KR102189566B1 - 디케토피페라진을 함유하는 식물 엑기스 및 그 제조 방법 - Google Patents

디케토피페라진을 함유하는 식물 엑기스 및 그 제조 방법 Download PDF

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Abstract

음식물로의 배합에 적합한 디케토피페라진 혼합체와 그 제조법을 제공한다.
식물성 펩티드를 액체 중에서 고온 고압 처리함으로써, 시클로류실류신 및 시클로류실페닐알라닌을 포함하는 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스를 제조할 수 있다. 본 발명에 의하면, 식물성 천연물 유래의 향미가 우수한 디케토피페라진이 얻어지고, 그대로 음식물에 배합하여 디케토피페라진이 갖는 기능이 부가된 음식물을 제조할 수 있다.

Description

디케토피페라진을 함유하는 식물 엑기스 및 그 제조 방법{PLANT EXTRACT CONTAINING DIKETOPIPERAZINE AND METHOD FOR PRODUCING SAME}
본 발명은 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
아미노산이 2 개 결합한 「디펩티드」 가 기능성 물질로서 주목받고 있다. 디펩티드는 단체 아미노산에 없는 물리적 성질이나 새로운 기능을 부가하는 것이 가능하고, 아미노산 이상의 응용 범위를 갖는 것으로서 기대되고 있다. 특히, 고리형의 디펩티드인 디케토피페라진은, 항균 작용이나 항산화 작용 (비특허문헌 1, 2), 학습 의욕 개선 작용 (특허문헌 1) 등의 다양한 생리 활성을 갖는 것이 알려져 있으며, 의료·약리 분야에 있어서 수요가 확대될 것이 예상되고 있다.
통상적으로, 디케토피페라진은, 화학 합성법 (비특허문헌 3) 이나 효소법 (비특허문헌 2, 4) 등으로 제조되고 있다. 또, 직사슬 펩티드를 초임계 영역 또는 아임계 영역에 있는 고온 고압수로 탈수·고리화 반응시킴으로써, 임의의 아미노산 배열을 가진 고리형 펩티드를 합성하는 방법 (특허문헌 2), 직사슬 디펩티드 또는 직사슬 트리펩티드를 물 용매 중에서 가열 처리하여 고리형 디펩티드를 제조하는 방법 (특허문헌 3, 4) 도 제안되어 있다.
일본 공표특허공보 2012-517998호 일본 공개특허공보 2003-252896호 한국 공개특허 10-2011-0120051 일본 특허공보 5456876호 일본 공개특허공보 2010-166911호 일본 공표특허공보 2012-517214호
Peptides, 16 (1), 151-164 (1995) 바이오사이언스와 인더스트리, 60 (7), 454-457 (2002) J. Comb, Chem., 3, 453-460 (2001) Chemistry Biology, 8, 997-1010 (2001) Agr. Biol. Chem., 38 (5), 927-932 (1974)
이와 같이, 생체 내에서 각종 생리 활성이 기대되는 디케토피페라진이지만, 천연 유래의 디케토피페라진이나, 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식품은 거의 존재하고 있지 않다. 천연 유래의 디케토피페라진으로는, 셰리주, 사오싱주, 간장, 미림, 식초 등의 발효 식품 중에 디케토피페라진이 존재하는 것이 알려져 있지만 (비특허문헌 5), 그 함유량은 극미량이며, 이들 식품을 디케토피페라진이 갖는 기능을 기대하고 섭취하려면, 상당량을 섭취하지 않으면 안되어, 모두 실용성이 부족한 것이다. 또, Cyclo(Pro-Phe) 나 Cyclo(Pro-Leu) 를 함유하는 커피 음료도 알려져 있지만 (특허문헌 5), 이들 디케토피페라진은 쓴맛이 강하여, 다른 음료에 응용하는 것은 어렵다.
또한, 콜라겐이나 축육 등의 동물성 단백질을 기원으로 하는, 디케토피페라진을 비교적 많이 함유하는 조성물도 알려져 있다 (특허문헌 4, 6). 그러나, 이들 동물성 단백질을 기원으로 하는 디케토피페라진 함유 조성물을, 차 음료, 커피 음료, 대두 음료, 과즙 음료 등의 식물의 추출액 또는 착즙액 등을 주성분으로 하여 배합하여 얻어지는 음료나, 플레이버드 워터, 미네랄 음료, 탄산 음료 등의 청량 음료에 그대로 사용하는 것은 향미의 영향 때문에 어렵다.
본 발명의 목적은, 천연 유래이고 안전성이 높은 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 향미 양호한 엑기스와 그 제조법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 실시한 결과, 단백질을 함유하는 식물체에 분해 처리를 실시하여 식물성 펩티드를 생성시키고, 이 식물성 펩티드를 액체 중에서 고온 고압 처리함으로써, 고농도로 디케토피페라진을 함유하는 식물 엑기스를 제조할 수 있는 것을 알아내었다. 그리고, 이 식물 엑기스가 풍미 양호한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
(1) 시클로알라닐글루타민, 시클로알라닐알라닌, 시클로세릴티로신, 시클로글리실류신, 시클로글리실트립토판, 시클로발릴발린, 시클로트립토파닐티로신, 시클로류실트립토판 및 시클로페닐알라닐페닐알라닌 중 어느 하나 이상을, 10 ㎍/100 g/Bx 이상의 농도로 함유하는, 식물 엑기스.
(2) Bx 당 디케토피페라진의 총량이 900 ㎍/100 g/Bx 이상인, (1) 기재의 식물 엑기스.
(3) 식물 엑기스가 차 엑기스, 대두 엑기스 또는 맥아 엑기스인, (1) 또는 (2) 기재의 식물 엑기스.
(4) 단백질을 함유하는 식물체에 분해 처리를 실시하여 식물성 펩티드를 생성시키고, 이 식물성 펩티드를 액체 중에서 고온 고압 처리함으로써 얻어지는 식물 엑기스.
(5) 식물성 펩티드를, 액체 중에서 고온 고압 처리하는 공정을 포함하는, 시클로류실류신 및 시클로류실페닐알라닌을 포함하는 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스의 제조 방법.
(6) 고온 고압 처리 공정에서의 가열 조건이, 100 ∼ 170 ℃ 의 액체 중에서 30 분 ∼ 수 시간인, (5) 에 기재된 제조 방법.
(7) 식성 펩티드가 올리고 펩티드인, (5) 또는 (6) 에 기재된 제조 방법.
(8) 식물성 펩티드가, 식물 유래의 단백질 또는 단백질을 함유하는 식물체에 분해 처리를 실시하여 얻어진 것인, (5) ∼ (7) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
(9) 분해 처리가 가열 처리 또는 효소 처리인, (8) 에 기재된 제조 방법.
(10) 분해 처리가 효소 처리이며, 효소가 엔도형 프로테아제인, (9) 기재의 제조 방법.
본 발명에 의하면, 천연 유래이고 안전성이 높은 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스를, 대량 생산 규모로 번잡한 공정이나 복잡한 설비를 수반하지 않고 간편하게 제조할 수 있다.
도 1 은, 대두 단백질을 사용하여 얻어진 식물 펩티드 가공품 중의 시클로페닐알라닐페닐알라닌 농도의 정량 결과를 나타낸다.
도 2 는, 쌀 단백질을 사용하여 얻어진 식물 펩티드 가공품 중의 시클로페닐알라닐페닐알라닌 농도의 정량 결과를 나타낸다.
도 3 은, 전 (前) 추출의 횟수와 가용성 성분의 제거율의 관계를 나타낸다.
(식물성 펩티드)
본 발명의 식물 엑기스는, 식물성 펩티드를 액체 중에서 고온 고압 처리하여 제조하는 것이 가능하다. 여기서, 본 명세서에 있어서의 「식물성 펩티드」 란, 특별히 언급이 없는 한, 식물 유래의 단백질 또는 단백질을 포함하는 식물체에 이미 알려진 분해 처리 (열이나 압력에 의한 분해 처리, 산이나 알칼리에 의한 분해 처리, 효소에 의한 분해 처리 등) 를 실시하여 저분자화 (올리고 펩티드) 함으로써 발생하는 아미노산이 수 개 이어진 펩티드를 말한다.
본 발명의 식물성 펩티드에는, 대두 펩티드, 보리 펩티드, 밀 펩티드, 밀 배아 펩티드, 완두콩 펩티드, 쌀 펩티드 등을 사용할 수 있다. 후술하는 바와 같이 식물 유래의 단백질 또는 단백질을 포함하는 식물체로부터 식물성 펩티드를 조제하여 사용해도 되지만, 시판품을 사용해도 된다. 시판되는 식물성 펩티드로는, 예를 들어 하이뉴트 AM, 하이뉴트 DC, 하이뉴트 HK (이상, 후지 정유사 제조) 등의 대두 펩티드, 오리자 펩티드 P60 (오리자 유화사 제조) 등의 쌀 펩티드, 글루타민 펩티드 GP-1N, 글루타민 펩티드 GP-N (이상, 닛신 파르마사 제조) 등의 밀 펩티드, 참깨 펩티드 KM-20 (KISCO 사 제조) 등의 참깨 펩티드를 예시할 수 있다.
본 발명자들의 검토에 의하면, 펩티드의 크기에 따라 얻어지는 디케토피페라진 혼합물의 수율에 차가 발생한다. 식물성 펩티드는, 분자량 5000 이하의 펩티드의 비율이 높은 것을 사용하는 것이 바람직하고, 분자량 3000 이하의 펩티드의 비율이 높은 것을 사용하는 것이 보다 바람직하며, 분자량 1000 이하의 펩티드의 비율이 높은 것을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 또, 아미노산 스코어가 높은 대두를 사용하면, 복수 종의 디케토피페라진이 보다 높은 농도로 생성되기 때문에, 대두 펩티드는 바람직한 양태의 일례이다.
본 발명의 식물성 펩티드에는, 식물 유래의 단백질이나, 단백질을 포함하는 식물체를 원료로 하여 제조되는 펩티드 혼합체를 사용할 수 있다. 구체적으로는, 대두 단백질, 밀 단백질, 밀 배아 단백질, 쌀 단백질, 참깨 단백질 등의 식물 유래의 단백질이나, 녹차잎 등의 엽류 (葉類), 보리, 밀, 맥아, 참깨, 쌀 등의 종자류, 대두, 팥, 검은콩 등의 콩류, 고구마, 감자 등의 저류 (藷類) 등, 단백질을 함유하여 음식 가능한 식물체를 원료로 하여, 이미 알려진 분해 처리 (열이나 압력에 의한 분해 처리, 산이나 알칼리에 의한 분해 처리, 효소에 의한 분해 처리 등) 를 실시하여 제조되는 펩티드 혼합체를 들 수 있다. 이들 단백질을 포함하는 식물체 중에서도, 본 발명에서는 대두, 맥아, 찻잎이 적합하게 사용된다. 특히, 대두나 찻잎을 사용하는 것이 바람직하고, 찻잎을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 상기의 식물 유래의 단백질이나, 단백질을 포함하는 식물체를 원료로 하여 분해 처리를 실시하여, 식물성 펩티드인 펩티드 혼합체를 얻지만, 이 분해 처리는, 올리고 펩티드가 생성되는 조건하에서 실시한다. 구체적으로는, 분자량 5000 이하의 펩티드 (바람직하게는 분자량 3000 이하의 펩티드, 보다 바람직하게는 분자량 1000 이하의 펩티드) 의 비율이 높아지도록 분해 처리를 실시한다.
분해 처리는, 목적으로 하는 올리고 펩티드의 생성의 쉬움 (반응 속도의 빠르기), 다량 처리의 용이함에서, 열에 의한 분해 처리 및/또는 효소에 의한 분해 처리가 바람직하고, 특히 효소에 의한 분해 처리 (이하, 효소 처리) 가 적합하게 이용된다.
가열에 의한 분해 처리를 실시하는 경우, 식물체나 단백질이 타는 것을 방지하기 위해서, 용매 중에서 실시한다. 그 양은, 통상적으로, 식물체 1 질량부당 용매를 10 ∼ 100 질량부, 바람직하게는 15 ∼ 80 질량부, 보다 바람직하게는 20 ∼ 60 질량부, 특히 바람직하게는 20 ∼ 40 질량부 정도이다. 용매로는, 물, 에탄올, 또는 이들의 혼합물 등을 사용하는 것이 바람직하고, 특히 물을 사용하는 것이 바람직하다. 가열 조건은, 펩티드가 생성되는 조건이면 특별히 한정되지 않는다. 가열 조건으로서 100 ℃ 이상, 또한, 125 ℃ 이상의 온도에서, 30 분 ∼ 수 시간, 바람직하게는 2 ∼ 7 시간 정도의 가열을 예시할 수 있다. 가열 처리 장치로는, 압력 냄비, 오토클레이브 등을 조건에 맞추어 사용할 수 있다. 또한, 이 가열 처리는, 본 발명의 「액체 중에서의 고온 고압 처리 공정」 과 동시에 실시할 수 있다.
효소 처리에 의해 식물성 펩티드를 제조하는 경우, 효소에는, 단백질 분해 효소 (프로테아제) 가 사용되지만, 엔도형 분해 활성이 강한 프로테아제를 사용하는 것이 바람직하다. 프로테아제는, 또, 작용 최적 pH 의 차이에 따라 알칼리성 프로테아제, 중성 프로테아제 및 산성 프로테아제의 3 종류로 대별된다. 또한 프로테아제의 기원으로는, 식물 기원, 동물 기원 혹은 미생물 기원의 것이 있지만, 효소 기원 및 최적 pH 는, 분해 효율이 나쁜 경우나 얻어진 분해 추출액의 향미가 나빴던 등의 악영향이 없는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 본 발명의 사용 가능한 세균 유래의 프로테아제로서, 프로테아제 N, 프로테아제 NL, 프로테아제 S, 프로레자 (등록상표) FG-F, (이상, 아마노 엔자임사 제조)；프로틴 NY, 프로틴 P, 데스킨, 데피레이스, 프로틴 A, 서모아제 (등록상표) (이상, 다이와 화성사 제조)；비오플라제 (등록상표) XL-416F, 비오플라제 (등록상표) SP-4FG, 비오플라제 (등록상표) SP-15FG (이상, 나가세 켐텍스사 제조)；오리엔타제 (등록상표) 90N, 누클레이신 (등록상표), 오리엔타제 (등록상표) 10NL, 오리엔타제 (등록상표) 22BF (이상, 에이치비아이사 제조)；알로아제 (등록상표) AP-10 (야쿠르트 약품 공업사 제조)；프로타멕스 (등록상표), 뉴트라제 (등록상표), 알칼라제 (등록상표) (이상, 노보자임즈사 제조)；COROLASE N, COROLASE 7089, VERON W, VERON P (이상, AB 엔자임사 제조)；엔치론 NBS (라쿠토 화성 공업사 제조)；알칼리 프로테아제 GL440, 퓨라펙트 (등록상표) 4000L, 프로테아제 899, 프로텍스 6L (이상, 제넨코아 쿄와사 제조) 등을 들 수 있다. 또, 본 발명의 사용 가능한 국균 (麴菌) 유래의 프로테아제로서, 프로테아제 A, 프로테아제 M, 프로테아제 P, 우마미자임, 펩티다아제 R, 뉴라아제 (등록상표) A, 뉴라아제 (등록상표) F (이상, 아마노 엔자임사 제조)；스미자임 (등록상표) AP, 스미자임 (등록상표) LP, 스미자임 (등록상표) MP, 스미자임 (등록상표) FP, 스미자임 (등록상표) LPL (이상, 신닛폰 화학 공업사 제조)；프로틴 (등록상표) FN (다이와 화성사 제조)；데나프신 2P, 데나자임 (등록상표) AP, XP-415 (이상, 나가세 켐텍스사 제조)；오리엔타제 (등록상표) 20A, 오리엔타제 (등록상표) ONS, 테트라제 (등록상표) S (이상, 에이치비아이사 제조)；몰신 (등록상표) F, PD 효소, IP 효소, AO-프로테아제 (이상, 키코만사 제조)；사카나제 (카켄 파르마사 제조) 판티다제 (등록상표) YP-SS, 판티다제 (등록상표) NP-2, 판티다제 (등록상표) P (이상, 야쿠르트 약품 공업사 제조)；플레이버자임 (등록상표) (노보자임즈 재팬사 제조)；코크라제 (등록상표) SS, 코크라제 (등록상표) P (이상, 미츠이 라이프텍사 제조)；VERON PS, COROLASE PN-L (이상, AB 엔자임사 제조) 등을 들 수 있다. 그 외, 본 발명에서 사용 가능한 프로테아제로서, 방선균 유래 프로테아제 (예를 들어 아크티나제 (등록상표) AS, 아크티나제 (등록상표) AF (이상, 카켄 파르마사 제조), 타시나제 (등록상표) (제넨코아 쿄와사 제조)) 나, 식물 유래 프로테아제 (예를 들어 파파인 W-40 (아마노 엔자임사 제조), 식품용 정제 파파인 (나가세 켐텍스사 제조)) 나, 동물 유래의 펩신, 트립신 등을 들 수 있다.
상기 프로테아제 중에서도, 분해 효율이나 얻어지는 펩티드 함유 액의 향미의 관점에서, 세균 유래의 프로테아제를 사용하는 것이 바람직하고, 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis) 유래의 중성 프로테아제나, 바실루스·아밀롤리케파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) 유래의 프로테아제나, 바실루스·스테아로서모필루스 (Bacillus stearothermophilus) 유래의 프로테아제를 사용하는 것이 보다 바람직하고, 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis) 유래의 중성 프로테아제를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
이와 같은 프로테아제를, 식물 유래의 단백질이나 단백질을 포함하는 식물체에 대해 0.1 ∼ 20 중량％, 바람직하게는 1 ∼ 15 중량％, 보다 바람직하게는 3 ∼ 10 중량％ 의 범위에서 사용하는 것이 바람직하다. 상기 범위보다 첨가량이 적은 경우에는, 펩티드 생성 수율을 향상시키는 효과를 발휘할 수 없고, 한편 상기 범위보다 많이 첨가해도 대폭적인 펩티드 생성 수율의 향상을 기대할 수 없어, 비용면에서 불리해진다. 또한, 효소 처리는, 식물 유래의 단백질이나 식물체에 물을 첨가하여, 습윤시킨 상태로 효소를 작용시킨다. 첨가하는 물의 양은, 통상적으로, 건조 상태의 단백질이나 식물체 1 질량부당 물을 10 ∼ 50 질량부, 보다 바람직하게는 10 ∼ 30 질량부, 특히 바람직하게는 10 ∼ 20 질량부 정도이다.
프로테아제에 의한 효소 처리 조건은, 사용하는 프로테아제의 최적 조건을 감안하여 설정하면 되는데, 통상적으로, 20 ∼ 70 ℃ (바람직하게는 30 ∼ 60 ℃, 보다 바람직하게는 40 ∼ 60 ℃) 에서, 30 분 ∼ 24 시간 (바람직하게는 1 시간 ∼ 12 시간, 보다 바람직하게는 1 시간 ∼ 6 시간) 정도이다.
효소의 종류에 따라, 기질인 단백질에 대한 작용 부위가 상이하고, 결과적으로 본 발명에서 얻어지는 디케토피페라진 혼합체의 조성을 바꿀 수 있으므로, 원하는 디케토피페라진 혼합체의 조성을 감안하여, 효소를 선택할 수도 있다. 효소는 2 종 이상을 병용하여 사용해도 된다.
식물성 펩티드로서, 식물체를 사용하는 경우, 상기 서술한 분해 처리에 의한 펩티드 생성 공정을 실시하기 전에, 식물체에 함유되는 수용성 단백질을 미리 저감시키는 전 (前) 처리를 실시해 두는 것이 바람직하다. 본 발명자들의 검토에 의하면, 수용성 단백질을 미리 저감시켜 둠으로서, 분해 처리에 의한 펩티드의 생성 수율이나, 본 발명의 가열 처리 공정에 의한 디케토피페라진의 생성 수율이 현격히 향상된다. 수용성 단백질을 제거하는 전처리 방법으로는, 식물체를 액체 중에서 가열하여 수용성 단백질을 용출시키는 방법으로서 그 후에 고액 분리하여 얻어지는 고체 (식물체) 를 분해 처리에 제공하는 방법, 식물체에 물 등의 수성 용매로 추출 처리를 실시하는 방법으로서 그 추출 잔류물을 분해 처리에 제공하는 방법 등을 들 수 있다 (이하, 총칭하여 「전추출」 이라고 한다). 전추출시에는, 식물체의 중량에 대해 바람직하게는 15 배 중량 이상, 보다 바람직하게는 15 ∼ 150 배 중량 정도의 추출 용매에 침지하여 식물체에 포함되는 수용성 단백질 등의 가용성 성분을 용출시키는 것이 바람직하다. 이 경우, 미리 추출 용매를 가열해 두어도 되지만, 식물체를 추출 용매에 침지한 후에 가열하여 추출해도 된다. 추출 용매로는 순수를 적합하게 사용할 수 있지만, 이것에 에탄올 등 유기 용매를 적절히 함유시킬 수도 있다. 또, 추출 용매에 미네랄분을 첨가함으로써 적절히 경도를 조정할 수도 있다.
전추출에 있어서, 그 추출 온도는 특별히 한정되지 않지만, 통상적으로, 50 ∼ 100 ℃, 바람직하게는 60 ∼ 95 ℃, 보다 바람직하게는 70 ∼ 90 ℃ 정도이다. 또, 추출 시간은, 1 분 ∼ 24 시간, 바람직하게는 3 분 ∼ 20 시간 정도이다. 추출 온도, 시간 등의 추출 조건은, 얻어지는 추출 잔류물의 가용성 성분 제거율이 60 ％ 이상, 바람직하게는 70 ％ 이상, 보다 바람직하게는 80 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 특히 바람직하게는 95 ％ 가 되도록 한다. 가용성 성분의 제거율은, 최대한 제거할 수 있는 가용성 성분을 100 ％ 로 한 경우에 있어서의 추출액으로 회수되는 고형분의 상대적인 비율을 말하며, 식 「(전추출로 얻어진 채액량 (총량) (g) × 그 브릭스 [Bx]) / (최대한 제거할 수 있는 가용성 성분 (g) × 그 브릭스 [Bx]) × 100 (％)」 로 산출되는 값을 말한다. 본 명세서에서는, 「최대한 제거할 수 있는 가용성 성분」 으로서, 편의적으로 「식물체의 중량에 대해 30 배량의 열탕으로 10 분간 추출하는 것을 10 회 반복했을 때의 채액량」 으로 나타내는 것으로 한다. 여기서, 본 명세서에서 말하는 Bx 는, 시판되는 Bx 측정 계측기로 계측할 수 있다.
식물체의 전추출은, 1 회만 실시해도 되고, 복수 회 실시해도 된다. 전추출로 얻어지는 추출액은 폐기해도 되지만, 음식물에 배합하여 이용할 수도 있으며, 예를 들어 본 발명에서 얻어지는 디케토피페라진을 함유하는 식물 엑기스와 혼합하여 음식물에 배합할 수도 있다.
(가열 처리)
본 발명의 제조 방법에서는, 이와 같은 식물성 펩티드를 액체 중에서 고온 고압 처리함으로써, 디케토피페라진을 생성한다. 고온 고압 처리에 있어서의 액체로는 순수를 적합하게 사용할 수 있지만, 이것에 에탄올 등 유기 용매를 적절히 함유시킬 수도 있다. 또, 추출 용매에 미네랄분을 첨가함으로써 적절히 경도를 조정할 수도 있다. 가열 처리에 제공하는 액체의 브릭스 (Bx) 는, 0.1 ∼ 50 정도가 되도록 필요에 따라 농축 또는 희석해 두는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 말하는 고온 고압이란, 100 ℃ 이상의 온도 또한 대기압을 넘는 압력을 의미한다. 고온 고압 추출 장치로는, 내압성 추출 장치나 압력 냄비, 오토클레이브 등을 조건에 맞추어 사용할 수 있다.
고온 고압의 온도는, 100 ∼ 170 ℃ 가 바람직하고, 110 ∼ 150 ℃ 가 보다 바람직하며, 120 ∼ 140 ℃ 가 특히 바람직하다. 또한, 이 온도는, 가열 장치로서 내압성 추출 장치를 사용한 경우에는, 추출 칼럼의 출구 온도를 측정한 값을 나타내며, 가열 장치로서 오토클레이브를 사용한 경우에는, 압력 용기 내의 중심 온도의 온도를 측정한 값을 나타낸다. 또, 압력은, 0.101 ∼ 0.79 ㎫ 가 바람직하고, 0.101 ∼ 0.48 ㎫ 가 보다 바람직하다. 또한, 가열 시간은, 30 ∼ 500 분이 바람직하고, 60 ∼ 300 분 정도가 보다 바람직하다.
보다 최적인 가열 처리 조건은, 가로축을 시간 (min.), 세로축을 온도 (℃) 로 한 좌표계에 있어서, 다음의 좌표계 (i) ∼ (Vi) 에 의해 둘러싸이는 시간 및 온도의 범위 내에서 유지되는 가열 처리이다.
(i) (170 ℃, 30 min.), (ii) (150 ℃, 30 min.), (iii) (115 ℃, 180 min.), (iv) (105 ℃, 480 min.), (v) (135 ℃, 480 min.), (vi) (150 ℃, 180 min.)
액체 중에서의 고온 고압 처리 후, 필요에 따라 고액 분리를 실시하여 액부를 회수하여, 본 발명의 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스가 얻어진다. 고액 분리에는, 여과 및/또는 원심 분리 수단이 이용된다.
식물성 펩티드의 유래 (원료가 되는 식물의 종류) 나 효소의 종류에 따라, 얻어지는 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스 중의 디케토피페라진의 조성은 상이하지만, 본 발명의 식물성 펩티드의 액체 중에서의 고온 고압 처리에 의해, 시클로알라닐글루타민 (CAS Registry Number：268221-76-7；Cyclo(Ala-Gln)), 시클로히스티딜프롤린 (CAS Registry Number：53109-32-3；Cyclo(His-Pro)), 시클로알라닐알라닌 (CAS Registry Number：5845-61-4；Cyclo(Ala-Ala)), 시클로글리실프롤린 (CAS Registry Number：3705-27-9；Cyclo(Gly-Pro)), 시클로세릴티로신 (CAS Registry Number：21754-31-4；Cyclo(Ser-Tyr)), 시클로프롤릴트레오닌 (CAS Registry Number：227777-31-3；Cyclo(Pro-Thr)), 시클로히스티딜페닐알라닌 (CAS Registry Number：56586-95-9；Cyclo(His-Phe)), 시클로알라닐프롤린 (CAS Registry Number：65556-33-4；Cyclo(Ala-Pro)), 시클로페닐알라닐세린 (CAS Registry Number：35591-00-5；Cyclo(Phe-Ser)), 시클로글리실류신 (CAS Registry Number：5845-67-0；Cyclo(Gly-Leu)), 시클로글리실페닐알라닌 (CAS Registry Number：10125-07-2；Cyclo(Gly-Phe)), 시클로프롤릴프롤린 (Cyclo(Pro-Pro)), 시클로글리실트립토판 (Cyclo(Gly-Trp)), 시클로아스파르틸페닐알라닌 (CAS Registry Number：5262-10-2；Cyclo(Asp-Phe)), 시클로발릴프롤린 (Cyclo(Val-Pro)), 시클로프롤릴티로신 (Cyclo(Pro-Tyr)), 시클로메티오닐프롤린 (Cyclo(Met-Pro)), 시클로메티오닐메티오닌 (Cyclo(Met-Met)), 시클로발릴발린 (Cyclo(Val-Val)), 시클로류실프롤린 (CAS Registry Number：2873-36-1；Cyclo(Leu-Pro)), 시클로트립토파닐티로신 (Cyclo(Trp-Tyr)), 시클로페닐알라닐프롤린 (CAS Registry Number：3705-26-8；Cyclo(Phe-Pro)), 시클로류실트립토판 (CAS Registry Number：15136-34-2；Cyclo(Leu-Trp)), 시클로페닐알라닐트립토판 (CAS Registry Number：82597-82-8；Cyclo(Phe-Trp)), 시클로류실페닐알라닌 (CAS Registry Number：7280-77-5；Cyclo(Leu-Phe)), 시클로류실류신 (CAS Registry Number：952-45-4；Cyclo(Leu-Leu)), 시클로페닐알라닐페닐알라닌 (CAS Registry Number：2862-51-3；Cyclo(Phe-Phe)) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 디케토피페라진을 증가시킬 수 있다.
특히 본 발명은, Cyclo(Leu-Leu) 및 Cyclo(Leu-Phe) 를 비교적 고농도로 함유하는 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스의 제조에 유리하다. 또, 본 발명은, Cyclo(Phe-Phe) 를 고농도로 함유하는 식물 엑기스의 제조에 유리하다.
본 발명의 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스로부터, 공지된 정제 처리를 실시함으로써, 특정한 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 천연 식물 유래의 디케토피페라진을 선택적으로 제조할 수도 있다. 따라서, 하나의 관점에서 본 발명은 Cyclo(Leu-Leu), 및 Cyclo(Phe-Phe) 를 포함하는 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스의 제조 방법이며, 또 다른 관점에서 본 발명은, 특정한 디케토피페라진 (예를 들어 Cyclo(Ala-Ala), Cyclo(Leu-Phe), Cyclo(Leu-Leu), Cyclo(Phe-Phe)) 의 제조 방법이다.
(식물 엑기스)
본 명세서에서 말하는 엑기스란, 액체상의 추출물을 말하며, 본 발명의 「식물 엑기스」 란, 식물체에 추출 처리를 실시하여 얻어지는 액체상의 추출물 또는 그 가공물을 말한다.
본 발명에 의하면, Cyclo(Ala-Gln), Cyclo(Ala-Ala), Cyclo(Ser-Tyr), Cyclo(Gly-Trp), Cyclo(Val-Val), Cyclo(Trp-Tyr), Cyclo(Leu-Trp) 및 Cyclo(Phe-Phe) 중 어느 하나 이상을, Bx 당 함량이 10 ㎍/100 g/Bx 이상인 식물 엑기스가 얻어진다.
또, 본 발명에 의하면, 디케토피페라진의 총량이 900 ㎍/100 g 이상, 바람직하게는 1000 ㎍/100 g 이상, 보다 바람직하게는 2000 ㎍/100 g 이상, 특히 바람직하게는 5000 ㎍/100 g 이상이 되는 식물 엑기스를 얻을 수 있다. 또한, 본 명세서에서는, 특별히 언급이 없는 한, 디케토피페라진의 총량은, Cyclo(Ala-Gln), Cyclo(His-Pro), Cyclo(Ala-Ala), Cyclo(Gly-Pro), Cyclo(Ser-Tyr), Cyclo(Pro-Thr), Cyclo(His-Phe), Cyclo(Ala-Pro), Cyclo(Phe-Ser), Cyclo(Gly-Leu), Cyclo(Gly-Phe), Cyclo(Pro-Pro), Cyclo(Gly-Trp), Cyclo(Asp-Phe), Cyclo(Val-Pro), Cyclo(Pro-Tyr), Cyclo(Met-Pro), Cyclo(Met-Met), Cyclo(Val-Val), Cyclo(Leu-Pro), Cyclo(Trp-Tyr), Cyclo(Phe-Pro), Cyclo(Leu-Trp), Cyclo(Phe-Trp), Cyclo(Leu-Phe), Cyclo(Leu-Leu), 및 Cyclo(Phe-Phe) 의 총량을 나타내는 것으로 한다.
일반적으로, Bx 가 높은 엑기스는, 원료 유래의 다양한 물질 (예를 들어, 쓴맛 성분) 이 고농도로 포함되는 것을 의미하고 있으며, 그것이 음료에 부적합할 뿐만 아니라, 향미나 맛 등으로의 영향 때문에 음료로의 첨가에도 부적합하다. 따라서, 음료로의 첨가를 생각한 경우, Bx 는 낮은 쪽이 바람직하다. 본 발명에 의하면, 생리 활성 물질인 디케토피페라진을 많이 포함하고, 또한 Bx 가 낮은 식물 엑기스, 즉, 디케토피페라진의 함유량과 Bx 의 비가 높은 식물 엑기스가 얻어진다. 구체적으로는, 상기의 디케토피페라진의 총량 (단위：㎍/100 g) 과 브릭스 (Bx) 의 비가 900 (㎍/100 g/Bx) 이상, 바람직하게는 1000 (㎍/100 g/Bx) 이상, 보다 바람직하게는 2000 (㎍/100 g/Bx), 더욱 바람직하게는 5000 (㎍/100 g/Bx) 인 식물 엑기스가 얻어진다. 엑기스 중의 디케토피페라진의 상한은, 특별히 제한되지 않고, 디케토피페라진의 용해성 등을 고려하여 적절히 설정하면 되는데, 통상적으로, 1000 ㎎/100 g 이하, 바람직하게는 500 ㎎/100 g 이하, 보다 바람직하게는 200 ㎎/100 g 이하 정도이다.
식물체를 원료로 하여 본 발명의 제조 방법을 적용하여 얻어지는 식물 엑기스의 경우에는, 발효를 수반하지 않기 때문에 부생성물이 적고, 또 전추출을 실시한 경우에는 가용성 성분이 낮고, 매우 쓴맛이 적다는 향미적인 특징을 갖는다.
이와 같은 식물 엑기스는, 향미가 좋고, 침전이나 탁함 등도 없어 외관도 우수하므로, 특별한 후처리를 실시하지 않아도, 엑기스, 조미료, 음료 등에 그대로 이용 가능하다. 또, 본 발명의 식물 엑기스는, 디케토피페라진을 고함유량으로 포함함에도 불구하고, Bx 가 상대적으로 낮기 때문에, 음식물 (특히, 음료) 에 대한 배합량이 적어 좋고, 음식물의 설계의 자유도가 늘어난다는 이점도 있다. 특히, 차 음료, 커피 음료, 대두 음료, 과즙 음료 등의 식물의 추출액 또는 착즙액 등을 주성분으로서 배합하여 얻어지는 음료나, 플레이버드 워터, 미네랄 음료, 탄산 음료 등의 청량 음료에 그대로 배합하여 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 식물 엑기스를 음료에 배합하면, 디케토피페라진의 총량이 10 ㎍/100 g 이상, 바람직하게는 20 ㎍/100 g 이상, 보다 바람직하게는 40 ㎍/100 g 이상, 더욱 바람직하게는 60 ㎍/100 g 이상이 되는 음료이고, 또한 쓴맛을 나타내지 않는 풍미 양호한 음료를 얻을 수 있다.
본 발명에 의해 얻어지는 식물 엑기스는, 첨가하는 음식물의 양태에 맞추어, 청정화 처리 등을 실시할 수도 있다. 이 경우, 유분이 없는 것, 섬유질이 존재하는 것 등의 이유에서, 청정화를 용이하게 실시할 수 있다는 이점도 있다.
본 발명의 식물 엑기스의 적합한 양태로서, 차 엑기스, 대두 엑기스 및 맥아 엑기스를 예시할 수 있다. 이하, 이들 엑기스에 대하여 상세히 서술한다.
(차 엑기스)
본 명세서에서 말하는 「차 엑기스」 란, 찻잎을 추출 처리하여 얻어지는 차 추출물을 말한다. 추출 원료가 되는 찻잎으로는, 차나무 (학명：Camellia sinensis) 를 이용하여 제조된 찻잎의 잎, 줄기 등, 추출하여 음용 가능한 부위를 사용할 수 있다. 또, 그 형태도 대엽 (大葉), 분말상 등 제한되지 않는다. 찻잎의 수확기에 대해서도, 원하는 향미에 맞추어 적절히 선택할 수 있다.
본 발명에서 얻어지는 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스 (차 엑기스) 는, 발효 과정을 거치지 않고 제조함으로써 부생성물의 생성을 억제하여, 향미가 좋은 것이 얻어지는 것을 특징으로 한다. 이 향미의 관점에서, 찻잎은, 센차, 반차, 호우지차, 옥로, 카부세차, 감차 등의 쪄서 제조한 불발효차 (녹차) 나, 우레시노차, 아오야기차, 각종 중국차 등의 부초차 등의 불발효차를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명자들은, 시판되는 찻잎을 추출하여 얻어지는 차 엑기스 중의 디케토피페라진 농도를 측정하였다. 그 결과, 발효차에 극미량 (0 ∼ 200 ㎍/100 g/Bx 정도) 포함되는 것, 또 녹차에는 거의 포함되지 않는 것을 확인하였다 (표 1 참조, 측정 방법은 후술하는 실시예 1 과 동일).
Figure 112016001710538-pct00001
한편, 본 발명의 차 엑기스는, 종래의 차류에는 포함되어 있지 않았던 디케토피페라진인 Cyclo(Ala-Gln), Cyclo(Ala-Ala), Cyclo(Ser-Tyr), Cyclo(Gly-Trp), Cyclo(Val-Val), Cyclo(Trp-Tyr), Cyclo(Leu-Trp) 및 Cyclo(Phe-Phe) 중 어느 하나 이상을, 10 ㎍/100 g/Bx 이상의 농도로 함유한다.
또, 본 발명의 차 엑기스는, Cyclo(Ala-Gln), Cyclo(His-Pro), Cyclo(Ala-Ala), Cyclo(Gly-Pro), Cyclo(Ser-Tyr), Cyclo(Pro-Thr), Cyclo(His-Phe), Cyclo(Ala-Pro), Cyclo(Phe-Ser), Cyclo(Gly-Leu), Cyclo(Gly-Phe), Cyclo(Pro-Pro), Cyclo(Asp-Phe), Cyclo(Val-Pro), Cyclo(Pro-Tyr), Cyclo(Met-Pro), Cyclo(Leu-Pro), Cyclo(Phe-Pro), Cyclo(Leu-Phe), 및 Cyclo(Leu-Leu) 를 각각 0.1 ppm/Bx (10 ㎍/100 g/Bx) 이상의 농도로 함유한다. 바람직하게는 상기의 디케토피페라진 각각을 0.2 ppm/Bx 이상, 보다 바람직하게는 0.3 ppm/Bx 이상, 더욱 바람직하게는 0.4 ppm/Bx 이상, 특히 바람직하게는 0.5 ppm/Bx 이상의 농도로 함유하는 차 엑기스이다. 또한, Cyclo(Gly-Trp), Cyclo(Val-Val), Cyclo(Trp-Tyr), Cyclo(Leu-Trp), Cyclo(Phe-Trp) 및 Cyclo(Phe-Phe) 를, 각각 0.1 ppm/Bx (10 ㎍/100 g/Bx) 이상, 바람직하게는 0.2 ppm/Bx 이상, 보다 바람직하게는 0.3 ppm/Bx 이상의 농도로 함유시킬 수 있다.
쓴맛이 강한 디케토피페라진으로서, 커피 음료 중의 디케토피페라진인 Cyclo(Leu-Pro) 나 Cyclo(Phe-Pro) (일본 공개특허공보 2010-166911호 참조), 카제인의 분해 처리물인 Cyclo(Leu-Trp) (단백질 연구 장려회 펩티드 연구소보, No. 2, 1974) 가 알려져 있다. 본 발명의 차 엑기스는, 이들 강한 쓴맛을 갖는 디케토피페라진을 함유함에도 불구하고, 엑기스 자체는 쓴맛을 거의 갖지 않는다. 차 엑기스와 동일한 농도의 Cyclo(Leu-Pro), Cyclo(Phe-Pro) 및 Cyclo(Leu-Trp) 를 함유하는 수용액을 조제한 경우에는, 강한 쓴맛이 느껴졌기 때문에, 공존하는 다른 디케토피페라진이나 차 유래의 성분이 상가적 또는 상승적으로 Cyclo(Leu-Pro), Cyclo(Phe-Pro) 및 Cyclo(Leu-Trp) 의 쓴맛을 저감시키고 있는 것으로 생각된다. 특히, Cyclo(Leu-Leu) 와 Cyclo(Leu-Phe) 의 총량 (A) 에 대한 쓴맛을 갖는 디케토피페라진 Cyclo(Leu-Pro), Cyclo(Phe-Pro) 및 Cyclo(Leu-Trp) 의 총량 (B) 의 비율 [(B)/(A)] 이, 1.0 이하 (바람직하게는 0.8 이하, 보다 바람직하게는 0.6 이하, 특히 바람직하게는 0.4 이하) 가 되는 차 엑기스는, 쓴맛을 비롯한 맛을 수반하지 않는 디케토피페라진 함유 엑기스이며, 음식품 (특히, 음료) 에 그대로 배합할 수 있다.
차 엑기스 중의 Bx 당 디케토피페라진의 총량은, 900 ㎍/100 g/Bx 이상, 바람직하게는 900 ∼ 30000 ㎍/100 g/Bx, 보다 바람직하게는 2000 ∼ 25000 ㎍/100 g/Bx, 특히 바람직하게는 5000 ∼ 20000 ㎍/100 g/Bx 이다. 이와 같은 농도 범위로 하면, 디케토피페라진이 갖는 기능 (생리 활성 등) 이 부가된 음식품을 제조하는 데에 유리하다.
이와 같은 차 엑기스는, 찻잎 중의 단백질을 분해 처리하여 차 펩티드를 조제하고, 이것을 액체 중에서 고온 고압 처리를 함으로써, 간편하게 제조할 수 있다. 찻잎 중에는 단백질이 약 25 ％ 로 풍부하게 포함되어 있다 (개정 5 판 식품 성분표). 따라서, 이 찻잎 단백질을 프로테아제 등의 효소로 분해 처리하면, 차 펩티드가 얻어져야 하지만, 찻잎에 프로테아제를 작용시켜도, 그만큼 많은 차 펩티드는 얻어지지 않는다. 찻잎 중의 전체 단백질의 80 ％ 이상은 불용성 단백질이기 때문에, 찻잎에 포함되어 있는 단백질에 효율적으로 단백질 분해 효소를 작용시켜, 차 펩티드를 얻는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 찻잎으로부터 수용성 단백질을 제거하는 전처리를 실시한 후, 그 추출 잔류물에 프로테아제 등의 단백질 분해 효소를 작용시켜 차 펩티드를 조제한다. 즉, 본 발명의 차 엑기스는, 이하의 공정을 순차 실시함으로써, 수불용성의 단백질을 효율적으로 분해하여, 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 차 엑기스를 간편하게 제조할 수 있다.
(a) 찻잎을 물로 추출하고, 추출 잔류물을 회수하는 공정,
(b) 추출 잔류물에, 물 존재하에서 엔도형 프로테아제를 작용시켜 찻잎 단백질을 분해하고, 차 펩티드를 포함하는 액을 얻는 공정,
(c) 차 펩티드를 포함하는 액을 고온 고압 처리하여 반응액을 얻는 공정, 및
(d) 반응액을 고액 분리 처리하여, 디케토피페라진을 포함하는 액체를 회수하는 공정
또는,
(a) 찻잎을 물로 추출하고, 추출 잔류물을 회수하는 공정,
(b) 추출 잔류물에, 물 존재하에서 엔도형 프로테아제를 작용시켜 찻잎 단백질을 분해하고, 차 펩티드를 포함하는 액을 얻는 공정,
(d') 차 펩티드를 포함하는 액을 고액 분리 처리하여, 차 펩티드를 포함하는 액체를 회수하는 공정, 및
(C') 차 펩티드를 포함하는 액체를 고온 고압 처리하여 디케토피페라진을 포함하는 반응액을 얻는 공정
각 공정의 조건은, 전술한 바와 같지만, 공정 (a) 의 전추출에서는, 차 음료의 제조 등으로 추출 처리를 실시하여 얻어지는 차 찌꺼기 등의 추출 잔류물을 사용할 수도 있다. 종래, 찻잎 중의 수불용성 차 단백질은, 영양원으로는 이용되지 않고, 예를 들어, 일본 내의 녹차 음료 제조시에 발생하는 2.2 만톤에 달하는 추출 잔류물은, 그 대부분이 미이용 자원으로서 폐기되고 있지만, 상기의 차 엑기스의 제조 방법은, 종래 폐기되고 있던 차 찌꺼기의 유효 이용에도 유효하다.
이 방법에 의하면, Cyclo(Leu-Leu), Cyclo(Leu-Phe), 및 Cyclo(Ala-Ala) 를 고농도로 함유하는 차 엑기스를 제조할 수 있다. 구체적으로는, 차 엑기스 중의 디케토피페라진 전체량에 대해, Cyclo(Leu-Leu) 가 10 ％ 이상 (중량 기준), Cyclo(Leu-Phe) 가 10 ％ 이상, Cyclo(Ala-Ala) 가 7 ％ 이상이 되는 엑기스이다. 이들을 농도로 나타내면, 각각 5.0 ppm/Bx (500 ㎍/100 g/Bx) 이상, 바람직하게는 8.0 ppm/Bx 이상, 보다 바람직하게는 10.0 ppm/Bx 이상의 농도가 되는 차 엑기스가 된다. 이들의 상한은, 50.0 ppm/Bx 이하, 바람직하게는 40.0 ppm/Bx 이하, 보다 바람직하게는 35.0 ppm/Bx 이하, 더욱 바람직하게는 30.0 ppm/Bx 이하 정도이다.
또, 공정 (a) 에 있어서의 찻잎의 물 추출 (전추출) 을 복수 회 반복하여 실시함으로써, Cyclo(Leu-Leu), Cyclo(Leu-Phe), 및 Cyclo(Phe-Phe) 의 농도가 현저하게 높아지는 것을 알아내었다. 따라서, 이 방법은, Cyclo(Phe-Phe) 의 제조에도 유리하다. 본 발명자들은, 이 방법으로 얻어진 Cyclo(Phe-Phe) 를 3.0 ppm/Bx 이상 함유하는 차 엑기스가 학습 의욕 개선 작용을 갖는 것을 확인하였다.
그런데, 소수성의 관능기를 갖는 디케토피페라진은, 고리형화함으로써, 직사슬 펩티드보다 그 소수성이 높아지는 것이 알려져 있다. Cyclo(Phe-Phe) 는, 가장 소수성이 높은 성분이지만, 상기의 차 엑기스를 가속 보존 시험 (55 ℃, 2 주간) 한 결과, Cyclo(Phe-Phe) 가 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 차 엑기스는, Cyclo(Phe-Phe) 함유 엑기스로서도 유용한 것이다. 차 엑기스 중의 Cyclo(Phe-Phe) 함량은, 10 ㎍/100 g/Bx 이상, 20 ㎍/100 g/Bx 이상, 30 ㎍/100 g/Bx 이상으로 하는 것이 바람직하다.
(대두 엑기스)
본 명세서에서 말하는 「대두 엑기스」 란, 대두에 가수 (加水) 하여 추출 처리 또는 밀링 처리하여 얻어지는 액체를 말한다. 원료가 되는 대두 (학명：Glycine max) 는 품종이나 산지 등의 제한없이 사용할 수 있으며, 분쇄품 등의 가공품 단계의 것을 사용할 수도 있다. 또, 본 명세서에서 말하는 대두 엑기스에는, 대두 단백 분해물에 가수하여 얻어지는 액체도 편의상 포함되는 것으로 한다.
대두 중의 단백질은, 약 3 할을 차지한다고 일컬어지고 있다. 대두 단백질은, 차 단백질과 같이 수불용성 단백질이 많지는 않기 때문에, 수용성 단백질을 제거하는 전처리는 필수가 아니라, 필요에 따라 실시하면 된다. 수용성 단백질을 제거하는 전처리가 없는 경우, 원 포트 (One-Pot) 반응으로, 보다 간편하게 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스 (대두 엑기스) 를 제조할 수 있다.
본 발명자들은, 시판되는 대두 펩티드 (분체) 가, 분무 건조시에 180 ∼ 220 ℃ 정도의 열이 가해지고 있는 것을 감안하여, 대두 펩티드 중의 디케토피페라진 농도를 측정하고 있다. 그 결과, 시판되는 대두 펩티드에는, 극미량 (650 ㎍/100 g/Bx 정도) 포함되는 것을 확인하였다 (표 2 참조).
한편, 본 발명의 대두 엑기스는, 종래의 대두 단백 분해물 (대두 펩티드) 에는 포함되어 있지 않던 디케토피페라진인 Cyclo(Ala-Gln), Cyclo(Ala-Ala), Cyclo(Ser-Tyr), Cyclo(Gly-Trp), Cyclo(Val-Val), Cyclo(Trp-Tyr), Cyclo(Leu-Trp) 및 Cyclo(Phe-Phe) 중 어느 하나 이상을 Bx 당 함량이 10 ㎍/100 g/Bx 이상으로 함유한다.
또, 본 발명의 대두 엑기스는, Cyclo(Ala-Gln), Cyclo(His-Pro), Cyclo(Ala-Ala), Cyclo(Gly-Pro), Cyclo(Ser-Tyr), Cyclo(Pro-Thr), Cyclo(His-Phe), Cyclo(Ala-Pro), Cyclo(Phe-Ser), Cyclo(Gly-Leu), Cyclo(Gly-Phe), Cyclo(Gly-Trp), Cyclo(Asp-Phe), Cyclo(Val-Pro), Cyclo(Pro-Tyr), Cyclo(Met-Pro), Cyclo(Val-Val), Cyclo(Leu-Pro), Cyclo(Trp-Tyr), Cyclo(Phe-Pro), Cyclo(Leu-Trp), Cyclo(Leu-Phe), Cyclo(Leu-Leu) 및 Cyclo(Phe-Phe) 를 각각 0.1 ppm/Bx (10 ㎍/100 g/Bx) 의 농도로 함유한다. 바람직하게는 상기의 디케토피페라진 각각을 0.5 ppm/Bx 이상, 보다 바람직하게는 0.7 ppm/Bx 이상, 더욱 바람직하게는 0.9 ppm/Bx 이상, 특히 바람직하게는 1.0 ppm/Bx 이상, 특히 바람직하게는 1.2 ppm/Bx 이상의 농도로 함유하는 대두 엑기스이다. 또한, Cyclo(Pro-Pro) 및 Cyclo(Phe-Trp) 를, 각각 0.1 ppm/Bx (10 ㎍/100 g/Bx) 이상, 바람직하게는 0.2 ppm/Bx 이상, 보다 바람직하게는 0.3 ppm/Bx 이상의 농도로 함유시킬 수 있다.
이 대두 엑기스 (특히, 대두 또는 그 분쇄물을 원료로 하여 얻어지는 엑기스) 는, 쓴맛이 강한 디케토피페라진으로서 알려져 있는 Cyclo(Leu-Pro), Cyclo(Phe-Pro) 및 Cyclo(Leu-Trp) 를 함유함에도 불구하고, 그 쓴맛이 저감되어 있다. 동일한 농도의 Cyclo(Leu-Pro) 및 Cyclo(Phe-Pro) 를 함유하는 수용액을 조제한 경우에는, 강한 쓴맛이 느껴졌기 때문에, 공존하는 다른 디케토피페라진이나 대두 유래의 성분이 상가적 또는 상승적으로 Cyclo(Leu-Pro), 및 Cyclo(Phe-Pro) 및 Cyclo(Leu-Trp) 의 쓴맛을 완화하고 있는 것으로 생각된다. 특히, Cyclo(Leu-Leu) 와 Cyclo(Leu-Phe) 의 총량 (A) 에 대한 쓴맛을 갖는 디케토피페라진 Cyclo(Leu-Pro), Cyclo(Phe-Pro) 및 Cyclo(Leu-Trp) 의 총량 (B) 의 비율 [(B)/(A)] 이, 1.0 이하 (바람직하게는 0.8 이하, 보다 바람직하게는 0.6 이하, 특히 바람직하게는 0.5 이하) 가 되는 대두 엑기스는, 쓴맛이 현저하게 저감된 디케토피페라진 함유 엑기스이며, 음식품 (특히, 음료) 에 유리하게 배합할 수 있다.
대두 엑기스 중의 Bx 당 디케토피페라진의 총량은, 900 ㎍/100 g/Bx 이상, 바람직하게는 900 ∼ 30000 ㎍/100 g/Bx, 보다 바람직하게는 2000 ∼ 25000 ㎍/100 g/Bx, 특히 바람직하게는 5000 ∼ 20000 ㎍/100 g/Bx 이다. 이와 같은 농도 범위로 하면, 디케토피페라진이 갖는 기능 (생리 활성 등) 이 부가된 음식품을 제조하는 데에 유리하다.
본 발명의 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 대두 엑기스는, 이하의 공정을 순차 실시함으로써 제조할 수 있다.
(x) 대두 또는 대두 단백 분해물에, 물 존재하에서 엔도형 프로테아제를 작용시켜, 대두 펩티드를 포함하는 액을 얻는 공정,
(y) 대두 펩티드를 포함하는 액을 고온 고압 처리하여 반응액을 얻는 공정, 및
(z) 반응액을 고액 분리 처리하여, 디케토피페라진을 포함하는 액체를 회수하는 공정
차 엑기스의 제조와 마찬가지로, 공정 (y) 및 (z) 는 순서를 교환해도 된다. 또, 공정 (x) 의 전에, 수용성 단백을 제거하는 공정 (w) 를 첨가해도 된다. 디 또는 트리펩티드를 많이 함유하는 대두 펩티드를 원료로서 사용하는 경우, 공정 (x) 는,
(x') 디 또는 트리펩티드를 많이 함유하는 대두 펩티드에 가수하여, 대두 펩티드를 포함하는 액을 얻는 공정
이 된다. 그 외, 각 공정의 조건은 전술한 바와 같다.
이 방법에 의하면, Cyclo(Leu-Leu), Cyclo(Leu-Phe), Cyclo(Ser-Tyr) 및 Cyclo(Pro-Thr) 을 고농도로 함유하는 대두 엑기스를 제조할 수 있다. 구체적으로는, 대두 엑기스 중의 디케토피페라진 전체량에 대해, Cyclo(Leu-Leu) 가 8 ％ 이상 (중량 기준), Cyclo(Leu-Phe) 가 8 ％ 이상, Cyclo(Ser-Tyr) 이 6 ％ 이상이 되는 엑기스이다. 이들 농도가 각각 5.0 ppm/Bx (500 ㎍/100 g/Bx) 이상, 바람직하게는 6.0 ppm/Bx 이상, 보다 바람직하게는 7.0 ppm/Bx 이상의 농도가 되는 대두 엑기스가 된다. 특히, Cyclo(Leu-Leu) 및 Cyclo(Leu-Phe) 는, 10.0 ppm/Bx 이상, 바람직하게는 12.0 ppm/Bx 이상이 되는 대두 엑기스가 얻어진다. 이들의 상한은, 50.0 ppm/Bx 이하, 바람직하게는 40.0 ppm/Bx 이하, 보다 바람직하게는 35.0 ppm/Bx 이하, 더욱 바람직하게는 30.0 ppm/Bx 이하 정도이다.
또, 이 방법에 의해, 대두 펩티드에는 포함되어 있지 않은 Cyclo(Phe-Phe) 를 3.0 ppm/Bx 이상, 바람직하게는 Cyclo(Phe-Phe) 를 4.0 ppm/Bx 이상 함유하는 대두 엑기스가 얻어지므로, 이 방법은, Cyclo(Phe-Phe) 의 제조에도 유리하다 (후술하는 실시예 참조). Cyclo(Phe-Phe) 는 소수성이 높은 성분이지만, 이 대두 엑기스 중에서는, 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다.
(맥아 엑기스)
본 명세서에서 말하는 「맥아 엑기스」 란, 맥아 또는 그 분쇄물에 추출 처리하여 얻어지는 추출물을 말한다. 원료가 되는 맥아 대두 (malt) 는, 품종이나 산지 등의 제한없이 사용할 수 있지만, 특히 보리의 종자를 발아시킨 보리 맥아가 적합하게 사용된다. 보리 맥아는, 껍질부를 제거하여 단백질 함량이 높은 획분을 분리하여 사용하는 것이 실용적이고 효율적이다. 단백질 함량이 높은 획분은, 맥아를 표면으로부터 서서히 깎아, 곡피 (穀皮) 를 제거하고, 그 후, 알류론층 및 배유와 같은 단백질이 많이 포함되는 획분을 깎아낸다는 방법을 들 수 있다. 혹은, 차 엑기스로 실시한 바와 같이, 전추출을 실시한 추출 잔류물을 이용할 수 있다. 추출 잔류물로는, 맥주 제조시에 발생하는 맥아의 짜고 난 찌꺼기를 예시할 수 있다.
단백질 함량이 많은 획분을 원료로 하면, 원 포트 (One-Pot) 반응으로, 보다 간편하게 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스 (맥아 엑기스) 를 제조할 수 있다.
본 발명의 맥아 엑기스는, 종래, 잘 추출되지 않았던 디케토피페라진인 Cyclo(Ala-Gln), Cyclo(Ala-Ala), Cyclo(Ser-Tyr), Cyclo(Gly-Trp), Cyclo(Val-Val), Cyclo(Trp-Tyr), Cyclo(Leu-Trp) 및 Cyclo(Phe-Phe) 중 어느 하나 이상을 10 ㎍/100 g/Bx 이상의 농도로 함유한다.
또, 본 발명의 맥아 엑기스는, Cyclo(Ala-Gln), Cyclo(His-Pro), Cyclo(Ala-Ala), Cyclo(Gly-Pro), Cyclo(Ser-Tyr), Cyclo(Pro-Thr), Cyclo(His-Phe), Cyclo(Ala-Pro), Cyclo(Phe-Ser), Cyclo(Gly-Leu), Cyclo(Gly-Phe), Cyclo(Gly-Trp), Cyclo(Asp-Phe), Cyclo(Val-Pro), Cyclo(Pro-Tyr), Cyclo(Met-Pro), Cyclo(Val-Val), Cyclo(Leu-Pro), Cyclo(Trp-Tyr), Cyclo(Phe-Pro), Cyclo(Leu-Trp), Cyclo(Leu-Phe), Cyclo(Leu-Leu) 및 Cyclo(Phe-Phe) 를 각각 0.1 ppm/Bx (50 ㎍/100 g/Bx) 이상의 농도로 함유한다. 바람직하게는 상기 디케토피페라진 각각을 0.3 ppm/Bx 이상, 보다 바람직하게는 0.4 ppm/Bx 이상, 더욱 바람직하게는 0.5 ppm/Bx 이상, 특히 바람직하게는 0.6 ppm/Bx 이상의 농도로 함유하는 맥아 엑기스이다.
이 맥아 엑기스는, 쓴맛이 강한 디케토피페라진으로서 알려져 있는 Cyclo(Leu-Pro), Cyclo(Phe-Pro) 및 Cyclo(Leu-Trp) 를 함유함에도 불구하고, 그 쓴맛이 저감되어 있다. 특히, Cyclo(Leu-Leu) 와 Cyclo(Leu-Phe) 의 총량 (A) 에 대한 쓴맛을 갖는 디케토피페라진 Cyclo(Leu-Pro), Cyclo(Phe-Pro) 및 Cyclo(Leu-Trp) 의 총량 (B) 의 비율 [(B)/(A)] 이, 1.0 이하 (바람직하게는 0.8 이하) 가 되는 맥아 엑기스는, 쓴맛이 현저하게 저감된 디케토피페라진 함유 엑기스이며, 음식품 (특히, 음료) 에 유리하게 배합할 수 있다.
맥아 엑기스 중의 Bx 당 디케토피페라진의 총량은, 900 ㎍/100 g/Bx 이상, 바람직하게는 900 ∼ 30000 ㎍/100 g/Bx, 보다 바람직하게는 2000 ∼ 25000 ㎍/100 g/Bx, 특히 바람직하게는 5000 ∼ 20000 ㎍/100 g/Bx 이다. 이와 같은 농도 범위로 하면, 디케토피페라진이 갖는 기능 (생리 활성 등) 이 부가된 음식품을 제조하는 데에 유리하다.
본 발명의 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 맥아 엑기스는, 이하의 공정을 순차 실시함으로써 제조할 수 있다.
(x) 맥아 또는 맥아 단백 분해물에, 물 존재하에서 엔도형 프로테아제를 작용시켜, 맥아 펩티드를 포함하는 액을 얻는 공정,
(y) 맥아 펩티드를 포함하는 액을 고온 고압 처리하여 반응액을 얻는 공정, 및
(z) 반응액을 고액 분리 처리하여, 디케토피페라진을 포함하는 액체를 회수하는 공정
차 엑기스의 제조와 마찬가지로, 공정 (y) 및 (z) 는 순서를 교환해도 된다. 또, 공정 (x) 의 전에, 수용성 단백을 제거하는 공정 (w) 를 첨가해도 된다. 그 외, 각 공정의 조건은 전술한 바와 같다.
이 방법에 의하면, Cyclo(Leu-Leu), Cyclo(Leu-Phe) 및 Cyclo(Ala-Ala) 를 고농도로 함유하는 맥아 엑기스를 제조할 수 있다. 구체적으로는, 이들의 농도가 각각 5.0 ppm/Bx (500 ㎍/100 g/Bx) 이상, 바람직하게는 6.0 ppm/Bx 이상, 보다 바람직하게는 7.0 ppm/Bx 이상의 농도가 되는 맥아 엑기스가 된다. 이들의 상한은, 50.0 ppm/Bx 이하, 바람직하게는 40.0 ppm/Bx 이하, 보다 바람직하게는 30.0 ppm/Bx 이하, 더욱 바람직하게는 20.0 ppm/Bx 이하 정도이다.
또, 이 방법에 의해, Cyclo(Phe-Phe) 를 1.0 ppm/Bx 이상, 바람직하게는 2.0 ppm/Bx 이상, 더욱 바람직하게는 3.0 ppm/Bx 이상 함유하는 맥아 엑기스가 얻어지므로, 이 방법은, Cyclo(Phe-Phe) 의 제조에도 유리하다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또, 본 명세서에 있어서 특기하지 않는 한, 농도 등은 중량 기준이며, 수치 범위는 그 단점을 포함하는 것으로서 기재된다.
(실시예 1) 식물성 펩티드로부터의 디케토피페라진의 제조
식물성 펩티드로서 대두 펩티드 및 참깨 펩티드를 사용하고, 액체 중에서 고온 고압 처리하여 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스를 제조하였다. 구체적으로는, 대두 펩티드 (하이뉴트 AM, 후지 제유사 제조) 및 참깨 펩티드 (KM-20, KISCO 사 제조) 3 g 에, 각각 15 ㎖ 의 증류수를 첨가하고, 오토클레이브 (토미 정공사 제조) 에 넣어, 135 ℃, 0.31 ㎫, 3 시간 고온 고압 처리를 가하였다. 또, 비교예로서, 동일한 펩티드를 사용하여 고온 고압 처리를 실시하지 않은 것을 조제하였다. 처리 후의 액체 10 ㎖ 를 50 배 희석하여 막 처리한 것을 LC-MS/MS 에 제공하고, 각종 디케토피페라진 농도를 구하였다. 분석 조건 상세한 내용은, 하기한 바와 같다. 또, 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스의 브릭스 (Bx) 를 디지털 굴절계 RX-5000a (ATAGO 사 제조) 를 사용하여 측정하고, 디케토피페라진의 총량 (단위：㎍/100 g) 과 브릭스 (Bx) 의 비를 산출하였다.
[화학식 1]
Figure 112016001710538-pct00002
표 2 에 결과를 나타낸다 (본 명세서 중, Cyclo(Leu-Leu) 는 Cyclo(Leu-Leu) 와 Cyclo(Ile-Ile) 의 합산값을 나타낸다). 본 발명의 액체 중에서의 고온 고압 처리에 의해, 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스를 간편하게 제조할 수 있는 것을 알 수 있었다. 또, Cyclo(Ala-Gln), Cyclo(His-Pro), Cyclo(Ala-Ala), Cyclo(Gly-Pro), Cyclo(Ser-Tyr), Cyclo(Pro-Thr), Cyclo(His-Phe), Cyclo(Ala-Pro), Cyclo(Phe-Ser), Cyclo(Gly-Leu), Cyclo(Gly-Phe), Cyclo(Pro-Pro), Cyclo(Gly-Trp), Cyclo(Asp-Phe), Cyclo(Val-Pro), Cyclo(Pro-Tyr), Cyclo(Met-Pro), Cyclo(Met-Met), Cyclo(Val-Val), Cyclo(Leu-Pro), Cyclo(Trp-Tyr), Cyclo(Phe-Pro), Cyclo(Leu-Trp), Cyclo(Phe-Trp), Cyclo(Leu-Phe), Cyclo(Leu-Leu), 및 Cyclo(Phe-Phe) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 디케토피페라진을 증가시킬 수 있는 것이 시사되었다. 특히, Cyclo(Leu-Leu) 및 Cyclo(Leu-Phe) 를 고농도로 함유하고, 그 함유량은, 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스 중 21.5 ％ 였다.
Figure 112016001710538-pct00003
(실시예 2) 식물성 펩티드로부터의 Cyclo(Phe-Phe) 의 제조
식물성 펩티드로서, 이하의 펩티드를 사용하였다.
1) 대두 펩티드 「하이뉴트 AM」 (후지 제유사 제조)：디·트리펩티드가 67 ％, 평균 분자량 500
2) 대두 펩티드 「하이뉴트 DC」 (후지 제유사 제조)：사슬 길이 3 ∼ 7, 평균 분자량 1000
3) 대두 펩티드 「하이뉴트 HK」 (후지 제유사 제조)
4) 쌀 펩티드 「오리자 펩티드」 (오리자 유화사 제조)：트리펩티드가 40 ∼ 50 ％
5) 밀 펩티드 「글루타민 펩티드 GP-1N」 (닛신 파르마사 제조)：분자량 5000 ∼ 10000
6) 밀 펩티드 「글루타민 펩티드 GP-N」 (닛신 파르마사 제조)：분자량 5000 ∼ 10000
식물성 펩티드 3 g 에, 각각 15 ㎖ 의 증류수를 첨가하고, 오토클레이브 (토미 정공사 제조) 에 넣어, 132 ℃, 0.29 ㎫, 2 시간 고온 고압 처리를 가하였다. 처리 후의 액체 10 ㎖ 를 OASIS MAX (Waters 사 제조) 를 사용하여 고상 추출하고, 얻어진 고상 추출물을 감압 농축 후, DMSO 100 ㎕ 에 용해하고, 그 중 10 ㎕ 를 사용하여 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 에 의해 시클로페닐알라닐페닐알라닌 농도를 구하였다.
표 3 에 결과를 나타낸다. 펩티드의 종류에 따라, 시클로페닐알라닐페닐알라닌의 생성 정도에 차이가 있었다. 대두 펩티드는, 쌀 펩티드나 밀 펩티드를 사용한 경우에 비해, 시클로페닐알라닐페닐알라닌이 고농도로 생성되었다. 이로부터, 분자량 5000 이하 (특히 분자량 1000 이하) 의 펩티드의 비율이 높은 대두 펩티드를 사용하는 것이 바람직한 것이 시사되었다. 또, 대두 펩티드로 비교하면, 분자량이 보다 작고, 디·트리펩티드를 많이 포함하는 올리고 펩티드를 원료로 하는 것이 바람직한 것이 시사되었다.
Figure 112016001710538-pct00004
(실시예 3) 식물 유래의 단백질로부터의 디케토피페라진의 제조
식물 유래의 단백질을 원료로 하여 효소에 의한 분해 처리를 실시한 것을 사용하였다. 식물 유래의 단백질에는, 대두 단백질 (프롤리나 900 (후지 제유사 제조)) 과 쌀 단백질 (오리자 프로테인 P70 (오리자 유화사 제조)) 을 사용하였다. 단백질 300 ㎎ 을 15 ㎖ 의 증류수에 첨가하였다. 이어서, 효소 A (프로테악스), 효소 B (뉴라아제 F3G；Rhizopus niveus 유래의 산성 프로테아제 (엔도펩티다아제)), 효소 C (파파인 W-40；Carica papaya 유래의 프로테아제), 효소 D (프로테아제 A 「아마노」 SD；Aspergillus sp. 유래의 프로테아제), 효소 E (프로테아제 M 「아마노」 SD；Aspergillus sp. 유래의 프로테아제), 효소 F (프로테아제 P 「아마노」 3SD；Aspergillus sp. 유래의 프로테아제), 효소 G (프로멜라인 F；Ananas comosus 유래의 프로테아제), 효소 H (펩티다아제 R), 효소 I (서모아제 PC10F；Bacillus stearothermophilus 유래의 프로테아제 (엔도펩티다아제)), 효소 J (프로틴 SD-NY10；Bacillus sp. 유래의 프로테아제), 효소 K (프로틴 SD-AY10；Bacillus sp. 유래의 프로테아제) (이상, 모두 아마노 엔자임사 제조) 중 어느 것을 15 ㎎ 첨가하고, 37 ℃, 2 시간 진탕 혼화하였다. 그 후, 이 효소 처리액을 고액 분리하지 않고 가열 처리하였다. 가열 처리는 오토클레이브 (토미 정공사 제조) 로, 132 ℃, 2 시간 고온 고압 처리를 실시하였다. 또, 대두 단백질 및 쌀 단백질을 효소로 처리하지 않고 동일하게 처리한 것도 제조하였다. 처리 후의 액체 10 ㎖ 를 OASIS MAX (Waters 사 제조) 를 사용하여 고상 추출하고, 얻어진 고상 추출물을 감압 농축 후, DMSO 100 ㎕ 에 용해하고, 그 중 10 ㎕ 를 사용하여 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 에 의해 시클로페닐알라닐페닐알라닌 농도를 구하였다.
대두 단백질을 사용한 경우의 결과를 도 1 에, 쌀 단백질을 사용한 경우의 결과를 도 2 에 나타낸다. 효소에 의한 분해 처리를 실시하지 않은 것 (미 (未)) 도 가열에 의한 처리에 의해 디케토피페라진이 생성되었다. 효소의 종류에 따라, 시클로페닐알라닐페닐알라닌의 생성 정도에 차이가 있고, Bacillus sp. 유래의 프로테아제를 사용한 경우에 많이 생성되는 경향이 있는 것을 알 수 있었다.
(실시예 4) 식물체로부터의 디케토피페라진의 제조 (1)
식물체로서, 카고시마현산(産)의 일번차 (一番茶) 찻잎 (품종：야부키타, 전체 질소：6.3 ％) 을 사용하였다. 이 찻잎에 대해, 먼저, 수용성 단백질을 저감시키는 전처리 (3 회의 전추출) 를 실시하였다. 즉, 찻잎 10 g 에 대해서, 열탕 200 g 을 첨가하여 적절히 교반하고, 5 분간 추출을 실시하였다. 추출 종료 후, 140 메시로 여과하고, 추출 잔류물 (차 찌꺼기) 을 회수하였다. 이 차 찌꺼기에 대해, 200 g 의 열탕을 부어 5 분간 추출을 실시하여 차 찌꺼기를 회수하였다. 재차, 이 차 찌꺼기에 대해서 동일하게 추출 처리를 실시하여 차 찌꺼기를 회수하였다.
다음으로, 이 전추출을 실시한 찻잎 (차 찌꺼기) 에 대해서, 효소에 의한 분해 처리를 실시하였다. 차 찌꺼기 (전체량) 에 대해 50 ℃ 의 뜨거운 물을 200 g 붓고, 프로테아제 (상품명：프로틴 NY100, 다이와 화성사 제조) 를 1 g 첨가하고, 교반자로 교반 (300 rpm) 하면서, 55 ℃ 의 워터 바스 내에서 3 시간 반응시켰다. 그 후, 95 ℃, 30 분간 유지하여 효소를 실활시켰다.
이 효소 처리액을 고액 분리하지 않고 찻잎 액체 혼합물의 형태로, 가열 처리를 실시하였다. 가열 처리는, 오토클레이브 (토미 정공사 제조) 에 넣어, 135 ℃, 3 시간의 고온 고압 유체에 의한 가열 처리로 하였다. 처리 후의 액체를 140 메시로 여과하고, 차 엑기스 (엑기스 A) 를 얻었다. 이 차 엑기스 (엑기스 A) (Bx 0.99) 에 대해, 실시예 1 과 동일하게, 엑기스 중의 디케토피페라진의 분석을 실시하였다.
표 4 에 결과를 나타낸다. 찻잎 (차 찌꺼기) 에 액체 중에서의 고온 고압 처리를 실시함으로써, 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스를 고농도로 함유하는 차 엑기스를 간편하게 제조할 수 있는 것을 알 수 있었다. 또, Cyclo(Ala-Gln), Cyclo(His-Pro), Cyclo(Ala-Ala), Cyclo(Gly-Pro), Cyclo(Ser-Tyr), Cyclo(Pro-Thr), Cyclo(His-Phe), Cyclo(Ala-Pro), Cyclo(Phe-Ser), Cyclo(Gly-Leu), Cyclo(Gly-Phe), Cyclo(Pro-Pro), Cyclo(Gly-Trp), Cyclo(Asp-Phe), Cyclo(Val-Pro), Cyclo(Pro-Tyr), Cyclo(Met-Pro), Cyclo(Met-Met), Cyclo(Val-Val), Cyclo(Leu-Pro), Cyclo(Trp-Tyr), Cyclo(Phe-Pro), Cyclo(Leu-Trp), Cyclo(Phe-Trp), Cyclo(Leu-Phe), Cyclo(Leu-Leu), 및 Cyclo(Phe-Phe) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 디케토피페라진을 증가시킬 수 있는 것이 시사되었다. 특히, 시클로류실류신 및 시클로류실페닐알라닌을 고농도로 함유하고, 그 함유량은, 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스 중 27.2 ％ 였다. 이 차 엑기스의 풍미를 관능 평가하면, 거의 무미 무취였다.
Figure 112016001710538-pct00005
(실시예 5) 식물체로부터의 디케토피페라진의 제조 (2)
식물체로서, 시판되는 물에 익힌 대두 및 맥아를 사용하였다. 물에 익힌 대두 및 맥아에 대해서, 각각 실시예 4 와 동일하게, 식물체 (대두) 의 건조 중량에 대해 20 배량의 열탕으로 전추출을 3 번 실시한 후에, 실시예 3 과 동일한 효소 처리 및 액체 중에서의 고온 고압 처리를 실시하고, 대두 엑기스 (엑기스 B) 및 맥아 엑기스 (엑기스 C) 를 얻었다. 또한, 개정 5 판 데이터에 기초하여, 대두의 건조 중량은 물에 익힌 대두 전체량의 36.5 ％ 로서 환산하였다. 엑기스 B 및 엑기스 C 에 대해, Bx 를 1 로 조정한 후에 실시예 1 과 동일하게, 엑기스 중의 디케토피페라진의 분석을 실시하였다. 표 5 에 결과를 나타낸다. 대두나 맥아로부터도 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스를 간편하게 제조할 수 있는 것을 알 수 있었다.
Figure 112016001710538-pct00006
(실시예 6) 식물체로부터의 디케토피페라진의 제조 (3)
식물체로서, 실시예 4 와 동일한 찻잎을 사용하고, 전추출, 효소 처리, 가열 처리의 영향에 대하여 검토하였다. 샘플을 표 6 에 나타낸다. 샘플 No. 5 및 6 은, 식물체로부터 올리고 펩티드를 생성시키는 공정과 액체 중에서의 고온 고압 처리에 의해 올리고 펩티드를 고리화시켜 디펩티드를 생성시키는 공정을 동시에 가열 처리로 실시하고 있는 것을 나타낸다. 전추출은 횟수를 2 회로 하는 것 외에는, 실시예 4 와 동일하게 하여 실시하고, 효소 처리는 반응 온도를 50 ℃ 로, 또 가열 처리는 가열 시간을 8 시간으로 바꾸는 것 외에는, 실시예 4 와 동일하게 하여 실시하였다. 얻어진 차 엑기스 (샘플 No. 1 ∼ 8) 에 대해, 실시예 1 과 동일하게 LC-MS/MS 를 이용하여 분석을 실시하였다.
Figure 112016001710538-pct00007
표 7 에 결과를 나타낸다. 액체 중에서의 고온 고압 처리를 실시하지 않으면, 디케토피페라진은 생성되지 않는 것이 분명해졌다 (샘플 No. 1 ∼ 4). 또, 샘플 No. 5 ∼ 8 을 비교하여, 이하의 지견이 얻어졌다.
·전처리 (추출 처리) 를 실시함으로써, 얻어지는 차 엑기스 중의 디케토피페라진 농도는 증가하였다.
·가열 처리와 효소 처리 중 어느 방법으로도 올리고 펩티드가 얻어지지만, 효소 처리가 보다 효과적이고 또한 효율적이었다.
전추출, 가열 처리 및 효소 처리를 적절히 이용함으로써, Bx 당 디케토피페라진의 총량이 900 ㎍/100 g/Bx 이상으로 현격히 다량으로 포함하는 식물 엑기스 (차 엑기스) 가 얻어졌다. 이로부터, 본 발명이, 디케토피페라진을 고농도로 포함하는 식물 엑기스 및 그 제조에 유리한 것이 시사되었다. 또, Cyclo(Ala-Gln), Cyclo(His-Pro), Cyclo(Ala-Ala), Cyclo(Gly-Pro), Cyclo(Ser-Tyr), Cyclo(Pro-Thr), Cyclo(His-Phe), Cyclo(Ala-Pro), Cyclo(Phe-Ser), Cyclo(Gly-Leu), Cyclo(Gly-Phe), Cyclo(Pro-Pro), Cyclo(Asp-Phe), Cyclo(Val-Pro), Cyclo(Pro-Tyr), Cyclo(Met-Pro), Cyclo(Leu-Pro), Cyclo(Phe-Pro), Cyclo(Leu-Phe), 및 Cyclo(Leu-Leu) 를 각각 10 ㎍/100 g/Bx 이상의 농도로 함유하는 식물 엑기스 (차 엑기스) 가 얻어지는 것이 시사되었다. 본 발명은, 이들 디케토피페라진의 1 이상의 제조에도 유용한 것이 시사되었다.
또한, 전처리나 효소 처리를 실시함으로써 Cyclo(Phe-Phe) 가 생성되었다. 이로부터, 본 발명에 의하면, Bx 당 Cyclo(Phe-Phe) 함량이 10 ㎍/100 g/Bx 이상인, 식물 엑기스 (차 엑기스) 가 얻어지는 것이 시사되었다. 소수성이 높은 Cyclo(Phe-Phe) 는, 엑기스 중 (수용액 중) 에서 안정적으로 유지되었다.
샘플 No. 5 ∼ 8 의 향미 평가를 실시했지만, 엑기스 자체는 쓴맛을 비롯한 맛을 수반하지 않는 엑기스였다. No. 5 샘플과 동일 농도의 Cyclo(Leu-Pro), Cyclo(Phe-Pro) 및 Cyclo(Leu-Trp) 를 각각 1 종류 또는 3 종류 전부를 함유하는 수용액을 조제하여 향미 평가를 실시한 결과, 쓴맛이 현저하게 지각되었기 때문에, 차 엑기스 중에서 존재함으로써, 쓴맛이 저감되는 것이 시사되었다.
Figure 112016001710538-pct00008
(실시예 7) 식물체로부터의 디케토피페라진의 제조 (4)
실시예 6 에 있어서, 전추출의 유용성이 확인되었기 때문에, 전추출의 횟수에 대하여 검토하였다. 식물체로서, 카고시마현산의 일번차 찻잎 (품종：야부키타, 전체 질소：6.3 ％) 을 사용하였다. 디케토피페라진의 농도를 보다 높이기 위해서, 전추출의 최적 횟수의 검토를 실시하였다. 전추출은 다음의 요령으로 실시하였다. 찻잎 10 g 에 대해서, 열탕 200 g 을 첨가하여 적절히 교반하고 5 분간 추출을 실시하였다. 추출 종료 후, 140 메시로 여과하고, 추출액은 폐기하였다. 전추출을 2 회 이상 실시하는 수준에 있어서는, 여과하여 얻은 차 찌꺼기에 재차 열탕을 200 g 첨가하여 동일한 조작을 반복하였다. 이와 같이 하여, 전추출을 0 회 ∼ 3 회 실시한 찻잎 (초기 양 10 g) 대해 50 ℃ 의 뜨거운 물을 200 g 붓고, 효소 프로테아제 (아마노 엔자임, 프로틴 NY100) 를 1 g 첨가하고, 교반자로 교반 (300 rpm) 하면서, 50 ℃ 의 워터 바스 내에서 3 시간 반응시켰다. 그 후, 95 ℃, 30 분간 유지함으로써 효소를 실활시켰다. 얻어진 찻잎 액체 혼합물을 오토클레이브 (토미 정공) 에 넣어, 135 ℃, 8 시간 고온 고압 처리를 실시한 후의 액체를 140 메시로 여과하고, 차 엑기스를 얻었다. 얻어진 추출액은 각각 Bx 측정을 한 후에, 실시예 1 과 동일하게 LC-MS/MS 를 이용하여 디케토피페라진의 농도를 정량하였다.
표 8 에 결과를 나타낸다. 전추출의 횟수에 따라, 디케토피페라진의 생성량이 증가하였다. 전추출의 횟수와 가용성 성분의 제거율의 관계를 도 3 에 나타낸다. 가용성 성분의 제거율은, 식 「(전추출로 얻어진 채액량 (총량) (g) × 그 브릭스 [Bx]) / (식물체의 중량에 대해 30 배량의 열탕으로 10 분간 추출하는 것을 10 회 반복했을 때의 채액량 (g) × 그 브릭스 [Bx]) × 100 (％)」 로 산출하였다. 전추출을 3 회 반복함으로써, 가용성 성분을 95 ％ 이상 제거할 수 있는 것을 알 수 있었다.
Figure 112016001710538-pct00009
(실시예 8) 식물체로부터의 디케토피페라진의 제조 (5)
실시예 6 에 있어서, 효소 처리의 유용성이 확인되었기 때문에, 효소의 종류에 대하여 검토를 실시하였다. 검토한 효소는 다음의 9 종류이다.
＜샘플 No. 9＞ 프로틴 NY100：Bacillus amyloliquefaciens 유래의 프로테아제 (엔도펩티다아제)
＜샘플 No. 10＞ 서모아제 160：Bacillus stearothermophilus 유래의 내열성 프로테아제 (엔도펩티다아제)
＜샘플 No. 11＞ 서모아제 PC10F：Bacillus stearothermophilus 유래의 프로테아제 (엔도펩티다아제)
＜샘플 No. 12＞ 프로테악스：Aspergillus oryzae 유래의 중성 프로테아제
＜샘플 No. 13＞ 프로테아제 M：Ananas comosus 유래의 중성 프로테아제
＜샘플 No. 14＞ 프로테아제 P：Aspergillus melleus 유래의 알칼리성 프로테아제
＜샘플 No. 15＞ 프로테아제 A：Aspergillus oryzae 유래의 중성 프로테아제
＜샘플 No. 16＞ 펩티다아제 R：Rhizopus oryzae 유래의 중성 프로테아제
＜샘플 No. 17＞ 뉴라아제 F3G：Rhizopus niveus 유래의 산성 프로테아제 (엔도펩티다아제)
식물체로서, 카고시마현산의 일번차 찻잎 (품종：야부키타, 전체 질소：6.3 ％) 을 사용하였다. 찻잎 10 g 에 실시예 6 과 동일한 전추출을 3 회 실시하여 얻은 차 찌꺼기에 대해서 55 ℃ (서모아제 160 및 서모아제 PC10F 에 관해서는 70 ℃) 의 뜨거운 물을 200 g 붓고, 각종 효소를 1 g 첨가하고, 교반자로 교반 (300 rpm) 하면서, 55 ℃ (서모아제 160 및 서모아제 PC10F 에 관해서는 70 ℃) 의 워터 바스 내에서 3 시간 반응시켰다. 그 후, 95 ℃, 30 분간 유지함으로써 효소를 실활시켰다. 얻어진 찻잎 액체 혼합물을 오토클레이브 (토미 정공) 에 넣어, 135 ℃, 8 시간 고온 고압 처리를 가하였다. 처리 후의 액체를 140 메시로 여과하고, 차 엑기스를 얻었다. 얻어진 추출액은 각각 Bx 측정을 한 후에, 실시예 1 과 동일하게 LS-MS/MS 측정에 의해 디케토피페라진의 농도를 정량하였다.
표 9 에 결과를 나타낸다. 세균 유래의 효소로 엔도펩티다아제 활성이 높은 효소를 사용한 경우에, 디케토피페라진의 농도가 현저하게 증가하는 것을 알 수 있었다. 세균 유래의 효소 중에서도, Bacillus subtilis 유래의 중성 프로테아제나 Bacillus stearothermophilus 유래의 프로테아제를 사용한 경우에, 특히 디케토피페라진의 생성량이 증가하였다.
Figure 112016001710538-pct00010
(실시예 9) 식물체로부터의 디케토피페라진의 제조 (6)
찻잎에 대한 효소 (프로틴 NY100) 농도를 0 ∼ 20 ％ 로 바꾸는 것 외에는, 실시예 4 와 동일하게 하여 차 엑기스를 제조하였다. 얻어진 차 엑기스에 대해, 관능 평가를 실시함과 함께, 실시예 1 과 동일하게 LC-MS/MS 를 이용하여 표 10 에 나타내는 17 종의 디케토피페라진의 함유량을 정량하고, 그 총량을 구하였다.
표 10 에 결과를 나타낸다. 효소 농도는, 식물 원료에 대해 1 중량％ ∼ 20 중량％, 바람직하게는 3 중량％ ∼ 15 중량％, 보다 바람직하게는 4 중량％ ∼ 10 중량％ 의 범위인 것이 시사되었다. 또, 어느 차 엑기스도 엑기스 자체에 거의 풍미는 없고, 음식물에 배합하여 이용 가능한 엑기스인 것으로 판단하였다. 특히, 전추출, 효소 처리, 가열 처리를 조합하여 실시한 것의 향미가 우수하였다.
Figure 112016001710538-pct00011
(실시예 10) 식물체로부터의 디케토피페라진의 제조 (7)
고온 고압 처리의 조건을 바꾸는 것 외에는, 실시예 4 와 동일하게 하여 차 엑기스를 제조하였다. 구체적으로는, 식물체로서, 실시예 4 와 동일한 찻잎을 동량 사용하였다. 전추출을 20 배량의 물에서 30 배량의 물로 바꾸어 3 회 반복하여 찻잎 (차 찌꺼기) 을 얻고, 실시예 4 와 동일하게 효소 처리를 실시하고, 실시예 4 와 동일한 가열 처리 장치를 사용하여 표 11 에 나타내는 각종 가열 조건으로 가열 처리를 실시하였다. 얻어진 차 엑기스에 대해, 실시예 1 과 동일하게, 엑기스 중의 디케토피페라진의 분석을 실시하였다.
표 11 에 결과를 나타낸다. 디케토피페라진을 생성하기 위해서는, 100 ℃ 이상 (바람직하게는 115 ℃ 이상, 보다 바람직하게는 125 ℃ 이상) 의 가열이 필요한 것이 시사되었다. 또, 가열 시간은, 30 분 ∼ 10 시간, 바람직하게는 2 ∼ 8 시간 정도의 가열인 것이 시사되었다.
Figure 112016001710538-pct00012
(실시예 11) 디케토피페라진 함유 음식물의 제조
시판되는 PET 녹차 음료 450 g 에, 실시예 4 에서 제조한 차 엑기스 A 및/또는 물을 표 12 와 같이 50 g 씩 첨가하여, 전체량 500 g 의 디케토피페라진 함유 차 음료를 조제하였다. 이들 차 음료에 대해 향미의 관능 평가를 실시하였다. 평가는, 쓴맛을 중심으로 종합적인 바람직함으로 판단하고, ◎：향미가 매우 양호, ○：향미 양호, △：음용 가능한 향미, ×: 약간 음용이 곤란한 향미, ××：음용이 매우 곤란한 향미의 5 단계로 실시하였다.
표 12 에 결과를 나타낸다. 음료 500 g 당, 디케토피페라진 혼합체로서 실시예 4 의 차 엑기스 A 를 0 ∼ 50 g 함유하는 차 음료는, 모두 향미 양호한 것을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 얻어지는 차 엑기스가 음료 향미의 배합 설계에 있어서, 범용성이 높은 소재인 것이 시사되었다.
Figure 112016001710538-pct00013

Claims (10)

  1. 시클로알라닐글루타민, 시클로알라닐알라닌, 시클로세릴티로신, 시클로글리실류신, 시클로글리실트립토판, 시클로발릴발린, 시클로트립토파닐티로신, 시클로류실트립토판, 시클로페닐알라닐프롤린 및 시클로페닐알라닐페닐알라닌 중 어느 하나 이상을, 10 ㎍/100 g/Bx 이상의 농도로 함유하는 식물 엑기스로서,
    식물 엑기스가 차 엑기스, 대두 엑기스, 보리 엑기스 또는 참깨 엑기스이고, Bx 당 디케토피페라진의 총량이 900 ㎍/100 g/Bx 이상인, 식물 엑기스.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    식물 엑기스가 차 엑기스, 대두 엑기스 또는 보리 엑기스인 식물 엑기스.
  4. 식물성 펩티드를, 액체 중에서 100 ∼ 170 ℃ 및 0.101 ∼ 0.79 ㎫ 로 처리하는 공정을 포함하는, 시클로류실류신 및 시클로류실페닐알라닌을 포함하는 디케토피페라진을 고농도로 함유하는 식물 엑기스의 제조 방법으로서,
    식물성 펩티드가 차 펩티드, 대두 펩티드, 보리 펩티드 또는 참깨 펩티드이고, 식물 엑기스 중의 Bx 당 디케토피페라진의 총량이 900 ㎍/100 g/Bx 이상인, 제조 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    처리 공정이, 액체 중에서 30 분 ∼ 500 분 수행되는 제조 방법.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    식물성 펩티드가 올리고 펩티드인 제조 방법.
  7. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    식물성 펩티드가, 식물 유래의 단백질 또는 단백질을 함유하는 식물체에 분해 처리를 실시하여 얻어진 것인 제조 방법으로서,
    식물이 차, 대두, 보리 또는 참깨인 제조 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    분해 처리가 가열 처리 또는 효소 처리인 제조 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    분해 처리가 효소 처리이며, 효소가 엔도형 프로테아제인 제조 방법.
  10. 삭제
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