JP2008076407A - 多重アレイの多重特異的な電気化学発光試験 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】複数の結合ドメインからなるECL反応および測定を行うカセットに関し、この別々の結合ドメインは、各々の電極と対電極の対と共に間を空けて整列される。個々の電極対に電気化学発光を引き起こすに有効な電位波形を与える電位制御手段、試料からの電気化学発光を検出する光子検出手段、および、試料走査手段からなる。
【選択図】なし
Description
1.緒言
本発明は、電気化学発光(electrochemiluminescence)に基づく試験のためのパターン付けした多重アレイの多重特異的な表面(PMAMS)、さらにはPMAMSの製造法と使用法を提供する。
2.1.診断用測定法
迅速で感度の高い診断技術に対する強い経済的なニーズが存在する。診断技術は、医療、研究、農業、獣医学、および工業市場などの種々の経済的市場において重要である。感度、必要時間、使用の簡便さ、頑丈さ、またはコストを改良すれば、これまでいずれの技術でも市場ニーズに応えることのできなかった、全く新規な診断市場を開発することができるであろう。高感度を有する診断技術もあるが、市場ニーズに応えるには高価過ぎる。また他の技術は、費用効果が高くても、種々の市場にとって頑丈さが足りない。これらの品質を組合せることのできる新規な診断技術は、診断薬事業において顕著な進歩であり好機である。
今日使用されている多くの高感度診断技術は、第一に、試験を実施するのに熟練した技術者を必要とするため、市場が限定されている。例えば今日使用されている電気化学発光法は、熟練技術者を必要とするだけでなく、洗浄の繰り返しや準備段階を必要とする。このため、コストと廃棄物処分の必要の両方が高まる。試験法を単純にし、同時に試験当たりのコストを低下させる新規な診断法は、新規な市場を開発する上にも、既存の市場の性能を改善する上にも非常に重要で有用となるであろう。
電気化学発光(「ECL」)は、電気的に励起した分子種が、光子を放射する現象である(例えば、非特許文献1を参照のこと)。このような分子種はECL標識物と呼ばれ、本明細書においてはTAGとも呼ぶ。一般に使用されるECL標識は、例えば金属がRu含有およびOs含有有機金属化合物[例えば、バード(Bard)ら(特許文献1)により開示されている、Ru(2,2’−ビピリジン)3+残基(「Rubpy」とも呼ばれる)]を含む第VIII族の貴金属由来の有機金属化合物を含む。ECL標識物により発生する光は、診断法におけるレポーターシグナルとして使用することができる(バード(Bard)ら、特許文献2)。例えばあるECL標識物は、抗体または核酸プローブのような結合物質に共有結合することができる。このECL標識/結合物質複合体は、種々の物質の測定のために使用することができる(バード(Bard)ら、特許文献1)。ECLに基づく検出系の基本は、光子を放射させるためにECL標識物を励起させる電位が必要なことである。ある電位波形が、電極表面(典型的には金属表面)と対電極にわたるECL測定溶液に適用される(例えば、特許文献3、特許文献4、特許文献5、特許文献6、特許文献7、特許文献8、特許文献9、特許文献10、特許文献11を参照のこと)。
上に引用されている発行された特許ではTAGと呼ばれるECL残基は、アナライトに結合してもしなくてもよいが、いずれの場合にも、作用電極から受ける電気エネルギーにより引き起こされる一連の化学反応の結果として、励起状態にさせられる。TAGのECLを促進する分子としては、有利には、シュウ酸塩、またはさらに好ましくは、トリプロピルアミン(特許文献10を参照)が提供される。
現在までのところ、全ての工業用のECL反応は、センチメートルのスケールの電極表面で行われている。センチメートルスケールの電極は、より大きな電極から生じるECLシグナルの増強された大きさと、各測定に必要な全試料容量を低く抑える必要性との間で比較検討されている。しかし、センチメートルスケールの電極でさえ、多くの測定に必要とされる感度を達成できない。この問題を克服するために、全ての工業用のECL系は、コーティングした磁性ビーズを使用してECLアナライトまたは試薬を捕捉することにより感度をさらに増強している。こうしてビーズは作用電極近くに移動して感度が増強される。
しかし、磁性ビーズの使用は多くの限界を有する。ビーズはこれら自体が、経時的に脱落し分解するタンパク質でコーティングされているため、シグナル変動を引き起こす。ビーズに基づく測定法の操作およびフォーマット化が複雑なため、工業用のECL診断は、所定の試料で行われる各測定について複雑な逐次行われる一連の手順を必要とし、このため実施すべき各試験についての時間とコストが増大する。5ミクロンの大きさのビーズは、作用電極に隣り合う薄膜にビーズ結合ECL TAGの大部分が到達するのを防止して、ECL TAGの励起を非効率的なものにする。
ECL感度を上昇させる別のアプローチは、電極技術を改良することである。ジャン(Zhang)ら(特許文献12)は、種々の金属および半導体表面上にECL分子種のフィルムを直接沈積した。電極表面の大半の飽和を利用するジャン(Zhang)とバード(Bard)の技術により、高感度測定には適していない一様でなくつぎはぎ状の被覆が生じた(著者らにより記載されている通り)。
従って本発明の目的は、複数のECL反応を逐次または同時に行うための新規で費用効果の高い測定法を提供することであり、好適な実施態様においては、正確性の改善のために組み込まれた対照標準物質を提供することである。
本発明のさらなる目的は、これもまた処分可能な、複数の同時または逐次ECL反応を行うのに適した1つまたはそれ以上の支持体からなるカセットを提供することである。
本発明のさらに別の関連する目的は、生物学的試料中の目的のアナライトに関する個々の測定を行う時間とコストを低減することである。
本発明のなおさらに別の関連する目的は、単一の生物学的試料中の複数の目的のアナライトについて複数の同時測定を行うための方法と装置を提供することである。
本発明は、支持体に固定化されている複数の別々の結合ドメインからなるECL反応および測定を行うためのカセットに関し、この別々の結合ドメインは、1つまたはそれ以上の電極と1つまたはそれ以上の対電極の対と共に間を空けて整列している。このカセットは、好ましくは、表面に固定化されている複数の別々の結合ドメインを有する第1の支持体を含む。これは、1つまたはそれ以上の電極と1つまたはそれ以上の対電極の対を有していてよい。電極と対電極の対は、電気化学発光を引き起こすのに有効な電位波形の形の電気エネルギー源により、別々にアドレスが可能である。このカセットはまた、第1の支持体に近接して配置されてその間に試料含有手段を提供することができるように、および/または電極として機能するように、第2の支持体を含んでもよい。結合ドメインは、支持体表面状にパターン付けされて、目的のアナライトまたは試薬を結合するように作成される。
本発明はさらに、支持体またはカセット操作手段、電気化学発光を引き起こすのに有効な制御された電位波形をかけるように適合させた電位制御手段、試料からの電気化学発光を検出するための光子検出手段、および試料操作手段を提供する、試料の電気化学発光を測定するための装置に関する。
本発明はさらに、カセットの複数の結合ドメインを、複数の目的のアナライトを含有する試料にECL測定条件下で接触させて、次に複数の電極と対電極の対の各々に電気化学発光を引き起こすのに有効な電位波形をかけて、引き起こされる電気化学発光を検出または測定することにより、試料中の電気化学発光を測定するためのカセットの使用法に関する。広い意味で、本発明は、試料が電極に接触しないECL測定法を提供する。さらに、電極と対電極の対の使用の代替法として、本発明は、結合ドメイン上の電極と対電極の走査を提供する。
本発明はまた、同時に複数の電気化学発光反応を測定するのに適したカセット、その上に複数のドメインが固定化されている支持体表面、および化学反応を行うECL測定の実施のための測定用媒体を含む成分からなるキットを提供する。
本発明はまた、黒鉛ナノチューブから作成された電極を提供する。
従って本発明は、広い意味で、複数の電気化学発光測定を実施するためのカセットを含む。このカセットは、1つまたはそれ以上の目的のアナライトと特異的に結合することができる複数の結合ドメインを、その上に有する支持体より形成される。結合ドメインは、支持体上に、パターン付けされた、多重アレイの多重特異的な表面(「PMAMS」)として作成される。PMAMSは、例えば、実施できる測定の密度の大きな上昇、および迅速にまたは同時に複数の異なる測定を実施することを可能にしたことにより、既知のECL測定法からの有意な改良を提供する。カセットは、結合ドメインに結合したECL標識試薬からの光のECL放出を選択的に引き起こしうる、複数の電極を含んでもよい。図47は、導線4710〜4716により接続された、電極4700、4704、結合ドメイン4706を有するマトリックス4702、およびECLシグナルを発生および分析するためのコントローラー4720手段を含有するマイクロプロセッサーを有する、多重アレイのECL装置を示している。
本発明のいくつかの実施態様において、規定量または前もって決められた量の1つまたはそれ以上の試薬を表面上に再現可能に固定化することが望ましい。固定化は、試薬が表面に結合している任意の方法に広く適用され、これらの方法は:共有化学結合;非特異的吸着;表面上の試薬の乾燥;静電相互作用;疎水性および/または親水性相互作用;液体またはゲル中の封じ込めまたは巻き込み;生物特異的結合(例えば、リガンド/受容体相互作用またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション);金属/リガンド結合;キレート化、および/またはポリマー中の巻き込み、を含むがこれらに限定されない。
試薬はまた、コーティングされた表面上に再現可能に固定化されていてもよい。コーティングは、いくつかの試薬の固定化を増強するのに役立ち、および/または他の試薬の固定化を低減または妨害するのに役立つことがある。表面は完全にコーティングされるか、または表面は部分的にコーティング(すなわち、パターン付けされたコーティング)することができる。コーティングは、組成が均一であるか、または異なる組成の要素を含有してもよい。具体例において、コーティングは、ある領域では免疫グロブリンGを共有化学結合により固定化し、他の領域ではその固定化を防止する、パターン付けされた単層フィルムであってよい。
コーティングはまた、後の工程またはプロセスにおいて表面上に固定化される1つまたはそれ以上の試薬の量を前もって決めるのにも役立つ。あるいは、特定試薬の量は、沈積される試薬の量を制限することにより制御することができる。
定量的に再現可能な方法で固定化された試薬(またはコーティング)を有する表面であれば、試料からのECLシグナルを再現可能かつ定量的に測定する能力が得られ、こうして較正が可能になる。
図1Aは、ハウジング11に含有されている、図1に記載された、カセット、導線、波形発生器、光検出手段およびディジタルコンピュータからなるシステムを例示する。カセットは、開口部15によりハウジング内に挿入される。
別の実施態様において、1つの作用電極が、同時に複数の結合ドメインでECLシグナルを生成するために使用される。この実施態様において、各結合ドメインからのECLシグナルは、光イメージング装置の使用により同定される。
概して、本発明のカセットを使用して実施される測定は、複数の別々の結合ドメインの使用が有効な測定である。例えば、このようなカセットの使用により、広い範囲の目的のアナライトの迅速および/または同時の検出または測定が可能になる。好適な実施態様において、本発明の測定法はまた、ECL標識試薬、アナライトまたは結合表面の使用が有効な測定法である。本発明のECL測定は、複数の結合ドメインを、目的のアナライトを含有することが疑われる試料と接触させて、結合したECL標識物からのECL発光を引き起こすことを含んでなり、ここでECL標識物は、アナライト上にあるか、またはアナライトの競合物質上にある、または複数の結合ドメインの上にある。
支持体上の複数の結合ドメインを、測定すべき試料と相互作用させる。PMAMSはさらに、測定を完了するのに必要な試薬を含有する溶液と接触してもよい。次に結合表面は、相補的な電極(好ましくは、清浄な、または新しい電極)の表面と接触(例えば、圧力をかけて)させて、次にこれは、ECLを促進するための電位をかけるのに使用される。
本発明は、多成分の液体試料のある容量中の、試料中に種々の濃度で存在するかもしれない目的の複数のアナライトを検出する方法を提供する。
概して、複数のアナライトは、10−3モル濃度未満で多成分試料から検出することができる。好ましくは、複数のアナライトは、多成分試料から10−12モル濃度未満で検出することができる。
本発明の測定において、特定のアナライトを検出するために使用される電磁線は、PMAMS内の結合ドメインのパターンに対応するパターンの1つまたはそれ以上の特徴としてその位置および/または配置を同定することにより、他のアナライトに対応する電磁線から識別可能である。
本発明の均一系測定において、電磁線は、非結合試薬に比較した結合標識試薬により放出される電磁線の量の増加または減少として結合標識試薬により放出される、あるいはPMAMS内の結合ドメインのパターンに対応するパターンの1つまたはそれ以上の特徴に空間的に対応する、光源から放出される電磁線の検出により、測定される。
本発明のさらなる実施態様、特徴および変法は、後述のように提供される。
本発明をさらに理解するために、支持体上の結合ドメインの作成をさらに詳細に説明する。複数のアナライトに特異的な、表面上の結合ドメインのパターン付けされたアレイは、本明細書ではパターン付けした多重アレイの多重特異的な表面またはPMAMSと呼ばれる。PMAMSは、例えば、自己組立単層(「SAM」)のパターン付けにより、支持体上に作成される(ファーガソン(Ferguson)ら、1993,Macromolecules 26(22):5870−5875:プライム(Prime)ら、1991,Science 252:1164−1167:ライビニス(Laibinis)ら、1989,Science 245:845−847:クマール(Kumar)ら、1984,Langmuir 10(5):1498−1511:バイン(Bain)ら、1989,Angew.Chem.101:522−528)。表面パターン付け法はまた、物理的エッチング(例えば、ミクロ機械加工)(アボット(Abbott)ら、1992,Science 257:1380−1382:アボット,1994,Chem.Mater.6(5):596−602)、ミクロ石版術(microlithography)(ライビニス(Laibinis)ら、1989,Science 245:845−847)、光活性化化学の使用による表面への化学基の結合(サンドバーグ(Sundberg)ら、1995,J.Am.Chem.Soc.117(49):12050−12057)、および微小型押し法(micro−stamping techniques)(クマール(Kumar)ら、1994,Langmuir 10(5):1498−1511:クマールら、1993,Appl.Phys.Lett.63(14):2002−2004)の使用を含む。その他の表面パターン付け法は、流体または粒子の空間的に制御された分散のための方法(例えば、マイクロペン沈積(micropen deposition)(例えば、X−Y平行移動を使用する表面上に送達するための微量流体ガイドを使用して))、毛細管充填(キム(Kim)ら、1995,Nature 376:581)、インクジェット法(Ink−Jettechnology)、またはシリンジディスペンサーを含む。これらの方法の組合せを使用して複雑な表面パターンを提供することができる。図5Aにおいて、異なる結合特異性が、単一の支持体上に存在してもよいことを示す、単に説明目的で幾何学図形602として表される形非依存性結合ドメインを有する支持体600が示される。結合ドメイン間の表面604は、結合試薬の沈積物を閉じこめて結合ドメインを形成するために、疎水性であるか、あるいは親水性であってよい。結合ドメインおよび/または結合ドメイン間の表面は、非特異的結合に対して交互に感受性であるか耐性であり、および/またはこれらは共有または非共有相互作用により結合試薬の付加に対して交互に感受性または耐性でもよい。疎水性相互作用による非特異的結合が、表面に結合化学種を結合させる所望の付加方法でない場合、偶発的な非特異的結合が起こるのを防止するために、洗浄剤を添加してもよい。
PMAMSは、大体2〜108の結合ドメインを含有してよい。好ましくは、結合ドメインの数は、50〜500である。さらに他の実施態様において、結合ドメインの数は、25〜100である。
PMAMSがその上に作成される支持体の表面は、種々の材料、例えば、網、フェルト、繊維材料、ゲル、固体(例えば、金属から形成される)、エラストマーなどを含有してもよい。支持体表面は、種々の構造的、化学的および/または光学的性質を有してもよい。例えば、表面は、剛性または可撓性、扁平であるかまたは変形しており、透明、半透明、部分的にまたは完全に反射するかまたは不透明であってよく、そして複合性、異なる性質の領域を有してもよく、そして2つ以上の材料の複合体であってもよい。表面は、パターン付けした表面の結合領域、および/または1つまたはそれ以上の表面上で本発明の触媒作用が起こるパターン付けした領域、および/または1つまたはそれ以上の表面上の電極のアドレスが可能なアレイを有してもよい。支持体の表面は、平面状、球状、立方体状、および円筒状を含む、任意の適切な形に形作ることができる。具体例において、PMAMSを有する支持体は、ディップスティックである。別の具体例において、PMAMSを有する支持体は、炭素、例えば、黒鉛、グラッシーカーボンまたはカーボンブラックを含有している。
好適な実施態様において、PMAMSを有する支持体は、1つまたはそれ以上の炭素小繊維(ハイパーイオン・小繊維(Hyperion Fibrils)(登録商標))を含有する(米国特許第4,663,230号)。個々の炭素小繊維(米国特許第4,663,230号、5,165,909号、および5,171,560号に開示されるようなもの)は、約3.5nm〜70nmの範囲の直径と、直径の102倍より大きい長さ、順序付けられた炭素原子の多くの本質的に連続的な層の外部領域および明確な内部コア領域を有してもよい。単に例示目的で述べると、炭素小繊維の典型的な直径は、約7〜25nmの間であり、そして典型的な範囲の長さは、1μm〜10μmであろう。
小繊維は、ある場合には磁性であり、別の場合には磁性でない。小繊維が磁性または非磁性に作られる程度は、米国特許第4,663,230号、5,165,909号、および5,171,560号に開示されるような、小繊維製造プロセスの結果として小繊維中にある触媒の量により制御される。PMAMSは、上述の支持体の上、中、またはこれに接近させて配置される。
不完全な単層の作成法は、当該分野で公知である。不完全な単層の作成のためのその他の方法は、結合試薬の希釈溶液からの単層の形成、完了前の単層形成反応の停止、照射(例えば、イオン性粒子)、光試薬または化学試薬によるより完全な単層に損傷を与えることを含むが、これらに限定されない。1つの実施態様において、再び型押しに墨入れすることなく反復型押し操作を行うと、ある範囲の欠陥のある単層が得られる(ウィルバー(Wilbur)ら、1995,Langmuir,11:825)。
多孔性材料は、さらなる材料と組合せてもよい。例えば、さらなる多孔性材料、導電性材料、半導体材料、チャネリング構造および/または溶液(例えば、イオン性流体)と共に多孔性材料から複合構造を組み立てることができる。このような複合体は、積層構造、サンドイッチ構造、および/または分散した複合体であってよい。金属電極上に支持された多孔性材料である、固体マトリックスを使用することができる。あるいは、多孔性材料は、導電性材料、半導体材料、または半導体材料と導電性材料の組合せたものの間にサンドイッチされる。1つまたはそれ以上の結合ドメインは、多孔性材料の1つの連続するスラブ上に封じ込めるか、および/または各々1つまたはそれ以上の結合ドメインを有する支持体上の複数の別々の物体に配置してもよい。多孔性材料(例えば、ゲル)の表面は、平面状、半球上であっても、または任意の規則的な若しくは不規則な形をとってもよく、および/または種々の物理的な性質(例えば、エラストマー性、剛性、低密度、高密度、密度の勾配、乾燥、湿潤など)および/または光学的性質(例えば、透明、半透明、不透明、反射性、屈折性など)および/または電気的性質(例えば、導電性、半導体性、絶縁性、可変導電性、例えば、湿潤対乾燥など)を有してもよい。
孔は、部分的および/または材料全体に拡大しているか、または孔の網の一部であってもよい。これらの孔は、50Å〜10000μmの広い範囲の寸法を有してよい。好適な実施態様において、この材料は、200Å〜500Åの範囲の寸法のいくつかの孔と、0.5μm〜100μmの範囲の寸法のいくつかの孔を有する。
材料の多孔度は、材料全体で一定であるか、または材料の位置の関数として増大または減少していてもよい。材料は、無秩序におよび/またはランダムに分配された異なるサイズの種々の孔を有してもよい。
多孔性材料は、2つ以上の材料の複合体であってもよい。
例えば、材料は、生物の細胞のように大きな物体を通過させるのに十分なほど大きいいくつかの孔、タンパク質または抗体のような大きな生物学的媒体を通過させることのできるいくつかの孔、有機低分子(分子量<1000)のみを通過させることのできるいくつかの孔、および/またはこれらの組合せを有してよい。
材料の多孔度は、1つまたはそれ以上の分子、液体、固体、エマルション、懸濁液、気体、ゲルおよび/または分散液が、材料の中に、材料の中で、および/または材料を通り抜けて拡散することができる程度であってよい。材料の多孔度は、生物学的媒体が、材料の中に、材料の中で、および/または材料を通り抜けて(能動的にまたは受動的に)拡散することができるか、あるいは何らかの手段により強制的にこれを起こすことのできる程度である。生物学的媒体の例は、全血、分画血液、血漿、血清、尿;タンパク質、抗体またはその断片、細胞、細胞より小さい粒子、ウイルス、核酸、抗原、リポタンパク質、リポサッカリド、脂質、糖タンパク質、炭水化物、ペプチド、ホルモンまたは薬剤の溶液を含むが、これらに限定されない。多孔性材料は、生物学的媒体が、1つまたはそれ以上の層を通過できるが、その他の層は通過できないような、異なる多孔度の1つまたはそれ以上の層を有してもよい。
アナライトよりも小さな孔サイズを有するPMAMS上では、結合反応は実質的にゲルの表面上で起こる。この場合、ゲルによる濾過および/または電気泳動を利用して、ゲルの表面でアナライトを濃縮し、結合反応の速度を調節する(例えば、速度を増大させる)ことができる。速度を高めると迅速な測定(例えば、結果が出るまで短時間)において有利であり、短い時間で高感度が得られる。
アナライトよりも大きな孔サイズのPMAMSでは、結合反応は、大量のゲルの中と同様に表面上で起こりうる。この場合に、濾過および/または電気泳動を利用して、結合の速度を増大させて、表面から未結合種を除去することができる。
ゲル上に形成されるPMAMSは、湿潤状態で保存しても、および/または乾燥状態で保存して測定の間に再構成してもよい。ECL測定法に必要な試薬は、保存の前にゲルに組み込まれるか(ゲル中への浸透またはゲルの形成中の取り込みにより)、および/またはこれらは測定中に添加してもよい。
パターン付けはまた、各々1つまたはそれ以上の結合ドメインを含有するマトリックスの積層構造を形成することにより、達成することができる。例えば、抗体に結合(標準的化学による)したアガロースを容器に注ぎ入れて、冷却することによりゲル化させた。次に他の抗体を含有する次の層を最初の層上に注ぎ入れて、ゲル化させた。この積層構造の横断面は、複数の別々の結合ドメインを提示する連続表面を与える。このような横断面を積み重ねて、もう1つの横断面を切断してさらに高密度の結合ドメインを有するPMAMS表面を作り出すことができる。あるいは、所定の結合要素を含有するマトリックスの線を相互に接近させて作るか、かつ/あるいは積み重ねる。このような構造はまた、横断面で切断して、PMAMS表面として使用することができる。
微量流体ガイド(microfluidic guide)も、支持体上のPMAMS結合ドメインを作成するのに使用することができる。微量流体ガイドの部分的な一覧は、中空毛細管、マトリックス(例えば、多孔性または溶媒膨潤性媒体)から作られたか、および/またはマトリックスで充填された毛細管、薄膜または液滴を支持することができる固体支持体を含む。毛細管は固体であってよく、そして試薬は毛細管の外表面に沿って流れ、試薬流体リザーバーは、PMAMS表面と接触させられる多孔性マトリックス先端に露出してもよい。例えば、試薬リザーバーは、所定の多孔性マトリックス先端が、何回も試薬(例えば、単層および/または結合試薬などを形成するためのアルカンチオール)を再現可能に沈積することができるように、連続的にまたは周期的に再充填される。さらに、この先端の多孔度を変化させると、表面への試薬の流れを制御することができる。異なるかまたは同一の結合試薬は、複数の毛細管中に存在してもよく、および/または多数の別別の結合物質は、所定の毛細管中に存在してもよい。毛細管をPMAMS(例えば、パターン付けしたSAM)表面と接触させて、そのため、ある領域が結合試薬に暴露されて、別々の結合ドメインが作り出される。各々異なる微量流体ガイド中に存在する異なる結合試薬は、同時に流体ガイドアレイから、必要に応じて金属表面、SAMなどに送達される。微量流体ガイドはまた、支持体表面への適用の前に、微小型押しに目的の分子を補充するために使用することができる。例えば、個々の微量流体ガイドは、支持体の表面への吸着を促進してPMAMSを形成する残基(例えば、炭化水素リンカー上の遊離チオールであり、これは金への吸着を促進する)に結合した、異なる結合試薬を適用するために使用することができる。すなわち、例えば、微量流体ガイドの使用により異なる特異性の抗体を充填した微小型押しは、金表面上の目的の領域にこのような抗体を適用して、PMAMSの別々の結合ドメインを形成するために使用することができる。
PMAMSの1つの作成方法において、微量流体ガイドを使用して、表面上の別々の領域に、目的の結合試薬を含有する液滴を直接(好ましくは同時に)送達して別々の結合ドメインを形成する。結合試薬は、これが適用される表面上の化学基と結合する化学官能基を含有してもよい。別の変法において、液滴中の結合試薬は、表面に非特異的に吸着または結合される(例えば、表面上で乾燥する)。
あるいは、表面上に沈積した液滴は、マトリックスを形成することができる試薬を含有してもよい。このマトリックスは、固体、ポリマーまたはゲルであってよい。マトリックスの形成は、溶媒の留去によってもよい。モノマー分子種の重合でもよい。前もって形成されたポリマーの架橋でもよい。温度の調節(例えば、冷却および/または加熱)でもよい。他の方法でもよい。例えば、ポリマー分子種を冷却遷移(cooling transition)により、またはゲル化を起こす試薬の添加により冷却してもよい。固体マトリックスの形成は、光(または他の放射線)、凝固またはゲル化を誘導する試薬の添加、冷却または加熱による、電極での反応性分子種(基質を含む)の生成により誘導することができる。さらに、表面は、マトリックス形成(例えば、ゲル化または重合)を開始することができる触媒を含有してもよい。
詳細には、PMAMSは、ミクロコンタクトプリンティング、すなわち、型押しにより生成する。こうして適用された単層は、表面結合基から構成され、これは、例えば、金表面については、アルカン((CH2)n)スペーサーを有するチオール基が好適である。スペーサー基は、結合基Aに結合(好ましくは共有結合)される。「A」は、例えば、アビジン、ストレプトアビジンまたはビオチン、あるいは利用可能な相補的結合パートナーの「B」との任意の他の適切な結合試薬であってよい。A:B結合は、共有または非共有であってよく、使用可能な当該分野で公知のいくつかの結合化学種は、例えば、バード(Bard)ら(米国特許第5,221,605号および5,310,687号)により開示されている。「B」はさらに、抗体、抗原、核酸、薬剤、または試験すべき試料中の目的の1つまたはそれ以上のアナライトに結合することができる結合ドメインを形成するために適切な他の物質のような、結合試薬に結合している。Bはまた、ECL TAGまたは標識物に結合していてもよい。結合基Bは、異なる結合表面特異性を有する複数の「B」試薬を、単層「A」結合上に配置することができる、毛細管または微量流体ガイドアレイ(図5A〜5C)によりSAMに送達することができる。AとBはまた、単層に結合する前に結合することができる。図5Aでは、考察したように単に例示の目的で幾何学図形602として、異なる結合特異性が、単一支持体600上に存在しうることを示すために、形に非依存性の結合ドメインが表される。図5Bは、微量流体ガイド(例えば、毛細管)アレイ606の平面図を提供する。ドット610は、横断面のガイドである。図5Cは、微量流体ガイドアレイ608の側面図を提供する。上部と底部から出ている線は、個々の微量流体ガイド610である。下面の幾何学図形612は、個々の毛細管からの結合試薬の送達により形成される特異的な結合ドメインを表す。
1つの目的のアナライトに特異的な結合試薬を各結合ドメインに使用することができるか、または多数の目的のアナライトに特異的に結合する結合試薬を使用することができる。
さらに別の変法において、支持体表面は、上記図5Aに示されるように、異なる結合化学種および/または結合残基を有する物質(例えば、結合試薬、ECL標識、SAM)により何度も型押しすることができる。
パターン付けした結合試薬は、安定であるか、および/または頑丈な化学基(例えば、これらが受ける条件に耐えて残る基)であってよく、これが後であまり安定でないかまたは強い結合基に結合する。PMAMS表面の作成における各工程の条件を最適化するために、および/またはPMAMS表面の製造法を単純化するために、多数の結合の仕方を利用することができる。例えば、最初のPMAMS表面は、一般的な方法で組み立てて、次に異なるPMAMS表面を作り出すために修飾してもよい。別の例において、一般的なPMAMS表面を、それ自体がPMAMS表面上の特定領域(例えば、結合ドメイン)に向ける結合ドメインを含有する結合試薬の溶液混合物と反応させることができる。例えば、各々異なるオリゴ(ヌクレオチド)配列を提示する結合ドメインのパターンを表面に結合する。次にこの表面を、各々表面上の配列に相補的なオリゴ(ヌクレオチド)配列に結合している、二次結合試薬の混合物を含有する溶液で処理する。このように、これらの二次結合要素のパターン付けを達成することができる。好ましくは、オリゴ(ヌクレオチド)配列は、6〜30量体のDNAである。あるセットの6〜30量体配列は、実質的に同様な配列相補性を有するため、ハイブリダイゼーションのおよその結合定数は、所定のセット内で同様であり、相補性の低い配列とは識別可能に異なっている。別の実施態様において、二次結合要素はタンパク質(例えば、抗体)である。
PMAMS結合試薬は、炭素を含有する材料上に存在してもよい。これらはまた、個々の炭素小繊維に存在するか、またはPMAMS結合試薬は、1つまたはそれ以上の小繊維の凝集体に存在してもよい。多くの実施態様において、PMAMS結合試薬は、1つまたはそれ以上の小繊維の懸濁液、小繊維の分散液、小繊維と他の材料との混合物(例として上に記載されるような)並びにその組合せに存在してもよい。
別の例において、個々のこのような結合ドメインまたは複数のこのような結合ドメインは、支持体の間の空いた別々の領域内に存在する。非限定的な例として、個々のこのような結合ドメインまたは結合ドメインの集合は、支持体の凹部、くぼみおよび/または穴に存在してもよい。さらに別の例において、個々の結合ドメインまたは複数のドメインは、支持体の表面上に局在化している、水、ゲル、エラストマー、プラスチック、油などの液滴に存在してもよい。また別の例において、個々の結合ドメインは、異なる結合試薬および/または結合試薬/小繊維全体に対して異なる結合親和性を有するコーティング(パターン付けされていてもよい)により、支持体上に局在化してもよい。
支持体は、磁性でない領域に囲まれている、磁性であるいくつかの別々の領域を含有することができる。磁性小繊維上に局在化される結合試薬は、支持体の磁性領域上に局在化することができる。1つの例において、支持体は、かつ磁性でない領域に囲まれている、磁性である1つまたはそれ以上の領域を含有してよく、磁性領域の磁界の強さは調節するか、または切り替えることができる。この面において、このような調節された、または切り替え可能な磁界の使用は、支持体の表面から小繊維上に局在化される結合試薬を付加または放出する際に助けとなり、このため、前記ドメインを撹拌または混合するのに役立つ。
大体2〜108の結合ドメインが存在し、好ましくは25〜500ドメインが存在する。
異なる型のPMAMS、支持体、および電極並びにそれらの配置について本明細書に記載される異なる実施態様はまた、相互の組合せで実施することができる。
PMAMS支持体は、後の使用のために保存(例えば、保護表面コーティング、表面の乾燥、真空下または不活性雰囲気下の頑丈な包装、冷蔵および関連方法)することができる。
本発明の結合ドメインは、少なくとも1つの目的のアナライト(リガンド)に特異的に結合する結合試薬を含有するように作成される。別々の結合ドメイン内の結合試薬は、結合ドメインが目的の結合特異性を有するように選択される。結合試薬は、目的のアナライトを特異的に結合することができるか、またはできることが推定されることが当該分野で公知の任意の分子の中から選択することができる。目的のアナライトは、下記セクション5.10の「実施することができるECL測定法」に記載されるものの中から選択することができる。すなわち、結合試薬は、受容体、受容体のリガンド、抗体またはその結合部分(例えば、Fab、(Fab)’2)、タンパク質またはその断片、核酸、オリゴヌクレオチド、糖タンパク質、多糖、抗原、エピトープ、細胞および細胞成分、細胞内粒子、炭水化物残基、酵素、酵素基質、レクチン、プロテインA、プロテインG、有機化合物、有機金属化合物、ウイルス、プリオン、ウイロイド、脂質、脂肪酸、リポ多糖、ペプチド、細胞内代謝物、ホルモン、薬剤、トランキライザー、バルビツール酸、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖類、非生物学的ポリマー、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ポリマー樹脂のような有機結合化合物、リポタンパク質、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、合成ポリマー、有機および無機分子などを含むが、これらに限定されない。核酸とオリゴヌクレオチドは、DNA、RNAおよび/またはオリゴヌクレオチド類似体を意味し、これらには、修飾塩基または修飾糖を含有するオリゴヌクレオチド、ホスホジエステル結合以外の基本骨格化学種を含有するオリゴヌクレオチド(例えば、ピー・イー・ニールセン(Nielsen,P.E.)(1995)Annu Rev.Biophys.Biomcl.Street.24 167−183を参照のこと)、および/または他の分子への結合(共有または非共有)を形成するのに使用することができる化学基を提示するように合成または修飾されているオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない(ここで、我々は核酸またはオリゴ(ヌクレオチド)を2つまたはそれ以上の核酸塩基および/または核酸塩基の誘導体を含有するとして定義している)。
PMAMSは、(i)相互に同一であり、かつ他の結合ドメインに含まれる少なくとも1つの結合試薬とは特異性の異なる結合試薬を含有する、少なくとも1つの結合ドメイン;および(ii)結合特異性が異なる結合試薬をその中に含有する少なくとも1つの結合ドメインからなる、複数の別々の結合ドメインを有してよい。例として、(a)単一の本体(例えば、T細胞抗原受容体、例えば、α、β−T細胞抗原受容体またはγ、δ−T細胞抗原受容体に対する抗体)の結合試薬を含有するため、この少なくとも1つの結合ドメインが、このT細胞抗原受容体を発現する全ての細胞に結合することができる、少なくとも1つの結合ドメイン;および(b)2つの異なる結合試薬、例えば、T細胞抗原受容体に対する抗体とCD4に対する抗体を含有するため、その少なくとも1つの結合ドメインが、そのT細胞抗原受容体を発現するCD4+Tリンパ球(すなわち、Tリンパ球の部分集団)に結合することができる、少なくとも1つの結合ドメインを有するPMAMSが製造される。
複数の結合試薬は、これらの試薬が、異なっており、異なる結合特異性を有するとしても、同じアナライトを認識するように、選択することができる(別の実施態様においては、異なるアナライトが認識される)。例えば、アナライトが、多くの結合残基を有するアナライト(例えば、異なる細胞表面抗原を有する細胞)である場合は、異なる結合残基に結合する異なる結合試薬は、同じアナライトを認識するであろう。別の例として、単一細胞上の異なる細胞表面抗原に対する抗体は同じ細胞を認識するであろう。さらに別の例として、単一抗原の異なるエピトープに対する抗体は、その抗原を認識するための結合試薬として使用することができる。
結合ドメインはまた、目的の標準的アナライトに特異的で、内部標準として利用される結合試薬を含有するPMAMS中に組み込むことができる(例えば、結合試薬が結合するアナライトの明確な量を含有する試料と接触させることのできる結合ドメイン)。同じアナライトに特異的な結合試薬を含有する多数の結合ドメインはまた、分析結果の統計的平均化が可能になるように、PMAMS中に組み込むことができる。結合試薬は、同じアナライトに特異的であるだけでなく、同一であり、このため、アナライト上の同じ結合残基を認識する。すなわち、ECLの読みを変量について照合し、正確度を改善するために統計的に平均化することができるように、同じ結合残基に特異的に結合する複数の結合ドメイン(例えば、2〜108個の範囲内の)を作成することができる。PMAMS上の複数の結合ドメインは、単一の支持体上の、対照のアナライトまたは目的のアナライト、あるいは両方に特異的であってもよい。
基質(この基質は、目的のアナライトである)に対して特異的な酵素である結合試薬を使用することができ、そして基質上のこの酵素反応の産物は、レポーター物質(検出可能な物質)、例えば、ECL反応を引き起こす産物、蛍光分子、適切な酵素との接触により色を変化する基質(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼの発色性基質)などである。このような実施態様の例において、結合試薬として使用される酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)であり、これは、試料中のグルコースを検出または測定するために使用することができる。ECL標識物は、GDHを含有する結合ドメイン内、またはその近くに位置する。NADHは、グルコースへの酵素の作用により産生し、NADHはECL標識と反応して、ECLを促進することができる(マーティン(Martin)ら、1993,Anal.Chim.Acta 281:475)。
バックグラウンド結合を増大させる結合試薬(すなわち、目的のアナライトだけでなく試料中の他のアナライト上に存在する結合残基にも結合する)を含有する結合ドメインを、電気化学発光の検出または測定の間のシグナル対ノイズ比を増大させるために使用することができる。例として、目的のアナライトが特異的な細胞の部分集団(例えば、CD4+細胞)であり、かつ試料が患者からの細胞を含有する液体試料(例えば、血液)である場合、シアル酸に対する抗体を試料中の実質的に全ての細胞に対するバックグラウンド結合を増大させる結合試薬として使用し(シアル酸は、実質的に全ての細胞表面糖タンパク質の成分であるため)、そしてその細胞の部分集団に対して特異的な細胞表面糖タンパク質に対する抗体(例えば、CD4に対する抗体)を結合試薬(シアル酸に対する抗体を含有する結合ドメインと同じかまたは異なる結合ドメイン中の)として使用することができる。
ECLセルの複数の電極および対電極の対にかけられる電位波形(電位/時間の変化)は、ECL反応を引き起こすのに十分なものである必要がある。この電位波形は通常、第1の電位で開始して、着実に第2の電位に移行し、第1の電位を通過して第3の電位に移行し、再度第1の電位に戻す、一定の掃引電位の形である。例えば、波形は、−0.5〜0.5ボルトの範囲の第1の電位で開始し、1〜2.5ボルトに上げて、第1の電位を通過して、0.0〜−1ボルトの範囲の第3の電位に移行してもよい。別の例として、より単純な波形で、電位を0.0〜+3.5〜0.0に変更することができる。電位波形は、線形傾斜路、階段関数、および/またはその他の関数を組み込むことができる。電位波形は、電位が1つの電位に固定されて留まる時間を組み込むことができる。適用される電位は、1つまたはそれ以上の参照電極に対して制御されるか、または参照電極を使用しなくてもよい。さらに、負電位を使用することができる。従って、本発明のカセットからのECL発光を誘導するために使用される電位は、ECLラベルに対する最適なECLシグナル強度と特異性、および測定媒体について、容易に選択されるであろう。
いくつかの適用において、電位は、好ましくは結合ドメインから放出される光が測定されるにつれ変化する。このことは、結合ドメインに光を放出させるのに必要な電場の閾値を決定するために特に重要である。この場合、結合ドメインに適用される電位は、光を放出するのに必要な閾値以下であると考えられる値で開始して、最初の測定が放出される光により行われる。光が測定されなければ、または光が、前もって決めた閾値以下であるならば、電極対間に適用される電位は、コンピュータ制御電位供給源によるなどして、コンピュータ制御下で増大させて、もう一度光測定を行う。このプロセスは、前もって決めた適切な量の光が受けられるまで、反復することができる。このように、適用される電位は、測定シグナルとして使用することができる。
例えば、米国特許第5,324,457号および5,068,088号に開示されるような、電位および電流の設定に詳しい普通の技術者であれば、ECL発光を引き起こすための最適な操作電位および掃引電位を容易に選択することができるであろう。
ECLを生成するために要する電位は、作用電極が半導体であるか、または光に応答して電流を生成する別の残基を含有するならば、作用電極表面の発光により生成することができる。
複数の電極/対電極の対をアドレスするために多くの方法を使用することができる。このような方法のいくつかを図14〜18に例示する。これらの図面に例として4つの電極/対電極の対101、102、103、104、および典型的にはディジタルコンピュータであり、かつ検出手段により検出されるECLを処理するために使用されるのと同じコンピュータである波形発生器が示される。
図14において、各電極/対電極の対101〜104は、波形発生器に接続される線の対により個々にアドレスされている。例として、線105、106は、電極/対電極の対101にアクセスしている。適切な波形は、種々の電極/対電極の対に接続されている任意の1つまたはそれ以上の線の対に、任意の所定の時間に適用することができる。
各電極対の迅速で一連のエネルギー付与を可能にするために、コンピュータ制御切り替え装置は有益である。図16の構成は、第1のマルチプレクサー310に接続した複数の電極を示している。複数の対電極は第2のマルチプレクサー320に接続している。第1のマルチプレクサーはまた、典型的には後述される時間変動電位を供給する、電位供給源330の第1の極にも接続されている。第2のマルチプレクサーも、電位供給源の第2の極にも接続されている。各マルチプレクサーに電気的に接続され、ラッチ340に接続されている線A0〜A3のアドレスを使用して、コンピュータプロセッサー350は、任意のまたは全ての第1電極を電位供給源の第1の極に、任意のまたは全ての第2の電極を電位供給源の第2の極に選択的に接続するために、マルチプレクサーを管理することができる。
この実施態様の電極アレイが、独立に駆動可能な電極対の少なくとも一部を有するならば、図14または15に示されるように、例えば、1つの電極対は、1つの電位供給源により駆動することができ、一方もう1つの電極対は同時に別の電位供給源で駆動される。あるいは、図17の2つの電位供給源は、両方のセットのマルチプレクサーと並列に接続された単一の電位供給源で置換されて、同じ電位供給源から2つの電極対が駆動可能であってもよい。
あるいは、任意の実施態様において各電極対に適用される電位を変化させることができる。これは、複数の異なる結合ドメインを有するカセットが使用されるときには特に有益である。このようなカセットは、異なる結合ドメインで異なる範囲の適用電位を必要とするかもしれない。各電極に適用される電位を変化させることのできるいくつかの異なる実施態様が企図される。
有利には、コンピュータ制御電位供給源が使用される。コンピュータ制御電位供給源は、コンピュータによりアドレスを行って供給すべき特定の電位を選択することができるものである。あるいは、前もって決めた時間にわたり、特定の範囲の電位を順に適用するようにプログラムすることができる。このようなシステムにおいて、コンピュータに接続されるアドレス線および電位供給源は、コンピュータが、エネルギーを与えるべき電極対に適用される特定の電位を生成するように電位供給源をプログラムすることを可能にする。
図36は、本発明の別の実施態様を示している;電極のアレイ(3600,3601)は、絶縁体3604中の間隙のパターン(例えば、穴3605を開けたプラスチックのシート)により分離される各々2つの表面(3602,3603)上に支持されている。各電極は、複数の間隙を横切ってもよい。各表面上の1つの電極間に電位が適用されるならば、電流は、両方の電極に接触している間隙を通過できるだけであり、このため、発生する任意の電気化学すなわちECLの位置を限定することになる。図に示される好適な実施態様において、電極(3600,3601)は、支持体上の線のアレイである。この2つの表面上の2セットの電極は、相互に垂直に向いている。絶縁シートの間隙は、各表面からの電極の交差部分にのみ位置する。
この実施態様は、導電性の低い導線を必要とする電極を個々にアドレスするには有利である。
引き起こされたECL発光により生成される光は、本発明の装置に隣接して置かれる適切な光検出器により検出される。光検出器は、例えば、フィルム、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、電荷結合素子(「CCD」)あるいは他の光検出器またはカメラであってよい。光検出器は、順に発光を検出するための単一の検出器であっても、または放出光の単一または多数の波長での同時放出を検出し空間的に解像するために複数の検出器であってもよい。放出され検出される光は、可視光であっても、または赤外線または紫外線のような非可視光として放出されてもよい。検出器は、静置型であってもまたは移動可能であってもよい。放出される光または他の放射線は、カセットの結合表面の上、またはこれに隣接して位置する、レンズ、鏡および光ファイバーのガイドまたは光コンジット(単一の、多数の、固定の、または移動可能な)により、検出器に導くことができるか、あるいは検出器は光を直接受けることができる。さらに、支持体、PMAMSおよび電極表面自体を利用して、光の伝搬をガイドするか、または可能にすることができる。
結合ドメイン上、または近くの第2の表面上に沈積される液滴は、放出される光を管理または制御するためのマイクロレンズとして使用することができる。あるいは、光検出器は、カセットの前に直接向けることができ;そして、放物面反射装置またはレンズのような種々の光焦点調整装置を、任意の複数の結合ドメインからの光を検出器に向けるために光コンジットの代わりに利用することができる。少なくとも2つの別々の結合ドメインから放出される光は、同時にまたは順に測定することができる。
また、ECLシグナルは、試薬の消耗によるシグナル変調を修正するため、標準試薬で前に測定した結果と比較して較正することができる。
所定の結合ドメインから発生するシグナルは、ある範囲の値を有しており、これらの値は、「アナログ」シグナルを提供する定量測定と相関している。別の方法において、各ドメインから、アナライトが存在するかまたは存在しないかのいずれかを示す「ディジタル」シグナルが得られる。
統計解析は、両方の方法について使用され、そして定量的な結果を提供するために複数のディジタルシグナルを変換するのに特に有用である。しかしいくつかのアナライトは、閾値濃度を示すディジタルの存在/非存在のシグナルを必要とする。「アナログ」および/または「ディジタル」フォーマットは、別々にまたは組合せて利用することができる。他の統計的方法をPMAMSで利用することができる。例えば、表面上のPMAMSの濃度勾配を作ることが可能である(ショウドハリー(Chaudhury)ら、1992,Science 256:1539−1541)。この方法は、濃度勾配にわたる結合の統計解析により濃度を決定するのに使用される。濃度勾配を有するPMAMSの多数の線形アレイは、非常に多数の異なる特異的結合試薬により生成することができる。濃度勾配は、異なる濃度の結合試薬を提示する、別々の結合ドメインよりなっていてよい。
本発明により実施される測定により、迅速かつ効率的に大量のデータを集め、そしてこれらを、例えば、臨床情報または研究情報の集合よりなるデータベースの形で保存することができる。集められるデータはまた、迅速な法医学的または個人的な同定に使用することができる。例えば、ヒトDNA試料に暴露されるときに複数の核酸プローブを使用すると、臨床試料または研究試料を同定するために容易に使用することができる、署名(signature)のDNAフィンガープリントに使用することができる。
電極は、大体0.001〜10mmの幅または直径であってよい。電極対の好適な範囲では、0.01〜1mmの大きさ(幅または直径または電極対の形状に依存して最も広い寸法)である。
好ましくは、電極は、透明金属フィルムまたは半導体(例えば、各々、金またはインジウム−酸化スズ)のような適切な導電性材料から、当該分野で周知のように、例えば、液晶ディスプレイなどの組立のように、組み立てられる。カセットの組立た形において、例えば、薄膜または湿潤表面のように、第1支持体と第2支持体の間に、分析用試料を含有するのに十分な空間が残る。
電極は、炭素、炭素繊維、カーボンナノチューブおよび/または上記の凝集体を含有する材料から組み立てることができる。
電極は、炭素小繊維から組み立てることができる。1つまたはそれ以上の個々の小繊維および/または1つまたはそれ以上の小繊維の凝集体は、より大きな凝集体を形成するために加工することができる(米国特許第5,124,075号)。
例として、小繊維マットは、分析用および/または分取用の電気化学において、作用電極、対電極または参照電極として使用することができる。1つの例において、小繊維マットは、電気化学発光(ECL)用の電極として使用される。
PMAMSの結合ドメインは、小繊維マットにより支持されてよい。本発明のPMAMSは、複数の別々の結合ドメインを有し、この内2つまたはそれ以上は、相互に同一であっても、または異なっていてもよい。小繊維マットは、1つまたはそれ以上の結合ドメインを支持する。
1つまたはそれ以上の微量流体ガイドを使用して、小繊維マット上に複数の結合ドメインを作成することができる。異なるかまたは同一の結合試薬が、複数の微量流体ガイドに存在しても、および/または多数の別々の結合試薬が微量流体ガイドに存在してもよい。
目的の結合試薬は、マットに吸引濾過を適用しながら、小繊維マットに送達される。この場合に、吸引濾過は、結合試薬を全く引かないか、少しまたは全ての結合試薬をマット中にまたはマットを通して吸引し、そうすることで、パターン付けプロセス中のマットの表面上の結合試薬の横への拡散の量を低下させる。
小繊維マットは、懸濁液の液体が通り抜けることのできる基質(例えば、フィルター)上に炭素小繊維の懸濁液を圧縮することにより、作成される。小繊維マットを形成するのに使用することができるフィルターの例は、濾紙、ポリマー性(例えば、ナイロン)膜から形成されるフィルター、金属マイクロメッシュ、セラミックフィルター、ガラスフィルター、エラストマーフィルター、ガラス繊維フィルターおよび/またはこのようなフィルター材料の2つまたはそれ以上の組合せを含む。濾過の分野の当業者であれば、これらの材料が、固体の懸濁液の濾過に適した多くの可能な材料の一例にすぎないことを認識するであろう。
図23Aおよび23Bは、小繊維マットが、吸引濾過により作成される実施態様を例示する。炭素小繊維の分散液および/または懸濁液2301を、場合によりフィルター膜2303および/またはフィルター支持体2302を取りつけたフィルター2300を使用して濾過する。懸濁液は、例えばフィルターフラスコ2306によって、真空供給源2305によりフィルターに適用される吸引を使用して濾過される。小繊維マット2304は、フィルター膜2303および/またはフィルター支持体2302のいずれかまたは両方の上に集まる。小繊維マット2304は、フィルター膜2303と共にまたは膜なしに、フィルターから除去することができる。
小繊維の懸濁液は、毛細管作用によりフィルターを通過させられるか、またはフィルター中へのまたはフィルターを通っての懸濁液の吸上作用により濾過される。
別の実施態様において、個々の小繊維または小繊維の凝集体は、マット中に共有結合で架橋結合される。露光されると重合する光感受性残基で誘導体化した小繊維に、光を照射する。
フィルターは、その孔に小繊維を捕捉するために使用して、フィルターが支持体として作用する複合マットを形成することができる。図24において、小繊維マット2400は、供給源2402により2つの大きなローラー2403の間に送達される小繊維のスラリー2401を通過させることにより作成することができる。紙またはポリマーシートの作成において見い出されるプロセスに類似している、このプロセスにおいて、ローラーは、懸濁液から液体を絞り出して、小繊維の大きな連続したマットが生成して、ここから小さなマットを切り出すことができる。
小繊維マットは、自立構造(例えば、支持されていない)であるか、または支持されている。
炭素小繊維の懸濁液は閉じこめられて、小繊維が懸濁している液体は除去される。1つの例において、小繊維が懸濁している液体は蒸発除去させられる。別の例において、液体は加熱により除去される。さらに別の例において、懸濁液は遠心分離にかけられて、生じた液体(例えば、上清)は除去される。別の例において、液体は吸引により除去される。
懸濁液は、上述の1つまたはそれ以上のフィルター上に置かれて、懸濁液を蒸発により乾燥させる。懸濁液は、加熱またはオーブンで加熱乾燥して乾燥させるか、または液体は、凍結および液体の抽出により除去することができる。さらに別の例において、液体は、ポンプで排気して除去される。当業者には周知の多くの他の方法が、懸濁液から液体を除去するために利用可能である。
濾過により小繊維マットを形成するのに適した小繊維の懸濁液は、1つまたはそれ以上の炭素小繊維を適切な液体、半固体またはゲルに分散させることにより形成することができる。適切な液体の例は、水、エタノール、メタノール、ヘキサン、塩化メチレン、緩衝液、界面活性剤、有機溶媒、生物学的媒体を含有する溶液(例えば、タンパク質、抗体またはその断片、抗原、リポタンパク質、リポサッカリド、脂質、糖タンパク質、炭水化物、ペプチド、ホルモンまたは薬剤、低分子の溶液、ポリマー前駆体、酸または塩基の溶液、油および/またはこれらの組合せ)を含むが、これらに限定されない。
小繊維の懸濁液は、音波破砕により、炭素小繊維を水性溶液に分散させることにより調製することができる。別の実施態様において、界面活性剤および/または洗浄剤を添加してもよい。
小繊維マットは、大体0.01μm〜10,000μmの間の厚みを有してよい。
小繊維マットは、懸濁液から残った残渣物質を除去するために、繰り返し洗浄し再濾過することができる。
濾過または蒸発により作成される小繊維マットは、加熱(例えば、オーブン内で)して、濾過により除去されない懸濁液からの残渣の液体を除去する。
連続濾過工程を使用して、1つまたはそれ以上の別々の層からなる小繊維のマットを形成することができる。層は、多孔度、密度、厚み、個々の小繊維および/または小繊維の微視的凝集体の粒度分布、型、小繊維凝集体の数および/またはサイズ、小繊維の化学的誘導体化(下記を参照のこと)、および/または小繊維に結合している他の物質の存在を含むが、これらに限定されない、いくつかの性質により区別することができる。
図25の多層小繊維マット2500は、連続濾過工程により作成される。未処理の小繊維の0.5μm〜100μmの厚さの層2501が第1の層を形成し;ポリ−(エチレングリコール)のような残基を組み込み、タンパク質および他の分子の吸着に抵抗する、小繊維の0.5〜10μmの厚さの層2502が第2の層を形成し;1つまたはそれ以上の結合ドメイン(上記を参照のこと)を組み込む、0.5〜5μmの厚さの層2503が第3の層を形成する。結合ドメインは、1つまたはそれ以上の抗体2504を含有し、この抗体がアナライト2505に結合しうる。この抗体/アナライト複合体は、標識抗体に結合することができる。標識物は、ECL標識物であってよい。他の実施態様において、標識物は、本出願の他の部分で記載される、1つまたはそれ以上の複数の標識物であってよい。このような多層マットは、自立構造であるか、または上述の複数の可能な支持体の1つの上に支持されていてもよい。
層の組合せが存在し、いくつかのまたは全ての層が異なる多層マットが形成されてよい。
フィルターは、金属でコーティングされ、そして小繊維は、前記金属と結合を形成する化学官能基で誘導体化される。フィルターは、金属スクリーンまたは金属シートである。
小繊維マットは、平板であるかまたは変形され、規則的であるかまたは不規則であり、円形、楕円形、長方形、または多くの形の1つ、剛性または可撓性、透明、半透明、部分的にまたは完全に不透明であってよく、かつ複合性または異なる個々のまたは複合性の領域を有してもよい。
マットは、円盤状であるか、またはシートから取られる断片であってよい。
穴のアレイを有するマスク(例えば、スクリーン)が、フィルターまたは支持体のある部分を覆うために使用され、複数の別々の小繊維マットが濾過および/または蒸発のいずれかにより同時に作られる。
小繊維マットは、0.1〜3.0グラム/cm2の密度を有してよい。マットは、可変的な密度を有してもよい。例えば、機械的な力または圧力を、異なる時間にマットに適用して、密度を増大または減少させることができる。
小繊維マットは孔を有してもよい。これらの孔は、部分的におよび/またはマット全体に拡張されてもよく、または孔の網の一部であってもよい。これらの孔は、大体50Å〜1000μmの範囲の寸法を有してよい。好適な実施態様において、小繊維物質は、200Å〜500Åの範囲の寸法の孔を有する。マットの多孔度は、他の因子の中でも、マットの密度に依存するようである。
マットの多孔性はマット全体で一定であるか、またはマット内の位置の関数として増加または減少する。小繊維マットは、不規則におよび/またはランダムに分散した異なるサイズの広範囲の多孔を有する。
マットの多孔性は、異なるサイズ、形、組成、または組合せを有する、炭素小繊維の凝集物の異なる量を含有させることにより変化させてもよい。具体例において、マットはCC小繊維(前述)およびBN小繊維(前述)、または異なる組合せである各小繊維から作成される。例えば、小繊維マットのある孔は生物細胞のような大きな物体を通過させるのに充分なほど大きく、ある孔はタンパク質または抗体の大きさの生物学的媒体を通過させることができ、ある孔は小さな(<1000分子量)有機分子のみを通過させることができ、および/またはこれらの組合せである。
マットの多孔性は、1つまたはそれ以上の分子、液体、固体、エマルジョン、懸濁物、気体、ゲルおよび/または分散物が、マット中に、この内部、および/またはこれを通過するようなものである。小繊維マットの多孔性は、生物学的媒体がマット内、この内部、および/またはこれを通過して分散する(能動的にまたは受動的に)か、または何らかの手段で強制されるようなものである。生物学的媒体の例としては、分画した血液、血漿、血清、尿、タンパク質溶液、抗体またはその断片、細胞、細胞内粒子、ウイルス、核酸、抗原、リポタンパク質、リポ多糖、脂質、糖タンパク質、炭水化物、ペプチド、ホルモンまたは薬剤があるが、これらに限定されない。小繊維マットは、物質が1つまたはそれ以上の層を通過し、他の層は通過しないように、多孔性の異なる1つまたはそれ以上の層を含有してもよい。
米国特許第5,304,326号および5,098,771号に開示の実施態様では、小繊維は別の物質に分散される。例えば、小繊維は、油、蝋、パラフィン、プラスチック(例えば、ABS、ポリスチレン、ポリエチレン、アクリロニトリルなど)、セラミックス、テフロン(登録商標)、ポリマー、エラストマー、ゲル、および/またはこれらの組合せ中に分散される。他の物質中の小繊維の分散物は、成形、圧縮、二次成形、注型、遠心分離、編み込み、および/または投入により、所望の形および/または型に成形される。小繊維マットは、マットの導電性を上げるために別の物質、例えば金属の薄い線維、破片、または球を含有してもよい。別の例では、小繊維マットは、小繊維単独で得られるものとは異なる多孔性を作成するために、種々のサイズ、形および密度の炭素、ガラスおよび/または金属線維を含有してよい。別の面において、マットは磁気ビーズ(例えば、ダイナル(DYNAL)ビーズ)を含有する。後の例で、ビーズはマットの多孔性を変化させるのに有用であるか、またはそれ自身が結合ドメインを固定化するための支持体として使用される。
炭素小繊維は、その表面に共有結合した化学官能基を用いて作成される。国際特許公報第90/14221号に記載のように、これらの官能基は、COOH、OH、NH2、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)−エステル、ポリ−(エチレングリコール)、チオール、アルキル((CH2))n)基、および/またはこれらの組合せがあるが、これらに限定されない。これらおよび他の化学官能基が、小繊維の表面に他の物質を結合させるのに利用できる。
ある化学官能基(例えば、COOH、NH2、SH、NHS−エステル)が、小繊維に他の小分子を結合させるのに利用できる。このような化学的官能基と小分子の複数の可能な組合せがある。
多くの実施態様においてNHS−エステル基は、求核性化学官能基が、天然のおよび/または化学的修飾により、生体分子上および/またはその中に存在する。適当な生体分子の例には、アミノ酸、タンパク質およびその断片、抗体、抗体の結合性断片、酵素、核酸、およびこれらの組合せがあるが、これらに限定されない。これは多くの可能な方法の1つであり、本明細書に記載の例および他の類似の物質および/または生体分子に一般的に適用できる。好適な実施態様において、ECLに使用される試薬は、NHS−エステル基を介して小繊維に結合してよい。
ECL測定法に使用できる抗体は、共有結合(例えば、NHS−エステルとの反応)により、適当なリンカー(上記)により、非特異結合により、および/またはこれらの組合せにより、1つまたはそれ以上の小繊維または小繊維マットに結合することができる。小繊維に結合したNHS−エステルに共有結合により、小繊維または小繊維マットに、核酸および/または細胞を結合することができる。
小繊維および/または小繊維マットへの物質の非特異結合の程度を調節することが好ましいことがある。非限定例として、タンパク質、抗体、抗体の断片、細胞、細胞内粒子、ウイルス、血清および/または1つまたはそれ以上のその成分、ECL標識物(例えば、RuII(bpy)3およびRuIII(bpy)3誘導体)、シュウ酸塩、トリアルキルアミン、Ag、アナライトおよび/またはこれらの組合せの非特異結合吸着を低下または防止することが好ましい。別の例では、生体分子の結合を増強させることが好ましい。
支持体、電極および/または結合ドメインに使用される物質は、非特異結合を低下させるために、界面活性剤で処理される。例えば、小繊維または小繊維マットは、当業者に公知の界面活性剤および/または洗浄剤で処理される(例えば、ツイーンシリーズ、トリトン、スパン、ブリジ(Brij))。小繊維または小繊維マットは、界面活性剤および/または洗浄剤の溶液で洗浄、浸漬、インキュベーション、音波処理、またはこれらの組合せ処理を行われる。PEGおよびPEGと同様の挙動を示す分子(例えば、オリゴ糖または多糖、他の親水性オリゴマーまたはポリマー)(「ポリエチレングリコールの化学:生体工学および生体医学的応用(Polyethylene glycol chemistry:Biotechnical and biomedical applications)」、ジェイ・エム・ハリス(Harris,J.M.)編、1992、プレヌムプレス(Prenum Press))の溶液を、界面活性剤および/または洗浄剤の代わりにおよび/またはこれとともに使用することができる。
前記したようなある物質の好ましくない非特異吸着は、競合的非特異吸着により阻止される。この競合的結合種は、ウシ血清アルブミン(BSA)免疫グロブリンG(IgG)でもよい。
小繊維または小繊維マットに生体分子または他の媒体を固定化することが好適であり得る。抗体、抗体の断片、タンパク質、酵素、酵素基質、インヒビター、補助因子、抗原、ハプテン、リポタンパク質、リポ糖、細胞、細胞成分、細胞受容体、ウイルス、核酸、抗原、脂質、糖タンパク質、炭水化物、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、タンパク質結合リガンド、薬剤、および/またはこれらの組合せを結合させてもよい。
エラストマー、ゲル、コーティング、ECL標識物、酸化還元活性種(例えば、トリプロピルアミン、シュウ酸塩)、無機物質、キレート化剤、リンカーなどの物質(但し、これらに限定されない)を、小繊維に結合させることが好ましい。
1つまたはそれ以上のすなわち複数の種を、小繊維または小繊維マットの表面に非特異的に結合(例えば、吸着)してもよい。
小繊維はアルキル(CH2)鎖および/またはカルボン酸基で誘導体化して、生体分子または媒体もしくは他の物質の非特異結合を上昇させることができる。
図26は、単一の小繊維の場合の前記実施態様の略図である。小繊維2600はアルキル鎖2601により誘導体化される。生体分子2602、2603、および2604は、アルキル鎖に非特異的に結合する。ポリマー/エラストマー2605もまた結合する。
誘導体化していない小繊維、小繊維凝集物および/または小繊維マットは、非特異結合により生体分子、生物学的媒体、および他の物質の固定化に使用される。
ECL TAGは荷電残基を含有する。ECL TAGは、支持体および/または電極に選択的に結合するように作成される。例えば、正味の陰性荷電を有する誘導体化したECL TAGは、より還元性の電位の電極には親和性が比較的小さく、電極電位がより酸化性になると電極に対する親和性が大きくなる。電極に対するECL TAGおよび/または結合試薬の親和性は、調節できるように作成される(例えば、結合および/または洗浄工程で親和性を低下させ、そしてECL TAGおよび/または結合試薬の親和性を増加させて、ECL読みとり時のECL TAGにより感知される有効電位を増加させる)。
複数の結合対(例えば、M1/S1/M2)が形成されてよい。M1はモノクローナル抗体、S1はM1に対する抗原、そしてM2はS1に結合する抗体である。この複合体は、抗体/抗原/抗体「サンドイッチ」複合体(そのような抗体は、モノクローナル抗体であってもでなくてもよい)でもよい。M2はECL活性標識物(前述)、蛍光標識物、放射性標識物、酵素標識物、および/またはこれらの組合せでもよい。
表面上の電極に電流を分配するための金属性電極パターンと導電性成分の作成は、当該分野で公知の方法により行われる(例えば、レベンティス(Leventis)ら、米国特許第5,189,549号を参照)。透明な表面上の金属フィルムの作成は、液晶ディスプレイを製造するために使用されており、本発明の電極の作成に容易に適用できる。ハネコ(Haneko)、1987、液晶テレビディスプレイ、液晶ディスプレイの原理と応用(Liquid Crystal TV Displays,Principles and Applications of Liquied Crystal Displays)、ケーティーケー・サイエンティフックパバリッシャーズ(KTK Scientific Publishers)、トーキョー、ディー・レイデルパブリシング(D.Reidel Publishing)。透明電極表面もまた、例えばディミラ(DiMilla)らの方法(1994、J.Am.Chem.Soc.116(5):2225−2526)に従って作成できる。0.5nmのチタンと5nmの金を透明な基板(ガラスまたはプラスチック)の上に沈積させる。ディミラ(DiMilla)らの方法(前述)により作成した薄い金の層を用いて、クマール(Kumar)の方法により透明な電気的構造を作成する。透明性を維持しながら、電流運搬性の改良のために導電性層の厚さを増加させるようにこの方法を修飾することが好ましく、これは当業者に公知である。そのような方法は、PMAMSの別々の結合ドメインに整列または近傍にある電極表面の作成に使用される。
オリゴヌクレオチドは、電子移動を調節するために使用される。例えば、2本鎖DNA中の重複パイ結合は、電子移動速度を増加させるために使用される。電極表面に結合したオリゴヌクレオチドは、結合ドメイン中の結合物質として使用される。相補的なオリゴヌクレオチド配列に結合すると、整然とした重複パイ結合を有する2重結合が形成される。具体例において、第1のまたは第2の固定化(例えば、支持体への共有結合)されたオリゴヌクレオチドがECL標識される。別の実施態様において、第1のオリゴヌクレオチドに相補的な第2のオリゴヌクレオチドまたは部分的に相補的なオリゴヌクレオチド配列がECL標識する。第2のオリゴヌクレオチドに相補的なまたは部分的に相補的な三次オリゴヌクレオチドが標識される(例えば、サンドイッチ測定法)。分岐したオリゴヌクレオチド鎖も使用することができる。種々のオリゴヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチド模倣物が使用できる(例えば、修飾塩基、および/または例えば窒素及び/もしくはイオウを有する修飾骨格を有するオリゴヌクレオチド)。差別的試験を行ってもよい。オリゴヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチド複合体中のパイ重複の安定性の変動は、電子移動により追跡できる。パイ結合で安定したECL標識2重らせんオリゴヌクレオチド対から生成するシグナル(例えば、発生するECL光および/またはインピーダンス測定)は、より不規則な1本鎖オリゴヌクレオチドからのシグナルまたは予測されるシグナルに対して相関付けられる。完全に相補的なECL標識2本鎖オリゴヌクレオチドと部分的に相補的なECL標識2本鎖オリゴヌクレオチドの間のECLシグナルは相関し得る。さらに複数オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド複合体が利用できる。例えば、三重らせんが利用できる。
場合により単層またはフィルムの少なくとも1つの成分が電位の移動を促進する、混合単層および/またはフィルムが使用される。あるいは、電位の移動を促進する分子または粒子が、単層またはフィルムに吸着される。前記の例として、電極表面に吸着するかおよび/またはそれに近いパイ共役単層および/または導電性微粒子が、使用される。パターン付けされた規則的な間隙が単層および/もしくはフィルム中で形成される。ECL標識物が次に結合される長鎖アルカンチオール(すなわち、絶縁性)からなる規則的な実質的に直角のSAM中の間隙の調節パターンを用いて、ECL標識物に付加される有効な電位が調節される。例えば図11は、金属層1204を有する1つの支持体1202から形成されるカセット1200、SAMパターン1206およびSAMパターンの間の間隙1208を示す。
ECL標識タンパク質は、単層表面に非共有結合してもよい。ECL標識タンパク質は、メチルが末端にあるアルカンチオールで誘導体化した金表面に吸着してもよい。金表面は、作用電極または対電極として作用する。図11〜13に記載のように、複数の結合ドメインが1つの支持体に導入されてよい。好適な実施態様では、結合ドメインは標識および/または非標識タンパク質および/または核酸および/または細胞および/または化学的分子種を含有する。
広い意味でアルカンチオールは、1炭素〜100炭素の長さの炭素鎖を有してもよい。好適な実施態様において、アルカンチオールの炭素の長さは、2〜24炭素を含有する。アルカンチオールの炭素鎖の長さは、2〜18炭素である。炭素鎖の長さは7〜11炭素である。このようなアルカンチオールは、測定媒体に暴露された種々の頭部の基(例えば、メチル基、水酸基、アミン、カルボン酸、オリゴ(エチレングリコール)、リン酸基、ホスホリル基、ビオチン、ニトリロ三酢酸、グルタチオン、エポキシド、ジニトロフェニル、および/またはNHS−エステル)を含有する。他の頭部の基には、組換え融合蛋白の精製と固定化に通常使用されるリガンドがある(例えば、サッセンフェルト(Sassenfeld)、1990、TIBTECH 8:88−93)。結合ドメインは、種々の密度の結合試薬を得るために、種々の程度に誘導体化される。例えば、異なる密度の活性化可能な化学種が使用されるか、および/または種々の程度に誘導体化が行われる。所望の結合密度を作成するために、種々の化学が使用される。活性化可能な基および/または結合試薬の密度を調節するために、種々の単層を使用してもよい。結合基の密度は、ECLシグナル対ノイズ比を最適化するために調節される。他の結合ドメインからの他のECL光シグナルに関して(そのECL光シグナルが順番にまたは同時に、および/または光検出手段で検出されようが)、電気化学的光シグナルの強度を最適化するために、結合ドメイン内の結合部位の総数が調節される。
さらに、単層の成分を放出するのに充分な電位が適用される。電極表面上の容量が小さい単層成分を放出することが好ましい(例えば、電極表面上の他の支持体またはプレート)。こうして単層が破壊されると、効率的に励起されていない一部のECL標識物さえ電極表面で励起されて電気化学発光シグナルが生成し、ECL標識物は小さな容量に限定され、電極からの拡散が制限される。ある電位の単層破壊の程度を調節するために、種々の単層組成が使用される。強い成分間親和性を有する成分を有する単層は、単層破壊に対してより耐性がある。長いアルカン鎖チオールは、短いアルカン鎖チオールより、有効に破壊に耐える。鎖の長さを変えることにより、所望の安定性が達成される。
特に、図12に示すように、ECL標識物の周りの電界の絶対値が増加するように、導電性粒子は電極表面の間隙を埋めるかおよび/または支持体または単層をカバーする。これらの導電性粒子は、電極表面積を拡大し、従ってECL反応の効率を増加させる。図12は、金属層1304上のパターン付けしたSAM1306を有する支持体1302を有するカセット1300を示し、SAMパターンの間の間隙を埋める導電性微粒子(例えば、図11の1208)を示し、および金属表面上に拡大していることを示す。磁性導電性粒子については、磁石または磁界を、粒子を表面に引きつけるために使用できる。導電性粒子はまた、電極表面と2つの近接した支持体を有するPMAMSの結合ドメインの間の電位を拡大するために使用することもできる。図8では、カセット900は、多重アレイの電極を有する第1の支持体902から構成され、第2の支持体904は、PMAMSを有する。導電性微粒子906は、電位を結合ドメイン上のECL標識物に拡大するために、反対の表面の間に位置する(データは示していない)。
あるいは、導電性ポリマーは、図13に示すSAMのECL標識物の周りの電位の拡大を促進するために、電極表面上の露出した間隙から成長する。図13は、パターン付けしたSAM表面1406上に金属層1404を有する支持体1402を有するカセット1400を示す。導電性ポリマー1408は、多重アレイの電極(示していない)により提供される電界を、SAM表面上の結合ドメイン(示していない)に拡大するために、SAM表面上で成長する。導電性ポリマーはまた、前述のように図7に示す2つの近接する支持体の電極表面とPMAMSの間の電位を拡大するために使用される。図7では、カセット800は、近接する支持体802と804からなる。導電性ポリマー806は、結合ドメイン(示していない)上のECL標識物に向けて電位を拡大するために、反対の表面の間で成長する。
電極対は、種々の構成で作成される。最も簡単な構成(本明細書の添付図面に記載されている)は、非導電性の平らな表面上の金属および/または金属酸化物フィルムおよび/または半導体フィルムで作成される。これらの電極対の電極は、好ましくはこれらの間の比較的一定の幅の領域を規定し、こうして比較的一定の電界を提供する。
電極の他の構成が提供される。これらの構成のいくつかは、図19(a)〜(e)に示される。図19(a)は、互いにかみ合った櫛様の電極対を示す。この構造では、各電極は、導電体から延びる複数の指を有し、櫛様構造を形成している。電極と対電極の対は、結合ドメインに隣接して位置するか、または結合ドメインが電極と対電極の間に位置してもよい。図19(b)は、1対の同心円電極(1つは環状で1つは半環状である)を示す。図19(c)は、その直線的な端が互いに向かい合っている2つの半環状電極を示す。図19(d)は、1対の長方形の電極を示す。図19(e)は、相補的な反対に曲がった表面を有してその間に波形の間隙を形成している互いにかみ合った1対の電極を示す。
電極/対電極対はまた、整列のためのPMAMS結合表面上の形に相補的な特異的な形に作成されてもよい。形の例を図6Bに示す。電極対714−720を有する支持体712を示す。電極対は例えば、環状714、互いにかみ合う716、三角にかみ合う718、または複数の電極が互いにかみ合う720でもよい。
前記した図14〜19に示す実施態様において、電極対は1つの支持体の上に位置する。あるいは、図2に示すように電極対は第1および第2の反対の支持体上に位置する。
カセットは、本発明の1つまたはそれ以上の支持体を含有する。カセットは、複数の結合ドメインおよび1つまたはそれ以上の作用電極を含有してもよい。
図2は、支持体26上の複数の結合ドメイン30のそれぞれが複数の電極32の異なる1つに隣接しているカセットを示す。対電極38は、第2の支持体28上で形成される。ECL測定は、前述のように試料を結合ドメイン30の上に置き、次に支持体26と28を一緒に動かして対電極38が結合ドメイン30のそれぞれに隣接するようにして、前述のように導線34を介して波形発生手段によりECL反応を開始させ、ECLシグナルを光検出手段40、ワイアー41、およびデジタルコンピューター手段42を用いて検出し記録する。
図3は、複数の結合ドメイン48のそれぞれが、支持体44上で複数の電極/これに隣接する対電極対50の異なる1つを有するカセットを示す。支持体46は、支持体46が、複数の結合ドメイン48と複数の電極50に隣接する試料封じ込め手段を形成するように、随時支持体44に隣接して置かれる。すなわち、ECL反応は、電気的接続52を介して波形発生手段54により開始させ、ECLシグナルを光検出手段56を用いて検出し、デジタルコンピューター手段42を用いて記録する。
図4は、ECL電極が随時提供されるカセットを例示する。支持体60上の結合ドメイン64を、アナライトを含有することが疑われる試料と接触させる。支持体62上の領域66は、目的のアナライトを検出もしくは測定するためまたは目的の反応を実施するための反応媒体を含有する。支持体60と支持体62は、一緒に近づけ、そのため結合ドメイン64と領域66は接触し、アナライトまたは反応生成物の存在は、レポーター系(例えば、フォト検出手段68により検出される光学的、化学発光もしくは蛍光シグナル)により測定され、疑似コンピューター手段70により分析される。
測定を実施するための試薬は、カセット上で、かつ/または分離した容器中で保存することができる。試薬は、乾燥および/または湿潤状態で保存することができる。1つの実施態様において、カセット内の乾燥試薬は、試験試料の添加により再水和される。別々の実施態様において、試薬は、移動可能なローラーまたはピストンからの圧力により破裂開封される「ブリスターパック」中の溶液で保存される。カセットは、測定の終了後の廃棄物区画または液体廃棄物の保存用のスポンジを含有してよい。1つの実施態様において、カセットは、試験すべき生物学的試料の調製用の装置を含む。血液から細胞を除去するためのフィルターを含んでもよい。別の例において、カセットは、試料の計量用の精密毛細管のような装置を含んでもよい。
カセットの支持体は、ECL反応を引き起こす必要が生じるまで、電極対が試料に接触するのを保護するように配列することができる。例えば、電極は、取り外し可能な電極保護手段のような種々の機械的手段を使用することにより、電極の試料との接触が必要となるまで、結合ドメイン表面から分離して維持することができる。
本発明のカセットまたは装置は、参照電極、例えば、Ag/AgClまたは飽和カロメル電極(SCE)からなる。
支持体は、クリップ、接着剤、リベット、ピンまたは任意の他の適切な機械的保持機構により結合させることができる。これらはまた、液体試料の表面張力により、または2つの支持体の反対側に取り外し可能に置かれた圧縮手段により結合させることができる。
第1および第2の支持体は、平面状でかつその間に試料保持容量を規定するように向かい合わせることができる。あるいは、第1および第2の支持体層は、2つの支持体およびその任意の他の成分の形が一致するならば、球形、立方体、円筒形を含む他の適切な形に構成させることができる。例えば、図10は、2つの隣接する非平面状支持体1102および1104から形成されるカセット1100を示している。各支持体は、形態がもう一方に対して相補的な表面を有する。いずれかの支持体も、PMAMS表面または多数の電極アレイまたはその両方を有してよい。支持体の一方または両方が、もう一方の支持体の形に一致するように、エラストマー性であってよい。支持体またはカセットはまた、プレカット(precut)型に作成されても、または回転ディスペンサーから適切な長さに提供してもよい。カセットは、試料保持容量のような試料受容手段および試料分配溝、チャネル、くぼみなどをさらに含んでもよい。
図37は、マトリックス(3703)の中および/または上の結合ドメイン(3702)が表面(3701)上に提示されているカセットを示す。作用電極(3704)および対電極(3705)を支持する第2の表面(3700)は、結合ドメインが作用電極にかなり近づくように置かれる。結合ドメインに結合したECL標識から光生成をもたらす条件下で、光はいずれかの表面または両方の表面から検出することができる。光検出器のアレイ(3706、例えば、CCDアレイ、増強CCDアレイ、またはアバランシェフォトダイオードアレイ)は、同時に各結合ドメインからの複数の光シグナルを測定するのに使用される。光検出器アレイは、結合ドメインから生成する光を撮像する。レンズ、反射器および/または光学ガイドを利用して撮像を増強することができる。他の例において、光検出器(例えば、光検出ピクセル)のゾーンまたは領域から検出される光は、結合ドメインに相関する。画像分析を使用して、検出される光の結合ドメインとの相関を促進することができる。1つの好ましい実施態様において、表面は、エラストマー性すなわち柔軟であり、このため、電極表面と密接な接触を作ることができる。結合ドメインは、対電極から作用電極にイオン電流を運ぶことができるポリマーに結合している。さらに好ましい実施態様において、この物体は、対電極から作用電極にイオン電流を運ぶことができる水膨潤性ポリマーである。
図38は、結合ドメイン(3805,3806,3807)が、対電極(3800)上に支持される別々の物体(3808,3809,3810)の表面上に提示されるカセットを示している。作用電極(3801)は、この物体の表面に接近して置かれる。結合ドメインに結合したTAG標識した基からECLを導く条件下で、光は、いずれかまたは両方の電極(もし一方または両方の電極が透明または半透明であれば)を通して、かつ/または側面から検出することができる。光検出器のアレイ(3802)は、各結合ドメインからの複数の光シグナルを同時に測定するのに使用される。この物体は、エラストマー性であるか、かつ/または柔軟であり、このため、作用電極と密接な接触を形成することができる。この物体は、対電極から作用電極にイオン電流を運ぶことができるポリマーであってよい。この物体は、対電極から作用電極にイオン電流を運ぶことができる水膨潤性ポリマーであってよい。
別の好適な実施態様において、電極は、電極の有効表面積が増大するように、光学的に半透明または透明な炭素小繊維の層でコーティングされる。
本発明のPMAMS支持体および/またはカセットは、キットとして包装することが有利である。キットは、測定物、対照などを含む、ECL反応を実施するための、本発明により調製される1つまたはそれ以上のPMAMS支持体からなる。対照試薬、ECL測定用および較正用試薬などを含む試薬は、場合によりキットに含まれる。複数の異なるアナライトに特異的な複数の結合試薬を含有する試薬混合物が含まれてもよい。
反応
1つの実施態様において、支持体上のPMAMS、およびこれを含有するカセットは、PMAMS結合ドメイン上に1つまたはそれ以上の試験試料を適用するための手段、および複数のECL反応を開始させるための手段を含有する装置中に挿入されるように設計される。このような装置は、支持体またはカセットに基づいて複数のECL測定を行うために、本発明により適切に変更された従来型の装置から得ることができる。本発明は、上述のセクションに記載されたPMAMSの各具体的な実施態様を使用して、ECL測定を行うために適合させた種々の装置を提供する。ECL反応を行うための装置は、ゾスキ(Zoski)ら(米国特許第5,061,445号)により開示されている。必要とされる変更は、支持体および/またはカセットの操作、多数の試料送達、電圧波形の供給源による多数の電極のアドレス呼び出しおよび多数のECLシグナルの獲得および処理のための手段を含む。
本発明の例示的装置の要素は図6Aに示される。このような装置700は、上部および下部支持体702、704、および電極ガード710からなる。上部支持体は、複数の電極/対電極の対(図示していない)を有する。下部支持体は、結合ドメイン706を有する。この装置は、カセットから電極ガードを取り外し、結合ドメインに結合したアナライトと接触させるように電極/対電極を配置することができる。試薬または流体の流路空間708は、結合ドメインを有する支持体の隣にある。この装置はまた、同一または個々の決められた電圧波形を、複数の各電極/対電極の対に同時または順に送って、カセット内のECL反応を引き起こし、次に放出されるECL放射を光子検出器(例えば、光検出手段)により測定することができる。装置はさらに、支持体および/またはカセット、またはその周囲の温度を維持し、ECL反応条件を最適化するために必要に応じて温度を調整するための温度制御手段を含んでもよい。温度制御手段は、好ましくは加熱および冷却手段、例えば、電気抵抗性発熱体、冷却ファン、冷凍手段、および加熱もしくは冷却の任意の他の適切な供給源である。温度制御手段はまた、温度センサー、例えば、サーモスタットまたは熱電対装置、および検出される温度変化に応答して加熱または冷却手段のスイッチを入れるかまたは切るための手段をも含む。
装置はまた、カセットの別々にアドレス呼び出し可能な電極接続部のアレイを、電子的電圧波形発生手段、例えば、ポテンシオスタットに電気的に接続することができる電極接触手段を含んでもよい(例えば、米国特許第5,068,088号の図5を参照のこと)。波形発生手段は、順にまたは同時に、カセット内の複数のECL反応を独立に引き起こすための、シグナルを送達する。
ECL測定の間、作用電極と対電極の間のイオン電流は、イオンにより導電性になった液体(例えばイオン性塩を含有する水)を通って、このような液体の薄膜を通って、かつ/またはイオンにより導電性の固体マトリックスを通って流れることができる。
装置はさらに、例えば、1つまたはそれ以上の検出手段により、カセット内で行われるECL反応を検出することができる光検出手段を含んでもよい。このような検出手段は、単に例として、光検出手段のアレイに接続された、または放出されるとECLシグナルのアレイを走査することができる単一の光検出手段に接続された電極アレイに合い、これと隣接する位置に置かれる光ファイバーチャネルのアレイを含む。
装置はまた、シグナル処理手段も含む。1つの実施態様において、かつ単に例として、シグナル処理手段は、各ECL測定の結果の移動、記録、分析および/または表示のためのデジタルコンピュータを含む。
あるいは、装置は、例えば、結合表面上にわたって順にECLを引き起こすために、1つまたはそれ以上の電極/対電極の対を走査するための、電極移行手段を含む。
PMAMSの平行アレイにおいてサイズ排除フィルターを使用することができる。
本発明で使用されるECL標識物は、当該分野で公知のECL標識物から選択される(前記セクション2.2、および米国特許第5,310,687号を参照)。ECL標識物は例えば、金属含有有機化合物からなり、ここで金属は、ルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、パラジウム、モリブデン、テクネチウムおよびタングステンよりなる群から選択される。ECL TAG試薬を調製するのに適した結合化学は公知であり、例えばバード(Bard)ら(米国特許第5,310,687号および第5,221,605号)により開示されている。結合試薬へのECL標識物の結合手段は、共有結合および/または非共有結合でもよい。ECL標識物は結合試薬に非共有結合(例えば、疎水性作用またはイオン性相互作用)をしてもよい。非共有結合の他の例では、ECL標識物が(共有結合または非共有結合で)複合体に結合し、次にこれが非共有結合で結合試薬に結合する。より具体的な例は、Ru(bpy)3がリンカーを介してNi(II)−トリニトリロ三酢酸錯体に共有結合することであろう。この分子は、複数のヒスチジンを含有するペプチド配列などの結合試薬に結合する。他の受容体リガンド対は、当該分野で公知であり、同様に使用することができる(サセンフェルト(Sassenfeld)、1990、TIBTECH 8:88−93)。さらに、分岐ネットワーク(例えば、炭化水素リンカーを介して)として構成されている複数の有機金属化合物(例えば、Ru−含有)を含有するECL標識物が使用できる。ECLが可能な複数の有機金属化合物残基を含有するこのような分岐ネットワークは、ECL標識される分子上で1回または複数の位置で結合してもよい。別の実施態様において、化合物は、ポリマー鎖の長さに沿う複数の位置で結合する有機金属基を有する線状ポリマーである(例えば、線状、分岐または環状ポリマー)。
あるいは、多重アレイ多重特異的パターン付け表面に結合した結合試薬が、ECL標識されるように、測定法をフォーマット化してもよい。試料中の目的のアナライトに結合すると、ECL標識シグナルは定量的に変化する。例えば、この表面に結合したECL標識結合試薬は、細胞表面上のアナライト(例えば、αおよびβT細胞抗原受容体抗原、またはCD4もしくはCD8抗原)に特異的であってよい。細胞の混合物に暴露すると、表面に結合した細胞は、多重アレイ多重特異的パターン付け表面の接近した電極表面がECL標識した結合試薬を励起する能力を立体的に妨害し、こうしてECLシグナルを下方に変化させる。
結合試薬をアナライトまたはその競合物およびその結合パートナーに接触させ所望の工程が終了すると、次にECL標識物を確実にECL誘導性の環境に置く。適切なECL測定媒体は当該分野で公知である。そのような測定媒体は、ECL標識物のECLを促進する分子(シュウ酸、NADH、および最も好ましくはトリプロピルアミンがあるが、これらに限定されない)を含有することが有利である。このような「プロモーター」分子は溶液中で遊離状態で提供されるか、またはPMAMS表面、表面上の単層、結合ドメイン、電極表面、結合試薬および/またはECL標識物などにあらかじめ結合させるかもしくはこの表面上で産生させることにより提供される。接触工程から得られる結合ドメインに結合したECL標識物の周りの媒体がECL誘導性の場合は、媒体を変化させる必要はない。あるいは、ECL誘導性の媒体を提供するように調整または置換をすることができる。電極または対電極は、すでに結合ドメインのすぐ近傍にあるか、または結合ドメインに接近させるかもしくは接触させて、電位波形を適用し、ECLを検出または測定する。
PMAMSを有する支持体は、核酸鎖の配列決定に使用してもよい。例えば、複数の結合ドメインを有するPMAMSは、異なる結合ドメイン中の結合試薬として、既知のヌクレオチド配列の異なるオリゴヌクレオチドを用いて作成することができる。すなわち、異なる結合ドメインは、異なる既知のヌクレオチド配列の結合試薬を含有する。配列決定されるオリゴヌクレオチドの断片のオリゴヌクレオチド鎖は、次にPMAMS結合ドメインに結合(ハイブリダイズ)させる。配列決定される核酸はECL標識される。PMAMS上で結合測定法を行い、PMAMS上の別々の結合ドメインからのECLシグナルの分布を用いて、オリゴヌクレオチド鎖の配列を決定する。
上記方法は、短いオリゴヌクレオチドが、別の核酸分子中のその相補的なまたは実質的に相補的な配列にハイブリダイズする能力に基づく(例えば、ストレゾスカ(Strezoska)ら、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1089−1093:バインズ(Bains)、1992、Bio/Technology 10:757−58を参照。これらは参考のため本明細書に引用される)。ハイブリダイゼーションの成功のためには所望の程度の配列相補性の程度が必要であるように、条件が選択される。あらかじめ配列の決定されたプローブへの、配列が未知のDNA分子のハイブリダイゼーションにより、DNA分子中の相補的な配列の存在が検出される。この方法は好ましくは、ハイブリダイゼーション反応が結合ドメインに結合したオリゴヌクレオチドプローブと溶液中の試料DNAで行われるように行う。
試料は、例えば固体、エマルジョン、懸濁物、液体または気体から得られてもよい。さらに、試料は、例えば体液または組織、水、食物、血液、血清、血漿、尿、便、組織、唾液、油、有機溶媒または空気から得られてもよい。試料は還元剤または酸化剤を含有してもよい。
以下の物質に特異的な結合試薬を、本発明の結合表面の結合ドメインに導入することにより、本発明により以下の物質を検出または測定するための測定を行ってもよい:アルブミン、アルカリ性ホスファターゼ、alt/SGPT、アンモニア、アミラーゼ、AST/SGOP、総ビリルビン、血液尿素窒素、カルシウム、二酸化炭素、塩素、総コレステロール、クレアチニン、GGT、グルコース、HDLコレステロール、鉄、LDH、マグネシウム、リン、カリウム、総タンパク質、ナトリウム、トリグリセリド、尿酸、耽溺薬物、ホルモン、心血管系調節物質、腫瘍マーカー、感染症抗原、アレイ誘発性抗原、免疫タンパク質、サイトカイン、貧血/代謝マーカー、カルバマゼピン、ジゴキシン、ゲンタマイシン、リチウム、フェノバルビタール、フェニトイン、プロカインアミド、キニジン、テオフィリン、トブラマイシン、バルプロ酸、バンコマイシン、アンフェタミン、抗うつ剤、バルビタール酸、ベンゾジアゼピン、カナビノイド、コカイン、LSD、メタドン、メタクアロン、アヘン、フェニリジン、フロポキシフェン、エタノール、サリチル酸、アセトアミノフェン、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、hCG/bhCG、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、プロラクチン、甲状腺ホルモン(例えば、甲状腺刺激ホルモン、T4、TUP、総T3、遊離T4、遊離T3)、コルチゾール、クレアチニンキナーゼ−MB、総クレアチニンキナーゼ、PT、APTT/PTT、LDISOs、クレアチニンキナーゼISOs、ミオグロビン、ミオ軽鎖、トロポニン1、トロポニンT、クラミジア、淋菌、ヘルペスウイルス、ライム病、エプスタインバーウイルス、IgE、風疹−G、風疹−M、CMV−G、CMV−M、トキソ−G、トキソ−M、HBsAg(B型肝炎表面抗原)、HIV1、HIV2、抗−HBc、抗−HBs、HCV、抗−HAV IgM、抗−HBc IgM、抗−HAV、HBeAg、抗−HBeAg、TB、前立腺特異抗原、CEA、AFP、PAP、CA125、CA15−3、CA19−9、b2−マイクログロブリン、ヘモグロビン、赤血球、HBcAb、HTLV、ALT、STS−梅毒、ABO血液型抗原および他の血液型抗原、サイトメガロウイルス、フェリチン、B−12、葉酸、グリコシル化ヘモグロビン、アンフェタミン、抗うつ剤および他の向精神薬。
異なる結合ドメインでのECLの測定は、順にまたは同時に行われる。
本発明は好ましくは、また5〜15分間で1000ECL反応の速度でECL反応を行う方法(例えば、測定法)を与える。
ECLベースの前記方法は、他の測定法とともに使用することができる(例えば、触媒反応や他の化学反応が起きるドメインとして)。本発明の別々の結合ドメインは、他の測定法(例えば、電解質測定のような臨床化学的化学物質測定法、臨床酵素測定、血液タンパク質測定、グルコース、尿およびクレアチニン測定など)で使用することができる。ECL測定法と組合せるかまたは本発明のPMAMSとともに単独で使用される他の測定法には、化学発光ベースの標識、蛍光ベースの測定法、酵素結合測定系、電気化学測定法(例えば、ヒックマン(Hickman)ら、1991、Science 252:688−691を参照)、および/または共鳴検出(例えば、表面プラズモンおよび音響法)測定系がある。
液滴のアレイの中に複数の異なる化学物質を有する、液滴を有するPMAS支持体を使用することができる。各液滴は、異なる結合試薬および/または異なる化学物質を含有してもよい(すなわち、この反応媒体)。例えば、疎水性表面領域に囲まれた親水性表面結合ドメイン上にあり、液滴は親水性でもよい。液滴は、表面を覆う疎水性溶液により保護される。測定される親水性溶液は、疎水性領域に囲まれた親水性結合ドメインを有する第2のPMAMS上に沈積される。2つの表面は決められた近傍に来て、反対の表面の親水性ドメインと接触し、スペクトル解析を行って化学的測定の反応生成物を検出する。
第1のPMAMSを覆う疎水性溶液は、上面の親水性液滴の一部のみが環境に暴露されるように、調節して除去する(例えば、蒸発、はじき)。光学化学反応のために測定される親水性溶液は次に、PMAMS表面に暴露され、親水性の微小液滴と測定される溶液を混合し、分析(例えば、スペクトル)を行う。
PMAMS結合ドメインはまた、プレフィルターまたはフィルターとして使用される。例えば細胞特異的なPMAMSは、ある場合にはある型の細胞のフィルターとして単独で、およびサイズ排除フィルターとともに使用できる。得られるアナライト溶液は次に、細胞内顆粒物質(例えば、ウイルス)に特異的なPMAMSに暴露される。顆粒細胞内PMAMSおよび/またはサイズ排除フィルターを用いて、小分子(例えば、タンパク質、小さな化学的物質)アナライト溶液を形成させる。非特異的なアナライト相互作用を低下させるために、連続的PMAMS測定系を使用して、アナライト溶液を順に精製する。
支持体、電極および/または結合ドメインに使用される材料の光学的不透明度は、所望の性質を得るように変化させることができる。このような材料は、材料の厚さ、組成および/または光学密度により、半透明、透明もしくは実質的に不透明であってよい。
ある材料がある厚さで実質的に透明であり、別の厚さでは実質的に不透明であるなら、その材料のある深さから放出される光は通過するが、別の(例えば、より深い)深さから放出される光は、材料に実質的に吸収されるかまたは分散される。1つの例では、ある材料は種々の不透明度により、光学フィルターとして使用することが可能である。
ある試薬は、多孔性材料中で充分な深さまで拡散(能動的または受動的)されるか、はじかれるか、圧力により押されて、これらの試薬からの光の放出はマットにより実質的にまたは完全に吸収されるかまたは拡散される。1つの例では、小繊維マットは、マットの表面またはその近傍で、ある試薬が通過し、ある試薬が捕捉され、および/またはある試薬が非常に薄い層に結合する、物理的および光学的フィルターの両方として作用する。1つまたはそれ以上の結合ドメインに結合した試薬および/または1つまたはそれ以上の結合ドメインに結合した分子種(これらのドメインは、小繊維マットの表面のいずれかに位置するか、またはPMAMS上のマットの表面の近くの層に位置する)は、マット内もしくはマットを介して拡散したり、引っ張られたりするのを妨害される。試薬がマットの表面の非常に薄い層にのみ結合するように、試薬および/または他の溶液は、小繊維マットの表面を流れるか、懸濁されるかおよび/または離れている。試薬は、1つまたはそれ以上の方向に、マットを介して1回またはそれ以上洗浄される。試薬は、小繊維マット、1つまたはそれ以上の結合ドメイン、1つまたはそれ以上の結合ドメインに結合した他のもしくは同じ試薬に結合してもよく、マット内に混入、マットを通過してもよく、またはこれらの組合せでもよい。
マットを作成する前に、小繊維および/または小繊維凝集物の特定のサイズ、型、派生物を選択するのに、前濾過工程が使用される。小繊維の懸濁物を濾過するのに使用されるフィルター物質は、1つのまたは多くの孔を有する小繊維のマットである。
多孔性材料(例えば、小繊維マット)は、結合ドメインのための支持体、ECLもしくは他の電気化学的応用に使用される電極、試薬の送達を調節するために使用されるフィルター、および/または種々の程度に光を伝搬、吸収および/または拡散することができる光学フィルターとして作用することができる。
本発明はまた、平面パネルディスプレーに使用される単離された電気化学的ピクセルの製造を提供する。電気的にアドレスされた時に隣接ピクセルに対して限定された作用(すなわち、限定クロストーク)を有するピクセルを作成するために、エレクトロクロミックおよび電気化学発光ベースの平面パネルディスプレーで使用するために、リトグラフ法が提唱されている(米国特許第5,189,549号を参照)。そのようなクロストークを減少させるためのリトグラフ法の限界は、電解質材料が、露光された時に導電率を変化することができなければならないことである。光誘導性の導電率調節が可能な材料を使用することなく、ピクセル間のクロストークを低下させ、こうして広範囲の異なる溶液、ゲルまたはフィルムの使用を可能にすることが、本発明の特徴である。
ピクセルの活性領域である2つの電極表面は、サンドイッチ型で互いに向かい合っている2つの表面上にある。電極表面は、例えば相補的なエレクトロクロミックな材料でコーティングされる。クロストークを減少させるために、異なる電極対の間に非導電性領域を有する電極表面の間(すなわち、ピクセル要素の間)に、導電性電解性フィルムを置く。コーティングされた電極表面が親水性の場合は、電極の周りの表面の領域は疎水性にされ(例えば、マスクを介する型押しまたは沈積)、親水性導電性液滴を第1の表面上の電極にのせ(例えば、流体アレイにより)、次に第2の表面をロボットで整列させ、第1の表面と接触させ、こうして電極がそろう。こうして電解性液滴は、ピクセルの間に導電性材料を入れることなく1つのピクセル内に拘束される。ピクセルの電極対は、同じ表面上で近接して並ぶ。コーティングされた電極が親水性の場合は、両方の電極を含む領域は、親水性電極の周りで疎水性環を形成するように作成される(例えば、マスクの打ち出し法または沈積法により)。前述の2つの実施態様で記載した液滴は、疎水性溶液を用いて安定化される。溶液の粘度は、液滴アレイの安定性を上げるために上げられる。親水性と疎水性が逆転する。他の実施態様では、電極対の間またはその上のフィルムの安定性および/または導電性(例えば、導電性ポリマー)を上げるために、重合可能な溶液を含有する。さらに、ピクセル間のクロストークを制限するために、構造的特徴を利用する。例えば、電極ピクセル対に限界を規定することができる環形の型押し突起を有する弾性打ち出し(例えば、ポリ(ジメチルシロキサン))を使用して、フィルム間の電解溶液、ゲル、またはピクセルを単離する。あるいは並んだ電極ピクセル対を、上記電極のウェル内に置いたある表面、電解溶液、ゲルまたはフィルム上の電気的絶縁性ウェル様構造中に入れ、全表面を覆うかまたはコーティングして、各ピクセルの電解成分を単離または封じこめる。
本発明のPMAMSはまた、ECLと組合せずに化学反応を行うのに使用できる。例えば、前記セクション5.11に記載した方法および非ECL測定法が利用できる。
試料中の目的のアナライトを検出または測定するためにカセットが提供され、該カセットは、(a)別々の結合ドメインの少なくとも一部は他の結合ドメインとは異なる結合特異性を有し、複数の別々の結合ドメインのそれぞれは親水性でありそして疎水性領域に囲まれている、少なくとも1つの結合表面を形成するための、その表面上の複数の別々の結合ドメインを有する第2の支持体、および(b)測定表面を形成するためにその上で化学的測定法を行うのに適した反応媒体からなる複数の親水性ドメインを有する第2の支持体(ここで、複数の別々の結合ドメインと複数の反応媒体は、接触させることができ、その結果各結合ドメイン上に存在する分析される試料は反応媒体と接触されて、目的のアナライトが検出または測定される)からなる。あるいは、結合ドメインは疎水性であり、第2の支持体は、反応媒体を含有する複数の疎水性ドメインを有する。
本発明は、試料中の目的のアナライトを検出または測定するための方法を提供し、該方法は、(a)検出または測定すべきアナライトを含有する試料の液滴を、支持体表面上の複数の別々の結合ドメインにのせて、この複数の別々の結合ドメインは、他の結合ドメイン内に封じ込められた結合試薬と特異性が互いに同一である結合試薬、かつこれとは異なる結合試薬を含有する少なくとも1つの結合ドメインからなり、各別々の結合ドメインは、疎水性であるかまたは親水性であることを特徴とするが、但し各結合ドメインの周りの支持体表面の領域は、試料中の1つまたはそれ以上の目的のアナライトが結合ドメインに結合できるようにするために、(i)結合ドメインが親水性なら疎水性であり、そして(ii)結合ドメインが疎水性なら親水性であり、そして
(b)第1の支持体上の液滴を、化学的測定法を行うのに適した反応媒体からなる複数の別々の親水性ドメインをその上に有する第2の支持体の表面に接触させ、そして
(c)結合ドメインに結合した目的のアナライトの存在を測定する、ことからなる。
(b)試料の液滴上に反応媒体の液滴をのせ、そして
(c)結合ドメインに結合した目的のアナライトの存在を測定する、ことからなる。
例えば、片面または両面に酵素が固定化されたシートは、溶液容量に対する高表面積比を達成するために重ねられる。あるいは、そのような固定化酵素は、多孔性材料に結合される。さらに、そのような固定化酵素は、ディプスティック、化学反応物質、試験管または毛細管の壁面、またはインキュベーターチャンバーのような容器の壁面上でもよい。
以下の例により本発明をさらに説明するが、これらは決して本発明の範囲を限定するものではない。
6.1.微量型押しによるMAB PMAMS表面の作成
厚さ1〜2ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード(SYLGARD)シリコーンエラストマー184(ポリ(ジメチルシロキサン);ダウコーニグ(Dow Corning)から入手できる)と対応するシルガード(SYLGARD)184硬化剤の10:1混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード(SYLGARD)184を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液(1〜10mM)中の親水性OHが末端にあるアルカンチオール、SH(CH2)11−(OCH2CH2)6OHに暴露して「墨入れ」を行い、整列した金表面にロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に基板を、疎水性CH3が末端にあるアルカンチオール、SH(CH2)10−CH3(エタノール中1〜10mM)の溶液で数秒間(例えば、2〜10秒間)洗浄する(クマール(Kumar)ら、前述、およびプライム(Prime)ら、Science 252:1164−7)。得られる表面を次に、窒素流中で静かに乾燥させる。親水性溶液を含有する毛細管アレイを次に、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させ毛細管をSH(CH2)11−(OCH2CH2)6OHドメインで整列させる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、アミド結合を介して親水性ドメイン上の反応性OH基に共有結合することができるモノクローナル抗体(MAB)を含有する。
厚さ1〜2ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード(SYLGARD)シリコーンエラストマー184と対応するシルガード(SYLGARD)184硬化剤の10:1混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード(SYLGARD)184を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液(1〜10mM)中の親水性OHが末端にあるアルカンチオール、SH(CH2)11−(OCH2CH2)6OHに暴露して「墨入れ」を行い、整列した金表面にロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に基板を、疎水性CH3が末端にあるアルカンチオール、SH(CH2)10−CH3(エタノール中1〜10mM)の溶液で数秒間(例えば、2〜10秒間)洗浄する(クマール(Kumar)ら、前述、およびプライム(Prime)ら、Science 252:1164−7)。得られる表面を次に、窒素流中で静かに乾燥させる。親水性溶液を含有する毛細管アレイを次に、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させ毛細管をSH(CH2)11−(OCH2CH2)6OHドメインで整列させる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、アミド結合を介して親水性ドメイン上の反応性OH基に共有結合することができる抗体または修飾核酸を含有する。
きれいな金表面を、エタノール性溶液(1〜10mM)中の親水性OHが末端にあるアルカンチオール、SH(CH2)11−(OCH2CH2)6OHに暴露させる(プライム(Prime)ら、Science 252:1164−7)。先が細くとがった器具を線状に並べたものを、並べた金表面とロボットで光学レジスター接触させ、線状アレイを使用して、表面のX方向とY方向にエッチングして、SH(CH2)11−(OCH2CH2)6OHドメインの二次元の格子アレイを作成する。次に基板を、疎水性SH(CH2)11−(OCH2CH2)6CH3(エタノール中1〜10mM)の溶液で数秒間(例えば、2〜10秒間)洗浄する。得られる表面を次に、窒素流中で静かに乾燥させる。親水性溶液を含有する毛細管アレイを次に、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させ毛細管をSH(CH2)11−(OCH2CH2)6OHドメインで整列させる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、親水性ドメイン上の反応性OH基に共有結合することができる抗体または核酸を含有する。
パターン付けされた多重特異的アレイの一次抗体を表面に結合して含有する実質的に透明の、透明PMAMS表面を前述のように作成する。支持体、電極アッセイ、モノログ(monologues)表面の使用が透明であるとして選択される。次にPMAMS表面を、測定すべき目的のアナライトを含有することが疑われる溶液試料に暴露する。次に試料を洗浄して、抗体の結合したアナライトを表面に残す。次にPMAMS表面を、表面に結合したアナライトに特異的な第2ECL標識抗体を含有する溶液に暴露する。次にこの溶液をPMAMS表面から洗浄して、アナライトが存在するドメインに結合したECL標識第2抗体を残す。
汚染作用を避けるために、試料と電極表面との早すぎる接触を防ぐため、取り外し可能なバリアーにより電極アッセイを保護する。次にこのバリアーをはずして、測定緩衝液で濡れた電極アレイを、PMAMS表面と並べて接触させる。電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極/対電極対に電位をかける。次に放出される光をCCDで読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
パターン付けされた多重特異的アレイの第1抗体を表面に結合して含有する、透明PMAMS表面を前述のように作成する。次にPMAMS表面を、測定すべき目的のアナライトを含有することが疑われる溶液試料に暴露する。次に試料を洗浄して、抗体の結合したアナライトを表面に残す。
ECL標識物で標識した複数の第2抗体のパターン付けされた微小液滴が上にある、疎水性/親水性パターンが交互に存在する、保護カバーの下の第2のPMAMSが提供される。
第1のPMAMSと位置の合っている第2のPMAMSを保護するバリアーを取り外し、微小液滴を、第1抗体の位置に合わせる。第2PMAMSを取り外し、電極アレイを第1のPMAMS表面と整列させて接触させる。電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極/対電極対に電位をかける。次に放出される光を光電子増倍管で読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
パターン付けされた多重特異的アレイの1本鎖核酸プローブを表面に結合して含有する、透明PMAMS表面を前述のように作成する。プローブは、目的の核酸アナライトの5’領域に相補的である。次にPMAMS表面を、測定すべき目的のハイブリダイズ可能な核酸アナライトを含有することが疑われる溶液試料に暴露する(試料は、あらかじめ変性させておく、すなわち、目的のアナライトを1本鎖にしておく)。次に試料を洗浄して、ハイブリダイズしたアナライトを表面に残す。次にPMAMS表面を、表面に結合した核酸アナライトの3’末端に特異的な第2ECL標識核酸プローブを含有する溶液に暴露する。次にこの溶液をPMAMS表面から洗浄して、アナライトが存在するドメインに結合したECL標識核酸プローブを表面に残す。
第1のPMAMSと位置の合っている第2のPMAMSを保護するバリアーを取り外し、微小液滴を、第1のPMAMS上の第1抗体結合ドメインの位置に合わせる。第2PMAMSを取り外し、電極アレイを第1のPMAMS表面と整列させて接触させる。
電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極/対電極対に電位をかける。次に放出される光をCCDで読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
目的のアナライトに特異的な、パターン付けされた多重特異的アレイの一次抗体を表面に結合して含有する、透明PMAMS表面を前述のように作成する。次にPMAMS表面を、目的のアナライトを含有することが疑われる試料と、抗体への結合に関して目的のアナライトと競合する既知のECL標識分子を含有する試料の混合物である溶液試料に暴露する。試料を洗浄して、抗体の結合したアナライトおよび/または標識した競合的結合物を表面に結合して残す。
汚染作用を避けるために、試料と電極表面との接触を防ぐため、取り外し可能なバリアーにより電極アレイを保護する。次にこのバリアーをはずして、測定緩衝液で濡れた電極アレイを、PMAMS表面と並べて接触させる。電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極/対電極対に電位をかける。次に放出される光を光電増幅管で読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
パターン付けされた多重特異的アレイの第1抗体を表面に結合して含有する、透明PMAMS表面を前述のように作成する。次にPMAMS表面を、測定すべき目的のアナライトを含有することが疑われる溶液試料に暴露する。次に試料を洗浄して、抗体の結合したアナライトを表面に残す。
目的のアナライトと競合する複数の既知のECL標識分子のパターン付けされた微小液滴が上にある、疎水性/親水性パターンが交互に存在する、保護カバーの下の第2のPMAMSが提供される。
第1のPMAMSと位置の合っている第2のPMAMSを保護するバリアーを取り外し、微小液滴を、第1のPMAMS上の第1抗体結合ドメインの位置に合わせる。第2PMAMSを取り外し、電極アレイをPMAMS表面と整列させて接触させる。電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極/対電極対に電位をかける。次に放出される光をCCDで読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
厚さ1〜2ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード(SYLGARD)シリコーンエラストマー184(ポリ(ジメチルシロキサン);ダウコーニグ(Dow Corning)から入手できる)と対応するシルガード(SYLGARD)184硬化剤の10:1混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード(SYLGARD)184を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液(1〜10mM)中の親水性OHが末端にあるアルカンチオール、SH(CH2)11OHに暴露して「墨入れ」を行い、整列した金表面にロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に基板を、疎水性CH3が末端にあるアルカンチオール、SH(CH2)10CH3(エタノール中1〜10mM)の溶液で数秒間(例えば、2〜10秒間)洗浄する(クマール(Kumar)ら、前述)。次に得られる表面を、窒素流中で静かに乾燥させる。次に親水性溶液を含有する毛細管アレイを、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させ毛細管をSH(CH2)11OHドメインで整列させて、特異的抗体を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、親水性ドメイン上の反応性OH基に共有結合することができるモノクローナル抗体(MAB)を含有する。
厚さ1〜2ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード(SYLGARD)シリコーンエラストマー184と対応するシルガード(SYLGARD)184硬化剤の10:1混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード(SYLGARD)184を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液(1〜10mM)中の親水性OHが末端にあるアルカンチオール、SH(CH2)11OHに暴露して「墨入れ」を行い、整列した金表面にロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に基板を、疎水性CH3が末端にあるアルカンチオール、SH(CH2)10CH3(エタノール中1〜10mM)の溶液で数秒間(例えば、2〜10秒間)洗浄する(クマール(Kumar)ら、前述)。次に得られる表面を、窒素流中で静かに乾燥させる。次に親水性溶液を含有する毛細管アレイを、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させ毛細管をSH(CH2)11OHドメインで整列させて、特異的抗体を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、アミド結合を介して親水性ドメイン上の反応性OH基に共有結合することができるモノクローナル抗体または修飾核酸を含有する。
厚さ1〜2ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード(SYLGARD)シリコーンエラストマー184と対応するシルガード(SYLGARD)184硬化剤の10:1混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード(SYLGARD)184を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、メルカプトウンデカノールと12−メルカプト(8−ビオチンアミド−3,6−ジオキサオクチル)ドデカンアミドの混合物(ここで、ビオチン化チオールのモル分率は0.1である)に暴露して「墨入れ」を行う(スピンケ(Spinke)ら、1993、ラングミュア(Langmuir)9:1821−5およびスピンケ(Spinke)ら、1993、J.Chem.Phys.99(9):7012−9を参照)。次に基板を、疎水性CH3が末端にあるアルカンチオール、SH(CH2)10CH3アルカンチオール(エタノール中1〜10mM)の溶液で数秒間(例えば、2〜10秒間)洗浄する(クマール(Kumar)ら、前述)。次に得られる表面を、窒素流中で静かに乾燥させる。次に各毛細管中にストレプトアビジンの溶液を含有する毛細管アレイを、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させる。毛細管アレイ中の各毛細管を整列させて、ビオチン化ドメインと接触させ、毛細管アレイを除去し、表面を洗浄する。次に複数のビオチン化抗体とビオチン化核酸溶液を含有する第2の毛細管アレイを、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させて、各ドメイン上に特異的抗体と核酸を入れる。
ケイ素表面上の金の上の交互にあわさった作用電極/対電極対の電極アレイを、当該分野で公知の方法により作成する(例えば、クマール(Kumar)ら、前述、を参照)。この例では、電極アレイと別々の結合ドメインアレイは、支持体の同じ表面に存在する。厚さ1〜2ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、作用電極のパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード(SYLGARD)シリコーンエラストマー184(ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS);ダウコーニグ(Dow Corning)から入手できる)と対応するシルガード(SYLGARD)184硬化剤の10:1混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード(SYLGARD)184を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液(1〜10mM)中の親水性OHが末端にあるアルカンチオール、SH(CH2)11−(OCH2CH2)6OHに暴露して「墨入れ」を行い、電極アレイ表面上の整列した作用電極にロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に親水性溶液を含有する毛細管アレイを、電極アレイ表面上のSH(CH2)11−(OCH2CH2)6OHドメインを有する毛細管を整列させて、ロボットでピンレジスター接触させて、特異的抗体を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、アミド結合を介して親水性ドメイン上の反応性OH基に共有結合することができるモノクローナル抗体を含有する。
6.12に記載の支持体(前述)を作成する。それぞれが作用電極/対電極の範囲を限定する環としてパターン付けしたフォトレジストマスターから、前述のようにPDMS型押しを作成する。電極アレイ表面を、分析される試料に暴露し、ECL標識第2抗体の混合物で洗浄し、次にトリプロピルアミンを含有する測定緩衝液溶液で洗浄する。次にPDMS型押しを整列させ、レジスター接触させてPDMS型押しの管を整列させ、各電極対の上の測定緩衝液の各容量成分を限定および規定する。電極対に過電位をかけて、表面から単層を放出させて、作用電極をECL標識第2抗体に暴露する。次に透明PDMSから放出される光を光電増幅管で読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
ケイ素支持体上の金の上の交互にあわさった電極の間の、結合ドメインを有する交互にあわさった作用および対金電極対の電極アレイを、当該分野で公知の方法により作成する(例えば、クマール(Kumar)ら、前述、を参照)。この例では、電極アレイと別々の結合ドメインアレイは、支持体の同じ表面に存在する。厚さ1〜2ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、交互にあわさった電極対の間の結合ドメインのパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード(SYLGARD)シリコーンエラストマー184(ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS);ダウコーニグ(Dow Corning)から入手できる)と対応するシルガード(SYLGARD)184硬化剤の10:1混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード(SYLGARD)184を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液(1〜10mM)中の親水性OHが末端にあるアルカンチオール、SH(CH2)11−(OCH2CH2)6OHに暴露して「墨入れ」を行い、電極アレイ表面上の整列した金結合ドメインにロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に親水性溶液を含有する毛細管アレイを、電極アレイ表面上のSH(CH2)11−(OCH2CH2)6OHドメインを有する毛細管を整列させて、ロボットでピンレジスター接触させて、特異的抗体を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、アミド結合を介して親水性ドメイン上の反応性OH基に共有結合することができる抗体を含有する。
前記6.14に記載の支持体表面を記載した方法(前述)により作成する。作成された表面を、分析される試料に暴露し、ECL標識第2抗体の混合物で洗浄し、次にトリプロピルアミンを含有する測定緩衝液で洗浄する。電極アレイを、電位波形発生器に接続し、作用電極/対電極対に電位をかける。次に放出される光を光電子増倍管で読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
厚さ1〜2ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード(SYLGARD)シリコーンエラストマー184と対応するシルガード(SYLGARD)184硬化剤の10:1混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード(SYLGARD)184を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液(1〜10mM)中の親水性OHが末端にあるアルカンチオール、SH(CH2)11−(OCH2CH2)6OHに暴露して「墨入れ」を行い、金表面上の整列したパターン付け対電極と角結合ドメインにロボットでピンレジスター接触させ、除去する。パターン付けした金表面は、結合ドメインを限定するアドレスが可能な環対電極から構成される。各単層結合ドメインについて、各金対電極と各金表面の間に間隙すなわち分離スペースが存在する。次に結合試薬溶液を含有する毛細管アレイを、SH(CH2)11−(OCH2CH2)6OHドメインを有する毛細管を示す表面を、ロボットでピンレジスター接触させて、特異的抗体または核酸を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、親水性ドメイン上の反応性OH基に共有結合することができる抗体または核酸を含有する。
例6.16に記載した支持体表面を分析すべき試料溶液に暴露させる。次に支持体表面を洗浄し、異なる特異性を有する複数のECL標識MABまたはECL標識核酸を含有する溶液に暴露し、次にトリプロピルアミンを含有する測定緩衝液で洗浄する。セクション6.16に記載のように支持体上の別々の結合ドメイン/対電極領域に対応するアレイ中に各作用電極を有する透明なアドレスが可能な作用電極アレイを作成する。2つの支持体を測定緩衝液で濡らし、ロボットでレジスターで整列したコンフォーマル接触を行う。電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極/対電極対に電位をかけ、2つの支持体の間に電界を発生させる。次に透明の作用電極から放出される光をCCDで読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
0.1%w/w CC小繊維/脱イオン水を混合して、1mg/ml溶液を有するCC小繊維の水性スラリーを作成した。スラリー中に400ワットの音波ホーンを10分〜1時間沈めて、CC小繊維をスラリーに分散させた(大きなミクロンサイズの凝集物は、小さな凝集物または個別の線維に分散される)。分散の程度は、光学顕微鏡で追跡した。
ナイロンのフィルター膜(孔径0.47μm、直径25mm)を、直径25mmのガラス濾過器に入れた。分散した小繊維スラリーを、吸引濾過により膜/フィルター装置を通して濾過した(図23A)。スラリーのアリコート(5ml)を20mlの脱イオン水で希釈し、次に膜/フィルター装置で濾過する。約0.25〜0.3g/ccの平均的なマットについて、約100μmのマットは6つのアリコートが必要であった。
分散物のすべての水がマットから除去されるまで吸引濾過を続けた(肉眼で判定)。フィルター膜から直接マットを(手で)はがした。
オーブン中で60℃で10〜15分間マットを乾燥した。使用のためにマットを切断し、穴をあけたか、または切片にした。
0.1%w/w CC小繊維/脱イオン水を混合して、1mg小繊維/ml溶液を有するCC小繊維の水性スラリーを調製した。スラリー中に400ワットの音波ホーンを10分〜1時間沈めて、CC小繊維をスラリーに分散させた(大きなミクロンサイズの凝集物は、小さな凝集物または個別の線維に分散される)。分散の程度は、光学顕微鏡で追跡した。
ステンレスメッシュの1cm2切片(400カウント)を、直径25mmの紙フィルターに入れる。スラリーの5mlのアリコートを、スクローン/フィルター紙組合せ物の表面にピペットでのせた。スラリー中の水を室温と圧力、または加熱オーブン中で蒸発させた。
小繊維マットが乾燥したら、アリコートをさらに加えた。濾紙から1つのユニットとして小繊維とスクリーンをはがした。
使用のためにマットを切断し、穴をあけたか、または切片にした。
COOHで誘導体化した小繊維(ハイペリオンキャタリスト社(Hyperion Catalysts Inc.)から提供された)を、絶えず攪拌しながらジオキサン水溶液に〜10mg/mlで懸濁した。20倍モル過剰のN−ヒドロキシスクシンイミドを加え、溶解させた。次に、20倍モル過剰のエチル−ジアミノ−プロピル−カルボジイミド(EDAC)を加え、混合物を室温で2時間攪拌した。
攪拌後、上清を吸引し、固体を無水ジオキサンで3回、無水メタノールで1回洗浄し、0.45μmのポリスルホン膜で濾過した。濾過物をさらにメタノールで洗浄し、ガラスバイアル中に入れて、重量の減少が観察されなくなるまで真空で引いた。
10.4mgのNHS−エステル小繊維をPBS−1(約70mMリン酸塩、150mMNaCl)(オリゲン(ORIGEN)試薬402−130−01、pH7.8、イゲン社(IGEN,Inc.))で洗浄した。洗浄した小繊維を2.3mlのアビジン溶液に懸濁した(8.3mgアビジン/mlPBS−1)。
フラスコを絶えず回転させて懸濁物を室温で1.5時間置いた。
1.5時間後、懸濁物を4℃で16時間保存し、次に室温に戻し、PBS−1で洗浄し、PBS−1中で4℃で懸濁物として保存した。
炭素小繊維をNHS−エステルで官能基化して、例6.20に記載のように作成した。
14mgの小繊維−NHS−エステルを500mlのPBS−1緩衝液と混合した。混合物が粘性のスラリーになるまで、20分間音波処理した。さらに500mlのPBS−1緩衝液を加えた。
80mlのPBS−1中全部で1.6mgの抗AFP(アルファフェトプロテイン)抗体を、上記スラリーに加えた。室温で2.5時間反応させた。
6mlのPBS−1緩衝液を加え、反応混合物を4℃で5分間遠心分離した。この操作を9回繰り返した。
最後の洗浄後、上清を除去し、小繊維−抗AFP生成物を4℃で保存した。
6.22.小繊維マットのサイクリックボルタングラム:小繊維マットと金箔電極との比較
0.5M K2SO4中の6mM Fe3+/2+(CN)6のサイクリックボルタングラムを測定した。図30Aにおいて、CC(分散した)の未処理の小繊維マットのCVは、10,25および50mV/秒での測定値は0.10mA/cmであった。例6.18に記載のようにマットを作成した。図30Bにおいて、金箔電極について測定したCVは、10,25および50mV/秒で0.05mA/cmであった。すべての電位は、Ag/AgClに対する電位である。
同じ面積(0.20cm2)であるが異なる厚さの小繊維マットについて、0.5M K2SO4中の6mM Fe3+/2+(CN)6のサイクリックボルタングラムを測定した。陽極ピーク電流(図31)は、24μm〜425μmの範囲内でマットの厚さの増加とともに増加した。各厚さについての陽極ピーク電流もまた、走査速度の増加とともに増加した(10mV/秒〜150mV/秒の範囲)。厚さの関数としての陽極ピーク電流の増加速度もまた、厚さとともに増加した。厚さ24μmの小繊維マットは、金箔電極と同等の挙動を示した。
6.24.小繊維へのタンパク質の非特異結合
炭素小繊維(CC)へのタンパク質の非特異結合を以下のように測定した:(i)Ru(bipy)3 2+(「TAG1」)標識タンパク質の溶液を、平衡に達するまで既知量の炭素小繊維に暴露した;(ii)標識タンパク質/小繊維溶液を遠心分離し、上清を採取し、そして(iii)上清中に残存している標識タンパク質の量を電気化学発光(ECL)を用いて測定した。
図32に示す曲線を作成するために、3μg/mlの誘導体化TAG1に結合した抗CEA抗体(誘導体化TAG1 ECL標識物に結合した癌胎児性抗原に対する抗体)を、0.1Mのリン酸カリウム(pH7)中の連続希釈CC(未処理)小繊維に加えた。20分間ボルテックス混合した後、遠心分離により小繊維を除去した。上清中に残存するタンパク質(非結合)の量を測定するECL測定は、オリゲン(ORIGEN)測定緩衝液で5倍希釈した反応混合物上清のアリコートについてオリゲン(ORIGEN)アナライザーで行った。高濃度の炭素小繊維が存在する時に、(小繊維に暴露しなかった反応混合物の物体についてのECLシグナルに対する)ECLシグナルの低下は、誘導体TAG1で標識したタンパク質の結合の増加により得られた。
例6.2.4に記載の方法を使用して、小繊維へのタンパク質結合に及ぼす界面活性剤の影響を調べた。誘導体化TAG1/小繊維混合物に結合した抗CEAにトリトンX−100を加え、溶液を20分間インキュベートし、管を遠心分離し、オリゲン(ORIGEN)測定緩衝液で5倍希釈した上清のアリコートをECLで分析した。結果を下記表と図33に示す。
チューフ゛No. [T-X100] ヒ゜ーク強度 Prot-TAG1 [GF]
ppm μg/ml ppm
19 1674 1611 2.65 52
18 837 1634 2.65 52
17 418 1697 2.65 52
16 209 1583 2.65 52
15 105 1772 2.65 52
14 52 1463 2.65 52
13 26 627 2.65 52
12 13 23 2.65 52
トリトンX−100対誘導体化したTAG1で標識したタンパク質溶液のECL強度をプロットして得られた曲線を図33に示す。大きい電気化学的シグナルは、上清中の誘導体化−TAG1−標識タンパク質が多いことに対応し、小繊維に結合した誘導体化−TAG1−標識タンパク質が少ないことを示す。10ppm〜100ppmまでの濃度のトリトンX−100は、結合の程度を減少させ、
例6.18のように作成した小繊維マットを、図34に示す「小繊維セル」固定具の作用電極ホルダー3401の取り付け部3403に取り付けた。ホルダー3401を、電気化学的セル区画3400の底にはめた。3M Ag/AgCl参照電極(サイプラス(Cyprus)#EE008)を、参照セルホール3402を介して電気化学的セル区画に取り付けた。セルに測定緩衝液(イゲン(IGEN)#402−005−01、ロット番号#5298)を充填し、PMTホルダー3404に取り付けた。イージーアンドジー(EG&G)、パークモデル175ユニバーサルプログラマーとイージーアンドジー(EG&G)、モデル175ポテンショスタット/ガルバノスタットを使用して、100mV/秒で電位を0V〜+3Vで掃引した。パシフィックインストルメンツ(Pacific INstruments)モデル126光度計により900Vの電位をかけたハママツ(Hamamatsu)R5600U−01により測定した。HEMスナップマスター(HEM Snap−Master)により駆動したCIO−DAS−1601A/Dボードにより、アナログデータをデジタル化した。小繊維セルの水分を切り、瞬間的に1000pMのTAG1(イゲン(IGEN)#402−004−C,ロット#4297)で洗浄し、1000pMのTAG1を充填した。測定緩衝液のように電位を掃引した。図35は、測定緩衝液3501と1000pMTAG1 3502についてのECLトレース(24.0±0.2Cで測定した)を示す。暗補正ECLピーク面積は、測定緩衝液については22.10nAで、1000pM TAG1については46.40nAであった。
例6.28に記載の方法で未処理のcc−分散小繊維から0.0035インチの厚さの小繊維マットを作成した。次に乾燥したマットを3mmのディスクにパンチし、支持体の上にのせた。この実験で使用した支持体は、スクリーン印刷した導電性金インクによりパターン付けした0.030インチのポリエステルシートから作成した。この導電性金インクは対電極、参照電極を形成し、作用電極および他の電極の導線を提供した。炭素含有導電性両面テープ(アドヒーシブズリサーチ(Adheseves Research))を使用して、各パターン付け支持体に2つのマットディスクを取り付けた。取り付け後、誘導体化TAG1に結合した脱イオン水中10μg/mlの抗TSH抗体水溶液(Ru−THSモノ1:2 26JUN95、イゲン(IGEN))0.5μl、または脱イオン水中10μg/mlのTAG1誘導体化しない抗TSH捕捉抗体抗体水溶液を(THSポリ26JUN95、イゲン(IGEN))ディスクにスポットし、乾燥させた。乾燥後、マットをイゲン(IGEN)測定緩衝液に浸した。支持体上の浸したマットを、イゲン(IGEN)オリゲン(ORIGEN)1.5ベースの装置に入れ、0〜4500mVまで500mV/秒の走査速度を用いて、ECLを読んだ。図43は、マット4301を含有するTAG1−抗体からと、マット4302を含有するTAG1化していない捕捉抗体からのピークECLシグナルを比較する。
6.28.サンドイッチ測定法のための小繊維マット電極を用いるECL
前述のように抗AFP捕捉抗体をフィルター上に固定化した。抗AFP小繊維を脱イオン水(dI)で洗浄し、1mg/mlの濃度で再懸濁した。例6.18に記載のように真空濾過を使用して4層の小繊維マットを作成した。未処理CC分散小繊維3mgに2mgの抗AFP小繊維を加え、混合物をdI中で総量20mlに希釈した。希釈した混合物を0.45μmナイロンフィルターで濾過した。次にこの最初のマット層の後に、それぞれ5mgの未処理CC分散小繊維で構成される2つのコア層が続く。次にマットのコアに、最初の層と同じ混合フィルター層をのせた。こうして、上部と下部に〜40%抗AFP小繊維と、コア内に〜100%未処理小繊維のマットが得られた。この混合マットを真空下で空気乾燥し、3mmのディスクにパンチした。次にこれらのディスクを、例6.27に記載のように支持体にのせた。乾燥し支持体にのせた抗AFPマットを、AFPカリブレーターA、C、およびF(イゲン社(IGEN,Inc.))に浸し、実験台で室温で15分間インキュベートした。インキュベーション後、支持した電極をdI流で10秒間洗浄し、次にけばのないワイプでブロットして乾燥した。次に小繊維マットを、誘導体化TAG1イゲン社(IGEN,Inc.))で標識した抗体に血液グルタチオン−S−トランスフェラーゼ抗AFPに浸し、実験台で室温で15分間インキュベートした。インキュベーション後、支持した電極をdI流で洗浄し、ワイプで乾燥した。次に、小繊維マットをイゲン(IGEN)測定緩衝液に浸し、例6.27に記載のように読んだ。
アクリルアミド、ビス−アクリルアミド、およびN−アクリロイル−N’−ビオチニル−3,6−ジオキサオクタン−1,9−ジアミン(ビオチンはトリ(エチレングリコール)リンカーを介してアクリルアミド残基に結合している)を、公知の方法(過硫酸アンモニアとTEMEDで開始する)を用いて、共有結合したビオチンを含有する架橋ポリアクリルアミドゲルを調製した。この実験で、3つのモノマー種の濃度は、それぞれ2.6M、0.065M、および0.023Mであった(アクリルアミドとビス−アクリルアミドのこれらの濃度により、孔径がほとんどのタンパク質より小さいゲルが得られることが報告されている)。約0.7mmの距離で離して固定した2つのガラスプレートの間にモノマーを含有する溶液の重合により、同じ厚さのスラブゲルが生成した。重合反応終了後、ゲルをPBSに浸して4回交換して、取り込まれていないビオチンを洗い流した。PBS中50μg/mlの濃度のタンパク質を含有する溶液中でゲルを20分間浸すことにより、誘導体化TAG1で標識されたアビジン(ここで、アビジンは、NSBの低い修飾アビジンであるNeutroAvidinを意味し、この実験に使用した)が、ゲルの表面に結合した。ゲルをECL測定緩衝液(200mMリン酸ナトリウム、100mMトリプロピルアミン、0.02%(w/v)ツイーン20、pH7.2)に浸して4回交換して、過剰のTAG1標識アビジンを洗い流した。図39に示すように、ゲル(3900)を、ガラス支持体(3903)にパターン付けした金の作用電極(3901)と対電極(3902)に接触させた。2つの電極の間で500mV/秒の速度で0.0〜3.0Vまでそして0.0Vまでもどる電位勾配をつけて、ECL光シグナルを得て、これをゲルの上に置いたPMT(3904)で測定した(図40)。ビオチン含有アクリルアミド誘導体を含まないで調製したゲルは、ECLシグナルを示さなかった(図41)。ビオチン含有ポリマーについて得られるこのシグナルは、ゲルの表面にほぼ完全に近いタンパク質の単層が存在することを示した。
例6.29のように、共有結合したビオチンを含有する架橋ポリアクリルアミドゲルを調製した。ストレプトアビジンをゲルの表面に吸着させて、ビオチン標識分子種を捕捉することができる結合ドメインを形成させる。表面を、トリプロピルアミン、未知濃度のアナライト、アナライトに対するビオチン標識抗体、およびアナライトに対する異なるECL TAG1標識抗体を含有する溶液で処理する。アナライトが存在すると、アナライトと2つの抗体の複合体が形成され、これは次に、ストレプトアビジン表面に捕捉される。表面に存在する第2抗体に結合したECL標識物を、例6.29に記載のように測定する。
6.31.電極上に支持されたポリアクリルアミド表面上の多重ECLサンドイッチ免疫測定
厚さ1〜2ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード(SYLGARD)シリコーンエラストマー184と対応するシルガード(SYLGARD)184硬化剤の10:1混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード(SYLGARD)を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、HS−(CH2)11−(OCH2CH2)6−OH(1〜10mM)に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールHS−(CH2)10−CH3(エタノール中1〜10mM)の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、N−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、およびアミノ基を提示する抗体の混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、特異的抗体を含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的な抗体を含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンとECL−TAG1標識第2抗体を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の1つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができるアナライトの混合物で基板を処理して、測定を行う。次に金電極(4232)上のポリアクリルアミド液滴(4203)上の結合ドメイン(4200,4201、4202)を、図42A−Bに記載のように、ITO作用電極(4204)に接近させる。各結合ドメインから放出される光をCCDカメラ(4205)で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
厚さ1〜2ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード(SYLGARD)シリコーンエラストマー184と対応するシルガード(SYLGARD)184硬化剤の10:1混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード(SYLGARD)を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、HS−(CH2)11−(OCH2CH2)6−OH(1〜10mM)に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールHS−(CH2)10−CH3(エタノール中1〜10mM)の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、N−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、および抗体の混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、特異的抗体を含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的な抗体を含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンとアナライトのECL−TAG1標識類似体を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の1つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができるアナライトの混合物で基板を処理して、測定を行う(すなわち、結合ドメインに対して、ECL−TAG1で標識したアナライトおよび標識していないアナライトの競合を起こさせる)。次に金電極(4232)上のポリアクリルアミド液滴(4203)上の結合ドメイン(4200,4201,4202)を、図42に記載のように、ITO作用電極(4204)に接近させる。各結合ドメインから放出される光をCCDカメラ(4205)で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
厚さ1〜2ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード(SYLGARD)シリコーンエラストマー184と対応するシルガード(SYLGARD)184硬化剤の10:1混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード(SYLGARD)を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、HS−(CH2)11−(OCH2CH2)6−OH(1〜10mM)に暴露して、整列した金基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールHS−(CH2)10−CH3(エタノール中1〜10mM)の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、N−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、および細胞表面に対する抗体の混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、プレポリマー溶液を各ドメインに入れる。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。結合ドメインをまず細胞の懸濁物で処理して、次にトリプロピルアミンとECL−TAG1標識第2抗体および/またはアナライトに特異的な他の結合試薬を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面に結合した1つまたはそれ以上のセルに結合することができる結合試薬の混合物で基板を処理して、測定を行う。次に金電極(4232)上のポリアクリルアミド液滴(4203)上の結合ドメイン(4200,4201,4202)を、図42に記載のように、ITO作用電極(4204)に接近させる。各結合ドメインから放出される光をCCDカメラ(4205)で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
厚さ1〜2ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード(SYLGARD)シリコーンエラストマー184と対応するシルガード(SYLGARD)184硬化剤の10:1混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード(SYLGARD)を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、HS−(CH2)11−(OCH2CH2)6−OH(1〜10mM)に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールHS−(CH2)10−CH3(エタノール中1〜10mM)の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、N−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、および細胞の混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、各細胞型を含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、異なるアナライトに結合する異なる表面構造を有する細胞を含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンとECL−TAG標識抗体および/またはアナライトに特異的な他の結合試薬を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の1つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができるアナライトの混合物を含有する試料でゲルを処理して、測定を行う。次に金電極(4232)上のポリアクリルアミド液滴(4203)上の結合ドメイン(4200、4201、4202)を、図42に記載のように、ITO作用電極(4204)に接近させる。各結合ドメインから放出される光をCCDカメラ(4205)で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
厚さ1〜2ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード(SYLGARD)シリコーンエラストマー184と対応するシルガード(SYLGARD)184硬化剤の10:1混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード(SYLGARD)を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、HS−(CH2)11−(OCH2CH2)6−OH(1〜10mM)に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールHS−(CH2)10−CH3(エタノール中1〜10mM)の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、N−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、およびアミノ酸で官能基化した核酸プローブの混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、特異的プローブを含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的の核酸配列に特異的なプローブを含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンと表面への結合について目的のアナライトと競合することができるECL−TAG1標識配列を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の1つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができる配列を含有する試料混合物で基板を処理して、測定を行う。次に金電極(4232)上のポリアクリルアミド液滴(4203)上の結合ドメイン(4200,4201,4202)を、図42に記載のように、ITO作用電極(4204)に接近させる。各結合ドメインから放出される光をCCDカメラ(4205)で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
厚さ1〜2ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード(SYLGARD)シリコーンエラストマー184と対応するシルガード(SYLGARD)184硬化剤の10:1混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード(SYLGARD)を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、HS−(CH2)11−(OCH2CH2)6−OH(1〜10mM)に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールHS−(CH2)10−CH3(エタノール中1〜10mM)の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、N−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、およびアミノ基で官能基化した核酸プローブの混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、特異的プローブを含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的の核酸配列に特異的なプローブを含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンと表面結合プローブに相補的でない配列でアナライトに結合することができるECL−TAG1標識配列を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の1つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができる配列を含有する試料混合物で基板を処理して、測定を行う。次に金電極(4232)上のポリアクリルアミド液滴(4203)上の結合ドメイン(4200、4201、4202)を、図42に記載のように、ITO作用電極(4204)に接近させる。各結合ドメインから放出される光をCCDカメラ(4205)で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
厚さ1〜2ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード(SYLGARD)シリコーンエラストマー184と対応するシルガード(SYLGARD)184硬化剤の10:1混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード(SYLGARD)を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、HS−(CH2)11−(OCH2CH2)6−OH(1〜10mM)に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールHS−(CH2)10−CH3(エタノール中1〜10mM)の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、N−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、および例6.31〜6.36に記載の任意の結合試薬の混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、特異的プローブを含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的な結合ドメインを含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンと結合ドメインへの結合についてアナライトと競合するアナライトのECL−TAG1標識類似体および/または目的のアナライトに対するECL−TAG1標識第2結合試薬を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の1つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができるアナライトを含有する試料混合物で基板を処理して、測定を行う。次に金電極(4232)上のポリアクリルアミド液滴(4203)上の結合ドメイン(4200,4201,4202)を、図42に記載のように、ITO作用電極(4204)に接近させる。各結合ドメインから放出される光をCCDカメラ(4205)で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
多結晶性金電極(バイオ−アナリティカルサービシーズ(Bio−Analytical Services)から購入、2mm2)を、0.5μmと0.03μmのアルミナスラリーで連続して手で磨き、次に1:3 H2O2/H2SO4で化学的エッチングし、そしてAg/AgClに対して−0.2V〜1.7Vの間で希硫酸中で電気化学的サイクリングできれいにした。次にきれいな電極を、エタノールに溶解したオクチルチオール(C8SH)の希薄溶液に一晩浸した。C8SH修飾電極を、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS、0.15M NaCl/0.1M NaPi、pH7.2)に溶解した20μlのTAG1標識ウシ血清アルブミン(BSA)で覆い、10分間インキュベーション後表面を同じ緩衝液で充分洗浄した。
ECLは、Ag/AgCl参照電極、白金線対電極およびイージーアンドジー(EG&G)ポテンシオスタットを有する3電極セル中で行った。光の強度は、底に置いたパシフィックインストルメンツ(Pacific INstruments)光度計とハママツ(Hamamatsu)光電子増倍管で測定した。タンパク質を吸着した電極を、0.1M TPAと0.2Mリン酸塩(pH7.2)の溶液に浸した。電極電位を図44Aに示すように、0.0Vと1.2Vの間にサイクルをさせると、高度に可逆性のECL応答(前進および後退走査と実質的に同じ強度)が観察され、ECLプロセスの可逆性と電極上でのチオールとタンパク質層の安定性を示していた。
PMTや光度計を使用せずに、ECLの場合と同じ装置を使用してサイクリックボルタン実験を行った。実験では、C8SHで覆った電極(タンパク質なし)を1mMフェリシアン化カリウムの溶液(PBS中)に入れ、電極を+0.5V〜1.2Vそして逆に走査し、+0.5V〜−0.3Vでもう一度走査した。+0.5V〜−0.3Vの間のボルタングラムでは容量性電流のみでフェリシアンカ物のファラデー電流はなかったため、単層はそのままで1.2Vで脱着がないことを示している(図44B)。
電極修飾とタンパク質吸着を、前述のように行った。ECL実験では、電位を0.0vと1.5Vの間で走査し、対応する光の強度を記録した。図45Aに示すように、同じサイクルの前進と後退走査の間では、異なるサイクルの間と同様に、ECLの喪失があった。1.5Vで酸化した後のフェリシアン化物中のチオール/Auのサイクリックボルタングラムは、多量のファラデー電流を示し、1.5Vでのチオール単層の少なくとも部分的な脱着を示した(図45B)。
6.40.可逆性ECL
これらの実験では、電極修飾とタンパク質吸着を例6.38に記載のように行った。ECLを測定するために、電極電位を2.0Vまでそして逆方向に0.0Vまで走査した。前進走査で強い光が観察された(例6.38の可逆性条件下で観察されたものより強い光)が、図46Aに示すように逆走査でバックグランドまで低下した。2.0Vで酸化した後のフェリシアン化物中の修飾電極のサイクリックボルタングラムは、チオール単層のほとんどが脱着していることを示した(図46B)。
この例では、前立腺特異抗原(PSA)に対する抗体が、PSAの免疫測定法で使用するためのパターン付け金電極上に固定化される。
厚さ1〜2ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、1mm×1mm平方の斑点(ここでフォトレジストが除去される)を有するケイ素支持体上のフォトレジストの層が得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード(SYLGARD)シリコーンエラストマー184と対応する硬化剤の10:1混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード(SYLGARD)を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、HS−(CH2)11(OCH2CH2)6−OHおよびニトリロ三酢酸(NTA)末端−チオールHS−(CH2)11(OCH2CH2)3OC(O)NH(CH2)4CH(CO2H)N(CH2CO2H)2を含有する溶液に暴露して、「墨入れ」を行う。「墨入れ」を行った型押しは、金の基板と接触させ、除去して1mm×1mmSAMを形成させる。基板を、エタノール中にヒドロキシルを末端に有するチオールのみを含有する溶液で数秒間洗浄して、型押し構造以外の領域へのタンパク質の非特異結合を防止する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。NiCl2の溶液で表面を処理し、次に抗PSAマウスモノクローナル抗体とペプチド(HIs)6の結合部位を提示する融合蛋白を含有する溶液で処理すると、調節された方法で表面に融合蛋白が固定化される。この方法は、表面上の固定化されたタンパク質の再現性のあるあらかじめ決められた量を与える。表面上のタンパク質の配置は、融合蛋白の一次構造中の(His)6配列の位置により調節される。固定化されたタンパク質の絶対量は、型押しされたSAM中のNEA末端チオールとヒドロキシル末端チオールの比、および型押しされた構造の表面積により調節される。PSAの較正曲線は、血清中に既知量のPSAを含有する溶液を調製することにより測定される(1fM〜1μMの範囲の濃度)。前述のように作成される多くの表面をPSA較正標準物質で処理し、次に最適濃度でPSAに対する第2抗体(TAG1の誘導体で標識されている)を含有する溶液で処理される。0.1M TPAと0.2Mリン酸塩(pH7.2)を含有する溶液に表面を浸して、金表面の電位を0.5V/秒の速度で0.0〜2.0Vの間でサイクルした時放出される光のピーク強度を測定することにより、較正曲線が測定される。試料の血清中のPSAの未知濃度の測定は、PSAの濃度は、較正曲線に対する参照によりピークECLシグナルから計算される以外は、同じ方法により行われる。
本発明は、本明細書に記載の具体例に限定されるものではない。前記説明と添付図面から、本発明の種々の改変が可能であることは当業者には明らかであろう。このような改変は本発明の請求の範囲に包含される。本明細書においては種々の文献が引用され、それらの開示内容は参考のためそれらの全体が本明細書に引用される。
Claims (17)
- 第一核酸鎖と第二核酸鎖を有する二重鎖核酸におけるハイブリダイゼーションの程度を検出または測定する方法であって、ラベルと電極との間の電子移動を測定することを含む方法であり、該第二核酸鎖は該電極に固定化されており、該ラベルは、(i)該第一核酸鎖または該第二核酸鎖に連結している、または(ii)核酸インターカレーターであり、該電子移動は、該第一核酸鎖と該第二核酸鎖との間の相補性の程度に関連している、方法。
- 該ラベルは該第一核酸に連結している請求項1の方法。
- 該ラベルは該第二核酸に連結している請求項1の方法。
- 該ラベルは核酸インターカレーターである請求項1の方法。
- 更に、充分に相補的な二重鎖を生成するハイブリダイゼーション反応と、部分的に相補的な二重鎖を生成するハイブリダイゼーション反応とを区別する工程を含む請求項1の方法。
- ハイブリダイゼーション反応により核酸を検出する方法であって、
(a)第一核酸と第二核酸を含む組成物であって、該第二核酸は電極に固定化されておりそしてラベルに連結されている、組成物を形成する工程、
(b)該第一核酸が該第二核酸にハイブリダイズしたかどうかを決定するように、該ラベルと該電極との間の電子移動を測定する工程、
を含む方法。 - 該ラベルと該電極との間の電子移動を、インピーダンス測定により測定する請求項1または6の方法。
- 該ラベルと該電極との間の電子移動を、電気化学発光測定により測定する請求項1または6の方法。
- 該第二核酸は、該電極に固定化された5’チオール化DNAである請求項1または6の方法。
- 該電極は金電極である請求項9の方法。
- 該第二核酸は、10原子未満の長さのリンカーを介して該電極にカップル化されている請求項1または6の方法。
- 該第二核酸は、電導性リンカーを介して該電極にカップル化されている請求項1または6の方法。
- 該電導性リンカーはポリアセチレンを含む請求項12の方法。
- 該電極は、混合単一層を含み、該混合単一層の少なくとも一つの構成成分が電位転移を促進する請求項1または6の方法。
- 該ラベルは該第二核酸に共有的に連結している請求項6の方法。
- 該ラベルは該第二核酸に非共有的に連結している請求項6の方法。
- 該ラベルは、該第二核酸とそれにハイブリダイズした該第一核酸との間にインターカレート化している請求項6の方法。
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