ES2627507T3 - Composiciones de nanopartícula-péptido - Google Patents

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ES2627507T3 ES12756725.3T ES12756725T ES2627507T3 ES 2627507 T3 ES2627507 T3 ES 2627507T3 ES 12756725 T ES12756725 T ES 12756725T ES 2627507 T3 ES2627507 T3 ES 2627507T3
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Abstract

Una nanopartícula que comprende: (i) un núcleo que comprende un metal y/o un átomo semiconductor; (ii) una corona que comprende una pluralidad de ligandos unidos covalentemente al núcleo, en donde al menos un primer ligando de dicha pluralidad comprende un resto de hidrato de carbono que está unido covalentemente al núcleo mediante un primer conector o comprende glutatión, y en donde al menos un segundo ligando de dicha pluralidad comprende un péptido de elección que está unido covalentemente al núcleo mediante un segundo conector, comprendiendo dicho segundo conector: una porción de péptido y una porción no de péptido, en donde dicha porción de péptido de dicho segundo conector comprende la secuencia X1X2Z1, en la que: X1 es un aminoácido seleccionado de A y G; X2 es un aminoácido seleccionado de A y G; y Z1 es un aminoácido seleccionado de Y y F.

Description

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nanopartícula usando la radiactividad emitida por el radionúclido, por ejemplo usando PET, SPECT, o para su uso en terapia, es decir, para destruir células diana. Ejemplos de radionúclidos comúnmente usados en la materia que podrían ser fácilmente adaptados para su uso en la presente invención incluyen 99mTc, que existe en varios estados de oxidación aunque el más estable es TcO4-; 32P o 33P; 57Co; 59Fe; 67Cu que se usa frecuentemente como sales de
5 Cu2+; 67Ga que se usa comúnmente como una sal de Ga3+, por ejemplo citrato de galio; 68Ge; 82Sr; 99Mo; 103Pd; 111In que se usa generalmente como sales de In3+; 125I o 131I que se usa generalmente como yoduro de sodio; 137Cs; 71Lu3+
153Gd; 153Sm; 158Au; 186Re; 201Tl generalmente usado como una sal de Tl+ tal como cloruro de talio; 39Y3+; ; y 24Cr2+
. El uso general de radionúclidos como marcas y trazadores es muy conocido en la técnica y podría ser fácilmente adaptado por el experto para su uso en los aspectos de la presente invención. Los radionúclidos pueden emplearse lo más fácilmente dopando los núcleos de las nanopartículas o incluyéndolos como marcas presentes como parte de ligandos inmovilizados sobre las nanopartículas.
Adicionalmente o alternativamente, las nanopartículas de la presente invención, o los resultados de sus interacciones con otras especies, pueden detectarse usando varias técnicas muy conocidas en la técnica usando 15 una marca asociada a la nanopartícula como se indica anteriormente o empleando una propiedad de ellas. Estos métodos de detección de nanopartículas pueden oscilar de detectar la agregación que resulta cuando las nanopartículas se unen a otra especie, por ejemplo por simple inspección visual o usando dispersión de la luz (transmitancia de una solución que contiene las nanopartículas), a usar técnicas sofisticadas tales como microscopía electrónica de transmisión (TEM) o microscopía de fuerza atómica (AFM) para visualizar las nanopartículas. Otro método de detección de partículas metálicas es emplear resonancia de plasmones, que es la excitación de electrones en la superficie de un metal, normalmente producida por radiación óptica. El fenómeno de resonancia de plasmones superficiales (SPR) existe en la interfase de un metal (tal como Ag o Au) y un material dieléctrico tal como aire o agua. Como se producen cambios en SPR a medida que los analitos se unen al ligando inmovilizado sobre la superficie de una nanopartícula que cambia el índice de refracción de la interfase. Otra ventaja de SPR es
25 que puede usarse para monitorizar interacciones en tiempo real. Como se ha mencionado anteriormente, si las nanopartículas incluyen o se dopan con átomos que son activos para RMN, entonces esta técnica puede usarse para detectar las partículas, tanto in vitro como in vivo, usando técnicas muy conocidas en la técnica. Las nanopartículas también pueden detectarse usando un sistema basado en la amplificación de señales cuantitativas usando la reducción promovida por nanopartículas de plata (I). Puede usarse espectroscopía de fluorescencia si las nanopartículas incluyen ligandos como sondas fluorescentes. Por tanto, puede usarse marcado isotópico del hidrato de carbono para facilitar su detección.
Péptido de elección
35 La nanopartícula de la presente invención comprende un ligando que contiene péptido ("dicho segundo ligando") que se une covalentemente al núcleo de la nanopartícula mediante un conector ("dicho segundo conector"). El segundo ligando comprende un péptido que puede estar previsto para administración intracelular. Este "péptido de elección" puede ser cualquier péptido adecuado. En particular, el péptido puede ser un fragmento de un polipéptido mayor que es capaz de ejercer un efecto cuando se administra a un sitio intracelular. En ciertos casos, el péptido de elección puede ser un fármaco basado en péptido. En ciertos casos, el péptido de elección puede comprender un epítopo (un "péptido epitópico") que da lugar a una respuesta inmunitaria cuando se administra a, por ejemplo, un compartimento intracelular de una APC. En ciertos casos preferidos, el péptido de elección puede ser un péptido que se une a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I o es capaz de ser procesado para unirse a una molécula de MHC de clase I. En algunos casos según la presente invención, el péptido de
45 elección puede consistir en una secuencia de 8 a 40 restos de aminoácidos, tales como una secuencia de 8 a 12 restos de aminoácidos. En ciertos casos, el péptido de elección puede ser capaz de ser presentado por una molécula de MHC de clase I de manera que estimule una respuesta linfocitos T citotóxicos (CTL). Tales péptidos epitópicos pueden formar al menos una porción de, o derivarse de, un antígeno asociado a tumor (TAA) o un antígeno asociado a patógeno (por ejemplo, un antígeno viral, bacteriano o parásito). En algunos casos, el péptido de elección puede ser un fármaco de péptido, tal como un péptido que se dirige a diana intracelular. Un ejemplo de un péptido de direccionamiento intracelular es el inhibidor del dominio GIPC-PDZ descrito en Muders et al., 2009, Clin Cancer Res, Vol. 15(12), pp. 4095-4103.
Administración y tratamiento
55 Las nanopartículas y composiciones de la invención pueden formularse para administración a pacientes por cualquier número de vías diferentes, que incluyen vías enterales o parenterales. La administración parenteral incluye administración por las siguientes vías: intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular, intraocular, transepitelial, intraperitoneal y tópica (incluyendo dérmica, ocular, rectal, nasal, inhalación y aerosol), y vías sistémicas rectales.
La administración se realiza, por ejemplo, mediante inyección, o balísticamente usando una pistola de administración para acelerar su paso transdérmico a través de la capa externa de la epidermis. Las nanopartículas pueden entonces ser captadas, por ejemplo, por células dendríticas, que maduran a medida que migran a través del sistema 65 linfático, produciendo la modulación de la respuesta inmunitaria y la vacunación contra el péptido epitópico y/o el antígeno del que se derivó el péptido epitópico o del que forma una parte. Las nanopartículas también pueden
8
administrarse en aerosoles. Esto se hace posible por el pequeño tamaño de las nanopartículas.
El tamaño excepcionalmente pequeño de las nanopartículas de la presente invención es una gran ventaja para la administración a células y tejidos, ya que pueden ser captadas por células incluso cuando se unen a moléculas de
5 direccionamiento o terapéuticas. Así, las nanopartículas pueden ser internalizadas por células tales como APC, los péptidos procesados y liberados, por ejemplo para la presentación mediante MHC de clase I o para la interacción con componentes intracelulares.
Las nanopartículas de la invención pueden formularse como composiciones farmacéuticas que pueden estar en las formas de composiciones sólidas o líquidas. Tales composiciones generalmente comprenderán un vehículo de algún tipo, por ejemplo un vehículo sólido tal como gelatina o un adyuvante o un diluyente inerte, o un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Pueden incluirse solución salina fisiológica, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Tales composiciones y preparaciones generalmente contienen al menos 0,1 % en peso del compuesto.
15 Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el sitio de aflicción, el principio activo estará en forma de una solución acuosa aceptable por vía parenteral que está libre de pirógenos y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Aquellos de habilidad relevante en la materia son muy capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, soluciones de los compuestos o un derivado de los mismos, por ejemplo en solución salina fisiológica, una dispersión preparada con glicerol, polietilenglicol líquido o aceites.
Además de uno o más de los compuestos, opcionalmente en combinación con otro principio activo, las composiciones pueden comprender uno o más de un excipiente, vehículo, tampón, estabilizador, agente isotonizante, conservante o antioxidante farmacéuticamente aceptable, u otros materiales muy conocidos para
25 aquellos expertos en la materia. Tales materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material puede depender de la vía de administración, por ejemplo, por vía oral o por vía parenteral.
Las composiciones farmacéuticas líquidas normalmente se formulan para tener un pH entre aproximadamente 3,0 y 9,0, más preferentemente entre aproximadamente 4,5 y 8,5 y todavía más preferentemente entre aproximadamente 5,0 y 8,0. El pH de una composición puede mantenerse usando un tampón tal como acetato, citrato, fosfato, succinato, Tris o histidina, normalmente empleado en el intervalo de aproximadamente 1 mM a 50 mM. El pH de las composiciones puede ajustarse de otro modo usando ácidos o bases fisiológicamente aceptables.
35 Generalmente se incluyen conservantes en las composiciones farmacéuticas para retardar el crecimiento microbiano, prolongar la estabilidad en almacén de las composiciones y permitir envases de múltiples usos. Ejemplos de conservantes incluyen fenol, meta-cresol, alcohol bencílico, ácido para-hidroxibenzoico y sus ésteres, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio. Los conservantes normalmente se emplean en el intervalo de aproximadamente el 0,1 al 1,0 % (peso/volumen).
Preferentemente, las composiciones farmacéuticas se formulan para la administración a un individuo en una cantidad profilácticamente eficaz o una cantidad terapéuticamente eficaz (según sea el caso, aunque la profilaxis puede considerarse terapia), siendo esto suficiente para mostrar beneficios al individuo. Normalmente, esto será para producir una actividad terapéuticamente útil que proporciona beneficio al individuo. La actual cantidad de los 45 compuestos administrados, y la tasa y transcurso de tiempo de administración, dependerán de la naturaleza y gravedad de la afección que está tratándose. La prescripción de tratamiento, por ejemplo decisiones sobre dosificación, etc., está dentro de la responsabilidad de los médicos generales y otros doctores médicos, y normalmente tiene en cuenta el trastorno que va a tratarse, la afección del paciente individual, el sitio de administración, el método de administración y otros factores conocidos para los médicos. Ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente pueden encontrarse en Handbook of Pharmaceutical Additives, 2ª Edición (eds. M. Ash y I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, Nueva York, EE.UU.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 20ª Edición, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2ª edición, 1994. A modo de ejemplo, y las composiciones se administran preferentemente a pacientes en dosificaciones de entre aproximadamente 0,01 y 100 mg de compuesto activo por kg de peso corporal, y más
55 preferentemente entre aproximadamente 0,5 y 10 mg/kg de peso corporal.
Se entenderá que donde se refiere al tratamiento de tumores, el tratamiento incluye cualquier medida tomada por el médico para aliviar el efecto del tumor sobre un paciente. Así, aunque la remisión completa del tumor es un objetivo deseable, el tratamiento eficaz también incluirá cualquier medida capaz de lograr la remisión parcial del tumor, además de un ralentizamiento en la tasa de crecimiento de un tumor que incluye metástasis. Tales medidas pueden ser eficaces en prolongar y/o potenciar la calidad de vida y aliviar los síntomas de la enfermedad.
Inmunoterapia
65 Las composiciones de la invención, tales como las vacunas como se define en las reivindicaciones, pueden en algunos casos ser para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades tales como cáncer, y más particularmente para
9
imagen7
Esto es altamente beneficioso en ciertas circunstancias, ya que se considera que varios adyuvantes son tóxicos o de otro modo inadecuados para uso humano.
Ejemplos
5
Ejemplo 1 -Síntesis y caracterización de nanopartículas
Se dan a continuación ligandos de prueba y sus números de identificación (peso molecular);
SIINFEKL (963) (SEQ ID NO: 2)
10 SIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1021) FLSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1280) (SEQ ID NO: 3) FLAAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1587) (SEQ ID NO: 4) AAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1325) (SEQ ID NO: 5) HS(CH2)2-CONH-SIINFEKL (1051)
15 HS(CH2)2-CONH-FLSIINFEKL (1309) HS(CH2)2-CONH-FLAAYSIINFEKL (1616) HS(CH2)2-CONH-AAYSIINFEKL (1356) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-SIINFEKL (1471) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLSIINFEKL (1732)
20 HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYSIINFEKL (2034) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYSIINFEKL (1774)
Se sintetizaron NP de prueba usando 10 µmoles de cloruro de oro (Aldrich 484385), 30 µmoles de glucosa con un conector de tioetilo (GlcC2) y 1,5 µmoles de ligando de péptido (variable 1,5-3 mg).
25 Se usó el siguiente método; Se disolvieron 1,5 µmoles de péptido en 2 ml de metanol, seguido de la adición de 30 µmoles de GlcC2 en 200 µl de metanol, y 116 µl de cloruro de oro acuso que contiene 10 µmoles de Au. La muestra se agitó con vórtex durante 30 s, se agitó durante aproximadamente 5 min y luego bajo agitación con vórtex rápida durante un total de 30 s. Se añadieron 200 µl de NaBH4 1 M, se taparon los tubos y entonces se agitaron
30 suavemente durante 1,5 h.
Las muestras se centrifugaron en la mesa, se eliminó el sobrenadante y el sedimento oscuro se disolvió en 2 ml de agua, y entonces se transfirió a una Vivaspin de 10 kDa durante un total de 4 veces. Lavados con 2 ml de agua cada uno de 8 min a 5 Krpm. Se eliminaron las nanopartículas (NP) de las Vivaspin y se enrasaron a 500 µl con agua,
35 entonces se sometieron a centrifugación en mesa de 15 Krpm para eliminar cualquier agregado grande.
El contenido de oro después de la centrifugación/producción por el ensayo interno se muestra a continuación, 100 % de rendimiento sería 1,97 mg;
NP
mg de Au totales
2
1,14
3
0,03
4
0,00
5
0,05
6
1,34
7
1,06
9
1,59
10
1,69
11
1,37
13
1,49
Glc
1,02
40 Las NP 3, 4 y 5 mostraron gran agregación casi completa, la adición de DMSO a estos agregados dejó de solubilizar esta partícula.
Las restantes muestras de NP se volvieron a centrifugar para eliminar cualquier agregado adicional, y se tomaron 45 alícuotas para permitir análisis posteriores, específicamente contenido de oro y péptido. Se enrasó una alícuota a 500 µl con agua, se fechó y se etiquetó, éstas se usaron posteriormente para la prueba de presentación de HLA.
El análisis final de estas muestras de 500 µl para la presentación de HLA fue del siguiente modo;
11
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promover el entendimiento de la presentación de MHCI convencional y alternativa. Estos reactivos pueden utilizarse para experimentar con los posibles enlaces químicos de péptidos en nanopartículas. Así, los presentes inventores pueden descubrir qué enlace se procesa más fácilmente en una línea celular de ratón.
5 Resultados y discusión
Citometría de flujo como una medida de presentación
Con el fin de analizar el enlace de epítopo a nanopartículas, los presentes inventores optimizaron primero un ensayo de lectura para la presentación del epítopo liberado de la nanopartícula. Para este fin, se evaluó la presentación de SIINFEKL en células LKb. Como se ha mencionado antes, existe más de un reactivo. De los dos métodos probados, uno se basa en citometría de flujo, mientras que el otro se basa en células. El método basado en citometría de flujo empieza con pulsar células LKb con diferentes cantidades de péptido SIINFEKL. Después de dejar tiempo suficiente para la unión del péptido a la superficie de moléculas Kb, las células se lavaron y se incubaron con el anticuerpo
15 25.D1.16 que es específico para el complejo SIINFEKL:Kb. A continuación, las células se marcaron secundariamente y se sometieron a análisis de citometría de flujo usando células no pulsadas como la lectura de ruido de fondo. Se encontró que este método detectó complejos de superficie cuando las células se pulsaron con tan solo 5 ng/ml.
Activación de linfocitos T como una medida de presentación de antígenos
Otra forma de presentación específica de epítopo-antígeno es la medición de la activación de linfocitos T por el complejo de MHCI-péptido. Aquí, los presentes inventores usaron B3Z (línea de linfocitos T específica del péptido OVA), que reconoce SIINFEKL en el contexto de Kb. Como medida conveniente, esta línea de linfocitos T contiene β-galactosidasa clonada con el promotor de NFAT. Tras el reconocimiento de péptido y la activación de linfocitos T,
25 se expresa β-galactosidasa y la conversión de un sustrato detectable sirve de excelente medida de la presentación de antígeno a linfocitos T.
Para evaluar este método, los presentes inventores realizaron un experimento similar como antes. Se pulsaron células LKb con el péptido SIINFEKL, se lavaron y entonces se co-incubaron con la línea de linfocitos T B3Z durante la noche. Al día siguiente, las células se lisaron y se midió β-galactosidasa usando un sustrato luminiscente. Como era de esperar, la resolución de este método fue similar a la del método previo con el límite de detección a aproximadamente 5 ng/ml.
Por tanto, ambos métodos presentan aproximadamente la misma resolución y se seleccionaron para su uso en la 35 evaluación de construcciones de nanopartícula-péptido.
Materiales y métodos
Líneas celulares
Las células LKb son fibroblastos de ratón y fueron la línea primaria usada. Específicamente, son células L929 que expresan establemente la molécula H-2Kb murina.
Péptidos sintéticos
45 Se compraron péptidos SIINFEKL sintéticos (OVA 257-264) (SEQ ID NO: 2) de Genscript USA (Piscataway, NJ). Los péptidos se resuspendieron a 5 mg/ml en DMSO y se pulsaron sobre células a la concentración indicada en las figuras.
Hibridomas de linfocitos T
El hibridoma T específico de SIINFEKL:Kb (B3Z) expresa β-galactosidasa tras el reconocimiento de complejos de péptido-clase I de MHC y se ha descrito previamente (3, 6). Se mantuvieron hibridomas de linfocitos T en RPMI completo más 10 % de FCS y 2-ME 0,05 mM. La activación se midió usando el sustrato luminiscente Galactolight
55 Plus (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. La intensidad de luz se midió usando un lector de placas TopCount NXT (Perkin Elmer, Waltham, MA).
Citometría de flujo
Se trataron células LKb con cantidades variables de péptidos SIINFEKL (SEQ ID NO: 2). Después de una incubación de 2 h, las células se recogieron, se lavaron una vez con PBS, y entonces se incubaron durante 1 h con sobrenadante de cultivo de 25.D1.16 (anticuerpo monoclonal específico para SIINFEKL complejado con H-2Kb) (7) sobre hielo. Entonces, las células se lavaron dos veces en PBS y se incubaron durante 30 min sobre hielo con anticuerpo secundario anti-IgG de ratón de cabra marcado con FITC (Caltag Laboratories, Burlingham, CA). 65 Finalmente, las células se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en PBS+,1 % de BSA para citometría de flujo en un citómetro de flujo Guava EasyCyte Plus (Millipore, Billerica, MA) y se analizaron usando el software
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