KR20230042591A - 게놈 및 하위 게놈 바이러스 RNA의 RNAi 매개 조절을 위한 기질 서열 - Google Patents

게놈 및 하위 게놈 바이러스 RNA의 RNAi 매개 조절을 위한 기질 서열 Download PDF

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크리스찬 로베르토 마린-멀러
오스발도 베가 마르티네즈
후안 카를로스 발베르데-에르난데스
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스페라툼 바이오파마 아이엔씨.
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Abstract

RNAi 서열을 식별하는 방법으로서, gRNA로부터 하나 이상의 7-mer에 대하여 선별검사하는 단계; 하나 이상의 7-mer의 제1 수를 선택하는 단계; 하나 이상의 7-mer 각각에 대해 하나 이상의 적중 부위를 특성화하는 단계; 7-mer 각각에 대해 게놈 영역당 적중을 계산하는 단계; 7-mer의 제2 수를 선택하는 단계; 7-mer 각각에 연관된 하나 이상의 15-mer에 대한 빈도 행렬을 생성하는 단계; 7-mer 각각에 대해 생성된 하나 이상의 15-mer를 생성하는 단계; 하나 이상의 생성된 15-mer 각각에 대해 gRNA 내 적중을 특성화하는 단계; 누적 적중 빈도 및 길이에 기반하여 요약 지수를 계산하는 단계; 및 하나 이상의 생성된 특징 및 하나 이상의 구조적 특징에 기반하여 RNAi 서열의 제3 수를 선택하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.

Description

게놈 및 하위 게놈 바이러스 RNA의 RNAi 매개 조절을 위한 기질 서열
우선권 주장
본 출원은 2020년 8월 12일에 출원한 미국 가출원 특허 제63/064,446호의 우선권을 주장하며, 이의 내용은 본원에 원용된다.
본 발명은 일반적으로 RNAi 서열 분야에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 RNAi 서열 식별을 위한 장치, 방법 및 시스템에 관한 것이다.
코로나바이러스, 특히 SARS-CoV-2는 전 세계적으로 유행하는 코로나(Covid)-19 질병으로 이어지는 바이러스 발병을 일으켰다. 전 세계적으로 현재 상황으로 인해 전 세계적인 공중 보건 비상 사태가 발생하였다.
세계보건기구(WHO)에 따르면, 인간 병원체로서 2020년 8월 현재 전 세계적으로 1,800만 건 이상의 코로나-19 사례가 확인되었으며 최소 687,000명이 사망하였다. 2021년 8월까지, 전 세계 감염 사례 및 사망자 수는 2억 건 이상으로 증가했으며 적어도 400만 명이 사망하였다.
SARS-CoV-2가 인간에서 인간으로 쉽게 전염되어 여러 대륙으로 확산되고 2020년 1월 30일 WHO의 국제적 공중보건 비상사태(Public Health Emergency of International Concern, PHEIC) 선언으로 이어지는 것으로 현재 공지되고 이해되고 있다.
과학자들이 가능한 새로운 치료법을 개발하는 데 진전을 보였지만, 그러한 고도로 실험적인 치료법의 효능과 안전성은 아직 입증되지 않았으며 많은 질문에 답하지 못한 채 남아 있다. SARS-CoV-2에 대한 백신 또는 기타 항바이러스 치료법이 가장 필요하지만, 여전히 많은 것들이 효과성이 부족하다.
효능은 SARS-CoV-2 대유행을 치료하는 데 매우 중요하지만, 이러한 치료법은 안전성도 입증되어야 한다. 실제로, 광범위한 효능 시험에 참여하기 전에 안전성을 입증하기 위해 더 작은 규모의 안전성 시험을 실행해야 하므로, 추가 시간이 필요하다.
따라서, SARS-CoV-2 치료에 대한 성공 가능성 및 잠재적 승인 시간을 최대화하기 위해 효능과 안전성의 기회가 증가된 치료법을 제공하는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 본 개시의 발명은 잠재적인 7-mer 서열을 식별하는 단계; 및 하나 이상의 적중(hit) 부위를 등록하는 단계를 포함하는, RNAi 서열을 식별하는 방법일 수 있으며, 여기서 하나 이상의 적중 부위는 잠재적인 7-mer 서열이 존재하는 게놈 RNA 서열 내 하나 이상의 위치이다. 일 구현예에서, 방법은 하나 이상의 적중 부위와 함께 7-mer 서열이 발견된 게놈 영역의 이름, 및 7-mer 서열 시작 위치에서 시작하는 등록된 15-mer 서열을 등록하는 단계; 등록된 15-mer 서열을 사용하여, 각 위치에 대한 가장 빈번한 뉴클레오티드를 기반으로 각 7-mer 서열에 대한 뉴클레오티드 위치 빈도 행렬 및 생성된 15-mer를 생성하는 단계; 및 생성된 15-mer 서열을 사용하여, 추정되는 RNAi 분자에 대한 하나 이상의 적중을 예측하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 방법은 또한 하나 이상의 등록된 적중 부위에 대한 적중 가능성 지수를 계산하는 단계; 일반 지수를 생성하는 단계; 및 요약 행렬을 개발하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 표적 RNA에서 가장 많은 7-mer에 대하여 선별검사하여 잠재적인 7-mer 서열을 식별할 수 있다. 일 구현예에서, 추정되는 RNAi 분자에 대한 하나 이상의 적중은 완벽한 매칭(matching)을 기반으로 예측될 수 있다. 일 구현예에서, 적중 가능성 지수는 적중 부위의 상류 및 하류에서 30개 뉴클레오티드의 AU 함량 비율 및 일치 서열 ΔG 값을 기반으로 각각의 적중 부위에 가중치를 할당할 수 있다. 적중 가능성 지수는 하기의 수학식을 통해 계산할 수 있고:
Figure pct00001
, 여기서 n은 m 적중 부위를 예측하는 데 사용되는 생성된 15-mer이고, H는 적중 가능성이고, ΔG는 염기쌍 형성만을 고려하여 일치가 발생하는 데 필요한 자유 에너지이며, p(AU)는 적중 부위의 상류 및 하류의 30 nt의 비율이다.
일 구현예에서, 일반 지수는 하기의 수학식에 의해 계산할 수 있고:
Figure pct00002
, 여기서 IG는 적중의 효과를 요약하는 일반 지수이고, A는 일치의 n 생성된 15-mer에 대한 적중의 양이다. 요약 행렬은 7-mer, 7-mer의 생성된 15-mer, 센스 가닥, RNAi 제안 서열, 적중 가능성 지수, 및 일반 지수를 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 요약 행렬은 제안된 안티센스 가닥을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 요약 행렬은 종자(seed) 서열 GC 함량 및 가이드(guide) 가닥 GC 함량을 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 개시의 발명은 gRNA로부터 하나 이상의 7-mer에 대하여 선별검사하는 단계; 하나 이상의 7-mer의 제1 수를 선택하는 단계로서, 제1 수는 하나 이상의 7-mer의 빈도에 기반하는, 단계; 및 하나 이상의 7-mer 각각에 대해 하나 이상의 적중 부위를 특성화하는 단계를 포함하는, RNAi 서열을 식별하는 방법일 수 있다. 방법은 하나 이상의 7-mer 각각에 대해 게놈 영역당 적중을 계산하는 단계; 하나 이상의 7-mer의 제2 수를 선택하는 단계로서, 제2 수는 sgRNA 내 가장 많은 적중에 기반하는, 단계; 및 하나 이상의 7-mer 각각에 연관된 하나 이상의 15-mer에 대한 빈도 행렬을 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 방법은 또한 가장 빈번한 뉴클레오티드에 기반하여 하나 이상의 7-mer 각각에 대해 생성된 하나 이상의 15-mer를 생성하는 단계; 하나 이상의 생성된 15-mer 각각에 대해 gRNA 내 적중을 특성화하는 단계; 누적 적중 빈도 및 길이에 기반하여 요약 지수를 계산하는 단계; 및 하나 이상의 생성된 특징 및 하나 이상의 구조적 특징에 기반하여 RNAi 서열의 제3 수를 선택하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 제1 수, 제2 수, 및 제3 수는 임의의 적절한 양일 수 있다. 일 구현예에서, 제1 수는 500일 수 있다. 일 구현예에서, 제2 수는 50일 수 있다. 일 구현예에서, 제3 수는 5일 수 있다. 일 구현예에서, 하나 이상의 생성된 특징 및 하나 이상의 구조적 특징은 요약 지수의 함수일 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 RNAi 설계 작업흐름의 구현예를 도시한다.
도 2a는 5개의 RNAi SARS-CoV-2 침묵화(silencing) 서열을 도시한 표이다.
도 2b는 RNAi SARS-CoV-2 침묵화 서열의 매칭 부위의 수를 도시한 표이다.
도 3a는 SARS-CoV-2 RNA를 공격할 수 있는 서열을 도시한 표이다.
도 3b는 SARS-CoV-2 RNA의 3'UTR(번역되지 않은 영역)을 도시한 도면이다. 도 4는 NPM-SC2 서열 3'UTR 조절을 도시한 그래프이다.
도 5는 NPM-SC2 서열 세포독성을 도시한 그래프이다.
SARS-CoV-2에 대한 신규의 치료법이 본원에 제공된다. 구현예에서, RNA 간섭(RNAi) 분자와 같은 리보핵산(RNA)이 활용된다. RNAi 분자는 바이러스 RNA 번역의 하향 조절에 사용될 수 있다.
짧은 간섭 RNA(siRNA)는 특정 표적 서열에 결합하도록 설계될 수 있다. 비표적(off-target) 효과가 비특이적 결합을 통해 발생할 수 있으며 siRNA 설계에 한계를 제시할 수 있다. 마이크로RNA(miRNA)는 자연 발생 RNAi 분자이다. miRNA는 불완전한 쌍형성(pairing) 덕분에 다수의 상이한 표적을 동시에 표적으로 삼도록 진화했을 수 있다는 점에서 siRNA와 상이하다. 이러한 불완전한 쌍형성은 표준 siRNA 조절과 상이한 차등 조절 반응으로 이어진다. 구현예에 따르면, 본원에 기재된 RNAi 분자는 siRNA와 유사한 방식으로 합성 분자로서 설계되지만, miRNA와 같이 불완전한 쌍형성의 허용 가능성을 고려한다. 따라서, 생성된 항바이러스성 올리고뉴클레오티드는 더 광범위하고 더 유연한 표적화를 제공하고, 비표적 효과를 예상할 수 있다.
SARS-CoV-2는 이의 30 kb의 고유한 내포된(nested) 복제 전략으로 인해 대략 니도바이러스과(Nidoviridae)에서 발견되거나, 또는 유사한 크기의 단일가닥 바이러스 RNA가 각각 다수의 단백질을 부호화하는 더 작은 많은 메신저(messenger) RNA(mRNA)로 처리된다. SARS-CoV-2 mRNA는 3'UTR을 함유하며, 내포된 RNA 복제 과정이 시작된 후에도 표적화 부위는 그대로 유지된다. 따라서, 본 발명에 따르면, 바이러스 RNA에 대한 RNAi 기반 공격이 제안되어 이러한 내포된 서열을 표적으로 삼는다.
본 발명에 따라, 하기의: 가닥 특이적 RNA 서열(ssRNA); 비표준 처리; 패신저(passenger) 가닥 없음; 바이러스 게놈에서 표적을 최대화하기 위해 인간 게놈에서 표적 최소화; 임의의 적합한 핵산 전달 비히클로 투여 가능; 증가된 침묵화 비율, 생체 활성 상태로의 짧은 처리 경로; 균주 간의 유전적 다양성을 줄이기 위한 다중 표적화 부위; 표준 이중체와 비교하여 단순화된 생성 및 분리/정제 및 대체 siRNA 구조체 설계 내로 삽입 가능 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는 siRNA 및 miRNA 서열이 제안된다.
본 발명의 원리에 따르면, SARS-CoV-2의 게놈 이해는 코로나-19와 관련된 신규의 코로나바이러스를 치료하기 위해 맞춤화된 약물 및 치료법을 개발하는 데 사용될 수 있다. 따라서, SARS-CoV-2의 바이러스 RNA는 항 SARS-CoV-2 치료제인 siRNA로 표적화될 수 있다.
일 구현예에서, siRNA는 SARS-CoV-2 RNA의 다중 표적 부위에 작용할 수 있는 능력 및 잠재력을 갖도록 특별히 설계되었다. 일 구현예에서, 특히, siRNA는 (1) mRNA의 3'UTR 영역 및 (2) SARS-CoV-2 RNA의 부호화 영역(CDS) 상의 복수의 부위에 작용하도록 설계된다. 번역 종결 코돈 바로 뒤에 위치하기 때문에, 3'UTR mRNA는 유전자 발현 조절을 담당할 수 있으므로, 치료제를 수용하기에 매우 적합하다. 이러한 부위를 siRNA로 표적화함으로써, Ago2 매개 절단이 발생할 수 있으며, 이는 리보솜 진입 전에 바이러스 RNA를 파괴하여 SARS-CoV-2의 바이러스 복제를 감소시킬 수 있다.
대안적으로, 바이러스 RNA 번역의 억제는 바이러스 RNA의 리보솜 탈락 억제 또는 격리를 통해 모두 표적 서열과의 상호작용을 통해 발생할 수 있다.
RNA 바이러스는 돌연변이를 일으킬 가능성이 있으며, 이러한 바이러스에 대한 RNAi 유도 분자의 사용은 siRNA 활동에 필요한 특정 상보성으로 인해 불완전한 일치를 발생시킬 수 있다. 또한, siRNA는 상대적으로 긴 서열의 무결성을 요구하는 경향이 있으며, 이는 의도된 표적 RNA와 적절하게 일치하기 위해 돌연변이를 훨씬 더 번거롭게 만들 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 miRNA처럼 거동하는 합성 올리고뉴클레오티드의 생성을 통해 siRNA의 높은 상보성에 대한 요건 및 가능성 있는 돌연변이를 다루는 것을 고려한다. 종종, miRNA는 덜 특이적이고 더 적합하게는 표적 RNA당 더 많은 수의 일치 부위와 일치할 수 있다. 이와 같이, 조절 표적 부위에 대한 다중 기능성(promiscuity)의 증가로 인하여, 특정 RNA 표적에 대한 miRNA 조절은 siRNA 표적화와 비교하여 유전적 가변성 및 돌연변이에 더 적합할 수 있다. 단 하나의 일치 부위만 존재하기 때문에, siRNA 상보적 부위의 결실은 표적 RNA에 대한 siRNA의 침묵화 효과를 제거하여 돌연변이가 이의 조절을 파괴할 가능성을 증가시킨다. 이와 대조적으로, miRNA는 표적에 대한 다수의 상보적 부위를 가지고 있어 하나의 일치 부위가 결실되거나 변경된 경우에도 조절을 유지할 수 있다. 하지만, 일 구현예에서, 올바른 서열을 가진 단일 표적 부위는 효과적인 조절을 위해 충분할 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 선택된 RNA 표적에서 상보적인 부위의 수를 최대화하면서 침묵화 특이성을 증가시키도록 특별히 제형화된 독점 RNAi가 제공된다. 이와 같이, RNA 기반 바이러스는 높은 돌연변이 비율에도 불구하고 효과적으로 치료할 수 있다. 이에 따라, 다수의 구현예에 따르면, 본 발명은 돌연변이 및 표적 파괴의 위험을 감소시키면서 항바이러스 표적화를 최대화하기 위해 잠재적인 표적화 부위를 식별하는 시스템 및 방법을 제공하고, 표적 서열을 설계하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, RNAi 분자의 조합은 miRNA 또는 siRNA 설계된 분자와 함께 사용될 수 있거나, 또는 단독으로 사용될 수 있다. RNAi 분자는 바이러스 게놈의 임의의 또는 다수의 부분을 표적으로 할 수 있다.
도 1을 참조하면, 도 1은 본 발명에 따른 RNAi 설계 작업흐름의 비제한적 예를 도시한다. 제1 단계(102)에서, 잠재적인 RNAi 서열의 식별이 실시된다(예를 들어, SARS-CoV-2 gRNA로부터의 7-mer 선별검사). 제2 단계(104)에서, 표적 RNA에서 가장 빈번한 7-mer(예를 들어, 선택된 500개의 가장 빈번한 7-mer)를 검색함으로써 잠재적인 7-뉴클레오티드 종자(seed) 서열을 검색할 수 있다.
비제한적인 예로서, 5'UTR 및 CDS는 5'UTR 및 CDS의 조절을 통해 전사체의 침묵화를 발생시키는 RNA 유도 침묵화 과정으로 인해 평가할 수 있다. 일 구현예에서, 7'mer를 수집한 후, 단계(104)에서, 추가 분석을 위해 가장 빈번한 500개를 선택할 수 있다.
다음 단계(106)에서, 적중 부위로서 공지된, 선택된 7-mer가 존재하는 게놈 RNA 서열 내 모든 위치는 해당 위치, 7-mer가 발견된 게놈 영역의 이름, 및 7-mer 시작 위치에서 시작하는 15-mer와 함께 등록될 수 있다. 예를 들어, gRNA 내 7-mer 적중 부위를 특성화할 수 있다. 가장 많은 적중 부위를 갖는 50개의 7-mer를 선택할 수 있다. 단계(108)에서, 게놈 영역당 적중은 7-mer마다 계산할 수 있다. 단계(110)에서, sgRNA에서 가장 많은 적중을 갖는 상위 50개를 선택할 수 있다.
단계(112)에서, 등록된 15-mer를 사용하여, 뉴클레오티드 위치 빈도 행렬을 생성할 수 있고, 15-mer를 생성할 수 있다. 단계(114)에서, 각 7-mer는 RNAi에 대해 제안된 센스 가닥에 해당하는 서열과 함께 각 위치에 대해 가장 빈번한 뉴클레오티드를 기반으로 한다. 이에 따라, 비표준 염기쌍형성(non-canonical base paring) 및 종자 서열을 넘어선 쌍형성을 촉진할 수 있다.
단계(116)에서, 생성된 15-mer 서열의 적중은 완벽한 매칭에 기반하여 추정된 RNAi 분자에 대해 예측할 수 있다. 따라서, 완벽한 종자 서열 및 종자 서열을 넘어선 일치가 검색될 수 있다. 예를 들어, 등록된 6 내지 22개의 뉴클레오티드 길이와 일치한다. 많은 연구가 6, 7 및 8개의 뉴클레오티드 길이의 일치의 효과를 지지하고 검증하지만, 5개의 뉴클레오티드 길이의 일치와 같은 전사체와의 짧은 RNAi 일치 및 10 및 15개의 일치와 같은 더 큰 일치는 RNA 분자의 침묵화에 관여하는 것으로 나타날 수 있다.
단계(118)에서, 모든 등록된 적중 부위에 대해 적중 가능성 지수가 계산될 수 있다. 이의 일치 서열 ΔG 값 및 적중 부위의 상류 및 하류에서 30 nt의 AU 함량 비율을 기반으로 모든 적중에 가중치를 할당할 수 있다. 누적 적중 빈도 및 길이를 요약하는 지수에 대한 계산이 실시될 수 있다. 단계(120)에서, 생성된 특징 및 구조적 특징을 기반으로 5개의 최상의 RNAi 선택사항이 선택될 수 있다.
따라서, 종자 서열의 구조가 이의 표적 침묵화 능력에 매우 중요한 역할을 하는 구현예에서, 더 낮은 ΔG 종자 서열 쌍형성 값은 더 높은 억제 수준과 상관되는 경향이 있다.
RNAi 결합 부위 근처에서 더 높은 AU 함량이 발견되는 경우, 이는 일반적으로 덜 안정적인 이차 구조를 암시하는 더 많은 전사 및 단백질 침묵화와 관련이 있다.
Figure pct00003
상기에서 예시적인 수학식이 개시되며, 여기서 n은 m 적중 부위를 예측하는 데 사용되는 생성된 15-mer이고, H는 적중 가능성이고, ΔG는 염기쌍 형성만을 고려하여 일치가 발생하는 데 필요한 자유 에너지이며, p(AU)는 적중 부위의 상류 및 하류의 30 nt의 비율이다. 다음으로, 생성된 15-mer에 대해 두 개의 지수를 계산할 수 있다:
Figure pct00004
일 구현예에서, IG는 적중의 효과를 요약하는 일반 지수이고, A는 일치의 n 생성된 15-mer에 대한 적중의 양이다.
단계(112)를 참조하면, 하기의: 7-mer, 이의 생성된 15-mer 또는 제안된 안티센스 가닥, 센스 또는 가이드 가닥, RNAi 제안된 서열, 종자 서열 GC 함량, 가이드 가닥 GC 함량뿐만 아니라 앞서 언급한 모든 지수를 특징으로 하는 행렬이 전개될 수 있다. 일 구현예에서, 종자 비표적 효과에 의해 침묵화될 수 있는 인간 전사체는 miRDB 플랫폼(platform)의 맞춤형 마이크로RNA 예측 기능성을 사용하여 검색될 수 있다.
도 2a를 참조하면, 표는 구현예에 따른 5개의 RNAi SARS-CoV-2 침묵화 서열을 도시한다.
도 2b를 참조하면, 표는 RNAi SARS-CoV-2 침묵화 서열의 매칭 부위의 수를 도시한다.
본원에 개시된 바와 같이, 본 발명은 고려되는 바와 같이 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 대안적으로, 분자 제시는 RNAi 모방체로서 또는 바이러스, 플라스미드 등과 같은 발현 벡터로서 치료를 실시하기 위해 변형될 수 있다.
양한 구현예는 LNP, 중합체 나노입자, 앱타머 관련 전달, 항체 전달, 아피머(affimer) 관련 전달 또는 금속 나노입자와 같은 다양한 전달 방법과 조합하여 변형될 수 있다.
추가로, 치료는 선형 또는 원형 RNA로서 또는 더 긴 비부호화 RNA의 일부로서 실시할 수 있다. 치료는 또한 플라스미드 또는 다른 시스템 벡터, 또는 shRNA 벡터 시스템을 통한 것을 포함하여 DNA 대응물로 실시될 수 있다.
본원에 개시된 구현예는 siRNA와 유사한 높은 특이성을 촉진하면서 miRNA에서와 같이 다수의 상보성 부위를 갖는 능력을 추가하기 위해 siRNA 및 miRNA의 이점을 조합한다. 추가적으로, 이는 돌연변이 문제를 해결할 수 있으며, 단일 또는 다중 선택된 RNA를 표적으로 하는 RNAi 분자를 설계하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 다양한 구현예는 부호화 및 비부호화 RNA를 침묵시키거나 단일 선택된 RNA 또는 RNA의 조합을 침묵시키도록 설계될 수 있다. 추가로, 표적화될 RNA 내부 영역은 표적 부위에 대해 농축될 수 있다. 이들 구현예는 임상적으로 또는 비임상적으로 구현될 수 있고, 단독으로 또는 다른 화합물과 함께 실시될 수 있다.
일 구현예에서, 다수의 SARS-CoV-2 시험관내 대리 발현 방법이 있을 수 있다.
세포 배양과 관련하여, 일 구현예에서, ACE2 및 TMPRSS2 발현 인간 결장암 세포주 Caco-2(ATCC® HTB-37™), 인간 배아 신장 세포주 HEK 293T(ATCC® CRL-3216™) 및 사바나원숭이(grivet) 신장 세포주 Vero E6(ATCC® CRL-1586™)는 10% 소태아 혈청(F2442, Sigma-Aldrich), 항생제-항진균제 용액(A5955, Sigma-Aldrich) 및 비필수 아미노산 용액(M714, Sigma-Aldrich) 1x로 보충된 DMEM 배지(D6429, Sigma-Aldrich) 내에서 유지될 수 있다.
항 SARS-CoV-2 설계 miRNA 모방체의 치료 가능성에 대한 첫번째 접근을 위한 플라스미드 구조체 설계와 관련하여, 일 구현예에서, 반딧불이-레닐라(Firefly-Renilla) 루시페라아제 리포터 벡터 및 S-단백질/N-단백질 발현 벡터는 하기와 같이 설계될 수 있다: (a) 반딧불이-레닐라 루시퍼라아제 리포터 벡터의 경우, SARS-CoV-2 범용 3'UTR 서열은 pmirGLO 벡터(E1330, Promega)의 반딧불이 루시퍼라아제 전사체의 3' 말단에서 외부 서비스(GenScript)에 의해 합성 및 복제될 수 있다. 레닐라 루시퍼라아제 전사체는 내인성 대조군인 임의의 SARS-CoV-2 요소를 포함하지 않을 수 있고; (b) S-단백질/N-단백질 발현 벡터의 경우, SARS-CoV-2 S-단백질 및 N-단백질 (1) mRNA 완전 서열 및 (2) 3'UTR 쌍형성 서열 돌연변이 mRNA는 phMGFP 벡터(E6421, Promega)에서 외부 서비스(GenScript)에 의해 합성 및 복제될 수 있다. 이러한 설계는 항 SARS-CoV-2로 설계된 miRNA 모방체의 3'UTR과 5'UTR-CDS 조절 기능 간을 구별하는 것을 가능하게 할 수 있다.
형질감염과 관련하여, 일 구현예에서, Lipofectamine3000(L3000015, ThermoFisher)을 제조업체 지침에 따라 Caco-2, HEK 293T 및 Vero E6 세포주에서 플라스미드 구조체의 일시적 발현에 사용할 수 있다.
루시퍼라아제 분석과 관련하여, 일 구현예에서, 분석은 제조업체 지침에 따라 Dual-Glo® 루시퍼라아제 분석 시스템(E2940, Promega)을 사용하여 실시할 수 있다.
진핵생물 발현 분석과 관련하여, 일 구현예에서, 구체적으로 RT-qPCR에서 제조업체 지침에 따라 mirVana™ miRNA Isolation Kit(AM1561, ThermoFisher)를 사용하여 세포주로부터 전체 RNA를 추출할 수 있고, RT-qPCR은 Q qPCR 기계(Quantabio)에서 제조업체 지침에 따라 SuperScript™ III One-Step RT-PCR System 키트(12574026, ThermoFisher)를 사용하여 실시할 수 있다.
웨스턴 블롯(western blot)과 관련하여, 일 구현예에서, 총 단백질은 RIPA Buffer(R0278, Sigma-Aldrich), Protease Inhibitor Tablets(S8820, Sigma-Aldrich) 및 Protease Inhibitor Cocktail(P8340, Sigma-Aldrich)을 사용하여 권장 프로토콜에 따라 세포주로부터 추출할 수 있다. 총 단백질 정량화는 Pierce™ BCA Protein Assay Kit(23227, Thermo Fisher)를 사용하여 제조업체 지침에 따라 실시할 수 있다.
살아있는 바이러스를 사용하는 SARS-CoV-2 시험관내 모델에서 바이러스 역가의 평가와 관련하여, 일 구현예에서, SARS-CoV-2(수탁: NC_045512.2) 스톡(stock)은 이전에 기재된 조건에 따라 배양할 수 있다. 바이러스 스톡은 생물안전 수준 4(BSL-4) 시설에서 Vero E6 세포(ATCC® CRL-1586™)에 대하여 적정된다. 바이러스 적정 분석은 이전에 기재된 프로토콜에 따라 실시할 수 있다. 바이러스 역가는 하기의 공식을 사용하여 계산할 수 있다: PFU/mL = 계수된 플레이트 수 / (접종 부피(이 경우 50 uL) * 샘플 희석).
예를 들어, 이 작업은 외부 서비스 또는 협업을 통해 실시할 수 있다. RT-qPCR은 바이러스 RNA 부하와 SARS-CoV-2의 특이성을 확인하는 데 사용할 수 있다. 바이러스 RNA 증폭을 위한 표준 및 승인된 방법이 사용될 수 있다.
이계 교배 뮤린 모델에서의 용량 범위 결정 안전성 연구와 관련하여, CD-1 마우스(CD-1® IGS Mice, Charles River)를 실험 대상체로서 사용할 수 있다. 마우스는 이의 체중에 따라 분류할 수 있다. 실험 대상체는 한 달 동안 200 μL의 최종 주입 부피에서 결정된 투여량으로 격일로 정맥 주사로 치료될 수 있다. 치료 요법이 완료되면, 간 및 신장 기능에 대한 참조 인자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 혈액 매개변수가 안전성 참조로서 평가될 수 있다.
다양한 신체 조직에 대한 병리 분석을 인증된 수의 병리학자에 의해 실시할 수 있다.
형질전환 뮤린 또는 기타 동물 모델에서의 효능 연구와 관련하여, 일 구현예에서, SARS-CoV-2 연구를 위해 신규의 형질전환 마우스 모델을 개발할 수 있다. 이러한 경우, 특정 병원균이 없는 6~11개월 된 암컷 야생형(WT) C57BL/6J(000664) 및 형질전환(TG) K18-hACE2(034860) 마우스를 수득할 수 있다. 구현예에서, 2개의 실험을 실행할 수 있다: (a) 나노입자 제제 전달: SARS-CoV-2가 없는 WT 및 TG 마우스는 항 SARS-CoV-2 miRNA 모방체를 함유하는 나노입자 제제를 q.o.d 요법(M, W, F)의 정맥 주사로 투여받을 수 있다. 치료 완료 후, 마우스를 희생시키고, 항 SARS-CoV-2 miRNA 모방체를 RT-qPCR을 통해 호흡기에서 정량화할 수 있다; 그리고 (b) 효능 연구: TG 마우스는 105 TCID50의 투여량으로 SARS-CoV-2를 비강내로 접종할 수 있다. 구현예에서, 감염이 확인된 후, 마우스는 2개의 군으로 분리될 것이다: (1) q.o.d 요법(M, W, F)으로 항 SARS-CoV-2 miRNA 모방체를 함유하는 나노입자 제제의 정맥내 투여, 및 (2) q.o.d 요법(M, W, F)으로 스크램블(scramble) miRNA 모방체를 함유하는 나노입자 제제의 정맥내 투여.
체중, 임상 증상, 외부 자극에 대한 반응성 및 사망을 기록하기 위해 동물을 매일 지속적으로 관찰할 수 있다.
다만, 상기 모델이 입수 가능하지 않거나 대체 동물 모델이 더 적절하다고 판단되는 경우, 적절한 대체 연구 방법론을 제안할 수 있다.
체외 인간 혈액 면역 반응 분석과 관련하여, 일 구현예에서, 제형화된 나노입자가 인간 사이토카인 반응을 유도하는지 여부를 결정하기 위해, 건강한 지원자로부터 수집한 전혈에서 24시간 동안 배양할 수 있다. 응고를 방지하기 위해 항응고제를 전혈에 첨가할 수 있으며 제형화된 나노입자는 세 가지 상이한 농도에서 시험할 수 있다. 배양 후, 혈장을 원심분리하여 IL-1β, IL-6, IL-12, INFα, TNFα를 ELISA(KHC0011, BMS223HS, KHC0121, BMS213HS, ThermoFisher)로 분석할 수 있다.
따라서, 일련의 RNAi 유도 siRNA/miRNA 분자는 상이한 위치에서 SARS-CoV-2 바이러스 RNA를 특이적으로 표적화하도록 설계될 수 있다. 도 3a에 도시된 서열은 합성되었을 수 있으며, "D"로 표시된 제1 후보에 대한 결과를 수득했을 수 있다. 스크램블된 비효율적인 서열 "NC"는 "음성 대조군"으로서 사용할 수 있다.
서열 "D"는 도 3b에 도시된 바와 같이 SARS-CoV-2 RNA의 3'UTR(번역되지 않은 영역)을 포함하도록 설계된 루시퍼라아제 리포터 구조체에 대한 효능에 대해 시험할 수 있다.
293T 세포는 루시퍼라아제 리포터 구조체 및 항바이러스 서열 "D" 둘 모두로 형질감염될 수 있다. 48시간 후, 리포터 구조체의 루시퍼라아제 발현을 플레이트 판독기를 사용하여 검사할 수 있다. 서열 "D"의 형질감염 후 루시퍼라아제 활성이 유의적으로 감소할 수 있으며, 이는 설계된 서열의 조절 가능성 및 효능을 입증한다. 결과의 비제한적인 예가 도 4에 도시되어 있다.
섬유아세포에서 서열 "D"의 잠재적인 세포독성 효과를 또한 시험할 수 있다. 세포는 양성 세포독성 대조군인 NC 또는 서열 "D"로 형질감염될 수 있다. 일 구현예에서, 형질감염 후 48시간에 MTS 검정을 통해 세포 변성 효과가 관찰되지 않을 수 있으며, 이는 서열의 상대적 안전성을 나타낸다. 결과의 비제한적인 예가 도 5에 도시되어 있다.
일 구현예에서, 본 개시의 발명은 잠재적인 7-mer 서열을 식별하는 단계; 및 하나 이상의 적중(hit) 부위를 등록하는 단계를 포함하는, RNAi 서열을 식별하는 방법일 수 있으며, 여기서 하나 이상의 적중 부위는 잠재적인 7-mer 서열이 존재하는 게놈 RNA 서열 내 하나 이상의 위치이다. 일 구현예에서, 방법은 하나 이상의 적중 부위와 함께 7-mer 서열이 발견된 게놈 영역의 이름, 및 7-mer 서열 시작 위치에서 시작하는 등록된 15-mer 서열을 등록하는 단계; 등록된 15-mer 서열을 사용하여, 각 위치에 대한 가장 빈번한 뉴클레오티드를 기반으로 각 7-mer 서열에 대한 뉴클레오티드 위치 빈도 행렬 및 생성된 15-mer를 생성하는 단계; 및 생성된 15-mer 서열을 사용하여, 추정되는 RNAi 분자에 대한 하나 이상의 적중을 예측하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 방법은 또한 하나 이상의 등록된 적중 부위에 대한 적중 가능성 지수를 계산하는 단계; 일반 지수를 생성하는 단계; 및 요약 행렬을 개발하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 표적 RNA에서 가장 많은 7-mer에 대하여 선별검사하여 잠재적인 7-mer 서열을 식별할 수 있다. 일 구현예에서, 추정되는 RNAi 분자에 대한 하나 이상의 적중은 완벽한 매칭(matching)을 기반으로 예측될 수 있다. 일 구현예에서, 적중 가능성 지수는 적중 부위의 상류 및 하류에서 30개 뉴클레오티드의 AU 함량 비율 및 일치 서열 ΔG 값을 기반으로 각각의 적중 부위에 가중치를 할당할 수 있다. 적중 가능성 지수는 하기의 수학식을 통해 계산할 수 있고:
Figure pct00005
, 여기서 n은 m 적중 부위를 예측하는 데 사용되는 생성된 15-mer이고, H는 상기 적중 가능성이고, ΔG는 염기쌍 형성만을 고려하여 일치가 발생하는 데 필요한 자유 에너지이며, p(AU)는 적중 부위의 상류 및 하류의 30 nt의 비율이다.
일 구현예에서, 일반 지수는 하기의 수학식에 의해 계산할 수 있고:
Figure pct00006
, 여기서 IG는 적중의 효과를 요약하는 일반 지수이고, A 는 일치의 n 생성된 15-mer에 대한 적중의 양이다. 요약 행렬은 7-mer, 7-mer의 생성된 15-mer, 센스 가닥, RNAi 제안 서열, 적중 가능성 지수, 및 일반 지수를 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 요약 행렬은 제안된 안티센스 가닥을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 요약 행렬은 종자(seed) 서열 GC 함량 및 가이드(guide) 가닥 GC 함량을 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 개시의 발명은 gRNA로부터 하나 이상의 7-mer에 대하여 선별검사하는 단계; 하나 이상의 7-mer의 제1 수를 선택하는 단계로서, 제1 수는 하나 이상의 7-mer의 빈도에 기반하는, 단계; 및 하나 이상의 7-mer 각각에 대해 하나 이상의 적중 부위를 특성화하는 단계를 포함하는, RNAi 서열을 식별하는 방법일 수 있다. 방법은 하나 이상의 7-mer 각각에 대해 게놈 영역당 적중을 계산하는 단계; 하나 이상의 7-mer의 제2 수를 선택하는 단계로서, 제2 수는 sgRNA 내 가장 많은 적중에 기반하는, 단계; 및 하나 이상의 7-mer 각각에 연관된 하나 이상의 15-mer에 대한 빈도 행렬을 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 방법은 또한 가장 빈번한 뉴클레오티드에 기반하여 하나 이상의 7-mer 각각에 대해 생성된 하나 이상의 15-mer를 생성하는 단계; 하나 이상의 생성된 15-mer 각각에 대해 gRNA 내 적중을 특성화하는 단계; 누적 적중 빈도 및 길이에 기반하여 요약 지수를 계산하는 단계; 및 하나 이상의 생성된 특징 및 하나 이상의 구조적 특징에 기반하여 RNAi 서열의 제3 수를 선택하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 제1 수, 제2 수, 및 제3 수는 임의의 적절한 양일 수 있다. 일 구현예에서, 제1 수는 500일 수 있다. 일 구현예에서, 제2 수는 50일 수 있다. 일 구현예에서, 제3 수는 5일 수 있다. 일 구현예에서, 하나 이상의 생성된 특징 및 하나 이상의 구조적 특징은 요약 지수의 함수일 수 있다.
본 발명은 상기에서 개략적으로 설명된 구현예와 관련하여 설명되었지만, 많은 대안, 수정 및 변형이 전술한 개시 내용을 읽을 때 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 전술한 구현예는 특정 양, 화학물질, 화합물, 유전 물질, 서열, 기간 또는 기타 양을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 전술한 양 중 임의의 것은 비제한적일 수 있다. 이에 따라, 상술한 바와 같이 본 발명의 구현예는 예시적인 것으로 의도된 것이며 제한적이지 않다. 설명된 구현예에 대한 수정 및 변형은 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 만들어질 수 있다.

Claims (14)

  1. RNAi 서열을 식별하는 방법으로서,
    a. 잠재적인 7-mer 서열을 식별하는 단계;
    b. 하나 이상의 적중(hit) 부위를 등록하는 단계로서, 상기 하나 이상의 적중 부위는 상기 잠재적인 7-mer 서열이 존재하는 게놈 RNA 서열 내 하나 이상의 위치인, 단계;
    c. 상기 하나 이상의 적중 부위와 함께, 상기 7-mer 서열이 발견된 게놈 영역의 이름, 및 7-mer 서열 시작 위치에서 시작하는 등록된 15-mer 서열을 등록하는 단계;
    d. 상기 등록된 15-mer 서열을 사용하여, 각 위치에 대한 가장 빈번한 뉴클레오티드를 기반으로 각 7-mer 서열에 대한 뉴클레오티드 위치 빈도 행렬 및 생성된 15-mer를 생성하는 단계;
    e. 상기 생성된 15-mer 서열을 사용하여, 추정되는 RNAi 분자에 대한 하나 이상의 적중을 예측하는 단계;
    f. 상기 하나 이상의 등록된 적중 부위에 대한 적중 가능성 지수를 계산하는 단계;
    g. 일반 지수를 생성하는 단계; 및
    h. 요약 행렬을 개발하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    표적 RNA에서 가장 많은 7-mer에 대하여 선별검사하여 상기 잠재적인 7-mer 서열을 식별하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 추정되는 RNAi 분자에 대한 하나 이상의 적중은 완벽한 매칭(matching)을 기반으로 예측되는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 적중 가능성 지수는 상기 적중 부위의 상류 및 하류에서 30개 뉴클레오티드의 AU 함량 비율 및 일치 서열 ΔG 값을 기반으로 각각의 적중 부위에 가중치를 할당하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 적중 가능성 지수는 하기의 수학식을 통해 계산되고:
    Figure pct00007
    ,
    여기서 n은 m 적중 부위를 예측하는 데 사용되는 생성된 15-mer이고, H는 상기 적중 가능성이고, ΔG는 염기쌍 형성만을 고려하여 일치가 발생하는 데 필요한 자유 에너지이며, p(AU)는 적중 부위의 상류 및 하류의 30 nt의 비율인, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 일반 지수는 하기의 수학식에 의해 계산되고:
    Figure pct00008
    ,
    여기서 IG는 상기 적중의 효과를 요약하는 일반 지수이고, A는 상기 일치의 n 생성된 15-mer에 대한 적중의 양인, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 요약 행렬은 상기 7-mer, 상기 7-mer의 생성된 15-mer, 센스 가닥, RNAi 제안 서열, 적중 가능성 지수, 및 일반 지수를 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 요약 행렬은 제안된 안티센스 가닥을 추가로 포함하는, 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 요약 행렬은 종자(seed) 서열 GC 함량 및 가이드 가닥 GC 함량을 추가로 포함하는, 방법.
  10. RNAi 서열을 식별하는 방법으로서,
    a. gRNA로부터 하나 이상의 7-mer에 대하여 선별검사하는 단계;
    b. 상기 하나 이상의 7-mer의 제1 수를 선택하는 단계로서, 상기 제1 수는 상기 하나 이상의 7-mer의 빈도에 기반하는, 단계;
    c. 상기 하나 이상의 7-mer 각각에 대해 하나 이상의 적중 부위를 특성화하는 단계;
    d. 상기 하나 이상의 7-mer 각각에 대해 게놈 영역당 적중을 계산하는 단계;
    e. 상기 하나 이상의 7-mer의 제2 수를 선택하는 단계로서, 상기 제2 수는 sgRNA 내 가장 많은 적중에 기반하는, 단계;
    f. 상기 하나 이상의 7-mer 각각에 연관된 하나 이상의 15-mer에 대한 빈도 행렬을 생성하는 단계;
    g. 상기 가장 빈번한 뉴클레오티드에 기반하여 상기 하나 이상의 7-mer 각각에 대해 생성된 하나 이상의 15-mer를 생성하는 단계;
    h. 상기 하나 이상의 생성된 15-mer 각각에 대해 gRNA 내 적중을 특성화하는 단계;
    i. 누적 적중 빈도 및 길이에 기반하여 요약 지수를 계산하는 단계; 및
    j. 하나 이상의 생성된 특징 및 하나 이상의 구조적 특징에 기반하여 RNAi 서열의 제3 수를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 제1 수는 500인, 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 제2 수는 50인, 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 제3 수는 5인, 방법.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 하나 이상의 생성된 특징 및 상기 하나 이상의 구조적 특징은 상기 요약 지수의 함수인 방법.
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