JP2013524773A5

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Publication number: JP2013524773A5
Application number: JP2012555146A
Authority: JP
Filing date: 2011-02-24
Publication date: 2014-07-10
Anticipated expiration: 2031-02-24

Description

ネズミモノクローナル抗体Ｍｏｖ１９及びＦＲ１−２１のヒト化Ｍｏｖ１９抗体は以前に報告されているフレームワークリサーフィシング法（Roguska M.等、Proc.Natl.Acad. Sci.USA 1994 Feb;91:969-973)及び(Roguska等、Protein Eng.9(10):895-904 (1996)）に従ってヒト化した。要すれば、各可変領域フレームワーク残基に関する平均溶媒アクセス性をＰＤＢデータベースの緊密関連解明抗体構造(closely related solved antibody structure)を用いて計算し、そして３０％平均アクセス性より高値の位置を表面残基としてマークした（Pedersen J.T.等、J. Mol. Biol. 1994; 235: 959-973）。ヒト表面置き換え配列は、Ｋａｂａｔデータベースにおけるヒト抗体生殖細胞系統配列の相当する位置にネズミ抗体配列の表面位置をアラインすることにより選択した（Johnson,G. and Wu, T. T. (2001) Nucleic Acids Research,29:205-206）。最も相同なヒト軽鎖可変領域表面（クローンDPK19、Ｍｏｖ１９に関してはIMGT遺伝子座IGKV2D-30*01、そしてＦＲ１−２１に関してはIMGT遺伝子座IGKV1/OR2-0*01）及び最も相同なヒト重鎖可変領域表面（クローン8M27、Ｍｏｖ１８に関してはIMGT遺伝子座IGHV1-69*08、そしてＦＲ１−２１に関してはIMGT遺伝子座IGHV5-51*02 for FR1-21）を選択することによりネズミＭｏｖ１９フレームワーク表面位置を置き換え、６ＣＤＲ（表１）は未改変のままとした。ネズミ及びヒトＭｏｖ１９及びＦＲ１−２１の表面位置及び残基を図１Ａ〜Ｄに示す。

ねずみ抗ＦＯＬＲ１抗体の開発
２種の異なる免疫化／スクリーニングのシリーズを用いた。第１のシリーズはＦＲ１−２１クローンの形成をもたらし、そして第２のシリーズはＦＲ１−４８、ＦＲ１−４９、ＦＲ１−５７及びＦＲ１−６５クローンの形成をもたらしている。第１のシリーズにおいては、マウスを約５ｘ１０^６ＦＯＬＲ１発現ＫＢ細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣＣＣＬ−１７）で皮下免疫化した。第２のシリーズにおいては、自身の表面にヒトＦＯＬＲ１を発現する３００−１９細胞を用いてマウスを免疫化した。これらの細胞を作成するためにヒトＦＯＬＲ１アミノ酸配列をＮＣＢＩウエブサイト（アクセッションＮＰ＿０５７９３７）から入手し、次にそれをコドン最適化し、ＢｌｕｅＨｅｒｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより合成し、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ制限部位によりフランキングさせることによりｐＳＲａ哺乳類発現ベクター内へのクローニングを容易にした。３００−１９細胞、即ちＢａｌｂ／ｃマウスから誘導した前Ｂ細胞系統（Reth等、Nature, 317: 353-355 (1985)）をｐＳＲａ−ＦｏｌＲ１発現プラスミドでトランスフェクトすることにより細胞表面上にｈｕＦＯＬＲ１を高レベルで安定に発現させた。ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃにおいて使用されているもののような当該分野で知られている標準的な免疫化プロトコルを両方のシリーズに適用した。免疫化したマウスは、ハイブリドーマ形成のために屠殺する３日前に抗原でブーストした。マウスの脾臓を標準的動物プロトコルに従って、例えば２枚の滅菌フロスト処理顕微鏡用スライドの間で組織を磨砕することによりＲＰＭＩ−１６４０培地中の単細胞懸濁液を得た。脾細胞を遠心分離し、ペレット化し、洗浄し、ポリエチレングリコール−１５００（Ｒｏｃｈｅ７８３６４１）を用いることによりネズミミエローマ、例えばＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Kearney等、J Immunol,123: 1548-1550（1979））と融合させた。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）（ＳｉｇｍａＨ−０２６２）を含有するＲＰＭＩ−１６４０選択培地に融合細胞を再懸濁し、そして３７℃５％ＣＯ_２下に９６穴平底培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ３５９６、ウェル当たり細胞懸濁液０．２ｍＬ）中における生育に関して選択した。５日間インキュベートした後、培養上澄み０．１ｍＬを各ウェルから取り出し、ヒポキサンチン−チミジン（ＨＴ）補給物（ＳｉｇｍａＨ−０１３７）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地０．１ｍＬと置き換えた。ハイブリドーマクローンが抗体スクリーニングに使用できるようになるまで、３７℃５％ＣＯ_２下にインキュベーションを継続した。免疫化及びハイブリドーマ作成の他の手法、例えばLangone等、(編集“Immunochemical Techniques,Part I”,Methods in Enzymology,Academic Press, volume 121,Florida)及びHarlow等、(“Antibodies: A Laboratory Manual”; Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York (1988))に記載されているものも使用できる。

（実施例６）

本明細書において引用した全ての出版物、特許、特許出願、インターネットサイト、及び受託番号／データベースの配列（ポリヌクレオチド及びポリペプチドの配列の両方を包含する）は、各々の出版物、特許、特許出願、インターネットサイト、及び受託番号／データベースの配列が特定的及び個別に参照により本明細書に組み込まれる場合と同等程度まで、全ての目的のために、参照により全体が本明細書に組み込まれる。

Claims

ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントであって、該抗体が下記：
（ａ）ＧＹＦＭＮ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＸａａ_１ＦＸａａ_２Ｘａａ_３（配列番号５６）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＹＤＧＳＲＡＭＤＹ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び、
（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＲＡＳＮＬＥＡ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＳＲＥＹＰＹＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ３；
を含み、
ここで、Ｘａａ_１はＫ、Ｑ、Ｈ及びＲから選択され；Ｘａａ_２はＱ、Ｈ、Ｎ及びＲから選択され；そしてＸａａ_３はＧ、Ｅ、Ｔ、Ｓ、Ａ及びＶから選択される、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
該重鎖ＣＤＲ２配列がＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号２）を含む、請求項１に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
配列番号４の重鎖可変ドメイン、および配列番号１０又は１１の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
配列番号６の重鎖、および配列番号１２又は１３の軽鎖を含む、請求項１に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
２０１０年４月７日にＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７７２、ＰＴＡ−１０７７３又は１０７７４を有するプラスミドＤＮＡによりコードされるヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
配列番号４に少なくとも約９０％、約９５％、約９９％、又は約１００％同一である重鎖可変ドメイン、及び配列番号１０又は配列番号１１に少なくとも約９０％、約９５％、約９９％、又は約１００％同一である軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
ヒトフォレート受容体１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、該抗体が下記：
（ａ）ＳＳＹＧＭＳ（配列番号３０）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹ（配列番号３１）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＤＧＥＧＧＬＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を含む重鎖ＣＤＲ３；並びにＫＡＳＤＨＩＮＮＷＬＡ（配列番号２７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＧＡＴＳＬＥＴ（配列番号２８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＹＷＳＴＰＦＴ（配列番号２９）を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｂ）ＴＮＹＷＭＱ（配列番号６０）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＡＩＹＰＧＮＧＤＳＲ（配列番号６１）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＲＤＧＮＹＡＡＹ（配列番号６２）を含む重鎖ＣＤＲ３；並びにＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ（配列番号５７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号５８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＨＦＷＡＳＰＹＴ（配列番号５９）を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｃ）ＴＮＹＷＭＹ（配列番号６６）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＡＩＹＰＧＮＳＤＴＴ（配列番号６７）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＲＨＤＹＧＡＭＤＹ（配列番号６８）を含む重鎖ＣＤＲ３；並びにＲＡＳＥＮＩＹＴＮＬＡ（配列番号６３）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＴＡＳＮＬＡＤ（配列番号６４）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＨＦＷＶＳＰＹＴ（配列番号６５）を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）ＳＳＦＧＭＨ（配列番号７２）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＳ（配列番号７３）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＥＡＹＧＳＳＭＥＹ（配列番号７４）を含む重鎖ＣＤＲ３；並びにＲＡＳＱＮＩＮＮＮＬＨ（配列番号６９）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＹＶＳＱＳＶＳ（配列番号７０）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＳＮＳＷＰＨＹＴ（配列番号７１）を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｅ）ＴＳＹＴＭＨ（配列番号７８）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＹＩＮＰＩＳＧＹＴＮ（配列番号７９）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＧＧＡＹＧＲＫＰＭＤＹ（配列番号８０）を含む重鎖ＣＤＲ３；並びにＫＡＳＱＮＶＧＰＮＶＡ（配列番号７５）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号７６）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＹＮＳＹＰＹＴ（配列番号７７）を含む軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。
完全長抗体である請求項１〜７の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
抗原結合フラグメントである請求項１、２、または４〜７の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
該抗体又は抗原結合フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ即ちｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディー、ＩｇＧ−ＣＨ２、ミニボディー、Ｆ（ａｂ'）_３、テトラボディー、トリアボデ
ィー、ダイアボディー、単ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ^２、（ｓｃＦｖ）_２、又はｓｃＦｖ−Ｆｃを含む、請求項９記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
約１．０ｎＭ又はそれより良好なＫｄで、或いは約１．０〜約１０ｎＭのＫｄでヒトフォレート受容体１に結合する、請求項１〜１０の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（ａ）請求項１〜１１の何れか１項に記載の抗体を発現する細胞を培養すること；及び
（ｂ）該培養細胞から抗体を単離すること
を含む該抗体を作成する方法。
式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有し、式中：
（Ａ）は請求項１〜１１の何れか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント又はポリペプチドであり；
（Ｌ）はリンカーであり；そして、
（Ｃ）は細胞傷害剤であり；
そして該リンカー（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結するイムノコンジュゲート。
該リンカーが切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性リンカー、及びジカルボン酸系リンカーよりなる群から選択される、請求項１３記載のイムノコンジュゲート。
該リンカーがＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）又はＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホペンタノエート（スルホ−ＳＰＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）又はＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）；及びＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）よりなる群から選択される、請求項１４記載のイムノコンジュゲート。
該リンカーがＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）又はＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）である、請求項１５記載のイムノコンジュゲート。
該細胞傷害剤がマイタンシノイド、マイタンシノイド類縁体、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類縁体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類縁体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類縁体、アリスタチン、トマイマイシン誘導体、及びレプトマイシン誘導体又は該剤のプロドラッグよりなる群から選択される、請求項１３〜１６の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート。
該細胞傷害剤がマイタンシノイドである、請求項１７記載のイムノコンジュゲート。
該細胞傷害剤がＮ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン又はＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシンである、請求項１８記載のイムノコンジュゲート。
下記：
（Ａ）配列番号９７、９９、１０１又は１０３の重鎖可変ドメイン及び配列番号９６、９８、１００又は１０２の軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体；
（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）；及び、
（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン；
を含み、ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結する、イムノコンジュゲート。
下記：
（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体；
（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）；又はＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）；及び、
（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン；
を含み、ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結する、イムノコンジュゲート。
下記：
（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体；
（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）；及び、
（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン；
を含み、ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結する、イムノコンジュゲート。
下記：
（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体；
（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホペンタノエート（スルホ−ＳＰＰ）又はＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）；及び、
（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン；
を含み、ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結する、イムノコンジュゲート。
該ヒト化抗体は、配列番号４の重鎖可変ドメイン、および配列番号１１の軽鎖可変ドメインを含む、請求項２１〜２３に記載のイムノコンジュゲート。
（Ａ）が、ヒトフォレート受容体１への特異的結合に関してｃｈＭｏｖ１９と競合する、抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、請求項１３〜２４に記載のイムノコンジュゲート。
該抗体又は抗原結合フラグメント（Ａ）が、１０ｎＭ以下のＫｄでヒトフォレート受容体１に結合する、請求項１３〜２５に記載のイムノコンジュゲート。
２〜６個の（Ｃ）をさらに含む、請求項１３〜２６の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート。
請求項１〜１１の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、或いは請求項１３〜２７の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート及び製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物。
請求項１〜１１の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、或いは請求項１３〜２７の何れか１項に記載のイムノコンジュゲートを含み、第２の抗癌剤をさらに含む、医薬組成物。
該イムノコンジュゲートが（Ａ）当たり平均で約３〜約４個の（Ｃ）を有する請求項２８又は２９に記載の医薬組成物。
請求項１〜１１の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む診断試薬であって、該抗体は標識されている、診断試薬。
該標識が放射標識、蛍光団、発色団、画像化剤及び金属イオンよりなる群から選択される、請求項３１記載の診断試薬。
請求項１〜１１の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、或いは請求項１３〜２７の何れか１項に記載のイムノコンジュゲートを含むキット。
腫瘍生育の阻害における使用のための、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
腫瘍生育の阻害のための医薬の製造における、請求項１〜１１の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項１３〜２７の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート、或いは請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
癌の治療における使用のための、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
癌の治療のための医薬の製造における、請求項１〜１１の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項１３〜２７の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート、或いは請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
該抗体が２０１０年４月７日にＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７７５及びＰＴＡ−１０７７６を有するｈｕＦＲ−１−２１抗体である、請求項３５又は３７に記載の使用。
該抗体が２０１０年４月７日にＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７７５及びＰＴＡ−１０７７６を有するｈｕＦＲ−１−２１抗体である、請求項３４又は３６に記載の医薬組成物。
該腫瘍又は癌が、卵巣腫瘍又は癌、脳腫瘍又は癌、乳房腫瘍又は癌、子宮腫瘍又は癌、子宮内膜腫瘍又は癌、膵臓腫瘍又は癌、腎臓腫瘍又は癌、及び肺腫瘍又は癌よりなる群から選択される、請求項３４、３６、又は３９の何れか１項に記載の医薬組成物。
該腫瘍が卵巣腫瘍又は肺腫瘍である、請求項４０に記載の医薬組成物。
癌の該治療において腫瘍生育が阻害される、請求項３６又は３９に記載の医薬組成物。
該腫瘍又は癌が、卵巣腫瘍又は癌、脳腫瘍又は癌、乳房腫瘍又は癌、子宮腫瘍又は癌、子宮内膜腫瘍又は癌、膵臓腫瘍又は癌、腎臓腫瘍又は癌、及び肺腫瘍又は癌よりなる群から選択される、請求項３５、３７、又は３８の何れか１項に記載の使用。
該腫瘍が卵巣腫瘍又は肺腫瘍である、請求項４３に記載の使用。
癌の該治療において腫瘍生育が阻害される、請求項３７又は３８に記載の使用。
該医薬は、第２の抗癌剤を含む、請求項３５、３７、又は３８の何れか１項に記載の使用。
該第２の抗癌剤が化学療法剤である、請求項４６記載の使用。
請求項１〜１１の何れか１項に記載の抗体、又は抗原結合フラグメントを生産する単離された細胞。
配列番号５、１４、１５、３７、３８、４３、４４、４７、４８及び１２０〜１２７よりなる群から選択される配列に少なくとも９０％、９５％、又は９９％同一である配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
請求項４９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。