TWI665970B - 含有二酮哌嗪之植物萃取物及其製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題係提供一種適合摻混於飲食物中之二酮哌嗪混合體及其製造方法。
本發明係藉由將植物性胜肽於液體中進行高溫高壓處理，可製造以高濃度含有含環白胺醯基白胺酸以及環白胺醯基苯基丙胺酸之二酮哌嗪之植物萃取物。根據本發明，可獲得具有來自植物性天然物質的優異香味之二酮哌嗪，且直接摻混於飲食物後，可製造經附加具有二酮哌嗪功能的飲食物。

Description

含有二酮哌嗪之植物萃取物及其製造方法
本發明係有關以高濃度含有二酮哌嗪之植物萃取物及其製造方法。
目前正注目於將結合二個胺基酸之「二胜肽」作為功能性物質。由於可對二胜肽附加單體胺基酸所不具有的物理性質與新穎的功能，而被期待為具有胺基酸以上之應用範圍者。特別係環狀二胜肽之二酮哌嗪，已知具有抗菌作用與抗氧化作用(非專利文件1、2)、學習意願改善作用(專利文件1)等各種生理活性，且預測於醫療、藥理領域中之需求將會擴大。
一般而言，二酮哌嗪係利用化學合成法(非專利文件3)與酵素法(非專利文件2、4)等方法製造。另外，目前亦提案有藉由於超臨界狀態或亞臨界狀態下使直鏈胜肽於高溫高壓下進行脫水、環化反應，而合成具有任意的胺基酸序列之環狀胜肽之方法(專利文件2)，以及於水溶媒中對直鏈二胜肽或直鏈三胜肽進行加熱處理後，製造環狀二胜肽之方法(專利文件3、4)。
先前技術文件 專利文件
專利文件1：特表2012-517998號公報
專利文件2：特開2003-252896號公報
專利文件3：韓國公開專利10-2011-0120051
專利文件4：專利5456876號公報
專利文件5：特開2010-166911號公報
專利文件6：特表2012-517214號公報
非專利文件
非專利文件1：Peptides, 16(1), 151-164(1995)
非專利文件2：生物科學與產業，60(7), 454-457(2002)
非專利文件3：J. Comb. Chem., 3, 453-460(2001)
非專利文件4：Chemistry Biology, 8, 997-1010(2001)
非專利文件5：Agr. Biol. Chem., 38 (5), 927-932 (1974)
如此被期待於生體內具有各種生理活性之二酮哌嗪，卻幾乎不存在來自天然的二酮哌嗪，以及於食物中以高濃度含有二酮哌嗪。來自天然的二酮哌嗪，已知於雪莉酒、紹興酒、醬油、味醂、醋等發酵食品中存在有二酮哌嗪 (非專利文件5)但由於其含量極為微量，期待該等食品所具有之二酮哌嗪之功能性而進行攝取時，不僅需攝取相當大的量，同時亦缺乏實用性。另外，亦已知含有Cyclo(Pro-Phe)與Cyclo(Pro-Leu)之咖啡飲料(專利文件5)，但該等之二酮哌嗪具有強烈的苦味，而難以應用於其他飲料。
進而，已知源自於膠原蛋白與畜肉等動物性蛋白質，含有較多之二酮哌嗪之組成物(專利文件4、6)。然而，將該等源自於動物性蛋白質之含二酮哌嗪組成物，作為茶飲料、咖啡飲料、大豆飲料、果汁飲料等植物性萃取液或榨汁液等之主要成份，摻混後所得之飲料、風味調味水、礦物質飲料、碳酸飲料等之清涼飲料時，由於直接使用會影響香味而難以進行製造。
本發明之目的係提供來自天然物質，具高安全性且以高濃度含有二酮哌嗪之香味優異的萃取物及其製造方法。
本發明團隊為解決上述課題進行專心檢討後，發現對含蛋白質的植物體施以分解處理後使植物性胜肽生成，再藉由將該植物性胜肽於液體中進行高溫高壓處理，可製造含有高濃度二酮哌嗪之植物萃取物。並且，確認了該植物萃取物具有良好的風味，遂完成本發明。
亦即，本發明係與下述內容有關。
(1)一種植物萃取物，其係以10μg/100g/Bx以上的 濃度，含有環丙胺醯基麩醯胺酸、環丙胺醯基丙胺酸、環絲胺醯基酪胺酸、環甘胺醯基白胺酸、環甘胺醯基色胺酸、環纈胺醯基纈胺酸、環色胺醯基酪胺酸、環白胺醯基色胺酸以及環苯基丙胺醯基苯基丙胺酸之任一種以上。
(2)如(1)之植物萃取物，其中Bx相當之二酮哌嗪的總量係900μg/100g/Bx以上。
(3)如(1)或(2)之植物萃取物，其中植物萃取物係茶萃取物、大豆萃取物或麥芽萃取物。
(4)一種植物萃取物，其係對含有蛋白質之植物體施以分解處理後，使生成植物性胜肽，再藉由將該植物性胜肽於液體中進行高溫高壓處理而可得。
(5)一種植物萃取物之製造方法，其係包含將植物性胜肽於液體中進行高溫高壓處理之步驟，且以高濃度含有含環白胺醯基白胺酸以及環白胺醯基苯基丙胺酸之二酮哌嗪。
(6)如(5)之製造方法，其中高溫高壓處理步驟中之加熱條件，係於100~170℃的液體中30~數小時。
(7)如(5)或(6)之製造方法，其中植物性胜肽係寡胜肽。
(8)如(5)~(7)中任一項之製造方法，其中植物性胜肽，係對來自植物之蛋白質或含有蛋白質之植物體施以分解處理所得者。
(9)如(8)之製造方法，其中分解處理係加熱處理或酵素處理。
(10)如(9)之製造方法，其中分解處理係酵素處理，酵素係內切型蛋白酶。
根據本發明，可以大量生產規模且無需繁雜步驟與複雜的設備，簡便地製造來自天然物質，具高安全性且以高濃度含有二酮哌嗪之植物萃取物。
(植物性胜肽)
本發明之植物萃取物，係於液體中對植物性胜肽進行高溫高壓處理後而可製造。本說明書中之「植物性胜肽」，若無特別註記時，係指對植物來源的蛋白質或含有蛋白質之植物體，施以已知之分解處理(利用熱及壓力之分解處理、利用酸及鹼之分解處理、利用酵素之分解處理等)，藉由使其低分子化(寡胜肽)所產生之連結了數個胺基酸之胜肽。
本發明之植物性胜狀，係可使用大豆胜肽、大麥胜肽、小麥胜肽、小麥胚芽胜肽、豌豆胜肽、米胜肽等。可使用如後述之來自植物來源的蛋白質或含有蛋白質之植物體所調製之植物性胜肽，亦可使用市售品。市售之植物性胜肽可舉出例如HI-NUTE AM、HI-NUTE DC、HI-NUTE HK(均為不二精油公司製)等大豆胜肽、ORYZA胜肽P60(ORYZA油化公司製)等米胜肽、麩醯胺酸胜肽GP-1N、麩醯胺酸胜肽GP-N(均為日清製藥公司製)等小麥胜 肽、芝麻胜肽KM-20(KISCO公司製)等芝麻胜肽。
根據本發明團隊之檢討，藉由胜肽的大小所獲得之二酮哌嗪混合物在回收率上有所差異。植物性胜肽以使用分子量為5000以下之胜肽之比例高者為佳，使用分子量為3000以下之胜肽之比例高者更佳，使用分子量為1000以下之胜肽之比例高者特佳。另外，使用胺基酸點數高之大豆時，由於可以更高濃度生成複數種的二酮哌嗪，使用大豆胜肽係較佳之實施方式之一例。
本發明之植物性胜肽，可使用以來自植物來源的蛋白質或含有蛋白質之植物體所製造之胜肽混合體作為原料。具體而言，係可舉出以大豆蛋白質、小麥蛋白質、小麥胚芽蛋白質、米蛋白質、芝麻蛋白質等植物來源之蛋白質、綠茶葉等葉類、大麥、小麥、麥芽、芝麻、米等種子類、大豆、小豆、黑豆等豆類、地瓜、馬鈴薯等根莖類等含有蛋白質之可食用之植物體作為原料，施以已知之分解處理(利用熱及壓力之分解處理、利用酸及鹼之分解處理、利用酵素之分解處理等)所製造之胜肽混合體。於該等含蛋白質之植物體中，本發明較適合使用大豆、麥芽、茶葉。特別以使用大豆及茶葉為佳，以使用茶葉更佳。對上述之來自植物來源的蛋白質或含有蛋白質之植物體為原料並施以分解處理，可獲得植物性胜肽之胜肽混合體，該分解處理，係於生成寡胜肽之條件下進行。具體而言，以使分子量5000以下之胜肽(較佳係分子量3000以下之胜肽，更佳係分子量1000以下之胜肽)之比例變高之方式而進行分 解處理。
分解處理由於係使標的之寡胜肽容易生成(快速的反應速度)，與容易進行大量處理，較佳係利用熱之分解處理及/或利用酵素之分解處理，更適合使用利用酵素之分解處理(以下稱作酵素處理)。
利用加熱進行分解處理時，為防止植物體與蛋白質焦化，而於溶媒中進行。其量一般係每1質量份之植物體使用10~100質量份之溶媒，較佳係15~80質量份，更佳是20~60質量份，特佳係約20~40質量份。溶媒係以使用水、乙醇、或該等之混合物為佳，特別係以使用水為佳。加熱條件若為可生成胜肽之條件則無特別限制。加熱條件可舉例以100℃以上，進而以125℃以上之溫度，進行30分鐘~數小時，較佳係約2~7小時之加熱。加熱處理裝置可配合條件適當地使用壓力鍋、自動滅菌裝置等。且，該加熱處理可與本發明之「於液體中之高溫高壓處理步驟」同時進行。
利用酵素處理製造植物性胜肽時，酵素可使用蛋白質分解酵素(蛋白酶)，以使用內切型分解活性強之蛋白酶為佳。蛋白酶另因適合作用之pH的差異，可大致分為鹼性蛋白酶、中性蛋白酶以及酸性蛋白酶等3種。進而，由於蛋白酶的來源有植物來源、動物來源或微生物來源者，酵素的來源與最適合作用之pH值，若於不會造成分解效率不佳之情況與所獲得之分解萃取液的香味不佳等不良影響，則無特別限制。
例如，本發明可使用之細菌來源之蛋白酶可舉出蛋白酶N、蛋白酶NL、蛋白酶S、Prolazer(註冊商標)FG-F(以上均為Amano酵素公司製)；蛋白質NY、蛋白質P、Deskin、Depirace、蛋白質A、Thermoase(註冊商標)(以上均為大和化成公司製)；Bioprase(註冊商標)XL-416F、Bioprase(註冊商標)SP-4FG、Bioprase(註冊商標)SP-15FG(以上均為Nagase化學技術公司製)；Orientase(註冊商標)90N、Nucleisin(註冊商標)、Orientase(註冊商標)10NL、Orientase(註冊商標)22BF(以上均為Eichibiai公司製)；Aloase(註冊商標)AP-10(養樂多藥品工業公司製)、Protamex(註冊商標)、Neutrase(註冊商標)、Alkalase(註冊商標)(以上均為Novozyme公司製)；COROLASE N、COROLASE 7089、VERON W、VERON P(以上均為AB酵素公司製)、EnzyronNBS(洛東化成工業公司製)；鹼性蛋白酶GL440、Purafect(註冊商標)4000L、蛋白酶899、Protex 6L(以上均為Jyenekon協和公司製)等。另外，本發明可使用來自麴菌之蛋白酶可舉出例如蛋白酶A、蛋白酶M、蛋白酶P、Umamizyme、肽酶R、Newlase(註冊商標)A、Newlase(註冊商標)F(以上均為天野酵素公司製)；Sumizyme(註冊商標)AP、Sumizyme(註冊商標)LP、Sumizyme(註冊商標)MP、Sumizyme(註冊商標)FP、Sumizyme(註冊商標)LPL(以上均為新日本化學工業公司製)；蛋白(註冊商標)FN(大和化成公司製)、Denapsin 2P、Denazyme(註冊商標)AP、XP-415(以上均為 Nagase化學技術公司製)；Orientase(註冊商標)20A、Orientase(註冊商標)ONS、Tetrase(註冊商標)S(以上均為Eichibiai公司製)；Molsin(註冊商標)F、PD酵素、IP酵素、AO-蛋白酶(以上均為Kikkoma公司製)；Sakanase(科研製藥公司製)Punchdase(註冊商標)YP-SS、Punchdase(註冊商標)NP-2、Punchdase(註冊商標)P(以上均為養樂多藥品工業公司製)；Flavorzyme(註冊商標)(Novozyme公司製)；Kokulase(註冊商標)SS、Kokulase(註冊商標)P(以上為三共生命技術公司製)；VERON PS、COROLASE PN-L(以上均為AB酵素公司製)等。其他本發明可使用之蛋白酶，可舉出例如來自放射菌之蛋白酶之Actinase(註冊商標)AS、Actinase(註冊商標)AF(以上為科研製藥公司製)、Tasinase(註冊商標)(Jyenekon協和公司製)、與來自植物之蛋白酶，例如木瓜酵素W-40(Amano酵素公司製)、食品用純化木瓜酵素(Nagase化學技術公司製)、與來自動物的胃蛋白酶、胰蛋白酶等。
上述之蛋白酶中自分解效率與所獲得之含胜肽液體的香味之觀點而言，以使用來自細菌之蛋白酶為佳，較佳係使用來自枯草桿菌(Bacillus subtilis)之中性蛋白酶，與來自液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的蛋白酶，與來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilius)之蛋白酶，其中以使用來自枯草桿菌(Bacillus subtilis)之中性蛋白酶特佳。
該等蛋白酶，以使用相對於植物來源的蛋白質與含蛋 白質之植物體為0.1~20重量%為佳，1~15重量%更佳，3~10重量%之範圍最佳。添加量較上述範圍為少時，無法發揮提升胜肽生成收率之效果，反之即使較前述範圍添加更多量時，亦無法期待大幅度地提高胜肽生成收率，反而不利於成本面。且，酵素處理係將水加入植物來源的蛋白質與植物體，於濕潤的狀態下使酵素作用。添加之水量係每1質量份之乾燥狀態之蛋白質與植物體，使用10~50質量份之水，較佳係10~30質量份，更佳是約10~20質量份。
利用蛋白酶之酵素處理條件，可依據使用之蛋白酶的最適當條件而進行設定，一般係以20~70℃(較佳係30~60℃，更佳係40~60℃)，約進行30分鐘~24小時(較佳係1小時~12小時，更佳係1小時~6小時)。
由於依據酵素的種類，及對基質之蛋白質的作用部位的不同，可以改變作為結果之本發明可獲得之二酮哌嗪混合體之組成，可依據期望的二酮哌嗪混合體之組成，而選擇酵素。酵素亦可並用2種以上使用。
植物性胜肽，於使用植物體之情況時，於施以利用前述之分解處理生成胜肽之步驟之前，以進行預先降低植物體中所含水溶性蛋白質之前處理為佳。根據本發明團隊之檢討，藉由預先降低水溶性蛋白質，可更加提高利用分解處理之胜肽之生成收率，與本發明之利用加熱處理步驟之二酮哌嗪之生成收率。去除水溶性蛋白質前處理之方法，係可舉出將植物體於液體中加熱後，使水溶性蛋白質溶出 之方法，其後，再將固液分離後所得之固體(植物體)供於分解處理之方法，以及，對植物體施以利用水等水性溶媒進行萃取處理之方法，其後，再將該萃取殘渣供於分解處理之方法等(以下統稱為「前萃取」)。進行前萃取時，較佳係浸漬於相對於植物體重量為15倍重量以上，更佳係約15~150倍重量之萃取溶媒中，使植物體所含之水溶性蛋白質等可溶性成分溶出。此時，可預先加熱萃取溶媒，亦可於將植物體浸漬於萃取溶媒之後進行加熱後，再進行萃取。萃取溶媒較適合使用純水，但亦可使其中適當地含有乙醇等有機溶媒。另外，藉由於萃取溶媒中添加礦物質成分亦可調整適當的硬度。
前萃取中並未特別限定萃取溫度，一般係50~100℃，較佳係60~95℃，更佳係約70~90℃。另外萃取時間為1分鐘~24小時，較佳係約3分鐘~20小時。萃取溫度、時間等萃取條件，係以可使所得之萃取殘渣之可溶性成分之去除率為60%以上，較佳係70%以上，更佳係80%以上，進而更佳係90%以上，最佳係95%而設定。可溶性成分之去除率，係指將最大限度之可去除之可溶性成分設定為100%時，萃取液中回收之固體成分的相對的比例，以計算式「(前萃取獲得之採液量(總量)(g)×其濃度[Bx])/(最大限度之可去除之可溶性成分(g)×其濃度[Bx]×100%)」所計算之值。本說明書中「最大限度之可去除之可溶性成分」係可簡單表示為「相對於植物體之重量以30倍量的熱水進行10分鐘萃取重複10次後時之採液 量」。此處本說明書中之Bx係可使用市售之Bx測定計測器進行計測。
植物體之前萃取係可僅進行1次，亦可進行複數次。可廢棄前萃取所得之萃取液，亦可摻混於飲食物中而利用，例如可與含本發明所得之二酮哌嗪之植物萃取液混合後再摻混於飲食物中。
(加熱處理)
本發明之製造方法，係利用於液體中以高溫高壓處理該等植物性胜肽，生成二酮哌嗪。高溫高壓處理時液體較適合使用純水，但亦可使其中適當地含有乙醇等有機溶媒。另外，藉由於萃取溶媒中添加礦物質成分亦可調整適當的硬度。提供於加熱處理之液體，可因應需要預先將其濃縮或稀釋成為濃度(Bx)約為0.1~50為佳。
本說明書中之高溫高壓係意指100℃以上之溫度且超過大氣壓力之壓力。高溫高壓萃取裝置係可配合條件而使用耐壓性萃取裝置、壓力鍋與自動滅菌裝置等。
高溫高壓之溫度係以100~170℃為佳，110~150℃更佳，120~140℃特佳。且該溫度於加熱裝置使用耐壓性萃取裝置時，係表示測定萃取管柱的出口溫度之值，而加熱裝置使用自動滅菌裝置時，係表示測定壓力容器內的中心溫度之溫度值。另外，壓力係以0.101~0.79MPa為佳，0.101~0.48MPa更佳。進而加熱時間以30~500分鐘為佳，約60~300分鐘更佳。
更適當的加熱處理條件係於以時間(min.)為橫軸，以溫度(℃)為縱軸之座標系中，保持於下述座標系(i)~(vi)所圍成之時間以及溫度範圍內之加熱處理。(i)(170℃,30min.)，(ii)(150℃,30min.)，(iii)(115℃,180min.)，(iv)(105℃,480min.)，(v)(135℃,480min.)，(vi)(150℃,180min.)。
進行於液體中之高溫高壓處理後可因應需要進行固液分離後，回收液體部分，可獲得以高濃度含有本發明之二酮哌嗪之植物萃取物。固液分離可使用過濾及/或離心分離方法。
由於植物性胜肽的來源(作為原料之植物之種類)與酵素的種類不同，可獲得之以高濃度含有二酮哌嗪之植物萃取物中的二酮哌嗪其組成亦相異，藉由本發明之於液體中對植物性胜肽進行高溫高壓處理，可使選自環丙胺醯基麩醯胺酸(CAS Registry Number：268221-76-7；Cyclo(Ala-Gln))、環組胺醯基脯胺酸(CAS Registry Number：53109-32-3；Cyclo(His-Pro))、環丙胺醯基丙胺酸(CAS Registry Number：5845-61-4；Cyclo(Ala-Ala))、環甘胺醯基脯胺酸(CAS Registry Number：3705-27-9；Cyclo(Gly-Pro))、環絲胺醯基酪胺酸(CAS Registry Number：21754-31-4；Cyclo(Ser-Tyr))、環脯胺醯基蘇胺酸(CAS Registry Number：227777-31-3；Cyclo(Pro-Thr))、環組胺醯基苯丙胺酸(CAS Registry Number：56586-95-9；Cyclo(His-Phe))、環丙胺醯基脯胺酸(CAS Registry Number：65556-33- 4；Cyclo(Ala-Pro))、環苯丙胺醯基絲胺酸(CAS Registry Number：35591-00-5；Cyclo(Phe-Ser))、環甘胺醯基白胺酸(CAS Registry Number：5845-67-0；Cyclo(Gly-Leu))、環甘胺醯基苯丙胺酸(CAS Registry Number：10125-07-2；Cyclo(Gly-Phe))、環脯胺醯基脯胺酸(Cyclo(Pro-Pro))、環甘胺醯基色胺酸(Cyclo(Gly-Trp))、環天冬醯胺醯基苯丙胺酸(CAS Registry Number：5262-10-2；Cyclo(Asp-Phe))、環纈胺醯基脯胺酸(Cyclo(Val-Pro))、環脯胺醯基酪胺酸(Cyclo(Pro-Tyr))、環甲硫胺醯基脯胺酸(Cyclo(Met-Pro))、環甲硫胺醯基甲硫胺酸(Cyclo(Met-Met))、環纈胺醯基纈胺酸(Cyclo(Val-Val))、環白胺醯基脯胺酸(CAS Registry Number：2873-36-1；Cyclo(Leu-Pro))、環色胺醯基酪胺酸(Cyclo(Trp-Tyr))、環苯丙胺醯基脯胺酸(CAS Registry Number：3705-26-8；Cyclo(Phe-Pro))、環白胺醯基色胺酸(CAS Registry Number：15136-34-2；Cyclo(Leu-Trp))、環苯丙胺醯基色胺酸(CAS Registry Number：82597-82-8；Cyclo(Phe-Trp))、環白胺醯基苯丙胺酸(CAS Registry Number：7280-77-5；Cyclo(Leu-Phe))、環白胺醯基白胺酸(CAS Registry Number：952-45-4；Cyclo(Leu-Leu))、環苯丙胺醯基苯丙胺酸(CAS Registry Number：2862-51-3；Cyclo(Phe-Phe))所成群之至少1種二酮哌嗪增加。
本發明係特別適用於製造含有以較高濃度含有Cyclo(Leu-Leu)以及Cyclo(Leu-Phe)之二酮哌嗪之植物萃 取物。另外，本發明係有利於製造以高濃度含有Cyclo(Phe-Phe)之植物萃取物。
自本發明之以高濃度含有二酮哌嗪之植物萃取物，藉由施以周知之純化處理，亦可選擇性地製造以高濃度含有特定的來自天然植物之二酮哌嗪。因此，自其中一個觀點而言，本發明係以高濃度含有含Cyclo(Leu-Leu)以及Cyclo(Phe-Phe)之二酮哌嗪之植物萃取物之製造方法，另外，自其他觀點，本發明係特定之二酮哌嗪(例如Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Leu-Phe)、Cyclo(Leu-Leu)、Cyclo(Phe-Phe))之製造方法。
(植物萃取物)
本說明書中所謂之萃取物係指液體狀的萃取物，本發明之「植物萃取物」係指對植物體施以萃取處理後所得之液體狀之萃取物或其加工品。
利用本發明，可獲得Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Leu-Trp)以及Cyclo(Phe-Phe)任一種以上，且每Bx之含量係10μg/100g/Bx以上之植物萃取物。
另外，利用本發明，可獲得二酮哌嗪之總量係900μg/100g以上，較佳係1000μg/100g以上，更佳係2000μg/100g以上，特佳係5000μg/100g以上之植物萃取物。且本說明書中，若無特別說明時，二酮哌嗪之總量係表示 Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(His-Pro)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Gly-Pro)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Pro-Thr)、Cyclo(His-Phe)、Cyclo(Ala-Pro)、Cyclo(Phe-Ser)、Cyclo(Gly-Leu)、Cyclo(Gly-Phe)、Cyclo(Pro-Pro)、Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Asp-Phe)、Cyclo(Val-Pro)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Met-Pro)、Cyclo(Met-Met)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Phe-Pro)、Cyclo(Leu-Trp)、Cyclo(Phe-Trp)、Cyclo(Leu-Phe)、Cyclo(Leu-Leu)以及Cyclo(Phe-Phe)之總量者。
一般而言，Bx高之萃取物，係意味著以高濃度含有來自原料的各種物質(例如苦味成分)，該物質不僅不適合飲料，由於對香味與口感等造成影響亦不適於添加至飲料中。因此，考慮添加至飲料時，以Bx較低者為佳。利用本發明，可獲得大量含有為生理活性物質之二酮哌嗪，且低Bx之植物萃取物，亦即，可獲得二酮哌嗪之含量與Bx之比為高之植物萃取物。具體而言，可獲得上述之二酮哌嗪之總量(單位：μg/100g)與濃度(Bx)之比係900(μg/100g/Bx)以上，較佳係1000(μg/100g/Bx)以上，更佳為2000(μg/100g/Bx)，最佳為5000(μg/100g/Bx)之植物萃取物。並未特別限制萃取物中二酮哌嗪之上限，可考慮二酮哌嗪之溶解性等而適當地設定，一般係1000mg/100g以下，較佳為500mg/100g以下，更佳為約200mg/100g以下。
作為原料之植物體可適用於本發明之製造方法獲得之植物萃取物時，由於未伴隨發酵副產物較少，另外具有進行前萃取時可溶性成分低，極少苦味之香味上的特徵。
由於該植物萃取物具優異香味，以及於外觀上沒有沈澱與混濁等，即使未施以特別的後處理，亦可直接利用於萃取物、調味料、飲料等。另外，本發明之植物萃取物儘管含有高含量之二酮哌嗪，但由於Bx相對為低，可以少量摻混於飲食物(特別係飲料)中，亦具有增加飲食物設計之自由度之優點。特別係可直接摻混於茶飲料、咖啡飲料、大豆飲料、果汁飲料等之植物的萃取液或榨汁液等作為等主成分摻混所得之飲料，與調味水、含礦物質飲料、碳酸飲料等清涼飲料。例如，將本發明之植物萃取物摻混於飲料時，可獲得二酮哌嗪之總量係10μg/100g以上，較佳係20μg/100g以上，更佳係40μg/100g以上，特佳係60μg/100g以上之飲料，且未呈現苦味的風味良好之飲料。
利用本發明獲得之植物萃取物，亦可配合添加之飲食物之型態，進行澄清化處理等。此時，由於不含油份，且存在有纖維質等理由，亦具有容易進行澄清化之優點。
本發明之植物萃取物較合適之實施方式，係可例示為茶萃取物、大豆萃取物以及麥芽萃取物。以下，針對萃取物進行詳述。
(茶萃取物)
本說明書中「茶萃取物」係指對茶葉進行萃取處理後所得之茶萃取物。可作為萃取原料之茶葉，係使用茶樹(學名：Camellia sinensis)製造之茶葉之葉片、茶梗等，可使用萃取後可飲用之部位。另外，其型態未限制為葉片狀、粉狀等。針對茶葉的收穫期，亦可配合期望的香味適當地選擇。
本發明中所獲得之以高濃度含有二酮哌嗪之植物萃取物(茶萃取物)，由於未經發酵過程而進行製造，特徵係可抑制副產物生成，且可獲得香味佳之萃取物。自香味的觀點而言，茶葉以使用煎茶、番茶、焙茶、玉露、冠茶、甜茶等蒸製之未發酵茶(綠茶)、嬉野茶、青柳茶、各種中國茶等釜炒茶等未發酵茶。
本發明團隊，測定自市售之茶葉進行萃取所得之茶萃取物中之二酮哌嗪濃度。其結果，確認發酵茶含極微量(約0~200μg/100g/Bx)，另外綠茶幾乎未含二酮哌嗪(參照表1，測定方法係與後述實施例1相同)。
反之，本發明之茶萃取物，於先前之茶類所未含有之二酮哌嗪之Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Ser- Tyr)、Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Leu-Trp)以及Cyclo(Phe-Phe)任一種以上，含有濃度為10μg/100g/Bx以上。
另外，本發明之茶萃取物，分別含有Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(His-Pro)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Gly-Pro)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Pro-Thr)、Cyclo(His-Phe)、Cyclo(Ala-Pro)、Cyclo(Phe-Ser)、Cyclo(Gly-Leu)、Cyclo(Gly-Phe)、Cyclo(Pro-Pro)、Cyclo(Asp-Phe)、Cyclo(Val-Pro)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Met-Pro)、Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)、Cyclo(Leu-Phe)以及Cyclo(Leu-Leu)濃度為0.1ppm/Bx(10μg/100g/Bx)以上。較佳係上述之二酮哌嗪分別含有0.2ppm/Bx以上、較佳係0.3ppm/Bx以上、更佳為0.4ppm/Bx以上、特佳係0.5ppm/Bx以上之濃度之茶萃取物。進而，可使Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Leu-Trp)、Cyclo(Phe-Trp)以及Cyclo(Phe-Phe)分別以濃度為0.1ppm/Bx(10μg/100g/Bx)以上、較佳係0.2ppm/Bx以上、更佳係0.3ppm/Bx以上而含有。
具有強烈苦味的二酮哌嗪，已知係咖啡飲料中之二酮哌嗪之Cyclo(Leu-Pro)與Cyclo(Phe-Pro)(參照特開2010-166911號公報)，與酪蛋白之分解處理物之Cyclo(Leu-Trp)(蛋白質研究獎勵會胜肽研究所報，No.2,1974)。本發明之茶萃取物，儘管含有該等具強烈苦味之二酮哌嗪，但萃取物本身卻幾乎未含有苦味。調製與茶萃取物具有相同 濃度之含Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)以及Cyclo(Leu-Trp)之水溶液時，由於可感受強烈的苦味，認為係其他共存的二酮哌嗪及來自茶的成份，相加性的或相乘性的降低了Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)以及Cyclo(Leu-Trp)之苦味。特別使相對於Cyclo(Leu-Leu)與Cyclo(Leu-Phe)之總量(A)，具有苦味之二酮哌嗪之Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)以及Cyclo(Leu-Trp)之總量(B)的比例[(B)/(A)]，為1.0以下(較佳係0.8以下，更佳係0.6以下，特佳為0.4以下)之茶萃取物，係未伴隨以苦味為首之含二酮哌嗪之萃取物，可直接摻混於飲食品(特別係飲料)。
茶萃取物中每Bx之二酮哌嗪總量，係900μg/100g/Bx以上，較佳係900~30000μg/100g/Bx，更佳係2000~25000μg/100g/Bx，特佳係5000~20000μg/100g/Bx。於該濃度範圍時，有利於製造經附加具有二酮哌嗪功能(生理活性等)之飲食品。
該等茶萃取物，係分解處理茶葉中之蛋白質後調製茶胜肽，再藉由於液體中對其進行高溫高壓處理，可簡便地進行製造。茶葉中含有豐富的約25%的蛋白質(五訂增補食品成分表)。因此，利用蛋白酶等酵素對該茶葉蛋白質進行分解處理，應可獲得茶胜肽，但即使利用蛋白酶對茶葉作用，亦無法獲得該種大量的茶胜肽。由於茶葉中全蛋白質的80%以上係不溶性的蛋白質，以使茶葉中所含之蛋白質以更佳的效率利用蛋白質分解酵素作用，而獲得茶胜 肽為佳。具體而言，進行自茶葉中去除水溶性蛋白質之前處理後，再以蛋白酶等蛋白質分解酵素對該萃取殘渣進行作用，而調製茶胜肽。亦即，本發明之茶萃取物，藉由依序進行下述之步驟，可有效率地分解水不溶性的蛋白質，而可簡便地製造以高濃度含有二酮哌嗪之茶萃取物。
(a)以水萃取茶葉，再回收萃取殘渣之步驟，(b)對萃取殘渣，於水存在下使內切型蛋白酶作用後，分解茶葉蛋白質，獲得含茶胜肽液體之步驟，(c)以高溫高壓處理含茶胜肽之液體後，獲得反應液之步驟，以及(d)對反應液進行固液分離處理，回收含二酮哌嗪之液體之步驟，或為，(a)以水萃取茶葉，再回收萃取殘渣之步驟，(b)對萃取殘渣，於水存在下使內切型蛋白酶作用後，分解茶葉蛋白質，獲得含茶胜肽液體之步驟，(d’)對含茶胜肽之液體進行固液分離處理，回收含茶胜肽之液體之步驟，以及(c’)以高溫高壓處理含茶胜肽之液體後，獲得含二酮哌嗪之反應液之步驟，各步驟之條件係如前所述於步驟(a)之前萃取中，可使用茶飲料製造等進行萃取處理後所得之茶渣等萃取殘渣。以往，茶葉中之不溶於水性的茶蛋白質，並未被利用為營養源，例如，日本國內製造綠茶飲料時產生之2.2萬噸以 上的萃取殘渣，幾乎以未被利用過的資源而廢棄，但利用前述之茶萃取物之製造方法，可將先前被廢棄的茶渣進行有效利用。
利用該方法，可製造以高濃度含有Cyclo(Leu-Leu)、Cyclo(Leu-Phe)以及Cyclo(Ala-Ala)。具體而言，係成為相對於茶萃取物中之二酮哌嗪全量Cyclo(Leu-Leu)為10%以上(重量標準)，Cyclo(Leu-Phe)為10%以上，Cyclo(Ala-Ala)為7%以上之萃取物。將該等以濃度表示時，係成為分別為5.0ppm/Bx(500μg/100g/Bx)以上、較佳係8.0ppm/Bx以上、更佳係10.0ppm/Bx以上之茶萃取物。該等之上限係以50.0ppm/Bx以下、較佳係40.0ppm/Bx以下、更佳係35.0ppm/Bx以下，進而以約30.0ppm/Bx以下。
另外，藉由重複進行複數次步驟(a)中之茶葉的水萃取(前萃取)，發現可使Cyclo(Leu-Leu)、Cyclo(Leu-Phe)以及Cyclo(Phe-Phe)之濃度顯著變高。因此，該方法亦有利於Cyclo(Phe-Phe)之製造。本發明團隊，確認利用該方法所得之含有Cyclo(Phe-Phe)為3.0ppm/Bx以上之茶萃取物，具有學習意欲改善作用。
另一方面，已知具有疏水性官能基之二酮哌嗪，藉由使其環狀化，較直鏈胜肽具有更高的疏水性。Cyclo(Phe-Phe)為係具有最高疏水性之成分，對上述茶萃取物進行加速保存試驗(55℃，2周)，結果確認了Cyclo(Phe-Phe)可被安定地維持。因此，本發明之茶萃取物，係可有效作為 含Cyclo(Phe-Phe)之萃取物。茶萃取物中之Cyclo(Phe-Phe)含量係以10μg/100g/Bx以上為佳，更佳係20μg/100g/Bx以上，30μg/100g/Bx以上最佳。
(大豆萃取物)
本說明書中「大豆萃取物」係指於大豆中加入水後進行萃取處理或磨碎處理所得之液體。使用為原料之大豆(學名：Glycine max)並未限制其品種與產地等，亦可使用粉碎品等加工品階段者。另外，本說明書中之大豆萃取物，亦可簡便地含有於大豆蛋白分解物中加入水後所得之液體。
一般認為大豆中蛋白質約佔3成。由於大豆蛋白質如同茶蛋白質般，大多為不溶於水性之蛋白質，而無需去除水溶性蛋白質之前處理，但亦可因應需要進行前處理。未進行去除水溶性蛋白質之前處理之情況時，可利用一鍋化(One-Pot)反應，更簡便地製造以高濃度含有二酮哌嗪之植物萃取物(大豆萃取物)。
本發明團隊有鑑於將市售之大豆胜肽(粉體)於噴霧乾燥時需加熱180~220℃，測定大豆胜肽中二酮哌嗪之濃度。其結果，確認市售之大豆胜肽中含有極微量(約650μg/100g/Bx)(參照表2)。
另一方面，本發明之大豆萃取物，係含有先前之大豆蛋白分解物(大豆胜肽)中未含有之二酮哌嗪之Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Gly-Trp)、 Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Leu-Trp)以及Cyclo(Phe-Phe)任一種以上，每Bx含量為10μg/l00g/Bx以上。
另外，本發明之大豆萃取物，分別含有Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(His-Pro)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Gly-Pro)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Pro-Thr)、Cyclo(His-Phe)、Cyclo(Ala-Pro)、Cyclo(Phe-Ser)、Cyclo(Gly-Leu)、Cyclo(Gly-Phe)、Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Asp-Phe)、Cyclo(Val-Pro)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Met-Pro)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Phe-Pro)、Cyclo(Leu-Trp)、Cyclo(Leu-Phe)、Cyclo(Leu-Leu)以及Cyclo(Phe-Phe)濃度為0.1ppm/Bx(10μg/100g/Bx)。較佳係上述之二酮哌嗪分別含有0.5ppm/Bx以上、較佳係0.7ppm/Bx以上、更佳為0.9ppm/Bx以上、特佳係1.0ppm/Bx以上、最佳為1.2ppm/Bx以上之濃度之大豆萃取物。進而，可使Cyclo(Pro-Pro)以及Cyclo(Phe-Trp)分別以濃度為0.1ppm/Bx(10μg/100g/Bx)以上、較佳係0.2ppm/Bx以上、更佳係0.3ppm/Bx以上而含有。
已知儘管該大豆萃取物(特別係將大豆或其粉碎物作為原料所得之萃取物)含有具強烈苦味的二酮哌嗪之Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)以及Cyclo(Leu-Trp)，其苦味亦被降低。由於調製具有相同濃度之含Cyclo(Leu-Pro)以及Cyclo(Phe-Pro)之水溶液時，可感受強烈的苦 味，認為係其他共存的二酮哌嗪及來自大豆的成份，相加性的或相乘性的緩和了Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)以及Cyclo(Leu-Trp)之苦味。特別使相對於Cyclo(Leu-Leu)與Cyclo(Leu-Phe)之總量(A)，具有苦味之二酮哌嗪之Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)以及Cyclo(Leu-Trp)之總量(B)的比例[(B)/(A)]，為1.0以下(較佳係0.8以下，更佳係0.6以下，特佳為0.5以下)之大豆萃取物，係苦味顯著降低之含二酮哌嗪之萃取物，可有效地摻混於飲食品(特別係飲料)。
大豆萃取物中每Bx之二酮哌嗪總量，係900μg/100g/Bx以上，較佳係900~30000μg/100g/Bx，更佳係2000~25000μg/100g/Bx，特佳係5000~20000μg/100g/Bx。於該濃度範圍時，有利於製造經附加具有二酮哌嗪功能(生理活性等)之飲食品。
本發明之以高濃度含有二酮哌嗪之大豆萃取物，藉由依序進行下述之步驟，可進行製造。
(x)對大豆或大豆蛋白分解物，於水存在下使內切型蛋白酶作用後，獲得含大豆胜肽液體之步驟，(y)以高溫高壓處理含大豆胜肽之液體後，獲得反應液之步驟，以及(z)對反應液進行固液分離處理，再回收含二酮哌嗪之液體之步驟，與茶萃取物製造同樣的，可將步驟(y)以及(z)之順序交換。另外，亦可於步驟(x)之前，加上去除水溶性蛋白 質之步驟(w)。將大量含有二或三胜肽之大豆胜肽作為原料時，步驟(x)係成為，(x’)對大量含有二或三胜肽之大豆胜肽中加入水，獲得含大豆胜肽液體之步驟。
其他各步驟之條件係如前所述。
利用該方法，可製造以高濃度含有Cyclo(Leu-Leu)、Cyclo(Leu-Phe)、Cyclo(Ser-Tyr)以及Cyclo(Pro-Thr)之大豆萃取物。具體而言，係成為相對於大豆萃取物中之二酮哌嗪全量Cyclo(Leu-Leu)為8%以上(重量標準)，Cyclo(Leu-Phe)為8%以上，Cyclo(Ser-Tyr)為6%以上之萃取物。將該等以濃度表示時，係成為分別為5.0ppm/Bx(500μg/100g/Bx)以上、較佳係6.0ppm/Bx以上、更佳係7.0ppm/Bx以上之大豆萃取物。特別可獲得Cyclo(Leu-Leu)以及Cyclo(Leu-Phe)為10.0ppm/Bx以上、較佳係12.0ppm/Bx以上之大豆萃取物。該等之上限係以50.0ppm/Bx以下、較佳係40.0ppm/Bx以下、更佳係35.0ppm/Bx以下，進而以約30.0ppm/Bx以下。
另外，由於利用該方法，可獲得大豆胜肽中未含有，而以3.0ppm/Bx以上之濃度含有Cyclo(Phe-Phe)，更佳係以4.0ppm/Bx以上之含有Cyclo(Phe-Phe)之大豆萃取物，該方法亦有利於Cyclo(Phe-Phe)之製造(參照後述之實施例)。由於Cyclo(Phe-Phe)為係具有最高疏水性之成分，確認了於該大豆萃取物中可被安定地維持。
(麥芽萃取物)
本說明書中「麥芽萃取物」係指對麥芽或其粉碎物進行萃取處理後可得之萃取物。使用作為原料之麥芽大豆(malt)並未限制品種與產地等，特別適合使用經使大麥種子發芽之大麥麥芽。大麥麥芽係使用分離去除皮部後含蛋白質含量高的畫分，相當實用與有效率。蛋白質含量高的畫分，係可舉出自麥芽表面緩緩削除去除榖皮後，再削下糊粉層以及胚乳等蛋白質含量高之畫分之方法。或者，可如茶萃取物中所實施方式一般，利用經進行前萃取之萃取殘渣。萃取殘渣係可舉出例如製造啤酒時所產生之麥芽的酒粕。
將蛋白質含量高之畫分作為原料時，可利用一鍋化(One-Pot)反應，更簡便地製造以高濃度含有二酮哌嗪之植物萃取物(麥芽萃取物)。
本發明之麥芽萃取物，係含有先前不易萃取之二酮哌嗪之Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Leu-Trp)以及Cyclo(Phe-Phe)任一種以上，濃度含量為10μg/100g/Bx以上。
另外，本發明之麥芽萃取物，分別含有Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(His-Pro)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Gly-Pro)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Pro-Thr)、Cyclo(His-Phe)、Cyclo(Ala-Pro)、Cyclo(Phe-Ser)、Cyclo(Gly-Leu)、Cyclo(Gly-Phe)、Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Asp-Phe)、 Cyclo(Val-Pro)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Met-Pro)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Phe-Pro)、Cyclo(Leu-Trp)、Cyclo(Leu-Phe)、Cyclo(Leu-Leu)以及Cyclo(Phe-Phe)濃度為0.1ppm/Bx(50μg/100g/Bx)以上。較佳係上述之二酮哌嗪分別含有0.3ppm/Bx以上、較佳係0.4ppm/Bx以上、更佳為0.5ppm/Bx以上、特佳係0.6ppm/Bx以上之濃度之麥芽萃取物。
已知儘管該麥芽萃取物含有具強烈苦味的二酮哌嗪之Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)以及Cyclo(Leu-Trp)，其苦味亦被降低。特別使相對於Cyclo(Leu-Leu)與Cyclo(Leu-Phe)之總量(A)，具有苦味之二酮哌嗪之Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)以及Cyclo(Leu-Trp)之總量(B)的比例[(B)/(A)]，為1.0以下(較佳係0.8以下)之麥芽萃取物，係苦味顯著降低之含二酮哌嗪之萃取物，可有效地摻混於飲食品(特別係飲料)。
麥芽萃取物中每Bx之二酮哌嗪總量，係900μg/100g/Bx以上，較佳係900~30000μg/100g/Bx，更佳係2000~25000μg/100g/Bx，特佳係5000~20000μg/100g/Bx。於該濃度範圍時，有利於製造經附加具有二酮哌嗪功能(生理活性等)之飲食品。
本發明之以高濃度含有二酮哌嗪之麥芽萃取物，藉由依序進行下述之步驟，可進行製造。
(x)對麥芽或麥芽蛋白分解物，於水存在下使內切型 蛋白酶作用後，獲得含麥芽胜肽液體之步驟，(y)以高溫高壓處理含麥芽胜肽之液體後，獲得反應液之步驟，以及(z)對反應液進行固液分離處理，再回收含二酮哌嗪之液體之步驟，與茶萃取物製造同樣的，可將步驟(y)以及(z)之順序交換。另外，亦可於步驟(x)之前，加上去除水溶性蛋白質之步驟(w)。其他各步驟之條件係如前所述。
利用該方法，可製造以高濃度含有Cyclo(Leu-Leu)、Cyclo(Leu-Phe)以及Cyclo(Ala-Ala)之麥芽萃取物。具體而言，將該等以濃度表示時，係成為分別為5.0ppm/Bx(500μg/100g/Bx)以上、較佳係6.0ppm/Bx以上、更佳係7.0ppm/Bx以上之麥芽萃取物。該等之上限係以50.0ppm/Bx以下、較佳係40.0ppm/Bx以下、更佳係30.0ppm/Bx以下、進而約20.0ppm/Bx以下。
另外，由於利用該方法，可獲得以1.0ppm/Bx以上之濃度含有Cyclo(Phe-Phe)，更佳係以2.0ppm/Bx以上，進而更佳係以3.0ppm/Bx以上之麥芽萃取物，該方法亦有利於Cyclo(Phe-Phe)之製造。
[圖1]圖1係表示使用大豆蛋白質所獲得之植物胜肽加工品中，環苯基丙胺醯基苯基丙胺酸濃度之定量結果。
[圖2]圖2係表示使用米蛋白質所獲得之植物胜肽加 工品中，環苯基丙胺醯基苯基丙胺酸濃度之定量結果。
[圖3]圖3係表示前萃取的次數與可溶性成分之去除率之關係。
[實施例]
以下，以實施例為基礎說明本發明，但本發明未被限制於該等實施例。另外，若本說明書中無特別記述，記載之濃度等係重量標準，數值範圍係包含其端點者。
(實施例1)自植物性胜肽製造二酮哌嗪
使用大豆胜肽以及芝麻胜肽作為植物性胜肽，於液體中進行高溫高壓處理後，製造以高濃度含有二酮哌嗪之植物萃取物。具體而言，於3g之大豆胜肽(HI-NUTE AM，不二製油公司製)以及芝麻胜肽(KM-20，KISCO公司製)，分別加入15ml之蒸餾水，置入自動滅菌裝置(TOMI精工公司製)內，以135℃，0.31MPa，進行3小時之高溫高壓處理。另外，比較例係使用相同的胜肽，調製未進行高溫高壓處理者。將處理後之10ml液體，進行50倍稀釋並經膜處理者，利用LC-MS/MS分析，求得各種二酮哌嗪濃度。詳細分析條件係如下所述。另外，以高濃度含有二酮哌嗪之植物萃取物的濃度(Bx)係使用電子式折射計RX-5000a(ATAGO公司製)進行測定，並計算出二酮哌嗪之總量(單位：μg/100g)與濃度(Bx)之比。
[化1]
(LC-MS/MS分析條件)
LC裝置 SHIMADZU UFLC XR
管柱 Agilent technologies Zorbax SB-AQ 1.8μm 2.1×150mm
管柱溫度 40℃
移動相 A：0.1%蟻酸，B：甲醇之梯度分析
流速 總量0.2mL/min
注入量 2μL
檢測器 AB Sciex 4000 Q TRAP®-Turbo Spray(ESI)-Scheduled MRM(multiple reaction monitoring)
噴嘴位置 上4mm，橫7mm
MRM dection window 40sec,Target Scan Time 0.5sec
[Positive mode]利用Scheduled MRM分析
離子源部條件CUR 20.0,CAD 6,IS 5500,TEM 700,GS1 70,GS2 70
結果示於表2(本說明中Cyclo(Leu-Leu)係表示Cyclo(Leu-Leu)與Cyclo(Ile-Ile)之合計值)。得知利用本發明之於液體中進行高溫高壓處理，可以簡便地製造以高濃度含有二酮哌嗪之植物萃取物。另外，亦暗示了可使選自Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(His-Pro)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Gly-Pro)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Pro-Thr)、Cyclo(His-Phe)、Cyclo(Ala-Pro)、Cyclo(Phe-Ser)、Cyclo(Gly-Leu)、Cyclo(Gly-Phe)、Cyclo(Pro-Pro)、 Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Asp-Phe)、Cyclo(Val-Pro)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Met-Pro)、Cyclo(Met-Met)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Phe-Pro)、Cyclo(Leu-Trp)、Cyclo(Phe-Trp)、Cyclo(Leu-Phe)、Cyclo(Leu-Leu)以及Cyclo(Phe-Phe)所成群之至少1種之二酮哌嗪增加。特別係以高濃度含有Cyclo(Leu-Leu)以及Cyclo(Leu-Phe)，且其含量係以高濃度含有二酮哌嗪之植物萃取物中之21.5%。
(實施例2)自植物性胜肽製造Cyclo(Phe-Phe)
植物性胜肽係使用下述之胜肽。
1)大豆胜肽「HI-NUTE AM」(不二製油公司製)：二、三胜肽係67%，平均分子量500
2)大豆胜肽「HI-NUTE DC」(不二製油公司製)：鏈長3~7，平均分子量1000
3)大豆胜肽「HI-NUTE HK」(不二製油公司製)
4)米胜肽「ORYZA胜肽」(ORYZA油化公司製)：三胜肽係40~50%
5)小麥胜肽「麩醯胺酸胜肽GP-1N」(日清製藥公司製)：分子量5000~10000
6)小麥胜肽「麩醯胺酸胜肽GP-N」(日清製藥公司製)：分子量5000~10000
於3g之植物性胜肽，分別加入15ml之蒸餾水，置入自動滅菌裝置(TOMI精工公司製)內，以132℃，0.29MPa，進行2小時之高溫高壓處理。將處理後之10ml液體使用OASIS MAX(Waters公司製)進行固相萃取，再將所得之固相萃取物進行減壓濃縮後，溶解於100μl之DMSO中，使用其中的10μl利用高速液相色層分析儀(HPLC)求出環苯基丙胺醯基苯基丙胺酸濃度。
結果示於表3。依胜肽之種類，環苯基丙胺醯基苯基丙胺酸的生成速度不同。大豆胜肽與使用米胜肽及小麥胜肽之情況相比，可生成高濃度的環苯基丙胺醯基苯基丙胺酸。此結果暗示使用分子量為5000以下(特別係分子量為 1000以下)之胜肽比例較高之大豆胜肽為佳。另外，以大豆胜肽比較時，暗示以分子量較小，且二、三胜肽含量較多之寡胜肽為原料較佳。
(實施例3)來自植物的蛋白質製造二酮哌嗪
作為原料之來自植物的蛋白質係使用利用酵素施以分解處理者。來自植物之蛋白質，係使用大豆蛋白質(Purorina900(不二製油公司製))與米蛋白質(ORYZA蛋白質P70(ORYZA油化公司製))。於300mg的蛋白質中加入15ml蒸餾水。其次，添加15mg之酵素A(ProteAX)、酵素B(Newlase F3G；來自Rhizopus niveus之酸性蛋白酶(內肽酶))、酵素C(木瓜酵素W-40；來自木瓜(Carica papaya)之蛋白酶)、酵素D(蛋白酶A「Amano」SD；來自麴菌之蛋白酶)、酵素E(蛋白酶M「Amano」SD；來自麴菌之蛋白酶)、酵素F(蛋白酶P「Amano」3SD；來自麴菌之蛋白酶)、酵素G(鳳梨酵素F；來自鳳梨(Ananas comosus)的蛋白酶)、酵素H(肽酶R)、酵素I(thermoase PC10F；與來自嗜熱脂肪芽孢桿菌之蛋白酶(內肽酶))、酵素J(蛋白質SD-NY10；來自枯草桿菌屬的蛋白酶)、酵素K(蛋白質SD-AY10；來自枯草桿菌屬的蛋白酶)(以上均為 天野酵素公司製)各酵素，並於37℃下震盪混合2小時。之後，未對該酵素處理液固液分離而進行加熱處理。加熱處理係使用自動滅菌裝置(TOM1精工公司製)，以132℃，進行2小時之高溫高壓處理。另外亦製造使用大豆蛋白質以及米蛋白質未經酵素處理但進行同樣處理者。將處理後之10ml液體使用OASIS MAX(Waters公司製)進行固相萃取，再將所得之固相萃取物進行減壓濃縮後，溶解於100μl之DMSO中，使用其中的10μl利用高速液相色層分析儀(HPLC)求出環苯基丙胺醯基苯基丙胺酸濃度。
使用大豆蛋白質之結果示於圖1，使用米蛋白質之結果示於圖2。由於未利用酵素進行分解處理者(未)亦已藉由加熱處理，而生成二酮哌嗪。因酵素之種類，環苯基丙胺醯基苯基丙胺酸的生成量有所不同，但可得知使用來自枯草桿菌屬之蛋白酶時，有生成較多之傾向。
(實施例4)自植物體製造二酮哌嗪(1)
植物體係使用鹿兒島縣產的一番茶茶葉(品種：籔北，全氮量：6.3%)。相對於該茶葉，首先進行降低水溶性蛋白質之前處理(3次前處理)。亦即對10g茶葉，加入200g熱水並適當攪拌，進行萃取5分鐘。萃取完成後，以140號濾網過濾，並回收萃取殘渣(茶渣)。相對於該茶渣，注入200g熱水進行萃取5分鐘並回收茶渣。再一次，對該茶渣進行相同的萃取處理並回收茶渣。
其次，對進行前萃取之茶葉(茶渣)，進行利用酵素之 分解處理。相對茶渣(全量)注入200g之50℃熱水，再添加1g的蛋白酶(商品名：蛋白質NY100，大和化成公司製)，並以攪拌子進行攪拌(300rpm)，同時於55℃的水浴中進行反應3小時。之後，於95℃保持30分鐘使酵素失活。
使該酵素處理液以未固液分離之茶葉液體混合物之型態，施以加熱處理。加熱處理係使用自動滅菌裝置(TOMI精工公司製)，以135℃，進行3小時之高溫高壓流體進行加熱處理。處理後之液體以140號濾網過濾，獲得茶萃取物(萃取物A)。針對該茶萃取物(萃取物A)(Bx0.99)，與實施例1相同，進行萃取物中之二酮哌嗪之分析。
結果示於表4。已知茶葉(茶渣)係於液體中進行高溫高壓處理，可簡單製造以高濃度含有以高濃度含有二酮哌嗪之植物萃取物之茶萃取物。另外，亦暗示了可使選自Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(His-Pro)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Gly-Pro)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Pro-Thr)、Cyclo(His-Phe)、Cyclo(Ala-Pro)、Cyclo(Phe-Ser)、Cyclo(Gly-Leu)、Cyclo(Gly-Phe)、Cyclo(Pro-Pro)、Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Asp-Phe)、Cyclo(Val-Pro)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Met-Pro)、Cyclo(Met-Met)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Phe-Pro)、Cyclo(Leu-Trp)、Cyclo(Phe-Trp)、Cyclo(Leu-Phe)、Cyclo(Leu-Leu)以及Cyclo(Phe-Phe)所成群之至少1種之二酮哌嗪增加。特別係以高濃度含有環白胺醯基白胺酸以及環白胺醯基苯丙胺酸，且其含量係以高 濃度含有二酮哌嗪之植物萃取物中之27.2%。該茶萃取物進行官能評價後，係幾乎無味無臭者。
(實施例5)自植物體製造二酮哌嗪(2)
植物體係使用市售之水煮大豆以及麥芽。相對於水煮大豆以及麥芽，分別如同實施例4般，相對於植物體(大豆)之乾燥重量，以20倍的熱水進行3次前萃取之後，再如同實施例3進行同樣的酵素處理以及於液體中之高溫高壓處理，獲得大豆萃取物(萃取物B)以及麥芽萃取物(萃取物C)。以五訂增補食品成分表為基礎，大豆乾燥重量係換算為水煮大豆全量之36.5%。針對萃取物B以及萃取物C，將Bx調整為1之後，與實施例1相同，進行萃取物中之二酮哌嗪之分析。結果示於表5。得知自大豆及麥芽可簡單製造以高濃度含有二酮哌嗪之植物萃取物。
(實施例6)自植物體製造二酮哌嗪(3)
植物體係與實施例4同樣地使用茶葉，並針對前萃 取、酵素處理、加熱處理之影響進行檢討。檢體示於表6。檢體5及6係表示實施了自植物體使寡胜肽生成步驟、藉由於液體中進行高溫高壓處理使寡胜肽環化後生成二胜肽之步驟、與同時進行加熱處理。除了前萃取之次數為2次之外，均進行與實施例4相同之步驟，除酵素處理之反應溫度為50℃，另外加熱處理之加熱時間改變為8小時之外，其餘均進行與實施例4相同之步驟。針對獲得之茶萃取物(檢體No.1~8)，使用與實施例1相同之LC-MS/MS進行分析。
結果示於表7。可明確得知未於液體中進行高溫高壓處理時，不會生成二酮哌嗪(檢體No.1~4)。比較檢體No.5~8，獲得下述之發現。
．藉由進行前處理(萃取處理)，增加了所得茶萃取物中之二酮哌嗪濃度。
．加熱處理與酵素處理之任一種方法可獲得寡胜肽，但以酵素處理為更有效且具效率。
藉由適當地使用前萃取、加熱處理以及酵素處理，可獲得含有每Bx的二酮哌嗪總量為900μg/100g/Bx以上，更為增量的植物萃取物(茶萃取物)。
因此，本發明亦暗示了有利於製造以高濃度含有二酮哌嗪之植物萃取物。另外，亦暗示了可獲得分別含有Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(His-Pro)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Gly-Pro)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Pro-Thr)、Cyclo(His-Phe)、Cyclo(Ala-Pro)、Cyclo(Phe-Ser)、Cyclo(Gly-Leu)、Cyclo(Gly-Phe)、Cyclo(Pro-Pro)、Cyclo(Asp-Phe)、Cyclo(Val-Pro)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Met-Pro)、Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)、Cyclo(Leu-Phc)以及Cyclo(Leu-Leu)為10μg/100g/Bx以上之濃度之植物萃取物(茶萃取物)。本發明亦暗示亦適用於該等二酮哌嗪之一種以上之製造。
進而，藉由進行前處理與酵素處理可生成Cyclo(Phe-Phe)。因此，利用本發明亦暗示可獲得每Bx的Cyclo(Phe-Phe)含量係10μg/100g/Bx以上之植物萃取物(茶萃取物)。疏水性較高之Cyclo(Phe-Phe)在萃取物中(水溶液中)可安定被維持。
進行檢體No.5~8之香味評價，萃取物本身係並未伴隨以苦味為首味道之萃取物。調製與No.5檢體相同濃度之個別含有Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)以及Cyclo(Leu-Trp)之各1種，或是全部3種之水溶液並進行香味評價後，由於顯著察覺到苦味，暗示藉由存在於茶萃 取物中，可降低苦味。
(實施例7)自植物體製造二酮哌嗪(4)
因實施例6確認了前萃取之有效性，針對前萃取之次數進行檢討。植物體係使用鹿兒島縣產的一番茶茶葉(品種：籔北，全氮量：6.3%)。為提高二酮哌嗪的濃度，實施前萃取最合適次數之檢討。前萃取係依照下述要領實施。對10g茶葉，加入200g熱水並適當攪拌進行萃取5分鐘。萃取完成後以140號濾網過濾，並廢棄萃取物。於實施前萃取2次以上之水準，將過濾所得之茶渣再度加入200g熱水反覆進行相同操作。如此，對已實施0~3次前萃取之茶葉(初期量為10g)注入200g的50℃的熱水，再添加1g的蛋白酶(天野酵素，蛋白質NY100)，並以攪拌子進行攪拌(300rpm)，同時於50℃水浴中進行反應3小時。之後，於95℃保持30分鐘使酵素失活。將所得之茶葉液體混合物，置入自動滅菌裝置(TOMI精工公司製)，以135℃，進行8小時之高溫高壓處理後之液體以140號濾網過濾，獲得茶萃取物。分別測定所得萃取液之Bx之後，與實施例1相同使用LC-MS/MS定量二酮哌嗪之濃度。
結果示於表8。因應前萃取次數，增加二酮哌嗪之生成量。前萃取次數與可溶性成分之去除率之關係示於圖3。可溶性成分之去除率係依據式「(前萃取獲得之採液量(總量)(g)×其濃度[Bx])/(相對於植物體之重量以30倍量的熱水進行10分鐘萃取重複10次後時之採液量(g)×其濃度[Bx]×100%)」所計算之值。得知重複進行3次前 萃取，可去除95%以上之可溶性成分。
(實施例8)自植物體製造二酮哌嗪(5)
由於實施例6中確認了酵素處理之有效性，針對酵素之種類進行檢討。檢討的酵素係下述9種。
<檢體No.9>蛋白質NY100：來自液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的蛋白酶(內肽酶)
<檢體No.10>thermoase 160：來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilius)的耐熱性蛋白酶(內肽酶)
<檢體No.11>thermoase PC10F：來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilius)的蛋白酶(內肽酶)
<檢體No.12>ProteAX：來自米麴菌(Aspergillus oryzae)的中性蛋白酶
<檢體No.13>蛋白酶M：來自鳳梨(Ananas comosus)的中性蛋白酶
<檢體No.14>蛋白酶P：來自蜂蜜麴菌(Aspergillus melleus)的鹼性蛋白酶
<檢體No.15>蛋白酶A：來自米麴菌(Aspergillus oryzae)的中性蛋白酶
<檢體No.16>肽酶R：來自米根黴(Rhizopus oryzae)的中性蛋白酶
<檢體No.17>：NewlaseF3G：來自雪白根黴(Rhizopus niveus)的酸性蛋白酶(內肽酶)
植物體係使用鹿兒島縣產的一番茶茶葉(品種：籔北，全氮量：6.3%)。對10g茶葉進行如實施例6相同之前萃取3次之後，獲得茶渣，加入200g之55℃(對 thermoase 160以及thermoase PC10F則使用70℃)的熱水，再添加1g的各種酵素，以攪拌子進行攪拌(300rpm)，同時於55℃(對thermoase 160以及thermoase PC10F則使用70℃)水浴中進行反應3小時。之後，於95℃保持30分鐘使酵素失活。將所得之茶葉液體混合物，置入自動滅菌裝置(TOMI精工公司製)，以135℃，進行8小時之高溫高壓處理。處理後之液體以140號濾網過濾，獲得茶萃取物。分別測定所得之各萃取液之Bx之後，與實施例1相同使用LC-MS/MS定量二酮哌嗪之濃度。
結果示於表9。得知使用來自細菌之酵素之內肽酶活性高之酵素時，二酮哌嗪之濃度顯著增加。來自細菌之酵素之中，以使用來自枯草桿菌(Bacillus subtilis)之中性蛋白酶，與來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilius)之蛋白酶時，特別增加了二酮哌嗪之生成量。
(實施例9)自植物體製造二酮哌嗪(6)
除了改變對茶葉的酵素(蛋白質NY100)濃度為0~20%之外，製造與實施例4相同之茶萃取物。針對所得之茶萃取物實施官能評價的同時，定量同樣與實施例1使用LC-MS/MS如表10所示17種二酮哌嗪的含量，並求出其總量。
結果示於表10。暗示了酵素濃度係相對於植物原料為1重量%~20重量%，較佳係3重量%~15重量%，更佳為4重量%~10重量%之範圍。另外，任一種茶萃取物其萃取物本身幾乎不具有風味，判斷為可利用為摻混於飲食物中之萃取物。特別係組合前萃取、酵素處理、加熱處理而進行處理者具有優異的香味。
(實施例10)自植物體製造二酮哌嗪(7)
除改變高溫高壓條件之外，製造與實施例4相同的茶萃取物。具體而言，植物體係使用與實施例4相同的茶葉。將前萃取的水量由20倍改變為30倍的水重複3次獲得茶葉(茶渣)，進行與實施例4相同的酵素處理，使用與實施例4相同的加熱處理裝置進行表11所示各種加熱條件進行加熱處理。針對所得茶萃取物，與實施例1相同地對萃取物中之二酮哌嗪進行分析。
結果示於表11。為了生成二酮哌嗪，暗示100℃以上(較佳係115℃以上，更佳係125℃以上)之加熱為必須。 另外，亦暗示加熱時間為30分鐘~10小時，更佳係約2~8小時之加熱。
(實施例11)製造含二酮哌嗪之飲食物
於市售之450g的PET綠茶飲料，分別如表12所示添加50g之實施例4製造之茶萃取物A以及/或水，調製為全量500g的含二酮哌嗪之茶飲料。針對該等茶飲料實施香味的官能評價。評價係以苦味為中心的綜合性的喜好進行判斷，◎：香味非常良好，○：香味良好，△：可飲用的香味，×：稍為難以飲用的香味，××：非常難以飲用的香味等五個階段。
結果示於表12。確認每500g飲料，含有0~50g之二酮哌嗪混合體之實施例4之茶萃取物A的茶飲料，均具有良好香味。由此結果，暗示本發明所得之茶萃取物，於飲料香味的摻混設計時，係泛用性高之素材。

Claims (8)

  1. 一種植物萃取物，其係以10μg/100g/Bx以上的濃度，含有環丙胺醯基麩醯胺酸、環丙胺醯基丙胺酸、環絲胺醯基酪胺酸、環甘胺醯基白胺酸、環甘胺醯基色胺酸、環纈胺醯基纈胺酸、環色胺醯基酪胺酸、環白胺醯基色胺酸以及環苯基丙胺醯基苯基丙胺酸之任一種以上，Bx單位之二酮哌嗪的總量係900μg/100g/Bx以上。
  2. 如請求項1之植物萃取物，其中植物萃取物係茶萃取物、大豆萃取物或麥芽萃取物。
  3. 一種植物萃取物之製造方法，其係包含將植物性胜肽於液體中進行高溫高壓處理之步驟，該植物萃取物中含有各10μg/100g/Bx以上的濃度之環白胺醯基白胺酸以及環白胺醯基苯基丙胺酸，且Bx單位之二酮哌嗪的總量係900μg/100g/Bx以上。
  4. 如請求項3之製造方法，其中高溫高壓處理步驟中之加熱條件，係於100~170℃的液體中30~500分鐘。
  5. 如請求項3或4之製造方法，其中植物性胜肽係寡胜肽。
  6. 如請求項3或4之製造方法，其中植物性胜肽，係對來自植物之蛋白質或含有蛋白質之植物體施以分解處理所得者。
  7. 如請求項6之製造方法，其中分解處理係加熱處理或酵素處理。
  8. 如請求項7之製造方法，其中分解處理係酵素處理，酵素係內切型蛋白酶。
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