JP2020103292A - レバウディオサイドdおよびレバウディオサイドmの改良された産生方法 - Google Patents
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Abstract
Description
およびレバウディオサイドD:
4,5‐ジヒドロキシ‐6‐(ヒドロキシメチル)‐3‐{[3,4,5‐トリヒドロキシ‐6‐(ヒドロキシメチル)オキサン‐2‐イル]オキシ}オキサン‐2‐イル13‐{[5‐ヒドロキシ‐6‐(ヒドロキシメチル)‐3,4‐ビス({[3,4,5‐トリヒドロキシ‐6‐(ヒドロキシメチル)オキサン‐2‐イル]オキシ})オキサン‐2‐イル]オキシ}‐5,9‐ジメチル‐14‐メチリデンテトラシクロ[11.2.1.01,10.04,9]ヘキサデカン‐5‐カルボン酸などのステビオールグリコシド類の産生に関する。
(a)GGPPSをコードする組換え遺伝子;
(b)ent‐コパリル二リン酸シンターゼ(CDPS)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(c)カウレンオキシダーゼ(KO)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(d)カウレンシンターゼ(KS)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(e)ステビオールシンターゼ(KAH)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(f)シトクロムP450レダクターゼ(CPR)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(h)UGT74G1ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(i)UGT76G1ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(j)UGT91d2ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;および
(k)EUGT11ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
を発現する組換え宿主細胞であって、
少なくとも1つの前記遺伝子が組換え遺伝子であり、レバウディオサイドD、レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、および/またはレバウディオサイドIを産生する、前記細胞を提供する。
(a)GGPPSをコードする組換え遺伝子;
(b)ent‐コパリル二リン酸シンターゼ(CDPS)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(c)カウレンオキシダーゼ(KO)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(d)カウレンシンターゼ(KS)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(e)ステビオールシンターゼ(KAH)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(f)シトクロムP450レダクターゼ(CPR)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(g)UGT85C2ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(h)UGT74G1ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(i)UGT76G1ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(j)UGT91d2ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;および
(k)EUGT11ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
を含む外来性核酸を含む組換え宿主細胞であって、
レバウディオサイドD、レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、および/またはレバウディオサイドIを産生する、前記細胞を提供する。
ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生する、前記細胞を提供する。
(a)GGPPS;ent‐コパリル二リン酸シンターゼ(CDPS)ポリペプチド;カウレンオキシダーゼ(KO)ポリペプチド;カウレンシンターゼ(KS)ポリペプチド;ステビオールシンターゼ(KAH)ポリペプチド;シトクロムP450レダクターゼ(CPR)ポリペプチド;UGT85C2ポリペプチド;UGT74G1ポリペプチド;UGT76G1ポリペプチド;UGT91d2ポリペプチド;およびEUGT11ポリペプチドをコードする遺伝子が発現され、前記遺伝子の発現を誘導することまたは前記遺伝子を構成的に発現することを含む条件下、培地において組換え細胞を培養すること;および
(b)細胞中でレバウディオサイドD、レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、レバウディオサイドI、ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を合成すること;および任意に
(c)レバウディオサイドD、レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、レバウディオサイドI、ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を単離すること
を含む、前記方法を提供する。
配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;
配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;
配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;
配列番号26に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するUGT91d2ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号15の残基211および286において置換を有するUGT91d2eポリペプチドまたはそれらの組み合わせ、を含むUGT91d2ポリペプチド;または
配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドを使用することを含む。
配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;または配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドを使用することを含む。
配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;配列番号26に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するUGT91d2ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号15の残基211および286において置換を有するUGT91d2eポリペプチド;またはそれらの組み合わせを含むUGT91d2ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドを使用することを含む。
配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;または配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドを使用することを含む。
(a)GGPPSをコードする組換え遺伝子;
(b)ent‐コパリル二リン酸シンターゼ(CDPS)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(c)カウレンオキシダーゼ(KO)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(d)カウレンシンターゼ(KS)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(e)ステビオールシンターゼ(KAH)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(f)シトクロムP450レダクターゼ(CPR)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;および/または
(g)1または2以上のUGTポリペプチドをコードする1または2以上の組換え遺伝子;
を含み、
レバウディオサイドD、レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、またはレバウディオサイドI、ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生する、前記細胞を提供する。
配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;
配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;
配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;
配列番号26に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するUGT91d2ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号15の残基211および286において置換を有するUGT91d2eポリペプチド;またはそれらの組み合わせを含むUGT91d2ポリペプチド;または
配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドである。
配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;または配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドである。
配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;または配列番号26に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するUGT91d2ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号15の残基211および286において置換を有するUGT91d2eポリペプチド;またはそれらの組み合わせを含むUGT91d2ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドである。
配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;または配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドである。
配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;または配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドである。
(a)配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;配列番号26に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するUGT91d2ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号15の残基211および286において置換を有するUGT91d2eポリペプチドまたはそれらの組み合わせを含むUGT91d2ポリペプチド;配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチド、および植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類の1または2以上を反応混合物に添加すること;および
(b)反応混合物中でレバウディオサイドDまたはレバウディオサイドMを合成すること;および任意に
(c)反応混合物中でレバウディオサイドDまたはレバウディオサイドMを単離すること
を含む、前記方法を提供する。
(a)配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド、および植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類の1または2以上を反応混合物に添加すること;および
(b)反応混合物中でレバウディオサイドQを合成すること;および任意に
(c)反応混合物中でレバウディオサイドQを単離すること
を含む、前記方法を提供する。
(a)配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;配列番号26に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するUGT91d2ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号15の残基211および286において置換を有するUGT91d2eポリペプチド;またはそれらの組み合わせを含むUGT91d2ポリペプチド、および植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類の1または2以上を反応混合物に添加すること;および
(b)反応混合物中でレバウディオサイドIを合成すること;および任意に
(c)反応混合物中でレバウディオサイドIを単離すること
を含む、前記方法を提供する。
(a)配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチド、および植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類の1または2以上を反応混合物に添加すること;および
(b)反応混合物中でジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を合成すること;および任意に
(c)反応混合物中でジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を単離すること
を含む、前記方法を提供する。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチド、および植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類の1または2以上を反応混合物に添加すること;および
(b)反応混合物中でトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を合成すること;および任意に
(c)反応混合物中でトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を単離すること
を含む、前記方法を提供する。
本明細書で挙げたすべての文献、特許、申請特許は、あらゆる目的のために参照により本明細書に明白に組み込むものである。
A.ステビオール生合成ポリペプチド
ステビオールを産生する生化学経路では、前駆体であるゲラニルゲラニル二リン酸(GGDPSにより触媒される)の生成、(‐)コパリル二リン酸(CDPSにより触媒される)への環化、その後(‐)‐カウレン(KSにより触媒される)の生成、その後(KOにより触媒される)酸化、および(KAHにより触媒される)ヒドロキシル化により、ステビオールを生成する。図4参照。従って、組換え微生物におけるゲラニルゲラニル二リン酸のステビオールへの変換は、カウレンシンターゼ(KS)をコードする遺伝子、カウレンオキシダーゼ(KO)をコードする遺伝子、およびステビオールシンセターゼ(KAH)をコードする遺伝子の発現を含む。ステビオールシンセターゼは、カウレン酸13‐ヒドロキシラーゼとしても知られている。
ステビオールをステビオールグリコシドに変換することが可能な組換え宿主細胞が、本明細書に記載される。そのような宿主(例えば、微生物)は、UGTとしても知られるUDPグリコシルトランスフェラーゼの1または2以上をコードする遺伝子を含有する。UGTは、活性化糖ヌクレオチドのモノサッカライドユニットを、受容部分、この場合には、ステビオールまたはステビオール誘導体の-OHまたは-COOH部分またはステビオール骨格に既に付加したグルコースの-OH部分へ転移する。UGTは、配列相同性に基づいて、ファミリーおよびサブファミリーに分類されている。Li et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:4338-4343参照。
ルブソシド生合成ポリペプチド
レバウディオサイドAの生合成には、アグリコンステビオールのグルコシル化が含まれる。具体的には、レバウディオサイドAは、13‐O‐ステビオールモノシドを生成するステビオールの13‐OHのグルコシル化、ステビオール‐1,2‐ビオシドを生成するステビオールモノシドの13‐O‐グルコースのC‐2’のグルコシル化、ステビオシドを生成するステビオール‐1,2‐ビオシドのC‐19カルボキシルのグルコシル化、およびRebAを産生するステビオシドのC‐13‐O‐グルコースのC‐3’のグルコシル化により生成可能である。各グルコシル化反応が起こる順番は、様々であり得る。図1参照。
本明細書で提供されるように、組換え宿主におけるステビオールのレバウディオサイドMへの変換は、以下の機能性UGT:91D2、EUGT11、74G1、85C2、および76G1の組み合わせを発現することにより達成可能である。図1参照。多数のプラスミドのコピーを使用して、または強力なプロモーター、または複数の組み込まれた遺伝子のコピー、または多数の遺伝子コピーであるように選択したエピソームを使用して、EUGT11を高いレベルで発現することが特に有用である。従って、これらのUGTの組み合わせを発現する組換え微生物が、レバウディオサイドA(85C2;76G1;74G1;91D2e)、レバウディオサイドD(85C2;76G1;74G1;91D2e;EUGT11)、レバウディオサイドE(85C2;74G1;91D2e;EUGT11)、またはレバウディオサイドM(85C2;76G1;74G1;91D2e;EUGT11)を作ることが可能である。図1参照。一般に、1または2以上のこれらの遺伝子は、天然にそれらを有さない微生物に形質転換される組換え遺伝子である。また、本明細書でSM12UGTと命名されたUGTは、UGT91D2の代わりに使用可能であることが発見された。
発現によりステビオールまたはステビオールグリコシドのより効率的またはより大規模な産生を促進する追加のポリペプチドのための遺伝子も、組換え宿主に導入することが可能である。例えば、組換え微生物、植物、または植物細胞は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ(GGPPS,またGGDPSとも呼ぶ)をコードする遺伝子を1または2以上含有することが可能である。他の例として、組換え宿主は、ラムノースシンセターゼをコードする1または2以上の遺伝子またはUDPグルコースデヒドロゲナーゼおよび/またはUDPグルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする1または2以上の遺伝子を含有することが可能である。他の例として、組換え宿主は、シトクロムP450レダクターゼ(CPR)をコードする1または2以上の遺伝子も含有することが可能である。組換えCPRの発現は、NADP+のサイクルを促進し、テルペノイド生合成の補助因子として利用されるNADPHを再生する。他の方法を使用して、NADHPレベルを再生することも可能である。NADPHが律速となる状況では、例えば、株を外来性トランスヒドロゲナーゼ遺伝子を含むように更に改変することが可能である。例えば、Sauer et al., 2004, J. Biol. Chem. 279: 6613-6619参照。所望の補助因子レベルが増加するように、NADH/NADPHの比を減少あるいは改変するための他の方法は当業者には公知である。
他の例として、組換え宿主は、MEP経路またはメバロン酸経路における1または2以上の酵素をコードする1または2以上の遺伝子を含有することが可能である。そのような遺伝子は、炭素のジテルペン生合成経路へのフラックスを増加することが可能であるので有用であり、上記経路で産生されたイソペンテニル二リン酸およびジメチルアリル二リン酸からゲラニルゲラニル二リン酸を産生する。そのように産生されたゲラニルゲラニル二リン酸を、ステビオール生合成ポリペプチドおよびステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの発現によるステビオールおよびステビオールグリコシド生合成へ誘導することが可能である。例えば、Brandle et al., 2007, Phytochemistry 68:1855-1863参照。
S.セレビシエは、イソプレノイド合成のための機能性メバロン酸経路の酵素をコードする内在性遺伝子を含有する。いくつかの実施態様では、組換え宿主も、メバロン酸経路に関与する酵素をコードする1または2以上の異種遺伝子を含有する。宿主の形質転換に好適な遺伝子は、切断型3‐ヒドロキシ‐3‐メチル‐グルタリル(HMG)‐CoAレダクターゼ(tHMG)などのメバロン酸経路における酵素をコードし、および/またはメバロン酸キナーゼ(MK)をコードする遺伝子、および/またはホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)をコードする遺伝子、および/またはメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ(MPPD)をコードする遺伝子などである。従って、HMG‐CoAレダクターゼ遺伝子、MK遺伝子、PMK遺伝子、および/またはMPPD遺伝子の1または2以上を、微生物などの組換え宿主に組み込むことが可能である。
スクロースシンターゼ(SUS)は、UDP糖類、特にUDPグルコースを産生するためのツールとして使用可能である。SUS(EC2.4.1.13)は、スクロースおよびUDPからUDPグルコースおよびフルクトースの生成を触媒する。
内在性のERG9遺伝子の発現を、核酸構築物を使用して本明細書に記載される組換え宿主中で変化させることが可能である。構築物は、それぞれERG9プロモーターまたはERG9読み取り枠(ORF)の5’末端内のゲノム配列の一部と相同である2つの領域を含むことができる。構築物としては、更に、野生型ScKex2または野生型ScCyc1のどちらかのプロモーターを含むことができ、プロモーターは、3’末端にヘアピンなどの異種挿入断片を含むことができる。ORFによりコードされているポリペプチドは、スクアレンシンターゼ(EC2.5.1.21)または、このスクアレンシンターゼと少なくとも100個のアミノ酸が重複する範囲で少なくとも70%の配列同一性を有する生物学的に活性な断片と、少なくとも70%の同一性を有しており有利である。例えば、第PCT/US2012/050021号(すべての目的で、その全開示を本明細書に組み込む)参照。
‐X1‐X2‐X3‐X4‐X5
を有し、ここで、
上述のポリペプチドの機能的ホモログも、組換え宿主においてステビオールまたはステビオールグリコシド類を産生するための使用に好適である。機能的ホモログは、参照ポリペプチドに対して配列類似性を有し、参照ポリペプチドの生化学的または生理学的機能の1または2以上を実行するポリペプチドである。機能的ホモログおよび参照ポリペプチドは、天然にあるポリペプチドであってもよく、配列類似性は、収束または分岐進化現象であってもよい。従って、機能的ホモログは、文献ではホモログ、またはオルソログ、またはパラログとも命名されることもある。野生型コード配列の変異体によりコードされているポリペプチドなどの天然に存在する機能的ホモログのバリアントそれ自体が機能的ホモログであることができる。機能的ホモログは、ポリペプチドのコード配列の部位特異的突然変異誘導により、または異なる天然に存在するポリペプチドのコード配列からのドメインを組み合わせることにより(「ドメインスワッピング」)生成することも可能である。本明細書に記載される機能性UGTポリペプチドをコードする遺伝子を改変する技術は公知であり、特に定向進化技術、部位特異的突然変異誘導技術およびランダム突然変異誘導技術などが挙げられ、ポリペプチドの特定の活性を増加させること、基質特異性を変化させること、発現レベルを変化させること、細胞内位置を変化させること、または所望されるようにポリペプチド:ポリペプチド相互作用を改変することに有用であろう。そのような改変されポリペプチドは、機能的ホモログとみなされる。「機能的ホモログ」という用語は、機能的に類似のポリペプチドをコードする核酸に使用されることもある。
本明細書に記載されるポリペプチドコードする組換え遺伝子は、ポリペプチドを発現するのに好適な1または2以上の調節領域とセンス方向に機能的に連結したそのポリペプチドのコード配列を含む。多くの微生物は、ポリシストロン性mRNAから複数の遺伝子産物を発現することが可能であるため、所望ならばこれらの微生物の単一の調節領域の制御下で複数のポリペプチドを発現することが可能である。調節領域がコード配列の転写または翻訳を調節するのに効果的であるように調節領域およびコード配列が配置されているとき、コード配列および調節領域は機能的に連結しているとみなされる。一般に、コード配列の翻訳読み枠の翻訳開始サイトは、モノシストロン性遺伝子の調節領域から1個〜約50個のヌクレオチドの下流に配置される。
微生物
組換え宿主を、ステビオールグリコシド類の産生のためのポリペプチドを発現するために使用することが可能であり、例えば哺乳類、昆虫および植物細胞などが挙げられる。多くの原核生物および真核生物も、本明細書に記載される組換え微生物の構築における使用に好適であり、例えばグラム陰性細菌、酵母および真菌類などが挙げられる。ステビオールまたはステビオールグリコシド産生株としての使用のために選択された種および株は、まず、どの産生遺伝子が株に内在性であり、どの遺伝子が存在しないかを決定するために分析する。株に内在性のカウンターパートが存在しない遺伝子を1または2以上の組換え構築物中に構築し、その後、欠落した機能を提供するために株に形質転換する。
サッカロマイセス・セレビシエは、合成生物学において広く使用されているシャーシ生物体であり、組換え微生物プラットフォームとして使用可能である。S.セレビシエに関する変異体のライブラリー、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデルおよび他の情報があり、産生物収量を高めるための様々なモジュールの合理的設計を可能としている。組換え微生物を作る方法は公知である。
A.オリゼ、A.ニガーおよびA.ソーヤなどのアスペルギルス属種は、食物産生において広く使用される微生物であり、組換え微生物プラットフォームとしても使用可能である。A.ニジュランス、A.フミガタス、A.オリゼ、A.クラバタス、A.フラバス、A.ニガー、およびA.テレウスのゲノムのヌクレオチド配列は入手可能であり、フラックスを高め、産生物収量を増やすための内在性経路の合理的設計および改変を可能としている。アスペルギルス属の代謝モデルは開発されており、トランスクリプトームの研究およびプロテオミクスの研究も行われている。A.ニガーは、クエン酸およびグルコン酸などの多くの食品成分の工業的生産のために培養されており、従ってA.ニガーなどの種はステビオールおよびステビオールグリコシド類などの食品成分の産生に一般的に好適である。
合成生物学において広く使用されている他のプラットフォーム生物体である大腸菌も、組換え微生物プラットフォームとして使用することが可能である。サッカロミケス属と同様に、大腸菌に関する変異体のライブラリー、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデルおよび他の情報があり、産生物収量を高めるための様々なモジュールの合理的設計を可能としている。組換え大腸菌微生物を作るために、サッカロミケス属に関して述べたと同様の方法を使用することが可能である。
アガリクス属、ジベレラ属およびファネロカエテ属は、培養物中で大量のジベレリンを産生することが公知であるので、有用であり得る。従って、大量のステビオールおよびステビオールグリコシド類を産生するテルペン前駆体は、内在性の遺伝子により既に産生されている。従って、ステビオールまたはステビオールグリコシド生合成ポリペプチドのための組換え遺伝子を含有するモジュールを、メバロン酸またはMEP経路遺伝子を導入することを要さずにそれらの属の種に導入することが可能である。
アークスラ・アデニニボランスは、独特な生化学的特性を有する二形成の酵母である(温度42℃まではパン酵母のように出芽酵母として増殖し、この閾値以上では糸状に増殖する)。広範囲の基質で増殖可能であり、硝酸を同化することが可能である。天然プラスチックを産生する株の生成や、環境サンプル中のエストロゲンのバイオセンサー開発への応用に成功している。
ヤロウイア・リポリティカは、広範囲の基質で増殖可能な二形成の酵母である(アークスラ・アデニニボランス参照)。産業的応用への可能性は高いが、商業的に利用可能な組換え産生物は今のところない。
ロドバクター属は、組換え微生物プラットフォームとして使用可能である。大腸菌と同様にして、プラスミドベクターとして利用可能で好適な変異体のライブラリーがあり、産生物収量を高めるための様々なモジュールの合理的設計を可能としている。カロテノイドおよびCoQ10の産生増加のために、ロドバクターの膜状細菌種において、イソプレノイド経路が設計されている。米国特許公報第20050003474号および第20040078846号参照。大腸菌に関して述べた方法と同様の方法を使用して組換えロドバクター微生物を作成可能である。
カンジダ・ボイジニイは、メチロトローフ酵母である(メタノールで増殖可能である)。ハンセヌラ・ポリモルファおよびピキア・パストリスなどの他のメチロトローフ種のように、異種タンパク質の産生に優れたプラットフォームを提供する。数グラムの範囲の収量の外来タンパク質が分泌されたことが報告されている。コンピューター法の一つであるIPROは、最近、カンジダ・ボイジニイキシロースレダクターゼの補助因子特異性をNADPHからNADHへ実験的に変換する変異を予測した。
ハンセヌラ・ポリモルファは、もう1つのメチロトローフ酵母である(カンジダ・ボイジニイ参照)。更に、広範囲の他の基質でも増殖可能であり、熱耐性があり、硝酸を同化することが可能である(クルイベロミセス・ラクチス参照)。B型肝炎ワクチン、インスリンおよびC型肝炎の処置用インターフェロンα‐2a、更に多様な産業用酵素の生産に応用されている。
クルイベロミセス・ラクチスは、一般に、ケフィアの生産に応用されている酵母である。数種類の糖類で、最も大切なことには牛乳やホエーに存在するラクトースで増殖可能である。特に、チーズの生産のためのキモシン(子牛の胃に通常存在する酵素)の生産への応用に成功している。生産は、40,000Lの規模の発酵槽で行われる。
ピキア・パストリスはメチロトローフ酵母である(カンジダ・ボイジニイおよびハンセヌラ・ポリモルファ参照)。外来タンパク質の産生のための効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォーム領域はキットで入手可能であり、学術的研究におけるタンパク質の産生に世界中で使用されている。株は、複雑なヒトN‐グリカンを産生できるように操作されている(酵母グリカンは、ヒトで見られるものと類似しているが、同一ではない)。
フィスコミトレラ・モスセスは、培養懸濁液で増殖すると、酵母または他の真菌培養物と類似の特性を有する。この属は、他のタイプの細胞では産生が困難である植物二次代謝物の産生用細胞タイプとして重要になりつつある。
本明細書に記載される組換え宿主を、レバウディオサイドMなどのステビオールグリコシド類を産生する方法に使用することが可能である。例えば、組換え宿主が微生物である場合、方法には、ステビオールおよび/またはステビオールグリコシド生合成遺伝子が発現される条件下で培地において組換え微生物を増殖することが含まれる。組換え微生物は、供給バッチまたは連続プロセスにおいて増殖可能である。一般に、組換え微生物は、所望の期間、所定の温度で発酵槽中で増殖される。ある実施態様では、微生物としては、限定することなくS.セレビシエ、A.ニガー、A.オリゼ、大腸菌、L.ラクチスおよびB.スブチリスなどが挙げられる。本発明で提供される、構築・遺伝子改変微生物は、従来の発酵プロセスを使用して培養可能であり、特に、ケモスタット、バッチ式、流加培養、連続灌流発酵、および連続灌流細胞培養などが挙げられる。
本明細書で開示される方法により得られたステビオールグリコシド類は、食品および飲料製品、健康補助食品および甘味料組成物を作るために使用可能である。例えば、レバウディオサイドMなどの実質的に純粋なステビオールグリコシドを、アイスクリーム、炭酸飲料、フルーツジュース、ヨーグルト、ベイカリー製品、チューイングガム、ハードおよびソフトキャンディー、およびソース類などの食品に含有させることが可能である。実質的に純粋なステビオールグリコシドは、医薬品、医療用品、健康補助食品および栄養補助食品などの非食品に含有させることも可能である。実質的に純粋なステビオールグリコシド類は、農業用およびペット動物用両方の動物用飼料製品に含有させることも可能である。あるいは、ステビオールグリコシド類の混合物は、特定のステビオールまたはステビオールグリコシドを産生する、組換え微生物を別々に培養すること、または異なる植物/植物細胞を増殖すること、各微生物または植物/植物細胞から実質的に純粋な形態でステビオールまたはステビオールグリコシドを回収すること、その後各化合物を所望の割合で含有する混合物を得るために化合物(例えば、レバウディオサイドMと1または2以上の他のステビオールグリコシド類)を混合することにより作ることが可能である。本明細書に記載される組換え微生物、植物および植物細胞は、現行のステビア属産生物と比較して、より正確で均一な混合物を得ることを可能とする。他の方法では、実質的に純粋なステビオールグリコシドは、例えばサッカリン、デキストロース、スクロース、フルクトース、エリスリトール、アスパルテーム、スクラロース、モナチン、またはアセスルファムカリウムなどの他の甘味料と一緒に、食品に組み込むことが可能である。他の甘味料に対するステビオールグリコシドの重量比は、最終食品の良好な味を達成するために所望ならば変化させることが可能である。例えば、米国特許公報第2007/0128311号参照。いくつかの実施態様では、ステビオールグリコシドには、風味調節剤として風味(例えば、柑橘系)を付与することが可能である。
以下の例は、本発明の具体的な実施態様およびその様々な使用の例示である。それらは、単に説明の目的であり、本発明を限定することを意図するものではない。
EFSC3044酵母株は、3つの栄養要求性改変、すなわちURA3、LEU2およびHIS3を欠失する野生型サッカロマイセス・セレビシエ株から誘導した。株は、標準的な遺伝子方法を用いて操作可能であり、通常の二倍体または一倍体酵母株として使用可能である。株を、5個のDNA構築物のゲノム組込みによりステビオールグリコシド類産生酵母に変換した。各構築物は複数の遺伝子を含有し、相同組換えにより酵母ゲノム中へ導入した。更に、第1、第2、および第5構築物を、酵母における相同組換えにより組み立てた。
例1で述べたように、EUGT11がステビオールグリコシドを産生する酵母株において高いレベルで発現されたとき、ヘキサグルコシルステビオールグリコシドが観察された。この分子を産生している反応をキャラクタライズするために、個々のUGTを使用してin vitroの研究をさらに行った。
ヘキサグルコシルステビオールグリコシド産生物が、例1に記載と類似の発酵から単離され、図6に概要を示すスキームに従った構造解析を行った。
NMR用の純粋なサンプルを産生するために、例3で得た約50mgのヘキサグリコシル化の濃度が高い残渣を、セミ分取HPLCシステムで更に精製した。システムには、Aqua(登録商標)C18カラム(Phenomenex:寸法250x21.2mm、5ミクロン)を設けた。溶出は、移動相として溶離剤B(0.1%トリフルオロ酢酸含有MeCN)および溶離剤A(0.1%トリフルオロ酢酸含有水)を使用し、勾配を0.0分から21分で1%から50%Bへ、21.0分から27.0分で50%から100%分へ、そして最終的に100%Bを流し、再平衡化することで行った。流速は、室温で14mL/minであった。画分を時間毎に収集し、LC‐QTOF‐MSでステビオールグリコシド類が存在するかどうか分析した。システムは、MicrOTOFII質量分析計(Bruker)を連結したUPLC(Waters)を使用した。カラムは、AcquityUPLC(登録商標)BEHC18、100x2.1mm、1.7μm(Waters)を使用した。移動相は、A:0.1%ギ酸水溶液およびB:0.1%ギ酸アセトニトリル溶液であった。適用した勾配は、12分で1%Bから50%B、その後3分で100%Bに増加した。流速は、0.4mL/minであった。
RebM以外に、EFSC3044の発酵により、保持時間2.31でジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)(図8B)および保持時間2.15でトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)(図8C)が生成した。
例1で使用した野生型サッカロミケス属株を、ステビオールグリコシド産生に関与する表14の異種遺伝子を含有するように操作した。遺伝子はすべて、例1に記載したのと同様の方法を使用して宿主株の染色体に組み込んだ。
例1で使用したものと同じ野生型サッカロミケス属株を、ステビオールグリコシド産生に関与する表15の異種遺伝子を含有するように操作した。例1に記載のものと同様の方法で、すべての遺伝子は宿主株の染色体に組み込んだ。遺伝子は例1のものと同一であったが、ステビオール経路におけるボトルネックである酵素のコピー数が増加したことによりRebDおよびRebMの産生が増加した。株3297の発酵は、上記の3261株と同様な方法で行った。
例1で使用したものと同じ野生型サッカロミケス属株を、ステビオールグリコシド産生に関与する表16の異種遺伝子を含有するように操作した。例1に記載のものと同様の方法を使用して、すべての遺伝子は宿主株の染色体に組み込んだ。3841の発酵条件は、上記の3261株と同様であった。
EFSC3643と命名された、上述のEFSC3841株の栄養要求性(leu2、ura3)バージョンを、野生型76G1UGT遺伝子の1つを欠損するように更に改変した。1つのUGT76G1のコピーを含有する3つのコロニーの性能を、2つのUGT76G1のコピーを含有する非改変株の4つのコロニーに対して検討した。PCRを使用して、新たな株が1つの76G1のコピーだけを持つことを確かめた。簡単に述べると、1つのUGT76G1のコピーの破壊が、破壊用組込みカセット部分の挿入部位の上流領域と組込みカセット部分の挿入部位の下流領域を増幅する2つのPCR反応により検証された。野生型76G1用に設計されたPCRプライマーにより、野生型76G1が依然変化しておらず株に存在することが確認された。コロニーを、96ディープウェルプレート中30℃、400RPMで96時間増殖した。RebDおよびRebMの総量を、LC/MS分析により求めた。
WT‐76G1を含有するp416GPDを、SC‐ura培地中プロテアーゼ欠損酵母株DSY6で48時間発現した。100μLの細胞を、3mLのSC‐ura培地に16時間再播種した。細胞を、200μLのCelLytic(商標)Yで使用説明書に従って溶解した。6μLの可溶化液を、20mMのトリス緩衝液(pH8.0)、0.3μMのUDPG、および0.1μMのRebDまたはRebEからなる反応混合物24μLに添加した。反応を30℃でインキュベートし、0、1、2、および18時間後に30μLの反応混合物のうち25μLを25μLのDMSO中へ移すことで反応を停止した。RebD、RebEおよびRebMの量をLC‐MSで分析し、「曲線下面積」としてデータ処理の間のピーク積分により評価した。
RebMまたはRebDに対する活性および位置選択性を増加したUGT76G1バリアントを同定する手段として、相同性モデリングおよびドッキング試験を行った。3つの相同性モデルを、テンプレートとして以下のPDBファイル2PQ6(%ID=31)、2C1X(%ID=28)、3HBF(%ID=28)、2VCE(%ID=35)を組み合わせてSybylXプログラムにおいて標準的な設定を使用して作成した。PDB2VCEに存在するリガンドを、主鎖および側鎖の作成の間使用し、エネルギー極小化の前に除去した。最も質の高い構造を得るために、標準設定または0.1kJの閾値、カットオフ半径10オングストロームおよび最大反復数5000回の勾配終結のどちらかでのAMBERFF99フォースフィールドを使用してモデルをエネルギー極小化した。モデルの統計を表17に示し、モデル間の変動を図14に示した。
本明細書に記載されるUGT76G1部位飽和変異ライブラリースクリーニングを行う前に、RebMおよびRebDの培養増殖および産生を96および4x24ディープウェルプレート中でモニターした。標準的な酢酸リチウムプロトコールを使用して、EFSC3385株を、WT‐76G1を含有するp416GPDで形質転換し、形質転換細胞を、SC‐URAプレートに播種した。EFSC3385は、UGT76G1を欠損した株であり、従って活性なUGT76G1を含有するプラスミドで形質転換されるまでRebEを作成するであろう。株は、spHIS5マーカーで置換されたUGT76G1コード領域の破壊を含有し、UGT91D2e‐2X変異体、UGT74G1、ATR2、UGT85C2、S.レバウディアナCPR8(2コピー)、A.タリアナKS5(2コピー)、シネココッカスGGPPS7、コドン最適化S.レバウディアナKAHe1(2コピー)、S.レバウディアナKO(2コピー)、切断型ゼア・メイズCDPS5(2コピー)、およびEUGT11のコピーも組み込まれている。
Baseclear社により、SpeIおよびXhoI制限部位を使用してUGT76G1を、EPSC2060(p423GPD)からEPSB492(p416GPD)へサブクローン化し、縮重NNSプライマーを使用して部位飽和変異ライブラリーを作成した。標準的な酢酸リチウムプロトコールを使用して、EFSC3385株をライブラリーまたはWT‐76G1を含有する対照プラスミドで形質転換し、形質転換細胞をSC‐URAプレートに播種した。
RebDまたはRebMAのどちらかを最大量産生するUGT76G1バリアントコロニーの47個の再スクリーニングを三つずつで行ったところ、最初のスクリーニングと同じ傾向を示した(図19)。配列を決定するコロニーを、スクリーニングおよび再スクリーニングの結果を集計して選択した。スクリーニングおよび再スクリーニングの産生レベルを直接比較できなかったので、コロニーを、RebDおよびRebMのそれぞれの最高産生コロニーから最低産生コロニーへとランク付けし、スクリーニングおよび再スクリーニングのランクの平均を求めた。平均から、上位16個のRebD、上位16個のRebM、および上位16個のRebD/M産生コロニー(合計48個のコロニー)を特定した。上位RebDおよび上位RebD/M産生コロニーのいくつかは同一のコロニーであったので、重複するコロニーは一度だけ数え、配列決定するコロニーの合計を48個のとするために追加のコロニーを選んだ。これらのコロニーは、以下に示すGPD配列_fwdおよびCYC1配列_revプライマーで2つずつ配列決定した。
UGT76G1は、1,2‐ステビオシドの1,3‐グリコシル化を触媒して、RebAに変換し、1,2‐ビオシドをRebBに変換することだけが文献より公知である。本発明者等は、表26に示す反応がUGT76G1により触媒されることを新たに発見した。
各ステビオールグリコシドの定量用標準品は、市販されていないため、いくつかの濃度測定は不可能であった。従って、野生型酵素と比較した酵素バリアントによる追加のステビオールグリコシド類の産生は、データ処理の間のピーク積分により評価した。各バリアントの曲線下面積のデータを野生型UGT76G1に対して標準化し、表27に示した。これらのデータは、先の例と一致したが、バリアントのいくつかは、野生型対照が産生した1,3‐ステビオシド(RebG)、ルブソシド、「RebQ」、および/または1.43分に溶出するステビオール‐テトラグリコシドを産生しなかったことも示した。RebMおよびRebD産生の増加は、この観察により説明可能である。
参考文献
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6.Madhav et al., 'Functional and structural variation of uridine diphosphate glycosyltransferase (UGT) gene of Stevia rebaudianaeUGTSr involved in the synthesis of rebaudioside A' Plant Physiology and Biochemistry 63 (2013) 245e253.
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Claims (117)
- 約1%〜約99%w/wのレバウディオサイドMを含む組成物であって、ステビア抽出物に対してステビア由来混入物のレベルが減少した、前記組成物。
- 少なくとも1つの混入物が、異臭に寄与する植物由来の化合物である、請求項1に記載の組成物。
- ステビア抽出物に対して0.1%未満のステビア由来混入物を有する、請求項1に記載の組成物。
- 少なくとも1つの混入物が、異臭に寄与する植物由来の化合物である、請求項3に記載の組成物。
- 請求項1に記載の組成物を含む食品。
- 食品が飲料または飲料濃縮物である、請求項5に記載の食品。
- 組換え宿主細胞であって、
(a)GGPPSをコードする組換え遺伝子;
(b)ent‐コパリル二リン酸シンターゼ(CDPS)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(c)カウレンオキシダーゼ(KO)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(d)カウレンシンターゼ(KS)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(e)ステビオールシンターゼ(KAH)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(f)シトクロムP450レダクターゼ(CPR)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(g)UGT85C2ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(h)UGT74G1ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(i)UGT76G1ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(j)UGT91d2ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;および
(k)EUGT11ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
を発現し、
少なくとも1つの前記遺伝子が組換え遺伝子であり、レバウディオサイドD、レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、および/またはレバウディオサイドIを産生する、前記細胞。 - 組換え宿主細胞であって、
(a)GGPPSをコードする組換え遺伝子;
(b)ent‐コパリル二リン酸シンターゼ(CDPS)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(c)カウレンオキシダーゼ(KO)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(d)カウレンシンターゼ(KS)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(e)ステビオールシンターゼ(KAH)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(f)シトクロムP450レダクターゼ(CPR)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(g)UGT85C2ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(h)UGT74G1ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(i)UGT76G1ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(j)UGT91d2ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;および
(k)EUGT11ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
を含む外来性核酸を含み、
レバウディオサイドD、レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、および/またはレバウディオサイドIを産生する、前記細胞。 - 組換え宿主細胞であって、GGPPS、ent‐コパリル二リン酸シンターゼ(CDPS)ポリペプチド、カウレンオキシダーゼ(KO)ポリペプチド、カウレンシンターゼ(KS)ポリペプチド;ステビオールシンターゼ(KAH)ポリペプチド、シトクロムP450レダクターゼ(CPR)ポリペプチド、UGT74G1ポリペプチド、UGT76G1ポリペプチド、UGT91d2ポリペプチド、およびEUGT11ポリペプチドを発現し、少なくとも1つの前記ポリペプチドが前記細胞に導入された外来性または異種遺伝子によりコードされ、
ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生する、前記細胞。 - GGPPSが、配列番号24に記載のシネココッカス属GGPPSを含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の細胞。
- CDPポリペプチドが、葉緑体トランジットペプチドを欠いている、配列番号13に記載のZ.メイズCDPSポリペプチドを含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の細胞。
- KOポリペプチドが、配列番号25に記載のS.レバウディアナKOポリペプチドのアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するKOポリペプチドを含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の細胞。
- KSポリペプチドが、配列番号21に記載のA.タリアナKSポリペプチドのアミノ酸配列と40%以上の同一性を有するKSポリペプチドを含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の細胞。
- KAHポリペプチドが、配列番号11に記載のS.レバウディアナKAHアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するKAHポリペプチドを含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の細胞。
- CPRポリペプチドが、配列番号4に記載のS.レバウディアナCPRアミノ酸配列と65%以上の同一性を有するCPRポリペプチド、配列番号9に記載のアミノ酸配列のA.タリアナCPRポリペプチド;またはそれらの組み合わせを含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の細胞。
- UGT85C2ポリペプチドが、配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含む、請求項7または8に記載の細胞。
- UGT74G1ポリペプチドが、配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の細胞。
- UGT76G1ポリペプチドが、配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の細胞。
- UGT91d2ポリペプチドが、配列番号15または86に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するUGT91d2ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号15の残基211および286において置換を有するUGT91d2eポリペプチド;またはそれらの組み合わせを含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の細胞。
- EUGT11ポリペプチドが、配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の細胞。
- UGT76G1ポリペプチドが、配列番号2のT55K、T55E、S56A、Y128S、Y128E、H155L、H155R、Q198R、S285R、S285T、S253W、S253G、T284R、T284G、S285G、K337E、K337PおよびL379Vを含むUGT76G1ポリペプチドバリアントの1または2以上を含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の細胞。
- UGT76G1ポリペプチドが、配列番号2のQ23G、Q23H、I26F、I26W、T146A、T146G、T146P、H155R、L257P、L257W、L257T、L257G、L257A、L257R、L257E、S283GおよびS283Nを含むUGT76G1ポリペプチドバリアントの1または2以上を含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の細胞。
- 組換え宿主細胞が、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である、請求項7〜22のいずれか一項に記載の細胞。
- 酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・グラブラタ、アシュビア・ゴシピー、サイバリンドネラ・ジャディニ、ピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクチス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、カンジダ・ボイジニイ、アークスラ・アデニニボランス、キサントフィロミセス・デンドロロウス、またはカンジダ・アルビカンス種由来の細胞である、請求項23に記載の細胞。
- 酵母細胞がサッカロミケス属である、請求項23に記載の細胞。
- 酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ種由来の細胞である、請求項25に記載の細胞。
- レバウディオサイドDを産生する、請求項7、8、10〜20または22〜26のいずれか一項に記載の細胞。
- レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、またはレバウディオサイドIを産生する、請求項7、8、10〜21または23〜26のいずれか一項に記載の細胞。
- ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生する、請求項9〜15、17〜21または23〜26のいずれか一項に記載の細胞。
- レバウディオサイドDが、約1,000mg/L〜約2,900mg/Lの間の濃度で産生される、請求項27に記載の細胞。
- レバウディオサイドDおよびレバウディオサイドMが、約1:1〜約1.7:1の間の比で産生される、請求項27に記載の細胞。
- レバウディオサイドMが、約600mg/L〜約2,800mg/Lの間の濃度で産生される、請求項28に記載の細胞。
- レバウディオサイドMおよびレバウディオサイドDが、約0.6:1〜約1.1:1の間の比で産生される、請求項28に記載の細胞。
- レバウディオサイドD、レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、レバウディオサイドI、ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生する方法であって、
(a)GGPPS;ent‐コパリル二リン酸シンターゼ(CDPS)ポリペプチド;カウレンオキシダーゼ(KO)ポリペプチド;カウレンシンターゼ(KS)ポリペプチド;ステビオールシンターゼ(KAH)ポリペプチド;シトクロムP450レダクターゼ(CPR)ポリペプチド;UGT85C2ポリペプチド;UGT74G1ポリペプチド;UGT76G1ポリペプチド;UGT91d2ポリペプチド;およびEUGT11ポリペプチドをコードする遺伝子が発現され、前記遺伝子の発現を誘導することまたは前記遺伝子を構成的に発現することを含む条件下、培地において組換え細胞を培養すること;および
(b)細胞中でレバウディオサイドD、レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、レバウディオサイドI、ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を合成すること;および任意に
(c)レバウディオサイドD、レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、レバウディオサイドI、ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を単離することを含む、前記方法。 - レバウディオサイドDが、請求項5、7〜17または19〜23のいずれか一項に記載の細胞によって産生される、請求項34に記載の方法。
- レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、またはレバウディオサイドIが、請求項5、7〜18または20〜23のいずれか一項に記載の細胞によって産生される、請求項34に記載の方法。
- ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)が、請求項6〜12、14〜18または20〜23のいずれか一項に記載の細胞によって産生される、請求項34に記載の方法。
- レバウディオサイドDが、約1,000mg/L〜約2,900mg/Lの間の濃度で産生される、請求項34に記載の方法。
- レバウディオサイドDおよびレバウディオサイドMが、約1:1〜約1.7:1の間の比で産生される、請求項34に記載の方法。
- レバウディオサイドMが、約600mg/L〜約2,800mg/Lの間の濃度で産生される、請求項34に記載の方法。
- レバウディオサイドMおよびレバウディオサイドDが、約0.6:1〜約1.1:1の間の比で産生される、請求項34に記載の方法。
- 組換え宿主細胞が、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である、請求項34〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・グラブラタ、アシュビア・ゴシピー、サイバリンドネラ・ジャディニ、ピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクチス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、カンジダ・ボイジニイ、アークスラ・アデニニボランス、キサントフィロミセス・デンドロロウス、またはカンジダ・アルビカンス種由来の細胞である、請求項42に記載の方法。
- 酵母細胞がサッカロミケス属である、請求項42に記載の方法。
- 酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ種由来の細胞である、請求項44に記載の方法。
- UGTポリペプチドの1または2以上を使用した植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類のin vitroの生物変換を含む、レバウディオサイドD、レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、レバウディオサイドI、ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生する方法。
- レバウディオサイドDまたはレバウディオサイドMを産生する方法が、配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;
配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;
配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;
配列番号15または86に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するUGT91d2ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号15の残基211および286において置換を有するUGT91d2eポリペプチド;またはそれらの組み合わせを含むUGT91d2ポリペプチド;または
配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドを使用することを含む、請求項46に記載の方法。 - レバウディオサイドDの産生に使用するステビオールグリコシドが、ステビオシド、RebA、RebB、RebE、またはその混合物を含む、請求項46に記載の方法。
- レバウディオサイドMの産生に使用するステビオールグリコシドが、ステビオシド、RebA、RebB、RebE、RebD、またはその混合物を含む、請求項46に記載の方法。
- レバウディオサイドQを産生する方法が、
配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;または配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドを使用することを含む、請求項46に記載の方法。 - レバウディオサイドQを産生するために使用するステビオールグリコシドが、ルブソシド、RebG、またはその混合物を含む、請求項46に記載の方法。
- レバウディオサイドIを産生する方法が、
配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;配列番号15または86に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するUGT91d2ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号15の残基211および286において置換を有するUGT91d2eポリペプチド;またはそれらの組み合わせを含むUGT91d2ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドを使用することを含む、請求項46に記載の方法。 - レバウディオサイドIを産生するために使用するステビオールグリコシドが、1,2‐ステビオシド、RebA、またはその混合物を含む、請求項46に記載の方法。
- ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生する方法が、
配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;または配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドを使用することを含む、請求項46に記載の方法。 - ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)の産生に使用するステビオールグリコシドが、ステビオール‐19‐O‐グルコシドを含む、請求項46に記載の方法。
- トリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生する方法が、
配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドを使用することを含む、請求項46に記載の方法。 - トリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)の産生に使用するステビオールグリコシドが、ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)、ステビオール‐19‐O‐グルコシド、またはその混合物を含む、請求項46に記載の方法。
- 生物変換が、酵素生物変換または全細胞生物変換を含む、請求項46〜57のいずれか一項に記載の方法。
- 全細胞生物変換の細胞が、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である、請求項58に記載の方法。
- 酵母細胞が、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・グラブラタ、アシュビア・ゴシピー、サイバリンドネラ・ジャディニ、ピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクチス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、カンジダ・ボイジニイ、アークスラ・アデニニボランス、キサントフィロミセス・デンドロロウス、またはカンジダ・アルビカンス種由来の細胞である、請求項59に記載の方法。
- 酵母細胞がサッカロミケス属である、請求項59に記載の方法。
- 酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ種由来の細胞である、請求項61に記載の方法。
- 組換え宿主細胞であって、
(a)GGPPSをコードする組換え遺伝子;
(b)ent‐コパリル二リン酸シンターゼ(CDPS)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(c)カウレンオキシダーゼ(KO)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(d)カウレンシンターゼ(KS)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(e)ステビオールシンターゼ(KAH)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;
(f)シトクロムP450レダクターゼ(CPR)ポリペプチドをコードする組換え遺伝子;および/または
(g)1または2以上のUGTポリペプチドをコードする1または2以上の組換え遺伝子;
を含む外来性核酸を含み、
レバウディオサイドD、レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、またはレバウディオサイドI、ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生する、前記細胞。 - GGPPSが、配列番号24に記載のシネココッカス属GGPPSを含み;CDPポリペプチドが、葉緑体トランジットペプチドを欠いている、配列番号13に記載のZ.メイズCDPSポリペプチドを含み;KOポリペプチドが、配列番号25に記載のS.レバウディアナKOポリペプチドのアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するKOポリペプチドを含み;KSポリペプチドが、配列番号21に記載のA.タリアナKSポリペプチドのアミノ酸配列と40%以上の同一性を有するKSポリペプチドを含み;KAHポリペプチドが、配列番号11に記載のS.レバウディアナKAHアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するKAHポリペプチドを含み;CPRポリペプチドが、配列番号4に記載のS.レバウディアナCPRアミノ酸配列と65%以上の同一性を有するCPRポリペプチド、配列番号9に記載のアミノ酸配列のA.タリアナCPRポリペプチド;またはそれらの組み合わせを含む、請求項63に記載の組換え細胞。
- 細胞がレバウディオサイドDまたはレバウディオサイドMを産生し、UGTポリペプチドが、
配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;
配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;
配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;
配列番号15または86に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するUGT91d2ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号15の残基211および286において置換を有するUGT91d2eポリペプチド;またはそれらの組み合わせを含むUGT91d2ポリペプチド;または
配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドである、請求項63に記載の細胞。 - 細胞がレバウディオサイドQを産生し、UGTポリペプチドが、
配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;または配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドである、請求項63に記載の細胞。 - 細胞がレバウディオサイドIを産生し、UGTポリペプチドが、
配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;または配列番号15または86に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するUGT91d2ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号15の残基211および286において置換を有するUGT91d2eポリペプチド;またはそれらの組み合わせを含むUGT91d2ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドである、請求項63に記載の細胞。 - 細胞がジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生し、UGTポリペプチドが、
配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;または配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドである、請求項63に記載の細胞。 - 細胞がトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生し、UGTポリペプチドが、
配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;または配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチドである、少なくとも1つのUGTポリペプチドである、請求項63に記載の細胞。 - UGT76G1ポリペプチドが、配列番号2のQ23G、Q23H、I26F、I26W、T146A、T146G、T146P、H155R、L257P、L257W、L257T、L257G、L257A、L257R、L257E、S283GおよびS283Nを含むUGT76G1ポリペプチドバリアントの1または2以上を含む、請求項63〜65のいずれか一項に記載の細胞。
- UGT76G1ポリペプチドが、配列番号2のT55K、T55E、S56A、Y128S、Y128E、H155L、H155R、Q198R、S285R、S285T、S253W、S253G、T284R、T284G、S285G、K337E、K337PおよびL379Vを含むUGT76G1ポリペプチドバリアントの1または2以上を含む、請求項63〜69のいずれか一項に記載の細胞。
- 組換え宿主細胞が、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である、請求項63〜71のいずれか一項に記載の細胞。
- 酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・グラブラタ、アシュビア・ゴシピー、サイバリンドネラ・ジャディニ、ピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクチス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、カンジダ・ボイジニイ、アークスラ・アデニニボランス、キサントフィロミセス・デンドロロウス、またはカンジダ・アルビカンス種由来の細胞である、請求項72に記載の細胞。
- 酵母細胞がサッカロミケス属である、請求項72に記載の細胞。
- 酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ種由来の細胞である、請求項74に記載の細胞。
- 請求項63〜65または70のいずれか一項に記載の組換え細胞を使用する発酵によりレバウディオサイドDを産生する方法。
- 請求項63〜65または71のいずれか一項に記載の組換え細胞を使用する発酵によりレバウディオサイドMを産生する方法。
- 請求項63〜64、66または71のいずれか一項に記載の組換え細胞を使用する発酵によりレバウディオサイドQを産生する方法。
- 請求項63〜64、67または71のいずれか一項に記載の組換え細胞を使用する発酵によりレバウディオサイドIを産生する方法。
- 請求項63〜64、68または71のいずれか一項に記載の組換え細胞を使用する発酵によりジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生する方法。
- 請求項63〜64、69または71のいずれか一項に記載の組換え細胞を使用する発酵によりトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生する方法。
- 組換え宿主細胞が、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である、請求項76〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・グラブラタ、アシュビア・ゴシピー、サイバリンドネラ・ジャディニ、ピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクチス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、カンジダ・ボイジニイ、アークスラ・アデニニボランス、キサントフィロミセス・デンドロロウス、またはカンジダ・アルビカンス種由来の細胞である、請求項82に記載の方法。
- 酵母細胞がサッカロミケス属である、請求項82に記載の方法
- 酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ種由来の細胞である、請求項84に記載の方法。
- レバウディオサイドDまたはレバウディオサイドMを産生するin vitroの方法であって、
(a)配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;配列番号15または86に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するUGT91d2ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号15の残基211および286において置換を有するUGT91d2eポリペプチド;またはそれらの組み合わせを含むUGT91d2ポリペプチド;配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチド、および植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類の1または2以上を反応混合物に添加すること;および
(b)反応混合物中でレバウディオサイドDまたはレバウディオサイドMを合成すること;および任意に
(c)反応混合物中でレバウディオサイドDまたはレバウディオサイドMを単離すること
を含む、前記方法。 - レバウディオサイドQを産生するin vitroの方法であって、
(a)配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド、および植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類の1または2以上を反応混合物に添加すること;および
(b)反応混合物中でレバウディオサイドQを合成すること;および任意に
(c)反応混合物中でレバウディオサイドQを単離すること
を含む、前記方法。 - レバウディオサイドIを産生するin vitroの方法であって、
(a)配列番号26に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT85C2ポリペプチドを含むUGT85C2ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;配列番号15または86に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するUGT91d2ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号15の残基211および286において置換を有するUGT91d2eポリペプチド;またはそれらの組み合わせを含むUGT91d2ポリペプチド、および植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類の1または2以上を反応混合物に添加すること;および
(b)反応混合物中でレバウディオサイドIを合成すること;および任意に
(c)反応混合物中でレバウディオサイドIを単離すること
を含む、前記方法。 - ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生するin vitroの方法であって、
(a)配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチド、および植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類の1または2以上を反応混合物に添加すること;および
(b)反応混合物中でジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を合成すること;および任意に
(c)反応混合物中でジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を単離すること
を含む、前記方法。 - トリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生するin vitroの方法であって、
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するUGT76G1ポリペプチドを含むUGT76G1ポリペプチド;配列番号19に記載のアミノ酸配列と55%以上の同一性を有するUGT74G1ポリペプチドを含むUGT74G1ポリペプチド;配列番号16に記載のOs03g0702000アミノ酸配列と65%以上の同一性を有するEUGT11ポリペプチドを含むEUGT11ポリペプチド、および植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類の1または2以上を反応混合物に添加すること;および
(b)反応混合物中でトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を合成すること;および任意に
(c)反応混合物中でトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を単離すること
を含む、前記方法。 - レバウディオサイドDを産生するUGT76G1ポリペプチドが、配列番号2のQ23G、Q23H、I26F、I26W、T146A、T146G、T146P、H155R、L257P、L257W、L257T、L257G、L257A、L257R、L257E、S283GおよびS283Nからなる群から選択されるUGT76G1ポリペプチドバリアントの1または2以上を含む、請求項86に記載の方法。
- レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、レバウディオサイドI、ジグリコシル化ステビオールグリコシド、およびトリグリコシル化ステビオールグリコシドを産生するUGT76G1ポリペプチドが、配列番号2のT55K、T55E、S56A、Y128S、Y128E、H155L、H155R、Q198R、S285R、S285T、S253W、S253G、T284R、T284G、S285G、K337E、K337PおよびL379Vからなる群から選択されるUGT76G1ポリペプチドバリアントの1または2以上を含む、請求項86〜90のいずれか一項に記載の方法。
- in vitroの方法が、酵素のin vitroの方法または全細胞のin vitroの方法である、請求項86〜92のいずれか一項に記載の方法。
- 全細胞のin vitroの方法の細胞が、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である、請求項93に記載の方法。
- 酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・グラブラタ、アシュビア・ゴシピー、サイバリンドネラ・ジャディニ、ピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクチス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、カンジダ・ボイジニイ、アークスラ・アデニニボランス、キサントフィロミセス・デンドロロウス、またはカンジダ・アルビカンス種由来の細胞である、請求項94に記載の方法。
- 酵母細胞がサッカロミケス属である、請求項94に記載の方法。
- 酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ種由来の細胞である、請求項96に記載の方法。
- 請求項34、36、42〜46、50〜51、58〜62、78、82〜85、87または92〜97のいずれか一項に記載の方法により産生されたレバウディオサイドQ。
- 請求項34、36、42〜46、52〜53、58〜62、79、82〜85、88または92〜97のいずれか一項に記載の方法により産生されたレバウディオサイドI。
- 請求項34、37、42〜46、54〜55、58〜62、80、82〜85、89または92〜97のいずれか一項に記載の方法により産生されたジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)。
- 請求項34、37、42〜46、56〜62、81〜84、90または92〜97のいずれか一項に記載の方法により産生されたトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)。
- レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、レバウディオサイドI、ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生するために使用するUGT76G1ポリペプチドであって、配列番号2のUGT76G1ポリペプチドまたは配列番号2のT55K、T55E、S56A、Y128S、Y128E、H155L、H155R、Q198R、S285R、S285T、S253W、S253G、T284R、T284G、S285G、K337E、K337PおよびL379Vを含むUGT76G1ポリペプチドバリアントの1または2以上を含む、前記ポリペプチド。
- レバウディオサイドDを産生するために使用するUGT76G1ポリペプチドであって、配列番号2のUGT76G1ポリペプチドまたは配列番号2のQ23G、Q23H、I26F、I26W、T146A、T146G、T146P、H155R、L257P、L257W、L257T、L257G、L257A、L257R、L257E、S283GおよびS283Nを含むUGT76G1ポリペプチドバリアントの1または2以上を含む、前記ポリペプチド。
- UGT76G1ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む組換え宿主細胞であって、UGT76G1ポリペプチドが、配列番号2のT55K、T55E、S56A、Y128S、Y128E、H155L、H155R、Q198R、S285R、S285T、S253W、S253G、T284R、T284G、S285G、K337E、K337PおよびL379Vを含むUGT76G1ポリペプチドバリアントの1または2以上を含む、前記細胞。
- レバウディオサイドDを産生する、請求項104に記載の細胞。
- UGT76G1ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む組換え宿主細胞であって、UGT76G1ポリペプチドが、配列番号2のQ23G、Q23H、I26F、I26W、T146A、T146G、T146P、H155R、L257P、L257W、L257T、L257G、L257A、L257R、L257E、S283GおよびS283Nを含むUGT76G1ポリペプチドバリアントの1または2以上を含む、前記細胞。
- レバウディオサイドM、レバウディオサイドQ、レバウディオサイドI、ジグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸、[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)、またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド(13‐ヒドロキシカウラ‐16‐エン‐18‐酸;[2‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐3‐O‐β‐D‐グルコピラノシル‐β‐D‐グルコピラノシル]エステル)を産生する、請求項106に記載の細胞。
- 組換え宿主細胞が、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である、請求項104〜107のいずれか一項に記載の細胞。
- 酵母細胞が、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・グラブラタ、アシュビア・ゴシピー、サイバリンドネラ・ジャディニ、ピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクチス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、カンジダ・ボイジニイ、アークスラ・アデニニボランス、キサントフィロミセス・デンドロロウス、またはカンジダ・アルビカンス種由来の細胞である、請求項108に記載の細胞。
- 酵母細胞がサッカロミケス属である、請求項108に記載の細胞。
- 酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ種由来の細胞である、請求項110に記載の細胞。
- 約1%〜約99%w/wのレバウディオサイドDを含む組成物であって、ステビア抽出物に対してステビア由来混入物のレベルが減少した、前記組成物。
- 少なくとも1つの混入物が、異臭に寄与する植物由来の化合物である、請求項112に記載の組成物。
- ステビア抽出物に対して0.1%未満のステビア由来混入物を有する、請求項112に記載の組成物。
- 少なくとも1つの混入物が、異臭に寄与する植物由来の化合物である、請求項114に記載の組成物。
- 請求項112に記載の組成物を含む食品。
- 食品が飲料または飲料濃縮物である、請求項116に記載の食品。
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