KR101852042B1 - 비타민 ｄ 결핍 및 관련 장애에 유용한 방법, 조성물, 용도 및 키트 - Google Patents

비타민 ｄ 결핍 및 관련 장애에 유용한 방법, 조성물, 용도 및 키트 Download PDF

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Abstract

이화작용 관련 비타민 D 결핍 및 이와 관련된 질환의 진단, 치료 및 예방 방법; 관련 조성물, 장치 및 키트가 개시된다. 상기 방법은 환자 내에서 CYP24 발현 및/또는 활성, 또는 FGF23 수준과 같은 이의 대용물을 측정하는 단계 및 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성을 이화작용 관련 비타민 D 결핍 또는 이화작용 관련 비타민 D 결핍에 대한 감수성과 관련시키는 단계를 포함한다. 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성에 대하여, 상기 방법은 비타민 D 결핍 또는 위험 환자에게 CYP24 억제제를 투여하는 단계, 및 바람직하게, 예컨대 이와 같은 환자에게 활성 비타민 D 화합물의 투여를 피함으로써, 비타민 D 결합 수용체의 활성화를 방지하는 단계를 포함한다. 임의로, 비타민 D 전호르몬 또는 프로호르몬을 투여할 수 있다.

Description

비타민 Ｄ 결핍 및 관련 장애에 유용한 방법, 조성물, 용도 및 키트{METHODS, COMPOSITIONS, USES, AND KITS USEFUL FOR VITAMIN D DEFICIENCY AND RELATED DISORDERS}
본원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2008, 4, 2자로 출원된 미국 가출원 제 61/041,898 호, 및 2009, 3, 18자로 출원된 미국 가출원 제 61/161,292 호의 우선권을 주장하며, 상기 문헌들의 전체 개시가 본원에 참조로 통합된다.
본 발명은 일반적으로 질환 및 장애의 진단 및 치료 방법, 관련 조성물 및 이를 위하여 유용한 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 이화작용 관련 비타민 D 결핍 및 이에 대한 감수성의 진단 및 치료 방법, 관련 조성물 및 키트, 및 관련 장애의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.
인간은 비타민 D를 식이 급원으로부터, 및 7-디하이드로콜레스테롤의 비타민 D3로의 자외선 의존성 전환으로부터 획득한다. 비타민 D3(또는 콜레칼시페롤) 및 비타민 D2(또는 에르고칼시페롤)는 "비타민 D"로서 총괄적으로 언급되며, 활성 비타민 D 호르몬에 대한 지용성 전구체이다. 비타민 D3 및 비타민 D2의 대사는 주로 간 내에서 일어나 25-히드록시비타민 D3 및 25-히드록시비타민 D2("비타민 D"로서 총괄적으로 언급됨)를 각각 생산하며, 이들은 각각의 활성 비타민 D 호르몬의 프로호르몬(prohormones)이다. 이들 비타민 D 프로호르몬의 추가적인 대사 활성화가 사이토크롬 P450 효소, CYP27B에 의하여 주로 신장 내에서 일어난다. CYP27B는 또한 많은 신장 외 비타민 D 표적 조직 내에서 발현되며 25-히드록시비타민 D의 국소적 활성화를 야기하여 오토크린(autocrine) 및/또는 파라크린(paracrine) 호르몬 반응을 생산할 수 있다. 구체적으로, 25-히드록시비타민 D3은 활성 호르몬 1,25-디히드록시비타민 D3(또는 칼시트리올)로 대사되고, 25-히드록시비타민 D2는 활성 호르몬 1,25-디히드록시비타민 D2로 대사된다(총괄적으로 "1,25-히드록시 비타민 D"로 본원에서 언급됨).
비타민 D 호르몬은 비타민 D 수용체(VDR)와의 상호작용을 통하여 다양한 세포 과정을 조절한다. 특히, 비타민 D 호르몬은 소장에 의한 식이 칼슘의 흡수 및 신장에 의한 칼슘의 재흡수를 조절함으로써 혈액 칼슘 수준을 조절한다. 과도한 호르몬 수준은 비정상적으로 증가된 뇨 칼슘(과칼슘뇨증), 혈액 칼슘(고칼슘혈증) 및 혈액 인(고인산혈증)을 야기할 수 있다. 반면, 비타민 D 결핍은 이차성 부갑상선기능항진증, 부갑상선 과형증, 저칼슘혈증, 만성 신장 질환(CKD), 및 낭종섬유성골염, 골연화증, 구루병, 골다공증, 및 골외석회화와 같은 대사성 골 진환과 관련이 있다. 비타민 D 호르몬은 부갑상선 호르몬계에 대한 "고전적" 효과 이상으로 많은 다양한 "비고전적" 생물학적 효과를 가지는 것으로 보고되었다. 이와 같은 효과는 레닌-앤지오텐신계, 혈압, 세포 성장 및 분화, 항섬유화, 적혈구 형성, 모발 성장 및 근기능을 포함하는, 세포 증식, 면역계 및 심혈관계와 관련하여 보고되었다.
비타민 D 프로호르몬, 호르몬 및 유사체의 이화(catabolism)는 사이토크롬 P450 효소의 작용을 통하여 달성된다. 사이토크롬 P450 효소 CYP24는 다양한 비타민 D 화합물의 이화에 있어서 첫 단계를 촉매한다. 특히, 예를 들어, CYP24는 25-히드록시비타민 D3의 24,25-디히드록시비타민 D3로의 전환 및 1,25-디히드록시비타민 D3(칼시트리올)의 1,24,25-트리히드록시비타민 D3로의 전환을 수행하여 칼시트로산을 생성한다. CYP24는 또한 23 위치에서 히드록시화하여 최종 대사 산물 1,25-디히드록시비타민 D3-26,23-락톤의 생산을 야기할 수 있다. II상 분해 촉매에 의한 추가적인 프로세싱은 최종적으로 신체로부터 비타민 D 화합물의 제거를 초래한다.
본 발명은 일반적으로 질환 및 장애의 진단 및 치료 방법, 관련 조성물 및 이를 위하여 유용한 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 이화작용 관련 비타민 D 결핍 및 이에 대한 감수성의 진단 및 치료 방법, 관련 조성물 및 키트, 및 관련 장애의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명의 일 측면은 환자 내 이화작용 관련 비타민 D 결핍에 대한 감수성의 진단 방법으로서, 예컨대 환자로부터 조직, 혈액 또는 세포 표본을 수득하고 CYP24 발현 및/또는 활성, 또는 이의 대용 지표에 대하여 상기 표본을 검사함으로써, CYP24 발현 및/또는 활성, 또는 이의 대용 지표의 환자의 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성은 이화작용 관련 비타민 D 결핍에 대한 감수성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법이다. 일 구현예에서, 상기 환자는 비타민 D 충분하고, 상기 방법은 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성에 대하여 CYP24 억제제를 상기 환자에게 투여함으로써 비타민 D 결핍을 억제 및/또는 예방하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 환자는 비타민 D 결핍이고, 상기 방법은 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성에 대하여 CYP24 억제제를 상기 환자에게 투여함으로써 비타민 D 결핍을 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 환자 내 이화작용 관련 비타민 D 결핍에 대한 감수성의 진단 방법으로서, 예컨대 환자로부터 조직, 혈액 또는 세포 표본을 수득하고 FGF23 농도에 대하여 상기 표본을 검사함으로써, 환자의 FGF23 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 비정상적으로 증가된 FGF23 농도는 이화작용 관련 비타민 D 결핍에 대한 감수성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법이다. 상기 방법은 본원에 개시된 치료 또는 예방 방법 중 어느 하나를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 환자의 CYP24 발현 및/또는 활성, 또는 이의 대용 지표를 측정하는 단계; 및 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성에 대하여 CYP24 억제제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자의 진단 및 치료 방법이다. 상기 방법은 상기 환자로부터 조직, 혈액 또는 세포 표본을 수득하고, CYP24 발현 및/또는 활성, 또는 이의 대용 지표에 대하여 상기 표본을 검사하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게, CYP24 발현 및/또는 활성, 또는 이의 대용 지표의 측정시에, 상기 환자는 활성 비타민 D 치료를 받지 않는다.
바람직하게, 상기 환자는 암을 가지지 않는 환자이다.
상기 방법은 환자의 25-히드록시비타민 D 수준을 측정하고, CYP24 억제제를 비타민 D 결핍 환자에 투여함으로써 비타민 D 결핍을 치료하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 환자에게 비타민 D 전호르몬(prehormones), 프로호르몬(prohormones), 및 이들 중 임의의 것의 유사체 중 하나 이상, 바람직하게 콜레칼시페롤, 에르고칼시페롤, 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3, 및 이의 조합으로부터 선택되는 화합물을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 치료법은 25-히드록시비타민 D3의 투여를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 치료법은 치료적으로 유효량의 25-히드록시비타민 D3를 투여하여 환자의 25-히드록시비타민 D 수준을 적어도 30 ng/mL 까지 회복시키는 것을 포함한다.
상기 방법은 환자의 25-히드록시비타민 D 수준을 측정하고, 비타민 D 충분 환자에게 CYP24 억제제를 투여함으로써 비타민 D 결핍을 억제 및/또는 예방하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 유형의 구현예에서, 상기 환자는 예컨대 1 단계 또는 2 단계로부터 선택되거나, 3 단계 또는 4 단계로부터 선택되는 만성 신장 질환을 가진다.
일 유형의 구현예에서, 상기 환자는 부갑상선기능항진증을 가진다. 예를 들어, 상기 환자의 PTH 수준은 환자의 CKD 단계에 대한 표적 범위 위이다.
일 유형의 구현예에서, 상기 환자는 1,25-디히드록시비타민 D3 결핍을 가진다.
상기 방법은 활성 비타민 D 치료를 피하거나, 또는 상기 환자가 활성 비타민 D 치료를 받고 있을 경우, 활성 비타민 D 치료 수준을 감소시키거나 이를 생략하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 25-히드록시비타민 D를 1,25-디히드록시비타민 D 수준을 증가시키기에 충분한 양으로 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 CYP24 억제제는 또한 비타민 D 수용체 작동제이다.
상기 방법은 CYP24 발현 및/또는 활성 수준의 대용으로서 환자 내 FGF23 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있고, 정상 범위의 상한값 보다 큰 FGF23 수준은 비정상적으로 증가된 CYP2 발현을 나타낸다. 예를 들어, 정상 범위의 상한값 보다 적어도 2 배, 적어도 4 배, 적어도 10 배, 또는 적어도 40 배 큰 FGF23 수준은 비정상적으로 증가된 CYP24 발현을 나타낸다.
상기 방법은 CYP24 활성의 대용으로서 혈청 또는 다른 체액 내 하나 이상의 CYP24의 이화작용 부산물의 농도를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 CYP24 활성의 대용으로서, 혈청 또는 다른 체액 내 하나 이상의 CYP24의 이화작용 부산물에 대한 하나 이상의 전구체의 농도를 측정하고, 하나 이상의 상응하는 전구체의 혈청 농도에 대한 하나 이상의 CYP24 이화작용 부산물의 농도의 비를 계산하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 CYP24의 이화작용 부산물은 24,25-디히드록시비타민 D 및 1,24-25-트리히드록시비타민 D 중 하나 또는 이들 모두를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 CYP24 활성의 측정은 25-히드록시비타민 D에 대한 24,25-디히드록시비타민 D의 비 및 1,25-디히드록시비타민 D에 대한 1,24-25-트리히드록시비타민 D의 비로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 비를 측정하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 CYP24의 이화작용 부산물은 파리칼시톨, 독세르칼시페롤, 22-옥사칼시트리올, 디하이드로타키스테롤, 및 26,26,26,27,27,27-헥사플루오로칼시트리올(팔레칼시트리올)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 24-히드록시화 및/또는 23-히드록시화 이화작용 부산물을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 CYP24 발현 및/또는 활성, 또는 이의 대용 지표의 측정에 이어 CYP24 기질을 급성 또는 만성 투여한다. 이러한 구현예에서, 바람직하게 상기 CYP24 기질은 이중 작용 억제제가 아니며 후술하는 바와 같은 VDR 작동제이다.
일 구현예에서, 하나 이상의 측정은 혈청 농도를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 CYP 발현의 측정은 조직, 혈장 또는 세포 내 CYP24 mRNA의 측정을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 CYP24 발현의 측정은 조직, 혈장 또는 세포 내 CYP24 단백질의 측정을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 CYP24 활성의 측정은 조직, 혈장 또는 세포 내 CYP24 효소 활성의 측정을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 조직 또는 세포는 신장 조직, 간 조직, 부갑상선 조직, 말초 혈액 단핵 세포, 및 구강 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 상기 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성은 정상적인 CYP24 발현 및/또는 활성에 비하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 10배, 또는 적어도 40배 증가된 것이다.
본 발명의 다른 측면은 하나 이상의 CYP24 이화작용 부산물 수준을 측정하기 위한 검사 기구, 및 본원에 개시된 방법을 실행하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 포함한다. 상기 키트는 하나 이상의 상응하는 전구체 수준을 측정하기 위한 검사 기구를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 CYP24 단백질 수준을 측정하기 위한 검사 기구, 및 본원에 개시된 방법을 실행하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 포함한다. 상기 검사 기구는 고정화된 항-CYP24 항체, 및 표지된 항-CYP24 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 유효량의 CYP24 억제제를 포함하는 비타민 D 결핍을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 제제를 포함한다. 상기 제제는 유효량의 25-히드록시비타민 D3를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 유효량의 CYP24 억제제를 포함하는 부갑상선기능항진증을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 제제를 포함한다. 상기 제제는 유효량의 25-히드록시비타민 D3를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적 제제는 만성 신장 질환, 예컨대 3 단계 또는 4 단계 만성 신장 질환에 2차적인 부갑상선기능항진증을 치료하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 비타민 D 결핍의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 CYP24 억제제를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 부갑상선기능항진증, 예를 들어 만성 신장 질환(Chronic Kidney Disease), 예컨대 3 단계 또는 4 단계 CKD에 2차적인 부갑상선기능항진증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 CYP24 억제제를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 비타민 D 결핍의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한 CYP24 억제제의 용도를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 부갑상선기능항진증, 만성 신장 질환, 예컨대 3 단계 또는 4 단계 CKD에 2차적인 부갑상선기능항진증의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한 CYP24 억제제의 용도를 포함한다.
본원에 기재된 조성물, 방법, 용도 및 키트, 이들의 성분, 성분비, 대안, 상태(예를 들어, 환자 집단의 특성)와 같은 바람직한 특징들, 및 방법 단계가 본원에 제공되는 다양한 실시예부터 선택될 수 있다.
추가적인 측면과 이점들이 도면과 함께 이하 상세한 설명을 참조로 하여 당업자에게 명백하여질 것이다. 상기 방법은 다양한 형태의 구현예를 허용하나, 이하 기재는 특정 구현예를 포함하며, 본 명세서 기재는 예시적이고 본 발명을 본원에 기재된 특정 구현예로 제한하려는 의도가 아닌 것으로 이해될 것이다.
본 발명에 의하면, 이화작용 관련 비타민 D 결핍 및 이와 관련된 질환의 진단, 치료 및 예방 방법; 관련 조성물, 장치 및 키트가 개시된다.
본 발명의 이해를 돕기 위하여, 19 개의 도면이 첨부된다.
도 1은 아데닌 풍부 식이 또는 대조 식이를 공급받는 래트 내에 시간 경과에 따른 혈청 부갑상선 호르몬(PTH) 수준의 그래프를 도시한다.
도 2는 1주일 동안 세 개의 상이한 비타민 D 화합물 처리받은 아데닌 공급 래트 내에 혈청 부갑상선 호르몬(PTH) 수준의 그래프를 도시한다.
도 3은 아데닌 공급 및 대조 식이 공급 래트 내에서, 및 세 개의 상이한 비타민 D 화합물 처리받은 아데닌 공급 동물 내에서 1,25 (OH)2-D3 (칼시트리올) 수준의 그래프를 도시한다.
도 4는 아데닌 공급 및 대조 식이 공급 래트로부터 및 세 개의 상이한 비타민 D 화합물 처리 받은 아데닌 공급 동물로부터의 신장 조직 내 CYP24 발현의 그래프를 도시한다. RFI는 상대적인 배수 유도를 나타낸다.
도 5는 아데닌 공급 및 대조 식이 공급 래트로부터 및 상이한 세 개의 비타민 D 처리 받은 아데닌 공급 동물로부터의 부갑상선 조직 내 CYP24 발현의 그래프를 도시한다.
도 6은 아데닌 공급 및 대조 식이 공급 래트 내 및 세 개의 상이한 비타민 D 화합물 처리 받은 아데닌 공급 동물 내 혈청 FGF23 수준의 그래프를 도시한다.
도 7은 아데닌 공급 및 대조 식이 공급 래트로부터의 신장 조직 내 FGF23 수준 및 오스테오칼신 수준의 그래프를 도시한다.
도 8은 2 중 동안 비타민 D (25-히드록시비타민 D2 및 25-히드록시비타민 D3) 처리 받은 래트 내 상대적인 CYP24 유도의 그래프를 도시한다.
도 9는 위약 및 (5Z,7E,16Z,23E)-(1S,3R)-25-노르-25-t-부틸설포닐-9,10-세코-5,7,10(19),16,23-콜레스타펜타엔-1,3-디올의 투여에 대한 인간 내 25-OH-D 수준 변화를 도시한다.
도 10은 정상 및 아데인 유도 요독증 래트 내 신장 조직 내 상대적인 CYP24 유도를 도시하며, CYP24의 기저 발현(베히클) 및 1,25-디히드록시비타민 D3(1α,25(OH)2D3)에 의한 CYP24의 유도 발현을 나타낸다.
도 11은 정상 및 아데인 유도 요독증 래트 내 부갑상선 조직 내 상대적인 CYP24 유도를 도시하며, CYP24의 기저 발현(베히클) 및 1,25-디히드록시비타민 D3(1α,25(OH)2D3)에 의한 CYP24의 유도 발현을 나타낸다.
도 12는 정상 래트, 아데닌 유도 요독증 래트, 및 결과적으로 비타민 D 결핍 악화된 1,25-디히드록시비타민 D3 처리 받은 아데닌 유도 요독증 래트 내 CYP24 및 CYP27B1의 상대 발현을 도시한다.
도 13은 정상 래트 대 비타민 D 결핍 식이를 공급받는 정상 래트 내에, 및 정상 식이 및 비타민 D 결핍 식이를 공급받는 아데닌 유도 요독증 래트 사이의 CYP24 및 CYP27B1의 상대 발현을 도시한다.
도 14는 1,25-디히드록시비타민 D3 단독으로 또는 CYP24 억제제와 함께 배양된 HEK 세포 내 CYP24 발현의 상대적인 유도를 도시한다.
도 15는 1,25-디히드록시비타민 D3 단독 또는 다양한 농도의 CYP24 억제제와 조합 처리된 HEK 세포 내 3H-티미딘 혼입(%)를 도시한다.
도 16은 1,25 디히드록시비타민 D3 단독 또는 FGF23과 조합 처리된 HPK1a-ras 세포 내 CYP24의 상대적인 발현을 도시한다.
도 17은 정상 래트 대 비타민 D 결핍 식이 공급 정상 래트, 및 다양한 농도의 25-히드록시비타민 D3 처리 받은 비타민 D 결핍 식이 공급 정상 래트 내에 CYP24의 상대적인 유도를 도시한다.
도 18은 아데닌 보충된 정상 식이(아데닌 베히클) 대 아데닌 보충된 비타민 D 결핍 식이 공급 래트 대 아데닌 보충된 비타민 D 결핍 식이를 공급받고 다양한 농도의 25-히드록시비타민 D3 처리 받은 래트 내에 CYP24의 상대적인 유도를 도시한다.
도 19는 요독증 비타민 D 결핍 래트 대 그렇지 않으면 정상적일 비타민 D 결핍 래트 내에서 1,25-디히드록시비타민 D3 농도에 대한 25-히드록시비타민 D3의 영향을 도시한다.
"비타민 결핍"은 일반적으로 혈청 25-히드록시비타민 D 수준이 30 ng/mL 이하인 인간 환자 또는 기타 포유류 내 상태로 정의된다 (National Kidney Foundation guidelines, NKF, Am. J. Kidney Dis. 42:S1-S202 (2003) 참조, 본원에 참조로 통합됨). "비타민 결핍"은 16 ng/mL 이상 30 ng/mL 미만의 혈청 25-히드록시비타민 D로 정의되는 "비타민 D 불충분" 및 5-15 ng/mL의 혈청 25-히드록시비타민 D로 정의되는 "가벼운" 비타민 D 결핍, 및 5 ng/mL 이하의 혈청 25-히드록시비타민 D로 정의되는 "심각한" 비타민 D 결핍을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "비타민 D 충분"은 혈청 25-히드록시비타민 D 수준이 30 ng/mL 이상인 인간 환자 또는 기타 포유류 내 상태로서 정의된다.
본원에 사용되는 용어 "위험에 있는"은 일반적으로 비타민 D 결핍과 관련된 특성 또는 질환을 가지는 환자 집단을 의미한다. 특정 예는, 이에 제한되지 않으나, 1, 2, 3, 4 또는 5 단계 만성 신장 질환을 가지는 대상; 비타민 D 강화 우유를 마시지 않는 유아, 어린이 및 성인(예를 들어, 락토오스 내성 대상, 우유 알레르기를 가지는 대상, 우유를 마시지 않는 채식주의자, 및 모유 공급받는 유아); 구루병을 가지는 대상; 검은 피부를 가지는 대상(예를 들어, 백인 여성의 4%와 비교하여, 미국 내 15 내지 49세 아프리카계 미국인 여성의 42%가 비타민 D 결핍이었다); 노령자(감소된 비타민 D 합성 능력을 가지고 또한 실내에 머무는 경향이 있는 사람); 만성 또는 급성의 심각한 병을 가지는 성인(알츠하이머병 또는 정신병을 가지는 대상을 포함하는, 실내, 병원, 집중 케어 시설, 기관의 및 케어 보조 시설에 머무는 경향이 있는 사람); 노출되는 피부를 모두 덮는 대상(예를 들어, 특정 종교 또는 문화의 일원); 자외선 차단제를 항상 사용하는 대상(예를 들어, 자외선 차단 지수 8의 자외선 차단제의 적용은 비타민 D 생산을 95% 감소시키고, 더 높은 SPF 값은 비타민 D를 더욱 감소시킬 것이다); 지방흡수불량증후군을 가지는 대상(이에 제한되지 않으나, 낭포성 섬유증, 담즙 저류성 간 질환, 기타 간 질환, 담낭 질환, 췌장 효소 결핍, 크론병, 염증성 장 질환, 스프루우 또는 셀리악병, 또는 위 및/또는 장 일부 또는 전부의 외과적 절제를 포함함); 염증성 장 질환을 가지는 대상; 크론병을 가지는 대상; 소장 절제술을 받은 대상; 잇몸 질환을 가지는 대상; 페니토인, 포스페니토인, 페노바르비탈, 카르바마제핀, 및 리팜핀을 포함하는 비타민 D의 이화작용을 증가시키는 약을 복용하는 대상; 콜레스티라민, 콜레스티폴, 오르리스타트, 미네랄유 및 지방 대체물을 포함하는 비타민 D 흡수를 감소시키는 약을 복용하는 대상; 케토코나졸을 포함하는 비타민 D 활성을 저해하는 약을 복용하는 대상; 코르티코스테로이드를 포함하는 칼슘 흡수를 감소시키는 약을 복용하는 대상; 비만, 당뇨병, 인슐린 저항성 증후군, 내피 기능장애를 가지는 대상(체지방 저장소 내 축적되는 비타민 D는 생체이용률이 낮음); 골다공증을 가지는 대상; 폐경기후 여성; 심혈관 질환, 죽상동맥경화증 및/또는 심부전을 가지는 대상; 및/또는 위독한 입원 환자를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 환자는 암을 가지지 않는다. "암"은 비조절된 증식, 불멸의 상태, 전이능, 빠른 성장 및 증식 속도, 및 특정 특징적인 형태학적 특징과 같은 암 유발 세포에 전형적인 특징을 가지는 세포의 존재를 의미한다. 종종, 암 세포는 종양의 형태이나, 이와 같은 세포는 인간 또는 동물 내에 단독으로 존재하거나 또는 백혈병 세포와 같이 비-종양성 암 세포일 수 있다. 암은 이에 제한되지 않으나 유방암, 폐암, 기관지암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 위암, 난소암, 방광암, 뇌 또는 중추신경계암, 말초신경계암, 식도암, 자궁경부암, 흑색종, 자궁 또는 자궁내막암, 구강 또는 인두 암, 간암, 신장암, 고환암, 담관암, 소장 또는 맹장암, 타액선암, 갑상선암, 부신암, 골육종 및 연골육종을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "부갑상선기능항진증"은 일차성 부갑상선기능항진증, 이차성 부갑상선기능항진증, 만성 신장 질환(3, 4 또는 5 단계)에 2차적인 부갑상선기능항진증 및 비타민 D 결핍에 2차적인 부갑상선기능항진증 중 하나 이상을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "대상" 및 "환자"는 일반적으로 인간, 포유류(예를 들어, 개, 고양이, 설치류, 양, 말, 소, 염소), 수의학적 동물, 동물원 동물, 바람직하게 인간을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "CYP24 발현 및/또는 활성"은 일반적으로 CYP24 mRNA를 생산하기 위한 전사, CYP24 단백질 생산을 위한 번역, 및 CYP24 단백질 생산을 위한 전사 및 번역의 조합, 및 직접적으로 또는 CYP24 기질에 대한 CYP24 생성물의 비를 계산함에 의한 CYP24 효소의 활성을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "비타민 D 화합물"은 일반적으로 비타민 D 전호르몬(prehormones)(예를 들어, 콜레칼시페롤 및 에르고칼시페롤), 비타민 D 프로호르몬(prohomones)(예를 들어, 1α-히드록시비타민 D3, 1α-히드록시비타민 D3, 25-히드록시비타민 D3, 및 25-히드록시비타민 D2), 활성 비타민 D 호르몬, 이의 유사체, 및 이들의 조합을 포함한다. 특정 예는, 이에 제한되지 않으나, 비타민 D3(콜레칼시페롤), 비타민 D2(에르고칼시페롤), 25-히드록시비타민 D3, 25-히드록시비타민 D2, 1α,25-디히드록시비타민 D3, 1α,25-디히드록시비타민 D2, 1α,25-디히드록시비타민 D4, 및 1,25-디히드록시-19-노르-비타민 D2, 22-옥사칼시트리올, 디히드로타키스테롤, 및 26,26,26,27,27,27-헥사플루오로칼시트리올(팔레칼시트리올)을 포함하는 비타민 D 유사체(모든 히드록시 및 디히드록시 형태를 포함함)를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "활성 비타민 D" 및 "활성화된 비타민 D"는 적어도 1α 위치에서 히드록시화된 비타민 D 화합물을 의미한다. 활성 비타민 D 화합물은 칼시트리올, 1,25-디히드록시비타민 D2, 알파칼시돌, 독세르칼시페롤, 22-옥사칼시트리올 및 파리칼시톨을 포함한다.
본원에 사용되는 문구 "치료적 유효량"은 본 발명의 구현에 적절하고, 원하는 치료 계획에 따라 투여시 원하는 치료 또는 예방 효과를 유발할 치료 또는 예방약(예를 들어, CYP24 억제제 또는 이중 작용 CYP24 억제제 및 VDR 작동제)의 양을 의미한다. 보다 구체적으로, "치료적 유효량"은 관련된 상태, 예를 들어 비타민 D 결핍의 발생의 예방, 제거, 수정, 또는 진행 지연에 효과적인 양을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은 특히 본원에 제공되는 상세한 설명의 견지에서 당업자의 능력 범위 내이다.
"치료적 유효 투여량"은 원하는 효과를 달성하도록 하는 활성 성분의 양이다. 이러한 활성 성분의 독성 및 치료적 유효성은 세포 배양액 또는 실험 동물 내에서 표준 약학적 절차에 의하여 결정될 수 있다; 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치사 투여량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유효한 투여량)을 결정한다. 독성 및 치료적 효과 사이의 투여 비율이 치료 지수이며, 이는 LD50과 ED50의 비로서 표현된다. 높은 치료 지수가 바람직하다. 얻어진 데이터를 인간 내 사용하기 위한 다양한 투여량의 제제화에 이용할 수 있다. 활성 성분의 투여량은 바람직하게 독성이 거의 없거나 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 변화할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "포함하는"은 명시된 것 이외에 다른 제제, 요소, 단계 또는 특징이 포함될 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 일 측면은 이화작용 관련 비타민 D 결핍의 진단 방법을 제공한다. 상기 방법은 비타민 D 결핍 환자 내에서 CYP24 발현 및/또는 활성을 측정하는 단계 및 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성을 이화작용 관련 비타민 D 결핍과 관련시키는 단계를 포함한다. 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성에 대하여, 상기 방법은 CYP24 억제제를 비타민 D 결핍 환자에 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 이화작용 관련 비타민 D 결핍에 대한 감수성을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자 내에서 CYP24 발현 및/또는 활성을 측정하는 단계 및 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성을 이화작용 관련 비타민 D 결핍에 대한 감수성과 관련시키는 단계를 포함한다. 비타민 D 결핍 환자 내에서 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성에 대하여, 상기 방법은 CYP24 억제제를 비타민 D 결핍 환자에 투여함으로써 비타민 D 결핍을 억제 및/또는 예방하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 비타민 D 결핍 환자 내에서 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성에 대하여, 상기 방법은 CYP24 억제제를 비타민 D 결핍 환자에 투여함으로써 비타민 D 결핍을 치료하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 비타민 D 결핍 및/또는 부갑상선기능항진증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자 내에서 CYP24 발현 및/또는 활성, 또는 이의 대용물을 측정하는 단계, 및 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성에 대하여 환자에게 CYP24 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성을 가지는 비타민 D 결핍 환자에게 CYP24 억제제를 투여함으로써 비타민 D 결핍을 치료하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성을 가지는 비타민 D 풍부 환자에게 CYP24 억제제를 투여함으로써 비타민 D 결핍을 억제 및/또는 예방하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성을 가지는 환자에게 CYP24 억제제를 투여함으로써 부갑상선기능항진증을 억제 및/또는 예방하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성을 가지는 환자에게 CYP24 억제제를 투여함으로써 1,25-디히드록시비타민 D 결핍을 억제 및/또는 예방하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 환자 내 비타민 D 결핍의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자 내에 CYP24 발현 및/또는 활성을 측정하는 단계 및 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성에 대하여 환자에게 CYP24 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은, 예컨대 활성 비타민 D 화합물의 투여를 감소, 방지(생략), 또는 중단함에 의하여 외부 영향에 의한 비타민 D 결합 수용체 (VDR)의 활성화를 감소, 방지(생략) 또는 중단시킴으로써, 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성에 대하여 환자 내에 증가된 CYP24 수준 및 비타민 D 결핍의 악화를 방지하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법은 환자에게 25-히드록시비타민 D(예를 들어, 25-히드록시비타민 D3)을 투여하는 것과 같은 환자에 비타민 D 보충제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 환자 내 무손상 부갑상선 호르몬(PTH) 수준 및 25-히드록시비타민 D 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 환자는 비정상적으로 증가된 PTH 수준 및 정상적 25-히드록시비타민 D 수준을 가진다. 다른 구현예에서, 상기 환자는 비정상적으로 증가된 PTH 수준 및 비정상적으로 감소된 25-히드록시비타민 D 수준(예를 들어 비타민 D 결핍)을 가진다. 다른 구현예에서, 상기 환자는 정상적인 PTH 수준 및 비정상적으로 감소된 25-히드록시비타민 D 수준을 가진다. 상기 방법은 환자 내 사구체 여과율(GFR)을 측정하여 만성 신장 질환의 단계를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 환자는 1-5 단계로부터 선택되는 CKD를 가질 것이다. 다른 구현예에서, 상기 환자는 1 및 2 단계로부터 선택되는 CKD를 가질 것이다. 다른 구현예에서, 상기 환자는 3 및 4 단계로부터 선택되는 CKD를 가질 것이다.
본 발명의 일 구현예는 환자 내 섬유아세포 증식인자-23(FGF23)의 수준을 측정함으로써 CYP24 활성을 측정하는 것을 제공한다. 다른 구현예는 하나 이상의 CYP24의 이화작용 부산물(이에 제한되지 않으나, 24,25-디히드록시비타민 D3, 25-히드록시비타민 D3-26,23-락톤, 1,24,25-트리히드록시비타민 D3, 24,25-디히드록시비타민 D2, 또는 1,24,25-트리히드록시비타민 D2 또는 칼시트로산 또는 1,25-(OH)2D3-26,23-락톤을 포함하는 비타민 D3 대사 산물에 대한 CYP24 활성의 최종 산물을 포함함)의 수준을 측정함으로써 CYP24 발현 및/또는 활성을 측정하는 것을 제공한다. 다른 구현예는 하나 이상의 상응하는 전구체에 대한 하나 이상의 CYP24의 이화작용 부산물의 비(예를 들어, 25-히드록시비타민 D에 대한 24,25-디히드록시비타민의 비, 또는 1,25-디히드록시비타민에 대한 1,24,25-트리히드록시비타민의 비)를 측정함으로써 CYP24 활성을 측정하는 것을 제공한다. 또 다른 구현예는 환자 내 CYP24 mRNA 수준, 환자 내 CYP24 단백질 수준, 및/또는 환자 내 CYP24 효소 활성 수준을 측정함으로써 CYP24 발현을 측정하는 것을 제공한다. 다른 구현예는 도입되고(예를 들어 주입에 의하여), CYP24에 의하여 대사된 다음, 측정될 수 있는 다른 CYP24 기질의 CYP24 대사 산물을 측정함으로써 CYP24 활성을 측정하는 것을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 이화작용 관련 비타민 D 결핍 진단용 키트를 제공한다. 일 구현예에서, 상기 키트는 CYP24 mRNA, 단백질 또는 효소 활성 측정을 위한 검사 또는 다른 기구, 및 예컨대 본원에 개시된 방법에 따른 사용을 위한 설명서를 포함한다.
본원에 개시된 진단 키트 및 방법은 달리 기재하지 않는 한 이하 추가적으로 기재될 (도면에 도시되는 것들을 포함하는) 부가적인 임의적 요소, 특징, 및 단계들의 하나 이상의 임의의 조합을 포함하는 구현예를 포함하는 것으로 간주된다.
또한, 본원에 인용된 임의의 수치는 하한값으로부터 상한값까지 모든 값을 포함하는 것으로 이해된다; 즉, 열거된 최저값과 최고값 사이의 수치의 모든 가능한 조합이 본원에 명확히 기재된 것으로 간주된다. 예를 들어, 농도 범위 또는 유리한 효과 범위가 1% 내지 50%로 기재되는 경우, 2% 내지 40%, 10% 내지 30%, 또는 1% 내지 3%와 같은 값이 본원 명세서에 명확히 열거되어 있는 것으로 의도된다. 이들은 특히 의도되는 실시예에 불과하다.
일 측면에서, 본 발명은 이화작용 관련 비타민 D 결핍의 진단 방법을 제공한다. 상기 방법은 비타민 D 결핍 환자 내에서CYP24 발현 및/또는 활성을 측정하는 단계 및 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성을 이화작용 관련 비타민 D 결핍과 관련시키는 단계를 포함한다. 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성에 대하여, 상기 방법은 비타민 D 결핍 환자에게 CYP24 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 이화작용 관련 비타민 D 결핍에 대한 감수성의 진단 방법을 제공한다. 상기 방법은 비타민 D 결핍 환자 내에서CYP24 발현 및/또는 활성을 측정하는 단계 및 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성을 이화작용 관련 비타민 D 결핍에 대한 감수성과 관련시키는 단계를 포함한다. 비타민 D 풍부 환자 내에 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성에 대하여, 상기 방법은 상기 비타민 D 풍부 환자에게 CYP24 억제제를 투여함으로써 비타민 D 결핍을 억제 및/또는 예방하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 비타민 D 결핍 환자 내에 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성에 대하여, 상기 방법은 상기 비타민 D 결핍 환자에게 CYP24 억제제를 투여함으로써 비타민 D 결핍을 치료하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 비타민 D 결핍 및/또는 부갑상선기능항진증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자 내에서 CYP24 발현 및/또는 활성, 또는 이의 대용물을 측정하는 단계, 및 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성에 대하여 상기 환자에 CYP24 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성을 가지는 비타민 D 결핍 환자에게 CYP24 억제제를 투여함으로써 비타민 D 결핍을 치료하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성을 가지는 비타민 D 풍부 환자에게 CYP24 억제제를 투여함으로써 비타민 D 결핍을 억제 및/또는 예방하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성을 가지는 환자에게 CYP24 억제제를 투여함으로써 부갑상선기능항진증을 억제 및/또는 예방하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성을 가지는 환자에게 CYP24 억제제를 투여함으로써 1,25-디히드록시비타민 D 결핍을 억제 및/또는 예방하는 것을 포함할 수 있다.
비타민 D 결핍은 이차성 부갑상선기능항진증, 부갑상선 증식, 저칼슘혈증, 건선, 만성 신장 질환(CKD), 및 골성 불완전 섬유 생성증, 낭종섬유성골염, 골연화증, 구루병, 골다공증, 골감소증, 골경화증, 신성골이영양증, 골외석회화와 같은 대사성 골 질환을 포함하는 다수의 부가적인 질환 및 장애와 관련이 있다. 본 발명에 따른 방법은 또한 비타민 D 결핍과 관련된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 유용하다.
현재 CKD 환자 케어의 표준은 환자의 PTH 및 25-히드록시비타민 D 수준을 측정하여야 한다고 기재한다. 3 단계 및 4 단계 환자에서, 혈장 무손상 부갑상선 (PTH) 수준이 증가되고(예를 들어, CKD 단계에 대한 표적 범위 위) 25-히드록시비타민 D 가 감소된(<30 ng/ml) 경우, 환자를 비타민 D2 보충물(에르고칼시페롤)로 처리한다. 만성 신장 질환에서 골 대사 및 질환에 대한 국립 신장 재단 K/DOQI 임상 시험 지침, Am J Kidney Dis 42:S1-S202, 2003 (Suppl 3)의 "Guidline 7: Prevention And Treatment Of Vitamin D Insufficiency And Vitamin D Deficiency In People With CKD (Algorithm 1)"을 참고하며, 상기 문헌은 본원에 참조로 통합된다. CKD 3 단계의 경우 (GFR 범위 30-59 ml/min/1.73m2), 표적 PTH 수준은 35-70 pg/ml (3.85-7.7 pmol/L)이다. CKD 4 단계의 경우 (GFR 범위 15-29 ml/min/1.73m2), 표적 PTH 수준은 70-110 pg/ml (7.7-12.1 pmol/L)이다.
한편, PHT 수준이 CKD 단계의 표적 범위 위이고 25-히드록시비타민 D의 혈청 수준이 >30 ng/ml이면, 환자를 활성 비타민 D 호르몬(예를 들어, 칼시트리올, 알카칼시돌 또는 독세르칼시페롤)로 처리한다. 만성 신장 질환에서 골 대사 및 질환에 대한 국립 신장 재단 K/DOQI 임상 시험 지침, Am J Kidney Dis 42:S1-S202, 2003 (Suppl 3)의 "Guideline 8A: Active Vitamin D Therapy In Stages 3 And 4 CKD (Algorithm 2)"를 참조하며, 상기 문헌은 본원에 참조로 통합된다.
특정 이론에 구애받고자 하는 의도 없이, 도 12는 25-히드록시비타민 D 수준이 정상이면, 활성 비타민 D 호르몬으로 처리하면 CYP24 수준이 증가하며 따라서 PHT 수준이 감소됨에도 불구하고 비타민 D 결핍을 악화시킬 것임을 보인다. 만성 신장 질환 및 증가된 PTH 수준을 가지는 환자에서는, (a) CYP24 억제제를 사용 및/또는 (b) 증가된 CYP24 수준 및 비타민 D 결핍의 추가적인 악화를 방지함에 의하여 CYP24 과잉 활성을 다루어야 한다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 환자 내에 만성 신장 질환(바람직하게 3 및 4 단계)에 2차적인 부갑상선기능항진증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자 내 CYP24 발현 및/또는 활성을 측정하는 단계, 및 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성에 대하여 환자에게 CYP24 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 바람직하게, 활성 비타민 D 투여를 피함으로써, 존재한다면, 증가된 CYP24 수준 및 비타민 D 결핍의 악화를 방지하는 것을 추가로 포함한다. 상기 방법은 비타민 D 보충물, 바람직하게 25-히드록시비타민 D(예를 들어, 25-히드록시비타민 D3)를 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 환자 내 25-히드록시비타민 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 환자는 비정상적으로 증가된 PTH 수준 및 정상적인 25-히드록시비타민 D 수준을 가진다. 다른 구현예에서, 환자는 비정상적으로 증가된 PTH 수준 및 비정상적으로 감소된 25-히드록시비타민 D 수준을 가진다. 또 다른 구현예에서, 환자는 정상적인 PTH 수준 및 비정상적으로 감소된 25-히드록시비타민 D 수준을 가진다. 상기 방법은 환자 내 사구체 여과율(GFR)을 측정하여 만성 신장 질환의 단계를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 임의의 특정 이론에 구애받고자 하는 의도 없이, FGF23 수준을 CYP24 발현 및/또는 활성의 대용물로서 이용한다. 다른 구현예에서, 임의의 특정 이론에 구애받고자 하는 의도 없이, 증가된 FGF23 자체가 특정 야기 메커니즘과 무관하게(CYP24에 의한 이화작용을 통해서든 아니든) 비타민 D 결핍에 대한 감수성에 대한 마커이다. 환자로부터 얻어진 생물학적 표본 내 FGF23 수준은 당업자에게 공지된 다양한 기법에 의하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 무손상 FGF-23(iFGF23) 및 중앙 C-말단 FGF-23(cFGF23)의 농도를 IMMUTOPICS(San Clemente, CA, USA)로부터 구할 수 있는 ELISA 키트를 이용하여 측정할 수 있다. 상기한 것들의 측정은 바람직하게 혈청 농도로서 수행되나, 농도는 혈장, 혈청 또는 기타 체액(예를 들어, 타액) 또는 조직 내에서 측정될 수 있다. 정상적인 iFGF23 수준은 건강한 성인의 경우 0 내지 90 pg/mL 범위이다(Fliser et al. J. Am. Soc. Nephrol. 18:2601-2608 (2007), Ibrahim et al. Int. Urol. Nephrol. 41(1):163-169 (2009)). 정상적인 cFGF23 수준은 건강한 성인의 경우 0 내지 85 참조 단위(RU)/mL이다(Tebbin et al. Mayo Clin. Proc. 80(6):745-751 (2005)). 정상 범위의 상한값보다 큰 FGF23 수준은 비정상적으로 증가된 CYP24 발현을 나타낸다. FGF23 수준이 정상 범위의 상한에서 멀어질수록, 비정상적으로 증가된 CYP24 발현에 대한 상관관계가 커진다. 본원에 기재된 방법에 따라 증가된 FGF23는 정상의 적어도 2배, 예를 들어, 3배, 4배, 5배, 10배, 50배, 100배 또는 1000배일 것이다.
다른 구현예에서, CYP24 활성은 하나 이상의 CYP24의 이화작용 부산물의 수준을 측정함으로써 측정된다. 환자로부터 얻어진 생물학적 표본 내 CYP24의 이화작용 부산물 수준은 당업자에게 공지된 다양한 기법에 의하여 측정될 수 있다. 예를 들어, CYP24 이화작용 부산물을 효소결합면역흡착검사(ELISAs), 방사면역측정법(RIAs), 면역 형광 검사 등과 같은 면역검사법에 의하여 측정할 수 있다. 25-히드록시비타민 D3-26,23-락톤 또는 1,25-디히드록시비타민 D3-26,23-락톤과 같은 CYP24 부산물 측정에 대한 다른 접근법은 비타민 D 결합 단백질(DBP) 또는 비타민 D 수용체와 같은 천연 비타민 D 결합 단백질에 대한 높은 친화성의 이점을 이용할 것이다. 이러한 단백질은 또한 이와 같은 비타민 D 산물에 대한 더 큰 친화도 또는 선택도를 가지도록 당업자에게 공지된 방법에 의하여 변경될 수 있다. 관심의 비타민 D 대사산물에 대한 친화성을 가지는 합성 항체 또는 단백질을 또한 파아지 디스플레이 또는 효모 디스플레이와 같은 기법을 이용하여 생성할 수 있으며, 비타민 D 대사산물 및 CYP24 이화작용 부산물 농도의 측정을 위해 키트 내로 통합할 수 있다. CYP24 이화작용 부산물을 측정하기 위한 다른 기법은 자외선-가시광선분광법, 형광분광법, 질량분광법 등과 함께 고속액체크로마토그래피를 포함한다. CYP24 활성은 또한 하나 이상의 상응하는 전구체에 대한 하나 이상의 CYP24의 이화작용 부산물의 비를 측정함으로써 측정할 수 있다. CYP24 이화작용 부산물은 24-히드록시화된 천연 및 합성 비타민 D를 포함한다. 천연 CYP24 이화작용 부산물의 예는 24,25-디히드록시비타민 D3, 1,24,25-트리히드록시비타민 D3, 24,25-디히드록시비타민 D2, 및 1,24,25-트리히드록시비타민 D2를 포함한다. CYP24의 추가적인 부산물은 25-히드록시비타민 D3-26,23-락톤 또는 1,25-디히드록시비타민 D3-26,23-락톤과 같이 23-히드록시화될 수 있다. CYP24 이화작용 부산물의 추가적인 예는 합성 비타민 D 화합물의 24-히드록시화에 의하여 얻어진 산물을 포함한다. 합성 비타민 D는 파리칼시톨(ZEMPLAR®), 독세르칼시페롤(HECTOROL®), 22-옥사칼시트리올, 알파칼시돌 및 26,26,26,27,27,27-헥사플루오로칼시트리올(팔레칼시트리올)을 포함한다. 전술한 것들의 측정은 바람직하게 혈청 농도로서 수행되나, 농도는 혈청 또는다른 체액(예를 들어, 타액) 내에서 측정될 수 있다. 측정은 CYP24 기질의 급성 또는 만성 투여 후 수행될 수 있다.
CYP24 이화작용 부산물의 상응하는 전구체는 예를 들어 25-히드록시비타민 D3, 1,25-디히드록시비타민 D3, 25-히드록시비타민 D2, 및 1,25-디히드록시비타민 D2을 포함한다. 상응하는 전구체 화합물의 수준은 CYP24 이화작용 부산물과 함께 측정할 수 있으며, 하나 이상의 상응하는 전구체에 대한 하나 이상의 CYP24 이화작용 부산물의 비를 이용하여 CYP24 활성 값을 얻을 수 있다. 예를 들어, 25-히드록시비타민 D에 대항 24, 25-디히드록시비타민의 비 및 1,25-디히드록시비타민 D에 대한 1,24,25-트리히드록시비타민의 비를 포함하는 비를 측정할 수 있으며 CYP24 활성을 얻는데에 이용할 수 있다. 전술한 것들의 측정은 바람직하게 혈청 농도로서 수행되나, 농도는 혈청 또는 다른 체액(예를 들어, 타액) 내에서도 측정될 수 있다. 측정은 CYP24 기질의 급성 또는 만성 투여 후 수행될 수 있다.
다른 구현예에서, CYP24 발현은 환자 내 CYP24 mRNA 수준을 측정함으로써 결정된다. 환자로부터 얻은 생물학적 표본 내 mRNA의 수준은 당업자에게 공지된 다양한 기법에 의하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 노던 블로팅에서, mRNA 수준은 방사성동위원소로 또는 형광 표지된 프로브를 전기영동에 의하여 분리되었고/거나 막 또는 기타 고체 지지체에 결합된 mRNA 표본과 하이브리다이즈함으로써 정량될 수 있다. DNA 마이크로어레이 기법은 mRNA 수준을 정량할 수 있는 다른 수단을 제공하며, 이에 따라 형광 표지된 mRNA 표본을 소정 패턴으로 고체 지지체에 부착되어 있는 수만 내지 수십만의 DNA 올리고뉴클레오티드와 하이브리다이즈되도록 한다. 신호 증폭을 제공하는 기법은 저수준의 mRNA가 존재할 경우 특히 유용하다. 예를 들어, 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)은 표적 mRNA를 상응하는 DNA 분자로 전환한 후 중합효소연쇄반응을 통하여 증폭시킴으로써 mRNA 정량을 제공한다. 형광 표지된 프라이머를 사용함으로써, mRNA 수준을 증폭 과정 중 실시간 모니터링할 수 있다.
다른 구현예에서, CYP24 발현은 환자 내 CYP24 단백질 수준을 측정함으로써 측정된다. 환자로부터 얻어진 생물학적 표본 내 단백질 수준은 당업자에게 공지된 다양한 기법에 의하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블로팅에서, 표적 단백질에 특이적인 항체의 전기영동에 의하여 분리되었고/거나 막 또는 기타 고체 지지체에 결합된 단백질 표본과의 결합을 검출함으로써 단백질 수준을 정량할 수 있다. 특정 항체의 표적 항원(예를 들어, CYP24)에의 결합에 의존하는 검사는 다양한 형태를 취하 수 있으며, 웨스턴 블로팅(면역블로팅) 외에, 그러한 검사의 예는 효소결합면역흡착검사(ELISAs), 방사면역측정법(RIAs), 면역형광검사 등을 포함한다. 단백질 수준 또한 임의로 다양한 분리 기법과 결합된 다양한 염색 및 분광 검출법에 의하여 측정될 수 있다. 검출 기법의 예는 쿠마시 염색, 은 염색, 적외-가시분광법, 형광분광법, 질량분광법 등을 포함한다. 이러한 검출 기법은 전기영동, 모세관 전기이동, 고속액체크로마토그래피(HPLC), 고속단백질액체크로마토그래피(FPLC), 박막크로마토그래피(TLC), 유전자 정량을 위한 Luminex®xMAP® 다중화 기법 등과 같은 분리 기법과 결합될 수 있다.
또 다른 구현예에서, CYP24 활성은 환자 내 CYP24 효소 활성 수준을 측정함으로써 측정된다. 환자로부터 얻어진 생물학적 표본 내 효소 활성 수준은 당업자에게 공지된 다양한 기법에 의하여 측정될 수 있다. CYP24의 경우, 25-히드록시비타민 D3의 상응하는 24-히드록시화 산물로의 전환을 측정함으로써 효소 활성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 환자로부터의 생물학적 표본을 방사성동위원소 표지된 25-히드록시비타민 D3 기질과 함께 배양하고, 반응 생성물을 HPLC에 의하여 분리하고, 전체 방사능과 비교하여 24, 25-디히드록시비타민 D3 피크의 방사능을 측정함으로써 25-히드록시비타민 D3의 24,25-디히드록시비타민 D3로의 전환을 측정할 수 있다
일 측면에서, CYP24 발현 및/또는 비타민 D 결핍 또는 비타민 D 풍부 환자의 활성은 조직, 혈장 및 세포 중 하나 내에서 측정될 수 있다. CYP24 발현 및/또는 활성은 조직 생검에 의하여 얻어진 조직 내에서 측정될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 피부 조직, 신장 조직, 간 조직, 부갑상선 조직 등과 같은 조직을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 신장 조직이 바람직하다. 다른 구현예에서, 부갑상선 조직이 바람직하다. CYP24 발현 및/또는 활성은 또한 말초혈액단핵세포와 같은 혈액으로부터 얻어진 세포, 및 구강 세포와 같은 조직 표본으로부터 얻어진 세포를 포함하는 세포 내에서 측정될 수 있다. 본원의 방법의 일 구현예에서, CYP24 발현 및/또는 활성은, 종양 성장에서 일어날 수 있는 과도활성의 조직 기반 측정에 우선하여 전신 지표(예를 들어, 말초혈액단핵세포 또는 혈청)에 의하여 측정된다.
일 측면에서, CYP24 발현 및/또는 활성이 비정상적으로 증가된다. CYP24 발현 및/또는 활성의 정상적인 수준은 CYP24 mRNA가 준비되고 참조로서 사용된 50~100명의 정상적인 기증자로부터의 CYP24 발현 및/또는 활성의 평균값에 근거하여 측정된 1 상대 단위(RU)로서 정의된다.
CYP24의 기저 수준을 예컨대 성, 민족성 및/또는 연령에 근거하여 다양한 인구 군으로부터의 정상적인 개체 내에서 수집된 표본(예를 들어, 신장, 피부, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 구강 조직)으로부터 설정할 수 있다. CYP24 RNA 수준은 실시간 PCR, Luminex®xMAP® 다중화 기법 또는 다른 기법에 의하여 조직(예를 들어, 신장 또는 피부 생검) 또는 세포(예를 들어, 구강 조직)으로부터 설정될 수 있다. CYP24 단백질 수준은 Luminex®xMAP® 다중화 기법 및 웨스턴 블로팅과 같은 기법을 이용하여 상기 조직 내에서 측정될 것이다. CYP24 RNA 수준 또는 CYP24 단백질 수준에 대한 평균값을 1 RU로서 기록한다.
24,25-디히드록시비타민 D3, 1,24,25-트리히드록시비타민 D3 또는 락톤과 같은 24-히드록시화 천연 및 합성 비타민 D의 정상적인 수준을 HPLC, 기체크로마토그래피, 질량분광법 및 이전에 인용된 방법과 같은 기법을 이용하여 표준 곡선에 근거하여 절대 양으로 표본(예를들어, 혈액, 혈장, 타액)으로부터 설정할 수 있다. 의사는 24-히드록시화 천연 및 합성 비타민 D 화합물의 절대값을 정상 수준으로 이용할 것이다.
환자 내 CYP24 RNA 수준, CYP24 단백질 수준, 또는 24-히드록시화 천연 또는 합성 비타민 D 화합물의 절대값이 정상 범위를 벗어나는 경우, 환자는 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성을 가진다. 예를 들어, CYP24 발현 및/또는 활성은 정상 CYP24 발현 및/또는 활성에 비하여 적어도 2배 증가, 적어도 3배 증가, 적어도 4배 증가, 적어도 5배 증가, 또는 적어도 10배 증가된 것일 수 있다. 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성은 정상 CYP24 발현 및/또는 활성에 비하여 수백 또는 수천 배(예를 들어, 100x, 500x, 1000x, 5000x, 등)일 수 있는 것으로 간주된다.
일 구현예에서, 의사는 환자로부터 적어도 하나의 표본(예를 들어, 혈액, 혈장, 타액, 혈청, 구강 조직)을 수집하고 CYP24 RNA 수준, CYP24 단백질 수준 또는 24-히드록시화 천연 또는 합성 비타민 D 화합물의 절대값을 측정함으로써 환자가 비정상적으로 증가된 CYP24 발현 및/또는 활성을 가지는지 판단할 것이다. 하나 또는 몇몇 개의 측정된 파라미터가 정상 범위를 벗어나는 경우, 바람직하게 상기한 바와 같이 적어도 2 배, 3 배, 4 배 등인 경우, 의사는 상기 환자가 비정상적으로 증가된 CYP24 활성 및/또는 발현을 가지는 것으로 진단할 것이며 CYP24 억제제를 처방할 것이다.
CYP24 억제제는 유기 분자, 단일사슬 또는 이중사슬 핵산(예를 들어, 센스, 안티센스, 또는 미스센스 올리고뉴클레오티드; 앱타머; 센스, 안티센스 또는 미스센스 폴리뉴클레오티드; 센스, 안티센스, 또는 미스센스 DNA; 센스, 안티센스 또는 미스센스 RNA; 및 siRNA), 펩타이드, 탄수화물 및 단백질(예를 들어, 항체, 항체 단편, 호르몬, 호르몬 유사체, 당단백질 및 렉틴)을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, CYP24 억제제는 미국 특허 제 6,380,408 호(col. 6)에 식 IX(화합물 1)로 개시된 화합물, 즉 (5Z,7E,16Z,23E)-(1S,3R)-25-노르-25-t-부틸설포닐-9,10-세코-5,7,10(19),16,23-콜레스타펜타엔-1,3-디올을 포함한다. 다른 구현예에서, CYP24 억제제는 예를 들어 (R)-N-(2-(1H-이미다졸-1-일)-2-페닐에틸)-4'-클로로비페닐-4-카르복스아미드, 케토코나졸, 메트로니다졸, 클로메티아졸, 이트라코나졸 및 플루코나졸과 같은 아졸 화합물을 포함한다.
CYP24의 유기분자 억제제의 한 부류는 비타민 D 화합물 유사체를 포함한다.
CYP-24 억제 활성을 가지는 1α,25-디히드록시비타민 D3 유사체의 예는 미국 특허 제 6,380,408호; 제 7,101,865호; 제 7,166,585호 ; 및 제 6,982,258호, 및 미국 특허 출원 제 10/738,248호에 개시되어 있으며 (상기 문헌들은 그 전체로서 본원에 참조로 통합됨), 23,23-디플루오로-24-설폰 비타민 D3 화합물, 25-설폰 비타민 D3 화합물, 24,24-디플루오로-25-설폰 비타민 D3 화합물, 24-설폭시민 비타민 D3 화합물, 16-엔-25-옥심 비타민 D3 화합물, 및 16-엔-25-옥심 에테르 비타민 D3 화합물, 24-설폰 비타민 D3 화합물, 및 24,24-디플루오로 비타민 D3 화합물을 포함한다. 상기 방법의 일 측면에서, 상기 분자는 순수 CYP24 억제제, 예를 들어 (5Z,7E)-(1S,3R)-24-(S)-페닐설폭시민-25-노르-9,10-세코-5,7,10(19)-콜레스타트리엔-1,3-디올 (미국 특허 제 7,101,865호, 화합물 I(a) 참조)로부터 선택될 수 있다. 상기 방법의 다른 측면에서, 상기 분자는 CYP24 억제제이면서 비타민 D 작동제인 화합물, 예를 들어 (5Z,7E,16Z,23E)-25-노르-25-t-부틸설포닐-9,10-세코-5,7,10(19),16,23-콜레스타펜타엔-1,3β디올(미국 특허 제 6,380,408호, 식 IX, 화합물 1 참조) 및 (5Z,7E,16Z)-(1S,3R)-25-(O-allyl)-N-t-부틸옥심-9,10-세코-5,7,10(19),16-콜레스타테트라엔-1,3β디올(미국 특허 제 6,982,258호, 화합물 I(g) 참조)로부터 선택될 수 있다.
CYP24 억제제는 임의로 신체 내 비타민 D 수준을 증가시키는 다른 제제와 함께 투여될 수 있다. 신체 내 비타민 D 수준을 증가시키는 것으로 종래 공지된 제제가 본원에 포함되며, 이는 예를 들어 비타민 D2, 25-히드록시비타민 D2, 1,25-디히드록시비타민 D2, 비타민 D3, 25-히드록시비타민 D3, 및 1,25-디히드록시비타민 D3를 포함한다. 바람직하게, 활성 비타민 D 화합물은 피하여지며, 비타민 D 전호르몬, 비타민 D 프로호르몬 및 이의 유사체가 바람직하다.
콜레칼시페롤 및 에르고칼시페롤 모두 주로 인체의 간에 위치하는 효소에 의하여 프로호르몬으로 대사된다. 콜레칼시페롤은 프로호르몬 25-히드록시비타민 D3으로 대사되며,에르고칼시페롤은 두 개의 프로호르몬 25-히드록시비타민 D2 및 24(S)-히드록시비타민 D2으로 대사된다. 콜레칼시페롤 및 에르고칼시페롤은 또한 간에서 발견되는 것과 동일하거나 유사한 효소에 의하여 장 세포와 같은 특정 세포 내에서 간 밖에서 프로호르몬으로 대사될 수 있다. 이들 전구체 중 하나의 농도 증가는 프로호르몬 생산을 증가시키며; 유사하게, 전구체 농도 감소는 호르몬 생산을 감소시킨다. 콜레칼시페롤 및/또는 에르고칼시페롤("콜레칼시페롤/에르고칼시페롤")의 혈액 수준 급증은 일시적으로 세포내 비타민 D 농도를 증가시켜, 프로호르몬 생산을 가속화하고 세포내 및 혈액 프로호르몬 농도를 증가시킬 수 있다.
1,25-디히드록시비타민 D의 혈액 수준은 PHT를 수반하는 피드백 메커니즘에 의하여 정확히 조절된다. 신장의 1a-히드록시라아제(또는 CYP27B1)는 PHT에 의하여 자극되고 1,25-디히드록시비타민 D에 의하여 억제된다. 1,25-디히드록시비타민 D의 혈액 수준이 저하되면, 부갑상선이 세포내 비타민 D 수용체를 경유하여 이러한 변화를 감지하여 PTH를 분비한다. 분비된 PTH는 신장 CYP27BA의 발현을 자극하여, 비타민 D 호르몬 생산을 증가시킨다. 1,25-디히드록시비타민 D의 혈액 농도가 다시 증가함에 따라, 부갑상선은 추가적인 PTH 분비를 약화시킨다. 혈액 PTH 수준이 저하됨에 따라, 비타민 D 호르몬의 신장 생산이 감소한다. 1,25-디히드록시비타민 D의 혈액 수준 증가는 또한 CYP27B1에 의한 추가적인 비타민 D 호르몬 생산을 직접적으로 억제한다.
콜레칼시페롤, 에르고칼시페롤 및 25-히드록시비타민 D의 혈액 수준의 상당한 급증은 또한 반응으로서 CYP24의 상향 조절을 야기하여 일시적인 과량의 비타민 D 기질을 이화할 수 있다. 유사하게, 1,25-디히드록시비타민 D의 혈액 수준 증가는 CYP24 활성의 상향 조절을 야기할 수 있다.
임의의 특정 작동 방식에 구애받고자 의도함이 없이, CYP24의 과잉발현은 기질 및/또는 햇빛 내에 결핍과 무관하나 잠재적으로 관련되어 작동하는 적어도 일부 형태의 비타민 D 결핍의 원인이다.
따라서, 본원에 개시된 방법의 일 유형의 구현예에서, CYP24 억제제를 단독으로, 또는 비타민 D 화합물 (예를 들어, 콜레칼시페롤, 에르고칼시페롤, 비타민 D 프로호르몬, 비타민 D 호르몬, 또는 이의 유사체)의 투여 없이, 가장 바람직하게 활성 비타민 D 호르몬 또는 이의 유사체 없이 투여될 것이다. 본원에 개시된 방법의 다른 구현예에서, CYP24 억제제는 단독으로 투여되거나, 또는 비타민 D 화합물 (예를 들어, 콜레칼시페롤, 에르고칼시페롤, 비타민 D 프로호르몬, 비타민 D 호르몬, 또는 이의 유사체)이 함께 투여되는 경우, 상기 비타민 D 화합물을 화합물의 혈액 수준 급증을 방지하기 위하여 변경된 방출 제제(서방 또는 연장 방출 제제) 내에 또는 슬로우 푸쉬 IV 전달을 통하여 투여될 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 이화작용 관련 비타민 D 결핍 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 CYP24 발현 및/또는 활성의 측정을 제공하며, CYP24 이화작용 부산물 또는 상기 이화작용 부산물에 대한 전구체의 수준, CYP24 mRNA 수준, CYP24 단백질 수준 및/또는 CYP24 효소 활성 수준을 포함하는 하나 이상의 특성을 측정하는 키트를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 키트는 고정화된 항-CYP24 항체, 표지된 항-CYP24 항체 및, 예를 들어 본원에 개시된 방법에 따른 사용 설명서를 포함한다. 다른 항체 기반 검출을 수반하는 키트 또한 본 발명에서 고려된다. 예를 들어, CYP24 발현을 측정하기 위한 키트는 CYP24 이화작용 부산물 수준을 측정할 수 있다. 상기 키트는 하나 이상의 이화작용 산물에 대한 상응하는 전구체의 수준을 측정하기 위한 검사 기구를 포함한다. 이러한 키트는
CYP24 이화작용 부산물에 특이적인 항체(또는 이의 기능성 단편), 및 CYP24 이화작용 부산물을 포함하는 비타민 D 화합물에 특이적인 항체를 포함한다. 비타민 D 대사산물 및 DBP 또는 VDR 또는 합성적으로 유도된 단백질 또는 거대분자와 같은 CYP24 이화작용 부산물 또한 이러한 키트 내에 항체를 대신하여 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 상기 항체 중 하나는 고체 지지체에 고정화되고 다른 항체는 검출을 위한 표지를 가지는 것으로 고려된다. 다른 실시예에서, CYP24 발현을 측정하기 위한 키트는 고정화된 CYP24 이화작용 부산물, 및 항-CYP24 항체를 포함할 수 있다. CYP24 활성은 CYP24 이화작용 부산물이 항-CYP24 항체에의 결합을 위하여 고정화된CYP24 이화작용 부산물과 경쟁하는 능력을 측정함으로써 상기한 바와 같은 키트에 의하여 측정된다.
다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 CYP24 억제제를 포함하는 비타민 D 결핍 치료 또는 예방을 위한 약학적 제제를 포함한다. 상기 제제는 유효량의 25-히드록시비타민 D3을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 CYP24 억제제를 포함하는 부갑상선기능항진증을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 제제를 포함한다. 상기 제제는 유효량의 25-히드록시비타민 D3를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적 제제는 만성 신장 질환, 예를 들어 1 단계 또는 2 단계 CKD에 2차적인 부갑상선기능항진증의 치료를 위한 것일 수 있다.
정확한 제제, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태에 따라 의사에 의하여 결정될 수 있다. 투여량 및 간격을 개별적으로 조정하여 치료적 또는 예방적 효과를 유지하기에 충분한 활성 성분의 수준을 제공할 수 있다.
이와 같은 제제는 예를 들어 과립, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 좌약, 주사제, 에멀젼, 엘릭시르, 현탁액 또는 용액 형태일 수 있다. 일회용 제제를 다양한 투여 경로, 예를 들어, 경구 투여, 비내(nasal) 투여, 직장 투여, 피하 주사, 정맥 주사, 근육내 주사, 또는 복강내 주사를 위하여 제제화할 수 있다. 이하의 제형이 예로서 주어지나 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
경구, 구강 및 설하 투여를 위하여, 분말, 현탁액, 과립, 정제, 알약, 캡슐, 겔캡, 및 당의정이 고체 제형으로서 허용된다. 이들은 예를 들어 본 발명의 CYP24 억제제 또는 이중 작용 CYP24 억제제 및 VDR 작동제 중 하나 이상을 전분 또는 기타 첨가제와 같은 적어도 하나의 첨가제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 적합한 첨가제는 수크로오스, 락토오스, 셀룰로오스, 당, 만니톨, 말티톨, 덱스트란, 전분, 한천, 알기네이트, 키틴, 키토산, 펙틴, 트라가칸트 검, 아라비아 검, 젤라틴, 콜라겐, 카제인, 알부민, 합성 또는 반합성 폴리머 또는 글리세라이드이다. 임의로, 경구 제형은 불활성 희석제, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 파라벤 또는 소르브산과 같은 방부제, 또는 아스코르브산, 토코페롤 또는 시스테인과 같은 항산화제, 붕해제, 결합제, 점증제, 버퍼, 감미제, 착향료, 또는 향료와 같은 투여를 보조하는 기타 성분을 함유할 수 있다. 정제 및 알약은 당업계에 공지된 적절한 코팅 물질로 추가로 처리될 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 제형은 약학적으로 허용가능한 에멀젼, 시럽, 엘릭시르, 현탁액 및 용액 형태일 수 있으며, 이는 물과 같은 불활성 희석제를 함유할 수 있다. 약학적 제제 및 약제를, 이에 제한되지 않으나 오일, 물, 알코올 및 이들의 조합과 같은 살균 액체를 이용하여 액상 현탁액 또는 용액으로서 제조할 수 있다. 약학적으로 적합한 계면활성제, 현탁제, 유화제를 경구 또는 비경구 투여를 위하여 첨가할 수 있다.
상기한 바와 같이, 현탁액은 오일을 포함할 수 있다. 이러한 오일은, 이에 제한되지 않으나 땅콩유, 참깨유, 면실유, 옥수수유 및 올리브유를 포함할 수 있다. 현탁액 제제는 또한 에틸 올레이트, 이소프로필 미리스테이트, 지방산 글리세라이드 및 아세틸화 지방산 글리세라이드와 같은 지방산 에스테르를 함유할 수 있다. 현탁액 제제는, 이에 제한되지 않으나 에탄올, 이소프로필 알콜, 헥사데실 알콜, 글리세롤 및 프로필렌 글리콜과 같은 알콜을 포함할 수 있다. 이에 제한되지 않으나 폴리(에틸렌글리콜)과 같은 에테르, 미네랄유 및 페트롤라툼과 같은 석유 탄화수소; 및 물을 또한 현탁액 제제 내에 사용할 수 있다.
비내 투여를 위하여, 약학적 제제 및 약제는 적절한 용매 및 임의로 이에 제한되지 않으나 안정화제, 항미생물제, 항산화제, pH 조정제, 계면활성제, 생체 이용률 조정제 및 이들의 조합과 같은 기타 화합물을 함유하는 스프레이 또는 에어로졸일 수 있다. 에어로졸 제제를 위한 프로펠런트는 압축 공기, 질소, 이산화탄소 또는 탄화수소계 저비등 용매를 포함할 수 있다.
주사가능 제형은 일반적으로 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 이용하여 제조될 수 있는 수성 현탁액 또는 유성 현탁액을 포함한다. 주사가능 제형은 용매 또는 희석제를 이용하여 제조되는 용액 상 또는 현탁액 형태일 수 있다. 허용가능한 용매 또는 베히클은 살균수, 링거 용액 또는 등장 수성 식염 용액을 포함한다. 대안적으로, 살균유를 용매 또는 현탁제로서 사용할 수 있다. 바람직하게, 상기 오일 또는 지방산은 비휘발성이며, 천연 또는 합성유, 지방산, 모노-, 디-, 또는 트리글리세라이드를 포함한다.
주사를 위하여, 약학적 제제 및/또는 약제는 상기한 바와 같은 적절한 용액을 이용하는 재구성을 위하여 적합한 분말일 수 있다. 그 예는, 이에 제한되지 않으나, 동결 건조, 회전 건조 또는 분무 건조 분말, 비결정성 분말, 과립, 침전물 또는 미립자를 포함한다. 주사를 위하여, 상기 제제는 임의로 안정화제, pH 조정제, 계면활성제, 생체이용률 조정제 및 이들의 조합을 함유할 수 있다.
직장 투여를 위하여, 약학적 제제 및 제약은 장, S자 결장 및/또는 직장 내 화합물 방출을 위한 좌약, 연고, 관장제, 정제 또는 크림 형태일 수 있다. 항문 좌제는 하나 이상의 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 호변이성체를 허용가능한 베히클, 예컨대, 코코아 버터 또는 폴리에틸렌글리콜과 혼합함으로써 제조되며, 이는 정상적인 저장 온도에서 고체상이고 약물을 직장과 같은 신체 내로 방출하기에 적합한 온도에서 액상으로 존재한다. 오일 또한 연질 젤라틴 타입의 제제 및 좌제의 제조에 사용될 수 있다. 물, 식염, 수성 덱스트로오스 및 관련된 당 용액, 및 글리세롤을, 펙틴, 카르보머, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 또는 카르복시메틸셀룰로오스와 같은 현탁제 및 버퍼 및 방부제를 함유할 수 있는 현탁액 제제의 제조에 사용할 수 있다.
본 발명의 제제는 단기 작용, 신속 방출, 장기 작용 및 후술하는 바와 같은 지속 방출로서 고안될 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학적 제제는 또한 조절된 방출 또는 서방출을 위하여 제제화될 수 있다.
인스턴트 조성물은 또한 예를 들어 미셀 또는 리포오솜, 또는 기타 캡슐화된 형태를 포함하거나, 또는 연장 방출 형태로 투여되어 연장된 저장 및/또는 전달 효과를 제공할 수 있다. 따라서, 상기 약학적 제제 및 약제는 펠릿 또는 실린더로 압축되고 근육내 또는 피하에 데포(depot) 주사제로서 또는 스텐트와 같은 삽입물로서 주입될 수 있다. 이와 같은 삽입물은 실리콘 및 생분해성 폴리머와 같은 공지의 불활성 물질을 사용할 수 있다.
투여량을 대상의 질환 상태, 연령, 체중, 일반적 건강 상태, 성별 및 식이, 약물의 투여 간격, 투여 경로, 분비 속도 및 조합에 따라 조정할 수 있다. 유효량을 함유하는 상기한 것들 중 임의의 제형이 통상적인 실험 범위 내이며 따라서 본 발명의 범위 내이다.
상기한 바와 같은 대표적인 제형 이외에, 약학적으로 허용가능한 부형제 및 담체가 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, 따라서 본 발명의 범위 내이다. 이러한 부형제 및 담체는 예를 들어 "Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991)에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 통합된다.
비타민 D 화합물의 적합한 조절 방출 제제가 WIPO 공보 WO 2008/134512로서 공개된(November 6, 2008) PCT/US2008/061579에 개시되어 있으며, 그 개시는 본원에 참조로 통합된다. 이러한 제제는 또한 상용가능한 CYP24 억제제 및 이중 작용 CYP23 억제제 및 VDR 작동제를 포함할 수 있는 것으로 간주된다.
실시예
이하 실시예들은 예시를 위하여 제공되는 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
이하 실시예는 다음 결론을 지지한다.
CYP24 유전자 발현이 정상 및 요독증 래트 모두로부터의 조직 내에서 1,25-디히드록시비타민 D3에 의하여 강하게 유도된다.
CYP24의 구성적 발현은 다른 조직과 비교하여 건강한 신장 내에서 상대적으로 높다. 그러나, 요독증 래트 내에서, CYP24의 기저 발현은 현저히 증가된다. 이는 요독증 상태와 관련된 메커니즘이 CYP24 발현 조절에 수반될 수 있음을 시사한다.
CYP24는 정상적인 동물과 비교하여 요독증 동물의 부갑상선 내 1,25-디히드록시비타민 D3에 의하여 현저히 유도된다.
요독증 래트 내에 CYP27BA의 발현은 1,25-디히드록시비타민 D3의 감소된 수준과 관련이 없으며, 이는 요독증에서 비타민 D 수준을 감소시킴에 있어서 CYP24의 보다 현저한 역할을 시사한다.
정상적인 동물에서, CYP24 발현은 비타민 D 상태에 의존하며; 비타민 D 결핍은 CYP24 발현 수준을 현저히 감소시킨다. 요독증 동물은 비타민 D 결핍 상태에서 변화하지 않는 더 높은 CYP24 발현의 기저 수준을 나타낸다. 이는 요독증에서, 비타민 D와 무관한 메커니즘이 CYP24 수준을 조절함을 시사한다. 이는 요독증에서 비타민 D 상태에 영향을 미칠 것이다.
요독증 신장 내 CYP24의 증가된 기저 발현은 근본적인 25(OH)D3 및 1,25-디히드록시비타민 D3 결핍 및 비타민 D 호르몬 대체 치료법에 대한 저항성에 기인하는 중요한 메커니즘일 수 있다. CYP24를 억제하는 화합물은 비타민 D 상태를 유지하고 치료에 대한 CYP24 저항성을 극복하는데에 유용할 것이다.
FGF23은 1,25-디히드록시비타민 D와 상승작용하여 CYP24 RNA 생산을 유도한다. 요독증 상태에서, 높은 수준의 FGF23은 CYP24를 더욱 증가시켜 환자가 비타민 D 치료에 저항성이 되도록 할 것이다.
CYP24 수준은 비타민 D 결핍 동물에서 감소되고 25-히드록시비타민 D 처리 후 정상 또는 더 높은 수준으로 증가한다.
CYP24 수준은 요독증 비타민 D 결핍 래트 내에서 변화하지 않으며 25-히드록시비타민 D 처리 후 증가하지 않는바, 이는 요독증 래트 내 비타민 D 조절 손실을 시사한다.
비타민 D 결핍 요독증 래트 내에서, CYP24 RNA 수준은 비타민 D 결핍 동물과 비교하여 증가된다. 이는 2주 동안 25-히드록시비타민 D3 투여 후 1,25-디히드록시비타민 D3 수준이 비타민 D 결핍 동물과 비교하여 비타민 D 결핍 요독증 래트 내에서 더 낮은 이유를 설명할 수 있다.
실시예 1
비타민 D 결핍 동물 모델
비타민 D 결핍 동물 모델을 얻기 위하여, 래트에 아데닌 풍부 식이를 공급하였다. 7일 후, 대조 식이 동물과 비교하여 아데닌 공급 동물에서 무손상 PHT(iPHT) Elisa 키트에 의하여 증가된 부갑상선 호르몬(PTH) 수준이 관측되었으며, 29일 후 이차성 부갑상선기능항진증이 아데닌 공급 동물에서 발생하였으나 대조 식이를 받은 동물에서는 그러하지 않았다(도 1). iPTH 수준은 비타민 D 화합물로 아데닌 공급 동물을 처리함으로써 현저히 감소되었다. 도 2에 도시하는 바와 같이, 아데닌 공급 동물 내 , iPHT 수준은 아데닌 공급 동물을 1,25-(OH)2-D3 (칼시트리올 또는 1,25- 디히드록시비타민 D3), 25-OH-D3 (칼시디올 또는 25-히드록시비타민 D3), 또는 1,25-(OH)2-D2 (1,25-디히드록시비타민 D2)로 처리함에 의하여 대조 식이 공급 동물과 유사한 수준으로 회복되었다.
1,25-(OH)2-D3 (칼시트리올 또는 1,25-디히드록시비타민 D3), 비타민 D의 활성 형태 수준을 질량분광법에 의하여 측정함으로써 아데닌 공급 및 대조 동물의 비타민 D 호르몬 상태를 평가하였다. 아데닌 공급 동물은 대조 식이를 공급받은 동물과 비교하여 비타민 D 호르몬 상태 감소를 나타냈다(도 3). 아데닌 공급 동물 내 비타민 D 상태는 상기 아데닌 공급 동물을 1,25-(OH)2-D3로 처리함으로써 대조 공급 동물의 수준까지 회복되었다. 이와 대조적으로, 아데닌 공급 동물을 25-OH-D3 (칼시디올 또는 25-히드록시비타민 D3) 또는 1,25-(OH)2-D2 (1,25-디히드록시비타민 D2)로 처리하였더니 상기 동물들의 1,25-(OH)2-D3 수준에 유의한 영향을 미치지 않았다(도 3).
실시예 2
비타민 D 결핍에서 CYP24 발현
비타민 D 결핍과 CYP24 수준과의 관계를 결정하기 위하여, 아데닌 공급 래트 및 대조 식이 공급 동물 내에서 qRT-PCR에 의하여 CYP24 발현을 측정하였다. 아데닌 공급 동물의 신장 조직 내에서, CYP24 발현은 대조 식이 공급 동물의 신장 조직과 비교하여 대략 7 배 비정상적으로 증가하였다(도 4). 아데닌 공급 동물의 비타민 D 화합물 처리는 CYP24를 추가적으로 유도하였다. 도 4에 도시되는 바와 같이, 아데닌 공급 래트를 1,25-(OH)2-D3 (칼시트리올 또는 1,25-디히드록시비타민 D3), 25-OH-D3 (칼시디올 또는 25-히드록시비타민 D3), 또는 1,25-(OH)2-D2 (1,25-디히드록시비타민 D2)로 처리하였더니 CYP24 발현 활성의 2배 내지 25배 증가가 초래되었다. 아데닌 공급 동물의 부갑상선 조직에서, CYP24 발현 활성은 대조 식이 공급 동물의 부갑상선 조직과 비교하여 대략 3배 비정상적으로 증가하였다(도 5). 아데닌 공급 동물의 비타민 D 화합물 처리는 CYP24를 대폭적으로 유도하였다. 도 5에 도시되는 바와 같이, 아데닌 공급 래트를 1,25-(OH)2-D3 (칼시트리올 또는 1,25-디히드록시비타민 D3), 25-OH-D3 (칼시디올 또는 25-히드록시비타민 D3), 또는 1,25-(OH)2-D2(1,25-디히드록시비타민 D2)로 처리하였더니 CYP24 발현 활성의 50배 내지 14,000배 증가가 초래되었다.
실시예 3
비타민 D 결핍에서 FGF23 발현
비타민 D 결핍과 섬유아세포 증식인자-23(FGF23) 수준과의 관계를 결정하기 위하여, 혈청 FGF23 수준을 아데닌 공급 래트 및 대조 식이 공급 동물 내에서 측정하였다. 아데닌 공급 동물에서, 혈청 FGF23 수준은 대조 식이 공급 동물과 비교하여 적어도 53배 비정상적으로 증가하였다(도 6). 비타민 D 화합물로 처리된 아데닌 공급 동물 또한 증가된 FGF23 수준을 나타냈다. 도 6에 도시하는 바와 같이, 아데닌 공급 래트를 1,25-(OH)2-D3 (칼시트리올 또는 1,25-디히드록시비타민 D3), 25-OH-D3 (칼시디올 또는 25-히드록시비타민 D3), 또는 1,25-(OH)2-D2 (1,25-디히드록시비타민 D2)로 처리하였더니 대조 식이 공급 동물과 비교하여 적어도 74배 FGF23 증가가 초래되었다.
FGF23 및 골 형성에 대한 바이오마커인 오스테오칼신 수준을 아데닌 공급 래트 및 대조 식이 공급 동물로부터의 신장 조직 내에서 측정하였다. 대조 식이 동물과 비교하여 아데닌 공급 동물에서 FGF23은 대략 55배 증가하였으며, 오스테오칼신은 대략 1.5배 증가하였다(도 7).
실시예 4
25-히드록시비타민 D 처리에서 CYP24 발현
도 8은 2주 동안 비타민 D(25-히드록시비타민 D2 및 25-히드록시비타민 D3) 처리된 래트 내에서 상대적인 CYP24 유도 그래프를 도시한다. 정상적인 래트에 16 ㎍/kg의 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3, 및 대조 베히클을 2주 동안 투여하였다. 혈액을 수집하고 CYP24 발현을 실시간 PCR에 의하여 측정하였다.
실시예 5
5Z,7E,16Z,23E)-(1S,3R)-25-노르-25-t-부틸설포닐-9,10-세코-5,7,10(19),16,23-콜레스타펜타엔-1,3-디올의 25-히드록시비타민 D 수준에 대한 영향을 인간 피험체 내에서 평가하였다. 피험체에 위약 또는 상기 화합물을 1, 3, 5, 8 및 10일째에 투여하였다. 상기 화합물의 마지막 투여 24시간 후에, 25-히드록시비타민 D 수준을 측정하였다. 혈청 25-히드록시비타민 D 백분율 변화를 도 9에 도시한다(90 mcg 및 180 mcg 모두에 대하여 p = 0.1).
실시예 6
Sprague-Dawley 래트를 매일 베히클 또는 0.5 mcg/kg 1,25-디히드록시비타민 D3으로 1 주일 동안 i.v 처리했다. 마지막 투여로부터 24 시간 후, 기관을 수집하였다. 실시간 PCR에 의하여 CYP24 유전자 발현을 측정하였다. 결과를 도 10에 도시한다.
Sprague-Dawley 래트에 표준 식이 (정상) 또는 0.75% 아데닌을 함유하는 요독증 유발 식이(요독증)를 4 주 동안 공급하였다. 그 다음, 동물에 베히클 또는 0.5 mcg/kg 1,25-디히드록시비타민 D3를 7일 동안 매일 i.v. 투여하였다. 마지막 투여로부터 24 시간 후 기관을 수집하였다. 실시간 PCR에 의하여 CYP24 유전자 발현을 측정하고 GAPDH 수준에 대하여 표준화하였다. 상대 발현값을 베히클 처리군(상대 발현=1)에 대하여 표준화하였다. 결과를 도 11에 도시한다.
도 10 및 11은 정상 래트와 비교하여 요독증 래트 내에서 CYP24의 기저 발현이 신장에서 현저히 증가하나(도 10), 부갑상선에서는 그러하지 않음(도 11)을 보인다. 그러나, 1,25-디히드록시비타민 D3 (1α, 25(OH)2D3)에 의한 CYP24의 유도 발현은 정상 동물과 비교하여 요독증 동물의 부갑상선에서 현저히 컸다. "*"은 정상 및 요독증 래트 내에서 베히클 및 1,25-디히드록시비타민 D3 처리 간의 CYP24 발현의 유의한 차이를 나타낸다. "**"는 베히클 처리된 정상 및 요독증 래트 사이의 유의한 차이를 나타낸다. "
Figure 112016118553295-pat00001
"는 1,25-디히드록시비타민 D3 처리된 정상 및 요독증 래트 사이의 CYP24 유도에 있어서의 유의한 차이를 나타낸다. 유의성을 <0.05의 p 값 컷오프로 설정하였다. 데이터를 평균±SEM으로 나타낸다. 각각의 막대 위의 숫자는 정상 베히클에 대한 상대적인 배수 유도를 나타낸다.
실시예 7
CYP24 및 CYP27B1 발현을 도 11에 대하여 실시예 6에 서술된 것과 동일한 프로토콜을 이용하여 측정하였다. 25(OH)D3 및 1,25-디히드록시비타민 D3의 혈청 수준을 LC-MS에 의하여 측정하였다. 혈청 PTH를 ELISA IMMUTOPICS (San Clemente, CA, USA)에 의하여 제조업자의 지시에 따라 측정하였다. 간략히, 혈청 표본을 [26,27-2H6] 25(OH)D3 또는 [25,26-2H6] 1,25-디히드록시비타민 D3으로 스파이킹하고, 아세토니트릴 내에 용해하여 내부 표준으로 이용하였다. 1,25-디히드록시비타민 D3 또는 25(OH)D3 및 내부 표준을 Accubond II ODS-C18 100 mg, 1 mL SPE 카트리지 (Agilent Technologies)를 이용하여 혈청으로부터 추출하였다. 수집된 단편을 꾸준한 질소 기체 스트림 하에 증발 건조시키고, 잔사를 50 μL의 메탄올/H2O (80/20; v/v) 내에 재구성하고 LC-MS/MS (Waters Alliance HPLC- Waters Quattro Ultima mass spectrometer)을 이용하여 분석하였다. 상대 발현값을 베히클 처리군(상대 발현 =1)에 대하여 표준화하였다. 결과를 도 12에 도시한다.
도 12는 CYP27B1로의 변화없이 증가된 기저 CYP24 발현이 요독증 래트 내에서 더 낮은 수준의 1,25-디히드록시비타민 D3에 기여할 수 있음을 보인다. 1,25-디히드록시비타민 D3 처리는 혈청 25-(OH)D3 수준 감소를 야기한다. 1,25-디히드록시비타민 D3 처리는 PHT 감소를 야기하나, CYP24 발현을 대폭적으로 유도한다. 별표는 CYP27B1 (*) 및 CYP24 (**)에 대하여 정상 및 요독증군 사이의 통계학적으로 유의한 차이를 나타낸다. 상부 패널에서, (*)는 정상 및 요독증 래트 사이의 비타민 D 수준에 있어서 유의한 차이를 나타낸다. <0.05의 p값 컷오프를 가지는 스튜던트 독립 t 검정을 이용하여 통계학적 유의성을 결정하였다. 데이터를 평균±SEM으로 나타낸다.
실시예 8
비타민 D가 부족한 식이를 6 중 동안 공급함으로써 Sprague-Dawley 래트 내에 비타민 D 결핍을 유발시켰다. 정상 래트에 비타민 D를 함유하는 표준 식이를 공급하였다. 0.2% 아데닌 용액을 마지막 2 주 동안 경구 투여함으로써(위관영양법) 요독증을 유발시켰다. 비-요독증 대조 래트에 경구 위관영양법에 의하여 베히클을 투여하였다. 마지막 아데닌 투여로부터 24 시간 후 혈청 및 기관을 수집하였다. 유전자 발현을 실시간 PCR에 의하여 측정하였다. 25(OH)D3 및 1,25-디히드록시비타민 D3 의 혈청 수준 측정은 실시예 7에 상세히 기재되어 있다. 결과를 도 13에 도시한다.
도 13은 요독증 래트 내에서 증가된 CYP24 기저 발현이 비타민 D 대사산물에 의존하지 않음을 보인다. "*"는 비-요독증 정상에 대하여 군 간의 유의한 차이를 나타낸다. "**"는 CYP27B1 정상 및 CYP27B1 비타민 D 결핍 (VD Def) 식이 간의 유의한 차이를 나타낸다. <0.05의 p 값 컷오프를 가지는 스튜던드 독립 t 검정을 이용하여 통계학적 유의성을 결정하였다. 데이터를 평균±SEM으로 나타낸다. 검출 불가능한 수준을 "ND"로 나타낸다.
실시예 9
HEK 세포를 웰(24-웰 플레이트) 당 25,000 세포로 시딩하고, 1,25-디히드록시비타민 D3 (10nM) 단독으로 또는 CYP24 억제제(MK-24(S)-S(O)(NH)-Ph-1, 미국 특허 제. 7,101,865호, 화합물 I(a) 참조) (10nM)와 함께 6, 24, 48 및 72 시간 동안 배양하였다. 세포를 수집하고 RNA를 TRIZOL® 시약을 이용하여 제조하였다. CYP24를 실시간 PCR을 이용하여 정량하였다. 결과를 도 14에 도시한다.
상기 결과는 CYP24 유도가 CYP24 억제제 MK-24(S)-S(O)(NH)-Ph-1 존재하에 1,25-디히드록시비타민 D3에 의하여 현저히 연장됨을 보인다.
실시예 10
HEK 세포를 2000 세포/웰 밀도로 96-웰 플레이트 내로 이동시켰다. 96-웰 플레이트 내에서 성장 2일 후, 세포를 변화하는 최종 농도 0, 1, 10 및 50 nM의 MK-24(S)-S(O)(NH)-Ph-1 화합물과 함께 최종 농도 10-6-10-11 M 의 1,25-디히드록시비타민 D3로 처리하였다. 하룻밤 처리 후, [3H]-티미딘을 KGM 매질 내에서 16 시간 동안 0.2 mCi/웰, 세포에 첨가하였다. 25 ml의 섬광 액체 첨가 후, 섬광계수기를 이용하여 방사능 혼입을 계산하였다. 결과를 도 15에 도시한다. 데이터를 1,25-디히드록시비타민 D3 농도에 따른 티미딘의 혼입으로서 cpm으로 나타낸다. 각각의 데이터 포인트는 적어도 4 개의 독립적인 시험을 나타낸다.
결과는 CYP24 활성 억제가 배양된 HEK 세포 내에서 1,25-디히드록시비타민 D3의 항증식 효과를 대략 30배까지 증진시킴을 보인다.
실시예 11
HPK1a-ras 세포를 0, 1, 10, 및 100 nM의 1,25-디히드록시비타민 D3 (칼시트리올) 단독으로 또는 100 ng/mL의 FGF23와 함께 처리하고, 8 시간 후 CYP24 RNA 발현을 측정하였다. 결과는 FGF23의 존재가 1,25-디히드록시비타민 D3과 함께 상승작용하여 CYP24 RNA 생산을 유도함을 보인다 (도 16).
실시예 12
Sprague Dawley 래트에 정상 식이 또는 비타민 D 결핍 식이를 4 주의 기간 동안 공급하였다. 그 다음, 동물에 25-히드록시비타민 D3을 0.6, 3, 또는 18 mcg/kg로, 또는 베히클을 도 17의 축 라벨대로 2주 동안 매일 주입하였다. 마지막 주입으로부터 24 시간 후에 신장을 수집하고, CYP24 mRNA 수준을 실시간 PCR에 의하여 측정하였다. 결과를 도 17에 도시한다.
실시예 13
Sprague Dawley 래트에 정상 식이(아데닌 베히클 군) 또는 비타민 D 결핍 식이(Vit. D def./아데닌 베히클 군)을 4 주의 기간 동안 공급하였다. 이러한 처리 이후, 동물에 100 mg의 아데닌을 2 주 동안 매일 투여하였다. 그 다음, 동물에 25-히드록시비타민 D3을 0.6 또는 18 mcg/kg로, 또는 베히클을 도 18의 축 라벨대로 다른 2 주 동안 매일 주입하였다. 마지막 주입으로부터 24시간 후 신장을 수집하고, CYP24 mRNA 수준을 실시간 PCR에 의하여 측정하였다. 결과를 도 18에 도시한다.
실시예 14
도 19는 6 또는 18 mcg/kg의 25-히드록시비타민 D를 2 주 동안 투여받은 비타민 D 결핍 래트와 비교하여 비타민 D 결핍 요독증 래트 내에 1,25-디히드록시비타민 D3의 수준을 도시한다.
앞서 기재한 내용은 단지 명확한 이해를 위하여 제공되는 것이며, 본 발명의 범위 내에서 변경이 당업자에게 분명하므로 불필요한 제한으로 이해되지 않아야 한다.
명세서를 통하여, 조성물이 성분 또는 물질을 포함하는 것으로 기재되어 있는 경우, 달리 기재하지 않는 한, 그 조성물은 인용되는 그 성분 또는 물질의 임의의 조합으로 필수적으로 구성되거나, 구성되는 것으로 간주된다.
본원에 기재된 방법 및 그 개별 단계의 실행은 수동으로 및/또는 전자 장비를 이용하여 수행될 수 있다. 공정들은 특정 구현예를 참조로 기재되었으나, 당업자는 그 방법과 관련된 행위를 수행하는 다른 방식을 이용할 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 예를 들어, 달리 기재되지 않는 한, 다양한 단계들의 순서를 본 발명의 방법의 범위 또는 사상으로부터 이탈됨이 없이 변경할 수 있다. 또한, 개별 단계들 중 일부를 결합, 생략, 또는 부가적인 단계들로 추가로 나눌 수 있다.
인체에 대하여 실행되는 방법의 특허를 금지하는 관할권에서, 조성물의 인간 피험체에의 "투여"의 의미는 인간 피험체가 임의의 기법(예를 들어, 경구, 흡입, 국소 적용, 주사, 삽입 등)에 의하여 자가 투여할 것을 조절 피험체에 처방하는 것으로 제한될 것이다. 특허가능한 대상을 정의하는 법 또는 규정에 부합하는 가장 넓은 타당한 해석이 의도된다. 인체에 실행되는 방법의 특허를 금지하지 않는 관할권에서, 조성물의 투여"는 인체에 실행되는 방법 및 전술한 행위를 모두 포함한다.
본원에 인용된 모든 특허, 공보 및 참조 문헌은 본원에 그 전체로서 참조로 통합된다. 본 발명과 통합되는 특허, 공보 및 참조 문헌과의 충돌이 있는 경우, 본 발명을 조절하여야 한다.

Claims (37)

  1. CYP24 억제제 및 비타민 D 프로호르몬(prohormone)을 포함하는 연장 방출형 약학 제제로서,
    상기 CYP24 억제제는 23,23-디플루오로-24-설폰 비타민 D3 화합물, 25-설폰 비타민 D3 화합물, 24,24-디플루오로-25-설폰 비타민 D3 화합물, 24-설폭시민 비타민 D3 화합물, 16-엔-25-옥심 비타민 D3 화합물, 16-엔-25-옥심 에테르 비타민 D3 화합물, 24-설폰 비타민 D3 화합물, 및 24,24-디플루오로 비타민 D3 화합물에서 선택되는 것인, 연장 방출형 약학 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비타민 D 프로호르몬은 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3 및 이들의 조합에서 선택되는 것인 약학 제제.
  3. 제2항에 있어서, 상기 비타민 D 프로호르몬은 25-히드록시비타민 D3 인 약학 제제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제제는 경구 투여용인 약학 제제.
  5. 제1항에 있어서, 오일을 더욱 포함하는 약학 제제.
  6. 제5항에 있어서, 지방산 에스테르를 더욱 포함하는 약학 제제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 지방산 에스테르는 지방산 글리세라이드인 약학 제제.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제제는 캡슐을 포함하는 약학 제제.
  9. 유효량의 연장 방출 형태의 비타민 D 프로호르몬 및 CYP24 억제제를 포함하는, 환자에서 비타민 D 결핍을 치료하기 위한 약학 제제로서,
    상기 제제는 혈청 25-히드록시비타민 D 를 적어도 30ng/mL 의 수준으로 유지하거나 증가시키도록 투여되고,
    상기 CYP24 억제제는 23,23-디플루오로-24-설폰 비타민 D3 화합물, 25-설폰 비타민 D3 화합물, 24,24-디플루오로-25-설폰 비타민 D3 화합물, 24-설폭시민 비타민 D3 화합물, 16-엔-25-옥심 비타민 D3 화합물, 16-엔-25-옥심 에테르 비타민 D3 화합물, 24-설폰 비타민 D3 화합물, 및 24,24-디플루오로 비타민 D3 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학 제제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 비타민 D 프로호르몬은 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3 및 이들의 조합에서 선택되는 것인 약학 제제.
  11. 제10항에 있어서, 상기 비타민 D 프로호르몬은 25-히드록시비타민 D3 인 약학 제제.
  12. 제9항에 있어서, 상기 제제는 경구 투여되는 것인 약학 제제.
  13. 제9항에 있어서, 상기 제제는 오일을 더욱 포함하는 것인 약학 제제.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제제는 지방산 에스테르를 더욱 포함하는 것인 약학 제제.
  15. 제14항에 있어서, 상기 지방산 에스테르는 지방산 글리세라이드인 약학 제제.
  16. 제9항에 있어서, 상기 제제는 캡슐을 포함하는 것인 약학 제제.
  17. 제9항에 있어서, 상기 환자는 이차성 부갑상선기능항진증을 가진 환자인 약학 제제.
  18. 제9항에 있어서, 상기 환자는 만성 신장 질환 1 단계 또는 2 단계를 가진 환자인 약학 제제.
  19. 제9항에 있어서, 상기 환자는 만성 신장 질환 3 단계 또는 4 단계를 가진 환자인 약학 제제.
  20. 제9항에 있어서, 상기 환자는 만성 신장 질환 5 단계를 가진 환자인 약학 제제.
  21. 유효량의 연장 방출 형태의 비타민 D 프로호르몬 및 CYP24 억제제를 포함하는, 만성 신장 질환 환자에서 이차성 부갑상선기능항진증을 치료하기 위한 연장 방출형 약학 제제로서,
    상기 제제는 혈청 부갑상선 호르몬을 낮추도록 투여되고,
    상기 CYP24 억제제는 23,23-디플루오로-24-설폰 비타민 D3 화합물, 25-설폰 비타민 D3 화합물, 24,24-디플루오로-25-설폰 비타민 D3 화합물, 24-설폭시민 비타민 D3 화합물, 16-엔-25-옥심 비타민 D3 화합물, 16-엔-25-옥심 에테르 비타민 D3 화합물, 24-설폰 비타민 D3 화합물, 및 24,24-디플루오로 비타민 D3 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학 제제.
  22. 제21항에 있어서, 상기 비타민 D 프로호르몬은 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3 및 이들의 조합에서 선택되는 것인 약학 제제.
  23. 제22항에 있어서, 상기 비타민 D 프로호르몬은 25-히드록시비타민 D3 인 약학 제제.
  24. 제21항에 있어서, 상기 제제는 경구 투여되는 것인 약학 제제.
  25. 제21항에 있어서, 상기 제제는 오일을 더욱 포함하는 것인 약학 제제.
  26. 제25항에 있어서, 상기 제제는 지방산 에스테르를 더욱 포함하는 것인 약학 제제.
  27. 제26항에 있어서, 상기 지방산 에스테르는 지방산 글리세라이드인 약학 제제.
  28. 제21항에 있어서, 상기 제제는 캡슐을 포함하는 것인 약학 제제.
  29. 제21항에 있어서, 상기 환자는 만성 신장 질환 1 단계 또는 2 단계를 가진 환자인 약학 제제.
  30. 제21항에 있어서, 상기 환자는 만성 신장 질환 3 단계 또는 4 단계를 가진 환자인 약학 제제.
  31. 제21항에 있어서, 상기 환자는 만성 신장 질환 5 단계를 가진 환자인 약학 제제.
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  33. 삭제
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