MX2014002418A - Composiciones de peptidos en nanoparticulas. - Google Patents

Composiciones de peptidos en nanoparticulas.

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Abstract

La presente invención proporciona nanopartículas y composiciones que comprenden las nanopartículas, así como métodos para la administración intracelular de péptidos, y métodos de producción de nanopartículas y productos relacionados. Las nanopartículas comprenden un núcleo que comprende un metal y/o un átomo semiconductor, y una corona que comprende una pluralidad de ligandos unidos covalentemente al núcleo, en donde al menos un primer ligando de la pluralidad comprende una porción de carbohidrato que está unida covalentemente al núcleo a través de un primer enlazador, y en donde al menos un segundo ligando de la pluralidad comprende un péptido de elección que está unido covalentemente al núcleo a través de un segundo enlazador. El segundo enlazador comprende una porción peptídica y una porción no peptídica, en donde la porción peptídica del segundo enlazador comprende la secuencia de X1X2Z1, en donde: X1 es un aminoácido seleccionado de A y G; X2 es un aminoácido seleccionado de A y G, y Z1 es un aminoácido seleccionado de Y y F.

Description

COMPOSICIONES DE PEPTIDOS EN NANOPARTICULAS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a sustancias y composiciones útiles en el suministro intracelular de péptidos, en particular suministro de péptidos mediado por nanopartículas . En ciertos casos, la invención se refiere al suministro intracelular de péptidos epitópicos, por ejemplo, para inducir una respuesta de células T. El suministro intracelular de péptidos puede emplearse para tratamiento terapéutico y/o profiláctico de, en particular, tumores y/o enfermedad mediada por patógenos, tal como infección bacteriana, viral o parasítica.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Un desafío significativo para el diseño y desarrollo de terapia a base de péptidos, tal como inmunoterapia, es el suministro intracelular de los péptidos a compartimientos intracelulares . Un ejemplo de esto es la necesidad de suministrar péptidos antigénicos a la maquinaria de procesamiento de antígenos de tal manera que los péptidos se presenten unidos a una molécula MHC clase I y de esta manera estimulen una respuesta CTL. Otros ejemplos incluyen el suministro de fármacos a base de péptidos a objetivos de fármaco intracelulares. En particular, los péptidos libres comúnmente despliegan una absorción deficiente por las Ref. 246998 células .
Un enfoque que se ha empleado hasta la fecha, es suministrar péptidos a una ubicación intracelular al administrar un vector, tal como un vector viral, que contiene un polinucleótido que codifica para el péptido de elección de tal manera que la célula pueda ser transfectada por el vector y el péptido se produzca por la maquinaria de traducción celular. Un ejemplo más de una estrategia para suministrar un péptido a una ubicación intracelular se describe en Muders et al., 2009, Clin Cáncer Res, volumen 15(12), páginas 4095-4103, en el cual un péptido de dirección a GIPC-PDZ fue suministrado a ciertas células de tumor pancreático. El péptido fue modificado por miristoilación N-terminal.
Sin embargo, sigue habiendo la necesidad por métodos y composiciones adicionales para el suministro intracelular de péptidos, por ejemplo, para inducir una respuesta inmunitaria o para la administración de ciertos fármacos a base de péptidos. La presente invención resuelve éstas y otras necesidades.
WO 2006/037979 describe nanopartículas que comprenden antígenos y adyuvantes, y estructuras inmunogénicas que comprenden las nanopartículas .
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Ampliamente, la presente invención se refiere al suministro intracelular de péptidos a base de nanopartículas.
Los presentes inventores han encontrado que las nanopartículas de la invención, descritas en la presente, las cuales tienen una corona que incluye un péptido de elección que se fija covalentemente al núcleo de las nanopartículas por medio de enlazadores particulares, son capaces de ser absorbidas por células y de esta manera suministrar el péptido de elección a un objetivo intracelular . Como se describe en la presente, el péptido de elección puede ser luego liberado de la nanopartícula , por ejemplo, por procesos de corte específicos, para de esta manera liberar al péptido de elección para su interacción con un objetivo intracelular. Un ejemplo de esto es el suministro de un péptido epitópico a una APC para procesamiento y presentación por medio de una molécula MHC clase I de tal manera que se pueda generar una respuesta CTL.
En consecuencia, en un primer aspecto la presente invención proporciona una nanopartícula que comprende: (i) un núcleo que comprende un átomo de metal y/o semiconductor; (ii) una corona que comprende una pluralidad de ligandos enlazados covalentemente al núcleo, en donde al menos un primer ligando de la pluralidad comprende una porción de carbohidrato que se enlaza covalentemente al núcleo por medio de un primer enlazador o en donde el primer ligando de la pluralidad comprende glutatión, y en donde al menos un segundo ligando de la pluralidad comprende un péptido de elección que se enlaza covalentemente al núcleo por medio de un segundo enlazador, el segundo enlazador comprende : una porción peptídica y una porción no peptídica, en donde la porción peptídica del segundo enlazador comprende la secuencia ???2??, en donde: X es un aminoácido seleccionado de A y G; X2 es un aminoácido seleccionado de A y G; y Zi es un aminoácido seleccionado de Y y F.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, la porción no peptídica del segundo enlazador comprende alquilo de C2-C15 y/o glicol de C2-C15, por ejemplo un grupo tioetilo o un grupo tiopropilo.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el primer ligando y/o el segundo ligando son enlazados covalentemente al núcleo por medio de un grupo que contiene azufre, un grupo que contiene amino, un grupo que contiene fosfato o un grupo que contiene oxígeno.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, la porción peptídica del segundo enlazador comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de: (i) AAY; y (ii) FLAAY (SEQ ID NO : 1) .
En ciertos casos preferidos, el segundo enlazador se selecciona del grupo que consiste en: (i) HS- (CH2) 2-CONH-AAY; (Ü) HS- (CH2) 2 -CONH-FLAAY; (üi) HS- (CH2) 3-CONH-AAY; ( iv) HS - ( CH2 ) 3 - CONH- FLAAY ; (v) HS - (CH2) io- (CH2OCH2) 7- CONH- FLAAY, en donde el segundo enlazador se enlaza covalentemente al núcleo por medio del grupo tiol de la porción no peptídica del enlazador.
De preferencia, el peptido de elección es enlazado por un medio de su extremo N-terminal a la porción peptídica del segundo enlazador.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el segundo ligando se selecciona del grupo que consiste en: (i) HS- (CH2) 2-CONH-AAYZ2; (ii) HS - (CH2) 2-CONH-FLAAYZ2; (iii) HS- (CH2) 3-CONH-AAYZ2; (iv) HS - (CH2) 3-CONH-FLAAYZ2; (v) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-CONH-FLAAYZ2; y ( i ) HS - ( CH2 ) io - ( CH2OCH2 ) 7 - CONH- FLAAYZ2 , en donde Z2 representa el péptido de elección.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el péptido de elección es un péptido epitópico que se une a una molécula de complejo de histocompatibilidad mayor (MHC, por sus siglas en inglés) clase I o es capaz de ser procesado para de esta manera unirse a una molécula MHC clase I.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el péptido de elección consiste en una secuencia de 8 a 40 residuos de aminoácido. En particular, el péptido de elección puede consistir en una secuencia de 8 a 12 residuos de aminoácido.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el péptido de elección es un péptido epitópico que es capaz de ser presentado por una molécula MHC clase I para de esta forma estimular una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés) .
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el péptido de elección forma al menos una porción de o se deriva a partir de un antígeno asociado a tumor (TAA, por sus siglas en inglés) o un antígeno asociado a virus, bacterias o parásitos. En particular, el TAA puede ser un antígeno de cáncer pulmonar. El cáncer pulmonar en algunos casos puede seleccionarse de: carcinoma pulmonar microcítico y cualquier carcinoma pulmonar no microcítico, opcionalmente en donde el carcinoma pulmonar no microcítico comprende un adenocarcinoma . El antígeno asociado a patógeno puede en algunos casos ser un antígeno viral, bacteriano o parasítico.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, la porción de carbohidrato del primer ligando comprende un monosacárido y/o un disacárido. En particular, la porción de carbohidrato puede comprender glucosa, mañosa, fucosa y/o N-acetilglucosamina .
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, la pluralidad de ligandos comprenden uno o más ligandos seleccionados del grupo que consiste en: glucosa, N-acetilglucosamina y glutatión, además del uno o más ligandos que comprenden el péptido de elección.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, la pluralidad de ligandos comprende: (a) glucosa; (b) N-acetilglucosamina; (c) glutatión; (d) glucosa y N-acetilglucosamina; (e) glucosa y glutatión; (f) N-acetilglucosamina y glutatión; o (g) glucosa, N-acetilglucosamina y glutatión, además del ligando que comprende el péptido de elección.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el primer enlazador comprende alquilo de C2-C15 y/o glicol de C2-C15.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el primer ligando comprende 2 ' -tioetil -ß-D- glucopiranósido o 2 ' -tioetil-a-D-glucopiranósido fijados covalentemente al núcleo por medio del átomo de azufre de tiol .
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, la nanopartícula comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40 o al menos 50 ligandos que contienen carbohidratos y/o ligandos de glutatión.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, la nanopartícula comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 ligandos que contienen péptidos .
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, la relación molar de ligandos que contienen carbohidrato y/o ligandos de glutatión a ligandos que contienen péptido está en el intervalo de 5:1 a 100:1, tal como en el intervalo de 10:1 a 30:1.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el diámetro del núcleo de la nanopartícula está en el intervalo de 1 nm a 5 nm.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el diámetro de la nanopartícula incluyendo sus ligandos está en el intervalo de 5 nm a 20 nm, opcionalmente 5 nm a 15 nm u 8 nm a 10 nm.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el núcleo comprende un metal seleccionado del grupo que consiste en: Au, Ag, Cu, Pt, Pd, Fe, Co, Gd y Zn, o cualquier combinación de los mismos.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el núcleo es magnético.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el núcleo comprende un semiconductor. En particular, el semiconductor en algunos casos puede seleccionarse del grupo que consiste en: selenuro de cadmio, sulfuro de cadmio, teluro de cadmio y sulfuro de zinc.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el núcleo es capaz de actuar como un punto cuántico .
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, la nanopartícula comprende al menos dos ligandos que contienen péptidos de elección, y en donde el péptido de elección de cada uno de los por lo menos dos ligandos que contienen péptidos de elección difieren.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, los péptidos de elección de los por lo menos dos ligandos que contienen péptidos de elección forman cada uno al menos una porción de o cada uno son derivados de uno o más antígenos, tales como TAAs . En algunos casos de acuerdo con la presente invención, los péptidos de elección de los por lo menos dos ligandos que contienen péptidos de elección forman cada uno al menos una porción de o cada uno son derivados de un TAA de cáncer pulmonar diferente.
En un aspecto más, la presente invención proporciona una composición que comprende una pluralidad de nanopartículas de acuerdo con el primer aspecto de la invención. La composición puede comprender además al menos un portador, sal y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, la composición comprende una primer especie de nanopartícula que tiene un primer ligando que contiene péptido de elección y una segunda especie de nanopartícula que tiene un segundo ligando que contiene péptido de elección, en donde los péptidos de elección de la primera y segunda especies difieren. Los péptidos de elección de cada una de la primera y segunda especies de nanopartículas en algunos casos pueden formar al menos una porción de o cada uno ser derivado de uno o más antígenos, tales como TAAs .
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, la composición de la invención puede comprender un fondo de al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 10 especies de nanopartícula diferentes, cada especie teniendo un péptido de elección diferente.
La composición puede comprender además al menos un adyuvante, adyuvante que opcionalmente puede ser fijado covalentemente al núcleo de al menos una nanopartícula. Como alternativa, la composición de la invención puede estar sustancialmente libre de adyuvante o el único efecto adyuvante puede ser provisto por las nanopartículas .
En un aspecto más, la presente invención proporciona una vacuna que comprende una composición de la invención. La vacuna puede ser para tratamiento terapéutico o profiláctico de un cáncer, incluyendo cáncer pulmonar.
En un aspecto más la presente invención proporciona una nanopartícula , composición o vacuna de la invención, para uso en medicina.
La nanopartícula, composición o vacuna puede ser para usarse en un método de tratamiento de un cáncer o una infección por patógenos en un sujeto mamífero.
En un aspecto más, la presente invención proporciona el uso de una nanopartícula, composición o vacuna de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer o una infección por patógenos en un sujeto o animal.
La nanopartícula, composición o vacuna de la invención puede ser para su administración por medio de absorción linfática.
En un aspecto más, la presente invención proporciona un método para el tratamiento profiláctico o terapéutico de un cáncer o una infección por patógenos, que comprende administrar una cantidad profiláctica o terapéuticamente suficiente de una nanopartícula, composición o vacuna a un sujeto mamífero que la requiera. En algunos casos de acuerdo con el aspecto de método de la presente invención, la nanopartícula, composición o vacuna se administra por medio de una ruta seleccionada del grupo que consiste en: inyección en un órgano o tejido de un sujeto mamífero en, o en las inmediaciones de, un sitio de absorción linfática ; suministro nasal por medio de un spray o gel; suministro bucal por medio de un spray o gel o película soluble por vía oral; suministro oral por medio de una película soluble; suministro transdérmico por medio de un parche que incorpora la nanopartícula; y suministro por inhalación de una composición que comprende la nanopartícula.
En un aspecto más, la presente invención proporciona un método in vitro o in vivo para generar una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) , que comprende: (i) poner en contacto al menos una célula presentadora de antígeno (APC) con al menos una nanopartícula de la invención, de tal manera que el péptido de elección sea presentado en una molécula MHC clase I de la APC; y (ii) poner en contacto la por lo menos una APC de (i) con al menos una célula CTL, de tal manera que la célula CTL sea activada por la APC para generar una respuesta CTL que se especifica para el péptido de elección, en donde el péptido de elección es un péptido epitópico.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, la APC se cultiva en presencia de la nanopartícula , y, simultáneamente o secuencialmente , se co-cultiva con la célula CTL. Opcionalmente , la APC puede ser sujeta a una etapa de lavado después de haber sido puesta en contacto con la nanopartícula antes de ser co-cultivada con la célula CTL. En algunos casos, el método puede comprender además administrar la célula CTL a un sujeto mamífero.
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, la nanopartícula puede ser suministrada por una ruta de administración seleccionada del grupo que consiste en : inyección en un órgano o tejido de un sujeto mamífero en, o cerca de, un sitio de absorción linfática; suministro nasal por medio de un spray o gel; suministro bucal por medio de un spray o gel o película soluble por vía oral; suministro oral por medio de una película soluble; suministro transdérmico por medio de un parche que incorpora la nanopartícula; y suministro por inhalación de una composición que comprenda la nanopartícula.
En algunos casos, la por lo menos una nanopartícula comprende un fondo de nanopartículas que tienen diferentes péptidos de elección.
En un aspecto más, la presente invención proporciona un método para producir una nanopartícula de acuerdo con la invención, que comprende: derivar el carbohidrato con el primer enlazador; derivar el péptido de elección con el segundo enlazador; y hacer reaccionar el carbohidrato derivado con primer enlazador y el péptido de elección derivado con segundo enlazador con reactivos para producir el núcleo de la nanopartícula de tal manera que durante el autoensamble de la nanopartícula , el núcleo de la nanopartícula se fije al carbohidrato y el péptido de elección por medio de sus enlazadores respectivos. En algunos casos, la mezcla de reacción comprende el carbohidrato derivado, el péptido de elección derivado, una sal de los átomos de metal y/o semiconductores y un agente reductor para producir la nanopartícula. Como alternativa o además, el carbohidrato puede ser reemplazado por, o complementado por, glutatión.
En ciertos casos de acuerdo con este y otros aspectos de la invención, el producto de reacción, incluyendo la nanopartícula, se somete a una etapa de purificación para eliminar péptido libre no reaccionado, opcionalmente en donde 5 la etapa de purificación comprende ejecutar el producto de reacción a través de una columna G-50 Sephadex™.
En ciertos casos de acuerdo con este y otros aspectos de la invención, el método puede comprender además la etapa de formular la nanopartícula en una composición con al menos un portador, sal o diluyente farmacéuticamente aceptable .
En ciertos casos de acuerdo con este y otros aspectos de la invención, el método es para fijar el péptido de elección por medio del segundo enlazador a la nanopartícula de tal manera que la nanopartícula con el péptido de elección fijado sea capaz de ser internalizada por una célula.
En ciertos casos de acuerdo con este y otros aspectos de la invención, el método es para fijar el péptido de elección por medio del segundo enlazador a la nanopartícula de tal manera que la nanopartícula con el péptido de elección fijado sea capaz de ser internalizada por una célula presentadora de antígenos (APC, por sus siglas en inglés) .
En un aspecto más, la presente invención proporciona un método para el suministro intracelular de un péptido de elección, que comprende poner en contacto una célula con una nanopartícula o composición de la invención.
En un aspecto más, la presente invención proporciona un uso de una nanopartícula o composición de la invención para el suministro intracelular del péptido de la elección.
La presente invención incluye la combinación de los aspectos y características preferidas descritas excepto cuando esta combinación sea claramente impermisible o se indique como expresamente evitada. Estos y adicionales aspectos y modalidades de la invención se describen en más detalle abajo y con referencia a los ejemplos y figuras acompañantes .
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las figuras 1A-1E muestran la presentación de SIINFEKL (SEQ ID NO : 2) de GNP : células LKb fueron sembradas en placas de 24 pocilios y dejadas adherir durante la noche. Después, las GNPs fueron pulsadas al equivalente de 1 ug/mL de péptido (verde), 0.1 ug/mL (azul), o 0.01 ug/mL (rojo). Después de dos horas, las células fueron lavadas y sometidas a (figuras 1A-1D) marcado citométrico de flujo con anticuerpo 25. DI.16 (Angel), o (figura 1E) combinadas con CTL B3Z para co-cultivo nocturno. Al día siguiente, las células fueron lisadas y se midió la actividad beta-galactosidasa .
Las figuras 2A-2N muestran la presentación de GNP comparada con la presentación de péptido libre: Figuras 2A-2B - GNPs 8 y 9 fueron separadas por columna Sephadex en 15 fracciones, las cuales fueron luego analizadas por absorción UV para niveles de proteína. La línea roja (indicada por círculos) en la figura 2A representa péptido libre solo. Figuras 2C-2H - células LKb fueron pulsadas durante 2 horas con GNPs indicadas o péptido libre correspondiente a la concentración anotada (1 ug/mL de péptido (verde), 0.1 ug/mL (azul) o 0.01 ug/mL (rojo)) . Las lecturas son por (figuras 2C-2F) citoraetría de flujo o (figuras 2G-2H) ensayo B3Z. Figuras 2I-2N - LKb fueron pulsadas con el péptido libre anotado durante 2 horas en hielo (figuras; 2I-2K) o a 37°C (figuras 2L-2N) . Después, las células fueron analizadas mediante citometría de flujo para presentación de SIINFEKL (SEQ ID NO: 2) . Las porciones rojas del histograma representan tinción positiva en comparación con células no pulsadas .
Las figuras 3A-3F muestran la presentación GNP de preparaciones que carecen de péptido libre: Figuras 3A-3B -Nuevas preparaciones de GNPs 8 y 9 fueron separadas por columnas Sephadex G-50 en 15 fracciones, las cuales fueron luego analizadas por absorción UV para niveles de proteínas. Las flechas indican qué fracciones fueron agrupadas para uso adicional. Figuras 3C-3E, 3F - Células LKb fueron pulsadas durante 2 horas con las preparaciones anteriores indicadas de GNPs (GNP viejas) o preparaciones más nuevas de (Figuras 3A y 3B) (GNP nuevas) a las concentraciones indicadas (1 ug/mL de péptido (verde), o 0.1 ug/mL (rojo)) : Las lecturas son por (figuras 3C-3E) citometría de flujo o (figura 3F) ensayo B3Z. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Para describir la presente invención se emplearán los siguientes términos, y se intenta que sean definidos como se indica abajo.
Según se usa en la presente, "nanopartícula" se refiere a una partícula que tiene una escala nanométrica, y no se intenta que transmita ninguna limitación de forma específica. En particular, "nanopartícula" abarca nanoesferas, nanotubos, cajas nanométricas , racimos nanométricos , barras nanométricas y similares. En ciertas modalidades las nanopartículas y/o núcleos de nanopartícula contemplados en la presente tienen una geometría generalmente poliédrica o esférica.
Nanopartículas que comprenden una pluralidad de ligandos que contienen carbohidratos han sido descritas en, por ejemplo, WO 2002/032404, WO 2004/108165, O 2005/116226, WO 2006/037979, WO 2007/015105, WO 2007/122388, WO 2005/091704 (los contenidos completos de cada una de las cuales se incorporan expresamente en la presente por referencia) y estas nanopartículas pueden encontrar uso de acuerdo con la presente invención. Además, nanopartículas recubiertas con oro que comprenden un núcleo magnético de ferritas de óxido de hierro (que tienen la fórmula XFe204, en donde x = Fe, Mn o Co) funcionarizadas con compuestos orgánicos (por ejemplo, por medio de un enlace tiol-oro) se describen en EP2305310 (los contenidos completos de la cual se incorporan expresamente en la presente por referencia) y se contemplan específicamente para uso como nanopartículas/núcleos de nanopartícula de acuerdo con la presente invención.
Según se usa en la presente, "corona" se refiere a una capa o recubrimiento, que puede cubrir parcial o completamente la superficie expuesta del núcleo de la nanopartícula. La corona incluye una pluralidad de ligandos que incluyen al menos una porción de carbohidrato, una porción de tensioactivo y/o una porción de glutatión. Así, la corona puede considerarse como una capa orgánica que rodea o rodea parcialmente el núcleo metálico. En ciertas modalidades la corona proporciona y/o participa en pasivar el núcleo de la nanopartícula. Así, en ciertos casos, la corona puede incluir una capa de recubrimiento suficientemente completa sustancialmente para estabilizar el núcleo que contiene metal. Sin embargo, se contempla específicamente en la presente que ciertas nanopartículas que tengan núcleos, por ejemplo, que incluyan un núcleo interior que contenga óxido de metal recubierto con un metal noble pueden incluir una corona que sólo recubra parcialmente la superficie del núcleo. En ciertos casos la corona facilita la solubilidad, tal como solubilidad en agua, de las nanopartículas de la presente invención.
Nanopartículas Las nanopartículas son partículas pequeñas, por ejemplo, racimos de átomos de metal o semiconductores, que se pueden usar como un substrato para inmovilizar ligandos.
De preferencia, las nanopartículas tienen núcleos que tienen diámetros medios entre 0.5 y 50 nm, muy preferiblemente entre 0.5 y 10 nm, más preferiblemente entre 0.5 y 5 nm, muy preferiblemente entre 0.5 y 3 nm y aún más preferiblemente entre 0.5 y 2.5 nm. Cuando los ligandos se consideran además de los núcleos, de preferencia el diámetro medio total de las partículas es de entre 5.0 y 100 nm, muy preferiblemente entre 5 y 50 nm y más preferiblemente entre 5 y 10 nm. El diámetro medio puede medirse usando técnicas bien conocidas en la técnica tales como microscopía electrónica de transmisión .
El material de núcleo puede ser un metal o semiconductor y puede formarse de más de un tipo de átomo. Preferiblemente, el material del núcleo es un metal seleccionado de Au, Fe o Cu. Los núcleos de la nanopartícula también pueden ser formados a partir de aleaciones que incluyan Au/Fe, Au/Cu, Au/Gd, Au/Fe/Cu, Au/Fe/Gd y Au/Fe/Cu/Gd, y se pueden usar en la presente invención. Los materiales de núcleo que se prefieren son Au y Fe, y el material que más se prefiere es Au. Los núcleos de las nanopartículas comprenden de preferencia entre aproximadamente 100 y 500 átomos (por ejemplo, átomos de oro) para proporcionar diámetros de núcleo en la escala nanométrica. Otros materiales de núcleo particularmente útiles son impurificados con uno o más átomos que activos en N M, permitiendo a las nanopartículas ser detectadas usando RMN, tanto in vi tro como in vivo. Ejemplos de átomos activos en RMN incluyen Mn+2, Gd+3, Eu+2, Cu+2, V+2, Co+2, Ni+2, Fe+2, Fe+3 y lantánidos+3 , o los puntos cuánticos descritos en cualquier lado en esta solicitud.
Los núcleos de nanopartícula que comprenden átomos semiconductores pueden detectarse como cristales semiconductores en escala nanométrica que son capaces de actuar como puntos cuánticos, es decir que pueden absorber luz excitando de esta manera electrones en los materiales a niveles de energía más altos, liberando posteriormente fotones de luz a frecuencias características del material . Un ejemplo de un material de núcleo semiconductor es selenuro de cadmio, sulfuro de cadmio, telurio de cadmio. También se incluyen los compuestos de zinc tales como sulfuro de zinc.
En algunas modalidades, el núcleo de las nanopartículas puede ser magnético y comprende átomos de metal magnético, opcionalmente en combinación con átomos de metal pasivo. A manera de ejemplo, el metal pasivo puede ser oro, platino, plata o cobre, y el metal magnético puede ser hierro o gadolinio. En modalidades preferidas, el metal pasivo es oro y el metal magnético es hierro. En este caso, convenientemente la relación de átomos de metal pasivo a átomos de metal magnético en el núcleo es de entre aproximadamente 5:0.1 y alrededor de 2:5. Muy preferiblemente, la relación es de entre alrededor de 5:0.1 y alrededor de 5:1. Según se usa en la presente, el término "metales pasivos" se refiere a metales que no muestran propiedades magnéticas y son químicamente estables a oxidación. Los metales pasivos pueden ser diamagnéticos o superparamagnéticos . Preferiblemente, las nanopartículas son superparamagnéticas .
Ejemplos de nanopartículas que tienen núcleos que comprenden un metal paramagnético, incluyen aquellas que comprenden Mn+2, Gd+3, Eu+2, Cu+2, V+2, Co+2, Ni+2, Fe+2, Fe+3 y lantánidos+3.
Otras nanopartículas magnéticas pueden formarse a partir de materiales tales como MnFe (ferrita de espinela) o CoFe (ferrita de cobalto) pueden formarse en nanopartículas (fluido magnético) , con o sin la adición de un material de núcleo adicional como el definido arriba. Ejemplos de la química de fijación de auto-ensamble para producir las nanopartículas se dan en Biotechnol . Prog., 19:1095-100 (2003), J. Am. Chem. Soc . 125:9828-33 (2003), J. Colloid Interface Sci. 255:293-8 (2002) .
En algunas modalidades, la nanopartícula o su ligando comprende un marcador de ectable . El marcador puede ser un elemento del núcleo de la nanopartícula o el ligando. El marcador puede ser detectable debido a una propiedad intrínseca de ese elemento de la nanopartícula o al ser enlazado, conjugado o asociado con una porción adicional que sea detectable. Ejemplos preferidos de marcadores incluyen un marcador que es un grupo fluorescente, un radionúclido, un marcador magnético o un colorante. Los grupos fluorescentes incluyen fluoresceína, rodamina o tetrametilrodamina, rojo Texas, Cy3 , Cy5 , etc., y se pueden detectar por excitación del marcador fluorescente y detección de la luz emitida usando espectroscopia de dispersión Raman (Y.C. Cao, R. Jin, C. A. Mirkin, Science 2002, 297: 1536-1539).
En algunas modalidades, las nanopartículas pueden comprender un radionúclido para usarse en detectar la nanopartícula usando la radioactividad emitida por el radionúclido, por ejemplo, al usar PET, SPECT, o para terapia, es decir, para matar células objetivo. Ejemplos de radionúclidos usados comúnmente en la técnica que podrían ser fácilmente adaptados para usarse en la presente invención incluyen 99mTc, que existe en una variedad de estados de oxidación aunque el más estable es TcO4"; 32P o 33P; 57Co; 59Fe; 67Cu que comúnmente se usa como sales de Cu2+ 67Ga que se usa comúnmente como una sal de Ga3+, por ejemplo, citrato de galio; 68Ge; 82Sr; 99Mo; 103Pd; 11:LIn el cual se usa generalmente como en sales de In3+; 125I o 131I que se usa generalmente como yoduro de sodio; 137Cs; 153Gd; 153Sm; 158Au; 186Re; 201Tl usado generalmente como una sal Tl+ tal como cloruro de talio, 39Y34; 71Lu3+; y 24Cr+. El uso general de radionúclidos como marcadores y trazadores se conoce bien en la técnica y se podría adaptar fácilmente por la persona experta para usarse en los aspectos de la presente invención. Los radionúclidos pueden emplearse más fácilmente al impurificar los núcleos de las nanopartículas o incluirlos como marcadores presentes como parte de ligandos inmovilizados en las nanopartículas.
Como alternativa o además, las nanopartículas de la presente invención, o los resultados de sus interacciones con otras especies, pueden detectarse usando un número de técnicas bien conocidas en la técnica usando un marcador asociado con la nanopartícula como se indicó arriba o al emplear una propiedad de ellos. Estos métodos para detectar nanopartículas pueden variar de detectar la agregación que resulta cuando las nanopartículas se unen a otras especies, por ejemplo, por inspección visual simple o al usar dispersión de luz (transmitancia de una solución que contenga las nanopartículas) , a usar técnicas sofisticadas tales como microscopía electrónica de transmisión (TEM) o microscopía de fuerza atómica (AFM) para visualizar las nanopartículas. Un método adicional para detectar partículas de metal es emplear resonancia en un plasmón que es la excitación de electrones en la superficie de un metal, causada normalmente por radiación óptica. El fenómeno de resonancia en un plasmón de superficie (SP , por sus siglas en inglés) existe en la interfaz de un metal (tal como Ag o Au) y un material dieléctrico tal como aire o agua. Al presentarse cambios en SPR cuando los analitos se unen al ligando inmovilizado en la superficie de una nanopartícula que cambie el índice de refracción de la interfaz. Una ventaja más de SPR es que se puede usar para monitorear interacciones en tiempo real. Como se mencionó arriba, si las nanopartículas incluyen o son impurificadas con átomos que sean activos en NRM, entonces esta técnica puede usarse para detectar las partículas, tanto in vitro como in vivo, usando técnicas bien conocidas en la técnica. Las nanopartículas también pueden ser detectadas usando un sistema a base de amplificación de señal cuantitativa usando la reducción de plata (I) promovida por nanopartículas. Espectroscopia de fluorescencia puede usarse si las nanopartículas incluyen ligandos de sondas fluorescentes. Asimismo, se puede usar marcado isotrópico de carbohidrato para facilitar su detección.
Péptido de elección La nanopartícula de la presente invención comprende un ligando que contiene péptido ("segundo ligando") que es enlazado covalentemente al núcleo de la nanopartícula por medio de un enlazador ("el segundo enlazador"). El segundo ligando comprende un péptido que puede estar diseñado para suministro intracelular . Este "péptido de elección" puede ser cualquier péptido adecuado. En particular, el péptido puede ser un fragmento de un polipéptido más grande que sea capaz de ejercer un efecto cuando sea suministrado a un sitio intracelular. En ciertos casos, el péptido de elección puede ser un fármaco a base de péptidos. En ciertos casos, el péptido de elección puede comprender un epítopo (un "péptido epitópico") que dé origen a una respuesta inmunitaria cuando sea suministrado a, por ejemplo, un compartimiento intracelular de una APC. En ciertos casos preferidos, el péptido de elección puede ser un péptido que se una a una molécula de complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) clase I o sea capaz de ser procesado para de esta manera unirse a una molécula MHC clase I. En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el péptido de elección puede consistir en una secuencia de 8 a 40 residuos de aminoácido, tal como una secuencia de 8 a 12 residuos de aminoácido. En ciertos casos, el péptido de elección puede ser capaz de ser presentado por una molécula MHC clase I para de esta forma estimular una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) . Estos péptidos epitópicos pueden formar al menos una porción de, o usar derivados de, un antígeno asociado a tumor (TAA) o un antígeno asociado a patógeno (por ejemplo, un antígeno viral, bacteriano o parasítico) . En algunos casos, el péptido de elección puede ser un fármaco peptídico, tal como un péptido que se dirija a un objetivo intracelular . Un ejemplo de este péptido de dirección intracelular es el inhibidor del dominio GIPC-PDZ descrito en Muders et al., 2009, Clin Cáncer Res, volumen 15(12), páginas 4095-4103 (los contenidos completos del cual se incorporan en la presente a manera de referencia) .
Administración y tratamiento Las nanopartículas y composiciones de la invención pueden ser administradas a pacientes mediante cualquier número de rutas diferentes, incluyendo rutas enteral o parenteral. La administración parenteral incluye administración por medio de las siguientes rutas: rutas sistémicas intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular, intraocular, transepitelial , intraperitoneal y tópica (incluyendo dérmica, ocular, rectal, nasal, inhalación y aerosol) y rectal.
La administración se puede llevar a cabo, por ejemplo, por inyección, o balísticamente usando una pistola de suministro para asegurar su paso transdérmico a través de la capa exterior de la epidermis. Las nanopartículas pueden ser luego absorbidas, por ejemplo, por células dendríticas, las cuales maduran al migrar a través del sistema linfático, dando como resultado la modulación de la respuesta inmunitaria y vacunación contra el péptido epitópico y/o el antígeno del cual el péptido epitópico se derivó o del cual forma parte. Las nanopartículas también pueden ser suministradas en aerosoles. Esto se hace posible por el tamaño pequeño de las nanopartículas.
El tamaño excepcionalmente pequeño de las nanopartículas de la presente invención es una gran ventaja para el suministro a células y tejidos, toda vez que pueden ser absorbidas por células incluso cuando estén enlazadas a moléculas de dirección o terapéuticas. Así, las nanopartículas pueden ser internalizadas por células tales como APCs, los péptidos procesados y liberados, por ejemplo, para presentación por medio de MHC clase I o para interacción con componentes intracelulares .
Las nanopartículas de la invención pueden ser formuladas como composiciones farmacéuticas que pueden estar en las fórmulas de composiciones sólidas o líquidas. Estas composiciones generalmente comprenderán un portador de cierto tipo, por ejemplo un portador sólido tal como gelatina o un adyuvante o un diluyente inerte, o un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Solución salina fisiológica, o glicoles tales como etilenglicol , propilenglicol o polietilenglicol pueden ser incluidos. Estas composiciones y preparaciones generalmente contienen al menos 0.1% en peso del compuesto.
Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que esté libre de pirógenos y tenga pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Aquellos de capacidad relevante en la técnica son muy capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, soluciones de los compuestos o un derivado de los mismos, por ejemplo, en solución salina fisiológica, una dispersión preparada con glicerol, polietilenglicol líquido o aceites.
Además de uno o más de los compuestos, opcionalmente en combinación con otro ingrediente activo, las composiciones pueden comprender uno o más de un excipiente, portador, regulador de pH, estabilizador, agente isotonificador, conservador o antioxidante farmacéuticamente aceptable, u otros materiales bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro material puede depender de la ruta de administración, por ejemplo, oralmente o parenteralmente .
Las composiciones farmacéuticas líquidas se formulan típicamente para tener un pH de entre alrededor de 3.0 y 9.0, más preferiblemente entre alrededor de 4.5 y 8.5 y aún más preferiblemente entre alrededor de 5.0 y 8.0. El pH de una composición puede mantenerse mediante el uso de un regulador de pH tal como acetato, citrato, fosfato, succinato, Tris o histidina, empleado típicamente en el intervalo de alrededor de 1 mM a 50 mM. El pH de las composiciones de otra manera puede ser ajustado usando ácidos o bases fisiológicamente aceptables.
Los conservadores se incluyen generalmente en composiciones farmacéuticas para retrasar el crecimiento microbiano, extender la vida útil de las composiciones y permitir envase de varios usos. Ejemplos de conservadores incluyen fenol, meta-cresol, alcohol bencílico, ácido para-hidroxibenzoico y sus esteres, metil parabeno, propil parabeno, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio. Los conservadores se emplean típicamente en el intervalo de alrededor de 0.1 a 1.0% (p/v) .
De preferencia, las composiciones farmacéuticas se dan a un individuo en una cantidad profilácticamente efectiva o una cantidad terapéuticamente efectiva (según sea el caso, aunque la profilaxis puede ser considerada terapia) , esto siendo suficiente para mostrar beneficio al individuo. Típicamente, esto será para causar una actividad terapéuticamente útil que proporcione beneficio al individuo. La cantidad real de los compuestos administrados, y la velocidad y curso de tiempo de administración, dependerán de la naturaleza y severidad de la condición que esté siendo tratada. La prescripción de tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre la dosificación etc., está dentro de la responsabilidad de médicos generales u otros doctores en medicina, y típicamente toma en cuenta el trastorno que será tratado, la condición del paciente individual, el sitio de suministro, el método de administración y otros factores conocidos por los practicantes. Ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados arriba pueden encontrarse en Handbook of Pharmaceutical Additives, 2 a edición (eds. M. Ash and I. Ash) , 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, Nueva York, E.U.A.); Remington' s Pharmaceutical Sciences, 20a edición, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2a edición, 1994. A manera de ejemplo, las composiciones se administran de preferencia a pacientes en dosis de aproximadamente 0.01 y 100 mg de compuesto activo por kg de peso corporal, y más preferiblemente entre alrededor de 0.5 y 10 mg/kg de peso corporal .
Se entenderá que cuando se involucre el tratamiento de tumores, tratamiento incluye cualquier medida tomada por el médico para aliviar el efecto del tumor en un paciente. Así, aunque la remisión completa del tumor es una meta deseable, el tratamiento efectivo también incluirá cualquier medida capaz de lograr remisión parcial del__tumor así como ralentizar la velocidad de crecimiento de un tumor que incluya metástasis. Estas medidas pueden ser efectivas para prolongar y/o potenciar la calidad de vida y aliviar los síntomas de la enfermedad.
Inmunoterapia Las composiciones de la invención, tales como las vacunas definidas en las reivindicaciones, en algunos casos pueden usarse para la profilaxis y tratamiento de enfermedades tales como cáncer, y más particularmente para inmunoterapia .
En la presente invención, el término "vacunación" significa una inmunización activa, que es una inducción de una respuesta inmunitaria específica debido a administración, por ejemplo, por medio de las rutas subcutánea, intradérmica , intramuscular, oral o nasal, de pequeñas cantidades de un antígeno que es reconocido por el individuo vacunado como extraño y es por lo tanto inmunogénico en una formulación adecuada. El antígeno se usa entonces como un "gatillo" para que el sistema inmunológico acumule una respuesta inmunitaria específica contra el antígeno.
De acuerdo con la presente invención, la vacunación puede ser terapéutica o profiláctica. A manera de ejemplo, puede ser posible lograr una protección profiláctica contra el brote de una enfermedad cancerosa por vacunación de individuos quienes no sufran de cáncer. Ejemplos de individuos para quienes esta vacunación profiláctica podría ser aplicada son individuos quienes tienen un riesgo de desarrollar una enfermedad cancerosa, aunque esta aplicación no está limitada a tales individuos. Los pacientes que estén en riesgo de cáncer ya pueden haber desarrollado tumores, ya sea tumores primarios o metástasis, o mostrar predisposición para cáncer.
Para la inmunización activa de pacientes de cáncer de acuerdo con la invención, las nanopartículas se formulan típicamente como vacunas. De preferencia, estas preparaciones farmacéuticas contienen un portador farmacéuticamente aceptable que, a manera de ejemplo, puede comprender además sustancias auxiliares, reguladores de pH, sales y/o agentes conservadores. Las preparaciones farmacéuticas pueden, por ejemplo, ser usadas para la profilaxis y terapia de condiciones asociadas con cáncer, tales como formación de metástasis, en pacientes con cáncer. Al hacer esto, células presentadoras de antígenos se modulan específicamente in vivo o también ex vivo para generar de esta manera la respuesta inmunitaria contra las TAAs .
Para la inmunización activa con los antígenos específicos o la combinación de antígenos normalmente una formulación de vacuna se usa que contiene el inmunógeno - sea un TAA natural o su epítopo, mímico o mímico neoepítopo, principalmente a bajas concentraciones, por ejemplo, en una cantidad inmunogénica que varía de 0.01 µg a 10 mg, pero el intervalo de dosis puede incrementarse hasta un intervalo de 100 a 500 mg. Dependiendo de la inmunogenicidad del antígeno de vacunación que sea, por ejemplo, determinada por secuencias de una especie extraña o por derivación, o también dependiendo de las sustancias o adyuvantes auxiliares, respectivamente, usados, la dosis inmunogénica adecuada puede seleccionarse, por ejemplo, en el intervalo de 0.01 pg a 1 mg, de preferencia 100 µg a 500 µg. Una vacuna de depósito que va a ser suministrada al organismo durante un periodo de tiempo extendido puede, sin embargo, también contener cantidades mucho más altas de antígeno de vacunación, por ejemplo, al menos 1 mg a más de 100 mg.
La concentración dependerá de la cantidad de líquido o vacuna suspendida administrada. Una vacuna se proporciona normalmente en jeringas o ampolletas listas para usar que tienen un volumen que varía de 0.01 a 1 mi, de preferencia 0.1 a 0.75 mi.
El antígeno de vacunación de un componente de vacuna se presenta de preferencia en un portador farmacéuticamente aceptable que es adecuado para administración subcutánea, intramuscular y también intradérmica o transdérmica . Un modo de administración adicional funciona por medio de la vía mucosa, por ejemplo, vacunación por administración nasal o peroral . Si se emplean sustancias sólidas como agente auxiliar para la formulación de vacuna, por ejemplo, se administrará un adsorbato, o una mezcla suspendida, respectivamente, del antígeno de vacuna con el agente auxiliar. En modalidades especiales, la vacuna se presenta como una solución o una vacuna líquida en un solvente acuoso.
De preferencia, unidades de vacunación de una vacuna de tumor ya están provistas en una jeringa o ampolleta lista para usar adecuada. Una formulación estable de la vacuna puede adecuadamente ser puesta en el mercado en una forma fácil de usar. Aunque un contenido de agentes conservadores, tales como timerosal u otros agentes conservadores con una tolerabilidad mejorada, no necesariamente se requiere, no obstante puede ser provisto en la formulación para una estabilidad más larga a temperaturas de almacenamiento a partir de las temperaturas de refrigeración hasta la temperatura ambiente. La vacuna de acuerdo con la invención puede, sin embargo, también ser provista en forma congelada o liofilizada y puede ser descongelada o reconstituida, respectivamente, bajo demanda.
En ciertos casos de acuerdo con la presente invención, la inmunogenicidad de la vacuna de la invención puede ser incrementada al emplear adyuvantes. Para este propósito, se usan sustancias sólidas o adyuvantes de vacuna líquidos, por ejemplo, hidróxido de aluminio (Alu-Gel) o fosfato de aluminio, factores de crecimiento, linfocinas, citocinas, tales como IL-2, IL-12, GM-CSF, interferón gamma o factores de complemento, tales como C3d, preparaciones liposómicas adicionales, o también formulaciones con antígenos adicionales contra los cuales el sistema inmunológico ya haya generado una fuerte respuesta inmunitaria, tal como toxoide de tétanos, toxinas bacterianas, tales como exotoxinas de Pseudomonas, y derivados de lípido A y lipopolisacárido .
En ciertos casos, no se emplea un adyuvante adicional, en particular, los ejemplos descritos en la presente muestran que una generación eficiente de una respuesta CTL se logra usando nanopartículas de la invención sin ningún adyuvante agregado (véanse péptidos libres que generalmente se administran con uno o más adyuvantes) . Esto es altamente benéfico en ciertas circunstancias ya que un número de adyuvantes se considera que son tóxicos o de otra manera inadecuados para uso en humanos .
Lo siguiente se presenta a manera de ejemplo y no se debe considerar como una limitación del alcance de las reivindicaciones .
Ej emplos Ejemplo 1 - Síntesis y caracterización de nanopart culas Ligandos de prueba y sus números de identificación se dan abajo (peso molecular) : SIINFEKL (963) (SEQ ID NO: 2) SIINFEKL-N- (CH2)2-SH (1021) FLSIINFEKL-N- (CH2) 2-SH (1280) (SEQ ID NO: 3) FLAAYSIINFEKL-N- (CH2)2-SH (1587) (SEQ ID NO: 4) AAYSIINFEKL-N- (CH2) 2-SH (1325) (SEQ ID NO: 5) HS (CH2) 2-CONH-SIINFEKL (1051) HS (CH2) 2-CONH-FLSIINFEKL (1309) HS (CH2) 2-CONH-FLAAYSIINFEKL (1616) HS (CH2) 2-CONH-AAYSIINFEKL (1356) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2)2-CONH-SIINFEKL (1471) HS- (CH2) 10- (CHOCH2) 7-CONH-FLSIINFEKL (1732) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-CONH-FLAAYSIINFEKL (2034) HS-CH2) 10- (CH2OCH2) 7-CONH-AAYSIINFEKL (1774) NPs de prueba fueron sintetizadas usando 10 µ?t??? de cloruro de oro (Aldrich 484385) , 30 umol de glucosa con un enlazador de tioetilo (GlcC2) y 1.5 mol de ligando peptídico (variable 1.5-3 mg) .
Se usó el siguiente método: se disolvieron 1.5 mol de péptido en 2 mi de metanol, seguidos por la adición de 30 Umol de GlcC2 en 200 ul de metanol, y 116 l de cloruro de oro acuoso que contenía 10 um°l de Au . La muestra se remolinó durante 30 segundos, se agitó durante aproximadamente 5 minutos y luego bajo remolinado rápido durante un total de 30 segundos, se añadieron 200 ul de NaBH4 1M, los tubos se sellaron y luego se agitaron suavemente durante 1.5 hora.
Las muestras fueron centrifugadas en laboratorio, el sobrenadante fue removido y el sedimento oscuro se disolvió en 2 mi de agua, y luego se transfirió a un vivaspin de 10 kDa para un total de 4 veces de lavados con 2 mi de agua cada uno durante 8 minutos a 5 Krpm. Las nanopartículas (NPs) fueron retiradas de los vivaspins y constituidas a 500 µ? con agua, luego fueron sujetas a 15 Krp de centrifugado en laboratorio para remover cualquier agregado grande.
El contenido de oro después de la centrifugación/producción por ensayo en casa se muestra a continuación y el rendimiento de 100% sería 1.97 mg.
NPs 3, 4 y 5 mostraron una gran agregación completa, y la adición de DMSO a estos agregados falló en solubilizar esta partícula.
Las muestras de NP restantes fueron centrifugadas de nuevo para eliminar cualquier agregado adicional, y se tomaron alícuotas para permitir análisis posteriores, específicamente contenido de oro y péptido. Una alícuota se formó a 500 µ? con agua, se fechó y se marcó, éstas fueron usadas posteriormente para pruebas de presentación de HLA.
El análisis final de estas muestras de 500 µ? para presentación de HLA fue el siguiente: * BSA Std ** Estándar de Péptido Las relaciones de ligando usadas fueron tales que 2 péptidos teóricamente se unirían a cada NP de aproximadamente 100 átomos de Au, los datos anteriores sugieren aproximadamente 6-8 péptidos/100 átomos Au. Esto simplemente podría ser un artefacto del método BCA (un estándar de BSA) usado para la medición peptídica de péptidos unidos a NP o tal vez los ligandos péptidos se fijan.
El análisis de contenido de péptidos es tanto crucial como en este caso complejo, se usó el método BCA. Desafortunadamente, NPs de oro exhiben gran absorbencia uv/vis, por lo que además de llevar a cabo las muestras de prueba también se midieron alícuotas de NPs en agua y se pusieron contra agua para determinar su absorbancia a 565 nm la longitud de onda usada en el ensayo BCA, esta absorbancia equivalió a aproximadamente 20% del valor del ensayo BCA de muestra de prueba y se corrigió individualmente. Sin embargo, esta corrección asume que una NP peptídica sujeta a análisis BCA aún mantendría la misma absorbancia que la observada para la NP libre sobre el componente específico de BCA; esto coincide con los altos coeficientes de extinción vistos sólo con NPs de oro puro.
En la tabla anterior, * se refiere a cuantificación relacionada con un estándar de BSA inicialmente sobre una base de peso y luego convertido a moles de péptido, en la columna ** los ligandos peptídicos individuales fueron usados como estándares.
Análisis iniciales usando Sephadex G-50 con elución con PBS para intentar resolver péptido unido a NP en forma libre se llevó a cabo principalmente con NP6 , y sugiere que muy poco o ningún ligando libre contamina las preparaciones de NP. Se usó yodo para liberar todos los ligandos unidos a NP y el yodo empezó a aparecer en las fracciones 16+ para la figura 1.
Tamaños de fracción más grandes y cantidades equivalentes de NP antes y después del tratamiento con yodo fueron luego usados, el péptido liberado por yodo eluye con un pico en la fracción 10, este material parece más pequeño que el péptido estándar posiblemente debido a que éste último es oxidado/dimérico . Las correcciones individuales también se aplicaron para absorbancias no peptídicas a partir de NP6, áreas casi equivalentes bajo la curva fueron obtenidas para NP6 corregido y NP6 + yodo.
Producción de NP8 y 12 NP y 12 fueron producidas exitosamente por los métodos anteriores, las siguientes cuantificaciones representan la muestra de 500 µ? usada posteriormente, la cual a su vez es (60% de la preparación total) : * Determinado por método de Coomassie Producción repetida de NPs 2-5 NPs 2-5 fueron producidas por una variación usando 75% de metanol no 95% en la etapa de síntesis. NP2 Produjo una NP ¾ normal' como previamente, NPs 3, 4 y 5 como arriba formaron agregados, estos agregados no fueron solubles en agua, ácido acético al 10%, PBS, DMSO o DMF, sin embargo 300 mM de NaOH sí dieron como resultado disolución de NP total.
Síntesis adicional se llevó a cabo usando Sephadex G-50 para remover cualquier péptido libre. Estas NPs se hicieron como arriba pero con los siguientes cambios: Los péptidos libres no fueron completamente solubles en MeOH por lo que además de los 2 mi de MeOH se añadieron 100 µ? de agua más P8, 70 µ? de NaOH 1M y para P9 sólo 20 µ? de NaOH que se requirieron para llevar a cabo disolución de péptidos completa. NaOH es compatible con la síntesis de NP, el agua y álcali redujeron la reducción de borohidruro posterior en % de MeOH final a 82 y 83.5% para NP8 y NP9 respectivamente.
Se incluyó una etapa de lavado adicional después de la post - reducción de centrifugado inicial pero pre-vivaspin, esto se llevó a cabo con 2 mi de MeOH y 100 µ? de NaCl 1M .
La mitad post-vivaspin de cada preparación se sometió a una columna Sephadex G-50 eluida con PBS, las fracciones se recolectaron y alícuotas se midieron para proteína con BCA, fondos estrechos de las picos proteináceos principales fueron agrupados y luego sometidos de nuevo a vivaspin con lavados con agua para llevar a cabo cambio de solvente .
Sólo la mitad de la preparación de NP se pasó a G-50, los perfiles y fondos resultantes se encontró que estaban esencialmente libres de péptido libre. La coloración café de NP podría ser vista visualmente a la fracción 12, en una prueba separada 50 ul de la preparación de abastecimiento se volvió a correr bajo las mismas condiciones y la absorbancia a 515 nm fue medida (lo cual detectará NPs de AU no péptidos libres) y da una indicación de si la NP está arrastrando la columna G-50.
El material agrupado final tuvo las siguientes especificaciones : Los valores teóricos se determinan al asumir 44 ligandos/lOOAu, competencia aleatoria entre los dos ligandos en el momento de la formación de NP y el rendimiento de Au.
Liberación de ligando de NP con yodo Una alícuota de NP9 se midió con un exceso en volumen de 4 veces de KI 1M y se dejó a 4°C durante 4 días, para de esta manera dar como resultado una liberación de ligando completa. Después de 4 días, el material se centrifugó y el sobrenadante claro se pasó a G-50 y las fracciones se recogieron y ensayaron por BCA. La cantidad de NP9 post KI ensayada fue exactamente el doble que la usada para la NP9 sola (una corrección de 1.1 se aplicó para diferencias de absorbancia entre ensayo) , se encontró que las áreas eran casi exactamente 2:1 sugiriendo una remoción de ligando completa. La cantidad de ligando liberado se cuantificó usando dos ensayos: Coomassie y BCA en conjunto con 2 estándares de péptidos 9 y BSA, y se tabula abajo.
Los datos en la tabla han sido corregidos hasta el rendimiento esperado total para la preparación completa.
En conclusión, NPs que contienen péptido han sido sintetizadas. Las NPs peptídicas están esencialmente libres de péptidos libres contaminantes mediante el uso simple de cromatografía de filtración en gel Sephadex G-50. Se usó yodo exitosamente para liberar péptido unido a NP, y dio datos de rendimiento cuantitativos.
Ejemplo 2 - Evaluación de ensayos de presentación Los receptores de células T (TCR) están sobre la superficie de linfocitos T y reconocen péptidos en el contexto de complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) (1) . Generalmente, células presentadoras de antígeno (APC) contienen la maquinaria para procesar proteínas y cargarlas sobre MHC vacías. Aunque las células T CD4+ reconocen MHC clase II (MHCII) , las células T CD8+ responden a MHC clase I (MHCI) . Convencionalmente , los péptidos MHCII se derivan de componentes endocitosados del medio extracelular . En contraste, MHCI carga péptidos procesados de una fuente intracelular (1, 2) .
SIINFEKL (SEQ ID NO: 2), un epítopo peptídico que se deriva de ovoalbúmina (OVA) , se presenta en el contexto de un alelo MHCI de murino llamado H-2Kb (3) . Si OVA se expresa en una célula de murino que expresa H-2Kb, SIINFEKL se presenta convencionalmente. Sin embargo, si OVA se suministra exógenamente , SIINFEKL puede presentarse por un proceso alternativo conocido como presentación cruzada de MHCI (4, 5) . De hecho, ratón igualado a haplotipo inmunizado con OVA genera una respuesta inmunodominante a SIINFEKL (SEQ ID NO: 2) .
Por lo tanto, se han desarrollado muchos reactivos para ensayar la presentación de este péptido en un esfuerzo por entender más la presentación de MHCI convencional y alternativa. Estos reactivos pueden usarse para experimentar con los enlaces químicos potenciales de péptidos en nanopartículas . Así, se puede develar qué enlace se procesa más fácilmente en una Línea celulars de ratón.
Resultados y discusión Citometría de flujo como una medida de presentación Para analizar el enlace de epítopos a nanopartículas , se optimizó primero un ensayo de lectura para la presentación del epítopo liberado de la nanopartícula . Para este propósito, la presentación de SIINFEKL en células LKb fue evaluada. Como se mencionó anteriormente, existe más de un reactivo. De los dos métodos probados, uno es a base de citometría de flujo, mientras que el otro es a base de células. El método a base de citometría de flujo empieza con pulsar células LKB con diferentes cantidades de péptido SIINFEKL. Después de dejar tiempo suficiente para que el péptido se usa a las moléculas de superficie Kb' , las células fueron lavadas e incubadas con el anticuerpo 25. DI.16 que es específico para el complejo SIINFEKL:Kb. Después, las células fueron marcadas secundariamente y sujetas a análisis de citometría de flujo usando células no pulsadas como la lectura de fondo. Se encontró que este método detectó complejos en superficie cuando las células fueron pulsadas con tan poco como 5 ng/mL.
Activación de células T como una medida de presentación de antigenos Otra forma de presentación de antígenos específica de epítopo es la medición de la activación de células T por el complejo de péptido MHCI . Aquí, se usó B3z (Línea celulars T específica de células T OVA) , que reconoce SIINFEKL en el contexto de Kb . Como una medida conveniente, esta Línea celulars T contiene ß-galactosidasa clonada con el promotor NFAT . Después del reconocimiento de péptido y activación de células T, ß-galactosidasa se expresa y la conversión de un substrato detectable sirve como una excelente medida de presentación de antígenos a células T.
Para evaluar este método, se llevó a cabo un experimento similar al de arriba. Células LKb fueron pulsadas con péptido SINNFEKL, lavadas y luego co- incubadas con Línea celulars T B3Z durante la noche. El día siguiente, las células fueron lisadas y ß-galactosidasa fue medida usando un substrato luminiscente. Como se esperaba, la resolución de este método fue similar a la del método anterior con el límite de detección a aproximadamente 5 ng/mL.
Por lo tanto, ambos métodos exhiben aproximadamente la misma resolución y fueron seleccionados para usarse en la evaluación de construcciones de péptidos-nanopartículas .
Materiales y métodos Líneas celulares Células LKb son fibroblastos de ratón y fueron la línea principal usada. Específicamente, son células L929 que expresan establemente la molécula H-2Kb de murino.
Péptidos sintéticos Péptidos SIINFEKL (OVA 257-264) (SEQ ID NO: 2) sintéticos fueron comprados de Genscript USA (Piscataway, NJ) . Los péptidos fueron resuspendidos a 5 mg/mL en DMSO y pulsados sobre células a la concentración indicada en las figuras .
Hibrido as de células T El hibridoma T específico de SIINFEKL :Kb (B3Z) expresa ß-galactosidasa después del reconocimiento de complejos péptido-MHC clase I y ha sido descrito previamente (3, 6) . Los hibridomas de células T se mantuvieron en RPMI completo más 10% de FCS y 0.05 mM de 2 -ME. La activación se midió usando el substrato luminiscente Galactolight Plus (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La intensidad de luz se midió usando un lector de placa TopCount NXT (Perkin Elmer, Waltham, MA) .
Ci ómetría de flujo Células LKb fueron tratadas con cantidades variables de péptidos SIINFEKL (SEQ ID NO: 2) . Después de una incubación de 2 horas, las células fueron recolectadas, lavadas una vez con PBS y luego incubadas durante 1 hora con sobrenadante de cultivo 25. DI.16 (anticuerpo monoclonal específico para SIINFEKL acomplejado con H-2Kb) (7) en hielo. Las células fueron luego lavadas dos veces en PBS e incubadas durante 30 minutos en hielo con anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra marcado con FITC (Caltag Laboratories, Burlingham, CA) . Finalmente, las células fueron lavadas dos veces con PBS y resuspendidas en PBS+ .1% de BSA para citometría de flujo en un citómetro de flujo Guava EasyCyte Plus (Millipore, Billerica, MA) se analizaron usando el software acompañante.
Ensayos de presentación de antígenos Para ensayar la presentación de SIINFEKL (SEQ ID NO: 2) usando un método citométrico de flujo o a base de células, pulsamos células LKb en un cono de 15 mL a 37°C durante 2 horas. Después de esta incubación, las células fueron lavadas una vez con PBS y luego sujetas a detección usando citometría de flujo o añadidas a células B3Z a una relación efectora objetivo de 1:1.
Referencias 1. Vyas, J. M . , A. G. Van der Veen, y H. L. Ploegh. 2008. The known unknowns of antigen processing and presentation . Nature reviews 8:607-618. 2. Hansen, T. H., y M. Bouvier. 2009. MHC class I antigen presentation : learning from viral evasión strategies. Nature reviews 9:503-513. 3. Shastri, N. , y F. González. 1993. Endogenous generation and presentation of the ovalbumin peptide/Kb complex to T cells. Journal of Immunology 150:2724-2736. 4. Amigorena, S., y A. Savina. 2010. Intracellular mechanisms of antigen cross presentation in dendritic cells. Current opinión in immunology 22:109-117. 5. Blanchard, N . , y N. Shastri. 2010. Cross-presentation of peptides from intracellular pathogens by MHC class I molecules. Annals of the New York Academy of Sciences 1183 :237-250. 6. Tewari, M. K. , G. Sinnathamby, D. Rajagopal, y L. C. Eisenlohr. 2005. A cytosolic pathway for MHC class II-restricted antigen processing that is proteasome and TAP dependent . Nature immunology 6:287-294. 7. Porgador, A., J. . Yewdell, Y. Deng, J. R. Bennink, y R. N. Germain. 1997. Localization, quantitation, and in situ detection of specific peptide-MHC class I complexes using a monoclonal antibody. Immunity 6:715-726.
Ejemplo 3 - Ensayos de presentación de nanopartículas -péptidos Los ligandos de prueba listados abajo se construyeron y fijaron a nanopartículas de oro (GNP) por la química enlazadora descrita arriba. 1. SIINFEKL (SEQ ID NO : 2) 2. SIINFEKL-N- (CH2) 2-SH 3. FLSIINFEKL-N- (CH2) 2-SH (SEQ ID NO : 3) 4. FLAAYSIINFEKL-N- (CH2) 2-SH (SEQ ID NO: 4) 5. AAYSIINFEKL-N- (CH2) 2-SH (SEQ ID NO: 5) 6. HS (CH2) 2 -CONH-SIINFEKL 7. HS (CH2) 2 -CONH-FLSIINFEKL 8. HS (CH2) 2 -CONH-FLAAYSIINFEKL 9. HS (CH2) 2 -CONH-AAYSIINFEKL 10. HS- (CH2) 10- (CH20CH2) 2 -CONH-SIINFEKL 11. HS- (CH2) 10- (CH20CH2) 7 -CONH-FLSIINFEKL 12. HS- (CH2) 10- (CH20CH2) 7 -CONH-FLAAYSIINFEKL 13. HS-CH2) 10- (CH20CH2) 7-CONH-AAYSIINFEKL SIINFEKL (SEQ ID NO: 2), un epítopo derivado de ovoalbúmina que se presenta en el contexto de molécula MHCI de murino H-2Kb, se midió usando dos métodos. Un método utilizó un anticuerpo tipo TCR llamado 25. DI.16, conocido también como "Angel", que reconoce el complejo SIINFEKL/MHCI . Además, se evaluó la presentación usando el hibridoma CTL especifico de péptido SIINFEKL, B3Z, el cual expresa beta-galactosidasa bajo el promotor de NFAT (molécula de señalización de CTL) , que después de la activación expresa beta-gal medido por un substrato emisor de luz.
A. Análisis de GNP Para evaluar la capacidad de las células para procesar y presentar SIINFEKL asociado con GNP, se usaron fibroblastos de raurino L-Kb. Como se demostró en la figura 1, las GNPs 8, 9, 12 y 13 exhibieron buen procesamiento y presentación. Esto se encontró que era el caso tanto para los métodos citométrico de flujo (procesamiento de las figuras 1A-1D) como métodos a base de CTL (figura 1E - presentación) . Así, FLAAYSIINFEKL (SEQ ID NO : 4) y AAYSIINFEKL (SEQ ID NO: 5) exhibieron superior procesamiento de SIINFEKL in vitro (SEQ ID NO: 2) (la porción subrayada muestra la porción peptídica del enlazador. Asimismo, como se ilustra en la figura 1E, la química de HS- (CH2) 10- (CH20CH2) 7-CONH se encontró que era mejor procesada que HS (CH2) 2-CONH. Sin embargo, HS (CH2) 2 -CONH aún se encontró que era procesado muy eficientemente. Además, notamos una reducción dependiente de dosis de presentación sin detección a 0.01 g/ml.
B. Análisis de péptido libre Fue importante considerar los posibles efectos de cualquier péptido presente en las muestras de nanopartículas (figuras 2A-2B) . Por lo tanto, se evaluó qué tan eficientemente el péptido libre correspondiente de cada preparación es presentado. De manera similar a experimentos previos, células LKb fueron pulsadas durante 2 horas con tres concentraciones de GNP o péptido libre. La presentación fue evaluada mediante citometría de flujo (figuras 2C-F) o ensayo B3Z (figuras 2G-H) . De estos resultados, redujimos que el péptido libre se presenta bien. Finalmente, buscamos probar si el procesamiento es necesario para la presentación de estos péptidos libres. Una prueba requiere el pulsado de péptidos en hielo en comparación con 37°C. A 37°C, las células pueden absorber péptido y procesarlo dentro del endosoma, sin embargo, en hielo, el péptido sólo puede ser cargado sobre la superficie sin procesamiento. De hecho, observamos que péptidos libres con enlazadores generalmente requieren procesamiento mientras el péptido sin el enlazador puede ser presentado (figuras 2I-2N) sin ningún procesamiento .
C. Análisis de preparaciones que carecen de péptido libre En vista de los resultados que demuestran el posible efecto de péptidos libres contaminantes, se hicieron preparaciones purificadas. La purificación se llevó a cabo en los GNPs (8 y 9) usando una columna Sephadex G-50 removiendo todo el péptido libre (figuras 3A-3B) . Finalmente, los experimentos anteriores se repitieron usando preparaciones previas y más recientes en el mismo ensayo. Se extendió la incubación de dos horas a un periodo nocturno, que había mostrado ser suficiente para la presentación de SIINFEKL (datos no mostrados) . Después del análisis citométrico de flujo, se observó que las muestras que carecían de péptido libre funcionan justo también como aquellas que contienen péptido (figuras 3C-3E) . Estos resultados fueron confirmados después usando un ensayo B3Z (figura 3F) . Por lo tanto, es claro que GNPs 8 y 9 sirven como una opción viable para el suministro de péptidos a una célula presentadora de antígenos para la presentación de MHCI .
D. Conclusiones • GNPs 8, 9, 12 y 13 se procesan y presentan muy bien en comparación con las demás.
• Esto corresponde a las secuencias FLAAYSIINFEKL (SEQ ID NO: 4) y AAYSIINFEKL (SEQ ID NO: 5) que son las mejores para la presentación de SIINFEKL in vitro (SEQ ID NO: 2) (porción peptídica del enlazador mostrada subrayada) .
• La química HS- (CH2 ) 10- (CH20CH2 ) 7-CONH se procesa mejor que HS (CH2 ) 2 -CONH . Sin embargo, HS (CH2 ) 2 -CONH también se procesa muy bien aunque es más económica.
• Péptidos libres contaminantes pueden dar origen a presentación .
• Preparaciones más recientes, las cuales carecen de péptido libre, también se procesan y presentan bien.
· Esto sugiere que GNPs 8 y 9 se procesan eficientemente para presentación de SIINFEKL (SEQ ID NO: 2) .
Todas las referencias citadas en la presente se incorporan aquí por referencia en su totalidad y para todos los propósitos al mismo grado que si cada publicación o patente o solicitud de patente individual estuviera específica e individualmente indicada como incorporada por referencia en su totalidad.
Las modalidades específicas descritas en la presente se ofrecen a manera de ejemplo, no a manera de limitación. Cualesquiera subtítulos en la presente están incluidos para conveniencia únicamente, y no se debe considerar como limitando la descripción de ninguna manera.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (80)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una nanopartícula caracterizada porque comprende : (i) un núcleo que comprende un metal y/o un átomo semiconductor; (ii) una corona que comprende una pluralidad de ligandos unidos covalentemente al núcleo, en donde al menos un primer ligando de la pluralidad comprende una porción de carbohidrato que está unida covalentemente al núcleo a través de un primera enlazador o comprende glutatión, y en donde al menos un segundo ligando de la pluralidad comprende un péptido de elección que está unido covalentemente al núcleo a través de un segundo enlazador, el segundo enlazador comprende : una porción peptídica y una porción no peptídica, en donde la porción peptídica del segundo enlazador comprende la secuencia XiX2Zi, en donde: X es un aminoácido seleccionado de A y G; X2 es un aminoácido seleccionado de A y G; y Zi es un aminoácido seleccionado de Y y F.
2. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la porción no peptídica del segundo enlazador comprende alquilo de C2-C15 y/o glicol de C2-C15.
3. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada porque el primer ligando y/o el segundo ligando se unen covalentemente al núcleo a través de un grupo que contiene azufre, un grupo que contiene amino, un grupo que contiene fosfato o un grupo que contiene oxígeno.
4. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la porción peptídica del segundo enlazador comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de: (i) AAY; y (ii) FLAAY (SEQ ID NO: 1) .
5. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el segundo enlazador se selecciona del grupo que consiste en: (i) HS- (CH2) 2-CONH-AAY; (ii) HS- (CH2) 2-CONH-FLAAY; (iii) HS- (CH2) 3-CONH-AAY; (iv) HS - (CH2) 3-CONH-FLAAY; (v) HS- (CH2) io- (CH2OCH2) 7-CONH-FLAAY, en donde el segundo enlazador se enlaza covalentemente al núcleo por medio del grupo tiol de la porción no peptídica del enlazador.
6. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el péptido de elección es enlazado por un medio de su extremo N-terminal a la porción peptídica del segundo enlazador.
7. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el segundo ligando se selecciona del grupo que consiste en: (i) HS- (CH2) 2-CONH-AAYZ2; (ii) HS- (CH2) 2-CONH-FLAAYZ2; (iii) HS- (CH2) 3-CONH-AAYZ2 ; (iv) HS- (CH2 ) 3-CONH- FLAAYZ2 ; (v) HS - (CH2) io- (CH2OCH2) 7-CONH- FLAAYZ2 ; y (vi) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH-FLAAYZ2, en donde Z2 representa el péptido de elección.
8. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el péptido de elección es un péptido epitópico que se une a una molécula de complejo de histocompatibil idad mayor (MHC) clase I o es capaz de ser procesado para de esta manera unirse a una molécula MHC clase I .
9. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el péptido de elección consiste en una secuencia de 8 a 40 residuos de aminoácido.
10. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el péptido de elección puede consistir en una secuencia de 8 a 12 residuos de aminoácido .
11. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el péptido de elección es un péptido epitópico que es capaz de ser presentado por una molécula HC clase I para de esta forma estimular una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) .
12. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el péptido de elección forma al menos una porción de o se deriva a partir de un antígeno asociado a tumor (TAA) o un antígeno asociado a virus, bacterias o parásitos.
13. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el TAA es un antígeno de cáncer pulmonar.
14. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el cáncer pulmonar se selecciona de: carcinoma pulmonar microcítico y cualquier carcinoma pulmonar no microcítico, opcionalmente en donde el carcinoma pulmonar no microcítico comprende un adenocarcinoma .
15. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el antígeno asociado a patógeno es un antígeno viral, bacteriano o parasítico.
16. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque el péptido de elección se deriva de la ovoalbúmina (OVA) .
17. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el péptido de elección comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SIINFEKL (SEQ ID NO : 2) .
18. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque: (i) la porción de carbohidrato del primer ligando comprende un monosacárido y/o un disacárido; y/o (ii) la pluralidad de ligandos comprenden al menos un ligando de glutatión unido covalentemente al núcleo de la nanopartícula a través del átomo de azufre del glutatión; y/o (iii) la pluralidad de ligandos comprenden: (a) glucosa; (b) N-acetilglucosamina; (c) glutatión; (d) glucosa y N-acetilglucosamina; (e) glucosa y glutatión; (f) N-acetilglucosamina y glutathionie; o (g) glucosa, N-acetilglucosamina y glutatión.
19. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 18 (i), caracterizada porque la porción de carbohidrato puede comprender glucosa, mañosa, fucosa y/o N-acetilglucosamina .
20. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el primer enlazador comprende alquilo de C2-C15 y/o glicol de C2-C15.
21. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el primer ligando comprende 2 ' -tioetil-P-D-glucopiranósido o 2'-tioetil -a-D-glucopiranósido fijados covalentemente al núcleo por medio del átomo de azufre de tiol.
22. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40 o al menos 50 ligandos que contienen carbohidratos y/o ligandos de glutatión.
23. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 ligandos que contienen péptido de interés.
24. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la relación molar de ligandos que contienen carbohidrato y/o ligandos de glutatión a ligandos que contienen péptido de interés está en el intervalo de 5:1 a 100:1.
25. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la relación molar de ligandos que contienen carbohidrato y/o ligandos de glutatión a ligandos que contienen péptido de interés está en el intervalo de 10:1 a 30:1.
26. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el diámetro del núcleo de la nanopartícula está en el intervalo de 1 nm a 5 nm.
27. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el diámetro de la nanopartícula incluyendo sus ligandos está en el intervalo de 5 nm a 20 nm, opcionalmente 5 nm a 15 nm u 8 nm a 10 nm.
28. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el núcleo comprende un metal seleccionado del grupo que consiste en: Au, Ag, Cu, Pt, Pd, Fe, Co, Gd y Zn, o cualquier combinación de los mismos.
29. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque el núcleo comprende un metal pasivo seleccionado del grupo que consiste en: Au, Ag, Pt, Pd y Cu, o cualquier combinación de los mismos.
30. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el núcleo comprende una combinación de metales seleccionados del grupo que consiste en: Au/Fe, Au/Ag, Au/Cu, Au/Ag/Cu, Au/Pt, Au/Pd, Au/Ag/Cu/Pd, Au/Gd, Au/Fe/Cu, Au/Fe/Gd y Au/Fe/Cu/Gd.
31. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el núcleo es magnético.
32. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el núcleo comprende además un átomo activo en RMN seleccionado del grupo que consiste en: Mn2+, Ge, Eu2+, Cu2+, V2+, Ce, Ni2+, Fe2+, Fe3+ y + lantánidos3+ .
33. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el núcleo comprende un semiconductor.
34. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque el semiconductor se selecciona del grupo que consiste en: selenuro de cadmio, sulfuro de cadmio, teluro de cadmio y sulfuro de zinc.
35. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 33 o la reivindicación 34, caracterizada porque el núcleo es capaz de actuar como un punto cuántico.
36. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende al menos dos ligandos que contienen péptidos de elección, y en donde el péptido de elección de cada uno de los por lo menos dos ligandos que contienen péptidos de elección difieren.
37. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque los péptidos de elección de los por lo menos dos ligandos que contienen péptidos de elección forman cada uno al menos una porción de o cada uno son derivados de uno o más TAAs .
38. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque los péptidos de elección de los por lo menos dos ligandos que contienen péptidos de elección forman cada uno al menos una porción de o cada uno son derivados de un TAA de cáncer pulmonar diferente .
39. Una composición caracterizada porque comprende una pluralidad de nanopartículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
40. La composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque comprende además al menos un portador, sal y/o diluyente farmacéuticamente aceptable .
41. La composición de conformidad con la reivindicación 39 o la reivindicación 40, caracterizada porque comprende una primer especie de nanopartícula que tiene un primer ligando que contiene péptido de elección y una segunda especie de nanopartícula que tiene un segundo ligando que contiene péptido de elección, en donde los péptidos de elección de la primera y segunda especies difieren .
42. La composición de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque los péptidos de elección de cada una de la primera y segunda especies de nanopartículas forman al menos una porción de o cada uno es derivado de uno o más TAAs .
43. La composición de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque los péptidos de elección de cada una de las primera y segunda especies de nanopartícula cada uno forma al menos una porción de o cada uno se deriva de un TAA de cáncer de pulmón diferente.
44. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 43, caracterizada porque comprende un fondo de al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 10 especies de nanopartícula diferentes, cada especie teniendo un péptido de elección diferente.
45. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 44, caracterizada porque comprende además al menos un adyuvante .
46. La composición de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque el adyuvante es fijado covalentemente al núcleo de al menos una nanopart ícula .
47. La composición de conformidad con la reivindicación 45 o la reivindicación 46, caracterizada porque el adyuvante comprende (S) - (2 , 3 -bis (palmitoiloxi) -(2RS) -propil) -iV-palmitoil- (R) -Cys- (S) -Ser (S) -Lys4-OH ("Pam3Cys") .
48. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 44, caracterizada porque está sustancialmente libre de adyuvante o en donde el único efecto adyuvante es proporcionado por las nanopartículas .
49. Una vacuna caracterizada porque comprende la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 48.
50. La vacuna de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque es para el tratamiento terapéutico o profiláctico de un cáncer.
51. La vacuna de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque el cáncer es un cáncer de pulmón.
52. La vacuna de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque el cáncer de pulmón se selecciona de: carcinoma de pulmón microcítico y cualquier carcinoma de pulmón no microcítico, opcionalmente en donde el carcinoma de pulmón no microcítico comprende un adenocarcinoma .
53. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 48, o la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 52, para usarse en medicina.
54. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 48, o la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 52, para usarse en un método de tratamiento de un cáncer o una infección patógena en un sujeto mamífero.
55. La nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 48, o la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 52, para usarse en un método de tratamiento de un cáncer de pulmón en un sujeto mamífero.
56. La nanopartícula, composición o vacuna para usarse en un método de conformidad con la reivindicación 55, en donde el cáncer de pulmón se selecciona de: carcinoma de pulmón microcítico y cualquier carcinoma de pulmón no microcítico, opcionalmente en donde el carcinoma de pulmón no microcítico comprende un adenocarcinoma .
57. Uso de la nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 48, o la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 52, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer o una infección patógena en un sujeto mamífero.
58. Uso de la nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 48, o la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 52, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer de pulmón en un sujeto mamífero .
59. El uso de conformidad con la reivindicación 58, en donde el cáncer de pulmón se selecciona de : carcinoma de pulmón microcítico y cualquier carcinoma de pulmón no microcítico, opcionalmente en donde el carcinoma de pulmón no microcítico comprende un adenocarcinoma .
60. La nanopartícula, composición o vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 53 a 56 o el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 57 a 59, en donde la nanopartícula, composición, vacuna o medicamento es para administración a través de absorción linfática .
61. Un método de tratamiento profiláctico o terapéutico de un cáncer o una infección patógena, caracterizado porque comprende administrar una cantidad profiláctica o terapéuticamente suficiente de la nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 48, o la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 52 a un sujeto mamífero que lo requiera.
62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el cáncer es un cáncer de pulmón.
63. El método de conformidad con la reivindicación 61 o la reivindicación 62, caracterizado porque el cáncer de pulmón se selecciona de: carcinoma de pulmón microcítico y cualquier carcinoma de pulmón no microcítico, opcionalmente en donde el carcinoma de pulmón no microcítico comprende un adenocarcinoma .
64. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61 a 63, caracterizado porque la nanopartícula, composición o vacuna se administra en un sitio para absorción linfática.
65. Un método in vitro o in vivo para generar una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) , caracterizado porque comprende : (i) poner en contacto al menos una célula presentadora de antígeno (APC) con al menos una nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, de manera que el péptido de elección se presente en una molécula MHC clase I de la APC; y (ii) poner en contacto la por lo menos una de APC de (i) con al menos una célula CTL, de tal manera que la célula CTL se active por la APC para generar una respuesta de CTL que sea específica para el péptido de elección, en donde el péptido de elección es un péptido epítópico.
66. El método in vítro de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la APC se cultiva en presencia de la nanopartícula, y, simultánea o secuencialmente , co-cultivada con la célula CTL.
67. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la APC se somete a una etapa de lavado después de haber sido puesta en contacto con la nanopartícula antes de ser co-cultivada con la célula CTL.
68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque comprende además administrar la célula CTL a un sujeto mamífero.
69. El método in vivo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la nanopartícula es suministrada por una vía de administración seleccionada del grupo que consiste en: inyección en un órgano o tejido de un sujeto mamífero en, o en las proximidades de, un sitio de absorción linfática; administración nasal a través de un spray o gel; suministro bucal a través de un spray o gel o película soluble por vía oral; suministro oral a través de una película soluble; administración transdérmica mediante un parche que incorpora la nanopartícula ; y administración por inhalación de una composición que comprende la nanopartícula.
70. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 a 69, caracterizado porque la por lo menos una nanopartícula comprende un fondo de nanopartículas que tienen diferentes péptidos de elección.
71. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 a 66, caracterizado porque la respuesta de CTL comprende la producción de una o más citocinas.
72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la una o más citocinas comprenden interferón gamma (IFN-gamma) .
73. Un método para producir la nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, caracterizado porque comprende: derivar el carbohidrato con el primer enlazador; derivar el péptido de elección con el segundo enlazador; y hacer reaccionar el carbohidrato derivado con primer enlazador y el péptido elección derivado con segundo enlazador con reactivos para producir el núcleo de la nanopartícula de manera que durante el auto-ensamblaj e de la nanopartícula , el núcleo de la nanopartícula se fije al carbohidrato y al péptido de elección a través de sus respectivos enlazadores.
74. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque la mezcla de reacción comprende el carbohidrato derivado, el péptido de elección derivado, una sal del metal y/o átomos semiconductores y un agente reductor para producir la nanopartícula.
75. El método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el producto de reacción, incluyendo la nanopartícula, se somete a una etapa de purificación para eliminar el péptido libre sin reaccionar, opcionalmente en donde la etapa de purificación comprende ejecutar el producto de reacción a través de una columna G-50 Sephadex™.
76. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73 a 75, caracterizado porque comprende además la etapa de formular la nanopartícula en una composición con al menos un portador, sal o diluyente farmacéuticamente aceptable.
77. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73 a 76, caracterizado porque es para fijar el péptido de elección a través del segundo enlazador a la nanopartícula de tal manera que la nanopartícula con el péptido de elección fijado sea capaz de ser internalizada por una célula.
78. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque es para fijar el péptido de elección a través del segundo enlazador a la nanopartícula de tal manera que la nanopartícula con el péptido de elección fijado sea capaz de ser internalizada por una célula presentadora de antígeno (APC) .
79. Un método para el suministro intracelular de un péptido de elección, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula con la nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, o la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 48.
80. Uso de la nanopartícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, o la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 48, para el suministro intracelular del péptido de elección.
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