ES2346319T3 - Nanoparticulas. - Google Patents
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Abstract
Nanopartícula que comprende un núcleo de átomos de metal o semiconductores unidos covalentemente a, por lo menos, 20 ligandos, donde la nanopartícula tiene dos o más especies de ligando unidas al núcleo y donde una de las especies de ligando comprende un grupo de hidratos de carbono.
Description
Nanopartículas.
La presente invención se refiere a
nanopartículas, y en particular a nanopartículas que tienen ligandos
inmovilizados que comprenden grupos hidratos de carbono, y a su uso
en el estudio de la interacción de estos ligandos con otras
especies. La presente invención se refiere además a aplicaciones de
las nanopartículas, por ejemplo para cribado, diagnosis y
terapia.
Existen tres clases importantes de biopolímeros,
los ácidos nucleicos, las proteínas y los hidrato de carbono. La
estructura y las interacciones de las proteínas y los ácidos
nucleicos se han estudiado de manera extensiva en la técnica y el
hecho de que la síntesis de las proteínas y los ácidos nucleicos se
efectúe dirigida con una plantilla y que estos polímeros sean
lineales ha dado lugar a que las técnicas para su producción y su
estudio se hayan automatizado ampliamente.
Sin embargo, los hidratos de carbono y sus
interacciones con otras especies son también de extrema importancia
biológica y no han sido objeto de estudios concertados. La
dificultad en el estudio de los hidratos de carbono y sus
interacciones proviene de la diversidad de los enlaces de los
hidratos de carbono y del hecho de que no existen técnicas análogas
a la clonación para amplificar y modificar los hidratos de carbono.
Por el contrario, el complejo camino de multietapas en el que se
ensamblan los hidratos de carbono en las células significa que los
hidratos de carbono y los glicoconjugados asociados tales como
glicoproteínas y glicolípidos se caracterizan por un alto grado de
variabilidad y no resulta trivial su síntesis o su estudio. Además,
las interacciones mediadas por hidratos de carbono tienden a ser
débiles y polivalentes y, por consiguiente, difíciles de detectar.
Por tanto, no existen en la técnica herramientas satisfactorias para
llevarlo a cabo.
Sin embargo, a pesar de estas características,
las interacciones mediadas por hidratos de carbono son
biológicamente importantes. Las superficies de muchos tipos de
células están cubiertas con una densa capa de glicoconjugados que
dan lugar a los denominados glicocálices. Se cree que el glicocáliz
es el responsable de las fuerzas repulsivas que evitan la adhesión
no específica de las células. Sin embargo, en algunas
configuraciones de las células, la barrera repulsiva se encuentra
contrabalanceada por la formación de contactos
célula-célula a través de fuerzas atractivas
^{[1]}. Ahora existe evidencia de que, aparte de las bien
conocidas interacciones de hidratos de
carbono-proteína^{[2]}, las células usan las
interacciones atractivas entre la superficies de los hidratos de
carbono como un nuevo mecanismo para la adhesión y reconocimiento de
las células^{[3]}. Un hecho característico de estas interacciones
es su baja afinidad, que está compensada mediante una presentación
polivalente de ligandos y receptores en la superficie de las
células^{[4]}.
Las investigaciones de las interacciones entre
hidratos de carbono-proteína polivalentes se han
llevado a cabo usando diferentes sistemas de modelos de hidratos de
carbono multivalente^{[5]}. Los ejemplos de aproximaciones en
antecedentes de la técnica incluyen conjuntos de dos dimensiones de
glicoconjugados sobre superficies de oro^{[6a]}, el uso de
liposomas para desplegar los hidratos de carbono, la tecnología de
dendrímeros y el uso de polímeros para proporcionar conjuntos de
hidratos de carbono esféricos y lineales^{[5a,b]}. Sin embargo,
los problemas del estudio de las interacciones que implican hidratos
de carbono se encuentran lejos de estar resueltos y existe en la
técnica una continua necesidad de nuevos procedimientos y
herramientas para llevarlo a cabo.
El documento WO 99/61911A describe partículas de
tamaño nanométrico funcionalizadas que comprenden un núcleo que
comprende por lo menos un metal o una aleación metálica.
De manera amplia, la presente invención
proporciona materiales y procedimientos para el estudio y la
modulación de la interacción de los hidratos de carbono que
contienen partes con otras especies. En particular, la presente
invención proporciona partículas pequeñas, p.e., grupos de átomos de
metal y opcionalmente semiconductores, que se pueden emplear como
substrato para inmovilizar una diversidad de ligandos, comprendiendo
estos ligandos a grupos de hidratos de carbono. Estas
"nanopartículas" se pueden usar a continuación para estudiar
las interacciones mediadas por hidratos de carbono, p.e., con otros
hidratos de carbono o proteínas, y como reactivos terapéuticos o
para diagnóstico. Por tanto, la presente invención proporciona un
medio para dar lugar a un conjunto esférico del ligando
inmovilizado sobre una partícula detectable. En algunas
realizaciones, las partículas tienen la ventaja adicional de que
son solubles, p.e., en agua y en diferentes solventes orgánicos, y
se pueden usar en diversos formatos de aplicaciones homogéneas.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la
presente invención proporciona una nanopartícula que comprende un
núcleo de átomos de metal o semiconductores unidos covalentemente a,
por lo menos, 20 ligandos, donde las nanopartículas tienen dos o
más especies de ligando unidas al núcleo y donde una de las especies
de ligando comprende un grupo de hidratos de carbono. Los ligandos
pueden comprender los grupos de hidratos de carbono solos o en
combinación con péptidos, dominios de proteínas, segmentos de ácido
nucleico o grupos fluorescentes.
\global\parskip0.880000\baselineskip
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona composiciones que comprenden poblaciones de una o más
de las partículas definidas anteriormente. En algunas realizaciones,
las poblaciones de nanopartículas pueden tener diferentes
densidades de los mismos o diferentes ligandos unidos al núcleo.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona las partículas definidas anteriormente para su uso en
un procedimiento de tratamiento químico.
En todavía otro aspecto, la presente invención
proporciona el uso de las partículas definidas anteriormente para
la preparación de un medicamento para el tratamiento de una
condición que se mejora mediante la administración del ligando. A
modo de ejemplo, esto puede ocurrir cuando el ligando bloquea una
interacción mediada por hidratos de carbono que, de otra manera,
tiende a llevar a una patología.
En esta realización, la presente invención tiene
ventajas sobre las aproximaciones que existen en la técnica
anterior para el tratamiento de las condiciones que implican
interacciones mediadas por hidratos de carbono. Tal como se ha
descrito anteriormente, de manera típica las interacciones son
polivalentes mientras que el agente usado para tratar las
interacciones sólo es capaz, a menudo, de modular una o unas pocas
de estas interacciones. El resultado es que resulta difícil que un
agente llegue al punto de la interacción que es capaz de modular
fiablemente la interacción del efecto terapéutico deseado. En
contraste con este problema, la presente invención proporciona
agentes que tienen una diversidad de ligandos para la modulación de
las interacciones mediadas por hidratos de carbono, salvando
potencialmente la dificultad en la modulación de las interacciones
polivalentes.
En las realizaciones preferidas, el diámetro
medio del núcleo, preferiblemente el núcleo metálico, tiene entre
0,5 y 100 nm, más preferiblemente entre 1 y 50 nm, y todavía más
preferiblemente entre 1 y 20 nm. El diámetro medio se puede medir
usando sistemas bien conocidos en la técnica, tal como la
microscopía electrónica de transmisión.
El material del núcleo puede ser un metal y
opcionalmente comprende además un semiconductor, y puede estar
formado por más de un tipo de átomo. Preferiblemente, el material
del núcleo es un metal seleccionado entre Au, Ag o Cu. También se
han descrito núcleos de nanopartículas formadas por aleaciones,
incluyendo Au/Ag, Au/Cu, Au/Ag/Cu, Au/Pt, Au/Pd y Au/Ag/Cu/Pd y se
pueden usar en la presente invención. Los materiales preferidos
para el núcleo son Au y Ag, siendo el Au el material más preferido.
Cuando se usan agregados de oro, preferiblemente tienen entre
aproximadamente 100 y 500 átomos de oro para proporcionar diámetros
del núcleo en el rango del nanómetro. Otros materiales del núcleo
particularmente útiles son, o están recubiertos con uno o más
átomos que son, activos a la RMN, permitiendo así que las
nanopartículas se puedan detectar usando la RMN, tanto in
vitro como in vivo. Ejemplos de átomos activos a la RMN
incluyen el gadolinio y el europio.
Los núcleos de nanopartículas que comprenden
átomos semiconductores se pueden detectar como cristales
semiconductores a escala de nanómetro y son capaces de actuar como
punto de quantun, es decir, pueden absorber luz, con lo cual se
excitan electrones de los materiales a niveles de energía
superiores, y consecuentemente liberan fotones de luz a frecuencias
características del material. Un ejemplo de material de núcleo
semiconductor es el seleniuro de cadmio.
Las nanopartículas y los resultados de sus
interacciones se pueden detectar usando diferentes técnicas bien
conocidas por los expertos. Estas técnicas pueden ir desde detectar
la agregación que resulta cuando las nanopartículas se unen a otras
especies, p.e., mediante una inspección visual simple o mediante el
uso de dispersión de luz (transmitancia de una solución que
contiene las nanopartículas), hasta el uso de técnicas sofisticadas
tales como la microscopía electrónica de transmisión (TEM) o la
microscopía de fuerza atómica (AFM) para visualizar las
nanopartículas. Otro método para detectar las partículas metálicas
es el empleo de resonancia plasmónica, es decir la excitación de
electrones en la superficie de un metal, normalmente originada por
radiación óptica. El fenómeno de la resonancia plasmónica de
superficie (SPR) existe en la interfase de un metal (tal como Ag o
Au) y un material dieléctrico tal como el aire o el agua. Debido a
que tienen lugar cambios en la SPR cuando los analitos se unen al
ligando inmovilizado sobre la superficie de una nanopartícula, se
produce un cambio del índice de refracción de la interfase. Una
ventaja adicional de la SPR es que se puede usar para controlar las
interacciones a tiempo real. Tal como se ha mencionado
anteriormente, si las nanopartículas incluyen, o están recubiertas
con, átomos que son activos a la RMN, entonces esta técnica se puede
usar para detectar las partículas, tanto in vitro como in
vivo, usando técnicas bien conocidas por los expertos. Las
nanopartículas también se pueden detectar tal como se ha descrito en
^{[18]}, usando un sistema basado en una amplificación de señal
cuantitativa, empleando la reducción de la plata (I) promovida por
la nanopartícula y usando como lector un digitalizador de imágenes
plano. Si las nanopartículas incluyen ligandos que combinan los
grupos hidratos de carbono y sondas fluorescentes se puede usar la
espectroscopía de fluorescencia. También se puede usar el marcado
isotópico de los hidratos de carbono para facilitar su
detección.
El ligando unido al núcleo comprende uno o más
grupos hidratos de carbono (sacáridos), p.e., comprende un
polisacárido, un oligosacárido o un único grupo sacárido. El ligando
también puede ser un glicanoconjugado tal como un glicolípido o una
glicoproteína. Además del grupo de los hidratos de carbono, el
ligando puede comprender adicionalmente uno o más grupos
peptídicos, un dominio proteína, una molécula de ácido nucleico
(p.e., un segmento de DNA) y/o una sonda fluorescente.
Las partículas de la presente invención tienen
más de una especie de ligando inmovilizada en las mismas, por
ejemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 20 ó 100 ligandos diferentes. Además, se
pueden utilizar juntas una serie de diferentes tipos de
partículas.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En la presente invención, el número medio de
ligandos unidos a un núcleo metálico individual de la partícula es
por lo menos de 20 ligandos, preferiblemente por lo menos 50
ligandos, y más preferiblemente por lo menos 100 ligandos. Las
densidades preferidas de ligandos se encuentran en el rango de
70-100 ligandos por cada 200 átomos de oro, tal
como se determina mediante análisis elemental.
Los ligandos se encuentran unidos covalentemente
al núcleo de las partículas. Los protocolos para llevarlo a cabo
resultan conocidos en la técnica, aunque el trabajo descrito en este
documento es el primer informe de las reacciones que se usan para
enlazar covalentemente los ligandos hidratos de carbono al núcleo de
la partícula. Se puede llevar a cabo mediante la reacción con oro
de ligandos con grupos terminales reductores, bajo condiciones
reductoras. Un procedimiento preferido para la preparación de las
partículas emplea grupos de hidratos de carbono con derivados tiol
para acoplar los ligandos a las partículas. Por tanto, en un
aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la
preparación de las partículas anteriormente definidas, y el
procedimiento comprende:
- - sintetizar un sulfuto derivado del
ligando;
- - reacción del ligando derivatizado con
sulfuro con el ácido tetracloroáurico en presencia de un
agente reductor para dar lugar a las partículas.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, el ligando se
derivatiza en forma de un disulfuro protegido. De manera
conveniente, el ligando protegido con disulfuro, en metanol, se
puede añadir a una solución acuosa de ácido tetracloroáurico. Un
agente reductor preferido es el hidruro de boro y sodio. Otras
condiciones preferidas del procedimiento se describen en los
ejemplos que siguen.
La presente invención proporciona una manera de
presentar un conjunto esférico de ligandos que contienen hidratos
de carbono y que presentan ventajas sobre otros tipos de conjuntos
propuestos en la técnica anterior. En particular, las
nanopartículas son solubles en muchos solventes orgánicos y
especialmente en agua. Esta solubilidad puede ser usada en su
purificación y significa, de manera importante, que se pueden usar
en solución como macroconjuntos para exponer el ligando
inmovilizado sobre la superficie de la partícula. El hecho de que
las nanopartículas sean solubles tiene la ventaja de presentar los
hidratos de carbono en una conformación natural. Para aplicaciones
terapéuticas, las nanopartículas no son tóxicas, son solubles y se
excretan en la orina.
En la técnica se conocen diferentes
interacciones mediadas por hidratos de carbono y se pueden estudiar
o modular usando las nanopartículas descritas en este documento.
Estas interacciones incluyen la adhesión
leucocito-célula endotelial, interacciones de
hidratos de carbono-anticuerpo, hidratos de
carbono-infecciones proteína bacteriana y viral,
reconocimiento immunológico de células tumorales, células
tumorales-células endoteliales (p.e., para estudiar
metástasis) y reconocimiento de tejido y células extrañas. Los
siguientes ejemplos de aplicación de las nanopartículas se
proporcionan a modo de ilustración y no de limitación, como soporte
de la amplia aplicabilidad de las tecnologías descritas en este
documento.
En general, ha constituido un problema difícil
en la técnica el detectar o modular las interacciones mediadas por
hidratos de carbono debido a que la unión de los hidratos de carbono
a otras especies tales como proteínas u otros hidratos de carbono
es muy débil y, para modular la interacción, los agentes
monovalentes sólo han tenido un éxito limitado en la supresión de
las interacciones basadas en hidratos de carbono polivalentes.
En las realizaciones de la invención
relacionadas con las interacciones de hidratos de carbono con
hidratos de carbono, se pueden identificar dos tipos de
interacciones. En las interacciones homofílicas, los hidratos de
carbono idénticos interaccionan uno con otro y se pueden detectar
mediante un incremento sostenido de la concentración de partículas
que tienen una única especie de ligandos inmovilizados sobre la
superficie hasta que tiene lugar la agregación. Ello se puede
detectar mediante dispersión de la luz o mediante efectos
electrónicos. Las interacciones heterofílicas se pueden detectar
mezclando dos o más nanopartículas diferentes y determinando el
estado de agregación de las partículas.
Por tanto, la presente invención proporciona una
plataforma versátil para el estudio y modulación de las
interacciones mediadas por hidratos de carbono. Por ejemplo, las
partículas se pueden usar para detectar los anticuerpos
antihidratos de carbono, detectando la unión de los anticuerpos a
los ligandos sobre la superficie a través de la dispersión de la
luz con el fin de detectar la agregación de las partículas, o los
efectos de los campos eléctricos, tales como la resonancia
plasmónica de superficie, que puede modificarse cuando los átomos
de metal en las partículas se agregan entre sí.
En un ejemplo de este aspecto de la invención,
las nanopartículas se pueden emplear para determinar los grupos de
sangre, tal como se efectúa en medicina de manera normal para
determinar los donantes y receptores compatibles en una transfusión
de sangre. Los grupos de la sangre son debidos a que las bacterias
comunes en el intestino tienen antígenos de hidratos de carbono que
son similares o idénticos a los antígenos de los grupos de la
sangre presentes sobre la superficie de las células rojas de la
sangre, y estos antígenos bacterianos estimulan la producción de
anticuerpos en individuos que no llevan los correspondientes
antígenos en sus propias células rojas de la sangre. Por tanto, el
suero de un individuo se analiza para los anticuerpos que aglutinan
las células rojas de la sangre del donante y viceversa, en un ensayo
cruzado para detectar los anticuerpos potencialmente perjudiciales
en el receptor. En la actualidad, la determinación del grupo de la
sangre se lleva a cabo usando estos ensayos de aglutinación que son
inconvenientes y no fácilmente susceptibles de automatización o de
realización en gran número de muestras.
Los antígenos del grupo de la sangre son
hidratos de carbono, p.e., para el antígeno común:
-
1
Por tanto, se pueden preparar poblaciones de
nanopartículas que tengan los antígenos de los grupos de la sangre
inmovilizados sobre su superficie. Así, si una muestra contiene
suero capaz de unirse al antígeno del grupo de la sangre y, a
continuación, se añaden las nanopartículas a una muestra de un
paciente es posible determinar el tipo de sangre de los donantes y
los receptores.
Otra aplicación de las nanopartículas es modular
la inflamación. En particular, miembros de la familia de las
selectinas participan en la unión inicial de las células blancas de
la sangre (leucocitos) a las células endoteliales durante el
proceso del reclutamiento de leucocitos en el tejido inflamado. La
L-selectina se expresa sobre los leucocitos, la
P-selectina sobre las plaquetas y la
E-selectina sobre las células endoteliales. La
E-selectina y la P-selectina se
inducen sobre las células endoteliales en respuesta a las citoquinas
pro-inflamatorias y se unen a los receptores ELAM
sobre la superficie de las células endoteliales. La
L-selectina se expresa constitutivamente sobre los
leucocitos circulantes y se une a las glicoproteínas expresadas
únicamente sobre el endotelio activado. Por consiguiente, todas
estas interacciones se podrían emplear como objetivos terapéuticos
para modular la inflamación y, en particular, para reducir la
inflamación aberrante.
Las aproximaciones que existen en la técnica en
el empleo de selectinas como objetivos terapéuticos se basan en el
hecho de que las selectinas comparten un dominio común de las
lectinas que es calcio dependiente y que puede ser el objetivo de
los ligandos basados en hidratos de carbono. En una revisión de la
técnica se ha encontrado que las tres selectinas se unen al
tetrasacárido sialilado y fucosilado sialil Lewis X (sLe^{x}) y
que esta molécula y sus análogos se pueden unir a la selectina,
aunque de manera débil. Las aproximaciones anteriores de la técnica
tienen el problema de que la interacción entre sLe^{x} y la
selectina es débil y que la interacción de las células que expresan
la selectina es polivalente. De acuerdo con ello, en uno de estos
aspectos, la presente invención propone un tratamiento de la
inflamación usando nanopartículas que tienen uno o más ligandos de
selectina inmovilizados sobre las mismas. En la referencia^{[5b]}
se proporciona una discusión de la inflamación mediada por
selectina y de los compuestos que se pueden usar para modular la
interacción.
En un aspecto adicional, las nanopartículas en
las que el grupo de los hidratos de carbono (sacárido) es un
antígeno se pueden administrar como una vacuna, p.e.,
balísticamente, usando una escopeta para la administración con el
fin de acelerar su paso transdérmico a través de la parte más
externa de la epidermis. Las nanopartículas pueden, a continuación,
ser absorbidas, p.e., por las células dendríticas, que maduran al
tiempo que migran a través del sistema linfático, dando lugar a una
modulación de la respuesta inmune y de la vacunación contra el
antígeno sacárido, tal como se describe en ^{[19]}.
En una aplicación adicional, se sabe que los
hidratos de carbono de la superficie de la célula actúan como
ligandos en los receptores virales o bacterianos (llamados
adhesinas) y que la unión de los hidratos de carbono a los
receptores es un hecho necesario durante la infección. Los hidratos
de carbono sintéticos, p.e., los gliconjugados, que son capaces de
modular estas interacciones, se pueden inmovilizar en las
nanopartículas de la invención y se pueden usar como reactivos para
estudiar estas interacciones y como agentes terapéuticos para
evitar la infección por virus o bacterias.
Un ejemplo de una infección bacteriana mediada
por un ligando hidrato de carbono es el Helicobacter pylori
que ocasiona gastritis crónica activa, úlceras gástricas y
duodenales, adenocarcinoma gástrico y linfoma del tejido linfoide
asociado a la mucosa en humanos. Puesto que la unión específica del
H. pylori a la célula puede ocurrir a través de múltiples
hidratos de carbono, incluyendo el antígeno Lewis b, los
oligosacáridos sialilados, las glicoproteinas de mucina sulfatadas
y las nanopartículas capaces de modular (es decir, bloquear) las
diferentes interacciones de la adhesina se pueden usar como
tratamiento de las anteriores condiciones.
Los ejemplos de infecciones virales mediadas por
hidratos de carbono incluyen el virus de la gripe que afecta las
células a través de enlace multivalente de las moléculas de
hemaglutinina de la envoltura viral a los glicoconjugados del
huésped terminados en ácido siálico. Por tanto, la infección se
puede inhibir mediante la interrupción de este he-
cho.
cho.
El HIV-1 también infecta las
células por reconocimiento de las estructuras de los hidratos de
carbono de la superficie de la célula y el glicolípido
galactosilceramida (GalCer) se ha identificado como un ligando del
receptor gp120 del HIV-1. Por tanto, el GalCer, o
análogos del mismo, se podrían inmovilizar sobre la superficie de
las nanopartículas y utilizarse para inhibir la interacción del
GalCer celular y el HIV-1.
En otra aplicación, la presente invención puede
ser útil en la modulación de la respuesta inmune, p.e., después de
un trasplante. Cuando se inicia el reconocimiento inmunológico del
tejido con las interacciones mediadas con hidratos de carbono entre
los hidratos de carbono de superficie presentes en el tejido
trasplantado y los componentes del sistema inmune del huésped tales
como los anticuerpos, todo ello puede ser el objetivo para mejorar
las reacciones inmunes que resultan de esta interacción. A modo de
ejemplo, el hidrato de carbono
Gal\alpha1-3Gal\beta1-4GlnAc (el
epitope "\alphaGal") se ha implicado como un epítopo
antigénico importante implicado en el rechazo del tejido
trasplantado. Por tanto, la modulación de la interacción del epitopo
\alphaGal y el sistema inmune puede ser un objetivo terapéutico
para las nanopartículas descritas en este documento.
Una aproximación alternativa puede resultar útil
en el tratamiento del cáncer ya que los antígenos asociados a
muchos tumores o factores autocrinos tumorales se basan en hidratos
de carbono. En este caso, las nanopartículas se podrían
proporcionar como vacunas que inician el sistema inmune para
producir anticuerpos que son capaces de atacar las células
tumorales que presentan los hidratos de carbono en su superficie. En
este sentido, se sabe que muchas células tumorales poseen
secuencias de glicosilación aberrantes que pueden facilitar la
respuesta inmune estimulada por las nanopartículas al estar
dirigidas específicamente a las células tumorales como opuestas a
las células normales sanas. Las nanopartículas también se pueden
usar para inhibir metástasis en cáncer, p.e., mediante la migración
de las células tumorales a través de las células endoteliales.
En un aspecto adicional, las nanopartículas se
pueden usar como soporte para incorporar los anticuerpos capaces de
unirse específicamente al ligando. Esto resulta particularmente
ventajoso ya que puede ser un desafío en la técnica para conducir
los anticuerpos contra las partes que contienen hidratos de carbono
ya que, a menudo, son pequeñas y no dan lugar a respuestas inmunes
fuertes.
En todavía otro aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para determinar cuándo tienen lugar
interacciones mediadas por hidratos de carbono, y el procedimiento
comprende la puesta en contacto de una o más especies de
nanopartículas con un candidato a la unión y la subsiguiente
determinación de si tiene lugar dicha unión.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento de análisis de substancias capaces de
unirse a un ligando que comprende un grupo hidrato de carbono, y el
procedimiento comprende:
- - contacto de las partículas que
comprenden un núcleo metálico unido a muchos de los ligandos con uno
o más compuestos candidatos;
- - detección de si los compuestos
candidatos se unen a los ligandos.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para determinar la presencia en una
muestra de una substancia capaz de unirse a un ligando que comprende
un ligando de hidrato de carbono, el procedimiento comprende el
contacto de la muestra con las nanopartículas unidas al ligando y la
determinación de si la unión tiene lugar. El procedimiento se puede
usar para determinar la presencia o cantidad de uno o más analitos
en una muestra, p.e., para su uso en el diagnóstico de una
enfermedad asociada con la presencia de un analito.
En una realización adicional, las nanopartículas
se pueden usar para el estudio o detección de interacciones
mediadas por hidratos de carbono en conjunción con especies
inmovilizadas sobre la superficie de sólidos, por ejemplo, ligandos
inmovilizados sobre superficies de oro tal como se describe en
^{[6a]}. Estas especies pueden ser otros hidratos de carbono,
especies candidatas a la unión o analitos.
En otro aspecto, los hidratos de carbono se
pueden unir a nanocristales de seleniuro de cadmio para
proporcionar puntos cuánticos que, a continuación, se pueden guiar
hasta la estructura celular requerida por las nanopartículas. Tal
como se discute en ^{[20]}, los puntos cuánticos tienen usos
potenciales en imágenes biológicas, tanto en dispositivos
electrónicos como eléctricos, computadores cuánticos y análisis de
medicamentos candidatos.
Las realizaciones de la presente invención se
describen a continuación a modo de ejemplo no limitante con
referencia a las figuras que se acompañan.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 muestra esquemáticamente el
procedimiento usado para la síntesis de las nanopartículas.
La Figura 2 muestra las micrografías
electrónicas de transmisión y los histogramas (insertados) de
distribución del tamaño del núcleo de las gliconanopartículas de
lacto 2-Au (arriba) y de
Le^{x}3-Au (abajo).
La Figura 3 muestra los espectros de ^{1}H RMN
de: (A) 2-Au en D_{2}O (a); 2 en D_{2}O (b) y 2
en CD_{3}OD (c) y (B) 3-Au en D_{2}O (a); 3 en
D_{2}O (b) y 3 en 70% CD_{3}OD/D_{2}O (c).
Las nanopartículas descritas en este documento o
sus derivados se pueden formular en composiciones farmacéuticas y
administrar a pacientes en una gran variedad de formas, en
particular para tratar las condiciones que pueden mejoran mediante
la administración del ligando. A modo de ejemplo, ésto puede ocurrir
debido a que el ligando bloquea una interacción mediada por un
hidrato de carbono que, de otra manera, llevaría a una patología.
Por tanto, las nanopartículas se pueden usar como medicamento para
la modulación de la adhesión entre leucocito-célula
endotelial, las interacciones entre hidratos de
carbono-anticuerpo, hidratos de
carbono-infección proteína bacteriana y viral,
reconocimiento inmunológico de las células tumorales, inhibición de
la metástasis y reconocimiento de tejidos y células extrañas.
Las composiciones farmacéuticas para la
administración oral pueden estar en forma de pastilla, cápsula,
polvo o líquido. Una pastilla puede incluir un soporte sólido tal
como gelatina o un adyuvante o un diluyente inerte. Las
composiciones farmacéuticas líquidas generalmente incluyen un
soporte líquido tal como agua, petróleo, aceite animal o vegetal,
aceite mineral o aceite sintético. También se puede incluir una
solución salina fisiológica, o glicoles tales como etilenglicol,
propilenglicol o polietilenglicol. Dichas composiciones y
preparaciones generalmente contienen por lo menos 0,1% en peso del
compuesto.
La administración parenteral incluye la
administración por las siguientes rutas: intravenosa, cutánea o
subcutánea, nasal, intramuscular, intraocular, transepitelial,
intraperitoneal y tópica (incluyendo dérmica, ocular, rectal,
nasal, inhalación y aerosol), y rutas sistémicas rectales. Para la
inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o la inyección en el
punto de la aflicción, el ingrediente activo estará en la forma de
una solución acuosa aceptable parenteralmente, que significa libre
de pirógenos y que tenga un pH adecuado, e isotonicidad y
estabilidad. Aquellas personas expertas en la técnica serán capaces
de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, soluciones de
los compuestos o de un derivado de los mismos, p.e., en una solución
fisiológica salina, una dispersión preparada con glicerina,
polietilen glicol líquido o aceites.
Además de uno o más de los compuestos,
opcionalmente en combinación con otros ingredientes activos, las
composiciones pueden comprender uno o más excipientes, soporte,
medio tamponante, estabilizante, agente isotónico, conservante o
antioxidante u otros materiales farmacéuticamente aceptables y que
resultan bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichos
materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la
eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del soporte o
de otro material puede depender de la ruta de administración, p.e.,
oral o parenteralmente.
Las composiciones farmacéuticas líquidas se
formulan de manera típica para que tengan un pH entre
aproximadamente 3,0 y 9,0, más preferiblemente entre
aproximadamente 4,5 y 8,5, y todavía más preferiblemente entre
aproximadamente 5,0 y 8,0. El pH de una composición se puede
mantener mediante el uso de un medio tamponante tal como acetato,
citrato, fosfato, succinato, Tris o histidina, empleados típicamente
en el margen entre aproximadamente 1 mM a 50 mM. Por otra parte, el
pH de las composiciones se puede ajustar usando ácidos o bases
fisiológicamente aceptables.
En las composiciones farmacéuticas generalmente
se incluyen conservantes para retardar el crecimiento microbiano,
aumentando así la vida de las composiciones y permitiendo el
empaquetado de múltiples usos. Los ejemplos de conservantes
incluyen fenol, metacresol, alcohol bencílico, ácido
parahidroxibenzoico y sus ésteres, paraben de metilo, paraben de
propilo, cloruro de benzalconio y cloruro de benzetonio. Los
conservantes se emplean típicamente en el margen de aproximadamente
0,1 a 1,0% (peso/volumen).
Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas
se administran a un sujeto individual "en una cantidad
profilácticamente efectiva" o "en una cantidad terapéuticamente
efectiva" (según sea el caso, aunque la profilaxis puede ser
considerada terapia), y que sea suficiente para demostrar beneficio
al individuo. Típicamente, significa que dé lugar a una actividad
útil terapéuticamente proporcionando un beneficio al individuo. La
cantidad real de los compuestos que se administra, y la velocidad y
tiempo de administración, dependerá de la naturaleza y severidad de
la condición a tratar. La prescripción del tratamiento, p.e., las
decisiones sobre la dosificación, etc, queda dentro de la
responsabilidad de los médicos en general, y de manera típica tiene
en cuenta el desorden que se debe tratar, la condición del paciente
particular, el sitio de la liberación, el procedimiento de
administración y otros factores conocidos por los médicos. Se
pueden encontrar ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados
anteriormente en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición,
Osol, A. (ed), 1980. A modo de ejemplo, las composiciones se
administran preferiblemente a los pacientes en dosis entre
aproximadamente 0,01 y 100 mg de compuesto activo por kg de peso
corporal, y más preferiblemente entre aproximadamente 0,5 y 10 mg/kg
de peso corporal.
Las nanopartículas se pueden usar como soportes
para promover las respuestas de los anticuerpos contra los ligandos
unidos a las partículas del núcleo que contienen hidratos de
carbono. Estos anticuerpos se pueden modificar usando metodologías
que resultan normales en la técnica. Los anticuerpos similares a los
que se ejemplifican por primera vez en este documento también se
pueden preparar utilizando lo que aquí se describe conjuntamente
con los procedimientos conocidos. Estos procedimientos de
preparación de anticuerpos incluyen el inmunizar a un mamífero
(p.e., ratón, rata, conejo, caballo, cabra, cordero o mono) con
la(s) nanopartícula(s). Los anticuerpos se pueden
obtener de los animales inmunizados usando una cualquiera de las
diferentes metodologías conocidas en la técnica y se analizan
preferiblemente usando la unión del anticuerpo al antígeno de
interés. El aislamiento de los anticuerpos y/o de las células que
producen los anticuerpos a partir de un animal puede estar
acompañado de una etapa de sacrificio del animal.
Como una alternativa o suplemento a la
inmunización de un animal con una nanopartícula, se puede obtener
un anticuerpo específico para el ligando y/o la nanopartícula a
partir de una biblioteca producida de manera recombinatoria de
dominios variables de inmunoglobulinas expresadas, p.e., usando
bacteriófagos lambda o bacteriófagos filamentosos que contienen en
su superficie dominios de unión de inmunoglobulinas funcionales; por
ejemplo, ver la patente WO92/01047. La biblioteca puede ser
ingenua, es decir, construida a partir de secuencias obtenidas de
un organismo que no se ha inmunizado con ninguna de las
nanopartículas, o puede ser una que se ha construida usando
secuencias obtenidas a partir de un organismo que se ha expuesto al
antígeno de interés.
El término "anticuerpo monoclonal" tal como
se utiliza en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido a
partir de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos,
es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población
son idénticos independientemente de las posibles mutaciones que
tienen lugar de manera natural y que pueden estar presentes en
pequeña cantidad. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir
mediante el procedimiento descrito por primera vez por Kohler and
Milstein, Nature, 256:495, 1975 o se pueden preparar mediante
procedimientos recombinantes, ver Cabily et al., patente U.S.
nº 4816567, o Mage y Lamoyl en Técnicas y Aplicaciones de la
Producción de Anticuerpos Monoclonales, páginas
79-97, Marcel Dekker Inc., Nueva York, 1987.
En el procedimiento del hibridoma, se inmuniza
un ratón u otro animal huésped apropiado con el antígeno por ruta
subcutánea, intraperitoneal o intramuscular para evitar los
linfocitos que producen, o son capaces de producir, anticuerpos que
se unirán específicamente a las nanopartículas usadas para la
inmunización. Alternativamente, se puede inmunizar los linfocitos
in vitro. A continuación, los linfocitos se fusionan con
células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como
polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma, ver Goding,
Anticuerpos Monoclonales: Principios y Práctica, p.
59-103 (Academic Press, 1986).
Las células de hibridoma así preparadas se
pueden sembrar y crecer en un medio de cultivo apropiado que
contiene preferiblemente una o más substancias que inhiben el
crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parental no
fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parental no
contienen el enzima hipoxantina guanina
fosfo-ribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio
de cultivo para los hibridomas incluirá de manera típica
hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), substancias que
evitan el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.
Las células de mieloma preferidas son aquellas
que se fusionan eficientemente, mantienen un alto nivel estable de
expresión del anticuerpo por las células productoras de anticuerpo
seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT.
El medio de cultivo en el que se hace crecer las
células de hibridoma se ensaya para la producción de anticuerpos
monoclonales dirigidos contra las nanopartículas/ligandos.
Preferiblemente, la especificidad de unión se determina mediante un
ensayo de inmunoabsorbancia unida a una enzima (ELISA). Los
anticuerpos monoclonales de la invención son aquellos que se unen
específicamente a las nanopartículas/ligandos.
En una realización preferida de la invención, el
anticuerpo monoclonal tendrá una afinidad que es mayor que
micromolar o una afinidad mayor (es decir, una afinidad mayor de
10^{-6} molar) tal como se determina, por ejemplo, por análisis
de Scatchard, ver Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107: 220,
1980.
Una vez se ha identificado las células de
hibridoma que producen los anticuerpos neutralizantes de la
especificidad y afinidad deseadas, los clones se pueden subclonar
mediante procedimientos de dilución limitante y hacer crecer
mediante procedimientos stándard. Los medios de cultivo adecuados
para este propósito incluyen el medio de Eagle modificado de
Dulbecco o medio RPM1-1640. Además, las células de
hibridoma pueden crecer in vivo como tumores ascitis en un
animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, del fluido
ascítico o del suero por procedimientos de purificación de
inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, protein
A-Sepharosa, cromatogradia de hidroxilapatita,
electroforesis de gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
El ácido nucleico que codifica los anticuerpos
monoclonales de la invención se aísla y se secuencia fácilmente
usando procedimientos bien conocidos en la técnica, p.e., usando
sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente
a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los
anticuerpos murinos. Las células de hibridoma de la invención son
una fuente preferida del ácido nucleico que codifica los
anticuerpos o fragmentos del mismo. Una vez aislado, el ácido
nucleico se liga a vectores de expresión o de clonación, que a
continuación se transfectan a células huésped, que se pueden
cultivar de manera que los anticuerpos monoclonales se producen en
el cultivo de las células huésped recombinantes.
Los hibridomas capaces de producir anticuerpos
con las características de unión deseadas quedan dentro del alcance
de la presente invención, ya que son células huésped que contienen
ácido nucleico que codifica los anticuerpos (incluyendo fragmentos
de anticuerpo) y son capaces de su expresión. La invención también
proporciona procedimientos de producción de los anticuerpos
incluyendo el crecimiento de una célula capaz de producir el
anticuerpo bajo condiciones en las que el mismo se produce, y
preferiblemente se excreta.
Los anticuerpos según la presente invención se
pueden modificar de diferentes maneras. En realidad el término
"anticuerpo" debe interpretarse incluyendo cualquier substancia
de unión que tenga un dominio de unión con la especificidad
requerida. Por tanto, la invención cubre los fragmentos de
anticuerpo, los derivados, equivalentes funcionales y homólogos de
anticuerpos, incluyendo moléculas sintéticas y moléculas cuya forma
mimetice la de un anticuerpo permitiendo que se una a un antígeno o
epítopo, en este caso un ligando de hidratos de carbono tal como se
ha definido en este documento.
Ejemplos de fragmentos de anticuerpo, capaces de
unión a un antígeno u otra pareja de unión, son el fragmento Fab
que consiste en los dominios VL, VH, CI y CH1; el fragmento Fd que
consiste en los dominios VH y CH1; el fragmento Fv que consiste en
los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; el
fragmento dAb que consiste en un dominio VH; las regiones CDR
aisladas y los fragmentos F(ab')_{2}, un fragmento
bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos a un puente
disulfuro en la región de anclaje. También están incluidos los
fragmentos Fv de cadena única.
Un hibridoma que produce un anticuerpo
monoclonal según la presente invención se puede someter a mutación
genética u otros cambios. También se entenderá por parte de los
expertos en la técnica que un anticuerpo monoclonal se puede
someter a las técnicas de la tecnología de ADN recombinante para dar
lugar a otros anticuerpos, anticuerpos humanizados o moléculas
quiméricas que retienen la especificidad del anticuerpo original.
Dichas técnicas pueden implicar la introducción de ADN que
codifique la región variable de inmunoglobulina, o las regiones
determinantes de complementariedad (CDRs), de un anticuerpo a las
regiones constantes, o las regiones constantes más las regiones
marco de una inmunoglobulina diferente. Ver, por ejemplo, las
patentes EP 0 184 187A, GB 2 188 638A o EP 0 239 400A. La clonación
y expresión de los anticuerpos quiméricos se describe en las
patentes EP 0 120 694A y EP 0 125 023A.
Como estrategia para el diseño de superficies de
hidratos de carbono polivalentes para investigar el reconocimiento
de hidratos de carbono a hidratos de carbono en solución, se ha
usado una aproximación por la cual los hidratos de carbono se unen
a nanopartículas de oro^{]7]}. A modo de ejemplo, se describe a
continuación la preparación, caracterización y estudios de
interacción preliminar de una monocapa funcionalizada de azúcar y
nanoagregados de oro solubles en agua. Se han preparado
neoglicoconjugados derivatizados de tiol de dos oligosacáridos
significantes biológicamente, el disacárido lactosa
(Gal\beta(1\rightarrow4) Glc\beta1-OR)
1 y 2 y el antígeno Le^{x} del trisacárido:
para unirlos a las nanopartículas
de oro. El trisacárido Le^{x} y el disacárido lactosa construyen
el antígeno del glicoesfingolípido
(GSL)Le^{x}:
que se ha propuesto para mediar la
compactación de la mórula y la metástasis en células sanas y de
carcinoma de ratón, respectivamente, a través de una interacción de
hidrato de carbono a hidrato de carbono
homotípica^{[8]}.
Las gliconanopartículas lacto y Le^{x}
protegidas proporcionan una superficie similar a glicocalix con una
matriz sintética químicamente bien definida y de forma globular.
Además, esta aproximación abre el camino para preparar
gliconanopartículas que contienen diversos ligandos de hidrato de
carbono así como diferentes densidades de superficie que
proporcionan un modelo bajo control para estudios
estructura-función y para investigar la agregación
de hidratos de carbono^{[9]} y los efectos de la orientación en
una superficie^{[10]}. Las nanopartículas funcionalizadas de
lacto y Le^{x} serán nuestro sistema de modelo polivalente
para imitar la agregación GSL en la membrana de plasma^{[11]} y
para investigar en solución las fuerzas de atracción y repulsión
implicadas en la agregación de las células a través de las
interacciones de hidratos de carbono a hidratos de carbono.
Estudios previos utilizando receptores sintéticos han proporcionado
la primera evidencia sólida de que en el agua existen interacciones
estabilizantes entre superficies de hidratos de carbono
lipofílicas^{[12]}.
La síntesis de los disulfuros 1, 2 y 3 se ha
llevado a cabo mediante glicosidación del derivado de lactosa y
Le^{x} convenientemente protegido con
11-tioacetato undecanol (para el 2 y 3) usando el
procedimiento de tricloroacetimidato, ver la Figura 1^{[13]}. Los
compuestos 1, 2 y 3 se aislaron en forma de disulfuro y se usaron
en esta forma para la formación de las gliconanopartículas
protegidas con oro. Las gliconanopartículas 1-Au,
2-Au y 3-Au solubles en agua se han
obtenido en metanol siguiendo el procedimiento de Brust et
al., para la síntesis de los nanoagregados de oro protegidos
con monocapa^{[7a]}. Una serie de nanopartículas protegidas con
oro, todas ellas solubles en solventes orgánicos, se han preparado
recientemente con diferentes propósitos^{[14]}. Las
gliconanopartículas de lacto-Au y
Le^{x}-Au son solubles en agua, son estables y se
pueden manipular como macromoléculas biológicas solubles en agua. Se
han purificado mediante diálisis y se han caracterizado mediante
^{1}H-RMN, UV y microscopía electrónica de
transmisión (TEM).
Síntesis de gliconanopartículas: Una
solución de disulfuro 1, 2 o 3 (0,012 M, 5,5 eq) en MeOH se añade a
una solución de ácido tetracloroáurico (0,025 M, 1 eq) en agua. Se
añade NaBH_{4} (1 M, 22 eq) en agua, en pequeñas porciones y con
agitación rápida. La suspensión negra que se forma se agita durante
otras 2 horas y a continuación se elimina el solvente con vacío. El
crudo de la reacción se lava con MeOH y se centrifuga durante 10
minutos. Se elimina el metanol y se repite el proceso varias veces
hasta que no se detecta el producto de partida por CCF. Las
gliconanopartículas son completamente insolubles en metanol pero
bastante solubles en agua. Se purifican por diálisis: 50 mg de
producto crudo se disuelve en 10 ml de agua (NANOpura). Esta
solución se carga en segmentos de 10 cm de membrana de diálisis de
ester de celulosa (SIGMA, MWCO=12400) y se colocan en 4 l de agua
(NANOpura). La solución oscura de gliconanopartículas se recoge de
los segmentos de diálisis y se liofiliza. Los productos obtenidos
están libres de sales y de producto de partida (ausencia de señales
debidas al disulfuro y Na^{+} en RMN).
Se lleva a cabo un examen de las muestras
mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) con
microscopio Philips CM200 que trabaja a 200 kV. Se coloca una única
gota de solución acuosa 0,1 mg/ml de las
gliconano-partículas de oro en una rejilla de cobre
recubierta con una película de carbono. La rejilla se deja secar al
aire durante varias horas a temperatura ambiente. Se evalúa la
distribución del tamaño de partícula de los agregados de Au a
partir de varias micrografías usando un analizador de imágenes
automático. El número de partículas seleccionadas para su
consideración es de aproximadamente 400, que da lugar a una
estadística de distribución de tamaño estable.
La Figura 2 muestra las imágenes de TEM y los
histogramas de distribución de tamaño de núcleo para las
gliconanopartículas de oro 2-Au y
3-Au. Las partículas de oro estabilizadas con la
lactosa muestran una distribución de tamaño de partícula más
homogénea y más estrecha que las partículas estabilizadas con el
conjugado Le^{x}. En ambas muestras se ha encontrado un diámetro
medio de 1,8 nm para el núcleo de oro de las nanopartículas
funcionalizadas. Dicho tamaño de partícula promedio corresponde,
según el trabajo previo^{[15]}, a un número promedio de átomos de
oro por partícula de aproximadamente 200, y 70 glicoconjugados
protegidos con alcanotiolato. Las soluciones acuosas de las
nanopartículas son estables durante meses y no se detecta
aglomeración mediante TEM.
A continuación se investigó la presentación de
las moléculas de hidratos de carbono en la superficie de las
nanopartículas. Las propiedades moleculares de los
neoglicoconjugados 1, 2 y 3 sufren un cambio diferencial después de
su unión a la superficie del oro. Por ejemplo, el lacto derivado 2,
que es soluble en metanol e insoluble en agua, da lugar a
gliconanopartículas 2-Au insolubles en metanol pero
con buena solubilidad en agua. El derivado Le^{x} 3 es soluble en
metanol y en agua, sin embargo, su nanopartícula
3-Au es insoluble en metanol y muy soluble en agua.
Estas diferencias en solubilidad se pueden usar para purificar las
gliconanopartículas de los disulfuros no reaccionados mediante
lavado con metanol. Sin embargo, el hecho más significativo en
estos cambios es que revelan la influencia de la agregación en la
superficie sobre la presentación de los hidratos de carbono
respecto a los alrededores.
Los espectros de ^{1}H-RMN de
las gliconanopartículas muestran claramente estas diferencias
(Figura 3). Los espectros de las lactonanopartículas
1-Au y 2-Au en D_{2}O difieren
fuertemente de los espectros de los
lacto-disulfuros 1 y 2 (Figura 3A, espectro de 1, no
mostrado) viéndose el ensanchamiento de la línea de las
macromoléculas de lenta rotación en solución. La señal de los
metilenos más próximos a la interfase tiolato/Au desaparece
completamente, ya que tiene lugar en los nanoagregados de oro
protegidos con una monocapa de alcanotiol. En contraste, estas
diferencias no se encuentran en el caso de las nanopartículas de
3-Au. Los espectros de ^{1}H-RMN
en D_{2}O de 3 y de 3-Au muestran un
ensanchamiento similar para todas las señales (Figura 3B, a, b),
indicando una agregación intramolecular ya presente en el disulfuro
de Le^{x} 3. Esta autointeracción persiste incluso en una
solución de agua altamente diluida y desaparece por adición de
cantidades crecientes de CD_{3}OD a la solución en D_{2}O de 3.
Algunas señales bien resueltas aparecen en solución de
CD_{3}OD/D_{2}O (1:1), y en una solución al 70% de
CD_{3}OD/D_{2}O todas las señales están bien resueltas en el
espectro (Figura 3B, c). La tendencia del disulfuro de Le^{x} 3 a
la autoagregación en agua no se puede atribuir exclusivamente a la
hidrofobicidad de la cadena alifática, sino más bien a la
participación específica de los grupos hidratos de carbono en esta
agregación, tal como pone de manifiesto la falta de agregación en
agua que se observa en el espectro de ^{1}H-RMN de
los lactodisulfuros 1 y 2 (Figura 3A). La capacidad de
autoagregación tendrá consecuencias en la organización y agregación
de los GSLs que contienen Le^{x}, tal como se ha reivindicado por
parte de algunos autores^{[16]} y contrariamente a la propuesta
de otros de que el grupo de hidrato de carbono de cabeza juega un
papel insignificante en la formación de microdominios enriquecidos
en glicolípidos en la membrana del plasma^{[17]}.
El hacinamiento estérico de los hidratos de
carbono en las superficies de las nanopartículas también se
comprueba mediante el diferente comportamiento de 1 y 2 y sus
correspondientes nanoagregados 1-Au y
2-Au con \beta-glucosidasas. La
\beta-galactosida de la E. coli procesa a 1
y 2 a un nivel comparable a la propia lactosa
(5-10% en relación a la actividad específica de
GONP), mientras que la hidrólisis por la enzima, bajo las mismas
condiciones, de las nanopartículas de 1-Au y
2-Au se detecta escasamente (< 3% en relación a
la actividad enzimática con los ligandos 1 y 2 libres).
Estos experimentos demuestran que es posible
usar nanopartículas para preparar modelos diseñados de hidratos de
carbono globulares que imiten los agregados GSL en la membrana del
plasma, permitiendo por primera vez llevar a cabo investigaciones
en solución de un nuevo mecanismo de adhesión celular a través de
las interacciones de hidratos de carbono con hidratos de carbono.
La aproximación de gliconanopartícula descrita en este documento
proporciona una estrategia para preparar, en un único camino, una
gran variedad de conjuntos de hidratos de carbono globulares que
pueden competir de manera ventajosa con otras disposiciones de
hidratos de carbono esféricos (dendrímeros, liposomas) o lineales.
Las nanopartículas de lacto- y Le^{x} se pueden
considerar modelos apropiados para intervenir en los procedimientos
de adhesión célula-célula y de reconocimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las referencias que se mencionan en este
documento se han incorporado expresamente como referencia.
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\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al
respecto.
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Claims (42)
1. Nanopartícula que comprende un núcleo de
átomos de metal o semiconductores unidos covalentemente a, por lo
menos, 20 ligandos, donde la nanopartícula tiene dos o más especies
de ligando unidas al núcleo y donde una de las especies de ligando
comprende un grupo de hidratos de carbono.
2. Nanopartícula según la reivindicación 1,
donde el núcleo de la nanopartícula está unido covalentemente a por
lo menos 50 ligandos.
3. Nanopartícula según las reivindicación 1 o la
reivindicación 2, donde el núcleo de la nanopartícula está unido
covalentemente a por lo menos 100 ligandos.
4. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde el núcleo es un núcleo metálico.
5. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el núcleo de la nanopartícula
tiene un diámetro medio entre 0,5 y 100 nm.
6. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el núcleo de la nanopartícula
tiene un diámetro medio entre 1 y 20 nm.
7. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6, donde el núcleo metálico comprende Au, Ag
o
Cu.
Cu.
8. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el núcleo comprende un átomo que
es activo en RMN.
9. Nanopartícula según la reivindicación 8,
donde el átomo activo en RMN es gadolinio y europio.
10. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el núcleo incluye un átomo que
es capaz de detectarse usando la resonancia de plasmón
superficial.
11. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la nanopartícula comprende como
un marcador.
12. Nanopartícula según la reivindicación 11,
donde el marcador es un grupo fluorescente o un isótopo
radioactivo.
13. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 12, donde el núcleo metálico es una aleación
seleccionada entre Au/Ag, Au/Cu, Au/Ag/Cu, Au/Pt, Au/Pd o
Au/Ag/Cu/Pd.
14. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 13, donde el núcleo metálico comprende entre
aproximadamente 100 y 500 átomos de Au.
15. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, o reivindicaciones 5 a 14, donde los átomos
semiconductores son capaces de actuar como un punto cuántico.
16. Nanopartícula según la reivindicación 15,
donde el núcleo de la nanopartícula está formado de seleniuro de
cadmio.
17. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde las especies adicionales de
ligando comprenden un ligando de péptido, un ligando de dominio de
proteína, un ligando de ácido nucleico o un ligando de grupo
fluorescente.
18. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el ligando que comprende un
grupo de hidratos de carbono comprende además un péptido, un dominio
de proteína, un segmento de ácido nucleico o un grupo
fluorescente.
19. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el ligando que comprende un
grupo de hidratos de carbono comprende un grupo polisacárido,
oligosacárido o monosacárido.
20. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el ligando comprende un
glicanoconjugado.
21. Nanopartícula según la reivindicación 20,
donde el glicanoconjugado es un glicolípido o una glicoproteína.
22. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el grupo de hidratos de carbono
es un ligando de selectina.
23. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, donde el grupo de hidratos de carbono es
un ligando para un receptor viral o bacteriano.
24. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, donde el grupo de hidratos de carbono es
un antígeno asociado a un tumor o un factor autocrino de tumor.
25. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 24, donde el ligando está unido al núcleo
metálico mediante un grupo sulfuro.
26. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la nanopartícula es soluble en
agua.
27. Composición que comprende una población de
una o más nanopartículas según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 26.
28. Composición según la reivindicación 27 que
comprende una serie de nanopartículas que tienen diferentes grupos
ligando.
29. Composición que comprende una población de
una o más nanopartículas según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 26 para su uso en terapia o diagnóstico.
30. Composición que comprende una población de
una o más nanopartículas según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 21, o reivindicaciones 24 a 26, donde el grupo de hidratos de
carbono es un antígeno, y donde la composición es una vacuna.
31. Uso de una nanopartícula según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 26 para la preparación de un medicamento
para el tratamiento de una condición mejorada mediante la
administración del ligando.
32. Método de preparación de una nanopartícula
según la reivindicación 1 que tiene un núcleo que comprende átomos
de oro, comprendiendo el método:
- sintetizar sulfuro derivados de los ligandos;
- reaccionar los ligandos derivatizados de sulfuro y ácido tetracloroáurico en presencia de un agente reductor para producir las nanopartículas.
\vskip1.000000\baselineskip
33. Método según la reivindicación 32, donde el
ligando está derivatizado como un disulfuro protegido.
34. Método in vitro de interrupción de
una integración entre un hidrato de carbono y una pareja de unión,
comprendiendo el método el contacto entre el hidrato de carbono y la
pareja de unión con nanopartículas según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 26, donde el ligando que comprende un grupo de
hidratos de carbono que interrumpe la interacción del hidrato de
carbono y la pareja de unión.
35. Método in vitro de cribado de
sustancias capaces de unirse a un ligando que comprende un grupo de
hidratos de carbono, comprendiendo el método (a) poner en contacto
las nanopartículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26
con uno o más compuestos candidatos y (b) determinar si los
compuestos candidatos se unen al ligando.
36. Método de determinación de la presencia en
una muestra de una sustancia capaz de unirse a un ligando que
comprende un grupo de hidratos de carbono, comprendiendo el método
(a) poner en contacto la muestra con las nanopartículas según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, de manera que la
sustancia se une al grupo de hidratos de carbono de las
nanopartículas y (b) determinar si tiene lugar la unión.
37. Método según la reivindicación 36, que
comprende además la etapa de correlacionar la presencia o ausencia
de unión con el diagnóstico de un estado patológico asociado con la
presencia de la sustancia.
38. Método según la reivindicación 36 o la
reivindicación 37, donde la sustancia es un anticuerpo que es capaz
de unirse al grupo de hidratos de carbono.
39. Método in vitro de determinación si
tiene lugar la interacción mediada por hidrato de carbono,
comprendiendo el método (a) poner en contacto una o más especies
sospechosas de interaccionar a través de una interacción mediada
por hidrato de carbono con las nanopartículas según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 26 y (b) determinar si las nanopartículas
modulan la interacción mediada por hidrato de carbono.
40. Método según cualquiera de las
reivindicaciones de 34 a 39, donde las nanopartículas son detectadas
mediante resonancia magnética nuclear (RMN), agregación,
microscopía electrónica de transmisión (MET), microscopía de fuerza
atómica (MFA), resonancia de plasmón superficial (RPS), o con
nanopartículas que comprenden átomos de plata, amplificación de
señal usando la reducción de plata (I) inducida por
nanopartículas.
41. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 33 a 40, donde las nanopartículas comprenden un
marcador fluorescente, un marcador isotópico, un átomo activo en
RMN, o un punto cuántico.
42. Uso de una nanopartícula según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 26 para desarrollar y aislar anticuerpos
capaces de unirse específicamente al ligando.
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