MXPA02006528A - Composiciones que comprenden acidos nucleicos incorporados en particulas minerales bilaminares. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a las composiciones que comprenden al menos un acido nucleico y una particula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables, su procedimiento de preparacion y sus aplicaciones para la transfeccion in vivo, in vit-ro y/o ex vivo de los acidos nucleicos. Preferentemente, dichas particulas minerales son de la formula general (I): [MII1-xMIIIx (OH) 2]X+[Xm-X/m°nH2O]X-.

Description

COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN ÁCIDOS NUCLEICOS INCORPORADOS EN PARTÍCULAS MINERALES BILAMINARES DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a las composiciones que comprenden al menos un ácido nucleico y una partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables, su procedimiento de preparación y sus aplicaciones para la transfección in vivo, in vi tro y/o ex vivo de ácidos nucleicos. Con el desarrollo de las biotecnologías, la posibilidad de transferir eficazmente ácidos nucleicos en las células (es decir de introducirlas en las células de manera para que el gen de interés que las porta sea expresado) se vuelve una técnica básica con las numerosas aplicaciones biotecnológicas. Se puede tratar de transferencia de ácidos nucleicos en las células in vi tro, por ejemplo para la producción de proteínas recombinantes, o en laboratorio para el estudio de la regulación de la expresión de los genes, la clonación de los genes o cualquier otra manipulación que implique el ADN. Se puede tratar igualmente de transferencia de ácidos nucleicos en las células in vivo, por ejemplo para la realización de vacunas, de estudios de marcación o igualmente de procedimientos terapéuticos. Se puede tratar incluso de REF 139930 r-*-" transferencia de genes ex vivo en las células tomadas de un organismo, con miras a su readministración ulterior, por ejemplo para la creación de animales transgénicos . Existen hoy en día numerosos métodos de transferencia de ácidos nucleicos en las células: la precipitación con fosfato de calcio, la electroporación, la microinyección, la infección viral, la inyección de ADN desnudo, o incluso la utilización de vectores no virales, como por ejemplo los polímeros catiónicos, los vectores bioquímicos (constituidos de una proteína catiónica asociada a un receptor celular) , o incluso los lipofectantes, y más particularmente los lípidos catiónicos. No obstante, estas técnicas desarrolladas hoy en día presentan numerosos inconvenientes que limitan la eficacia de la transfección y no permiten resolver de manera satisfactoria las dificultades ligadas a la transferencia de genes en las células y/o el organismo. De este modo, la precipitación con fosfato de calcio es un método que es método que es muy eficaz, principalmente con relación a la inyección del ADN desnudo, y ésta ha sido pues abandonada desde hace mucho tiempo. Se ha mostrado que la inyección de ácidos nucleicos "desnudos", es decir, no formulados, permite obtener niveles de transfección aceptables en ciertos tipos celulares in vivo (ver principalmente la solicitud de patente O90/11092) , los ácidos nucleicos desnudos no obstante no gozan más que de una vida media plasmática corta, en virtud de su degradación por enzimas y de su eliminación por las vías urinarias. El nivel de eficacia de transferencia de los genes mediante inyección del ácido nucleico desnudo, queda muy débil para la mayor parte de las aplicaciones consideradas. La utilización de polímeros o de lípidos catiónicos constituye de este modo un posible remedio frente a las degradaciones enzimáticas que sufre el ADN que se va a transfectar, pero ha sido frecuentemente constatado que su utilización inhibe más o menos fuertemente la eficacia de transfección en el músculo y que éstos inducen además una toxicidad frente a las células. Si los virus recombinantes permiten obtener una buena eficacia de transferencia de los ácidos nucleicos, su empleo presenta no obstante ciertos riesgos ligados a su naturaleza viral tales como la patogenicidad, la transmisión, la replicación, la recombinación, la transformación, la inmunogenicidad, etc. Es pues preferible evitar las técnicas de transfección viral. Finalmente, las técnicas tales como la electroporación constituyen una alternativa interesante pero limitada a una administración local . Éstas provocan muy frecuentemente desgastes irreversibles sobre las membranas celulares. Parece pues que sería deseable disponer de un vector de transferencia que permita a la vez proteger los ácidos nucleicos de las degradaciones enzimáticas y obtener una eficacia de transferencia satisfactoria en las células, sin dañarlas con ello ni inducirles toxicidad. La presente invención aporta una solución ventajosa a estos problemas. La solicitante ha mostrado en efecto que las composiciones que comprenden un ácido nucleico y una partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables, permiten la transferencia in vi tro, ex vivo o in vivo, de dicho ácido nucleico en una célula y/o un órgano con una eficacia superior a aquellas obtenidas hoy en día con las técnicas clásicas de transferencia no viral . Las composiciones de la invención permiten además evitar los inconvenientes ligados al empleo de los vectores virales o de las técnicas físicas de transfección. De este modo, un primer objetivo de la presente invención concierne a las composiciones que comprenden al menos un ácido nucleico y una partícula mineral que tiene la estructura de laminillas intercambiables. En el sentido de la invención, se entiende por "partículas minerales que tienen una estructura de laminillas intercambiables" , las partículas minerales donde la estructura está basada en un apilamiento de laminillas de composición M(0H)2 análogas a aquellas bien conocidas de la brucita ( g(OH)2), representando M un metal divalente, pero en los cuales una parte de los metales divalentes está reemplazada con metales trivalentes de manera para hacer a las laminillas globalmente catiónicas. Los espacios inter-laminillas comprenden entidades aniónicas solvatadas por las moléculas de agua, una estructura de este tipo es representada en la figura 1 y es igualmente llamada "hidróxido doble laminar" . Estas partículas tienen por fórmula general : [M^-xM111* (OH) 2] x+ [Xm-?/m.nH20] x" en la cual M11 representa un catión metálico divalente, M111 representa un catión metálico trivalente, Xm~ representa un anión interfoliar y n es un número entero superior o igual a 1, x está comprendido entre 0 y 1 estrictamente, y n es estrictamente superior a 0. Tales partículas minerales han sido ya descritas para las aplicaciones en numerosos dominios tales como la catálisis o el ambiente. En efecto, éstas forman materiales nanoestructurados donde las especies moleculares o coloidales están intercaladas en una estructura huésped laminar. Las propiedades de estas estructuras pueden de este modo ser puestas a beneficio en la catálisis heterogénea o homogénea sobre soporte, en las técnicas de intercambio o de separación, principalmente de isómeros ópticos, para la concepción de membranas eventualmente selectivas para la filtración y permeación, para el atrapamiento y la restitución controlada de moléculas, o incluso para la concepción de materiales y depósitos electro-activos, de electrodos y de dispositivos electrónicos. De este modo, el artículo de Choy y colaboradores (1999, J. Am. Chem. Soc. 12(6), 1399-1400) describe la preparación de nanopartículas híbridas compuestas de laminillas de un Hidróxido Doble Laminar (HDL) , la prístina (Mg2Al (N03) -LDH) , en las cuales están intercalados nucleósidos monofosfatados o fragmentos de ADN de testículos de arenque. Las moléculas nucleicas intercaladas en las partículas descritas en este artículo presentan un tamaño inferior a 1000 pares de bases. No se describe ninguna utilización de estas moléculas. No obstante, tales partículas minerales no habían sido jamás utilizadas para la transferencia de ácidos nucleicos y nada deja prever que sería posible de obtener un muy claro mejoramiento de la eficacia de transferencia, en particular con relación a los resultados de transfección obtenidos por inyección del ADN desnudo o formulado con los vectores sintéticos clásicos como los lípidos catiónicos. Las partículas minerales que tienen una estructura de laminillas intercambiables utilizables en el marco de la presente invención, son frecuentemente llamadas de acuerdo a la naturaleza de los cationes metálicos mayores de las laminillas. Por ejemplo, la hidrotalcita (Mg-Al) , la piroaurita (Mg-Fe) , la estictita (Mg-Cr) o incluso la takovita (Ni-Al) . La fórmula general indicada anteriormente subtiende la gran variedad de partículas minerales que es posible preparar, haciendo variar la naturaleza de los dos cationes metálicos 11 y M111, sus proporciones respectivas con extensión posible a más de dos tipos de cationes (por ejemplo, magnesio, zinc y aluminio) , la naturaleza de los aniones interlaminares, o incluso el estado de hidratación. Además, la riqueza de la fórmula general indicada anteriormente es incluso acrecentada por una diversidad estructural resultante de politipos que difieren por la secuencia del apilamiento de las laminillas, así como de la aparición de- las superestructuras debidas por ejemplo a una clasificación catiónica en la laminilla hidroxilada. Los cationes metálicos divalentes M11 pueden ser elegidos por ejemplo entre el magnesio (Mg) , el cromo (Cr) , la manganeso (Mn) , el hierro (Fe) , el níquel (Ni) , el cobalto (Co) , el cobre (Cu) , el calcio (Ca) , o incluso el zinc (Zn) . De preferencia, el catión metálico divalente es el magnesio. Los cationes metálicos trivalentes M111 pueden ser elegidos por ejemplo entre el aluminio (Al) , el cromo (Cr) , el manganeso (Mn) , el hierro (Fe) , el níquel (Ni) , el cobalto (Co) o incluso el galio (Ga) . De preferencia, el catión metálico trivalente es el aluminio. Además, los dos miembros del par M11 y M111 pueden igualmente corresponder al mismo elemento (por ejemplo FeII/Fe111 o MnII/Mn111) . .-- a » ¡ i Los aniones interfoliares X " pueden ser por ejemplo elegidos entre los halogenuros, los oxoaniones, los iso- y heteroaniones, los aniones complejos, o incluso los aniones orgánicos. Se citan a manera de ejemplo, los fluoruros, los cloruros, los bromuros, los carbonatos, los nitratos, los sulfatos o incluso los oxoaniones tetraédricos tales como el Cr042". De preferencia, el anión es elegido entre los carbonatos C032" . El valor de x está comprendido estrictamente entre 0 y 1, es decir que 0 y 1 son valores excluidos. De preferencia, x está comprendido entre 0.05 y 0.95, y de preferencia entre 0.1 y 0.9. Todavía más preferentemente, x está comprendido entre 0.2 y 0.85. A manera de ejemplo, x puede ser igual a 0.25. En lo que concierne al valor de n, éste indica el estado de hidratación de la partícula en cuestión, y es estrictamente superior a 0. De preferencia, n es superior o igual a 0.1. Por ejemplo, n puede ser igual a 0.5. m es un número entero superior o igual a 1 , que representa la carga del anión interfoliar. Por ejemplo, m puede ser igual a l, 2, 3, 4, 5 Ó 6. Las partículas minerales que tienen una estructura de laminillas intercambiables de acuerdo a la presente invención pueden ser elegidas por ejemplo entre la hidrotalcita de la fórmula Mg6Al2C03 (OH) ?6»4H20, la manaseita de fórmula Mg6Al2C03 (OH) 16»4H20, la piroaurita de la fórmula Mg6Fe2C03 (OH) ?6«4H20, la estictita de la fórmula Mg6Cr2C03 (OH) i6»H20, la takovita de la fórmula Ni6Al2C03 (OH) i6*4H20, la reevesita de la fórmula Ni6Fe2C03 (OH) ?6«4H20 o incluso la comblainita de la fórmula Ni6Co2C03 (OH) 16«4H20. Otras partículas minerales que tienen una estructura de laminillas intercambiables pueden igualmente convenir. De preferencia, las composiciones de acuerdo a la presente invención comprenden al menos un ácido nucleico y la hidrotalcita de la fórmula Mg6Al2C03 (OH) ?6^4H20. Las partículas minerales que tienen una estructura de laminillas intercambiables de acuerdo a la presente invención son ya sea comerciales, o bien éstas pueden ser preparadas de acuerdo a los métodos que se parecen a los métodos conocidos denominados de "química suave" . Principalmente, la preparación de las partículas minerales de acuerdo a la invención puede estar basada en la precipitación controlada de las soluciones o de las suspensiones acuosas que contienen a la vez los cationes metálicos destinados a tomar lugar en el armazón hidroxilado y los aniones destinados a ocupar los dominios interlaminares. En estas condiciones, existe simultáneamente la construcción de los dominios interlaminares constituidos de aniones y de moléculas de agua, y de la laminilla. La naturaleza y textura de las fases obtenidas son fuertemente dependientes de las condiciones de operación (temperatura, velocidad de adición y concentración de los reactivos, control del pH) , pero también de la geometría del reactor y del estado de asociación previa de los cationes metálicos en los reactivos (existencia de oligómeros) . El procedimiento de preparación se reduce finalmente siempre a poner en presencia, a concentración y reactividad adecuadas, las especies que conducen a la construcción de partículas minerales en las condiciones óptimas. Estas condiciones óptimas son determinadas caso por caso de acuerdo al método clásico de ensayo y error. Se entiende, en el sentido de la invención, por "ácido nucleico" tanto un ácido desoxirribonucleico como un ácido ribonucleico. Se puede tratar de secuencias naturales o artificiales, y principalmente de ADN genómico (ADNg) , de ADN complementario (ADNc) , de ARN mensajero (ARNm) , de ARN de transferencia (ARNt) , de ARN ribosómico (ARNr) , de secuencias híbridas o secuencias sintéticas o se i-sintéticas, de oligonucleótidos modificados o no. Estos ácidos nucleicos pueden ser por ejemplo de origen humano, animal, vegetal, bacteriano o viral. Éstos pueden ser obtenidos mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia, y principalmente mediante cribado o selección de bancos, mediante síntesis química, o incluso mediante los métodos mixtos que incluyen la modificación química o enzimática de las secuencias obtenidas mediante cribado de bancos. Éstos pueden ser modificados químicamente.

Respecto más particularmente a los ácidos desoxirribonucleicos, éstos pueden ser de una sola hebra o de doble hebra, o incluso los oligonucleótidos cortos o las secuencias más largas. En particular, los ácidos nucleicos están ventajosamente constituidos por ejemplo, por los plásmidos, los vectores, los episomas o los casetes de expresión. Estos ácidos desoxirribonucleicos pueden principalmente portar un origen de replicación funcional o no en la célula diana, uno o varios genes marcadores, secuencias reguladoras de la transcripción o de la replicación, genes de interés terapéutico, secuencias antisentido modificadas o no, o incluso las regiones de enlace a otros componentes celulares. De preferencia, dicho ácido nucleico presenta un tamaño superior a 1000 pares de bases. Todavía más preferentemente, éste presenta un tamaño comprendido entre aproximadamente 1000 pares de bases y aproximadamente 2,000,000 de pares de bases (2 Mb) , aproximadamente 1000 pares de bases y aproximadamente 100,000 pares de bases (100 kb) , y aproximadamente 1000 pares de bases y aproximadamente 20,000 pares de bases (20 kb) . De manera ventajosa el ácido nucleico comprende uno o varios genes de interés terapéutico bajo el control de secuencias de la regulación, por ejemplo uno o varios promotores y un terminador de la transcripción, activos en las células diana.

En el sentido de la invención, se entiende por gen de interés terapéutico, principalmente cualquier gen que codifique para un producto proteico que tenga un efecto terapéutico. El producto proteico codificado de este modo puede ser principalmente una proteína o un péptido. Este producto proteico puede ser exógeno, homólogo o endógeno frente a la célula diana, es decir un producto que es principalmente expresado en la célula diana cuando ésta no presenta ninguna patología. En este caso, la expresión de una proteína permite por ejemplo paliar una expresión insuficiente en la célula o la expresión de una proteína inactiva o débilmente activa, en virtud de una modificación o incluso de sobreexpresar dicha proteína. El gen de interés terapéutico puede también codificar para un mutante de una proteína celular que tiene por ejemplo una estabilidad acrecentada o una actividad modificada. El producto proteico puede igualmente ser heterólogo frente a las células diana. En este caso, una proteína expresada puede por ejemplo completar o aportar una actividad deficiente en la célula, permitiéndole luchar contra una patología, o estimular una respuesta inmunitaria. Entre los productos terapéuticos en el sentido de la presente invención, se pueden citar más particularmente las enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfocinas (por ejemplo las interleucinas, los interferones o el TNF: ver patente Francesa FR 92/03120) , los factores de crecimiento, los neurotransmisores o sus precursores o enzimas de síntesis, los factores tróficos (por ejemplo BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, VEGF, NT3 , NT5 o HARP/pleiotrofina) , las apolipoproteínas (por ejemplo ApoAI, ApoAIV o ApoE; ver la patente Francesa FR 93/05125) , la distrofina o una minidistrofina (patente Francesa FR 91/11947) , la proteína CFTR asociada a la mucoviscidosis, los genes supresores de tumores (por ejemplo p53, Rb, RaplA, DCC o k-rev: ver patente Francesa FR 93/04745) , los genes que codifican para los factores implicados en la coagulación (Factores VII, VIII, IX), los genes que intervienen en la reparación del ADN, los genes suicidas (timidina-cinasa, citosina-desaminasa) , los genes de la hemoglobina o de otros transportadores proteicos, las enzimas del metabolismo o del catabolismo. El ácido nucleico de interés terapéutico puede igualmente ser un gen o una secuencia antisentido, donde la expresión de la célula diana permite controlar la expresión de los genes o la transcripción de los ARNm celulares . Tales secuencias pueden, por ejemplo, ser transcritas en la célula diana en ARN complementarios de ARNm celulares, y bloquear de este modo la traducción en proteína, de acuerdo a la técnica descrita en la patente Europea EP 140 308. Los genes terapéuticos comprenden igualmente la secuencia que codifican para las ribozimas, que son capaces de destruir selectivamente los .ARN diana (patente Europea EP 321 201) . ...i. a . aá. . .taltal Como se indicó anteriormente, el ácido nucleico puede igualmente poseer un o varios genes que codifican para un péptido antigénico, capaz de generar en el hombre o en el animal una respuesta inmune. En esta modalidad particular de puesta en operación, la invención permite la realización ya sea de vacunas o bien de tratamientos in unoterapéuticos aplicados al hombre o al animal, principalmente contra los microorganismos, virus o los cánceres. Se pueden tratar principalmente de péptidos antigénicos específicos del virus de Epstein Barr, del virus VIH, del virus de la hepatitis B (patente Europea EP 185 573) , del virus de la pseudo-rabia, del "virus formador de sincitios" , otros virus o incluso de péptidos antigénicos específicos de tumores (patente Europea EP 259 212) . Como se indicó anteriormente, el ácido nucleico comprende de preferencia igualmente las secuencias que permiten la expresión del gen de interés terapéutico y/o del gen que codifica para el péptido antigénico en la célula u órgano deseado. Se puede tratar de secuencias que son naturalmente responsables de la expresión del gen considerado cuando esas secuencias son susceptibles de funcionar en la célula infectada. Se puede tratar igualmente de secuencias de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o incluso sintéticas) . Principalmente, se pueden tratar de secuencias promotoras de los genes eucariotes o virales. Por ejemplo, se puede tratar de secuencias promotoras provenientes del genoma de la célula que se desea infectar. De igual modo, se puede tratar de secuencias promotoras provenientes del genoma de un virus. A este respecto, se pueden citar por ejemplo los promotores de los genes E1A, MLP, CMV, RSV o HSV. Además, estas secuencias de expresión pueden ser modificadas por ejemplo mediante adición de secuencias de activación o de regulación. Se puede tratar también de promotores inducibles o reprimibles . Por otra parte, el ácido nucleico puede igualmente incluir, en particular corriente arriba (5') del gen de interés terapéutico, una secuencia de señal que dirige el producto terapéutico sintetizado hacia las vías de secreción de las células diana. Esta secuencia de señal puede ser la secuencia de señal natural del producto terapéutico, pero puede tratarse igualmente de cualquier otra secuencia de señal funcional, o de una secuencia de señal artificial. El ácido nucleico puede igualmente incluir una secuencia de señal que dirige el producto terapéutico sintetizado hacia un compartimiento particular de la célula. Las composiciones de la presente invención pueden ser preparadas mediante mezclas de una solución acuosa que contiene una partícula mineral que tiene una estructura de hojas o laminillas intercambiables y de una solución que contiene los ácidos nucleicos. De manera más precisa, las composiciones de acuerdo a la presente invención pueden ser preparadas poniendo las partículas minerales, que tienen una estructura de laminillas intercambiables, en solución acuosa a un pH cercano a la neutralidad (por ejemplo entre 6 y 8, y más preferentemente entre 6.5 y 7.5), luego agregando la solución acuosa obtenida de este modo a una solución que contiene los ácidos nucleicos, o bien agregando dicha solución que contiene los ácidos nucleicos a la solución acuosa de partículas minerales, que tienen una estructura de laminillas intercambiables. La solución que contiene los ácidos nucleicos es de preferencia una solución isotónica en cloruro de sodio o en glucosa. De preferencia, las partículas minerales que tienen una estructura de laminillas intercambiables y los ácidos nucleicos son introducidos en la composición en cantidades tales que la relación en masa entre las partículas minerales que tienen una estructura de laminillas intercambiables y los ácidos nucleicos, está comprendida entre 0.01 y 1000, de preferencia entre 0.01 y 500, más preferentemente entre 0.01 y 100, y todavía más preferentemente entre 0.5 y 100. En todo caso, las cantidades respectivas de cada componente pueden ser ajustadas y optimizadas fácilmente por el experto en la materia mediante el método habitual de ensayo y error, en función de la partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables utilizada, del ácido nucleico y de las aplicaciones buscadas (principalmente del tipo celular a transfectar) .

La invención tiene igualmente por objetivo las composiciones tal como se definen anteriormente para la utilización como medicamento. La invención tiene igualmente por objetivo la utilización de las composiciones tales como se definen anteriormente para la transferencia de los ácidos nucleicos en las células in vi tro, in vivo o ex vivo. De manera más precisa, la presente invención tiene por objetivo la utilización de las composiciones tales como se definen anteriormente, para la preparación de un medicamento destinado a tratar las enfermedades, en particular las enfermedades que resultan de una deficiencia en un producto proteico o nucleico. El ácido nucleico contenido en dicho medicamento codifica para el producto proteico o nucleico, o constituye dicho producto nucleico, apto para corregir dichas enfermedades in vivo o ex vivo. El medicamento puede además ser una vacuna o en este caso, el ácido nucleico transfectado induce una respuesta inmunitaria. Para las utilizaciones in vivo, por ejemplo en terapia o para el estudio de la regulación de los genes o la creación de modelos animales de patologías, las composiciones de acuerdo a la invención pueden ser formuladas con miras a administraciones principalmente mediante la vía tópica, cutánea, oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, transdérmica, intratraqueal o intraperitoneal . De preferencia, las composiciones de la invención contienen un vehículo farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable, principalmente para una inyección directa a nivel del órgano deseado, o para una administración mediante la vía tópica (sobre la piel y/o sobre la mucosa) . Se puede tratar en particular de soluciones estériles, isotónicas, o de composiciones anhidras, principalmente liofilizadas, que, mediante adición según el caso de agua esterilizada o de suero fisiológico, permite la constitución de solutos inyectables. Además, las composiciones de acuerdo a la invención pueden contener uno o más adyuvantes clásicamente utilizados en farmacia. Las dosis de ácidos nucleicos utilizadas para la inyección, así como el número de administraciones pueden ser adaptadas en función de los diferentes parámetros, y principalmente en función del modo de administración utilizado, de la patología en cuestión, del gen a expresar, o incluso de la duración del tratamiento buscado. En lo que concierne más particularmente al modo de administración, se puede tratar ya sea de una inyección directa en los tejidos, por ejemplo a nivel de los tumores, o en las vías circulatorias, o bien de un tratamiento de células en cultivo, seguido de su reimplantación in vivo, por inyección o injerto. Los tejidos en cuestión en el marco de la presente invención, son por ejemplo los músculos, la piel, el cerebro, los pulmones, el hígado, el bazo, la médula ósea, el timo, el corazón, la linfa, la sangre, los huesos, los cartílagos, el páncreas, los ríñones, la vesícula, el estómago, los intestinos, los testículos, los ovarios, el recto, el sistema nervioso, los ojos, las glándulas o los tejidos conjuntivos. Otro objetivo de la presente invención se refiere a un método de transferencia de los ácidos nucleicos en las células que comprende las siguientes etapas: (1) la formación de una composición que comprende al menos un ácido nucleico y una partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables tal como se define anteriormente, y (2) la puesta en contacto de las células en composición formada en (1) . Más particularmente, la presente invención se refiere un método de tratamiento terapéutico del cuerpo humano o animal que comprende las siguientes etapas: (1) la formación de una composición que comprende al menos un ácido nucleico y una partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables, tal como se define anteriormente, y (2) la puesta en contacto de las células del cuerpo humano o animal con la composición formada en (1) . La puesta en contacto de las células con la composición de acuerdo a la presente invención puede ser realizada mediante incubación de las células con dicha composición o mediante inyección de la composición en el organismo o una parte del organismo. La incubación es realizada de preferencia en presencia por ejemplo de 0.01 a 1000 µg de ácido nucleico por 106 células. Para una administración in vivo, la dosis de ácido nucleico que van de 0.01 a 10 mg, pueden por ejemplo ser utilizadas. Las composiciones de la invención pueden además contener uno o varios adyuvantes farmacéuticamente aceptables. En este caso, el o los adyuvantes son previamente mezclados con la solución acuosa que contiene la partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables de acuerdo a la invención, y/o con la solución de ácido (s) nucleico (s). La presente invención proporciona de este modo un método particularmente ventajoso para la transferencia de los ácidos nucleicos, principalmente para el tratamiento de las enfermedades, que comprenden la administración in vivo o ex vivo de un ácido nucleico que codifica para una proteína, o que puede ser transcrito en un ácido nucleico apto para corregir dicha enfermedad, el ácido nucleico está asociado a una partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables, tal como se define anteriormente, en las condiciones definidas anteriormente. Las composiciones de acuerdo a la presente invención son particularmente útiles para la transferencia de ácidos nucleicos en las células primarias o en las líneas establecidas. Se puede tratar por ejemplo de células fibroblásticas, musculares, nerviosas (neuronas, astrocitos, células gliales) , hepáticas, he atopoyéticas (por ejemplo los linfocitos, CD34, o dendríticas) o epiteliales, bajo las formas diferenciadas o pluripotenciales (precursoras) . Además de las disposiciones que preceden, la presente invención comprende igualmente otras características y ventajas que surgirán de los ejemplos y figuras que siguen, y que deben ser considerados como ilustrativos de la invención sin limitar su alcance.

FIGURAS Figura 1 : estructura idealizada de las partículas minerales que tienen una estructura de laminillas intercambiables (hidróxidos dobles laminares) de acuerdo a la presente invención. Figura 2 : representación esquemática de la hidrotalcita MgeAl2C03 (OH) 16»4H20. Figura 3 : medición del potencial zeta de las partículas de hidrotalcita solas, en solución. Figura 4 : medición del potencial zeta de las composiciones que contienen las partículas de hidrotalcita y del ADN en una relación de masa igual a 0.5. Figura 5 : medición del porcentaje de ADN que queda en el sobrenadante con relación a la cantidad inicial de ADN introducida, en función de la relación en masa de hidrotalcita/ADN. Las mediciones han sido realizadas para tres concentraciones diferentes de los ADN introducidos: 20 µg de ADN/ml, 50 µ de ADN/ml, y 100 µg de ADN/ml . Figura 6 : Electroforesis sobre gel de agarosa de diferentes formulaciones de ADN. La columna "a" constituye el control (ADN no formulado y no sometido a las nucleasas) , la columna "b" representa el ADN no formulado sometido a las nucleasas, y las columnas "c" a "f" representan las composiciones de hidrotalcita/ADN a relaciones en masa de 0.125 ó 0.25 ó 0.5 ó 1 que son sometidas a las nucleasas. Figura 7 : visualización bajo la forma de histograma de la eficacia de transferencia del gen in vivo (mediante inyección en el músculo tibial craneal del ratón) de las composiciones de ADN/hidrotalcita en diferentes relaciones en masa, comparativamente a la inyección del ADN desnudo. Figura 8 : representación esquemática del plásmido pXL3031 utilizado en los experimentos de transferencia de ADN en las células.

EJEMPLOS A] MATERIAL Y MÉTODOS Ratones utilizados: Los ratones utilizados en los experimentos de transferencia in vivo de los genes son ratones hembra C57B16 de edades de 8 semanas, y repartidos en 9 grupos de 12 ratones .

Partícula mineral de acuerdo a la invención utilizada La partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables utilizada en los diferentes ensayos, es la hidrotalcita en solución acuosa a una concentración de 20 g/1 y a pH 7. Esta hidrotalcita es comercializada por la sociedad Süd-Chemie AG (Alemania) .

ADN El plásmido utilizado es el pXL3031 que contiene el gen luc que codifica para la luciferasa bajo el control del promotor P/E CMV del citomegalovirus, representado en la figura 8. Su tamaño es de 3671 pares de bases. La solución del plásmido utilizado contiene 320 µg de /ADN/ml en una solución de cloruro de sodio (NaCl) a 150 mM.

Complejos de hidrotalcita/ADN Los complejos son preparados mediante la mezcla equivolumétrica de dos soluciones: una que contiene la hidrotalcita y la otra el ADN plasmídico.

Ejemplo 1: Medición de los potenciales zeta de la hidrotalcita sola y de los complejos de ADN/hidrotalcita El objetivo de este ejemplo es mostrar que el ADN es capaz de asociarse con una partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables tales como la hidrotalcita. La medición del potencial zeta informa de la naturaleza de la carga de la superficie de una partícula colocada en un líquido. El potencial zeta no es una medición directa de la carga de la superficie, sino que es el potencial que existe alrededor de la partícula cuando ésta se desplaza en una solución cuando es sometida a un campo eléctrico. Por consecuencia, si las partículas tienen una carga de superficie positiva, el potencial zeta, que es la única magnitud mensurable, será también positivo. El potencial zeta juega un papel determinante en la estabilidad coloidal de las partículas en solución. En efecto, cuando el potencial zeta es fuertemente positivo o negativo, las partículas no se agregan puesto que las fuerzas de repulsión electrostáticas las mantienen aisladas. Por el contrario, las partículas que poseen un potencial zeta cercano a cero no son estables, puesto que las fuerzas de Van Der aals atraen a las partículas entre ellas, y las hacen precipitar. El potencial zeta de la hidrotalcita y de los complejos de hidrotalcita/ADN han sido medidos con un zetámetro de marca Coulter (Delsa 440 SX) . La solución de hidrotalcita contendría 0.15 mg de hidrotalcita/ml en una solución de cloruro de sodio (NaCl) a 20 mM, o bien una conductividad de 2.3 mS/cm. Los complejos de hidrotalcita/ADN han sido preparados a concentraciones de 250 µg de ADN/ml en una solución de cloruro de sodio (NaCl) a 20 mM, con relación a la masa de 0.5. La medición ha sido efectuada aplicando un campo eléctrico de 1.5 mA durante 60 segundos . La figura 3 representa el potencial zeta de hidrotalcita sola, antes de ser mezclada con el ADN. Este potencial zeta es + 32 mV e indica por lo tanto una carga superficial globalmente catiónica, que es coherente con la estructura y la composición de la hidrotalcita (ver figuras 1 y 2) . La figura 4 representa el potencial zeta de los complejos de hidrotalcita/ADN con relación en masa de 0.5. En este caso, el potencial zeta es de -41 mV. La carga de superficie ha sido pues modificada y es a la fecha globalmente aniónica, lo que indica que las moléculas de .ADN aniónicas no están asociadas sobre la superficie de la hidrotalcita, modificando así su carga de superficie.

Ej emplo 2 : Puesta en evidencia de la asociación entre el ADN y las partículas minerales que tienen una estructura de laminillas intercambiables tal como la hidrotalcita El objetivo de este ejemplo es mostrar que las partículas minerales que tienen una estructura de laminillas intercambiables tales como la hidrotalcita, se asocian con el ADN. 5 Las isotermas de adsorción son realizadas mezclando cantidades crecientes de hidrotalcita con una cantidad constante de ADN. Las mezclas de hidrotalcita/ADN son preparadas mediante la mezcla equivolumétrica de una solución que contiene el ADN y una solución que contiene la hidrotalcita. El conjunto de estas mezclas es enseguida ultracentrifugado a 50,000 revoluciones por minuto durante 10 minutos (ultracentrífuga: Beckman TL100) . La gráfica de la figura 5 indica que la cantidad de ADN presente en el sobrenadante disminuye progresivamente con el aumento de las 5 relaciones en masa de la hidrotalcita/ADN. A una relación de hidrotalcita/ADN de 50 peso/peso, ya no existe ADN presente en el sobrenadante. Esto indica que todas las moléculas de ADN están asociadas con la hidrotalcita y se encuentran en el botón después de la ultracentrifugación. 0 El mismo fenómeno ha sido observado a tres concentraciones de ADN diferentes: 20, 50 y 100 µg de ADN/ml. Por consecuencia, se puede deducir que existe asociación entre la hidrotalcita y el ADN.

Ejemplo 3 : Protección del ADN frente a las degradaciones provocadas por las nucleasas: El objetivo de este ejemplo es mostrar que el 7ADN está protegido frente a las degradaciones enzimáticas cuando éste está asociado a una partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables, tales como la hidrotalcita. Las muestras de ADN desnudo y de ADN formulado con la hidrotalcita, han sido sometidas a la prueba de resistencia a las degradaciones provocadas por las nucleasas. Para esto, las muestras han sido incubadas con una recolección de líquido muscular. La figura 6 indica que cuando el ADN está asociado con la hidrotalcita a diferentes relaciones en. masa (columnas "c", "d" , "e" y "f") , éste no es degradado por las nucleasas puesto que es del todo posible observar una banda de ADN sobre el gel . Por el contrario, la columna "b" que representa el .ADN desnudo no asociado con la hidrotalcita, es totalmente degradado por las nucleasas puesto que en lugar de tener una banda de ADN bien identificada sobre el gel, se observa una multitud de pequeños fragmentos que migran en el gel . 20 De este modo, cuando el ADN es asociado con las partículas minerales de la hidrotalcita, éste es protegido de la acción de la degradación de las nucleasas, por oposición al ADN desnudo que es rápidamente degradado. Esta propiedad conferida por las partículas minerales que tienen una estructura de laminillas intercambiables tales como la hidrotalcita, es muy interesante puesto que una cantidad muy ^^^^^a grande de ADN puede de este modo alcanzar el núcleo de las células para ser transcrito, con las consecuencias benéficas que esto implica en términos de la eficacia de la transfección.

Ejemplo 4 : Transfección in vivo de complejos de hidrotalcita/.ADN a) Inyecciones 10 Las inyecciones han sido realizadas en forma bilateral en el músculo tibial craneal de ratones a razón de 25 µl/ratón, o bien 4 µg de ADN/músculo . Los animales son anestesiados con 250 µl de Cetamina/Xilazina mediante la vía intraperitoneal (3.9 mi de Imalgene 1000, 0.6 mi de Rompun al 2%, y 40.5 mi de una solución de cloruro de sodio NaCl a 150 mM) . Enseguida, los animales son afeitados e inyectados al nivel de los dos músculos tibiales craneales. 20 b) Toma de los músculos Los músculos tibiales craneales son recogidos 6 días después de la inyección en 1 mi de amortiguador de 25 lisis/músculo (amortiguador de lisis de Promega E) suplementado con los inhibidores de proteasa (cóctel de r^f-.^ua* * . j, t jk t ,¿ j, tabletas - Boehringer) . Los músculos son recogidos en los tubos especiales de BIO101 y conservados a -20°C, antes de la trituración y la lectura. c) Extracción de la luciferasa expresada por las células musculares La extracción de la luciferasa es realizada con un aparato "Fastprep machine" en las condiciones de extracción 10 que utilizan 1 mi de amortiguador de lisis por tubo a una velocidad de 6.5 m/s, durante 30 segundos. Los tubos son enseguida puestos en hielo y centrifugados a 12,000 g durante 10 minutos a 4°C. d) Determinación de la actividad de luciferasa La actividad de luciferasa es medida utilizando un equipo de luciferasa (Promega) y un luminómetro Dynex MLX. La lectura de esta actividad es medida en RLU ("RElative Light Unit" : Unité de Lumiere Relative (Unidad de Luz Relativa) ) . e) Transfección in vivo en el músculo Los resultados de la transferencia del gen in vivo en el músculo son representados en la figura 7. Estos aaa, . ai .¿ a,,- - • " * ' * **l *-» ~ ,* * & <*A * '*~* ' resultados indican que a la relación en masa de hidrotalcita/ADN de 0.5, un aumento de la actividad de luciferasa de un factor de 14 es obtenido con relación al ADN desnudo. Más en general, las composiciones de ADN/hidrotalcita presentan una eficacia de transfección mejorada con relación a aquella adquirida por la inyección del ADN desnudo.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descr_ipción de la invención. ¿ , sÁ.

Claims (30)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una composición, caracterizada porque comprende al menos un ácido nucleico y una partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables, con la exclusión de las composiciones que comprenden un ácido desoxirribonucleico que tiene un tamaño inferior a 1000 pares de bases . 2. Una composición, caracterizada porque comprende al menos un ácido nucleico que tiene un tamaño superior de 1000 pares de bases y una partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables.
3. 3. Una composición, caracterizada porque comprende al menos un ácido ribonucleico y una partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables .
4. 4. La composición de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el ácido nucleico es un plásmido, un vector, un episoma o un cásete de expresión.
5. 5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables tiene por fórmula general : (OH) 2] x+ [Xm-?/m.nH20] x" en la cual M11 representa un catión metálico divalente, M111 representa un catión metálico trivalente, Xm~ representa un anión interfoliar y m es un número entero superior o igual a 1, x está comprendido entre 0 y 1 estrictamente, y n es estrictamente superior a 0.
6. 6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el catión metálico divalente M11 puede ser elegido entre el magnesio (Mg) , el cromo (Cr) , el manganeso (Mn) , el hierro (Fe) , el níquel (Ni) , el cobalto (Co) , el cobre (Cu) o el zinc (Zn) .
7. 7. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el catión metálico divalente M11 es el magnesio.
8. 8. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el catión metálico trivalente M111 puede ser elegido entre el aluminio (Al) , el cromo (Cr) , el manganeso (Mn) , el hierro (Fe) , el níquel (Ni) , el cobalto (Co) , o el galio (Ga) .
9. 9. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el catión metálico trivalente M111 es el aluminio.
10. 10. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el anión interfoliar Xm~ puede ser elegido entre los halogenuros, los oxoaniones, los iso- y heteroaniones, los aniones complejos, o los aniones orgánicos.
11. 11. La composición de conformidad con la reivindicación 5 ó 10, caracterizada porque el anión interfoliar Xm~ es el carbonato C032".
12. 12. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque tt? es igual a 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
13. 13.. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque x está comprendido entre 0.05 y 0.95.
14. 14. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque n es superior o igual a 0.1
15. 15. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables es elegida entre la hidrotalcita de la fórmula Mg6Al2C03 (OH) ?6.4H20, la manaseita de fórmula Mg6Al2C03 (OH) ?6.4H20, la piroaurita de la fórmula Mg6Fe2C03 (OH)?6»4H20, la estictita de la fórmula Mg6Cr2C03 (OH)16.4H20, la takovita de la fórmula Ni6Al2C03 (OH)?s«4H20, la reevesita de la fórmula Ni6Fe2C03 (OH) ?6»4H20 o la comblainita de la fórmula Ni6C?2C03(OH)?6.4H20.
16. 16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables es la hidrotalcita de la fórmula Mg6Al2C03 (OH) ?6.4H20. 17. Una composición que comprende al menos un ácido nucleico y una partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables de la fórmula:
17. [M^-x 11^ (OH) 2] x+ [Xm-?/m.nH20] x" caracterizada porque M11 representa el magnesio, M111 representa el aluminio, Xm~ representa un anión interfoliar carbonato y m es un número entero superior o igual a l, x está comprendido entre 0 y 1 estrictamente, y n es estrictamente superior a 0.
18. 18. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque al menos un ácido nucleico y una partícula mineral tiene una estructura de laminillas intercambiables de la fórmula Mg6Al2C03 (OH) ?6»4H20.
19. 19. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque ésta comprende además uno o más adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
20. 20. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada porque ésta comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable.
21. 21. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada porque ésta comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable para una aplicación sobre la piel y/o las mucosas.
22. 22. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizada porque la relación en masa de las partículas minerales que tienen una estructura de laminillas intercambiables/ácido (s) nucleico (s), está comprendida entre 0.01 y 1000.
23. 23. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 17 ó 18, caracterizada porque el ácido nucleico presenta un tamaño comprendido entre aproximadamente 1000 pares de bases y aproximadamente 2,000,000 de pares de bases.
24. 24. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 17 ó 18, caracterizada porque el ácido nucleico presenta un tamaño comprendido entre aproximadamente 1000 pares de bases y aproximadamente 100,000 de pares de bases.
25. 25. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 17 ó 18, caracterizada porque el ácido nucleico presenta un tamaño comprendido A? i i entre aproximadamente 1000 pares de bases y aproximadamente 20,000 de pares de bases.
26. 26. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizada porque es para 5 la utilización como medicamento.
27. 27. El uso de una composición tal como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, para la preparación de un medicamento destinado a la transfección de células. 10
28. 28. El procedimiento de preparación de una composición tal como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado el procedimiento porque se mezcla una solución acuosa que contiene una partícula mineral que tiene una estructura de 15 laminillas intercambiables y una solución que contiene el o los ácidos nucleicos.
29. 29. El procedimiento de preparación de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque, en el caso donde las composiciones tal como se definen en 20 las reivindicaciones precedentes contienen además uno o varios adyuvantes farmacéuticamente aceptables, el o los adyuvantes son previamente mezclados con la solución acuosa que contiene una partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables y/o con la solución de 25 ácido (s) nucleico (s).
30. 30. Un método de transferencia de ácidos nucleicos en las células, in vi tro o ex vivo, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: (1) la formación de una composición que comprende al menos un ácido nucleico, una partícula mineral que tiene una estructura de laminillas intercambiables tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, y (2) la puesta en contacto de las células con la composición formada en (1) .