ES2304467T3

ES2304467T3 - Vehiculo de liberacion de nanoparticulas.

Info

Publication number: ES2304467T3
Application number: ES02802543T
Authority: ES
Inventors: Stefan Franzen; Daniel L. Feldheim; Alexander G. Tkachenko; Marisha L. Godek; Joseph A. Ryan; Miles F. Anderson
Original assignee: North Carolina State University; University of California
Current assignee: North Carolina State University; University of California
Priority date: 2001-07-10
Filing date: 2002-07-10
Publication date: 2008-10-16
Anticipated expiration: 2022-07-10
Also published as: EP1990040A1; AU2002364927A1; US7332586B2; DE60225589T2; US20080199529A1; JP2005511761A; CA2453417A1; EP1450751A2; DE60225589D1; ATE388691T1; US20030147966A1; WO2003051278A3; EP1450751A4; EP1450751B1; WO2003051278A2

Abstract

Vehículo de liberación de nanopartículas que comprende: (a) una nanopartícula; un agente activo; (b) una señal de localización nuclear; y (c) uno o más agentes marcadores extracelulares.

Description

Vehículo de liberación de nanopartículas.

Sector técnico

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos de liberación de un agente activo a las células y al interior de las mismas. Más particularmente, el procedimiento utiliza un vehículo de liberación de nanopartículas como vehículo para transportar proteínas, ácidos nucleicos, análogos de proteínas y ácidos nucleicos, moléculas pequeñas y otros compuestos a la superficie de una célula, en el citoplasma de una célula o en el núcleo de una
célula.

Tabla de abreviaturas

ATP: adenosintrifosfato

ADP: adenosindifosfato

AS: antisentido

AS-ODN: oligodesoxinucleótidos antisentido

bipy: bipiridina

ADNc: ADN complementario

ADN: ácido desoxirribonucleico

ADNds: ADN de doble cadena

EDTA: ácido etilendiaminotetraacético

HEPES: ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico

ITO: óxido de indio y estaño

IV: intravenosa

kDa: kilodalton(s)

LB: caldo de Luria

MES: ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico

ARNm: ARN mensajero

NDP: nucleótido difosfato

NLS: señal de localización nuclear

nt: nucleótido

NTP: nucleótido trifosfato

ODN: oligodesoxinucleótido

PACVD: deposición química de vapor asistida por plasma

PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida

PBS: solución salina tamponada con fosfato

PCR: reacción en cadena de la polimerasa

pI: punto isoeléctrico

PNA: análogo de ácido nucleico peptídico

RES: sistema reticuloendotelial

RME: endocitosis mediada por receptor

ARN: ácido ribonucleico

SDS: dodecil sulfato sódico

SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico

ADNss: ADN de cadena única

TEM: microscopio electrónico de transmisión

\vskip1.000000\baselineskip

Abreviaturas de aminoácidos

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

\newpage

Técnica anterior

El desarrollo de nuevas formas de productos terapéuticos que utilizan macromoléculas, tales como proteínas o ácidos nucleicos como agentes terapéuticos ha creado la necesidad de desarrollar estrategias nuevas y eficaces de liberación de dichas macromoléculas a sus apropiadas dianas celulares. Los productos terapéuticos basados en el uso de factores de crecimiento de polipéptidos específicos o genes específicos para sustituir o complementar genes ausentes o defectuosos son ejemplos de productos terapéuticos que podrían requerir de dichos nuevos sistemas de liberación. Los productos terapéuticos que implican oligonucleótidos que interaccionan con ADN para modular la expresión de un gen u otro segmento de ADN también podrían requerir de un nuevo sistema de liberación. La aplicación clínica de dichas terapias no depende sólo de la fiabilidad y la eficacia de nuevos sistemas de liberación, sino también de su seguridad y de la facilidad con que las tecnologías que soportan estos sistemas se pueden adaptar para la producción farmacéutica, almacenamiento y distribución de las formulaciones terapéuticas a gran escala.

La terapia génica se ha convertido en un modo cada vez más importante de tratar varios trastornos genéticos. El potencial para proporcionar tratamientos eficaces ha estimulado un esfuerzo intenso por aplicar esta tecnología a enfermedades para las que no hay tratamientos eficaces. El progreso reciente en esta área ha indicado que la terapia génica puede tener un impacto significativo no sólo en el tratamiento de trastornos de genes individuales, sino también en otras enfermedades más complejas, tales como cáncer. Sin embargo, un obstáculo significativo en el logro de una pauta eficaz de terapia génica ha sido la dificultad de diseñar estrategias nuevas y eficaces para liberar ácidos nucleicos terapéuticos a células y dianas intracelulares. De hecho, un vehículo ideal para la liberación de ácidos nucleicos o proteínas en las células y tejidos debería ser altamente eficaz, seguro de utilizar, fácil de producir en grandes cantidades y tener la suficiente estabilidad para ser practicable como vehículo de liberación farmacéutica.

Cuando se utilizan ácidos nucleicos como "agentes activos" en una pauta de terapia génica, existen esencialmente dos sistemas basados en vectores virales o vectores no virales que se describen en el estado de la técnica: (1) actualmente se estudian in vivo retrovirus, adenovirus y virus del herpes (o sus recombinantes) como vectores virales; y (2) se están investigando in vivo liposomas y ligandos de receptores específicos de la superficie celular como vectores no virales (Wu & Wu, (1991), Biotherapy 3: 87-95; Ledley, (1993) Clin. Invest. Med. 16: 78-88). También se están investigando partículas nanocristalinas (Patente de Estados Unidos No. 5.460.831 de Kossovsky). Todas estas estrategias sufren una serie de desventajas, incluyendo la degradación in vivo no deseada y una falta de especificidad para una estructura diana determinada, por ejemplo, el núcleo de una célula o la superficie de una célula que expresa un tipo de estructura particular.

La tecnología de nanopartículas ha hallado aplicación en una serie de disciplinas, pero ha hallado una mínima aplicación en farmacología y la liberación de fármacos. El desarrollo de nanopartículas terapéuticas tuvo su primer intento alrededor de 1970 y se pretendía que las nanopartículas propuestas funcionaran como portadores de fármacos anticancerígenos y otros fármacos (Couvreur et al., (1982) J. Pharm. Sci., 71: 790-92). También se hicieron intentos para elucidar procedimientos a través de los cuales se minimizaría la captación de las nanopartículas por las células del sistema reticuloendotelial (RES) (Couvreur et al., (1996) en Polymeric Nanoparticles and Microspheres, (Gulot & Couvreur, eds.), CRC Press, Boca Raton, páginas 27-93). Otros intentos perseguían el uso de nanopartículas para el tratamiento de trastornos específicos. Véase, por ejemplo, Labhasetwar et al., (1997) Adv. Drug. Del. Rev., 24: 63-85.

WO9856363 describe una nanopartícula sólida para la liberación a células diana, comprendiendo dicha nanopartícula un catión polimérico y un polianión, donde el polianión consiste en ácidos nucleicos (ADN, ARN). Un polipéptido se une a la superficie de dicha nanopartícula, este polipéptido comprende el dominio "knob" de la proteína fibrosa de adenovirus que es adecuada para la liberación dirigida de agentes terapéuticos a células y para la unión celular.

En WO9913719 se describe una composición que comprende una molécula de ácido nucleico (ADN, ARN), una molécula de ácido nucleico peptídico conjugado (PNA) asociada con dicha molécula de ADN. Esta molécula PNA es preferiblemente un péptido señal de localización nuclear que facilita la captación nuclear y contiene una región complementaria a la molécula de ADN. La insulina, interferón, eritropoyetina se utilizan como agentes terapéuticos.

La WO0242325 publicada el 30.05.2002 que reivindica una fecha de prioridad anterior (documento de Prioridad: 60/244,501) muestra una composición de micropartículas que comprende una matriz o armazón polimérico, comprendiendo el ácido nucleico además una unidad transcripcional que se basa en una secuencia codificante que codifica un polipéptido, y una señal de localización nuclear que provoca la translocación del ácido nucleico al núcleo (secuencias hnRNPA y la señal de localización nuclear de SV40).

Aunque las nanopartículas se han mostrado como prometedoras como herramientas útiles para los sistemas de liberación de fármacos, aún existen muchos problemas. Algunos problemas no solucionados se refieren al control, selección y comportamiento de varios tamaños de partículas, así como los problemas que rodean la carga de las partículas con productos terapéuticos. Adicionalmente, la dirección de la nanopartícula al sitio celular apropiado aun permanece como un problema. El diseño y la disposición de un vehículo de liberación de nanopartículas que afrontan estos problemas representan de este modo una necesidad actual y que se sentía desde hace tiempo en el estado de la técnica.

Descripción resumida de la invención

Se describe un vehículo de liberación de nanopartículas. En una realización el vehículo de liberación de nanopartículas comprende: (a) una nanopartícula; (b) un agente activo; y (c) una señal de localización nuclear. En otra realización, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende (a) una serie de agentes marcadores; (b) un soporte de nanopartículas; y (c) un agente activo.

Preferiblemente, el agente activo se selecciona del grupo que consiste en ácidos nucleicos de doble cadena, ácidos nucleicos de cadena única, ácidos nucleicos modificados químicamente, ácido nucleicos peptídicos, proteínas y moléculas pequeñas. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además a secuencia de unión fijada a, y dispuesta entre, el agente activo y la nanopartícula. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia de reconocimiento de la superficie celular. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas se dispone en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además un grupo detectable.

Opcionalmente, el vehículo de liberación de nanopartículas puede comprender además dos o más agentes activos diferentes. También, opcionalmente, el vehículo de liberación de nanopartículas puede comprender además un agente potenciador de la biocompatibilidad. Como opción adicional, el vehículo de liberación de nanopartículas puede comprender además un revestimiento protector que cubre al menos parte del vehículo de liberación. En una realización, el revestimiento protector puede cubrir todo el vehículo de liberación, incluyendo el agente o agentes activos y el agente o agentes marcadores. El revestimiento protector puede comprender un polímero. El revestimiento protector también puede comprender un material biológico.

El material biológico puede ser una proteína, lípido, carbohidrato o combinación de los mismos.

Se describe un procedimiento de liberación de un agente activo al núcleo de una célula. El procedimiento comprende: (a) proporcionar un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención que comprende una nanopartícula que tiene un diámetro de aproximadamente 30 nm o menos; y (b) poner en contacto una célula diana con el vehículo de liberación de nanopartículas, a través del cual se libera un agente activo al núcleo de una célula diana. Preferiblemente, el agente activo se selecciona del grupo que consiste en ácido nucleicos de doble cadena, ácidos nucleicos de cadena única, ácidos nucleicos químicamente modificados, ácidos nucleicos peptídicos, proteínas y moléculas pequeñas. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia de unión fijada a, y dispuesta entre, el agente activo y la nanopartícula. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia de reconocimiento de la superficie celular. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas se dispone en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además un grupo detectable.

Se dispone de un procedimiento de liberación de un agente activo al citoplasma de una célula. El procedimiento comprende: (a) proporcionar un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención que comprende una nanopartícula que tiene un diámetro superior o igual a aproximadamente 30 nm; y (b) poner en contacto una célula diana con el vehículo de liberación de nanopartículas. Preferiblemente, el agente activo se selecciona del grupo que consiste en ácido nucleicos de doble cadena, ácidos nucleicos de cadena única, ácidos nucleicos químicamente modificados, ácidos nucleicos peptídicos, proteínas y moléculas pequeñas. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia de unión fijada a, y dispuesta entre, el agente activo y la nanopartícula. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia de reconocimiento de la superficie celular. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas se dispone en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además un grupo detectable.

Se describe un procedimiento de modulación de la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos diana. El procedimiento comprende: (a) proporcionar un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención que comprende un agente activo capaz de interaccionar con una secuencia de ácidos nucleicos diana cuya expresión va a modularse; (b) poner en contacto una célula diana que comprende una secuencia de ácidos nucleicos diana con el vehículo de liberación de nanopartículas; y (c) modular la expresión de la secuencias de ácidos nucleicos diana a través del contacto de la etapa (b). Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia de unión fijada a, y dispuesta entre, el agente activo y la nanopartícula. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia de reconocimiento de la superficie celular. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas se dispone en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además un grupo detectable.

Se describe un procedimiento de modulación de la expresión de una proteína diana. El procedimiento comprende: (a) proporcionar un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención que comprende una secuencia de ácidos nucleicos antisentido de cadena única complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína diana; (b) poner en contacto una célula diana que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína diana con el vehículo de liberación de nanopartículas; y (c) modular la expresión de la proteína diana a través del contacto de la etapa (b). Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia de unión fijada a, y dispuesta entre, el agente activo y la nanopartícula. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia de reconocimiento de la superficie celular. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas se dispone en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además un grupo detectable.

Se describe un procedimiento de modulación de la transcripción en una muestra. El procedimiento comprende: (a) proporcionar un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención que comprende un agente activo que comprende un ligando para el que un componente de transcripción de tipo natural tiene una mayor afinidad que un ligando natural del componente de transcripción de tipo natural; (b) poner en contacto una muestra que comprende el componente de transcripción de tipo natural con el vehículo de liberación de nanopartículas; y (c) modular la transcripción en la muestra a través del contacto de la etapa (b). Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia de unión fijada a, y dispuesta entre, el agente activo y la nanopartícula. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia de reconocimiento de la superficie celular. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas se dispone en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además un grupo detectable.

Se describe un procedimiento de modulación de corte y empalme ("splicing") de ARN en una muestra. El procedimiento comprende: (a) proporcionar un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención que comprende una secuencia de ácidos nucleicos conocida o sospechosa de alterar el patrón de corte y empalme para un gen diana; y (b) poner en contacto una muestra que comprende el gen diana con el vehículo de liberación de nanopartículas; y (c) modular el corte y empalme de ARN en una muestra a través del contacto de la etapa (b). Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia de unión fijada a, y dispuesta entre, el agente activo y la nanopartícula. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia de reconocimiento de la superficie celular. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas se dispone en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además un grupo detectable.

Se describe un procedimiento de modulación de la traducción de una secuencia de ARNm que codifica una proteína de interés. El procedimiento comprende: (a) proporcionar a vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de cadena única complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ARNm que codifica una proteína de interés; (b) poner en contacto una muestra que comprende la secuencia de ARNm que codifica una proteína de interés con el vehículo de liberación de nanopartículas; y (c) modular la traducción de una secuencia de ARNm que codifica una proteína de interés a través del contacto de la etapa (b). Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia de unión fijada a, y dispuesta entre, el agente activo y la nanopartícula. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia de reconocimiento de la superficie celular. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas se dispone en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además un grupo detectable.

Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es proporcionar un vehículo de liberación de nanopartículas. Éste y otros objetivos se consiguen en su totalidad o en parte por la presente invención.

Algunos de los objetivos de la presente invención se han descrito anteriormente en la misma, otros objetivos serán evidentes a medida que avance la descripción cuando se tenga en cuenta los Dibujos que se acompañan tal como se describen mejor a continuación en la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A es una micrografía electrónica de transmisión de hepatocitos desarrollados en un medio que comprende nanopartículas de 5 nm. En la inserción se destaca una región del núcleo.

La Figura 1B es una micrografía electrónica de transmisión de hepatocitos desarrollados en un medio que comprende nanopartículas de 30 nm. En la inserción se destaca una región del citoplasma que incluye una vacuola.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un vehículo de liberación de nanopartículas como vehículo para transportar proteínas, ácidos nucleicos, análogos de proteínas y ácidos nucleicos, moléculas pequeñas y otros compuestos a la superficie de una célula, en el citoplasma de una célula y/o en el núcleo de la célula. Se puede asociar una serie de secuencias con un vehículo de liberación de nanopartículas, preferiblemente una serie de secuencias diferentes, tales como secuencias RME y secuencias NLS. Estas secuencias pueden ayudar en la translocación de un vehículo a través de varias membranas, tales como la membrana nuclear de una célula o la membrana externa de una célula. De este modo, si las membranas y otras estructuras que generalmente inhiben la translocación de un vehículo en una localización determinada en o sobre una célula se interpretan como "cerraduras", las secuencias NLS y RME se pueden interpretar como "llaves". De este modo, en una realización preferida, un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención puede comprender una serie de secuencias diferentes o "llaves" que pueden permitir que un vehículo de liberación de nanopartículas pase a través de varias barreras potenciales para la translocación en una variedad de tipos de células diferentes.

I. Definiciones

Siguiendo la vieja convención de la ley de patentes, los términos "un" y "una" significan "uno/a o más" cuando se utilizan en esta solicitud, incluyendo las reivindicaciones.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "agente activo" significa un agente terapéutico, incluyendo pero sin limitarse a agentes quimioterapéuticos, agentes radioterapéuticos, o agentes radiosensibles; un agente de la imagen; un agente de diagnóstico; u otro agente que se sabe que interacciona con una proteína intracelular, un ácido nucleico o un ligando soluble o insoluble.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "secuencia de aminoácidos" significa un oligopéptido, péptido, polipéptido, o secuencia de proteína, y fragmentos de los mismos, y moléculas naturales o sintéticas. Cuando se cita "secuencia de aminoácidos" en la presente invención se refiere a una secuencia de aminoácidos de péptido sintético o una molécula de proteína, secuencia de aminoácidos naturales, y similares. El término no pretende limitar la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos completa, nativa asociada con una molécula de proteína citada, sino que pretende comprender también variaciones en la secuencia de aminoácidos nativa.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "biodegradable" significa cualquier estructura, incluyendo pero sin limitarse a, una nanopartícula, que se descompone o en cualquier caso se desintegra después de la exposición prolongada a condiciones fisiológicas. Para ser biodegradable, la estructura debería desintegrarse sustancialmente en unas semanas después de la introducción en el cuerpo. La brushita es un material de nanopartícula biodegradable preferida.

Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "agente marcador extracelular" y "secuencia de reconocimiento de la superficie celular" se utilizan indistintamente y se refieren a una molécula pequeña o secuencia de proteína que es reconocida y unida por uno o más receptores presentes en la superficie de una célula concreta. Las secuencias de reconocimiento de la superficie celular pueden incluir proteínas de recubrimiento del VIH (gp160, 41, 120), proteínas de recubrimiento del virus corona, proteínas de recubrimiento del EBV (gp350) y péptidos. Otras secuencias de reconocimiento de la superficie celular representativas pero no limitativas pueden comprender carbohidrato y lípido, carbohidratos, ácidos nucleicos peptídicos, morfolino oligonucleótidos y polímeros. Se pretende que el término "secuencia de reconocimiento de la superficie celular" comprenda cualquier secuencia o molécula reconocida y/o unida por un receptor de la superficie celular. Es preferible, pero no necesario, que una "secuencia de reconocimiento de la superficie celular" que es reconocida y/o unida por un receptor de la superficie celular lleve a la endocitosis mediada por el receptor (RME). En la Tabla 1 se presenta una lista de grupos representativos que se pueden utilizar como agentes marcadores para la internalización mediante RME.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "modificación química" significa la alteración de un primer grupo mediante la unión covalente, no covalente o iónica de un segundo grupo al primer grupo. La modificación química puede implicar la adición de un grupo detectable a un péptido o proteína.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "detectar" significa confirmar la presencia de una entidad diana mediante la observación de la aparición de una señal detectable, tal como una señal eléctrica, radiológica o espectroscópica que aparecerá exclusivamente en presencia de la entidad diana. El término comprende el uso de las técnicas de electroforesis y técnicas de transferencia, incluyendo transferencias northern, Southern, western y far western. El término "detectar" también incluye el uso de técnicas de microscopía, tales como microscopía electrónica de transmisión. "Detectar" un suceso o la presencia de un compuesto se puede realizar directa o indirectamente, por ejemplo, mediante la monitorización de la velocidad de transcripción para detectar la presencia de los factores de transcripción. De este modo, el término "detectar" significa de manera amplia la identificación de la presencia o ausencia de un suceso, compuesto, molécula, etc.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "gen" se utiliza por simplicidad y significa una unidad codificante de una proteína, polipéptido o péptido funcional. Tal como s entenderá por los expertos en la materia, este término funcional incluye tanto secuencias genómicas como secuencias de ADNc.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "oro" significa el elemento 79, que tiene el símbolo químico Au; el término excluye específicamente cualquier connotación relativa al color u otras propiedades colorimétricas.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "homología" significa un grado de complementariedad. Puede haber una homología parcial o una homología completa (es decir, identidad). Una secuencia parcialmente complementaria que al menos inhibe parcialmente una secuencia idéntica de la hibridación a un ácido nucleico diana se puede considerar "sustancialmente homóloga". La inhibición de la hibridización de la secuencia completamente complementaria a la secuencia diana se puede examinar utilizando un ensayo de hibridización (transferencia Southern o northern, hibridación de solución y similar) en condiciones de baja astringencia. Una secuencia sustancialmente homóloga o sonda de hibridación competirá por e inhibirá la unión de una secuencia completamente homóloga a la secuencia diana en condiciones de baja astringencia. Esto no significa que las condiciones de baja astringencia sean tales que permitan la unión no específica; condiciones de baja astringencia requieren que la unión de dos secuencias entre sí sea una interacción específica (es decir, selectiva). La ausencia de unión no específica se puede evaluar mediante el uso de una segunda secuencia diana que carece incluso de un grado parcial de complementariedad (por ejemplo, menos de aproximadamente un 30% de identidad). En ausencia de unión no específica, la sonda no se hibridará a la segunda secuencia diana no complementaria.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "hibridación" significa la unión de una muestra de sonda a una muestra diana. La muestra de sonda puede comprender una molécula a la que se ha unido un grupo detectable, posibilitando de esta manera la detección de la presencia o ausencia de una muestra de sonda.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "interaccionar" significa interacciones detectables entre moléculas, tales como las que se pueden detectar utilizando, por ejemplo, microscopía electrónica de transmisión o microscopía de fluorescencia. El término "interaccionar" también se entiende que incluye interacciones de "unión" entre moléculas. Las interacciones pueden ser, por ejemplo, ácido nucleico-ácido nucleico, proteína-proteína o proteína-ácido nucleico en la naturaleza.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "aislado" significa oligonucleótidos sustancialmente libres de otros ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los que se pueden asociar, siendo dicha asociación en un material celular o en un medio de síntesis. El término se puede aplicar también a polipéptidos, en cuyo caso el polipéptido estará sustancialmente libre de ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos y otros polipéptidos no deseados.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "marcado" significa la unión covalente, no covalente o iónica de un grupo capaz de ser detectado mediante procedimientos electroquímicos, espectroscópicos, radiológicos u otros procedimientos a una molécula sonda.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "modificado" significa una alteración de un estado normal de una entidad. Una entidad se puede modificar eliminando unidades químicas discretas o añadiendo unidades químicas discretas. El término "modificado" comprende marcadores detectables así como aquellas entidades añadidas como auxiliares en la purificación. Cualquier variación con respecto al estado natural, independientemente del grado, está comprendida por el término "modificado".

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "modular" significa un aumento, descenso, u otra alteración de cualquiera o todas las actividades o propiedades, químicas y biológicas de una muestra que están mediadas por una secuencia de ácidos nucleicos, un péptido o una molécula pequeña. El término "modulación" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a tanto la sobrerregulación (es decir, la activación o estimulación) como la subrregulación (es decir, la inhibición o supresión) de una respuesta o propiedad.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "mutación" lleva su connotación tradicional y significa un cambio, heredado, natural o introducido, en una secuencia de ácidos nucleicos o polipéptido, y se utiliza en su sentido tal como es conocido generalmente por los expertos en la materia.

Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "nano", "nanoscópico" "del tamaño de los nanómetros", "nanoestructurado", "nanoescala", "complejos ADN-nanopartícula" y derivados gramaticales de los mismos se utilizan como sinónimos y de manera indistinta y significan nanopartículas, compuestos de nanopartículas y nanocápsulas huecas con un diámetro inferior o igual a aproximadamente 1000 nanómetros (nm), preferiblemente con un diámetro inferior a 30 nanómetros y más preferiblemente con un diámetro inferior a aproximadamente 10 nanómetros. Una nanopartícula se puede crear a partir de cualquier material. Una nanopartícula preferida se crea de un material semiconductor o un metal, y más preferiblemente de oro, TiO_{2} o materiales que contienen oro o TiO_{2}. También se prefieren materiales biodegradables, por ejemplo, polipéptidos. Los términos se pueden referir no sólo al componente metálico de una nanopartícula, sino también al compuesto de metal y otras partes componentes.

El término "nanopartícula" tal como se utiliza en la presente invención indica una estructura portadora que es biocompatible con y resistente de manera suficiente a la destrucción química y/o física por ambiente de uso, de manera que una cantidad suficiente de las nanopartículas permanece sustancialmente intacta después de la inyección en el torrente sanguíneo, administrada de manera intraperitoneal u oral o incubadas con una muestra in vitro para ser capaces de alcanzar el núcleo de una célula o alguna otra estructura celular. Si el fármaco puede entrar en la célula en forma en que es adsorbida a las nanopartículas, las nanopartículas también deben permanecer suficientemente intactas para entrar en la célula. La biodegradación de la nanopartícula es permisible tras la entrada en el núcleo de la célula. Las nanopartículas pueden ser partículas sólidas coloidales con un tamaño que varía desde 1 hasta 1000 nm. La nanopartícula puede tener cualquier diámetro inferior o igual a 1000 nm, incluyendo 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500 y 750 nm. Con las nanopartículas se pueden incubar fármacos, agentes activos, materiales bioactivos u otros materiales pertinentes, y de por tanto, se adsorben o unen a la nanopartícula.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "componente metálico de la nanopartícula" significa un componente de un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención al que se unen una señal de localización nuclear, fármacos, materiales bioactivos u otros materiales pertinentes. Habitualmente, pero no necesariamente, el componente metálico de la nanopartícula comprende una entidad aproximadamente esférica que comprende el átomo metálico. Preferiblemente, el componente metálico de la nanopartícula es un elemento metálico o material semiconductor, tal como una partícula de oro o TiO_{2}.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "señal de localización nuclear" significa una secuencia de aminoácidos que se sabe que dirige, in vivo, una proteína dispuesta en el citoplasma de una célula a través de la membrana nuclear y al núcleo de la célula. Una señal de localización nuclear puede también marcar la superficie exterior de una célula. De este modo, una señal de localización nuclear individual puede dirigir la entidad con la que se asocia al exterior de una célula y al núcleo de la célula. Dichas secuencias pueden tener cualquier tamaño y composición, por ejemplo más de 25, 25, 15, 12, 10, 8, 7, 6, 5 o 4 aminoácidos, pero preferiblemente comprenden al menos una secuencia de cuatro a ocho aminoácidos que se sabe que actúa como señal de localización nuclear (NLS).

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "farmacéuticamente aceptable" y variaciones gramaticales del mismo, si se refiere a composiciones, portadores, diluyentes y reactivos, significa que los materiales son capaces de administrarse a o en un sujeto vertebrado sin la producción de efectos fisiológicos tales como náuseas, mareos, malestar gástrico, fiebre y similares.

Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "polipéptido", "proteína", "producto génico" y "péptido" se utilizan indistintamente y significan cualquier polímero que comprende cualquiera de los 20 aminoácidos de las proteínas, independientemente de su tamaño. Aunque "proteína" se utiliza frecuentemente en referencia a polipéptidos relativamente grandes, y "péptido" se utiliza frecuentemente en referencia a polipéptidos pequeños, el uso de estos términos en el estado de la técnica se solapa y varía. El término "polipéptido" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a péptidos, polipéptidos y proteínas, a menos que se indique lo contrario. Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido" se utilizan indistintamente cuando se refieren a un producto génico.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "secuenciar" significa determinar la secuencia lineal ordenada de ácidos nucleicos o aminoácidos de una muestra diana de ADN o péptido (o proteína), utilizando técnicas de laboratorio manuales o automatizadas conocidas en el estado de la técnica.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "molécula pequeña" significa una molécula que tiene un peso molecular inferior o igual a 5000 daltons.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "sustancialmente puro" significa que el polinucleótido o polipéptido está sustancialmente libre de las secuencias y moléculas con las que se asocian en su estado natural, y aquellas moléculas utilizadas en el proceso de aislamiento. El término "sustancialmente libre" significa que la muestra está al menos un 50%, preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente un 80% y aún más preferiblemente un 90% libre de los materiales y compuestos con los que se asocia en la naturaleza.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "agente marcador" significa cualquier agente que tiene la capacidad de dirigir un grupo asociado con el agente marcador a la superficie de una célula, a la superficie de un tipo particular de célula, o al núcleo de una célula. Un agente marcador puede comprender, pero sin limitarse a, proteínas, péptidos, moléculas pequeñas, oligonucleótidos, morfolino oligonucleótidos y ácidos nucleicos peptídicos. Un marcador puede tener cualquier tamaño, siempre y cuando mantenga su capacidad de dirigir un grupo asociado con el agente marcador a la superficie de una célula o a la superficie de un tipo particular de célula.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "agente terapéutico" significa cualquier agente que tiene un efecto terapéutico, incluyendo pero sin limitarse a agentes quimioterapéuticos, toxinas, agentes radioterapéuticos, o agentes radiosensibles. También comprendidos por este término están los vectores de terapia génica, las construcciones de ácidos nucleicos antisentido y señuelos de factores de transcripción.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "factor de transcripción" significa un polipéptido que está implicado en la transcripción de ADN. Los factores de transcripción pueden, pero no necesitan unirse a ADN. Un factor de transcripción puede actuar en respuesta a un estímulo externo, o una acción del factor de transcripción puede ser constitutiva.

Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "señuelo del factor de transcripción" y "señuelo" se utilizan indistintamente y significan moléculas que no se unen o interaccionan con factores de transcripción y/o evitan su unión a secuencias potenciadoras nativas. Los señuelos incluyen secuencias de ácidos nucleicos, incluyendo, pero sin limitarse a, oligonucleótidos que corresponden a (es decir, son idénticos a o esencialmente idénticos a) el potenciador nativo. Dichos oligonucleótidos incluyen, pero sin limitarse a: oligonucleótidos palindrómicos de cadena única que comprenden una o más repeticiones de la secuencia de potenciador; oligonucleótidos sentido y antisentido que comprenden una o más repeticiones de la secuencia de potenciador; oligonucleótidos que forman estructuras de horquilla, de manera que se genera un sitio de unión a la doble cadena para el factor de transcripción; y uno o más oligonucleótidos que forman una estructura en cruz, de manera que se generan uno o más sitios de unión para el factor de transcripción; y secuencias de ADN de doble cadena que tienen una afinidad superior por un sitio de unión genómica de un factor de transcripción que la secuencia de ADN natural.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "tipo natural" significa la forma natural de una proteína o secuencias de ácidos nucleicos. El término no se utiliza para indicar una línea base a partir de la cual se establece una mutación. El término "tipo natural" se entiende que describe la forma de una proteína o secuencias de ácidos nucleicos tal como se encuentra de manera más habitual en la naturaleza.

II. Consideraciones Generales

La presente invención se refiere en parte a la regulación y la modulación de la expresión génica. La expresión génica puede regularse mediante la ubicación en la célula de un oligonucleótido de ADN o ARN extraño (o un análogo tal como el ADN/ARN fosforotionato) con el objetivo de (a) la incorporación dentro del genoma; (b) la expresión de un gen (que en ocasiones es considerado como "transfección transitoria"); (c) la alteración de las concentraciones de proteínas reguladoras (donde un vehículo puede actuar como un señuelo de factor de trascripción); (d) la alteración del corte y empalme de ARN; (e) la unión al ARN mensajero en el citoplasma, (f) interferencia de ARN o (g) la alteración de la expresión de un segmento de ADN mediante la inducción de la formación de estructuras intraducibles, tales como una triple hélice. La estrategia para (a), (b) y (g) generalmente implica la liberación al núcleo de un oligómero de ADN de doble cadena relativamente largo. La estrategia para (c) a (g) puede implicar un oligómero de ADN corto que es un operador (es decir, una secuencia de ADN que se sabe que actúa como un sitio de unión) para una proteína reguladora concreta.

La estrategia para (d) y (e) pueden implicar ARN, ADN o análogos tales como ácidos nucleicos peptídicos y oligonucleótidos de morfolino ADN/ARN así como el uso de oligonucleótidos antisentido. No obstante, ha habido una gran dificultad al llevar a cabo las estrategias antisentido. En la actualidad, se piensa que quizá esto está relacionado con un problema de liberación o, alternativamente, que la célula tiene un mecanismo para superar la reducción en la concentración de un mensaje concreto. En cualquier caso, la liberación de oligonucleótidos al núcleo todavía es un requisito para las estrategias (a) a (d).

Para las estrategias (e) y (f), podría ser sólo necesario para liberar un oligonucleótido al citoplasma, pero eso dependerá de cómo va a ser interceptado el oligonucleótido. Consecuentemente, la liberación controlada de oligonucleótidos es clave para entender el mecanismo y realizar el control de la expresión del gen. La presente invención afronta directamente este problema antisentido histórico.

La regulación y/o la perturbación de la expresión génica es un objetivo de la presente invención. Esto es útil tanto para propósitos de investigación como para aplicaciones terapéuticas. La liberación es un obstáculo importante en el uso de oligonucleótidos y oligonucleótidos modificados químicamente para estas aplicaciones. Pueden utilizarse nanopartículas de varias composiciones para conseguir un resultado deseado. Pueden utilizarse materiales tales como titanio, dióxido de titanio, estaño, óxido de estaño, silicio, dióxido de silicio, hierro, óxido de hierro^{III}, plata, níquel, oro, cobre, aluminio y otros materiales, aunque el oro es un material preferente. Las nanopartículas de oro poseen varías ventajas. En primer lugar, las nanopartículas ofrecen la capacidad de regular fácilmente el tamaño de la nanopartícula y, tal como se explica más adelante, la localización subcelular. Adicionalmente, la síntesis de dichas nanopartículas es fácil y hay disponibles muchas técnicas reconocidas en el sector.

Las nanopartículas pueden producirse convenientemente mediante procedimientos conocidos, que incluyen la polimerización en emulsión en una fase acuosa continua, la polimerización en emulsión en fase orgánica continua, la polimerización interfacial, la deposición del disolvente, la evaporación del disolvente, la disolución de una solución de polímero orgánico, la reticulación de polímeros solubles en agua en emulsión, la disolución de macromoléculas, y la reticulación de carbohidratos. Estos procedimientos de fabricación pueden realizarse con un amplio rango de materiales. También pueden servir como nanopartículas efectivas átomos metálicos, y estructuras que comprenden átomos metálicos. Las nanopartículas pueden ser sólidas o pueden comprender una estructura hueca que puede contener un material.

Un vehículo de liberación de la presente invención puede comprender uno o más oligonucleótidos apropiados asociados con una nanopartícula. A continuación, se asocian con la nanopartícula una señal de localización nuclear u otros péptidos de localización que ayudarán con el transporte y dirigirán la nanopartícula al núcleo. El tamaño de la nanopartícula puede utilizarse para evitar el transporte al núcleo cuando éste sea deseable. Finalmente, también pueden localizarse proteínas apropiadas en la superficie de la partícula. Las proteínas apropiadas pueden comprender ligasas, enzimas de restricción u otras enzimas de procesamiento de ADN útiles para una aplicación determinada. A continuación, puede identificarse la localización y el efecto del vehículo de liberación utilizando microscopía electrónica de transmisión, microscopía Raman, microscopía confocal y otras técnicas analíticas para determinar la concentración y la localización de las nanopartículas activas en la célula. Pueden identificarse incluso los vehículos de liberación que comprenden nanopartículas tan pequeñas como 5 nm utilizando una o más técnicas analíticas de las
anteriores.

De este modo, la presente invención proporciona una nueva estrategia para la resolución de los problemas de las nanopartículas como vehículos de liberación de fármacos encontrados en la técnica. Específicamente, la presente invención describe nanopartículas que no encapsulan necesariamente una estructura biológicamente activa, sino más bien sirven como un soporte para la estructura biológicamente activa para unirse a la superficie de la nanopartícula. De manera significativa, las nanopartículas de la presente invención también pueden comprender una señal de localización nuclear, que puede dirigir un agente terapéutico hacia el núcleo de la célula. Hasta la descripción de la presente invención, no se han utilizado las señales de localización nuclear para dirigir una nanopartícula a través de tanto la membrana plasmática como la membrana nuclear.

En otro aspecto de la presente invención, también puede asociarse una serie de secuencias con un vehículo de liberación de nanopartículas. También pueden asociarse varias secuencias, tales como secuencias RME, con un vehículo. Estas secuencias adicionales pueden ayudar en la translocación de un vehículo a través de varias membranas, tales como la membrana nuclear de la célula o la membrana exterior de la célula. De este modo, si se interpretan como "cerraduras" las membranas y otras estructuras que generalmente inhiben la translocación de un vehículo a una localización determinada en o sobre las células, las secuencias NLS y RME se pueden interpretar como "llaves". De este modo, en una realización preferente, un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención puede comprender una serie de secuencias diferentes o "llaves", que pueden permitir que un vehículo de liberación de nanopartículas determinado pase a través de varias barreras potenciales para la translocación y pueden proporciona el direccionamiento de una serie de tipos de células diferentes.

La presente invención describe un vehículo de liberación de nanopartículas que puede utilizarse con una variedad de sujetos incluyendo animales de sangre caliente, particularmente mamíferos, incluyendo humanos, perros, gatos y otros animales pequeños, y animales de granja. Adicionalmente, las nanopartículas de la presente invención pueden utilizarse con microorganismos procariotas y eucariotas y con cultivos in vitro. El vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención puede utilizarse como un agente diagnóstico en todos los sujetos anteriores, así como en la capacidad de un agente terapéutico. No hay limitación en el tipo de estructura biológicamente activa del sujeto al que puede introducirse una nanopartícula de la presente invención. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.783.263 y 6.106.798. Véase también, Colloidal Drug Delivery Systems, (1994) (Kreuter, ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, págs. 219-342; Kreuter, (1994) Eur. J. Drug Metab. Ph. 3: 253-56.

VI. Selección y Preparación de un Vehículo de liberación de Nanopartículas marcable

Un vehículo de liberación de nanopartículas dirigible de la presente invención comprende preferiblemente por lo menos tres componentes: una nanopartícula, uno o más agentes de marcaje (por ejemplo "llaves", tales como señales de localización nuclear y las señales de dirección de la superficie celular) y uno o más agentes activos. El agente activo puede ser de una o más de cualquier entidad química, por ejemplo, una secuencia peptídica, un oligómero de ácidos nucleicos de cadena única, un oligómero de ácidos nucleicos de doble cadena, un ácido nucleico peptídico o una molécula pequeña. Estos tres componentes se preparan y se unen para funcionar como un vehículo de liberación, que puede dirigirse hacia un núcleo de célula mediante la señal de localización nuclear. Los agentes activos y señales de localización nuclear pueden sintetizarse utilizando cebadores o plantillas, previamente asociados con la nanopartícula. La señal de localización nuclear dirige la translocación del vehículo de liberación al núcleo de la célula, con lo cual el agente activo puede interaccionar con una o más proteínas o ácidos nucleicos para facilitar un efecto deseado. Si se selecciona una nanopartícula de mayor tamaño, por ejemplo mayor o igual que aproximadamente 30 nm, el vehículo de liberación se translocará en el citoplasma de célula.

Un vehículo de liberación de nanopartículas dirigible de la presente invención puede comprender adicionalmente un agente marcador extracelular. En esta realización, un vehículo de liberación de nanopartículas puede comprender dos señales marcadoras. En primer lugar, puede seleccionarse un agente marcador que puede dirigir un vehículo de liberación a la superficie de una estructura diana que reconoce al agente marcador seleccionado. En segundo lugar, puede incluirse una secuencia de localización nuclear, que dirigirá un vehículo de liberación al núcleo de una estructura diana.

IV.A. Selección y preparación de una nanopartícula

No existen límites en los parámetros físicos de un componente de nanopartícula de la presente invención, aunque el diseño de un vehículo de liberación debería tener en cuenta la biocompatibilidad del vehículo de nanopartículas, cuando sea apropiado. Los parámetros físicos de un vehículo de nanopartículas se pueden optimizar, con el deseado efecto mandando sobre la elección del tamaño, la forma y el material. Los tamaños de partícula preferidos para el transporte al núcleo de la célula son del orden de 5 nm aunque, tal y como se discute más adelante, podrían desearse partículas mayores para una aplicación determinada. Adicionalmente, se prefieren partículas más pequeñas de aproximadamente 25 nm de diámetro para utilizar en el marcaje nuclear para facilitar la entrada en el núcleo a través de un poro nuclear. (Feldherr & Akin, (1990) Electron Microsc. Rev. 3(1):73-86; Feldherr et. al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 11002-5; Feldherr y Akin, (1999) J. Cell Sci. 112:2043-48; Feldherr y Akin, (1994) Exp. Cell Res. 215:206-10).

La nanopartícula, a la que también puede referirse como un soporte, de un vehículo de liberación de nanopartículas puede comprender una variedad de materiales inorgánicos incluyendo, pero sin limitarse a, metales, materiales semiconductores o cerámicos. Entre los compuestos de base metálica preferidos para la fabricación de nanopartículas se incluyen titanio, dióxido de titanio, estaño, óxido de estaño, silicio, dióxido de silicio, hierro, óxido de hierro^{III}, plata, oro, cobre, níquel, aluminio, acero, aleación de cobalto y cromo, cadmio (preferiblemente seleniuro de cadmio) y aleaciones de titanio. Entre los materiales cerámicos preferidos se incluyen brushita, fosfato tricálcico, alúmina, óxido de silicio, y óxido de zirconio. La nanopartícula puede fabricarse a partir de materiales orgánicos que incluyen carbono (diamante). Entre los polímeros preferidos se incluyen poliestireno, goma de silicona, policarbonato, poliuretanos, polipropilenos, polimetilmetacrilato, cloruro de polivinilo, poliésteres, poliéteres y polietileno. También son adecuados para su uso como soporte de nanopartículas materiales biodegradables, biopolímeros (por ejemplo, polipéptidos tales como BSA, polisacáridos, etc.), otros materiales biológicos (por ejemplo carbohidratos), y/o componentes poliméricos. Se prefiere especialmente el oro debido a sus perfiles de reactividad bien conocidos y a su inertidad biológica.

Las nanopartículas que comprenden los materiales anteriores y que tienen diámetros de menos de 1000 nanómetros se encuentran disponibles comercialmente o pueden producirse a partir de nucleación progresiva en solución (por ejemplo, mediante reacción de coloides), o mediante varios procesos químicos y físicos de deposición de vapor, tal como por ejemplo la deposición pulverizada. Véase, por ejemplo, Hayashi, (1987) Vac. Sci. Technol. Julio/Agosto 1987, A5(4):1375-84; Hayashi, (1987) Physics Today, December 1987, pág. 44-60; MRS Bulletin, Enero 1990, pág. 16-47.

Alternativamente, las nanopartículas pueden producirse utilizando HAuCl_{4} y un agente reductor de citrato, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Marinakos et al., (1999) Adv. Mater. 11: 34-37; Marinakos et al., (1998) Chem. Mater. 10: 1214-19; Enustun & Turkevich, (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 3317. Las nanopartículas de óxido de estaño que tienen un tamaño de partícula de agregado dispersado (en H_{2}O) de aproximadamente 140 nm se encuentran disponibles comercialmente en Vacuum Metallurgical Co., Ltd. of Chiba, Japón. Otras nanopartículas disponibles comercialmente de varias composiciones e intervalos de tamaño se encuentran disponibles, por ejemplo, en Vector Laboratories, Inc. of Burlingame, California. Los materiales de nanopartículas biodegradables, cerámicos y poliméricos serán conocidos para los expertos en la materia y pueden comprender una composición biodegradable.

Además de la deposición pulverizada, la deposición química de vapor asistida por plasma (PACVD) es otra técnica que se puede utilizar para preparar nanopartículas adecuadas. El PACVD funciona a presiones atmosféricas relativamente altas (del orden de un torr y superior) y es útil para la generación de partículas que tienen diámetros de aproximadamente 1000 nanómetros e inferiores. Por ejemplo, se pueden sintetizar partículas de nitruro de aluminio que tienen diámetros inferiores a 1000 nanómetros mediante PACVD utilizando Al(CH_{3})_{3} y NH_{3} como reactivos. El sistema PACVD incluye habitualmente un tubo de cuarzo montado horizontalmente con sistemas asociados de bombeo y de alimentación de gas. Se sitúa un susceptor en el centro del tubo de cuarzo y se calienta utilizando una fuente de radiofrecuencia de 60 kHz. Las partículas de nitruro de aluminio sintetizadas se recogen en las paredes del tubo de cuarzo. El gas nitrógeno se utiliza habitualmente como portador del Al(CH_{3})_{3}. La proporción de Al(CH_{3})_{3}:NH_{3} en la cámara de reacción se controla mediante la variación de las velocidades de flujo del N_{2}/Al(CH_{3})_{3} y el gas NH_{3} dentro de la cámara. En la cámara de reacción se mantiene generalmente una presión constante de 10 torr para proporcionar la deposición y la formación de las nanopartículas ultrafinas de nitruro de aluminio. Puede utilizarse el PACVD para preparar una serie de otras nanopartículas biodegradables adecuadas.

El tamaño de una nanopartícula puede ser una consideración importante. Se observa que las nanopartículas más grandes, del orden de mayores o iguales a aproximadamente 30 nm, entran en las células, pero no se translocan a través de la membrana nuclear al núcleo de una célula, tal y como se observa en la Figura 1B. Presumiblemente, este efecto está directamente relacionado con el tamaño de la nanopartícula, ya que las nanopartículas de 5 nm atraviesan la membrana nuclear y se translocan en el núcleo, tal como se observa en la Figura 1A. De este modo, será importante la selección del tamaño apropiado del vehículo de liberación, pero también ofrece un nivel adicional de direccionabilidad y facilita el diseño y el empleo de nanopartículas que transportan agentes activos que necesitan localizarse en el citoplasma y no en el núcleo.

\vskip1.000000\baselineskip

IV.B. Selección y preparación de un agente activo

Habiendo seleccionado y preparado una nanopartícula a la que se unen por lo menos una señal de localización nuclear y preferiblemente otro agente marcador diferente, se selecciona y prepara un agente activo deseado. Los agentes activos apropiados pueden comprender cualquier molécula pequeña, proteína o secuencia de ácidos nucleicos, y la selección está regida por la aplicación prevista del vehículo de liberación. Más adelante se describen en profundidad varias aplicaciones de vehículos de liberación de nanopartículas de la presente invención, y se incluyen la terapia génica, la modulación de la expresión génica, la alteración del corte y empalme de ARN y la modulación de las interacciones proteína-proteína. Los agentes activos apropiados serán evidentes para un experto en la materia tras la revisión de la presente descripción y se seleccionará con respecto a un objetivo experimental o clínico
deseado.

También es un aspecto de la presente invención proporcionar un vehículo de liberación de nanopartículas que comprende dos o más agentes activos diferentes, por ejemplo 2, 3, 4, 5, u otro número deseado de agentes activos diferentes. De este modo, puede realizarse la liberación de los diferentes agentes activos en la misma localización celular o tisular, o en dos o más localizaciones celulares o tisulares diferentes, dependiendo de las secuencias marcadoras que se empleen.

Puede proporcionarse cualquier combinación de cualquiera de los agentes activos descritos en la presente invención. Por ejemplo, puede proporcionarse un vehículo de liberación de nanopartículas que comprende un agente terapéutico y un agente para formación de imágenes, para utilizar en por ejemplo, la liberación a un tumor. Como otro ejemplo, puede proporcionarse un vehículo de liberación de nanopartículas que comprende un agente quimioterapéutico y un agente radiosensibilizante. Como otro ejemplo más, puede proporcionarse un vehículo de liberación de nanopartículas que comprende diferentes secuencias de polinucleótidos para utilizar en la modulación de la transcripción y/o la traducción del mismo o diferentes genes.

IV.B.1. Selección de un Agente Activo

Generalmente, puede seleccionarse una secuencia de ácidos nucleicos de cadena única apropiada para utilizarse como agente activo en la presente invención en base al contexto en el que la presente invención se emplea. En una realización, los ADN de cadena única apropiados son complementarios a una secuencia de ácido nucleico conocida o sospechosa de estar presente en una condición de enfermedad. En otra realización, el ADN de cadena única apropiado es complementario a un gen sobreexpresado. Los equivalentes funcionales de secuencias conocidas también pueden utilizarse como agentes activos y se considera que son un aspecto de la presente invención. Las secuencias de ácidos nucleicos de cualquier longitud manejable pueden utilizarse como agente activo. Habitualmente, dichos agentes varían entre aproximadamente 20 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, aunque pueden utilizarse secuencias más largas. En aún otra realización, puede utilizarse como agente activo una secuencia de ácidos nucleicos correspondiente a un gen de longitud completa, o a un fragmento del mismo.

El ADN de doble cadena de diversas longitudes y composiciones es adecuado para su uso como agente activo en la presente invención. El ADN de doble cadena puede ser de cualquier longitud, desde unas pocas pares de bases hasta la longitud de un gen de longitud completa. Tal y como se discute más adelante, longitudes largas de ADN, y de manera destacada genes de longitud completa, son útiles en aplicaciones de terapia génica. En esta realización, los genes de longitud completa se pueden incorporar en un genoma de la célula huésped o se pueden expresar transitoriamente dentro de la célula. En esta realización, entonces, una célula carece de un gen concreto y una secuencia de ADN de doble cadena apropiada seleccionada como agente activo es el gen ausente del genoma de la
célula.

Los análogos de ácidos nucleicos también se pueden utilizar como agentes activos en la presente invención. En un aspecto de la presente invención, los análogos de ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) se pueden utilizar como agentes activos. Un análogo de ácido nucleico peptídico es un análogo de ADN en el que el esqueleto del análogo, normalmente un esqueleto de azúcares en ADN, es un pseudopéptido. Un esqueleto de PNA puede comprender una secuencia de unidades N-(2-amino-etil)-glicina repetidas. Los análogos de ácidos nucleicos peptídicos reaccionan como reaccionaría el ADN en un ambiente determinado y pueden unirse adicionalmente a secuencia de ácidos nucleicos complementarias. Los análogos de ácidos nucleicos peptídicos ofrecen la ventaja potencial sobre ADN no modificado de la formación de enlaces más fuertes, debido al esqueleto de péptido cargado de forma neutra de los análogos, y pueden comunicar un mayor grado de especificidad que el que se consigue por el ADN no modificado.

Los PNAs se han utilizado en un amplio grupo de funciones bioquímicas que son aplicables en la presente invención, incluyendo el mapeo de secuencias. Los estudios in vitro indican que el PNA podría inhibir tanto la transcripción como la traducción de genes para los que se ha diseñado con una secuencia complementaria. Esto sugiere que los PNAs podrían ser útiles en la terapia de antígeno y antisentido. Véase, por ejemplo, Norden et al., (2000) FASEB J. 14(9): 1041-60. Hasta la fecha, sin embargo, los investigadores no han sido capaces de dirigir de manera reproducible dicha secuencia al núcleo de la célula desde el exterior de la membrana plasmática.

La presente invención afronta este problema y ofrece potencial para aplicaciones de PNAs imposibles de conseguir hasta ahora. Los PNAs adecuados para usar como agentes activos en la presente invención comprenderán, por tanto, una secuencia complementaria a una secuencia de interés. Otros análogos de ácidos nucleicos útiles en el contexto de la presente invención incluyen análogos de ácidos nucleicos morfolinos. Los análogos morfolinos se pueden sustituir por una secuencia de ácido nucleico y tienen las ventajas tanto de complementariedad como de una reacción química única y perfiles de unión no hallados en secuencias de ácidos nucleicos nativos. Véase, por ejemplo, Chakhmakhcheva et al., (1999), Núcleos. Nucleot. 18: 1427-28.

Adicionalmente, las proteínas son apropiadas para su uso como agente activo en la presente invención. En una realización, las proteínas apropiadas comprenden proteínas que se saben que interaccionan con proteínas asociadas con la replicación y expresión del ADN, por ejemplo, ligasas. En esta realización, una proteína unida a nanopartícula puede ser una proteína que interacciona con secuencias de ADN o ARN, posiblemente como sobrerregulador o subrregulador del proceso de transcripción, el proceso de traducción o ambos. En una realización alternativa, la presente invención se puede utilizar para demostrar o desmentir una interacción putativa proteína-proteína. En este caso, las secuencias unidas a nanopartículas es una proteína sonda y la aplicación de la invención puede proporcionar datos similares a los que se pueden conseguir utilizando el sistema de híbridos de la levadura bien conocido y otros sistemas analíticos, aunque la presente invención permite la oportunidad de examinar dicha interacción in situ. Más específicamente, las proteínas capaces de interaccionar con receptores en proteínas reguladoras nucleares se pueden utilizar como agentes activos.

Finalmente, se pueden utilizar moléculas pequeñas unidas a una nanopartícula como agentes activos en la presente invención. Las moléculas pequeñas apropiadas tendrán la capacidad de interaccionar con enzimas, cofactores, ácidos nucleicos y otras estructuras intracelulares. Las moléculas pequeñas pueden ser aquellas identificadas como ligandos naturales, inhibidores (competitivos, mixtos y no competitivos) o moduladores diseñados. Como agentes activos también se pueden utilizar agentes quimioterapéuticos, agentes radioterapéuticos o agentes radiosensibles; un agente de imagen; un agente de diagnóstico; u otro agente que se sabe que interacciona con una proteína intracelular, un ácido nucleico o un ligando soluble o insoluble.

\newpage

Debería indicarse que el uso de uno de los agentes activos anteriores no excluye la unión de un agente activo diferente a la nanopartícula y varios agentes activos se pueden unir a una nanopartícula individual. Además, los agentes activos pueden ser multivalentes y/o multifuncionales.

IV.B.2. Preparación de un Agente Activo

Las secuencias de ácidos nucleicos útiles como agentes activos en el contexto de la presente invención se pueden preparar de diversas maneras y serán evidentes para un experto en la materia tras la revisión de la presente descripción. Por ejemplo, una secuencia de ADN apropiada se puede escindir de una muestra de ADN más grande utilizando endonucleasas de restricción, que cortan las secuencias de ácidos nucleicos en secuencias conocidas. Las secuencias de ácidos nucleicos escindidas se pueden escindir y purificar utilizando procedimientos conocidos en el estado de la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva Cork para una discusión general de las estrategias de clonación. Alternativamente, y más preferiblemente, las secuencias de ácidos nucleicos se pueden sintetizar utilizando procedimientos manuales y automatizados de síntesis de ácidos nucleicos. Todas las secuencias de ácidos nucleicos que se utilizan como agentes activos, tanto si se escinden, sintetizan o en cualquier caso se preparan, deberían ser sustancialmente puras. La síntesis de agentes activos de ácidos nucleicos o proteínas puede seguir utilizando una plantilla previamente asociada con una nanopar-
tícula.

El aislamiento y purificación de proteína corresponderán con las técnicas establecidas para la preparación de una proteína determinada; aquellas proteínas de interés que no han sido purificadas se pueden aislar utilizando procedimientos conocidos por aquellos expertos en la materia y no se discuten aquí. De manera similar, las estrategias de síntesis y purificación de moléculas pequeñas se pueden hallar en el estado de la técnica y serán evidentes para un experto en química orgánica u otra disciplina química.

\vskip1.000000\baselineskip

IV.C Selección y preparación de una Señal de Localización Nuclear

La inclusión de una señal de localización nuclear (NLS) como componente del vehículo de liberación es un aspecto de la presente invención. Una señal de localización nuclear representativa es una secuencia peptídico que dirige la proteína al núcleo de la célula en la que se expresa la secuencia. Una señal de localización nuclear es predominantemente básica, se puede situar casi en cualquier posición en una secuencia de aminoácidos de la proteína, comprende generalmente una secuencia corta de cuatro aminoácidos (Autieri & Agrawal, (1998) J. biol. Chem. 273: 14731-37) a ocho aminoácidos, y es habitualmente rica en residuos de lisina y arginina (Magin et al., (2000) Virology 274: 11-16). Las señales de localización nuclear comprenden frecuentemente residuos de prolina. Se han identificada una serie de señales de localización nuclear y se han utilizado para realizar el transporte de moléculas biológicas desde el citoplasma al núcleo de una célula. Véase, por ejemplo, Tinland et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 7442-46; Molde et al., (1999) FEBS Lett. 461: 229-34. Actualmente se piensa que la translocación implica proteínas del poro nuclear.

En una realización preferida de la presente invención, una señal de localización nuclear se une a la nanopartícula. La señal de localización nuclear se puede sintetizar o escindir a partir de una secuencia más grande. Tal como se indica, se conoce una serie de señales de localización nuclear y se puede realizar una selección de una secuencia apropiada basada en las propiedades conocidas de estas diversas secuencias. Las NLS representativas incluyen la secuencia monopartito PKKKRKV (SEC ID No: 1) y la secuencia bipartito KRPAAIKKAGQAKKKK
(SEC ID No: 2).

Las señales de localización nuclear aparecen en varios puntos en las secuencias de aminoácidos de las proteínas. Las NLS han sido identificadas en el N-terminal, el C-terminal y en la región central de las proteínas. De este modo, una secuencia seleccionada puede servir como el componente funcional de una secuencia de péptido más larga. Los residuos de una secuencia más larga que no actúan como residuos de NLS del componente deberían seleccionarse para no interferir, por ejemplo, de manera iónica o estérica, con la propia señal de localización nuclear. Por lo tanto, aunque no existen límites estrictos en la composición de una secuencia que comprende NLS, en la práctica, dicha secuencia se puede limitar de manera funcional en la longitud y composición.

En otro aspecto de la presente invención, una serie de secuencias se pueden asociar con un vehículo de liberación de nanopartículas. Diversas secuencias, tales como secuencias RME, también se pueden asociar con un vehículo. Estas secuencias adicionales pueden ayudar en la translocación de un vehículo a través de varias membranas, tales como la membrana nuclear de una célula o la membrana externa de una célula. De este modo, si las membranas y otras estructuras que generalmente inhiben la translocación de un vehículo a una localización determinada en o sobre una célula se interpretan como "cerraduras", las secuencias NLS y RME se pueden interpretar que son "llaves". De este modo, en una realización preferida, un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención puede comprender una serie de secuencias diferentes o "llaves", que puede permitir que un vehículo de liberación de nanopartículas pase a través de varias barreras potenciales para la translocación.

\vskip1.000000\baselineskip

IV.D Selección y Preparación de una Grupo de Reconocimiento del Receptor de la Superficie Celular

En un aspecto de la presente invención, un grupo que transmite la capacidad de ser reconocido y/o unido mediante un receptor de la superficie celular está unido a la nanopartícula. Este grupo comprenderá generalmente una secuencia de proteína que se sabe que es reconocida por un receptor de la superficie celular. Preferiblemente, el grupo de reconocimiento del receptor de la superficie celular puede comprender además una secuencia de ácidos nucleicos, solo o como parte de un híbrido ácido nucleico-proteína, o análogo de péptido. Se conocen un gran número de receptores de la superficie celular y pueden ser útiles en la presente invención, incluyendo el receptor de manosa de macrófago y sus diversos homólogos, y aquellos asociados con retrovirus, tal como VIH.

En la Tabla 1 se presenta una lista representativa, pero no limitante, de grupos que se pueden utilizar como agentes de marcado en la presente invención. También se pueden utilizar homólogos de los grupos presentados. Estos agentes marcadores pueden estar asociados con una nanopartícula y utilizarse para dirigir la nanopartícula a una estructura diana, donde se puede internalizar posteriormente. No existe la necesidad de que se use el grupo completo como agente marcador. También se pueden utilizar fragmentos más pequeños de estos grupos que se sabe que interaccionan con un receptor específico u otra estructura como agente marcador. Los agentes marcadores de la Tabla 1 pueden actuar para internalizar (por ejemplo, mediante endocitosis mediada por recetor) un agente de liberación que interacciona con un agente marcador.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

El grupo de reconocimiento puede comprender además una secuencia que se somete a una división enzimática o electroquímica. El grupo de reconocimiento puede comprender de este modo una secuencia que es susceptible de dividirse mediante enzimas presentes en varias puntos en el interior de la célula, tales como proteasas o endonucleasas de restricción (por ejemplo, ADNasa o ARNasa).

Debe destacarse que una secuencia de reconocimiento de la superficie celular no es un requisito absoluto para la presente invención. De hecho, tal como se muestra en la figura 1A, los hepatocitos desarrollados en un medio que contiene nanopartículas que carecen de una secuencia de reconocimiento de la superficie celular se translocaron a través de la membrana celular en ausencia de dicha secuencia. De este modo, aunque una secuencia del receptor de la superficie celular puede ser útil para marcar un tipo de célula determinado, o para inducir la asociación de una nanopartícula con una superficie celular, no existe la necesidad de que la secuencia de reconocimiento de la superficie celular esté presente en la superficie de una nanopartícula para realizar la presente invención.

La presencia de un único receptor de la superficie celular para un tipo determinado de célula puede ayudar en la selección y liberación de un agente activo a ese tipo de célula. Por ejemplo, los macrófagos expresan un receptor de la superficie celular (el receptor manosa de macrófagos) que media en la pinocitosis de partículas que comprenden manosa a través de los dominios de reconocimiento de carbohidratos. Véase Mullin et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 5668-81. De este modo, la selección de un receptor de la superficie celular apropiado puede facilitar la selección específica de células por un vehículo de liberación de nanopartículas y, consecuentemente, la interacción específica de células.

\vskip1.000000\baselineskip

IV.E Selección y Preparación de una Secuencia De unión

En otro aspecto de la presente invención, se puede disponer una secuencia de unión corta entre la nanopartícula y una secuencia de reconocimiento de la superficie celular de un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención. El de unión puede ser una secuencia de proteínas, una secuencia de ácidos nucleicos o cualquier otra composición que sea compatible con un medio intracelular. En la presente invención, se prefieren secuencias de proteína y ácido nucleico debido a la capacidad de dividirse enzimáticamente. Por ejemplo, se puede utilizar un ácido nucleico de unión que comprende un sitio de corte conocido para una endonucleasa de restricción hallada en la célula diana. Alternativamente, se puede utilizar una proteína de unión que comprende un sitio de corte para una proteasa hallada habitualmente en el tipo de célula diana. Finalmente, se puede diseñar un de unión que se pueda dividir química o electroquímicamente.

La división de un de unión es un método por el cual la nanopartícula, que comprenderá un agente activo y una señal de localización nuclear, se puede liberar para translocarse a través de la membrana nuclear y en el núcleo de una célula. En un ejemplo, tras la asociación de un receptor de la superficie celular con una secuencia de reconocimiento de la superficie celular dispuesta en la superficie de una nanopartícula de un vehículo de liberación de la presente invención, el vehículo de liberación de nanopartículas está, de hecho, unido a la superficie celular. Después de la translocación del vehículo de liberación al interior de una célula, por endocitosis u otro mecanismo, el vehículo de liberación de nanopartículas permanece unido al receptor. Con el fin de liberar el vehículo de liberación de nanopartículas y su agente activo asociado, el de unión se puede dividir mediante proteasas endógenas, nucleasas u otras técnicas químicas o electroquímicas. La división de la secuencia de unión libera el vehículo de liberación de nanopartículas y permite el posterior direccionamiento del vehículo de liberación al núcleo, a través de la señal de localización nuclear dispuesta en la superficie de las nanopartículas.

IV.F Ensamblaje de un vehículo de liberación de nanopartículas

Una vez seleccionados y preparados los diversos componentes individuales de un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención, el propio agente entonces se ensambla. El orden del ensamblaje no es crítico y puede estar gobernado principalmente por los requisitos de una reacción química deseada. También deberían sopesarse las propiedades químicas de un agente activo, una NLS, una nanopartícula, así como consideraciones fisiológicas y otras diversas consideraciones. De este modo, el procedimiento se ensamblaje descrito a continuación en la presente invención tiene un orden arbitrario. Además, los materiales descritos, es decir, la composición de las nanopartículas, etc., se presentan sólo como ejemplos y no pretenden limitarse de ningún modo. Los materiales y secuencias adecuadas serán conocidos por los expertos en la materia cuando se evalúan a la luz de la presente descripción y el conocimiento y recursos disponibles para los investigadores en los sectores aplicables.

IV.F.1. Asociación de un Agente Activo con una Nanopartícula

Tras la selección y preparación de una nanopartícula y un agente activo adecuado, los dos componentes se unen para formar un complejo. En una realización, la nanopartícula está formada de oro. El oro es particularmente útil en la presente invención debido a su perfil de reactividad bien conocido y es relativamente inerte en el contexto de los sistemas biológicos. Se puede utilizar oro coloidal, aunque la carga global negativa de preparaciones habituales de oro proporciona la cualidad de que el oro coloidal tiene una afinidad no específica elevada para ciertas proteínas. La carga negativa de una preparación puede ser proporcionada por la asociación de moléculas de oro con ligandos cargados negativamente, tales como citrato o bis-sulfonatotrifenilfosfina. Estos ligandos cargados negativamente y, de este modo, la carga global negativa asociada con una preparación de oro coloidal se reducen o eliminan preferiblemente mediante el intercambio de cualquier ligando cargado negativamente con ligandos neutros, tales como polietilenglicol, o ligandos cargados positivamente, tales como aminas.

Alternativamente, el uso de oro coloidal puede estar acompañado de tratamientos adicionales, de manera que puede estar recubierto en algún punto en el proceso de preparación con otra proteína, tal como BSA, con el fin de bloquear la unión a proteína no específica no deseada. También se pueden utilizar recubrimientos de moléculas pequeñas y péptidos para evitar las interacciones específicas con proteínas celulares. Por ejemplo, se ha preparado oro coloidal con un recubrimiento de glutatión. Dado que el glutatión, un antioxidante natural, es uno de los péptidos más abundantes en la célula, este recubrimiento puede proporcionar a la nanopartícula un efecto de tipo camuflaje. Alternativamente, algunos clústers y partículas de oro están disponibles comercialmente y se pueden utilizar en la presente invención. Por ejemplo, las partículas de oro NANOGOLD® están disponibles de Nanoprobes, Inc., Yaphank, Nueva York. También preferible en la presente invención son partículas biodegradables, que pueden estar formadas de un polímero apropiado u otro material. Se preparan algunas nanopartículas disponibles comercialmente para el marcaje previo al transporte y son adecuadas para unir entidades a las nanopartículas.

En una realización, utilizando una nanopartícula de oro como nanopartícula y un ácido nucleico de cadena única o doble cadena como agente activo, se puede realizar una reacción de tiolación para añadir un grupo tiol al extremo 5' del oligómero de ácidos nucleicos. Alternativamente, se puede realizar una reacción de aminación y procederá mutatis mutandis a la reacción de tiolación descrita en la presente invención. El objetivo general de la reacción es introducir un centro nucleofílico que posteriormente se puede funcionalizar con un grupo deseado. Un reactivo fosforamidita modificador de tiol representativo se presenta como Compuesto 1, que está disponible de Glen Research, Inc. de Sterling, Virginia.

6

\vskip1.000000\baselineskip

Los oligómeros de ácidos nucleicos se incuban con una fosforamidita modificadora de tiol en condiciones que permiten la unión de la fosfina al extremo 5' del ADN sonda. La reacción se puede llevar a cabo en un sintetizador de ADN utilizando condiciones estándar. El compuesto 1 se puede añadir como una etapa en la síntesis automatizada de ADN utilizando un aparato automatizado, tal como el sintetizador de ADN de alto rendimiento ABI^{TM} 3900 (Applied Biosystems, Foster City, California). El modificador de tiol se añade en la última etapa de la síntesis de un oligonucleótido. La fosfina se oxida utilizando yodo y la purificación es exactamente la misma que la utilizada para oligonucleótidos no marcados. El proceso de purificación es más sencillo para oligonucleótidos marcados, ya que los oligonucleótidos marcados son significativamente más hidrofóbicos y, por tanto, tienden a eluir mucho más lentamente en condiciones de HPLC habituales. La fosforamidita reacciona espontáneamente con el hidroxilo 5' de ADN, el cual puede estar dispuesto en acetonitrilo. En esta reacción, el grupo tiol está protegido por un grupo protector tritilo o tioéster acético y está separado del 5'-fosfodiéster por un enlazador de carbonos de longitud variable. Un enlazador de seis carbonos está presente en el Compuesto 1.

El complejo con ácidos nucleicos se somete a continuación a la desprotección del grupo tiol para eliminar el grupo tritilo. Específicamente, el grupo tritilo se elimina mediante el tratamiento con nitrato de plata y ditiotreitol (DTT). El complejo con ácidos nucleicos se incuba con un componente metálico de las nanopartículas. Las dos entidades se unen en el tilo expuesto por la eliminación del grupo tritilo durante la reacción de desprotección. Los complejos agente activo-nanopartícula formados (en esta realización, complejos ácido nucleico-nanopartícula) se pueden mantener en el recipiente de reacción hasta su uso.

IV.F.2. Asociación de una Señal de Localización Nuclear con una Nanopartícula

Se une una señal de localización nuclear adecuada al complejo agente activo-nanopartícula. Las señales de localización nuclear se pueden sintetizar utilizando técnicas de química de péptidos estándar, o se pueden aislar mediante división proteolítica a partir de una proteína más grande. Las señales de localización nuclear sintetizadas o aisladas pueden ser de cualquier tamaño, con el único requisito de que la secuencia comprenda por lo menos una NLS conocida, que habitualmente tenga de cuatro a ocho aminoácidos de longitud. En la técnica se conocen los procedimientos de purificación adecuados de proteínas y péptidos para la preparación de señales de localización nuclear, que se aíslan a partir de proteínas más grandes. Véase, en general, Protein Purification Applications: A Practical Approach, (1989) (Harris & Angal, eds.) IRL Press; Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, Applications, (1989) (Janson & Ryden, eds.) VCH Publishers.

La presente invención también comprende la preparación y la asociación de un conjugado proteína-péptido con una nanopartícula. Dicho conjugado puede comprender, por ejemplo, una proteína comparativamente grande y una NLS comparativamente pequeña. Aunque ambas entidades comprenden aminoácidos, la distinción entre proteína y péptido se realiza en base a, entre otros criterios, la funcionalidad de cada entidad. En un ejemplo concreto, un conjugado proteína-péptido puede comprender BSA y una NLS. Los conjugados de proteína-péptido pueden unirse posteriormente a nanopartículas de oro.

La química de unión de proteínas y péptidos a nanopartículas de oro es similar a la química requerida para enlazar ácidos nucleicos a nanopartículas de oro. En un aspecto, se realiza una reacción de tiol. La reacción puede implicar un grupo tiol dispuesto en la señal de localización nuclear, que puede tomar la forma de un residuo terminal de cisteína o metionina, o en la nanopartícula. El grupo tiol puede reaccionar convenientemente con una amina primaria en la entidad alterna. La amina primaria puede convenientemente tomar la forma de un residuo terminal de lisina o arginina en la señal de localización nuclear, pero también puede disponerse en la superficie de la nanopartícula. Véase, por ejemplo, Hainfeld y Furuva, (1992) J. Histochem. Cytochem. 40: 177-84; Hainfeld, (1992) Ultramicroscopy 46: 135-44.

IV.F.3. Asociación de una Secuencia de Reconocimiento de la Superficie Celular con una Nanopartícula

Se puede seleccionar una secuencia de reconocimiento de la superficie celular (por ejemplo, una seleccionada entre o basada en aquellas presentadas en la Tabla 1) y se prepara tal y como se ha descrito anteriormente en la Sección IV.D anterior. La secuencia puede ser, esencialmente, una proteína o un péptido que se sabe que se unen a un receptor expresado en la superficie de un tipo de célula determinado. De este modo, se pueden realizar las mismas reacciones químicas para asociar una secuencia de reconocimiento de la superficie celular con una nanopartícula tal y como se realiza para asociar una señal de localización nuclear o un agente activo de proteína con una nanopartícula. Continuando con el ejemplo de la Sección IV.F.2 anterior, se puede realizar una reacción de tiol-amina para asociar un tiol dispuesto en la nanopartícula o la secuencia de reconocimiento de la superficie celular con una amina primaria dispuesta en el miembro alterno de una pareja de reacción de tiol-amina. Dependiendo de los perfiles de reactividad y el orden en el que las diversas partes componentes de un vehículo de liberación de nanopartículas se unan a la nanopartícula, se puede desarrollar un esquema de bloqueo de sitios. Dicho esquema puede evitar la unión de una entidad a sitios no deseados en la nanopartícula o en las propias partes componentes.

IV.F.4. Asociación de una Secuencia de unión con una Nanopartícula

También se puede unir una secuencia de unión a una nanopartícula. Dicha secuencia se puede disponer entre la nanopartícula y una secuencia de reconocimiento de la superficie celular u otra entidad asociada con la nanopartícula. Con el fin de cumplir su propósito, la secuencia de unión comprende preferiblemente un sitio en el que puede tener lugar la división química, electroquímica o enzimática. Cuando una secuencia de unión comprende una secuencia de ácidos nucleicos de cadena única o doble, la secuencia puede comprender un sitio de corte para una nucleasa que se sabe que está presente en las células en las que se introduce el vehículo de liberación. Cuando la unión es una proteína, puede comprender un sitio proteolítico. Finalmente, cuando se desea que la unión se divida fotolíticamente, puede comprender un material susceptible de fotodivisión. Las secuencias de unión fotodivisibles disponibles comercialmente incluyen varias fosforamiditas de separación, disponibles en Glen Research of Sterling, Virginia.

IV.F.5. Biocompatibilidad y Protección del Vehículo de Liberación

Si la nanopartícula comprende un componente metálico tal como oro, es deseable asegurar la biocompatibilidad entre la nanopartícula y un sujeto al que se le administra el vehículo de liberación. El oro es relativamente inerte y menos intrusivo fisiológicamente que otros metales, pero se pueden minimizar los efectos perjudiciales de cualquier material de nanopartícula metálico o polimérico mediante el revestimiento o en cualquier caso, el recubrimiento total o parcial de la nanopartícula con una sustancia biocompatible. Entre los componentes que pueden utilizarse para conseguir la biocompatibilidad se incluyen polímeros (tales como polietilenglicol-PEG), proteínas (tales como BSA), lípidos (que incluyen los envoltorios de membrana) y carbohidratos. Se pueden realizar la adición de estos compuestos de biocompatibilidad después de la adición de los otros componentes del vehículo de liberación y pueden actuar como la etapa sintética final antes de la introducción del vehículo de liberación al sujeto o sistema.

Estos materiales también pueden utilizarse como agentes enmascarados o protectores para el vehículo de liberación y el agente o agentes activos y el agente o agentes marcadores unidos al mismo para prevenir el reconocimiento por parte del sistema inmune u otros sistemas biológicos (por ejemplo, proteasas, nucleasas (por ejemplo ADNasa o ARNasa), u otras enzimas o entidades biológicas asociadas con una degradación no deseada). De este modo, el revestimiento o cubierta protectora proporciona características de tapa o escondimiento para facilitar que el vehículo de liberación alcance una célula o tejido deseado con el agente o agentes activos y el agente o agentes marcadores intactos.

IV.F.6. Asociación de múltiples Secuencias con un Vehículo de Liberación

Se pueden asociar secuencias múltiples con un vehículo de liberación de la presente invención. Mediante la asociación de secuencias múltiples con un único vehículo, el vehículo se puede adaptar para que pase a través de varias barreras celulares, tales como la membrana celular o la membrana nuclear. Por ejemplo, un vehículo de nanopartículas puede comprender una secuencia NLS y RME. La secuencia RME puede ayudar en la translocación de un vehículo a través de la membrana de la célula. Una vez dentro de la célula, la NLS puede dirigir el vehículo al núcleo de la célula.

Preferiblemente, cualquiera de las secuencias asociadas con un vehículo de liberación de nanopartículas se asocian independientemente con el vehículo, en lugar de formar componentes de una única secuencia larga. Tal y como se indica por los resultados descritos en el Ejemplo de Laboratorio 1, la asociación independiente de secuencias múltiples (preferiblemente múltiples secuencias diferentes) es un procedimiento más eficaz de dirigir un vehículo de liberación de nanopartículas a una estructura celular deseada. No obstante, la asociación secuencial de secuencias múltiples también puede ser un procedimiento eficaz de dirigir un vehículo de liberación de nanopartículas a un sitio determinado, y esta estrategia forma otro aspecto de la presente invención.

V. Introducción de un vehículo de liberación de nanopartículas a un sujeto o muestra

Después de preparar un vehículo de liberación de nanopartículas suficientemente puro (que comprende preferiblemente una nanopartícula, una agente activo y una NLS), se puede desear la preparación del vehículo en una composición farmacéutica que se puede administrar a un sujeto o muestra. Las técnicas de administración preferidas incluyen la administración parental, la administración intravenosa e infusión directamente en cualquier tejido diana deseado, incluyendo, pero sin limitarse a un tumor sólido u otro tejido neoplásico. Esto se puede conseguir mediante la utilización de una etapa de purificación final, que dispone el vehículo en un medio que comprende una composición farmacéutica adecuada.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas según la presente invención comprenden generalmente una cantidad del vehículo de liberación-agente activo deseado según la información de dosificación (que se determina en cada caso), mezclada con un diluyente o excipiente farmacéutica aceptable, tal como una solución acuosa estéril, para producir una concentración final apropiada según la información de dosificación indicada anteriormente con respecto al agente activo. Dichas formulaciones incluirán habitualmente tampones, tales como solución salina tamponada de fosfato (PBS) o aditivos adicionales, tales como excipientes farmacéuticos, agentes estabilizantes tales como BSA osa o sales, tales como cloruro sódico.

Para la administración parenteral, es generalmente deseable que además dichas composiciones sean farmacéuticamente aceptables asegurando su esterilidad, la no inmunogenicidad y no pirogenicidad. Dichas técnicas son generalmente bien conocidas en el estado de la técnica tal como se ejemplifica en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) (Osol, ed.) 16ª Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, incorporada en la presente invención por referencia. Además, para la administración humana, las preparaciones deberían cumplir los requisitos de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y normas de pureza tal como se requiere por la FDA Office of Biological
Standards.

Cuando los vehículos de liberación se introducen en células suspendidas en un cultivo celular, es suficiente incubar las células junto con los vehículos de liberación de nanopartículas en un medio de crecimiento adecuado, por ejemplo, caldo de Luria (LB) o un medio de cultivo celular adecuado. Aunque son posibles otros métodos de introducción, estos tratamientos de introducción son preferibles y se pueden realizar sin considerar entidades presentes en la superficie de un vehículo de liberación.

Cuando se realizan experimentos in vitro, los vehículos de liberación se pueden añadir directamente a un medio de crecimiento de células seleccionado antes de introducir las células en el medio. Dicho medio, obviamente, debe ser compatible no sólo con las necesidades fisiológicas de las células, sino también con el perfil químico y de reactividad del vehículo de liberación. El perfil de vehículo de liberación será evidente para un experto en la materia tras la revisión de la presente descripción y en vista de los grupos unidos a la nanopartícula.

V.A. Endocitosis mediada por receptor de un vehículo de liberación

El reconocimiento y la unión de una secuencia de reconocimiento de la superficie celular dispuesta en un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención es un aspecto de la presente invención. La presente invención saca ventaja del conocimiento de que la unión a la superficie celular es la etapa de iniciación en una cascada celular que conduce a una serie de hechos, principalmente la endocitosis mediada por receptor.

Los procedimientos anteriores describen procedimiento mediante los cuales se puede introducir un vehículo de liberación en una muestra o sujeto. Estos agentes se translocan a través de la membrana celular de varias maneras. Sin embargo, cuando una secuencia de reconocimiento celular está unida a una nanopartícula, puede aparecer un tipo diferente de internalización, concretamente la endocitosis mediada por receptor.

El término "endocitosis mediada por receptor" ("RME") describe en general un mecanismo mediante el cual, catalizado por la unión de un ligando a un receptor dispuesto en la superficie de una célula, un ligando unido al receptor se internaliza en una célula. Muchas proteínas y otras estructuras entran en las células a través de endocitosis mediada por receptor, incluyendo insulina, factor de crecimiento epidérmico, hormona de crecimiento, hormona estimuladora de la tiroides, factor de crecimiento nervioso, calcitonina, glucagón y muchas otras, incluyendo las presentadas en la Tabla 1. En el contexto de la presente invención, la endocitosis mediada por receptor permite un mecanismo conveniente para el transporte de una nanopartícula al interior de una célula.

En la RME, la unión de un ligando por un receptor dispuesto en la superficie de una célula puede iniciar una señal intracelular, que puede incluir una respuesta para la endocitosis. De este modo, un agente que está unido en la superficie de una célula se invagina y se internaliza en la célula. Posteriormente, cualquier secuencia de unión presente en la nanopartícula puede dividirse mediante las enzimas endógenas de la célula, liberando de este modo el agente a liberar su agente activo a la estructura apropiada.

Debe destacarse que la RME no es el procedimiento exclusivo mediante el cual un vehículo de liberación puede translocarse en una célula. Otros procedimientos de captación que pueden aprovecharse mediante la unión de la entidad apropiada a una nanopartícula incluyen el uso ventajoso de poros de membrana. Los mecanismos fagocíticos y pinocíticos también ofrecen mecanismos ventajosos mediante los cuales se puede internalizar un vehículo de liberación de nanopartículas.

\newpage

VI. Detección de un vehículo de liberación de nanopartículas

Los vehículos de liberación de nanopartículas de la presente invención se pueden detectar de varias maneras tanto en el interior como en el exterior de las células. De hecho, la capacidad para seleccionar una de las diversas técnicas para la detección es un aspecto de la presente invención. Un procedimiento para la detección de la presencia de un vehículo de liberación de nanopartículas es mediante la monitorización en una muestra del cambio homeostático que el vehículo de liberación de nanopartículas está diseñado para producir. Para algunas aplicaciones, sin embargo, podría ser deseable monitorizar la presencia de un vehículo de liberación de nanopartículas mediante una estrategia diferente. Algunos, pero no todos, de los procedimientos de detección de la presencia de agentes de liberación de nanopartículas pueden incluir el uso de técnicas de microscopía electrónica de transmisión, de fluorescencia y otras técnicas de microscopía; detección con base espectroscópica; y procedimientos de detección que implican proteínas, tales como procedimientos inmunológicos. Son posibles otros procedimientos y dependerá de las circunstancias específicas del protocolo de experimento o tratamiento.

VI. A. Detección mediante microscopía electrónica de transmisión de una vehículo de liberación de nanopartículas

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se puede utilizar para determinar la presencia de un vehículo de liberación de nanopartículas. Los vehículos de liberación de nanopartículas que comprenden nanopartículas de 5 nm y más grandes se pueden visualizar claramente mediante TEM, tal como se pone de manifiesto en las imágenes de TEM presentadas en las figuras 1A y 1B. La figura 1A representa vehículos de liberación de nanopartículas que comprenden nanopartículas de 5 nm. La figura 1B representa vehículos de liberación de nanopartículas que comprenden nanopartículas de 30 nm. En ambas figuras, los vehículos de liberación de nanopartículas comprenden una señal de localización nuclear. Las figuras 1A y 1B indican que la TEM es un procedimiento útil de detección de la presencia y la localización subcelular de vehículos de liberación de nanopartículas. Los vehículos de liberación de nanopartículas que comprenden nanopartículas tan pequeñas como de 5 nm de tamaño son visibles, tal como se representa en la figura 1A.

Las figuras 1A y 1B demuestran que la TEM se puede utilizar para detectar la presencia de un vehículo de liberación de nanopartículas en el núcleo de una célula. Los vehículos de liberación de nanopartículas que comprenden nanopartículas de 5 nm se localizan en el núcleo celular, tal como se muestra en la figura 1A. Los vehículos de liberación de nanopartículas que comprenden nanopartículas de 30 nm permanecen en el citoplasma de la célula, tal como se muestra en la figura 1B. De este modo, la TEM facilita la detección de vehículos de liberación de nanopartículas y la localización subcelular de los vehículos de liberación.

La TEM también se puede utilizar para estimar la densidad de los vehículos de liberación de nanopartículas en una región. Se puede realizar un cálculo de la densidad contando el número de partículas observadas en un área determinada rastreada por TEM. El conocimiento de la densidad de los vehículos de liberación de nanopartículas en una región definida, tal como el núcleo o citoplasma celular, puede proporcionar información con respecto a las necesidades de tamaño para una nanopartícula, la eficacia de una señal de localización nuclear determinada y otros parámetros.

VI.B. Detección espectroscópica de un vehículo de liberación de nanopartículas

Los vehículos de liberación de nanopartículas de la presente invención también se pueden detectar espectroscópicamente. En la presente invención se pueden utilizar procedimientos espectroscópicos de UV, visible e IR. La elección del procedimiento de detección dependerá habitualmente del diseño experimental. En una realización, los vehículos de liberación de nanopartículas de la presente invención se pueden detectar indirectamente utilizando espectroscopia de fluorescencia.

La expresión de GFP y otras proteínas marcadoras fluorescentes proporcionada por un agente activo de un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención se puede detectar por fluorescencia y puede actuar como indicadora de la presencia de un vehículo de liberación de nanopartículas. Alternativamente, se puede asociar un grupo fluorescente con el componente nanopartícula de un vehículo de liberación de nanopartículas y, de esta manera, se puede identificar la presencia del propio vehículo de liberación de nanopartículas.

VI.C. Detección basada en microscopía de un vehículo de liberación de nanopartículas

Tal como se indica en la sección VI.A anterior, la TEM es una forma de microscopía útil para la detección de vehículos de liberación. Sin embargo, también se pueden utilizar otras formas de microscopía. Se pueden utilizar técnicas de microscopía tales como microscopía de campo brillante, microscopía de contraste de fase, microscopía confocal y otras técnicas para detectar la presencia de vehículos de liberación.

La microscopía de fase contraste se utiliza habitualmente para la visualización de orgánulos celulares y se puede utilizar para detectar la presencia de vehículos de liberación. La microscopía confocal también puede ser útil para detectar vehículos de liberación. La resolución de cualquiera de las técnicas de microscopía anteriores se puede mejorar mediante la introducción de varios agentes de mejora del contraste u otros agentes conocidos para refinar imágenes y aumentar la resolución.

VI.D. Detección basada en proteínas de un vehículo de liberación de nanopartículas

También es posible la detección basada en proteínas de un vehículo de liberación de nanopartículas. Por ejemplo, una segunda proteína que se conoce que se asocia con una primera proteína unida a una nanopartícula se puede marcar y utilizar como sonda. Los marcadores adecuados incluyen grupos fluorescentes y otros marcadores. Tras la asociación de la primera y segunda proteínas y, por tanto, la asociación de la segunda proteína marcada y el vehículo de liberación de nanopartículas, la presencia del vehículo de liberación de nanopartículas es detectable mediante la detección de la presencia de la sonda. Cualquier pareja de proteínas adecuadas se puede utilizar para detectar un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención; preferiblemente, una primera proteína se asocia con una nanopartícula y una segunda proteína se marca con un marcador detectable, y se sabe que las dos proteínas se asocian.

VII. Aplicaciones de los vehículos de liberación de nanopartículas de la presente invención

Los vehículos de liberación de nanopartículas de la presente invención se pueden utilizar para liberar una serie de agentes activos a una serie de localizaciones celulares y subcelulares diferentes. Tal como se describe en detalle a continuación, la presente invención es útil para el análisis de la expresión génica; la incorporación de una secuencia de ácidos nucleicos o una secuencia que comprende análogos de ácidos nucleicos en un genoma de la célula; la alteración de la concentración de una proteína reguladora en una célula; la alteración de un patrón de corte y empalme de ARN; y la interacción de con ARNm en el citoplasma de la célula.

Como regla general, cuando se seleccionan y manipulan secuencias de ácidos nucleicos, se debería tener precaución, cuando sea posible, para minimizar el potencial para la formación de estructuras autohibridadas. Cuando se realiza la presente invención deberían evitarse las secuencias de cualquier composición química que se prevé que de lugar a estructuras autohibridadas.

Adicionalmente, se puede varia la astringencia de las condiciones de hibridación, con la regla general de que la temperatura debería permanecer en aproximadamente 10ºC de la T_{f} prevista de la doble cadena, que es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda con la que se empareja perfectamente. Un ejemplo de condiciones de hibridación astringentes para el análisis de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de aproximadamente 100 residuos complementarios es la incubación durante toda la noche en formamida al 50% con 1 mg de heparina a 42ºC. Un lavado de alta astringencia puede estar precedido por un lavado de baja astringencia para eliminar la señal de la sonda de fondo. Un ejemplo de condiciones de lavado de astringencia media para una doble cadena de más de aproximadamente 100 nucleótidos es la incubación durante 15 minutos en 1 X SSC a 45ºC. Un ejemplo de lavado de baja astringencia para una doble cadena de más de aproximadamente 100 nucleótidos es la incubación durante 15 minutos en 4-6 X SSC a 40ºC. Para sondas cortas (por ejemplo, aproximadamente 10 a 50 nucleótidos), las condiciones astringentes implican habitualmente la incubación en concentraciones de sal inferiores a una concentración de aproximadamente 1,0 M de ion sodio (u otro ion), habitualmente aproximadamente de 0,01 a 1,0 M de ion sodio (u otro ion), a pH 7,0-8,3, a una temperatura de por lo menos aproximadamente 30ºC. Las condiciones astringentes también se pueden conseguir con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida. En general, una señal para la proporción de ruido de 2 veces (o superior) a la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica.

VII.A. Modulación y análisis de la expresión génica

Los vehículos de liberación de nanopartículas de la presente invención se puede utilizar para modular y analizar la expresión génica en un sistema modelo. Es fundamental que la expresión de un gen de interés se correlacione con la producción de ARNm transcrito de la secuencia de ADN del gen. El ARNm transcrito se somete a las reglas estándar de emparejamiento de bases de Watson-Crick. De este modo, en una realización se puede utilizar un vehículo de liberación de nanopartículas para modular directamente la expresión de un gen mediante la selección de un agente activo que eliminará cualquier estructura inhibidora de la expresión o introducirá estructuras potenciadoras de la expresión. En otra realización, se utiliza un vehículo de liberación de la presente invención para mimetizar una parte del componente de un sistema natural de segundo mensajero de la célula y, de este modo, modular la transcripción y traducción de un gen determinado.

En una realización, un factor de transcripción u otra proteína que tiene la capacidad de modular la expresión de la proteína, que ha sido introducida al citoplasma o núcleo de una célula por un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención, modula la expresión génica. La modulación comprende tanto la sobrerregulación como la subregulación de un gen. En esta realización, un vehículo de liberación de nanopartículas comprende un modulador de la transcripción o la traducción competente (por ejemplo, un factor de transcripción) o bien, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un modulador de la transcripción o la traducción en el papel de agente activo. Los moduladores competentes pueden ser activos en la forma en la que están unidos a una nanopartícula, o pueden estar en una forma que es activada por un tratamiento proteolítico u otro tratamiento enzimático o químico en el citoplasma o núcleo de una célula diana. De manera similar, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un modulador de transcripción o traducción pueden ser traducidas por la maquinaria de traducción de la célula diana, la cual se puede utilizar en un procedimiento análogo a un bucle de inhibición por retroalimentación: la maquinaria de expresión de la célula diana se puede utilizar para expresar el ácido nucleico introducido por un vehículo de liberación, que entonces producirá una proteína que puede inhibir posteriormente la expresión de la proteína.

En otra realización, la expresión génica es modulada en una célula que tiene proteínas cuya expresión depende de un patrón de corte y empalme determinado. En esta realización, un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención que comprende un oligonucleótido morfolino, PNA u otro oligonucleótido modificado de secuencia apropiada que altera el corte y empalme, se introduce en células diana que comprenden un gen cuya expresión depende del corte y empalme. Cuando se utiliza un gen que codifica la proteína verde fluorescente ("GFP") para demostrar de manera detectable esta realización de la presente invención, en ausencia de dicho oligonucleótido morfolino no existe expresión de GFP. En células en las que el oligonucleótido morfolino liberado por un vehículo de liberación de la presente invención está presente, aparecen corte y empalmes alternativos y el gen de GFP se expresa y se puede detectar espectrofotométricamente. Este ejemplo se puede extender a cualquier gen que se puede cortar y empalmar para generar una proteína funcional, con un nucleótido apropiado que sirve como agente activo unido a un vehículo de liberación.

VII.B. Modulación de la traducción de una proteína

Se puede utilizar un vehículo de liberación de la presente invención para liberar una secuencia de ácidos nucleicos para la incorporación en el genoma de una célula diana. A este concepto se hace referencia algunas veces como "antisentido" o "terapia génica". Los avances en biología molecular y el Proyecto del Genoma Humano han abierto posibilidades previamente imprevisibles para la intervención dirigida con la expresión génica. Éstas incluyen estrategias permanentes, tales como la sobreexpresión transgénica o la interrupción recombinante de genes específicos, así como estrategias novedosas para la supresión transitoria de la función del gen. Los oligodesoxinucleótidos (ODN) antisentido (AS) sintéticos cortos diseñados para hibridarse con secuencias específicas en un ARNm marcado pertenecen a la última clase. La integración de un gen ausente en el genoma del huésped también ha sido de interés significativo.

La intervención AS en la expresión de genes específicos se puede conseguir mediante el uso de oligodesoxinucleótidos antisentido sintético (AS-ODNs). Véase, en general, Agrawal, (1996) Trends Biotechnol. 14 (10): 376-87; Lev-Lehman et al., (1997) en Antisense Therapeutics, (Cohen & Smisek, eds.), Plenum Press, Nueva York; y Lefebvre-D'Hellencourt et al., (1995) Eur. Cytokine Netw., 6: 7-19; Oligonucleotide & Gene Therapy-Base Antisense Therapeutics, (1997), (Mori, ed.), Drug & Market Development Publications, Westborough, Massachusetts; Antisense Therapeutics, (1996) (Agrawal, ed.), Humana Press, Totowa, New Jersey, para revisiones generales de los antisentidos. Las AD-ODNs son secuencias cortas de ADN, habitualmente de 15 a 25 bases de longitud, y están diseñadas para complementar un ARNm diana de interés y para formar una doble cadena ARN:ODN. Esta formación de doble cadena puede evitar el procesamiento, corte y empalme, transporte o traducción del ARNm pertinente. Además, ciertos AS-ODNs pueden obtener actividad ARNasa H celular para hibridarse adicionalmente con su ARNm diana, dando lugar a la degradación del ARNm. Calabretta et al., (1996) Semen. Oncol. 23: 78-87. En ese caso, la ARNasa dividirá el componente de ARN de la doble cadena y puede potencialmente liberar el AS-ODN para hibridarse adicionalmente con moléculas adicionales del ARN diana. Un modo de acción adicional resulta de la interacción de AS-ODNs con ADN genómico para formar una triple hélice que podría ser transcripcionalmente inactiva.

Los vehículos de liberación de nanopartículas de la presente invención se pueden utilizar para variar un perfil de expresión de la célula diana utilizando la descripción anterior como regla general. En una realización, se puede preparar un vehículo de liberación de nanopartículas que comprende por lo menos una secuencia AS, una secuencia ODN, una secuencia AS-ODN u otra secuencia de ácidos nucleicos o de ácidos nucleicos modificada. Esta secuencia puede actuar como agente activo en un vehículo de liberación de nanopartículas. El vehículo de liberación de nanopartículas también comprende una señal de localización nuclear, que dirige el vehículo de liberación al núcleo de la célula. Alternativamente, si se desea que el vehículo de liberación de nanopartículas permanezca en el citoplasma, se pueden utilizar nanopartículas de mayor tamaño (por ejemplo, 30 nm). La secuencia y/o composición exacta de un agente activo refleja la función o funciones del vehículo de liberación de nanopartículas. Por ejemplo, un agente activo puede ser complementario a un gen de interés.

En la práctica, se puede administrar a un sujeto un vehículo de liberación de nanopartículas diseñado para variar un perfil de traducción de proteína de la célula diana mediante inyección o, si las células diana están presentes en un medio in vitro, el vehículo de liberación de nanopartículas se puede añadir directamente al medio de crecimiento de las células. Ambos procedimientos de introducción se describen anteriormente en la presente invención y otros serán evidentes para un experto en la materia después de la revisión de la presente descripción.

VII.C. Modulación de la concentración de proteína reguladora

Los vehículos de liberación de nanopartículas de la presente invención se pueden utilizar para modular la concentración de varias proteínas reguladoras celulares. Se conoce un ejemplo específico de regulación ya que utiliza un señuelo de factores de transcripción. Tal como se indica anteriormente en la presente invención, los términos "señuelo" y "señuelo de factores de transcripción" se refieren a moléculas que se unen o interaccionan con factores de transcripción y evitan su unión a secuencias potenciadoras nativas. Es posible diseñar señuelos de factor de transcripción que interaccionan específicamente con factores de transcripción o mimetizan o se parecen al sitio de unión genómica natural para el factor de transcripción concreto. Algunos señuelos de factores de transcripción se pueden unir al factor de transcripción con una afinidad próxima o que supera su afinidad por el sitio de unión genómica natural.

Algunos factores de transcripción, además de unirse a un sitio de unión genómica endógeno, también se pueden unir a ligandos solubles intracelulares. La unión de dicho factor de transcripción a un ligando apropiado altera posteriormente el perfil de unión del factor de transcripción a su sitio o sitios de unión genómica. De nuevo, la unión de ligando mediante un factor de transcripción puede modular la capacidad del factor de transcripción para unirse a su sitio genómico previsto. A dichos factores de transcripción se hace referencia como en el estado de la técnica como receptores intracelulares o nucleares para ligandos solubles.

Los señuelos de los factores de transcripción pueden actuar de varias maneras y, de este modo, pueden comprender una variedad de elementos. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos pueden competir con ADN celular diana para unirse a uno o más factores de transcripción. En este ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos pueden formar una doble cadena con una secuencia diana e inactivar de manera eficaz la secuencia. Las secuencias de ácidos nucleicos se pueden introducir de manera que formarán otras estructuras de tipo de doble cadena, tales como horquillas, cruces u otras estructuras que inactivarán de manera eficaz el ADN diana celular.

No existe la necesidad de que una secuencia introducida en el ADN celular diana comprenda necesariamente ácidos nucleicos no modificados. Las secuencias pueden comprender moléculas de ácidos nucleicos que contienen enlaces fosfodiéster modificados. Los enlaces fosfodiéster modificados pueden incluir fosforotioato, fosforamidita, y derivados de metil fosfato, por ejemplo.

Los vehículos de liberación de nanopartículas de la presente invención son capaces de facilitar una modulación en la concentración de proteínas reguladoras. La modulación se puede conseguir mediante la asociación de un agente activo apropiado con una nanopartícula. Por ejemplo, una secuencia corta de ADN de doble cadena, para la que una proteína reguladora determinada (por ejemplo, un factor de transcripción) tiene una afinidad elevada, se puede utilizar como un señuelo del factor de transcripción, tal como se describe anteriormente en la presente invención. Las aplicaciones de modulación adicionales de proteínas reguladoras para un vehículo de liberación de la presente invención serán evidentes para un experto en la materia cuando se tiene en cuenta la presente descripción.

VII. D. Modulación de corte y empalme de ARN

En general, la expresión de un gen específico se puede regular en cualquier etapa en el proceso de producción de una proteína activa. La modulación de la actividad total de la proteína puede ser a través de mecanismos transcripcionales, de procesamiento del transcrito, traduccionales o post-traduccionales. Una función de un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención es modular la transcripción de una secuencia de ácidos nucleicos.

La transcripción significa un proceso celular que implica la interacción de una ARN polimerasa con un gen que dirige la expresión como ARN de la información estructural presente en las secuencias codificantes del gen. El proceso incluye, pero no se limita a las siguientes etapas: (1) iniciación de la transcripción, (2) alargamiento del transcrito, (3) corte y empalme del transcrito, (4) bloquear el transcrito, (5) terminación del transcrito, (6) polideanilzación del transcrito, (7) exportación nuclear del transcrito, (8) montaje del transcrito, y (9) estabilización del transcrito. La transcripción se puede modular mediante la alteración de la velocidad de iniciación transcripcional o la progresión de ARN polimerasa (Maniatis et al., (1987) Science, 236:1237-45). El procesamiento del transcrito puede estar influenciado por circunstancias, tales como el patrón de corte y empalme de ARN (el corte y empalme del ARN para producir una o más especies de ARNm), la velocidad del transporte de ARNm al citoplasma o estabilidad del ARNm.

Adicionalmente, aunque algunos transcritos de ARNm eucariotas se traducen directamente, muchos contienen una o más regiones, conocidas como "intrones", que se escinden de un transcrito antes de ser traducidas. Las regiones restantes (y por tanto, traducidas) son conocidas como "exones" y se cortan y empalman para formar una secuencia de ARNm continua. Los sitios de corte y empalme de ARNm, es decir, uniones intrón-exón, pueden ser regiones diana para un agente activo de la presente invención, y pueden ser particularmente útiles en situaciones en las que un corte y empalme aberrante está implicado en la enfermedad, o en las que una sobreproducción de un producto de corte y empalme de ARNm particular está implicado en la enfermedad. Las uniones de fusión aberrantes debido a los reajustes o deleciones también pueden ser dianas.

La presente invención también se puede utilizar para modular el corte y empalme de ARNm. Este aspecto de la presente invención se puede realizar mediante la selección de un agente activo apropiado, tal como una secuencia de ácidos nucleicos que se sabe que altera el patrón de corte y empalme para un gen determinado. El uso de una secuencia apropiada (por ejemplo, ADN, ARN, nucleótido morfolino, etc.) puede influir en el patrón de corte y empalme y, consecuentemente, en el perfil de expresión de proteínas para una célula. La liberación de la secuencia apropiada es el principal obstáculo en aplicaciones terapéuticas de corte y empalme de ARN que se puede superar utilizando vehículos de liberación de nanopartículas que comprenden una capacidad de direccionamiento nuclear.

VII.E. Interacción con ARNm en el citoplasma

La presente invención se puede utilizar para interaccionar con transcrito de ARNm para una proteína determinada mientras el transcrito está en el citoplasma. La interacción puede tomar una serie de formas, incluyendo la modulación de la cantidad de una proteína determinada producida por una célula. En un aspecto de la presente invención, un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención puede utilizar un nucléotido antisentido para interaccionar con ARNm que ha sido exportado al citoplasma. Véase, por ejemplo, Bassell et al., (1999) FASEB J. 13: 447-54.

Un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención se puede diseñar para interaccionar con ARNm en el citoplasma de una célula. La hibridación específica de un compuesto oligomérico con ARNm puede interferir con la función normal del ARNm. Esta modulación de la función de un ácido nucleico por compuestos que se hibridan específicamente a lo que se refiere en general como "antisentido" y se describe anteriormente en la presente invención. Los compuestos antisentido pueden interrumpir varias funciones del ARN que pueden incluir todas las funciones vitales, tales como, por ejemplo, la translocación del ARN al sitio de la traducción de la proteína, la traducción de proteína a partir de ARN, corte y empalme del ARN para producir una o más especies de ARNm y la actividad catalítica que podría estar implicada o facilitada por ARN. El efecto global de dicha interferencia con la función de ARNm es la modulación de la expresión de la proteína para la que el ARNm codifica.

La asociación de un compuesto antisentido con, por ejemplo, ARN, se puede utilizar para el diagnóstico, terapia, profilaxis y como reactivos de investigación y kits. Cuando se utiliza como agente terapéutico, se puede tratar un sujeto sospechoso de tener una enfermedad o trastorno que puede tratarse mediante la modulación de la expresión de una proteína determinada mediante la administración de un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención que comprende un agente activo antisentido. El uso de los vehículos de liberación de nanopartículas de la presente invención, cuando los compuestos antisentido están incluidos como agentes activos, también se puede realizar profilácticamente, por ejemplo, para evitar o retrasar la infección, inflamación o formación de tumores, por ejemplo.

Los vehículos de liberación que transportan compuestos antisentido de la presente invención son útiles para la investigación y el diagnóstico, ya que el componente antisentido se puede hibridar con ácidos nucleicos que codifican una proteína concreta de interés, permitiendo que se construyan fácilmente ensayos de "sándwich" u otros ensayos para explotar este hecho.

Adicionalmente, los vehículos de liberación de nanopartículas de la presente invención se pueden localizar subcelularmente a través de la selección de una nanopartícula de tamaño apropiado. Tal como se muestra en la figura 1B, los vehículos de liberación que comprenden nanopartículas de 30 nm o superior permanecen localizadas en el citoplasma de la célula y no se localizan en el núcleo de la célula, independientemente de la presencia o ausencia de una señal de localización nuclear. Esta observación indica que nanopartículas más grandes se pueden dirigir al citoplasma, donde se localiza el ARNm no traducido. Las nanopartículas más pequeñas se pueden utilizar para marcar el ARNm en el núcleo. De este modo, un vehículo de liberación de la presente invención se puede dirigir al citoplasma de una célula, donde puede interaccionar con las secuencias de ARN dispuestas en la misma.

VII. Ventajas de los vehículos de liberación de la presente invención

Existen una serie de ventajas de la presente invención sobre los procedimientos para la liberación conocidos en la actualidad en el estado de la técnica. En primer lugar, existe una ventaja distintiva en el uso de una señal de localización nuclear. La inclusión de una NLS como parte componente de un vehículo de liberación de nanopartículas asegura que, suponiendo la optimización de otras variables, el vehículo de liberación de nanopartículas esté dirigido directamente al núcleo de la célula. Esta ventaja incrementa ampliamente la eficacia de un agente activo diseñado para interaccionar con estructuras nucleares mediante el incremento de la cantidad de material liberado al núcleo de una célula diana; la inclusión de la NLS da lugar a menos material dispuesto en el citoplasma para periodos más cortos de tiempo y, en última instancia, menos degradación del material. La NLS ofrece adicionalmente la capacidad de dirigir de manera eficaz procesos celulares que tienen lugar en el núcleo, tales como replicación de ADN, transcripción y diversos cortes y empalme.

La asociación de agentes de direccionamiento adicionales puede ayudar en la translocación de un vehículo a través de varias membranas, tales como la membrana nuclear de una célula o la membrana externa de una célula, proporcionando de este modo otra ventaja. Si las membranas y otras estructuras que inhiben generalmente la translocación de un vehículo a una localización determinada en o sobre una célula se interpretan como "cerraduras", las secuencias NLS y RME se pueden interpretar como "llaves". De este modo, en una realización preferida, un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención puede comprender una serie de secuencias diferentes o "llaves" que pueden permitir que un vehículo de liberación de nanopartículas pase a través de varias barreras potenciales para la translocación.

Otra ventaja de una realización preferida de los vehículos de liberación de nanopartículas de la presente invención es la capacidad de crear nanopartículas que comprenden un material que es biológicamente inerte. Por ejemplo, es posible crear nanopartículas a partir de oro y otros materiales. El oro, a diferencia de algunos otros materiales, es biológicamente inerte y se puede tolerar fisiológicamente sin efectos adversos significativos por los sistemas biológicos. Además una nanopartícula puede comprender material biodegradable que, tras la rotura, puede proporcionar las partes componentes del vehículo de liberación de nanopartículas, todas ellas biodegradables.

Aún otra ventaja de una realización preferida de los vehículos de liberación de nanopartículas de la presente invención es su capacidad de actuar en cualquiera de una serie de funciones, debido a la falta de restricción del agente activo. Un vehículo de liberación de nanopartículas de la presente invención puede, por tanto, cumplir una serie de funciones simplemente cambiando el agente activo para ajustarse a la necesidad. De este modo, un vehículo de liberación de nanopartículas diseñado para modular la expresión génica mediante la liberación de una cadena antisentido al núcleo de una célula también puede actuar como señuelo de factores de transcripción mediante la sustitución del agente activo de cadena antisentido por una secuencia de doble cadena de ADN.

Finalmente, se puede variar el tamaño de la nanopartícula, lo cual puede proporcionar un direccionamiento diferente de un vehículo de liberación de nanopartículas. El tamaño de la nanopartícula puede influir en el direccionamiento del vehículo de liberación. Un vehículo de liberación de nanopartículas que comprende una nanopartícula de aproximadamente 30 nm o superior no se transportará al núcleo de la célula y permanecerá en el citoplasma de la célula, incluso si una NLS está presente. Sin embargo, aunque dicho vehículo de liberación de nanopartículas podría no transportarse al núcleo de una célula, el vehículo de liberación de nanopartículas se puede ser internalizado por la célula y permanecer localizado en el citoplasma. De este modo, dichos vehículos pueden ser útiles para modular procesos que tienen lugar en el citoplasma, tal como traducción y translocación.

Ejemplo de laboratorio

Se ha incluido el siguiente Ejemplo de laboratorio para ilustrar los modos preferidos de la presente invención. Ciertos aspectos del siguiente Ejemplo de laboratorio se describen en términos de técnicas y procedimientos hallados o contemplados por los presentes inventores para funcionar correctamente en la práctica de la presente invención. Este Ejemplo de laboratorio se ejemplifica a través del uso de prácticas de laboratorio estándar de los inventores. A la luz de la presente descripción y el nivel general de conocimiento en la materia, los expertos en la materia entenderán que el siguiente Ejemplo de laboratorio sólo pretende ser un ejemplo y que se pueden realizar numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin desviarse del espíritu y alcance de la presente invención.

Ejemplo de laboratorio

La entrada dirigida en las células es un área de investigación cada vez más importante. El núcleo es una diana deseable, ya que la información genética de la célula y la maquinaría de la transcripción reside ahí. El diagnóstico del fenotipo de la enfermedad, la identificación de fármacos candidatos potenciales, y el tratamiento de la enfermedad mediante nuevos procedimientos, tales como terapia antisentido, se potenciarían ampliamente mediante el transporte eficaz de materiales a los núcleos de células vivas (Kole & Sazani, (2001) Curr. Opin. Mol. Ther. 3: 229-234). El destino intracelular de las nanopartículas de oro diseñadas químicamente para transitar desde el exterior de una célula viva al núcleo se describe en el presente Ejemplo de laboratorio.

Aunque previamente se han introducido en las células metales, semiconductores, polímeros y partículas magnéticas (Liu et al., (2001) Biomacromolecules 2: 362-368; Marinakos et al., (2001) J. Phys. Chem. B. 105: 8872-8876; West & Halas, (2000) Curr. Opin. Biotech. 11: 215-217; Hogemann et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13: 116-121), no existe una estrategia citoquímica exhaustiva para marcar el núcleo desde el exterior de la membrana plasmática de las células vivas. El desarrollo de una estrategia que permite el transporte de partículas del tamaño de los nanómetros en las células tiene aplicaciones importantes en la biología celular como herramienta para el estudio del desarrollo y diferenciación celular.

Previamente se han utilizado una serie de técnicas para determinar las trayectorias celulares de las partículas. De hecho, el uso de la microscopía electrónica con manchas de oro coloidal fue quizás el primer procedimiento moderno de caracterización de la estructura celular (Havat (Ed.), (1998) Colloidal Gold. Principles, Methods, and Applications; Academic Press, Inc.: San Diego, Vol. 1). Más recientemente, se ha utilizado la microscopía por fluorescencia para localizar fluoróforos, incluyendo nanopartículas de CdSe luminiscentes en células (Bruchez et al., (1998) Science 281: 2013-2016; Nie & Chan, (1998) Science 281: 2016-2018). Sin embargo, se realizaron estudios anteriores de la translocación nuclear de nanopartículas utilizando la microinyección o células modificadas químicamente, evitando de este modo la entrada en la membrana celular. La combinación de endocitosis dirigida acoplada con la captación nuclear no se ha demostrado, antes de la presente descripción, en un vector de nanopartículas utilizando células
intactas.

La liberación nuclear dirigida es una tarea exigente, ya que cualquier sonda nuclear específica de célula debe satisfacer mínimamente los siguientes requisitos (Hallenbeck & Stevenson, (2000) Targetable Gene Delivery Vectors (Habib, Ed.), Kluwer Academic/Plenum Publishers: Nueva York, pág. 37-46): debe: (i) ser lo suficientemente pequeña para entrar en la célula y atravesar la membrana nuclear; (ii) unirse a receptores de membrana plasmática específicos de célula mediante endocitosis mediada por receptores (RME), por ejemplo; (iii) escapar por mecanismos endosómicos/lisosómicos; (iv) pasar a través del complejo de poros nucleares y (v) tienen baja toxicidad. En el presente Ejemplo de laboratorio, se describen los resultados de los estudios de movimiento intracelular de nanopartículas diseñadas para realizar estas y otras funciones.

Un vector de nanopartículas del presente Ejemplo de laboratorio comprende un núcleo de una partícula de oro de 20 nm y una cubierta de albúmina de suero bovino (BSA) conjugado a varios péptidos marcadores celulares, que se presentan en la siguiente Tabla de Secuencias de Péptidos Representativos:

\newpage

Tabla de Secuencias de Péptidos Representativos

7

Cuando se preparan los péptidos descritos en la Tabla de Secuencias de Péptidos Representativos, los péptidos se conjugaron a BSA con el enlazador de éster N-hidroxisuccinimida del ácido 3-maleimido benzoico. La electroforesis en gel (SDS-PAGE e IEF) se utilizó para cuantificar la proporción péptido:BSA. Cada péptido se escogió para realizar una cierta tarea (por ejemplo, RME). Previamente se han explorado péptidos individuales como vectores de liberación terapéuticos (Morris et al., (2000) Curr. Opin. Biotech. 11: 461-466). Sin embargo, el marcaje nuclear altamente eficaz en biología se realiza mediante virases, los cuales utilizan diferentes péptidos para cada barrera mencionada anteriormente. Una observación significativa del presente Ejemplo de laboratorio es que los péptidos virales conjugados a proteínas en la superficie de una nanopartícula retienen su función de provocar la entrada en la célula y el marcaje nuclear. Además, péptidos cortos separados en una única partícula conducen a un marcaje nuclear más eficaz que un único péptido largo. Juntos, el núcleo de oro y la cubierta de péptido multifuncional, proporcionan un soporte flexible que se puede acoplar en las células específicas diana para ensayos intranucleares o liberación terapéutica.

Se eligió el oro como vector marcador intracelular principalmente por tres razones. En primer lugar, el oro se puede sintetizar de manera rutinaria en tamaño que varía de manera continua desde 0,8 nm a 200 nm con una dispersidad del tamaño de menos de un 5%. En segundo lugar, el oro se puede modificar con una gran colección de moléculas pequeñas, péptidos, proteínas, ADN y polímeros. Además, todos estos elementos funcionales se pueden combinar en una única partícula, frecuentemente a través de procedimientos simples "one-pot". Finalmente, las partículas de oro tienen fuertes extinciones de la luz visible que se pueden utilizar para monitorizar sus trayectorias en el interior de las células bajo condiciones de luz polarizada. Estas propiedades se utilizaron de manera ventajosa en una combinación novedosa de microscopía de color mejorada por video (VEC) y microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC), que facilitaban la observación de la trayectoria de nanopartículas de oro de 20 nm en el interior de las células.

La dispersión de luz dinámica y la microscopía electrónica de transmisión revelaron que los conjugados BSA-péptido añaden menos de 2 nm al radio del complejo de nanopartículas. El hecho de que la BSA no añada demasiado al tamaño de la partícula de oro es importante en su uso en la construcción de vectores marcadores nucleares, ya que el diámetro del complejo de poro nuclear es de 20 a 50 nm dependiendo de la línea celular (Feldherr & Akin, (1990), J. Cell Biol. 111: 1-8). Las partículas de oro de 20 nm utilizadas en el presente Ejemplo de laboratorio tienen un diámetro máximo de 25 nm cuando forman complejos con cualquiera de los conjugados BSA-péptido estudiados (ver Información de soporte).

La translocación nuclear a través del complejo de poro nuclear se ha estudiado previamente utilizando nanopartículas de oro marcadas con una NLS de virus SV-40 (antígeno T grande). En los estudios clásicos, el marcaje nuclear se observó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) tras la microinyección en la célula (Feldherr et al., (1982) Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 89: 11002-11005). Como caso de prueba, los complejos de nanopartículas que comprenden el péptido N0 se introdujeron en el medio de crecimiento de células HepG2. De manera sorprendente, se observaron complejos N0 en el interior del citoplasma de células HepG2, aunque éstos no entraron en el núcleo. Los experimentos a 4ºC indicaron que la entrada a la célula se hizo a través de un mecanismo dependiente de energía. Esta observación sugiere que los N0 entraron en la célula mediante endocitosis mediada por receptor, pero eran incapaces de escapar del endosoma y marcar los núcleos (la microscopía TEM y la microscopía de fluorescencia confocal confirmaron que las nanopartículas se confinaron a los endosomas). Estos resultados destacan los desafíos asociados al marcaje nuclear: aunque un péptido de NLS conocido es capaz de entrar en las células HepG2, no puede marcar el núcleo a menos que sea capaz del escape endosomal.

En un esfuerzo por aumentar la eficacia del marcaje nuclear en células HepG2, se exploraron los péptidos de los adenovirus. Los adenovirus son utilizados ampliamente en la liberación de genes y existe un gran interés en la sustitución del virus completo, el cual es potencialmente infeccioso e inmunogénico con secuencias de péptidos derivadas de la proteína fibrosa del adenovirus (Seth, (2000) Adenoviral Vectors; (Aviv, Ed.) Kluwer Academic/Plenum Publishers: New York, páginas 13-22; Bilbao et al., (1998) Targeted Adenoviral vectors for Cancer Gene Therapy, Plenum Publishers: New York, Vol. 57, páginas 365-374). SE sabe que esta proteína contiene las secuencias RME y NLS (N1 y N2 en la Tabla de Secuencias de Péptidos Representativas). La fibra de longitud completa que contiene a tanto RME como a NLS es el péptido N3 de la Tabla de Secuencias de Péptidos Representativas. A continuación, se indica una comparación de las funciones de estos péptidos marcadores cuando se forman complejos con una nanopartícula de oro. N1 no entra en la célula. N2 entra en la célula, pero permanece atrapado en los endosomas y no alcanza el núcleo. N3 se dirige al núcleo, aunque, N1/N2 tiene una gran tendencia por el marcaje nuclear que N1, N2 y N3. Estos resultados se interpretan tal como se indica a continuación. N1 presenta únicamente la NLS del adenovirus (Tabla de Secuencias de Péptidos Representativas). Este péptido no actúa como una RME y no tiene otro grupo químico que permita la entrada en la célula. N2 presenta la RME (motivo NPXY (SEC ID No: 7)) y entra en la célula, aunque no es capaz de dirigirse al núcleo (Chen et al., (1990) J. Biol. Chem. 265: 3116-3123).

Estos resultados muestran que el complejo de nanopartículas debe presentar tanto la RME como la NLS con el fin de entrar en la célula y conseguir la localización nuclear. Los resultados por VEC-DIC muestran claramente valores significativos de N3 en el núcleo que concuerda con el estudio de liberación de genes utilizando el péptido (Zhang et al., (1999) Gene Her. 6: 171-181). La nanopartícula marcada con N1/N2 es incluso más eficaz, tal como puede observarse mediante microscopía VEC-DIC.

Otra comparación a realizar entre una nanopartícula multifuncional marcada con N1/N2 que presenta la RME y NLS en bioconjugados de BSA separados y N3, que presenta el péptido fibroso adenoviral de longitud completa. N1/N2 estaba presente en el núcleo en valores superiores a N3. El origen de la mayor eficacia de marcaje nuclear en partículas que transportan dos péptidos cortos frente a una secuencia larga podría ser estructural o espacial. La espectroscopía por infrarrojo indica que todos los péptidos utilizados en este Ejemplo adoptan una conformación extendida cuando se unen a nanopartículas. Sin embargo, cuando se sintetiza un péptido largo con dos señales consecutivas, es probable que una de las señales sea menos accesible a los receptores celulares. Esto es importante para los motivos NPXY (SEC ID No: 7), por ejemplo, debido a que se ha observado que la interacción en tándem de dos regiones NPXY (SEC ID No: 7) facilita la RME (Hussain, (2001) Front. Biosci. 6: 417-428). La unión de los dos péptidos señales a una nanopartícula como piezas más cortas separadas les proporciona probablemente el mismo acceso a los receptores celulares.

Los procedimientos utilizados en la presente invención proporcionan una estrategia para la rápida valoración de la eficacia de varias combinaciones de péptidos marcadores utilizando complejos de nanopartículas para el marcaje nuclear. La microscopía por combinación VEC-DIC permite el examen de cientos de muestras por día, una mejora sobre las técnicas costosas y laboriosas de microscopía electrónica y confocal.

La estrategia multifuncional demostró que utilizando secuencias marcadoras adenovirales se proporciona una prueba de la función de secuencias peptídicas individuales que permitirán el marcaje eficaz y específico de la célula para un intervalo de aplicaciones científicas y médicas.

Referencias

Las referencias indicas a continuación, así como todas las referencias citadas en el documento, se incorporan en la presente por referencia hasta el punto de que complementa, explica, proporcionan base o enseñan una metodología, técnicas y/o composiciones utilizadas en la presente invención.

Agrawal, (1996) Trends Biotechnol. 14 (10): 376-87

Antisense Therapeutics, (1996) (Agrawal, ed.), Humana Press, Totowa, Nueva Jersey

Autieri & Agrawal, (1998) J. Biol. Chem. 273: 14731-37

Bassell et al., (1999) FASEB J. 13: 447-54

Bilbao et al., (1998) Targeted Adenoviral vectors for Cancer Gene Therapy, Plenum Press: New York, Vol. 57, pp 365-374

Bruchez et al., (1998) Science 281: 2013-2016

Calabretta et al., (1996) Semin. Oncol., 23: 78-87

Chakhmakhcheva et al., (1999) Nucleos. Nucleot. 18: 1427-28

Chen et al., (1990) J. Biol. Chem. 265: 3116-3123

Colloidal Drug Delivery Systems, (1994) (Kreuter, ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, pág. 219-342

Couvreur et al., (1982) J. Pharm. Sci. 71: 790-92

Couvreur et al., (1986) in Polymeric Nanoparticles and Microspheres, (Guiot & Couvreur, eds.), CRC Press, Boca Raton, pág. 27-93

DeVita, (1983) in Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill Book Co., Nueva York, pág. 68

Enustun & Turkevich, (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 3317

Feldherr & Akin, (1990) Electron Microsc. Rev. 3 (1): 73-86

Feldherr & Akin, (1990) J. Cell Biol. 111: 1-8

Feldherr & Akin, (1994) Exp. Cell Res. 215: 206-10

Feldherr & Akin, (1999) J. Cell Sci. 112: 2043-48

Feldherr et al., (1992) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 89: 11002-11005

Gabe, (1994) Radiother. Oncol. 30: 199-205

Hainfeld & Furuya, (1992) J. Histochem. Cytochem. 40: 177-84

Hainfeld, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11064-11068

Hainfeld, (1992) Ultramicroscopy 46: 135-44

Hallenbeck & Stevenson, (2000) Targetable Gene Delivery Vectors (Habib, Ed.), Kluwer Academic/Plenum Publishers: New York, pág. 37-46

Hayashi, (1987) Physics Today, December 1987, pág. 44-60

Hayashi, (1987) Vac. Sci. Technol. July/August 1987, A5 (4): 1375-84

Hayat (Ed.), (1998) Colloidal Gold. Principles, Methods, and Applications; Academic Press, Inc.: San Diego,
Vol. 1

Hogemann et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13: 116-121)

Hussain, (2001) Front. Biosci. 6: 417-428

Kole & Sazani, (2001) Curr. Opin. Mol. Ther. 3: 229-234

Kreuter, (1994) Eur. J. Drug Metab. Ph. 3: 253-56

Labhasetwar et al., (1997) Adv. Drug. Del. Rev., 24: 63-85

Ledley, (1993) Clin. Invest. Med. 16: 78-88

Lefebvre-D'Hellencourt et al., (1995) Eur. Cytokine Netw., 6: 7-19

Lev-Lehman et al., (1997) in Antisense Therapeutics, (Cohen & Smisek, eds.), Plenum Press, Nueva York

Liu et al., (2001) Biomacromolecules 2: 362-368

Magin et al., (2000) Virology 274: 11-16

Maniatis et al., (1987) Science, 236: 1237-45

Marinakos et al., (1998) Chem. Mater. 10: 1214-19

Marinakos et al., (1999) Adv. Mater. 11: 34-37

Marinakos et al., (2001) J. Phys. Chem. B. 105: 8872-8876

Moede et al., (1999) FEBS Lett. 461: 229-34

Morris et al., (2000) Curr. Opin. Biotech. 11: 461-466

MRS Bulletin, Enero 1990, pág. 16-47

Mullin et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 5668-81

Nie & Chan, (1998) Science 281: 2016-2018

Norden et al., (2000) FASEB J. 14 (9): 1041-60

Oligonucleotide & Gene Therapy-Base Antisense Therapeutics, (1997), (Mori, ed.), Drug & Market Development Publications

Protein Purification Applications: A Practical Approach, (1989) (Harris & Angal, eds.) IRL Press, Oxford, England Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, Applications, (1989) (Janson & Ryden, eds.) VCH Publishers, Nueva York

Remington's Pharmaceutical Sciences, (1980) (Osol, ed.) 16th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania

Sambrook et al., (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York

Seth, (2000) Adenoviral Vectors; (Habib, Ed.) Kluwer Academic/Plenum Publishers: Nueva York, pág. 13-22

Tinland et al., (1992) Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 89: 7442-46

Patente de Estados Unidos No. 5.783.263

Patente de Estados Unidos No. 6.106.798

West & Halas, (2000) Curr. Opin. Biotech. 11: 215-217

Wu & Wu, (1991) Biotherapy 3: 87-95

Zhang et al., (1999) Gene Ther. 6: 171-181

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 5460831 A, Kossovsky [0006]

\bullet WO 9856363 A [0008]

\bullet WO 9913719 A [0009]

\bullet WO 0242325 A [0010]

\bullet WO 60244501 A [0010]

\bullet US 5783263 A [0065] [0176]

\bullet US 6106798 A [0065] [0176]

\bullet WO 60304236 A [0177]

Documentos que no son patentes citados en la descripción

\bulletWU; WU. Biotherapy, 1991, vol. 3, 87-95 [0006] [0176]

\bulletLEDLEY. Clin. Invest. Med., 1993, vol. 16, 78-88 [0006] [0176]

\bulletCOUVREUR et al. J. Pharm. Sci., 1982, vol. 71, 790-92 [0007]

\bulletCOUVREUR et al. Polymeric Nanoparticles and Microspheres. CRC Press, 1986, 27-93 [0007] [0176]

\bulletLABHASETWAR et al. Adv. Drug. Del. Rev. 1997, vol. 24, 63-85 [0007]

\bullet Colloidal Drug Delivery Systems. Marcel Dekker, Inc, 1994, 219-342 [0065] [0176]

\bulletKREUTER. Eur. J. Drug Metab. Ph., 1994, vol. 3, 253-56 [0065] [0176]

\bulletFELDHERR; AKIN. Electron Microsc. Rev., 1990, vol. 3 (1), 73-86 [0068] [0176]

\bulletFELDHERR et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, vol. 89, 11002-5 [0068]

\bulletFELDHERR; AKIN. J. Cell Sci., 1999, vol. 112, 2043-48 [0068] [0176]

\bulletFELDHERR; AKIN. Exp. Cell Res., 1994, vol. 215, 206-10 [0068] [0176]

\bulletHAYASHI. Vac. Sci. Technol., July 1987, vol. A5 (4), 1375-84 [0070] [0176]

\bulletHAYASHI. Physics Today, December 1987, 44-60 [0070] [0176]

\bulletMRS Bulletin, January 1990 [0070]

\bulletMARINAKOS et al. Adv. Mater., 1999, vol. 11, 34-37 [0071] [0176]

\bulletMARINAKOS et al. Chem. Mater., 1998, vol. 10, 1214-19 [0071] [0176]

\bulletENUSTUN; TURKEVICH. J. Am. Chem. Soc., 1963, vol. 85, 3317 [0071]

\bulletNORDEN et al. FASEB J., 2000, vol. 14 (9), 1041-60 [0080] [0176]

\bulletCHAKHMAKHCHEVA et al. Nucleos. Nucleot., 1999, vol. 18, 1427-28 [0081] [0176]

\bulletSAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1992 [0085]

\bulletAUTIERI; AGRAWAL. J. Biol. Chem., 1998, vol. 273, 14731-37 [0087] [0176]

\bulletMAGIN et al. Virology, 2000, vol. 274, 11-16 [0087] [0176]

\bulletTINLAND et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, vol. 89, 7442-46 [0087]

\bulletMOEDE et al. FEBS Lett., 1999, vol. 461, 229-34 [0087] [0176]

\bulletMULLIN et al. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, 5668-81 [0095] [0176]

\bullet Protein Purification Applications: A Practical Approach. IRL Press, 1989 [0104] [0176]

\bullet Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, Applications. VCH Publishers, 1989 [0104]

\bulletHAINFELD; FURUVA. J. Histochem. Cytochem., 1992, vol. 40, 177-84 [0106]

\bulletHAINFELD. Ultramicroscopy, 1992, vol. 46, 135-44 [0106] [0176]

\bulletRemington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, 1980 [0115] [0176]

\bulletAGRAWAL. Trends Biotechnol., 1996, vol. 14 (10), 376-87 [0139] [0176]

\bulletLEV-LEHMAN et al. Antisense Therapeutics. Plenum Press, 1997 [0139] [0176]

\bulletLEFEBVRE-D'HELLENCOURT et al. Eur. Cytokine Netw., 1995, vol. 6, 7-19 [0139]

\bullet Oligonucleotide & Gene Therapy-Base Antisense Therapeutics. Drug & Market Development Publications, 1997 [0139] [0176]

\bullet Antisense Therapeutics. Humana Press, 1996 [0139] [0176]

\bulletCALABRETTA et al. Semin. Oncol., 1996, vol. 23, 78-87 [0139] [0176]

\bulletMANIATIS et al. Science, 1987, vol. 236, 1237-45 [0148] [0176]

\bulletBASSELL et al. FASEB J., 1999, vol. 13, 447-54 [0151] [0176]

\bulletKOLE; SAZANI. Curr. Opin. Mol. Ther., 2001, vol. 3, 229-234 [0162] [0176]

\bulletLIU et al. Biomacromolecules, 2001, vol. 2, 362-368 [0163] [0176]

\bulletMARINAKOS et al. J. Phys. Chem. B., 2001, vol. 105, 8872-8876 [0163] [0176]

\bulletWEST; HALAS. Curr. Opin. Biotech., 2000, vol. 11, 215-217 [0163] [0176]

\bulletHOGEMANN et al. Bioconjugate Chem., 2002, vol. 13, 116-121 [0163] [0176]

\bullet Colloidal Gold. Principles, Methods, and Applications. Academic Press, Inc, 1998, vol. 1 [0164]

\bulletBRUCHEZ et al. Science, 1998, vol. 281, 2013-2016 [0164] [0176]

\bulletNIE; CHAN. Science, 1998, vol. 281, 2016-2018 [0164] [0176]

\bulletHALLENBECK; STEVENSON. Targetable Gene Delivery Vectors. Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2000, 37-46 [0165] [0176]

\bulletMORRIS et al. Curr. Opin. Biotech., 2000, vol. 11, 461-466 [0167] [0176]

\bulletFELDHERR; AKIN. J. Cell Biol., 1990, vol. 111, 1-8 [0169] [0176]

\bulletFELDHERR et al. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1992, vol. 89, 11002-11005 [0170] [0176]

\bulletSETH. Adenoviral Vectors. Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2000, 13-22 [0171] [0176]

\bulletBILBAO et al. Targeted Adenoviral vectors for Cancer Gene Therapy. Plenum Press, 1998, vol. 57, 365-374 [0171] [0176]

\bulletCHEN et al. J. Biol. Chem., 1990, vol. 265, 3116-3123 [0171] [0176]

\bulletZHANG et al. Gene Ther., 1999, vol. 6, 171-181 [0172] [0176]

\bulletHUSSAIN. Front. Biosci., 2001, vol. 6, 417-428 [0173] [0176]

\bulletCOUVREUR et al. J. Pharm. Sci., 1982, vol. 71, 790-92 [0176]

\bulletDEVITA. Harrison's Principles of Internal Medicine. McGraw-Hill, 1983, 68 [0176]

\bulletENUSTUN; TURKEVICH. J. Am. Chem. Soc, 1963, vol. 85, 3317 [0176]

\bulletGABE. Radiother. Oncol., 1994, vol. 30, 199-205 [0176]

\bulletHAINFELD; FURUYA. J. Histochem. Cytochem., 1992, vol. 40, 177-84 [0176]

\bulletHAINFELD. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 11064-11068 [0176]

\bulletLABHASETWAR et al. Adv. Drug. Del. Rev., 1997, vol. 24, 63-85 [0176]

\bulletLEFEBVRE-D'HELLENCOURT et al. Eur. Cytokine Netw., 1995, vol. 6, 7-19 [0176]

\bulletMRS Bulletin, January 1990, 16-47 [0176]

\bulletSAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1992 [0176]

\bulletTINLAND et al. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A., 1992, vol. 89, 7442-46 [0176]

<110> Franzen, Stefan

\hskip1cm

Feldheim, Daniel

\hskip1cm

Godek, Marisha

\hskip1cm

Ryan, Joseph

\hskip1cm

Anderson, Miles

\hskip1cm

Tkachenko, Alexander

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Agente de Liberación de nanopartículas

\vskip0.400000\baselineskip

<130> No. de archivo del agente 297-124-2

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/304236

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2001-07-10

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\hskip1cm

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de simio 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Adenovirus desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Adenovirus desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Adenovirus desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Adenovirus desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1).._(4)_

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm

14

Claims

1. Vehículo de liberación de nanopartículas que comprende:

(a) una nanopartícula; un agente activo;

(b) una señal de localización nuclear; y

(c) uno o más agentes marcadores extracelulares.

2. Vehículo de liberación de nanopartículas, según la reivindicación 1, en el que la nanopartícula comprende un material seleccionado del grupo que consiste en metales, cerámicos, semiconductores y polímeros.

3. Vehículo de liberación de nanopartículas, según la reivindicación 1, en el que la nanopartícula es biodegradable.

4. Vehículo de liberación de nanopartículas, según la reivindicación 1, en el que cada secuencia está asociada independientemente con la nanopartícula.

5. Vehículo de liberación de nanopartículas, según la reivindicación 1, que comprende además un revestimiento protector que cubre por lo menos parte del vehículo de liberación.

6. Vehículo de liberación de nanopartículas que comprende:

(a) una serie de agentes marcadores diferentes, en el que la serie de agentes marcadores diferentes comprende una señal de localización nuclear y uno o más agentes marcadores extracelulares diferentes;

(b) un soporte de nanopartículas, en el que el soporte de nanopartículas comprende un material seleccionado del grupo que consiste en seleniuro de cadmio, titanio, dióxido de titanio, estaño, óxido de estaño, silicio, dióxido de silicio, hierro, óxido de hierro III, plata, níquel, oro, cobre, aluminio, acero, aleación de cobalto y cromo, aleación de titanio, brushita, fosfato de tricalcio, alúmina, óxido de silicio, óxido de zirconio, diamante, poliestireno, goma de silicona, policarbonato, poliuretanos, polipropilenos, polimetilmetacrilato, cloruro de polivinilo, poliéteres, y polietileno; y

(c) un agente activo.

7. Vehículo de liberación de nanopartículas, según la reivindicación 6, en el que cada agente marcador está asociado independientemente con la nanopartícula.

8. Vehículo de liberación de nanopartículas, según las reivindicaciones 1 ó 6, en el que el agente marcador extracelular es un motivo RME.

9. Vehículo de liberación de nanopartículas, según las reivindicaciones 1 ó 6, en el que el agente marcador extracelular se selecciona del grupo que consiste en toxina de la difteria, toxina de pseudomonas, toxina del cólera, ricina, concanavalina A, virus del sarcoma de Rous, virus de los bosques de Semliki, virus de estomatitis vesicular, adenovirus, transferrina, lipoproteína de baja densidad, transcobalamina, proteínas de la yema, IgE, IgA polimérica, IgG maternal, insulina, factor de crecimiento epidérmico, hormona del crecimiento, hormona estimuladora de la tiroides, factor de crecimiento nervioso, calcitonina, glucagón, prolactina, hormona luteinizante, hormona de la tiroides, factor del crecimiento derivado de plaquetas, interferón, señal de localización nuclear y catecolaminas.

10. Vehículo de liberación de nanopartículas, según las reivindicaciones 1 ó 6, en el que el agente marcador extracelular comprende un fragmento de una molécula seleccionada del grupo que consiste en toxina de la difteria, toxina de pseudomonas, toxina del cólera, ricina, concanavalina A, virus del sarcoma de Rous, virus de los bosques de Semliki, virus de estomatitis vesicular, adenovirus, transferrina, lipoproteína de baja densidad, transcobalamina, proteínas de la yema, IgE, IgA polimérica, IgG maternal, insulina, factor de crecimiento epidérmico, hormona del crecimiento, hormona estimuladora de la tiroides, factor de crecimiento nervioso, calcitonina, glucagón, prolactina, hormona luteinizante, hormona de la tiroides, factor del crecimiento derivado de plaquetas, interferón, señal de localización nuclear y catecolaminas.

11. Vehículo de liberación de nanopartículas, según las reivindicaciones 1 ó 6, en el que los agentes marcadores se seleccionan del grupo que consiste en las SEC ID Nos. 4-6, y combinaciones de las mismas.

12. Vehículo de liberación de nanopartículas, según la reivindicación 6, en el que el soporte de las nanopartículas es biodegradable.

13. Vehículo de liberación de nanopartículas, según las reivindicaciones 1 ó 6, en el que la nanopartícula tiene aproximadamente 30 nm o menos de diámetro.

14. Vehículo de liberación de nanopartículas, según las reivindicaciones 1 ó 6, en el que el agente activo se selecciona del grupo que consiste en oligómeros de ácidos nucleicos de doble cadena, ácidos nucleicos de cadena única, ácidos nucleicos modificados químicamente, ácido nucleicos peptídicos, proteínas y moléculas pequeñas.

15. Vehículo de liberación de nanopartículas, según las reivindicaciones 1 ó 6, que comprende además una secuencia de unión fijada al agente activo y la nanopartícula y dispuesta entre los mismos.

16. Vehículo de liberación de nanopartículas, según las reivindicaciones 1 ó 6, que comprende además dos o más agentes activos diferentes.

17. Vehículo de liberación de nanopartículas, según las reivindicaciones 1 ó 6, en el que el vehículo de liberación de nanopartículas está dispuesto en un diluyente farmacéuticamente aceptable.

18. Vehículo de liberación de nanopartículas, según las reivindicaciones 1 ó 6, que comprende además un grupo detectable, en el que el grupo detectable es preferiblemente un compuesto fluorescente.

19. Vehículo de liberación de nanopartículas, según las reivindicaciones 1 ó 6, que comprende además un agente potenciador de la biocompatibilidad.

20. Vehículo de liberación de nanopartículas, según las reivindicaciones 1 ó 6, que comprende además un revestimiento protector que cubre por lo menos parte del vehículo de liberación.

21. Vehículo de liberación de nanopartículas, según las reivindicaciones 5 ó 20, que comprende además un revestimiento protector que cubre todo el vehículo de liberación, en el que preferiblemente el revestimiento protector comprende un polímero o un material biológico, en el que el material biológico es preferiblemente una proteína, un lípido, un carbohidrato o una combinación de los mismos.

22. Procedimiento in vitro de liberación de un agente activo al núcleo de una célula, comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar un vehículo de liberación de nanopartículas que comprende un soporte de nanopartículas que tiene un diámetro de aproximadamente 30 nm o menos; un agente activo y una serie de agentes marcadores, donde la serie de agentes marcadores comprende una señal de localización nuclear y uno o más agentes marcadores extracelulares diferentes; y

(b) poner en contacto una célula diana intacta con el vehículo de liberación de nanopartículas, donde el vehículo de liberación de nanopartículas entra en la célula y atraviesa la membrana nuclear, mediante lo cual se libera un agente activo al núcleo de una célula diana.

23. Procedimiento in vitro de modulación de la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos diana, comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar un vehículo de liberación de nanopartículas que comprende una nanopartícula, una serie de agentes marcadores y un agente activo capaz de interaccionar con una secuencia de ácidos nucleicos diana cuya expresión va a modularse, donde la serie de agentes marcadores diferentes comprende una señal de localización nuclear y uno o más agentes marcadores extracelulares diferentes;

(b) poner en contacto una célula diana intacta que comprende una secuencia de ácidos nucleicos diana con el vehículo de liberación de nanopartículas, donde el vehículo de liberación de nanopartículas entra en la célula y atraviesa la membrana nuclear; y

(c) modular la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos diana a través del contacto de la etapa (b), mediante lo cual se modula la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos diana.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, que comprende además determinar el grado en el que se expresa la secuencia de ácidos nucleicos diana.

25. Procedimiento in vitro de modulación de la expresión de una proteína diana, comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar un vehículo de liberación de nanopartículas que comprende una nanopartícula, una serie de agentes marcadores y una secuencia de ácidos nucleicos antisentido de cadena única complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína diana, donde la serie de agentes marcadores diferentes comprende una señal de localización nuclear y uno o más agentes marcadores extracelulares diferentes;

(b) poner en contacto una célula diana que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína diana con el vehículo de liberación de nanopartículas; y

\newpage

(c) modular la expresión de la proteína diana a través del contacto de la etapa (b), mediante lo cual se modula la expresión de una proteína diana.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, que comprende además determinar el grado en el que se expresa la proteína diana.

27. Procedimiento in vitro de modulación de la transcripción en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar un vehículo de liberación de nanopartículas que comprende una nanopartícula, una serie de agentes marcadores y un agente activo que comprende un ligando por el que un componente de transcripción natural tiene mayor afinidad que un ligando natural del componente de transcripción natural, donde la serie de agentes marcadores diferentes comprende una señal de localización nuclear y uno o más agentes marcadores extracelulares diferentes;

(b) poner en contacto una muestra que comprende el componente de transcripción natural con el vehículo de liberación de nanopartículas; y

(c) modular la transcripción en la muestra a través del contacto de la etapa (b), donde se modula la transcripción en una muestra.

28. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que el ligando por el que un componente de transcripción natural tiene mayor afinidad que un ligando natural del componente de transcripción natural comprende un oligonucleótido morfolino,

o en el que el ligando por el que un componente de transcripción natural tiene mayor afinidad que un ligando natural del componente de transcripción natural comprende enlaces fosfodiéster modificados,

o en el que el ligando por el que un componente de transcripción natural tiene mayor afinidad que un ligando natural del componente de transcripción natural tiene la capacidad de interaccionar con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína reguladora para formar de este modo por lo menos una de (a) una estructura tridimensional no transcribible y (b) una estructura tridimensional no traducible, o en el que el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia unida fijada a, y dispuesta entre, el ligando por el que un componente de transcrip-
ción natural tiene mayor afinidad que un ligando natural del componente de transcripción natural y la nanopartícula.

29. Procedimiento según la reivindicación 27, que comprende además determinar el grado en el que se modula la transcripción.

30. Procedimiento de modulación del corte y empalme del ARN en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar un vehículo de liberación de nanopartículas que comprende una nanopartícula, una serie de agentes marcadores y una secuencia de ácidos nucleicos conocida o sospechosa de alterar el patrón de corte y empalme para un gen diana, donde la serie de agentes marcadores diferentes comprende una señal de localización nuclear y uno o más agentes marcadores extracelulares diferentes; y

(b) poner en contacto una muestra que comprende el gen diana con el vehículo de liberación de nanopartículas; y

(c) modular el corte y empalme del ARN en una muestra a través del contacto de la etapa (b), donde se modula el corte y empalme del ARN en una muestra.

31. Procedimiento según la reivindicación 30, en el que la secuencia de ácidos nucleicos conocida o sospechosa de alterar el patrón de corte y empalme para un gen diana comprende un oligonucleótido morfolino,

o en el que la secuencia de ácidos nucleicos conocida o sospechosa de alterar el patrón de corte y empalme para un gen diana comprende enlaces fosfodiéster modificados,

o en el que el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia unida fijada a, y dispuesta entre, la secuencia de ácidos nucleicos conocida o sospechosa de alterar el patrón de corte y empalme para un gen diana y la nanopartícula.

32. Procedimiento según la reivindicación 30, que comprende además determinar el grado en el que se modula el corte y empalme de ARN en una muestra.

33. Procedimiento in vitro de modulación de la traducción de una secuencia de ARNm que codifica una proteína de interés, comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar un vehículo de liberación de nanopartículas que comprende una nanopartícula, una serie de agentes marcadores y una secuencia de ácidos nucleicos de cadena única complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ARNm que codifica una proteína de interés, donde la serie de agentes marcadores diferentes comprende una señal de localización nuclear y uno o más agentes marcadores extracelulares diferentes;

(b) poner en contacto una muestra que comprende la secuencia de ARNm que codifica una proteína de interés con el vehículo de liberación de nanopartículas; y

(c) modular la traducción de una secuencia de ARNm que codifica una proteína de interés a través del contacto de la etapa (b), mediante lo cual se modula la traducción de una secuencia de ARNm que codifica una proteína de interés.

34. Procedimiento in vitro según la reivindicación 33, en el que la secuencia de ácidos nucleicos de cadena única complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ARNm que codifica una proteína de interés comprende un oligonucleótido morfolino,

o en el que la secuencia de ácidos nucleicos de cadena única complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ARNm que codifica una proteína de interés comprende enlaces fosfodiéster modificados,

o en el que la secuencia de ácidos nucleicos de cadena única complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ARNm que codifica una proteína de interés tiene la capacidad de interaccionar con la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ARNm que codifica una proteína de interés para formar de este modo por lo menos una de (a) una estructura tridimensional no transcribible y (b) una estructura tridimensional no traducible,

o en el que el vehículo de liberación de nanopartículas comprende además una secuencia unida fijada a, y dispuesta entre, la secuencia de ácidos nucleicos de cadena única complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ARNm que codifica una proteína de interés y la nanopartícula.

35. Procedimiento in vitro según la reivindicación 33, que comprende además determinar el grado en el que se modula la concentración de una proteína reguladora en solución.

36. Procedimiento in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 23, 24, 25, 29, 32, 33 ó 35, en el que la determinación se realiza mediante una técnica seleccionada del grupo que consiste en SDS-PAGE, ensayo de actividad de enzima, ensayo basado en ELISA, ensayo espectroscópico, transferencia northern, transferencia Southern o ensayo basado en radiología.

37. Uso de un vehículo de liberación de nanopartículas según una o más de las reivindicaciones 1-21 para la fabricación de un medicamento para su uso en terapia génica, para la modulación de la expresión génica o para la modulación del corte y empalme del ARN.