CN105307514B - 含有二酮哌嗪的植物提取物及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明在于提供适于配合到饮食物中的二酮哌嗪混合物及其制造法。通过将植物性肽在液体中进行高温高压处理，可制造高浓度含有包含环亮氨酰亮氨酸及环亮氨酰苯丙氨酸的二酮哌嗪的植物提取物。根据本发明可得到来自植物性天然产物的香味优异的二酮哌嗪，可直接配合到饮食物中来制造附加有二酮哌嗪所具有的功能的饮食物。

Description

含有二酮哌嗪的植物提取物及其制造方法
技术领域
本发明涉及高浓度含有二酮哌嗪的植物提取物及其制造方法。
背景技术
两个氨基酸键合的“二肽”作为功能性物质而备受关注。二肽可附加单体氨基酸所没有的物理性质、新功能，作为具有比氨基酸广的应用范围的物质而备受期待。尤其是，已知作为环状二肽的二酮哌嗪具有抗菌作用、抗氧化作用(非专利文献1，2)、学习积极性改善作用(专利文献1)等各种各样的生理活性，预测在医疗·药理领域需求会扩大。
通常，二酮哌嗪通过化学合成法(非专利文献3)、酶法(非专利文献2，4)等制造。此外，还提出了下述方法：通过使直链肽在处于超临界区域或亚临界区域的高温高压水中进行脱水·环化反应来合成具有任意的氨基酸序列的环状肽的方法(专利文献2)、将直链二肽或直链三肽在水溶剂中进行加热处理来制造环状二肽的方法(专利文献3，4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1 日本特表2012-517998号公报
专利文献2 日本特开2003-252896号公报
专利文献3 韩国公开专利10-2011-0120051号公报
专利文献4 日本专利5456876号公报
专利文献5 日本特开2010-166911号公报
专利文献6 日本特表2012-517214号公报
非专利文献
非专利文献1 Peptides,16(1),151-164(1995)
非专利文献2 Bioscience and Industry(日语原名：バイオサイエンスとインダストリー),60(7),454-457(2002)
非专利文献3 J.Comb,Chem.,3,453-460(2001)
非专利文献4 Chemistry Biology,8,997-1010(2001)
非专利文献5 Agr.Biol.Chem.,38(5),927-932(1974)
发明内容
这样，虽然期待二酮哌嗪在生物体内发挥各种生理活性，然而来自天然产物的二酮哌嗪、高浓度含有二酮哌嗪的食品几乎不存在。作为来自天然产物的二酮哌嗪，已知在雪利酒、绍兴酒、酱油、甜料酒、醋等的发酵食品中存在二酮哌嗪(非专利文献5)，但其含量为极微量，期待二酮哌嗪所具有的功能性而摄取上述食品时，必须摄取相当大的量，无论怎样都缺乏实用性。此外，还已知含有Cyclo(Pro-Phe)、Cyclo(Pro-Leu)的咖啡饮料(专利文献5)，但上述二酮哌嗪的苦味强，难以应用于其他饮料。
进而，还已知以胶原蛋白、畜肉等的动物性蛋白质为起源的相对较多地含有二酮哌嗪的组合物(专利文献4，6)。然而，由于将以上述动物性蛋白质为起源的含二酮哌嗪组合物在下述饮料中直接使用时对香味有影响，故而存在困难，该饮料为茶饮料、咖啡饮料、大豆饮料、果汁饮料等以植物提取液或榨汁液等作为主成分配合而得的饮料或风味水饮料、矿物质饮料、碳酸饮料等的清凉饮料。
本发明所要解决的技术课题在于提供高浓度含有来自天然产物且安全性高的二酮哌嗪的香味良好的提取物及其制造法。
本发明者为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现通过对含有蛋白质的植物体实施分解处理来生成植物性肽，并将该植物性肽在液体中进行高温高压处理，可制造高浓度含有二酮哌嗪的植物提取物。其次，确认了该植物提取物的风味良好，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下内容。
(1)一种植物提取物，其特征在于，以10μg/100g/Bx以上的浓度含有环丙氨酰谷氨酰胺、环丙氨酰丙氨酸、环丝氨酰酪氨酸、环甘氨酰亮氨酸、环甘氨酰色氨酸、环缬氨酰缬氨酸、环色氨酰酪氨酸、环亮氨酰色氨酸及环苯丙氨酰苯丙氨酸中的任意一个以上。
(2)根据(1)所述的植物提取物，其特征在于，单位Bx的二酮哌嗪的总量为900μg/100g/Bx以上。
(3)根据(1)或(2)所述的植物提取物，其特征在于，植物提取物为茶提取物、大豆提取物或麦芽提取物。
(4)一种植物提取物，其特征在于，通过对含有蛋白质的植物体实施分解处理而生成植物性肽，并将该植物性肽在液体中进行高温高压处理而得。
(5)一种制造方法，其特征在于，包含将植物性肽在液体中进行高温高压处理的工序，且制造高浓度含有包含环亮氨酰亮氨酸及环亮氨酰苯丙氨酸的二酮哌嗪的植物提取物。
(6)根据(5)所述的制造方法，其特征在于，高温高压处理工序中的加热条件为在100～170℃的液体中进行30分钟～数小时。
(7)根据(5)或(6)所述的制造方法，其特征在于，植物性肽为寡肽。
(8)根据(5)～(7)中任一项所述的制造方法，其特征在于，植物性肽为对来自植物的蛋白质或含有蛋白质的植物体实施分解处理而得。
(9)根据(8)所述的制造方法，其特征在于，分解处理为加热处理或酶处理。
(10)根据(9)所述的制造方法，其特征在于，分解处理为酶处理，酶为内切型蛋白酶。
根据本发明，无需繁琐的工序、复杂的设备而能够以大量的生产规模来简便地制造高浓度含有来自天然产物且安全性高的二酮哌嗪的植物提取物。
附图说明
图1表示使用大豆蛋白质所得到的植物肽加工品中的环苯丙氨酰苯丙氨酸浓度的定量结果。
图2表示使用大米蛋白质所得到的植物肽加工品中的环苯丙氨酰苯丙氨酸浓度的定量结果。
图3表示前提取的次数与可溶性成分的去除率的关系。
具体实施方式
(植物性肽)
本发明的植物提取物可将植物性肽在液体中进行高温高压处理来制造。在此，只要没有特别声明，本说明书中的“植物性肽”是指数个下述氨基酸连接而成的肽，氨基酸通过对来自植物的蛋白质或包含蛋白质的植物体实施已知的分解处理(由热、压力进行的分解处理，由酸、碱进行的分解处理，由酶进行的分解处理等)从而进行低分子化(寡肽)来生成。
本发明的植物性肽可使用大豆肽、大麦肽、小麦肽、小麦胚芽肽、豌豆肽、大米肽等。如后所述，也可从来自植物的蛋白质或包含蛋白质的植物体来制备植物性肽进行使用，也可使用市售品。作为市售的植物性肽，例如可例示Hinute AM、Hinute DC、Hinute HK(以上，不二精油公司制)等的大豆肽、ORYZA PEPTIDE P60(Oryza油化公司制)等的大米肽、Glutamine Peptide GP-1N、Glutamine Peptide GP-N(以上，日清PHARMA公司制)等的小麦肽、Goma peptide KM-20(KISCO公司制)等的芝麻肽。
根据本发明者的研究，肽的大小不同所得到的二酮哌嗪混合物的收率也产生差别。优选使用分子量5000以下的肽的比例高的植物性肽，更优选使用分子量3000以下的肽的比例高的植物性肽，特别优选使用分子量1000以下的肽的比例高的植物性肽。此外，当使用氨基酸分数高的大豆时，由于多种二酮哌嗪以更高的浓度生成，故而大豆肽为优选方式的一个例子。
本发明的植物性肽可使用以来自植物的蛋白质、包含蛋白质的植物体作为原料制造的肽混合物。具体而言，可列举以下述物质作为原料实施已知的分解处理(由热、压力进行的分解处理，由酸、碱进行的分解处理，由酶进行的分解处理等)所制造的肽混合物，该物质有大豆蛋白质、小麦蛋白质、小麦胚芽蛋白质、大米蛋白质、芝麻蛋白质等来自植物的蛋白质，或者绿茶叶等的叶类、 大麦、小麦、麦芽、芝麻、米等的种子类、大豆、小豆、黑豆等的豆类、甘薯、马铃薯等的薯类等含有蛋白质且可饮食用的植物体。在上述包含蛋白质的植物体中，在本发明中可适合地使用大豆、麦芽、茶叶。特别优选使用大豆、茶叶，更优选使用茶叶。将上述来自植物的蛋白质、包含蛋白质的植物体作为原料实施分解处理并得到作为植物性肽的肽混合物，该分解处理在可生成寡肽的条件下进行。具体而言，为了使分子量5000以下的肽(优选分子量3000以下的肽、更优选分子量1000以下的肽)的比例增高来进行分解处理。
从成为目标的寡肽生成的容易度(反应速度的快慢)、大量处理的容易度出发，分解处理优选由热进行的分解处理及/或由酶进行的分解处理，特别适合使用由酶进行的分解处理(以下，称为酶处理)。
进行由加热进行的分解处理时，为了防止植物体、蛋白质的焦糊而在溶剂中进行。通常，每1质量份植物体，溶剂的量为10～100质量份、优选15～80质量份、更优选20～60质量份、特别优选20～40质量份左右。作为溶剂，优选使用水、乙醇或它们的混合物等，特别优选使用水。加热条件只要是可生成肽的条件，则没有特别限定。作为加热条件，可例示在100℃以上、进而125℃以上的温度下进行30分钟～数小时、优选2～7小时左右的加热。作为加热处理装置，可根据条件使用压力锅、高压灭菌器等。且，该加热处理可与本发明的“在液体中的高温高压处理工序”同时进行。
通过酶处理来制造植物性肽时，对于酶而言可使用蛋白质分解酶(蛋白酶)，优选使用内切型分解活性强的蛋白酶。此外，根据作用最适pH的差异，蛋白酶大致分为碱性蛋白酶、中性蛋白酶及酸性蛋白酶3种。进而，作为蛋白酶的起源，有植物起源、动物起源或微生物起源，只要没有分解效率差的情况或所得到的分解提取液的香味差等的不良影响，酶起源及最适pH就没有特别限定。
例如，作为本发明可使用的来自细菌的蛋白酶，可列举Protease N、Protease NL、Protease S、Proleather(注册商标)FG-F(以上，Amano Enzyme公司制)；protin NY、protinP、Desukin、Depireisu、protin A、Thermoase(注册商标)(以上，大和化成公司制)；Bioprase(注册商标)XL-416F、Bioprase(注册商标)SP-4FG、Bioprase(注册商标)SP-15FG(以上，Nagase chemtex公司制)；Orientase (注册商标)90N、Nucleisin(注册商标)、Orientase(注册商标)10NL、Orientase(注册商标)22BF(以上，HBI公司制)；Aroase(注册商标)AP-10(YAKULT药品工业公司制)；Protamex(注册商标)、Neutrase(注册商标)、Alcalase(注册商标)(以上，Novozyms公司制)；COROLASE N、COROLASE 7089、VERON W、VERON P(以上，AB Enzyme公司制)；Enchiron NBS(洛东化成工业公司制)；Alkali protease GL440、Purafect(注册商标)4000L、Protease 899、PROTEX6L(以上，Genencor协和公司制)等。此外，作为本发明可使用的来自曲菌的蛋白酶，可列举Protease A、Protease M、Protease P、Umamizyme、peptidase R、Newlase(注册商标)A、Newlase(注册商标)F(以上，Amano Enzyme公司制)；Sumizyme(注册商标)AP、Sumizyme(注册商标)LP、Sumizyme(注册商标)MP、Sumizyme(注册商标)FP、Sumizyme(注册商标)LPL(以上，新日本化学工业公司制)；protin(注册商标)FN(大和化成公司制)；Denapsin 2P、Denazyme(注册商标)AP、XP-415(以上，Nagase chemtex公司制)；Orientase(注册商标)20A、Orientase(注册商标)ONS、Tetraze(注册商标)S(以上，HBI公司制)；Molsin(注册商标)F、PD enzyme、IP enzyme、AO-protease(以上，Kikkoman公司制)；Sakanaze(科研制药公司制)、Pancidase(注册商标)YP-SS、Pancidase(注册商标)NP-2、Pancidase(注册商标)P(以上，YAKULT药品工业公司制)；Flavourzyme(注册商标)(Novozyms Japan公司制)；Kokulaze(注册商标)SS、Kokulaze(注册商标)P(以上，三共Lifetech公司制)；VERON PS、COROLASE PN-L(以上，AB Enzyme公司制)等。此外，作为本发明可使用的蛋白酶，可列举来自放线菌的蛋白酶(例如Actinase(注册商标)AS、Actinase(注册商标)AF(以上，科研制药公司制)、Tasinase(注册商标)(Genencor协和公司制))、来自植物的蛋白酶(例如papain W-40(Amano Enzyme公司制)、食品用纯化papain(Nagase chemtex公司制))、来自动物的胃蛋白酶、胰蛋白脢等。
在上述的蛋白酶中，从分解效率、所得到的含肽液的香味的观点出发，优选使用来自细菌的蛋白酶，更优选使用来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的中性蛋白酶、来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的蛋白酶、来自 嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的蛋白酶，特别优选使用来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的中性蛋白酶。
优选相对于来自植物的蛋白质、包含蛋白质的植物体，将上述蛋白酶在0.1～20重量％、优选1～15重量％、更优选3～10重量％的范围内使用。少于上述范围的添加量时，无法发挥使肽生成收率提高的效果，另一方面，即使多于上述范围进行添加，也无法期待肽生成收率的大幅提高且在成本方面不利。应予说明，酶处理为在来自植物的蛋白质或植物体中加入水且在湿润的状态下使酶作用。添加的水量通常为每1质量份干燥状态的蛋白质或植物体，水为10～50质量份、更优选10～30质量份、特别优选10～20质量份左右。
由蛋白酶进行的酶处理条件只要根据所使用的蛋白酶的最适条件进行设定即可，通常为在20～70℃(优选30～60℃、更优选40～60℃)下进行30分钟～24小时(优选1小时～12小时、更优选1小时～6小时)左右。
由于酶的种类不同，对作为基质的蛋白质的作用部位也不同，其结果可改变本发明所得到的二酮哌嗪混合物的组成，故而还可根据所期望的二酮哌嗪混合物的组成来选择酶。酶也可2种以上合用来进行使用。
作为植物性肽，在使用植物体时，在实施由上述的分解处理进行的肽生成工序前，优选进行预先减少植物体所含有的水溶性蛋白质的前处理。根据本发明者的研究，通过预先减少水溶性蛋白质，由分解处理进行的肽的生成收率、由本发明的加热处理工序进行的二酮哌嗪的生成收率明显提高。作为去除水溶性蛋白质的前处理的方法，可列举将植物体在液体中加热使水溶性蛋白质溶出的方法且其后进行固液分离将所得到的固体(植物体)供于分解处理的方法、用水等的水性溶剂对植物体实施提取处理的方法且将其提取残渣供于分解处理的方法等(以下，统称为“前提取”)。在前提取时，优选浸渍于相对于植物体的重量优选为15倍重量以上、更优选15～150倍重量左右的提取溶剂中，从而使植物体所包含的水溶性蛋白质等的可溶性成分溶出。此时，也可预先将提取溶剂进行加热，也可将植物体浸渍于提取溶剂后进行加热、提取。作为提取溶剂，可适合地使用纯水，也可使其适当含有乙醇等有机溶剂。此外，还可通过在提取溶剂中添加矿物质成分来适当调整硬度。
在前提取中，其提取温度没有特别限定，通常为50～100℃、优选60～95℃、更优选70～90℃左右。此外，提取时间为1分钟～24小时、优选3分钟～20小时左右。提取温度、时间等的提取条件设定为使所得到的提取残渣的可溶性成分去除率成为60％以上、优选70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上、特别优选95％。可溶性成分的去除率是指将可最大限度去除的可溶性成分作为100％时在提取液中可回收的固体成分的相对比例，指通过式“(通过前提取所得到的采液量(总量)(g)×其白利度[Bx])/(可最大限度去除的可溶性成分(g)×其白利度[Bx])×100(％)”计算的值。在本说明书中，作为“可最大限度去除的可溶性成分”，为了方便表示“反复进行10次下述操作时的采液量：在相对于植物体的重量为30倍量的热水中提取10分钟”。在此，本说明书中提到的Bx可用市售的Bx测定计测器进行计测。
植物体的前提取可仅进行1次，也可进行多次。可废弃前提取所得到的提取液，也可配合到饮食物中进行利用，例如还可与本发明所得到的含有二酮哌嗪的植物提取物混合从而配合到饮食物中。
(加热处理)
在本发明的制造方法中，通过将这样的植物性肽在液体中进行高温高压处理来生成二酮哌嗪。作为高温高压处理中的液体，可适合地使用纯水，也可使其适当含有乙醇等有机溶剂。此外，还可通过在提取溶剂中添加矿物质成分来适当调整硬度。优选根据需要预先进行浓缩或稀释，使得供于加热处理的液体的白利度(Bx)成为0.1～50左右。
本说明书中提到的高温高压意味着100℃以上的温度且超过大气压的压力。作为高温高压提取装置，可根据条件使用耐压性提取装置或压力锅、高压灭菌器等。
高温高压的温度优选100～170℃、更优选110～150℃、特别优选120～140℃。且，作为加热装置使用耐压性提取装置时，该温度表示测定提取柱的出口温度的值，作为加热装置使用高压灭菌器时，该温度表示测定压力容器内的中心温度的温度的值。此外，压力优选0.101～0.79MPa、更优选0.101～0.48MPa。进而，加热时间优选30～500分钟、更优选60～300分钟左右。
更为适合的加热处理条件为在以横轴作为时间(分钟)、以纵轴作为温度(℃)的坐标系中，保持在由如下坐标系(i)～(vi)所包围的时间及温度的范围内的加热处理。
(i)(170℃,30分钟)、(ii)(150℃,30分钟)、(iii)(115℃,180分钟)、(iv)(105℃,480分钟)、(v)(135℃,480分钟)、(vi)(150℃,180分钟)
在液体中进行高温高压处理后，根据需要进行固液分离回收液体部，可得到高浓度含有本发明的二酮哌嗪的植物提取物。在固液分离中可使用过滤及/或离心分离方法。
植物性肽的来源(成为原料的植物的种类)、酶的种类不同，所得到的高浓度含有二酮哌嗪的植物提取物中的二酮哌嗪的组成也不同，通过将本发明的植物性肽在液体中进行高温高压处理，可使选自环丙氨酰谷氨酰胺(CAS注册号:268221-76-7；Cyclo(Ala-Gln))、环组氨酰哺氨酸(CAS注册号:53109-32-3；Cyclo(His-Pro))、环丙氨酰丙氨酸(CAS注册号:5845-61-4；Cyclo(Ala-Ala))、环甘氨酰哺氨酸(CAS注册号:3705-27-9；Cyclo(Gly-Pro))、环丝氨酰酪氨酸(CAS注册号:21754-31-4；Cyclo(Ser-Tyr))、环哺氨酰苏氨酸(CAS注册号:227777-31-3；Cyclo(Pro-Thr))、环组氨酰苯丙氨酸(CAS注册号:56586-95-9；Cyclo(His-Phe))、环丙氨酰哺氨酸(CAS注册号:65556-33-4；Cyclo(Ala-Pro))、环苯丙氨酰丝氨酸(CAS注册号:35591-00-5；Cyclo(Phe-Ser))、环甘氨酰亮氨酸(CAS注册号:5845-67-0；Cyclo(Gly-Leu))、环甘氨酰苯丙氨酸(CAS注册号:10125-07-2；Cyclo(Gly-Phe))、环哺氨酰哺氨酸(Cyclo(Pro-Pro))、环甘氨酰色氨酸(Cyclo(Gly-Trp))、环天冬氨酰苯丙氨酸(CAS注册号:5262-10-2；Cyclo(Asp-Phe))、环缬氨酰哺氨酸(Cyclo(Val-Pro))、环哺氨酰酪氨酸(Cyclo(Pro-Tyr))、环蛋氨酰哺氨酸(Cyclo(Met-Pro))、环蛋氨酰蛋氨酸(Cyclo(Met-Met))、环缬氨酰缬氨酸(Cyclo(Val-Val))、环亮氨酰哺氨酸(CAS注册号:2873-36-1；Cyclo(Leu-Pro))、环色氨酰酪氨酸(Cyclo(Trp-Tyr))、环苯丙氨酰哺氨酸(CAS注册号:3705-26-8；Cyclo(Phe-Pro))、环亮氨酰色氨酸(CAS注册号:15136-34-2；Cyclo(Leu-Trp))、环苯丙氨酰色氨酸(CAS注册号:82597-82-8；Cyclo(Phe-Trp))、环亮氨酰苯丙氨酸(CAS注册号:7280-77-5； Cyclo(Leu-Phe))、环亮氨酰亮氨酸(CAS注册号:952-45-4；Cyclo(Leu-Leu))、环苯丙氨酰苯丙氨酸(CAS注册号:2862-51-3；Cyclo(Phe-Phe))中的至少1种的二酮哌嗪增加。
尤其是本发明对高浓度含有以相对较高的浓度含有Cyclo(Leu-Leu)及Cyclo(Leu-Phe)的二酮哌嗪的植物提取物的制造有利。此外，本发明对高浓度含有Cyclo(Phe-Phe)的植物提取物的制造有利。
也可通过从高浓度含有本发明的二酮哌嗪的植物提取物实施公知的纯化处理来选择性制造高浓度含有特定的二酮哌嗪的来自天然植物的二酮哌嗪。因此，从1个观点出发，本发明为高浓度含有包含Cyclo(Leu-Leu)及Cyclo(Phe-Phe)的二酮哌嗪的植物提取物的制造方法，另外从其他观点出发，本发明为特定的二酮哌嗪(例如Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Leu-Phe)、Cyclo(Leu-Leu)、Cyclo(Phe-Phe))的制造方法。
(植物提取物)
本说明书中提到的提取物是指液体状的提取物，本发明的“植物提取物”是指对植物体实施提取处理所得到的液体状的提取物或其加工品。
根据本发明可得到Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Leu-Trp)及Cyclo(Phe-Phe)中的任意一个以上的单位Bx的含量为10μg/100g/Bx以上的植物提取物。
此外，根据本发明可得到二酮哌嗪的总量为900μg/100g以上、优选1000μg/100g以上、更优选2000μg/100g以上、特别优选5000μg/100g以上的植物提取物。应予说明，只要没有特别声明，本说明书中二酮哌嗪的总量表示Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(His-Pro)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Gly-Pro)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Pro-Thr)、Cyclo(His-Phe)、Cyclo(Ala-Pro)、Cyclo(Phe-Ser)、Cyclo(Gly-Leu)、Cyclo(Gly-Phe)、Cyclo(Pro-Pro)、Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Asp-Phe)、Cyclo(Val-Pro)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Met-Pro)、Cyclo(Met-Met)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Phe-Pro)、Cyclo(Leu-Trp)、Cyclo(Phe-Trp)、Cyclo(Leu-Phe)、Cyclo(Leu-Leu)及Cyclo(Phe-Phe)的总量。
通常，Bx高的提取物意味着以高浓度含有来自原料的各种物质(例如，苦 味成分)，不仅其本身不适合作为饮料，而且由于对香味、舌头触感等有影响故而也不适合添加到饮料中。因此，考虑到在饮料中添加时，优选Bx低的提取物。根据本发明可得到大量包含作为生理活性物质的二酮哌嗪且Bx低的植物提取物，即可得到二酮哌嗪的含量与Bx之比高的植物提取物。具体而言，可得到上述二酮哌嗪的总量(单位：μg/100g)与白利度(Bx)之比为900(μg/100g/Bx)以上、优选1000(μg/100g/Bx)以上、更优选2000(μg/100g/Bx)、进一步优选5000(μg/100g/Bx)的植物提取物。提取物中的二酮哌嗪的上限没有特别限制，只要考虑二酮哌嗪的溶解性等来适当设定即可，通常为1000mg/100g以下、优选500mg/100g以下、更优选200mg/100g以下左右。
将植物体作为原料应用本发明的制造方法得到植物提取物时，由于不伴随发酵故而副产物少，而且进行前提取时可溶性成分少，具有苦味极少的香味的特征。
由于这样的植物提取物的香味良好，也没有沉淀、浑浊等，外观也优异，故而即使不实施特殊的后处理，也可直接用于提取物、调味料、饮料等。此外，本发明的植物提取物还存在下述优点：无论是否以高含量包含二酮哌嗪，由于Bx相对较低，故而在饮食物(尤其是饮料)中的配合量较少也可，饮食物设计的自由度增加。尤其是，可直接配合于茶饮料、咖啡饮料、大豆饮料、果汁饮料等以植物提取液或榨汁液等作为主成分配合而得的饮料或风味水饮料、矿物质饮料、碳酸饮料等的清凉饮料中利用。例如，将本发明的植物提取物配合到饮料中时，可得到二酮哌嗪的总量成为10μg/100g以上、优选20μg/100g以上、更优选40μg/100g以上、进一步优选60μg/100g以上的饮料，且不呈现苦味的风味良好的饮料。
按照添加的饮食物的形态，根据本发明所得到的植物提取物还可进行澄清处理等。此时，出于没有油分、存在纤维质等的理由，还存在可易于进行澄清这样的优点。
作为本发明植物提取物的适合的方式，可例示茶提取物、大豆提取物及麦芽提取物。以下，关于上述提取物进行详述。
(茶提取物)
本说明书中提到的“茶提取物”是指对茶叶进行提取处理所得到的茶提取物。作为成为提取原料的茶叶，可使用采用茶树(学名：Camellia sinensis)所制造的茶叶的叶、茎等的进行提取而可饮用的部位。此外，其形态也不限制于大叶、粉状等。关于茶叶的收获期，也可根据所期望的香味来适当选择。
本发明所得到的高浓度含有二酮哌嗪的植物提取物(茶提取物)的特征在于，通过不经过发酵过程来制造可抑制副产物的生成，从而可得到香味良好的植物提取物。从该香味的观点出发，茶叶优选使用煎茶、番茶、焙茶、玉露、冠茶、甜茶等蒸制的不发酵茶(绿茶)或嬉野茶、青柳茶、各种中国茶等的釜炒茶等的不发酵茶。
本发明者测定了将市售的茶叶进行提取所得到的茶提取物中的二酮哌嗪浓度。其结果，确认了在发酵茶中包含极微量(0～200μg/100g/Bx左右)，此外在绿茶中几乎不包含(参照表1，测定方法与后述的实施例1相同)。
表1
另一方面，本发明的茶提取物以10μg/100g/Bx以上的浓度含有作为以往的茶类所不包含的二酮哌嗪的Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Leu-Trp)及Cyclo(Phe-Phe)中的任意一个以上。
此外，本发明的茶提取物以0.1ppm/Bx(10μg/100g/Bx)以上的浓度分别含有Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(His-Pro)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Gly-Pro)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Pro-Thr)、Cyclo(His-Phe)、Cyclo(Ala-Pro)、Cyclo(Phe-Ser)、Cyclo(Gly-Leu)、Cyclo(Gly-Phe)、Cyclo(Pro-Pro)、Cyclo(Asp-Phe)、Cyclo(Val-Pro)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Met-Pro)、Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)、Cyclo(Leu-Phe)及Cyclo(Leu-Leu)。优选以0.2ppm/Bx以上、更优选0.3ppm/Bx以上、进一步优选0.4ppm/Bx以上、特别优选0.5ppm/Bx以上的浓度分别含有上述二酮哌嗪的茶提取物。进而，能够以0.1ppm/Bx(10μg/100g/Bx)以上、优选0.2ppm/Bx以上、更优选0.3ppm/Bx以上的浓度分别含有Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Leu-Trp)、Cyclo(Phe-Trp)及Cyclo(Phe-Phe)。
作为苦味强的二酮哌嗪，已知有作为咖啡饮料中的二酮哌嗪的Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)(参照日本特开2010-166911号公报)、作为酪蛋白的分解处理物的Cyclo(Leu-Trp)(蛋白质研究奖励会肽研究所报(日语原名：蛋白質研究奨励会ペプチド研究所報)，No.2，1974)。本发明的茶提取物虽然含有上述具有强烈苦味的二酮哌嗪，但提取物自身几乎没有苦味。制备含有与茶提取物为相同浓度的Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)及Cyclo(Leu-Trp)的水溶液时，由于可感觉到强烈的苦味，故而认为共存的其他二酮哌嗪、来自茶的成分可加成或协同减少Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)及Cyclo(Leu-Trp)的苦味。尤其是，相对于Cyclo(Leu-Leu)与Cyclo(Leu-Phe)的总量(A)的具有苦味的二酮哌嗪Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)及Cyclo(Leu-Trp)的总量(B)的比例[(B)/(A)]成为1.0以下(优选0.8以下、更优选0.6以下、特别优选0.4以下)的茶提取物为不伴随以苦味为代表的味道的含二酮哌嗪提取物，可直接配合于饮食品(尤其是饮料)。
茶提取物中单位Bx的二酮哌嗪的总量为900μg/100g/Bx以上、优选900～ 30000μg/100g/Bx、更优选2000～25000μg/100g/Bx、特别优选5000～20000μg/100g/Bx。成为这样的浓度范围时，对制造附加有二酮哌嗪所具有的功能(生理活性等)的饮食品有利。
这样的茶提取物可通过将茶叶中的蛋白质进行分解处理来制备茶肽并将其在液体中进行高温高压处理来简便地制造。茶叶中包含约25％丰富的蛋白质(五订日本食品标准成分表)。因此，只要将该茶叶蛋白质用蛋白酶等的酶进行分解处理，则理应可得到茶肽，但即使使蛋白酶作用于茶叶也无法得到那么多的茶肽。由于茶叶中总蛋白质的80％以上为不溶性蛋白质，故而优选使蛋白质分解酶高效作用于茶叶所包含的蛋白质来得到茶肽。具体而言，进行从茶叶去除水溶性蛋白质的前处理后，使蛋白酶等的蛋白质分解酶作用于该提取残渣来制备茶肽。即，本发明的茶提取物可通过依次进行以下工序来高效分解水不溶性蛋白质从而简便地制造高浓度含有二酮哌嗪的茶提取物。
(a)将茶叶用水提取并回收提取残渣的工序，
(b)在水的存在下使内切型蛋白酶作用于提取残渣从而将茶叶蛋白质分解并得到包含茶肽的液体的工序，
(c)将包含茶肽的液体进行高温高压处理得到反应液的工序，及
(d)将反应液进行固液分离处理来回收包含二酮哌嗪的液体的工序
或，
(a)将茶叶用水提取并回收提取残渣的工序，
(b)在水的存在下使内切型蛋白酶作用于提取残渣从而将茶叶蛋白质分解并得到包含茶肽的液体的工序，
(d’)将包含茶肽的液体进行固液分离处理来回收包含茶肽的液体的工序，及
(C’)将包含茶肽的液体进行高温高压处理得到包含二酮哌嗪的反应液的工序。
各工序的条件如前所述，在工序(a)的前提取中，还可使用在茶饮料的制造等中进行提取处理所得到的茶叶渣等的提取残渣。以往，茶叶中的水不溶性茶蛋白质不作为营养源利用，例如，日本国内的绿茶饮料制造时产生的超过2.2万吨的提取残渣基本被作为未利用资源而废弃，上述茶提取物的制造方法对以 往被废弃的茶叶渣的有效利用也有效。
根据该方法可制造高浓度含有Cyclo(Leu-Leu)、Cyclo(Leu-Phe)及Cyclo(Ala-Ala)的茶提取物。具体而言，相对于茶提取物中的二酮哌嗪总量，成为Cyclo(Leu-Leu)为10％以上(重量基准)、Cyclo(Leu-Phe)为10％以上、Cyclo(Ala-Ala)为7％以上的提取物。将它们以浓度表示时，成为分别为5.0ppm/Bx(500μg/100g/Bx)以上、优选8.0ppm/Bx以上、更优选10.0ppm/Bx以上的浓度的茶提取物。它们的上限为50.0ppm/Bx以下、优选40.0ppm/Bx以下、更优选35.0ppm/Bx以下、进一步优选30.0ppm/Bx以下左右。
此外，发现通过多次反复进行工序(a)中的茶叶的水提取(前提取)，Cyclo(Leu-Leu)、Cyclo(Leu-Phe)及Cyclo(Phe-Phe)的浓度显著提高。因此，该方法对Cyclo(Phe-Phe)的制造也有利。本发明者确认含有3.0ppm/Bx以上通过该方法所得到的Cyclo(Phe-Phe)的茶提取物具有学习积极性改善作用。
可是，已知具有疏水性官能团的二酮哌嗪通过环状化，与直链肽相比其疏水性提高。Cyclo(Phe-Phe)为疏水性最高的成分，将上述茶提取物进行加速保存试验(55℃、2周)，结果确认可稳定维持Cyclo(Phe-Phe)。因此，本发明的茶提取物作为含Cyclo(Phe-Phe)提取物也有用。茶提取物中的Cyclo(Phe-Phe)含量优选为10μg/100g/Bx以上、20μg/100g/Bx以上、30μg/100g/Bx以上。
(大豆提取物)
本说明书中提到的“大豆提取物”是指在大豆中加水进行提取处理或研磨处理所得到的液体。成为原料的大豆(学名：Glycine max)可没有品种、产地等的限制来使用，也可使用粉碎品等的加工品阶段的大豆。此外，本说明书中提到的大豆提取物为了方便还包括在大豆蛋白分解物中加水所得到的液体。
据说大豆中的蛋白质占约3成。由于大豆蛋白质不像茶蛋白质的水不溶性蛋白质那么多，故而不用必须进行除去水溶性蛋白质的前处理，只要根据需要进行即可。不进行除去水溶性蛋白质的前处理时，可通过一步法(One-Pot)反应来更为简便地制造高浓度含有二酮哌嗪的植物提取物(大豆提取物)。
依据市售的大豆肽(粉体)在喷雾干燥时施加180～220℃左右的热，本发明者测定大豆肽中的二酮哌嗪浓度。其结果，确认市售的大豆肽中包含极微量 (650μg/100g/Bx左右)(参照表2)。
另一方面，本发明的大豆提取物含有单位Bx的含量为10μg/100g/Bx以上的作为以往的大豆蛋白分解物(大豆肽)所不包含的二酮哌嗪的Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Leu-Trp)及Cyclo(Phe-Phe)中的任意一个以上。
此外，本发明的大豆提取物以0.1ppm/Bx(10μg/100g/Bx)的浓度分别含有Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(His-Pro)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Gly-Pro)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Pro-Thr)、Cyclo(His-Phe)、Cyclo(Ala-Pro)、Cyclo(Phe-Ser)、Cyclo(Gly-Leu)、Cyclo(Gly-Phe)、Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Asp-Phe)、Cyclo(Val-Pro)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Met-Pro)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Phe-Pro)、Cyclo(Leu-Trp)、Cyclo(Leu-Phe)、Cyclo(Leu-Leu)及Cyclo(Phe-Phe)。优选以0.5ppm/Bx以上、更优选0.7ppm/Bx以上、进一步优选0.9ppm/Bx以上、特别优选1.0ppm/Bx以上、特别优选1.2ppm/Bx以上的浓度分别含有上述二酮哌嗪的大豆提取物。进而，能够以0.1ppm/Bx(10μg/100g/Bx)以上、优选0.2ppm/Bx以上、更优选0.3ppm/Bx以上的浓度分别含有Cyclo(Pro-Pro)及Cyclo(Phe-Trp)。
该大豆提取物(尤其是将大豆或其粉碎物作为原料所得到的提取物)虽然含有作为苦味强的二酮哌嗪而已知的Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)及Cyclo(Leu-Trp)，其苦味也减少。在制备含有相同浓度的Cyclo(Leu-Pro)及Cyclo(Phe-Pro)的水溶液时，由于可感觉到强烈的苦味，故而认为共存的其他二酮哌嗪、来自大豆的成分可加成或协同地缓和Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)及Cyclo(Leu-Trp)的苦味。尤其是，相对于Cyclo(Leu-Leu)与Cyclo(Leu-Phe)的总量(A)的具有苦味的二酮哌嗪Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)及Cyclo(Leu-Trp)的总量(B)的比例[(B)/(A)]为1.0以下(优选0.8以下、更优选0.6以下、特别优选0.5以下)的大豆提取物为苦味显著减少的含二酮哌嗪提取物，可有利地配合于饮食品(尤其是饮料)。
大豆提取物中单位Bx的二酮哌嗪的总量为900μg/100g/Bx以上、优选900～30000μg/100g/Bx、更优选2000～25000μg/100g/Bx、特别优选5000～ 20000μg/100g/Bx。成为这样的浓度范围时，对制造附加有二酮哌嗪所具有的功能(生理活性等)的饮食品有利。
高浓度含有本发明二酮哌嗪的大豆提取物可通过依次进行以下工序来制造。
(x)在水的存在下使内切型蛋白酶作用于大豆或大豆蛋白分解物从而得到包含大豆肽的液体的工序，
(y)将包含大豆肽的液体进行高温高压处理从而得到反应液的工序，及
(z)将反应液进行固液分离处理来回收包含二酮哌嗪的液体的工序。
与茶提取物的制造同样，工序(y)及(z)也可以交换顺序。此外，也可以在工序(x)之前加入去除水溶性蛋白的工序(w)。将大量含有二或三肽的大豆肽作为原料使用时，工序(x)成为
(x’)在大量含有二或三肽的大豆肽中加水从而得到包含大豆肽的液体的工序。另外，各工序的条件如前所述。
根据该方法可制造高浓度含有Cyclo(Leu-Leu)、Cyclo(Leu-Phe)、Cyclo(Ser-Tyr)及Cyclo(Pro-Thr)的大豆提取物。具体而言，相对于大豆提取物中的二酮哌嗪总量，成为Cyclo(Leu-Leu)为8％以上(重量基准)、Cyclo(Leu-Phe)为8％以上、Cyclo(Ser-Tyr)为6％以上的提取物。成为上述物质的浓度分别为5.0ppm/Bx(500μg/100g/Bx)以上、优选6.0ppm/Bx以上、更优选7.0ppm/Bx以上浓度的大豆提取物。尤其是可得到Cyclo(Leu-Leu)及Cyclo(Leu-Phe)成为10.0ppm/Bx以上、优选12.0ppm/Bx以上的大豆提取物。它们的上限为50.0ppm/Bx以下、优选40.0ppm/Bx以下、更优选35.0ppm/Bx以下、进一步优选30.0ppm/Bx以下左右。
此外，由于根据该方法可得到含有大豆肽所不包含的3.0ppm/Bx以上的Cyclo(Phe-Phe)、优选4.0ppm/Bx以上的Cyclo(Phe-Phe)的大豆提取物，故而该方法对Cyclo(Phe-Phe)的制造也有利(参照后述的实施例)。可确认Cyclo(Phe-Phe)为疏水性高的成分，在该大豆提取物中可稳定维持。
(麦芽提取物)
本说明书中提到的“麦芽提取物”是指对麦芽或其粉碎物进行提取处理所 得到的提取物。成为原料的麦芽(malt)可没有品种、产地等的限制来进行使用，尤其是可适合地使用使大麦种子发芽的大麦麦芽。将大麦麦芽的皮部去除并将蛋白质含量高的组分分离来使用既实用又高效。蛋白质含量高的组分可列举如下方法得到：将麦芽从表面慢慢削下并去除谷皮，其后削掉糊粉层及胚乳等大量包含蛋白质的组分。或者如在茶提取物中实施的那样，可利用进行了前提取的提取残渣。作为提取残渣，可例示啤酒制造时产生的麦芽渣滓。
只要将蛋白质含量高的组分作为原料，则可通过一步法(One-Pot)反应更为简便地制造高浓度含有二酮哌嗪的植物提取物(麦芽提取物)。
本发明的麦芽提取物以10μg/100g/Bx以上的浓度含有作为以往难以提取的二酮哌嗪的Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Leu-Trp)及Cyclo(Phe-Phe)中的任意一个以上。
此外，本发明的麦芽提取物以0.1ppm/Bx(50μg/100g/Bx)以上的浓度分别含有Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(His-Pro)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Gly-Pro)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Pro-Thr)、Cyclo(His-Phe)、Cyclo(Ala-Pro)、Cyclo(Phe-Ser)、Cyclo(Gly-Leu)、Cyclo(Gly-Phe)、Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Asp-Phe)、Cyclo(Val-Pro)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Met-Pro)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Phe-Pro)、Cyclo(Leu-Trp)、Cyclo(Leu-Phe)、Cyclo(Leu-Leu)及Cyclo(Phe-Phe)。优选以0.3ppm/Bx以上、更优选0.4ppm/Bx以上、进一步优选0.5ppm/Bx以上、特别优选0.6ppm/Bx以上的浓度分别含有上述二酮哌嗪的麦芽提取物。
该麦芽提取物虽然含有作为苦味强的二酮哌嗪而已知的Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)及Cyclo(Leu-Trp)，其苦味也减少。尤其是，相对于Cyclo(Leu-Leu)与Cyclo(Leu-Phe)的总量(A)的具有苦味的二酮哌嗪Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)及Cyclo(Leu-Trp)的总量(B)的比例[(B)/(A)]为1.0以下(优选0.8以下)的麦芽提取物为苦味显著减少的含二酮哌嗪提取物，可有利地配合于饮食品(尤其是饮料)。
麦芽提取物中单位Bx的二酮哌嗪的总量为900μg/100g/Bx以上、优选900～ 30000μg/100g/Bx、更优选2000～25000μg/100g/Bx、特别优选5000～20000μg/100g/Bx。当成为这样的浓度范围时，对制造附加有二酮哌嗪所具有的功能(生理活性等)的饮食品有利。
高浓度含有本发明二酮哌嗪的麦芽提取物可通过依次进行以下工序来制造。
(x)在水的存在下使内切型蛋白酶作用于麦芽或麦芽蛋白分解物从而得到包含麦芽肽的液体的工序，
(y)将包含麦芽肽的液体进行高温高压处理从而得到反应液的工序，及
(z)将反应液进行固液分离处理来回收包含二酮哌嗪的液体的工序。
与茶提取物的制造同样，工序(y)及(z)也可以交换顺序。此外，也可以在工序(x)之前加入去除水溶性蛋白的工序(w)。另外，各工序的条件如前所述。
根据该方法可制造高浓度含有Cyclo(Leu-Leu)、Cyclo(Leu-Phe)及Cyclo(Ala-Ala)的麦芽提取物。具体而言，成为上述物质的浓度分别为5.0ppm/Bx(500μg/100g/Bx)以上、优选6.0ppm/Bx以上、更优选7.0ppm/Bx以上浓度的麦芽提取物。它们的上限为50.0ppm/Bx以下、优选40.0ppm/Bx以下、更优选30.0ppm/Bx以下、进一步优选20.0ppm/Bx以下左右。
此外，由于根据该方法可得到含有1.0ppm/Bx以上、优选2.0ppm/Bx以上、进一步优选3.0ppm/Bx以上的Cyclo(Phe-Phe)的麦芽提取物，故而该方法对Cyclo(Phe-Phe)的制造也有利。
实施例
以下，基于实施例来说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。此外，只要在本说明书中没有特别表述，则如下记载：浓度等为重量基准，数值范围包含其端点。
(实施例1)由植物性肽的二酮哌嗪的制造
作为植物性肽使用大豆肽及芝麻肽，在液体中进行高温高压处理来制造高浓度含有二酮哌嗪的植物提取物。具体而言，在3g大豆肽(Hinute AM、不二 制油公司制)及芝麻肽(KM-20、KISCO公司制)中分别加入15ml蒸馏水，放入高压灭菌器(TOMY精工公司制)，在135℃、0.31MPa下施加3小时的高温高压处理。此外，作为对比例，制备使用相同的肽而不进行高温高压处理的样品。将10ml处理后的液体进行50倍稀释并进行膜处理后供于LC-MS/MS，求得各种二酮哌嗪的浓度。分析条件的详细内容如下所述。此外，使用数显折光仪RX-5000a(ATAGO公司制)测定高浓度含有二酮哌嗪的植物提取物的白利度(Bx)，并计算二酮哌嗪的总量(单位：μg/100g)与白利度(Bx)的比。
(LC-MS/MS分析条件)
LC装置 SHIMADZU UFLC XR
色谱柱 Agilent technologies Zorbax SB-AQ 1.8μm 2.1×150mm
柱温 40℃
流动相 A:0.1％甲酸、B:甲醇的梯度分析
流速 总量0.2mL/分钟
进样量 2μL
检测器 AB Sciex 4000 Q-Turbo Spray(ESI)-Scheduled MRM(多反应监测)
喷嘴位置上4mm,横7mm
MRM detection window 40sec,Target Scan Time 0.5sec
[正离子模式]用Scheduled MRM进行分析
离子源部条件CUR 20.0,CAD 6,IS 5500,TEM 700,GS170,GS270
结果如表2所示(本说明书中，Cyclo(Leu-Leu)表示Cyclo(Leu-Leu)与Cyclo(Ile-Ile)的合算值)。可知通过在本发明的液体中进行高温高压处理，可简便地制造高浓度含有二酮哌嗪的植物提取物。此外，提示可使选自Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(His-Pro)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Gly-Pro)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Pro-Thr)、Cyclo(His-Phe)、Cyclo(Ala-Pro)、Cyclo(Phe-Ser)、Cyclo(Gly-Leu)、Cyclo(Gly-Phe)、Cyclo(Pro-Pro)、Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Asp-Phe)、Cyclo(Val-Pro)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Met-Pro)、Cyclo(Met-Met)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Phe-Pro)、Cyclo(Leu-Trp)、Cyclo(Phe-Trp)、Cyclo(Leu-Phe)、 Cyclo(Leu-Leu)及Cyclo(Phe-Phe)中的至少1种的二酮哌嗪增加。尤其是，高浓度含有Cyclo(Leu-Leu)及Cyclo(Leu-Phe)，且其含量在高浓度含有二酮哌嗪的植物提取物中为21.5％。
表2
(实施例2)由植物性肽的Cyclo(Phe-Phe)的制造
作为植物性肽，使用以下的肽。
1)大豆肽“Hinute AM”(不二制油公司制)：二·三肽为67％、平均分子量500
2)大豆肽“Hinute DC”(不二制油公司制)：链长3～7、平均分子量1000
3)大豆肽“Hinute HK”(不二制油公司制)
4)大米肽“ORYZA PEPTIDE”(Oryza油化公司制)：三肽为40～50％
5)小麦肽“Glutamine Peptide GP-1N”(日清PHARMA公司制)：分子量5000～10000
6)小麦肽“Glutamine Peptide GP-N”(日清PHARMA公司制)：分子量5000～10000
在3g植物性肽中分别加入15ml蒸馏水，放入高压灭菌器(TOMY精工公司制)，在132℃、0.29MPa下施加2小时的高温高压处理。将10ml处理后的液体使用OASIS MAX(Waters公司制)进行固相萃取，将所得到的固相萃取物进行减压浓缩后溶解于100μl DMSO，其中用10μl通过高效液相色谱(HPLC)求得环苯丙氨酰苯丙氨酸浓度。
结果如表3所示。肽的种类不同，环苯丙氨酰苯丙氨酸的生成程度也存在差异。与使用大米肽、小麦肽的情况相比，使用大豆肽时环苯丙氨酰苯丙氨酸高浓度生成。据此，提示优选使用分子量5000以下(尤其是分子量1000以下)的肽的比例高的大豆肽。此外，用大豆肽进行对比时，提示优选将分子量更小且大量包含二·三肽的寡肽作为原料。
表3
(实施例3)由来自植物的蛋白质的二酮哌嗪的制造
使用将来自植物的蛋白质作为原料并实施由酶进行的分解处理的物质。在来自植物的蛋白质中使用大豆蛋白质(PROLEENA 900(不二制油公司制))与大米蛋白质(Oryzaprotein P70(Oryza油化公司制))。将300mg蛋白质加入到15ml蒸馏水中。接着，添加15mg酶A(proteose Axe)、酶B(Newlase F3G；来自雪白根霉的酸性蛋白酶(内酞酶))、酶C(papainW-40；来自番木瓜的蛋白酶)、酶D(Protease A“Amano”SD；来自黑曲霉的蛋白酶)、酶E(Protease M“Amano”SD；来自黑曲霉的蛋白酶)、酶F(Protease P“Amano”3SD；来自黑曲霉的蛋白酶)、酶G(Bromelain F；来自菠萝的蛋白酶)、酶H(Peptidase R)、酶I(ThermoasePC10F；来自嗜热脂肪芽孢杆菌的蛋白酶(内酞酶))、酶J(protin SD-NY10；来自芽孢杆菌的蛋白酶)、酶K(protin SD-AY10；来自芽孢杆菌的蛋白酶)(以上均为Amano Enzyme公司制)中的任一个，在37℃下振荡混和2小时。其后，对该酶处理液不进行固液分离而进行加热处理。加热处理为用高压灭菌器(TOMY精工公司制)在132℃下进行2小时高温高压处理。此外，还制造对大豆蛋白质及大米蛋白质不进行酶处理而进行同样处理的样品。将10ml处理后的液体使用OASIS MAX(Waters公司制)进行固相萃取，将所得到的固相萃取物进行减压浓缩后溶解于100μl DMSO，其中用10μl通过高效液相色谱(HPLC)求得环苯丙氨酰苯丙氨酸浓度。
使用大豆蛋白质时的结果如图1所示，使用大米蛋白质时的结果如图2所示。即使未进行酶分解处理的样品(未)经过加热处理也生成二酮哌嗪。可知酶的种类不同，环苯丙氨酰苯丙氨酸的生成程度也存在差异，存在使用来自芽孢杆菌的蛋白酶时较多生成的趋势。
(实施例4)由植物体的二酮哌嗪的制造(1)
作为植物体，使用日本国鹿儿岛县产的一番茶茶叶(品种：茶树种、总氮：6.3％)。对于该茶叶，首先进行减少水溶性蛋白质的前处理(3次前提取)。即，相对于10g茶叶加入200g热水进行适当搅拌并进行5分钟提取。提取完成后，用140目筛过滤并回收提取残渣(茶叶渣)。相对于该茶叶渣，倒入200g热水进行5分钟提取来回收茶叶渣。回收对该茶叶渣再次进行了同样提取处理的茶叶渣。
接着，对该进行了前提取的茶叶(茶叶渣)通过酶进行分解处理。相对于茶叶渣(总量)倒入200g的50℃热水，添加1g蛋白酶(商品名：protin NY100、大和化成公司制)，一边用搅拌子搅拌(300rpm)一边在55℃的水浴内反应3小时。其后，于95℃保持30分钟使酶失活。
对该酶处理液不进行固液分离而以茶叶液体混合物的形态实施加热处理。加热处理为放入高压灭菌器(TOMY精工公司制)在135℃下由高温高压流体进行3小时的加热处理。将处理后的液体用140目筛过滤并得到茶提取物(提取物A)。关于该茶提取物(提取物A)(Bx0.99)，与实施例1同样地对提取物中的二酮哌嗪进行分析。
结果如表4所示。可知通过对茶叶(茶叶渣)在液体中进行高温高压处理，可简便地制造高浓度含有植物提取物的茶提取物，该植物提取物高浓度含有二酮哌嗪。此外，提示可使选自Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(His-Pro)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Gly-Pro)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Pro-Thr)、Cyclo(His-Phe)、Cyclo(Ala-Pro)、Cyclo(Phe-Ser)、Cyclo(Gly-Leu)、Cyclo(Gly-Phe)、Cyclo(Pro-Pro)、Cyclo(Gly-Trp)、Cyclo(Asp-Phe)、Cyclo(Val-Pro)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Met-Pro)、Cyclo(Met-Met)、Cyclo(Val-Val)、Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Trp-Tyr)、Cyclo(Phe-Pro)、Cyclo(Leu-Trp)、Cyclo(Phe-Trp)、Cyclo(Leu-Phe)、Cyclo(Leu-Leu)及Cyclo(Phe-Phe中的至少1种的二酮哌嗪增加。尤其是，高浓度含有环亮氨酰亮氨酸及环亮氨酰苯丙氨酸，且其含量在高浓度含有二酮哌嗪的植物提取物中为27.2％。对该茶提取物的风味进行感官评价时，几乎无味无臭。
表4
(实施例5)由植物体的二酮哌嗪的制造(2)
作为植物体，使用市售的水煮大豆及麦芽。对于水煮大豆及麦芽，分别与实施例4同样在相对于植物体(大豆)的干燥重量为20倍量的热水中进行了3次前提取后，进行与实施例3同样的酶处理及在液体中的高温高压处理，从而得到大豆提取物(提取物B)及麦芽提取物(提取物C)。且，基于五订数据，大豆的干燥重量换算为水煮大豆总量的36.5％。关于提取物B及提取物C，将Bx调整为1后与实施例1同样地进行提取物中二酮哌嗪的分析。结果如表5所示。可知由大豆、麦芽也可简便地制造高浓度含有二酮哌嗪的植物提取物。
表5
(实施例6)由植物体的二酮哌嗪的制造(3)
作为植物体，使用与实施例4相同的茶叶，关于前提取、酶处理、加热处理的影响进行研究。样品如表6所示。样品No.5及6表示同时通过加热处理来实施以下工序：由植物体使寡肽生成的工序与在液体中通过高温高压处理使寡肽环化来生成二肽的工序。前提取的次数为2次，除此以外与实施例4同样地进行，酶处理的反应温度变为50℃且加热处理的加热时间变为8小时，除此以外与实施例4同样地进行。与实施例1同样地使用LC-MS/MS对所得到的茶提取物(样品No.1～8)进行分析。
表6
结果如表7所示。表明不进行在液体中的高温高压处理时，无法生成二酮哌嗪(样品No.1～4)。此外，与样品No.5～8进行对比得到以下见解。
·通过进行前处理(提取处理)，所得到的茶提取物中的二酮哌嗪浓度增加。
·通过加热处理与酶处理中的任一种方法均可得到寡肽，但酶处理更为有效且高效。
通过适当使用前提取、加热处理及酶处理，可得到显著大量地包含单位Bx的二酮哌嗪的总量为900μg/100g/Bx以上的植物提取物(茶提取物)。据此，提示本发明对高浓度包含二酮哌嗪的植物提取物及其制造有利。此外，提示可得到以10μg/100g/Bx以上的浓度分别含有Cyclo(Ala-Gln)、Cyclo(His-Pro)、Cyclo(Ala-Ala)、Cyclo(Gly-Pro)、Cyclo(Ser-Tyr)、Cyclo(Pro-Thr)、Cyclo(His-Phe)、 Cyclo(Ala-Pro)、Cyclo(Phe-Ser)、Cyclo(Gly-Leu)、Cyclo(Gly-Phe)、Cyclo(Pro-Pro)、Cyclo(Asp-Phe)、Cyclo(Val-Pro)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Met-Pro)、Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)、Cyclo(Leu-Phe)及Cyclo(Leu-Leu)的植物提取物(茶提取物)。提示本发明对制造上述二酮哌嗪中的一个以上也有用。
进而，通过进行前处理、酶处理来生成Cyclo(Phe-Phe)。据此，提示根据本发明可得到单位Bx的Cyclo(Phe-Phe)含量为10μg/100g/Bx以上的植物提取物(茶提取物)。疏水性高的Cyclo(Phe-Phe)可在提取物中(水溶液中)稳定地维持。
进行样品No.5～8的香味评价时，提取物自身为不伴随以苦味为代表的味道的提取物。分别制备含有与No5.样品为相同浓度的Cyclo(Leu-Pro)、Cyclo(Phe-Pro)及Cyclo(Leu-Trp)中的1种或全部3种的水溶液来进行香味评价时，由于可显著感知到苦味，故而提示通过在茶提取物中存在从而苦味得到减少。
表7
(实施例7)由植物体的二酮哌嗪的制造(4)
由于在实施例6中确认了前提取的有用性，故而关于前提取的次数进行研究。作为植物体，使用鹿儿岛县产的一番茶茶叶(品种：茶树种、总氮：6.3％)。为了进一步提高二酮哌嗪的浓度，实施前提取的最佳次数的研究。前提取按照如下要领实施。在10g茶叶中加入200g热水适当搅拌并进行5分钟提取。提取完成后，用140目筛过滤并废弃提取液。在实施两次以上前提取的水准下，在过滤所得到的茶叶渣中再次加入200g热水重复同样的操作。这样，在实施了0次～3次前提取的茶叶(初始量10g)中倒入200g的50℃热水，添加1g酶蛋白酶(Amano Enzyme，protin NY100)，并一边用搅拌子搅拌(300rpm)一边在50℃的水浴内使其反应3小时。其后，通过在95℃下保持30分钟使酶失活。将所得到的茶叶液体混合物放入高压灭菌器(TOMY精工)，将在135℃下进行8小时高温高压处理后的液体用140目筛过滤，从而得到茶提取物。将所得到的提取液分别进行Bx测定后，与实施例1同样地使用LC-MS/MS对二酮哌嗪的浓度进行定量。
结果如表8所示。对应于前提取的次数，二酮哌嗪的生成量增加。前提取的次数与可溶性成分的去除率的关系如图3所示。可溶性成分的去除率通过式“(前提取所得到的采液量(总量)(g)×其白利度[Bx])/(反复进行10次下述操作时的采液量(g)：在相对于植物体的重量为30倍量的热水中提取10分钟×其白利度[Bx])×100(％)”进行计算。可知通过反复进行3次前提取，可去除95％以上的可溶性成分。
表8
(实施例8)由植物体的二酮哌嗪的制造(5)
由于在实施例6中确认了酶处理的有用性，故而关于酶的种类进行研究。研究的酶为如下9种。
＜样品No.9＞protin NY100：来自解淀粉芽孢杆菌的蛋白酶(内酞酶)
＜样品No.10＞Thermoase 160：来自嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热性蛋白酶(内酞酶)
＜样品No.11＞Thermoase PC10F：来自嗜热脂肪芽孢杆菌的蛋白酶(内酞酶)
＜样品No.12＞proteose Axe：来自米曲霉的中性蛋白酶
＜样品No.13＞Protease M：来自菠萝的中性蛋白酶
＜样品No.14＞Protease P：来自蜂蜜曲霉的碱性蛋白酶
＜样品No.15＞Protease A：来自米曲霉的中性蛋白酶
＜样品No.16＞Peptidase R：来自米根霉的中性蛋白酶
＜样品No.17＞NewlaseF3G：来自雪白根霉的酸性蛋白酶(内酞酶)
作为植物体，使用鹿儿岛县产的一番茶茶叶(品种：茶树种、总氮：6.3％)。在对10g茶叶实施了3次与实施例6同样的前提取所得到的茶叶渣中加入200g的55℃(涉及Thermoase160及Thermoase PC10F为70℃)热水，添加1g各种酶，并一边用搅拌子搅拌(300rpm)一边在55℃(涉及Thermoase160及Thermoase PC10F为70℃)的水浴内反应3小时。其后，通过在95℃下保持30分钟使酶失活。将所得到的茶叶液体混合物放入高压灭菌器(TOMY精工)，在135℃下实施8小时高温高压处理。将处理后的液体用140目筛过滤从而得到茶提取物。将所得到的提取液分别进行Bx测定后，与实施例1同样地通过LC-MS/MS对二酮哌嗪的浓度进行定量。
结果如表9所示。可知在使用来自细菌的酶中内酞酶活性高的酶时，二酮哌嗪的浓度显著增加。在来自细菌的酶中，使用来自枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶、来自嗜热脂肪芽孢杆菌的蛋白酶时，二酮哌嗪的生成量尤为增加。
表9
(实施例9)由植物体的二酮哌嗪的制造(6)
将相对于茶叶的酶(protin NY100)浓度变为0～20％，除此以外与实施例4 同样地制造茶提取物。在对所得到的茶提取物实施感官评价的同时，与实施例1同样地使用LC-MS/MS对表10所示的17种二酮哌嗪的含量进行定量，并求得其总量。
结果如表10所示。提示酶浓度相对于植物原料为1重量％～20重量％、优选3重量％～15重量％、更优选4重量％～10重量％的范围。此外，判断出任一种茶提取物的提取物自身也几乎没有风味，为可配合于饮食物进行利用的提取物。尤其是，对前提取、酶处理、加热处理进行组合的样品的香味优异。
表10
(实施例10)由植物体的二酮哌嗪的制造(7)
改变高温高压处理的条件，除此以外与实施例4同样地制造茶提取物。具体而言，作为植物体，使用相同量与实施例4相同的茶叶。将前提取从20倍量的水变为30倍量的水反复进行3次从而得到茶叶(茶叶渣)，与实施例4同样地进行酶处理，使用与实施例4相同的加热处理装置，在表11所示的各种加热条件下进行加热处理。与实施例1同样地对所得到的茶提取物进行提取物中二酮哌嗪的分析。
结果如表11所示。提示为了生成二酮哌嗪，需要100℃以上(优选115℃以上、更优选125℃以上)的加热。此外，提示加热时间为30分钟～10小时、优选2～8小时左右的加热。
表11
(实施例11)含二酮哌嗪饮食物的制造
在450g市售的PET绿茶饮料中按照表12各添加50g实施例4制造的茶提取物A及/或水，制备总量为500g的含二酮哌嗪茶饮料。对上述茶饮料实施香味的感官评价。评价为以苦味为中心通过综合喜好度进行判断，并通过以下五阶段进行：◎：香味非常良好、○：香味良好、△：可饮用的香味、×饮用稍微困难的香味、××：饮用非常困难的香味。
结果如表12所示。可确认每500g饮料含有0～50g实施例4的茶提取物A作为二酮哌嗪混合物的茶饮料中的任一个香味均良好。由此提示本发明所得到的茶提取物在饮料香味的配合设计中为通用性高的原材料。
表12

Claims (6)

1.一种植物提取物，其特征在于，含有环丙氨酰谷氨酰胺、环丙氨酰丙氨酸、环丝氨酰酪氨酸、环甘氨酰亮氨酸、环甘氨酰色氨酸、环缬氨酰缬氨酸、环色氨酰酪氨酸、环亮氨酰色氨酸及环苯丙氨酰苯丙氨酸，其中，环丙氨酰谷氨酰胺、环丙氨酰丙氨酸、环丝氨酰酪氨酸、环甘氨酰亮氨酸、环甘氨酰色氨酸、环缬氨酰缬氨酸、环色氨酰酪氨酸及环亮氨酰色氨酸的浓度分别为10μg/100g/Bx以上，环苯丙氨酰苯丙氨酸的浓度为230μg/100g/Bx以上，植物提取物为茶提取物、大豆提取物或麦芽提取物。
2.根据权利要求1所述的植物提取物，其特征在于，单位Bx的二酮哌嗪的总量为900μg/100g/Bx以上。
3.一种制造方法，其特征在于，包含将对来自植物的蛋白质或含有蛋白质的植物体实施酶处理而得到的植物性肽在液体中进行高温高压处理的工序，且制造高浓度含有包含环亮氨酰亮氨酸及环亮氨酰苯丙氨酸的二酮哌嗪、并且以230μg/100g/Bx以上的浓度含有环苯丙氨酰苯丙氨酸的植物提取物，所述植物和植物体为茶、大豆或麦芽。
4.根据权利要求3所述的制造方法，其特征在于，高温高压处理工序中的加热条件为在100～170℃的液体中进行30分钟～500分钟。
5.根据权利要求3或4所述的制造方法，其特征在于，植物性肽为寡肽。
6.根据权利要求3所述的制造方法，其特征在于，酶为内切型蛋白酶。
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