ES2625905T3 - Nanopartículas que comprenden antígenos y adyuvantes capaces de estimular linfocitos T cooperadores - Google Patents

Nanopartículas que comprenden antígenos y adyuvantes capaces de estimular linfocitos T cooperadores Download PDF

Info

Publication number
ES2625905T3
ES2625905T3 ES05788525.3T ES05788525T ES2625905T3 ES 2625905 T3 ES2625905 T3 ES 2625905T3 ES 05788525 T ES05788525 T ES 05788525T ES 2625905 T3 ES2625905 T3 ES 2625905T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
nanoparticle
nanoparticles
antigen
group
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES05788525.3T
Other languages
English (en)
Inventor
Gottfried Himmler
G. C. Mudde
Ralf Kircheis
T. Rademacher
Soledad Penades Ullate
Manuel Martin Lomas
Jose Luis De Paz Carrera
Rafael Ojeda Martinez De Castilla
Africa Garcia Barrientes
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Midatech Ltd
Original Assignee
Midatech Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Midatech Ltd filed Critical Midatech Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2625905T3 publication Critical patent/ES2625905T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/625—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier binding through the biotin-streptavidin system or similar
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A61K2039/645—Dendrimers; Multiple antigen peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Una nanopartícula que comprende un núcleo que incluye átomos metálicos y/o semiconductores, en la que el núcleo está covalentemente unido a una pluralidad de ligandos y los ligandos comprenden al menos un antígeno, y al menos un adyuvante peptídico que activa linfocitos T cooperadores, y en donde el núcleo de la nanopartícula tiene un diámetro medio de entre 0,5 y 10 nm.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Nanopartlcuias que comprenden antlgenos y adyuvantes capaces de estimular linfocitos T cooperadores Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a nanopartlcuias, y mas en particular a nanopartlcuias que comprenden adyuvantes y antlgenos, tales como antlgenos tumoraies y patogenos, y a su uso en una gama de apiicaciones.
Antecedentes de la invencion
El uso de antlgenos de hidrato de carbono y peptldicos en vacunas esta obstacuiizado en gran medida por su faita de inmunogenia cuando se inyectan directamente en un paciente. Dichos antlgenos, cuando se inyectan solos, por io general son ignorados por las celulas presentadoras de antlgenos (CPA), se eiiminan rapidamente y no inducen una respuesta inmunitaria.
En la mayorla de ios casos, tambien es necesario administrar el antlgeno en combinacion con un adyuvante. El adyuvante puede ser un sistema de entrega simple tai como iiposomas, que raientizan el aciaramiento del antlgeno y hacen que sea mas probable que sea aicanzado y recogido por las CAP. Sin embargo, esto en si mismo no es muy eficaz y por io general es necesario combinario con agentes que estimuien el sistema inmunitario, tales como productos bacterianos que estimuien la formacion de citocinas. Tambien pueden coadministrarse citocinas por si mismas. Muchos de estos productos son demasiado toxicos o demasiado experimentaies para ser utiiizados en seres humanos y ios adyuvantes mas eficaces no estan aprobados para el uso humano. La mayorla de ios adyuvantes disponibies para su uso en seres humanos son de eficacia iimitada. Encontrar adyuvantes eficaces adecuados para el uso humano es un desaflo continuo.
Los antlgenos de hidrato de carbono tienen una inmunogenia particularmente debil, ya que soiamente pueden estimular respuestas de celulas B y no de linfocitos T. Por io general esto se aborda mediante la conjugacion de ios hidratos de carbono con una protelna transportadora. Sin embargo, con el fin de provocar una respuesta inmunitaria tambien es necesario el uso de un adyuvante.
Los antlgenos de hidrato de carbono son dianas potenciaies para la inmunoterapia antineoplasica ya que estan expuestos en la superficie de las celulas tumoraies pero ocuitos en las celulas normaies. Muchas bacterias y otros patogenos tambien se distinguen por antlgenos de hidrato de carbono que serlan una buena diana para vacunas, si ios hidratos de carbono no fueran tan poco inmunogenos. La mejora de la inmunogenia de ios antlgenos de hidrato de carbono tendrla, por tanto, apiicaciones en una ampiia diversidad de campos terapeuticos.
Las celulas cancerosas casi siempre estan giucosiiadas de una manera aberrante, una caracterlstica que las distingue de las celulas normaies. (Glycoconjugate J. (1997), 14:569; Adv. Cancer Res. (1989), 52:257; Cancer Res. (1996), 56:5309). En la mayorla de ios casos, la glucosilacion aberrante se presenta en la superficie de las celulas en forma de giucoprotelnas y giucoilpidos. Por tanto, estas estructuras de hidrato de carbono aiteradas pueden denominarse antlgenos asociados a tumores (AAT), que con frecuencia no se producen en las celulas normaies. En muchos casos, las celulas no muestran una glucosilacion homogenea, es decir existen diferentes giucoformas de cadenas de giucano compiejas en una superficie ceiuiar (Annu. Rev. Biochem. (1988), 57:785).
En el curso del descubrimiento y la posterior caracterizacion de ios mas variados antlgenos asociados a tumores, la investigation ha demostrado que tienen funciones importantes para las celulas cancerosas. Por ejempio, ios antlgenos asociados a tumores permiten que las celulas degeneradas demuestren propiedades caracterlsticas del fenotipo maiigno, tales como un aumento de la capacidad de adhesion, que desempenan un papei importante en el estabiecimiento de las metastasis. Sin embargo, dichos antlgenos tambien pueden, en ciertas etapas, expresarse en celulas normaies en las que son responsabies de las funciones normaies de estas celulas. Por tanto, ios antlgenos asociados a tumores son estructuras que son presentadas predominantemente por las celulas tumoraies, en general, sobre o en la membrana ceiuiar, y que ies permiten diferenciarse del tejido no maiigno. Los antlgenos asociados a tumores pueden ser, por ejempio, polipeptidos, en particular protelnas giucosiiadas o patrones de glucosilacion de polipeptidos. Otras estructuras que pueden representar un antlgeno asociado a tumor inciuyen ios giucoilpidos, por ejempio, ios gangliosidos, tales como GM2. Dichos antlgenos asociados a tumores pueden representarse por cambios en la composition de ios ilpidos de la membrana ceiuiar que pueden ser caracterlsticos de las celulas cancerosas.
Los antlgenos asociados a tumores inciuyen ios siguientes ejempios.
N-CAM (molecula de adhesion ceiuiar neuronal, del ingles Neuronal Cell Adhesion Molecule), que se expresa con frecuencia en tumores de origen neuronal y que efectua la adhesion homofila (J. Cell Biol. 118 (1992), 937).
El antlgeno de hidrato de carbono Lewis Y, que se produce en la mayorla de ios tumores de origen epiteiiai, pero que tambien desempena un papei importante durante el desarroiio fetal de ios tejidos epiteiiaies. Se ha demostrado
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
que la expresion de este antlgeno en el cancer de pulmon esta fuertemente asociada a un pronostico desfavorable ya que las celulas de cancer positivas para Lewis Y, obviamente, tienen un potencial metastasico mas alto (N. Engl. J. Med. 327 (1992), 14).
CEA (antlgeno carcinoembrionario, del ingles Carcino Embryonic Antigen), que con frecuencia se produce en tumores epiteliales del tracto gastrointestinal y que se ha identificado como una molecula de autoadhesion (Cell 57 (1989), 327).
Ep-CAM (molecula de adhesion de celulas epiteliales, del ingles Epithelial Cell Adhesion Molecule), que se expresa en casi todos los tumores de origen epitelial, pero que tambien se produce en un gran numero de epitelios normales. Se ha caracterizado como una molecula de autoadhesion y, por tanto, puede clasificarse como un antlgeno de adhesion panepitelial (J. Cell Biol. 125 (1994), 437).
Son ejemplos adicionales de antlgenos asociados a tumores el hidrato de carbono Sialil Tn, los antlgenos Lewis (Lewis-x, Lewis-b, estructuras de Lewis y), hidrato de carbono Globo H, gangliosidos tales como GD2/GD3/GM2, antlgeno prostatico especlfico (PSA, del ingles Prostate Specific Antigen), CA 125, CA 19-9, CA 15-3, TAG-72, receptor de EGF, receptor Her2/Neu, p97, CD20 y CD21. Hay disponibles anticuerpos monoclonales dirigidos contra todos estos antlgenos. Se describen ejemplos de antlgenos asociados a tumores en DeVita et al. (Editores, "Biological Therapy of Cancer, 2° Edicion, Capltulo 3: Biology of Tumor Antigens, Lippincott Company, ISBN 0-39751416-6 (1995), (Elektrophoresis (1999), 20:362; Curr. Pharmaceutical Design (2000), 6:485, Neoplasma (1996), 43:285)).
Existen diversos metodos de tratamiento del cancer, sin embargo, todavla ha de mejorarse la tasa de exito de las pautas de tratamiento actuales. Aparte de la cirugla y la quimioterapia, tambien se conoce el tratamiento inmunoterapico.
En la inmunoterapia pasiva, los anticuerpos monoclonales (MAb, del ingles Monoclonal Antibody) se administran por via sistemica a un paciente en una cantidad adecuada de unirse directamente a una diana. El objetivo del tratamiento es formar un complejo inmunitario y, a traves de una serie de reacciones inmunitarias, se destruye la celula u organismo afectado por la diana. El efecto terapeutico depende de la concentracion de los MAb en la circulacion y de su semivida biologica, que suele ser bastante corta. Por tanto, es necesario repetir la administracion dentro de un plazo de tiempo adecuado. Si se usan MAb xenogenos, tales como anticuerpos murinos, se esperan reacciones adversas, que conduzcan posiblemente a un choque anafilactico. Debido a este inconveniente, dichas inmunoterapias se emplean durante un tiempo limitado solamente.
Las pautas de inmunizacion activa activan el sistema inmunitario de los pacientes de una manera diferente. Despues de la administracion de un antlgeno que se parece a una diana especlfica, la respuesta inmunitaria humoral y la especlfica de linfocitos T del paciente inducen mecanismos de defensa para combatir la diana in vivo. Se conocen bien en la tecnica antlgenos de vacuna de diversos tipos y frente a una amplia diversidad de diferentes enfermedades. Por ejemplo, la vacunacion contra la hepatitis B usando vacunas que contienen antlgenos de superficie de la hepatitis B es bien conocida. Se ha demostrado que los intervalos de dosis altas de antlgenos utilizados para la vacunacion, as! como la vacunacion con dosis bajas, pueden proporcionar tasas suficientes de seroconversion (Parish D.C. et al., 1991, Southern Medical Journal, 84, 426-430 Goudeau A. et al., 1984, The Lancet, 10, 1091-1092).
Tambien se conocen protelnas de fusion de manano-mucina y pueden usarse para la generacion de linfocitos T citotoxicos. Se ha demostrado que dependiendo de la dosificacion de la protelna de fusion administrada a ratones, puede inducirse ya sea casi solamente inmunidad celular (dosis bajas) o solamente inmunidad humoral (dosis altas) (Pietersz G.A. et al., 1998, Cancer Immunol. Immunother., 45, 321-326).
Para la inmunizacion activa, los antlgenos por lo general se presentan en una formulacion inmunogena para proporcionar una vacuna. Los antlgenos que imitan las dianas tienen similitudes en cualquiera de las secuencias primaria y secundaria de las dianas o fragmentos de las mismas. Los antlgenos mimotopos o mimotopicos, sin embargo, tienen similitudes en la estructura terciaria de la diana.
Aunque se han desarrollado muchos productos para el tratamiento del cancer todavla existe una gran demanda para proporcionar sustancias que tengan caracterlsticas mejoradas en comparacion con las sustancias ya conocidas. En particular, en el campo de la vacunacion, existe una necesidad de productos que sean altamente inmunogenos, facilmente reproducibles y altamente eficaces, pero que no provoquen efectos secundarios graves.
Barrientos et al., 2003, Chemistry, Vol. 9, N.° 9, paginas 1909-1921, describe gluconanopartlculas de oro como ligandos polivalentes sinteticos que imitan superficies similares al glucocaliz como herramientas para estudios glucobiologicos.
Rojo et al., 2004, Chembiochem., Vol. 5, N.° 3, paginas 291-297, describe gluconanopartlculas de oro como nuevas herramientas en la terapia antiadhesiva.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
El documento WO 98/43677 describe un conjugado de hidrato de carbono peptido y su uso para inducir una respuesta inmunitaria.
Jesus de la Fuente et al., 2004, Glycoconjugate Journal, vol. 21., N.° 3-4, paginas 149-163, describe gluconanopartlculas de oro que imitan la agrupacion de glucoesfingollpidos (GSL, del ingles glycosphingolipid) en la membrana celular.
Ada G., 2001, New England Journal of Medicine, vol. 345, N.° 14, paginas 1042-1053, describe vacunas y la vacunacion.
Edelman R., 2000, Methods in Molecular Medicine, Vol. 42, paginas 1-27, describe metodos de preparacion y protocolos de investigacion relacionados con adyuvantes de vacunas.
El documento WO 2005/002643 A2 describe metodos y productos para la entrega de moleculas biologicas a las celulas usando nanoestructuras de componentes multiples. En particular, la nanoestructura puede incluir antlgenos y ciertos adyuvantes para su uso en aplicaciones de vacunacion.
El documento WO 02/32404 (Consejo Superior de Investigaciones Cientlficas) desvela nanopartlculas formadas a partir de atomos metalicos o semiconductores en los que los ligandos que comprenden hidratos de carbono estan unidos covalentemente al nucleo de las nanopartlculas. Estas nanopartlculas se usan para modular interacciones mediadas por hidratos de carbono y son solubles y atoxicas. La solicitud PCT que reivindica la prioridad del documento GB-A-0313259.4 (Consejo Superior de Investigaciones Cientlficas y Midatech Limited) desvela nanopartlculas magneticas que tienen nucleos que comprenden atomos metalicos pasivos y magneticos, estando el nucleo unido covalentemente a ligandos. La solicitud GB 0411537.4 (Consejo Superior de Investigaciones Cientlficas y Midatech Limited) desvela nanopartlculas que incluyen nanopartlculas magneticas que estan conjugadas a ligandos de ARN, en particular ligandos de ARNip.
Sumario de la invencion
En terminos generales, la presente invencion se refiere a nanopartlculas que comprenden adyuvantes y antlgenos como se definen en las reivindicaciones.
En un primer aspecto la presente invencion proporciona una nanopartlcula que comprende un nucleo que incluye atomos metalicos y/o semiconductores, en la que el nucleo esta unido covalentemente a una pluralidad de ligandos y los ligandos comprenden al menos un antlgeno, y
al menos un adyuvante peptldico que activa linfocitos T cooperadores, y en la que el nucleo de la nanopartlcula tiene un diametro medio de entre 0,5 y 10 nm.
En algunos casos la nanopartlcula comprende adicionalmente al menos un ligando que comprende un grupo monosacarldico.
En algunos casos el adyuvante peptldico comprende un sitio de escision de proteasa. En particular, el adyuvante peptldico puede comprender la secuencia de aminoacidos FKLQTMVKLFNRIKNNVA.
En algunos casos el antlgeno es un antlgeno especlfico de tumor. En particular, el antlgeno puede ser un antlgeno de hidrato de carbono. En ciertos casos el antlgeno esta sialilado. Por ejemplo, el antlgeno puede ser sialil Tn, sialil Lewis a, sialil Lewis x o sialil Lewis y.
En algunos casos el antlgeno es un antlgeno especlfico de patogeno. Por ejemplo, el patogeno puede una bacteria,
un virus o un parasito.
En algunos casos al menos uno de los ligandos esta unido a la nanopartlcula a traves de un grupo enlazador. En particular, el grupo enlazador puede comprender un grupo tiol, un grupo alquilo, un grupo glicol o un grupo peptldico. Por ejemplo, el grupo enlazador puede comprender alquilo C2-C15 y/o glicol C2-C15. En particular, el grupo enlazador puede ser alquilo C2-C15 o hexaetilenglicol-alquilo C11.
En algunos casos la nanopartlcula comprende un marcador. En particular, el marcador puede ser un grupo fluorescente, un radionuclido, un marcador magnetico, un colorante, un atomo activo en RMN o un atomo que es susceptible de deteccion usando resonancia de plasmon superficial. En ciertos casos, el marcador magnetico es un
+2 +3 +2 +2 +2 +2 +2 +2 +3 +3
grupo paramagnetico que comprende Mn , Gd , Eu , Cu V , Co , Ni , Fe , Fe o lantanidos . En ciertos
casos, el atomo activo en RMN es Man+2, Gd+3, Eu+2, Cu+2, V+2, Co+2, Ni+2, Fe+2, Fe+ 3 o lantanidos+3.
En algunos casos la nanopartlcula es hidrosoluble.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En algunos casos el nucleo de la nanopartlcula puede tener un diametro medio de entre 1 y 2,5 nm.
En algunos casos la nanopartlcula que incluye sus ligandos tiene un diametro medio de entre 10 y 30 nm.
En algunos casos el nucleo de la nanopartlcula es un nucleo metalico. En particular, el nucleo metalico puede comprender Au, Ag o Cu. En ciertos casos el nucleo metalico es una aleacion seleccionada entre Au/Ag, Au/Cu, Au/Ag/Cu, Au/Pt, Au/Pd, Au/Ag/Cu/Pd, Au/Fe, Au/Cu, Au/Gd, Au/Fe/Cu, Au/Fe/Gd o Au/Fe/Cu/Gd. En ciertos casos el nucleo de la nanopartlcula es magnetico. En ciertos casos la nanopartlcula comprende atomos de metal pasivos y atomos de metal magneticos en el nucleo en una relacion entre aproximadamente 5:0,1 y aproximadamente 2:5. Por ejemplo, el metal pasivo puede ser oro, platino, plata o cobre, y el metal magnetico puede ser hierro o cobalto.
En algunos casos el nucleo de la nanopartlcula comprende atomos semiconductores. En ciertos casos los atomos semiconductores son capaces de actuar como un punto cuantico.
En algunos casos los ligandos comprenden adicionalmente un peptido, un dominio protelnico, un segmento de acido nucleico, un glucollpido o una glucoprotelna. En particular, el segmento de acido nucleico puede comprender ADN o ARN. En un segundo aspecto la presente invencion proporciona una composicion que comprende una poblacion de una o mas de las nanopartlculas del primer aspecto de la invencion.
En algunos casos la composicion comprende adicionalmente un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
En un tercer aspecto la presente invencion proporciona un metodo de preparacion de nanopartlculas del primer aspecto de la invencion mediante la conjugacion de dicho al menos un antlgeno y el dicho al menos un adyuvante peptldico que activa los linfocitos T cooperadores con el nucleo de la nanopartlcula, comprendiendo el metodo:
derivatizar el antlgeno con un enlazador; derivatizar el adyuvante peptldico con un enlazador; y
hacer reaccionar el antlgeno y el adyuvante peptldico derivatizados con enlazador con reactivos para producir el nucleo de la nanopartlcula de manera que durante el autoensamblaje de las nanopartlculas, los nucleos de nanopartlculas se unan al antlgeno y el adyuvante peptldico a traves del enlazador.
En algunos casos el grupo enlazador comprende un grupo tiol, un grupo alquilo, un grupo glicol o un grupo peptldico. En casos particulares el grupo enlazador comprende alquilo C2-C15 y/o glicol C2-C15. Por ejemplo, el grupo enlazador puede ser alquilo C2-C15 o hexaetilenglicol-alquilo C11.
En algunos casos la mezcla de reaccion comprende el antlgeno derivatizado, el adyuvante derivatizado, una sal de los atomos metalicos y/o semiconductores y un agente reductor para producir las nanopartlculas.
En un cuarto aspecto la presente invencion proporciona nanopartlculas obtenibles mediante el metodo del tercer aspecto de la invencion.
En un quinto aspecto la presente invencion proporciona nanopartlculas del primer aspecto de la invencion, o una composicion del segundo aspecto de la invencion, para su uso en terapia preventiva o paliativa.
En un sexto aspecto la presente invencion proporciona nanopartlculas del primer aspecto de la invencion, o una composicion del segundo aspecto de la invencion, para su uso como vacuna.
En un septimo aspecto la presente invencion proporciona el uso de nanopartlculas como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 para la preparacion de un medicamento para el tratamiento del cancer. En algunos casos el cancer es el cancer de colon, pancreas, intestino, pulmon, hlgado, ovario o vejiga. En ciertos casos las nanopartlculas comprenden una senal de translocacion de membrana de modo que sean capaces de penetrar a traves de la membrana celular.
En un octavo aspecto la presente invencion proporciona el uso de nanopartlculas como se define en la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10 para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad infecciosa. En ciertos casos la enfermedad infecciosa es la malaria o la tuberculosis. En ciertos casos las nanopartlculas comprenden una senal de translocacion de membrana de manera que sean capaces de penetrar a traves de la membrana celular.
Las realizaciones de la presente invencion se describiran ahora a modo de ejemplo y no de limitacion con referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 muestra la estructura de los ligandos Glc (A), Stn (B) y Ley (C).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La Figura 2 muestra la estructura del ligando peptldico de T cooperador BC11.
La Figura 3 muestra la estructura del ligando peptldico de T cooperador BMIX.
La Figura 4A muestra los espectros de RMN de la mezcla de partida (superior) y las nanopartlculas resultantes (inferior) para la nanopartlcula I de BC11.
La Figura 4B muestra los espectros de RMN de la mezcla de partida (superior) y las nanopartlculas resultantes (inferior) para la nanopartlcula II de BC11.
La Figura 5A muestra una micrografla electronica de transmision (izquierda) y un histograma de distribucion de tamano (derecha) para la nanopartlcula I de BC11.
La Figura 5B muestra una micrografla electronica de transmision (izquierda) y un histograma de distri bucion de tamano (derecha) para la nanopartlcula II de BC11.
La Figura 6 muestra representaciones esquematicas supuestas de la nanopartlcula I de BC11.
La Figura 7 muestra tltulos sericos de IgG frente a HSA-Ley de ratones inoculados con BC11 I (clrculos y cuadrados) o BC11 II (triangulos). Se muestra el suero de control de ratones no inoculados como un solo cuadrado relleno. Las flechas indican el momento de las inoculaciones.
La Figura 8 muestra tltulos sericos de IgG frente a HSA-Ley de ratones inoculados con BC11 III (triangulos) o BC11 IV (cuadrados y clrculos). Se muestra el suero de control de ratones no inoculados como un solo cuadrado abierto. Las flechas indican el momento de las inoculaciones.
La Figura 9 muestra los tltulos sericos de IgG de ratones inoculados con BC11 II con primovacunacion con toxina tetanica. Las flechas indican el momento de las inoculaciones.
Descripcion detallada
Nanopartlculas
Las nanopartlculas son partlculas pequenas, por ejemplo, agrupaciones de atomos metalicos o semiconductores, que pueden usarse como un sustrato para la inmovilizacion de ligandos.
Las nanopartlculas de la invencion son solubles en la mayorla de disolventes organicos y especialmente en agua. Esto puede usarse en su purificacion y significa de forma importante que pueden usarse en solucion para presentar el ligando inmovilizado sobre la superficie de la partlcula. El hecho de que las nanopartlculas sean solubles tiene la ventaja de presentar los ligandos en una conformation natural. Para las aplicaciones terapeuticas, las nanopartlculas son atoxicas, solubles y estables en condiciones fisiologicas.
Las nanopartlculas tienen nucleos que tienen diametros medios de entre 0,5 y 10 nm, mas preferentemente de entre 0,5 y 5 nm, mas preferentemente de entre 0,5 y 3 nm e incluso mas preferentemente de entre 0,5 y 2,5 nm. Cuando se consideran los ligandos ademas de los nucleos, el diametro medio global de las partlculas preferentemente es de entre 5,0 y 100 nm, mas preferentemente de entre 5 y 50 nm y mucho mas preferentemente de entre 10 y 30 nm. El diametro medio puede medirse usando tecnicas bien conocidas en la tecnica tales como microscopla electronica de transmision.
El material del nucleo puede ser un metal o un semiconductor y puede estar formado por mas de un tipo de atomo. Preferentemente, el material del nucleo es un metal seleccionado entre Au, Fe o Cu. Los nucleos de nanopartlculas tambien pueden formarse a partir de aleaciones incluyendo Au/Fe, Au/Cu, Au/Gd, Au/Fe/Cu, Au/Fe/Gd y Au/Fe/Cu/Gd y pueden usarse en la presente invencion. Son materiales de nucleo preferidos Au y Fe, siendo el material mas preferido el Au. Los nucleos de las nanopartlculas comprenden preferentemente entre aproximadamente 100 y 500 atomos (por ejemplo, atomos de oro) para proporcionar diametros del nucleo en el intervalo de nanometros. Otros materiales de nucleo particularmente utiles estan dopados con uno o mas atomos que son activos en RMN, permitiendo que las nanopartlculas se detecten usando rMn, tanto in vitro como in vivo. Los ejemplos de atomos activos en RMN incluyen Mn 2, Gd 3, Eu 2, Cu 2, V 2, Co 2, Ni 2, Fe 2 los puntos cuanticos descritos en otra parte en de la presente solicitud.
Fe+3 y lantanidos+3, o
Pueden detectarse nucleos de nanopartlculas que comprenden atomos semiconductores ya que los cristales semiconductores de escala nanometrica son capaces de actuar como puntos cuanticos, es decir, pueden absorber luz excitando de este modo electrones en los materiales a niveles de energla mas altos, liberando posteriormente fotones de luz a frecuencias caracterlsticas del material. Un ejemplo de un material de nucleo semiconductor es el seleniuro de cadmio, el sulfuro de cadmio, el teluro de cadmio. Tambien se incluyen los compuestos de cinc tales como el sulfuro de cinc.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En algunas realizaciones, el nucleo de las nanopartlculas puede ser magnetico y comprender atomos metalicos magneticos, opcionalmente en combinacion con atomos metalicos pasivos. A modo de ejemplo, el metal pasivo puede ser oro, platino, plata o cobre y el metal magnetico puede ser hierro o gadolinio. En realizaciones preferidas, el metal pasivo es oro y el metal magnetico es hierro. En este caso, de manera practica la relacion de atomos metalicos pasivos a atomos metalicos magneticos en el nucleo es de entre aproximadamente 5:0,1 y aproximadamente 2:5. Mas preferentemente, la relacion es de entre aproximadamente 5:0,1 y aproximadamente 5:1. Como se usa en el presente documento, la expresion "metales pasivos" se refiere a metales que no muestran propiedades magneticas y son qulmicamente estables a la oxidacion. Los metales pasivos pueden ser diamagneticos o superparamagneticos. Preferentemente, dichas nanopartlculas son superparamagneticas.
Los ejemplos de nanopartlculas que tienen nucleos que comprenden un metal paramagnetico, comprenden Mn+2, Gd+3 Eu+2, Cu+'2, V+2, Co+2, Ni+2, Fe+2, Fe+3 y lantanidos+3. Eu+2, Cu+2, V+2, Co+2 lantanidos-+3.
incluyen los que
Ni+2, Fe+2, Fe+3 y
Pueden formarse otras nanopartlculas magneticas a partir de materiales tales como MnFe (ferrita espinela) o CoFe (ferrita de cobalto) que pueden conformarse en nanopartlculas (fluido magnetico, con o sin la adicion de un material de nucleo adicional como se ha definido anteriormente. Se proporcionan ejemplos de la qulmica de union por autoensamblaje para la produccion de dichas nanopartlculas en Biotechnol. Prog., 19:1095-100 (2003), J. Am. Chem. Soc. 125:9828-33 (2003), J. Colloid Interface Sci. 255:293-8 (2002).
En algunas realizaciones, la nanopartlcula de la presente invencion o su ligando comprende un marcador detectable. El marcador puede ser un elemento del nucleo de la nanopartlcula o el ligando. El marcador puede ser detectable debido a una propiedad intrlnseca de ese elemento de la nanopartlcula o por estar unido, conjugado o asociado a un resto adicional que sea detectable. Los ejemplos preferidos de marcadores incluyen un marcador que es un grupo fluorescente, un radionuclido, un marcador magnetico o un colorante. Los grupos fluorescentes incluyen fluorescelna, rodamina o tetrametil rodamina, Rojo de Texas, Cy3, Cy5, etc. y pueden detectarse por la excitacion del marcador fluorescente y la deteccion de la luz emitida usando espectroscopla de dispersion Raman (Y.C. Cao, R. Jin, C. A. Mirkin, Science 2002, 297:1536-1539).
En algunas realizaciones, las nanopartlculas pueden comprender un radionuclido para su uso en la deteccion de la nanopartlcula usando la radiactividad emitida por el radionuclido, por ejemplo, mediante el uso de PET, SPECT o para terapia, es decir, para destruir celulas diana. Los ejemplos de radionuclidos utilizados habitualmente en la tecnica que se podrla adaptar facilmente para su uso en la presente invencion incluyen 99mTc, que existe en diversos estados de oxidacion aunque el mas estable es TcO4-; 32P o 33P; 57Co; 59Fe; 67Cu que se utiliza con frecuencia en forma de sales de Cu2+; 67Ga que se utiliza habitualmente en forma de sal de Ga3+, por ejemplo, citrato de galio;
£>Q OO QQ •'I HO 1 1 1 1 Ox •'I OC H 0-1 J 1 ^
Ge; Sr; Mo; Pd; In que en general se usa en forma de sales de In ; I o I que en general se usa en
3Sm
158Au; 186Re;
1Tl utilizado en general en forma de una sal de Tl+ tal
forma de yoduro de sodio; 137Cs; 113Gd;
como cloruro de talio; 39y3+; 71Lu3+; y 24Cr2+. El uso general de radionuclidos como marcadores e indicadores es bien conocido en la tecnica y podrla ser adaptado facilmente por el experto en la materia para su uso en los aspectos de la presente invencion. Los radionuclidos pueden emplearse mas facilmente mediante el dopado de los nucleos de las nanopartlculas o pueden incluirse como marcadores presentes como parte de ligandos inmovilizados sobre las nanopartlculas.
Adicionalmente o como alternativa, las nanopartlculas de la presente invencion, o los resultados de sus interacciones con otras especies, pueden detectarse usando varias tecnicas bien conocidas en la tecnica usando un marcador asociado a la nanopartlcula como se ha indicado anteriormente o mediante el empleo de una propiedad de los mismos. Estos metodos de deteccion de nanopartlculas pueden ir desde la deteccion de la agregacion que se produce cuando las nanopartlculas se unen a otras especies, por ejemplo, mediante simple inspeccion visual o mediante el uso de dispersion de luz (transmitancia de una solucion que contiene las nanopartlculas), hasta el uso de tecnicas sofisticadas tales como la microscopla electronica de transmision (MET) o la microscopla de fuerza atomica (MFA) para visualizar las nanopartlculas. Un metodo de deteccion adicional de partlculas metalicas es emplear resonancia de plasmon que es la excitacion de electrones en la superficie de un metal, por lo general provocada por radiacion optica. El fenomeno de la resonancia de plasmon superficial (SPR, del ingles Surface Plasmon Resonance) existe en la interfase de un metal (tal como Ag o Au) y un material dielectrico tal como aire o agua. Se producen cambios en la SPR cuando los analitos se unen al ligando inmovilizado sobre la superficie de una nanopartlcula cambiando el Indice de refraccion de la interfaz. Una ventaja adicional de la SPR es que puede usarse para controlar las interacciones en tiempo real. Como se ha mencionado anteriormente, si las nanopartlculas incluyen o estan dopadas con atomos que son activos en RMN, entonces puede usarse esta tecnica para detectar las partlculas, tanto in vitro como in vivo, usando tecnicas bien conocidas en la tecnica. Tambien pueden detectarse nanopartlculas usando un sistema basado en la amplificacion de la senal cuantitativa usando la reduccion de plata (I) promovida por nanopartlculas. Puede usarse espectroscopia de fluorescencia si las nanopartlculas incluyen ligandos como sondas fluorescentes. Ademas, el marcado isotopico de los hidratos de carbono puede usarse para facilitar su deteccion.
Los ligandos pueden incluir un componente de hidrato de carbono inerte (por ejemplo, glucosa) que permita controlar a voluntad la densidad de antlgenos y vehlculo en la construccion final.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Antiaeno
Un antlgeno es una molecula que es reconocida especlficamente por las celulas del sistema inmunitario adaptativo, es decir, linfocitos T o celulas B o ambos.
Los antlgenos incluyen protelnas, hidratos de carbono, acido nucleico o incluso moleculas pequenas tales como toxinas. En realizaciones preferidas de la presente invencion, el antlgeno es un antlgeno especlfico de tumor, en particular un antlgeno especlfico de tumor peptldico o de hidrato de carbono. En otras realizaciones preferidas, el antlgeno es un antlgeno que se encuentra en un agente patogeno, tal como un virus, bacteria o parasito.
Los ejemplos de antlgenos especlficos de tumor de hidrato de carbono incluyen estructuras de Lewis sialiladas y sin sialilar transportadas por las cadenas de hidrato de carbono de glucoprotelnas y glucollpidos en la superficie de las celulas tumorales. Estos antlgenos con frecuencia se sobreexpresan en tumores y parecen estar implicados en la adhesion de celulas tumorales al endotelio. Por ejemplo, sialil Lewis3 es responsable de la adhesion en celulas de cancer de colon, de pancreas y gastrico humanos, mientras que sialil Lewisx es responsable de la union de celulas de cancer de pulmon, hlgado y ovario. EL sialil LeA se sobreexpresa en el cancer colorrectal, hepatico y gastrico (para revision vease Ugorski y Laskowska (2002), Acta Biochimican Polonica, 49, 303-311).
Adyuvante
Un adyuvante es un agente que potencia la respuesta inmunitaria a un antlgeno. Los adyuvantes pueden potenciar la respuesta de anticuerpos mediante la estimulacion de celulas de la respuesta inmunitaria adaptativa y/o pueden actuar reforzando de forma no especlfica la actividad del sistema inmunitario innato. En general, los antlgenos que potencian la respuesta de anticuerpos lo hacen ya sea concentrando antlgeno en sitios apropiados donde esten mas expuestos a los linfocitos o mediante la estimulacion de la produccion de citocinas.
De acuerdo con la presente invencion, el adyuvante es un adyuvante peptldico que activa linfocitos T cooperadores.
Cuando se usan como una plataforma de entrega de vacuna, las nanopartlculas por si mismas pueden actuar como adyuvantes proporcionando el antlgeno en forma de partlculas de manera que sea ingerido mas facilmente por celulas presentadoras de antlgeno, tales como macrofagos. Sin embargo, este efecto puede potenciarse en gran medida mediante el uso de otros agentes conjugados con las nanopartlculas que potencien otros aspectos del sistema inmunitario.
Los adyuvantes que aumentan la actividad del sistema inmunitario innato incluyen restos de hidrato de carbono tales como xilosa, fucosa, manosa y N-acetil glucosamina. Estos funcionan de varias maneras. Pueden unirse a moleculas secretadas que circulan en la sangre y la linfa, que desencadenan la disociacion de los componentes del complemento conduciendo a la fijacion del complemento. Tambien pueden unirse a receptores de superficie en celulas fagoclticas tales como macrofagos, tales como CD2-6 (MMR), que estimulan la fagocitosis y la endocitosis
Dichos adyuvantes tambien pueden desempenar un papel en la estimulacion de la respuesta inmunitaria adaptativa.
Pueden unirse a receptores de la superficie celular que inician una senal que conduce a la liberacion de moleculas efectoras (citocinas). Por ejemplo, la union de hidrato de carbono a receptores de tipo Toll en la superficie de celulas dendrlticas provoca que secreten citocinas, incluyendo la interleucina 6 (IL-6), que interfiere con la capacidad de los linfocitos T reguladores de suprimir las respuestas de los linfocitos T efectores a antlgeno.
Las celulas B tambien tienen receptores de tipo Toll. Cuando el receptor esta unido, potencia la respuesta de la celula B al antlgeno.
Otros adyuvantes estimulan directamente las celulas de la respuesta inmunitaria adaptativa. Por ejemplo, pueden usarse peptidos que estimulan respuestas de linfocitos T cooperadores (HTL, del ingles helper Tlymphocyte), para amplificar la respuesta CTL al peptido antigenico. Dichos peptidos pueden ser, por ejemplo, antlgenos altamente inmunogenos de toxoide tetanico que producen una respuesta HTL no especlfica. Los HTL activados potencian las funciones de proliferacion, de supervivencia y efectoras de los CTL.
Dichos peptidos tienen una utilidad particular en la potenciacion de la respuesta inmunitaria a los antlgenos de hidrato de carbono. Aunque los antlgenos de hidrato de carbono pueden ser unidos e internalizados por las celulas B especlficas de hidrato de carbono, no pueden activar los HTL que solo se activan mediante peptidos. Sin embargo, las nanopartlculas de la invencion pueden provocar respuestas tanto de celulas B como de HTL a medida que se conjugan tanto con el antlgeno de hidrato de carbono como con un peptido activador de HTL. Esto proporciona una respuesta inmunitaria muy mejorada.
Administration y tratamiento
Las composiciones de nanopartlculas de la invencion pueden ser para la administracion a los pacientes por cualquier numero de vlas diferentes, incluyendo las vlas enterales o parenterales. La administracion parenteral
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
incluye la administracion por las siguientes vlas: intravenosa, cutanea o subcutanea, nasal, intramuscular, intraocular, transepitelial, intraperitoneal y topica (incluyendo la dermica, ocular, rectal, nasal, por inhalacion y aerosol) y vlas sistemicas rectales.
La administracion puede realizarse, por ejemplo, mediante inyeccion o de forma ballstica usando una pistola de entrega para acelerar su paso transdermico a traves de la capa externa de la epidermis. Las nanopartlculas pueden ser recogidas, por ejemplo, por celulas dendrlticas, que maduran a medida que migran a traves del sistema linfatico, dando como resultado la modulacion de la respuesta inmunitaria y la vacunacion contra el antlgeno. Las nanopartlculas tambien pueden administrarse en aerosoles. Esto se hace posible por el tamano pequeno de las nanopartlculas.
El tamano excepcionalmente pequeno de las nanopartlculas de la presente invencion es una gran ventaja para la entrega a celulas y tejidos, ya que pueden ser recogidas por las celulas incluso cuando estan unidas a moleculas de direccion o terapeuticas.
Las nanopartlculas de la invencion pueden formularse como composiciones farmaceuticas que pueden estar en las formas de composiciones solidas o llquidas. Dichas composiciones comprenderan generalmente un vehlculo de algun tipo, por ejemplo un vehlculo solido tal como gelatina o un adyuvante o un diluyente inerte, o un vehlculo llquido tal como agua, petroleo, aceites de origen animal o vegetal, aceite mineral o aceite sintetico. Pueden incluirse solucion salina fisiologica o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Dichas composiciones y preparaciones generalmente contienen al menos el 0,1 % en peso del compuesto.
Para la inyeccion intravenosa, cutanea o subcutanea, o la inyeccion en el sitio de la afeccion, el principio activo estara en forma de una solucion acuosa parenteralmente aceptable que este libre de pirogenos y tenga un pH, una isotonicidad y una estabilidad adecuados. Los expertos relevantes en la materia son capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, soluciones de los compuestos o un derivado de las mismas, por ejemplo en solucion salina fisiologica, una dispersion preparada con glicerol, polietilenglicol llquido o aceites.
Ademas de uno o mas de los compuestos, opcionalmente en combinacion con otro principio activo, las composiciones pueden comprender uno o mas de un excipiente, vehlculo, tampon, estabilizador, agente isotonizante, conservante o antioxidante farmaceuticamente aceptable u otros materiales bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos materiales deben ser atoxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del vehlculo u otro material puede depender de la via de administracion, por ejemplo, por via oral o parenteral.
Las composiciones farmaceuticas llquidas normalmente se formulan para que tengan un pH de entre aproximadamente 3,0 y 9,0, mas preferentemente de entre aproximadamente 4,5 y 8,5 e incluso mas preferentemente de entre aproximadamente 5,0 y 8,0. El pH de una composition puede mantenerse mediante el uso de un tampon tal como acetato, citrato, fosfato, succinato, Tris o histidina, empleados normalmente en el intervalo de aproximadamente 1 mM a 50 mM. El pH de las composiciones puede ajustarse de otro modo usando acidos o bases fisiologicamente aceptables.
Generalmente, se incluyen conservantes en las composiciones farmaceuticas para retardar el crecimiento microbiano, extendiendo la vida util de las composiciones y permitiendo el envasado de multiples usos. Los ejemplos de conservantes incluyen fenol, metacresol, alcohol bencllico, acido para-hidroxibenzoico y sus esteres, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio. Normalmente se emplean conservantes en el intervalo de aproximadamente el 0,1 al 1,0 % (p/v).
Preferentemente, las composiciones farmaceuticas se proporcionan a un individuo en una cantidad profilacticamente eficaz o una cantidad terapeuticamente eficaz (como sea el caso, aunque la profilaxis puede considerarse terapia), siendo esto suficiente para mostrar un beneficio al individuo. Normalmente, esto sera para provocar una actividad terapeuticamente util proporcionando un beneficio al individuo. La cantidad real de los compuestos administrados y la velocidad y el curso de tiempo de la administracion, dependeran de la naturaleza y la gravedad de la afeccion que se trate. La prescription del tratamiento, por ejemplo, las decisiones acerca de la dosificacion, etc., esta dentro de la responsabilidad de los medicos generales y otros doctores en medicina y, normalmente, tiene en cuenta el trastorno que se trata, la condition del paciente individual, el sitio de entrega, el metodo de administracion y otros factores conocidos para los medicos. Los ejemplos de las tecnicas y protocolos mencionados anteriormente pueden encontrarse en Handbook of Pharmaceutical Additives, 2a edition (editores M. Ash e I. Ash.), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, Nueva York, EE.UU.); Remington Pharmaceutical Sciences, 20a edicion, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2 edicion, 1994. A modo de ejemplo, las composiciones se administran preferentemente a los pacientes en dosis de entre aproximadamente 0,01 y 100 mg de compuesto activo por kg de peso corporal y, mas preferentemente, de entre aproximadamente 0,5 y 10 mg/kg de peso corporal.
Se entendera que cuando interesa el tratamiento de tumores, el tratamiento incluye cualquier medida tomada por el medico para aliviar el efecto del tumor sobre un paciente. Por tanto, aunque la remision completa del tumor es un
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
objetivo deseable, el tratamiento eficaz tambien incluira cualesquiera medidas capaces de conseguir la remision parcial del tumor, asi como una ralentizacion de la tasa de crecimiento de un tumor incluyendo las metastasis. Dichas medidas pueden ser eficaces en la prolongacion y/o la potenciacion de la calidad de vida y el alivio de los sintomas de la enfermedad.
Inmunoterapia
Las composiciones de la invencion pueden ser para su uso en la profilaxis y el tratamiento de enfermedades como el cancer y, mas en particular, para la inmunoterapia.
En la presente invencion, el termino "vacunacion" significa una inmunizacion activa, es decir una induccion de una respuesta inmunitaria especifica debida a la administracion, por ejemplo, a traves de las vias subcutanea, intradermica, intramuscular, oral o nasal, de pequenas cantidades de un antigeno que es reconocido por el individuo vacunado como extrano y, por tanto, es inmunogeno en una formulacion adecuada. El antigeno se usa, por tanto, como un "accionador" para el sistema inmunologico con el fin de construir una respuesta inmunitaria especifica contra el antigeno.
De acuerdo con la presente invencion, las nanoparticulas para su uso en la vacunacion pueden ser terapeuticas o profilacticas, como es el caso con todas las vacunas antimicrobianas. A modo de ejemplo, puede ser posible conseguir una protection profilactica contra la aparicion de una enfermedad cancerosa mediante la vacunacion de las personas que no padecen cancer. Son ejemplos de individuos a los que se podria aplicar una vacuna profilactica de este tipo las personas que tienen un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad cancerosa, aunque la presente solicitud no se limita a dichos individuos. Los pacientes que estan en riesgo de padecer cancer ya pueden haber desarrollado tumores, ya sea como tumores primarios o metastasis, o pueden mostrar predisposition para el cancer.
Para la inmunizacion activa de pacientes con cancer, las estructuras inmunogenas normalmente se formulan como vacunas. Preferentemente, dichas preparaciones farmaceuticas contienen un vehiculo farmaceuticamente aceptable, que, a modo de ejemplo, puede comprender adicionalmente sustancias auxiliares, tampones, sales y/o agentes conservantes. Las preparaciones farmaceuticas pueden utilizarse, por ejemplo, para la profilaxis y la terapia de afecciones asociadas al cancer, tales como la formation de metastasis, en pacientes con cancer. De este modo, las celulas presentadoras de antigenos se modulan especificamente in vivo o tambien ex vivo de manera que se genere la respuesta inmunitaria contra los AAT.
Para la inmunizacion activa con los antigenos especificos o la combination antigenica por lo general se usa una formulacion de vacuna, que contiene el inmunogeno - ya sea un AAT natural o su epitopo, mimetico o mimetico de neoepitopo, o un anticuerpo inmunogenico - sobre todo a bajas concentraciones, por ejemplo, en una cantidad inmunogenica que varia de 0,01 gg a 10 mg, sin embargo, el intervalo de dosis pueden aumentarse hasta un intervalo de 100 a 500 mg. Dependiendo de la inmunogenia del antigeno de vacunacion que, por ejemplo, se determina por las secuencias de una especie foranea o por derivatizacion, o por ejemplo, tambien dependiendo de las sustancias auxiliares o adyuvantes, respectivamente, que se usen, la dosis inmunogenica adecuada puede elegirse en el intervalo de 0,01 gg a 1 mg, preferentemente de 100 gg a 500 gg. Una vacuna de deposito que se ha de entregar al organismo durante un periodo prolongado de tiempo tambien puede, sin embargo, contener cantidades mucho mas grandes de antigeno de vacunacion, por ejemplo, de al menos 1 mg a mas de 100 mg.
La concentration dependera de la cantidad de vacuna liquida o suspendido administrada. Una vacuna por lo general se proporciona en jeringas o ampollas listas para usar que tienen un volumen que varia de 0,01 a 1 ml, preferentemente de 0,1 a 0,75 ml.
El antigeno de vacunacion de un componente del kit se presenta preferentemente en un vehiculo farmaceuticamente aceptable que sea adecuado para la administracion subcutanea, intramuscular y tambien intradermica o transdermica. Un modo adicional de administracion funciona a traves de la via mucosa, por ejemplo, la vacunacion por administracion nasal o peroral. Si se emplean sustancias solidas como agente auxiliar para la formulacion de vacuna se administrara, por ejemplo, un adsorbato o una mezcla en suspension, respectivamente, del antigeno de vacuna con el agente auxiliar. En realizaciones especiales, la vacuna se presenta como una solution o una vacuna riquida en un disolvente acuoso.
Preferentemente, las unidades de vacunacion de una vacuna de tumor ya se proporcionan en una jeringa o ampolla lista para usar adecuada. Una formulacion estable de la vacuna puede ponerse en el mercado ventajosamente en una forma lista para usar. Aunque no se requiere necesariamente un contenido de agentes conservantes, tales como timerosal u otros agentes conservantes con una tolerabilidad mejorada, aun asi puede proporcionarse en la formulacion para una mayor estabilidad a temperaturas de almacenamiento desde temperaturas de refrigeration hasta temperatura ambiente. La vacuna de acuerdo con la invencion tambien puede, sin embargo, proporcionarse en forma congelada o liofilizada y puede descongelarse o reconstituirse, respectivamente, a demanda.
Ha demostrado ser adecuada para aumentar la inmunogenia de un anticuerpo utilizado de acuerdo con la invencion mediante el empleo de adyuvantes. Para este fin, se usan sustancias solidas o adyuvantes de vacunas liquidos, por
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
ejemplo, hidroxido de aluminio (Alu-Gel) o fosfato de aluminio, factores de crecimiento, linfocinas, citocinas, tales como IL-2, IL-12, GM-CSF, interferon gamma o factores del complemento, tales como C3d, preparaciones de liposomas adicionales o tambien formulaciones con antlgenos adicionales contra los cuales el sistema inmunitario ya ha generado una fuerte respuesta inmunitaria, tales como el toxoide tetanico, toxinas bacterianas, tales como exotoxinas de Pseudomonas y derivados de llpido A y lipopolisacarido.
En el caso de que un peptido toxoide este unido covalentemente a la estructura del nucleo, la necesidad de adyuvantes podrla reducirse o suprimirse.
Ejemplos
Ejemplo 1
La preparacion y caracterizacion de nanopartlculas cargadas con antlgenos de hidrato de carbono, un vehlculo T cooperador y glucosa unidas a la superficie de oro se describe a continuacion.
Se usaron los ligandos Glc, STn y Ley (figura 1). Se eligio un espaciador alifatico CA2 para unir el resto de glucosa a la superficie de oro, mientras que se uso un enlazador alifatico C5 para la union de ambos antlgenos.
El ligando peptldico de T cooperador BC11 (Figura 2) se preparo mediante la union de un epltopo peptldico de linfocito T promiscuo (FKLQTMVKLFNRIKNNVA) de toxoide tetanico a traves del grupo amino terminal a un espaciador alifatico C11. El ligando peptldico de T cooperador BMIX (figura 3) se preparo mediante la union del mismo epltopo peptldico de linfocito T de toxoide tetanico a traves del grupo amino terminal a un enlazador mixto compuesto por hexaetilenglicol y un espaciador alifatico C11.
Para la preparacion de las gluconanoparflculas, se disolvieron Glc, STn, Ley y BC11 o BMIX en metanol deuterado en las proporciones deseadas y los espectros de RMN 1H de estas soluciones se registraron a 500 MHz. Los espectros de estas mezclas permitieron identificar senales que perteneclan de manera inequlvoca a los componentes individuales y confirmar que la intensidad de estas senales correspondla a las esperadas de acuerdo con la relacion de los diferentes ligandos en la solucion original (Figura 4). Despues de diluir con metanol las mezclas se trataron como se describe a continuacion para proporcionar las correspondientes gluconanopartlculas que se purificaron repetidamente por filtracion centrlfuga. Los espectros de RMN 1H de estas construcciones en agua deuterada (Figura 4) indicaron que la relacion de ligando original se mantuvo en las GNP obtenidas en las condiciones experimentales utilizadas establecidas previamente. Ademas, los espectros de RMN 1H de los sobrenadantes confirmaron la relacion de ligando propuesta.
Siguiendo el procedimiento anterior, se prepararon las siguientes gluconanopartlculas: BC11 I (Glc:STn:BC11 28:1:1), BC11 II (Glc:STn:BC11 20:9:1), BC11 III (Glc:STn:Ley:BC11 18:10:1:1), BC11 IV (Glc:STn:Ley:BC11 18:1:10:1), BMIX I (Glc:STn:BMIX 28:1:1), BMIX II (Glc:STn:BMIX 20:9:1), BMIX III (Glc:STn:Ley:BMIX 18:10:1:1), BMIX IV (Glc:STn:Ley:BMIX 18:1:10:1), BMIX V (Glc:Ley:BMIX 28:1:1) y BMIX VI (Glc:Ley:BMIX 20:9:1).
Los diametros medios de estas construcciones, determinados usando microscopla electronica de transmision (MET) (Figura 5) fueron de 2,25 nm, 1,45 nm, 2,05 nm y 1,81 nm para BC11 I, BC11 II, BC11 III y BC11 IV, respectivamente y 1,80 nm, 1,55 nm, 2,19 nm, 1,77 nm, 1,64 nm y 1,79 nm para BMIX I, BMIX II, BMIX III, BMIX IV, BMIX V y BMIX Vi respectivamente. A partir de estos diametros medios, se estimaron el numero de atomos de oro en la agrupacion, las cadenas unidas a oro y el peso molecular aproximado de las GNP.[3] Estos valores se proporcionan a continuacion.
Se han preparado y caracterizado (datos no mostrados) varias gluconanopartlculas adicionales (1-4). La composicion de estas construcciones es como se indica a continuacion:
1 (STn, 100 %), 2 (Ley, 100 %), 3 (Glc:STn:enlazador HS(CH2)10COOH 20:1:1), 4 (Glc:STn:enlazador HS(CH2)11O(CH2CH2O)6CH2COOH 28:1:1).
Seccion experimental
Se adquirieron HAuCl4 y NaBH4 de Aldrich Chemical Company. Para todos los experimentos y soluciones, se uso agua Nanopure (18,1 mO).
Preparacion de nanopartfculas de peptido BC11-Au-hidratos de carbono antigenicos.
a) BC11 I (Glc:STn:BC11 28:1:1).
Se disolvio peptido BC11 (3,1 mg, 1,31 pmol) en CF3COOD (100 pl) y la solucion se concentro en un chorro de argon hasta que se observo la formacion de un aceite. Despues se anadieron Glc (8,8 mg, 36,7 pmol) y STn (0,8 mg, 1,31 pmol) y la mezcla se disolvio en CD3OD (500 pl). El espectro de RMN-1H mostro una relacion 28:1:1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
entre las senales de Glc, STn y BC11.
La solucion se diluyo con MeOH (2,8 ml) y el valor de pH se ajusto a 1 mediante la adicion de acido trifluoroacetico. Se anadio una solucion acuosa de HAuCu (286 pl, 0,025 M). Despues, se anadio solucion acuosa 1 N de NaBH4 (157 pl) en varias porciones con agitacion rapida. La suspension de color negro formada se agito durante 2 h adicionales y la capa metanolica se separo por decantacion. El solido de color negro se disolvio en agua (700 pl) y se purifico por filtracion centrlfuga (AMICON PM 10000, 30 min, 14000 rpm). El proceso se repitio dos veces, hasta que las nanopartlculas estuvieron libres de sales y materiales de partida. El residuo en el filtro AMICON se disolvio en 500 pl de agua y se liofilizo para proporcionar 1,2 mg de nanopartlculas BC11 I. MET: diametro medio de 2,25 nm, 309 atomos de oro, 92 cadenas, PM = 90586.
b) BC11 II (Glc:STn:BC11 20:9:1).
Se disolvio peptido BC11 (4,0 mg, 1,7 pmol) en CF3COOD (100 pl) y la solucion se concentro en un chorro de argon hasta que se observo la formacion de un aceite. Despues se anadieron Glc (8,1 mg, 33,9 pmol) y STn (9,3 mg,
15.2 pmol) y la mezcla se disolvio en CD3OD (500 pl). El espectro de RMN-1H mostro una relacion 20:9:1 entre las senales de Glc, STn y BC11.
La solucion se diluyo con MeOH (3,7 ml) y el valor de pH se ajusto a 1 mediante la adicion de acido trifluoroacetico. Se anadio una solucion acuosa de HAuCu (368 pl, 0,025 M). Despues, se anadio solucion acuosa 1 N de NaBH4 (202 pl) en varias porciones con agitacion rapida. La suspension de color negro formada se agito durante 2 h adicionales y la capa metanolica se separo por decantacion . El solido de color negro se disolvio en agua (500 pl) y se purifico por filtracion centrlfuga (AMICON PM 10000, 30 min, 14000 rpm). El proceso se repitio dos veces, hasta que las nanopartlculas estuvieron libres de sales y materiales de partida. El residuo en el filtro AMICON se disolvio en 500 pl de agua y se liofilizo para proporcionar 1,8 mg de nanopartlculas BC11 II. MET: diametro medio de 1,45 nm, 116 atomos de oro, 53 cadenas, PM = 45358.
c) BC11 III (Glc:STn:Ley:BC1 18:10:1:1).
Se disolvio peptido BC11 (2,8 mg, 1,2 pmol) en CF3COOD (100 pl) y la solucion se concentro en un chorro de argon hasta que se observo la formacion de un aceite. Despues se anadieron Glc (5,1 mg, 21,3 pmol) Ley (0,9 mg,
1.2 pmol) y STn (7,3 mg, 11,8 pmol) y la mezcla se disolvio en CD3OD (500 pl). El espectro de RmN-H mostro una relacion 18:10:1:1 entre las senales de Glc, STn, LeY y BC11.
La solucion se diluyo con MeOH (2,4 ml) y el valor de pH se ajusto a 1 mediante la adicion de acido trifluoroacetico. Se anadio una solucion acuosa de HAuCu (256 pl, 0,025 M). Despues, se anadio solucion acuosa 1 N de NaBH4 (142 pl) en varias porciones con agitacion rapida. La suspension de color negro formada se agito durante 2 h adicionales y la capa metanolica se separo por decantacion . El solido de color negro se disolvio en agua (500 pl) y se purifico por filtracion centrlfuga (AMICON PM 10000, 30 min, 14000 rpm). El proceso se repitio dos veces, hasta que las nanopartlculas estuvieron libres de sales y materiales de partida. El residuo en el filtro AMICON se disolvio en 500 pl de agua y se liofilizo para proporcionar 0,5 mg de nanopartlculas BC11 III. MET: diametro medio de 2,05 nm, 225 atomos de oro, 71 cadenas, Pm = 76661.
d) BC11 IV (Glc:STn:Ley:BC11 18:1:10:1).
Se disolvio peptido BC11 (2,7 mg, 1,1 pmol) en CF3COOD (100 pl) y la solucion se concentro en un chorro de argon hasta que se observo la formacion de un aceite. Despues se anadieron Glc (4,9 mg, 20,6 pmol) Ley (8,8 mg, 11,4 pmol) y STn (0,7 mg 1,1 pmol) y la mezcla se disolvio en CD3OD (500 pl). El espectro de RmN-H mostro una relacion 18:1:10:1 entre las senales de Glc, STn, Ley y BC11.
La solucion se diluyo con MeOH (2,3 ml) y el valor de pH se ajusto a 1 mediante la adicion de acido trifluoroacetico Una solucion acuosa de HAuCl.4 (248 ml, 0,025 M) se anadio. Despues, se anadio solucion acuosa 1 N de NaBH4 (137 pl) en varias porciones con agitacion rapida. La suspension de color negro formada se agito durante 2 h adicionales y la capa metanolica se separo por decantacion . El solido de color negro se disolvio en agua (500 pl) y se purifico por filtracion centrlfuga (AMICON PM 10000, 30 min, 14000 rpm). El proceso se repitio dos veces, hasta que las nanopartlculas estuvieron libres de sales y materiales de partida. El residuo en el filtro AMICON se disolvio en 500 pl de agua y se liofilizo para proporcionar 1,2 mg de nanopartlculas BC11 IV. MET: diametro medio de 1,81 nm, 201 atomos de oro, 71 cadenas, Pm = 75409.
Preparation de nanopartfculas de peptido BMIX-Au-hidratos de carbono antigenicos.
a) BMIX I (Glc:STn:BMIX 28:1:1).
Se disolvio peptido BMIX (3,1 mg, 1,31 pmol) en CF3COOD (100 pl) y la solucion se concentro en un chorro de argon hasta que se observo la formacion de un aceite. Despues se anadieron Glc (8,8 mg, 36,7 pmol) y STn (0,8 mg, 1,31 pmol) y la mezcla se disolvio en CD3OD (500 pl). El espectro de RMN-1H mostro una relacion 28:1:1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
entre las senales de Glc, STn y BMIX.
La solucion se diluyo con MeOH (2,7 ml, volumen total: 3,2 ml) y el valor de pH se ajusto a 1 mediante la adicion de acido trifluoroacetico. Se anadio una solucion acuosa de HAuCU (314 pl, 0,025 M). Despues, se anadio solucion acuosa 1 N de NaBH4 (157 pl) en varias porciones con agitacion rapida. La suspension de color negro formada se agito durante 2 h adicionales y la capa metanolica se separo por decantacion [2]. El solido de color negro se disolvio en agua (700 pl) y se purifico por filtracion centrlfuga (AMlCON PM 10000, 30 min, 14000 rpm). El proceso se repitio dos veces, hasta que las nanopartlculas estuvieron libres de sales y materiales de partida. El residuo en el filtro AMlCON se disolvio en 500 pl de agua y se liofilizo para proporcionar 1,0 mg de nanopartlculas BMIX I.
MET: diametro medio de 1,80 nm, 201 atomos de oro, 71 cadenas, PM = 63300.
b) BMIX II (Glc:STn:BMIX 20:9:1).
Se disolvio peptido BMIX (3,5 mg, 1,31 pmol) en CF3COOD (100 pl) y la solucion se concentro en un chorro de argon hasta que se observo la formacion de un aceite. Despues se anadieron Glc (6,3 mg, 26,2 pmol) y STn (7,2 mg, 11,7 pmol) y la mezcla se disolvio en CD3OD (500 pl).
El espectro de RMN-1H mostro una relacion 20:9:1 entre las senales de Glc, STn y BMIX.
La solucion se diluyo con MeOH (2,7 ml, volumen total: 3,2 ml) y el valor de pH se ajusto a 1 mediante la adicion de acido trifluoroacetico. Se anadio una solucion acuosa de HAuCU (314 pl, 0,025 M). Despues, se anadio solucion acuosa 1 N de NaBH4 (157 pl) en varias porciones con agitacion rapida. La suspension de color negro formada se agito durante 2 h adicionales. Es esta, fue imposible separar la capa metanolica por decantacion. Despues, el volumen se redujo a 1 ml, se anadio agua (700 pl) y se purifico por filtracion centrlfuga (AMICON PM 10000, 30 min, 14000 rpm). El proceso se repitio dos veces, hasta que las nanopartlculas estuvieron libres de sales y materiales de partida. El residuo en el filtro AMICON se disolvio en 500 pl de agua y se liofilizo para proporcionar 2,5 mg de nanopartlculas BMIX II.
MET: diametro medio de 1,55 nm, 140 atomos de oro, 53 cadenas, PM = 50567.
c) BMIX III (Glc:STn:Ley:BC1 18:10:1:1).
Se disolvio peptido BMIX (3,9 mg, 1,46 pmol) en CF3COOD (100 pl) y la solucion se concentro en un chorro de argon hasta que se observo la formacion de un aceite. Despues se anadieron Glc (6,3 mg, 26,2 pmol), Ley (1,1 mg, 1,46 pmol) y STn (9,0 mg, 14,6 pmol) y la mezcla se disolvio en CD3OD (500 pl). El espectro de RMN-H mostro una relacion 18:10:1:1 entre las senales de Glc, STn, LeY y BMIX.
La solucion se diluyo con MeOH (3,2 ml, volumen total: 3,7 ml). Se anadio una solucion acuosa de HAuCU (350 pl, 0,025 M). Despues, se anadio solucion acuosa 1 N de NaBH4 (193 pl) en varias porciones con agitacion rapida. La suspension de color negro formada se agito durante 2 h adicionales y la capa metanolica se separo por decantacion
[2]. El solido de color negro se disolvio en agua (500 pl) y se purifico por filtracion centrlfuga (AMICON PM 10000, 30 min, 14000 rpm). El proceso se repitio dos veces, hasta que las nanopartlculas estuvieron libres de sales y materiales de partida. El residuo en el filtro AMICON se disolvio en 500 pl de agua y se liofilizo para proporcionar
2.8 mg de nanopartlculas BMIX III. MET: diametro medio de 2,19 nm, 309 atomos de oro, 92 cadenas, PM = 103569.
d) BMIX IV (Glc:STn:Ley:BMIX 18:1:10:1).
Se disolvio peptido BMIX (3,7 mg, 1,38 pmol) en CF3COOD (100 pl) y la solucion se concentro en un chorro de argon hasta que se observo la formacion de un aceite. Despues se anadieron Glc (6,0 mg, 24,8 pmol), Ley (10,7 mg,
13.8 pmol) y STn (0,85 mg 1,38 pmol) y la mezcla se disolvio en CD3OD (500 pl). El espectro de RmN-1H mostro una relacion 18:1:10:1 entre las senales de Glc, STn, Ley y BMIX.
La solucion se diluyo con MeOH (3,0 ml, volumen total: 3,5 ml) y el valor de pH se ajusto a 1 mediante la adicion de acido trifluoroacetico. Se anadio una solucion acuosa de HAuCl4 (330 pl, 0,025 M). Despues, se anadio solucion acuosa 1 N de NaBH4 (182 pl) en varias porciones con agitacion rapida. La suspension de color negro formada se agito durante 2 h adicionales y la capa metanolica se separo por decantacion [2]. El solido de color negro se disolvio en agua (500 pl) y se purifico por filtracion centrlfuga (AMICON PM 10000, 30 min, 14000 rpm). El proceso se repitio dos veces, hasta que las nanopartlculas estuvieron libres de sales y materiales de partida. El residuo en el filtro AMICON se disolvio en 500 pl de agua y se liofilizo para proporcionar 1,8 mg de nanopartlculas BMIX IV.
MET: diametro medio de 1,77 nm, 201 atomos de oro, 71 cadenas, PM = 75934.
e) BMIX V (Glc:Ley:BMIX 28:1:1).
Se disolvio peptido BMIX (3,7 mg, 1,4 pmol) en CF3COOD (100 pl) y la solucion se concentro en un chorro de argon hasta que se observo la formacion de un aceite. Despues se anadieron Glc (9,4 mg, 39,1 pmol) y Ley (1,1 mg, 1,4 pmol) y la mezcla se disolvio en CD3OD (500 pl). El espectro de RMN-1H mostro una relacion 28:1:1 entre las senales de Glc, Ley y BMIX.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La solucion se diluyo con MeOH (3,0 ml, volumen total: 3,5 ml) y el valor de pH se ajusto a 1 mediante la adicion de acido trifluoroacetico. Se anadio una solucion acuosa de HAuCL (331 pl, 0,025 M). Despues, se anadio solucion acuosa 1 N de NaBH4 (182 pl) en varias porciones con agitacion rapida. La suspension de color negro formada se agito durante 2 h adicionales y la capa metanolica se separo por decantacion [2]. El solido de color negro se disolvio en agua (700 pl) y se purifico por filtracion centrlfuga (AMICON PM 10000, 30 min, 14000 rpm). El proceso se repitio dos veces, hasta que las nanopartlculas estuvieron libres de sales y materiales de partida. El residuo en el filtro AMICON se disolvio en 500 pl de agua y se liofilizo para proporcionar 0,7 mg de nanopartlculas BMIX V.
MET: diametro medio de 1,64 nm, 140 atomos de oro, 53 cadenas, PM = 45568.
f) BMIX VI (Glc:Ley:BMIX 20:9:1).
Se disolvio peptido BMIX (3,5 mg, 1,31 pmol) en CF3COOD (100 pl) y la solucion se concentro en un chorro de argon hasta que se observo la formacion de un aceite. Despues se anadieron Glc (6,3 mg, 26,2 pmol) y Ley (9,2 mg,
11,8 pmol) y la mezcla se disolvio en CD3OD (500 pl). El espectro de RMN-1H mostro una relacion 20:9:1 entre las senales de Glc, Ley y BMIX.
La solucion se diluyo con MeOH (2,7 ml, volumen total: 3,2 ml) y el valor de pH se ajusto a 1 mediante la adicion de acido trifluoroacetico. Se anadio una solucion acuosa de HAuCl4 (314 pl, 0,025 M). Despues, se anadio solucion acuosa 1 N de NaBH4 (157 pl) en varias porciones con agitacion rapida. La suspension de color negro formada se agito durante 2 h adicionales. En esta, fue imposible separar la capa metanolica por decantacion. Despues, el volumen se redujo a 1 ml, se anadio agua (700 pl) y se purifico por filtracion centrlfuga (AMICON PM 10000, 30 min, 14000 rpm). El proceso se repitio dos veces, hasta que las nanopartlculas estuvieron libres de sales y materiales de partida. El residuo en el filtro AMICON se disolvio en 500 pl de agua y se liofilizo para proporcionar 1,8 mg de nanopartlculas BMIX VI.
MET: diametro medio de 1,79 nm, 201 atomos de oro, 71 cadenas, PM = 73864.
Uso de nanopartlculas conjugadas con antlgeno para inducir una respuesta inmunitaria
Se usaron nanopartlculas BC11 I, II, III y IV para inocular ratones y se controlo la reaccion inmunitaria al antlgeno conjugado. Se inyectaron 30 pg nanopartlculas en 200 pl de adyuvante (Sigma M-6536-MPL+TDM). Se proporcionaron cuatro inyecciones de 2 x 100 pl los dlas 0, 28, 40 y 157. Las tres primeras se proporcionaron por via subcutanea y la inyeccion final por via intraperitoneal. Se extrajeron muestras de sangre el dla 39, 48 y 67 y se determino el tltulo de IgG contra HSA-Ley (Figuras 7 y 8). Existe una gran diferencia entre el resultado visto con BC11 I/II y BC11 III/IV. El aumento en el tltulo contra Ley en BC11 I/II es un efecto inespeclfico debido al uso del adyuvante. Tras la inmunizacion repetida los tltulos no aumentan, pero comienzan a disminuir. Por el contrario, con BC11 III/IV, los tltulos aumentan con la inmunizacion de refuerzo demostrando un efecto de inmunizacion real.
Se uso BC11 II para la inoculacion de la primovacunacion con toxoide tetanico. El dla 0, los animales fueron inyectados por via subcutanea con 2,35 UI de toxoide tetanico de Aventis Pasteur MSD-DIFTAVAX (2 viales completados hasta un total de 3,4 ml con solucion salina al 0,9 % y 100 pl administrados). El dla 14 se inyectaron 50 pg de nanopartlculas en 2 x 100 pl por via subcutanea en adyuvante (Sigma M-6536) y el dla 34 se inyectaron 50 pg de nanopartlculas en 2 x 100 pl por via intraperitoneal en adyuvante. Se extrajeron muestras de sangre el dla 33 y 44. Los resultados para 5 ratones se muestran en la Figura 9 (diferentes animales estan representados por diferentes senales). La primera flecha indica la primovacunacion con toxoide tetanico, la segunda flecha la inyeccion subcutanea con nanopartlculas y la tercera flecha la inyeccion intraperitoneal con nanopartlculas.
Ejemplo 2
Nanopartlculas de oro como estructuras inmunogenas
Se fabrican formulaciones de nanopartlculas de oro de acuerdo con las tecnicas que se describen en el documento WO 02/32404. Se prepararan diferentes construcciones de nanopartlculas de oro con una relacion de alfa-sialil- Tn:Lewis y = 30:3 y 3:30 con diversas densidades de la secuencia peptldica FKLQTMVKLFNRIKNNVA. El espacio de apoyo puede bloquearse usando Glc-C2. Como alternativa, el enlazador tambien puede tener la secuencia FKFQILYNSIMG.
La relacion de Sialil-Tn o Lewis y o una combinacion de ambos enlazadores tambien puede aumentarse usando la tecnica de acuerdo con el documento WO 02/32404. Por ejemplo, pueden unirse facilmente hasta varios cientos de grupos hidrato de carbono a la molecula nucleo. Las proporciones de diferentes ligandos pueden variarse facilmente. Como alternativa, tambien puede haber un solo hidrato de carbono de Sialil Tn o Lewis y unido covalentemente a la molecula nucleo.
Anticuerpos como estructuras inmunogenas
El acoplamiento de un hidrato de carbono de SialilTn a HE2 SialilTn-O(CH2)3NH(CH2)4COO-pNp se acoplo a HE2. Con el fin de aumentar el numero de ligandos de hidrato de carbono de SialilTn, pueden usarse enlazadores
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ramificados bien conocidos en la tecnica para acoplar los ligandos de hidrato de carbono en el anticuerpo. El producto final se analizo por SEC, LDS-PAGE, Transferencia Western y diferentes ensayos ELISA.
Seccion experimental
Materiales y metodos
HE2 Panorex, 10 mg/ml, SialilTn-O(CH2)3NH(CH2)4COO-pNp Lote 170901, 2 x 5 mg, Fa. Lectinity DMF (N,N- dimetilformamida (anhidra, Merck)
Tampon de acoplamiento: Na2HPO4 0,1 M + NaCl 0,15 M (pH = 8)
Tampon de formulacion: NaCl al 0,86 %+ Na2HPO4 1 mM (pH = 6,0).
Procedimiento
1. Se dializaron 100 mg de HE2 (V = 10 ml; Conc: 10 mg/ml) frente a 2x 700 ml usando Tampon de Acoplamiento usando un modulo de dialisis Slide-a-Lyzer a 4 °C durante 20 horas, hasta un volumen de ~10 ml, concentracion de acuerdo con SEC ~10 mg/ml.
2. Se disolvieron 2x 5 mg de SialilTn-O(CH2)3NH(CH2)4COO-pNp con 2x 100 pl de DMF (100 pl/vial).
3. La solucion de SialilTn (en DMF) se anadio a ~10 ml (~100 mg) de HE2 enfriado con hielo (en tampon de acoplamiento).
4. Ambos viales de SialilTn se aclararon con 100 pl de DMF (transferir del Vial 1 al Vial 2), que tambien se anadio a la mezcla de reaccion.
5. La mezcla de reaccion se hizo girar durante la noche (28 h) a +4 °C. La cinetica de la reaccion se observo mediante SEC (vease 5.3.1 y 6.3.1).
6. La solucion final de HE2-SialilTn (10 ml, ~10 mg/ml) se dializo frente a 2 x 800 ml de Tampon de Formulacion usando un modulo de dialisis Slide-a-Lyzer a 4 °C durante 20 horas.
Analisis
Cromatografia de exclusion molecular
Se cuantificaron concentraciones de HE2-SialilTn mediante cromatografia de exclusion molecular (SEC, del ingles Size Exclusion Chromatography) en una columna ZORBAX GF-250 en un sistema Dionex. El sistema de HPLC se sometio a ensayo con el patron de filtracion en gel (Fa. BioRad). Se uso HE2 como patron de referencia para la cuantificacion de HE2-SialilTn. La disminucion en el tiempo de retencion (se correlaciona con el aumento en el peso molecular) se correlaciona con la eficacia de la reaccion de acoplamiento de SialilTn a HE2. Los datos recibidos muestran que la eficacia de acoplamiento aumenta con el tiempo de reaccion alcanzando la saturacion en 23-27 horas.
LDS-PAGE (PAGE con Dodecilsulfato de litio)
LDS-PAGE con Bis-Tris-Gel (4-12 %) Tincion SilverXpress™: vease el manual de instrucciones "NuPAGE Bis-Tris- Gel", pagina 13. Los resultados se muestran en la Figura 7.
Calle
Muestra Conc. Volumenes [pl] Preparacion
1
Patron de PM 12 Mark - 10 Ninguna
2
HE2 dializado en tampon de Acoplamiento 20 pg/ml 10 Vease SOP
3
HE2 dializado en tampon de Acoplamiento 10 pg/ml 10 Vease SOP
4
HE2 dializado en tampon de Acoplamiento 50 pg/ml 10 Vease SOP
5
HE2 dializado en tampon de Acoplamiento 2,5 pg/ml 10 Vease SOP
6
HE2SiaTn dializado en tampon de Formulacion 20 pg/ml 10 Vease SOP
7
HE2SiaTn dializado en tampon de Formulacion 10 pg/ml 10 Vease SOP
8
HE2SiaTn dializado en tampon de Formulacion 5 pg/ml 10 Vease SOP
9
HE2SiaTn dializado en tampon de Formulacion 2,5 pg/ml 10 Vease SOP
10
Patron de PM 12 Mark - 10 Ninguna
Transferencia Western
Transferencia Western con IgG2a de conejo x raton
1. LDS-Gel con Bis-Tris-Gel (4-12 %)
2. Instrucciones de Transferencia Western, vease el manual de instrucciones NuPAGE Bis-Tris-Gel paginas 1420 (con membrana de transferencia de PVDF Immobilon 0,45 pm, Fa. Millipore)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
3. Desarrollo de la membrana:
Material:
Conjugado: IgG2a de conejo x raton - HRP, n.° 61-0220, Fa. Zymed
Solucion de tincion 1: 15 mg HRP - Reactivo de Color (Fa. BioRAD) en 5 ml de MetOH.
Solucion de tincion 2: 15 |jl de H2O2 al 30 % en 25 ml de PBS def. 1x
Procedimiento:
Bloquear la membrana con leche en polvo desnatada al 3 % en PBS durante 1 hora a TA.
Lavar la membrana con PBS.
Incubar con conjugado (diluido 1:1000 en PBS) durante 1 hora a TA.
Lavar la membrana con PBS.
Desarrollar con soluciones de tincion 1+2 y detener con agua.
Transferencia Western con CD175s anti SialilTn (tipo IgG)/IgG1 de rata x raton - HRP.
Procedimiento:
1. Gel de LDS-PAGE con Bis-Tris-Gel (4-12 %).
2. Transferencia de Western: Instrucciones vease el manual de instrucciones "NuPAGE Bis-Tris-Gel", pagina 1420 (usando membrana de transferencia de PVDF Immobilon 0,45 jm, Fa. Millipore)
3. Desarrollo de la membrana:
Material:
Ab secundario: CD175s anti-SialilTn (de tipo IgG), 90 jg/ml, Fa. DAKO, Codigo n.° M0899, Lote 089(601).
Conjugado: IgG1 de rata x raton - HRP, Fa. Becton Dickinson, Mat. n.° 559626, lote: 37205.
Leche en polvo desnatada al 3 % en PBS def. 1x.
Solucion de tincion 1: 15 mg de HRP - Reactivo de Color (Fa. BioRAD) en 5 ml de MetOH.
Solucion de tincion 2: 15 jl de H2O2 al 30 % en 25 ml de PbS.
Procedimiento:
Bloquear la membrana con leche en polvo desnatada al 3 % en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). Lavar la membrana con PBS.
Incubar con Ab secundario, (concentracion 10 jg/ml) V = 5 ml, durante 1 hora a TA.
Lavar la membrana con PBS.
Incubar con conjugado (diluido 1:1000 en PBS) durante 1 hora a TA.
Lavar la membrana con PBS.
Desarrollar con soluciones de tincion 1+2 y detener con agua.
El aumento en el peso molecular de la cadena pesada del anticuerpo HE2 despues del acoplamiento con SialilTn se confirmo mediante Transferencia Western y tincion con un anticuerpo IgG2a de conejo anti raton - HRP.
Se realizo un ELISA convencional con el fin de mostrar cuanta de la actividad de union anti-idiotlpica (de HE2) se conserva en el producto de acoplamiento
El IGN111 inmovilizado atrapa el HE2 anti-idiotlpico que se detecta mediante IgG2a anti-raton - HRP. Se demostro que el HE2 es aproximadamente 2-3 veces mas reactivo que el HE2-SialilTn, lo que indica que solo se produce una perdida muy moderada de la union despues del acoplamiento.
Se realizo un ELISA convencional adicional para detectar SialilTn mediante anti-SialilTn-anticuerpo de raton. En el mismo el material de partida HE2 y el producto de acoplamiento HE2-SialilTn se inmovilizan. Para la deteccion, se usan anti-SialilTn (IgG de raton)/IgG1 de rata anti raton - HRP para la deteccion de SialilTn.
Los resultados muestran que el producto de reaccion HE2-SialilTn en realidad lleva SialilTn a diferencia del HE2 antes del acoplamiento.
Conclusiones
Se ha acoplado SialilTn satisfactoriamente al anticuerpo HE2. La reaccion de acoplamiento tiene una cinetica de tiempo mas bien prolongada, alcanzando la saturacion aproximadamente despues de 24 horas. Se ha acoplado SialilTn principalmente a la cadena pesada del anticuerpo HE2, mientras que la cadena ligera solo se ha acoplado parcialmente con SialilTn. El producto de acoplamiento HE2-SialilTn conserva la mayor parte de la especificidad
idiotfpica de HE2 y la parte SialilTn de esta neoglucoprotelna es reconocida por anticuerpos especlficos de SialilTn. Los niveles de endotoxina estan por debajo del llmite de deteccion.
Referencias
5
[1] J. M. de la Fuente, A. G. Barrientos, T. C. Rojas, J. Canada, A. Fernandez, S. Penades, Angew. Chem. Int. Ed., 2001, 40, 2257.
[2] A. G. Barrientos, J. M. de la Fuente, T. C. Rojas, A. Fernandez, S. Penades, Chem. Eur. J., 2003, 9, 1909.
[3] M. J. Hostetler, J. E. Wingate, C. Z. Zhong, J. E. Harris, R. W. Vachet, M. R. Clark, J. D. Londono, S. J. Green, 10 J. J. Stokes, G. D. Wignall, G. L. Clish, M. D. Porter, N. D. Evans, R. W. Murray, Langmuir, 1998, 14, 17.
[4] Esta capa metanolica se concentro a presion reducida. El espectro de rMN-1H del residuo mostro la misma relacion inicial, aproximadamente, entre las senales de Glc, STn, Ley y BC11.

Claims (45)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Una nanopartlcuia que comprende un nucleo que incluye atomos metalicos y/o semiconductores, en la que el nucleo esta covalentemente unido a una pluralidad de ligandos y los ligandos comprenden
    al menos un antlgeno, y
    al menos un adyuvante peptldico que activa linfocitos T cooperadores, y en donde el nucleo de la nanopartlcula tiene un diametro medio de entre 0,5 y 10 nm.
  2. 2. La nanopartlcula de la reivindicacion 1, en donde la nanopartlcula comprende adicionalmente al menos un ligando que comprende un grupo monosacarldico.
  3. 3. La nanopartlcula de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que el adyuvante peptldico comprende un sitio de escision de proteasa.
  4. 4. La nanopartlcula de la reivindicacion 3, en la que el peptido comprende la secuencia de aminoacidos FKLQTMVKLFNRIKNNVA.
  5. 5. La nanopartlcula de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el antlgeno es un antlgeno especlfico de tumor.
  6. 6. La nanopartlcula de la reivindicacion 5, en la que el antlgeno es un antlgeno de hidrato de carbono.
  7. 7. La nanopartlcula de la reivindicacion 6, en la que el antlgeno esta sialilado.
  8. 8. La nanopartlcula de la reivindicacion 7, en la que el antlgeno es sialil Tn, sialil Lewis a, sialil Lewis x o sialil Lewis
    y.
  9. 9. La nanopartlcula de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el antlgeno es un antlgeno especlfico de patogeno.
  10. 10. La nanopartlcula de la reivindicacion 9, en la que el patogeno es una bacteria, un virus o un parasito.
  11. 11. La nanopartlcula de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que al menos uno de los ligandos esta unido a la nanopartlcula a traves de un grupo enlazador.
  12. 12. La nanopartlcula de la reivindicacion 11, en la que el grupo enlazador comprende un grupo tiol, un grupo alquilo, un grupo glicol o un grupo peptldico.
  13. 13. La nanopartlcula de la reivindicacion 12, en la que el grupo enlazador comprende alquilo C2-C15 y/o glicol C2- C15.
  14. 14. La nanopartlcula de la reivindicacion 13, en la que el grupo enlazador es alquilo C2-C15 o hexaetilenglicol-alquilo C11.
  15. 15. La nanopartlcula de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la nanopartlcula comprende un marcador.
  16. 16. La nanopartlcula de la reivindicacion 15, en la que el marcador es un grupo fluorescente, un radionuclido, un marcador magnetico, un colorante, un atomo activo en RMN o un atomo que es susceptible de deteccion usando resonancia de plasmon superficial.
  17. 17. La nanopartlcula de la reivindicacion 16, en la que el marcador magnetico es un grupo paramagnetico que comprende Mn+2, Gd+3, Eu+2, Cu+2, V+2, Co+2, Ni+2, Fe+ , Fe+3 o lantanidos+3
  18. 18. La nanopartlcula de la reivindicacion 16, en la que el atomo activo en RMN es Mn , Gd , Eu , Cu , V , Co , Ni+2, Fe+2, Fe+3 o lantanidos+3.
  19. 19. La nanopartlcula de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la nanopartlcula es hidrosoluble.
  20. 20. La nanopartlcula de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el nucleo de la nanopartlcula tiene un diametro medio de entre 1 y 2,5 nm.
  21. 21. La nanopartlcula de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la nanopartlcula incluyendo sus ligandos tiene un diametro medio de entre 10 y 30 nm.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
  22. 22. La nanopartlcuia de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el nucleo es un nucleo metalico.
  23. 23. La nanopartlcula de la reivindicacion 22, en la que el nucleo metalico comprende Au, Ag o Cu.
  24. 24. La nanopartlcula de la reivindicacion 22 o la reivindicacion 23, en la que el nucleo metalico es una aleacion seleccionada entre Au/Ag, Au/Cu, Au/Ag/Cu, Au/Pt, Au/Pd, Au/Ag/Cu/Pd, Au/Fe, Au/Cu, Au/Gd, Au/Fe/Cu, Au/Fe/Gd o Au/Fe/Cu/Gd.
  25. 25. La nanopartlcula de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en donde el nucleo de la nanopartlcula es magnetico.
  26. 26. La nanopartlcula de la reivindicacion 25, en donde la nanopartlcula comprende atomos metalicos pasivos y atomos metalicos magneticos en el nucleo en una relacion de entre 5:0,1 y 2:5.
  27. 27. La nanopartlcula de la reivindicacion 26, en la que el metal pasivo es oro, platino, plata o cobre y el metal magnetico es hierro o cobalto.
  28. 28. La nanopartlcula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en la que el nucleo comprende atomos semiconductores.
  29. 29. La nanopartlcula de la reivindicacion 28, en la que los atomos semiconductores son capaces de actuar como un punto cuantico.
  30. 30. La nanopartlcula de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los ligandos comprenden ademas un peptido, un dominio de protelna, un segmento de acido nucleico, un glucollpido o una glucoprotelna.
  31. 31. La nanopartlcula de la reivindicacion 30, en la que dicho segmento de acido nucleico comprende ADN o ARN.
  32. 32. Una composition que comprende una poblacion de una o mas de las nanopartlculas de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
  33. 33. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 32 que comprende adicionalmente un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
  34. 34. Un metodo de preparation de nanopartlculas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 mediante la conjugation del dicho al menos un antlgeno y el dicho al menos un adyuvante peptldico que activa linfocitos T cooperadores con el nucleo de la nanopartlcula, comprendiendo el metodo:
    derivatizar el antlgeno con un enlazador; derivatizar el adyuvante peptldico con un enlazador; y
    hacer reaccionar el antlgeno y el adyuvante peptldico derivatizados con enlazador con reactivos para producir el nucleo de la nanopartlcula de manera que durante el autoensamblaje de las nanopartlculas, los nucleos de nanopartlculas se unan al antlgeno y el adyuvante peptldico a traves del enlazador.
  35. 35. El metodo de la reivindicacion 34, en el que el grupo enlazador comprende un grupo tiol, un grupo alquilo, un grupo glicol o un grupo peptldico.
  36. 36. El metodo de la reivindicacion 34, en el que el grupo enlazador comprende alquilo C2-C15 y/o glicol C2-C15.
  37. 37. El metodo de la reivindicacion 34, en el que el grupo enlazador es alquilo C2-C15 o hexaetilenglicol-alquilo C11.
  38. 38. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37, en el que la mezcla de reaction comprende el antlgeno derivatizado, el adyuvante derivatizado, una sal de los atomos metalicos y/o semiconductores y un agente reductor para producir las nanopartlculas.
  39. 39. Nanopartlculas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, o una composicion de la reivindicacion 32 o la reivindicacion 33, para su uso en terapia preventiva o paliativa.
  40. 40. Nanopartlculas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, o una composicion de la reivindicacion 32 o la reivindicacion 33, para su uso como una vacuna.
  41. 41. Las nanopartlculas de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 para su uso en el tratamiento del cancer.
  42. 42. Las nanopartlculas para el uso de la reivindicacion 41, en donde el cancer es cancer de colon, pancreas, intestino, pulmon, hlgado, ovario o vejiga.
  43. 43. Las nanopartlcuias de la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10 para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa.
  44. 44. Las nanopartlculas para el uso de la reivindicacion 43, en donde la enfermedad es la malaria o la tuberculosis.
    5
  45. 45. Las nanopartlculas para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44, en donde las nanopartlculas comprenden una senal de translocacion de membrana de manera que sean capaces de penetrar a traves de la membrana celular.
ES05788525.3T 2004-10-01 2005-09-30 Nanopartículas que comprenden antígenos y adyuvantes capaces de estimular linfocitos T cooperadores Active ES2625905T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US61518204P 2004-10-01 2004-10-01
US615182P 2004-10-01
US69223205P 2005-06-21 2005-06-21
US692232P 2005-06-21
PCT/GB2005/003791 WO2006037979A2 (en) 2004-10-01 2005-09-30 Nanoparticles comprising antigens and adjuvants and immunogenic structure

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2625905T3 true ES2625905T3 (es) 2017-07-20

Family

ID=35929602

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES05788525.3T Active ES2625905T3 (es) 2004-10-01 2005-09-30 Nanopartículas que comprenden antígenos y adyuvantes capaces de estimular linfocitos T cooperadores

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9079765B2 (es)
EP (1) EP1793863B1 (es)
JP (1) JP5117191B2 (es)
AU (1) AU2005291058B2 (es)
CA (1) CA2582668C (es)
ES (1) ES2625905T3 (es)
WO (1) WO2006037979A2 (es)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8900497B2 (en) 2001-10-12 2014-12-02 Monosol Rx, Llc Process for making a film having a substantially uniform distribution of components
US8765167B2 (en) 2001-10-12 2014-07-01 Monosol Rx, Llc Uniform films for rapid-dissolve dosage form incorporating anti-tacking compositions
US20110033542A1 (en) 2009-08-07 2011-02-10 Monosol Rx, Llc Sublingual and buccal film compositions
US20190328679A1 (en) 2001-10-12 2019-10-31 Aquestive Therapeutics, Inc. Uniform films for rapid-dissolve dosage form incorporating anti-tacking compositions
US10285910B2 (en) 2001-10-12 2019-05-14 Aquestive Therapeutics, Inc. Sublingual and buccal film compositions
US11207805B2 (en) 2001-10-12 2021-12-28 Aquestive Therapeutics, Inc. Process for manufacturing a resulting pharmaceutical film
US8603514B2 (en) 2002-04-11 2013-12-10 Monosol Rx, Llc Uniform films for rapid dissolve dosage form incorporating taste-masking compositions
US7357891B2 (en) 2001-10-12 2008-04-15 Monosol Rx, Llc Process for making an ingestible film
US8900498B2 (en) 2001-10-12 2014-12-02 Monosol Rx, Llc Process for manufacturing a resulting multi-layer pharmaceutical film
US20070281003A1 (en) 2001-10-12 2007-12-06 Fuisz Richard C Polymer-Based Films and Drug Delivery Systems Made Therefrom
WO2007001448A2 (en) 2004-11-04 2007-01-04 Massachusetts Institute Of Technology Coated controlled release polymer particles as efficient oral delivery vehicles for biopharmaceuticals
EP1919507A2 (en) * 2005-08-04 2008-05-14 Thomas William Rademacher Nanoparticles comprising antibacterial ligands
WO2007070682A2 (en) 2005-12-15 2007-06-21 Massachusetts Institute Of Technology System for screening particles
CA2648099C (en) 2006-03-31 2012-05-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc System for targeted delivery of therapeutic agents
ATE517613T1 (de) * 2006-04-13 2011-08-15 Midatech Ltd Nanoteilchen mit drei verschiedenen liganden zur auslösung einer immunantwort gegen infektiöse mittel
EP2019691B1 (en) 2006-05-15 2020-08-12 Massachusetts Institute of Technology Polymers for functional particles
WO2007150030A2 (en) 2006-06-23 2007-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Microfluidic synthesis of organic nanoparticles
AT504160A1 (de) * 2006-09-11 2008-03-15 Ralf Dr Kircheis Verwendung einer mehrkomponenten-tumorvakzine
US9217129B2 (en) 2007-02-09 2015-12-22 Massachusetts Institute Of Technology Oscillating cell culture bioreactor
US10265407B2 (en) 2007-02-15 2019-04-23 Yale University Modular nanodevices for smart adaptable vaccines
WO2008115641A2 (en) * 2007-02-15 2008-09-25 Yale University Modular nanoparticles for adaptable vaccines
EP2144600A4 (en) 2007-04-04 2011-03-16 Massachusetts Inst Technology POLY (AMINIC ACID) TARGET MOLECULES
BRPI0817664A2 (pt) 2007-10-12 2015-03-24 Massachusetts Inst Technology Nanopartículas, método para preparar nanopartículas e método para tratar terapeuticamente ou profilaticamente um indivíduo
EP2711021B1 (en) * 2008-05-02 2016-03-09 BliNK Therapeutics Limited Products and methods for stimulating an immune response
US8343498B2 (en) 2008-10-12 2013-01-01 Massachusetts Institute Of Technology Adjuvant incorporation in immunonanotherapeutics
US8343497B2 (en) 2008-10-12 2013-01-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Targeting of antigen presenting cells with immunonanotherapeutics
US8591905B2 (en) 2008-10-12 2013-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Nicotine immunonanotherapeutics
US8277812B2 (en) 2008-10-12 2012-10-02 Massachusetts Institute Of Technology Immunonanotherapeutics that provide IgG humoral response without T-cell antigen
MX2011012597A (es) 2009-05-27 2012-04-19 Selecta Biosciences Inc Nanoportadores que poseen componentes con diferentes tasas de liberacion.
KR101873179B1 (ko) * 2009-08-26 2018-06-29 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. Ｔ－세포 도움을 유도하는 조성물
EP2305310A1 (en) 2009-09-25 2011-04-06 Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Biomateriales - CIC biomaGUNE Gold -coated magnetic glyconanoparticles functionalised with proteins for use as diagnostic and therapeutic agents
CN107080839A (zh) 2010-05-26 2017-08-22 西莱克塔生物科技公司 多价的合成纳米载体疫苗
JP5819949B2 (ja) * 2010-06-10 2015-11-24 ミダテック リミテッド ナノ粒子フィルム送達システム
CA2802031C (en) * 2010-06-10 2015-05-12 Midatech Limited Peptide-carrying nanoparticles
US9149959B2 (en) 2010-10-22 2015-10-06 Monosol Rx, Llc Manufacturing of small film strips
EP2640190A4 (en) 2010-11-05 2016-05-11 Selecta Biosciences Inc MODIFIED NICOTINIC COMPOUNDS AND ASSOCIATED METHODS
US9511151B2 (en) * 2010-11-12 2016-12-06 Uti Limited Partnership Compositions and methods for the prevention and treatment of cancer
CN103702687A (zh) 2011-07-29 2014-04-02 西莱克塔生物科技公司 产生体液和细胞毒性t淋巴细胞（ctl）免疫应答的合成纳米载体
EA201490520A1 (ru) * 2011-09-07 2014-09-30 Мидатек Лимитед Противоопухолевые вакцины на основе наночастиц
ES2627507T3 (es) * 2011-09-07 2017-07-28 Midatech Ltd. Composiciones de nanopartícula-péptido
US10988516B2 (en) 2012-03-26 2021-04-27 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating inflammation
EP2841098A4 (en) 2012-04-23 2016-03-02 Allertein Therapeutics Llc NANOPARTICLES FOR THE TREATMENT OF ALLERGIES
ES2453205B1 (es) * 2012-09-04 2015-03-13 Univ Valencia Politecnica Liberacion de sustancias en celulas senescentes
US9603948B2 (en) 2012-10-11 2017-03-28 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders
GB201301991D0 (en) 2013-02-05 2013-03-20 Midatech Ltd Permeation enhanced active-carrying nanoparticles
GB201302427D0 (en) 2013-02-12 2013-03-27 Midatech Ltd Nanoparticle delivery compositions
GB201303787D0 (en) 2013-03-04 2013-04-17 Midatech Ltd Nanoparticle peptide compositions
GB201303771D0 (en) 2013-03-04 2013-04-17 Midatech Ltd Nanoparticles peptide compositions
EP2981285B1 (en) 2013-04-03 2020-06-03 N-Fold Llc Novel nanoparticle compositions
WO2014178195A1 (ja) 2013-05-02 2014-11-06 独立行政法人産業技術総合研究所 糖鎖抗原の免疫誘導剤
US20150065694A1 (en) * 2013-08-30 2015-03-05 United States Department Of Energy Preassembled hybrid nanocluster plasmonic resonator for immunological detection and serotyping of virus and microbes
EP3065771B1 (en) 2013-11-04 2019-03-20 UTI Limited Partnership Methods and compositions for sustained immunotherapy
GB201401706D0 (en) 2014-01-31 2014-03-19 Midatech Ltd Nanoparticle-insulin and insulin analogue compositions
KR20160132034A (ko) 2014-03-13 2016-11-16 우니페르시테트 바젤 미엘린-관련 당단백질에 대한 IgM 항체와 결합하는 탄수화물 리간드
CN106668853A (zh) * 2014-07-25 2017-05-17 武汉博沃生物科技有限公司 一种肺炎球菌缀合疫苗及其制备方法
US10688125B2 (en) 2014-12-23 2020-06-23 Midatech Ltd. Nanoparticles and their use in cancer therapy
WO2016123365A1 (en) 2015-01-30 2016-08-04 The Regents Of The University Of Michigan Liposomal particles comprising biological molecules and uses thereof
CA2979712C (en) 2015-03-25 2024-01-23 The Regents Of The University Of Michigan Nanoparticle compositions for delivery of biomacromolecules
US12011480B2 (en) 2015-05-06 2024-06-18 Uti Limited Partnership Nanoparticle compositions for sustained therapy
GB2541166A (en) 2015-07-24 2017-02-15 Midatech Ltd Nanoparticle-based liver-targeting therapy and imaging
US11091591B2 (en) 2015-09-16 2021-08-17 Universität Basel Carbohydrate ligands that bind to antibodies against glycoepitopes of glycosphingolipids
US11273131B2 (en) 2016-05-05 2022-03-15 Aquestive Therapeutics, Inc. Pharmaceutical compositions with enhanced permeation
JP2019519487A (ja) 2016-05-05 2019-07-11 アクエスティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 送達増強エピネフリン組成物
US20210106538A1 (en) * 2016-06-20 2021-04-15 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for delivery of biomacromolecule agents
AU2017306328B2 (en) * 2016-08-05 2021-05-06 Shenzhen Profound-View Pharma Tech Co., Ltd. Substance containing gold cluster and preparation method and use thereof
WO2018127689A1 (en) 2017-01-03 2018-07-12 Emergex Vaccines Holdings Ltd Universal influenza vaccine compositions
GB201701745D0 (en) 2017-02-02 2017-03-22 Midatech Ltd Nanoparticle-based liver-targeting therapy and imaging
EP3684405A2 (en) 2017-09-21 2020-07-29 Emergex Vaccines Holdings Ltd MHC Class I Associated Peptides for Prevention and Treatment of Zika Virus
WO2019135086A1 (en) * 2018-01-06 2019-07-11 Emergex Vaccines Holding Limited Mhc class i associated peptides for prevention and treatment of multiple flavi virus
CN112292148A (zh) * 2018-03-29 2021-01-29 埃默杰克斯疫苗控股有限公司 疫苗组合物
US20210283237A1 (en) 2018-03-29 2021-09-16 Emergex Vaccines Holding Limited Vaccine compositions
WO2019220150A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Emergex Vaccines Holding Limited Reverse peptide vaccine
GB201819430D0 (en) 2018-11-29 2019-01-16 Midatech Ltd Therapeutic compounds, nanoparticles and uses thereof
GB201820470D0 (en) 2018-12-14 2019-01-30 Midatech Ltd Antifolate-carrying nanoparticles and their use in medicine
GB201820471D0 (en) 2018-12-14 2019-01-30 Midatech Ltd Nanoparticle-based therapy of inflammatory disorders
CN110618093B (zh) * 2019-08-16 2022-06-17 深圳大学 一种纳米探针综合体系在肿瘤标志物检测试剂盒中的应用
EP3909612A1 (en) 2020-05-12 2021-11-17 Life Science Inkubator Betriebs GmbH & Co. KG Composition of nanoparticles
GB202008250D0 (en) 2020-06-02 2020-07-15 Emergex Vaccines Holding Ltd Diagnosis, prevention and treatment of coronavirus infection
WO2022175330A1 (en) 2021-02-16 2022-08-25 Emergex Vaccines Holding Limited Reverse peptides from coronavirus for immunogenic purposes
US20240269264A1 (en) 2021-06-02 2024-08-15 Emergex Vaccines Holding Limited Human coronavirus 229e derived peptides

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8924438D0 (en) * 1989-10-31 1989-12-20 Hoffmann La Roche Vaccine composition
CA2285018C (en) * 1997-03-27 2011-01-04 Institut Pasteur Multiple antigen glycopeptide carbohydrate, vaccine comprising the same and use thereof
CA2329859A1 (en) * 1998-04-20 1999-12-02 Allen C. Templeton Nanometer particles containing a reactive monolayer
US7192778B2 (en) * 1999-10-06 2007-03-20 Natan Michael J Surface enhanced spectroscopy-active composite nanoparticles
GB0025414D0 (en) * 2000-10-16 2000-11-29 Consejo Superior Investigacion Nanoparticles
US7332586B2 (en) * 2001-07-10 2008-02-19 North Carolina State University Nanoparticle delivery vehicle
AU2003215388A1 (en) * 2002-02-22 2003-09-09 Purdue Research Foundation Magnetic nanomaterials and methods for detection of biological materials
IL165033A0 (en) * 2002-05-07 2005-12-18 Univ California Bioactivation of particles
WO2004071493A1 (en) * 2003-02-17 2004-08-26 Peter Burkhard Peptidic nanoparticles as drug delivery and antigen display systems
WO2005002643A2 (en) * 2003-06-24 2005-01-13 Johns Hopkins University Method and products for delivering biological molecules to cells using multicomponent nanostructures

Also Published As

Publication number Publication date
CA2582668A1 (en) 2006-04-13
WO2006037979A3 (en) 2007-04-05
JP5117191B2 (ja) 2013-01-09
WO2006037979A2 (en) 2006-04-13
US20090104268A1 (en) 2009-04-23
JP2008514686A (ja) 2008-05-08
US9079765B2 (en) 2015-07-14
CA2582668C (en) 2013-10-01
AU2005291058A1 (en) 2006-04-13
AU2005291058B2 (en) 2011-09-29
EP1793863A2 (en) 2007-06-13
EP1793863B1 (en) 2017-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2625905T3 (es) Nanopartículas que comprenden antígenos y adyuvantes capaces de estimular linfocitos T cooperadores
JP6479744B2 (ja) 二酸化ケイ素ナノ粒子およびワクチン接種のためのその使用
ES2346319T3 (es) Nanoparticulas.
KR102001269B1 (ko) 나노입자-펩티드 조성물
AU2004289210B2 (en) Carbohydrate antigen-nanoparticle conjugates and uses thereof as antimetastatic agents in treating cancer
CN101123990A (zh) 包含抗原和佐剂的纳米颗粒，和免疫原性结构
AU2005209318B2 (en) Functionalized colloidal metal compositions and methods
ES2441235T3 (es) Nanopartículas magnéticas
Yang et al. A new concept of enhancing immuno-chemotherapeutic effects against B16F10 tumor via systemic administration by taking advantages of the limitation of EPR effect
US9394369B2 (en) Luminescent porous silicon nanoparticles for targeted delivery and immunization
AU2002259107B2 (en) Colloidal metal compositions and methods
EP4062935A1 (en) Theranostic system for directed diffusion of therapeutic and imaging agents to cancer cells
TW201018487A (en) Peptide ligand directed drug delivery
WO2005012363A1 (ja) 標的化された炎症惹起剤
AU2008202025A1 (en) Magnetic nanoparticles