JP2016026179A - ヌクレオチド糖の改良製造法 - Google Patents
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
Abstract
【課題】ポリ(アルキレンオキシド)残基[例えば、ポリ(エチレングリコール)又はポリ(プロピレングリコール)残基]のようなポリマー修飾基で修飾された、ヌクレオチド糖の製造方法(例えば、大規模製造法)の提供。【解決手段】(i)修飾ヌクレオチド糖を含む反応混合物を陰イオン交換媒体と接触させること;(ii)該陰イオン交換媒体から該ヌクレオチド糖を溶出することにより、該修飾ヌクレオチド糖を含む溶出画分を生成すること;及び(iii)該溶出画分を脱塩すること、からなる製造方法。【選択図】なし
Description
関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法第119(e)条の下で米国仮特許出願第60/943,527号(2007年6月12日出願)、米国仮特許出願第60/968,274号(2007年8月27日出願)、及び米国仮特許出願第60/970,247号(2007年9月5日出願)に対して優先権を主張するが、これらは各々その全体が全ての目的に対して引用例として本明細書に取り込まれる。
本出願は、米国特許法第119(e)条の下で米国仮特許出願第60/943,527号(2007年6月12日出願)、米国仮特許出願第60/968,274号(2007年8月27日出願)、及び米国仮特許出願第60/970,247号(2007年9月5日出願)に対して優先権を主張するが、これらは各々その全体が全ての目的に対して引用例として本明細書に取り込まれる。
発明の分野
本発明は、糖残基がポリマー修飾基により修飾されている、糖ヌクレオチドの製造方法に関する。
本発明は、糖残基がポリマー修飾基により修飾されている、糖ヌクレオチドの製造方法に関する。
発明の背景
酵素触媒反応(例えば、グリコシルトランスフェラーゼを用いる)及び/又は他の合成方法を介して製造されるヌクレオチド糖は、所望の化合物だけでなく、未反応糖、塩、ピルビン酸、リン酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質などのような混入物をも包含する、複雑な混合物の形でしばしば得られる。これらの混入物の存在は、多くの下流の用途には望ましくない。副産物は、1種以上のクロマトグラフィー精製工程を用いて典型的には除去される。一般的なクロマトグラフィー法は、逆相クロマトグラフィーである。しかし、逆相クロマトグラフィーは、分離媒体が高価であり、そして充填済みカラムの供給が限られているため、しばしば大規模利用が実現できない。更に、逆相クロマトグラフィーでは、最適な分離及び分割のために典型的には有機溶媒が必要である。ヌクレオチド糖の製造及び複雑な反応混合物からのその単離に有用な、費用効率及び時間効率の高い製造法及び精製方法に対するニーズが存在している。本発明は、このニーズ及び他のニーズに対処する。
酵素触媒反応(例えば、グリコシルトランスフェラーゼを用いる)及び/又は他の合成方法を介して製造されるヌクレオチド糖は、所望の化合物だけでなく、未反応糖、塩、ピルビン酸、リン酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質などのような混入物をも包含する、複雑な混合物の形でしばしば得られる。これらの混入物の存在は、多くの下流の用途には望ましくない。副産物は、1種以上のクロマトグラフィー精製工程を用いて典型的には除去される。一般的なクロマトグラフィー法は、逆相クロマトグラフィーである。しかし、逆相クロマトグラフィーは、分離媒体が高価であり、そして充填済みカラムの供給が限られているため、しばしば大規模利用が実現できない。更に、逆相クロマトグラフィーでは、最適な分離及び分割のために典型的には有機溶媒が必要である。ヌクレオチド糖の製造及び複雑な反応混合物からのその単離に有用な、費用効率及び時間効率の高い製造法及び精製方法に対するニーズが存在している。本発明は、このニーズ及び他のニーズに対処する。
発明の要約
本発明は、ポリマー修飾基により修飾されている、ヌクレオチド糖の製造方法(例えば、大規模製造法)を提供する。典型的な修飾基は、ポリ(エチレングリコール)(PEG)及びポリ(プロピレングリコール)(PPG)残基のような、ポリ(アルキレンオキシド)残基から選択される、少なくとも1つのポリマー残基を包含する。詳細には、本発明は、修飾シチジン−一リン酸−シアル酸(CMP−SA)の製造方法を提供する。本発明の方法を用いて製造することができる、典型的な修飾ヌクレオチド糖は、CMP−SA−PEG−10kDa、CMP−SA−PEG−20kDa及びCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaを包含する(典型的なCMP−SA−PEG類については図2を参照のこと)。
本発明は、ポリマー修飾基により修飾されている、ヌクレオチド糖の製造方法(例えば、大規模製造法)を提供する。典型的な修飾基は、ポリ(エチレングリコール)(PEG)及びポリ(プロピレングリコール)(PPG)残基のような、ポリ(アルキレンオキシド)残基から選択される、少なくとも1つのポリマー残基を包含する。詳細には、本発明は、修飾シチジン−一リン酸−シアル酸(CMP−SA)の製造方法を提供する。本発明の方法を用いて製造することができる、典型的な修飾ヌクレオチド糖は、CMP−SA−PEG−10kDa、CMP−SA−PEG−20kDa及びCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaを包含する(典型的なCMP−SA−PEG類については図2を参照のこと)。
修飾ヌクレオチド糖は、例えば、複合糖質化(glycoconjugation)(例えば、糖PEG化(GlycoPEGylation))プロセスにおいて使用される。修飾ヌクレオチド糖(例えば、CMP−SA−PEG類)の種々の合成方法が報告されている。例えば、2002年10月9日出願のWO 2003/31464、2004年4月9日出願のWO 2004/99231及び2006年11月3日出願のWO 2007/056191を参照のこと(これらの開示は、全ての目的にその全体が引用例として本明細書に取り込まれる)。
修飾ヌクレオチド糖は、反応性官能基(例えば、アミノ基)を取り込んでいるヌクレオチド糖誘導体を、PEG−p−ニトロフェニル(pNP)カーボネートのような反応性ポリマー試薬と反応させることにより調製することができる。例えば、CMP−SA−PEG類(CMP−SA−PEG−10kDa、CMP−SA−PEG−20kDa及びCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaなど)は、CMP−SA−グリシン(GSC)を、p−ニトロフェニルカーボネート残基を取り込んでいるPEG試薬と反応させることにより調製することができる。本実施態様の典型的な合成経路は、図2に略述されている。予期しないことに、本発明者らは、水性溶媒系中の約8.0と約8.8の間のpH範囲が、PEG−p−ニトロフェニル(pNP)カーボネート(例えば、mPEG−p−ニトロフェニル)とヌクレオチド糖誘導体(例えば、CMP−SA−グリシン)との間のカップリング反応中には決定的であることを発見した。最適化pH範囲は、反応相手の加水分解による副産物の生成を大きく減少させ、そして最終生成物の収量及び純度を有意に増大させる。
本発明では、既知の方法に比較するとき、少ない製造工程を含み、純度及び全収率が改善された修飾ヌクレオチド糖(例えば、CMP−SA−PEG)を提供するプロセスを記述する。典型的なプロセスは、(a)例えば、PEGベースの不純物を除去するのに有用な、陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)を組み込む。陰イオン交換クロマトグラフィーの次に(b)接線流濾過(TFF)のような、膜濾過(即ち、限外濾過)を用いる部分精製生成物溶液の脱塩が続く。本発明の代表的なプロセスは図1に図解される。一例を挙げれば、TFF工程では、精製される修飾ヌクレオチド糖の分子量よりも有意に小さい分子量カットオフ(MWCO)を持つ膜を用いる。例えば、CMP−SA−PEG−10kDa、CMP−SA−PEG−20kDa及びCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaには、約10kDaと約1kDaの間の分子量カットオフの膜が使用される。本改良プロセスは、陰イオン交換クロマトグラフィーの前の限外濾過(例えば、TFF)を必要としない。代わりに、粗反応混合物の容量は、反応混合物中に存在する溶媒(例えば、THF)の一部を留去することにより減少させることができる。一例を挙げれば、留去は、回転蒸発を利用して達成される。次いで容量減少した混合物は、粒子を除去するために、例えば、0.22μmフィルターにより濾過することができ、次に混合物を陰イオン交換クロマトグラフィーに付す。一例を挙げれば、本発明の方法により製造した修飾ヌクレオチド糖(例えば、CMP−SA−PEG類)は、約90%(w/w)を超える純度及び約60〜約80%の間の単離収率で得られる。
種々の例では、本発明は、ポリマー修飾基に共有結合した修飾ヌクレオチド糖を包含する組成物の製造方法であって、このポリマー修飾基が、少なくとも1つの直鎖状又は分岐状ポリ(アルキレンオキシド)残基を包含する方法を提供する。本方法は、以下を包含する:(i)修飾ヌクレオチド糖を含む反応混合物を陰イオン交換媒体と接触させること;(ii)陰イオン交換媒体から修飾ヌクレオチド糖を溶出することにより、修飾ヌクレオチド糖を含有する溶出画分を生成すること;及び(iii)溶出画分を脱塩すること。本方法は、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィーの前の限外濾過(例えば、TFF)を包含しない。
特定の例では、本発明の方法は以下を包含する:(i)第1級アミノ基を包含するヌクレオチド糖誘導体を、p−ニトロフェニルカーボネートを取り込んでいる活性化ポリ(アルキレンオキシド)残基と、ヌクレオチド糖誘導体のアミノ基とポリ(アルキレンオキシド)残基との間に共有結合を生成させるのに十分な条件下で接触させること。この接触は、約8.0〜約8.8の間のpHを有する水性溶媒の存在下で行われる。修飾ヌクレオチド糖を包含する反応混合物が生成する。本方法は更に以下を包含する:(ii)反応混合物を陰イオン交換媒体と接触させること;及び(iii)陰イオン交換媒体から修飾ヌクレオチド糖を溶出して、修飾ヌクレオチド糖を含有する溶出画分を生成すること。本方法は更に以下を包含することができる:(iv)膜濾過を用いて溶出画分を脱塩すること;及び(v)溶出画分から水を除去すること。本方法は、好ましくは工程(i)の前の限外濾過を包含しない。
本発明は更に、本発明の方法により製造される修飾ヌクレオチド糖を提供する。
発明の詳細な説明
I. 略語
PEG、ポリ(エチレングリコール);PPG、ポリ(プロピレングリコール);Ara、アラビノシル;Fru、フルクトシル;Fuc、フコシル;Gal、ガラクトシル;GalNAc、N−アセチルガラクトサミニル;Glc、グルコシル;GlcNAc、N−アセチルグルコサミニル;Man、マンノシル;ManAc、酢酸マンノサミニル;Xyl、キシロシル;及びNeuAc、シアリル(N−アセチルノイラミニル);M6P、マンノース−6−リン酸;BEVS、バキュロウイルス発現ベクター系;CV、カラム容量;NTU、比濁計濁度単位;vvm、容量/容量/分;ACN、アセトニトリル;mcL、マイクロリットル;RO、逆浸透。
I. 略語
PEG、ポリ(エチレングリコール);PPG、ポリ(プロピレングリコール);Ara、アラビノシル;Fru、フルクトシル;Fuc、フコシル;Gal、ガラクトシル;GalNAc、N−アセチルガラクトサミニル;Glc、グルコシル;GlcNAc、N−アセチルグルコサミニル;Man、マンノシル;ManAc、酢酸マンノサミニル;Xyl、キシロシル;及びNeuAc、シアリル(N−アセチルノイラミニル);M6P、マンノース−6−リン酸;BEVS、バキュロウイルス発現ベクター系;CV、カラム容量;NTU、比濁計濁度単位;vvm、容量/容量/分;ACN、アセトニトリル;mcL、マイクロリットル;RO、逆浸透。
II. 定義
特に断りない限り、本明細書に使用される全ての技術及び科学用語は一般に、本発明が属する分野の当業者が普通に理解するものと同じ意味を有する。一般に、本明細書において使用される命名法、並びに細胞培養、分子遺伝学、有機化学及び核酸化学及びハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当該分野において周知であり、かつ普通に利用されるものである。核酸及びペプチド合成には、標準手法が利用される。手法及び手順は、一般には当該分野における従来法及び種々の一般参考文献にしたがい実行され(一般的には、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと、これは引用例として本明細書に取り込まれる)、そしてこれらは本文書の至るところに提供されている。本明細書において使用される命名法、並びに分析化学、及び後述の有機合成法における実験手順は、当該分野において周知であり、かつ普通に利用されるものである。化学合成及び化学分析には、標準手法、又はその変法が使用される。
特に断りない限り、本明細書に使用される全ての技術及び科学用語は一般に、本発明が属する分野の当業者が普通に理解するものと同じ意味を有する。一般に、本明細書において使用される命名法、並びに細胞培養、分子遺伝学、有機化学及び核酸化学及びハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当該分野において周知であり、かつ普通に利用されるものである。核酸及びペプチド合成には、標準手法が利用される。手法及び手順は、一般には当該分野における従来法及び種々の一般参考文献にしたがい実行され(一般的には、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと、これは引用例として本明細書に取り込まれる)、そしてこれらは本文書の至るところに提供されている。本明細書において使用される命名法、並びに分析化学、及び後述の有機合成法における実験手順は、当該分野において周知であり、かつ普通に利用されるものである。化学合成及び化学分析には、標準手法、又はその変法が使用される。
「ヌクレオチド糖」という用語は、「糖ヌクレオチド」という用語と互換的に使用され、シアル酸のような別の糖残基に共有結合したヌクレオチドのことをいう。このヌクレオチド糖は、場合により、直鎖状又は分岐状PEG残基のようなポリマー修飾基により共有結合で修飾される。
本発明のヌクレオチド糖の「糖残基」は、天然及び非天然のフラノース及びヘキサノースの両方から選択される。非天然糖類は、場合により、環上にアルキル化又はアシル化ヒドロキシル及び/又はアミン残基、例えば、エーテル、エステル及びアミド置換基を包含する。他の非天然糖類は、そのような置換基が天然糖類には存在しない環上の位置に、H、ヒドロキシル、エーテル、エステル又はアミド置換基を包含する。あるいは、この炭水化物は、その名称が由来する炭水化物に見い出されるであろう置換基を欠いている(例えば、デオキシ糖)。更なる典型的な非天然糖は、酸化(例えば、オン酸(-onic)及びウロン酸(-uronic acids))及び還元(糖アルコール)炭水化物を包含する。糖残基は、単糖類、オリゴ糖類又は多糖類であってよい。
本発明に有用な典型的な天然糖は、グルコース、ガラクトース、フコース、マンノース、キシラノース、リボース、N−アセチルグルコース(GlcNAc)、シアル酸及びN−アセチルガラクトース(GalNAc)を包含する。
同様に、ヌクレオシドは天然及び非天然ヌクレオシドの両方から選択することができる。本発明に有用な典型的な天然ヌクレオシドは、シトシン、チミン、グアニン、アデニン及びウラシルを包含する。種々の非天然ヌクレオシド類及びその製造方法が当該分野において知られている。
「シアル酸」という用語は、カルボキシル化9炭糖のファミリーの任意のメンバーのことをいう。シアル酸ファミリーの最もありふれたメンバーは、N−アセチル−ノイラミン酸(2−ケト−5−アセトアミド−3,5−ジデオキシ−D−グリセロ−D−ガラクトノヌロピラノース−1−オン酸(しばしばNeu5Ac、NeuAc、NAN又はNANAと略される))である。このファミリーの第2のメンバーは、N−グリコリル−ノイラミン酸(Neu5Gc又はNeuGc)であるが、ここでNeuAcのN−アセチル基はヒドロキシル化されている。第3のシアル酸ファミリーメンバーは、2−ケト−3−デオキシ−ノヌロソン酸(KDN)である(Nadano et al., (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990))。また、9−O−C1−C6アシル−Neu5Ac(9−O−ラクチル−Neu5Ac又は9−O−アセチル−Neu5Acなど)、9−デオキシ−9−フルオロ−Neu5Ac及び9−アジド−9−デオキシ−Neu5Acのような、9−置換シアル酸が含まれる。シアル酸ファミリーの総説については、例えば、Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992))を参照のこと。シアル化方法におけるシアル酸化合物の合成及び使用は、国際出願WO 92/16640(1992年10月1日公開)に開示されている。
「陰イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、充填カラムを伴う手順、並びに陰イオン交換膜を伴う手順を包含する。「陰イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、陰イオン交換能を有する任意の混合モード媒体を用いて実行されるクロマトグラフィーを包含する。
「水性溶媒」という用語は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%又は少なくとも約80%の水(v/v)を組み込んでいる溶媒を記述している。この水性溶媒は、場合により、アルコール類(例えば、メタノール、エタノール又はブタノール)、THF及び他の脂肪族又は環状エーテル類のような、水混和性有機溶媒を包含することができる。
「ポリマー修飾基」という用語は、本発明のヌクレオチド糖に結合している任意のポリマーのことをいう。このポリマー修飾基は、水溶性であっても、又は本質的に水不溶性であってもよい。本発明に有用な典型的な水溶性ポリマーは、PEG、m−PEG及び他の官能基化PEG残基、m−PPG、PPG、ポリシアル酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリシン、ポリエチレンイミン及び生分解性ポリマー(例えば、ポリラクチド、ポリグリセリド)を包含する。
「水溶性」という用語は、ある検出可能な程度の水への溶解度を有する残基のことをいう。水溶解度を検出及び/又は定量するための方法は、当該分野において周知である。典型的な水溶性ポリマーは、ペプチド、糖類、ポリ(エーテル)、ポリ(アミン)、ポリ(カルボン酸)などを包含する。ペプチドは、混合配列を有しても、又は単一アミノ酸からなってもよい(例えば、ポリ(リシン))。典型的な多糖類は、ポリ(シアル酸)である。典型的なポリ(エーテル)は、ポリ(エチレングリコール)、例えば、m−PEGである。ポリ(エチレンイミン)は、典型的なポリアミンであり、そしてポリ(アクリル酸)は、代表的なポリ(カルボン酸)である。
水溶性ポリマーのポリマー基本骨格は、ポリ(エチレングリコール)(即ち、PEG)であってよい。しかし、当然のことながら、他の関連ポリマーもまた、本発明の実施における使用に適しており、そしてPEG又はポリ(エチレングリコール)という用語の使用は、この点で包括的であり、かつ排他的ではないことが意図される。「PEG」という用語は、アルコキシPEG、二官能性PEG、多腕PEG、フォーク型PEG、分岐状PEG、ペンダントPEG(即ち、ポリマー基本骨格に1つ以上の官能基ペンダントを有する、PEG又は関連ポリマー)、又は分解性結合部を有するPEGを包含する、そのいずれかの型のポリ(エチレングリコール)を包含する。
ポリマー基本骨格は、直鎖状又は分岐状であってよい。分岐ポリマー基本骨格は、当該分野において一般に知られている。典型的には、分岐ポリマーは、中心枝コア残基及び中心枝コアに結合している複数の直鎖状ポリマー鎖を有する。PEGは普通、グリセロール、ペンタエリトリトール及びソルビトールのような種々のポリオールへの、エチレンオキシドの付加により調製することができる分岐型として使用される。中心枝残基はまた、リシンのような幾つかのアミノ酸から誘導することができる。分岐ポリ(エチレングリコール)は、R(−PEG−OH)m(ここで、Rは、グリセロール又はペンタエリトリトールのようなコア残基を表し、そしてmは、腕の数を表す)のような一般型として表すことができる。米国特許第5,932,462号(引用例としてその全体が本明細書に取り込まれる)に記載されるような、多腕PEG分子もまた、ポリマー基本骨格として使用することができる。
多数の他のポリマーもまた、本発明に適している。非ペプチドで水溶性であり、2〜約300個の末端を持つポリマー基本骨格は、本発明において特に有用である。適切なポリマーの例は、特に限定されないが、他のポリ(アルキレングリコール)[ポリ(プロピレングリコール)(「PPG」)、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーなど]、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレフィンアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ(N−アクリロイルモルホリン)[米国特許第5,629,384号(引用例としてその全体が本明細書に取り込まれる)に記載されている]、並びにこれらのコポリマー、ターポリマー、及び混合物を包含する。ポリマー基本骨格の各鎖の分子量は変化させることができるが、典型的には約100Da〜約100,000Da、しばしば約6,000Da〜約80,000Daの範囲である。
「供給溶液」とは、精製すべき化合物を含有する任意の溶液のことをいう。例えば、ある反応混合物は、本発明の方法を用いてそこから所望の反応生成物が精製される供給溶液として使用することができる。
置換基が、左から右へ書かれるその従来の化学式により特定される場合には、これらは、右から左へその構造を書くことによって生じるであろう、化学的に同一の置換基を等しく包含する(例えば、−CH2O−とは、−OCH2−のことも言うものとする)。
「アルキル」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、特に断りない限り、直鎖若しくは分岐鎖、又は環状(即ち、シクロアルキル)炭化水素基、あるいはその組合せを意味し、そしてこれは、完全に飽和であるか、一価不飽和又は多価不飽和であってよく、かつ指定される数の炭素原子を有する(即ち、C1−C10は、1〜10個の炭素を意味する)、二価(例えば、アルキレン)及び多価基を包含することができる。飽和炭化水素基の例は、特に限定されないが、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、シクロヘキシル、(シクロヘキシル)メチル、シクロプロピルメチル、例えば、n−ペンチル、n−ヘキシル、n−ヘプチル、n−オクチルの同族体及び異性体などのような基を包含する。不飽和アルキル基は、1つ以上の二重結合又は三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例は、特に限定されないが、ビニル、2−プロペニル、クロチル、2−イソペンテニル、2−(ブタジエニル)、2,4−ペンタジエニル、3−(1,4−ペンタジエニル)、エチニル、1−及び3−プロピニル、3−ブチニル、並びに高級同族体及び異性体を包含する。「アルキル」という用語はまた、特に断りない限り、「ヘテロアルキル」のような、更に詳細には以下に定義されるアルキルの誘導体を包含する意味である。炭化水素基に限られたアルキル基は、「ホモアルキル」と呼ばれる。
「アルキレン」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、特に限定されないが、−CH2CH2CH2CH2−を典型例とする、アルカンから誘導される二価基を意味し、そして更に「ヘテロアルキレン」として後述される基を包含する。典型的には、アルキル(又はアルキレン)基は、1〜24個の炭素原子を有するが、10個又はそれより少ない炭素原子を有する基が本発明では好ましい。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」は、一般には8個又はそれより少ない炭素原子を有する短鎖アルキル又はアルキレン基である。
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」(又はチオアルコキシ)という用語は、その従来の意味で使用され、そしてそれぞれ酸素原子、アミノ基、又は硫黄原子を介して、分子の残りの部分に結合したアルキル基のことをいう。
「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体で又は別の用語との組合せで、特に断りない限り、提示数の炭素原子、並びにO、N、Si及びSよりなる群から選択される少なくとも1個のヘテロ原子よりなる(ここで、窒素及び硫黄原子は、場合により酸化されていてもよく、そして窒素ヘテロ原子は、場合により4級化されていてもよい)、安定な直鎖若しくは分岐鎖、又は環状炭化水素基、あるいはこれらの組合せを意味する。ヘテロ原子のO、N及びS並びにSiは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に、又はアルキル基が分子の残りの部分に結合している位置に配置されていてもよい。例としては、特に限定されないが、−CH2−CH2−O−CH3、−CH2−CH2−NH−CH3、−CH2−CH2−N(CH3)−CH3、−CH2−S−CH2−CH3、−CH2−CH2−S(O)−CH3、−CH2−CH2−S(O)2−CH3、−CH=CH−O−CH3、−Si(CH3)3、−CH2−CH=N−OCH3、及び−CH=CH−N(CH3)−CH3を包含する。例えば、−CH2−NH−OCH3及び−CH2−O−Si(CH3)3のように、最大2個までのヘテロ原子が連続してもよい。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、特に限定されないが、−CH2−CH2−S−CH2−CH2−及び−CH2−S−CH2−CH2−NH−CH2−を典型例とする、ヘテロアルキルから誘導される二価基を意味する。ヘテロアルキレン基では、ヘテロ原子はまた、鎖末端のいずれか又は両方を占めることができる(例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど)。更に、アルキレン及びヘテロアルキレン連結基では、この連結基の式が書かれる向きによって連結基の幾何学配置を意味するものではない。例えば、式:−CO2R’は、−C(O)OR’と−OC(O)R’の両方を表す。
「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それ自体で又は他の用語との組合せで、特に断りない限り、それぞれ「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の環状版を表す。更に、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子は、その複素環が分子の残りの部分に結合している位置を占めることができる。シクロアルキルの例は、特に限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、1−シクロヘキセニル、3−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどを包含する。ヘテロシクロアルキルの例は、特に限定されないが、1−(1,2,5,6−テトラヒドロピリジル)、1−ピペリジニル、2−ピペリジニル、3−ピペリジニル、4−モルホリニル、3−モルホリニル、テトラヒドロフラン−2−イル、テトラヒドロフラン−3−イル、テトラヒドロチエン−2−イル、テトラヒドロチエン−3−イル、1−ピペラジニル、2−ピペラジニルなどを包含する。
「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、特に断りない限り、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素原子を意味する。更に、「ハロアルキル」のような用語は、モノハロアルキル及びポリハロアルキルを包含する意味である。例えば、「ハロ(C1−C4)アルキル」という用語は、特に限定されないが、トリフルオロメチル、2,2,2−トリフルオロエチル、4−クロロブチル、3−ブロモプロピルなどを包含する意味である。
「アリール」という用語は、特に断りない限り、単環、又は縮合しているか若しくは共有結合している多環(好ましくは1〜3つの環)であってよい、多価不飽和の芳香族置換基を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、N、O、S、Si及びBから選択される1個〜4個のヘテロ原子を含有する(ここで、窒素及び硫黄原子は、場合により酸化されており、そして窒素原子は、場合により4級化されている)、アリール基(又は環)のことをいう。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子によって分子の残りの部分に結合してもよい。アリール及びヘテロアリール基の非限定例は、フェニル、1−ナフチル、2−ナフチル、4−ビフェニル、1−ピロリル、2−ピロリル、3−ピロリル、3−ピラゾリル、2−イミダゾリル、4−イミダゾリル、ピラジニル、2−オキサゾリル、4−オキサゾリル、2−フェニル−4−オキサゾリル、5−オキサゾリル、3−イソオキサゾリル、4−イソオキサゾリル、5−イソオキサゾリル、2−チアゾリル、4−チアゾリル、5−チアゾリル、2−フリル、3−フリル、2−チエニル、3−チエニル、2−ピリジル、3−ピリジル、4−ピリジル、2−ピリミジル、4−ピリミジル、5−ベンゾチアゾリル、プリニル、2−ベンゾイミダゾリル、5−インドリル、1−イソキノリル、5−イソキノリル、2−キノキサリニル、5−キノキサリニル、3−キノリル、及び6−キノリルを包含する。上記アリール及びヘテロアリール環系の各々の置換基は、後述の許容しうる置換基の群から選択される。
簡潔さのために、他の用語と組合せて使用されるとき(例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル)「アリール」という用語は、上記と同義のアリール及びヘテロアリール環の両方を包含する。即ち、「アリールアルキル」という用語は、アリール基が、アルキル基[炭素原子(例えば、メチレン基)が、例えば、酸素原子により置換されているアルキル基を包含する(例えば、フェノキシメチル、2−ピリジルオキシメチル、3−(1−ナフチルオキシ)プロピルなど)]に結合している基(例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど)を包含する意味である。
上記用語の各々(例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」及び「ヘテロアリール」)は、特に断りない限り指示基の置換及び非置換型の両方を包含する意味である。各タイプの基に好ましい置換基は後述される。
アルキル及びヘテロアルキル基(しばしばアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニルと呼ばれる基を包含する)の置換基は、総称的に「アルキル基置換基」と呼ばれ、そしてこれらは、特に限定されないが、ゼロから(2m’+1)の範囲の数(ここで、m’は、このような基中の炭素原子の総数である)の、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、−OR’、=O、=NR’、=N−OR’、−NR’R”、−SR’、−ハロゲン、−SiR’R”R'''、−OC(O)R’、−C(O)R’、−CO2R’、−CONR’R”、−OC(O)NR’R”、−NR”C(O)R’、−NR’−C(O)NR”R'''、−NR”C(O)2R’、−NR−C(NR’R”R''')=NR''''、−NR−C(NR’R”)=NR'''、−S(O)R’、−S(O)2R’、−S(O)2NR’R”、−NRSO2R’、−CN及び−NO2から選択される、1種以上の種々の基であってよい。R’、R”、R'''及びR''''は、各々好ましくは独立に、水素、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換アリール、例えば、1〜3個のハロゲンで置換されたアリール、置換若しくは非置換アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を意味する。本発明の化合物が、例えば、2つ以上のR基を包含するとき、R基の各々は、各R’、R”、R'''及びR''''基が2つ以上存在するときと同様に、独立に選択される。R’及びR”が、同じ窒素原子に結合しているとき、これらは、この窒素原子と一緒になって、5員、6員、又は7員環を形成することができる。例えば、−NR’R”は、特に限定されないが、1−ピロリジニル及び4−モルホリニルを包含する意味である。上記置換基の考察から、当業者であれば、「アルキル」という用語は、ハロアルキル(例えば、−CF3及び−CH2CF3)及びアシル(例えば、−C(O)CH3、−C(O)CF3、−C(O)CH2OCH3など)のような、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を包含する意味であることを理解するだろう。
アルキル基について記述された置換基と同様に、アリール及びヘテロアリール基の置換基は、総称的に「アリール基置換基」と呼ばれる。この置換基は、例えば、ゼロから芳香環系上のオープン原子価の総数の範囲の数の、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、−OR’、=O、=NR’、=N−OR’、−NR’R”、−SR’、−ハロゲン、−SiR’R”R'''、−OC(O)R’、−C(O)R’、−CO2R’、−CONR’R”、−OC(O)NR’R”、−NR”C(O)R’、−NR’−C(O)NR”R'''、−NR”C(O)2R’、−NR−C(NR’R”R''')=NR''''、−NR−C(NR’R”)=NR'''、−S(O)R’、−S(O)2R’、−S(O)2NR’R”、−NRSO2R’、−CN及び−NO2、−R’、−N3、−CH(Ph)2、フルオロ(C1−C4)アルコキシ、及びフルオロ(C1−C4)アルキルから選択される(ここで、R’、R”、R'''及びR''''は、好ましくは独立に、水素、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール及び置換又は非置換ヘテロアリールから選択される)。本発明の化合物が、例えば、2つ以上のR基を包含するとき、R基の各々は、各R’、R”、R'''及びR''''基が2つ以上存在するときと同様に、独立に選択される。
アリール又はヘテロアリール環の隣接原子上の2つの置換基は、場合により式:−T−C(O)−(CRR’)q−U−(ここで、T及びUは、独立に−NR−、−O−、−CRR’−又は単結合であり、そしてqは、0〜3の整数である)の置換基で置換されていてもよい。あるいは、アリール又はヘテロアリール環の隣接原子上の2つの置換基は、場合により式:−A−(CH2)r−B−(ここで、A及びBは、独立に−CRR’−、−O−、−NR−、−S−、−S(O)−、−S(O)2−、−S(O)2NR’−又は単結合であり、そしてrは、1〜4の整数である)の置換基で置換されていてもよい。そうして生成する新しい環の1つの単結合は、場合により二重結合で置換されていてもよい。あるいは、アリール又はヘテロアリール環の隣接原子上の2つの置換基は、場合により式:−(CRR’)s−X−(CR”R''')d−(ここで、s及びdは、独立に0〜3の整数であり、そしてXは、−O−、−NR’−、−S−、−S(O)−、−S(O)2−、又は−S(O)2NR’−である)の置換基で置換されていてもよい。置換基のR、R’、R”及びR'''は、好ましくは水素又は置換若しくは非置換(C1−C6)アルキルから独立に選択される。
本明細書において使用されるとき、「ヘテロ原子」という用語は、酸素(O)、窒素(N)、硫黄(S)、ケイ素(Si)及びホウ素(B)を包含する。
「R」という記号は、置換基を表す一般的略語である。典型的な置換基は、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基を包含する。
本明細書に記載される全てのオリゴ糖は、非還元糖に対する名称又は略語(即ち、Gal)、続いてグリコシド結合の立体配置(α又はβ)、環結合(1又は2)、結合に関与する還元糖の環位置(2、3、4、6又は8)、及び次に還元糖の名称又は略語(即ち、GlcNAc)により記述される。それぞれの糖は好ましくはピラノースである。標準的な糖鎖生物学の命名法の総説については、Essentials of Glycobiology Varki et al. eds. CSHL Press (1999)を参照のこと。
オリゴ糖は、還元末端の糖が実際に還元糖であろうとなかろうと、還元末端及び非還元末端を有するものと考えられる。一般に認められた命名法により、オリゴ糖は、本明細書において非還元末端を左側に還元末端を右側に描かれる。
本明細書において使用されるとき、「修飾糖」という用語は、本発明のプロセスにおいてペプチドのアミノ酸又はグリコシル残基に酵素的に付加された、天然又は非天然の炭水化物のことをいう。修飾糖は、特に限定されないが、糖ヌクレオチド(一、二、及び三リン酸)、活性化糖(例えば、ハロゲン化グリコシル、メシル酸グリコシル)及び活性化もされずヌクレオチドでもない糖を包含する、幾つかの酵素基質から選択される。「修飾糖」は、「修飾基」で共有結合により官能基化される。有用な修飾基は、特に限定されないが、PEG残基、治療薬残基、診断薬残基、生体分子などを包含する。修飾基は、好ましくは天然、即ち非修飾炭水化物ではない。修飾基による官能基化の部位は、「修飾糖」が酵素的にペプチドに付加するのを妨げないように選択される。
「複合糖質化」という用語は、本明細書において使用されるとき、本発明の方法により調製される、ポリペプチド、例えば、エリトロポエチンペプチドのアミノ酸又はグリコシル残基への修飾糖種の酵素介在結合のことをいう。「複合糖質化」の下位には、修飾糖の修飾基が、ポリ(エチレングリコール)、そのアルキル誘導体(例えば、m−PEG)又は反応性誘導体(例えば、H2N−PEG、HOOC−PEG)である「糖PEG化」がある。
「大規模」及び「工業的規模」という用語は、互換的に使用され、そして少なくとも約250mg、少なくとも約500mg、少なくとも約1グラム、少なくとも約2グラム、少なくとも約5g、少なくとも約10g、少なくとも約20g、少なくとも約30g、少なくとも約50又は少なくとも約100gのヌクレオチド糖を単一サイクルの完了時に製造する、反応サイクル又はプロセスのことをいう。1つの実施態様において、本発明は、キログラムスケール(例えば、合成/精製1回あたり、少なくとも約1kg、少なくとも約1.5kg、少なくとも約2kg、又は少なくとも約3kgの精製糖ヌクレオチド)で高度の純度までヌクレオチド糖を調製するのに適した、大規模製造法を提供する。
「単離された」又は「精製された」という用語は、本発明のヌクレオチド糖又は修飾ヌクレオチド糖に関するとき、このような物質が、これを製造するために使用される成分を本質的に含まないことを意味する。「単離された」、「純粋な」又は「精製された」は、互換的に使用される。純度は、任意の当該分野で認められた分析法(例えば、銀染色ゲル上のバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、NMR、HPLC、ELISA、又は類似手段)により決定することができる。一例を挙げれば、純度は、目的のヌクレオチド糖の量と、試料中に存在する他の成分全部の量との比(w/w)として決定される。例えば、試料中のヌクレオチド糖の濃度は、ヌクレオチド糖標準物質と組合せた分析用クロマトグラフィー(例えば、HPLC、RP−HPLC)を用いて決定してもよい。
典型的には、本発明の方法を用いて単離されるヌクレオチド糖は、ある範囲として表されるレベルの純度を有する。糖ヌクレオチドの純度の範囲の下端は、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約75%又は約80%であり、そして純度の範囲の上端は、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約95%超である。
ヌクレオチド糖が約90%よりも純粋であるとき、その純度もまた、好ましくはある範囲として表される。この純度の範囲の下端は、約90%、約92%、約94%、約96%又は約98%である。この純度の範囲の上端は、約92%、約94%、約96%、約98%又は約100%純度(w/w)である。
「ヌクレオチド糖回収率」、「収率」又は「反応収率」は、典型的には特定の製造工程(又は一連の工程)後の回収ヌクレオチド糖の量と、その製造工程に入ったヌクレオチド糖の量との間の範囲として表される。例えば、本発明の方法のヌクレオチド糖の回収率は、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%又は約90%である。別の例では、本発明の方法のヌクレオチド糖回収率は、約92%、約94%、約96%、約98%又は約98%超である。
「ローディング液(loading buffer)」という用語は、その中で精製されるペプチドが精製装置、例えば、クロマトグラフィーカラム又はフィルターカートリッジに加えられる緩衝液のことをいう。典型的には、ローディング液は、不要な不純物からの目的のペプチドの分離が達成できるように選択される。例えば、ペプチドをヒドロキシアパタイト(HA)又はフルオロアパタイトカラム上で精製するとき、ローディング液のpH及びローディング液中の塩濃度は、ペプチドが最初はカラム上に保持され、一方ある種の不純物が流出液中に見い出されるように選択することができる。
「制限液(limit buffer)」とも呼ばれる「溶離液(elution buffer)」という用語は、典型的にはそれ以前に加えた精製装置(例えば、クロマトグラフィーカラム又はフィルターカートリッジ)からペプチドを除去(溶出)するために使用される緩衝液のことをいう。典型的には、ローディング液は、不要な不純物からの目的のペプチドの分離が達成できるように選択される。しばしば溶離液中の特定の塩(例えば、NaCl)の濃度は、溶出進行中に変化させる(勾配)。この勾配は連続的又は段階的であってよい。
「室温」又は「周囲温度」という用語は、少なくとも約10℃、少なくとも約15℃、少なくとも約20℃又は少なくとも約25℃の温度のことをいう。典型的には、室温は約20℃と約25℃の間である。
III. 方法
本発明は、ヌクレオチド糖の製造方法(例えば、大規模製造法)を提供する。1つの実施態様において、ヌクレオチド糖はポリマー修飾基で修飾される(修飾ヌクレオチド糖)。典型的なポリマー修飾基は本明細書において開示される。一例を挙げれば、ポリマー修飾基は、ポリ(アルキレンオキシド)残基から選択される少なくとも1つのポリマー残基を包含する。典型的なポリ(アルキレンオキシド)は、ポリ(エチレングリコール)(PEG)及びポリ(プロピレングリコール)(PPG)残基を包含する。
本発明は、ヌクレオチド糖の製造方法(例えば、大規模製造法)を提供する。1つの実施態様において、ヌクレオチド糖はポリマー修飾基で修飾される(修飾ヌクレオチド糖)。典型的なポリマー修飾基は本明細書において開示される。一例を挙げれば、ポリマー修飾基は、ポリ(アルキレンオキシド)残基から選択される少なくとも1つのポリマー残基を包含する。典型的なポリ(アルキレンオキシド)は、ポリ(エチレングリコール)(PEG)及びポリ(プロピレングリコール)(PPG)残基を包含する。
一例を挙げれば、本発明は、修飾ヌクレオチド糖を包含する組成物の製造方法を提供する。修飾ヌクレオチド糖では、糖残基がポリマー修飾基に共有結合しており、そしてこのポリマー修飾基は、少なくとも1つの直鎖状又は分岐状ポリ(アルキレンオキシド)残基を包含する。典型的な方法は、以下を包含する:(i)修飾ヌクレオチド糖を含む反応混合物を陰イオン交換媒体と接触させること;(ii)陰イオン交換媒体から修飾ヌクレオチド糖を溶出することにより、修飾ヌクレオチド糖を含有する溶出画分を生成すること;及び(iii)溶出画分を脱塩すること。予期しないことに、本発明者らは、本発明のプロセスにより、このプロセスが陰イオン交換クロマトグラフィーの前の限外濾過を包含せず、そして反応混合物が最初に陰イオン交換クロマトグラフィーにより処理される(例えば、溶媒及び粒子の除去により反応混合物を調整後)ときでさえ、高純度及び高い全収率で修飾ヌクレオチド糖が得られることを発見した。よって一例を挙げれば、本方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー、即ち、工程(i)の前の限外濾過(例えば、TFF)を包含しない。
典型的な実施態様において、上記方法は、更に以下を包含することができる:(iv)反応混合物の容量を減少させること。一例を挙げれば、反応混合物の容量は、少なくとも溶媒の一部(例えば、回転蒸発を介して)の留去(例えば、減圧下)により減少する。一例を挙げれば、反応混合物は、減圧下での留去によって本質的に除去されるか又は部分的に除去される有機溶媒(例えば、THF)を包含する。上記方法は、更に以下を包含してもよい(例えば、反応混合物の容量の減少後):(v)反応混合物を濾過すること(例えば、粒子を除去するために)。典型例では、反応混合物は、0.22μmフィルターにより濾過する。「濾過」という用語は、この文脈において「限外濾過」を包含しない。陰イオン交換クロマトグラフィーのために反応混合物を前処理するのに有用な他の適切なフィルターは、本明細書に記載される。特定の例では、反応混合物の容量を最初に減少させ、生じる混合物を濾過に付し、次いで濾液を陰イオン交換媒体と接触させる。
上記実施態様のいずれかによる一例を挙げれば、本方法は、例えば、工程(iii)の後に更に以下を包含することができる:(v)溶出画分から水を除去すること。一例を挙げれば、溶出画分を凍結乾燥又は噴霧乾燥に付すことにより水を除去する。典型的には、これらの手順により、残留含水量が、例えば、約10%(w/w)未満、約5%(w/w)未満、約4%(w/w)未満、約3%(w/w)未満、約2%(w/w)未満又は約1%(w/w)未満である、本質的に乾燥生成物が得られる。
特定の例では、本発明は、ポリマー修飾基がヌクレオチド糖に共有結合している、修飾ヌクレオチド糖を包含する組成物の製造方法を提供する。一例を挙げれば、ポリマー修飾基は、少なくとも1つの直鎖状又は分岐状ポリ(アルキレンオキシド)残基を包含する。この方法は、以下を包含する:(i)第1級アミノ基を包含するヌクレオチド糖誘導体を、p−ニトロフェニルカーボネートを取り込んでいる活性化ポリ(アルキレンオキシド)残基と、ヌクレオチド糖誘導体のアミノ基とポリ(アルキレンオキシド)残基との間に共有結合を生成させるのに十分な条件下で接触させること。この接触は、約8.0〜約8.8の間のpHを有する水性溶媒の存在下で行われる。こうして修飾ヌクレオチド糖を包含する反応混合物が生成する。本方法は更に以下を包含することができる:(ii)反応混合物を陰イオン交換媒体と接触させること;及び(iii)陰イオン交換媒体から修飾ヌクレオチド糖を溶出して、修飾ヌクレオチド糖を含有する溶出画分を生成すること。本方法は更に以下を包含することができる:(iv)膜濾過を用いて溶出画分を脱塩すること;及び(v)溶出画分から水を除去すること(例えば、場合により添加剤の存在下での凍結乾燥又は噴霧乾燥を介して)。本方法は、好ましくは工程(i)の前の限外濾過を包含しない。
上記実施態様のいずれかにおいて有用な典型的なポリマー修飾基は、本明細書の以下に開示される。一例を挙げれば、ポリマー修飾基は、ポリ(アルキレンオキシド)残基から選択される、少なくとも1つのポリマー残基を包含する。典型的なポリ(アルキレンオキシド)は、ポリ(エチレングリコール)(PEG)及びポリ(プロピレングリコール)(PPG)を包含する。一例を挙げれば、PEG修飾基は、約5kDaと約600kDaの間、約5kDaと約500kDaの間、約5kDaと約400kDaの間、約10kDaと約400kDaの間、約10kDaと約300kDaの間、約10kDaと約200kDaの間又は約10kDaと約100kDaの間の分子量を有する。特定の例では、PEG残基は、約10kDaと約80kDaの間、約10kDaと約60kDaの間又は約10kDaと約40kDaの間の分子量を有する。一例を挙げれば、ポリマー修飾基が分岐しており、そして少なくとも2つのポリマー残基(例えば、2つのPEG残基)に共有結合したグリセロール基本骨格を包含する。
ヌクレオチド糖
上記実施態様のいずれかのヌクレオチド糖又は修飾ヌクレオチド糖は、リン酸残基(一リン酸、二リン酸、三リン酸及びポリリン酸残基から選択される)に共有結合したヌクレオシド残基、及びそのリン酸残基に共有結合した更なる糖残基を包含する。ヌクレオチド糖のヌクレオシド残基は、アデノシン、グアノシン、5−メチルウリジン、ウリジン、シチジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、及びデオキシシチジンを包含する、任意のヌクレオシド又はデオキシヌクレオシドであってよい。更に別のヌクレオシド残基は、本明細書に記載される。本発明の方法は、ヌクレオチドが種々のリン酸化状態にある、ヌクレオチド糖を製造するのに有用である。したがって、ヌクレオチド糖の典型的なヌクレオチドは、CMP、CDP、CTP、AMP、cAMP、ADP、ATP、UMP、UDP、UTP、GMP、cGMP、GDP、GTP、TMP、TDP及びTTP、更にはこれらや修飾ヌクレオチドを包含する他のヌクレオチドのデオキシ型を包含する。
上記実施態様のいずれかのヌクレオチド糖又は修飾ヌクレオチド糖は、リン酸残基(一リン酸、二リン酸、三リン酸及びポリリン酸残基から選択される)に共有結合したヌクレオシド残基、及びそのリン酸残基に共有結合した更なる糖残基を包含する。ヌクレオチド糖のヌクレオシド残基は、アデノシン、グアノシン、5−メチルウリジン、ウリジン、シチジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、及びデオキシシチジンを包含する、任意のヌクレオシド又はデオキシヌクレオシドであってよい。更に別のヌクレオシド残基は、本明細書に記載される。本発明の方法は、ヌクレオチドが種々のリン酸化状態にある、ヌクレオチド糖を製造するのに有用である。したがって、ヌクレオチド糖の典型的なヌクレオチドは、CMP、CDP、CTP、AMP、cAMP、ADP、ATP、UMP、UDP、UTP、GMP、cGMP、GDP、GTP、TMP、TDP及びTTP、更にはこれらや修飾ヌクレオチドを包含する他のヌクレオチドのデオキシ型を包含する。
ヌクレオチド糖の糖残基は、単糖及びオリゴ糖を包含する、任意のグリコシル残基であってよい。典型的な糖残基は、シアル酸、グルコース、GlcNAc、マンノース、フコース、ガラクトース、GalNAc及びこれらの組合せを包含する。「グリコシル残基」又は「糖残基」という用語は、「グリコシル擬態残基」を包含する。
典型的なヌクレオチド糖は、CMP−SA、CDP−SA、CTP−SA、AMP−SA、cAMP−SA、ADP−SA、ATP−SA、UMP−SA、UDP−SA、UTP−SA、GMP−SA、cGMP−SA、GDP−SA、GTP−SA、TMP−SA、TDP−SA及びTTP−SA、CMP−GlcNAc、CDP−GlcNAc、CTP−GlcNAc、AMP−GlcNAc、cAMP−GlcNAc、ADP−GlcNAc、ATP−GlcNAc、UMP−GlcNAc、UDP−GlcNAc、UTP−GlcNAc、GMP−GlcNAc、cGMP−GlcNAc、GDP−GlcNAc、GTP−GlcNAc、TMP−GlcNAc、TDP−GlcNAc及びTTP−GlcNAc、CMP−Gal、CDP−Gal、CTP−Gal、AMP−Gal、cAMP−Gal、ADP−Gal、ATP−Gal、UMP−Gal、UDP−Gal、UTP−Gal、GMP−Gal、cGMP−Gal、GDP−Gal、GTP−Gal、TMP−Gal、TDP−Gal及びTTP−Gal、CMP−GalNAc、CDP−GalNAc、CTP−GalNAc、AMP−GalNAc、cAMP−GalNAc、ADP−GalNAc、ATP−GalNAc、UMP−GalNAc、UDP−GalNAc、UTP−GalNAc、GMP−GalNAc、cGMP−GalNAc、GDP−GalNAc、GTP−GalNAc、TMP−GalNAc、TDP−GalNAc及びTTP−GalNAc、CMP−Glc、CDP−Glc、CTP−Glc、AMP−Glc、cAMP−Glc、ADP−Glc、ATP−Glc、UMP−Glc、UDP−Glc、UTP−Glc、GMP−Glc、cGMP−Glc、GDP−Glc、GTP−Glc、TMP−Glc、TDP−Glc及びTTP−Glc、CMP−フコース、CDP−フコース、CTP−フコース、AMP−フコース、cAMP−フコース、ADP−フコース、ATP−フコース、UMP−フコース、UDP−フコース、UTP−フコース、GMP−フコース、cGMP−フコース、GDP−フコース、GTP−フコース、TMP−フコース、TDP−フコース及びTTP−フコース、CMP−Man、CDP−Man、CTP−Man、AMP−Man、cAMP−Man、ADP−Man、ATP−Man、UMP−Man、UDP−Man、UTP−Man、GMP−Man、cGMP−Man、GDP−Man、GTP−Man、TMP−Man、TDP−Man及びTTP−Man、並びにこれらのデオキシ種を包含する。上記ヌクレオチド糖はいずれも、本発明の方法により製造される修飾ヌクレオチド糖の一部となりうる。好ましい実施態様において、これらの修飾ヌクレオチド糖中のポリマー修飾基(例えば、直鎖状又は分岐状PEG残基)は、場合によりリンカー残基を介して、ヌクレオチド糖の糖残基に共有結合している。
本発明の方法を用いて製造することができる典型的な修飾ヌクレオチド糖は、CMP−SA−PEG、CDP−SA−PEG、CTP−SA−PEG、AMP−SA−PEG、cAMP−SA−PEG、ADP−SA−PEG、ATP−SA−PEG、UMP−SA−PEG、UDP−SA−PEG、UTP−SA−PEG、GMP−SA−PEG、cGMP−SA−PEG、GDP−SA−PEG、GTP−SA−PEG、TMP−SA−PEG、TDP−SA−PEG及びTTP−SA−PEG、CMP−GlcNAc−PEG、CDP−GlcNAc−PEG、CTP−GlcNAc−PEG、AMP−GlcNAc−PEG、cAMP−GlcNAc−PEG、ADP−GlcNAc−PEG、ATP−GlcNAc−PEG、UMP−GlcNAc−PEG、UDP−GlcNAc−PEG、UTP−GlcNAc−PEG、GMP−GlcNAc−PEG、cGMP−GlcNAc−PEG、GDP−GlcNAc−PEG、GTP−GlcNAc−PEG、TMP−GlcNAc−PEG、TDP−GlcNAc−PEG及びTTP−GlcNAc−PEG、CMP−Gal−PEG、CDP−Gal−PEG、CTP−Gal−PEG、AMP−Gal−PEG、cAMP−Gal−PEG、ADP−Gal−PEG、ATP−Gal−PEG、UMP−Gal−PEG、UDP−Gal−PEG、UTP−Gal−PEG、GMP−Gal−PEG、cGMP−Gal−PEG、GDP−Gal−PEG、GTP−Gal−PEG、TMP−Gal−PEG、TDP−Gal−PEG及びTTP−Gal−PEG、CMP−GalNAc−PEG、CDP−GalNAc−PEG、CTP−GalNAc−PEG、AMP−GalNAc−PEG、cAMP−GalNAc−PEG、ADP−GalNAc−PEG、ATP−GalNAc−PEG、UMP−GalNAc−PEG、UDP−GalNAc−PEG、UTP−GalNAc−PEG、GMP−GalNAc−PEG、cGMP−GalNAc−PEG、GDP−GalNAc−PEG、GTP−GalNAc−PEG、TMP−GalNAc−PEG、TDP−GalNAc−PEG及びTTP−GalNAc−PEG、CMP−Glc−PEG、CDP−Glc−PEG、CTP−Glc−PEG、AMP−Glc−PEG、cAMP−Glc−PEG、ADP−Glc−PEG、ATP−Glc−PEG、UMP−Glc−PEG、UDP−Glc−PEG、UTP−Glc−PEG、GMP−Glc−PEG、cGMP−Glc−PEG、GDP−Glc−PEG、GTP−Glc−PEG、TMP−Glc−PEG、TDP−Glc−PEG及びTTP−Glc−PEG、CMP−フコース−PEG、CDP−フコース−PEG、CTP−フコース−PEG、AMP−フコース−PEG、cAMP−フコース−PEG、ADP−フコース−PEG、ATP−フコース−PEG、UMP−フコース−PEG、UDP−フコース−PEG、UTP−フコース−PEG、GMP−フコース−PEG、cGMP−フコース−PEG、GDP−フコース−PEG、GTP−フコース−PEG、TMP−フコース−PEG、TDP−フコース−PEG及びTTP−フコース−PEG、CMP−Man−PEG、CDP−Man−PEG、CTP−Man−PEG、AMP−Man−PEG、cAMP−Man−PEG、ADP−Man−PEG、ATP−Man−PEG、UMP−Man−PEG、UDP−Man−PEG、UTP−Man−PEG、GMP−Man−PEG、cGMP−Man−PEG、GDP−Man−PEG、GTP−Man−PEG、TMP−Man−PEG、TDP−Man−PEG及びTTP−Man−PEG、並びにこれらのデオキシ種を包含する。上記PEG残基のいずれも、PPG残基のような別のポリマー残基で置換することができる。
一例を挙げれば、本発明の糖ヌクレオチド又は修飾糖ヌクレオチドは、ヌクレオチドとしてシチジンを、そして糖残基としてシアル酸を包含する。特定の例では、糖ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド糖は、シチジン−モノホスホ−シアル酸(CMP−SA)を包含する。別の例では、ヌクレオチド糖はCMP−SAである。更に別の例では、修飾ヌクレオチド糖は、直鎖状又は分岐状PEG残基に共有結合したCMP−SA(CMP−SA−PEG)である。
一例を挙げれば、上記実施態様のいずれかのヌクレオチド糖は、下記:
[式中、各nは、1〜2500から独立に選択される整数である]から選択されるメンバーである。一例を挙げれば、nは、約100〜約1000、約100〜約800、約100〜約600、約100〜約500から選択される。各Qは、H、負電荷及び塩の対イオン(例えば、Na、K)から独立に選択されるメンバーである。各Q1は、H、及びC1−C6アルキル[メチル、エチル、プロピル(例えば、n−プロピル、イソプロピル)、ブチル(例えば、n−ブチル、イソブチル)、ペンチル及びヘキシルなど]から独立に選択されるメンバーである。
上記方法のいずれかの典型的な実施態様において、陰イオン交換媒体は、第4級アンモニウム樹脂及びジエチルアミノエチル(DEAE)樹脂から選択される。別の例では、陰イオン交換媒体は、セファロース樹脂(例えば、Q−セファロース)である。その他の陰イオン交換媒体は本明細書に記載されるが、その各々は本発明の方法において同等に有用である。一例を挙げれば、陰イオン交換媒体は、対イオンとして重炭酸イオンを包含する、第4級アンモニウム樹脂である。例えば、この第4級アンモニウム樹脂は、使用の前に重炭酸緩衝液(例えば、NaHCO3)で処理する。
別の例では、ヌクレオチド糖は、重炭酸緩衝液を用いて陰イオン交換媒体から溶出する。例えば、ヌクレオチド糖は、溶出緩衝液中の重炭酸濃度が約0mMから約1M重炭酸(例えば、NaHCO3)まで上昇する、段階的溶出プロトコール又は勾配を用いて溶出する。典型的には、PEG修飾ヌクレオチド糖(例えば、CMP−SA−PEG)は、修飾ヌクレオチド糖を生成するのに利用されるカップリング反応のよくある副産物である、対応する修飾糖(例えば、SA−PEG)に近接して溶出する。予期しないことに、本発明者らは、ヌクレオチド糖が、低濃度の重炭酸又は緩徐な勾配(約0.01mM〜約30mMの間の重炭酸を含む)を用いて対応する修飾糖から分離できることを発見した。よって一例を挙げれば、ヌクレオチド糖は、約0.01mM〜50mMの間、約0.01mM〜30mMの間、約0.01mM〜20mMの間又は約0.01mM〜10mMの間の重炭酸濃度を包含する重炭酸緩衝液を用いて陰イオン交換媒体から溶出する。反応混合物の他の混入物(例えば、ヌクレオシド、非修飾ヌクレオチド糖)は、典型的には約30又は50mMより高い重炭酸濃度で溶出する。
別の典型的な実施態様において、陰イオン交換カラムに装填した(即ち、陰イオン交換媒体と接触させた)反応混合物(陰イオン交換供給溶液)は、約10mS/cm未満、約8mS/cm未満、約6mS/cm未満、約5mS/cm未満、約4mS/cm未満、約3mS/cm未満又は約2mS/cm未満の塩導電率を有する。一例を挙げれば、陰イオン交換カラムに装填した反応混合物は、約1mS/cm未満、約0.8、0.6、0.4又は0.2mS/cm未満の塩導電率を有する。反応混合物の塩導電率は、陰イオン交換クロマトグラフィーの前に、例えば、反応混合物を水で希釈することにより調整できる。
上記実施態様のいずれかの一例を挙げれば、工程(iii)の脱塩は、限外濾過のように膜濾過を用いて達成される。例えば、脱塩は、接線流濾過(TFF)を用いて達成される。脱塩に有用な限外濾過膜は当該分野において知られている。典型的な膜は本明細書に記載される。一例を挙げれば、この限外濾過膜は、ヌクレオチド糖の分子量より小さいMWCOを有する。よって、ヌクレオチド糖は膜により保持されるが、一方塩イオンは膜フィルターを通り抜けることができる。例えば、ヌクレオチド糖溶液の脱塩に使用される限外濾過膜は、約100kDa未満、約80kDa未満、約60kDa未満、約40kDa未満又は約20kDa未満の分子量カットオフを有する。特定の例では、限外濾過膜は、約10kDa未満の分子量カットオフを有する。約10kDa〜60kDaの間のPEG残基を持つCMP−SA−PEG類を脱塩するのに使用される限外濾過膜は、典型的には約1kDa〜約5kDaの間の分子量カットオフを有する。
一例を挙げれば、上記の脱塩工程(例えば、限外濾過のような膜濾過を含む)により、膜濾過前の塩導電率に比較してヌクレオチド糖溶液(例えば、溶出画分)の塩導電率は低下する。例えば、膜濾過後の低下した溶出画分の塩導電率は、約1μS/cm〜約1000μS/cmの間である。特定の例では、膜濾過後の溶出画分の塩導電率は、約1μS/cm〜約600μS/cmの間、約1μS/cm〜約400μS/cmの間、約1μS/cm〜約200μS/cmの間、約10μS/cm〜約100μS/cmの間、約10μS/cm〜約80μS/cmの間、約10μS/cm〜約60μS/cmの間、約10μS/cm〜約40μS/cmの間、約10μS/cm〜約20μS/cmの間又は約1μS/cm〜約10μS/cmの間である。好ましい例では、膜濾過中の塩導電率は、約400μS/cm未満、約300μS/cm未満、約200μS/cm未満、約100μS/cm未満、約80μS/cm未満、約60μS/cm未満、約50μS/cm未満、約40μS/cm未満、約30μS/cm未満、約20μS/cm未満、約10μS/cm未満、約8μS/cm未満、約6μS/cm未満、約4μS/cm未満、約2μS/cm未満又は約1μS/cm未満まで低下する。
一例を挙げれば、溶出画分又は精製修飾ヌクレオチド糖溶液の最終容量を減少させるために限外濾過(例えば、TFF)が利用される。
特定の例では、本発明は、修飾シチジン−一リン酸−シアル酸(CMP−SA)ヌクレオチドの製造方法を提供する。本発明の方法を用いて製造することができる、典型的な修飾ヌクレオチド糖は、CMP−SA−PEG−10kDa、CMP−SA−PEG−20kDa及びCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaを包含する。典型的な修飾ヌクレオチド糖類(CMP−SA−PEG)は図2に示される。
上記実施態様のいずれかの一例を挙げれば、本発明の方法により製造されるヌクレオチド糖(例えば、CMP−SA−PEG)は、少なくとも約50%(w/w)、少なくとも約60%(w/w)、少なくとも約70%(w/w)、少なくとも約80%(w/w)、少なくとも約85%(w/w)、少なくとも約90%(w/w)又は少なくとも約95%(w/w)の純度を有する。特定の例では、本発明の方法により製造されるヌクレオチド糖は、約50%〜約100%(w/w)の間、約60%〜約100%(w/w)の間、約80%〜約100%(w/w)の間又は約90%〜約100%(w/w)の間の純度を有する。別の例では、本発明の方法により製造されるヌクレオチド糖は、約96%〜約100%(w/w)の間、約97%〜約100%(w/w)の間、約98%〜約100%(w/w)の間又は約99%〜約100%(w/w)の間の純度を有する。
1つの実施態様において、本発明の製造法は、他の反応成分からヌクレオチド糖を精製するために利用される。CMP−SA−PEG類の場合には、反応混合物は、例えば、mPEG−p−ニトロフェニルカーボネートの加水分解中に生成する、例えば、mPEG−OH及びp−ニトロフェノール(PNP)を含有しうる。この反応混合物は更に、例えば、CMP−SAグリシン及び/又はCMP−SA−PEGの加水分解を介して生成する、CMPを包含することができる。反応混合物は更に、例えば、CMP−SA−PEGの加水分解により生成する、SA−PEG、更には塩類を包含することができる(図3)。
1つの実施態様において、本発明の方法は、CMP−SA−PEGに比較して約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満又は約1%未満のCMP(w/w)を包含する、CMP−SA−PEG生成物を提供する。別の実施態様において、本発明の方法は、CMP−SA−PEGに比較して約0.9%未満、約0.8%未満、約0.7%未満、約0.6%未満、約0.5%未満、約0.4%未満、約0.3%未満又は約0.2%未満のCMP(w/w)を包含する、CMP−SA−PEGを提供する。
別の実施態様において、本発明の方法は、CMP−SA−PEGに比較して約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満又は約1%未満のSA−PEG(w/w)を包含する、CMP−SA−PEG生成物を提供する。別の実施態様において、本発明の方法は、CMP−SA−PEGに比較して約0.9%未満、約0.8%未満、約0.7%未満、約0.6%未満、約0.5%未満、約0.4%未満、約0.3%未満又は約0.2%未満のSA−PEG(w/w)を包含する、CMP−SA−PEGを提供する。
別の実施態様において、本発明の方法は、CMP−SA−PEGに比較して約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満又は約1%未満のmPEG−OH(w/w)を包含する、CMP−SA−PEG生成物を提供する。別の実施態様において、本発明の方法は、CMP−SA−PEGに比較して約0.9%未満、約0.8%未満、約0.7%未満、約0.6%未満、約0.5%未満、約0.4%未満、約0.3%未満又は約0.2%未満のmPEG−OH(w/w)を包含する、CMP−SA−PEGを提供する。
別の実施態様において、本発明の方法は、CMP−SA−PEGに比較して約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満又は約1%未満のp−ニトロフェノール(w/w)を包含する、CMP−SA−PEG生成物を提供する。別の実施態様において、本発明の方法は、CMP−SA−PEGに比較して約0.9%未満、約0.8%未満、約0.7%未満、約0.6%未満、約0.5%未満、約0.4%未満、約0.3%未満又は約0.2%未満のp−ニトロフェノール(w/w)を包含する、CMP−SA−PEGを提供する。
別の実施態様において、本発明の方法は、CMP−SA−PEGに比較して約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満又は約1%未満のp−ニトロフェノール(w/w)を包含する、CMP−SA−PEG生成物を提供する。別の実施態様において、本発明の方法は、CMP−SA−PEGに比較して約0.9%未満、約0.8%未満、約0.7%未満、約0.6%未満、約0.5%未満、約0.4%未満、約0.3%未満又は約0.2%未満のp−ニトロフェノール(w/w)を包含する、CMP−SA−PEGを提供する。
上記実施態様のいずれかによる別の例では、本発明の方法により製造されるヌクレオチド糖は、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%又は少なくとも約95%の総収率で得られる。特定の例では、本発明の方法により製造されるヌクレオチド糖は、約50%〜約100%の間、約60%〜約95%の間、約80%〜約95%の間又は約90%〜約95%の間の総収率で得られる。別の例では、本発明の方法により製造されるヌクレオチド糖は、約40%〜約90%の間、約50%〜約90%の間、約60%〜約90%の間、約70%〜約90%の間、約80%〜約90%の間、約85%〜約90%(w/w)の間又は約85%〜約95%の間の総収率で得られる。
典型的な実施態様において、本発明の方法により精製された修飾ヌクレオチド糖は、1種以上のポリマー、例えば、分岐ポリマーに結合した糖、活性化糖又はヌクレオチド糖を包含する。典型的なポリマーは、水溶性及び水不溶性種の両方を包含する。
典型的な修飾ヌクレオチド糖は、ヌクレオチド糖の糖残基内の任意の位置でポリマー修飾基で置換されている。典型的な実施態様において、糖は、C−1、C−2、C−3、C−4又はC−5の1箇所以上が、リンカー又はリンカーにより結合されたポリマー修飾基で置換されている。別の実施態様において、本発明は、C−1、C−2、C−3、C−4、C−5又はC−6の1箇所以上が、リンカー又はリンカーにより糖に結合した修飾基で置換されているピラノースを提供する。好ましくは、リンカー及び/又は修飾基は、糖の炭素から、酸素、窒素又は硫黄ペンダントに直接結合している。
本発明の好ましい実施態様において、ポリマーリンカー又は修飾基は、生じる複合体が、修飾糖残基を別の種、例えば、ペプチド、グリコペプチド、脂質、糖脂質などに連結するために使用される酵素の基質として機能するように選択される位置に付加される。典型的な酵素は、当該分野において知られており、そしてグリコシルトランスフェラーゼ(シアリルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコシルトランスフェラーゼ、N−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼなど)を包含する。典型的な本発明の糖ヌクレオチド及び活性化糖複合体はまた、加水分解活性よりも合成活性を持つように修飾された変異体グリコシダーゼ及び変異体グリコセラミダーゼのための基質をも包含する。
典型的な実施態様において、本発明の方法により精製されるヌクレオチド糖は、下記式(I)及び(II):
から選択される式を有する。式(I)及び(II)において、R1は、H、CH2OR7、COOR7又はOR7であり、そしてここで、R7は、H、置換若しくは非置換アルキル又は置換若しくは非置換ヘテロアルキルを表す。R2は、H、OH、NH又はヌクレオチドを包含する残基である。本実施態様の典型的なR2種は、下記式:
R3、R4、R5、R6及びR6’という記号は、H、置換又は非置換アルキル、OR9、NHC(O)R10を表す。dという指数は、0又は1である。R9及びR10は、H、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル又はシアル酸から独立に選択される。R3、R4、R5、R6、及びR6’の少なくとも1つは、リンカー又はリンカー−修飾基、例えば、PEGを包含する。典型的な実施態様において、R6及びR6’は、これらが結合している炭素と一緒に、シアル酸の側鎖の構成要素である。更に別の典型的な実施態様において、この側鎖は、C−6、C−7又はC−9の1箇所以上が、リンカー又はリンカー−修飾残基で修飾されている。
典型的な実施態様において、リンカーアームは、wが0であるとき後述の構造を有し、そしてwが0より大きいとき、修飾基が下記式:
[式中、R11は、ポリマー残基であり、そしてLは、結合及び連結基から選択され、そしてwは、1〜6、好ましくは1〜3そして更に好ましくは1〜2の整数である]で示されるリンカーによって糖コアに繋がっている。
Lが、結合であるとき、これはR11の前駆体上の反応性官能基とLの前駆体上の相補的反応性の反応性官能基との間に形成される。本明細書に説明されるように、適切な反応性官能基を持つ前駆体の選択及び調製は当業者の能力の及ぶ範囲内である。更に、前駆体の化合は、当該分野において周知の化学により進行する。
典型的な実施態様において、Lは、アミノ酸、アミノ酸擬態物質、又は小ペプチド(例えば、1〜4個のアミノ酸残基)から生成する連結基であり、修飾糖を与える。別の実施態様において、修飾基はリンカーにより結合している(例えば、ポリマー修飾残基は置換アルキルリンカーにより結合している)。リンカーは、アミノ酸のアミン残基及びカルボン酸(又は反応性誘導体、例えば、活性エステル、酸ハロゲン化物など)と、L及びR11への前駆体上の相補的反応性の基との反応により生成する。複合体の要素は、本質的に任意の便利な順序で複合体化することができる。例えば、Lへの前駆体は、糖類コア上に配置して、次にR11の前駆体及びLを複合体化することができる。あるいは、L上に反応性官能基を有するR11−Lカセットを調製し、次いでこの種の上の相補的反応性の反応性官能基により糖類に連結することができる。
典型的な実施態様において、リンカー及び/又は修飾残基は、R3及び/又はR6である。別の典型的な実施態様において、R3及び/又はR6は、ポリマー修飾残基と、ポリマー残基を分子の残りの部分に繋げるリンカーLの両方を包含する。別の典型的な実施態様において、修飾残基はR3である。更に別の典型的な実施態様において、R3は、修飾基と、修飾基を分子の残りの部分に繋げるリンカーLの両方を包含する。糖がシアル酸である、また別の典型的な実施態様において、リンカー及び/又は修飾基は、R5にあるか、又はシアル酸側鎖、例えば、C−9の位置に結合している。
典型的な実施態様において、本発明は、水溶性又は水不溶性ポリマーのような直鎖状ポリマーの間に生成する、糖若しくは活性化糖複合体、又はヌクレオチド糖複合体の精製方法を提供する。これらの複合体において、ポリマーは、糖、活性化糖又は糖ヌクレオチドに結合している。本明細書に考察されるように、ポリマーは、直接か又はリンカーを介するかのいずれかで糖残基に連結されている。
本実施態様による典型的な化合物は、式(I)又は(II)の構造を有するが、ここで、R1、R3、R4、R5又はR6の少なくとも1つは、下記式:
を有する。R11は、存在するか又は存在しない。本実施態様において、典型的なリンカーは、天然又は非天然アミノ酸、アミノ酸類縁体若しくはアミノ酸擬態物質、又は1種以上のこのような種から生成する小ペプチドに由来する。例えば、本発明の方法により精製される化合物に見い出される、ある分岐ポリマーは、下記式:
Xaは、分岐ポリマー修飾残基の前駆体上の反応性官能基と、糖残基、又はリンカーへの前駆体との反応により生成する、連結残基である。例えば、X3’が、カルボン酸であるとき、これを活性化して、アミノ−糖類(例えば、GalNH2、GlcNH2、ManNH2など)からのアミン基ペンダントに直接結合することができる。更なる典型的な反応性官能基及び活性化前駆体は本明細書に後述される。cという指数は、1〜10の整数を表す。他の記号は、上述のものと同じ同一性を持つ。
別の典型的な実施態様において、Xaは、別のリンカーと一緒に形成される連結残基である:
Xa及びXbに典型的な種は、S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、OCNH及びNHC(O)O、及びOC(O)NHを包含する。
本実施態様による別の例は、下記式:
修飾基がPEG残基であるとき、このPEG残基は、本発明において有用な、任意の分子量、例えば、2kDa、5kDa、10kDa、20kDa、30kDa及び40kDaを有することができる。
典型的なヌクレオシドは、AMP、UMP、GMP、CMP、TMP、ADP、UDP、GDP、CDP、TDP、ATP、UTP、GTP、CTP、TTP、cAMP及びcGMPを包含する。
好ましい実施態様において、本発明の方法により精製される糖は、リンカー基で修飾されたシアル酸を包含する。このような修飾に好ましい部位は、R5、R6又はR6’である。よって好ましい実施態様において、R1及びR2の少なくとも一方はリンカーを含む。典型的なリンカーは、グリシルリンカーである。
別の好ましい実施態様において、本明細書に説明される方法により精製されるヌクレオチド糖は、下記式:
1つの実施態様において、修飾シアル酸(ヌクレオチド糖誘導体)は、下記構造を有する:
更に別の実施態様において、修飾基は、リンカーによりシアル酸に結合している。この記述による典型的な種は、リンカーの第1級アミノ基により結合している修飾基を包含する。典型的な修飾基は、ポリ(エチレングリコール)及びポリ(プロピレングリコール)のような、水溶性ポリマーである。
別の実施態様において、本発明の方法により製造されるヌクレオチド糖は、下記式:
で示される基は、リンカー−修飾基である]を有する。sという指数は、1〜20から選択される整数である。fという指数は、1〜2500から選択される整数である。Qは、H及び置換又は非置換C1−C6アルキルから選択されるメンバーである。
本発明の修飾ヌクレオチド糖において修飾基として包含される典型的なPEG残基は、特に限定されないが、下記式:
[式中、Laは、結合、置換又は非置換アルキル及び置換又は非置換ヘテロアルキルから選択されるリンカーである]で示される基を包含する。X5、R16及びR17という記号は、ポリマー残基及び非反応性基を独立に表す。X2及びX4は、ポリマー残基のR16及びR17をCに結合する、選択結合断片を独立に表す。m及びnという指数は、0〜5000から独立に選択される整数である。
A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10及びA11という記号は、H、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリール、−NA12A13、−OA12又は−SiA12A13を独立に表す。A12及びA13は、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アリール、及び置換又は非置換ヘテロアリールから独立に選択されるメンバーである。
X2及びX4の典型的な結合断片は、CH2、S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH及びNHC(O)O、及びOC(O)NH、CH2S、CH2O、CH2CH2O、CH2CH2S、(CH2)aO、(CH2)aS又は(CH2)aY’−PEG又は(CH2)aY’−PEG[ここで、Y’は、S又はOであり、そしてaは、1〜50の整数である]を包含する。
典型的な実施態様において、ポリマー修飾基は、下記式:
上記式の別の典型的な実施態様において、ポリマー修飾基は、下記式:
本実施態様による典型的なリンカー−ポリマー修飾基は、下記式:
本発明において有用な直鎖状及び分岐状ポリマー、例えば、PEGの更に別の特定の実施態様は、下記式:
で示されるような、これらの種の炭酸及び活性エステルは、直鎖状及び分岐状ポリマー種、これらの種のリンカーアーム複合体並びにこれらの化合物と糖及びヌクレオチド糖との間の複合体を生成するのに使用することができる。
本明細書に説明される化合物の調製に有用な直鎖状PEG類を活性化するのに適切な、他の典型的な活性化基又は脱離基は、特に限定されないが、下記式:
これらや他の種で活性化されるPEG分子、及び活性化PEG類の製造方法は、WO 04/083259に説明されている。
典型的な実施態様において、分岐ポリマーは、システイン、セリン、リシン、ジ−又はトリ−リシンコアに基づくPEGである。よって、更に別の典型的な分岐PEGは、下記式:
また別の実施態様において、分岐PEG残基は、トリ−リシンペプチドに基づく。このトリ−リシンは、モノ−、ジ−、トリ−、又はテトラ−PEG化することができる。本実施態様による典型的な種は、下記式:
本発明の典型的な実施態様において、PEGは、m−PEG(5kDa、10kDa、又は20kDa)である。典型的な分岐PEG種は、セリン−又はシステイン−(m−PEG)2(ここで、m−PEGは、20kDa m−PEGである)である。
当業者には明らかになるように、本発明に有用な分岐ポリマーは、上述のテーマに沿った変種を包含する。例えば、上記のジ−リシン−PEG複合体は、3つのポリマーサブユニット(三番目は上記構造中に非修飾として示されるα−アミンに結合している)を包含することができる。同様に、3又は4つのポリマーサブユニットで官能基化されたトリ−リシンの使用は本発明の範囲に含まれる。
当業者であれば、分岐ポリマーのm−PEGアームの1つ以上を、様々な末端、例えば、OH、COOH、NH2、C2−C10−アルキルなどを持つPEG残基により置換できることは正しく理解するだろう。更に、上記構造は、α−炭素原子と側鎖の官能基との間のアルキルリンカーの挿入(又は炭素原子の脱離)により容易に修飾される。即ち、「ホモ」誘導体及び高級同族体、更には低級同族体は、本発明において有用な分岐PEG類のコアの範囲に含まれる。
典型的な実施態様において、Laは、リンカーアーム、例えば、グリシルリンカーの遊離アミン残基に、アミン、アミド又はウレタン結合により結合している。
別の典型的な実施態様において、PEGは直鎖状PEGである。分岐PEG種と同様に、直鎖状PEGは、リンカーアームのアミン残基に、アミン、アミド又はウレタン連鎖により結合することができる。
本発明の好ましい実施態様において、上述の糖類は、そのヌクレオシド類縁体、リンカーアームを包含する誘導体、修飾基が糖類の糖残基に直接又はリンカーにより結合した類似体、及びこれらのモチーフ各々のヌクレオチド付加物に変換される。
修飾ヌクレオチド糖の生成
上記実施態様のいずれかによる別の例では、本方法は更に以下を包含する:(vi)修飾ヌクレオチド糖を生成すること。一例を挙げれば、修飾ヌクレオチド糖は、反応性官能基(例えば、第1級アミノ基)を包含するヌクレオチド糖誘導体を、活性化ポリマー試薬、例えば、活性化ポリ(アルキレンオキシド)試薬と接触させることにより生成する。このポリマー試薬は、活性化エステル残基(例えば、NHS−エステル)、酸塩化物基又は活性化カーボネート(例えば、p−ニトロフェニルカーボネート)残基を組み込むことにより活性化することができる。典型的な活性化ポリマー試薬は、p−ニトロフェニル残基を包含する。当業者であれば、2つの反応相手を複合体化するのに適切な任意のカップリング反応を利用して、ヌクレオチド糖を修飾基に共有結合させることができることは正しく理解するだろう。「ヌクレオチド糖誘導体」という用語は、ポリマー修飾基上の別の反応性官能基との共有結合を形成するのに有用な反応性官能基を取り込んでいる、任意のヌクレオチド糖である。典型的な反応性官能基基は、アミノ基、ヒドロキシル基及びスルフヒドリル基のような求核性基を包含する。典型的な求電子性反応性官能基は、活性化エステル、p−ニトロフェニルカーボネート、酸塩化物などを包含する。
上記実施態様のいずれかによる別の例では、本方法は更に以下を包含する:(vi)修飾ヌクレオチド糖を生成すること。一例を挙げれば、修飾ヌクレオチド糖は、反応性官能基(例えば、第1級アミノ基)を包含するヌクレオチド糖誘導体を、活性化ポリマー試薬、例えば、活性化ポリ(アルキレンオキシド)試薬と接触させることにより生成する。このポリマー試薬は、活性化エステル残基(例えば、NHS−エステル)、酸塩化物基又は活性化カーボネート(例えば、p−ニトロフェニルカーボネート)残基を組み込むことにより活性化することができる。典型的な活性化ポリマー試薬は、p−ニトロフェニル残基を包含する。当業者であれば、2つの反応相手を複合体化するのに適切な任意のカップリング反応を利用して、ヌクレオチド糖を修飾基に共有結合させることができることは正しく理解するだろう。「ヌクレオチド糖誘導体」という用語は、ポリマー修飾基上の別の反応性官能基との共有結合を形成するのに有用な反応性官能基を取り込んでいる、任意のヌクレオチド糖である。典型的な反応性官能基基は、アミノ基、ヒドロキシル基及びスルフヒドリル基のような求核性基を包含する。典型的な求電子性反応性官能基は、活性化エステル、p−ニトロフェニルカーボネート、酸塩化物などを包含する。
一例を挙げれば、修飾ヌクレオチド糖は、第1級アミノ基を包含するヌクレオチド糖誘導体を、活性化ポリ(アルキレンオキシド)残基と、ヌクレオチド糖誘導体のアミノ基とポリ(アルキレンオキシド)残基との間に共有結合を生成させるのに十分な条件下で接触させることにより生成する。一例を挙げれば、ヌクレオチド糖誘導体は、グリシン残基に共有結合したヌクレオチド糖である。別の例では、ヌクレオチド糖誘導体は、CMP−SA−グリシン、AMP−SA−グリシン、UMP−SA−グリシン、GMP−SA−グリシン、CMP−SA−グリシン、TMP−SA−グリシン、ADP−SA−グリシン、UDP−SA−グリシン、GDP−SA−グリシン、CDP−SA−グリシン、TDP−SA−グリシン、ATP−SA−グリシン、UTP−SA−グリシン、GTP−SA−グリシン、CTP−SA−グリシン、TTP−SA−グリシン、cAMP−SA−グリシン及びcGMP−SA−グリシンから選択されるが、ここでシアル酸残基(SA)は、場合により別の糖残基(例えば、Glc、GlcNAc、Gal、GalNAc、フコース、マンノース、キシロース)で置換されているか、かつ/又はグリシン残基は、場合により別のリンカー残基で置換されて反応性官能基を与える。
一例を挙げれば、本発明の方法に使用されるヌクレオチド糖誘導体は、ヌクレオチド及び糖から、グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、シアリルトランスフェラーゼ)のような酵素の存在下で酵素的に合成される。ヌクレオチド糖誘導体の典型的な合成及び精製方法、並びに典型的な酵素は、11月3日出願のWO 2007/056191に開示されており、この開示はその全体が本明細書に取り込まれる。
上記実施態様のいずれかによる一例を挙げれば、第1級アミノ基、及びp−ニトロフェニルカーボネート残基を包含する活性化ポリマー残基(例えば、ポリ(エチレングリコール)−p−ニトロフェニルカーボネート)を包含する、ヌクレオチド糖誘導体は、約8.0〜9.0の間、8.0〜約8.9の間又は約8.0〜約8.8の間のpHを有する水性溶媒の存在下で接触させる。
予期しないことに、本発明者らは、水性溶媒系中の約8.0〜約8.8の間のpH範囲が、PEG−p−ニトロフェニルカーボネート(例えば、mPEG−p−ニトロフェニル)のようなp−ニトロフェニル(pNP)カーボネート残基を包含する活性化ポリマー修飾基と、ヌクレオチド糖誘導体(例えば、CMP−SA−グリシン)との間のカップリング反応進行中に決定的であることを発見した。最適化pH範囲(pH7.0以上)では、反応相手及び生成物の加水分解による副産物の生成が大きく減少し、そして最終生成物の収率及び純度が有意に増大する。例えば、pH7.0未満では、CMP−SA−グリシン及びCMP−SA−PEGは加水分解により分解して、CMP、シアル酸−グリシン及びシアル酸−PEGが生成した。典型的な分解産物は図3に示される。反応混合物の約8.0〜約8.8の間の初期pH(例えば、約8.6〜約8.7)が、最高変換収率を達成するのに決定的であった。本プロセスを通じての最適pH範囲は、約8.0〜約8.8の間であった。pHが8.0未満に落ちると、本反応は劇的に進行が遅くなり変換収率が悪化した。
例えば、CMP−SA−PEG類(例えば、CMP−SA−PEG−10kDa、CMP−SA−PEG−20kDa及びCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDa)は、CMP−SA−グリシン(GSC)を、p−ニトロフェニルカーボネート残基を取り込んでいるPEG試薬(例えば、直鎖状又は分岐状の10kDa、20kDa、40kDa、60kDa、80kDa、100kDa分子量のPEG試薬)と反応させることにより調製することができる。本実施態様による典型的な合成経路は図2に略述される。本発明は、CMP−SA−PEGが既知プロセスよりも高い純度及び良好な全収率で得られる改善法を提供する。
陰イオン交換クロマトグラフィー
典型的な実施態様において、目的のヌクレオチド糖を含有する試料を、ヌクレオチド糖がカラムから溶出するであろう濃度未満の塩濃度を含むローディング液に入れて陰イオン交換体に装填する。一例を挙げれば、緩衝液のpHは、ヌクレオチド糖が陰イオン交換媒体上に保持されるように選択する。緩衝液のpHを変化させると、ヌクレオチド糖の電荷が変わり、そしてpH値を低下させると、陰イオン交換体での保持時間が短くなる。あるいは、陰イオン交換条件は、不純物を優先的に結合するように選択し、一方精製ペプチドは流出液中に見い出される。
典型的な実施態様において、目的のヌクレオチド糖を含有する試料を、ヌクレオチド糖がカラムから溶出するであろう濃度未満の塩濃度を含むローディング液に入れて陰イオン交換体に装填する。一例を挙げれば、緩衝液のpHは、ヌクレオチド糖が陰イオン交換媒体上に保持されるように選択する。緩衝液のpHを変化させると、ヌクレオチド糖の電荷が変わり、そしてpH値を低下させると、陰イオン交換体での保持時間が短くなる。あるいは、陰イオン交換条件は、不純物を優先的に結合するように選択し、一方精製ペプチドは流出液中に見い出される。
カラムは、非結合物質及び/又は樹脂に弱く結合している物質を除去するために、数カラム容量(CV)の緩衝液で洗浄することができる。次に、例えば、従来法による重炭酸勾配を用いて、カラムから画分を溶出させる。溶液中の塩は、カラムへの結合においてヌクレオチド糖と競合し、そしてヌクレオチド糖が放出される。イオン相互作用が弱い成分は、イオン相互作用が強い成分よりも低い塩濃度で溶出する。試料画分をカラムから採取する。高レベルの所望のヌクレオチド糖及び低レベルの不純物を含有する画分を集めるか、又は別々に処理する。
陰イオン交換媒体は当業者には知られている。典型的な陰イオン交換媒体は、例えば、Protein Purification Methods, A Practical Approach, Ed. Harris ELV, Angal S, IRL Press Oxford, England (1989); Protein Purification, Ed. Janson JC, Ryden L, VCH-Verlag, Weinheim, Germany (1989); Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceutical Industry, Ed. Shukla AA, Etzel MR, Gadam S, CRC Press Taylor & Francis Group (2007), pages 188-196; Protein Purification Handbook, GE Healthcare 2007 (18-1132-29)及びProtein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications (2ndEdition 1998), Ed. Janson J-C and Ryden Lに記載されているが、これらの開示は、引用例としてその全体が本明細書に取り込まれる。本発明の典型的な陰イオン交換体は、第4級アンモニウム樹脂及びDEAE樹脂から選択される。1つの実施態様において、陰イオン交換体は第4級アンモニウム樹脂(例えば、Mustang Qイオン交換膜、Pall Corporation)である。他の有用な樹脂は、QXL、Capto及びBigBeads樹脂を包含する。一例を挙げれば、陰イオン交換体はSartobind Qである。
典型的な陰イオン交換媒体及び典型的な製造法が以下に要約される:
GE Healthcare:
Q-Sepharose FF
Q-Sepharose BB
Q-Sepharose XL
Q-Sepharose HP
Mini Q
Mono Q
Mono P
DEAE Sepharose FF
Source 15Q
Source 3OQ
Capto Q
ANX Sepharose 4 FF (high sub)
Streamline DEAE
Streamline QXL
Applied Biosystems:
Poros HQ 10及び20μmセルフパック(self pack)
Poros HQ 20及び50μmバルク媒体
Poros PI 20及び50μm
Poros D 50μm
Tosohaas:
Toyopearl DEAE 650S, M及びC
Super Q 650
QAE 550C
Pall Corporation:
DEAE Hyper D
Q Ceramic Hyper D
Mustang Q膜吸収体
Merck KGgA:
Fractogel DMAE
FractoPrep DEAE
Fractoprep TMAE
Fractogel EMD DEAE
Fractogel EMD TMAE
Sartorious:
Sartobind Q膜吸収体
GE Healthcare:
Q-Sepharose FF
Q-Sepharose BB
Q-Sepharose XL
Q-Sepharose HP
Mini Q
Mono Q
Mono P
DEAE Sepharose FF
Source 15Q
Source 3OQ
Capto Q
ANX Sepharose 4 FF (high sub)
Streamline DEAE
Streamline QXL
Applied Biosystems:
Poros HQ 10及び20μmセルフパック(self pack)
Poros HQ 20及び50μmバルク媒体
Poros PI 20及び50μm
Poros D 50μm
Tosohaas:
Toyopearl DEAE 650S, M及びC
Super Q 650
QAE 550C
Pall Corporation:
DEAE Hyper D
Q Ceramic Hyper D
Mustang Q膜吸収体
Merck KGgA:
Fractogel DMAE
FractoPrep DEAE
Fractoprep TMAE
Fractogel EMD DEAE
Fractogel EMD TMAE
Sartorious:
Sartobind Q膜吸収体
本発明の方法において使用される陰イオン交換体は、場合により、クロマトグラフィー樹脂又は支持体よりはむしろ膜吸着体である。この膜吸着体は、場合により使い捨てできる。
脱塩
1つの実施態様において、目的のヌクレオチド糖を含有する混合物は、陰イオン交換クロマトグラフィーの後に脱塩する。
1つの実施態様において、目的のヌクレオチド糖を含有する混合物は、陰イオン交換クロマトグラフィーの後に脱塩する。
ヌクレオチド糖溶液の脱塩は、膜が目的のヌクレオチド糖よりも小さいMWCOを有する膜フィルターを用いて達成される。ヌクレオチド糖は保持液(retentate)中に見い出され、そして最適な緩衝液(例えば、水)中に再構成される。ヌクレオチド糖の脱塩に使用される膜のMWCOは、膜の細孔によるヌクレオチド糖の漏出を回避するために比較的小さくなければならない。例えば、限外濾過膜のMWCOは、約1kDa〜10kDaの間である(例えば、約5kDaの細孔径)。
1つの実施態様において、ヌクレオチド糖の脱塩は、サイズ排除クロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過)を用いて達成される。この手法では、サイズに基づいて分子を分離する。典型的には、高分子量成分は、そのサイズによってビーズ細孔に入れないため、低分子よりも容易にカラムを移動できる。したがって、低分子量成分は、カラムを通り抜けるのに時間がかかる。即ち、不要な塩のような低分子量物質は、目的のヌクレオチド糖から分離することができる。
典型的な実施態様において、カラム材料は、デキストラン、アガロース、及びポリアクリルアミドゲル(ここで、ゲルは、様々な粒子径を特徴とする)から選択される。別の典型的な実施態様において、この材料は、硬質、親水性サイズ排除材料から選択される。本発明の典型的なゲル濾過樹脂は、Sepharose G-25樹脂(GE Healthcare)である。
典型的な実施態様において、脱塩は、陰イオン交換クロマトグラフィー後(例えば、Q-Sepharoseクロマトグラフィー後)に実行される。
本発明の方法によりヌクレオチド糖を精製するために、所望の炭水化物を、炭水化物を精製すべき溶液の不要な成分(混入物)から分離するのに適切な膜が選択される。膜の選択における目的は、特定の応用のために、分子量カットオフ(MWCO)、膜組成、透過率、及び阻止特性、即ち、他の種、例えば、塩や他の一般に小さいか又は反対に荷電した分子は通り抜けられるが、特定の分子は保持する膜の全能力を最適化することである。成分iの保持パーセント(Ri)は、式:Ri=(1−Cip/Cir)×100%[式中、Cipは、透過液中の成分iの濃度であり、そしてCirは、保持液中の成分iの濃度である(両方とも重量パーセントで表される)]により与えられる。ある成分の保持パーセントはまた、保持特性又は膜阻止係数とも呼ばれる。
典型的な実施態様において、目的のヌクレオチド糖の除去比が、そこからの分離が望まれる化合物の除去比に比較して高い膜が選ばれる。ある膜が、第1の化合物に対する除去比が、第2の化合物に比較して高いならば、その膜を通り抜ける透過溶液中の第1の化合物の濃度は、第2の化合物の濃度に比較して減少している。逆に、保持液中では第1の化合物の濃度は、第2の化合物の濃度に比較して増大している。ある膜が、ある化合物を阻止しないならば、透過液及び阻止部分の両方でその化合物の濃度は、供給溶液中と同じで本質的に変わらない。また、透過液中のある化合物の濃度が、供給溶液中のその化合物の濃度より大きくなるならば、膜が、その化合物に対する負の除去率を持つことも可能である。膜技術の一般的な総説は、"Membranes and Membrane Separation Processes," in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (VCH, 1990)に見い出される;また、Noble and Stern, Membrane Separations Technology: Principles and Applications (Elsevier, 1995)も参照のこと。
出発点として、一般には、供給流中に存在する不要な化合物は膜を通り抜けられるが、所望の化合物を保持することが期待される、分子量カットオフ(MWCO、しばしば膜細孔径に関連する)を有する膜を選択する。所望のMWCOは、一般に精製される化合物の分子量よりも小さく、そして典型的には、精製される化合物を含有する溶液から除去すべき不要な混入物の分子量より大きい。例えば、200Daの分子量を有する化合物を精製するには、MWCOが約200Daより小さい膜を選ぶであろう。例えば、100DaのMWCOを持つ膜もまた適切な候補であろう。本発明に利用できる膜は、ある程度そのMWCOに基づいて、所望の分離法に応じて、限外濾過(UF)膜、ナノ濾過(NF)膜、又は逆浸透(RO)膜として分類される。本発明の目的には、UF、NF、及びRO膜が、Pure Water Handbook, Osmonics, Inc.(Minnetonka MN)に定義されるように分類される。RO膜は、典型的には約200Daより小さい表示MWCOを有しており大部分のイオンを阻止し、NF膜は、一般に約150Da〜約5kDaの間の表示MWCOを有し、そしてUF膜は、一般に約1kDa〜約300kDa(このようなMWCO範囲は糖類様の分子を想定する)の間の表示MWCOを有する。ヌクレオチド糖PEG複合体を精製するのに有用な本発明の好ましい限外濾過膜は、19Kdの分子量カットオフを有する。
特定の分離法に適切な膜を選ぶのに考えられる第2のパラメーターは、膜のポリマータイプである。本発明に有用な典型的な膜は、無機、有機、又は無機と有機との混合であろうと従来の膜材料から製造される。典型的な無機材料は、ガラス、セラミック、サーメット、金属などを包含する。UF帯域に好ましいセラミック膜は、例えば、Asaedaらの米国特許第4,692,354号、Alaryらの第4,562,021号などに記載されるように製造することができる。NF及びRO応用に好ましい有機材料は、典型的には、等方性であろうと、異方性であろうと、繊維の内腔(bore)側又は外殻(shell)側のいずれかに薄層又は「皮膚」を持つポリマーである。繊維に好ましい材料は、米国特許第4,230,463号、4,806,244号及び4,259,183号に開示されるような、ポリアミド、ポリベンズアミド、ポリスルホン(特に、スルホン化ポリスルホン及びスルホン化ポリエーテルスルホンを包含する)、ポリスチレン(アクリロニトリル−スチレン、ブタジエン−スチレン及びスチレン−ビニルベンジルハロゲン化物コポリマーのようなスチレン含有コポリマーを包含する)、ポリカーボネート、セルロースポリマー(酢酸セルロースを包含する)、ポリプロピレン、ポリ(塩化ビニル)、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリビニルアルコール、フルオロカーボンなどである。NF及びRO膜は、ポリマー識別層に加えて、しばしば多孔性支持基板よりなる。
適切な膜組成を選択する際に特に重要なのは、膜表面電荷である。要求されるMWCO範囲内で、その炭水化物のイオン電荷及び混入物の電荷に適切な表面電荷を有する膜が選択される。特定の膜のMWCOは一般に不変であるが、供給溶液のpHを変化させると、膜表面電荷を変えることによって膜の分離特性に影響を及ぼすことができる。例えば、中性pHで正味の負の表面電荷を有する膜は、単に溶液のpHを下げることにより正味の中性電荷を有するように調整することができる。溶液pHの調整の更に別の効果は、混入物上及び目的の炭水化物上のイオン電荷を調節することである。したがって、適切な膜のポリマータイプ及びpHを選ぶことにより、混入物と膜の両方が中性で、混入物の通過を促進するシステムを得ることができる。例えば、中性pHで混入物が負に荷電しているならば、混入物をプロトン化するために供給溶液のpHを下げることがしばしば望まれる。例えば、溶液のpHを少なくとも約3まで、好ましくは少なくとも約4まで、更に好ましくは少なくとも約5まで、そして更に好ましくは少なくとも約6まで下げることにより、リン酸陰イオンがプロトン化して膜を通過できるため、リン酸の除去が促進される。陰イオン性炭水化物の精製には、pHは、一般に約pH1〜約pH7の間、好ましくは約3〜約7の間、そして更に好ましくは約4〜約6の間である。反対に、混入物が正の表面電荷を有するならば、約pH7〜約pH14の間に供給溶液のpHを調整することができる。例えば、アミノ基(−NH3 +)を有する混入物を含有する溶液のpHを上げると、アミノ基が中性になり、よってその膜の通過を促進する。即ち、本発明の1つの態様は、膜と接触する溶液のpHを調整することにより分離を調節することを伴う;これにより混入物のイオン電荷を変化させ、また膜の表面電荷に影響を及ぼすことによって、所望の炭水化物の精製を促進することができる。当然、膜への損傷を回避するため、特定の膜の許容しうるpH範囲に関しては、製造業者の取扱説明書に従う必要がある。
幾つかの応用には、混合物は先ず、あるpHでナノ濾過又は逆浸透に付し、次に目的のヌクレオチド糖を含有する保持液を様々なpHに調整して、更なる一連の膜精製に付す。例えば、pH3、好ましくは少なくとも約4、更に好ましくは少なくとも約5、そして更に好ましくは少なくとも約6での、Osmonics MX07膜(約500DaのMWCOを有するナノ濾過膜)による、シアリル乳糖を合成するために使用される反応混合物の濾過では、シアリル乳糖は保持して、大部分のリン酸、ピルビン酸、塩及びマンガンを溶液から除去するが、また少量のGlcNAc、乳糖、及びシアル酸も除去する。保持液のpHを約7、例えば7.4に調整後、更なるMX07膜による再循環によって、大部分の残存リン酸、全てのピルビン酸、全ての乳糖、少量のシアル酸、及び相当量の残存マンガンが除去される。
ヌクレオチド糖を、所望のオリゴ糖又はヌクレオチド糖を合成するのに使用される酵素のようなタンパク質を含有する混合物から精製しようとするならば、精製手順の第1工程としてタンパク質を除去することが、しばしば望まれる。タンパク質よりも小さいヌクレオチド糖では、この分離は、溶液から除去すべきタンパク質又は他の高分子の分子量よりも小さいが、精製されるオリゴ糖の分子量より大きいMWCOを有する膜を選ぶことにより達成される(即ち、この場合の阻止率は、所望の糖類よりもタンパク質に対して高い)。よってMWCOよりも大きい分子量を有するタンパク質及び他の高分子は、この膜によって阻止されるが、一方ヌクレオチド糖は膜を通り抜ける。反対に、オリゴ糖又はヌクレオチド糖を、そのオリゴ糖又はヌクレオチド糖よりも小さいタンパク質から精製しようとするならば、そのタンパク質の分子量よりも大きいが、そのオリゴ糖又はヌクレオチド糖の分子量より小さいMWCOを有する膜を使用する。一般に、炭水化物からのタンパク質の分離には、普通には限外濾過(UF)膜と呼ばれる膜を利用する。本発明の方法に使用するのに適したUF膜は、Millipore Corp.(Bedford, MA)、Osmonics, Inc.(Minnetonka, MN)、Filmtec(Minneapolis, MN)、UOP、Desalination Systems、Advanced Membrane Technologies、及びNittoを含む、幾つかの製造業者から入手できる。
本発明はまた、ナノ濾過(NF)又は逆浸透(RO)膜を用いることにより、目的のヌクレオチド糖を含有する混合物から塩及び他の低分子量成分を除去する方法を提供する。ナノ濾過膜は、分離が分子量とイオン電荷の両方に基づく種類の膜である。これらの膜は、膜を通り抜ける種のサイズに関して、典型的には逆浸透と限外濾過膜との間に位置する。ナノ濾過膜は、膨潤ポリマーネットワークの連鎖の間に典型的にはミクロ細孔又は開口部を有する。非イオン化分子の分子量カットオフは、典型的には100〜20,000ダルトンの範囲にある。同じ分子量のイオンでは、膜除去(保持)は、電荷密度の増大のため、特定の膜で0、1、2、3などのイオン電荷に対して累進的に増大する(例えば、Eriksson, P., "Nanofiltration Extends the Range of Membrane Filtration," Environmental Progress, 7:58-59 (1988)を参照のこと)。ナノ濾過はまた、Chemical Engineering Progress, pp. 68-74 (March 1994), Rautenbach et al., Desalination 77:73 (1990)、及びUSPN 4,806,244に記述されている。典型的な応用では、目的のヌクレオチド糖は、ナノ濾過膜に保持され、そして混入塩及び他の不要な成分は通り抜ける。本発明の方法に有用なナノ濾過膜は、典型的には約40%〜約100%、好ましくは約70%〜約100%、更に好ましくは約90%〜約100%の目的のヌクレオチド糖に対する保持特性を有する。本発明に使用されるナノ濾過膜は、従来のナノフィルター膜のいずれか1つであってもよいが、ポリアミド膜が特に適している。特に、Millipore Corp.(Bedford, MA)、Osmonics, Inc.(Minnetonka, MN)、Filmtec、UOP、Advanced Membrane Technologies、Desalination Systems、及びNittoを包含する幾つかの製造業者は、本発明の方法に使用するのに適切なナノ濾過膜を流通させている。例えば、適切な膜は、とりわけOsmonics MX07、YK、GH(G-10)、GE(G-5)、及びHL膜を包含する。
逆浸透(RO)膜もまた、選択分子を保持しながら、種々の水性溶質を通り抜けさせる。一般に、浸透とは、純粋な液体(通常は水)が溶液(通常は糖又は塩及び水)へと半透膜を通り抜ける、溶液を希釈するため、及び2種の液体間の浸透平衡を達成するためのプロセスのことをいう。対照的に、逆浸透は、膜系への外部圧力の付加により、膜系の食塩水又は糖溶液区画から純水区画へと通り抜ける水分子により逆の流れが生じる、圧力による膜プロセスである。半透性で非多孔性のRO膜は、水に溶解した物質の浸透圧より高い圧力で膜に送り込まれる水供給を必要とする。RO膜は、低分子量分子(<200ダルトン)及びイオンをも水から有効に除去することができる。好ましくは、逆浸透膜は、約40%〜約100%、好ましくは約70%〜約100%、そして更に好ましくは約90%〜約100%の目的のヌクレオチド糖の保持特性を有する。適切なRO膜は、特に限定されないが、とりわけFilmtec BW-30、Filmtec SW-30、Filmtec SW-30HR、UOPのRO膜、DesalのRO膜、OsmonicsのRO膜、Advanced Membrane TechnologiesのRO膜、及びNittoのRO膜を包含する。適切なRO膜の一例は、Milliporeカタログ番号CDRN500 60(Millipore Corp., Bedford MA)である。
本発明に使用される膜は、既知の膜構成物のいずれに利用してもよい。例えば、この膜は、扁平状、プレート・フレーム状、管状、らせん巻き状、中空糸状などであってよい。好ましい実施態様において、この膜はらせん巻き状である。この膜は、直交流又は深層配置のいずれかを包含する、任意の適切な配置で利用することができる。本発明の限外濾過、ナノ濾過及び逆浸透精製に好ましい「直交流」濾過では、「供給」又は目的の炭水化物を精製すべき溶液は、膜表面に平行するか又は正接するかのいずれかで膜チャネルを流れて、保持液(再循環液又は濃縮液とも呼ばれる)流と透過液流とに分離する。効率的な膜を維持するために、供給流は、膜に阻止された蓄積粒子を洗い流すための剪断力及び/又は乱流を生み出すよう、膜表面に平行に十分に高速で流すべきである。よって直交流濾過は、3本の流れ:供給液、透過液及び保持液を必要とする。対照的に、「全量」又は「深層」フィルターには、2つの流れ:供給液及び濾液(又は透過液)しかない。全ての粒子と膜に阻止された大分子を保持する再循環液又は保持液流は、再循環液流が生成する膜モジュールに全部を再循環することができるか、又は部分的にこの系から除去することができる。本発明の方法が、例えば、ヌクレオチド糖を低分子量成分から精製するために使用されるとき、所望のヌクレオチド糖は、保持液流(又は深層フィルターでは供給液流)に含有され、一方透過液流は、除去された混入物を含有する。
本発明の精製方法は、濾過が実施される、圧力、流量、及び温度を調整することにより更に最適化できる。UF、NF、及びROは、一般に、膜を通り抜ける溶液の浸透圧に打ち勝つための大気圧を超える圧力上昇を必要とする。最大及び推奨操作圧力に関しては膜の製造業者の取扱説明書に従うことができるが、漸増調整を行うことにより更なる最適化が可能である。例えば、UFの推奨圧力は、一般に約25〜約100psiの間であり、NFでは約50psi〜約1500psiの間、そしてROでは約100〜約1500psiの間であろう。濃縮液(供給溶液)及び透過液の両方の流量もまた、望まれる精製を最適化するために調整することができる。再び、特定の膜の製造業者の推奨値が、漸増調整を行う最適化プロセスを開始する出発点として役立つ。濃縮液に典型的な流量(Pc)は、約1〜約15ガロン/分(GPM)の間であり、更に好ましくは約3〜約7GPMの間であろう。透過液では、約0.05GPM〜約10GPMの間の流量(Pf)が典型的であり、約0.2〜約1GPMの間の流量が好ましい。精製が実施される温度もまた、精製の効率及び速度に影響を及ぼしうる。約0〜約100℃の間の温度が典型的であり、約20〜40℃の間の温度が大部分の応用に好ましい。高温になると、一部の膜では、膜の細孔径が上昇するため、精製を最適化するために調整することができる追加のパラメーターを提供することになる。
好ましい実施態様において、濾過は、流量、圧力、温度、及び精製に影響を及ぼしうる他のパラメーターを自動制御するための手段を提供する、膜精製機で実行される。例えば、Osmonics 213T膜精製機は、上記の他の会社が製造した機器と同様に、本発明の方法に使用するのに適している。
膜は、使用後又は膜の透過性減退後、容易に洗浄することができる。洗浄は、水又は苛性溶液で濯ぐことにより、必要に応じてわずかに高温で実施することができる。流れに少量の酵素が含有されるならば、少量の界面活性剤、例えば、ULTRASILの存在下で濯ぐのが有効である。また、より高価なナノ濾過膜を保護するためにプレフィルター(100〜200μm)を使用することができる。他の洗浄剤は、必要に応じて使用することができる。洗浄方法の選択は、洗浄される膜に依存し、そして膜の製造業者の取扱説明書を参考にすべきである。洗浄は、前進流フラッシング又は逆進流フラッシングにより達成することができる。
本発明の精製方法は、単独で、又は他の炭水化物の精製方法と組合せて使用することができる。例えば、目的のヌクレオチド糖を含有する混合物から特定のイオンを除去するために、ナノ濾過/逆浸透の前又は後に、あるいは濾過の前後両方に、イオン交換樹脂を使用することができる。イオン交換は、第1巡目のナノ濾過又は逆浸透後に残る、リン酸のようなイオン及びヌクレオチドを除去するには特に望ましい。上述のようなシアリル乳糖合成の場合には、これは、例えば、AG1X-8(酢酸塩型、BioRad;他のイオン交換樹脂については、例えば、BioRadカタログを参照のこと)のような陰イオン交換樹脂を、約pH3又はそれ以下の保持液に、リン酸濃度が必要なだけ低下するまで加えることにより達成できる。このプロセスでは、酢酸が放出されるため、イオン交換の次に、ナノ濾過又は逆浸透系による更なる精製を行おうとするだろう。例えば、透過液の導電率が低くかつ安定化するまで、Osmonics MX07又は類似の膜によりpH3又はそれ以下の溶液を循環することができる。次にこの溶液のpHは、約7、例えば、7.4までNaOHで上げることができ、そしてこの溶液は、残存酢酸ナトリウム及び塩を除去するために同じ膜により再循環させることができる。陽イオンは同様に除去することができる;例えば、Mn2+を除去するために、AG50WX8(H+)(BioRad)のような酸性イオン交換樹脂を使用することができる。
濾過
1つの実施態様において、合成後、ヌクレオチド糖溶液は、場合により濾過によって清澄にする。このヌクレオチド糖溶液は、混入塩及び他の不要な混入物がこのヌクレオチド糖溶液から除去される、膜フィルター(例えば、袋状フィルター)に通す。この清澄化工程は、プロセスの任意の工程に組み込むことができる。好ましい実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ヌクレオチド糖の合成後に清澄にする。ヌクレオチド糖溶液は、1回以上清澄にしてもよい。
1つの実施態様において、合成後、ヌクレオチド糖溶液は、場合により濾過によって清澄にする。このヌクレオチド糖溶液は、混入塩及び他の不要な混入物がこのヌクレオチド糖溶液から除去される、膜フィルター(例えば、袋状フィルター)に通す。この清澄化工程は、プロセスの任意の工程に組み込むことができる。好ましい実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ヌクレオチド糖の合成後に清澄にする。ヌクレオチド糖溶液は、1回以上清澄にしてもよい。
一例を挙げれば、ヌクレオチド糖溶液は、中空糸濾過を用いて精製する。中空糸濾過により、例えば、ヌクレオチド糖の酵素調製により導入されたタンパク質を除去する。中空糸膜は、酵素調製からのタンパク質を保持するが、一方ヌクレオチド糖溶液には膜を通り抜けさせる。典型的な実施態様において、この中空糸膜は、接線濾過スキッド(tangential filtration skid)を持つ中空糸膜を含む。中空糸濾過工程は、プロセスの任意の工程に組み込むことができる。1つの実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、清澄化後に中空糸濾過を受ける。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ヌクレオチド糖の合成後に中空糸濾過を受ける。ヌクレオチド糖溶液は、中空糸濾過を利用して1回以上濾過してもよい。
別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液はナノ濾過を用いて精製する。ナノ濾過により、塩及び他の低分子量成分を混合物から除去する。ナノ濾過膜は、分子量及びイオン電荷に基づいて分子を分離する。非イオン化分子の分子量カットオフは、典型的には100〜20,000ダルトンの範囲にある。典型的な応用において、目的の糖類はナノ濾過膜に保持され、混入塩及び他の不要な成分は通り抜ける。ナノ濾過工程は、プロセスの任意の工程に組み込むことができる。1つの実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、中空糸濾過を最初に、そして次にナノ濾過を受ける。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、最初にナノ濾過を、そして次に中空糸濾過を受ける。別の方法では、ヌクレオチド糖溶液は、中空糸濾過又はナノ濾過のいずれかを用いて精製することができる。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、清澄化後にナノ濾過を受ける。更に別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ヌクレオチド糖の合成後にナノ濾過を受ける。ヌクレオチド糖溶液は、ナノ濾過を利用して1回以上濾過してもよい。ナノ濾過後、精製されたヌクレオチド糖溶液は、一般に保存されるか、又は更なる精製を受けてもよい。
別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、場合により脱色(例えば、溶液を活性炭に通すことによる)してもよい。好ましい実施態様において、脱色は、ヌクレオチド糖溶液を、クロマトグラフィーシステムに取り付けた活性炭のプレ充填カラムに通すことを伴う。脱色は、プロセスの任意の工程に組み込むことができる。1つの実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ナノ濾過後に脱色する。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、中空糸濾過後に脱色する。更に別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、清澄化後に脱色する。ヌクレオチド糖溶液は1回以上脱色してもよい。
別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、荷電深層媒体フィルターを用いて精製する。荷電深層媒体フィルターにより、例えば、エンドトキシンをヌクレオチド糖溶液から除去する。エンドトキシンは、細菌の細胞壁外側の病原体中に見い出されたリポ多糖類のような毒性の天然化合物である。荷電深層媒体フィルターによる精製は、プロセスの任意の工程に組み込むことができる。1つの実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、脱色後に濾過する。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ナノ濾過後に荷電深層媒体フィルターにより精製する。更に別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、中空糸濾過後に荷電深層媒体フィルターにより精製する。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、清澄化後に荷電深層媒体フィルターにより精製する。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ヌクレオチド糖の合成後に荷電深層媒体フィルターにより精製する。ヌクレオチド糖溶液は、荷電深層媒体フィルターを用いて1回以上濾過してもよい。
別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、滅菌フィルターを用いて精製する。滅菌フィルターにより、混入塩及び他の不要な混入物をヌクレオチド糖溶液から除去する。更に好ましい実施態様において、滅菌フィルターは、最終濾過及び保存のためにバッグマニホールド方式で予め包装及び滅菌化される。滅菌フィルターによる精製は、プロセスの任意の工程に組み込むことができる。1つの実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、荷電深層媒体フィルターによる精製後に滅菌フィルターにより濾過する。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、脱色後に滅菌フィルターにより精製する。更に別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ナノ濾過後に滅菌フィルターにより精製する。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、中空糸濾過後に滅菌フィルターにより精製する。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、清澄化後に滅菌フィルターにより精製する。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ヌクレオチド糖の合成後に滅菌フィルターにより精製する。ヌクレオチド糖溶液は、滅菌フィルターを用いて1回以上濾過してもよい。
以下の実施例は、例証の目的にのみ提示されるものであり、本発明を限定するものでも定義するものでもない。以下の実施例は、CMP−SA−PEG類の製造方法を記述している。この焦点は説明の明瞭さのためであり、本プロセスを限定するものと解釈すべきでない。当業者であれば、記述されるプロセスが、それぞれCMP及びシアル酸以外のヌクレオチド及び糖残基を包含する、修飾ヌクレオチド糖にも等しく応用されることは正しく理解するところであろう。
実施例
一般:
CMP−SA−PEG類(例えば、CMP−SA−PEG−10kDa、CMP−SA−PEG−20kDa及びCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDa)の生産のための従来の製造方法では、逆相クロマトグラフィー(例えば、C−4樹脂)を利用した。典型的な既知の方法は、塩基加水分解、次にTFF、次にpH中和、次に逆相クロマトグラフィー、次に脱塩、次に溶媒除去(例えば、回転蒸発)及び凍結乾燥を包含する。このプロセスは、主に逆相クロマトグラフィー工程に関連する限界(例えば、樹脂の高コスト、工業的規模のプレ充填C−4カラムの入手可能性、有機溶媒使用の必要性)のため、更にはこのアプローチは全ての反応混入物を完全に分離することができないために、大規模な応用(kg量の生産)には適していないことが分かった。したがって、上記欠点に対処するために、特に単位操作の数を減らすために、代わりの合理化された製造法を開発した。
一般:
CMP−SA−PEG類(例えば、CMP−SA−PEG−10kDa、CMP−SA−PEG−20kDa及びCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDa)の生産のための従来の製造方法では、逆相クロマトグラフィー(例えば、C−4樹脂)を利用した。典型的な既知の方法は、塩基加水分解、次にTFF、次にpH中和、次に逆相クロマトグラフィー、次に脱塩、次に溶媒除去(例えば、回転蒸発)及び凍結乾燥を包含する。このプロセスは、主に逆相クロマトグラフィー工程に関連する限界(例えば、樹脂の高コスト、工業的規模のプレ充填C−4カラムの入手可能性、有機溶媒使用の必要性)のため、更にはこのアプローチは全ての反応混入物を完全に分離することができないために、大規模な応用(kg量の生産)には適していないことが分かった。したがって、上記欠点に対処するために、特に単位操作の数を減らすために、代わりの合理化された製造法を開発した。
典型的な改良法を図1に示す。1つの実施態様において、本改良法は、5種の単位操作しか含まない。これらは、CMP−SA−PEGを生成するためのカップリング(PEG化)反応、本質的にTHFを除去するための回転蒸発、陰イオン交換クロマトグラフィー(精製工程)、TFFを使用する脱塩/濃縮/ダイアフィルトレーション、及び固体生成物を生成するための凍結乾燥を包含する。凍結乾燥を除いて各工程は、プロセスの成績を改善するために最適化されており、このためCMP−SA−PEG類が高純度で得られる。
カップリング反応の変換収率は、PEGのサイズにより67〜99%の範囲であった。AEXクロマトグラフィーのこの工程の収率は95〜99%の範囲であり、そしてTFF工程は90〜95%の範囲であり、カップリング反応に由来する全ての混入物(SA−PEGを包含する)を本質的に除去する。結合反応、回転蒸発、イオン交換、TFF及び凍結乾燥の単位操作の生成物の総回収率は、約65〜77%の間であった。新しいプロセスによって製造されるCMP−SA−PEG類は、約90と95%の間の純度であった。最終生成物の1H−NMR分析では、SA−PEG不純物の存在は示されなかった。ICP分析では、生成物が二ナトリウム塩型であり、別のナトリウム塩は含まないことを示した。
方法と材料
Q-Sepharose Big BeadsはGE Healthcareから得た。CMP−SA−グリシンナトリウム塩はAMRIから得た。10kDa mPEG−p−ニトロフェニルカーボネートはDow Chemical Companyから得た。40kDa mPEG−p−ニトロフェニルカーボネートはNOFから得た。
Q-Sepharose Big BeadsはGE Healthcareから得た。CMP−SA−グリシンナトリウム塩はAMRIから得た。10kDa mPEG−p−ニトロフェニルカーボネートはDow Chemical Companyから得た。40kDa mPEG−p−ニトロフェニルカーボネートはNOFから得た。
一般には以下の装置を使用した:蠕動ポンプ(Cole-Palmer、Masterflex L/Sデジタルスタンダードドライブ、easy-load IIポンプヘッド);蠕動ポンプ(Cole-Palmer、Masterflex L/Sデジタル標準ドライブ、easy-load Iポンプヘッド);FPLC(GE Healthcare、AEKTA FPLC);HPLCポンプA及びB(Dynamax、SD-1);HPLC検出器(Dynamax、UV-C);HPLC検出器(Varian、ProStarモデル340);ELS検出器(S.E.D.E.R.E. France、Sedex 55)、凍結乾燥機(VirTis、6K Benchtop);イオン交換カラム(4L)(Sepracor SA、285530、180×300mm);イオン交換カラム(12mL)(Biovalve, Inc.、Omnifit、006CC-10-50-AF、10×250mm);イオン交換カラム(2L)(GE Healthcare、BPG 100/500カラム、18-1103-01);イオン交換カラム(100mL)(GE Healthcare, XK26/40、18-8768-01);導電率計(Fisher Thermo Electron Corporation、Accumet Basic AB30、Orion 4 star);pH計(Orionモデル250A0;容積式ポンプ(Teknoflow Inc.、Labtop (300/350));Pellicon 2 Standard 1K膜、再生セルロース(Millipore、P2PLACV01;1kDa再生セルロース膜;0.1m2;Vスクリーン);Pellicon 2 Standard 3K膜、再生セルロース(Millipore、P2PLBCV01;3kDa再生セルロース膜;0.1m2;Vスクリーン);Pellicon 2 Standard 5K膜、再生セルロース(Millipore、P2C005C01;5kDa再生セルロース膜;0.1m2;Cスクリーン);Pellicon 2 Standard 1K膜、再生セルロース(Millipore、P2PLACC01;1kDa再生セルロース膜;0.1m2;Cスクリーン);Pellicon 2 Standard 1K膜、再生セルロース(Millipore、P2PLACV05;1kDa再生セルロース膜;0.5m2;Vスクリーン)。
NWP=標準化透水性;GSC=CMP−SA−グリシン;PSC=CMP−SA−PEG−20kDa
1H−NMR(500MHz、800MHz)スペクトルはD2Oで記録した。化学シフトは、水ピークに対してppmで表す。
CMP−SA−PEG類を含有する混合物を逆相HPLCを利用して分析した(例えば、純度及び回収率測定)。典型的な方法を以下に示す:Chromolith Performance RP18カラム(VWR又はPhenomonex)をBeckman HPLCシステムに取り付けた。オートサンプラー(10℃)を介して、35℃に維持したカラムに試料を注入した。カラムを流量5.0mL/分で以下の勾配条件で溶出した(溶離液A:20mMリン酸カリウム、1mM TABHS、pH=6.2;溶離液B:100%アセトニトリル):0.5% Bを2分、次に連続直線勾配で2分で20% Bまで、8分で40% Bまで、最後に40% Bで均一濃度溶出を7分間。カラムを0.5% Bで3分間再平衡化して、総分析時間は22分間であった。溶出したピークを271nmで検出した。GSC及びCMP−SA−PEG−10kDa(AMRI)を、保持時間及び較正標準物質として使用した。GSC標準物質(AMRI)を使用して、CMP−SA−PEG−10kDa濃度を算出するための標準曲線を確定した。これらの標準物質の純度は定量的NMR分析により測定した。
精製及び脱塩したCMP−SA−PEG試料のナトリウム含量は、誘導結合プラズマ分析(ICP)により測定した。
実施例1
CMP−SA−PEG類の調製
1.1. CMP−SA−PEG−10kDaの調製
シチジン−5’−モノホスホ−N−グリシルシアル酸(CMP−SA−グリシン)二ナトリウム塩(1.23g、73.5重量%純度、1.34mmol)を、1Lの1ツ口丸底フラスコ中のMilli Q水(80mL)に溶解した。この無色溶液のpHは10.48であった。無水THFを加え(320mL)、500mMリン酸一ナトリウム溶液(pH4.6)5.5mLを滴下により加えてpHを8.6に調整した。次にこの反応溶液に10kDa mPEG−p−ニトロフェニルカーボネート(20g、2.0mmol、1.5当量)を一度に加えた。PEG試薬が溶解後、溶液のpHは8.7であった。この黄色の溶液を20℃で21時間撹拌した。次に0.1M NaOH(4.0mL)を加えて、反応混合物のpHを7.8から8.5に調整した。この反応混合物は更に3時間撹拌し、THFは、ロータリーエバポレーターを使用した減圧下で30℃での蒸発により除去した。採取した液体の容量が320mLを超えたとき、蒸発を停止した。生じた黄色の溶液をMilli Q水(400mL)で希釈し、この溶液を0.22ミクロンの1L Nalgeneフィルターユニットで真空を利用して濾過することにより不溶性物質をどれも除去した。黄色の濾液の最終容量は684mLであり、導電率は0.97mS/cmであった。HPLCにより測定した変換収率は82%であった(表1、バッチ9)。
CMP−SA−PEG類の調製
1.1. CMP−SA−PEG−10kDaの調製
シチジン−5’−モノホスホ−N−グリシルシアル酸(CMP−SA−グリシン)二ナトリウム塩(1.23g、73.5重量%純度、1.34mmol)を、1Lの1ツ口丸底フラスコ中のMilli Q水(80mL)に溶解した。この無色溶液のpHは10.48であった。無水THFを加え(320mL)、500mMリン酸一ナトリウム溶液(pH4.6)5.5mLを滴下により加えてpHを8.6に調整した。次にこの反応溶液に10kDa mPEG−p−ニトロフェニルカーボネート(20g、2.0mmol、1.5当量)を一度に加えた。PEG試薬が溶解後、溶液のpHは8.7であった。この黄色の溶液を20℃で21時間撹拌した。次に0.1M NaOH(4.0mL)を加えて、反応混合物のpHを7.8から8.5に調整した。この反応混合物は更に3時間撹拌し、THFは、ロータリーエバポレーターを使用した減圧下で30℃での蒸発により除去した。採取した液体の容量が320mLを超えたとき、蒸発を停止した。生じた黄色の溶液をMilli Q水(400mL)で希釈し、この溶液を0.22ミクロンの1L Nalgeneフィルターユニットで真空を利用して濾過することにより不溶性物質をどれも除去した。黄色の濾液の最終容量は684mLであり、導電率は0.97mS/cmであった。HPLCにより測定した変換収率は82%であった(表1、バッチ9)。
1.2. CMP−SA−PEG−20kDaの調製
シチジン−5’−モノホスホ−N−グリシルシアル酸(CMP−SA−グリシン)二ナトリウム塩(0.61g、73.5重量%、0.656mmol)を、500mLの1ツ口丸底フラスコ中のMilli Q水(40mL)に溶解した。この無色溶液のpHは10.5であった。この撹拌溶液に無水THF(160mL)を加え、500mMリン酸一ナトリウム溶液(pH4.6)2.0mLを滴下により加えてpHを(11.2から)8.5に調整した。この反応溶液に20kDa mPEG−p−ニトロフェニルカーボネート(20.0g、1.0mmol、1.5当量)を一度に加えた。PEGが溶解後、溶液のpHは8.6であった。この黄色の混合物を20℃で21時間撹拌した。反応混合物のpHをNaOH(1.0N、2.0mL)で8.5に調整し、反応混合物を更に18時間撹拌した。THFは、減圧を利用した35℃でロータリーエバポレーターでの回転蒸発により除去した。採取した液体の容量が160mLを超えたとき、蒸発を停止した。生じた黄色の溶液をMilli Q水(300mL)で希釈し、溶液を0.22ミクロンの1L Nalgeneフィルターユニットで真空を利用して濾過することにより不溶性物質をどれも除去した。黄色の溶液の最終容量は476mLであり、導電率はpH7.21で0.725mS/cmであった。HPLCにより測定した変換収率は87%であった(表5、例2)。
シチジン−5’−モノホスホ−N−グリシルシアル酸(CMP−SA−グリシン)二ナトリウム塩(0.61g、73.5重量%、0.656mmol)を、500mLの1ツ口丸底フラスコ中のMilli Q水(40mL)に溶解した。この無色溶液のpHは10.5であった。この撹拌溶液に無水THF(160mL)を加え、500mMリン酸一ナトリウム溶液(pH4.6)2.0mLを滴下により加えてpHを(11.2から)8.5に調整した。この反応溶液に20kDa mPEG−p−ニトロフェニルカーボネート(20.0g、1.0mmol、1.5当量)を一度に加えた。PEGが溶解後、溶液のpHは8.6であった。この黄色の混合物を20℃で21時間撹拌した。反応混合物のpHをNaOH(1.0N、2.0mL)で8.5に調整し、反応混合物を更に18時間撹拌した。THFは、減圧を利用した35℃でロータリーエバポレーターでの回転蒸発により除去した。採取した液体の容量が160mLを超えたとき、蒸発を停止した。生じた黄色の溶液をMilli Q水(300mL)で希釈し、溶液を0.22ミクロンの1L Nalgeneフィルターユニットで真空を利用して濾過することにより不溶性物質をどれも除去した。黄色の溶液の最終容量は476mLであり、導電率はpH7.21で0.725mS/cmであった。HPLCにより測定した変換収率は87%であった(表5、例2)。
1.3. CMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaの調製
シチジン−5’−モノホスホ−N−グリシルシアル酸(CMP−SA−グリシン)二ナトリウム塩(368mg、73.5重量%純度、0.40mmol)を、500mLの1ツ口丸底フラスコ中のMilli Q水40mLに溶解した。この撹拌溶液に無水THF(160mL)を加えた。500mMリン酸一ナトリウム溶液(pH4.6)2.0mLを滴下により加えて、この混合物のpHを11.5から8.6に注意深く調整した。この反応混合物に40kDa mPEG−p−ニトロフェニルカーボネート(20.96g、90%活性化、0.44mmol、1.1当量)を一度に加えた。20時間後、0.1N NaOH溶液1.4mLを加えて、反応混合物のpHを8.31から8.82に調整した。更に22時間後、0.1N NaOH約0.8mLを加えることにより、混合物のpHを8.52から8.89にした。更に24時間後(総反応時間66時間)、減圧下でロータリーエバポレーターを使用して35℃未満の水浴温度を利用してTHFを除去した。採取した液体の容量が160mLを超えたとき、蒸発を停止した。生じた黄色の溶液をMilli Q水600mLで希釈し、真空ポンプで0.22ミクロンの1L Nalgeneフィルターユニットにより濾過した。フィルターをMilli Q水約50mLで濯いだ。黄色の濾液の最終容量は678mLであり、導電率はpH7.25で0.40mS/cmであった。変換収率はHPLCにより57%であった(表6、実施例5)。反応混合物を2つの等量(335mL)に分けた。一方を後述のように精製した。
シチジン−5’−モノホスホ−N−グリシルシアル酸(CMP−SA−グリシン)二ナトリウム塩(368mg、73.5重量%純度、0.40mmol)を、500mLの1ツ口丸底フラスコ中のMilli Q水40mLに溶解した。この撹拌溶液に無水THF(160mL)を加えた。500mMリン酸一ナトリウム溶液(pH4.6)2.0mLを滴下により加えて、この混合物のpHを11.5から8.6に注意深く調整した。この反応混合物に40kDa mPEG−p−ニトロフェニルカーボネート(20.96g、90%活性化、0.44mmol、1.1当量)を一度に加えた。20時間後、0.1N NaOH溶液1.4mLを加えて、反応混合物のpHを8.31から8.82に調整した。更に22時間後、0.1N NaOH約0.8mLを加えることにより、混合物のpHを8.52から8.89にした。更に24時間後(総反応時間66時間)、減圧下でロータリーエバポレーターを使用して35℃未満の水浴温度を利用してTHFを除去した。採取した液体の容量が160mLを超えたとき、蒸発を停止した。生じた黄色の溶液をMilli Q水600mLで希釈し、真空ポンプで0.22ミクロンの1L Nalgeneフィルターユニットにより濾過した。フィルターをMilli Q水約50mLで濯いだ。黄色の濾液の最終容量は678mLであり、導電率はpH7.25で0.40mS/cmであった。変換収率はHPLCにより57%であった(表6、実施例5)。反応混合物を2つの等量(335mL)に分けた。一方を後述のように精製した。
実施例2
CMP−SA−PEG類の陰イオン交換クロマトグラフィー
2.1. Q-Sepharose Big Bead樹脂のカラム充填手順(2Lスケール)
製造業者の取扱説明書に従ってカラムを調製した。代表的な手順を以下に記載する。
CMP−SA−PEG類の陰イオン交換クロマトグラフィー
2.1. Q-Sepharose Big Bead樹脂のカラム充填手順(2Lスケール)
製造業者の取扱説明書に従ってカラムを調製した。代表的な手順を以下に記載する。
空のGE BPG 100/500クロマトグラフィーカラムを、清浄度及び構造的完全性について検査した。底フリット(frit)を水で湿らせた。カラムの出口に栓をして、カラムの底に水1〜2cmを注いだ。20%エタノール中のQ-Sepharose Big Beads樹脂スラリー(約3.2L、65%)を再懸濁して均一性を確認した。空気の閉じ込めを防ぐため、樹脂スラリーをカラムの内側に沿ってゆっくり注ぎ入れた。樹脂スラリーをカラムに移した後、20%エタノールを含有する噴射瓶を使用してカラムの内側を濯いだ。樹脂を約30分間沈降させて、樹脂の高さが、所望の高さ25cmより約3〜5cm高いことを確認した(必要であれば更に樹脂を加える)。フローアダプターは、水で満たして、カラムに入れた。フローアダプターと液体との間に空気が入らないように注意した。カラムの出口を開き、フローアダプターがベッド上に静かにおさまるように落として調整した。入口をDynamax SD-1 HPLCポンプに連結した。ポンプを開始させ、目標の流量200mL/分までゆっくり上げていった(流量は、2分間の維持時間で数回上昇変化させて上げることができる)。ベッドが完全に固まってから、ポンプのスイッチを切った。フローアダプターをそれ以上進まないような抵抗があるまで、ベッド上に下げて調整した。カラムの出口を閉じた。樹脂の高さに印をした(25.4cm)。使用可能な状態で、カラムをまず脱気RO水4Lで洗浄することにより、樹脂スラリーから20%エタノールを除去した。ここにNaOH(2CV、100mL/分で、40分の滞留時間)を充填してカラムを消毒し、水酸化物型の樹脂を作成し、RO水(2CV、200mL/分で)で洗浄し、次に1M重炭酸ナトリウム(3CV、200mL/分)を充填して、上述のように重炭酸対イオン型を作成した。
2.2. CMP−SA−PEG−10kDaのQ-Sepharose Big Beads精製
BPG 100/500カラムに、上述のようにQ-Sepharose Big Beads陰イオン交換樹脂(塩化物型;10cm ID×26cm)2.0Lを充填し、214nm及び271nmの両方で読むことができるUV検出器を備えたDynamax SD-1 HPLCシステムに連結した。カラムを脱気水2CV(4L)により100mL/分(76cm/時)で洗浄することにより、20%エタノール充填溶液を除去した。次にカラムを1M NaOH(2CV、4L、100mL/分、76cm/時)で洗浄することにより消毒し、次にRO水(2CV、4L、200mL/分、130cm/時)で洗浄し、続いて1M NaHCO3(3CV、6L、200mL/分、130cm/時)で洗浄し、最後にRO水(3CV、6L、200mL/分、130cm/時)で洗浄することにより重炭酸塩型に変換した。完了したとき、カラム流出液の導電率は≦10microS/cm(pH4.5〜6)であった。
BPG 100/500カラムに、上述のようにQ-Sepharose Big Beads陰イオン交換樹脂(塩化物型;10cm ID×26cm)2.0Lを充填し、214nm及び271nmの両方で読むことができるUV検出器を備えたDynamax SD-1 HPLCシステムに連結した。カラムを脱気水2CV(4L)により100mL/分(76cm/時)で洗浄することにより、20%エタノール充填溶液を除去した。次にカラムを1M NaOH(2CV、4L、100mL/分、76cm/時)で洗浄することにより消毒し、次にRO水(2CV、4L、200mL/分、130cm/時)で洗浄し、続いて1M NaHCO3(3CV、6L、200mL/分、130cm/時)で洗浄し、最後にRO水(3CV、6L、200mL/分、130cm/時)で洗浄することにより重炭酸塩型に変換した。完了したとき、カラム流出液の導電率は≦10microS/cm(pH4.5〜6)であった。
実施例1.1の水性CMP−SA−PEG−10kDa反応混合物(684mL、pH7.27、導電率0.97mS/cm)を、流量65mL/分(50cm/時)でカラムに装填した。装填が完了後、全ての非結合不純物がカラムから洗浄されUVシグナル(271及び214nm)がベースラインに戻るまで、カラムをRO水4L(2CV)により流量130mL/分(100cm/時)で洗浄した。段階溶出を利用して生成物を得た。図4に示すように5mM NaHCO3 1.2L(0.6CV)を用いて流量130mL/分(100cm/時)で、まずSA−PEG不純物(保持時間55分)をカラムから溶出した。次に溶離緩衝液濃度を上げ、30mM NaHCO3 6L(3CV)により流量100cm/時で生成物(保持時間63分)を溶出した。次に1M NaHCO3 14L(7CV)を使用して過剰のCMP−SA−グリシン及び他の反応副産物をカラムから溶出した後、カラムを再生した。カラム溶出を214nm及び271nmの両方でUVを使用してモニターし、適切な画分を手動で採取した(図4)。SA−PEG不純物ピークの溶出後、UV271の読み値がベースラインを超えたときに生成物の分画を開始し、生成物ピークの立下り側でピーク最大値の約5%のときに終了した。生成物含有画分(画分1、2.0L)を2つの部分に分けた。約500mLを使用して接線流濾過(Tangential Flow Filtration;TFF)工程を最適化し、一方残りの1.5Lは後述の最適化TFF法により処理した。
2.3. CMP−SA−PEG−20kDaのQ-Sepharose Big Beads精製
BPG 100/500カラムに、上述のようにQ-Sepharose Big Beads陰イオン交換樹脂(塩化物型;10cm ID×26cm)2.0Lを充填し、214nm及び271nmの両方で読むことができるUV検出器を備えたDynamax SD-1 HPLCシステムに連結した。カラムを脱気水2CV(4L)により100mL/分(76cm/時)で洗浄することにより、20%エタノール充填溶液を除去した。次にカラムを1M NaOH(2CV、4L、100mL/分、76cm/時)で洗浄することにより消毒し、次にRO水(2CV、4L、200mL/分、153cm/時)で洗浄し、続いて1M NaHCO3(3CV、6L、200mL/分、153cm/時)及びRO水(3CV、6L、200mL/分、153cm/時)で洗浄することにより重炭酸塩型に変換した。完了したとき、カラム流出液の導電率は≦10microS/cm(pH4.5〜6)であった。
BPG 100/500カラムに、上述のようにQ-Sepharose Big Beads陰イオン交換樹脂(塩化物型;10cm ID×26cm)2.0Lを充填し、214nm及び271nmの両方で読むことができるUV検出器を備えたDynamax SD-1 HPLCシステムに連結した。カラムを脱気水2CV(4L)により100mL/分(76cm/時)で洗浄することにより、20%エタノール充填溶液を除去した。次にカラムを1M NaOH(2CV、4L、100mL/分、76cm/時)で洗浄することにより消毒し、次にRO水(2CV、4L、200mL/分、153cm/時)で洗浄し、続いて1M NaHCO3(3CV、6L、200mL/分、153cm/時)及びRO水(3CV、6L、200mL/分、153cm/時)で洗浄することにより重炭酸塩型に変換した。完了したとき、カラム流出液の導電率は≦10microS/cm(pH4.5〜6)であった。
実施例1.2のCMP−SA−PEG−20kDa反応混合物(476mL、pH7.21、導電率0.725mS/cm)を流量65mL/分(50cm/時)で、調製したカラムに装填した。装填が完了後、全ての非結合不純物がカラムから洗浄され、UVシグナル(217及び271nm)がベースラインに戻るまで、カラムをRO水4L(2CV)により流量130mL/分(100cm/時)で洗浄した。段階溶出を利用して生成物を溶出した。図6に示すように2mM NaHCO3 2.0L(1.0CV)を用いて流量130mL/分(100cm/時)で、まずSA−PEG不純物(保持時間55分)をカラムから溶出した。次に溶離緩衝液濃度を上げ、30mM NaHCO3 6L(3CV)により流量130mL/分(100cm/時)で生成物(保持時間75分)を溶出した。次に1M NaHCO3 14L(7CV)を使用して、過剰のCMP−SA−グリシン及び他の反応副産物をカラムから溶出した後、カラムを再生した。カラム溶出を214nm及び271nmの両方でUV吸収によりモニターし、適切な画分を採取した(図6)。SA−PEG不純物ピークの溶出後、UV271の読み値がベースラインを超えたときに生成物の分画を開始し、生成物ピークの立下り側でピーク最大値の約5%のときに終了した。生成物含有画分(画分1、2.0L)を次の工程に使用した。
2.4. CMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaのQ-Sepharose Big Beads精製
BPG 100/500カラムに、上述のようにQ-Sepharose Big Beads陰イオン交換樹脂(塩化物型;10cm ID×25.5cm)2.0Lを充填し、214nm及び271nmの両方で読むことができるUV検出器を備えたDynamax SD-1 HPLCシステムに連結した。カラムを脱気水2CV(4L)により100mL/分(76cm/時)で洗浄することにより、20%エタノール充填溶液を除去した。次にカラムを1M NaOH(2CV、4L、100mL/分、76cm/時)で洗浄することにより消毒し、次にRO水(2CV、4L、200mL/分、153cm/時)、続いて1M NaHCO3(3CV、6L、200mL/分、153cm/時)及びRO水(3CV、6L、200mL/分、153cm/時)で洗浄することにより重炭酸塩型に変換した。完了したとき、カラム流出液の導電率は≦10microS/cm(pH4.5〜6)であった。
BPG 100/500カラムに、上述のようにQ-Sepharose Big Beads陰イオン交換樹脂(塩化物型;10cm ID×25.5cm)2.0Lを充填し、214nm及び271nmの両方で読むことができるUV検出器を備えたDynamax SD-1 HPLCシステムに連結した。カラムを脱気水2CV(4L)により100mL/分(76cm/時)で洗浄することにより、20%エタノール充填溶液を除去した。次にカラムを1M NaOH(2CV、4L、100mL/分、76cm/時)で洗浄することにより消毒し、次にRO水(2CV、4L、200mL/分、153cm/時)、続いて1M NaHCO3(3CV、6L、200mL/分、153cm/時)及びRO水(3CV、6L、200mL/分、153cm/時)で洗浄することにより重炭酸塩型に変換した。完了したとき、カラム流出液の導電率は≦10microS/cm(pH4.5〜6)であった。
実施例1.3の反応混合物(335mL、pH7.25、導電率0.40mS/cm)を流量40mL/分(30.6cm/時)で、調製したカラムに装填した。装填が完了後、容器を水約500mLで濯ぎ、この溶液をカラムに装填した。次に全ての非結合不純物がカラムから洗浄され、UVシグナル(217及び271nm)がベースラインに戻るまで、カラムをRO水4L(2CV)により流量200mL/分(153cm/時)で洗浄した。段階溶出を利用して生成物を溶出した。図7に示すように2mM NaHCO3 2.0L(1.0CV)を用いて流量200mL/分(153cm/時)で、まずSA−PEG不純物(保持時間44分)をカラムから溶出した。次に溶離緩衝液濃度を上げ、20mM NaHCO3 6L(3CV)により流量200mL/分(153cm/時)で生成物(保持時間47分)を溶出した。カラム溶出を214nm及び271nmの両方でUV吸収によりモニターし、適切な画分を採取した(図7)。生成物ピーク最大の吸収の20%までUV271読み値が上昇したとき(SA−PEG不純物ショルダーの除去を可能にする)生成物の分画を開始し、主要な生成物ピークの立下り側でピーク最大値の約5%のときに終了した。生成物含有画分をプールして(4.05L、pH=7.4、1218microS/cm)、次の工程に使用した。
実施例3
限外濾過を利用する脱塩
3.1. CMP−SA−グリセロール−PEG−10kDa生成物プールの接線流濾過(TFF)
実施例2.2のQ-Sepharose Big Beadsプール1.5Lを、後述の表1に要約したプロセスパラメーターを利用して接線流濾過(TFF)により脱塩した。Masterflex L/S蠕動ポンプは、3つのMillipore 1kDa Pellicon 2 "MINI"フィルター(PLAC-V 1kDa再生セルロース膜;スクリーンタイプ:V;0.1m2)を取り付けたMillipore Pellicon-2 Mini Holderに、シリコーンチューブ(L/S 24)で連結した。生成物水溶液約500mLを500mLのPETG瓶に移し、これを氷浴に浸した。磁気撹拌棒を使用して溶液を撹拌し、温度をモニターし、このプロセスの間中14〜16℃に維持した。供給ライン及び保持液ラインの両方をTFFシステム上のPETG瓶の中に入れた。溶液の残り1L(これも氷浴を使用して冷却した)を、別のシリコーンチューブ(L/S 25)を介して第2のMasterflex蠕動ポンプを使用してPETG瓶に供給した。第2のポンプの移送流量は、PETG瓶中で一定容量を維持するために、TFFプロセスの透過液流量と等しくなるように設定した。透過溶液は250mLのメスシリンダー中に画分として採取し、採取した溶液各250mLを保存瓶に移した。蠕動ポンプの初期流量は1200mL/分に設定し、保持液バルブはこのプロセスの間中一定のTMP(〜22psi)を維持するように調整した。透過溶液を容量250mL毎にサンプリングし、pH及び導電率を記録した。透過液流量も手動で記録した。元々の生成物溶液1.5Lが総量約500mLに濃縮されたら、PETG保持液瓶に冷却RO水を加えて一定容量を維持した。透過溶液を500mL毎に連続的にサンプリングした。透過液の容量が〜2000mLに達し、透過溶液の導電率が47microS/cmに落ちたら、移送ポンプを止めた。次に保持溶液を別のPETG瓶(1L)に移した。次いでRO水(150mL)を保持液PETG瓶に加え、TFFシステム中を5分間再循環させた。こうしてシステム中の残りの生成物を除去した。次に元々の保持溶液と洗浄保持溶液とを合わせた。CMP−SA−PEG−10kDaのTFF工程総回収率は、HPLC分析に基づき90%であった(表2)。再び合わせた保持溶液(488mL、pH=7.31、138microS/cm)を凍結乾燥すると、白色の固体7.15g(プロセス総収率66%)が得られたが、これは現行分析法で87%の純度であった(表3)。凍結乾燥生成物を1H−NMRにより分析した。
限外濾過を利用する脱塩
3.1. CMP−SA−グリセロール−PEG−10kDa生成物プールの接線流濾過(TFF)
実施例2.2のQ-Sepharose Big Beadsプール1.5Lを、後述の表1に要約したプロセスパラメーターを利用して接線流濾過(TFF)により脱塩した。Masterflex L/S蠕動ポンプは、3つのMillipore 1kDa Pellicon 2 "MINI"フィルター(PLAC-V 1kDa再生セルロース膜;スクリーンタイプ:V;0.1m2)を取り付けたMillipore Pellicon-2 Mini Holderに、シリコーンチューブ(L/S 24)で連結した。生成物水溶液約500mLを500mLのPETG瓶に移し、これを氷浴に浸した。磁気撹拌棒を使用して溶液を撹拌し、温度をモニターし、このプロセスの間中14〜16℃に維持した。供給ライン及び保持液ラインの両方をTFFシステム上のPETG瓶の中に入れた。溶液の残り1L(これも氷浴を使用して冷却した)を、別のシリコーンチューブ(L/S 25)を介して第2のMasterflex蠕動ポンプを使用してPETG瓶に供給した。第2のポンプの移送流量は、PETG瓶中で一定容量を維持するために、TFFプロセスの透過液流量と等しくなるように設定した。透過溶液は250mLのメスシリンダー中に画分として採取し、採取した溶液各250mLを保存瓶に移した。蠕動ポンプの初期流量は1200mL/分に設定し、保持液バルブはこのプロセスの間中一定のTMP(〜22psi)を維持するように調整した。透過溶液を容量250mL毎にサンプリングし、pH及び導電率を記録した。透過液流量も手動で記録した。元々の生成物溶液1.5Lが総量約500mLに濃縮されたら、PETG保持液瓶に冷却RO水を加えて一定容量を維持した。透過溶液を500mL毎に連続的にサンプリングした。透過液の容量が〜2000mLに達し、透過溶液の導電率が47microS/cmに落ちたら、移送ポンプを止めた。次に保持溶液を別のPETG瓶(1L)に移した。次いでRO水(150mL)を保持液PETG瓶に加え、TFFシステム中を5分間再循環させた。こうしてシステム中の残りの生成物を除去した。次に元々の保持溶液と洗浄保持溶液とを合わせた。CMP−SA−PEG−10kDaのTFF工程総回収率は、HPLC分析に基づき90%であった(表2)。再び合わせた保持溶液(488mL、pH=7.31、138microS/cm)を凍結乾燥すると、白色の固体7.15g(プロセス総収率66%)が得られたが、これは現行分析法で87%の純度であった(表3)。凍結乾燥生成物を1H−NMRにより分析した。
表2では、初期供給溶液の濃縮及び脱塩後に、保持液容量を測定した。保持液温度は、濃縮工程の開始時に測定した初期保持液温度、及びダイアフィルトレーション工程の最後の最終保持液温度である。保持液pHは、第1の保持液(濃縮及びダイアフィルトレーション後)をシステム洗浄保持液と合わせた後に測定した。保持液の導電率は、第1の保持液(濃縮及びダイアフィルトレーション後)をシステム洗浄保持液と合わせた後に測定した。生成物総回収率は、最終の合わせた保持液(濃縮、ダイアフィルトレーション及びシステム洗浄後)中の生成物の量と比較したシステム供給溶液中の生成物の総量に基づいて決定した。
表3では、乾燥重量は凍結乾燥後の固体重量である。純度は、RP−HPLCにより測定した凍結乾燥生成物中の生成物の量を、凍結乾燥試料中の固体の総量で割って求めた(生成物の分子量として、CMP−SA−PEG−10kDaには10,600ダルトン、又はCMP−SA−PEG−20kDaには20,600ダルトンを仮定した)。製造プロセス(反応、溶媒留去、AEX精製、濃縮/ダイアフィルトレーション、及び凍結乾燥工程)の総回収率は、得られた生成物のモル数をカップリング反応で使用した制限試薬(CMP−SA−Gly)のモル数で割った比に、処理した生成物プールの割合を掛けたもの×100%に基づいて算出した。
3.2. CMP−SA−グリセロール−PEG−20kDa生成物プールの接線流濾過
実施例2.3のQ-Sepharose Big Beads生成物プール(2.0L)を、上記の表1に要約したプロセスパラメーターを使用して接線流濾過により脱塩した。Masterflex L/S蠕動ポンプは、3つのMillipore 1kDa Pellicon 2 "MINI"フィルター(PLAC-V 1kDa再生セルロース膜;スクリーンタイプ:V;0.1m2)を取り付けたMillipore Pellicon-2 Mini Holderに、シリコーンチューブ(L/S 24)を用いて連結した。生成物水溶液約500mLを500mLのPETG瓶に移し、これを氷浴に浸した。磁気撹拌棒を使用して溶液を撹拌し、温度をモニターし、このプロセスの間中4℃に維持した。供給ライン及び保持液ラインの両方をTFFシステム上のPETG瓶の中に入れた。溶液の残り1.5L(これも氷浴を使用して冷却した)を、別のシリコーンチューブ(L/S 25)を介して第2のMasterflex蠕動ポンプを使用してPETG瓶に供給した。第2のポンプの移送流量は、供給PETG瓶中で一定容量を維持するために、TFFプロセスの透過液流量と等しくなるように設定した。透過溶液は500mLのメスシリンダーを使用して500mL画分として採取し、保存瓶に移した。蠕動ポンプの初期流量は1200mL/分に設定し、次いで保持液バルブは、このプロセスの間中一定のTMP(〜22psi)を維持するように調整した。処理中、透過溶液を採取500mL毎にサンプリングし、pH及び導電率を記録した。透過液流量も手動で記録した。供給される生成物溶液の元々の容量(2.0L)が総容量約500mLに濃縮されたら、保持溶液をダイアフィルトレーションした。TFFシステムに連結したPETG保持液瓶に冷却RO水(4℃)を、ダイアフィルトレーション中一定容量を維持する速度で加えた。透過溶液を500mL毎に連続的にサンプリングし、導電率及びpHを記録した。透過液の容量が〜2000mLに達し、透過溶液の導電率が56microS/cmに落ちたら、移送ポンプを止めた。次に保持溶液を別のPETG瓶(1L)に移した。RO水(150mL)を供給PETG瓶に加え、TFFシステム中を5分間再循環させた。次に元々の保持溶液と洗浄保持溶液とを合わせた。CMP−SA−PEG−20kDaのTFF工程総回収率は、HPLC分析で測定すると112%であった(表3)。合わせた保持溶液(530mL、pH=7.81、110microS/cm)を凍結乾燥することにより、10.52g(総プロセス収率77%)を白色の固体として得たが、これは現行分析法で96%の純度であった(表3)。凍結乾燥生成物を1H−NMRにより分析した。
実施例2.3のQ-Sepharose Big Beads生成物プール(2.0L)を、上記の表1に要約したプロセスパラメーターを使用して接線流濾過により脱塩した。Masterflex L/S蠕動ポンプは、3つのMillipore 1kDa Pellicon 2 "MINI"フィルター(PLAC-V 1kDa再生セルロース膜;スクリーンタイプ:V;0.1m2)を取り付けたMillipore Pellicon-2 Mini Holderに、シリコーンチューブ(L/S 24)を用いて連結した。生成物水溶液約500mLを500mLのPETG瓶に移し、これを氷浴に浸した。磁気撹拌棒を使用して溶液を撹拌し、温度をモニターし、このプロセスの間中4℃に維持した。供給ライン及び保持液ラインの両方をTFFシステム上のPETG瓶の中に入れた。溶液の残り1.5L(これも氷浴を使用して冷却した)を、別のシリコーンチューブ(L/S 25)を介して第2のMasterflex蠕動ポンプを使用してPETG瓶に供給した。第2のポンプの移送流量は、供給PETG瓶中で一定容量を維持するために、TFFプロセスの透過液流量と等しくなるように設定した。透過溶液は500mLのメスシリンダーを使用して500mL画分として採取し、保存瓶に移した。蠕動ポンプの初期流量は1200mL/分に設定し、次いで保持液バルブは、このプロセスの間中一定のTMP(〜22psi)を維持するように調整した。処理中、透過溶液を採取500mL毎にサンプリングし、pH及び導電率を記録した。透過液流量も手動で記録した。供給される生成物溶液の元々の容量(2.0L)が総容量約500mLに濃縮されたら、保持溶液をダイアフィルトレーションした。TFFシステムに連結したPETG保持液瓶に冷却RO水(4℃)を、ダイアフィルトレーション中一定容量を維持する速度で加えた。透過溶液を500mL毎に連続的にサンプリングし、導電率及びpHを記録した。透過液の容量が〜2000mLに達し、透過溶液の導電率が56microS/cmに落ちたら、移送ポンプを止めた。次に保持溶液を別のPETG瓶(1L)に移した。RO水(150mL)を供給PETG瓶に加え、TFFシステム中を5分間再循環させた。次に元々の保持溶液と洗浄保持溶液とを合わせた。CMP−SA−PEG−20kDaのTFF工程総回収率は、HPLC分析で測定すると112%であった(表3)。合わせた保持溶液(530mL、pH=7.81、110microS/cm)を凍結乾燥することにより、10.52g(総プロセス収率77%)を白色の固体として得たが、これは現行分析法で96%の純度であった(表3)。凍結乾燥生成物を1H−NMRにより分析した。
3.3. CMP−SA−グリセロール−PEG−40kDa生成物プールの接線流濾過
実施例2.4のQ-Sepharose Big Beads生成物プール(4.05L)を、後述の表4に要約したプロセスパラメーターを使用して接線流濾過(TFF)により脱塩した。Masterflex L/S蠕動ポンプ(TFFポンプ)は、2つのMillipore 1kDa Pellicon 2再生セルロース膜;スクリーンタイプ:V;0.5m2を取り付けたMillipore Pellicon-2 Holderに、シリコーンチューブ(L/S 35)を介して連結した。生成物水溶液約1Lを1LのPETG瓶に移し、これを氷浴に浸した。磁気撹拌棒により溶液を撹拌し、全プロセスの間中温度をモニターした。残りの生成物溶液を氷浴で冷却し、この溶液をシリコーンチューブ(L/S 25)を介して第2のMasterflex蠕動ポンプによりPETG瓶に供給した。第2ポンプの移送速度は、PETG瓶中で一定容量を維持するために、透過液流量と等しくなるように設定した。供給ライン及び保持液ラインの両方をTFFシステム上のPETG瓶に入れた。透過溶液は1.0Lのメスシリンダー中に1.0L画分として集め、保存瓶に移した。TFF蠕動ポンプの初期流量を2.4L/分に設定し、このプロセスの間中一定のTMP(〜20psi)を維持するように保持液バルブを調整した。採取した溶液1.0L毎に透過液をサンプリングし、pH及び導電率を記録した。透過液流量も手動で記録した。元々の生成物溶液4.0Lが総容量約1.0Lに濃縮されたら、保持液をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションの間、一定容量を維持する速度で、冷却RO水(4℃)をPETG保持液瓶に加えた。透過溶液を1.0L毎に連続的にサンプリングした。透過溶液の総容量が〜4.0Lに達し、透過溶液の導電率が56microS/cmに落ちたら、移送ポンプを止めた。次に保持溶液を別のPETG瓶(2L)に移した。RO水(350mL)をPETG保持液瓶に加え、TFFシステム中を5分間再循環させた。次に元々の保持溶液と洗浄保持溶液とを合わせた。CMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaのTFF工程総回収率は、最終保持液プール及び元々のイオン交換プールのHPLC分析に基づき93%であった(表5、プロセス#1)。最終TFF生成物溶液(1060mL、pH7.60、66microS/cm)を凍結乾燥することにより、5.82g(総プロセス収率67%)の白色の固体を、HPLCによる純度92%で得た(表6、プロセス1)。凍結乾燥生成物を1H−NMRにより分析した。
実施例2.4のQ-Sepharose Big Beads生成物プール(4.05L)を、後述の表4に要約したプロセスパラメーターを使用して接線流濾過(TFF)により脱塩した。Masterflex L/S蠕動ポンプ(TFFポンプ)は、2つのMillipore 1kDa Pellicon 2再生セルロース膜;スクリーンタイプ:V;0.5m2を取り付けたMillipore Pellicon-2 Holderに、シリコーンチューブ(L/S 35)を介して連結した。生成物水溶液約1Lを1LのPETG瓶に移し、これを氷浴に浸した。磁気撹拌棒により溶液を撹拌し、全プロセスの間中温度をモニターした。残りの生成物溶液を氷浴で冷却し、この溶液をシリコーンチューブ(L/S 25)を介して第2のMasterflex蠕動ポンプによりPETG瓶に供給した。第2ポンプの移送速度は、PETG瓶中で一定容量を維持するために、透過液流量と等しくなるように設定した。供給ライン及び保持液ラインの両方をTFFシステム上のPETG瓶に入れた。透過溶液は1.0Lのメスシリンダー中に1.0L画分として集め、保存瓶に移した。TFF蠕動ポンプの初期流量を2.4L/分に設定し、このプロセスの間中一定のTMP(〜20psi)を維持するように保持液バルブを調整した。採取した溶液1.0L毎に透過液をサンプリングし、pH及び導電率を記録した。透過液流量も手動で記録した。元々の生成物溶液4.0Lが総容量約1.0Lに濃縮されたら、保持液をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションの間、一定容量を維持する速度で、冷却RO水(4℃)をPETG保持液瓶に加えた。透過溶液を1.0L毎に連続的にサンプリングした。透過溶液の総容量が〜4.0Lに達し、透過溶液の導電率が56microS/cmに落ちたら、移送ポンプを止めた。次に保持溶液を別のPETG瓶(2L)に移した。RO水(350mL)をPETG保持液瓶に加え、TFFシステム中を5分間再循環させた。次に元々の保持溶液と洗浄保持溶液とを合わせた。CMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaのTFF工程総回収率は、最終保持液プール及び元々のイオン交換プールのHPLC分析に基づき93%であった(表5、プロセス#1)。最終TFF生成物溶液(1060mL、pH7.60、66microS/cm)を凍結乾燥することにより、5.82g(総プロセス収率67%)の白色の固体を、HPLCによる純度92%で得た(表6、プロセス1)。凍結乾燥生成物を1H−NMRにより分析した。
表5では、初期供給溶液の濃縮及び脱塩後に保持液容量を測定した。システムの初期保持液温度は、濃縮工程の開始時に測定した。最終保持液温度はダイアフィルトレーション工程の最後に測定した。保持液のpHは、第1の保持液(濃縮及びダイアフィルトレーション後)をシステム洗浄保持液と合わせた後に測定した。保持液の導電率は、第1の保持液(濃縮及びダイアフィルトレーション後)とシステム洗浄保持液とを合わせた後に測定した。生成物回収率は、出発IEXプールの生成物(RP−HPLC濃度×容量)に対する最終TFF保持液プール中の生成物(RP−HPLC濃度×容量)の比から算出した。
表6では、生成物質量はTFF保持液プールのRP−HPLC濃度値及び容量から算出した。純度は、RP−HPLCを使用して決定し、CMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaの質量についての製造業者(NOF)の分析証明書のmPEG分子量(43,347ダルトン)を使用して算出した。総回収率は、得られた生成物のモル数(乾燥重量から)を反応における制限試薬のモル数で割った比に、処理した生成物プールの割合を掛けたもの×100%に基づいて、反応、クロマトグラフィー及びTFFをプロセスを合わせたものについて算出した。
実施例4
限外濾過を利用する追加の脱塩実験
4.1. 5kDa膜を使用するCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaの脱塩
Masterflex L/S蠕動ポンプは、1つのMillipore 5kDa Pellicon 2 "MINI"フィルター(PLCC 5kDa再生セルロース膜;スクリーンタイプ:C;0.1m2)を取り付けたMillipore Pellicon-2 Mini Holderに、シリコーンチューブ(L/S 15、#96400-15)を介して連結した。システムを2Lの水により1000mL/分でフラッシュした。次に水(2L)を1000mL/分でシステム内を再循環させ、透過液約500mLを20psiのTMPで採取した。保持液の導電率は、3microS/cmと測定した。標準化透水性(NWP)は、〜1.4L/時/m2/psiと測定した。CMP−SA−グリセロール−PEG−40kDa(4.0g)を、500mLのプラスチック瓶中の冷却Milli Q水200mLに溶解し、これを氷浴に浸した。磁気撹拌棒により溶液を撹拌した。供給ライン及び保持液ラインの両方をPETG瓶に入れた。この溶液を500mL/分で5分間システム中を再循環させた。次にポンプ速度を1000mL/分に上げ、保持液圧力を13psiに調整し、これにより供給圧力25psi及びTMP 19psiが得られた。このプロセスの間、TMPを一定に維持した。透過液を100mL画分として採取し、各画分の対応する時間及び保持液の温度を記録した。第2の蠕動ポンプを使用して冷却Milli Q水を送ることにより、保持液瓶中の一定容量を維持した。透過液600mLが採取されたら、透析工程を完了した。最終の100mL画分の導電率は12microS/cmであった。保持液の温度は、本プロセスの間15〜16℃であった。平均透過液流量は28.6mL/分であり、計算された流量は17.2L/時/m2であった。標準化した透過液速度は0.90L/時/m2/psiであった。保持液を別の瓶に移し、システムに水100mLを5分間再循環させた。次に元々の保持溶液と洗浄保持溶液とを合わせた。最終の合わせた保持溶液(〜350mL、pH6.6、33microS/cm)を凍結乾燥することにより、白色の固体3.92gを98%の回収率で得た(表7)。
限外濾過を利用する追加の脱塩実験
4.1. 5kDa膜を使用するCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaの脱塩
Masterflex L/S蠕動ポンプは、1つのMillipore 5kDa Pellicon 2 "MINI"フィルター(PLCC 5kDa再生セルロース膜;スクリーンタイプ:C;0.1m2)を取り付けたMillipore Pellicon-2 Mini Holderに、シリコーンチューブ(L/S 15、#96400-15)を介して連結した。システムを2Lの水により1000mL/分でフラッシュした。次に水(2L)を1000mL/分でシステム内を再循環させ、透過液約500mLを20psiのTMPで採取した。保持液の導電率は、3microS/cmと測定した。標準化透水性(NWP)は、〜1.4L/時/m2/psiと測定した。CMP−SA−グリセロール−PEG−40kDa(4.0g)を、500mLのプラスチック瓶中の冷却Milli Q水200mLに溶解し、これを氷浴に浸した。磁気撹拌棒により溶液を撹拌した。供給ライン及び保持液ラインの両方をPETG瓶に入れた。この溶液を500mL/分で5分間システム中を再循環させた。次にポンプ速度を1000mL/分に上げ、保持液圧力を13psiに調整し、これにより供給圧力25psi及びTMP 19psiが得られた。このプロセスの間、TMPを一定に維持した。透過液を100mL画分として採取し、各画分の対応する時間及び保持液の温度を記録した。第2の蠕動ポンプを使用して冷却Milli Q水を送ることにより、保持液瓶中の一定容量を維持した。透過液600mLが採取されたら、透析工程を完了した。最終の100mL画分の導電率は12microS/cmであった。保持液の温度は、本プロセスの間15〜16℃であった。平均透過液流量は28.6mL/分であり、計算された流量は17.2L/時/m2であった。標準化した透過液速度は0.90L/時/m2/psiであった。保持液を別の瓶に移し、システムに水100mLを5分間再循環させた。次に元々の保持溶液と洗浄保持溶液とを合わせた。最終の合わせた保持溶液(〜350mL、pH6.6、33microS/cm)を凍結乾燥することにより、白色の固体3.92gを98%の回収率で得た(表7)。
4.2. 3kDa膜を使用するCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaの脱塩
Masterflex L/S蠕動ポンプは、1つのMillipore 3kDa Pellicon 2 "MINI"フィルター(PLCC 3kDa再生セルロース膜;スクリーンタイプ:C;0.1m2)を取り付けたMillipore Pellicon-2 Mini Holderに、シリコーンチューブ(L/S 15、#96400-15)を介して連結した。システムを水2Lにより1000mL/分でフラッシュした。次に水2Lを1000mL/分でシステムに再循環させ、透過液約500mLを20psiのTMPで採取した。保持液の導電率は、5microS/cmと測定した。標準化透水性(NWP)は、〜0.75L/時/m2/psiと測定した。CMP−SA−グリセロール−PEG−40kDa(4.0g)を、500mLのプラスチック瓶中の冷却Milli Q水200mLに溶解し、これを氷浴に浸した。磁気撹拌棒により溶液を撹拌した。供給ライン及び保持液ラインの両方を瓶に入れた。この溶液をシステム中に500mL/分で5分間再循環させた。次にポンプ速度を1000mL/分に上げ、保持液圧力を20psiに調整し、これにより供給圧力20psi及びTMP 20psiが得られた。本プロセスの間、TMPは一定に維持した。透過液を100mL画分として採取し、各画分の対応する時間及び保持液の温度を記録した。第2の蠕動ポンプを使用して冷却Milli Q水を送ることにより、保持液瓶中の一定容量を維持した。透過液600mLが採取されたら、透析工程を完了した。最終の100mL画分の導電率は34microS/cmであった。保持液の温度は、本プロセスの間13〜15℃であった。平均透過液流量は16.7mL/分であり、計算された流量は10.0L/時/m2であり、標準化した透過液速度は0.50L/時/m2/psiであった。保持液を別の瓶に移し、システムに水100mLを5分間再循環させた。次に元々の保持溶液と洗浄保持溶液とを合わせた。合わせた保持溶液(〜300mL、pH7.4、56microS/cm)を凍結乾燥することにより、白色の固体3.86gを95%の回収率で得た(表7)。
Masterflex L/S蠕動ポンプは、1つのMillipore 3kDa Pellicon 2 "MINI"フィルター(PLCC 3kDa再生セルロース膜;スクリーンタイプ:C;0.1m2)を取り付けたMillipore Pellicon-2 Mini Holderに、シリコーンチューブ(L/S 15、#96400-15)を介して連結した。システムを水2Lにより1000mL/分でフラッシュした。次に水2Lを1000mL/分でシステムに再循環させ、透過液約500mLを20psiのTMPで採取した。保持液の導電率は、5microS/cmと測定した。標準化透水性(NWP)は、〜0.75L/時/m2/psiと測定した。CMP−SA−グリセロール−PEG−40kDa(4.0g)を、500mLのプラスチック瓶中の冷却Milli Q水200mLに溶解し、これを氷浴に浸した。磁気撹拌棒により溶液を撹拌した。供給ライン及び保持液ラインの両方を瓶に入れた。この溶液をシステム中に500mL/分で5分間再循環させた。次にポンプ速度を1000mL/分に上げ、保持液圧力を20psiに調整し、これにより供給圧力20psi及びTMP 20psiが得られた。本プロセスの間、TMPは一定に維持した。透過液を100mL画分として採取し、各画分の対応する時間及び保持液の温度を記録した。第2の蠕動ポンプを使用して冷却Milli Q水を送ることにより、保持液瓶中の一定容量を維持した。透過液600mLが採取されたら、透析工程を完了した。最終の100mL画分の導電率は34microS/cmであった。保持液の温度は、本プロセスの間13〜15℃であった。平均透過液流量は16.7mL/分であり、計算された流量は10.0L/時/m2であり、標準化した透過液速度は0.50L/時/m2/psiであった。保持液を別の瓶に移し、システムに水100mLを5分間再循環させた。次に元々の保持溶液と洗浄保持溶液とを合わせた。合わせた保持溶液(〜300mL、pH7.4、56microS/cm)を凍結乾燥することにより、白色の固体3.86gを95%の回収率で得た(表7)。
表7では、温度は、ダイアフィルトレーションプロセスの間中システムの保持液温度範囲である。導電率は、第1の保持液(ダイアフィルトレーション後)とシステムの洗浄保持液とを合わせた後の保持液で測定した。生成物の回収率は、凍結乾燥TFF生成物の質量対TFFの元々の溶液(4g)を調製するのに使用したCMP−SA−グリセロール−PEGの質量の比から算出した。
実施例5
カップリング(PEG化)反応の最適化
CMP−SA−PEG−10kDaを生成するのに使用したカップリング反応を最適化することにより、変換収率を改善し、反応中のプロセス操作を単純化した(表8)。最高の変換収率を得るのに、わずかにモル過剰のmPEG−pNP試薬(1.2〜1.5モル当量)が必要であった。反応は、THF/水(4/1)中で3.4〜3.7mMのCMP−SA−グリシン濃度及び50〜55mg/mLのmPEG−pNP濃度で行った。
カップリング(PEG化)反応の最適化
CMP−SA−PEG−10kDaを生成するのに使用したカップリング反応を最適化することにより、変換収率を改善し、反応中のプロセス操作を単純化した(表8)。最高の変換収率を得るのに、わずかにモル過剰のmPEG−pNP試薬(1.2〜1.5モル当量)が必要であった。反応は、THF/水(4/1)中で3.4〜3.7mMのCMP−SA−グリシン濃度及び50〜55mg/mLのmPEG−pNP濃度で行った。
表8では、PEG−pNPは10kDa−PEG−pNP(仮定MW:10,000ダルトン、100%活性化を仮定)であり、緩衝液は、反応のpHを維持するのに加えられるリン酸緩衝液(0.5M)の量であり、pHは、カップリング反応中に観測されるpH範囲である。カップリング反応完了後のPSC対GSCの量比はHPLCを利用して測定した。全ての計算は、二ナトリウム塩(MW=673)としてのGSC(CMP−SA−グリシン)について純度73.5%の乾燥重量純度を使用し、10kDa−mPEG−pNPについて10,000ダルトン、CMP−SA−PEG−10kDaについて10,700ダルトンの分子量を仮定する。全ての反応は約19〜約20℃の間で実行した。各反応物に加えられるGSCの質量及びモル数は、実際の試薬の純度について補正した。Rkt時間は総反応時間である。反応終了後のPSC濃度は、HPLCにより測定した。変換収率はPSC量(HPLC)対GSC量(使用量)の比に基づいた。反応1〜4は、較正標準物質としてCMP−SA−PEG−10kDaを使用してRP−HPLCにより分析した。反応5〜10は、較正標準物質としてCMP−SA−グリシンを使用した。
データは、最高の変換収率を達成するのに、反応混合物の初期pH8.6〜8.7が決定的であることを示す(表8)。このプロセスを通して最適pH範囲は約8.0と8.8の間であった。pHが8.0より低くなると、反応は劇的に遅くなり変換収率が低くなった。pHが7.0より低いと、このような条件下では加水分解のためにCMP−SA−グリシン及びCMP−SA−PEGが分解することにより、CMP、シアル酸−グリシン及びシアル酸−PEGが生成するため、pHがこれより低くならないように注意した(図3)。pHが8.8より高いと、10kDa−mPEG−pNP試薬は急速に加水分解して、変換収率が低くなった(図1、表8:反応1及び2)。いくつかのCMP−SA−グリシン試薬は残存NaOH(この試薬のナトリウム塩型を確保するため)を含有し、これが水に溶解するとpH>10で溶液を生成した。したがってカップリング反応の確立における第1段階は、CMP−SA−グリシンの水への溶解であり、これには、mPEG−pNPを加える前に、pHを約8.6に下げるための緩衝液(リン酸ナトリウム、pH4.6)の添加が必要であった。pH調整後、mPEG−pNPを反応混合物に加え、この反応混合物を周囲温度(約19〜20℃)で維持した。反応が進行すると、加えたリン酸緩衝液がpH8.0より低くなることを防ぎ、酸性種のp−ニトロフェノールが生成した。しかしpHが8.0より下がった場合、水酸化ナトリウム(0.1N)を使用することによりpHを8.6に上げた。
反応混合物の粘度のために、安定なpH読み値を達成することは時に困難であり、特に大きなPEG類が関与する反応の場合はそうであった。より大きなPEG類(20kDa及びグリセロール−40kDa)については、より高濃度のmPEG−pNPを使用することにより収率を上昇させた。CMP−SA−グリシン濃度が3.3で、反応混合物1mL当たりmPEG−pNP 100mgの濃度を使用した(表9と10)。より高濃度のPEGを使用した場合、変換収率は約10%上昇した(表10、反応1〜4)。
カップリング反応は、完了するまで約24〜約72時間を必要とした。反応はRP−HPLCを利用してモニターした。ある反応条件(特により大きなPEG分子が関与するもの)では、約48〜約72時間もの長い反応時間が必要であった。
異なる比のカップリング試薬(GSC及び40kDa−グリセロール−mPEG−p−ニトロフェニルカーボネート)を使用しても、変換収率に有意な差は観察されなかった。表10は、1.4モル当量GSC/1モル当量活性化PEGによる反応が、1.1モル当量活性化PEG/モル当量GSCを含有する反応と、その他は同じ条件下で同じ結果を与えることを示す(反応2及び3)。大過剰の40kDa−グリセロール−mPEG−p−ニトロフェニルカーボネートを使用して変換収率を上げることができるかも知れないが、プロセスの経済学としてあまり好ましくない。
CMP−SA−PEG−20kDa及びCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaを製造するためのPEG化反応も、100%水中で実行した(THF無し)(表9)。最初は、THFの非存在下では反応プロセスがより迅速に進行し、プロセス自体が単位操作としての回転蒸発を必要としないであろうと推定された。結果は、水性反応が可能であることを示す。しかし20kDa反応については、充分なpHモニタリング及び0.1N NaOHによるpH調整が、特に反応の最初の数時間には必要であった。その結果、有意な時間節約は観察されなかった。更に100%水を使用してCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaを製造した場合、グリセロール−mPEG−p−ニトロフェニルカーボネートは容易に溶解しなかった。これは、反応の速度と変換収率に影響を与えた。溶媒として水のみを使用してPEG化最適化プロセスの一環として、異なる緩衝液も検討した。しかし重炭酸ナトリウム緩衝液(10mM、pH8.1)及びホウ酸ナトリウム緩衝液(10mM、pH8.6)の両方ともが、低い変換収率を与えた(表10)。
表9では、GSCはCMP−SA−グリシンであり、PSCはCMP−SA−PEG−20kDaである。全ての計算は、二ナトリウム塩(673ダルトン)としてのGSCについて純度73.5%(HPLC)の乾燥重量純度を使用し、20kDa mPEG−pNPについて分子量20,000ダルトン及び100%活性化を、そしてCMP−SA−PEG−20kDaについて分子量20,700ダルトンを仮定する。各反応に加えられるGSCの質量及びモル数は、実際の試薬の純度について補正した。「緩衝液」は、反応のpHを維持するために加えられたリン酸緩衝液(0.5M)の量を示す。「pH範囲」は、カップリング反応の間に観測されたpH範囲を示す。「Rkt時間」は総反応時間である。PSC対GSCの量比は、カップリング反応完了後にHPLCにより測定した。PSCの濃度は、反応終了後にHPLCにより測定した。変換収率は、HPLCにより測定したPSC対GSCの量比に基づく。
表10では、GSCはCMP−SA−グリシンであり、PSCはCMP−SA−PEG−40kDaである。全ての計算は、二ナトリウム塩(673ダルトン)としてのGSCについて純度73.5%の乾燥重量純度を使用し、40kDa−mPEG−pNP(90%活性化)について分子量42,843ダルトンを、そしてCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaについて分子量40,700ダルトンを仮定する。各反応に加えられるGSCの質量及びモル数は、実際の試薬の純度について補正した。「緩衝液」は、反応のpHを維持するために加えられたリン酸緩衝液(0.5M)の量を示す。「pH範囲」は、カップリング反応の間に観測されたpH範囲を示す。「Rkt時間」は総反応時間である。PSC対GSCの量比は、カップリング反応終了後にHPLCにより測定した。PSCの濃度は、反応終了後にHPLCにより測定した。変換収率は、HPLCにより測定したPSC対GSCの量比に基づく。反応8及び9は、リン酸ナトリウム緩衝液の代わりに10mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH8.6)10mLを使用して実行した。
実施例6
CMP−SA−PEG類の典型的な製造プロセス
6.1. CMP−SA−PEG−10kDaの典型的な製造プロセス
CMP−SA−グリシンを水及びTHF(1部対4部)に3.4mMの濃度で溶解した。この溶液をリン酸ナトリウムでpH8.6に調整し、次に10kDa mPEG−pNP試薬を加えた(CMP−SA−グリシンの実際のモル数に対して1.5モル当量)。pHを8.6に維持しながら、この反応物を室温で20〜48時間撹拌した。反応は、RP−HPLCによりモニターし、完了後、反応混合物を回転蒸発により濃縮してTHFを除去した。濃縮した水性反応混合物を水(400mL)で、元々の反応物容量の1.7倍の最終容量まで希釈した。導電率を測定すると、1microS/cm未満であった。この生成物の希薄溶液をQ-Sepharose Big Beadsカラム(樹脂ベッド高さを少なくとも10cmにして、樹脂1リットル当たりPEG試薬10g)に流量50cm/時で装填した。非結合物質は、水2CVでカラムから洗浄した。SA−PEG−10kDa不純物は、5mM NaHCO3(0.6CV)により流量100cm/時で、カラムから溶出した。30mM NaHCO3(3CV)によりこれも流量100cm/時で、純粋な生成物CMP−SA−PEG−10kDaを溶出した。図4に示すように、生成物の分画は、UV271読み値がSA−PEG不純物ピークの後にベースラインを超えて上昇したときに開始し、生成物ピークの立下り側でピーク最大値の約5%のときに終了した。プールした生成物を4℃に冷却し、1kDa再生セルロース膜を使用する接線流濾過システムを利用して3倍濃縮した(生成物濃度が約14g/Lまで)。4℃の水(4保持液容量)による保持液のダイアフィルトレーションを利用して塩を除去し、透過液の導電率が供給水の導電率に近づくまで続けた。次に精製したCMP−SA−PEG−10kDa溶液を凍結し、凍結乾燥した。
CMP−SA−PEG類の典型的な製造プロセス
6.1. CMP−SA−PEG−10kDaの典型的な製造プロセス
CMP−SA−グリシンを水及びTHF(1部対4部)に3.4mMの濃度で溶解した。この溶液をリン酸ナトリウムでpH8.6に調整し、次に10kDa mPEG−pNP試薬を加えた(CMP−SA−グリシンの実際のモル数に対して1.5モル当量)。pHを8.6に維持しながら、この反応物を室温で20〜48時間撹拌した。反応は、RP−HPLCによりモニターし、完了後、反応混合物を回転蒸発により濃縮してTHFを除去した。濃縮した水性反応混合物を水(400mL)で、元々の反応物容量の1.7倍の最終容量まで希釈した。導電率を測定すると、1microS/cm未満であった。この生成物の希薄溶液をQ-Sepharose Big Beadsカラム(樹脂ベッド高さを少なくとも10cmにして、樹脂1リットル当たりPEG試薬10g)に流量50cm/時で装填した。非結合物質は、水2CVでカラムから洗浄した。SA−PEG−10kDa不純物は、5mM NaHCO3(0.6CV)により流量100cm/時で、カラムから溶出した。30mM NaHCO3(3CV)によりこれも流量100cm/時で、純粋な生成物CMP−SA−PEG−10kDaを溶出した。図4に示すように、生成物の分画は、UV271読み値がSA−PEG不純物ピークの後にベースラインを超えて上昇したときに開始し、生成物ピークの立下り側でピーク最大値の約5%のときに終了した。プールした生成物を4℃に冷却し、1kDa再生セルロース膜を使用する接線流濾過システムを利用して3倍濃縮した(生成物濃度が約14g/Lまで)。4℃の水(4保持液容量)による保持液のダイアフィルトレーションを利用して塩を除去し、透過液の導電率が供給水の導電率に近づくまで続けた。次に精製したCMP−SA−PEG−10kDa溶液を凍結し、凍結乾燥した。
6.2. 典型的なCMP−SA−PEG−20kDaの製造プロセス
CMP−SA−グリシンを水及びTHF(1部対4部)に3.3mMの濃度で溶解した。この溶液をリン酸ナトリウムでpH8.6に調整し、20kDa mPEG−pNP試薬(CMP−SA−グリシンの実際のモル数に対して1.5モル当量)を加えた。pHを8.6に維持しながら、反応物を室温で20〜48時間撹拌した。反応は、RP−HPLCによりモニターし、反応が完了したとき、反応混合物を回転蒸発により濃縮してTHFを除去した。濃縮した水性反応混合物を水(300mL)で、元々の総反応物容量の2.4倍の最終容量まで希釈した。導電率を測定し、0.8microS/cm未満であることを確認した。希釈生成物溶液をQ-Sepharose Big Beadsカラム(樹脂ベッド高さを少なくとも10cmにして、樹脂1リットル当たりPEG試薬10g)に流量50cm/時で装填した。非結合物質は、水2CVでカラムから洗浄した。SA−PEG−10kDa不純物は、2mM NaHCO3(1CV)により流量100cm/時でカラムから溶出した。純粋な生成物は、30mM NaHCO3(3CV)によりこれも流量100cm/時で溶出した(図6)。生成物の分画は、UV271読み値がSA−PEG不純物ピークの後にベースラインを超えて上昇したときに開始し、生成物ピークの立下り側でピーク最大値の約5%のときに終了した。プールした生成物を4℃に冷却し、1kDa再生セルロース膜を含有する接線流濾過システムを利用して4倍濃縮した(生成物濃度が約21g/Lまで)。4℃の水(4保持液容量)での保持液のダイアフィルトレーションを利用して塩を除去し、透過液の導電率が供給水の導電率に近づくまで続けた。精製したCMP−SA−PEG−20kDa溶液を凍結し、凍結乾燥した。
CMP−SA−グリシンを水及びTHF(1部対4部)に3.3mMの濃度で溶解した。この溶液をリン酸ナトリウムでpH8.6に調整し、20kDa mPEG−pNP試薬(CMP−SA−グリシンの実際のモル数に対して1.5モル当量)を加えた。pHを8.6に維持しながら、反応物を室温で20〜48時間撹拌した。反応は、RP−HPLCによりモニターし、反応が完了したとき、反応混合物を回転蒸発により濃縮してTHFを除去した。濃縮した水性反応混合物を水(300mL)で、元々の総反応物容量の2.4倍の最終容量まで希釈した。導電率を測定し、0.8microS/cm未満であることを確認した。希釈生成物溶液をQ-Sepharose Big Beadsカラム(樹脂ベッド高さを少なくとも10cmにして、樹脂1リットル当たりPEG試薬10g)に流量50cm/時で装填した。非結合物質は、水2CVでカラムから洗浄した。SA−PEG−10kDa不純物は、2mM NaHCO3(1CV)により流量100cm/時でカラムから溶出した。純粋な生成物は、30mM NaHCO3(3CV)によりこれも流量100cm/時で溶出した(図6)。生成物の分画は、UV271読み値がSA−PEG不純物ピークの後にベースラインを超えて上昇したときに開始し、生成物ピークの立下り側でピーク最大値の約5%のときに終了した。プールした生成物を4℃に冷却し、1kDa再生セルロース膜を含有する接線流濾過システムを利用して4倍濃縮した(生成物濃度が約21g/Lまで)。4℃の水(4保持液容量)での保持液のダイアフィルトレーションを利用して塩を除去し、透過液の導電率が供給水の導電率に近づくまで続けた。精製したCMP−SA−PEG−20kDa溶液を凍結し、凍結乾燥した。
6.3. 典型的なCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaの製造プロセス
CMP−SA−グリシンを水及びTHF(1部対4部)に2mMの濃度で溶解した。この溶液をリン酸ナトリウムでpH8.6に調整し、40kDa mPEG−pNP試薬(CMP−SA−グリシンの実際のモル数に対して1.1モル当量)を加えた。pHを8.6に維持しながら、反応物を室温で60〜66時間撹拌した。反応は、RP−HPLCによりモニターし、反応が完了したとき、反応混合物を回転蒸発により濃縮してTHFを除去した。濃縮した水性反応混合物を水(600mL)で希釈することにより、容量を元々の総反応物容量の3.4倍まで、かつ導電率を0.5microS/cm未満まで調整した。生成物の希薄溶液をQ-Sepharose Big Beadsカラム(樹脂ベッド高さを少なくとも10cmにして、樹脂1リットル当たりPEG試薬5g)に流量30cm/時で装填した。非結合物質は、水2CVでカラムから洗浄した。SA−PEG−10kDa不純物は、2mM NaHCO3(1CV)により流量150cm/時でカラムから溶出した。純粋なCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaは、30mM NaHCO3(3CV)によりこれも150cm/時で溶出した(図7)。生成物の分画は、UV271読み値が生成物ピーク最大吸収の20%(SA−PEG不純物ショルダーの除去を可能にする)まで上昇したときに開始し、生成物ピークの立下り側でピーク最大値の約5%のときに終了した(図7)。プールした生成物を4℃に冷却し、1kDa再生セルロース膜を含有した接線流濾過システムを利用して4倍濃縮した(生成物濃度が約6g/Lまで)。システムが必要とする大きなワーキング容量のために、更なる濃縮は制限された。4℃の水(4保持液容量)での保持液のダイアフィルトレーションを利用して塩を除去し、透過液の導電率が供給水の導電率に近づくまで続けた。精製したCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDa溶液を凍結し、凍結乾燥した。
CMP−SA−グリシンを水及びTHF(1部対4部)に2mMの濃度で溶解した。この溶液をリン酸ナトリウムでpH8.6に調整し、40kDa mPEG−pNP試薬(CMP−SA−グリシンの実際のモル数に対して1.1モル当量)を加えた。pHを8.6に維持しながら、反応物を室温で60〜66時間撹拌した。反応は、RP−HPLCによりモニターし、反応が完了したとき、反応混合物を回転蒸発により濃縮してTHFを除去した。濃縮した水性反応混合物を水(600mL)で希釈することにより、容量を元々の総反応物容量の3.4倍まで、かつ導電率を0.5microS/cm未満まで調整した。生成物の希薄溶液をQ-Sepharose Big Beadsカラム(樹脂ベッド高さを少なくとも10cmにして、樹脂1リットル当たりPEG試薬5g)に流量30cm/時で装填した。非結合物質は、水2CVでカラムから洗浄した。SA−PEG−10kDa不純物は、2mM NaHCO3(1CV)により流量150cm/時でカラムから溶出した。純粋なCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaは、30mM NaHCO3(3CV)によりこれも150cm/時で溶出した(図7)。生成物の分画は、UV271読み値が生成物ピーク最大吸収の20%(SA−PEG不純物ショルダーの除去を可能にする)まで上昇したときに開始し、生成物ピークの立下り側でピーク最大値の約5%のときに終了した(図7)。プールした生成物を4℃に冷却し、1kDa再生セルロース膜を含有した接線流濾過システムを利用して4倍濃縮した(生成物濃度が約6g/Lまで)。システムが必要とする大きなワーキング容量のために、更なる濃縮は制限された。4℃の水(4保持液容量)での保持液のダイアフィルトレーションを利用して塩を除去し、透過液の導電率が供給水の導電率に近づくまで続けた。精製したCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDa溶液を凍結し、凍結乾燥した。
実施例7
陰イオン交換条件の最適化
GE HealthcareからのQ-Sepharose Big Beads樹脂は、低コストの高い結合能力、高い線流速及び第4級アミンイオン結合官能基を有するため、これをCMP−SA−PEG類の精製のための樹脂として選択した。異なる対イオン型(塩化物、水酸化物、リン酸及び重炭酸イオンを包含する)の樹脂を、CMP−SA−PEG類を結合するその能力について検討した。恐らくは試薬−樹脂イオン相互作用を妨害する試薬上の大きなPEG残基のために、CMP−SA−PEG類はこの樹脂に対する結合親和力は低かった。その結果、装填溶液の導電率は1mS/cm未満であるように選んだ。
陰イオン交換条件の最適化
GE HealthcareからのQ-Sepharose Big Beads樹脂は、低コストの高い結合能力、高い線流速及び第4級アミンイオン結合官能基を有するため、これをCMP−SA−PEG類の精製のための樹脂として選択した。異なる対イオン型(塩化物、水酸化物、リン酸及び重炭酸イオンを包含する)の樹脂を、CMP−SA−PEG類を結合するその能力について検討した。恐らくは試薬−樹脂イオン相互作用を妨害する試薬上の大きなPEG残基のために、CMP−SA−PEG類はこの樹脂に対する結合親和力は低かった。その結果、装填溶液の導電率は1mS/cm未満であるように選んだ。
CMP−SA−PEG類は塩化物型の樹脂には結合しないが、水酸化物、リン酸塩及び重炭酸塩型には結合した(表11)。塩化ナトリウムを使用してCMP−SA−PEGを溶出すると、SA−PEGの分離度が達成できず、溶液のpHが強い塩基性になるため、水酸化物型の樹脂は処理に使用できなかった。pHの上昇はCMP−SA−PEGの分解を引き起こした(表11)。リン酸ナトリウム(pH7.5又はpH8.0)を使用してリン酸塩型の樹脂から生成物を溶出すると、混入物の分離度が悪かった(表11)。
溶離緩衝液としての重炭酸ナトリウムにより重炭酸塩型のQ-Sepharose Big Bead樹脂から生成物を溶出したときのみ、供給溶液中の多くの関連混入物(CMP、SA−PEG及びCMP−SA−グリシンを包含する)が分離された(図5)。反応又は製造プロセス中に生成する可能性のあるSA−PEGからCMP−SA−PEG類を選択的に溶出するのに、NaHCO3緩勾配又は小段階溶出法が必要であった。SA−PEG及びCMP−SA−PEGを溶出するのに、導電率のほんの小段階の上昇が必要なだけであった(<30mM NaHCO3、<2.7mS/cm)。しかし他の結合反応成分(CMP、CMP−SA−グリシン、p−ニトロフェノール)は全て、はるかに高濃度のNaHCO3を使用したときのみ溶出された。
表11では、濃縮及び希釈されたカップリング反応混合物溶液の導電率は<1.0mS/cmであった。分離は、他の関連混入物(例えば、CMP、GSC、SA−PEG、PEG及びp−ニトロフェノール)からのCMP−SA−PEG−10kDa生成物の分離を示す。PEG及びp−ニトロフェノールは、樹脂が塩化物イオン型であるときを除いて、全ての方法により生成物から容易に分離された。pH8.0のリン酸塩緩衝液もまた、同じ溶出法により検討した。pH7.5のリン酸塩緩衝液について見られるものと同様の結果を観測した。
段階溶出の最適化
HCO3 −型のQ-Sepharose Big Beads樹脂を使用して、NaHCO3緩衝液を用いる段階溶出条件をCMP−SA−PEG生成物について注意深く最適化した。早期に溶出するSA−PEG不純物ピークと生成物との分離を最大にした。水から低濃度NaHCO3(30mM、10mM、5mM)への小段階を、表12に記載のようにCMP−SA−PEG−10kDaについて調べた。5mM NaHCO3までの初期段階を用いて、SA−PEG−10kDaと生成物との間でベースライン分離を達成した。生成物はまた5mMのNaHCO3濃度でも溶出したが、生成物ピークの溶出プロフィールは非常に広かった。したがって5mMで0.6CV後、勾配を直ちに30mM NaHCO3まで段階上昇させた。図3に示すように、純粋なCMP−SA−PEG−10kDaは、pH8.3〜8.6で約1.5CVで効率的に採取した。より強く結合したCMP、CMP−SA−Gly及びp−ニトロフェノール不純物は、1M NaHCO3への段階溶出により溶出した。SA−PEG−10kDaピークも採取し、脱塩(G−25カラムで、記載していない)して凍結乾燥した。1H−NMRによる固体の分析により、その構造を確認した。
HCO3 −型のQ-Sepharose Big Beads樹脂を使用して、NaHCO3緩衝液を用いる段階溶出条件をCMP−SA−PEG生成物について注意深く最適化した。早期に溶出するSA−PEG不純物ピークと生成物との分離を最大にした。水から低濃度NaHCO3(30mM、10mM、5mM)への小段階を、表12に記載のようにCMP−SA−PEG−10kDaについて調べた。5mM NaHCO3までの初期段階を用いて、SA−PEG−10kDaと生成物との間でベースライン分離を達成した。生成物はまた5mMのNaHCO3濃度でも溶出したが、生成物ピークの溶出プロフィールは非常に広かった。したがって5mMで0.6CV後、勾配を直ちに30mM NaHCO3まで段階上昇させた。図3に示すように、純粋なCMP−SA−PEG−10kDaは、pH8.3〜8.6で約1.5CVで効率的に採取した。より強く結合したCMP、CMP−SA−Gly及びp−ニトロフェノール不純物は、1M NaHCO3への段階溶出により溶出した。SA−PEG−10kDaピークも採取し、脱塩(G−25カラムで、記載していない)して凍結乾燥した。1H−NMRによる固体の分析により、その構造を確認した。
SA−PEG−20kDaとCMP−SA−PEG−20kDa生成物との間で同じベースライン分離を達成するために、2mM NaHCO3への初期段階溶出が必要であった(図6)。生成物もまた2mM NaHCO3で溶出し始めた。非常に広い溶出生成物ピークを避けるために、2mM重炭酸ナトリウムでわずか1CVの後に、勾配を30mM NaHCO3に段階上昇させた。純粋な生成物は、pH7.8で約1.5CVで採取した(図5)。SA−PEG−20kDaピークも採取し、脱塩(G−25カラム、記載していない)して凍結乾燥した。1H−NMRによる固体の分析により、その構造を確認した。
表12では、Q Big Beadsカラムは、実験1〜6についてはGE XK-26(2.6cm×18.8cm、100mL)の重炭酸イオン型で、実験7についてはGE BPG 100/500カラム(10cm×26cm、2L)重炭酸塩型である。PEG装填量は、原料反応物中に使用した10kDa−mPEG−pNP質量(グラム)をカラムに装填した最終反応物容量液を乗じて、カラム容量(リットル)で割って計算した。
CMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaは、Q-Sepharose Big Beads樹脂に非常に弱く結合した。生成物とSA−PEG副産物は両方とも、2mM NaHCO3への段階溶出を利用して溶出した。SA−PEG−40kDa不純物は、生成物ピークの先端の非常に小さいショルダーとして部分的に分離された(図8)。CMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaを2mM重炭酸ナトリウムを使用して採取すると、広い溶出ピーク(3CV)を採取した。この溶出ピークのpHはわずかに6.5であり、これが生成物の分解を引き起こした。
したがって、SA−PEG−40kDaは、2mM重炭酸ナトリウム(1CV)による段階溶出を利用して溶出した。次に図7に示すように生成物を迅速に溶出するために、30mM NaHCO3による段階溶出を上昇させることにより、生成物を溶出した。これらの条件を利用して、CMP−SA−グリセロール−PEG−40kDa生成物は、pH7.4で2CVでカラムから採取した。更なるpH調整は必要なかった。図5で観察された異常な形のピークは、10kDa生成物で行ったように(図4)、2mM NaHCO3段階を完全な1カラム容量(CV)溶出から0.5CVに短縮することにより防止できた。この単位操作のプロセス段階回収率は、RP−HPLCにより測定すると95を超えることが決定的に判った(図7)。SA−PEG−40kDaピークも採取して凍結乾燥した。1H−NMRによる固体の分析により、その構造を確認した。
プロセスパラメーター CMP−SA−PEG−10kDa及び20kDa生成物の回転蒸発した反応混合物は、導電率がそれぞれ1及び0.8mS/cm未満に低下するまで好ましくは希釈した。更に、生成物の完全な捕捉を確保するために、溶液のpHは、好ましくは7.1〜7.6の間とした。この希釈溶液は、AEX樹脂1リットル当たりの、反応に使用した活性化mPEG−pNP出発試薬10gに対応する濃度でAEXカラムに装填した。CMP−SA−PEG−10kDa生成物(22g mPEG−pNP/L樹脂)には、より高い生成物カラム装填量を使用することができたが、SA−PEGとCMP−SA−PEG−10kDaとの分離は消失した(表11)。
回転蒸発したCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDa反応混合物の導電率を、水希釈により好ましくは0.5mS/cm未満に低下させた。更に、溶液のpHは、生成物の完全な捕捉を確保するために、好ましくは7.1〜7.6の間とした。小規模の装填試験による、反応に使用した40kDa−mPEG−pNP出発試薬各5グラムについてQ-Sepharose Big Beads樹脂約1リットルが必要であることが判った。即ち40kDa−mPEG−pNP20gで始めたCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDa反応生成物を捕捉するには、4Lのカラムで充分なはずである。これは、これらの溶出条件を利用するAEX樹脂についての最大装填能力の約70%である。カラムベッドの高さが15〜28cmの間であるカラムを有するクロマトグラフィーの性能に、差は観察されなかった。
濃縮し希釈した反応混合物を、15〜50cm/時の線流速(2Lカラム上で20〜65mL/分に対応する)でAEXカラムに装填した。全ての場合に、カラムへの装填溶液の滞留時間は約15分であった。2LのAEXカラムを用いて、3つ全てのCMP−SA−PEG生成物について100〜150cm/時(2Lカラムの130〜200mL/分)の洗浄及び溶出流量を使用した。したがって、反応混合物装填及び生成物溶出を包含する総単位操作時間は、1.5時間未満であった(図3、5及び7)。最大200cm/時までのより速い溶出流量を使用しても、SA−PEG−20kDaとCMP−SA−PEG−20kDa生成物の間の分離の消失は観察されなかった。
実施例8
限外濾過/ダイアフィルトレーション脱塩工程(TFF)の最適化
限外濾過/ダイアフィルトレーション(TFF)を利用してCMP−SA−PEGイオン交換溶出プールを濃縮及び脱塩した。TFFシステムは、Millipore Pellicon-2フラットシート膜(1kDa MWCO;再生セルロース膜)を使用して、供給溶液を脱塩し、生成物を保持した。
限外濾過/ダイアフィルトレーション脱塩工程(TFF)の最適化
限外濾過/ダイアフィルトレーション(TFF)を利用してCMP−SA−PEGイオン交換溶出プールを濃縮及び脱塩した。TFFシステムは、Millipore Pellicon-2フラットシート膜(1kDa MWCO;再生セルロース膜)を使用して、供給溶液を脱塩し、生成物を保持した。
典型的な接線流濾過プロセス
CMP−SA−PEG−10kDaイオン交換生成物プール(1500mL、図4)及びCMP−SA−PEG−20kDaイオン交換生成物プール(図6)の両方とも、蠕動ポンプを使用して、3×0.1m2膜(表1)を有するPellicon 2 "MINI"システムを利用して脱塩した。約22psiの膜貫通圧力を利用したが、これは約3.7LMHの流量を発生させた。
CMP−SA−PEG−10kDaイオン交換生成物プール(1500mL、図4)及びCMP−SA−PEG−20kDaイオン交換生成物プール(図6)の両方とも、蠕動ポンプを使用して、3×0.1m2膜(表1)を有するPellicon 2 "MINI"システムを利用して脱塩した。約22psiの膜貫通圧力を利用したが、これは約3.7LMHの流量を発生させた。
CMP−SA−グリセロール−PEG−40kDa(図7)のAEX溶出プールからの大きな溶出容量のために、2×0.5m2膜を使用して溶出プールを脱塩した(表4)。このシステムのために蠕動ポンプを使用したが、これはTMPが20psiで3LMHの流量速度を発生させた。処理の間、氷浴中でQ-Sepharose Big Beads溶出生成物プールを冷却することにより、ポンプから発生する熱の結果としてのCMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaの分解を防いだ。
MINIシステムで処理した保持溶液は、それぞれ14.3g/Lと21g/Lの生成物濃度に対応する500mL(CMP−SA−PEG−10kDaについては3倍、CMP−SA−PEG−20kDaについては4倍)に濃縮した。いずれの透過液試料についても生成物の分解は観察されなかった(RP−HPLC)。0.5m2システムの大きなシステム維持容量(2つの膜カートリッジについて約400mL)のために、達成できる最小保持液容量はわずかに1L(4〜6倍濃縮)であった。生じた生成物濃度は約5g/Lと非常に薄く、これはより小さい20kDa生成物について達成された20g/Lよりはるかに低かった。
濃縮後、保持液は、4ダイアフィルトレーション容量の冷却水を使用して一定容量でそれぞれダイアフィルトレーションをした(10及び20kDa生成物については2L;40kDa生成物については4L)。濃縮及びダイアフィルトレーションプロセスの間中、透過液試料を採取して、pH及び導電率を記録した。透過溶液の導電率がダイアフィルトレーションに使用した水の導電率(<50microS/cm)に近づいたら、ダイアフィルトレーションは完了した。
表8:
表8:
最終のダイアフィルトレーション保持液プールは、RP−HPLCにより分析し、凍結乾燥することにより、約3日間にわたって白色の粉末を得た。最終の凍結乾燥TFF生成物は、RP−HPLC及びNMRにより分析することにより、生成物の回収率(90〜95%)及び純度(>90%、表2、3、5及び6)を求めた。反応、回転蒸発、イオン交換、TFF単位操作及び凍結乾燥を合わせたものの総生成物回収率は、65〜77%であった。1H−NMRにより、各生成物の構造を確認し、ICP試験により、各生成物の構造が二ナトリウム型であることが判った。ICP試験はまた、他のナトリウム塩が存在しないことを示した。
純度及び総収率の計算は、製造業者が報告する、CMP−SA−PEG生成物の各々を製造するのに使用されたmPEGの推定平均質量に基づく(CMP−SA−PEG−10kDaでは10,700;CMP−SA−PEG−20kDaでは20,700;CMP−SA−グリセロール−PEG−40kDaでは43,347)。生成物の分子量の過小評価は、RP−HPLCによる生成物含量の過小報告をもたらすため、生成物の純度の過小評価となる。
Claims (38)
- ポリマー修飾基に共有結合した修飾ヌクレオチド糖を含む組成物の製造方法であって、該ポリマー修飾基が、少なくとも1つの直鎖状又は分岐状ポリ(アルキレンオキシド)残基を含み、該方法が、以下:
(i)該修飾ヌクレオチド糖を含む反応混合物を陰イオン交換媒体と接触させること;
(ii)該陰イオン交換媒体から該ヌクレオチド糖を溶出することにより、該修飾ヌクレオチド糖を含む溶出画分を生成すること;及び
(iii)該溶出画分を脱塩すること
を含み(ここで、該方法は、工程(i)の前の限外濾過を含まない)、こうして該組成物を生成する方法。 - 該反応混合物が、約5mS/cm未満の塩導電率を有する、請求項1記載の方法。
- 該陰イオン交換媒体が、第4級アンモニウム樹脂及びジエチルアミノエチル(DEAE)樹脂から選択されるメンバーである、請求項1又は2記載の方法。
- 該陰イオン交換媒体が、第4級アンモニウム樹脂の重炭酸塩型である、請求項3記載の方法。
- 該陰イオン交換媒体が、Q−セファロース樹脂である、先行する請求項のいずれか1項記載の方法。
- 該修飾ヌクレオチド糖が、重炭酸緩衝液を用いて該陰イオン交換媒体から溶出される、先行する請求項のいずれか1項記載の方法。
- 該緩衝液が、約0.01mM〜約30mMの間の該重炭酸を包含する、請求項6記載の方法。
- 該脱塩が、膜濾過を用いて達成される、先行する請求項のいずれか1項記載の方法。
- 該膜濾過が、接線流濾過(TFF)である、請求項8記載の方法。
- 該膜濾過が、該溶出画分の容量を減少させる、請求項8記載の方法。
- 該膜濾過により、該膜濾過前の塩導電率に比較して該溶出画分の該塩導電率が低下する、請求項8記載の方法。
- 該溶出画分の該低下した塩導電率が、約10μS/cm〜約200μS/cmの間である、請求項11記載の方法。
- 該溶出画分の該低下した塩導電率が、約50μS/cm未満である、請求項11記載の方法。
- 工程(i)の前に、更に
(iv)該混合物の容量を減少させること
を含む、先行する請求項のいずれか1項記載の方法。 - 該減少が、回転蒸発を利用して達成される、請求項14記載の方法。
- 更に
(v)該修飾ヌクレオチド糖を含む該溶出画分を凍結乾燥又は噴霧乾燥に付すこと
を含む、先行する請求項のいずれか1項記載の方法。 - 該ポリ(アルキレンオキシド)残基が、直鎖状又は分岐状ポリ(エチレングリコール)残基である、先行する請求項のいずれか1項記載の方法。
- 該ポリ(エチレングリコール)残基が、約5kDa〜約500kDaの間の分子量を有する、請求項17記載の方法。
- 該ポリ(エチレングリコール)残基が、約10kDa〜約100kDaの間の分子量を有する、請求項17記載の方法。
- 該修飾ヌクレオチド糖の該糖が、GlcNAc残基、GalNAc残基及びシアル酸(SA)残基から選択されるメンバーである、先行する請求項のいずれか1項記載の方法。
- 該修飾ヌクレオチド糖が、シチジン−モノホスホ−シアル酸(CMP−SA)を含む、先行する請求項のいずれか1項記載の方法。
- 該ヌクレオチド糖が、直鎖状又は分岐状ポリ(エチレングリコール)残基に共有結合したシチジン−モノホスホ−シアル酸(CMP−SA)である、請求項21記載の方法。
- 該分岐ポリ(エチレングリコール)残基が、グリセロール基本骨格を含む、請求項22記載の方法。
- nが、200〜500から選択される、請求項24記載の方法。
- 該方法が、約80%〜約100%(w/w)の間の純度で該修飾ヌクレオチド糖を与える、先行する請求項のいずれか1項記載の方法。
- 該方法が、約50%〜約90%(w/w)の全収率で該修飾ヌクレオチド糖を与える、先行する請求項のいずれか1項記載の方法。
- 工程(i)の前に、更に
(vii)第1級アミノ基を含むヌクレオチド糖誘導体を、活性化ポリ(アルキレンオキシド)残基と、該ヌクレオチド糖誘導体のアミノ基と該ポリ(アルキレンオキシド)残基との間に共有結合を生成させるのに十分な条件下で接触させること
を含む、先行する請求項のいずれか1項記載の方法。 - 該ヌクレオチド糖誘導体が、CMP−SA−グリシンである、請求項28記載の方法。
- 該活性化ポリ(アルキレンオキシド)残基が、p−ニトロフェニルカーボネート残基を含む、請求項28又は29記載の方法。
- 該ヌクレオチド糖誘導体と該ポリ(アルキレンオキシド)試薬とが、約8.0〜約8.8の間のpHを有する水性溶媒の存在下で接触する、請求項28〜30のいずれか1項記載の方法。
- 該ポリ(アルキレンオキシド)試薬が、ポリ(エチレングリコール)−p−ニトロフェニルカーボネートである、請求項28〜31のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1〜32のいずれか1項記載の方法により製造される、修飾ヌクレオチド糖。
- ポリマー修飾基に共有結合した修飾ヌクレオチド糖を含む組成物の製造方法であって、該ポリマー修飾基が、少なくとも1つの直鎖状又は分岐状ポリ(アルキレンオキシド)残基を含み、該方法が、以下:
(i)第1級アミノ基を含むヌクレオチド糖誘導体を、p−ニトロフェニルカーボネート残基を含む活性化ポリ(アルキレンオキシド)残基と、該ヌクレオチド糖誘導体の該アミノ基と該ポリ(アルキレンオキシド)残基との間に共有結合を生成させるのに十分な条件下で接触させること(ここで、該接触は、約8.0〜約8.8の間のpHを有する水性溶媒の存在下で行われ、こうして該修飾ヌクレオチド糖を含む反応混合物を生成する);
(ii)該修飾ヌクレオチド糖を含む該反応混合物を陰イオン交換媒体と接触させること;
(iii)該陰イオン交換媒体から該修飾ヌクレオチド糖を溶出して、該修飾ヌクレオチド糖を含む溶出画分を生成すること;
(iv)膜濾過を用いて該溶出画分を脱塩すること;及び
(v)該溶出画分から水を除去すること
を含み(ここで、該方法は、工程(i)の前の限外濾過を含まない)、こうして該組成物を生成する方法。 - 該ヌクレオチド糖誘導体が、CMP−SA−グリシンである、請求項34記載の方法。
- 該修飾ヌクレオチド糖が、直鎖状又は分岐状ポリ(エチレングリコール)残基に共有結合したCMP−SAである、請求項34記載の方法。
- 該ポリ(エチレングリコール)残基が、約10〜約100kDaの間の分子量を有する、請求項36記載の方法。
- 請求項34〜37のいずれか1項記載の方法により製造される、修飾ヌクレオチド糖。
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