JP6944369B2 - T細胞活性化二重特異性抗原結合分子cd3 abd葉酸受容体1(folr1)及びpd−1軸結合アンタゴニストの併用療法 - Google Patents
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本出願は、ASCII形式で電子的に提出されており、その全文が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。2015年11月11日に作製された前記ASCIIコピーは、32401_SL.txtと名付けられ、527,137バイトの大きさである。
a)配列番号8の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)アミノ酸配列と、
(b)配列番号9のCDR−H2アミノ酸配列と、
(c)配列番号50のCDR−H3アミノ酸配列と、
(d)配列番号52の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)アミノ酸配列と、
(e)配列番号53のCDR−L2アミノ酸配列と、
(f)配列番号54のCDR−L3アミノ酸配列と
を含む。
VLD1は、第1の軽鎖可変ドメインであり、
VLD2は、第2の軽鎖可変ドメインであり、
CLD1は、第1の軽鎖定常ドメインであり、
CLD2は、第2の軽鎖定常ドメインであり、
VHD1は、第1の重鎖可変ドメインであり、
VHD2は、第2の重鎖可変ドメインであり、
CH1D1は、第1の重鎖定常ドメイン1であり、
CH1D2は、第2の重鎖定常ドメイン1であり、
CH2D1は、第1の重鎖定常ドメイン2であり、
CH2D2は、第2の重鎖定常ドメイン2であり、
CH3D1は、第1の重鎖定常ドメイン3であり、
CH3D2は、第2の重鎖定常ドメイン3である。
a.第3のポリペプチド鎖並びに第5のポリペプチド鎖のVHD2及びCLD2は、CD3と結合可能な第1の抗原結合部分を形成し、
b.第1のポリペプチド鎖並びに第4のポリペプチド鎖のVHD1及びCH1D1は、FolR1と結合可能な第2の結合部分を形成し、
c.第2のポリペプチド鎖並びに第5のポリペプチド鎖のVHD1及びCH1D1は、FolR1と結合可能な第3の結合部分を形成する。
a.第1及び第2のポリペプチド鎖は、配列番号399のアミノ酸配列を含み、
b.第3のポリペプチド鎖は、配列番号86のアミノ酸配列を含み、
c.第4のポリペプチド鎖は、配列番号394のアミノ酸配列を含み、
d.第5のポリペプチド鎖は、配列番号397のアミノ酸配列を含む。
a)Fcドメインと、
b)各々FolR1に特異的な抗原結合部位を含む、第1及び第2のFab断片と、
c)CD3に特異的な抗原結合部位を含む第3のFab断片と
を含み、第3のFab断片は、可変重鎖(VH)のC末端で、Fcドメインの第2のサブユニットと接続しており、第3のFab断片は、可変重鎖のN末端で、第2のFab断片のC末端と接続している。
a)TIM3との結合について、配列番号7のVH及び配列番号8のVLを含む抗Tim3抗体と競合する、
b)ヒト及びカニクイザルTIM3と結合する、
c)イムノコンジュゲートとして、TIM3発現細胞に対して細胞傷害活性を示す、
d)インターフェロンガンマ放出を誘導する
のうち1つ又は複数を有する。
a.TIM3との結合について、配列番号7のVH及び配列番号8のVLを含む抗Tim3抗体と競合する、
b.ヒト及びカニクイザルTIM3と結合する、
c.イムノコンジュゲートとして、TIM3発現細胞に対して細胞傷害活性を示す、
d.インターフェロンガンマ放出を誘導する、
のうち1つ又は複数を有する。
A)(a)(i)配列番号304のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号305のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号306から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号307のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号308のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号309のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
B)(a)(i)配列番号304のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号305のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号306から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号314のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号308のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号309のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
C)(a)(i)配列番号304のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号305のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号306から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号315のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号308のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号309のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
D)(a)(i)配列番号316のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号317のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号318から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号319のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号320のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号321のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
E)(a)(i)配列番号324のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号325のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号326から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号327のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号328のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号329のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
F)(a)(i)配列番号332のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号333のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号334から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号335のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号336のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号337のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
G)(a)(i)配列番号340のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号341のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号342から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号343のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号344のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号345のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
H)(a)(i)配列番号348のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号349のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号350から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号351のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号352のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号353のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
I)(a)(i)配列番号356のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号357のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号358から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号359のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号360のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号361のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
J)(a)(i)配列番号364のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号365のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号366から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号367のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号368のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号369のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン
を含む。
本明細書における目的上、「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義されるような、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワーク又は重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一アミノ酸配列を含み得るか、又はアミノ酸配列変更を含有し得る。いくつかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下又は2以下である。いくつかの実施態様では、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列において同一である。
a)VH−CH1−リンカー−VL−CL、b)VL−CL−リンカー−VH−CH1、c)VH−CL−リンカー−VL−CH1又はd)VL−CH1−リンカー−VH−CL;前記リンカーは、少なくとも30個のアミノ酸、好ましくは、32から50個の間のアミノ酸のポリペプチドである。前記一本鎖Fab断片a)VH−CH1−リンカー−VL−CL、b)VL−CL−リンカー−VH−CH1、c)VH−CL−リンカー−VL−CH1及びd)VL−CH1−リンカー−VH−CLは、CLドメインとCH1ドメイン間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。さらに、これらの一本鎖Fab分子は、システイン残基の挿入(例えば、カバット番号付けに従う可変重鎖中の位置44及び可変軽鎖中の位置100)による鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化され得る。用語「N末端は、N末端の最後のアミノ酸を意味する。用語「C末端は、C末端の最後のアミノ酸を意味する。「融合している」又は「接続している」とは、成分(例えば、Fab分子及びFcドメインサブユニット)が、直接的に又は1つ又は複数のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結していることを意味する。
用語「免疫グロブリン分子」とは、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、IgGクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している2つの軽鎖及び2つの重鎖から構成される、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、NからC末端に、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VH)と、それに続いて、重鎖定常領域とも呼ばれる3つの定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3)を有する。同様に、各軽鎖は、NからC末端に、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)と、それに続いて、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖(CL)ドメインを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)又はμ(IgM)と呼ばれる5つの種類のうち1つに割り当てることができ、これらのうちいくつかは、さらにサブタイプ、例えば、γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)及びα2(IgA2)に分けることができる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2つの種類に割り当てることができる。免疫グロブリンは、本質的に、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結している2つのFab分子及びFcドメインからなる。
1表A中のすべてCDR定義の番号付けは、Kabat等によって示される番号付け慣習に従う(以下を参照のこと)。
2表Aにおいて使用されるような小文字「b」を用いる「AbM」とは、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されるようなCDRを指す。
100×割合X/Y
[式中、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN−2によって、A及びBのそのプログラムのアラインメントにおいて同一マッチとスコアされたアミノ酸残基数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である]。ということが認められよう。アミノ酸配列Aの長さが、アミノ酸配列Bの長さと等しくない場合には、Bに対するAのアミノ酸配列同一性%は、Aに対するBのアミノ酸配列同一性%と等しくならない。別に具体的に記載されない限り、本明細書において使用されるすべてのアミノ酸配列同一性%の値は、ALIGN−2コンピュータプログラムを使用して直前の段落に記載されるように得られる。
一態様では、本発明は、例えば、がんの治療のための、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、葉酸受容体1(FolR1)に特異的な第1の抗原結合部位と、CD3に特異的な第2の抗原結合部位を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びPD−1軸結合アンタゴニストの治療的組合せの使用に基づいている。いくつかの実施態様では、治療的組合せは、TIM3アンタゴニストをさらに含む。
広く、本発明は、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びPD−1軸結合アンタゴニストと組み合わせたその使用に関する。単剤療法を上回る組合せの利点は、本発明において使用されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、T細胞を、標的とされる細胞へ再指向させ、活性化することが可能であり、一方で、PD−1軸結合アンタゴニストは、T細胞消耗の低減によってT細胞機能を増強するということである。
(i)本明細書において記載されるような葉酸受容体1(FolR1)及びCD3に特異的なT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物を含む第1の容器と、
(ii)PD−1軸結合アンタゴニストを含む組成物を含む第2の容器と
を含むキットを提供する。
(i)本明細書において記載されるような葉酸受容体1(FolR1)及びCD3に特異的なT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物を含む第1の容器と、
(ii)PD−1軸結合アンタゴニストを含む組成物を含む第2の容器と、
(iii)TIM3アンタゴニストを含む組成物を含む第3の容器と
を含むキットを提供する。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、二重特異性である、すなわち、2種の異なる抗原決定基と、すなわち、CD3及びFolR1と特異的に結合可能な少なくとも2種の抗原結合部分を含む。本発明によれば、抗原結合部分は、Fab分子(すなわち、重鎖及び軽鎖からなり、各々、可変領域及び定常領域を含む抗原結合ドメイン)である。一実施態様では、前記Fab分子は、ヒトである。別の実施態様では、前記Fab分子は、ヒト化である。さらに別の実施態様では、前記Fab分子は、ヒト重鎖及び軽鎖定常領域を含む。
(i)CD3と特異的に結合可能なFab分子であり、配列番号37、配列番号38及び配列番号39からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号32、配列番号33、配列番号34の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む第1の抗原結合部分と、
(ii)葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子である第2の抗原結合部分
を含む、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
(iii)FolR1と特異的に結合可能なFab分子である第3の抗原結合部分
をさらに含む。
本発明の発明者らは、結合部分が、親の、CD3に対する単一特異性抗体の特異性及び有効性を保持し、同一軽鎖を使用して第2の抗原(例えば、FolR1)と結合し得る共通軽鎖を共有する二重特異性抗体を作製した。親抗体の結合特性を保持する共通軽鎖を有する二重特異性分子の作製は、ハイブリッド軽鎖の共通CDRが、両標的に対する結合特異性を実現しなくてはならないので容易なものではない。一態様では、本発明は、第1及び第2の抗原結合部分を含み、そのうち一方が、CD3と特異的に結合可能なFab分子であり、そのうち一方が、FolR1と特異的に結合可能なFab分子であり、第1及び第2のFab分子が同一のVLCL軽鎖を有する、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。一実施態様では、前記同一軽鎖(VLCL)は、配列番号32、配列番号33及び配列番号34の軽鎖CDRを含む。一実施態様では、前記同一軽鎖(VLCL)は、配列番号35を含む。
(i)CD3と特異的に結合可能なFab分子であり、配列番号37、配列番号38及び配列番号39からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号32、配列番号33、配列番号34の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、第1の抗原結合部分と、
(ii)葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子であり、配列番号16、配列番号17及び配列番号18からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号32、配列番号33、配列番号34の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、第2の抗原結合部分と
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
(i)配列番号36のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号31のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、CD3と特異的に結合可能なFab分子である第1の抗原結合部分と
(ii)配列番号15のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号31のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子である第2の抗原結合部分と
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
(iii)FolR1と特異的に結合可能な第3の抗原結合部分(Fab分子である)を
さらに含む。
(i)CD3と特異的に結合可能なFab分子であり、配列番号37、配列番号38及び配列番号39からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号32、配列番号33、配列番号34の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、第1の抗原結合部分と、
(ii)葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子であり、配列番号16、配列番号17及び配列番号18からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号32、配列番号33、配列番号34の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、第2の抗原結合部分と、
(iii)葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子であり、配列番号16、配列番号17及び配列番号18からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号32、配列番号33、配列番号34の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、第3の抗原結合部分と
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
(i)配列番号36のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号31のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、CD3と特異的に結合可能なFab分子である第1の抗原結合部分と、
(ii)配列番号15のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号31のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子である第2の抗原結合部分と、
(iii)配列番号15のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号31のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子である第3の抗原結合部分と
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
(i)CD3と特異的に結合可能なFab分子であり、配列番号37、配列番号38及び配列番号39からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号32、配列番号33、配列番号34の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、第1の抗原結合部分と、
(ii)葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子であり、配列番号16、配列番号402及び配列番号400からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号32、配列番号33、配列番号34の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、第2の抗原結合部分と
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
(i)配列番号36のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号31のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、CD3と特異的に結合可能なFab分子である第1の抗原結合部分と
(ii)配列番号401のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号31のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子である第2の抗原結合部分と
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
(iii)FolR1と特異的に結合可能な第3の抗原結合部分(Fab分子である)を
さらに含む。
(i)CD3と特異的に結合可能なFab分子であり、配列番号37、配列番号38及び配列番号39からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号32、配列番号33、配列番号34の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、第1の抗原結合部分と、
(ii)葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子であり、配列番号16、配列番号402及び配列番号400からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号32、配列番号33、配列番号34の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、第2の抗原結合部分と、
(iii)葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子であり、配列番号16、配列番号402及び配列番号400からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号32、配列番号33、配列番号34の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、第3の抗原結合部分と
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
(i)配列番号36のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号31のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、CD3と特異的に結合可能なFab分子である第1の抗原結合部分と、
(ii)配列番号401のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号31のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子である第2の抗原結合部分と、
(iii)配列番号401のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号31のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子である第3の抗原結合部分と
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
本発明の発明者らは、結合部分の1つが、クロスオーバーFab断片である第2の二重特異性抗体形式を作製した。本発明の一態様では、IgG分子のFab断片の1つが、クロスオーバーFab断片によって置換されている一価の二重特異性抗体が提供される。クロスオーバーFab断片は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているFab断片である。クロスオーバーFab断片を含む二重特異性抗体形式は、例えば、国際公開第2009080252号、国際公開第2009080253号、国際公開第2009080251号、国際公開第2009080254号、国際公開第2010/136172号、国際公開第2010/145792号及び国際公開第2013/026831号に記載されている。特定の実施態様では、第1の抗原結合部分は、Fab軽鎖及びFab重鎖の可変又は定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子である。このような修飾は、異なるFab分子に由来する重鎖及び軽鎖のミスペアリングを阻止し、それによって、組換え製造において本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善する。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子にとって有用な特定のクロスオーバーFab分子では、Fab軽鎖及びFab重鎖の可変領域が交換される。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子にとって有用な別のクロスオーバーFab分子では、Fab軽鎖及びFab重鎖の定常領域が交換される。
(i)配列番号37、配列番号38及び配列番号39からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号32、配列番号33、配列番号34の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、CD3と特異的に結合可能なクロスオーバーFab分子である第1の抗原結合部分と、
(ii)配列番号8、配列番号56及び配列番号57からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号59、配列番号60、配列番号65の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第2の抗原結合部分と
を含む。
(i)配列番号36のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号31のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、CD3と特異的に結合可能なクロスオーバーFab分子である第1の抗原結合部分と、
(ii)配列番号55のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号64のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子である第2の抗原結合部分と
を含む。
(iii)FolR1と特異的に結合可能な第3の抗原結合部分
をさらに含む。
(i)配列番号37、配列番号38及び配列番号39からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号32、配列番号33、配列番号34の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、CD3と特異的に結合可能なクロスオーバーFab分子である第1の抗原結合部分と、
(ii)配列番号8、配列番号56及び配列番号57からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号59、配列番号60、配列番号65の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第2の抗原結合部分と、
(iii)配列番号8、配列番号56及び配列番号57からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号59、配列番号60、配列番号65の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第3の抗原結合部分と
を含む。
(i)配列番号36のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号31のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、CD3と特異的に結合可能なクロスオーバーFab分子である第1の抗原結合部分と、
(ii)配列番号55のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号64のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子である第2の抗原結合部分と、
(iii)配列番号55のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号64のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子である第3の抗原結合部分と
を含む。
(i)配列番号37、配列番号38及び配列番号39からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号32、配列番号33、配列番号34の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、CD3と特異的に結合可能なクロスオーバーFab分子である第1の抗原結合部分と、
(ii)配列番号8、配列番号9及び配列番号50からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号52、配列番号53、配列番号54の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第2の抗原結合部分と
を含む。
(i)配列番号36のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号31のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、CD3と特異的に結合可能なクロスオーバーFab分子である第1の抗原結合部分と、
(ii)配列番号49のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号51のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子である第2の抗原結合部分と
を含む。
(iii)FolR1と特異的に結合可能な第3の抗原結合部分
をさらに含む。
(i)配列番号37、配列番号38及び配列番号39からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号32、配列番号33、配列番号34の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、CD3と特異的に結合可能なクロスオーバーFab分子である第1の抗原結合部分と、
(ii)配列番号8、配列番号9及び配列番号49からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号52、配列番号53、配列番号54の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第2の抗原結合部分と、
(iii)配列番号8、配列番号9及び配列番号50からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)並びに配列番号52、配列番号53、配列番号54の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第3の抗原結合部分と
を含む。
(i)配列番号36のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号31のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、CD3と特異的に結合可能なクロスオーバーFab分子である第1の抗原結合部分と、
(ii)配列番号49のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号51のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子である第2の抗原結合部分と、
(iii)配列番号49のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号51のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能なFab分子である第3の抗原結合部分と
を含む。
上記で、及び図1A−Iにおいて表されるように、一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、2種の異なる抗原に対する特異性を付与する、同一軽鎖(VLCL)を有し、異なる重鎖(VHCL)を有する少なくとも2つのFab断片を含む、すなわち、一方のFab断片は、T細胞活性化抗原CD3に対して特異的に結合可能であり、もう一方のFab断片は、標的細胞抗原FolR1と特異的に結合可能である。
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含むポリペプチド鎖の対からなる。例えば、免疫グロブリンG(IgG)分子のFcドメインは、ダイマーであり、その各サブユニットは、CH2及びCH3 IgG重鎖定常ドメインを含む。Fcドメインの2つのサブユニットは、互いに安定に会合可能である。一実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、1つ以下のFcドメインを含む。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Fcドメインの2つのサブユニットのうち一方又はもう一方と融合している異なる抗原結合部分を含み、したがって、Fcドメインの2つのサブユニットは、通常、2つの非同一ポリペプチド鎖中に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化は、2種のポリペプチドのいくつかの可能性ある組合せにつながる。したがって、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメイン中に、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することは、組換え製造におけるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善するために有利となろう。
Fcドメインは、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子に、標識組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期及び好ましい組織−血液分布比を含む、好ましい薬物動態特性を付与する。しかし、同時に、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の、好ましい抗原を有する細胞よりもFc受容体を発現する細胞への望ましくない標的化につながり得る。さらに、Fc受容体シグナル伝達経路の同時活性化は、サイトカイン放出につながり得、これは、抗原結合分子のT細胞活性化特性及び長い半減期と組み合わせて、全身投与の際にサイトカイン受容体の過剰な活性化及び重度の副作用をもたらす。T細胞以外の(Fc受容体を有する)免疫細胞の活性化は、例えば、NK細胞によるT細胞の可能性ある破壊のためにT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効性をさらに低減し得る。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、異なる抗原結合部分を含み、その一部は、Fcドメインの2つのサブユニットの一方又はもう一方と融合しており、したがって、Fcドメインの2つのサブユニットは、通常、2つの非同一ポリペプチド鎖中に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化は、2種のポリペプチドのいくつかの可能性ある組合せにつながる。したがって、組換え製造における本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を改善するために、本発明の二重特異性抗体のFcドメイン中に、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利となる。
当業者ならば、がん性及び非がん性の健常細胞間を選択的に区別する分子の有利な効率を理解できる。この目的を達成するための1つの方法は、適当な標的選択によってである。もっぱら腫瘍細胞で発現されるマーカーを使用して、このようなマーカーを発現しない正常細胞を残しながら、エフェクター分子又は細胞を腫瘍細胞に選択的に標的化できる。しかし、いくつかの例では、正常組織においても、いわゆる腫瘍細胞マーカーが、より低いレベルではあるが発現される。正常組織におけるこの発現は、毒性の可能性を高める。したがって、当該技術分野では、腫瘍細胞をより選択的に標的化できる分子が必要であった。本明細書において記載される本発明は、FolR1ポジティブ腫瘍細胞を選択的に標的化し、FolR1を低レベルで発現するか、又は全く発現しない正常な非がん性細胞を標的化しないT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、高及び低FolR1発現細胞間の区別を可能にする結合活性効果を付与する、比較的低い親和性の、少なくとも2つの、好ましくは2つのFolR1結合部分を含む。腫瘍細胞は、FolR1を高又は中程度のレベルで発現するので、本発明のこの実施態様は、腫瘍細胞と選択的に結合し、及び/又はその死滅を誘導し、FolR1を低レベルで発現するか、又は全く発現しない正常な非がん性細胞とは選択的に結合せず、及び/又はその死滅を誘導しない。一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、2+1インバーテッド形式である。一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、FolR1ポジティブ腫瘍細胞のT細胞媒介性死滅を誘導するが、非腫瘍細胞のT細胞媒介性死滅を誘導せず、配列番号37の重鎖CDR1、配列番号38の重鎖CDR2、配列番号39の重鎖CDR3、配列番号32の軽鎖CDR1、配列番号33の軽鎖CDR2及び配列番号34の軽鎖CDR3を含むCD3抗原結合部分並びに各々、配列番号8の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、配列番号50の重鎖CDR3、配列番号52の軽鎖CDR1、配列番号53の軽鎖CDR2及び配列番号54の軽鎖CDR3を含む2つのFolR1抗原結合部分を含む。
個体に、有効量のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びPD−1軸結合アンタゴニストを投与することを含む、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための方法が、本明細書において提供される。例えば、PD−1軸結合アンタゴニストは、PD−1結合アンタゴニスト、PDL1結合アンタゴニスト及びPDL2結合アンタゴニストを含む。「PD−1」の別名として、CD279及びSLEB2が挙げられる。「PDL1」の別名として、B7−H1、B7−4、CD274及びB7−Hが挙げられる。「PDL2」の別名として、B7−DC、Btdc及びCD273が挙げられる。いくつかの実施態様では、PD−1、PDL1及びPDL2は、ヒトPD−1、PDL1及びPDL2である。
(a)重鎖配列は、
重鎖配列:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号274)
に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%配列同一性を有するか、又は
(b)軽鎖配列は、
軽鎖配列:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号275)
に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。
(a)重鎖配列は、
重鎖配列:QVQLVQSGVE VKKPGASVKVSCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG INPSNGGTNF NEKFKNRVTLTTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRDYRFDMGFDYW GQGTTVTVSSASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPS NTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK(配列番号276)
に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%配列同一性を有するか、又は
(b)軽鎖配列は、
軽鎖配列:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC(配列番号277)
に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。
(a)HVR−H1配列は、GFTFSX1SWIH(配列番号283)であり、
(b)HVR−H2配列は、AWIX2PYGGSX3YYADSVKG(配列番号284)であり、
(c)HVR−H3配列は、RHWPGGFDY(配列番号285)であり、
さらに、ここで、X1は、D又はGであり、X2は、S又はLであり、X3は、T又はSである。
HC−FR1は、EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(配列番号295)であり、
HC−FR2は、WVRQAPGKGLEWV(配列番号296)であり、
HC−FR3は、RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号297)であり、
HC−FR4は、WGQGTLVTVSA(配列番号298)である。
(a)HVR−L1配列は、RASQX4X5X6TX7X8A(配列番号286)であり、
(b)HVR−L2配列は、SASX9LX10S(配列番号287)であり、
(c)HVR−L3配列は、QQX11X12X13X14PX15T(配列番号288)であり、
さらにここで、X4は、D又はVであり、X5は、V又はIであり、X6は、S又はNであり、X7は、A又はFであり、X8は、V又はLであり、X9は、F又はTであり、X10は、Y又はAであり、X11は、Y、G、F又はSであり、X12は、L、Y、F又はWであり、X13は、Y、N、A、T、G、F又はIであり、X14は、H、V、P、T又はIであり、X15は、A、W、R、P又はTである。
LC−FR1は、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号300)であり、
LC−FR2は、WYQQKPGKAPKLLIY(配列番号301)であり、
LC−FR3は、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号302)であり、
LC−FR4は、FGQGTKVEIKR(配列番号303)である。
(a)重鎖は、HVR−H1、HVR−H2及びHVR−H3を含み、ここで、さらに
(i)HVR−H1配列は、GFTFSX1SWIH(配列番号283)であり、
(ii)HVR−H2配列は、AWIX2PYGGSX3YYADSVKG(配列番号284)であり、
(iii)HVR−H3配列は、RHWPGGFDY(配列番号285)であり、
(b)軽鎖は、HVR−L1、HVR−L2及びHVR−L3を含み、ここで、さらに、
(i)HVR−L1配列は、RASQX4X5X6TX7X8A(配列番号286)であり、
(ii)HVR−L2配列は、SASX9LX10S(配列番号287)であり、
(iii)HVR−L3配列は、QQX11X12X13X14PX15T(配列番号288)であり、
さらにここで、X1は、D又はGであり、X2は、S又はLであり、X3は、T又はSであり、X4は、D又はVであり、X5は、V又はIであり、X6は、S又はNであり、X7は、A又はFであり、X8は、V又はLであり、X9は、F又はTであり、X10は、Y又はAであり、X11は、Y、G、F又はSであり、X12は、L、Y、F又はWであり、X13は、Y、N、A、T、G、F又はIであり、X14は、H、V、P、T又はIであり、X15は、A、W、R、P又はTである。
HC−FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(配列番号295)
HC−FR2 WVRQAPGKGLEWV(配列番号296)
HC−FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号297)
HC−FR4 WGQGTLVTVSA(配列番号298)。
LC−FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号300)
LC−FR2 WYQQKPGKAPKLLIY(配列番号301)
LC−FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号302)
LC−FR4 FGQGTKVEIKR(配列番号303)。
(a)重鎖は、それぞれGFTFSDSWIH(配列番号289)、AWISPYGGSTYYADSVKG(配列番号290)、およびRHWPGGFDY(配列番号291)に対して少なくとも85%の配列同一性を有するHVR−H1、HVR−H2及びHVRH3配列をさらに含むか、又は
(b)軽鎖は、それぞれ、RASQDVSTAVA(配列番号292)、SASFLYS(配列番号293)およびQQYLYHPAT(配列番号294)に対して少なくとも85%の配列同一性を有するHVR−L1、HVR−L2及びHVR−L3配列をさらに含み。
HC−FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(配列番号295)
HC−FR2 WVRQAPGKGLEWV(配列番号296)
HC−FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号297)
HC−FR4 WGQGTLVTVSA(配列番号298)。
LC−FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号300)
LC−FR2 WYQQKPGKAPKLLIY(配列番号301)
LC−FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号302)
LC−FR4 FGQGTKVEIKR(配列番号303)。
(a)重鎖配列は、重鎖配列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA(配列番号382)
に対して少なくとも85%の配列同一性を有するか、又は
(b)軽鎖配列は、軽鎖配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIY SASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(配列番号383)
に対して少なくとも85%の配列同一性を有する。
HC−FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(配列番号295)
HC−FR2 WVRQAPGKGLEWV(配列番号296)
HC−FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号297)
HC−FR4 WGQGTLVTVSA(配列番号298)。
LC−FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号300)
LC−FR2 WYQQKPGKAPKLLIY(配列番号301)
LC−FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号302)
LC−FR4 FGQGTKVEIKR(配列番号303)。
(a)重鎖配列は、重鎖配列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(配列番号280)に対して少なくとも85%の配列同一性を有するか、又は
(b)軽鎖配列は、軽鎖配列:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIY SASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(配列番号383)に対して少なくとも85%の配列同一性を有する。
(a)重鎖配列は、重鎖配列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTK(配列番号281)
に対して少なくとも85%の配列同一性を有するか、又は
(b)軽鎖配列は、軽鎖配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF
LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(配列番号282)
に対して少なくとも85%の配列同一性を有する。
HC−FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(配列番号295)
HC−FR2 WVRQAPGKGLEWV(配列番号296)
HC−FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号297)
HC−FR4 WGQGTLVTVSS(配列番号299)。
LC−FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号300)
LC−FR2 WYQQKPGKAPKLLIY(配列番号301)
LC−FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号302)
LC−FR4 FGQGTKVEIKR(配列番号303)。
(a)重鎖配列は、重鎖配列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(配列番号278)
に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するか、又は
(b)軽鎖配列は、軽鎖配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号279)
に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。
(a)重鎖は、それぞれ、GFTFSDSWIH(配列番号289)、AWISPYGGSTYYADSVKG(配列番号290)およびRHWPGGFDY(配列番号291)に対して少なくとも85%の配列同一性を有するHVR−H1、HVR−H2及びHVRH3配列をさらに含み、
(b)軽鎖は、それぞれ、
RASQDVSTAVA(配列番号292)、SASFLYS(配列番号293)およびQQYLYHPAT(配列番号294)に対して少なくとも85%の配列同一性を有するHVR−L1、HVR−L2及びHVR−L3配列をさらに含む。
HC−FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(配列番号295)
HC−FR2 WVRQAPGKGLEWV(配列番号296)
HC−FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号297)
HC−FR4 WGQGTLVTVSA(配列番号298)。
LC−FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号300)
LC−FR2 WYQQKPGKAPKLLIY(配列番号301)
LC−FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号302)
LC−FR4 FGQGTKVEIKR(配列番号303)。
個体に有効量のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子、PD−1軸結合アンタゴニスト及びTIM−3アンタゴニストを投与することを含む、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための方法が、本明細書において提供される。一実施態様では、TIM−3アンタゴニストは、抗TIM−3抗体である。いくつかの実施態様では、抗TIM3は、FACS解析によって調べられるように、37℃で120分後に、少なくとも45%の細胞上で発現されたTIM3の内部移行を誘導する。細胞は、例えば、RPMI8226細胞(ATCC(登録商標)CCL−155(商標))である。一実施態様では、抗体は、FACS解析によって調べられるように、37℃で120分後に、少なくとも55%のTIM3を発現するRPMI8226細胞(ATCC(登録商標)CCL−155(商標))上でTIM3の内部移行を誘導する。一実施態様では、抗体は、FACS解析によって調べられるように、37℃で240分後に、少なくとも60%のTIM3を発現するRPMI8226細胞(ATCC(登録商標)CCL−155(商標))上でTIM3の内部移行を誘導する。一実施態様では、抗体は、FACS解析によって調べられるように、37℃で240分後に、少なくとも65%のTIM3を発現するRPMI8226細胞(ATCC(登録商標)CCL−155(商標))上でTIM3の内部移行を誘導する。
i)配列番号310のVH配列及び配列番号311のVL配列を含み、
ii)配列番号312のVH配列及び配列番号313のVL配列を含み、
iii)又はi)若しくはii)の下で抗体のVH及びVLのヒト化変異体を含む。
i)配列番号322のVH配列及び配列番号323のVL配列を含み、
ii)i)の下で抗体のVH及びVLのヒト化変異体を含む。
i)配列番号330のVH配列及び配列番号331のVL配列を含み、
ii)i)の下で抗体のVH及びVLのヒト化変異体を含む。
i)配列番号338のVH配列及び配列番号339のVL配列を含み、
ii)i)の下で抗体のVH及びVLのヒト化変異体を含む。
i)配列番号346のVH配列及び配列番号347のVL配列を含み、
ii)i)の下で抗体のVH及びVLのヒト化変異体を含む。
i)配列番号354のVH配列及び配列番号355のVL配列を含み、
ii)i)の下で抗体のVH及びVLのヒト化変異体を含む。
i)配列番号362のVH配列及び配列番号363のVL配列を含み、
ii)i)の下で抗体のVH及びVLのヒト化変異体を含む。
i)配列番号370のVH配列及び配列番号371のVL配列を含み、
ii)i)の下で抗体のVH及びVLのヒト化変異体を含む。
上記のように、いくつかの実施態様では、PD−1結合アンタゴニストは、抗体(例えば、抗PD−1抗体、抗PDL1抗体又は抗PDL2抗体)である。いくつかの実施態様では、TIM3アンタゴニストは、抗体(例えば、抗TIM3アンタゴニスト抗体)である。本明細書において記載された抗体は、抗体を作製するための当該技術分野で入手可能な技術を使用して調製でき、その例示的方法は、以下の節により詳細に記載されている。
特定の実施態様では、本明細書において記載される抗体は、抗体断片である。抗体断片として、それだけには限らないが、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、Fv及びscFv断片及び以下に記載されるその他の断片が挙げられる。特定の抗体断片の概説については、Hudson等 Nat.Med.9:129−134(2003)を参照のこと。scFv断片の概説については、例えば、Pluckthun、in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、第113巻、Rosenburg及びMoore編、(Springer−Verlag、New York)、p.269−315(1994)を参照のこと;国際公開第93/16185号及び米国特許第5571894号及び同5587458号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増大したFab及びF(ab’)2断片の考察については、米国特許第5869046号を参照のこと。
特定の実施態様では、本明細書において記載される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4816567号;及びMorrison等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:6851−6855(1984)に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ又はサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域)及びヒト定常領域を含む。さらなる実施例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが、親抗体のものから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。特定の実施態様では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。通常、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を維持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるようにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、1つ又は複数の可変ドメインを含み、これでは、HVR、例えば、CDR、(又はその一部)は、非ヒト抗体に由来し、FR(又はその一部)は、ヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施態様では、例えば、抗体特異性又は親和性を回復させる又は改善するように、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基が、非ヒト抗体(例えば、HVR残基が由来する抗体)に由来する対応する残基で置換されている。
特定の実施態様では、本明細書において記載される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の種々の技術を使用して製造できる。ヒト抗体は、全般的に、van Dijk及びvan de Winkel、Curr.Opin.Pharmacol.5:368−74(2001)及びLonberg、Curr.Opin.Immunol.20:450−459(2008)に記載されている。
抗体は、所望の活性(単数又は複数)を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離できる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体についてこのようなライブラリーをスクリーニングするための種々の方法が、当該技術分野で公知である。このような方法は、例えば、Methods in Molecular Biology178:1−37中のHoogenboom等(O’Brien等、編、Human Press、Totowa、NJ、2001)に概説されており、例えば、McCafferty等、Nature348:552−554;Clackson等、Nature352:624−628(1991);Marks等、J.Mol.Biol.222:581−597(1992);Methods in Molecular Biology248:161−175中のMarks及びBradbury(Lo編、Human Press、Totowa、NJ、2003);Sidhu等、J.Mol.Biol.338(2):299−310(2004);Lee等、J.Mol.Biol.340(5):1073−1093(2004);Fellouse、Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467−12472(2004);及びLee等、J.Immunol.Methods284(1−2):119−132(2004)にさらに記載されている。
特定の実施態様では、本明細書において記載される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。FolR1及びCD3に対して特異的なT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の例が、本明細書において記載されている。いくつかの実施態様では、PD1軸成分アンタゴニストは、多重特異性である。結合特異性の一方では、PD−1軸成分(例えば、PD−1、PDL1又はPDL2)に対してであり、もう一方は、任意のその他の抗原に対してである。いくつかの実施態様では、結合特異性の一方は、IL−17又はIL−17Rに対してであり、もう一方は、任意のその他の抗原に対してである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、PD−1軸成分(例えば、PD−1、PDL1又はPDL2)、IL−17又はIL−17Rの2つの異なるエピトープと結合し得る。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製できる。
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、葉酸受容体1(FolR1)に特異的な第1の抗原結合部位及びCD3に特異的な第2の抗原結合部位を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びに抗体をコードするポリヌクレオチドが、本明細書において記載されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体の製造のために使用され得る。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体は、全二重特異性抗原結合分子をコードする単一ポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数の(例えば、2つ以上の)ポリヌクレオチドとして発現され得る。共発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又はその他の手段によって会合して、機能的T細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体を形成し得る。例えば、Fab断片の軽鎖部分は、Fab断片の重鎖部分、Fcドメインサブユニット及び任意選択的に別のFab断片(の一部)を含む、二重特異性抗体又はFolR1と結合する抗体の部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されると、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合して、Fab断片を形成する。別の例では、2つのFcドメインサブユニットのうちの1つ及び任意選択的に1つ又は複数のFab断片(の一部)を含む、本明細書において提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分又はFolR1抗原結合部分は、2つのFcドメインサブユニットのうちのもう一方及び任意選択的にFab断片(の一部)を含む、本明細書において提供される二重特異性抗体又はFolR1と結合する抗体の部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されると、Fcドメインサブユニットは会合して、Fcドメインを形成する。
特定の実施態様では、上記のものに加えて、本明細書において提供されるFolR1及びCD3に特異的なT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のアミノ酸配列変異体並びに抗体が考慮される。例えば、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性及び/又はその他の生物学的特性を改善することが望ましいことであり得る。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体のアミノ酸配列変異体は、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は抗体をコードするヌクレオチド配列中に適当な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製できる。このような修飾として、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失及び/又はそれへの挿入及び/又はその置換が挙げられる。最終コンストラクトが、所望の特性、例えば、抗原結合性を有する限り、欠失、挿入及び置換の任意の組合せを行って、最終コンストラクトに到達できる。
特定の実施態様では、1つ又は複数のアミノ酸置換を有する変異体が提供される。置換突然変異誘発のための対象の部位として、HVR及びFRが挙げられる。保存的置換は、「保存的置換」の表題のもと表Bに示されている。「例示的置換」の表題のもと表Bにおいて、アミノ酸側鎖クラスに関して以下にさらに記載されるように、より実質的な変更が提供されている。アミノ酸置換は、対象の抗体中に導入され得、生成物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持/改善、免疫原性の低減又はADCC若しくはCDCの改善ついてスクリーニングされる。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
特定の実施態様では、本明細書において提供されたT細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増大又は低減するように変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、簡便には、1つ又は複数のグリコシル化部位が作製又は除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって達成され得る。
特定の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の1個又は複数の残基が、システイン残基で置換されているシステイン操作されたT細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体、例えば、TIOMABSを作製することが望ましいものであり得る。特定の実施態様では、置換された残基は、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の到達可能な部位で起こる。それらの残基をシステインで置換することによって、それによって反応性チオール基が、抗体の到達可能な部位に位置付けられ、抗体を、薬物部分又はリンカー−薬物部分などのその他の部分にコンジュゲートして、イムノコンジュゲートを作製するために使用され得る。特定の実施態様では、以下の残基のうち任意の1個又は複数が、システインで置換され得る:軽鎖のV205(カバット番号付け);重鎖のA118(EU番号付け)及び重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第7521541号に記載されるように作製できる。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体は、例えば、固体状態ペプチド合成(例えば、Merrifield固相合成)又は組換え製造によって得ることができる。組換え製造のために、例えば、上記のような、1種又は複数の、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は抗体(又は断片)をコードするポリヌクレオチドを単離し、さらなるクローニング及び/又は宿主細胞における発現のために、1種又は複数のベクター中に挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来手順を使用して容易に単離でき、配列決定できる。一実施態様では、1種又は複数の本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは、発現ベクターが提供される。当業者に周知である方法を使用して、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は抗体のコード配列を、適当な転写/翻訳制御シグナルとともに含有する発現ベクターを構築できる。これらの方法として、インビトロ組換えDNA技術、合成技術及びインビボ組換え/遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Maniatis等、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory、N.Y.(1989);及びAusubel等、CURRENT PROOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、N.Y(1989)に記載される技術を参照のこと。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であり得るか、又は核酸断片であり得る。発現ベクターは、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)又は抗体(断片)をコードするポリヌクレオチド(すなわち、コード領域)が、プロモーター及び/又はその他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に関連してクローニングされる発現カセットを含む。本明細書において、「コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されるコドンから核酸の部分である。「停止コドン」(TAG、TGA又はTAA)は、アミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部であると考えられ得、しかし、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’及び3’非翻訳領域などは、コード領域の一部ではない。単一ポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば、単一ベクター上に、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば、別個の(異なる)ベクター上に2種以上のコード領域が存在し得る。さらに、任意のベクターが、単一のコード領域を含有し得るか、又は2種以上のコード領域を含み得る、例えば、本発明のベクターは、タンパク質分解による切断によって最終タンパク質に翻訳後に又は同時翻訳的に分離される、1種又は複数のポリペプチドをコードし得る。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)若しくは抗体又はその変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドと融合しているか、又は融合していない、異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、制限なく、分泌シグナルペプチド又は異種機能的ドメインなどの特定のエレメント又はモチーフを含む。作動可能な関連は、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列(単数又は複数)の影響又は制御下に置くような方法で、1種又は複数の調節配列と関連している場合である。2種のDNA断片(ポリペプチドコード領域及びそれと関連しているプロモーターなど)は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合に、及び2種のDNA断片間の連結の性質が、発現調節配列の遺伝子産物の発現を指示する能力に干渉しない、若しくはDNA鋳型が転写される能力に干渉しない場合に、「作動可能に関連している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが、その核酸の転写を達成可能であった場合に、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に関連する。プロモーターは、所定の細胞においてのみDNAの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。
本明細書において提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、葉酸受容体1(FolR1)に特異的な第1の抗原結合部位及びCD3に特異的な第2の抗原結合部位を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びに抗体、例えば、抗PD−1軸結合アンタゴニスト抗体及び抗TIM3アンタゴニスト抗体は、当該技術分野で公知の種々のアッセイによって、その物理的/化学的特性及び/又は生物活性について同定、スクリーニングされ、又は特徴を明らかにされ得る。
そのそれぞれの抗原、例えば、FolR1、PD−1、PD−L1、TIM3に対する、本明細書において提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、葉酸受容体1(FolR1)に特異的な第1の抗原結合部位及びCD3に特異的な第2の抗原結合部位を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びに抗体、例えば、抗PD−1軸結合アンタゴニスト抗体及び抗TIM3アンタゴニスト抗体の親和性は、BIAcore機器(GE Healthcare)などの標準機器使用及び組換え発現によって得ることができるような受容体又は標的タンパク質を使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)によって実施例に示される方法に従って決定できる。あるいは、本明細書において提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体の、そのそれぞれの抗原との結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えば、フローサイトメトリー(FACS)によって評価できる。
一態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、葉酸受容体1(FolR1)に特異的な第1の抗原結合部位及びCD3に特異的な第2の抗原結合部位を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びに抗体、例えば、抗PD−1軸結合アンタゴニスト抗体及び抗TIM3アンタゴニスト抗体は、例えば、ELISA、ウェスタンブロットなどといった公知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。
一態様では、生物活性を有する、本明細書において提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、葉酸受容体1(FolR1)に特異的な第1の抗原結合部位及びCD3に特異的な第2の抗原結合部位を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びに抗体、例えば、抗PD−1軸結合アンタゴニスト抗体及び抗TIM3アンタゴニスト抗体を同定するためのアッセイが、提供される。生物活性は、例えば、DNA断片化の誘導、標的化された細胞のアポトーシス及び溶解の誘導を含み得る。インビボ及び/又はインビトロでこのような生物活性を有する抗体も提供される。
本明細書において記載されるような、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、葉酸受容体1(FolR1)に特異的な第1の抗原結合部位及びCD3に特異的な第2の抗原結合部位を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びに抗体、例えば、抗PD−1軸結合アンタゴニスト抗体及び抗TIM3アンタゴニスト抗体の薬学的製剤を、所望の程度の純度を有するこのようなT細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は抗体を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態の、1種又は複数の任意選択の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版、Osol、A.編(1980))と混合することによって調製する。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投与量及び濃度でレシピエントにとって非毒性であり、それだけには限らないが、リン酸、クエン酸及びその他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロライド;ベンザルコニウムクロライド;ベンゼトニウムクロライド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾールなど);低分子量(約10個未満の残基)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸;単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含むその他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類;ナトリウムなどの塩形成性対イオン;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質複合体);及び/又はポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、rHuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International、Inc.)などのヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの間質薬物分散剤をさらに含む。rHuPH20を含む特定の例示的sHASEGP及び使用方法は、米国特許公開第2005/0260186号及び同2006/0104968号に記載されている。一態様では、sHASEGPを、コンドロイチナーゼなどの1種又は複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼと混合する。
本明細書において提供される1種又は複数のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗PD−1軸結合アンタゴニスト抗体、及び任意選択的にTIM3アンタゴニストを含む治療的組合せが治療方法において使用され得る。
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、阻止及び/又は診断にとって有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器及び容器上の、又は容器と関連している表示又は添付文書を含む。適した容器として、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。容器は、それだけであるか、又は状態の治療、阻止及び/又は診断に有効な別の組成物と混合された組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る(例えば、容器は、皮下注射ニードルによって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであり得る)。組成物中の少なくとも1種の活性薬剤は、二重特異性抗体であり、さらなる活性薬剤は、本明細書において記載されたようなさらなる化学療法剤である。表示又は添付文書は、組成物が、選択した状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、(a)二重特異性抗体を含む組成物が中に含有された第1の容器と、(b)さらなる細胞傷害性又はそうでなければ治療剤を含む組成物が中に含有された第2の容器を含み得る。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物が、特定の状態を治療するために使用され得ることを示す添付文書をさらに含み得る。あるいは、又はさらに、製造品は、静菌性の注射用水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストローズ溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む第2の(又は第3の)容器をさらに含み得る。その他のバッファー、希釈剤、フィルター、ニードル及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上記に示されている一般的な説明を考慮して、多様な他の実施態様が実施され得ることが理解される。
組換えDNA技術
DNAを操作するために、Sambrook等、Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989に記載のような標準的な方法が使用された。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書によって使用された。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に示されている:Kabat,E.A..等、(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、NIH Publication No.91−3242。
DNA配列は、二本鎖配列決定によって決定された。
必要とされる場合、望ましい遺伝子セグメントは、適切な鋳型を使用するPCRによって作製されたもの又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びPCR産物からGeneart AG(Regensburg、Germany)によって合成されたものの何れかである。正確な遺伝子配列が得られない場合には、オリゴヌクレオチドプライマーは、最も近いホモログからの配列に基づいて設計され、遺伝子は、適切な組織に由来するRNAからのRT−PCRによって単離された。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が側面に位置した遺伝子セグメントは、標準的なクローニング/配列決定ベクター内にクローニングされた。プラスミドDNAは、形質転換された細菌から精製され、濃度は、UV分光法によって決定された。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列は、DNA配列決定によって確認された。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター内にサブクローニングすることを可能にするための好適な制限部位で設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードしている5’末端DNA配列付きで設計された。
末梢血単核細胞(PBMC)は、地域血液銀行から又は健常なヒトのドナーからの新しい血液から得られた濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)からのHistopaque密度遠心分離によって調製された。簡単に説明すると、血液は、滅菌PBSで希釈され、Histopaque勾配(Sigma、H8889)の上に注意深く層にされた。(ブレーキスイッチオフで)室温で30分間の450×gでの遠心分離後、PBMCを含む中間相より上の血漿の部分は捨てられた。PBMCは、新しい50mlのFalconチューブ内に移され、チューブは、PBSで50mlの総容量までフィルアップされた。混合物は、(ブレーキスイッチオンで)室温で10分間、400×gで遠心分離された。上清は捨てられ、PBMCペレットは滅菌PBSで2回洗浄された(4℃で10分間の350×gでの遠心分離ステップ)。得られたPBMC集団は、自動的に計数され(ViCell)、10%のFCS及び1%のL−アラニル−L−グルタミン(Biochrom、K0302)を含む、RPMI1640培地中、インキュベーター内で37℃、5%のCO2でアッセイ開始まで保存された。
末梢血単核細胞(PBMC)は、地域血液銀行から又は健常なヒトのドナーからの新しい血液から得られた濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)からのHistopaque密度遠心分離によって調製された。PBMCからのT細胞濃縮は、Miltenyi BiotecからのNaive CD8+ T cell isolation Kit(#130−093−244)を使用して、製造業者の説明書に従ってではあるが、CD8+ T細胞の最後の単離ステップを省いて行われた(初代ヒトpan T細胞の単離についての説明も参照されたい)。
脾臓は、C57BL/6マウスから単離されて、MACSバッファー(PBS+0.5% BSA+2mM EDTA)を含むGentleMACS Cチューブ(Miltenyi Biotech #130−093−237)内に移され、単一細胞浮遊液を得るために製造業者の説明書に従ってGentleMACS Dissociatorで解離された。細胞浮遊液は、プリセパレーションフィルターに通され、残りの非解離組織粒子が除去された。4℃で4分間の400×gでの遠心分離後、ACK溶解バッファーが添加され、赤血球が溶解された(室温で5分間のインキュベーション)。残りの細胞は、MACSバッファーで2回洗浄され、計数されてマウスのpan T細胞の単離に使用された。(磁気的な)ネガティブ選択は、製造業者の説明書に従って、Miltenyi BiotecからのPan T Cell Isolation Kit(#130−090−861)を使用して行われた。得られたT細胞集団は、自動的に計数され(ViCell)、更なるアッセイに直ちに使用された。
末梢血単核細胞(PBMC)は、以下のように、健常なカニクイザルドナーからの新しい血液から密度遠心分離によって調製された:ヘパリン添加血液は、滅菌PBSで1:3希釈され、Lymphoprep培地(Axon Lab #1114545)は、滅菌PBSで90%に希釈された。2倍量の希釈された血液は、1倍量の希釈された密度勾配の上に層にされ、PBMC画分は、ブレーキなしで、室温で30分間の520×gでの遠心分離によって分離された。PBMCバンドは、新しい50mlのFalconチューブ内に移され、4℃で10分間の400×gでの遠心分離によって滅菌PBSで洗浄された。血小板を除去するために、1回の低速遠心分離が行われ(150×g、4℃で15分)、得られたPBMC集団は、自動的に計数され(ViCell)、更なるアッセイに直ちに使用された。
ビオチン化された葉酸受容体−Fc融合体の精製
ヒトFolR1に対する新しい抗体を作製するために、以下の抗原及びスクリーニングツールが、一価のFc融合タンパク質として作製された(抗原の細胞外ドメインが、Fc−ホール分子と共発現されるFc−ノブのヒンジ領域に連結される)。抗原遺伝子は、GenBank又はSwissProtから得られた配列に基づいて合成され(Geneart、Regensburg、Germany)、インビボ又はインビトロでのビオチン化のためのC末端Aviタグ付きのFc−ノブとの融合タンパク質を作製するために発現ベクター内に挿入された。インビボでのビオチン化は、産生中に細菌ビオチンリガーゼをコードしている細菌birA遺伝子を共発現させることによって達成された。全ての遺伝子の発現は、EBNAを含む細胞株におけるプラスミドの安定な維持のためのoriP要素を含むプラスミド上のキメラMPSVプロモーターの制御下にあった。
表1:ヒトFolR1抗体の単離、選択及び対抗選択のために作製された抗原
表2:FolR-Fc-融合体の収量及び最終モノマー含有量のまとめ。
CD3ε特異性を有する共通軽鎖の作製
本明細書に記載のT細胞活性化二重特異性分子は、少なくとも1つのCD3結合部分を含む。この部分は、実験動物を免疫化すること、ファージライブラリーをスクリーニングすること又は既知の抗CD3抗体を使用することによって作製され得る。CD3ε特異性を有する共通軽鎖は、マウス親抗CD3ε抗体(CH2527)の軽鎖をヒト化することによって作製された。ヒト以外の起源の抗体のヒト化のために、ヒト以外の抗体(ドナー)からのCDR残基は、ヒト(アクセプター)抗体のフレームワーク上に移植されなければならない。一般に、アクセプターフレームワーク配列は、ドナーの配列を一まとまりの潜在的なアクセプター配列に対してアラインメントすること、並びにドナーに対する合理的な相同性を有するもの、又は構造及び活性にきわめて重要ないくつかの部位において類似したアミノ酸を示すものの何れかを選択することによって選択される。本場合において、抗体アクセプターフレームワークの探索は、親抗体のマウスVLドメイン配列を一まとまりのヒト生殖系列配列に対してアラインメントすること、及び高い配列同一性を示したヒト配列を選択することによって行われた。驚くべきことに、フレームワーク配列相同性に関する良好な一致は、ラムダ型のVドメインファミリー7に属している比較的稀なヒト軽鎖、より正確には、hVL_7_46(IMGT命名法、GenBank 寄託番号Z73674)において見出された。この稀なヒト軽鎖は、次いで、CH2527の軽鎖のヒト化のためのアクセプターフレームワークとして選択された。マウス軽鎖可変ドメインの3つの相補性決定領域(CDR)は、このアクセプターフレームワーク上にグラフトされた。フレームワーク4領域は生殖系列V遺伝子の可変領域の部分ではないので、この領域(Jエレメント)についてのアライメントは、個別に行われた。それ故に、この軽鎖のヒト化のためにIGLJ3−02配列が選択された。
CD3ε特異性を有するヒト化変異体のSPR評価
ヒト化VL変異体は、2+1 TCB形式の、すなわち、ヒト化軽鎖Vドメインがマウス重鎖Vドメインと対にされた、キメラとして評価された。SPR評価は、ProteOn XPR36機器(Bio−Rad)上で行われた。より正確には、変異体は、抗Fab誘導体化GLMセンサーチップ(ヤギ抗ヒトIgG、F(ab’)2断片特異的、Jackson ImmunoResearch)上で垂直方向で培養液上清から直接に捕捉された。以下の被分析物は、次いで、ヒト及びカニクイザルのCD3εに対する結合を評価するために単一濃度として水平方向に注入された:それぞれ、3μM hu CD3ε(−1−26)−Fc(ノブ)−avi(ID807)及び2.5μM cy CD3ε−(−1−26)−Fc(ノブ)−Avi−Fc(ホール)(ID873)。結合応答は、マウスコントロールコンストラクトの結合と質的に比較され、+(比較可能な結合が観察される)、+/−(低減された結合が観察される)及び−(結合が観察されない)に分類された。捕捉抗体は、リガンド捕捉及び被分析物結合の各サイクルの後に再生され、マウスコンストラクトは、捕捉表面の活性を確認するために試験の終了時に再注入された。結果は、表3にまとめられている。
表3 CH2527のマウス重鎖と組み合わされたヒト化軽鎖変異体についてのSPRに基づいた定性的結合評価。太字で強調されている、最終的に選択されたヒト化軽鎖変異体、CH2527-VL7_46-13のみが、ヒト及びカニクイザルのCD3εに対する比較可能な結合を示した。
CD3ε特異性を有するヒト化共通軽鎖の特性
ヒト化鉛分子のために選択された軽鎖Vドメイン変異体は、VL7_46−13である。ヒト化の程度、すなわち、ヒト生殖系列Vドメイン配列に対するヒト化Vドメインの配列相同性が決定された。VL7_46−13については、最も近いヒト生殖系列ホモログとの全体の配列同一性は、ヒト化前に65%であり、ヒト化後に80%である。CDR領域を除き、配列同一性は、最も近いヒト生殖系列ホモログに対して92%である。表3から理解され得るように、VL7_46−13は、一区画の13種の変異体のうち、親マウス抗体に対する比較可能な結合を示し、且つ更にカニクイザルCD3εに対するその交差反応性を保持した唯一のヒト化VL変異体である。この結果は、CD3εに対する結合親和性を失うことなくマウスVLドメインをヒト化することは簡単ではなく、これには、CDR1内にG24を保持しつつ同時にマウスフレームワーク残基(特にG46)にいくつかの復帰突然変異が必要とされたことを示している。加えて、この結果は、VLドメインが、標的認識において重要な役割を果たすことを示している。重要なことに、ラムダ型のVドメインファミリー7に属しており且つCD3εに対する親和性及び特異性を保持している稀なヒト生殖系列に基づくヒト化VLドメインVL7_46−13は、Fab形式のファージディスプレイされた抗体ライブラリーにおける共通軽鎖としての使用にも好適であり、CD3ε及び、例えば、腫瘍標的に結合し且つ同じ「共通」軽鎖を共有する二重特異性分子の作製及び産生を大いに促進する新規特異性のための選択の成功を可能にする。
HVK1−39に由来するヒト生殖系列共通軽鎖を使用してファージディスプレイされた抗体ライブラリーの作製
全長ヒトIgGに類似した二重特異性抗体を作製するためのいくつかの手法は、異なる2つの重鎖のヘテロ二量体化を誘導するFc領域内の修飾を利用するものである。このような例には、ノブ・イントゥー・ホール(Merchant等、Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677-81)、SEED(Davis等、Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4):195-202)及び静電気的操縦技術(Gunasekaran等、J Biol Chem. 2010 Jun 18;285(25):19637-46)が含まれる。これらの手法は異なる2つの重鎖の有効なヘテロ二量体化を可能にするが、同起源の軽鎖及び重鎖の適切な対形成には問題が残される。共通軽鎖(LC)の使用により、この問題を解決することができる(Merchant等 Nat Biotech 16, 677-681 (1998))。
以下では、M13ファージ上でのディスプレイのための抗体ライブラリーの作製が記載されている。基本的には、本発明者らは、1つの一定の(又は「共通の」)軽鎖を有する重鎖のためのマルチフレームワークライブラリーを設計した。
IGHV1−46*01(X92343)(配列番号104)、
IGHV1−69*06(L22583)、(配列番号105)
IGHV3−15*01(X92216)、(配列番号106)
IGHV3−23*01(M99660)、(配列番号107)
IGHV4−59*01(AB019438)、(配列番号108)
IGHV5−51*01(M99686)、(配列番号109)
全ての親和性成熟ライブラリーでの選択は、標的抗原Xのモノマーの且つビオチン化された細胞外ドメインを使用して溶液中で以下の手順に従って行われる。
ここでは、M13ファージ上でのディスプレイのための抗体ライブラリーの作製が記載されている。基本的には、本発明者らは、1つの一定の(又は「共通の」)軽鎖を有する重鎖のためのマルチフレームワークライブラリーを設計した。このライブラリーは、1つ又は2つのFabが、腫瘍細胞上で発現される腫瘍表面抗原を認識するのに対して、抗体の残りのFabアームが、T細胞上のCD3eを認識する、Fcを含むがFcgR結合不活性な、IgG1 P329G LALA又はIgG4 SPLE PGアイソタイプのT細胞二重特異性抗体の作製のために設計された。
以下では、M13ファージ上でのディスプレイのための抗体ライブラリーの作製が記載されている。基本的には、本発明者らは、1つの一定の(又は「共通の」)軽鎖を有する重鎖のためのマルチフレームワークライブラリーを設計した。このライブラリーは、Fcを含むがFcgR結合不活性な、IgG1 P329G LALA又はIgG4 SPLE PGアイソタイプのT細胞二重特異性抗体の作製のためだけに設計されている。
IGHV1−46*01(X92343)、(配列番号104)
IGHV1−69*06(L22583)、(配列番号105)
IGHV3−15*01(X92216)、(配列番号106)
IGHV3−23*01(M99660)、(配列番号107)
IGHV4−59*01(AB019438)、(配列番号108)
IGHV5−51*01(M99686)、(配列番号109)
FolR1に対する(CD3ε特異性を有する軽鎖を含む)共通軽鎖ライブラリーからの抗体断片の選択
CD3ε特異性を有する共通軽鎖VL7_46−13を含む抗体16A3、15A1、18D3、19E5、19A4、15H7、15B6、16D5、15E12、21D1、16F12、21A5、21G8、19H3、20G6、及び20H7は、異なる種(ヒト、カニクイザル及びマウス)のFolR1に対するファージディスプレイ選択によって得られた。クローン16A3、15A1、18D3、19E5、19A4、15H7、15B6、21D1、16F12、19H3、20G6、及び20H7は、共通軽鎖がヒト生殖系列VH1_46に基づいた重鎖レパートリーと対にされたサブライブラリーから選択された。このサブライブラリーにおいて、VH1_46のCDR3は、異なる6つのCDR3長に基づいて無作為化されている。クローン16D5、15E12、21A5、及び21G8は、共通軽鎖がヒト生殖系列VH3_15に基づいた重鎖レパートリーと対にされたサブライブラリーから選択された。このサブライブラリーにおいて、VH3_15のCDR3は、異なる6つのCDR3長に基づいて無作為化されている。種交差反応性(又はマウスFolR1反応性)抗体を得るために、異なる種のFolR1は、以下の3回のバイオパニングにわたる異なる方法で交替された(又は一定に維持された):16A3及び15A1(ヒト−カニクイザル−ヒトFolR1);18D3(カニクイザル−ヒト−マウスFolR1);19E5及び19A4(マウスFolR1に対して3回);15H7、15B6、16D5、15E12、21D1、16F12、21A5、21G8(ヒト−カニクイザル−ヒトFolR1);19H3、20G6、及び20H7(マウスFolR1に対して3回)。
1.抗原のFc部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇させるために10ug/mlの無関係なヒトIgGで被覆されたマキシソーププレート上の〜1012個のファージミド粒子のプレクリアリング。
2.非Fc結合ファージミド粒子を、100nMのビオチン化されたヒト、カニクイザル、又はマウスのFolR1と共に、Fcバインダーの更なる枯渇のための100nMの無関係な非ビオチン化Fcノブ・イントゥ・ホールコンストラクトの存在下で1mlの総容量で0.5時間インキュベートすること。
3.ニュートラアビジンで予め被覆されたマイクロタイタープレートの4つのウェルに(1回目及び3回目に)10分間移すことにより、ビオチン化されたFolR1及び結合させた、特異的に結合するファージを捕捉すること。
4.5×のPBS/Tween20及び5×のPBSを使用してそれぞれのウェルを洗浄すること。
5.1ウェルあたり250ulの100mMのTEA(トリエチルアミン)の10分間の添加及び4つのウェルからのプールされた溶出液への500ulの1MのTris/HCl pH7.4の添加による中和によってファージ粒子を溶出すること。
6.Fcバインダー及び非特異的バインダーの最終除去のために、ニュートラアビジンで予め被覆されたマイクロタイタープレート上で、100nMのビオチン捕捉されたFolR2又はFolR3と共にインキュベートすることによる、中和された溶出液のポストクリアリング。
7.溶出されたファージ粒子の上清での対数増殖期大腸菌TG1細胞の再感染、ヘルパーファージVCSM13での感染、振盪機上での30℃で一晩のインキュベーション及びその後の次の選択回において使用されるファージミド粒子のPEG/NaCl沈澱。
表4:VL7_46-13、CD3εに特異的なヒト化軽鎖を含む共通軽鎖サブライブラリーからファージディスプレイによって選択された抗FolR1抗体(Fab形式)についての平衡解離定数(KD)。nMでのKD。
FolR1に対する一般的なマルチフレームワークライブラリーからの抗体断片の選択
抗体11F8、36F2、9D11、5D9、6B6、及び14E4は、異なる種(ヒト、カニクイザル及びマウス)のFolR1に対する一般的なマルチフレームワークサブライブラリーに基づいたファージディスプレイ選択によって得られた。これらのマルチフレームワークサブライブラリーにおいて、無作為化されたCDR3(異なる3つの長さ)を有する異なるVLドメインは、無作為化されたCDR3(異なる6つの長さ)を有する異なるVHドメインと対にされる。選択されたクローンは、以下のVL/VHペアリングのものである:11F8(Vk_1_5/VH_1_69)、36F2(Vk_3_20/VH_1_46)、9D11(Vk2D_28/VH1_46)、5D9(Vk3_20/VH1_46)、6B6(Vk3_20/VH1_46)、及び14E4(Vk3_20/VH3_23)。種交差反応性(又はマウスFolR1反応性)抗体を得るために、異なる種のFolR1は、以下の3回又は4回のバイオパニングにわたる異なる方法で交替された(又は一定に維持された):11F8(カニクイザル−マウス−ヒトFolR1);36F2(ヒト−マウス−カニクイザル−マウスFolR1);9D11(カニクイザル−ヒト−カニクイザルFolR1);5D9(ヒト−カニクイザル−ヒトFolR1);6B6(ヒト−カニクイザル−ヒトFolR1)及び14E4(マウスFolR1に対して3回)。
1.抗原のFc部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇させるために10ug/mlの無関係なヒトIgGで被覆されたマキシソーププレート上の〜1012個のファージミド粒子のプレクリアリング。
2.非Fc結合ファージミド粒子を、100nMのビオチン化されたヒト、カニクイザル、又はマウスのFolR1と共に、Fcバインダーの更なる枯渇のための100nMの無関係な非ビオチン化Fcノブ・イントゥ・ホールコンストラクトの存在下で1mlの総容量で0.5時間インキュベートすること。
3.ニュートラアビジンで予め被覆されたマイクロタイタープレートの4つのウェルに(1回目及び3回目に)10分間移すことにより、ビオチン化されたFolR1及び結合させた、特異的に結合するファージを捕捉すること。
4.5×のPBS/Tween20及び5×のPBSを使用してそれぞれのウェルを洗浄すること。
5.1ウェルあたり250ulの100mMのTEA(トリエチルアミン)の10分間の添加及び4つのウェルからのプールされた溶出液への500ulの1MのTris/HCl pH7.4の添加による中和によってファージ粒子を溶出すること。
6.Fcバインダー及び非特異的バインダーの最終除去のために、ニュートラアビジンで予め被覆されたマイクロタイタープレート上で、100nMのビオチン捕捉されたFolR2又はFolR3と共にインキュベートすることによる、中和された溶出液のポストクリアリング。
7.溶出されたファージ粒子の上清での対数増殖期大腸菌TG1細胞の再感染、ヘルパーファージVCSM13での感染、振盪機上での30℃で一晩のインキュベーション及びその後の次の選択回において使用されるファージミド粒子のPEG/NaCl沈澱。
表5:一般的なマルチフレームワークサブライブラリーからファージディスプレイによって選択された抗FolR1抗体(Fab形式)についての平衡解離定数(KD)。nMでのKD。
IgG及びT細胞二重特異性形式の新規FolR1バインダーの産生及び精製
選択された標的細胞のT細胞依存的な死滅を誘導することが可能なFolR1バインダーを同定するために、共通軽鎖ライブラリー又はFabライブラリーから単離された抗体は、対応するヒトIgG1形式に変換された。簡単に説明すると、ファージディスプレイからの固有のFolR1バインダーの可変重鎖及び可変軽鎖は、標準的なPCR反応によって鋳型としてFabクローンを使用して増幅された。PCR産物は、精製され、それらが適切なヒト定常重鎖又はヒト定常軽鎖に融合される好適な発現ベクター内に(制限エンドヌクレアーゼ及びリガーゼに基づくクローニングによって、又はInvitrogenからのInFusionキットを使用する「リコンビニーリング」によっての何れかで)挿入された。これらのベクター内の発現カセットは、キメラMPSVプロモーター及び合成ポリアデニル化部位からなる。更に、これらのプラスミドは、EBV核抗原(EBNA)を有するHEK293細胞内でのプラスミドの安定な維持のためのEpstein BarrウイルスからのoriP領域を含む。PEI媒介性トランスフェクション後、抗体は、HEK293 EBNA細胞において一過的に産生され、標準的なProteinAアフィニティークロマトグラフィー及びその後のサイズ排除クロマトグラフィーによって以下に記載のように精製された:
本明細書中で使用される全ての(二重特異性)抗体は(商業的な供給源から得られたのではない場合)、下記のような、必要とされるベクターのための、PEI媒介性トランスフェクション手順を使用して、HEK293 EBNA細胞において一過的に産生された。HEK293 EBNA細胞は、CD CHO培養培地中で無血清懸濁培養される。500mlの振盪フラスコ内での産生のために、トランスフェクション24時間前に4億個のHEK293 EBNA細胞が播種される(代替の規模では、全ての量がそれに応じて調整された)。トランスフェクションのために、細胞は、210×gによって5分間遠心分離され、上清は、予め温められた20mlのCD CHO培地に置き換えられる。発現ベクターは、200μgのDNAの最終量になるように、20mlのCD CHO培地中に混合される。540μlのPEIの添加後、溶液は、15秒間ボルテックス処理され、次いで、室温で10分間インキュベートされる。その後、細胞は、DNA/PEI溶液と混合され、500mlの振盪フラスコに移されて、5%のCO2雰囲気を有するインキュベーター内で37℃によって3時間インキュベートされる。インキュベーション時間後、160mlのF17培地が添加され、細胞は、24時間培養される。トランスフェクションの1日後、1mMのバルプロ酸及び7%のFeed1が添加される。7日間の培養後、上清は、210×gで15分間の遠心分離によって精製のために収集され、その溶液は、滅菌濾過され(0.22μmフィルター)、0.01%w/vの最終濃度のアジ化ナトリウムが添加されて、4℃で維持される。産生後、上清は収集され、抗体を含む上清は0.22μmの滅菌フィルターに通して濾過されて、精製まで4℃で保存された。
全ての分子は、プロテインAアフィニティー精製(Akta Explorer)及びサイズ排除クロマトグラフィー等の、標準的な手順を使用して2ステップで精製された。一過性の産生から得られた上清は、(2MのTRIS pH8.0を使用して)pH8.0に調整され、8カラム容積(cv)のバッファーA(20mM リン酸ナトリウム、20mM クエン酸ナトリウム、pH7.5)で平衡化されたHiTrap PA FF(GE Healthcare、カラム容積(cv)=5ml)にアプライされた。10cvのバッファーAでの洗浄後、タンパク質は、12cvを超えるバッファーB(20mM クエン酸ナトリウム pH3、100mM NaCl、100mM グリシン)へのpH勾配を使用して溶出された。目的のタンパク質を含む画分がプールされ、溶液のpHは、(0.5MのNa2HPO4 pH8.0を使用して)穏やかにpH6.0に調整された。試料は、超濃縮装置(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY、Sartorius)を使用して2mlに濃縮され、次いで、20mM ヒスチジン、pH6.0、140mM NaCl、0.01% Tween−20で平衡化されたHiLoad(商標)16/60 Superdex(商標)200調製用グレード(GE Healthcare)にアプライされた。溶出された画分の凝集体含有量は、分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって解析された。そのため、30μlの各画分が、25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L−アルギニン一塩酸塩、0.02%(w/v) NaN3、pH6.7のランニングバッファー中で25℃で平衡化されたTSKgel G3000 SW XL分析用サイズ排除カラム(Tosoh)にアプライされた。2%未満のオリゴマーを含む画分がプールされ、超濃縮装置(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY、Sartorius)を使用して1−1.5mg/mlの最終濃度に濃縮された。タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光係数を使用して、280nmで光学濃度(OD)を測定することによって決定された。コンストラクトの純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下でSDSキャピラリー電気泳動によって製造業者の説明書(機器Caliper LabChipGX、Perkin Elmer)に従って解析された。精製されたタンパク質は、液体N2中で凍結され、−80℃で保存された。
表6: IgG及びTCBそれぞれの形式の新規FolR1バインダーの収量及びモノマー含有量。
2+1及び1+1 T細胞二重特異性形式
1つの共通軽鎖バインダー(16D5)については異なる4つのT細胞二重特異性形式が、Fabライブラリーからの1つのバインダー(9D11)については3つの形式が調製され、それらのインビトロでの死滅特性が比較された。
表7: 異なるT細胞二重特異性形式の収量及び最終モノマー含有量のまとめ。
表面プラズモン共鳴によるFolR1バインダーの生化学的特徴づけ
IgGとしての、又は異なる組換え葉酸受容体(ヒトFolR1、2、及び3、マウスFolR1並びにカニクイザルFolR1;全てFc融合体として)に対するT細胞二重特異性形式の、FolR1バインダーの結合は、表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価された。全てのSPR実験は、Biacore T200上で25℃でランニングバッファーとしてHBS−EP(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005% Surfactant P20、Biacore、Freiburg/Germany)を用いて行われた。
最初に、抗FolR1 IgGは、それらの(ヒト、マウス及びカニクイザルのFolR1に対する)交差反応性及び(ヒトFolR1、ヒトFolR2、ヒトFolR3に対する)特異性を特徴づけするために、単独注入によって解析された(表1)。ヒト、カニクイザル及びマウスの葉酸受容体1(FolR1−Fc)又はヒトの葉酸受容体2及び3(FolR2−Fc、FolR3−Fc)の組換えビオチン化モノマーFc融合体は、標準的なカップリング説明書(Biacore、Freiburg/Germany)を使用してSAチップ上に直接にカップリングされた。固定化レベルは、約300−400RUであった。IgGは、500nMの濃度で60秒間注入された。huFolR2及びhuFolR3に対するIgG結合性は、特異性がないために否認された。大部分のバインダーは、ヒト及びカニクイザルのFolR1間のみで交差反応性であり、マウスのFolR1に対する更なる交差反応性は、特異性の喪失とほとんどいつも密接に関連した。
表8: (IgGとしての)25種の新しい葉酸受容体1バインダー並びに2種のコントロールIgG(Mov19及びファルレツズマブ)の交差反応性及び特異性。+は結合を意味し、-は結合なしを意味し、+/-は弱い結合を意味する。
抗FolR1 IgG又はT細胞二重特異性抗体と組換え葉酸受容体との間の相互作用の結合力は、下記のように決定された(表9)。
表9: ヒト及びカニクイザルのFolR1上での、IgGとしての又はT細胞二重特異性抗体(TCB)としての選択されたFolR1バインダーの二価の結合(見かけ上のKDでの結合力)。
抗FolR1 IgG又はT細胞二重特異性抗体と組換え葉酸受容体との間の相互作用の親和性は、下記のように決定された(表10)。
表10: ヒト及びカニクイザルのFolR1上での、IgGとしての又はT細胞二重特異性抗体(TCB)としての選択されたFolR1バインダーの一価の結合(親和性)。
抗FolR1 T細胞二重特異性抗体と組換えヒトCD3εδ−Fcとの間の相互作用の親和性は、下記のように決定された(表11)。
表11: ヒトCD3-Fc上での、選択されたFolR1 T細胞二重特異性抗体(TCB)の一価の結合(親和性)。
葉酸受容体1及びCD3上の同時結合性T細胞二重特異性抗体
組換え葉酸受容体1及び組換えヒトCD3εδ−Fc上での抗FolR1 T細胞二重特異性抗体の同時結合は、下記のように決定された。
エピトープビニング
エピトープビニングのために、抗FolR1 IgG又はT細胞二重特異性抗体は、標準的なアミンカップリングキット(GE Healthcare)を使用して、約700RUの最終レスポンスで、CM5チップ上にpH5.0で直接に固定化された。500nMのhuFolR1−Fcは、次いで、60秒間捕捉され、その後、500nMの異なるバインダーが30秒間捕捉された。表面は、10mMのグリシン pH2の30秒間ずつの2回の注入で再生された。固定化されたバインダー上に捕捉されたhuFolR1に異なるバインダーが結合できるかどうかが評価される(表12)。
表12: ヒトFolR1上のIgGとしての又はT細胞二重特異性抗体(TCB)としての選択されたFolR1バインダーのエピトープの特徴づけ。+は結合を意味し、-は結合なしを意味し、+/-は弱い結合を意味する
表13: ヒトFolR1上のIgGとしての又はT細胞二重特異性抗体(TCB)としての選択されたFolR1バインダーのエピトープのグループ分け
バインダーの選択
IgG形式のFolR1バインダーは、表面プラズモン共鳴(SPR)によって及び最良の候補を選択するための細胞上でのインビトロアッセイによってスクリーニングされた。
ヒトFolR1ポジティブ腫瘍細胞に対する、新たに作製されたFolR1バインダーの特異的な結合
新しいFolR1バインダーは、Fabライブラリー又はCD3軽鎖を使用した共通軽鎖ライブラリーの何れかを使用してファージディスプレイを介して作製された。同定されたバインダーはヒトIgG1形式に変換され、FolR1高発現HeLa細胞に対する結合について取り組まれた。参照分子としてヒトFolR1バインダーMov19が含まれていた。このアッセイにおいて試験された大部分のバインダーは、FolR1に対する中程度から良好な結合を示し、一部のクローンは、Mov19と同程度に良く結合した(図2を参照されたい)。クローン16A3、18D3、15H7、15B6、21D1、14E4及び16F12は、細胞上でのFolR1に対する結合をフローサイトメトリーによって確認することができなかったので除外された。次のステップでは、選択されたクローンは、密接に関連したヒトFolR2に対する結合を除外することによってヒトFolR1に対する特異性について試験された。HEK細胞は、特異性に対処するために、ヒトFolR1又はヒトFolR2の何れかで一過的にトランスフェクトされた。Fabライブラリーに由来するクローン36F2及び9D11並びにCLCライブラリーに由来するクローン16D5及び21A5は、ヒトFolR1に特異的に結合するがヒトFolR2には結合しない(図3A−Bを参照されたい)。試験された他の全てのクローンは、ヒトFolR2に対する少なくともいくらかの結合を示した(図3A−Bを参照されたい)。したがって、これらのクローンは、更なる特徴づけから除外された。並行して、カニクイザルFolR1に対するFolR1クローンの交差反応性については、カニクイザルFolR1で一過的にトランスフェクトされたHEK細胞に対する結合試験を行うことによって取り組まれた。試験された全てのクローンは、カニクイザルFolR1に結合することができていて、4種の選択されたヒトFoLR1特異的クローン36F2、9D11、16D5及び21A5は、比較的良くヒト及びカニクイザルのFoLR1に結合する(図4)。次いで、3種のヒトFolR1特異的カニクイザル交差反応性バインダーが、TCB形式に変換され、T細胞死滅及びT細胞活性化の誘導について試験された。これらのクローンは、Fabライブラリーからの9D11、並びにCLCライブラリーからの16D5及び21A5であった。参照分子としてMov19 FolR1 TCBが全ての試験において含まれていた。これらのFolR1 TCBは、次いで、HeLa細胞上でのFolR1に対する結合後の内部移行の誘導を比較するために使用された。試験された3種全てのクローンは、Mov19 FoLR1 TCBの結合の際の内部移行と同等にFolR1に対する結合の際に内部移行される(図5)。21A5 FolR1 TCBは、ポリ反応性の徴候が原因で中断された。
FolR1 TCB抗体によって誘導されるFolR1発現腫瘍標的細胞のT細胞媒介性死滅
FolR1 TCBを使用して、FoLR1を発現している腫瘍細胞のT細胞媒介性死滅が決定された。一区画の潜在的な標的細胞株を使用して、Qifikit解析によってFoLR1結合部位が決定された。
表15: SKOV3細胞での腫瘍細胞死滅及びT細胞活性化のEC50値
表16: HT-29細胞での腫瘍細胞死滅及びT細胞活性化のEC50値
赤血球に対するFolR1 TCB抗体の結合及び全血におけるT細胞活性化
FoLR1を発現している腫瘍細胞の非存在下で自発的な活性化がないことを証明するために、本発明者らは、潜在的にFolR1を発現する可能性がある赤血球に対するFolR1クローンの結合があるかどうかを試験した。ネガティブコントロールDP47 IgGを含めたところ、本発明者らは、赤血球に対する、9D11 IgG、16D5 IgG及びMov19 IgGのいかなる特異的結合も観察できなかった(図8)。
異なる一価及び二価のT細胞二重特異性形式の36F2 TCB及び16D5 TCBによって誘導されるT細胞死滅
Hela、Skov−3(中FolR1、約70000−90000コピー)及びHT−29(低FolR1、約10000)ヒト腫瘍細胞の36F2 TCB、16D5 TCB、古典的16D5 TCB、16D5 TCB 1+1及び16D5 TCB HT抗体によって媒介されるT細胞死滅が評価された。DP47 TCB抗体は、ネガティブコントロールとして含まれていた。ヒトPBMCがエフェクターとして使用され、二重特異性抗体と共に24時間のインキュベーションでの死滅が検出された。簡単に説明すると、標的細胞は、トリプシン/EDTAで収集されて、洗浄され、平底96ウェルプレートを使用して25 000細胞/ウェルの密度で播種された。細胞は、接着するように一晩放置された。末梢血単核細胞(PBMC)は、健常なヒトのドナーから得られた濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)のHistopaque密度遠心分離によって調製された。新鮮な血液は、滅菌PBSで希釈され、Histopaque勾配(Sigma、#H8889)の上に層にされた。遠心分離(450×g、30分、室温)後、PBMCを含む中間相より上の血漿は捨てられ、PBMCは新しいファルコンチューブ内に移され、次いで、50mlのPBSで満たされた。混合物は遠心分離(400×g、10分、室温)され、上清は捨てられ、PBMCペレットは滅菌PBSで2回洗浄された(遠心分離ステップ350×g、10分)。得られたPBMC集団は、自動的に計数され(ViCell)、10%のFCS及び1%のL−アラニル−L−グルタミン(Biochrom、K0302)を含むRPMI1640培地中、細胞インキュベーター内で37℃、5%のCO2で更なる使用(24時間以内)まで保存された。死滅アッセイのために、抗体が、指示された濃度(3重で0.01pM−100nMの範囲)で添加された。PBMCは、10:1の最終E:T比で標的細胞に添加された。標的細胞死滅は、37℃、5%のCO2で24時間のインキュベーション後に、プログラム死/壊死の細胞によって細胞上清中に放出されたLDHの定量化(LDH検出キット、Roche Applied Science、#11 644 793 001)によって評価された。標的細胞の最大溶解(=100%)は、標的細胞を1%のTritonX−100と共にインキュベートすることによって達成された。最小溶解(=0%)とは、二重特異性コンストラクトなしでエフェクター細胞と共インキュベートされた標的細胞を指す。これらの結果は、36F2 TCB及び16D5 TCBによって誘導される3種全てのFolR1+標的細胞株の標的特異的な死滅を示している(図10)。
抗TIM3抗体の作製
マウスの免疫化 NMRIマウスは、全長ヒトTim−3をコードしているプラスミド発現ベクターを使用して100ugのベクターDNA(プラスミド15304_hTIM3−fl)の皮内適用によって、遺伝的に免疫化され、次いで、エレクトロポレーションが行われた(1000V/cmの2スクエアパルス、時間0.1ミリ秒、間隔0.125秒;その後、287.5V/cmの4スクエアパルス、時間10ミリ秒、間隔0.125秒)。マウスは、0、14、28、42、56、70、及び84日目において、いずれか6回の連続的な免疫化を受けた。血液は、36、78及び92日目に採取されて、血清が調製され、これは、ELISAによる力価決定に使用された(以下を参照されたい)。50ugの組換えヒトTim−3ヒトFcキメラの静脈内注射により、最も高い力価を有する動物が96日目にブースティングのために選択され、モノクローナル抗体は、ブースト3日後に骨髄腫細胞株への脾細胞の融合により、ハイブリドーマ技術によって単離された。
抗Tim3抗体特徴づけ
Tim3についてのELISA Nunc−Maxi Sorp Streptavidineプレート(MicroCoat #11974998/MC1099)は、(BirAリガーゼでビオチン化された)Tim3−ECD−His−ビオチンで25μl/ウェルによって被覆され、400rpm回転で振盪しながら室温で1時間インキュベートされた。洗浄後(PBSTバッファーで3×90μl/ウェル)、25μlのaTim3試料又は(1:2段階)希釈された参照抗体aTim3 F38−2E2(Biolegend)が添加され、室温で1時間インキュベートされた。洗浄後(PBSTバッファーで3×90μl/ウェル)、25μl/ウェルのヒツジ抗マウスPOD(GE NA9310V)が1:9000の希釈で添加され、400rpm回転で振盪しながら室温で1時間インキュベートされた。洗浄後(PBSTバッファーで4×90μl/ウェル)、25μl/ウェルのTMB基質(Calbiochem、#CL07)が添加され、OD1.5−2.5までインキュベートされた。次いで、反応は、25μl/ウェルの1NのHCL溶液の添加によって停止された。測定は、370/492nmで行われた。ELISA結果は、EC50値[ng/ml]として下記のまとめの表17に一覧にされている。
表17: 例示的な抗体の結合親和性(ELISA及びBIACORE)
表18: 動態SPR測定によって得られるBiacore-KD値によって決定される結合親和性。-n.f.とは、可能な適合がないことを意味し、ない又は弱い結合に起因する可能性が最も高い。
抗Tim3抗体誘導体の作製
キメラ抗体誘導体 キメラTim3抗体は、抗TIM3マウス抗体Tim3−0016、Tim3−0016変異体(0018)、Tim3−0021、Tim3−0022、Tim3−0026、Tim3−0028、Tim3−0030、及びTim3−0033、Tim3−0038の可変重鎖及び軽鎖領域をPCRを介してから増幅すること、並びにそれらをエフェクター機能をなくすLALA及びPG変異(ロイシン234がアラニンに、ロイシン235がアラニンに、プロリン329がグリシンに)を有するヒトIgG1主鎖/ヒトCH1−ヒンジ−CH2−CH3との融合タンパク質として重鎖発現ベクター内に及びヒトC−カッパへの融合タンパク質として軽鎖発現ベクター内にクローニングすることによって作製された。LC及びHCプラスミドは、次いで、HEK293内にコトランスフェクトされ、7日後に抗体精製のための標準的な方法によって上清から精製された。
表19:
精製されたモノクローナル抗体の蛍光標識
ハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体の蛍光標識は、(Invitrogenによって製造された)Alexa Fluor 488 Monoclonal Antibody Labeling Kitを製造業者の説明書に従って使用することによって行われた。標識後、それぞれの抗体は、Alexa Fluor 488(以下、「Alexa−488」と呼ばれる)でポジティブに標識されることが、TIM−3を発現しているRPMI−8226及びPfeiffer細胞についての(BD Biosciencesによって製造された)FACSCalibur解析によって確認された。
FACSに基づく競合アッセイを使用した結合エピトープグループの分類
作製された抗TIM3抗体と6種の抗TIM3参照抗体との間のエピトープの関係は、FACSに基づく結合競合アッセイによって解析された。TIM3参照抗体は、以下のものであった:米国特許第2012/189617号に記載のような抗体4177及び8213、国際公開第2013/06490号に記載のような抗体1.7E10及び27.12E12;抗体344823(R&D Systemsによって製造された、クローン344823)及び抗体F38−2E2(BioLegend及びR&D Systemsによって製造された、クローンF38−2E2)。簡単に説明すると、試験抗体は、TIM−3を発現しているRPMI−8226細胞(ATCC(登録商標)CCL−155(商標))と相互作用及び結合することができるようにされ、次いで、別の抗TIM−3抗体もTIM−3発現細胞に結合することができるかどうかがフローサイトメトリー法によって評価された。
1)製造業者の説明書(Molecular Probes A−20181)に従って1個の抗体あたり平均2.7個のフルオロフォアでAlexa*488とコンジュゲートされた、開示の精製抗TIM3(BD染色バッファー中に10μg/ml、4℃で0.5時間)。次いで、a)標識されていない(1−4)参照組換え抗TIM3抗体又はアイソタイプコントロールがBD SB中に4℃で0.5時間添加され(10μg/ml)、BD SBでの洗浄後、PE標識された抗huFcγ抗体で染色された(JIR、109−116−098、1:200、BD SB中、4℃で0.5時間)又はb)PE標識された(5−6)利用可能な参照抗TIM3抗体又は適切なアイソタイプコントロールがBD SB中に4℃で0.5時間添加された(10μg/ml)。洗浄及び遠心分離後、染色されたRPMI−8226細胞のMFIシグナルが、BD Biosciences FACSCantoフローサイトメーターによって解析された。
表20: エピトープ特徴づけのまとめ。
混合リンパ球反応(MLR)におけるサイトカイン産生に対する、ヒト抗TIM−3抗体の効果
混合リンパ球反応を使用して、TIM−3経路をブロックすることによるリンパ球エフェクター細胞に対する効果が実証された。T細胞は、アッセイにおいて、抗TIM−3モノクローナル抗体の存在下又は非存在下での活性化及びそれらのIFN−ガンマ分泌について試験された。
表21: ポジティブコントロールとしてのrec hu IL-2(20EU/ml)(=100%)及びネガティブコントロールとしての抗体なしと比較した、抗Tim3抗体に誘導されるIFNガンマ放出の百分率(ドナー)
TIM−3を発現している細胞内への抗TIM−3抗体の内部移行
本明細書に記載のTIM−3特異抗体は、TIM−3を発現しているリンパ腫、多発性骨髄腫及びAML細胞を含む、TIM−3を発現している細胞内に内部移行され得る。例えば、開示のTIM−3特異抗体及びそれらの断片は、細胞に基づくELISA、フローサイトメトリー(FACS)及び共焦点顕微鏡法によって評価されるように、ヒトTIM−3を安定に発現しているrec TIM3 CHO細胞内に内部移行されることが示されている。
内部移行[%]=(1−OD試料_37℃/OD試料_4℃)*100
内部移行[%]=(1−MFI試料_37℃/MFI試料_4℃)*100
本開示の抗TIM3抗体は、TIM3を発現しているRPMI−8226細胞(ATCC(登録商標)CCL−155(商標))内に高レベルで急速に内部移行される。実験は、huTIM−3を発現しているrec CHOK1細胞の代わりにTIM3を発現しているRPMI−8226細胞(ATCC(登録商標)CCL−155(商標))を用いて上記のように行われた。結果は、表22に示されている。以下の抗体がTIM3参照抗体として使用された:米国特許出願第2012/189617号に記載のような抗体8213、国際公開第2013/06490号に記載のような抗体27.12E12。ヒトIgG1キメラバージョンとしてTim3_0016、Tim3_0016変異体(Tim3_0018)、Tim3_0038が使用された。
表22: 表示の時点における内部移行の百分率(0分を0パーセントとして設定)。
TIM−3を発現している単離されたヒト単球に対する抗TIM−3抗体の結合
CD14+単球は、健常ドナーの血液凝固を阻止した末梢血からFicoll−Paque(GE Healthcare)(利用者マニュアル内の一般的なプロトコールを参照又はwww.miltenyibiotec.com/protocolsを閲覧されたい)を使用した密度勾配遠心分離法及びその後のCD14 MicroBeadsを介したポジティブ選択によって単離された。最初に、CD14+細胞は、CD14 MicroBeadsで磁気標識された。次いで、細胞浮遊液は、MACS Separatorの磁場内に配置されたMACS(登録商標)Column上へロードされる。磁気標識されたCD14+細胞は、カラム内に保持される。標識されていない細胞は通り抜け、この細胞画分はCD14+細胞が枯渇されている。磁場からのカラムの除去後、磁気的に保持されたCD14+細胞は、ポジティブ選択された細胞画分として溶出させることができる。室温で10分間の200×gでの遠心分離後、単球が収集され、結合アッセイにおいて直接に使用された又は凍結培地(10%DMSO、90%FCS)中に1.0E+07細胞/mlで再懸濁されて液体窒素中で保存された。
特異的な結合[MFI]=幾何平均MFI試料−幾何平均MFIアイソタイプコントロール
表23: ヒト単球に対する結合。
TIM−3を発現している単離されたカニクイザル単球に対する抗TIM−3抗体の結合
CD14+単球は、カニクイザルの血液凝固を阻止した末梢血(Covance)からFicoll−Paque(GE Healthcare)(利用者マニュアル内の一般的なプロトコールを参照又はwww.miltenyibiotec.com/protocolsを閲覧されたい)を使用した密度勾配遠心分離法及びその後のNHP CD14 MicroBeadsを介したポジティブ選択によって単離された。最初に、CD14+細胞は、CD14 MicroBeadsで磁気標識された。次いで、細胞浮遊液は、MACS Separatorの磁場内に配置されたMACS(登録商標)Column上へロードされる。磁気標識されたCD14+細胞は、カラム内に保持される。標識されていない細胞は通り抜け、この細胞画分はCD14+細胞が枯渇されている。磁場からのカラムの除去後、磁気的に保持されたCD14+細胞は、ポジティブ選択された細胞画分として溶出させることができる。室温で10分間の200×gでの遠心分離後、単球が収集され、結合アッセイにおいて直接に使用された又は凍結培地(10%DMSO、90%FCS)中に1.0E+07細胞/mlで再懸濁されて液体窒素中で保存された。
特異的な結合[MFI]=幾何平均MFI試料−幾何平均MFIアイソタイプコントロール
表24: カニクイザル単球に対する結合。
TIM−3を発現しているNHL及びMM細胞株に対する抗TIM−3抗体の結合
開示の抗TIM3抗体並びに2つの抗TIM3参照抗体クローン(1)4177及び(2)8213(Kyowa)の結合能力は、FACSによって解析された。手短に言えば、ヒトTIM3発現B細胞リンパ腫細胞(Pfeiffer細胞として例示される)及び多発性骨髄腫細胞(RPMI−8226細胞として例示される)は、非特異的な結合をブロックするためにBDヒトFc Blockと共に室温で10分間インキュベートされた。次いで、2×105細胞(50μl/ウェル)は、98ウェルのv底MTP内に入れられ、50μl/ウェルのAlexa488標識抗TIM3(BD Stainingバッファー中に10μg/ml)が添加され、4℃で1時間インキュベートされた。洗浄及び遠心分離後、染色された細胞のMFIシグナルは、BD Biosciences FACSCantoフローサイトメーターによって解析された。
特異的な結合[MFI]=幾何平均MFI試料−幾何平均MFIアイソタイプコントロール
シュードモナス外毒素(PE24)とコンジュゲートされたTIM3特異抗体は、TIM3を発現している細胞を効果的に死滅させる。開示の抗TIM3抗体及び市販の入手可能な1種の抗TIM3参照抗体クローン11E365(US Biologicalから入手可能)の細胞傷害活性は、Promega CellTiter−Glo Luminescent Cell Viability Assayを用いて解析された。手短に言えば、5×103個(98ウェルMTP中に50μl/ウェル、3重で)のヒトTIM−3安定発現組換えCHO K1に、又は2×104細胞(98ウェルMTP中に50μl/ウェル、3重で)のヒトTIM3発現B細胞リンパ腫細胞(Pfeiffer細胞として例示される)に、又は多発性骨髄腫細胞(RPMI−8226細胞として例示される)に、10μg/mlの最高濃度を有する1:5段階希釈の25μl/ウェルの開示の抗TIM−3抗体が、又は処理なしの細胞には適切な培地が、又は標的化されない処理細胞にはアイソタイプコントロールが添加された。処理は、3重で10μg/mlから1ng/mlまでの範囲に及ぶ。全ての抗体は、全長マウスFcγバージョンとして使用された。シュードモナス外毒素のコンジュゲーションのコンジュゲーションのために、PE24とコンジュゲートされた10μg/mlのマウスFcγ断片特異的Fabが添加され、37℃で3日間インキュベートされた。真核生物における既知のタンパク質合成阻害剤としてのシクロヘキシミドは、ポジティブコントロールとして使用された。処理された細胞の生存率は、Promega CellTiter−Glo Luminescent Cell Viability Assayで測定された。
相対阻害[%]=(1−(E試料−Eネガティブコントロール)/(Eポジティブコントロール−Eネガティブコントロール))*100
開示の抗TIM3抗体及び国際公開第2013/06490号に記載のようなTIM3参照抗体1.7.E10及び27−12E12の2種の抗TIM3参照抗体の細胞傷害活性は、Promega CellTiter−Glo Luminescent Cell Viability Assayを用いて上記のように解析された。全ての抗体は、ヒトFcガンマ部分を含む全長ヒトIgG1形式として使用された。この実験において、シュードモナス外毒素のコンジュゲーションは、PE24とコンジュゲートされたヒトFcγ断片特異的Fab(10μg/ml)を介して達成され、これは、添加されて37℃で5日間インキュベートされた。
(TIM3を発現しているが、PSMAは発現していない)MM、NHL及びAML細胞株における、開示の抗TIM3抗体のFab−PE24コンストラクトの細胞傷害活性。
細胞傷害活性は、Promega CellTiter−Glo Luminescent Cell Viability Assayを用いて上記のように解析された。50μg/mlの最高濃度を有する1:5段階希釈の、PE24に直接にコンジュゲートされた開示の抗TIM3抗体のFab断片、又は処理なしの細胞には適切な培地、又は標的化されない処理細胞には非結合性抗PSMA Fab−PE24コントロールが、7,5×103個のPfeiffer細胞又は2×103個のRPMI−8226細胞(98ウェルMTP中に50μl/ウェル)と共に4日間37℃でインキュベートされた。処理は、3重で50μg/mlから8ng/mlまでの範囲に及ぶ。シクロヘキシミドは、ポジティブコントロールとして使用された。
再発/難治性患者からの初代白血病幹細胞/始原AML細胞における、開示の抗TIM3のイムノコンジュゲート(シュードモナス外毒素Aコンジュゲート(Fab−PE24コンストラクト))の細胞傷害活性
再発/難治性患者の末梢血からのCD34+細胞は、AllCells、LLC、Alameda、CAから得られた。全ての試料の純度及び生存率の確認後(純度範囲84−94%及び生存率範囲95−99%)、抗TIM−3モノクローナル抗体344823(R&D)を使用して実施例7に記載のようなFACSによってTIM−3の発現レベルが評価された。(図31を参照されたい)。再発/難治性患者からの試験された全て(4/4)の初代白血病幹細胞/始原(CD34+)AML試料は、異なるレベルでTIM−3の均一な発現を示す。
表28: 初代CD34+ AML細胞における、開示の抗TIM3抗体のFab-PE24コンストラクトの細胞傷害活性。
NHL及びMM細胞株における、選択された抗TIM3抗体のFab−PE24コンストラクトの効力の比較
選択された開示の抗TIM3抗体の、ソルターゼがカップリングされたFab−PE24コンストラクトの細胞傷害活性の評価は、Promega CellTiter−Glo Luminescent Cell Viability Assayを用いて実施例28において上述されているように解析された。
Pfeiffer細胞における、開示の抗TIM−3抗体の同じクローンのFab−PE24コンストラクト対全IgG−アマトキシンコンジュゲートの細胞傷害活性の比較
開示の抗TIM3クローン0016のコンジュゲート化Fab−PE24コンストラクト対(国際公開第2012/041504号に記載されている手順による(アマトキシンアミノ酸4の6’C原子を介して、特に、アマトキシンアミノ酸の6’C原子に結合した酸素原子を介してコンジュゲートされていて、TIM3抗体が尿素部分を介してリンカーによって連結される)アマトキシンとコンジュゲートされた同じクローンの全IgGの細胞傷害活性の評価は、Promega CellTiter−Glo Luminescent Cell Viability Assayを用いて実施例12において上述されているように解析された。結果は、表30に示されている。
表30: NHL細胞における、抗TIM3クローン0016のFab-PE24コンストラクト対全IgG-アマトキシンコンジュゲートの細胞傷害活性
患者及び腫瘍の試料の加工
新たに切除された固形腫瘍病変及び悪性浸出液は、非小細胞肺がんを有する34名の患者、卵巣がんを有する7名の患者及び腎細胞癌(RCC)を有する1名の患者間から収集された。固形腫瘍病変は、アキュターゼ(PAA)、コラゲナーゼIV(Worthington)、ヒアルロニダーゼ(Sigma)、及びDNAse IV型(Sigma)を使用して切除後すぐに機械的に解離及び消化された。単一細胞浮遊液が調製された。悪性浸出液の細胞画分は、Histopaque−1119(Sigma)を使用して密度勾配遠心分離法によって単離された。全ての試料は、更なる使用まで液体窒素中で保存された。この試験は、地域の倫理審査委員会(Ethikkommission Nordwestschweiz)によって承認された。
腫瘍試料の特徴づけ
全ての腫瘍試料は、マルチカラーフローサイトメトリーによって包括的に特徴づけされた。以下の抗体が、フローサイトメトリー解析に使用された:α−CD4−PE、α−CD8−PE−Cy7、α−CD11b−PerCP−eFluor710、α−CD45−PE−Cy7、α−CD45−PerCP−Cy5.5、α−CD137−FITC、α−BTLA−ビオチン、α−CTLA−4−PE、α−ICOS−FITC、α−IFN−γ−FITC、α−Lag−3−APC(全てeBioscience)、α−CD3−PECF594、α−CD25−BV605、α−CD69−FITC、α−Epcam−FITC、α−グランザイムB−PE、α−活性カスパーゼ3−PE、α−PD−1−BV605、ストレプトアビジン−BV711(全てBD Bioscience)、α−CD45RA−BV421、α−CCR7−AlexaFluor647、α−FoxP3−AlexaFluor647、α−Tim−3−BV421、α−Tim−3−BV605(全てBiolegend)。死滅した細胞は、LIVE/DEAD(登録商標)Fixable Near−IR Dead Cell Stain Kit又はLIVE/DEAD(登録商標)Fixable Blue Dead Cell Stain Kit(Invitrogen)で染色された。細胞内染色のために、eBioscienceからのFixation and Permabilization Buffersが使用された。試料は、フローサイトメトリー解析のためにBD LSR Fortessa上で取得された。ヒトIL−2、IFN−γ及びTNF ELISAセットは、全てBD Bioscienceから得られた。
エクスビボでの腫瘍試料のFolR1−TCBでの処理
FolR1ポジティブ腫瘍消化物又は悪性浸出液は、解凍され、洗浄されて、完全培地(DMEM+ピルビン酸ナトリウム(1mM)+MEM非必須アミノ酸(1×)+L−グルタミン(2mM)+ペニシリン/ストレプトマイシン(100ng/ml)+2−メルカプトエタノール(50nM)+シプロキシン(1mg/ml)+10%ヒト血清)中に3×105細胞/200μl/ウェルの密度で96ウェル平底細胞培養プレート(BD Falcon)内に播種された。試料は、2nMの濃度のFolR1−TCB又はDP47 TCBの存在下又は非存在下で24時間培養された。FolR1−TCB処理によるCD8+及びCD4+ T細胞(CD45+CD3+)の活性化は、マルチカラーフローサイトメトリーによって細胞表面マーカーCD25、CD69、CD137、ICOS、PD−1及びTim−3の発現を測定することによって決定された。更に、グランザイムB及びIFN−γの発現は、細胞内染色によって決定された。細胞培養上清中のIL−2の濃度は、ELISA(ヒトIL−2 ELISAセット、BD OptEIA)によって製造業者の説明書に従って測定された。
エクスビボでの腫瘍試料のカツマキソマブでの処理
三機能性TCBカツマキソマブ(Removab(登録商標))は、Freseniusから得られた。実験条件は、FolR1−TCBについて上記に示されているものと同様であった。簡単に説明すると、EpCAMポジティブ腫瘍消化物又は悪性浸出液は、10ng/mlの濃度のカツマキソマブの存在下又は非存在下で24時間培養された。CD8+及びCD4+ポジティブT細胞(CD45+CD3+)の解析は、上記のように行われた。
死滅アッセイ
FolR1−TCBにより誘導される腫瘍細胞死滅を決定するために、3×104個のCFSE標識Skov3細胞が、96ウェル平底細胞培養プレート内で2nMの濃度のFolR1−TCBの存在下又は非存在下で腫瘍試料と24時間共培養された。E:T比(E:エフェクターCD45+CD3+細胞;T:腫瘍及び添加されたSkov3細胞からの標的FolR1+細胞)は、各ウェル内で1:1に調整され、添加された腫瘍試料の細胞数は、各試料について、フローサイトメトリーによる事前の特徴づけによって算出された。Skov3細胞の細胞死は、活性化されたカスパーゼ3を測定すること及び生/死マーカーLive/Dead−near−IRによってフローサイトメトリーによって決定された。アッセイは、3重で行われた。FolR1−TCB媒介性死滅は、以下の方程式によって算出された:特異的な死滅の%=100−[(FolR1−TCB処理された試料中のSkov3生細胞の%/未処理の試料中のSkov3生細胞の%)×100]。
抗CD3/CD28抗体でのポリクローナル刺激
96ウェル平底プレートは、0.5ug/mlの抗CD3ε(クローンOKT3、Biolegend)で37℃で2時間予め被覆された。その後、抗体溶液は除去され、プレートは広く洗浄された。凍結された腫瘍浮遊液は、解凍され、洗浄されて、2μg/mlの抗CD28抗体(クローン28.2、eBioscience)を含む完全培地中に3×105細胞/200μL/ウェルで24時間培養された。インキュベーションの24時間後、細胞は、収集され、洗浄されて、活性化マーカー、例えば、CD25及びT細胞エフェクター機能、例えば、CD8+ T細胞におけるグランザイムB及びIFN−γ等の発現についてフローサイトメトリーによって解析された。上清は、製造業者の説明書に従って行われたIL−2、IFN−γ及びTNF−αのELISAのために収集された。
PD−1ブロックによるT細胞機能の回復
腫瘍消化物は、1ウェルあたり10μg/mlの抗PD−1抗体(MDX5C4)の存在下又は非存在下で上記のようにアゴニストの抗CD3及び抗CD28抗体によって刺激され、24時間インキュベートされた。24時間後、細胞は、収集され、洗浄されて、フローサイトメトリーによって解析された。上清は、製造業者の説明書に従って行われたIL−2、IFN−γ及びTNF−αのELISAのために収集された。
腫瘍消化物及び悪性浸出液における、FolR1 TCBによるT細胞の活性化
CD3及び葉酸受容体1に結合しているT細胞二重特異性抗体(Mov19に基づくFolR1−TCB及びコントロール抗体DP47−TCBは、Roche Glycartによって提供された。抗PD−1抗体5C4は、米国特許第8008449号に記載されている。抗Tim3抗体F38−2ELが使用された。FolR1発現のフローサイトメトリーによる特徴づけのために、LifeSpanBiosciencesからの抗FolR1−APC抗体(aa25−233)及びその適合したアイソタイプコントロール(Biolegend)が使用された。FolR1+腫瘍を有する15名の患者からの腫瘍病変は、FolR1 TCBによって誘導されるT細胞活性化について特徴づけされた。試料は、NSCLC(n=7)、卵巣がん(n=7)、及び腎細胞がんを有する患者(n=1)に由来する9種の単一細胞浮遊液及び6種の悪性浸出液からなっていた。CD3+ T細胞及びFolR1+腫瘍細胞の量は、患者間で変動性が高かった(CD3+:平均33.9%±16.6%の標準偏差、FolR1+:17.1%±16.8%)。T細胞における阻害性受容体PD−1、Tim−3、CTLA−4、Lag−及びBTLAの発現の特徴づけにより、患者間での大きな不均一性が明らかにされた(図11A−B)。腫瘍浸潤性のCD8+ T細胞が高レベルのPD−1、Tim−3及びCTLA−4を示した(それぞれ、31.6%±25%;22.2%±20.8%及び18.7%±14.4%)のに対して、Lag−3及びBTLAは、このコホートの全ての患者において少数の細胞において発現されただけであった(それぞれ、3.5%±4.9%及び2.3%±1.7%)。CD4+ T細胞上の阻害性受容体は、同様に分布し、CTLA−4の発現がわずかにより顕著であった。
FolR1−TCBにより誘導されるT細胞活性化は、PD−1及びTim−3の発現と逆相関する
阻害性受容体の高い発現は、消耗T細胞の特徴として記載されている。したがって、腫瘍浸潤T細胞の機能不全状態は、FolR1 TCBの有効性に影響を与える可能性もあり、少なくとも部分的に、TCB曝露による不均一なT細胞活性化の原因となり得る。この目的のために、阻害性受容体の共発現は、ベースラインにおいて決定されたように、活性化マーカー及びT細胞エフェクター機能のFolR1 TCB誘導性上方制御と関連づけされた。CD8+ T細胞におけるPD−1及びTim−3の両方の発現は、それによって、CD25、CD137及びICOSの発現によって決定されたT細胞活性化と負に相関した。高発現のPD−1又はTim−3を有するCD8+ T細胞は、FolR1−TCB処理の際、不十分な効果を示したのに対して、低発現のこれらの阻害性受容体を有するT細胞は、FolR1−TCBでの処理の際、強く活性化されることが可能であった(図14A−I)。試料中のT細胞の含有量に対して標準化された、FolR1−TCBにより誘導されたIL−2分泌の測定により、PD−1及びTim−3発現への同じ依存性が明らかにされた(図15A−C)のに対して、FolR1−TCBにより誘導されたグランザイムBの上方制御は、これらの阻害性受容体の事前の発現への依存性が低かった(図14J−L)。興味深いことに、CD8+ T細胞におけるCTLA−4、Lag−3及びBTLAのベースラインの発現は、FolR1−TCBにより誘導されるT細胞活性化と相関していなかった(図26A−C)。CD4+ T細胞における阻害性受容体の発現は、CD8+ T細胞における同受容体の発現と比較して、FolR1−TCBにより誘導されるCD4+ T細胞活性化について、はるかに予測性が低かった。
FolR1−TCBにより誘導される腫瘍細胞死滅は、PD−1及びTim−3の発現と逆相関する
調整された1:1のE:T比の腫瘍細胞のFolR1−TCB誘導性死滅を調査するために、マルチカラーフローサイトメトリーを使用して予め決定された量のCD3+ T細胞を含む腫瘍消化物にCFSE標識Skov3細胞が外因的に添加された。Skov3細胞のFolR1−TCB誘導性死滅は、活性化されたカスパーゼ3を測定すること及び生/死マーカーによって決定された。CD25上方制御によって測定されるような、FolR1−TCBにより誘導されるT細胞活性化と一致して、FolR1−TCB曝露の際の特異的な死滅は、CD8+ T細胞におけるPD−1及びTim−3の単一発現又は共発現と負に相関した。更に、FolR1−TCBにより誘導される死滅は、CTLA−4のベースラインの発現並びにPD−1及びCTLA−4の共発現によっても影響された。しかし、FolR1−TCBにより誘導される腫瘍細胞死滅に対するCTLA−4発現の影響は、PD−1及びTim−3の発現と比較して顕著ではなかった。
カツマキソマブを用いた新しい腫瘍病変の治療 −
カツマキソマブを使用した腫瘍浸潤T細胞の活性化、及び阻害性受容体の発現との相関
カツマキソマブがT細胞活性化をどの程度まで誘導するかを決定し、且つ第2の独立のT細胞二重特異性分子を使用して上記の発見を確認するために、T細胞におけるCD3及び腫瘍細胞におけるEpCAMを認識する三機能性二重特異性抗体である、カツマキソマブに、NSCLCを有する患者からの4種の腫瘍消化物が曝露された。次いで、T細胞は、活性化マーカー及びT細胞エフェクター機能の発現についてフローサイトメトリーによって特徴づけされた(図17A−D)。FolR1−TCBについての上記の本発明者らのデータを検証して、本発明者らは、カツマキソマブにより誘導されるT細胞活性化における顕著な不均一性を観察した。したがって、阻害性受容体のベースラインの発現は、患者間で異なっていた(図17E−H)。
CD3/CD28による腫瘍浸潤T細胞のポリクローナル刺激 −
非小細胞肺がん試料中の腫瘍浸潤T細胞サブセットの免疫表現型分類
本発明者らは、マルチカラーフローサイトメトリーを使用した、34名のNSCLC患者からの腫瘍浸潤性のCD3+CD8+及びCD3+CD4+のT細胞サブセットにおける共阻害性T細胞受容体及び分化マーカーの発現を調査した。大多数の腫瘍は、T細胞消耗の主要な制御因子である、阻害性受容体PD−1の高い発現を示した(図19A−B)。重要なことに、Tim−3、CTLA−4、Lag−3又はBTLA等の他のチェックポイント阻害因子の発現は、異なる腫瘍から得られたT細胞間で実質的なバリエーションを示した(図19AーB)。
阻害性受容体の累積の発現は、T細胞機能障害を明らかにする
この実施例では、ポリクローナル刺激は、T細胞機能における阻害性受容体の影響を評価するために、最適より低い用量で使用された。CD25発現によって例示されるような、アゴニストの抗CD3及び抗CD28抗体での刺激による、T細胞活性化に対する効果、並びに、IFN−γ、TNF−α及びIL−2の産生、並びにグランザイムBの発現によって解析されるような、T細胞エフェクター機能に対する効果は、フローサイトメトリー(図20A−B)及びELISA(図20C−E)によって決定されたように、患者間で実質的に変化した。重要なことに、本発明者らは、異なるレベルのT細胞機能を観察し、ほぼ保存されたT細胞機能(すなわち、維持されたCD25及びグランザイムBの発現、並びにIL−2、IFN−γ及びTNF−αの産生)を示すT細胞集団から、排除されたT細胞機能(CD25及びグランザイムBの発現の損失並びにサイトカイン産生の損失)を有するものまで多様であった。
阻害性受容体発現
阻害性受容体の単一及び累積の発現は、腫瘍進行と共に上昇する。阻害性受容体の発現は、腫瘍ステージ及び腫瘍進行と相関した。PD−1、Tim−3及びLag−3ポジティブ細胞の数は、進行した腫瘍ステージにおいて明白に増加していた(図21G−K)。CTLA−4の発現について明らかな相関は観察されなかった。これは、この受容体が、異なる阻害機構を介して働くことを示し得る。BTLAは、低レベルで全体的に発現され、進行した腫瘍ステージにおいてわずかな増加だけが見出された(図21K)。iRスコアによって反映されるような、阻害性受容体の累積の発現における顕著な増加は、結節節ポジティブがん及び進行した腫瘍ステージを有する患者において観察されたのに対して、初期の腫瘍サイズは、iRスコアと有意には相関しなかった(図21L−M)。これらのデータは、腫瘍進行中の、阻害性受容体の緩やか且つ持続的な上方制御を示唆し、これは、NSCLCにおけるT細胞消耗に関与する可能性がきわめて高い。
PD−1のブロックは、T細胞機能を部分的に回復させることができる
PD−1ブロック抗体によるT細胞機能のレスキューは、PD−1発現のレベルに依存する。本発明者らは、阻害性受容体、特に、PD−1及びTim−3の発現と、ポリクローナル刺激の際のT細胞活性化との間の明らかな相関を見出したので、PD−1又はPD−1/Tim−3経路のブロックは、T細胞機能を回復させる可能性があった。しかし、アゴニスト抗CD3及び抗CD28抗体での刺激の際、PD−1に対するブロック抗体(5C4)の添加、又はPD−1及びTim−3の組み合わされたブロックは、一部の患者のみにおいてIL−2、IFN−γ及びTNF−αの産生及び分泌等のT細胞エフェクター機能を回復させることができたのに対して、他の患者では、不十分な効果しか認められなかった(図23A−D)。慢性マウスLCMV感染モデルにおいて観察されたように(Blackburn等、PNAS 105(39):15016 (2008))、本発明者らは、NSCLC患者からの腫瘍浸潤性のCD8+ T細胞においてPD−1hi及びPD−1intサブセットを同定した。簡単に説明すると、PD−1hi、PD−1int、及びPD−1negサブセットは、それらの測定された蛍光強度に基づいて同定が可能であった。3種のサブセットの再現可能な識別のための均一なパラメーターを規定するために、33名の患者からの細胞がPD−1発現について解析された。解析は、PD−1発現レベルの全スペクトルをカバーしており、明らかに顕著なPD−1neg又はPD−1hi集団を有する腫瘍試料を含んでいた。これにより、この解析のためのゲートを設定することが可能にされ、これは、次いで、全ての試料に適用された。
FolR1−TCBによる、健常ドナー及びがん患者からのT細胞の活性化
T細胞活性化におけるFolR1−TCBの効果を評価するために、健常ドナーからの末梢血単核細胞(PBMC)が、FolR1+卵巣がん細胞株Skov3と共培養された(図40A)。0.6pMから2nMまでの範囲に及ぶ漸増濃度のFolR1−TCBへの24時間の曝露の際、本発明者らは、CD25、CD137、及びICOSの上方制御を伴うCD8+ T細胞の強い活性化を観察した。加えて、T細胞は、IL−2、IFN−γ、及びTNFを分泌していた。無関係な抗原に対して指向されるTCBである、DP47−TCBへの曝露は、いかなるT細胞活性化も誘導しなかった(図40B及びC)。
阻害性受容体発現は、腫瘍浸潤性CD8+ T細胞においてきわめて多様である
腫瘍内在T細胞はきわめて機能不全の表現型を示すことが多いので、FolR1−TCB刺激後の異なる患者間のT細胞活性化において観察された不均一性は、損なわれたTIL機能性が原因であり得る。慢性ウイルス感染及び腫瘍の両方における機能不全のT細胞の特徴は、阻害性受容体の過剰発現である。この目的のために、本発明者らは、全ての腫瘍試料において腫瘍浸潤性CD8+ T細胞における免疫チェックポイントPD−1、Tim−3、CTLA−4、Lag−3、及びBTLAの発現を決定した。本発明者らは、異なる腫瘍間のこれらの受容体の頻度及び組み合わされた発現における高い多様性を観察した;PD−1は、最も高い百分率の発現(60.2±30%)を有する最も顕著な阻害性受容体であり、その後にTim−3(29.5±24.4%)、CTLA−4(24.6±17.6%)、Lag−3(7.0±5.9%)、及びBTLA(3.9±2.6%)が続くことが見出された(図35F)。マウス慢性ウイルス感染モデルにおいて以前に記載されているように(Blackburn等、Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105(39):15016-21)且つ、本明細書に示されているように、ヒト腫瘍において、PD−1+集団は、PD−1hi及びPD−1intを発現している部分母集団に分けられた(図35A)。これらの特定のサブセットにおいて発現される更なる阻害性受容体の解析により、PD−1hi部分母集団では、Tim−3、CTLA−4、Lag−3、及びBTLAを含む、他の全ての阻害性受容体が、PD−1int及びPD−1negサブセットにおけるこれらの受容体の発現と比較して有意に高く発現されることが示された(図36A−D)。したがって、本発明者らは、阻害性受容体の累積の発現についての代替マーカーとして、CD8+サブセットにおけるPD−1hi T細胞の百分率を使用した。腫瘍試料は、PD−1hi細胞の頻度によって、PD−1hiを発現しているT細胞がそれぞれ高頻度(PD−1hiが豊富な腫瘍)及び低頻度(PD−1hiが稀な腫瘍)の2つのグループに分けられた。2つのグループを分けるために、30%のPD−1hi発現のカットオフ値が選択された。PD−1hi細胞の百分率は、PD−1hiが豊富なグループでは39.1−60.5%(49.5±7.9%)、PD−1hiが稀なグループでは2.65−19.5%の範囲に及んだ(8.4±5.7%;図36E)。カットオフ値は、PD−1hi細胞の頻度において同様の分布を有する14名のNSCLC患者及び2名の卵巣がん患者の第2のコホートにおいて検証され、ここで、本発明者らは、抗CD3/抗CD28抗体によるポリクローナル刺激の際に比較可能な結果を観察した(図39)。
FolR1−TCBにより誘導されるT細胞活性化は、CD8+ T細胞においてPD−1発現のレベルに大きく依存する
本発明者らは、阻害性受容体の発現が、FolR1−TCB処理の際に低下されたT細胞機能性と相関し得るかどうかを解析した。上記の実施例41に記載の結果と一致して、CD25、CD137、及びICOSの発現(それぞれ、p=0.028;p<0.001、及びp=0.008)によって例示されたように、FolR1−TCBにより誘導されるT細胞活性化、並びに、IFN−γ、IL−2、TNF、及びパーフォリン分泌によって示された、T細胞エフェクター機能は、PD−1hiが豊富な腫瘍において、PD−1hiが稀な腫瘍と比較して有意に損なわれていた(それぞれ、p=0.019;p=0.007;p=0.028、及びp=0.029;図37A−G)。同様に、PD−1hiが豊富な腫瘍は、FolR1−TCB刺激の際に有意に低下された細胞傷害性を示したのに対して、PD−1hiが稀な腫瘍の大多数において、強い腫瘍細胞死滅が観察可能であった(p=0.021;図37H)。
PD−1ブロックは、PD−1hiが稀な腫瘍のみにおいて、FolR1−TCBにより誘導されるT細胞機能を回復させる
TILにおけるPD−1発現のレベルがFolR1−TCBの有効性と相関するので、本発明者らは、FolR1−TCB処理と組み合わされたPD−1/PD−L1軸のブロックがT細胞機能を回復させることができる可能性があるかどうかを解析した。本発明者らは、FolR1−TCB及びPD−1ブロック抗体ニボルマブ(MDX5C4)での組み合わされた処理の際、エフェクターサイトカインIFN−γ、TNF、及びIL−2並びにパーフォリンの分泌が、PD−1hiが稀な腫瘍の一部のみにおいて増加され得たことを見出した。対照的に、PD−1hiが豊富な腫瘍では、PD−1ブロックは、いかなる応答も誘発することができなかった(図38A−D)。重要なことに、細胞傷害性腫瘍細胞死滅は、T細胞において、PD−1hiが稀な腫瘍からもPD−1hiが豊富な腫瘍からも、更なるPD−1ブロックによって改良することができなかった(図38E)。
例示的実施態様のアミノ酸配列
1)共通軽鎖形式、可変重鎖において有用なFolRバインダー
2)CD3バインダー共通軽鎖(CLC)
3)CD3バインダー、重鎖
4)crossfab形式にとって有用なFolRバインダー
5)crossfab形式において有用なCD3バインダー
6)CD3-FolR二重特異性抗体2+1インバーテッドcrossmab形式の例示的アミノ酸配列
7)共通軽鎖を有するCD3-FolR二重特異性抗体の例示的アミノ酸配列
8) 親和性が低減した例示的16D5変異体
a.親和性が低減した例示的軽鎖変異体
b.親和性が低減した例示的重鎖変異体
9)ファージディスプレイライブラリーから作製されたさらなる例示的実施態様(CDRに下線が引かれている)
10)例示的実施態様の9D11グリコシド変異体:可変軽鎖(CDRに下線が引かれている)
11)脱アミノ化変異体
12)例示示的実施態様のMov19ベースのFolR1 TCB(CDRに下線が引かれている)
13)中間親和性のバインダーを有するさらなるFolR1 TCB(カバットに従うCDRに下線が引かれている)
14)抗原配列
2)例示的実施態様のヌクレオチド配列
例示的抗TIM3抗体アミノ酸配列及び例示的TIM3配列の配列が、以下のように以下の配列表中に示されている:
配列番号304 重鎖HVR−H1、Tim3_0016
配列番号305 重鎖HVR−H2、Tim3_0016
配列番号306 重鎖HVR−H3、Tim3_0016
配列番号307 軽鎖HVR−L1、Tim3_0016
配列番号308 軽鎖HVR−L2、Tim3_0016
配列番号309 軽鎖HVR−L3、Tim3_0016
配列番号310 重鎖可変ドメインVH、Tim3_0016
配列番号311 軽鎖可変ドメインVL、Tim3_0016
配列番号312 重鎖可変ドメインVH、Tim3_0016変異体(0018)
配列番号313 軽鎖可変ドメインVL、Tim3_0016変異体(0018)
配列番号314 軽鎖HVR−L1、Tim3_0016_HVR−L1変異体1_NQ
(NからQへの突然変異によるグリコシル化部位の除去)
配列番号315 軽鎖HVR−L1、Tim3_0016_HVR−L1変異体2_NS
(NからSへの突然変異によるグリコシル化部位の除去)
配列番号316 重鎖HVR−H1、Tim3_0021
配列番号317 重鎖HVR−H2、Tim3_0021
配列番号318 重鎖HVR−H3、Tim3_0021
配列番号319 軽鎖HVR−L1、Tim3_0021
配列番号320 軽鎖HVR−L2、Tim3_0021
配列番号321 軽鎖HVR−L3、Tim3_0021
配列番号322 重鎖可変ドメインVH、Tim3_0021
配列番号323 軽鎖可変ドメインVL、Tim3_0021
配列番号324 重鎖HVR−H1、Tim3_0022
配列番号325 重鎖HVR−H2、Tim3_0022
配列番号326 重鎖HVR−H3、Tim3_0022
配列番号327 軽鎖HVR−L1、Tim3_0022
配列番号328 軽鎖HVR−L2、Tim3_0022
配列番号329 軽鎖HVR−L3、Tim3_0022
配列番号330 重鎖可変ドメインVH、Tim3_0022
配列番号331 軽鎖可変ドメインVL、Tim3_0022
配列番号332 重鎖HVR−H1、Tim3_0026
配列番号333 重鎖HVR−H2、Tim3_0026
配列番号334 重鎖HVR−H3、Tim3_0026
配列番号335 軽鎖HVR−L1、Tim3_0026
配列番号336 軽鎖HVR−L2、Tim3_0026
配列番号337 軽鎖HVR−L3、Tim3_0026
配列番号338 重鎖可変ドメインVH、Tim3_0026
配列番号339 軽鎖可変ドメインVL、Tim3_0026
配列番号340 重鎖HVR−H1、Tim3_0028
配列番号341 重鎖HVR−H2、Tim3_0028
配列番号342 重鎖HVR−H3、Tim3_0028
配列番号343 軽鎖HVR−L1、Tim3_0028
配列番号344 軽鎖HVR−L2、Tim3_0028
配列番号345 軽鎖HVR−L3、Tim3_0028
配列番号346 重鎖可変ドメインVH、Tim3_0028
配列番号347 軽鎖可変ドメインVL、Tim3_0028
配列番号348 重鎖HVR−H1、Tim3_0030
配列番号349 重鎖HVR−H2、Tim3_0030
配列番号350 重鎖HVR−H3、Tim3_0030
配列番号351 軽鎖HVR−L1、Tim3_0030
配列番号352 軽鎖HVR−L2、Tim3_0030
配列番号353 軽鎖HVR−L3、Tim3_0030
配列番号354 重鎖可変ドメインVH、Tim3_0030
配列番号355 軽鎖可変ドメインVL、Tim3_0030
配列番号356 重鎖HVR−H1、Tim3_0033
配列番号357 重鎖HVR−H2、Tim3_0033
配列番号358 重鎖HVR−H3、Tim3_0033
配列番号359 軽鎖HVR−L1、Tim3_0033
配列番号360 軽鎖HVR−L2、Tim3_0033
配列番号361 軽鎖HVR−L3、Tim3_0033
配列番号362 重鎖可変ドメインVH、Tim3_0033
配列番号363 軽鎖可変ドメインVL、Tim3_0033
配列番号364 重鎖HVR−H1、Tim3_0038
配列番号365 重鎖HVR−H2、Tim3_0038
配列番号366 重鎖HVR−H3、Tim3_0038
配列番号367 軽鎖HVR−L1、Tim3_0038
配列番号368 軽鎖HVR−L2、Tim3_0038
配列番号369 軽鎖HVR−L3、Tim3_0038
配列番号370 重鎖可変ドメインVH、Tim3_0038
配列番号371 軽鎖可変ドメインVL、Tim3_0038
配列番号372 例示的シュードモナス属(Pseudomonas)外毒素A変異体1(脱免疫化PE24実施例)
配列番号373 例示的シュードモナス属(Pseudomonas)外毒素A変異体2(脱免疫化PE24実施例)
配列番号374 ヒトκ軽鎖定常領域
配列番号375 ヒトλ軽鎖定常領域
配列番号376 IgG1に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号377 突然変異L234A及びL235Aを有するIgG1に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号378 突然変異L234A、L235A及びP329Gを有するIgG1に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号379 IgG4に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号380 例示的ヒトTIM3 配列
配列番号381 ヒトTIM3細胞外ドメイン(ECD)
<210> 304
<211> 9
<212> PRT
<213> マウス(Mus musculus)
<400> 304
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met
1 5
<210> 305
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 305
Leu Asn Asp
1
<210> 306
<211> 8
<212> PRT
<213> マウス
<400> 306
Asn Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp
1 5
<210> 307
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 307
Ser Ser Ser Val Asn Tyr
1 5
<210> 308
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 308
Asp Ala Phe
1
<210> 309
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 309
Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 310
<211> 120
<212> PRT
<213> マウス
<400> 310
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Leu Asn Asp Asp Val Phe Phe Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Gln Ile Ala Ser Val Val Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Ala Asn Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 311
<211> 106
<212> PRT
<213> マウス
<400> 311
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Thr
20 25 30
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ala Phe Lys Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Thr Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 312
<211> 120
<212> PRT
<213> マウス
<400> 312
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Leu Asn Asp Asp Val Phe Phe Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Arg Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Gln Ile Ala Ser Val Val Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Ala Asn Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 313
<211> 106
<212> PRT
<213> マウス
<400> 313
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Thr
20 25 30
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ala Phe Lys Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Thr Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 314
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 314
Ser Ser Ser Val Gln Tyr
1 5
<210> 315
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 315
Ser Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 316
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 316
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 317
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 317
Ser Asp Ser
1
<210> 318
<211> 9
<212> PRT
<213> マウス
<400> 318
Gly Tyr Tyr Ala Trp Tyr Tyr Phe Asp
1 5
<210> 319
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 319
Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn
1 5
<210> 320
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 320
Tyr Ala Ser
1
<210> 321
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 321
Ser Asn Ser Trp Pro Leu
1 5
<210> 322
<211> 120
<212> PRT
<213> マウス
<400> 322
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gln Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Gln Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Tyr Ala Trp Tyr Tyr Phe Asp Cys Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 323
<211> 107
<212> PRT
<213> マウス
<400> 323
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser His Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Lys Phe Ser Gly
50 55 60
Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Phe Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 324
<211> 5
<212> PRT
<213> マウス
<400> 324
Gly Asp Ser Ile Ala
1 5
<210> 325
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 325
Tyr Ser Gly
1
<210> 326
<211> 4
<212> PRT
<213> マウス
<400> 326
Asp Tyr Phe Asp
1
<210> 327
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 327
Arg Gln Asp Val Arg Lys Asn
1 5
<210> 328
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 328
Tyr Thr Ser
1
<210> 329
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 329
Tyr Asp Asn Leu Pro Phe
1 5
<210> 330
<211> 114
<212> PRT
<213> マウス
<400> 330
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Ala Ser Ala
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Gln Asn Gln Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 331
<211> 107
<212> PRT
<213> マウス
<400> 331
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Arg Gln Asp Val Arg Lys Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Trp Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Asn Ile Asn Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
100 105
<210> 332
<211> 5
<212> PRT
<213> マウス
<400> 332
Gly Tyr Thr Phe Thr
1 5
<210> 333
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 333
Glu Thr Tyr
1
<210> 334
<211> 4
<212> PRT
<213> マウス
<400> 334
Gly Tyr Pro Ala
1
<210> 335
<211> 12
<212> PRT
<213> マウス
<400> 335
Ser Arg Thr Ile Leu His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 336
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 336
Lys Val Ser
1
<210> 337
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 337
Asp Ser His Val Pro Phe
1 5
<210> 338
<211> 115
<212> PRT
<213> マウス
<400> 338
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Thr Glu Thr Tyr Glu Pro Thr Phe Gly Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Tyr Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Ile
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 339
<211> 112
<212> PRT
<213> マウス
<400> 339
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Thr Ile Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Asp
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 340
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 340
Gly Phe Asn Ile Lys Thr Thr
1 5
<210> 341
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 341
Ala Asp Asp
1
<210> 342
<211> 8
<212> PRT
<213> マウス
<400> 342
Phe Gly Tyr Val Ala Trp Phe Ala
1 5
<210> 343
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 343
Ser Gln Ser Val Asp Asn Tyr
1 5
<210> 344
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 344
Tyr Ala Ser
1
<210> 345
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 345
His Tyr Ser Ser Pro Tyr
1 5
<210> 346
<211> 119
<212> PRT
<213> マウス
<400> 346
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Thr Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Phe Gly Tyr Val Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Phe Ser Ala
115
<210> 347
<211> 107
<212> PRT
<213> マウス
<400> 347
Asn Ile Val Met Thr Pro Thr Pro Lys Phe Leu Pro Val Ser Ser Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Val
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 348
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 348
Gly Tyr Pro Phe Ser Glu Tyr
1 5
<210> 349
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 349
Glu Thr Gly
1
<210> 350
<211> 4
<212> PRT
<213> マウス
<400> 350
Gly Tyr Pro Ala
1
<210> 351
<211> 12
<212> PRT
<213> マウス
<400> 351
Ser Arg Ser Ile Val His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 352
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 352
Lys Val Ser
1
<210> 353
<211> 5
<212> PRT
<213> マウス
<400> 353
Asp Ser His Val Pro
1 5
<210> 354
<211> 115
<212> PRT
<213> マウス
<400> 354
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Val Tyr Val Asn Thr Glu Thr Gly Gln Pro Ile Val Gly Asp Asp Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Val Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Tyr Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 355
<211> 112
<212> PRT
<213> マウス
<400> 355
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Asp
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 356
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 356
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
1 5
<210> 357
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 357
Ala Thr Gly
1
<210> 358
<211> 8
<212> PRT
<213> マウス
<400> 358
Tyr Pro His Tyr Tyr Ala Met Asp
1 5
<210> 359
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 359
Ser Glu Asn Ile Phe Ser Asn
1 5
<210> 360
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 360
Ser Ala Thr
1
<210> 361
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 361
Phe Tyr Lys Ile Pro Phe
1 5
<210> 362
<211> 121
<212> PRT
<213> マウス
<400> 362
Gln Gly Gln Met His Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Ile Ser Trp Leu Lys Gln Lys Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Trp Ile Tyr Ala Ala Thr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Asn Lys Ala Gln Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ala Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 363
<211> 107
<212> PRT
<213> マウス
<400> 363
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Phe Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Asn Leu Gly Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Tyr Lys Ile Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 364
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 364
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
1 5
<210> 365
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 365
Glu Asp Gly
1
<210> 366
<211> 8
<212> PRT
<213> マウス
<400> 366
His Gly Tyr Val Gly Trp Phe Ala
1 5
<210> 367
<211> 8
<212> PRT
<213> マウス
<400> 367
Ala Ser Glu Asn Val Asp Thr Tyr
1 5
<210> 368
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 368
Gly Ala Ser
1
<210> 369
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 369
Ser Tyr Ser Tyr Pro Trp
1 5
<210> 370
<211> 119
<212> PRT
<213> マウス
<400> 370
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Pro Leu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Leu Ile Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Asp His Gly Tyr Val Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 371
<211> 107
<212> PRT
<213> マウス
<400> 371
Asn Val Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ile Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Gln Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Phe Arg
100 105
<210> 372
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 例示的シュードモナス属(Pseudomonas)外毒素A変異体1(脱免疫化PE24実施例)
<400> 372
Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser
1 5 10 15
Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His
20 25 30
Ala Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr
35 40 45
Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Ala Ala Arg
50 55 60
Ser Gln Asp Leu Ala Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp
65 70 75 80
Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala
85 90 95
Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Ala Ser
100 105 110
Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu
115 120 125
Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Ala
130 135 140
Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr
145 150 155 160
Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala
165 170 175
Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser
180 185 190
Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser
195 200 205
Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys
210 215
<210> 373
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 例示的シュードモナス属(Pseudomonas)外毒素A変異体2(脱免疫化PE24実施例)
<400> 373
Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser
1 5 10 15
Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His
20 25 30
Ala Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr
35 40 45
Ala Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg
50 55 60
Ser Gln Asp Leu Arg Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp
65 70 75 80
Pro Ala His Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg
85 90 95
Gly Arg Ile Ala Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Ala Ser
100 105 110
Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu
115 120 125
Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg
130 135 140
Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Glu Glu Thr
145 150 155 160
Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala
165 170 175
Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser
180 185 190
Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser
195 200 205
Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys
210 215
<210> 374
<211> 107
<212> PRT
<213> ヒト(Homo Sapiens)
<400> 374
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 375
<211> 105
<212> PRT
<213> ヒト
<400> 375
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 376
<211> 330
<212> PRT
<213> ヒト
<400> 376
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 377
<211> 330
<212> PRT
<213> ヒト
<400> 377
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 378
<211> 330
<212> PRT
<213> ヒト
<400> 378
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 379
<211> 327
<212> PRT
<213> ヒト
<400> 379
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 380
<211> 280
<212> PRT
<213> ヒト
<400> 380
Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro
1 5 10 15
Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp
20 25 30
Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg
35 40 45
Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn
50 55 60
Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr
65 70 75 80
Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile
85 90 95
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100 105 110
Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro
115 120 125
Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu
130 135 140
Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn
145 150 155 160
Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala
165 170 175
Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Gly Leu
180 185 190
Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe Lys Trp Tyr Ser His
195 200 205
Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile Ser Leu Ala Asn Leu
210 215 220
Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu Gly Ile Arg Ser Glu
225 230 235 240
Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr Glu Val Glu Glu Pro
245 250 255
Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln Gln Pro Ser Gln Pro
260 265 270
Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro
275 280
<210> 381
<211> 181
<212> PRT
<213> ヒト
<400> 381
Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro
1 5 10 15
Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp
20 25 30
Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile
85 90 95
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100 105 110
Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro
115 120 125
Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu
130 135 140
Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn
145 150 155 160
Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala
165 170 175
Thr Ile Arg Ile Gly
180
Claims (70)
- CD3と特異的に結合可能な第1の抗原結合部分及び葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第2の抗原結合部分を含む有効量のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びPD−1軸結合アンタゴニストを含む、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための医薬であって、
第1の抗原結合部分が、配列番号37、配列番号38、及び配列番号39からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列並びに配列番号32、配列番号33、及び配列番号34からなる群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRアミノ酸配列を含み、
葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第2の抗原結合部分が、配列番号16、配列番号17及び配列番号18の重鎖相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列並びに配列番号32、配列番号33、及び配列番号34の軽鎖CDRアミノ酸配列を含み、
PD−1軸結合アンタゴニストが、抗PD−1抗体、抗PD−L1抗体、及び抗PD−L2抗体からなる群から選択される、
医薬。 - 第1の抗原結合部分が、配列番号36のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号31のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項1に記載の医薬。
- T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、FolR1と特異的に結合可能な第3の抗原結合部分をさらに含む、請求項2に記載の医薬。
- FolR1と特異的に結合可能な第2及び第3の抗原結合部分が、同一の重鎖相補性決定領域(CDR)及び軽鎖CDR配列を含む、請求項3に記載の医薬。
- 第3の抗原結合部分が、第2の抗原結合部分と同一である、請求項4に記載の医薬。
- 第1、第2及び第3の抗原結合部分のうちの少なくとも1つが、Fab分子である、請求項3から5の何れか一項に記載の医薬。
- 葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な抗原結合部分が、配列番号15のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号31のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項6に記載の医薬。
- T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒトFolR1及びカニクイザルFolR1と結合し、マウスFolR1と結合しない、請求項1から7の何れか一項に記載の医薬。
- T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、インビトロでヒトCD3陽性T細胞の増殖を誘導する、請求項1から8の何れか一項に記載の医薬。
- T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、インビトロでFolR1発現ヒト腫瘍細胞のヒト末梢血単核細胞媒介性死滅を誘導する、請求項1から9の何れか一項に記載の医薬。
- T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、インビトロでFolR1発現ヒト腫瘍細胞のT細胞媒介性死滅を誘導する、請求項1から10の何れか一項に記載の医薬。
- T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、フローサイトメトリーによって測定されるような、T細胞でのCD25及びCD69のうちの少なくとも一方の細胞表面発現の上方制御を誘導する、請求項1から11の何れか一項に記載の医薬。
- T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒト腫瘍細胞上に発現されるFolR1と結合する、請求項1から12の何れか一項に記載の医薬。
- T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒト葉酸受容体2(FolR2)又はヒト葉酸受容体3(FolR3)と結合しない、請求項1から13の何れか一項に記載の医薬。
- 抗原結合部分が、ヒトFolR1(配列番号227)のアミノ酸25−234を含むFolR1ポリペプチドと結合する、請求項1から14の何れか一項に記載の医薬。
- CD3と特異的に結合可能な第1の抗原結合部分と、葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第2及び第3の抗原結合部分とを含む有効量のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子、並びにPD−1軸結合アンタゴニストを含む、請求項1から15の何れか一項に記載の医薬であって、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、第1、第2及び第3の抗原結合部分を形成する第1、第2、第3、第4及び第5のポリペプチド鎖を含み、第1の抗原結合部分が、CD3と結合可能であり、第2及び第3の抗原結合部分が各々、葉酸受容体1(FolR1)と結合可能であり、a)第1及び第2のポリペプチド鎖が、アミノ(N)末端からカルボキシル(C)末端の方向に、VLD1及びCLD1を含み、b)第3のポリペプチド鎖が、N末端からC末端の方向に、VLD2及びCH1D2を含み、c)第4のポリペプチド鎖が、N末端からC末端の方向に、VHD1、CH1D1、CH2D1及びCH3D1を含み、d)第5のポリペプチド鎖が、VHD1、CH1D1、VHD2、CLD2、CH2D2及びCH3D2を含み、
VLD1が、第1の軽鎖可変ドメインであり、
VLD2が、第2の軽鎖可変ドメインであり、
CLD1が、第1の軽鎖定常ドメインであり、
CLD2が、第2の軽鎖定常ドメインであり、
VHD1が、第1の重鎖可変ドメインであり、
VHD2が、第2の重鎖可変ドメインであり、
CH1D1が、第1の重鎖定常ドメイン1であり、
CH1D2が、第2の重鎖定常ドメイン1であり、
CH2D1が、第1の重鎖定常ドメイン2であり、
CH2D2が、第2の重鎖定常ドメイン2であり、
CH3D1が、第1の重鎖定常ドメイン3であり、
CH3D2が、第2の重鎖定常ドメイン3であり、
PD−1軸結合アンタゴニストが、抗PD−1抗体、抗PD−L1抗体、及び抗PD−L2抗体からなる群から選択される、
医薬。 - a.第3のポリペプチド鎖並びに第5のポリペプチド鎖のVHD2及びCLD2が、CD3と結合可能な第1の抗原結合部分を形成し、
b.第1のポリペプチド鎖並びに第4のポリペプチド鎖のVHD1及びCH1D1が、FolR1と結合可能な第2の結合部分を形成し、
c.第2のポリペプチド鎖並びに第5のポリペプチド鎖のVHD1及びCH1D1が、FolR1と結合可能な第3の結合部分を形成する、請求項16に記載の医薬。 - 第3のポリペプチド鎖が、配列番号86のアミノ酸配列を含む、請求項16又は17に記載の医薬。
- 抗PD−1抗体が、PD−1の、そのリガンドである結合パートナーとの結合を阻害する、請求項1から18の何れか一項に記載の医薬。
- 抗PD−1抗体が、PD−1のPD−L1との結合を阻害する、請求項19に記載の医薬。
- 抗PD−1抗体が、PD−1のPD−L2との結合を阻害する、請求項19に記載の医薬。
- 抗PD−1抗体が、PD−1の、PD−L1及びPD−L2の両方との結合を阻害する、請求項19に記載の医薬。
- 抗PD−1抗体が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ及びCT−011からなる群から選択される、請求項18に記載の医薬。
- 抗PD−L1抗体が、PD−L1のPD−1との結合を阻害する、請求項1から18の何れか一項に記載の医薬。
- 抗PD−L1抗体が、PD−L1のB7−1との結合を阻害する、請求項1から18の何れか一項に記載の医薬。
- 抗PD−L1抗体が、PD−L1の、PD−1及びB7−1両方との結合を阻害する、請求項1から18の何れか一項に記載の医薬。
- 抗PD−L1抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1から18の何れか一項に記載の医薬。
- 抗PD−L1抗体が、Fab、Fab’−SH、Fv、scFv及び(Fab’)2断片からなる群から選択される抗体断片である、請求項1から18の何れか一項に記載の医薬。
- 抗PD−L1抗体が、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項27又は28に記載の医薬。
- 抗PD−L1抗体が、YW243.55.S70、MPDL3280A、MDX−1105及びMEDI4736からなる群から選択される、請求項1から18の何れか一項に記載の医薬。
- 抗PD−L1抗体が、配列番号289のHVR−Hl配列、配列番号290のHVR−H2配列及び配列番号291のHVR−H3配列を含む重鎖並びに配列番号292のHVR−L1配列、配列番号293のHVR−L2配列及び配列番号294のHVR−L3配列を含む軽鎖を含む、請求項1から18の何れか一項に記載の医薬。
- 抗PD−L1抗体が、配列番号280又は配列番号281のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号383のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1から18の何れか一項に記載の医薬。
- PD−1軸結合アンタゴニストが、抗PD−L2抗体である、請求項1から18の何れか一項に記載の医薬。
- 抗PD−L2抗体が、イムノアドヘシンである、請求項33に記載の医薬。
- 個体に、抗T細胞免疫グロブリンムチン3(TIM3)アンタゴニスト抗体を投与することをさらに含む、請求項1から34の何れか一項に記載の医薬。
- 抗TIM3アンタゴニスト抗体が、37℃で120分後に少なくとも45%の、TIM3発現細胞でTIM3の内部移行を誘導し、内部移行が、FACS解析によって測定される、請求項35に記載の医薬。
- 抗TIM3アンタゴニスト抗体が、以下の特性:
a)TIM3との結合について、配列番号7のVH及び配列番号8のVLを含む抗Tim3抗体と競合する、
b)ヒト及びカニクイザルTIM3と結合する、
c)イムノコンジュゲートとして、TIM3発現細胞に対して細胞傷害活性を示す、
d)インターフェロンガンマ放出を誘導する
のうちの少なくとも1つを有する、請求項35に記載の医薬。 - 抗TIM3アンタゴニスト抗体が、
a)TIM3との結合について、配列番号7のVH及び配列番号8のVLを含む抗Tim3抗体と競合し、
b)ヒト及びカニクイザルTIM3と結合し、
c)イムノコンジュゲートとして、TIM3発現細胞に対して細胞傷害活性を示し、
d)インターフェロンガンマ放出を誘導する、
請求項35に記載の医薬。 - 抗TIM3アンタゴニスト抗体が、モノクローナル抗体である、請求項36から38の何れか一項に記載の医薬。
- 抗TIM3アンタゴニスト抗体が、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体である、請求項35から39の何れか一項に記載の医薬。
- 抗TIM3アンタゴニスト抗体が、TIM3と結合する抗体断片である、請求項35から40の何れか一項に記載の医薬。
- 抗TIM3アンタゴニスト抗体が、Fab断片である、請求項35から41の何れか一項に記載の医薬。
- A)(a)(i)配列番号304のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号305のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号306から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号307のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号308のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号309のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
B)(a)(i)配列番号304のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号305のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号306から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号314のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号308のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号309のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
C)(a)(i)配列番号304のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号305のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号306から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号315のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号308のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号309のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
D)(a)(i)配列番号316のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号317のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号318から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号319のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号320のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号321のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
E)(a)(i)配列番号324のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号325のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号326から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号327のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号328のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号329のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
F)(a)(i)配列番号332のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号333のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号334から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号335のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号336のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号337のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
G)(a)(i)配列番号340のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号341のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号342から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号343のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号344のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号345のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
H)(a)(i)配列番号348のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号349のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号350から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号351のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号352のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号353のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
I)(a)(i)配列番号356のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号357のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号358から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号359のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号360のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号361のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン;又は
J)(a)(i)配列番号364のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号365のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号366から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含むVHドメイン並びに(b)(i)配列番号367のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号368のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号369のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含むVLドメイン
を含む、請求項35から39の何れか一項に記載の医薬。 - 抗TIM3アンタゴニスト抗体が、カバット番号付けのEUインデックスに従って突然変異S228P、L235E及びP329Gを有する全長IgG1抗体である、請求項35から39の何れか一項に記載の医薬。
- 抗TIM3アンタゴニスト抗体が、F38−2E2である、請求項35に記載の医薬。
- がんが、KRAS野生型を含有する、請求項1から45の何れか一項に記載の医薬。
- がんが、活性化KRAS突然変異を含有する、請求項1から45の何れか一項に記載の医薬。
- 治療が、治療の休止後、個体における持続応答をもたらす、請求項1から47の何れか一項に記載の医薬。
- T細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びPD−1軸結合アンタゴニストの少なくとも一方が、継続的に投与される、請求項1から48の何れか一項に記載の医薬。
- T細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びPD−1軸結合アンタゴニストの少なくとも一方が、断続的に投与される、請求項1から48の何れか一項に記載の医薬。
- PD−1軸結合アンタゴニストが、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の前に投与される、請求項1から48の何れか一項に記載の医薬。
- PD−1軸結合アンタゴニストが、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子と同時に投与される、請求項1から48の何れか一項に記載の医薬。
- PD−1軸結合アンタゴニストが、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の後に投与される、請求項1から48の何れか一項に記載の医薬。
- がんが、卵巣がん、肺がん、乳がん、腎がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんからなる群から選択される、請求項1から53の何れか一項に記載の医薬。
- T細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びPD−1軸結合アンタゴニストの少なくとも一方が、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所に、経口的に、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、移植によって、吸入によって、髄腔内に、脳室内に又は鼻腔内に投与される、請求項1から53の何れか一項に記載の医薬。
- 個体中のT細胞が、組合せの投与の前に比べ、増強された活性化、増殖及び/又はエフェクター機能を有する、請求項1から55の何れか一項に記載の医薬。
- 個体中のT細胞が、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子単独の投与に比べ、増強された活性化、増殖及び/又はエフェクター機能を有する、請求項1から53の何れか一項に記載の医薬。
- T細胞エフェクター機能が、IL−2、IFN−γ及びTNF−αのうちの少なくとも1種の分泌である、請求項56又は57に記載の医薬。
- CD3と特異的に結合可能な第1の抗原結合部分及び葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第2の抗原結合部分を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにPD−1軸結合アンタゴニストの組合せの有効量を含む、FolR1陽性がんを有する個体において免疫機能を増強するための医薬であって、
ここで、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、
第1の抗原結合部分が、配列番号37、配列番号38、及び配列番号39からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列並びに配列番号32、配列番号33、及び配列番号34からなる群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRアミノ酸配列を含み、かつ
葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第2の抗原結合部分が、配列番号16、配列番号17及び配列番号18の重鎖相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列並びに配列番号32、配列番号33、及び配列番号34の軽鎖CDRアミノ酸配列を含む、分子であり、
PD−1軸結合アンタゴニストが、抗PD−1抗体、抗PD−L1抗体、及び抗PD−L2抗体からなる群から選択される、医薬。 - 個体中のT細胞が、組合せの投与の前に比べ、増強された活性化、増殖及び/又はエフェクター機能を有する、請求項59に記載の医薬。
- 個体中のT細胞が、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子単独の投与に比べ、増強された活性化、増殖及び/又はエフェクター機能を有する、請求項59に記載の医薬。
- T細胞エフェクター機能が、IL−2、IFN−γ及びTNF−αのうちの少なくとも1種の分泌である、請求項60又は61に記載の医薬。
- CD3と特異的に結合可能な第1の抗原結合部分及び葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第2の抗原結合部分を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子をPD−1軸結合アンタゴニストとともに使用して、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための使用説明書を含む添付文書とを含むキットであって、
ここで、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、
第1の抗原結合部分が、配列番号37、配列番号38、及び配列番号39からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列並びに配列番号32、配列番号33、及び配列番号34からなる群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRアミノ酸配列を含み、かつ
葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第2の抗原結合部分が、配列番号16、配列番号17及び配列番号18の重鎖相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列並びに配列番号32、配列番号33、及び配列番号34の軽鎖CDRアミノ酸配列を含む、分子であり、
PD−1軸結合アンタゴニストが、抗PD−1抗体、抗PD−L1抗体、抗PD−L2抗体、及び抗PD−1イムノアドヘシンからなる群から選択される、キット。 - T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を抗TIM3アンタゴニスト抗体とともに使用するための使用説明書をさらに含む、請求項63に記載のキット。
- 葉酸受容体1(FolR1)及びCD3に特異的なT細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにPD−1軸結合アンタゴニストと、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びPD−1軸結合アンタゴニストを使用して、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための使用説明書を含む添付文書とを含む、請求項63又は64に記載のキット。
- 抗TIM3アンタゴニスト抗体をさらに含む、請求項65に記載のキット。
- PD−1軸結合アンタゴニストが、抗PD−1抗体又は抗PD−L1抗体である、請求項63から66の何れか一項に記載のキット。
- がんの治療のための医薬の製造における、CD3と特異的に結合可能な第1の抗原結合部分及び葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第2の抗原結合部分を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにPD−1軸結合アンタゴニストの組合せの使用であって、
ここで、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、
第1の抗原結合部分が、配列番号37、配列番号38、及び配列番号39からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列並びに配列番号32、配列番号33、及び配列番号34からなる群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRアミノ酸配列を含み、かつ
葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第2の抗原結合部分が、配列番号16、配列番号17、及び配列番号18の重鎖相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列並びに配列番号32、配列番号33、及び配列番号34の軽鎖CDRアミノ酸配列を含む、分子であり、
PD−1軸結合アンタゴニストが、抗PD−1抗体、抗PD−L1抗体、及び抗PD−L2抗体からなる群から選択される、
使用。 - がんの治療のための医薬の製造における、CD3と特異的に結合可能な第1の抗原結合部分及び葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第2の抗原結合部分を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにPD−1軸結合アンタゴニスト並びに抗TIM3アンタゴニスト抗体の組合せの使用であって、
ここで、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、
第1の抗原結合部分が、配列番号37、配列番号38及び配列番号39からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列並びに配列番号32、配列番号33、及び配列番号34からなる群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRアミノ酸配列を含み、かつ
葉酸受容体1(FolR1)と特異的に結合可能な第2の抗原結合部分が、配列番号16、配列番号17及び配列番号18の重鎖相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列並びに配列番号32、配列番号33、及び配列番号34の軽鎖CDRアミノ酸配列を含む、分子であり、
PD−1軸結合アンタゴニストが、抗PD−1抗体、抗PD−L1抗体、及び抗PD−L2抗体からなる群から選択される、
使用。 - 医薬が、卵巣がん、肺がん、乳がん、腎がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんの治療用である、請求項68又は69に記載の使用。
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