で１時間プレインキュベート
した。
１０）ＲＮＡプローブ（ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７プローブ：５’－ＧＣＴＴＡＣＡＡＣ
ＣＡＣＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ－３’、スクランブルプローブ：５’－ＣＡＧ
ＴＡＣＴＴＴＴＧＴＧＴＡＧＴＡＣＡＡ－３’、Ｕ６プローブ：５’－ＴＴＴＧＣＧＴＧ
ＴＣＡＴＣＣＴＴＧＣＧ－３’）をハイブリダイゼーション緩衝液に添加し（ＲＮＡプロ
ーブの濃度は、０．１～０．２ｎｇ／μｌであった）、８５℃で５分間変性させ、素早く
氷上に置く。
１１）ステップ９のプレハイブリダイゼーション緩衝液を除去し、それをステップ１０
のＲＮＡプローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液に取り替え、その後プレートをハ
イブリダイゼーションカセットに設置し、６５℃で一晩（１２～１６時間）インキュベー
トする。
１２）０．２×ＳＳＣ溶液を６５℃に予加熱し、各回２０分間０．２×ＳＳＣ（１ｍＬ
／ウェル）で３回洗浄する。
１３）室温の０．２×ＳＳＣ溶液（１ｍＬ／ウェル）を添加し、５分間静置する。
１４）０．２×ＳＳＣを吸引し、緩衝液Ｂ１（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．
４～７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を添加し、室温で各回５分間２回洗浄する。
１５）ＰＢＳで３回、各回５分間洗浄する。
１６）共焦点顕微鏡で観察する。
３．４ 細胞内への核酸の吸収および進入に対する伝統的漢方薬抽出物の効果
１）表１に示されている３０個の脂質を実験のために選択した。実験群は、表１に示さ
れている脂質番号に従って付番した。脂質核酸混合物を、ステップ２に記載されている逆
相蒸散法および煮沸法に従って調製した。ステップ３．１～３．３による脂質核酸混合物
を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ送達実験を実施し、細胞内ＲＮＡの存在量を決定した。
実験結果を図１～４に示した。図１～２は、逆相蒸散法により調製した脂質核酸混合物
が、ＮＣＩ－Ｎ８７およびＭＲＣ－５細胞に核酸を送達することに成功することができた
ことを示した。図３～４は、煮沸法により調製した脂質核酸混合物が、ＭＲＣ－５および
Ａ５４９細胞に核酸を送達することに成功することができたことを示した。
２）さらに、表１の種々の脂質を組み合わせた。２００μｌの脂質組合せのジエチルエ
ーテル溶液（番号１／２／４／９／１８／１９／２０／２１／２２／２３／２４／２５／
２６／２７／２８／２９の脂質組合せの場合は０．００３２６ｍｇ／ｍＬ、番号３／８／
１０／１３の脂質組合せの場合は０．００６５２ｍｇ／ｍＬ、番号５／１６／１７の脂質
組合せの場合は０．０００６５２ｍｇ／ｍＬの濃度を有する）および３μｌの脂質組合せ
のクロロホルム溶液（番号１／２／４／９／１８／１９／２０／２１／２２／２３／２４
／２５／２６／２７／２８／２９の脂質組合せの場合は５ｍｇ／ｍＬ、番号３／８／１０
／１３の脂質組合せの場合は１０ｍｇ／ｍＬ、番号１５／１６／１７の脂質組合せの場合
は１ｍｇ／ｍＬの濃度を有する）を調製した。上記脂質を等容積で混合して、混合脂質を
得、下記に記載されているように、それぞれ逆相蒸散法および煮沸法により脂質核酸混合
物を調製した。ステップ３．１～３．３による脂質核酸混合物を使用してｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ送達実験を実施し、細胞内ＲＮＡの存在量を決定した。
逆相蒸散法による脂質組合せおよび核酸の混合物の調製：
２００μｌの脂質組合せのジエチルエーテル溶液を、脂質溶液とＲＮＡとの間の５：１
の容積比で、４０μｌのＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７水溶液（５μＭ）に添加し、３分間超音
波処理した。ジエチルエーテルを、５５℃での蒸発により除去し、その後水和のために２
００μｌのＤＥＰＣ水を添加して、脂質核酸混合物を得た。
煮沸法による脂質組合せおよび核酸の混合物の製造：
３μｌの脂質組合せのクロロホルム溶液を、１００μｌのＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７水溶
液（２μｌ）と混合し、１００℃で３０分間加熱した。
実験結果を図５～８に示した。図５～６は、逆相蒸散法により調製した脂質組合せおよ
び核酸の混合物が、標的細胞内への核酸の進入を容易にすることに成功することができた
ことを示した。図７～８は、煮沸法による脂質組合せおよび核酸の混合物が、標的細胞内
への核酸の進入を容易にすることに成功することができたことを示した。
３）表１に示されている様々なタイプの脂質、例えば、ＴＧ混合物およびＤＧ混合物な
どを組み合わせ、それぞれ逆相蒸散法および煮沸法により脂質核酸混合物の調製に使用し
た。ステップ３．１～３．３による脂質核酸混合物を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ送達実験
を実施し、細胞内ＲＮＡの存在量、細胞内局在化、および標的領域を決定した。
様々なタイプの脂質を、以下のように組み合わせた。
組合せ１：脂質番号１～３２、番号１／２／３／４／６／８／９／１０／１３～３２の
組合せ、但し、脂質番号５、７、１１、および１２は含まない、
組合せ２：脂質番号２９を含まない組合せ１、
組合せ３：脂質番号１、２、３、１９を含まない組合せ１、
組合せ４：脂質番号４、１４を含まない組合せ１、
組合せ５：脂質番号６、９、１０、１３、１５、１６、１８、２０～２８、３２を含ま
ない組合せ１、
組合せ６：脂質番号８を含まない組合せ１、
組合せ７：脂質番号１７、３０、３１を含まない組合せ１、
ＦＡ：脂質番号２９、
ＤＧ組合せ：脂質番号１、２、３、１９の組合せ、
Ｃｅｒ組合せ：脂質番号４、１４の組合せ、
ＴＧ組合せ：脂質番号６、９、１０、１３、１５、１６、１８、２０～２８、３２の組
合せ、
ＰＥ組合せ：脂質番号８、
Ｓｏ組合せ：脂質番号１７、３０、３１の組合せ。
実験結果を図９～１０に示した。結果は、異なる方法（煮沸または逆相蒸散）による様
々なタイプの脂質組合せ（例えば、ＴＧの混合物、ＤＧの混合物など）が、標的細胞内へ
の核酸の進入を促進することができたことを示した。
４）さらに、脂質番号１１および番号１２を、異なる配列を有する核酸を送達する核酸
の効率、ならびに核酸の局在化および標的遺伝子領域を調査するための実験のために選択
した。プロトコールは以下の通りであった。
大豆ＰＣ、脂質番号１１（１８：０／１８：２）および脂質番号１２（１６：０／１８
：２）ならびに種々の小分子ＲＮＡ（下記の表３を参照）の混合物を、逆相蒸散法により
調製し、その後、Ａ５４９細胞株に添加した（ｓＲＮＡの終濃度は、２００ｎＭであった
）。陰性対照群（対照）を、同じ濃度のｓＲＮＡに直接添加した。陽性対照群（ＲＮＡｉ
ｍａｘ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉｍａｘ（トランスフェクション試薬
６μｌ／ウェル）でトランスフェクトした。細胞内のｓＲＮＡの存在量を、３時間後にＴ
ａｑｍａｎプローブにより検出し、ｓＲＮＡの相対的発現レベルを、２－ΔＣｔ法により
算出した。
実験結果を図１１～１３に示した。図１１Ａ～Ｃは、対照と比較して、２つの脂質（脂
質番号１１（１８：０／１８：２）および脂質番号１２（１６：０／１８：２））が、異
なる配列を有する核酸分子の種々の細胞内への進入を効果的に促進することができたこと
を示した。図１２は、脂質番号１１（１８：０／１８：２）および脂質番号１２（１６：
０／１８：２）により送達された核酸が、細胞質内に進入し、主に細胞質に局在化された
ことを示した。加えて、図１３を参照すると、本発明者は、意外にも、脂質番号１１およ
び番号１２が両方とも、核酸の小断片の進入を促進し、それらの標的遺伝子の野生型３’
ＵＴＲｓにそれらが作用し、標的遺伝子の野生型３’ＵＴＲを有するルシフェラーゼの相
対的発現レベルを低減させたが、それらの標的遺伝子の変異３’ＵＴＲには作用しなかっ
たことを見出した。それは、核酸薬を送達するための手段として使用することができる。
４．脂質核酸混合物のｉｎ ｖｉｖｏ送達実験
４．１ 実験ステップ
１．脂質核酸混合物の調製：脂質番号１１または番号１２と核酸との混合物、ならびに
番号１／２／４／９／１４／１８／１９／２０／２１／２２／２３／２４／２５／２６／
２７／２８／２９／３０／３２、番号３／８／１０／１１／１２／１３、および番号６／
１５／１６／１７／３１の脂質組合せと核酸との混合物を、逆相蒸散法および煮沸法によ
り調製した（ステップ２．１～２．２を参照）。
２．胃管栄養を、６～８週齢の雄Ｃ５７マウスに対して２００μｌ／動物で実施し、以
下のようにグループ化した。
（１）対照群（自由取込み群）：無処置、または胃管栄養によりＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ
７を投与した。
（２）脂質番号１１（１８：０／１８：２）群：胃管栄養により、脂質番号１１（１８
：０／１８：２）か、脂質番号１１（１８：０／１８：２）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ
７の混合物を投与した。
（３）脂質番号１２（１６：０／１８：２）群：胃管栄養により、脂質番号１２（１６
：０／１８：２）か、脂質番号１２（１６：０／１８：２）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ
７の混合物を投与した。
３．試料収集：胃管栄養の６時間後、マウス全血（５００μｌ）および肺（１１０ｍｇ
）を、それぞれ１．５ｍＬのＴＲＩｚｏｌ－ＬＳまたは３ｍＬのＴＲＩｚｏｌにより収集
し、ホモジナイズし、その後保管のために－８０℃下で凍結した。
４．全ＲＮＡ抽出：（１）ＴＲＩｚｏｌまたはＴＲＩｚｏｌ－ＬＳ溶解緩衝液（Ｓｉｇ
ｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を細胞に添加し、その後、室温で５分間静置して完全に
溶解させた（マウス肺組織の場合、１．０ｍＬのＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液を１００ｍｇの
組織に添加し、溶液をホモジナイザーで粉砕し、４℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠
心分離して、ホモジナイズされなかった組織沈殿物を除去した。マウス全血の場合、１．
５ｍＬのＴＲＩｚｏｌ－ＬＳ溶解緩衝液を５００μｌの全血に添加し、４℃で１０分間１
２，０００ｒｐｍで遠心分離して、完全に開裂されていない沈殿物を除去した）。（２）
４℃で５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、沈殿物を廃棄する。（３）クロロホルム
を２００μｌ／ｍＬ ＴＲＩｚｏｌの比率で添加し、ボルテックスして混合し、室温で１
５分間静置させる。（４）４℃で１５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上部水相を
別の遠心分離チューブにピペットする。（５）ステップ４を反復し、等量のクロロホルム
を上部水相に添加し、十分に混合し、室温で１０分間維持させ、４℃で１５分間１２，０
００ｒｐｍで遠心分離する。（６）上部水相を吸い出して、新たなＥＰチューブに移し、
イソプロパノールを０．５ｍｌ／ｍＬのＴＲＩｚｏｌの比率で添加し、混合し、室温で５
～１０分間維持させる。（７）４℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、沈殿物
を廃棄する。（８）１ｍＬの７５％エタノールを添加し、遠心分離チューブを穏やかに振
盪し、沈殿物を懸濁させる。（９）４℃にて５分間８０００ｇで遠心分離し、沈殿物をで
きるだけ廃棄する。（１０）室温で５～１０分間乾燥し、ＲＮＡ試料を、５０μｌのＤＥ
ＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解する。
５．ＲＴ－ｑＰＣＲ検出：上記セクション３．３．１および３．３．２に記載されてい
る方法を参照されたい。
４．２ 実験結果
図１４を参照すると、本発明者は、意外にも、脂質番号１１（１８：０／１８：２）お
よび脂質番号１２（１６：０／１８：２）が、（非侵襲性）胃管栄養により、血液および
肺内への核酸の小断片の進入を促進することができたことを発見した。それらは、核酸薬
を送達するための手段として使用することができる。驚くべきことに、直接煮沸法により
得られた脂質核酸混合物は、著しい送達効果を達成した。
図１５を参照すると、本発明者は、驚くべきことに、２８個の脂質の混合物が、（非侵
襲性）胃管栄養により、血液中への核酸の小断片の進入を容易にすることができたことを
見出した。それらは、核酸薬を送達するための手段として使用することができる。驚くべ
きことに、直接煮沸法により得られた脂質組合せと核酸との混合物は、著しい送達効果を
達成した。
表１に番号１～７１として示されている脂質の実施例
方法
１．伝統的漢方薬からの脂質の抽出
１．１ 漢方薬の煎出
１）１００ｇの漢方薬煎出片（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔｏｎｇｒｅｎｔａｎｇ ｐｈａｒｍ
ａｃｙから購入したロディオラ・クレヌラータ、モウコタンポポ、スイカズラ、およびア
ンドログラフィス・パニクラータ）を１０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏに添加し、３０分間浸漬
した。
２）漢方薬煎出ポットを、激しく加熱して１５分間、およびゆっくりと加熱して２０分
間煮沸した。
３）４００ｍＬの加熱した漢方薬スープを、ロータリーエバポレータに添加し、６０℃
、６０ｒｐｍで３０分間にわたって１００ｍＬに濃縮した。
１．２ 脂質抽出
１）１６０ｍｌの漢方薬スープ（ロータリーエバポレータにより濃縮した）に、クロロ
ホルム－メタノール混合物（クロロホルム：メタノール＝１：２、ｖ／ｖ）６００ｍＬを
添加して、クロロホルム：メタノール：水＝１：２：０．８にし、１０～１５分間撹拌し
て混合した。
２）２００ｍＬのクロロホルムを、エルレンマイヤーフラスコに添加し、１０分間撹拌
して混合した。
３）２００ｍＬのｄｄＨ２Ｏを、エルレンマイヤーフラスコに添加して、クロロホルム
：メタノール：水＝２：２：１：８にし、１０分間撹拌して混合した。
４）上部層の液体および中間層の不溶性物質を除去し、下部層のクロロホルム層を取り
出し、－４０℃で保管した。
１．３ 脂質成分のＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ同定
機器設定
１）クロマトグラフィー設定：
機器：Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００；カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（１００×２．１
ｍｍ、１．９μｍ）；カラム温度：４５℃；移動相Ａ：アセトニトリル：水（Ｖ／Ｖ、６
０：４０）、１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウムを含む溶液、移動相Ｂ：アセトニトリル
：イソプロパノール（１０：９０、Ｖ／Ｖ）、１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウムおよび
０．１％ギ酸を含む溶液。流速：０．４ｍＬ／分；インジェクション容積：４μｌ。
２）質量分析パラメーター：
ａ）ポジティブモード：ヒーター温度３００℃、シースガス流速、４５ａｒｂ、補助ガ
ス流速、１５ａｒｂ、スイープガス流速、１ａｒｂ、スプレー電圧、３．０ｋＶ、キャピ
ラリー温度、３５０℃、Ｓ－レンズＲＦレベル、３０％。スキャン範囲：２００～１５０
０。
ｂ）ネガティブモード：ヒーター温度３００℃、シースガス流速、４５ａｒｂ、補助ガ
ス流速、１５ａｒｂ、スイープガス流速、１ａｒｂ、スプレー電圧、２．５ｋＶ、キャピ
ラリー温度、３５０℃、Ｓ－レンズＲＦレベル、６０％。スキャン範囲：２００～１５０
０。
１．４ 漢方薬に由来する脂質の同定
脂質成分をＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより同定した。伝統的漢方薬に由来する合計１３８
個の脂質成分を同定した。そのうち１２５個はポジティブモードで、１３個はネガティブ
モードで同定した。表１に示されている化合物１～６９に対して、以下の実験を実施した
。なお、下記で試験した脂質はすべて、表１－１に記載されているように、商業的に購入
されたかまたは商業的に合成され、使用されたことが留意されるべきである。
２．脂質核酸混合物の製造
２．１ 逆相蒸散法：
１００μｌの脂質のジエチルエーテル溶液を調製し、表１に示されている脂質番号に従
ってグループ化した（脂質濃度は、下記の表に示されている）。脂質溶液に、２０μｌの
核酸溶液（ＨＪＴ ｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）を５：１の容積比で添加し、３分後に超
音波処理した。ジエチルエーテルを、５５℃での蒸発により除去し、その後、水和のため
に１００μｌのＤＥＰＣ水を添加し、核酸脂質混合物を得た。
Figure 2023078392000024
２．２ 煮沸法：
１００μＬの核酸溶液（ＨＪＴ ｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）を、２～５μＬの脂質溶
液に添加し（濃度は表１に示されている）、混合し、８０～１００℃で１５～３０分間加
熱して、核酸脂質混合物を得た。
３．脂質核酸混合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ送達実験
３．１ 脂質により送達された核酸の細胞内発現のリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑ
ＰＣＲ）検出。
３．１．１ ＭＲＣ－５細胞（肺胚線維芽細胞）、Ａ５４９細胞（ヒト肺腺癌細胞）、
Ｃａｃｏ－２細胞（ヒト結腸腺癌細胞）（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ
ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから
購入した）を対数増殖期まで培養し、その後、６×１０５／１ｍＬ培地／ウェルの細胞密
度で１２－ウェルプレートにプレーティングした。ＭＲＣ－５およびＣａｃｏ－２細胞を
、イーグルＭＥＭ培地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）で培養し、Ａ５４９細胞をハムＦ－１２培
地（ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養し、その後３７℃で一晩インキュベーションし、細胞が壁面
に付着した後で追跡実験を実施した。
３．１．２ 実験群は以下の通り。
１）ナイーブ群：これは、未処理細胞を指し、この群は、ブランク対照群としての役目
を果たした。
２）ＲＮＡｉｍａｘ処理群：２μｌ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉｍ
ａｘトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸの正式名
称、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およ
びＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した）でそれぞれ
希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。Ｈ
ＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。この群は、陽性対照群としての
役目を果たした。
３）自由取込み群：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎ
Ｍであった）。この群は陰性対照群としての役目を果たした。
４）脂質核酸混合物：ステップ２で調製した脂質およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の混合
物を、細胞に添加し、混合した。ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであっ
た。
３．１．３ 細胞と共に１２～２４時間共インキュベーションした後、細胞を、ＰＢＳ
で２回洗浄した。細胞を、ＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購
入した）を用いて回収し、全ＲＮＡを抽出した。細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７
の存在量を、ＲＴ－ｑＰＣＲにより検出した。プロトコールは以下の通りであった。
１）全細胞ＲＮＡの抽出：
Ａ． １２－ウェルプレートで培養された細胞（約１×１０６細胞／ウェル）に対して
、１ｍＬ ＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液を各ウェルに添加し、その後氷上に置いた。試料すべ
てにＴＲＩｚｏｌを添加した後、室温で５分間静置させて、完全に溶解させた。
Ｂ． ４℃で５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、ペレットを廃棄し、新たな遠心
分離チューブにＴＲＩｚｏｌを移す。
Ｃ． ２００μＬクロロホルム／ｍＬ ＴＲＩｚｏｌの比率でクロロホルムを添加し、
混合し、室温で５分間静置させる。
Ｄ． ４℃で１５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離する。
Ｅ． 上部水相を別の遠心分離チューブにピペットし、０．５ｍＬイソプロパノール／
ｍＬ ＴＲＩｚｏｌの比率でイソプロパノールを添加し、室温で５～１０分間静置させる
。
Ｆ． ４℃で１５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄し、ＲＮＡがチュ
ーブの底部に沈殿することを可能にする。
Ｇ． １ｍＬの７５％エタノールを添加し、チューブを穏やかに振盪して、沈殿物を懸
濁させる。
Ｈ． ４℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄し、１ｍＬの７５
％エタノールを添加し、遠心分離チューブを穏やかに振盪して、沈殿物を懸濁させる。
Ｉ． ４℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄し、室温で乾燥し
、ＲＮＡ試料を５０μＬの無ＲＮａｓｅ Ｈ２Ｏに溶解し、ＯＤ値を測定することにより
ＲＮＡ濃度を定量化する。
２）全ＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。逆転写キット（高容量ｃＤＮＡ逆転写キット
、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３６８８１３）を使用して、
ステム－ループ法によりｓＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した（例えば、ｓｔｅｍ－ｌｏｏ
ｐ ＲＴ－ＰＣＲ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００５ Ｎｏｖ ２７；３
３（２０）：ｅ１７９によるマイクロＲＮＡのリアルタイム定量化を参照。この文献は、
参照により本明細書に組み込まれる）。逆転写系は以下の通りであった：鋳型ＲＮＡ（１
５０ｎｇ／μＬ）１０μＬ、１０×ＲＴ緩衝液２．０μＬ、２５×ｄＮＴＰミックス（１
００ｍＭ）０．８μＬ、Ｕ６ ＲＴステム－ループプライマー２．０μＬ、ＨＪＴ－ｓＲ
ＮＡ－ｍ７ ＲＴステム－ループプライマー２．０μＬ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（商標
）逆転写酵素１．０μＬ、ＲＮａｓｅ阻害剤１．０μＬ、無ヌクレアーゼＨ２Ｏ １．２
μＬを、短時間遠心分離した後、ＰＣＲ反応器にロードした。反応条件は以下の通りであ
った：（１）２５℃、１０分間；（２）３７℃、１２０分間；（３）８５℃、５分間；（
４）４℃、反応停止。反応後に２０μｌの無ＲＮａｓｅ ｄｄＨ２Ｏを添加して、最終容
積を４０μｌにした。逆転写プロセスに使用したステム－ループプライマーは、Ｂｅｉｊ
ｉｎｇ Ｔｓｉｎｇｋｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により合成さ
れた（Ｕ６ ＲＴプライマー、ＲＴ－ｑＰＣＲ反応による小分子ＲＮＡの定量化は、相対
的であるに過ぎない場合があるため、相対発現レベルを算出するための標準参照遺伝子と
してＵ６を使用した）：ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴ
ＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＡＡＡＴＡＴＧ；ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ ＲＴス
テム－ループプライマー：ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴ
ＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＧＣＴＴＡＣＡＡ）。
３）定量ＰＣＲ増幅反応：ｑＰＣＲ反応系は、５μＬの２×ＳＹＢＲグリーンマスター
ミックス、０．５μｌのフォワードプライマー（１０μＭ）、０．５μｌのリバースプラ
イマー（１０μＭ）、逆転写による１μｌのｃＤＮＡ、３μｌの無ＲＮａｓｅ ｄＨ２Ｏ
を含む、１０μｌの全容積を有していた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０蛍光定量ＰＣＲ
機器を使用した。ＰＣＲ反応条件は、以下の通りであった：プレ変性のために９５℃で５
分間、その後ＰＣＲ増幅サイクル：（１）９５℃、１０秒間；（２）５５℃、１０秒間；
（３）７２℃、２０秒間；合計４０サイクル；最後に４０℃で１０秒間の冷却。増幅反応
のフォワードおよびリバースプライマーは両方とも、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔｓｉｎｇｋｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により設計および合成された（Ｕ６フォ
ワードプライマー：ＧＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧＴＴＣ、Ｕ６リバースプライマー：
ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７フォワードプライマー：Ｔ
ＣＧＣＧＣＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴ、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７リバースプライマー
：ＧＴＧＣＡＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴ）。
４）２－ΔＣｔ法（相対的遺伝子発現レベル＝２－（Ｃｔ標的遺伝子－Ｃｔ内部基準遺
伝子））を使用して、進入の相対量（一本鎖または二本鎖ＲＮＡ）を算出した。
３．２ ｍＲＮＡ発現レベルのリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）検出
３．２．１ ＴＨＰ－１細胞（ヒト単球）を対数増殖期まで培養し、その後、６×１０
５／１ｍＬ培地の細胞密度で１２－ウェルプレートにプレーティングした。ＴＨＰ－１細
胞を、ＲＰＭＩ－１６４０培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養した。細胞を３７℃で一晩イン
キュベートし、細胞が壁面に付着した後で追跡実験を実施した。
３．２．２ 実験群は以下の通りであった。
１）ナイーブ群：未処理ＴＨＰ－１細胞を指し、この群は、ブランク対照群としての役
目を果たした。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉｍ
ａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および核酸溶液（ＴＮＦα ｓｉＲＮＡ）を、１００μｌのｏｐ
ｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ）でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し
、その後混合した。核酸の終濃度は、４００ｎＭであった。この群は、陽性対照群として
の役目を果たした。
３）自由取込み群：核酸溶液（ＴＮＦα ｓｉＲＮＡ）を、直接添加した（終濃度は４
００ｎＭであった）。この群は陰性対照群としての役目を果たした。
４）脂質核酸混合物：ステップ２で調製した脂質および核酸の混合物を、細胞に添加し
、混合した。核酸の終濃度は、４００ｎＭであった。
３．２．３ 処理の２４時間後、細胞を、１μｇ／ｍＬ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ
（リポポリサッカリド、ＬＰＳ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０１１１
：Ｂ４、Ｌ４３９１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激し、９時間後にＴＲＩｚｏｌ
溶解緩衝液を使用して回収して、全ＲＮＡを抽出した。ＴＮＦ－αのｍＲＮＡ発現レベル
（ケースバイケースで異なる以下の実施例の標的遺伝子は図に示した）を、ＲＴ－ｑＰＣ
Ｒ（ＳＹＢＲグリーン色素法）により決定した。プロトコールは以下の通りであった。
１）細胞からの全ＲＮＡの抽出：手順は、セクション３．１．３の全ＲＮＡの抽出法と
同じであった。
２）全ＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。逆転写キット（高容量ｃＤＮＡ逆転写キット
、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３６８８１３）を使用して全
ＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。逆転写系は以下の通りであった：鋳型ＲＮＡ（１５０
ｎｇ／μＬ）１０μＬ、１０×ＲＴ緩衝液２．０μＬ、２５×ｄＮＴＰミックス（１００
ｍＭ）０．８μＬ、ランダムプライマー２．０μＬ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（商標）逆
転写酵素１．０μＬ、ＲＮａｓｅ阻害剤１．０μＬ、無ヌクレアーゼＨ２Ｏ ３．２μＬ
を、短時間遠心分離した後、ＰＣＲ反応器にロードした。反応条件は以下の通りであった
：（１）２５℃、１０分間；（２）３７℃、１２０分間；（３）８５℃、５分間；（４）
４℃、反応停止。反応後に２０μｌの無ＲＮａｓｅ ｄｄＨ２Ｏを添加して、最終容積を
４０μｌにした。
３）定量ＰＣＲ増幅反応：ｑＰＣＲ反応系の全容積は、５μＬの２×ＳＹＢＲグリーン
マスターミックス、０．５μｌのフォワードプライマー（１０μＭ）、０．５μｌのリバ
ースプライマー（１０μＭ）、逆転写による１μｌのｃＤＮＡ、３μｌの無ＲＮａｓｅ
ｄＨ２Ｏを含む１０μｌであった。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０蛍光定量ＰＣＲ機器を
使用した。ＰＣＲ反応条件は、以下の通りであった：プレ変性のために９５℃で５分間、
その後ＰＣＲ増幅サイクル：（１）９５℃、１０秒間；（２）５５℃、１０秒間；（３）
７２℃、２０秒間；合計４０サイクル；最後に４０℃で１０秒間の冷却。増幅反応のフォ
ワードおよびリバースプライマーは両方とも、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｑｉｎｇｋｅ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により設計および合成された。プライマー配列は
以下の通りであった：内部基準遺伝子ＵＢＣのフォワードプライマー：ＣＴＧＧＡＡＧＡ
ＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＣＴＧ、内部基準遺伝子ＵＢＣのリバースプライマー：ＧＧＴＣＴ
ＴＧＣＣＡＧＴＧＡＧＴＧＴＣＴ；標的遺伝子ＴＮＦ－αのフォワードプライマー：ＣＴ
ＧＣＣＣＣＡＡＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴ：標的遺伝子ＴＮＦ－αのリバースプライマー：Ｃ
ＣＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＴＴＴＧＡＧＣＣ。
４）相対発現レベルを、上記に記載のように２－ΔＣｔ法により算出した。
３．３ タンパク質発現レベルのウエスタンブロット検出
３．３．１ ＭＲＣ－５細胞（肺胚繊維芽細胞）およびＡ５４９細胞（ヒト肺腺癌細胞
）を対数増殖期まで培養し、その後、６×１０５／１ｍＬ培地／ウェルの細胞密度で１２
－ウェルプレートにプレーティングした。ＭＲＣ－５細胞を、イーグルＭＥＭ培地（ＭＥ
Ｍ、Ｇｉｂｃｏ）で培養し、Ａ５４９細胞を、ハムＦ－１２培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）で培
養した。その後、３７℃で一晩インキュベーションし、細胞が壁面に付着した後、追跡実
験を実施した。
３．３．２ 実験群は以下の通りであった。
１）ナイーブ群：これは、未処理細胞を指し、この群は、ブランク対照群としての役目
を果たした。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉｍ
ａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および核酸溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でそれぞれ希釈
し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。核酸の
終濃度は、４００ｎＭであった。この群は、陽性対照群としての役目を果たした。
３）自由取込み群：核酸溶液を、直接添加した（終濃度は４００ｎＭであった）。この
群は陰性対照群としての役目を果たした。
４）脂質核酸混合物：ステップ２で調製した脂質および核酸の混合物を、細胞に添加し
、混合した。核酸の終濃度は、４００ｎＭであった。
３．３．３ 処理の２４時間後、細胞を、刺激剤（二本鎖ＲＮＡウィルス模倣体として
の１μｇ／ｍＬポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｐ１５３０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）または３ｎ
ｇ／ｍＬ形質転換増殖因子ＴＧＦβ１（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ））で刺激した。細胞を、
強力なＲＩＰＡ溶解緩衝液を使用して回収し、しばらくの間インキュベーションした後、
ウエスタンブロットを使用して、関連遺伝子のタンパク質発現レベルを検出した（関連遺
伝子のタイプは、ケースバイケースで異なり、対応する図に示した）（ＲＥＬ－Ａのタン
パク質発現レベルを、Ａ５４９細胞を内部標準タンパク質としてのβ－アクチンと共にポ
リ（Ｉ：Ｃ）により刺激した２４時間後に検出し、フィブロネクチンおよびα－ＳＭＡの
タンパク質発現レベルを、ＭＲＣ－５細胞を内部標準タンパク質としてのＧＡＰＤＨと共
にＴＧＦ－β１で刺激した７２時間後に検出し、対応するノックダウン遺伝子のタンパク
質発現を、内部標準タンパク質としてのβ－アクチンを用いたｓｉＲＮＡ送達アッセイで
検出した）。プロトコールは以下の通りであった。
１）タンパク質試料の収集およびＢＣＡ法による濃度の決定。
Ａ． 培地を廃棄し、１ｍＬのＰＢＳ緩衝液を、１２－ウェルプレートの各ウェルに添
加して、細胞を１回洗浄し、１００μＬの予冷強力ＲＩＰＡ溶解緩衝液を各細胞に添加し
、ピペットチップで細胞を掻爬し、遠心分離チューブに移し、溶解のために２０分間氷上
に置いて維持する。
Ｂ． ４℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を新たな遠心分離チュー
ブに移す。
Ｃ． ＢＣＡ試薬ＡおよびＢ（５０：１、ｖ／ｖ）を徹底的に混合して、ＢＣＡ作業溶
液を調製する。
Ｄ． ２５μＬの新たに調製したＢＳＡ標準溶液および試験しようとする試料を、９６
－ウェルプレートに添加し、２００μＬのＢＣＡ作業溶液を各ウェルに添加し、十分に混
合し、３７℃で３０分間インキュベートする。
Ｅ． 紫外分光光度計（Ｓｙｎｅｒｇｙ４多機能マイクロプレートリーダー）を使用し
て、５６２ｎｍの吸光度を測定し、標準曲線により試料中のタンパク濃度を算出する。
Ｆ． 各試料の濃度が同じになるように、ＲＩＰＡ溶解緩衝液およびローディング緩衝
液で各試料の濃度を調整する。
Ｇ． ９５℃で１０分間変性させる。
２）ウエスタンブロット
Ａ． ゲル調製：１０％の濃度を有する分離ゲル（下層ゲル）、および５％の濃度を有
する濃縮ゲル（上層ゲル）を使用した。１５－ウェルコムでレーンを作り、等量のタンパ
ク質を各レーンにロードした。
Ｂ． タンパク質電気泳動：電気泳動緩衝液を添加し、８０Ｖの初期電圧を電気泳動に
使用する。ブロモフェノールブルー色素が分離ゲルに到達したら、電圧を１２０Ｖに上昇
させ、ブロモフェノールブルー色素が底部に到達し、分離ゲルを完全に通り抜けるまで電
気泳動を継続する。
Ｃ． 湿式転写：以下の順序：転写パッド（陽極）－スポンジ－濾紙－ゲル－ＰＶＤＦ
膜－濾紙－スポンジ－転写パッド（陰極）のアッセンブリを製作し、アッセンブリを取り
付け、転写デバイス全体を４℃の低温庫に入れ、定電流を３００ｍＡに設定して、１２０
分間の転写を行う。
Ｄ． ブロッキング：移転後に膜を３％ＢＳＡブロッキング溶液に入れ、室温で１時間
ブロッキングする。
Ｅ． 一次抗体インキュベーション：ブロッキングしたＰＶＤＦ膜をハイブリダイゼー
ションバッグに移し、対応する一次抗体（一次抗体情報は、以下の通りであった）を含む
３％ＢＳＡブロッキング溶液を添加し、バッグから気泡を除去し、４℃で一晩インキュベ
ートする。
Figure 2023078392000025
Ｆ． 膜洗浄：ＰＶＤＦ膜を取り出し、膜を、ＴＢＳＴで３回、各回１０分間洗浄する
。
Ｇ． 二次抗体インキュベーション：ＴＢＳＴを廃棄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）を有するヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス二次抗体（Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｌｉ
ａｎｋｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した）を含む３％Ｂ
ＳＡブロッキング溶液（二次抗体の希釈率は１：５０００であった）を添加し、室温で１
時間インキュベートする。
Ｈ． 膜洗浄：膜を、ＴＢＳＴで３回、各回１０分間洗浄する。
Ｉ． 現像：ウエスタン用現像溶液（１：１、Ｖ／Ｖ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入したＥＣＬ化学ルミネセンス現像溶液）を調製し、調製
した現像溶液を、タンパク質が結合している側の膜に均等に添加し、プラスチックラップ
で薄膜を注意深く包み、現像後に観察する。
Ｊ． 分析：分析は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して実施した。
４．脂質核酸混合物のｉｎ ｖｉｖｏ送達実験
４．１ 実験ステップ
１）脂質核酸混合物の調製：煮沸法を使用した。４００μＬのＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７
（５ｎｍｏｌ）一本鎖ＲＮＡのＤＥＰＣ処理溶液に、９μＬまたは１８μＬの脂質組合せ
（脂質ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号３２）、４：２：３、Ｖ／Ｖ
／Ｖ）をそれぞれ添加し、混合し、１００℃で３０分間加熱した。
２）６～８週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスに対するＲＮＡの胃内投与：ＨＪＴ－
ｓＲＮＡ－ｍ７水溶液、または脂質およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の混合物溶液を、胃管
栄養針を使用して４００μＬ／動物で投与した（ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７、５ｎｍｏｌ／
動物）。群は以下の通りであった：
Ａ． 対照群（ナイーブ群）：いかなる処置も受けなかったマウス、
Ｂ． 陰性対照群（脂質群）：９μＬの脂質組合せ（脂質ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（
番号３７）＆ＴＧ（番号３２）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）の胃内投与、
Ｃ． 自由取込み群：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖ＲＮＡ溶液の直接胃内投与、
Ｄ． 脂質および核酸混合物群：脂質組合せおよびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖ＲＮ
Ａの混合物の胃内投与。
３）試料収集：胃内投与の３時間後に、マウス肺全体を、３ｍＬのＴＲＩｚｏｌで溶解
し、ホモジナイズし、－８０℃で凍結した。
４）全ＲＮＡ抽出：
Ａ． ３．０ｍＬのＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液をマウス肺組織に添加し、ホモジナイザー
で粉砕し、４℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、ホモジナイズできなかった
組織沈殿物を除去する。
Ｂ． クロロホルムを２００μｌ／ｍＬ ＴＲＩｚｏｌの比率で添加し、十分に振盪し
て混合し、室温で１５分間維持する。
Ｃ． ４℃で１５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上部水相を別の遠心分離チュ
ーブにピペットする。
Ｄ． 上記のステップを反復し、等量のクロロホルムを上部水相に添加し、十分に混合
し、室温で１０分間維持する。
Ｅ． ４℃で１５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離する。
Ｆ． 上部水相を取り出して、新たなＥＰチューブに移し、イソプロパノールを０．５
ｍｌ／ｍＬ ＴＲＩｚｏｌの比率で添加し、混合し、室温で５～１０分間維持する。
Ｇ． ４℃で１５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄する。
Ｈ． １ｍＬの７５％エタノールを添加し、遠心分離チューブを穏やかに振盪し、沈殿
物を懸濁させる。
Ｉ． ４℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄する。
Ｊ． 室温で５～１０分間乾燥し、ＲＮＡ試料を、５０μｌのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶
解する。
５）ＲＴ－ｑＰＣＲ（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）によりＨＪＴ－ｓＲＮＡ
－ｍ７の存在量を検出する。
別様の指定がない限り、一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液は、ＤＥＰＣ処理水溶液中
の一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７を指す。二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液は、ＤＥＰ
Ｃ処理水溶液中の二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７を指す。
［実施例１－１］
様々なタイプの脂質組合せによるＭＲＣ－５細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群
１）ナイーブ群：未処理ＭＲＣ－５細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７のＤＥＰＣ処理水溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ
培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その
後混合した。一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は２００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は２
００ｎＭであった）。
４）脂質核酸混合物：煮沸法により処理した、３μＬの単一脂質または脂質組合せおよ
びＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡ
の終濃度は２００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの単一脂
質または脂質組合せのクロロホルム溶液（５ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号１／２／
４／９／１４／１８／１９／２０／２１／２２／２３／２４／２５／２６／２７／２８／
２９／３０／３２のクロロホルム溶液、および１０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号３
／８／１０／１１／１２／１３／３３／３４／３５／３６のクロロホルム溶液、１ｍｇ／
ｍＬの濃度を有する脂質番号６／１５／１６／１７／３１のクロロホルム溶液）を添加し
、１００℃で３０分間加熱した。
ａ）脂質組合せ：
ｂ）ＭＧ（モノグリセリド）：３μＬ脂質番号３４、
ｃ）ＤＧ（ジグリセリド）：等容積の脂質番号１／２／３／１９／３５のクロロホルム
溶液の３μＬ混合物、
ｄ）ＴＧ（トリグリセリド）：等容積の脂質番号６／９／１０／１３／１５／１６／１
８／２０／２１／２２／２３／２４／２５／２６／２７／２８／３２／３３のクロロホル
ム溶液の３μＬ混合物、
ｅ）ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：等容積の脂質番号３６／３７のクロロホル
ム溶液の３μＬ混合物、
ｆ）ＰＣ（ホスファチジルコリン）：等容積の脂質番号１１／１２のクロロホルム溶液
の３μＬ混合物、
ｇ）ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）：等容積の脂質番号８／３８のクロロホ
ルム溶液の３μＬ混合物、
ｈ）Ｃｅｒ（セラミド）：等容積の脂質番号４／１４のクロロホルム溶液の３μＬ混合
物、
ｉ）Ｓｏ：（スフィンゴシン）等容積の脂質番号１７／３０／３１のクロロホルム溶液
の３μＬ混合物、
ｊ） ＦＡ（脂肪酸）：３μＬの脂質番号２９、
ｋ）混合物：等容積の脂質番号１～３６（番号５／７を含まない）のクロロホルム溶液
の３μＬ混合物、
ｌ）混合物１：等容積の脂質番号１～３６（番号５／７／３４を含まない）のクロロホ
ルム溶液の３μＬ混合物、
ｍ）混合物２：等容積の脂質番号１～３６（番号５／７／１／２／３／１９／３５を含
まない）のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｎ）混合物３：等容積の脂質番号１～３６（番号５／７／６／９／１０／１３／１５／
１６／１８／２０／２１／２２／２３／２４／２５／２６／２７／２８／３２／３３を含
まない）のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｏ）混合物４：等容積の脂質番号１～３６（番号５／７／３６／３７を含まない）のク
ロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｐ）混合物５：等容積の脂質番号１～３６（番号５／７／１１／１２を含まない）のク
ロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｑ）混合物６：等容積の脂質番号１～３６（番号５／７／８を含まない）のクロロホル
ム溶液の３μＬ混合物、
ｒ）混合物７：等容積の脂質番号１～３６（番号５／７／４／１４を含まない）のクロ
ロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｓ）混合物８：等容積の脂質番号１～３６（番号５／７／２９を含まない）のクロロホ
ルム溶液の３μＬ混合物。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は２００ｎＭであった。細胞に添加し
た１２時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（ＳＹ
ＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉ
ｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅ
ｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖ
ｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記脂質組合せがすべて、自由取込み群と比較して、細胞内への核酸送
達に効果的であり（図１６を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性
を有していたことを示した。混合物２、混合物３、混合物５、混合物７により媒介された
核酸は、より多くの量がＭＲＣ－５細胞に進入した。
［実施例１－２］
脂質組合せによるＭＲＣ－５細胞およびＣａｃｏ－２細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
試験しようとする細胞は、ＭＲＣ－５細胞およびＣａｃｏ－２細胞であった。
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ
－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は２００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は２
００ｎＭであった）。
４）単一脂質および核酸による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの単一脂質（番
号１または８または１２）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細
胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は２００ｎＭであった。
５）脂質組合せ混合物および核酸混合物による処理群：煮沸法により処理した、３μＬ
の脂質組合せ（等容積で混合した番号１／８／１２）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本
鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は２００ｎＭであった
。
６）脂質組合せおよび核酸混合物による処理群：煮沸法により処理した、３μＬ脂質組
合せ（２μＬの単一脂質番号１または番号８または番号１２および１μＬの以下のタイプ
の脂質（ＭＧ、ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡ）の混合物）およびＨＪ
Ｔ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃
度は２００ｎＭであった。図１７Ａおよび１７Ｂでは、処理群を、まとめて、番号１ ２
μＬ＋ミックス １μＬ、番号８ ２μＬ＋ミックス １μＬ、および番号１２ ２μＬ
＋ミックス １μＬとして表し、横線内では、ＭＧは、２μＬの番号１または番号８また
は番号１２の単一脂質＋１μＬのＭＧを表し、ＤＧは、２μＬの番号１または番号８また
は番号１２の単一脂質＋１μＬのＤＧを表し、ＴＧは、２μＬの番号１または番号８また
は番号１２の単一脂質＋１μＬのＴＧを表し、ＬＰＣは、２μＬの番号１または番号８ま
たは番号１２の単一脂質＋１μＬのＬＰＣを表し、Ｃｅｒは、２μＬの番号１または番号
８または番号１２の単一脂質＋１μＬのＣｅｒを表し、Ｓｏは、２μＬの番号１または番
号８または番号１２の単一脂質＋１μＬのＳｏを表し、ＦＡは、２μＬの番号１または番
号８または番号１２の単一脂質＋１μＬのＦＡを表していた。
２．実験手順
１）煮沸法の条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの単一
脂質（５ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号１のクロロホルム溶液、１０ｍｇ／ｍＬの濃
度を有する脂質番号８／１２のクロロホルム溶液）または脂質組合せを添加し、１００℃
で３０分間加熱した。
ＭＧ（モノグリセリド）：２μＬの脂質番号３４、
ＤＧ（ジグリセリド）：等容積の脂質番号１／２／３／１９／３５のクロロホルム溶液
の２μＬ混合物、
ＴＧ（トリグリセリド）：等容積の脂質番号６／９／１０／１３／１５／１６／１８／
２０／２１／２２／２３／２４／２５／２６／２７／２８／３２／３３のクロロホルム溶
液の２μＬ混合物、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：等容積の脂質番号３６／３７のクロロホルム溶
液の２μＬ混合物、
Ｃｅｒ（セラミド）：等容積の脂質番号４／１４のクロロホルム溶液の２μＬ混合物、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：等容積の脂質番号１７／３０／３１のクロロホルム溶液の
２μＬ混合物、
ＦＡ（脂肪酸）：２μＬの脂質番号２９。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は２００ｎＭであった。細胞に添加し
た２４時間後、細胞内に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（Ｓ
ＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、ＭＲＣ－５細胞の場合、混合物（等容積で混合した番号１／８／１２）
、番号１ ２μＬ＋番号８ １μＬ、番号１ ２μＬ＋番号１２ １μＬ、番号１ ２μ
Ｌ＋ＭＧ １μＬ、番号８ ２μＬ＋ＭＧ １μＬ、番号１２ ２μＬ＋番号８ １μＬ
、および番号１２ ２μＬ＋Ｓｏ １μＬが、核酸をより効率的に送達したことを示した
。
Ｃａｃｏ－２細胞の場合、混合物（等容積の番号１／８／１２）、番号１ ２μＬ＋番
号８ １μＬ、番号１ ２μＬ＋番号１２ １μＬ、番号１ ２μＬ＋ＭＧ １μＬ、番
号８ ２μＬ＋ＭＧ １μＬ、番号１２ ２μＬ＋番号８ １μＬ、番号１２ ２μＬ＋
ＬＰＣ １μＬ、および番号１２ ２μＬ＋Ｓｏ １μＬが、核酸をより効率的に送達し
た。
［実施例１－３］
脂質組合せによる細胞内への一本鎖核酸の送達
細胞タイプ：Ａ５４９、ＭＲＣ－５、およびＣａｃｏ－２細胞。
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）単一脂質および核酸による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの単一脂質（番
号８または番号１２）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に
添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せＰＣ（番号１２）＆ＰＥ（番号８）および核酸混合物による処理群：煮
沸法により処理した、２．２５μＬの脂質組合せ（ＰＣ（番号１２）＆ＰＥ（番号８）、
２：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加
し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
６）脂質組合せおよび核酸混合物による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質
組合せ（２．２５μＬの脂質組合せＰＣ（番号１２）＆ＰＥ（番号８）および０．７５μ
Ｌの以下のタイプの脂質：ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、ＰＣ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合
物）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した
。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。図１８では、混合物処理群は、「２．２５μＬ
＋０．７５μＬ」の上方の横線内の処理群に対応する。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、単一脂質（１０
ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号８／１２のクロロホルム溶液）または脂質組合せを添
加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＤＧ（ジグリセリド）：等容積の脂質番号１／２のクロロホルム溶液の０．７５μＬ混
合物、
ＴＧ（トリグリセリド）：０．７５μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：等容積の脂質番号３６／３７のクロロホルム溶
液の０．７５μＬ混合物、
ＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：０．７５μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液
、
Ｃｅｒ（セラミド）：０．７５μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：０．７５μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：０．７５μＬの脂質番号２９。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。細胞に添加し
た２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（ＳＹ
ＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉ
ｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅ
ｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖ
ｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記単一脂質および脂質組合せがすべて、自由取込み群と比較して、細
胞内への核酸送達に効果的であり（図１８を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向
上させる可能性を有していたことを示した。
Ａ５４９、ＭＲＣ－５、およびＣａｃｏ－２細胞の場合、２．２５μＬのＰＣ（番号１
２）＆ＰＥ（番号８）＋０．７５μＬのＤＧ（等容積の脂質番号１／２のクロロホルム溶
液の混合物）が、最良の送達効率を達成した。
［実施例１－４］
脂質組合せによる細胞内への一本鎖核酸の送達
細胞タイプ：Ａ５４９、ＭＲＣ－５、およびＣａｃｏ－２細胞。
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）単一脂質および核酸による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの単一脂質（番
号８または番号１２）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に
添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）および核酸混合物
による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番
号８）＆ＰＣ（番号１２）、１：１：１、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一
本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであっ
た。
６）脂質組合せおよび核酸混合物による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質
組合せ（２μＬの脂質組合せＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）および
１μＬの以下のタイプの脂質：ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、ＰＣ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの
混合物）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合
した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。図１９では、混合物処理群は、２μＬの脂
質組合せＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）＋１μＬの上方の横線内の
処理群に対応する。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの単一脂
質（５ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号１のクロロホルム溶液、１０ｍｇ／ｍＬの濃度
を有する脂質番号８／１２のクロロホルム溶液）または脂質組合せを添加し、１００℃で
３０分間加熱した。
ＤＧ（ジグリセリド）：等容積の脂質番号１／２のクロロホルム溶液の１μＬ混合物、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：等容積の脂質番号３６／３７のクロロホルム溶
液の１μＬ混合物、
ＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：１μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。細胞に添加し
た２４時間後、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユ
ニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎ
ｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ
ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記脂質組合せが、自由取込み群と比較して、細胞内への核酸送達に効
果的であり（図１９を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有し
ていたことを示した。
Ａ５４９、ＭＲＣ－５、およびＣａｃｏ－２細胞の場合、２μＬのＤＧ（番号１）＆Ｐ
Ｅ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）＋１μＬのＴＧ（番号１５）が、最良の送達効率を達成
した。
［実施例１－５］
脂質組合せによる細胞内への一本鎖核酸の送達
細胞タイプ：Ａ５４９、ＭＲＣ－５、およびＣａｃｏ－２細胞。
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）単一脂質および核酸の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの番号８の単一脂質
およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。Ｒ
ＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せＰＥ（番号８）＆ＭＧ（番号３４）および核酸混合物の処理群：煮沸法
により処理した、２．２５μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆ＭＧ（番号３４）、２：
１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、
混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
６）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合
せ（２．２５μＬの脂質組合せＰＥ（番号８）＆ＭＧ（番号３４）および０．７５μＬの
以下のタイプの脂質：ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、ＰＣ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）
およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。Ｒ
ＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。図２０では、混合物処理群は、「２．２５μＬ［脂
質組合せＰＥ（番号８）＆ＭＧ（番号３４）］＋０．７５μＬ」の上方の横線内の処理群
に対応する。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、単一脂質（１０
ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号８のクロロホルム溶液）または脂質組合せを添加し、
１００℃で３０分間加熱した。
ＤＧ（ジグリセリド）：等容積の脂質番号１／２のクロロホルム溶液の０．７５μＬ混
合物、
ＴＧ（トリグリセリド）：０．７５μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：等容積の脂質番号３６／３７のクロロホルム溶
液の０．７５μＬ混合物、
ＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：０．７５μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液
、
Ｃｅｒ（セラミド）：０．７５μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：０．７５μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：０．７５μＬの脂質番号２９。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。細胞に添加し
た２４時間後、細胞内に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（Ｓ
ＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記単一脂質および脂質組合せが、自由取込み群と比較して、細胞内へ
の核酸送達に効果的であり（図２０を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させ
る可能性を有していたことを示した。
Ａ５４９、ＭＲＣ－５、およびＣａｃｏ－２細胞の場合、２．２５μＬのＰＥ（番号８
）＆ＭＧ（番号３４）＋０．７５μＬのＳｏ（番号３１）が、最良の送達効率を達成した
。
［実施例１－６］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）単一脂質および核酸による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの単一脂質番号
３８およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した
。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せおよび核酸混合物による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質
組合せ（２μＬの単一脂質番号３８および１μＬの以下のタイプの脂質：ＭＧ、ＤＧ、Ｔ
Ｇ、ＬＰＣ、ＰＣ、ＰＥ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ
－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎ
Ｍであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの単一脂
質（１０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号３８のクロロホルム溶液）または脂質組合せ
を添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＭＧ（モノグリセリド）：１μＬの脂質番号３４、
ＤＧ（ジグリセリド）：１μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号３７のクロロホルム溶液、
ＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）：１μＬの脂質番号８のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：１μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９のクロロホルム溶液。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。細胞に添加し
た２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（ＳＹ
ＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉ
ｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅ
ｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖ
ｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、Ａ５４９細胞の場合、上記の２μＬの単一の脂質番号３８および１μＬ
のＬＰＣ（番号３７）、ＴＧ（番号１５）、ＰＣ（番号１２）、ＤＧ（番号１）が、自由
取込み群と比較して、細胞内への核酸送達に効果的であったことを示した（図２１を参照
）。
［実施例１－７］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）および核酸混合
物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番号
３８）＆ＰＣ（番号１２）、１：１：１、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一
本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであっ
た。
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合
せ（２μＬの脂質組合せＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）および１
μＬの以下のタイプの脂質：ＭＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、ＰＥ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混
合物）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合し
た。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
Ｍｇ（モノグリセリド）：１μＬの脂質番号３４、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号３７のクロロホルム溶液、
ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）：１μＬの脂質番号８のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：１μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９のクロロホルム溶液。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。細胞に添加し
た２４時間後、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユ
ニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎ
ｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ
ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記の２μＬの脂質組合せＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（
番号１２）および１μＬのＴＧ（番号１５）、Ｃｅｒ（番号４）、Ｓｏ（番号３１）、Ｆ
Ａ（番号２９）、ＬＰＣ（番号３７）、ＰＥ（番号８）がすべて、自由取込み群と比較し
て、Ａ５４９細胞内への核酸送達に効果的であり（図２２を参照）、臨床の場面で核酸薬
の送達効率を向上させる可能性を有することを示した。
［実施例１－８］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）および核酸混合物の処理群：煮沸
法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）、２：１
、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混
合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合
せ（２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）および１μＬの以下のタイ
プの脂質：ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、ＰＣ、ＰＥ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）およ
びＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡ
の終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＤＧ（ジグリセリド）：１μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号３７のクロロホルム溶液、
ＰＣ（ホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）：１μＬの脂質番号８のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：１μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９のクロロホルム溶液。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。細胞に添加し
た２４時間後、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユ
ニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎ
ｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ
ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記の脂質組合せがすべて、細胞内へ核酸送達に効果的であり（図２３
を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有し、２μＬ脂の質組合
せＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）および１μＬのＬＰＣ（番号３７）が、最良の送
達効果を達成したことを示した。
［実施例１－９］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）および核酸混合物の処理群：煮沸
法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）、２：１
、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混
合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合
せ（２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）および１μＬの以下のタイ
プの脂質：ＭＧ、ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、ＰＥ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）およ
びＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡ
の終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＭＧ（モノグリセリド）：１μＬの脂質番号３４、
ＤＧ（ジグリセリド）：１μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号３７のクロロホルム溶液、
ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）：１μＬの脂質番号８のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：１μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（Ｓ
ＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記の脂質組合せが、細胞内へ核酸送達に効果的であり（図２４を参照
）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有し、２μＬ脂質組合せＰＥ（
番号３８）＆ＰＣ（番号４）および１μＬのＣｅｒ（番号４）が、最良の効果を達成した
ことを示した。
［実施例１－１０］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ（番号１）＆ＴＧ（番号１
５）および核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番
号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ（番号１）＆ＴＧ（番号１５）、２：２：２：３、Ｖ
／Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し
、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合
せ（２．２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ（番号１）＆Ｔ
Ｇ（番号１５）および０．８μＬの以下のタイプの脂質：ＭＧ、ＬＰＣ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、
またはＦＡの混合物）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に
添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＭＧ（モノグリセリド）：０．８μＬの脂質番号３４、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：０．８μＬの脂質番号３７のクロロホルム溶液
、
Ｃｅｒ（セラミド）：０．８μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：０．８μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：０．８μＬの脂質番号２９。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（Ｓ
ＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記の脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図２５を参
照）、２．２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ（番号１）＆
ＴＧ（番号１５）、２．２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ
（番号１）＆ＴＧ（番号１５）、および０．８μＬのＬＰＣ（番号３７）またはＳｏ（番
号３１）が、相対的により良好な送達効率を達成したことを示した。
［実施例１－１１］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉｍａｘ処理群：２μｌ ＲＮＡｉｍａｘトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）＆ＬＰＣ（番号３７）および核酸
混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＭＧ
（番号３４）＆ＬＰＣ（番号３７）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ
－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎ
Ｍであった。
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合
せ（２．２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）＆ＬＰＣ（番号３７）
および０．８μＬの以下のタイプの脂質：ＤＧ、ＴＧ、ＰＣ、Ｃｅｒ、またはＳｏの混合
物）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した
。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＤＧ（ジグリセリド）：０．８μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液
ＴＧ（トリグリセリド）：０．８μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＰＣ（ホスファチジルコリン）：０．８μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：０．８μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：０．８μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（Ｓ
ＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図２６を参照
）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。
［実施例１－１２］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）および核酸混
合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（
番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ
７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭで
あった。
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合
せ（２．２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）お
よび０．８μＬの以下のタイプの脂質：ＭＧ、ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、Ｓｏ、またはＦＡの
混合物）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合
した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＭＧ（モノグリセリド）：０．８μＬの脂質番号３４、
ＤＧ（ジグリセリド）：０．８μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＴＧ（トリグリセリド）：０．８μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：０．８μＬの脂質番号３７のクロロホルム溶液
、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：０．８μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：０．８μＬの脂質番号２９のクロロホルム溶液。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（Ｓ
ＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記の脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図２７を参
照）、２．２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）
および０．８μＬのＦＡ（番号２９）が、最良の送達効果を達成したことを示した。
［実施例１－１３］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）＆ＦＡ（番号
２９）および核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（
番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）＆ＦＡ（番号２９）、４４：２２：３
３：３６、Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、
細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合
せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）＆ＦＡ（番号２９）および
１μＬの以下のタイプの脂質の混合物）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の
混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＭＧ（モノグリセリド）：１μＬの脂質番号３４、
ＤＧ（ジグリセリド）：１μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号３７のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：１μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（Ｓ
ＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図２８を参照
）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。
［実施例１－１４］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｓｏ（番号３１）および核酸混
合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（
番号１２）＆Ｓｏ（番号３１）、２：１：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ
７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭで
あった。
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合
せ（２μＬのＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｓｏ（番号３１）および１μＬの以
下のタイプの脂質：ＭＧ、ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、Ｃｅｒ、またはＦＡの混合物）およびＨ
ＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終
濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＤＧ（ジグリセリド）：１μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＰＣ（ホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９のクロロホルム溶液。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（Ｓ
ＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記の脂質組合せが、細胞内へ核酸送達に効果的であり（図２９を参照
）、２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｓｏ（番号３１）および
１μＬのＦＡ（番号２９）が、最良の送達効果を達成したことを示した。
［実施例１－１５］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）＆ＬＰＣ（番号３７）＆Ｓｏ（番
号３１）および核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ
（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）＆ＬＰＣ（番号３７）＆Ｓｏ（番号３１）、４４：２２
：３３：３６、Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物
を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合
せ（２μＬのＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）＆ＬＰＣ（番号３７）＆Ｓｏ（番号３
１）および１μＬの以下のタイプの脂質：ＤＧ、ＴＧ、ＰＣ、Ｃｅｒ、またはＦＡの混合
物）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した
。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＤＧ（ジグリセリド）：１μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＰＣ（ホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９のクロロホルム溶液。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（Ｓ
ＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、自由取込み群と比較して、１μＬのＤＧ（番号１）、ＴＧ（番号１５）
、ＰＣ（番号１２）、Ｃｅｒ（番号４）、またはＦＡ（番号２９）を、２μＬのＰＥ（番
号３８）＆ＭＧ（番号３４）＆ＬＰＣ（番号３７）＆Ｓｏ（番号３１）を追加すると、細
胞内に核酸を効率的に送達することができ（図３０を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達
効率を向上させる可能性を有していたことを示した。１μＬのＰＣ（番号１２）の追加が
、最良の核酸送達効率を達成し、送達効率を増強することができた。
［実施例１－１６］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）および核酸混合物の処理群：煮
沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）、２
：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し
、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合
せ（２μＬのＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）および１μＬの以下のタイプの脂質
：ＭＧ、ＤＧ、ＴＧ、ＰＣ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）およびＨＪＴ－ｓＲＮ
Ａ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００
ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＭＧ（モノグリセリド）：１μＬの脂質番号３４、
ＤＧ（ジグリセリド）：１μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＰＣ（ホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：１μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９のクロロホルム溶液。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（Ｓ
ＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、自由取込み群と比較して、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効
果的であり（図３１を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有し
ていたことを示した。１μＬのＴＧ（番号１５）を、２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８
）＆ＬＰＣ（番号３７）に追加することにより、最良の核酸送達効果が達成された。
［実施例１－１７］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号１５）および核酸
混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＬＰ
Ｃ（番号３７）＆ＴＧ（番号１５）、３２：８：５、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮ
Ａ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００
ｎＭであった。
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合
せ（２μＬのＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号１５）および１μＬの
以下のタイプの脂質：ＭＧ、ＤＧ、ＰＣ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）およびＨ
ＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終
濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＭＧ（モノグリセリド）：１μＬの脂質番号３４、
ＤＧ（ジグリセリド）：１μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＰＣ（ホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：１μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９のクロロホルム溶液。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（Ｓ
ＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図３２を参照
）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。脂質
組合せＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号１５）は、核酸を効率的に細
胞内へと送達した。他のタイプの脂質を、脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３
７）＆ＴＧ（番号１５）にさらに付加しても、この効果は増強されなかった。
［実施例２－１］
脂質組合せによるＭＲＣ－５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）単一脂質および核酸の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの単一脂質番号３８
およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。Ｒ
ＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合
せ（２μＬの単一脂質番号３８および１μＬの脂質番号８、１、２、１１、１２、３４、
３７、４、３０、３１、２９、３２、１＋２（等容積で混合）、または１１＋１２（等容
積で混合）の混合物のクロロホルム溶液）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液
の混合物を細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの単一脂
質（１０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号３８のクロロホルム溶液）または脂質組合せ
を添加し、１００℃で３０分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（Ｓ
ＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記の単一脂質および脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であ
り（図３３を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたこ
とを示した。単一脂質番号３８は、核酸をＭＲＣ－５細胞内へと効果的に送達し、トラン
スフェクション試薬ＲＮＡｉＭＡＸに近い効果を示した。他の脂質をそれに追加しても、
効果のさらなる増強はなかった。
［実施例２－２］
脂質組合せによるＭＲＣ－５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せ（番号３８＆番号３７、２：１、Ｖ／Ｖ）および核酸の処理群：煮沸法
により処理した、３μＬの脂質組合せおよびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液の混
合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合
せ（２μＬの脂質組合せ番号３８＆番号３７ならびに１μＬの脂質番号８、１、２、１１
、１２、３４、３７、４、３０、３１、２９、３２、１＋２（等容積で混合）、または１
１＋１２（等容積で混合）の混合物のクロロホルム溶液）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７
二本鎖核酸溶液の混合物を細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであっ
た。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（Ｓ
ＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記の単一脂質および脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であ
り（図３４を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたこ
とを示した。脂質番号３８＆番号３７混合物は、核酸をＭＲＣ－５細胞内へと効率的に送
達した。１μＬの脂質を、２μＬの番号３８＆番号３７混合物に追加すると、番号１１お
よび３４を除いて、この効果を増強することができた。加えて、意外にも、１μＬの脂質
番号３２を、２μＬの番号３８＆番号３７混合物に追加すると、最良の効果が達成され、
ＲＮＡｉＭＡＸの効果よりさらに良好であった。
［実施例２－３］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４））および核
酸の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番
号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７
二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであ
った。
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合
せ（２．５μＬのＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）および０．５
μＬの脂質（ＤＧ（番号２）、ＴＧ（番号６）、Ｓｏ（番号１７）、ＦＡ（番号２９）、
ＭＧ（番号３４）、およびＬＰＣ（番号３７）の混合物）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７
二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであ
った。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬのＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖溶液に、３μＬの脂質組合
せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（Ｓ
ＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記の単一脂質および脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であ
り（図３５を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたこ
とを示した。１／５ ＬＰＣ（番号３７）を、ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃ
ｅｒ（番号４）混合物に追加することにより、核酸送達の効果を著しく増強することがで
きた。加えて、ＤＧ（番号２）およびＴＧ（番号１６）を追加することによっても、送達
効果をさらに増強することができた。
［実施例２－４］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＤＧ（番号２））および核酸の処理群：煮沸法に
より処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＤＧ（番号２）、２：１、Ｖ／
Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した
。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合
せ（２μＬのＰＥ（番号３８）＆ＤＧ（番号２）および他の脂質である１μＬの番号３７
、３１、２９、３４、１２、または４の混合物）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核
酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法（Ｓ
ＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記の単一脂質および脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であ
り（図３６を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたこ
とを示した。脂質組合せ（２μＬのＰＥ（番号３８）＆ＤＧ（番号２）混合物）は、二本
鎖核酸を、Ａ５４９細胞内へと効果的に送達することができた。この脂質組合せと比較し
て、２：１の比率で混合した、２μＬのＰＥ（番号３８）＆ＤＧ（番号２）および番号３
７、３１、１２、または４の脂質組合せは、送達効率を増強することができた。
［実施例２－５］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）、４
：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し
、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、７０℃で３０分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法によ
り検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣ
Ｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照さ
れたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図３７を参照
）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有し、トランスフェクション試
薬ＲＮＡｉＭＡＸに近い効果を有していたことを示した。
［実施例２－６］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）、４：
１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、
混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、７０℃で３０分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法によ
り検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣ
Ｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照さ
れたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図３８を参照
）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。効果
は、ＲＮＡｉＭＡＸの効果よりも良好であるかまたは同じである。
［実施例２－７］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ
（番号２）、４：１：５、Ｖ／Ｖ／Ｖ）および二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７核酸溶液の
混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、２μＬの脂質組
合せを添加し、８０℃で３０分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法によ
り検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣ
Ｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照さ
れたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図３９を参照
）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。脂質
組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ（番号２）、４：１：５、Ｖ／Ｖ／
Ｖ）は、ＲＮＡｉＭＡＸよりも、Ａ５４９細胞内への二本鎖核酸送達により良好な効果を
示した。
［実施例２－８］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆Ｄ
Ｇ（番号２）、３２：８：５、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶
液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、２μＬの脂質組
合せを添加し、８０℃で３０分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法によ
り検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣ
Ｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照さ
れたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図４０を参照
）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。効果
は、ＲＮＡｉＭＡＸの効果と類似していた。
［実施例２－９］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）、１：２
、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混
合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、２μＬの脂質組
合せを添加し、８０℃で３０分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法によ
り検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣ
Ｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照さ
れたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図４１を参照
）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。脂質
組合せ（ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）、１：２、Ｖ／Ｖ）は、ＲＮＡｉＭＡＸより
も、Ａ５４９細胞内への二本鎖核酸送達により良好な効果を示した。
［実施例２－１０］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆ＬＰＣ（番号３７）、４：
１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、
混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、２μＬの脂質組
合せを添加し、８０℃で３０分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法によ
り検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣ
Ｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照さ
れたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図４２を参照
）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。
［実施例２－１１］
脂質組合せによるＭＲＣ－５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）、１：２
、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混
合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せおよび二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７混合物の処理群：煮沸法により処
理した、３μＬの脂質組合せ（２μＬのＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）および１μＬ
の他のタイプの脂質（ＭＧ（番号３４）、ＤＧ（番号２）、ＴＧ（番号３２）、ＬＰＣ（
番号３７）、ＰＣ（番号１１）、ＰＥ（番号３８）、Ｃｅｒ（番号４）、Ｓｏ（番号３１
）、またはＦＡ（番号２９））および二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７核酸溶液の混合物を
、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、８０℃で３０分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法によ
り検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣ
Ｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照さ
れたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図４３を参照
）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。ＰＥ
（番号８）＆ＰＣ（番号１２）は、核酸を細胞内へと効果的に送達することができ、ＲＮ
ＡｉＭＡＸよりも有意に良好な効果を有していた。ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）と
比較して、ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）およびＣｅｒ（番号４）またはＰＥ（番号
３８）の２：１比の混合物は、この効果を増強することができた。
［実施例２－１２］
脂質組合せによるＭＲＣ－５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ（
番号２）、８：１６：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液の
混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、２μＬの脂質組
合せを添加し、８０℃で３０分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法によ
り検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣ
Ｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照さ
れたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、自由取込み群およびＲＮＡｉＭＡＸ群と比較して、脂質組合せ（ＰＥ（
番号８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ（番号２）、８：１６：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）が、ＲＮＡ
ｉＭＡＸよりも良好な送達効果を示し（図４４を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率
を向上させる可能性を有していたことを示した。
［実施例２－１３］
脂質組合せによるＭＲＣ－５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）煮沸法により処理した、脂質組合せおよびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液
の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
混合物１：ＰＥ（番号８）：ＬＰＣ（番号３７）：ＴＧ（番号３２）－４：１：２
混合物２：ＰＥ（番号８）：ＬＰＣ（番号３７）：ＤＧ（番号２）－４：１：２
混合物３：ＰＥ（番号８）：ＰＣ（番号１２）：Ｓｏ（番号３１）：ＦＡ（番号２９）
－１：２：１：１
５）．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、２．５μＬの脂
質組合せを添加し、９０℃で１５分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法によ
り検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣ
Ｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照さ
れたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図４５を参照
）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。ＲＮ
ＡｉＭＡＸ群と比較して、混合物１：ＰＥ（番号８）：ＬＰＣ（番号３７）：ＴＧ（番号
３２）－４：１：２および混合物２：ＰＥ（番号８）：ＬＰＣ（番号３７）：ＤＧ（番号
２）－４：１：２は、同等の送達効果を示したが、混合物３：ＰＥ（番号８）：ＰＣ（番
号１２）：Ｓｏ（番号３１）：ＦＡ（番号２９）－１：２：１：１は、より良好な効果を
示した。
［実施例２－１４］
脂質組合せによるＭＲＣ－５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞を指す。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せ混合物および二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７混合物の処理群：煮沸法に
より処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号８）：ＰＣ（番号１２）：Ｓｏ（番号３
１）：ＦＡ（番号２９）－１：２：１：１）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶
液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せおよび二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７混合物の処理群：煮沸法により処
理した、３μＬの脂質組合せ（２μＬの脂質組合せミックスおよび図４６に示されている
１μＬの他のタイプの脂質、すなわち脂質番号３４、２、３２、１１、３７、３８、また
は４の混合物）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し
、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、３μＬの脂質組
合せを添加し、９０℃で１５分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法によ
り検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣ
Ｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照さ
れたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図４６を参照
）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。混合
物（ＰＥ（番号８）：ＰＣ（番号１２）：Ｓｏ（番号３１）：ＦＡ（番号２９）－１：２
：１：１）は、ＲＮＡｉＭＡＸよりも良好な送達効果を示した。混合物（ＰＥ（番号８）
：ＰＣ（番号１２）：Ｓｏ（番号３１）：ＦＡ（番号２９）－１：２：１：１）を、脂質
番号２、３８、または４に２：１の比率で追加すると、混合物（ＰＥ（番号８）：ＰＣ（
番号１２）：Ｓｏ（番号３１）：ＦＡ（番号２９）－１：２：１：１）と比較して、送達
効果を増強することができた。
［実施例２－１５］
脂質組合せによるＭＲＣ－５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆Ｓｏ（番号３１）、６：１
、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混
合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
５）．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、２μＬの脂質組
合せを添加し、９０℃で１５分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法によ
り検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣ
Ｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照さ
れたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆Ｓｏ（番号３１）、６：１、Ｖ／Ｖ）が
、ＲＮＡｉＭＡＸよりも良好な送達効果を示し（図４７を参照）、臨床の場面で核酸薬の
送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。
［実施例２－１６］
脂質組合せによるＭＲＣ－５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆Ｓｏ（番号３１）、４：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ
－ｓＲＮＡ－ｍ７混合物の処理群：煮沸法により処理した、２μＬの脂質組合せおよびＨ
ＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃
度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せおよび二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７混合物の処理群：煮沸法により処
理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆Ｓｏ（番号３１）、４：１、Ｖ／Ｖ）および他の
タイプの脂質（ＭＧ（番号３４）、ＤＧ（番号２）、ＬＰＣ（番号３７）、ＰＣ（番号１
２）、ＰＣ（番号１１）、Ｃｅｒ（番号４）、ＦＡ（番号２９）、またはＴＧ（番号３２
）、１２：３：５、Ｖ／Ｖ、図４８）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液の混
合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、２μＬの脂質組
合せを添加し、９０℃で１５分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した１２時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法によ
り検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣ
Ｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照さ
れたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図４８を参照
）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。ＰＥ
（番号８）：Ｓｏ（番号３１）（４：１、Ｖ／Ｖ）は、核酸を細胞内へと効果的に送達す
ることができ、ＲＮＡｉＭＡＸに近い効果を有していた。ＰＥ（番号８）：Ｓｏ（番号３
１）およびＭＧ（番号３４）、ＤＧ（番号２）、ＰＣ（番号１２）、ＰＣ（番号１１）、
またはＴＧ（番号３２）の１２：３：５比の混合物は、ＰＥ（番号８）：Ｓｏ（番号３１
）と比較して、核酸送達の効果を増強することができ、ＰＥ（番号８）：Ｓｏ（番号３１
）：ＰＣ（番号１１）は、最良の効果を示し、ＲＮＡｉＭＡＸよりも有意に良好であった
。
［実施例２－１７］
脂質組合せによるＭＲＣ－５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１
００ｎＭであった）。
４）脂質組合せ（ＰＥ（番号８）：Ｃｅｒ（番号４）、４：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ
－ｓＲＮＡ－ｍ７混合物の処理群：煮沸法により処理した、２μＬの脂質組合せおよびＨ
ＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃
度は１００ｎＭであった。
５）脂質組合せおよび二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７混合物の処理群：煮沸法により処
理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）：Ｃｅｒ（番号４）および他のタイプの脂質ＭＧ（
番号３４）、ＤＧ（番号２）、ＬＰＣ（番号３７）、ＰＣ（番号１２）、ＰＣ（番号３１
）、ＦＡ（番号２９）、またはＴＧ（番号３２）の混合物、１２：３：５、Ｖ／Ｖ、図４
９）および二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した
。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、２μＬの脂質組
合せを添加し、９０℃で１５分間加熱した。
２）実験条件：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加
した１２時間後、細胞に進入したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の量を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法によ
り検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣ
Ｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ」を参照さ
れたい。実験は、すべて三連で実施した。
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図４９を参照
）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。脂質
組合せＰＥ（番号８）：Ｃｅｒ（番号４）は、核酸を細胞内へと効果的に送達することが
でき、ＲＮＡｉＭＡＸに近い効果を有していた。ＰＥ（番号８）：Ｓｏ（番号３１）、お
よびＤＧ（番号２）、ＦＡ（番号２９）、またはＴＧ（番号３２）の１２：３：５比の混
合物は、ＰＥ（番号８）：Ｓｏ（番号３１）と比較して、核酸送達の効果を増強すること
ができ、ＦＡ（番号２９）は、ＰＥ（番号８）：Ｓｏ（番号３１）の送達効果を有意に向
上させることができた（ＲＮＡｉＭＡＸよりも有意に良好）。
［実施例３］
脂質組合せは、消化管を介して肺内への核酸進入を促進する
脂質組合せは、以下の通りであった。
脂質ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号３２）、４：２：３、Ｖ／Ｖ
／Ｖ
１．脂質核酸混合物の調製
方法：煮沸法
４００μＬのＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７（５ｎｍｏｌ）一本鎖ＲＮＡのＤＥＰＣ処理水溶
液に、９μＬまたは１８μＬの脂質組合せ（脂質ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）
＆ＴＧ（番号３２）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）を添加し、混合し、１００℃で３０分間
加熱した。
２．消化管を介した核酸の送達実験
６～８週齢雄Ｃ５７マウスにＲＮＡを胃管栄養により投与した。ＨＪＴｓＲＮＡ－ｍ７
の水溶液または脂質およびＨＪＴｓＲＮＡ－ｍ７の混合物溶液を、胃管栄養針により、４
００μＬ／動物（ＨＪＴｓＲＮＡ－ｍ７、５ｎｍｏｌ／動物）で投与した。群は以下の通
りであった。
（１）対照群（ナイーブ群）：いかなる処置も受けなかったマウス、
（２）陰性対照群（脂質群）：９μＬの脂質組合せ（脂質ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（
番号３７）＆ＴＧ（番号３２）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）の胃管栄養による投与、
（３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴｓＲＮＡ－ｍ７ ＲＮＡの胃管栄養による直接投与
、
（４）脂質および核酸混合物群：脂質組合せおよび一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ Ｒ
ＮＡの混合物の胃管栄養による投与。
胃管栄養による投与の３時間後、マウスの肺全体を、３ｍＬのＴＲＩｚｏｌで溶解し、
全ＲＮＡを抽出し、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の存在量をＲＴ－ｑＰＣＲにより検出した。
結論：図５０に示されているように、９μＬまたは１８μＬの脂質組合せ（脂質ＰＥ（
番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号３２）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）は、自
由取込み群と比較して、肺組織内への核酸の小断片の進入を有意に促進した（＊は、０．
０５未満のＰ値を示す）。胃管栄養によるこの（非侵襲性）投与では、脂質組合せ（脂質
ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号３２）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）
は、核酸の小断片の肺組織への進入を促進することができ、核酸薬送達の手段として使用
することができる可能性があった。
［実施例４］
中国伝統医薬由来脂質混合物により媒介される細胞内への二本鎖核酸の送達の機能実験
１．番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）脂質混合物は、核酸が細胞
内に進入して機能することを媒介した。
実験方法：ウエスタンブロット、上記の「タンパク質発現レベルのウエスタンブロット
検出」を参照されたい。
１）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）脂質混合物は、ＭＲＣ－５
細胞内への抗線維化二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を媒介した。
図５１に示されているように、煮沸法および逆相蒸散法により、番号８（ＰＥ）：番号
１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）脂質混合物は、核酸を細胞内に効果的に送達して、機能
させることができた。
ナイーブ群：未処理ＭＲＣ－５細胞、すなわちブランク対照群。
ＴＧＦβＧ１群：ＭＲＣ－５細胞を、ＴＧＦβ１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）
で刺激し、試料を７２時間後に収集した。
ＮＣ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質組合せおよび二
本鎖ＮＣ模倣体の混合物を、ＭＲＣ－５細胞に添加し、十分に混合した。核酸の終濃度は
２００ｎＭであった。２４時間後、細胞をＴＧＦβ１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度
）で刺激し、ＴＧＦβ１により刺激した７２時間後に試料を収集した。
Ｍ７群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質組合せと二本鎖
ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７との混合物を、ＭＲＣ－５細胞に添加し、混合した。核酸の終濃
度は２００ｎＭであった。２４時間後、細胞をＴＧＦβ１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終
濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
２）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）脂質混合物は、Ａ５４９細
胞内へのｓｉＲＮＡの進入を媒介した。
図５２および５３に示されているように、煮沸法により、脂質番号８（ＰＥ）：番号１
２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）脂質混合物は、核酸を細胞内へと効果的に送達して、タン
パク質発現をノックダウンすることができた。
図５２のナイーブ群：未処理細胞、すなわちブランク対照群。
ｓｉ－ＮＣ：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質組合せおよ
びｓｉ－ＮＣ（Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｒｉｂｏｂｉｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により合成、配
列不明）の混合物を、Ａ５４９細胞に添加し、混合した。終濃度は４００ｎＭであった。
４８時間後に細胞を回収し、ＲＩＰＡ強力溶解緩衝液により溶解して、タンパク質試料を
収集した。
ｓｉ－ＣＰＳＦ３０:：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質
組合せおよびｓｉ－ＣＰＳＦ３０の混合物を、Ａ５４９細胞に添加し、混合した。核酸の
終濃度は４００ｎＭであった。４８時間後に細胞を回収し、ＲＩＰＡ強力溶解緩衝液によ
り溶解して、タンパク質試料を収集した。
ｓｉ－ＬＡＭＰ１：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質組合
せおよびｓｉ－ＬＡＭＰ１の混合物を、Ａ５４９細胞に添加し、混合した。終濃度は４０
０ｎＭであった。４８時間後に細胞を回収し、ＲＩＰＡ強力溶解緩衝液により溶解して、
タンパク質試料を収集した。
ｓｉ－ＬＡＭＰ２：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質組合
せおよびｓｉ－ＬＡＭＰ２の混合物を、Ａ５４９細胞に添加し、混合した。終濃度は４０
０ｎＭであった。４８時間後に細胞を回収し、ＲＩＰＡ強力溶解緩衝液により溶解して、
タンパク質試料を収集した。
図５３に示されている自由取込み群：核酸溶液を直接添加した。
Ｌｉｐｏ２０００群：２μＬ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００トランス
フェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ）およびｓｉ－ＮＦ－κＢ溶液を、１００μＬのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞ
れ希釈し、２つを混合し、１５分間維持させ、細胞に添加した。核酸溶液の終濃度は４０
０ｎＭであった。２４時間後、細胞をｐｏｌｙＩ：Ｃで刺激し（濃度は１μｇ／ｍＬであ
った）、６時間後にタンパク質試料を収集した。
番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（１：２）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（
１：２）を、加熱法によりｓｉ－ＮＦ－κＢ溶液と混合し、その後細胞に添加した。核酸
溶液の終濃度は４００ｎＭであった。２４時間後に細胞をｐｏｌｙＩ：Ｃで刺激し（濃度
は１μｇ／ｍＬであった）、６時間後にタンパク質試料を収集した。
上記核酸のタイプおよび配列は表２を参照されたい。
３）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）脂質混合物は、ＴＨＰ－１
細胞内へのｓｉＲＮＡの進入を媒介した。
図５４に示されているように、煮沸法により、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ
：ｖ＝１：２）脂質混合物は、核酸を細胞内に効果的に送達して、機能させることができ
た。
ナイーブ群：未処理細胞、すなわちブランク対照群。
ＬＰＳ群：ｓｉＲＮＡ無し、しかしながら、ＬＰＳのみを刺激のために添加した。終濃
度は１μｇ／ｍＬであった。９時間後にＲＮＡ試料および細胞上清を回収した。
ｓｉ－ＮＣ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質組合せお
よびｓｉ－ＮＣの混合物を、ＴＨＰ－１細胞に添加し、混合した。終濃度は４００ｎＭで
あった。ＬＰＳを、２４時間後に１μｇ／ｍＬの終濃度で刺激のために添加し、刺激の９
時間後、細胞のＴＲＩｚｏｌ溶解物を収集し、ＥＬＩＳＡ検出のために上清を収集した。
ｓｉ－ＴＮＦα群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質組合
せおよびｓｉ－ＴＮＦαの混合物を、ＴＨＰ－１細胞に添加し、混合した。終濃度は４０
０ｎＭであった。ＬＰＳを、２４時間後に１μｇ／ｍＬの終濃度で刺激のために添加し、
刺激の９時間後、細胞のＴＲＩｚｏｌ溶解物を収集し、ＥＬＩＳＡ検出のために上清を収
集した。
２．番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）
脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
１）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）
脂質混合物は、ＭＲＣ－５細胞内への抗線維化ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を媒介した
。
図５５に示されているように、煮沸法により、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番
号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）脂質混合物は、抗線維化ＨＪＴｓＲＮＡ－ｍ７
を、ＭＲＣ－５細胞内へと効果的に送達して、フィブロネクチンタンパク質発現を低減す
ることができた。
２）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）
脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を阻害する
ことを媒介した。
図５６に示されているように、煮沸法により、番号２（ＤＧ）を、番号８（ＰＥ）：番
号１２（ＰＣ）：番号２０（ＤＧ）、ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３の混合物に追加することに
より、核酸を細胞内へと効果的に送達して機能させることができた。
ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
ＮＣ ｓｉＲＮＡ群：煮沸法により調製した、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番
号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）の脂質混合物およびｓｉ－ＮＣの混合物を細胞
に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡ群：煮沸法により調製した、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）
：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）の脂質混合物およびＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡ
の混合物を細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
３．番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１
）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
１）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１
）脂質混合物は、抗線維化ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７がＭＲＣ－５細胞内に進入して機能す
ることを媒介した（煮沸法）。
図５７に示されているように、煮沸法により、番号４（Ｃｅｒ）を、番号８（ＰＥ）：
番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質混合物にｖ：ｖ：ｖ＝１：
２：１で追加することにより、抗線維化ＨＪＴｓＲＮＡ－ｍ７を、ＭＲＣ－５細胞内へと
効果的に送達して、フィブロネクチンタンパク質発現を低減することができた。
ナイーブ群：未処理細胞。
ＴＧＦ－β１群：ＴＧＦ－β１タンパク質を、刺激のために３ｎｇ／ｍＬの終濃度で添
加し、７２時間後に試料を収集した。
ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）の脂質組合せ（ｖ
：ｖ：ｖ＝３２：８：５）を使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、ＴＧＦ－β
１ ＴＧＦｂ１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後
に試料を収集した。
ｍ７群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２
：１）の脂質組合せと二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７との混合物を、ＭＲＣ－５細胞に添
加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。２４時間後、ＴＧＦ－β１タンパ
ク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収集した。
２）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１
）脂質混合物は、ＮＦ－κＢ ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を阻害
することを媒介した（煮沸法）。
図５８に示されているように、番号４（Ｃｅｒ）を、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ
）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質混合物にｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１で追加することにより、核
酸を細胞内へと効果的に送達して機能させることができた。
ナイーブ群：未処理細胞。
ｓｉ－ＮＣ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ＝
１：２：１）の脂質混合物およびｓｉ－ＮＣ ｓｉＮＣの混合物を細胞に添加し、混合し
た。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
ｓｉ－ＮＦ－κＢ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ
：ｖ＝１：２：１）の脂質混合物およびｓｉ－ＮＦ－κＢ ｓｉＲＮＡの混合物を細胞に
添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
４．番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＰＣ（１１）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１
）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
１）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＰＣ（１１）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３
）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を阻害す
ることを媒介した。
図５９に示されているように、番号１１（ＰＣ）を、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ
）（ｖ：ｖ＝１：２）の混合物にｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１で追加することにより、核酸を
細胞内へと効果的に送達して機能させることができた。
ナイーブ群：未処理細胞。
ｓｉ－ＮＣ ｓｉＮＣ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＰＣ（１１）（ｖ
：ｖ：ｖ＝１：２：１）の脂質混合物およびｓｉ－ＮＣの混合物を細胞に添加し、混合し
た。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
ｓｉ－ＸＲＮ２群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＰＣ（１１）（ｖ：ｖ：
ｖ＝１：２：１）の脂質混合物およびＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡの混合物を細胞に添加し、混
合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
５．番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＬＰＣ（３７）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：
１）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
１）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＬＰＣ（３７）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：
１）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を阻害
することを媒介した。
図６０に示されているように、番号３７（ＬＰＣ）を、番号８（ＰＥ）、番号１２（Ｐ
Ｃ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質混合物に、ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１で追加することに基づ
いて、核酸を細胞内へと効果的に送達して、機能させることができた。
ナイーブ群：未処理細胞。
ｓｉ－ＮＣ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＬＰＣ（３７）（ｖ：ｖ：ｖ
＝１：２：１）の脂質混合物およびｓｉ－ＮＣの混合物を細胞に添加し、混合した。核酸
の終濃度は４００ｎＭであった。
ｓｉ－ＸＲＮ２群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＬＰＣ（３７）（ｖ：ｖ
：ｖ＝１：２：１）の脂質混合物およびＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡの混合物を細胞に添加し、
混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
６．番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＭＧ（３４）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：３：１
）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
１）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＭＧ（３４）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：３：１
）脂質混合物は、ＣＰＳＦ４ ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を阻害
することを媒介した。
ナイーブ群：未処理細胞。
ｓｉ－ＮＣ ｓｉＮＣ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＭＧ（３４）（ｖ
：ｖ：ｖ＝２：３：１）の脂質混合物およびｓｉ－ＮＣｓｉＮＣの混合物を細胞に添加し
、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
ｓｉ－ＣＰＳＦ４群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＭＧ（３４）（ｖ：ｖ
：ｖ＝２：３：１）の脂質混合物およびＣＰＳＦ４ ｓｉＲＮＡの混合物を細胞に添加し
、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
図６１に示されているように、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＭＧ（３４）
（ｖ：ｖ：ｖ＝２：３：１）脂質混合物は、核酸を細胞内に効果的に送達して、機能させ
ることができた。
７．番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：
８：５）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
１）番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：
８：５）脂質混合物は、ＭＲＣ－５細胞内への抗線維化ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を
媒介した（煮沸法）。
図６２に示されているように、ｍ７バンドは、対照と比較してより薄色であった。Ｍ７
の効果は、細胞を未刺激レベルに回復させるには十分ではなかった。
ナイーブ群：未処理細胞、すなわちブランク対照群。
ＴＧＦ－β１群：細胞を、ＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し
、７２時間後に試料を収集した。
ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）の脂質組合せ（ｖ
：ｖ：ｖ＝３２：８：５）を使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、細胞をＴＧ
Ｆ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
Ｍ７群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝３
２：８：５）の脂質組合せと二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７との混合物を、ＭＲＣ－５細
胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。２４時間後、細胞をＴＧＦ
－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
２）番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：
８：５）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を
阻害することを媒介した。
図６３に示されているように、番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（Ｔ
Ｇ）（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：８：５）脂質混合物は、核酸を効果的に送達して細胞内に進入
させ、機能させることができた。
ｓｉ－ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：ｖ：
ｖ＝３２：８：５）の脂質混合物およびｓｉ－ＮＣの混合物を細胞に添加し、混合した。
核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
ｓｉ－ＸＲＮ２群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：
ｖ：ｖ＝３２：８：５）の脂質混合物およびＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡの混合物を細胞に添加
し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
８．番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）：番号３
１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：
１：２：２：３：１：３）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介し
た。
１）図６４に示されているように、番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ
）：番号４（Ｃｅｒ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：
ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：１：２：２：３：１：３）脂質混合物は、ＭＲＣ－５細胞
内への抗線維化ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を媒介した（煮沸法）。
ナイーブ群：未処理細胞、すなわちブランク対照群。
ＴＧＦ－β１群：細胞を、ＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し
、７２時間後に試料を収集した。
ＮＣ群：番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）：番
号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝
２：１：２：２：３：１：３）の脂質組合せを使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時
間後、ＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時
間後に試料を収集した。
Ｍ７群：番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）：番
号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝
２：１：２：２：３：１：３）の脂質組合せと二本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７との混合物
を、ＭＲＣ－５細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。２４時間
後、ＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間
後に試料を収集した。
２）図６５に示されているように、番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ
）：番号４（Ｃｅｒ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：
ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：１：２：２：３：１：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉ
ＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介した（煮沸法）。
番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）：番号３１（
Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：１：
２：２：３：１：３）脂質混合物は、核酸を効果的に送達して細胞に進入させ、機能させ
ることができた。
ｓｉ－ＮＣ群：番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ
）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ
：ｖ＝２：１：２：２：３：１：３）脂質混合物およびｓｉ－ＮＣの混合物を、細胞に添
加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
ｓｉ－ＸＲＮ２群：番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃ
ｅｒ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ
：ｖ：ｖ＝２：１：２：２：３：１：３）脂質混合物およびｓｉ－ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡ
の混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
９．番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号
４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５）脂質混合物は、核酸が細胞内
に進入して機能することを媒介した。
１）図６６に示されているように、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓ
ｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５
）脂質混合物は、ＭＲＣ－５細胞内への抗線維化ＨＪＴ－ｓＲＮＡ、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－
３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入
を媒介した（煮沸法）。
ナイーブ群：未処理細胞、すなわちブランク対照群。
ＴＧＦ－β１群：細胞を、ＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し
、７２時間後に試料を収集した。
ＮＣ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：
番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５）の脂質組合せを使用して
、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、細胞をＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの
終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
Ｍ７群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：
番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５）の脂質組合せとＨＪＴ－
ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖との混合物を、ＭＲＣ－５細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度
は４００ｎＭであった。２４時間後、細胞をＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終
濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
２）図６７に示されているように、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓ
ｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５
）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害
することを媒介した（煮沸法）。
番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号４（
Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５）脂質混合物は、核酸を細胞内に効
果的に送達して機能させることができた。
ｓｉ－ＮＣ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（Ｆ
Ａ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５）の脂質混合物およ
びｓｉ－ＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった
。
ｓｉ－ＸＲＮ２群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９
（ＦＡ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５）の脂質混合物
およびＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４０
０ｎＭであった。
１０．番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）脂質混合物は、核酸
が細胞内に進入して機能することを媒介した。
１）図６８に示されているように、番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝
４：１）脂質混合物は、ＭＲＣ－５細胞内への抗線維化ＨＪＴ－ｓＲＮＡ、ＨＪＴ－ｓＲ
ＮＡ－３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７
の進入を媒介した（煮沸法）。
ナイーブ群：未処理細胞、すなわちブランク対照群。
ＴＧＦ－β１群：細胞を、ＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し
、７２時間後に試料を収集した。
ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）の脂質組合せを使
用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、細胞をＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／
ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
Ｍ７群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）の脂質組合せとＨ
ＪＴ－ｓＲＮＡ－３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３、ＨＪＴ－ｓＲ
ＮＡ－ｍ７との混合物を、ＭＲＣ－５細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎ
Ｍであった。２４時間後、細胞をＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺
激し、７２時間後に試料を収集した。
２）図６９に示されているように、番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝
４：１）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を
阻害することを媒介した（煮沸法）。
番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）脂質混合物は、核酸を効果
的に送達して細胞内に進入させ、機能させることができた。
ｓｉ－ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）の脂質混合
物およびｓｉ－ＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭで
あった。
ｓｉ－ＸＲＮ２群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）の脂質
混合物およびＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度
は４００ｎＭであった。
１１．番号３８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：
３）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
図７０に示されているように、番号３８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）
（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進
入して遺伝子発現を阻害することを媒介した。
番号８（ＰＥ）の代わりの番号３８（ＰＥ）と、番号１２（ＰＣ）、番号２（ＤＧ）と
の脂質混合物（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：３）は、核酸を効果的に送達して細胞に進入させ、
機能させることができた。
ｓｉ－ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝
４：１：３）の脂質混合物およびｓｉ－ＮＣの混合物を細胞に添加し、混合した。核酸の
終濃度は４００ｎＭであった。
ｓｉ－ＸＲＮ２群：番号３８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：
ｖ＝４：１：３）の脂質混合物およびＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、
混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
１２．番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：
１：１）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
図７１に示されているように、番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号１２（Ｐ
Ｃ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：１）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内
に進入して遺伝子発現を阻害することを媒介した（逆相蒸散法）。
番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：１）を、番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰ
Ｃ）（ｖ：ｖ＝４：１）の脂質混合物に追加することにより、核酸を細胞内へと効果的に
送達して、遺伝子発現を阻害することができた。
ｓｉ－ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ：
ｖ＝４：１：１）の脂質混合物およびｓｉ－ＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。
核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
ｓｉ－ＲＮＡ群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ
：ｖ＝４：１：１）の脂質混合物およびＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡ、β－アクチン ｓｉＲＮ
Ａ、Ｓｓｕ７２ ｓｉＲＮＡ、またはＣＰＳＦ４ ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し
、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
１３．番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）
（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能するこ
とを媒介した。
１）図７２に示されているように、番号４（Ｃｅｒ）を、番号３８（ＰＥ）、番号３７
（ＬＰＣ）、番号１２（ＰＣ）の脂質混合物に追加することにより、番号４（Ｃｅｒ）：
番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：
８：３）の脂質混合物がもたらされ、これは、抗線維化ＨＪＴ－ｓＲＮＡ、ＨＪＴ－ｓＲ
ＮＡ－３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７
二本鎖ＲＮＡがＭＲＣ－５細胞内に進入して、フィブロネクチン発現レベルを低減するこ
とを媒介した（煮沸法）。
ナイーブ群：未処理細胞、すなわちブランク対照群。
ＴＧＦ－β１群：細胞を、ＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し
、７２時間後に試料を収集した。
ＮＣ群：番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ
）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）の脂質組合せを使用して、ＮＣ模倣体を送達した
。２４時間後、刺激のためにＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を添加し
、７２時間後に試料を収集した。
ＨＪＴ－３＆ａ２＆ｈ３群：番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）
：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）の脂質混合物と、ＨＪＴ－ｓ
ＲＮＡ－３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３、およびＨＪＴ－ｓＲＮ
Ａ－ｍ７二本鎖との混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであ
った。
ｍ７群：番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ
）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）の脂質組合せと、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７との混
合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
２）図７３に示されているように、番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（
ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）脂質混合物は、ＸＲＮ
２ ｓｉＲＮＡが細胞内に進入して遺伝子発現を阻害することを媒介した。
ｓｉ－ＮＣ群：番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（
ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）の脂質混合物およびｓｉ－ＮＣの混合物を
、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
ｓｉ－ＸＲＮ２群：番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３
７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）の脂質混合物およびＸＲＮ２ ｓｉＲ
ＮＡの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
１４．番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：
３）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
１）図７４に示されているように、番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓ
ｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：３）脂質混合物は、抗線維化ＨＪＴ－ｓＲＮＡ、ＨＪＴ－ｓ
ＲＮＡ－３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ
７二本鎖ＲＮＡがＭＲＣ－５細胞内に進入して、フィブロネクチン発現レベルを低減する
ことを媒介した（煮沸法）。
ナイーブ群：未処理細胞、すなわちブランク対照群。
ＴＧＦ－β１群：細胞を、ＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し
、７２時間後に試料を収集した。
ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２
：３）の脂質組合せを使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、刺激のためにＴＧ
Ｆ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を添加し、７２時間後に試料を収集した。
ＨＪＴ－３＆ａ２＆ｈ３群：番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（
ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：３）の脂質混合物と、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－
ａ２、およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３との混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終
濃度は４００ｎＭであった。
Ｍ７群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）の脂質組合せとＨ
ＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７との混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎ
Ｍであった。
２）図７５に示されているように、番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓ
ｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内
に進入して遺伝子発現を阻害することを媒介した（煮沸法）。
番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：３）脂
質混合物は、ＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡをＡ５４９細胞内に効果的に送達して機能させた。
ｓｉ－ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝
４：２：３）の脂質混合物およびｓｉ－ＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸
の終濃度は４００ｎＭであった。
ｓｉ－ＸＲＮ２群：番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：
ｖ＝４：２：３）の脂質混合物およびＸＲＮ２ ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、
混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
［実施例５］
脂質番号４１およびその組成物の効果の検証
Ｉ．単一脂質は、異なる調製方法（逆相蒸散法および煮沸法）により、核酸（二本鎖Ｒ
ＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ）を細胞内へと送達した。
脂質番号４１。スフィンガニン（ｄ２２：０）
Figure 2023078392000026
１．脂質による核酸送達の効率の定量リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）検出
図７６に示されているように、異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製され
た脂質番号４１は、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した
。Ａ５４９細胞では、煮沸法の場合、脂質番号４１の送達効果は、ＲＮＡｉＭＡＸの送達
効率の約２倍であった。逆相蒸散法の場合も、脂質番号４１の送達効果は、ＲＮＡｉＭＡ
Ｘの送達効果よりも有意に高かった。
図７７に示されているように、異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製され
た脂質番号４１は、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖ＲＮＡをＭＲＣ－５細胞内へと送達し
た。ＭＲＣ－５細胞では、煮沸法の場合、脂質番号４１は、二本鎖ＲＮＡをＭＲＣ－５細
胞内へと送達した。逆相蒸散法の場合、脂質番号４１の送達効果は、ＲＮＡｉＭＡＸの送
達効果よりも有意に高かった。
図７８に示されているように、脂質番号４１は、煮沸法により、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ
７一本鎖ＲＮＡを、Ａ５４９およびＭＲＣ－５細胞内へと送達した。
２．脂質による核酸送達の効率のデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）検出
２．１ 実験材料：Ａ５４９細胞は、Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｉｎｅｓ
ｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、ＴＲＩｚｏ
ｌ溶解緩衝液は、Ｓｉｇｍａから購入し、高容量ｃＲＮＡ逆転写キットは、ＡＢＩ、ＵＳ
Ａから購入し、デジタルＰＣＲ関連試薬は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＵＳＡから購入した。
２．２ 実験方法：全細胞ＲＮＡを収集し、上記の方法に従ってＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝
液により抽出し、高容量ｃＲＮＡ逆転写キットを使用して、ｃＤＮＡへと逆転写し、異な
る群に由来するｃＤＮＡを、デジタルＰＣＲ反応にかけた。プロトコールは、ＱＸ２００
Ｄｒｏｐｌｅｔ ＲｅａｄｅｒおよびＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアマニュアルを
参照して、結果をＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアを使用して分析した。群は以下の通
りであった：（１）ナイーブ群：処理していないＡ５４９細胞。（２）自由取込み群：細
胞を、ＨＪＴｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡと共に直接的に６時間インキュベートした。（
３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：Ａ５４９細胞を、ＲＮＡｉＭＡＸによりＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７
ｄｓＲＮＡでトランスフェクトし、６時間後に試料を検出のために収集した。（４）番
号４１群：異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製した脂質番号４１は、二本
鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。６時間後に試料を検出のために収集した。
実験結果および分析：図７９に示されているように、脂質番号４１は、煮沸法および逆
相蒸散法の両方により、ＨＪＴーｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡをＡ５４９細胞内へと効果
的に送達することができた。煮沸法は、逆相蒸散法よりも良好な効果を示した。
３．脂質による核酸送達の効率のフローサイトメトリー検出
実験材料：Ａ５４９細胞（Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、ＦＡＭ－ｓＲＮ
Ａ（Ｒｉｂｏｂｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）、脂質
番号４１、Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６機器（ＢＤ、ＵＳＡから購入）。
実験方法：ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－６－ＦＡＭを、１００μｌの水に溶解し、４μｌの脂質
と混合し、煮沸法により調製した。その後、混合物を、Ａ５４９細胞に滴下し、共インキ
ュベーションの６時間後、試料を以下の通り、検出のために収集した：まず、ＰＢＳで３
回洗浄し、その後トリプシンで３分間消化し、トリプシンを除去し、再びＰＢＳで洗浄し
、その後細胞を吹下した。検出は、Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６機器を使用して実施し
た。
図８０に示されている実験結果：脂質番号４１は、ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－６一本鎖ＲＮＡ
の送達に９４．１％の効率を示した。これは、陽性対照ＲＮＡｉＭＡＸの６９．４％より
も高かった。また、脂質番号４１は、ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－６二本鎖ＲＮＡの送達に９６．
７％の効率を示した。これも、陽性対照ＲＮＡｉＭＡＸの９４．９％よりも高かった。脂
質４１は、一本鎖および二本鎖核酸をＡ５４９細胞内へと効果的に送達することができた
。
４．脂質により細胞に送達された核酸の局在化の共焦点蛍光顕微鏡法による観察
実験材料：Ａ５４９細胞（Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）、ＰＧＹ－ｓ
ＲＮＡ－６－Ｃｙ３（Ｒｉｂｏｂｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
から購入した）、脂質番号４１、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７８０（Ｚｅｉｓｓ、ドイツから購
入した）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、ＵＳＡから購入した）、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡから購入した）
、パラホルムアルデヒド（ｓｉｇｍａ、ＵＳＡから購入した）。
実験方法：ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－６－ＦＡＭを、１００μｌの水に溶解し、４μｌの脂質
と混合し、煮沸法により調製した。その後、混合物をＡ５４９細胞に滴下し、共インキュ
ベーションの６時間後、試料をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し
、ＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジンで３０
分間の染色し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩで５分間染色し、ＰＢＳで洗浄し、その後
密封した。
図８１に示されている実験結果：赤色のＰＧＹ－ｓＲＮＡ－６－Ｃｙ３の進入を、共焦
点顕微鏡で明白に観察することができた。脂質番号４１は、二本鎖核酸をＡ５４９細胞内
へと効果的に送達することができた。
５．脂質による核酸送達の効率のウエスタンブロット検出
図８２に示されているように、単一脂質番号４１は、ｓＲＮＡｉがＭＲＣ－５Ａ５４９
細胞内に進入してタンパク質発現をノックダウンすることを媒介した（逆相蒸散法による
）。タンパク質レベルでは、単一脂質番号４１により媒介されたタンパク質ノックダウン
効果は、ＲＮＡｉＭＡＸにより媒介されたＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の阻害効果よりも有意
に高かった。
ナイーブ群：未処理ＭＲＣ－５Ａ５４９細胞。
ｓｉＮＣ群：単一脂質番号４１およびｓｉＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。
核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
ｓｉＮＣ群：単一脂質番号４１およびＬＡＭＰ２、ＸＰＮ２、Ｓｓｕ７２、ＣＰＳＦ４
、またはβ－アクチン ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度
は４００ｎＭであった。
自由取込み群：試験物質を直接添加した。
ＲＮＡｉＭＡＸ群：２ｕｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および核酸溶液
を、１００ｕｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、２つを混合し、１５分間維持
させ、細胞に添加し、その後混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
Ｓｏ（４１）群（逆相蒸散法）：脂質番号４１および核酸の混合物を、細胞に添加し、
混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
図８３に示されているように、単一脂質番号４１は、ＭＲＣ－５細胞内への抗線維化Ｈ
ＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖の進入を媒介した（逆相蒸散法）。タンパク質レベルでは、
単一脂質番号４１が媒介したＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７阻害は、ＲＮＡｉＭＡＸが媒介した
ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７阻害よりも高かった。
ＴＧＦβ１群：ＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加
し、７２時間後に試料を収集した。
ＮＣ群：単一脂質番号４１は、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、細胞をＴＧＦ－β
１ ＴＧＦｂ１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集
した。
ＨＪＴ－３＆ａ２＆Ｈ３群：単一脂質番号４１ならびにＨＪＴ－ｓＲＮＡ－３、ＨＪＴ
－ｓＲＮＡ－ａ２、およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３の混合物を、細胞に添加し、混合した
。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
ｍ７群：単一脂質番号４１およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の混合物を、細胞に添加し、
混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
６．脂質番号４１のｉｎ ｖｉｖｏ結果の要約
［実験方法］
６～８週齢マウス、２２～２４ｇを、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄ
ｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの動物センターのＳＰＦ室で飼育した。胃内投与の前に、マウ
スを１２時間絶食させた。マウスを、ランダムに３群に分割した：（１）対照群、４００
μｌのＤＥＰＣ処理水、胃内投与；（２）自由取込み群、小分子ＲＮＡ（ＰＧＹ－ｓＲＮ
Ａ－２６、ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－３２、およびＰＧＹ－ｓＲＮＡ－２３）、各小分子ＲＮＡ
１ｎｍｏｌ／動物、４００μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解、胃内投与；（３）脂質番号４
１群：加熱法により調製した小分子ＲＮＡ（ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－２６およびＰＧＹ－ｓＲ
ＮＡ－３２）および脂質番号４１の混合物を胃内投与した。各小分子ＲＮＡ １ｎｍｏｌ
／動物、脂質番号４１ １０μｌ／動物、４００μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解。組織およ
び器官試料はすべて、胃内投与の６時間後に収集した。小分子ＲＮＡはすべて、３ｐ末端
２－Ｏメチル化により修飾された一本鎖ＲＮＡであった。
［実験結果］
図１０８に示されているように、脂質番号４１は、血液中への小分子ＲＮＡの進入を促
進し、血液中での分解からそれを保護することができた。
図１０９に示されているように、脂質番号４１は、胃細胞内への小分子ＲＮＡの進入を
促進し、胃での分解からそれを保護することができた。
図１１０に示されているように、脂質番号４１は、小腸細胞内への小分子ＲＮＡの進入
を促進し、小腸での分解からそれを保護することができた。
図１１１に示されているように、脂質番号４１は、肝臓内への小分子ＲＮＡの進入を促
進し、肝臓での分解からそれを保護することができた。
７．脂質番号４１を含む脂質組合せの核酸送達に対する効果
１）核酸送達に対する、脂質組合せ１（番号８＋番号４１＝６：１）および脂質組合せ
２（番号３８＋番号４１＝６：１）の効果。
図８４に示されているように、脂質組合せ１（番号８＋番号４１＝６：１）および脂質
組合せ２（番号３８＋番号４１＝６：１）は、ＭＲＣ－５細胞内への抗線維化ＨＪＴ－３
＆ａ２＆Ｈ３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を媒介し（加熱法）、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－
ｍ７の有意な阻害効果をタンパク質レベルで媒介した。
ＴＧＦ：ＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７
２時間後に試料を収集した。
ＮＣ群：単一脂質番号４１を使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、ＴＧＦ－
β１ ＴＧＦｂ１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間
後に試料を収集した。
ＨＪＴ－３＆ａ２＆Ｈ３群：脂質混合物と、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ
－ａ２、およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３との混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の
終濃度は４００ｎＭであった。
ＨＪＴ－ｍ７群：脂質混合物およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の混合物を、細胞に添加し
、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
２）核酸送達に対する、脂質組合せ３（番号３９＋番号４１＝６：１）および脂質組合
せ４（番号４０＋番号４１＝６：１）の効果。
図８５に示されているように、脂質組合せ３（番号３９＋番号４１＝６：１）および脂
質組合せ４（番号４０＋番号４１＝６：１）は、ＭＲＣ－５細胞内への抗線維化ＨＪＴ－
３＆ａ２＆Ｈ３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を媒介し（加熱法）、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ
－ｍ７の有意な阻害効果をタンパク質レベルで媒介した。
ＴＧＦ：ＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７
２時間後に試料を収集した。
ＮＣ群：単一脂質番号４１を使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、ＴＧＦ－
β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収
集した。
ＨＪＴ－３＆ａ２＆Ｈ３群：脂質混合物と、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ
－ａ２、およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－Ｈ３との混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の
終濃度は４００ｎＭであった。
ＨＪＴ－ｍ７：脂質混合物およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の混合物を、細胞に添加し、
混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
３）核酸送達に対する、脂質組合せ５（番号３８＋１２＋４１＋２９＝１：２：１：１
）の効果。
図８６に示されているように、脂質組合せ５（番号３８＋１２＋４１＋２９＝１：２：
１：１）は、ＭＲＣ－５細胞内への抗線維化ＨＪＴ－３＆ａ２＆Ｈ３およびＨＪＴ－ｓＲ
ＮＡ－ｍ７の進入を媒介し（加熱法）、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の有意な阻害効果をタン
パク質レベルで媒介した。
ＴＧＦ：ＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７
２時間後に試料を収集した。
ＮＣ群：単一脂質番号４１を使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、ＴＧＦ－
β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収
集した。
ＨＪＴ－３＆ａ２＆Ｈ３群：脂質混合物と、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ
－ａ２、およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－Ｈ３混合物との混合物を、細胞に添加し、混合した。
核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
ＨＪＴ－ｍ７：脂質混合物およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の混合物を、細胞に添加し、
混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
４）核酸送達に対する、脂質組合せ６（番号４０（ＰＥ）＋番号１２（ＰＣ）＋番号４
１（Ｓｏ）＝２：４：３）の効果。
図８７に示されているように、脂質組合せ６（番号４０（ＰＥ）＋番号１２（ＰＣ）＋
番号４１（Ｓｏ）＝２：４：３）は、ＭＲＣ－５細胞内への抗線維化ＨＪＴ－３＆ａ２＆
Ｈ３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の進入を媒介し（煮沸法および逆相蒸散法）、ＨＪＴ－ｓ
ＲＮＡ－ｍ７の有意な阻害効果をタンパク質レベルで媒介した。
ＴＧＦ：ＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７
２時間後に試料を収集した。
３’－ＮＣ群：脂質番号４１を使用して、ＮＣ模倣体を送達し、２４時間後、ＴＧＦ－
β１ ＴＧＦｂ１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間
後に試料を収集した。
３’－３＆ａ２＆Ｈ３群：脂質混合物と、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－
ａ２、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－Ｈ３との混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は
４００ｎＭであった。
３’－ｍ７：脂質混合物およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の混合物を、細胞に添加し、混
合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
右側の図：脂質－ＲＮＡ混合物を逆相蒸散法により調製した。脂質組合せ６（番号４０
（ＰＥ）＋番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝２：４：３）は、ＸＲＮ２、Ｓｓｕ７
２、ＣＰＳＦ４ ｓｉＲＮＡを、Ａ５４９細胞内に効果的に送達することができた。それ
により、タンパク質レベルでの発現レベルが有意に低減される。
ｓｉＮＣ：脂質混合物およびｓｉＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終
濃度は４００ｎＭであった。
ｓｉＲＮＡ：脂質混合物およびＸＲＮ２、Ｓｓｕ７２、ＣＰＳＦ４ ｓｉＲＮＡの混合
物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
５）核酸送達に対する、脂質組合せ７（番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝６：１
）および脂質組合せ８（番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝６：１）の効果。
図８８に示されているように、逆相蒸散法により、脂質組合せ７（番号１２（ＰＣ）＋
番号４１（Ｓｏ）＝６：１）および脂質組合せ８（番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）
＝６：１）は、Ｓｓｕ７２、ＣＰＳＦ４ ｓｉＲＮＡをＡ５４９細胞内へと効果的に送達
することができ、タンパク質レベルでの発現レベルが有意に低減された。
ｓｉＮＣ：脂質混合物およびｓｉＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終
濃度は４００ｎＭであった。
ｓｉＲＮＡ：脂質混合物およびＸＲＮ２、Ｓｓｕ７２、ＣＰＳＦ４ ｓｉＲＮＡの混合
物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
６）核酸送達に対する、脂質組合せ９（番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝６：１
）および脂質組合せ１０（番号４０（ＰＥ）＋番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝２
：２：２）の効果。
図８９に示されているように、逆相蒸散法により、脂質組合せ９（番号１２（ＰＣ）＋
番号４１（Ｓｏ）＝６：１）および脂質組合せ１０（番号４０（ＰＥ）＋番号１２（ＰＣ
）＋番号４１（Ｓｏ）＝２：２：２）は、ＸＲＮ２、Ｓｓｕ７２、ＣＰＳＦ４ ｓｉＲＮ
ＡをＡ５４９細胞内へと効果的に送達することができ、タンパク質レベルでの発現レベル
が有意に低減された。
ｓｉＮＣ：脂質混合物およびｓｉＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終
濃度は４００ｎＭであった。
ｓｉＲＮＡ：脂質混合物およびＸＲＮ２、Ｓｓｕ７２、ＣＰＳＦ４ ｓｉＲＮＡの混合
物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
７）核酸送達に対する、脂質組合せ１１（番号４（Ｃｅｒ）＋番号１２（ＰＣ）＋番号
４１（Ｓｏ）＝１：１：１）の効果。
図９０に示されているように、逆相蒸散法により、脂質組合せ１１（番号４（Ｃｅｒ）
＋番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝１：１：１）は、Ｓｓｕ７２ ｓｉＲＮＡをＡ
５４９細胞内へと効果的に送達することができ、タンパク質レベルでの発現レベルが有意
に低減された。
ｓｉＮＣ：脂質混合物およびｓｉＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終
濃度は４００ｎＭであった。
ｓｉＳｓｕ７２：脂質混合物およびＳｓｕ７２ ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し
、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
［実施例６］
脂質番号３８およびその組合せの効果の検証
脂質番号３８ＰＥ（１６：０／１６：１）
Figure 2023078392000027
１．脂質による核酸送達の効率の定量リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）検出
（１）煮沸法による脂質番号３８は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９およびＭＲＣ－５細胞内
へと送達した。
図９１に示されているように、加熱法による脂質番号３８は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９
およびＭＲＣ－５細胞内へと送達した。ＭＲＣ－５細胞では、加熱法の場合、二本鎖ＲＮ
Ａに対する脂質番号３８の送達効果は、ＲＮＡｉＭＡＸの送達効果の約２倍であった。
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
２）自由取込み群：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡを、細胞と共に直接的に１２
時間インキュベートした。核酸の終濃度は１００ｎＭであった。
３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し
、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。ＨＪＴ－
ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖の終濃度は１００ｎＭであった。
４）脂質および核酸の処理群：２．５μＬの単一脂質番号３８およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ
－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、煮沸法または逆相蒸散法により調製し、その後Ａ５４
９細胞に添加した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。１２時間後、試料を収集して
、進入の量を検出した。
（２）煮沸法による脂質番号３８は、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖ＲＮＡを、Ａ５４
９およびＭＲＣ－５細胞内へと送達した。
図９２に示されているように、加熱法による脂質番号３８は、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７
一本鎖ＲＮＡをＡ５４９およびＭＲＣ－５細胞内へと送達した。送達効率は、ＲＮＡｉＭ
ＡＸの送達効率よりもはるかに高かった。
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
２）自由取込み群：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖ＲＮＡを、細胞と共に直接的に１２
時間インキュベートした。核酸の終濃度は１００ｎＭであった。
３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し
、その後、２つを混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖Ｈ
ＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。
４）脂質および核酸の処理群：２．５μＬの単一脂質番号６４およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ
－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、煮沸法または逆相蒸散法により調製し、その後Ａ５４
９細胞に添加した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。１２時間後、試料を収集して
、進入の量を検出した。
２．脂質による核酸送達の効率のデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）検出
２．１ 実験材料：Ａ５４９細胞は、Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｉｎｅｓ
ｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、ＴＲＩｚｏ
ｌ溶解緩衝液は、Ｓｉｇｍａから購入し、高容量ｃＲＮＡ逆転写キットは、ＡＢＩ、ＵＳ
Ａから購入し、デジタルＰＣＲ関連試薬は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＵＳＡから購入した。
２．２ 実験方法：全ＲＮＡを収集し、上記の方法に従ってＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液に
より抽出し、高容量ｃＲＮＡ逆転写キットを使用して、ｃＤＮＡへと逆転写し、異なる群
に由来するｃＤＮＡを、デジタルＰＣＲ反応にかけた。プロトコールは、ＱＸ２００ Ｄ
ｒｏｐｌｅｔ ＲｅａｄｅｒおよびＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアマニュアルを参照
；結果をＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアを使用して分析した。
（１）ナイーブ群：いかなる処理もしていないＡ５４９細胞。
（２）自由取込み群：細胞を、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡと共に直接的に６
時間共インキュベートした。
（３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡを、ＲＮＡｉＭＡＸに
よりＡ５４９細胞内へとトランスフェクトし、６時間後に試料を検出のために収集した。
（４）番号３８群：脂質番号３８は、異なる調製方法（煮沸法または逆相蒸散法）によ
り、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。６時間後に試料を検出のために収集し
た。
実験結果および分析：図９３に示されているように、煮沸法または逆相蒸散法では、脂
質番号３８は、ＨＪＴｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡをＡ５４９細胞内に効果的に送達する
ことができた。
３．脂質による核酸送達の効率のフローサイトメトリー検出
実験材料：Ａ５４９細胞（Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、ＦＡＭ－ｓＲＮ
Ａ（Ｒｉｂｏｂｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）、脂
質番号３８、Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６機器（ＢＤ、ＵＳＡから購入）。
実験方法：ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－６－ＦＡＭを、１００μｌの水に溶解し、４μｌの脂質
と混合し、煮沸法により脂質－ｓＲＮＡ混合物へと調製した。その後、混合物をＡ５４９
細胞に滴下し、共インキュベーションの６時間後、試料を収集し、ＰＢＳで３回洗浄し、
その後トリプシンで単離細胞へと消化し、洗浄してＰＢＳに再懸濁し、その後Ａｃｃｕｒ
ｉ（登録商標）Ｃ６機器で検出するために吹下した。
実験結果（図９４に示されている）：脂質番号３８は、７２．５％の効率でＰＧＹ－ｓ
ＲＮＡ－６一本鎖ＲＮＡを送達した。これは、陽性対照ＲＮＡｉＭＡＸの効率と近かった
。
４．脂質により細胞に送達された核酸の位置を観察するための共焦点蛍光顕微鏡法
実験材料：Ａ５４９細胞（Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）、ＰＧＹ－ｓ
ＲＮＡ－６－Ｃｙ３（Ｒｉｂｏｂｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
から購入した）、脂質番号３８、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７８０（Ｚｅｉｓｓ、ドイツから購
入した）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、ＵＳＡから購入した）、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡから購入した）
、パラホルムアルデヒド（ｓｉｇｍａ、ＵＳＡから購入した）。
実験方法：ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－６－ＦＡＭを、１００μｌの水に溶解し、４μｌの脂質
と混合し、煮沸法により調製した。その後、混合物をＡ５４９細胞に滴下し、共インキュ
ベーションの６時間後、試料をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し
、ＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジンで３０
分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩで５分間染色し、ＰＢＳで洗浄し、その後密
封した。
実験結果（図９５に示されている）：赤色のＰＧＹ－ｓＲＮＡ－６－Ｃｙ３の進入を、
共焦点顕微鏡で明白に観察することができた。脂質番号３８－ｓＲＮＡ混合物は、二本鎖
核酸をＡ５４９細胞内へと効果的に送達することができた。
［実施例７］
脂質番号６４およびその組成物の効果の検証
脂質番号６４ＰＥ（１５：０／２４：１（１５Ｚ））
Figure 2023078392000028
１．脂質による核酸送達の効率の定量リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）検出
（１）異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製された脂質番号６４は、ＨＪ
Ｔ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。
図９６に示されているように、脂質６４は、異なる調製方法（煮沸法または逆相蒸散法
）により、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。Ａ５４
９細胞では、煮沸法の場合、脂質番号６４の送達効果は、ＲＮＡｉＭＡＸの送達効果の約
３倍であった。
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
２）自由取込み群：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡを、細胞と共に直接的に１２
時間インキュベートした。核酸の終濃度は１００ｎＭであった。
３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：２μｌ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し
、混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、その後混合した。ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７
二本鎖の終濃度は、１００ｎＭであった。
４）脂質および核酸の処理群：２．５μＬの単一脂質番号６４およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ
－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、煮沸法または逆相蒸散法により調製し、その後Ａ５４
９細胞に添加した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。１２時間後、試料を収集して
、進入の量を検出した。
２．脂質による核酸送達の効率のフローサイトメトリー検出
実験材料：Ａ５４９細胞（Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、ＦＡＭ－ｓＲＮ
Ａ（Ｒｉｂｏｂｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）、脂質
番号６４、Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６機器（ＢＤ、ＵＳＡから購入）。
実験方法：ＦＡＭ－ｓＲＮＡを、１００μｌの水に溶解し、４μｌの脂質と混合し、煮
沸法により調製した。その後、脂質－ｓＲＮＡ混合物をＡ５４９細胞に滴下し、共インキ
ュベーションの６時間後、試料を収集し、ＰＢＳで３回洗浄し、その後トリプシンで単離
細胞へと消化し、ＰＢＳに再懸濁し、その後Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６機器で検出す
るために吹下した。
実験結果（図９７に示されている）：脂質番号６４は、陽性対照ＲＮＡｉＭＡＸの効率
の約半分（１／２）の効率で、ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－６一本鎖ＲＮＡを送達した。
３．脂質により細胞に送達された核酸の位置を観察するための共焦点蛍光顕微鏡法
実験材料：Ａ５４９細胞（Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）、ＰＧＹ－ｓ
ＲＮＡ－６－Ｃｙ３（Ｒｉｂｏｂｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
から購入した）、脂質番号６４、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７８０（Ｚｅｉｓｓ、ドイツから購
入した）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、ＵＳＡから購入した）、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡから購入した）
、パラホルムアルデヒド（ｓｉｇｍａ、ＵＳＡから購入した）。
実験方法：ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－６－ＦＡＭを、１００μｌの水に溶解し、４μｌの脂質
と混合し、煮沸法により調製した。その後、混合物をＡ５４９細胞に滴下し、共インキュ
ベーションの６時間後、試料をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し
、ＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジンで３０
分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩで５分間染色し、ＰＢＳで洗浄し、その後密
封した。
実験結果（図９８に示されている）：赤色のＰＧＹ－ｓＲＮＡ－６－Ｃｙ３の進入を、
共焦点顕微鏡で明白に観察することができた。脂質番号６４は、一本鎖ＲＮＡをＡ５４９
細胞内へと効果的に送達することができた。
［実施例８］
脂質番号４０およびその組成物の効果の検証
脂質番号４０ＰＥ（１６：０／２２：１）
Figure 2023078392000029
１．脂質による核酸送達の効率の定量リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）検出
（１）異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製された脂質番号４０は、二本
鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。
図９９に示されているように、異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製され
た脂質番号４０は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。Ａ５４９細胞では、逆
相蒸散法の場合、脂質番号４０の送達効果は、ＲＮＡｉＭＡＸの送達効果の約半分（１／
２）であった。
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
２）自由取込み群：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡを、細胞と共に直接的に１２
時間インキュベートした。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：２μＬ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μＬのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し
、その後、２つを混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、その後混合した。ＨＪＴ－
ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖の終濃度は１００ｎＭであった。
４）脂質および核酸の処理群：２．５μＬの単一脂質番号４０およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ
－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、煮沸法または逆相蒸散法により調製し、Ａ５４９細胞
に添加した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。１２時間後、試料を収集して、進入
の量を検出した。
２．脂質による核酸送達の効率のデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）検出
２．１ 実験材料：Ａ５４９細胞は、Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｉｎｅｓ
ｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、ＴＲＩｚｏ
ｌ溶解緩衝液は、Ｓｉｇｍａから購入し、ＴａｑＭａｎ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅ
ｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＫｉｔＨｉｇｈは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈ
ｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入し、デジタルＰＣＲ関連試薬は、Ｂｉｏ－Ｒａｄか
ら購入した。
２．２ 実験方法：全ＲＮＡを収集し、上記の方法に従ってＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液に
より抽出し、ＴａｑＭａｎ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒ
ｉｐｔｉｏｎ ＫｉｔＨｉｇｈを使用して、ｃＤＮＡへと逆転写し、異なる群に由来する
ｃＤＮＡを、デジタルＰＣＲ反応にかけた。プロトコールは、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅ
ｔ ＲｅａｄｅｒおよびＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアマニュアルを参照；結果をＱ
ｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアを使用して分析した。
（１）ナイーブ群：いかなる処理もしていないＡ５４９細胞
（２）自由取込み群：細胞を、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡと共に直接的に６
時間共インキュベートした。
（３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡを、ＲＮＡｉＭＡＸに
よりＡ５４９細胞内へとトランスフェクトし、６時間後に試料を検出のために収集した。
（４）番号４０群：異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製した脂質番号４
０は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。６時間後に試料を検出のために収集
した。
実験結果および分析：図１００に示されているように、煮沸法または逆相蒸散法では、
脂質番号４０は、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡをＡ５４９細胞内へと効果的に送
達することができた。
３．脂質により細胞に送達された核酸の位置を観察するための共焦点蛍光顕微鏡法
実験材料：Ａ５４９細胞（Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）、ＰＧＹ－ｓ
ＲＮＡ－６－Ｃｙ３（Ｒｉｂｏｂｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
から購入した）、脂質番号４０、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７８０（Ｚｅｉｓｓ、ドイツから購
入した）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、ＵＳＡから購入した）、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡから購入した）
、パラホルムアルデヒド（ｓｉｇｍａ、ＵＳＡから購入した）。
実験方法：ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－６－ＦＡＭを、１００μｌの水に溶解し、４μｌの脂質
と混合し、煮沸法により調製した。その後、混合物をＡ５４９細胞に滴下し、共インキュ
ベーションの６時間後、試料をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し
、ＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジンで３０
分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩで５分間染色し、ＰＢＳで洗浄し、その後密
封した。
実験結果（図１０１に示されている）：赤色のＰＧＹ－ｓＲＮＡ－６－Ｃｙ３の進入を
、共焦点顕微鏡で明白に観察することができた。脂質番号４０は、一本鎖ＲＮＡをＡ５４
９細胞内へと効果的に送達することができた。
４．脂質による核酸送達の効率のウエスタンブロッティング検出
図１０２に示されているように、ホスファチジルエタノールアミン単一脂質番号４０は
、抗線維化二本鎖ＲＮＡ ＨＪＴｓＲＮＡ－ｍ７がＭＲＣ－５細胞内へと進入して、フィ
ブロネクチンタンパク質発現を下方制御することを媒介した。
ＴＧＦ：ＴＧＦ－β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７
２時間後に試料を収集した。
３’－ＮＣ群：脂質混合物を使用してＮＣ模倣体を送達し、２４時間後、細胞をＴＧＦ
－β１タンパク質（終濃度は３ｎｇ／ｍＬであった）で刺激し、７２時間後に試料を収集
した。
３’－ｍ７群：脂質混合物およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液を、細胞に添
加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
［実施例８］
脂質番号３７の効果の検証
脂質番号３７ＬＰＣ（１８：３）
Figure 2023078392000030
１．脂質による核酸送達の効率の定量リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）検出
（１）脂質番号３７は、煮沸法により、一本鎖ＲＮＡをＡ５４９およびＭＲＣ－５細胞
内へと送達した。
図１０３に示されているように、一本鎖ＲＮＡは、煮沸法により、Ａ５４９およびＭＲ
Ｃ５細胞内へと送達された。
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
２）自由取込み群：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡを、細胞と共に直接的に３時
間インキュベートした。核酸の終濃度は１００ｎＭであった。
３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：２μＬ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μＬのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し
、混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、混合した。ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７一本鎖
の終濃度は、１００ｎＭであった。
４）脂質および核酸の処理群：２．５μＬの単一脂質番号３９およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ
－ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、煮沸法または逆相蒸散法により調製し、Ａ５４９細胞
に添加した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。３時間後、試料を収集して、進入の
量を検出した。
［実施例９］
脂質番号３９の効果の検証
脂質番号３９ＰＥ（１６：１－１８：１）
Figure 2023078392000031
１．脂質による核酸送達の効率の定量リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）検出
図１０４に示されているように、異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製さ
れた脂質番号３９は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
２）自由取込み群：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡを、細胞と共に直接的に６時
間インキュベートした。核酸の終濃度は１００ｎＭであった。
３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：２μＬ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μＬのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し
、混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、混合した。ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖
の終濃度は１００ｎＭであった。
４）脂質および核酸の処理群：２．５μＬの単一脂質番号３９およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ
－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、煮沸法または逆相蒸散法により調製し、Ａ５４９細胞
に添加した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。１２時間後、試料を収集して、進入
の量を検出した。
２．脂質による核酸送達の効率のデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）検出
２．１ 実験材料：Ａ５４９細胞は、Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、ＴＲＩｚｏｌ
溶解緩衝液は、Ｓｉｇｍａから購入し、高容量ｃＲＮＡ逆転写キットは、ＡＢＩ、ＵＳＡ
から購入し、デジタルＰＣＲ関連試薬は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＵＳＡから購入した。
２．２ 実験方法：全ＲＮＡを収集し、上記の方法に従ってＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液に
より抽出し、高容量ｃＲＮＡ逆転写キットを使用してｃＤＮＡへと逆転写し、異なる群に
由来するｃＤＮＡを、デジタルＰＣＲ反応にかけた。プロトコールは、ＱＸ２００ Ｄｒ
ｏｐｌｅｔ ＲｅａｄｅｒおよびＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアマニュアルを参照；
結果をＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアを使用して分析した。
（１）ナイーブ群：いかなる処理もしていないＡ５４９細胞。
（２）自由取込み群：細胞を、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡと共に直接的に６
時間；１２時間共インキュベートした。
（３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡを、ＲＮＡｉＭＡＸに
よりＡ５４９細胞内へとトランスフェクトし、６時間後、１２時間後に試料を検出のため
に収集した。
（４）番号３９群：脂質番号３９は、逆相蒸散法により、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞
内へと送達した。６時間、１２時間後に試料を検出のために収集した。
図１０５に示されているように、逆相蒸散法により、脂質番号３９は、ＨＪＴ－ｓＲＮ
Ａ－ｍ７ ｄｓＲＮＡをＡ５４９細胞内へと効果的に送達することができた。
［実施例１０］
脂質番号６０および番号６１２の効果の検証
脂質番号６０ ｄＭｅＰＥ（１６：１／１６：１）
Figure 2023078392000032
１．脂質による核酸送達の効率の定量リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）検出
図１０６に示されているように、異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製さ
れた脂質番号６０は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。
７）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
８）自由取込み群：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡを、細胞と共に直接的に６時
間インキュベートした。核酸の終濃度は１００ｎＭであった。
ＲＮＡｉＭＡＸ群：２μＬ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖Ｈ
ＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μＬのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、そ
の後、２つを混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ
－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
４）脂質および核酸：２．５μＬの単一脂質番号６０およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二
本鎖核酸溶液の混合物を、煮沸法または逆相蒸散法により調製し、細胞に添加した。ＲＮ
Ａの終濃度は１００ｎＭであった。１２時間後、試料を収集して、進入の量を検出した。
脂質番号６２ ｄＭｅＰＥ（１６：１／１８：１）
１．脂質による核酸送達の効率の定量リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）検出
図１０７に示されているように、異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製し
た脂質番号６２は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
２）自由取込み群：ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ ｄｓＲＮＡを、細胞と共に直接的に６時
間インキュベートした。核酸の終濃度は１００ｎＭであった。
３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：２μＬ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μＬのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し
、その後、２つを混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、その後混合した。ＨＪＴ－
ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖の終濃度は１００ｎＭであった。
４）脂質および核酸の処理群：２．５μＬの単一脂質番号６２およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ
－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、煮沸法または逆相蒸散法により調製し、細胞に添加し
た。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。１２時間後、試料を収集して、進入の量を検
出した。
脂質核酸混合物のＩｎ ｖｉｖｏ送達実験
１．実験動物：Ｃ５７マウス、雄、およそ６週齢。
２．脂質混合物の製造：調製は、マウス１匹当たり１０μｌの脂質－１ｎｍｏｌ ｓＲ
ＮＡの用量に基づき以下のように実施した：１ｎｍｏｌの各ｓＲＮＡを、５００μｌのＤ
ＥＰＣ水に溶解し、１０μｌの対応する脂質を添加し、ピペットして徹底的に混合し、次
いで９０℃にて１５分間の水浴後に自然冷却し、胃管栄養で投与する。
３．ｓＲＮＡ：ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－２６、ＰＧＹｓＲＮＡ－３２
４．実験群：
１）ナイーブ群：５００μｌの生理食塩水の胃内投与。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：１０μｌのＲＮＡｉＭＡＸ－１ｎｍｏｌ ｓＲＮＡを、徹
底的に混合し、各マウスに胃内投与した。この群は、陽性対照群としての役目を果たした
。ＲＮＡｉＭＡＸは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
３）自由取込み群：ｓＲＮＡ溶液（１ｎｍｏｌ／動物、５００μＬ）を直接添加した。
この群は対照としての役目を果たした。
４）脂質核酸混合物の処理群：ステップ２で調製した脂質－ｓＲＮＡ混合物を胃内投与
した。
５．進入の相対量の検出
１）組織サンプリングおよびＲＮＡの抽出：マウスに胃管栄養した６時間後に、５００
μｌの血液を眼球から採取し、１．５ｍｌのＴｒｉｚｏｌ試薬ＬＳを添加して徹底的に混
合および溶解し、３ｍｌのＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した）を組
織試料に添加し、完全に溶解するまでホモジナイズする。組織はサンプリングした：肝臓
／胃／小腸。
２）ｃＤＮＡへのｓＲＮＡの逆転写：逆転写キット（高容量ｃＤＮＡ逆転写キット、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３６８８１３）を使用して、全Ｒ
ＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。逆転写系は以下の通りであった：鋳型ＲＮＡ（１５０ｎ
ｇ／μＬ）１０μＬ、１０×ＲＴ緩衝液、２．０μＬ、２５×ｄＮＴＰミックス（１００
ｍＭ）０．８μＬ、ランダムプライマー ２．０μＬ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（商標）
逆転写酵素 １．０μＬ、ＲＮａｓｅ阻害剤 １．０μＬ、無ヌクレアーゼＨ２Ｏ ３．
２μＬ。短時間遠心分離した後、反応をＰＣＲ反応器にロードした。反応条件は以下の通
りであった：（１）２５℃、１０分間；（２）３７℃、１２０分間；（３）８５℃、５分
間；（４）４℃、反応停止。反応後に２０μＬの無ＲＮａｓｅ ｄｄＨ２Ｏを添加して、
最終容積を４０μＬにした。
３）定量ＰＣＲ増幅反応：ｑＰＣＲ反応系は、５μｌの２×ＳＹＢＲグリーンマスター
ミックス、０．５μｌのフォワードプライマー（１０μＭ）、０．５μＬのリバースプラ
イマー、逆転写による１μｌのｃＤＮＡ、３μｌの無ＲＮａｓｅ ｄＨ２Ｏを含む１０μ
ｌの全容積を有していた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０蛍光定量ＰＣＲ機器を使用した
。ＰＣＲ反応条件は以下の通りであった：９５℃で５分間のプレ変性、その後ＰＣＲ増幅
サイクル：（１）９５℃、１０秒間；（２）５５℃、１０秒間；（３）７２℃、２０秒間
；合計４０サイクル；最後に４０℃で１０秒間の冷却。増幅反応のフォワードプライマー
およびリバースプライマーは、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｑｉｎｇ ｋｅ Ｎｅｗ Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により設計および合成された
。（Ｕ６ Ｆプライマー：ＧＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧＴＴＣ、Ｕ６ Ｒプライマー
：ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ）。
３）相対発現量を、２－ΔＣｔ法で算出した。
［実施例１１－１］
単一脂質番号４１による一本鎖核酸のｉｎ ｖｉｖｏでの送達
１．実験動物：Ｃ５７マウス、雄、およそ６週齢。
１）ナイーブ群：５００μｌの生理食塩水の胃内投与。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：１０μｌのＲＮＡｉＭＡＸ－１ｎｍｏｌ ｓＲＮＡを混合
し、各マウスに胃内投与した。この群は、陽性対照群としての役目を果たした。ＲＮＡｉ
ＭＡＸは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
３）自由取込み群：一本鎖ｓＲＮＡ混合物溶液（各１ｎｍｏｌ）を直接添加した（各１
ｎｍｏｌ）
４）単一脂質および核酸混合物の処理群：１０μＬの単一脂質（番号４１）と一本鎖ｓ
ＲＮＡ混合物溶液（ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－２３、ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－２６、およびＰＧＹ－
ｓＲＮＡ－３２、各１ｎｍｏｌ）との混合物を、加熱法により処理し、その後胃内投与で
マウスに投与した。
２．胃内投与の１２時間後、眼球から血液を採取し、種々の組織（肝臓／胃／小腸）を
サンプリングした。ＴＲＩｚｏｌを使用して完全に溶解し、ＲＮＡを抽出して、進入の量
を検出した。
結論：
図１０８に示されているように、単一ＰＥ（番号４１）は、ｓＲＮＡ一本鎖核酸を、経
口投与によりマウス血液中へと効果的に送達し、ｓＲＮＡを分解から保護することができ
た。送達効果は、ＰＯＰＣおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸよりも良
好であった。
図１０９に示されているように、単一ＰＥ（番号４１）は、ｓＲＮＡ一本鎖核酸を、経
口投与によりマウス胃内へと効果的に送達し、ｓＲＮＡを分解から保護することができた
。
図１１０に示されているように、単一ＰＥ（番号４１）は、ｓＲＮＡ一本鎖核酸を、経
口投与によりマウス小腸内へと効果的に送達し、ｓＲＮＡを分解から保護することができ
た。
図１１１に示されているように、単一ＰＥ（番号４１）は、ｓＲＮＡ一本鎖核酸を、経
口投与によりマウス肝臓内へと効果的に送達し、ｓＲＮＡを分解から保護することができ
た。
［実施例１１－２］
ｉｎ ｖｉｖｏでの単一脂質番号３８による一本鎖核酸の送達
１．実験動物：Ｃ５７マウス、雄、およそ６週齢。
１）ナイーブ群：５００μｌの生理食塩水の胃内投与。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：１０μｌのＲＮＡｉＭＡＸ－１ｎｍｏｌ ｓＲＮＡを混合
し、各マウスに胃内投与した。この群は、陽性対照群としての役目を果たした。ＲＮＡｉ
ＭＡＸは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
３）自由取込み群：一本鎖ｓＲＮＡ混合物溶液（各１ｎｍｏｌ）を直接添加した（各１
ｎｍｏｌ）。
４）ＰＯＰＣおよび核酸の処理群：加熱法により処理した、１０μＬのＰＯＰＣおよび
一本鎖ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－３２ ｓＲＮＡ（各１ｎｍｏｌ）混合物溶液の混合物を、胃管
栄養によりマウスに投与した。
５）単一脂質および核酸混合物の処理群：加熱法により処理した、１０μＬの単一脂質
（番号３８）および一本鎖ｓＲＮＡ（ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－３２）混合物溶液（各１ｎｍｏ
ｌ）の混合物を、経管栄養によりマウスに投与した。
２．胃管栄養の１２時間後に、眼球から血液を採取し、進入の量を検出するために、Ｔ
ＲＩｚｏｌにより溶解して、ＲＮＡを抽出した。
結論：
図１１２に示されているように、単一ＰＥ（番号３８）は、ｓＲＮＡ一本鎖核酸を、経
口投与によりマウス血液中へと効果的に送達することができた。送達効果は、ＰＯＰＣお
よびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸよりも良好であった。
［実施例１１－３］
ｉｎ ｖｉｖｏでの単一脂質番号４０による一本鎖核酸の送達
１．実験動物：Ｃ５７マウス、雄、およそ６週齢。
１）ナイーブ群：５００μｌの生理食塩水の胃内投与。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：１０μｌのＲＮＡｉＭＡＸ－１ｎｍｏｌ ｓＲＮＡを混合
し、各マウスに胃内投与した。この群は、陽性対照群としての役目を果たした。ＲＮＡｉ
ＭＡＸは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
３）自由取込み群：一本鎖ｓＲＮＡ混合物溶液を直接添加した（各１ｎｍｏｌ）。
４）ＰＯＰＣおよび核酸の処理群：加熱法により処理した、１０μＬのＰＯＰＣおよび
一本鎖ｓＲＮＡ（各１ｎｍｏｌ）混合物溶液の混合物を、胃管栄養によりマウスに投与し
た。
５）単一脂質および核酸混合物の処理群：加熱法により処理した、１０μＬの単一脂質
（番号４０）および一本鎖ｓＲＮＡ（ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－３２およびＰＧＹ－ｓＲＮＡ－
２６、各１ｎｍｏｌ）混合物溶液の混合物を、経管栄養によりマウスに投与した。
２．胃管栄養の１２時間後に、眼球から血液を採取し、進入の量を検出するために、Ｔ
ＲＩｚｏｌにより溶解して、ＲＮＡを抽出した。
結論：
図１１３に示されているように、単一ＰＥ（番号４０）は、ｓＲＮＡ一本鎖核酸を、経
口投与によりマウス血液中へと効果的に送達することができた。送達効果は、ＰＯＰＣお
よびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸよりも良好であった。
［実施例１１－４］
ｉｎ ｖｉｖｏでの単一脂質番号６４による一本鎖核酸の送達
１．実験動物：Ｃ５７マウス、雄、およそ６週齢。
１）ナイーブ群：５００μｌの生理食塩水の胃内投与。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：１０μｌのＲＮＡｉＭＡＸ－１ｎｍｏｌ ｓＲＮＡを混合
し、各マウスに胃内投与した。この群は、陽性対照群としての役目を果たした。ＲＮＡｉ
ＭＡＸは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
３）自由取込み群：一本鎖ｓＲＮＡ混合物溶液を直接添加した（各１ｎｍｏｌ）。
４）ＰＯＰＣおよび核酸の処理群：加熱法により処理した、１０μＬのＰＯＰＣおよび
一本鎖ｓＲＮＡ（各１ｎｍｏｌ）混合物溶液の混合物を、胃管栄養によりマウスに投与し
た。
５）単一脂質および核酸混合物の処理群：加熱法により処理した、１０μＬの単一脂質
（番号６４）および一本鎖ｓＲＮＡ（ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－３２、各１ｎｍｏｌ）混合物溶
液の混合物を、経管栄養によりマウスに投与した。
２．胃管栄養の１２時間後に、眼球から血液を採取し、進入の量を検出するために、Ｔ
ＲＩｚｏｌにより溶解して、ＲＮＡを抽出した。
結論：
図１１４に示されているように、単一ＰＥ（番号６４）は、ｓＲＮＡ一本鎖核酸を、経
口投与によりマウス血液中へと効果的に送達することができた。送達効果は、ＰＯＰＣお
よびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸよりも良好であった。
［実施例１１－５］
ｉｎ ｖｉｖｏでの単一脂質番号７１による一本鎖核酸の送達
１．実験動物：Ｃ５７マウス、雄、およそ６週齢。
１）ナイーブ群：５００μｌの生理食塩水の胃内投与。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：１０μｌのＲＮＡｉＭＡＸ－１ｎｍｏｌ ｓＲＮＡを混合
し、各マウスに胃内投与した。この群は、陽性対照群としての役目を果たした。ＲＮＡｉ
ＭＡＸは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
３）自由取込み群：一本鎖ｓＲＮＡ混合物溶液を直接添加した（各１ｎｍｏｌ）。
４）ＰＯＰＣおよび核酸の処理群：加熱法により処理した、１０μＬのＰＯＰＣおよび
一本鎖ｓＲＮＡ（各１ｎｍｏｌ）混合物溶液の混合物を、胃管栄養によりマウスに投与し
た。
５）単一脂質および核酸混合物の処理群：加熱法により処理した、１０μＬの単一脂質
（番号７１）および一本鎖ｓＲＮＡ混合物（ＰＧＹ－ｓＲＮＡ－３２、各１ｎｍｏｌ）溶
液の混合物を、経管栄養によりマウスに投与した。
２．胃管栄養の１２時間後に、眼球から血液を採取し、進入の量を検出するために、Ｔ
ＲＩｚｏｌにより溶解して、ＲＮＡを抽出した。
結論：
図１１５に示されているように、単一ＰＥ（番号７１）は、ｓＲＮＡ一本鎖核酸を、経
口投与によりマウス血液中へと効果的に送達することができた。送達効果は、ＰＯＰＣお
よびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸよりも良好であった。
［実施例１２］
脂質は、様々な温度勾配にて、一本鎖核酸をＭＲＣ－５細胞内へと効果的に送達する。
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μＬ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および
一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液を、１００μＬのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でそれぞれ希
釈し、その後、２つを混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、その後混合した。一本
鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。
３）単一脂質および核酸混合物の処理群：異なる温度にて煮沸法により処理した、２．
５μＬの単一脂質（番号３８）およびＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を
、細胞に添加し、その後混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
４℃：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、２．５μＬの単一脂質を添
加し、１５分間４℃に置いておいた。細胞に添加した６時間後に、細胞でのＨＪＴ－ｓＲ
ＮＡ－ｍ７の発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより検出した。
３７℃：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、２．５μＬの単一脂質を
添加し、１５分間３７℃に置いておいた。細胞に添加した６時間後に、細胞でのＨＪＴ－
ｓＲＮＡ－ｍ７の発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより検出した。
６０℃：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、２．５μＬの単一脂質を
添加し、１５分間５０℃に置いておいた。細胞に添加した６時間後に、細胞でのＨＪＴ－
ｓＲＮＡ－ｍ７の発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより検出した。
８０℃：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、２．５μＬの単一脂質を
添加し、１５分間５０℃に置いておいた。細胞に添加した６時間後に、細胞でのＨＪＴ－
ｓＲＮＡ－ｍ７の発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより検出した。
１００℃：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７溶液に、２．５μＬの単一脂質
を添加し、１５分間５０℃に置いておいた。細胞に添加した６時間後に、細胞でのＨＪＴ
－ｓＲＮＡ－ｍ７の発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより検出した。
結論：
図１１６に示されているように、結果は、異なる温度条件での煮沸法による脂質が、核
酸を細胞内へと効果的に送達することができ（統計的に有意に、ｐ＜０．０１）、臨床の
場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。

Claims (66)

  1. 核酸送達試薬を製造するための、下記式を有する天然に（伝統的漢方薬抽出物を含む）
    または合成に由来する化合物の使用であって、抽出物は、下記式の構造を有するか、また
    は下記式の構造を有する化合物を含み、
    Figure 2023078392000033
     式中、Ｌ１、Ｌ２、もしくはＬ３は存在しないか、またはＬ１、Ｌ２、およびＬ３は、
    各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２
    －、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ
    ）ＮＨ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ２－、
    Figure 2023078392000034
     からなる群から選択され、
    但し、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の最大で２つは存在せず、
    ２価基Ｌ１およびＬ２に関して、左側のダッシュ「－」は、それぞれ基ＡおよびＢに連
    結され、右側のダッシュ「－」は、中央の炭素原子に連結され、
    ２価基Ｌ３に関して、左側のダッシュ「－」は、中央の炭素原子に連結され、右側のダ
    ッシュ「－」は、基Ｑに連結され、
    Ａ、Ｂ、およびＱは、各々独立して、Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１～２０アルキル、Ｃ１～２０ア
    ルケニル、Ｃ１～２０ヘテロアルキル、Ｃ１～２０ヘテロアルケニル、－ＮＨ２、および
    －ＮＲ３ ＋からなる群から選択され、Ｒは、ＨまたはＣ１～６アルキルであり、
    ｎは、整数０、１、２、３、または４であり、
    好ましくは、核酸は、小分子核酸であり、好ましくは一本鎖または二本鎖であり、好ま
    しくは、小分子核酸の長さは、１４～３２ｂｐ、１６～２８ｂｐ、または１８～２４ｂｐ
    であり、
    好ましくは、伝統的漢方薬は、ロディオラ・クレヌラータ、モウコタンポポ、アンドロ
    グラフィス・パニクラータ、およびスイカズラの煎出片からなる群から選択され、好まし
    くは、抽出物は、脂溶性成分をＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法で抽出することにより、より好ま
    しくは、漢方薬煎出片を水に浸漬し、その後激しい加熱およびゆっくりとした加熱を順に
    実施することにより得られ、加熱した漢方薬スープを濃縮し、その後クロロホルム－メタ
    ノールおよび水を順に添加して撹拌し、クロロホルム層を得、
    好ましくは、試薬は、経口試薬であり、好ましくは、核酸は、がん、例えば胃がんまた
    は肺がんなどの疾患を処置するために使用される、使用。
  2. 前記構造において、
    Ｌ１は、存在しないか、またはＬ１は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、および－ＣＨ（ＯＨ
    ）－から選択され、
    Ｌ２は、存在しないか、またはＬ２は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、および－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－から
    選択され、
    Ｌ３は、存在しないか、またはＬ３は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－
    ＣＨ２－、および
    Figure 2023078392000035
     からなる群から選択され、
    Ａは、Ｈ、Ｃ１～２０アルキル、およびＣ１～２０アルケニルからなる群から選択され
    、
    Ｂは、Ｈ、－ＮＨ２、Ｃ１～２０アルキル、およびＣ１～２０アルケニルからなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１～２０アルキルおよびＣ１～２０アルケニル、ならびに－ＮＲ
    ３ ＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１～６アルキルである、請求項１に記載の
    使用。
  3. 前記化合物は、下記式の構造：
    Figure 2023078392000036
     を有する、請求項１または２に記載の使用。
  4. 構造において、
    Ａは、Ｈ、Ｃ１０～２０アルキル、およびＣ１０～２０アルケニルからなる群から選択
    され、
    Ｂは、Ｈ、－ＮＨ２、Ｃ１０～２０アルキル、およびＣ１０～２０アルケニルからなる
    群から選択され、
    Ｑは、Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１０～２０アルキル、およびＣ１０～２０アルケニル、ならびに
    －ＮＲ３ ＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１～４アルキルである、前記請求項
    のいずれか一項に記載の使用。
  5. 前記構造において、
    Ａは、Ｈ、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からな
    る群から選択され、
    Ｂは、Ｈ、－ＮＨ２、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５～１８アルケニ
    ル基からなる群から選択され、
    Ｑは、Ｈ、－ＯＨ、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル
    基、ならびに－ＮＲ３ ＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１～４アルキル基であ
    り、
    Ａ、Ｂ、およびＱのアルケニル基は、１～５個の二重結合を有する、請求項４に記載の
    使用。
  6. 前記構造のＡ、Ｂ、Ｑにおいて、アルケニル基は、１～４個の二重結合を有し、Ｚ配置
    にある、請求項５に記載の使用。
  7. Ａ、Ｂ、Ｑにおいて、アルケニル基は、１～３個の二重結合を有し、Ｚ配置にある、請
    求項６に記載の使用。
  8. 前記抽出物は、下記式から選択されるか、または下記式から選択される化合物を含み、
    Figure 2023078392000037
     式中、
    Ａは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基から選択され
    、
    Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基から選択され
    、
    Ｑは、Ｈ、－ＯＨ、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル
    基、ならびに－ＮＲ３＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはメチルであり、
    Ｌ３は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
  9. 抽出物は、リゾレシチン、セラミド、ジグリセリド、ホスファチジルエタノールアミン
    、ホスファチジルコリン、トリグリセリド、モノガラクトシルジグリセリド、（神経）ス
    フィンゴシン、ホスファチジルエタノール、モノアシルグリセロール、脂肪酸、血小板活
    性化因子、またはジメチルホスファチジルエタノールアミンであるかまたはそれを含む、
    前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
  10. 前記抽出物は、表１に示されている脂質から選択されるか、または表１から選択される
    いずれか１つまたは複数の脂質を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
  11. 前記抽出物は、番号４１、番号７１、番号１１、番号１２、番号３８、番号６４、番号
    ４０、番号３７、番号３９、番号６０、番号６２として表１に示されている脂質のいずれ
    か１つ、または表１の他の脂質のいずれか１つもしくは複数とのその組合せ、またはいず
    れか１つもしくは複数の脂質および他の関連化学物質とのその組合せを含む、前記請求項
    のいずれか一項に記載の使用。
  12. 核酸送達試薬の製造における、表１に示されているいずれか１つまたは複数の脂質を含
    む組合せの使用であって、好ましくは、組合せは、番号４１、番号７１、番号１１、番号
    １２、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、および番号６２
    として表１に示されている脂質のいずれか１つ、または表１の他の脂質のいずれか１つも
    しくは複数とのその組合せ、またはいずれか１つもしくは複数の脂質および他の関連化学
    物質とのその組合せを含み、好ましくは、前記核酸は、小分子核酸であり、好ましくは一
    本鎖または二本鎖であり、好ましくは、小分子核酸は、１４～３２ｂｐ、１６～２８ｂｐ
    、または１８～２４ｂｐの長さを有し、好ましくは、試薬は、経口試薬であり、好ましく
    は、核酸は、がん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処置するために使用される、
    使用。
  13. 核酸送達試薬の製造における、伝統的漢方薬の使用であって、好ましくは、核酸は、小
    分子核酸であり、好ましくは一本鎖または二本鎖であり、好ましくは、小分子核酸は、１
    ４～３２ｂｐ、１６～２８ｂｐ、または１８～２４ｂｐの長さを有し、好ましくは、試薬
    は、経口試薬であり、好ましくは、核酸は、がん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患
    を処置するために使用される、使用。
  14. 前記伝統的漢方薬は、ロディオラ・クレヌラータ、モウコタンポポ、アンドログラフィ
    ス・パニクラータ、およびスイカズラ漢方薬煎出片から選択される、請求項１３に記載の
    使用。
  15. 試薬は、伝統的漢方薬から抽出されるかまたは人為的に合成される化合物を含み、好ま
    しくは、化合物は、脂溶性成分をＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法で抽出することにより、または
    伝統的漢方薬を煎出することにより得られ、より好ましくは、漢方薬煎出片を水に浸漬し
    、その後激しい加熱およびゆっくりとした加熱を順に実施し、加熱した漢方薬スープを濃
    縮し、その後クロロホルム－メタノール、クロロホルムおよび水を順に添加して撹拌し、
    クロロホルム層を得る、請求項１３または１４に記載の使用。
  16. 前記化合物は、請求項１～１１のいずれか一項に示されている構造を有するか、あるい
    は試薬は、表１に示されているいずれか１つまたは複数の脂質、好ましくは、番号４１、
    番号７１、番号１１、番号１２、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、
    番号６０、および番号６２として表１に示されている脂質のいずれか１つ、または表１の
    他の脂質のいずれか１つもしくは複数とのその組合せ、またはいずれか１つもしくは複数
    の脂質および他の関連化学物質とのその組合せを含む、請求項１５に記載の使用。
  17. 化合物は、リゾレシチン、セラミド、ジグリセリド、ホスファチジルエタノールアミン
    、ホスファチジルコリン、トリグリセリド、モノガラクトシルジグリセリド、（神経性）
    スフィンゴシン、ホスファチジルエタノール、モノアシルグリセロール、脂肪酸、血小板
    活性化因子、またはジメチルホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される
    、請求項１６に記載の使用。
  18. 化合物は、表１から選択される、請求項１７に記載の使用。
  19. 前記化合物は、番号４１、番号７１、番号１１、番号１２、番号３８、番号６４、番号
    ４０、番号３７、番号３９、番号６０、および番号６２として表１に示されている脂質か
    ら選択される、請求項１８に記載の使用。
  20. 送達は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞送達またはｉｎ ｖｉｖｏ胃腸管送達を含む、請求項１
    ３～１８のいずれか一項に記載の使用。
  21. 使用は、脂質核酸混合物の製造を含む、請求項１３～２０のいずれか一項に記載の使用
    。
  22. 脂質核酸混合物は、煮沸法により、または逆相蒸散法により、または直接混合により製
    造される、請求項２１に記載の使用。
  23. 煮沸法での温度は、約４℃から約１００℃まで、約２５℃から約１００℃まで、好まし
    くは、約８０℃から約１００℃まで、すなわち、４℃、３７℃、６０℃、８０℃、または
    １００℃であり、逆相蒸散法での温度は、約２５℃から約７０℃まで、好ましくは、約５
    ５℃である、請求項２２に記載の使用。
  24. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の構造の１つまたは複数の脂質抽出物および核酸
    を含む医薬組成物であって、好ましくは、脂質は、表１のいずれか１つまたは複数の脂質
    、好ましくは、番号４１、番号７１、番号１１、番号１２、番号３８、番号６４、番号４
    ０、番号３７、番号３９、番号６０、および番号６２として表１に示されているいずれか
    １つの脂質、または表１の他の脂質のいずれか１つまたは複数とのその組合せ、またはい
    ずれか１つもしくは複数の脂質および他の関連化学物質とのその組合せから選択され、好
    ましくは、核酸は、小分子核酸であり、好ましくは一本鎖または二本鎖であり、好ましく
    は、小分子核酸は、１４～３２ｂｐ、１６～２８ｂｐ、または１８～２４ｂｐの長さを有
    し、好ましくは、医薬組成物は、経口医薬組合せであり、好ましくは、医薬組成物は、が
    ん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処置するために使用される、医薬組成物。
  25. 脂質および核酸の少なくとも一部または全部は、脂質核酸混合物の形態で存在する、請
    求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 脂質核酸混合物は、煮沸法により、または逆相蒸散法により、または直接混合により製
    造される、請求項２５に記載の医薬組成物。
  27. 煮沸法での温度は、約４℃から約１００℃まで、約２５℃から約１００℃まで、好まし
    くは、約８０℃から約１００℃まで、すなわち、４℃、３７℃、６０℃、８０℃、または
    １００℃であり、逆相蒸散法での温度は、約２５℃から約７０℃まで、好ましくは、約５
    ５℃である、請求項２６に記載の医薬組成物。
  28. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の構造を有し、好ましくは、表１の、好ましくは
    、番号４１、番号７１、番号１１、番号１２、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７
    、番号３９、番号６０、および番号６２として表１に示されているいずれか１つまたは複
    数の脂質、または表１の他の脂質のいずれか１つもしくは複数とのその組合せ、またはい
    ずれか１つもしくは複数の脂質および他の関連化学物質とのその組合せから選択される１
    つまたは複数の脂質、核酸を含むキットであって、脂質および核酸は、各々独立して第１
    の容器および第２の容器に入れて提供され、第１の容器および第２の容器は同じであって
    もよくまたは異なっていてもよく、好ましくは、核酸は、小分子核酸であり、好ましくは
    一本鎖または二本鎖であり、好ましくは、小分子核酸は、１４～３２ｂｐ、１６～２８ｂ
    ｐ、または１８～２４ｂｐの長さを有し、好ましくは、キットは、経口キットであり、好
    ましくは、キットは、がん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処置するために使用
    される、キット。
  29. 前記脂質および核酸の少なくとも一部または全部は、使用直前に脂質核酸混合物へと調
    製される、請求項２８に記載のキット。
  30. 脂質核酸混合物の調製方法は、煮沸法であるか、または逆相蒸散法であるか、または直
    接混合である、請求項２９に記載のキット。
  31. 前記煮沸法での温度は、約４℃から約１００℃まで、約２５℃から約１００℃まで、好
    ましくは、約８０℃から約１００℃まで、すなわち、４℃、３７℃、６０℃、８０℃、ま
    たは１００℃であり、逆相蒸散法での温度は、約２５℃から約７０℃まで、好ましくは、
    約５５℃である、請求項３０に記載のキット。
  32. 核酸を標的細胞内へと送達する方法であって、核酸は、請求項２４～２７のいずれか一
    項に記載の医薬組成物または請求項２８～３１のいずれか一項に記載のキットの形態で提
    供され、好ましくは、核酸は、小分子核酸であり、好ましくは、一本鎖または二本鎖であ
    り、好ましくは、小分子核酸は、１４～３２ｂｐ、１６～２８ｂｐ、または１８～２４ｂ
    ｐの長さを有し、好ましくは、核酸は、がん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処
    置するために使用される、方法。
  33. 核酸を、それを必要とする対象にｉｎ ｖｉｖｏで送達する方法であって、核酸は、請
    求項２４～２７のいずれか一項に記載の医薬組成物または請求項２８～３１のいずれか一
    項に記載のキットから提供され、好ましくは、前記核酸は、小分子核酸であり、好ましく
    は、一本鎖または二本鎖であり、好ましくは、前記小分子核酸は、１４～３２ｂｐ、１６
    ～２８ｂｐ、または１８～２４ｂｐの長さを有し、好ましくは、前記核酸は、がん、例え
    ば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処置するために使用される、方法。
  34. 対象は、ヒト、または哺乳動物などの動物である、請求項３３に記載の方法。
  35. 核酸は、対象の血液循環または標的組織／細胞にｉｎ ｖｉｖｏで送達される、請求項
    ３３～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 請求項２４～２７のいずれか一項に記載の医薬組成物または請求項２８～３１のいずれ
    か一項に記載のキットを、必要とする対象に消化管により直接送達することを含む、請求
    項３５に記載の方法。
  37. 核酸および脂質は、投与および／または注射用に調製されている、請求項２４～２７の
    いずれか一項に記載の医薬組成物または請求項２８～３１のいずれか一項に記載のキット
    。
  38. 核酸および脂質は、消化投与または呼吸投与用に調製されている、請求項３７に記載の
    医薬組成物またはキット。
  39. 核酸および脂質は、経口投与または吸入投与用に調製されている、請求項３７または３
    ８に記載の医薬組成物またはキット。
  40. 核酸は、小分子ＲＮＡである、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の医薬組成物ま
    たはキット。
  41. 核酸は、ステム－ループ構造を有する、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の医薬
    組成物またはキット。
  42. 小分子ＲＮＡは、１４～３２ｂｐまたは１８～２４ｂｐの長さを有し、例えば、長さは
    、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、
    ２７、２８、２９、３０、３１、および３２ｂｐである、請求項３７～４１のいずれか一
    項に記載の医薬組成物またはキット。
  43. 伝統的漢方薬から抽出されるかまたは人為的に合成される、核酸送達に使用することが
    できる化合物であって、以下の構造を有し、
    Figure 2023078392000038
     Ｌ１、Ｌ２、もしくはＬ３は存在しないか、またはＬ１、Ｌ２、およびＬ３は、各々独
    立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２－、－
    ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ
    －、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ２－、
    Figure 2023078392000039
     からなる群から選択され、
    但し、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の最大で２つは存在せず、
    ２価基Ｌ１、Ｌ２に関して、左側のダッシュ「－」は、それぞれ基ＡおよびＢに連結さ
    れ、右側のダッシュ「－」は、中央の炭素原子に連結され、
    ２価基Ｌ３に関して、左側のダッシュ「－」は、中央の炭素原子に連結され、右側のダ
    ッシュ「－」は、基Ｑに連結され、
    Ａ、Ｂ、およびＱは、各々独立して、Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１～２０アルキル、Ｃ１～２０ア
    ルケニル、Ｃ１～２０ヘテロアルキル、Ｃ１～２０ヘテロアルケニル、－ＮＨ２、および
    －ＮＲ３ ＋からなる群から選択され、Ｒは、ＨまたはＣ１～６アルキルであり、
    ｎは、０、１、２、３、または４の整数であり、好ましくは、化合物は経口化合物であ
    り、好ましくは、核酸は、がん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処置するために
    使用される、化合物。
  44. Ｌ１は存在しないか、またはＬ１は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－および－ＣＨ（ＯＨ）－
    からなる群から選択され、
    Ｌ２は存在しないか、またはＬ２は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－および－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－からなる
    群から選択され、
    Ｌ３は存在しないか、またはＬ３は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ
    Ｈ２－、および
    Figure 2023078392000040
     からなる群から選択され、
    Ａは、Ｈ、Ｃ１～２０アルキル、およびＣ１～２０アルケニルからなる群から選択され
    、
    Ｂは、Ｈ、－ＮＨ２、Ｃ１～２０アルキル、およびＣ１～２０アルケニルからなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１～２０アルキルおよびＣ１～２０アルケニル、ならびに－ＮＲ
    ３ ＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１～６アルキルであり、好ましくは、伝統
    的漢方薬は、ロディオラ・クレヌラータ、モウコタンポポ、アンドログラフィス・パニク
    ラータ、およびスイカズラ漢方薬煎出片から選択され、好ましくは、化合物は、脂溶性成
    分をＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法で抽出することにより、より好ましくは、漢方薬煎出片を水
    に浸漬し、その後激しい加熱およびゆっくりとした加熱を順に実施することにより得られ
    、加熱した漢方薬スープを濃縮し、その後クロロホルム－メタノール、クロロホルムおよ
    び水を添加して撹拌し、クロロホルム層を得、好ましくは、核酸は、小分子核酸であり、
    好ましくは一本鎖または二本鎖であり、小分子核酸は、１４～３２ｂｐ、１６～２８ｂｐ
    、または１８～２４ｂｐの長さを有する、請求項４３に記載の化合物。
  45. 下記式を有する、請求項４３または４４に記載の化合物。
    Figure 2023078392000041
  46. Ａは、Ｈ、Ｃ１０～２０アルキルおよびＣ１０～２０アルケニルからなる群から選択さ
    れ、
    Ｂは、Ｈ、－ＮＨ２、Ｃ１０～２０アルキル、およびＣ１０～２０アルケニルからなる
    群から選択され、
    Ｑは、Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１０～２０アルキル、およびＣ１０～２０アルケニル、ならびに
    －ＮＲ３ ＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１～４アルキルである、請求項４３
    ～４５のいずれか一項に記載の化合物。
  47. Ａは、Ｈ、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からな
    る群から選択され、
    Ｂは、Ｈ、－ＮＨ２、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５～１８アルケニ
    ル基からなる群から選択され、
    Ｑは、Ｈ、－ＯＨ、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル
    基、ならびに－ＮＲ３ ＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１～４アルキル基であ
    り、
    Ａ、Ｂ、およびＱのアルケニル基は、１～５個の二重結合を有する、請求項４３～４６
    のいずれか一項に記載の化合物。
  48. 前記構造のＡ、Ｂ、Ｑにおいて、アルケニル基は、１～４個の二重結合を有し、Ｚ配置
    にある、請求項４３～４７のいずれか一項に記載の化合物。
  49. 構造のＡ、Ｂ、Ｑにおいて、アルケニル基は、１～３個の二重結合を有し、Ｚ配置にあ
    る、請求項４３～４８のいずれか一項に記載の化合物。
  50. 下記式から選択され、
    Figure 2023078392000042
     式中、
    Ａは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、Ｈ、－ＯＨ、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル
    基、ならびに－ＮＲ３ ＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはメチルであり、
    Ｌ３は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である、請求項４３～４９のいずれか一項に記載の化合物。
  51. 表１に示されている脂質から選択される、請求項４３～５０のいずれか一項に記載の化
    合物。
  52. 番号４１、番号７１、番号１１、番号１２、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７
    、番号３９、番号６０、または番号６２として表１に示されている脂質から選択される、
    請求項４３～５１のいずれか一項に記載の化合物。
  53. 核酸送達を容易にする方法であって、核酸および伝統的漢方薬抽出物、天然または合成
    に由来する任意の化合物、好ましくは、請求項１～１１のいずれか一項に記載の脂質を加
    熱または加温することを含み、加熱または加温の温度は、好ましくは、約４℃から約１０
    ０℃まで、約２５℃から約１００℃まで、好ましくは約５０℃から約１００℃まで、より
    好ましくは、約９５℃から約１００℃まで、特に好ましくは、約８０℃から約１００℃ま
    で、すなわち、４℃、３７℃、６０℃、８０℃、または１００℃であり、好ましくは、核
    酸は、小分子核酸であり、好ましくは一本鎖または二本鎖であり、好ましくは、小分子核
    酸は、１４～３２ｂｐ、１６～２８ｂｐ、または１８～２４ｂｐの長さを有し、好ましく
    は、核酸送達は、経口投与により、好ましくは、核酸は、がん、例えば胃がんまたは肺が
    んなどの疾患を処置するために使用される、方法。
  54. 伝統的漢方薬抽出物は、請求項１～９のいずれか一項に記載の構造の化合物を含む、請
    求項５３に記載の方法。
  55. 伝統的漢方薬抽出物は、表１に示されているいずれか１つまたは複数の脂質を含む、請
    求項５３に記載の方法。
  56. 伝統的漢方薬抽出物は、番号４１、番号７１、番号１１、番号１２、番号３８、番号６
    ４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、番号６２として表１に示されている脂質
    のいずれか１つ、または表１の他の脂質のいずれか１つもしくは複数とのその組合せ、ま
    たはいずれか１つもしくは複数の脂質および他の関連化学物質とのその組合せを含む、請
    求項５３に記載の方法。
  57. 組合せは、下記のいずれか１つである：
    番号８：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号３８：番号４１＝６：１の脂質組合せ；
    番号３９：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号４０：番号４１＝６：１の脂質組合せ；
    番号３８：番号１２：番号４１：番号２９＝１：１：２：１の脂質組合せ；番号４０：番
    号１２：番号４１＝２：４：３の脂質組合せ；番号１２：番号４１＝１：６の脂質組合せ
    ；番号１２：番号４１＝１：１の脂質組合せ；番号１２：番号４１＝６：１の脂質組合せ
    ；番号４０：番号１２：番号４１＝２：２：２の脂質組合せ；番号４：番号１２：番号４
    １＝１：１：１の脂質組合せ；番号１：番号２：番号３：番号１９：番号３５＝１：１：
    １：１：１のＤＧ組合せ；番号６：番号９：番号１０：番号１３：番号１５：番号１６：
    番号１８：番号２０：番号２１：番号２２：番号２３：番号２４：番号２５：番号２６：
    番号２７：番号２８：番号３２：番号３３＝１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：
    １：１：１：１：１：１：１：１のＴＧ組合せ；番号３６：番号３７＝１：１のＬＰＣ組
    合せ；番号１１：番号１２＝１：１のＰＣ組合せ；番号８：番号３８＝１：１のＰＥ組合
    せ；番号４：番号１４＝１：１のＣｅｒ組合せ；番号１７：番号３０：番号３１＝１：１
    ：１のＳｏ組合せ；番号５、番号７を含まない番号１～３６の等容積組合せ；番号５、番
    号７、番号３４を含まない番号１～３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号１、番号
    ２、番号３、番号１９、番号３５を含まない番号１～３６の等容積組合せ；番号５、番号
    ７、番号６、番号９、番号１０、番号１３、番号１５、番号１６、番号１８、番号２０、
    番号２１、番号２２、番号２３、番号２４、番号２５、番号２６、番号２７、番号２８、
    番号３２、番号３３を含まない番号１～３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号３６
    、番号３７を含まない番号１～３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号１１、番号１
    ２を含まない番号１～３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号８を含まない番号１～
    ３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号４、番号１４を含まない番号１～３６の等容
    積組合せ；番号５、番号７、番号２９を含まない番号１～３６の等容積組合せ；番号１：
    番号３４＝２：１の脂質組合せ；番号１：前記ＤＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１
    ：前記ＴＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１：前記ＬＰＣ組合せ＝２：１の脂質組合
    せ；番号１：番号８＝２：１の脂質組合せ；番号１：番号１２＝２：１の脂質組合せ；番
    号１：前記Ｃｅｒ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１：前記Ｓｏ組合せ＝２：１の脂質
    組合せ；番号１：番号２９＝２：１の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２＝１：１：
    １の脂質組合せ；番号８：番号３４＝２：１の脂質組合せ；番号８：前記ＤＧ組合せ＝２
    ：１の脂質組合せ；番号８：前記ＴＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：前記ＬＰＣ
    組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：番号３７＝４：１の脂質組合せ；番号８：番号１
    ２＝２：１の脂質組合せ；番号８：前記Ｃｅｒ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：前
    記Ｓｏ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：番号３１＝６：１の脂質組合せ；番号８：
    番号２９＝２：１の脂質組合せ；番号１２：番号３４＝２：１の脂質組合せ；番号１２：
    前記ＤＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１２：前記ＴＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ
    ；番号１２：前記ＬＰＣ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１２：番号８＝２：１の脂質
    組合せ；番号１１：前記Ｃｅｒ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１２：前記Ｓｏ組合せ
    ＝２：１の脂質組合せ；番号１２：番号２９＝２：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：
    番号１＆２＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号１５＝２：１：１の脂質
    組合せ；番号１２：番号８：番号３６＆３７＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号
    ８：番号１１＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号１２＝２：１：１の脂
    質組合せ；番号１２：番号８：番号４＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番
    号３１＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９＝２：１：１の脂質組合
    せ；番号１２：番号８：番号３４＝３：２：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３
    ４＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２＝４：２：３の脂質組合せ；番
    号１２：番号８：番号２＝１６：８：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３２＝４
    ：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３７＝４：２：３の脂質組合せ；番号１
    ２：番号８：番号１１＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３８＝４：２
    ：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号４＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番
    号８：番号３１＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９＝４：２：３の
    脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１＝２：１：１：１の脂質組合せ；番
    号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号３４＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番
    号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号２＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号
    １２：番号８：番号２９：番号３１：番号３２＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号
    １２：番号８：番号２９：番号３１：番号１１＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号
    １２：番号８：番号２９：番号３１：番号３７＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号
    １２：番号８：番号２９：番号３１：番号３８＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号
    １２：番号８：番号２９：番号３１：番号４＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１
    ２：番号８：番号２９：番号３１：番号４：番号１：番号１６＝２：１：１：３：２：２
    ：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号１＆２＝２：２：２：３の脂質組合
    せ；番号１：番号８：番号１２：番号１５＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号
    ８：番号１２：番号３６＆３７＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１
    ２：番号１２＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号４＝２：
    ２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号３１＝２：２：２：３の脂質
    組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号２９＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号８：
    番号３４：番号１＆２＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号１５＝２：１
    ：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号３６＆３７＝２：１：１の脂質組合せ；番号
    ８：番号３４：番号１２＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号４＝２：１
    ：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号３１＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番
    号３４：番号２９＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号３４＝１２：３：
    ５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号
    ３１：番号３７＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号１１＝１２：３：
    ５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号１２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番
    号３１：番号４＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号２９＝１２：３：
    ５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号３２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番
    号４：番号３４＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号２＝１２：３：５の
    脂質組合せ；番号８：番号４：番号３７＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：
    番号１２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号３１＝１２：３：５の脂質
    組合せ；番号８：番号４：番号２９＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号
    ３２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号３８：番号３４＝２：１の脂質組合せ；番号３８
    ：番号１＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番
    号１＆２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１５＝２：１の脂質組合せ；番号３８：
    番号３２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号３７＝２：１の脂質組合せ；番号３８：
    番号３７＝４：１の脂質組合せ；番号３８：番号１１＝２：１の脂質組合せ；番号３８：
    番号１２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１１＆１２＝２：１の脂質組合せ；番号
    ３８：番号１２＝４：１の脂質組合せ；番号３８：番号８＝２：１の脂質組合せ；番号３
    ８：番号４＝２：１の脂質組合せ；番号３８：Ｓｏ（３０）＝２：１の脂質組合せ；番号
    ３８：番号３１＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号２９＝２：１の脂質組合せ；番号
    １：番号３８：番号１２：番号３４＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：
    番号１２：番号１５＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号
    ３７＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号８＝２：２：２
    ：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号４＝２：２：２：３の脂質組合せ
    ；番号１：番号３８：番号１２：番号３１＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号
    ３８：番号１２：番号２９＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号１
    ＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号１５＝２：１：３の脂質組合せ；
    番号３８：番号３４：番号３７＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号１
    ２＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号８＝２：１：３の脂質組合せ；
    番号３８：番号３４：番号４＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３１
    ＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号２９＝２：１：３の脂質組合せ；
    番号３８：番号１２：番号１＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号２＝
    ４：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１５＝２：１：３の脂質組合せ；番
    号３８：番号１２：番号３７＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号８＝
    ２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４＝２：１：３の脂質組合せ；番号
    ３８：番号１２：番号３１＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号２９＝
    ２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１：番号１５：番号３４＝２２：２
    ２：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１：番号１５：番号３７
    ＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１：番号１５
    ：番号４＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１：
    番号１５：番号３１＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２
    ：番号１：番号１５：番号２９＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８
    ：番号３４：番号３７：番号１＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号
    ３４：番号３７：番号１５＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号３４
    ：番号３７：番号１２＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番
    号３７：番号４＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７
    ：番号３１＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号
    ３４＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号１＝４
    ４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号１５＝４４：２
    ２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３７＝４４：２２：３
    ３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３７＝８：２：５：３の脂質
    組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３１＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ
    ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号
    ３８：番号１２：番号４：番号２９：番号３４＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質
    組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９：番号１＝８８：４４：６６：７２：１
    ３５の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９：番号１５＝８８：４４：６
    ６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９：番号３７＝８
    ８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９：
    番号３１＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４
    ：番号２＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号６＝
    ２
    ０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号１７＝２０：１０
    ：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９＝２０：１０：１５：
    ９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３４＝２０：１０：１５：９の脂質
    組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３７＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；
    番号３８：番号１２：番号３１：番号３４＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番
    号１２：番号３１：番号１＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３
    １：番号１５＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号３７
    ＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号４＝２：１：３：
    ３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号２９＝２：１：３：３の脂質組合
    せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１：番号１＝８８：４４：６６：７２：１３
    ５の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１：番号１５＝８８：４４：６
    ６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１：番号１２＝
    ８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３
    １：番号４＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号
    ３７：番号３１：番号２９＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：
    番号３７：番号３４＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１＝４：２：
    ３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番
    号３７：番号１＆２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号２＝３２：８
    ：５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号３２＝３２：８：５の脂質組合せ；番号３
    ８：番号３７：番号１５＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号３２＝４
    ：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号８＝４：２：３の脂質組合せ；番号３
    ８：番号３７：番号１１＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１２＝４
    ：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１１＆１２＝４：２：３の脂質組合せ
    ；番号３８：番号３７：番号１２＝４：１：１の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号
    ４＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号３０＝４：２：３の脂質組合せ
    ；番号３８：番号３７：番号３１＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号
    ２９＝４：２：３の脂質組合せ；番号８：番号３７：番号３２＝４：１：２の脂質組合せ
    ；番号８：番号３７：番号２＝４：１：２の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５
    ：番号３４＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番
    号１＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号１２
    ＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号４＝６４
    ：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号３１＝６４：１
    ６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号２９＝６４：１６：
    １０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号３７＝４：２：３の脂質組合せ；番号
    ３８：番号２：番号３１＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号２９＝４：
    ２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号３４＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８
    ：番号２：番号３２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号１２＝４：２：
    ３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号１２＝４：５：１の脂質組合せ；番号３８：番
    号２：番号４＝４：２：３の脂質組合せ；番号１＆２、番号１１＆１２、および番号３６
    ＆３７は、それぞれ、任意の比率の脂質番号１および番号２、任意の比率の脂質番号１１
    および番号１２、任意の比率の脂質番号３６および番号３７を表す、請求項１１、１２、
    または１６に記載の使用、請求項２４に記載の医薬組成物、または請求項２８に記載のキ
    ット。
  58. 核酸送達試薬を製造するための、下記式を有する化合物の使用であって、
    Figure 2023078392000043
     式中、
    Ｌ１、Ｌ２、もしくはＬ３は、存在しないか、またはＬ１、Ｌ２、およびＬ３は、各々
    独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）、－Ｃ（
    Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－からなる群から選択され、
    但し、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の最大で２つは存在せず、
    ２価基Ｌ１、Ｌ２に関して、左側のダッシュ「－」は、それぞれ基ＡおよびＢに連結さ
    れ、右側のダッシュ「－」は、中央の炭素原子に連結され、
    ２価基Ｌ３に関して、左側のダッシュ「－」は、中央の炭素原子に連結され、右側のダ
    ッシュ「－」は、基Ｑに連結され、
    Ａ、Ｂ、およびＱは、独立して、Ｈ、－ＯＨ、Ｃ１～２０アルキル、Ｃ１～２０アルケ
    ニル、－ＮＨ２、および－ＮＲ３ ＋からなる群から選択され、Ｒは、ＨまたはＣ１～６ア
    ルキルであり、
    好ましくは、試薬は、経口試薬であり、好ましくは、核酸は、がん、例えば胃がんまた
    は肺がんなどの疾患を処置するために使用される、使用。
  59. 化合物は、以下の構造を有し、
    Figure 2023078392000044
     式中、
    Ａは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、－ＯＨであり、
    好ましくは、
    Ａは、直鎖Ｃ１５～２０アルキル基および直鎖Ｃ１５～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１５～２０アルキル基および直鎖Ｃ１５～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、－ＯＨであり、
    好ましくは、
    Ａは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、－ＯＨである、請求項５８に記載の使用。
  60. 化合物は、以下の構造を有し、
    Figure 2023078392000045
     式中、
    Ａは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２２アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２２アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２２アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    好ましくは、
    Ａは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２２アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２２アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２２アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    好ましくは、
    Ａは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択される、請求項５８に記載の使用。
  61. 化合物は、以下の構造を有し、
    Figure 2023078392000046
     式中、
    Ａは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、－ＯＨであり、
    好ましくは、
    Ａは、直鎖Ｃ１５～２０アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、－ＯＨであり、
    好ましくは、
    Ａは、直鎖Ｃ１５～２０アルキル基であり、
    Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基であり、
    Ｑは、－ＯＨである、請求項５８に記載の使用。
  62. 化合物は、以下の構造を有し、
    Figure 2023078392000047
     式中、
    Ａは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、－ＯＨであり、
    好ましくは、
    Ａは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、－ＯＨであり、
    好ましくは、
    Ａは、直鎖Ｃ１５～２０アルキル基であり、
    Ｑは、－ＯＨである、請求項５８に記載の使用。
  63. 脂質または化合物は、以下の構造を有し、
    Figure 2023078392000048
     式中、
    Ａは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、－ＯＨであり、
    好ましくは、
    Ａは、直鎖Ｃ１５～２０アルキル基および直鎖Ｃ１５～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１５～２０アルキル基および直鎖Ｃ１５～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、－ＯＨであり、
    好ましくは、
    Ａは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、－ＯＨである、請求項１～２３のいずれか一項に記載の使用、請求項２４～２７
    のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項２８～３１のいずれか一項に記載のキット、
    請求項３２～３６および５３～５６のいずれか一項に記載の方法、または請求項４３に記
    載の方法。
  64. 前記化合物は、以下の構造を有し、
    Figure 2023078392000049
     式中、
    Ａは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２２アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２２アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２２アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    好ましくは、
    Ａは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２２アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２２アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２２アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    好ましくは、
    Ａは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択される、請求項６３に記載の使用、医薬組成物、キット、または方法。
  65. 化合物は、以下の構造を有し、
    Figure 2023078392000050
     式中、
    Ａは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、－ＯＨであり、
    好ましくは、
    Ａは、直鎖Ｃ１５～２０アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、－ＯＨであり、
    好ましくは、
    Ａは、直鎖Ｃ１５～２０アルキル基であり、
    Ｂは、直鎖Ｃ１５～１８アルキル基であり、
    Ｑは、－ＯＨである、請求項６３に記載の使用、医薬組成物、キット、または方法。
  66. 化合物は、以下の構造を有し、
    Figure 2023078392000051
     式中、
    Ａは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１０～２０アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、－ＯＨであり、
    好ましくは、
    Ａは、直鎖Ｃ１０～２０アルキル基および直鎖Ｃ１５～１８アルケニル基からなる群か
    ら選択され、
    Ｑは、－ＯＨであり、
    好ましくは、
    Ａは、直鎖Ｃ１５～２０アルキル基であり、
    Ｑは、－ＯＨである、請求項６３に記載の使用、医薬組成物、キット、または方法。
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