KR100449615B1 - 다-배열,다-특이적전기화학발광시험법 - Google Patents

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Abstract

전기화학발광에 기초한 테스트에서 사용하기 위하여, 전기적으로 여기되는 유형화된 다-배열, 다-특이적 표면을 제조하는 물질 및 방법을 제공한다. 물질 및 방법은 평평한 패널 진열물 및 다 특이적 시험 과정에서 사용하기 위한, 전도성 영역 및 시약 침착의 화학적 및/또는 물리적 조절을 위해 제공된다.

Description

다-배열, 다-특이적 전기화학발광 시험법
2.1. 진단 분석
빠르게 감지하는 진단 기술에 대한 강한 경제적 필요가 존재한다. 진단 기술은 건강 치료, 연구, 농업, 수의학, 및 산업시장을 포함하는 광범위한 경제 시장에서 중요하다. 민감도, 요구 시간, 사용의 용이, 견고함, 또는 가격면에서의 향상은, 이전에 시장 수요를 채울 수 있는 기술이 없었던 진단 시장을 새롭게 전적으로 개방할 수 있다. 어떤 진단 기술들은 고감수성을 지닐 수 있으나, 시장 수요를 채우기에는 너무 비싸다. 다른 기술들은 가격면에서는 효과적일 수 있으나, 다양한 시장을 위해서는 충분히 견고하지 않다. 이러한 양질과 결합할 수 있는 신규한 진단 기술은 진단 사업에 있어서 중대한 발전이며 기회이다.
진단 적용에 사용되는 상이한 분석 기술들이 많이 있다. 이러한 기술들은 방사선 표지법, 효소 연결 면역분석법, 화학 유색도 분석법, 형광 표지법, 화학발광 표지법, 및 전기화학발광 표지법을 포함한다. 이러한 기술들 각각은 서로 다른 진단 시장에서의 이들의 사용을 제한하고 한정하는, 민감도 레벨, 사용의 용이, 견고함, 속도 및 가격의 독특한 조합을 가진다. 이러한 차이들은 각 기술들 고유의 물리적 압박에 부분적으로 기인한다. 예를 들면, 방사선 표지법은 표지 자체가 붕괴되기 때문에 비-견고하고, 결과 생기는 방사선 폐기물의 처리가 많은 적용을 위해 값비싼 경제적, 안전적 및 환경적 비용을 초래한다.
오늘날 사용되는 많은 민감한 진단 기술들은 일차적으로 시험을 수행하는 숙련공들을 위한 수요때문에 시장-제한적이다. 오늘날 사용되는 전기화학발광 과정은, 예를 들면, 숙련공들 뿐만 아니라 반복 세척 및 준비 단계도 필요로 한다. 이는 폐기물 처리를 위해 비용 및 수요 모두를 증가시킨다. 시험 당 비용을 절감 시킬뿐만 아니라 시험 과정을 단순화하는 신규한 진단법은 기존 시장에서의 수행을 향상시킬 뿐만 아니라, 새로운 시장을 개척함에 있어서 매우 중요하며 활용적이다.
2.2. 전기화학발광 분석법
전기화학발광("ECL")은 전기적으로 여기된 종(species)이 광자를 방출하는 현상이다[참고문헌; Leland and Powell, 1990 J. Electrochem. Soc. 137(10):3127-3131]. 상기 종을 ECL 표지로 명명하며, 본원에서는 또한 TAG로도 언급하기로 한다. 주로 사용되는 ECL 표지는 다음을 포함한다: 금속이 예를 들면, 8족의 신규 금속으로부터 유래되는, Ru-함유 및 Os-함유 유기 금속 화합물을 포함하는 유기금속화합물, 예컨대, Ru(2,2'-비피리딘)3+일부 (또한 "Rubpy"로도 언급됨)가 개시되어 있다[참고문헌; Bard et al. 미국 특허 No. 5,238,808]. ECL 표지에 의해 생성되는 빛은 진단 과정에서의 리포터 시그널로 이용될 수 있다[참고문헌; Bard et al. 미국 특허 No. 5,221,605]. 예컨대, ECL 표지는 항체 또는 핵산 탐침과 같은 결합제와 공유적으로 결합할 수 있다. ECL 표지/결합제 복합체는 다양한 물질을 분석하기 위해 사용될 수 있다[참고문헌; Bard et al. 미국 특허 No. 5,238,808]. ECL-기저 검출 시스템에의 토대는 광자를 방출하기 위해 ECL 표지를 여기시키는 전기 전위를 위하여 필요하다. 전기 전위 파형은 전극 표면, 전형적으로 금속 표면, 및 역전극을 횡단하는 ECL 분석법에 적용된다[참고문헌; 미국 특허 Nos. 5,068,088, 5,093,268, 5,061,445, 5,238,808, 5,147,806, 5,247,243, 5,296,191, 5,310,687, 5,221,605].
당업계에 알려진 다양한 장치들이 ECL 반응을 수행하고 검출하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, ECL을 수행하기 위한 전기화학 전지용 예시적 전극이 개시 되어있다[참고문헌; Zhang et al. 미국 특허 No. 5,324,457]. ECL 반응을 수행함에 있어서 사용되는 전기화학 전지가 개시되어있다[참고문헌; Levantis et al. 미국 특허 No. 5,093,268]. 전압 조절 장치를 포함하여, ECL 반응을 수행하고 검출하기 위한 장치가 개시되어있다[참고문헌; Kamin et al. 미국 특허 No. 5,147,806]. ECL 반응 유도용 전기 전위 파형 다이어그램, 디지탈 대 아날로그 전환기, 조절 장치, 전극 조절 장치로 피드백 정보를 제공하기 위하여 작동 전극에서 ECL 반응에 의해생성된 전류 검출용 검출 장치 및 방법을 포함하여, ECL 반응을 수행하고 검출하기 위한 장치가 개시되어있다[참고문헌; Zoski et al. 미국 특허 No. 5,061,445].
ECL 기술은 상세하게는 문헌[참조; 미국 특허 No. 5,093,268]에 의해 검토되어있다. 간단하게, ECL 기술은 샘플내에 상대적으로 적은 농도로 존재하는 해당 분석물을 샘플 부피내에서 검출하는 방법이다.
상기 참고 특허 문헌들에서 TAG로 명명되는, ECL 부분은 ECL 분석물과 결합할수도 있고 하지 않을 수도 있으나, 양 경우 모두 작동 전극으로부터 입수된 전기에너지에 의해 개시되는 일련의 화학 반응의 결과에 따라 여기 상태로 촉진된다. TAG의 ECL를 촉진하는 분자는 유리하게 옥살레이트, 또는 보다 바람직하게는, 트리프로필아민에 제공된다[참고문헌; 미국 특허 No. 5,310,687].
2.3. 상업적인 ECL 분석법
지금까지, 모든 상업적인 ECL 반응은 센티미터 규모 전극 표면 상에서 수행되었다. 센티미터 규모의 전극은 보다 큰 전극으로부터 기인하는 ECL 시그널의 증가된 크기와 각 분석을 위해 필요한 총 샘플 부피를 감소하고자 하는 바램 사이의 균형을 깨뜨린다. 그러나, 센티미터 규모 전극조차도 많은 분석법을 위해 필요되는 민감도를 달성하는데는 실패한다. 상기 문제점을 극복하고자 하는 시도에서, 모든 상업적인 ECL 시스템은 ECL 분석물 또는 시약을 포획하기 위해 코팅된 마그네틱 비트를 사용함으로써 추가로 민감도를 향상시킨다. 그리고나서, 상기 비드는 향상된 민감도를 위해 작동 전극에 근접하여 이동된다.
그러나, 마그네틱 비드의 사용은 많은 제한점을 가진다. 비드 자체는 시간이지남에 따라 벗겨지고 분해되는 단백질로 코팅되어 있어서, 시그널의 변동을 일으킨다. 또한, 비드-기저 분석법을 조작하고 포맷하는데 있어서의 복잡성에 기인하여, 상업적인 ECL 진단법은 주어진 샘플에 행해지는 각 분석법을 위한 과정의 복잡한 일련의 수행 세트를 필요로함으로써 수행되는 각 시험 당 시간 및 비용을 증대시킨다. 5 마이크론 규모의 비드는 비드-결합 ECL TAG의 대부분을 작동 전극에 근접한 얇은 필름에 도달하는 것을 방해함으로써, ECL TAG의 여기(excitation)에 있어서의 불충분을 야기한다.
한 번의 분석에 각 분석물을 위한 상이한 ECL 표지를 사용하고, 서로 상이한 분석물을 위해 상이한 파장에서 각각 방출되는 광자를 사용함으로써, 상이한 분석물 하나 이상을 동시적으로 분석하는 방법이 제안되었다[참고문헌; Leventis et al., 미국 특허 No. 5,093,268]. 하지만 이러한 기술은, 예를 들면, 서로 다른 파장에서 방사하는 충분한 수의 효과적인 ECL 표지의 비유용성 및 각 ECL 표지를 위한 화학 조건을 극대화할 필요성에 의해 제한된다. 이러한 실질적 제한에 의해, 상기 다-파장, 다-분석물 ECL 검출 시스템의 상업화는 방해되었다.
ECL 민감도를 증대시키고자 하는 또다른 시도는 전극 기술을 향상시키는 것이다. 다양한 금속 및 반도체 표면 상에 ECL 종의 필름이 직접 침착되었다[참고문헌; Zhang et al., 미국 특허 No. 5,324,457]. 전극 표면의 벌크 포화를 이용하는 Zhang 및 Bard 기술은 고도로 민감한 분석을 위해 적절치 못한 고르지 않은 패치 침착을 초래한다.
ECL 분석법을 수행하기 위한 전술한 방법은 또한, 전극을 포함하는 분석 전지가 희석 산, 희석 염기, 세정제 용액 등의 이용을 포함하는 많은 방법[참고문헌; 미국 특허 No. 5,147,806] 중의 임의의 방법에 의해 깨끗하게 되어야 함을 필요로 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 다수의 ECL 반응을 순차적으로 또는 동시적으로 수행하기 위한 신규하고 가격 효과적인 분석법을 제공하며, 개선된 정확도를 위해 강화된 조절 표준이 바람직한 양태에서 제공된다.
추가로, 본 발명의 목적은, 또한 폐기 가능한 많은 ECL 반응을 순차적으로 또는 동시적으로 수행하기에 적절한 하나 이상의 지지체를 포함하는 카세트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 생물학적 샘플내 해당 분석물을 위한 개별적인 분석을 수행함에 있어서 시간 및 비용을 절감하는 것에도 추가로 관련된다.
하나의 생물학적 샘플내 다수의 해당 분석물을 위한 다수의 동시적인 분석법을 수행함에 있어서의 방법 및 장치를 제공하는 것이 본 발명의 추가 관련 목적이다.
발명의 개요
본 발명은 지지체에 고정된 다수의 분리된 결합 영역으로 이루어진 ECL 반응 및 분석을 수행하기 위한 카세트에 관한 것으로, 상기 분리된 결합 영역은 하나 이상의 전극 및 하나 이상의 역전극 쌍과 공간적으로 배열된다. 카세트는 바람직하게는, 표면 상에 고정되는 다수의 분리된 결합 영역을 가진 제 1 지지체를 포함한다. 이는 하나 이상의 전극 및 하나 이상의 역전극 쌍을 가질 수도 있다. 상기 전극 및역전극-쌍은 전기화학발광을 개시하기에 효과적인 전압 파형의 형태로 전기 에너지원에 의해 분리하여 애드레스할 수 있다. 또한, 카세트는 제 1 지지체에 근접하여 위치할 수 있는 제 2 지지체를 포함할 수도 있는데, 이는 지지체들 사이에 수단을 포함하는 샘플을 제공하거나 및/또는 전극으로서 역할하기 위함이다. 결합 영역은 해당 분석물 또는 시약에 결합하기 위하여 지지 표면 상에서 유형화되고, 제조된다.
추가로, 본 발명은 지지체 또는 카세트 조작 수단, 전기화학발광을 개시하기에 효과적으로 조절된 전압 파형에 적용하도록 조정된 전압 조절 수단, 샘플로부터 전기화학발광을 검출하기 위한 광자 검출 수단 및 샘플 조작 수단을 제공하는 샘플의 전기화학발광을 측정하기 위한 장치에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 ECL 분석 조건하에서 다수의 카세트의 결합 영역을 다수의 해당 분석물을 함유하는 샘플과 접촉시킨 다음, 다수의 전극 및 역전극 쌍 각각에서 전기화학발광을 개시하기에 효과적인 전압 파형을 적용시켜 개시된 전기화학발광을 검출 또는 측정함으로써, 샘플내 전기화학발광을 측정하기 위한 카세트를 사용하는 방법에 관한 것이다. 넓은 일면에 있어서, 본 발명은 전극과 접촉하지 않는 샘플내에 ECL 분석 방법을 제공한다. 부가적으로, 전극 및 역전극 쌍의 사용에 대한 대안으로서, 본 발명은 전극 및 역전극을 결합 영역에 걸쳐서 스캐닝하는 것을 제공한다.
또한, 본 발명은 다수의 전기화학발광 반응을 동시적으로 측정하기에 적절한 카세트, 표면 상에 고정된 다수의 부위가 존재하는 지지표면 및 ECL 분석을 수행하기 위한 화학 반응을 행하는 매질을 포함하는 구성요소로 이루어진 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 흑연 나노튜브로부터 제조된 전극도 제공한다.
본 출원은 함께 계류중인 1995년 3월 10일자 출원 번호 08/402,076호 및 1995년 3월 10일자 출원 번호 08/402,277호의 계속출원(CIP)으로서, 양 출원은 본원에서 참조에 의해 전체적으로 통합된다.
본 발명은 전기화학발광 기저된 시험을 위한 유형화된 다-배열, 다-특이적 표면(PMAMS)을 제공하며, PMAMS를 제조하고 사용하는 방법도 또한 제공한다.
도 1 은 본 발명에 따라 카세트를 형성하는 두 개의 지지체를 나타내는 것으로서, 상기에서 다수의 결합 영역(14)이 지지체(10) 상에 존재하고 다수의 상응하는 전극(16)이 지지체(12) 상에 존재함으로써, 지지체들의 접근에 의해 전극쌍은 각 결합 영역에 인접하여 배치된다.
도 1 a 는 본 발명에 따라 카세트를 형성하는 두 개의 지지체를 나타내는 것으로서, 상기에서 다수의 결합 영역(14)이 지지체(10) 상에 존재하고 다수의 상응하는 전극(16)이 지지체(12) 상에 존재함으로써 지지체들의 접근에 의해 전극쌍은 각 결합 영역에 인접하여 배치된다.
도 2 는 본 발명에 따라 카세트를 형성하는 두 개의 지지체를 나타내는 것으로서, 상기에서 지지체(26) 상의 다수의 결합 영역(30)이 단일 전극(32) 각각에 근접함으로써, 지지체(26) 및 (28)의 접근에 의해 역전극(38) 각각은 각 결합 영역(30)에 인접하여 배치된다.
도 3 은 다수의 결합 영역(48)이 지지체(44) 상에서 결합 영역에 인접한 전극 및 역전극 쌍(50)을 가지는, 본 발명에 따라 카세트를 형성하는 두 개의 지지체를 나타낸다. 지지체(46)는 결합 영역(48) 및 전극(50)에 근접한 수단을 함유하는 샘플을 제공하기 위해 임의로 지지체(44)에 근접하게 위치할 수 있다.
도 4 는 지지체(60) 상의 다수의 결합 영역(64)이 분석물을 함유하는 샘플과 접촉하는, 본 발명에 따라 카세트를 형성하는 두 개의 지지체를 나타낸다. 지지체(62)는, 지지체(60) 및 지지체(62)의 접근에 의해 결합 영역(64) 및 영역(66)이 서로 접촉하도록 하기 위해서, 해당 분석물을 검출 또는 측정하거나 원하는 반응을 수행하기 위한 반응 매질을 함유하는 영역(66)을 가진다.
도 5a 는 다-배열, 다-특이적 결합 표면을 위한 유형화된 결합 영역의 윗면 도을 나타낸다. 기하학적 모양, 삼각형, 사각형 및 원은 상이한 분석물을 위한 특이적 결합 영역을 나타낸다. 결합 영역은 소수성 또는 친수성일 수 있다. 주변 표면은 결합제 또는 분석물을 결합 영역으로부터 분산되는 것을 최소화하기위해 결합 영역에 반대되는 성질(친수성 또는 소수성)을 가질 수 있다.
도 5b 는 결합제 및/또는 분석물을 분리된 결합 영역으로 전달하기 위한 미세유체 가이드의 윗면도를 나타낸다. 각각의 도트는 미세유체 가이드의 횡단면(예; 모세관)을 나타낸다.
도 5c 는 결합제 및/또는 분석물을 유형화된 다 배열의 결합 영역으로 전달하기 위하여 일직선 상에 맞춰져 정렬된 미세유체공학 가이드의 접근을 보여주는 미세유체 가이드의 측면도를 나타낸다. 각각의 미세유체 가이드는 상이한 결합제를 분리된 결합 영역으로 전달할 수 있다.
도 6a 는 유형화된 다-배열, 다-특이적 결합 영역을 가지는 표면을 지닌 레지스터내에서의 다-배열 전극들의 접근을 나타낸다. 제거될 수 있는 전극 보호 장벽은 전극 배열과 결합 표면 배열 사이에 보여진다. 전체적인 어셈블리는 다수의ECL 반응을 수행하기 위한 카세트를 포함한다.
도 6b 는 일직선상에 정렬된 애드레스할 수 있는 작동 및 역전극의 배열의 접근을 나타낸다. 전극은 결합 영역과 상보적인 모양이거나 기타의 모양(예; 깍지낀 모양)일 수 있다.
도 7 은 일직선상에 정렬된 애드레스할 수 있는 작동 및 역전극과 상보적 결합 표면의 접근된 배열을 나타내는 측면도인데, 상기에서, 전도성 중합체는 전극 배열 및 결합 영역 사이의 갭을 통해 전극 표면으로부터 연장됨으로써, 전위장을 샘플의 ECL 표지 둘레로 확장시켜 ECL 반응의 효율을 증가시킨다.
도 8 은 일직선상에 정렬된 애드레스할 수 있는 작동 및 역전극과 전위장을 확장하는 양 구성요소들 사이에 끼어든 전도성 입자를 지닌 상보적 결합 표면과의 접근된 배열의 접근의 측면도를 나타낸다. 전위장을 샘플의 ECL 표지 주변으로 확장시킴에 의해, ECL 반응의 효율은 향상된다. 전도성 입자는 신속한 조작을 허용하는 마그네틱일 수 있다.
도 9 는 일직선상에 정렬된 애드레스할 수 있는 작동 및 역전극과 상보적 결합 표면과의 접근된 배열의 측면도를 나타내는 것으로서, 상기에서 전극은 전극 표면 및 결합 영역 사이의 갭으로 확장하는 미세 돌기를 가짐으로써 전위장을 샘플의 ECL 표지 둘레로 확장시켜 ECL 반응의 효율을 증가시킨다.
도 10 은 일직선상에 정렬된 애드레스할 수 있는 작동 및 역전극과 상보적 표면과의 접근된 배열의 측면도를 나타내는 것으로서, 상기에서 표면은 평행하지는 않으나, 대신에 상보적 방식으로 서로 들어맞는다.
도 11 은 단일 전극을 제공하는 금속층을 가진 지지체와 카세트의 형태내 결합 표면 어셈블리의 측면도를 나타낸다. 다-어셈블리 단일층("SMAs")의 배열은 금속층 위에 유형화된다.
도 12 는 단일 전극을 제공하는 금속층을 가진 지지체와 카세트의 형태내 결합 표면 어셈블리의 측면도를 나타낸다. SAM의 배열은 금속층 위에서 유형화되고 전도성 마이크로입자는 유형화된 SAM 사이에 분산됨으로써, 전위장을 샘플의 ECL 표지 주변으로 확장시켜 ECL 반응의 효율을 증가시킨다.
도 13 은 단일 전극을 제공하는 금속층을 가진 지지체와 카세트의 형태내 결합 표면 어셈블리의 측면도를 나타낸다. 자동 어셈블리 단일층 또는 SAM의 배열은 금속층 위에서 유형화되고 전도성 중합체 및/또는 섬유는 ECL 표지로부터 연장됨으로써, 전위장을 샘플의 ECL 표지 주변으로 확장시켜 ECL 반응의 효율을 증가시킨다.
도 14 는 컴퓨터에 의해 조절되는 전극쌍 배열을 가지는 지지체의 다이어그램이다.
도 15 는 전극쌍의 배열을 가지는 지지체의 다이어그램이다.
도 16 은 전극쌍의 배열을 가지는 지지체 및 각 전극쌍의 에너지화를 조절하기 위한 컴퓨터 시스템의 다이어그램이다.
도 17 은 전극쌍의 배열을 가지는 지지체 및 각 전극쌍의 에너지화를 조절하기 위한 다수의 전압원과 멀티플렉서를 지닌 컴퓨터 시스템의 다이어그램이다.
도 18 은 전극쌍의 배열을 가지는 지지체 및 각 전극쌍의 에너지화를 조절하기 위한 다수의 스위치 전압원을 지닌 컴퓨터 시스템의 다이어그램이다.
도 19 (a)-(e) 는 여러개의 대안적인 전극-역전극 쌍 조합의 평면도이다.
도 20 은 완성된 샌드위치 분석을 지닌 지지체를 나타낸다.
도 21 은 지지체 상에서 마주보는 두 개의 PMAMS 표면을 나타낸다.
도 22a 는 미세유체 가이드(2201) 및 피브릴 매트(2200)의 배열을 나타낸다.
도 22b 는 결합 영역(2202)을 나타낸다.
도 23a 는 진공 여과에 의해 피브릴 막을 형성하는 장치를 나타낸다.
도 23b 는 여과막(2303)상의 피브릴 매트(2304)를 나타낸다.
도 24 는 피브릴 매트를 생산하는 롤러의 사용을 나타낸다.
도 25 는 다중층 피브릴 매트의 도식도로서, 상층은 분석에 사용되는 결합 영역을 가진다.
도 26 은 비-특이적 결합을 향상시키는 부분을 지니도록 유도된 피브릴의 도식도로서, 생물학적 비생물학적 여러 종들이 표면에 결합되어 있다.
도 27 은 비-특이 결합을 향상시키는 부분을 지니도록 유도된 피브릴의 도식도이고, 여러 종이 유도된 피브릴에 결합되고 일부 종은 추가로 리간드에 결합된다.
도 28 은 피브릴에 공유적으로 부착된 여러 종 및 일부 종들이 첨가분에 추가로 결합됨을 나타낸다.
도 29 는 다층 피브릴 매트를 광학 여과로서 사용하는 것을 나타내는데, 매트 위 또는 내에 광원의 위치에 의존하여 빛을 통과 및/또는 흡수 및/또는 분산케할 수 있다.
도 30a 는 탄소 피브릴 매트 전극상에서의 전기화학 측정으로부터 얻은 사이클릭 볼타모그램을 나타낸다.
도 30b 는 금 호일 전극상에서 전기화학 측정으로부터 얻은 사이클릭 볼타모그램을 나타낸다.
도 31 은 매트 두께와 스캔 속도와의 함수로서 피브릴 매트의 전기화학적 성질을 비교한 것이다.
도 32 는 단백질 용액내 피브릴의 농도가 증가할때 피브릴상에서의 비-특이 결합이 일반적으로 증가함을 나타내는 도표이다.
도 33 은 계면활성제의 사용에 의해 ECL-TAG 표지 단백질과 탄소 피브릴 사이에서 비-특이 결합을 감소시킬 수 있음을 보여준다.
도 34 는 피브릴 매트 전극상에서 전기화학 성질 및 ECL을 측정하는데 사용되는 실험 전지의 윗면 도식도이다.
도 35 는 용액내에서 전극으로서 피브릴 매트와 1000 pM TAG1을 사용하여 얻어지는 ECL 시그널(연속선)과 분석 완충액(TAG1이 없음)으로부터의 시그널(점선)을 나타낸다.
도 36 은 두 개의 표면 PMAMS 장치의 도식도로서, 상기에서 지지된 전극의 두 배열은 유형화된 이중전기층에 의해 분리된다.
도 37 은 하나의 지지체 상에 다수의 결합 영역(3702)을 지니고 또다른 지지체 상에 전극 및 역전극을 지니는 장치를 나타낸다.
도 38 은 결합 영역이 역전극상에 지지된 뚜렷한 목표물 표면 상에 존재하는 카세트를 나타낸다.
도 39 는 겔이 작동 및 역전극과 접촉함을 나타낸다.
도 40 은 ECL 강도의 그래프와 작동 및 역전극과 접촉하는 ECL 표지된 겔로 부터의 사이클릭 볼타모그램을 나타낸다.
도 41 은 ECL 강도의 그래프와 작동 및 역전극으로 접촉하는 비-ECL 표지된 겔로부터 얻어지는 사이클릭 볼타모그램을 나타낸다.
도 42 는 ECL에 사용되는 2-표면 카세트에 대한 도식도이다.
도 43 은 피브릴 매트가 매트에 흡수된 항체-TAG1의 ECL을 위한 전극으로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
도 44a 는 전극 상에 고정된 TAG1 표지된 단백질의 ECL 강도를 나타낸다.
도 44b 는 코팅된 전극의 사이클릭 볼타모그램을 나타낸다.
토 45a 는 고정된 ECL TAG1 표지된 단백질로부터 ECL 시그널의 준(quasi)-가역적 반복 발생을 나타낸다.
도 45b 는 코팅의 부분적 보존을 가리키는 코팅된 전극의 사이클릭 볼타모그램을 나타낸다.
도 46a 는 고정된 ECL TAG1 표지된 단백질로부터 ECL 시그널의 비가역적 발생을 나타낸다.
도 46b 는 코팅의 실질적 손실을 가리키는 코팅된 전극의 사이클릭 볼타모그램을 나타낸다.
도 47 은 ECL 시그널을 발생 및 분석하기 위한 조절 수단을 포함하는 다-배열 ECL 장치 및 마이크로프로세서를 나타낸다.
따라서, 본 발명은 다수의 전기화학발광 분석을 수행하기 위한 넓은 일면 카세트를 포함한다. 카세트는 하나 이상의 해당 분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 결합 영역을 그 위에 가지는 지지체로 형성된다. 결합 영역은 지지체 상에 유형화된 다-배열 다-특이적 표면("PMAMS")으로 제조된다. PMAMS는 예컨대, 수행될 수 있는 분석 밀도를 크게 증가시키고, 빠르게 또는 동시에 수행될 수 있는 다수의 상이한 분석을 허용함으로써, 공지된 ECL 분석 방법으로부터 상당한 개선을 제공한다. 카세트는 결합 영역에 결합된 ECL 표지된 시약로부터 선택적으로 광의 ECL 방출을 개시할 수 있는 다수의 전극을 포함할 수 있다. 도 47 은 전극(4700, 4704), 결합 영역(4706)를 지닌 매트릭스(4702) 및 리드(4710-4716)를 통해 접속되는 ECL 시그널을 발생 및 분석하기 위한 조절기(4720) 수단을 함유하는 마이크로프로세서를 가지는 다배열 ECL 장치를 나타낸다.
도 1에 보여지는 본 발명의 양태에서, 카세트는 두개의 지지체(10, 12)로 구성되며, 상기에서 다수의 결합 영역(14)가 제 1 지지체(10)의 표면 상에 존재하고 다수의 전극/역전극 쌍(16)이 제 2 지지체(12)의 표면 상에 존재한다. 결합 영역과 전극/역전극 쌍은, 제 1 및 제 2 지지체(10, 12)가 접근할때, 다수의 전극/비전극쌍(16) 각각이 다수의 결합 영역(14) 중 상이한 것에 인접하게 배치되도록 배열된다. 결합 영역(14) 아래의 제 1 지지체(10)는 바람직하게는 금 필름 표면과 투명결합 영역을 지닌 PMAMS이다. 제 2 지지체(12)는 바람직하게는, 투명 전극/역전극 쌍(16)을 그 위에 가지는 투명 평면 플라스틱 시이트이다. 결합 영역(14)는 바람직하게는 지지 표면 상에 유기의(organic) 자동 어셈블된 단일층(개별 단량체로 이루어짐) 유형을 마이크로 스탬핑함으로써 제조되며, 상기에서 단량체는 바이오틴 또는 연결부분을 가진다. 이후, 아비딘 또는 스테프타비딘은 노출된 바이오틴에 결합된다[참고문헌; 미국 특허 No. 5,093,268]. 그리고나서, 결합제는 바이오틴 표지된 항체와 같이 적절한 바이오틴-표지된 결합제의 분리량을 적용함으로써 적용되는데, 이는 단량체가 스탬핑된 지지 표면 상에 위치하는 해당 분석물에 선택적으로 결합할 수 있다. 도 1a는 하우징(11)내에 포함된 카세트(도 1)로 이루어진 시스템을 나타낸다.
본 발명의 어떤 양태에서는, 표면 상에 특정 또는 선결정된 양의 하나 이상의 시약을 재생산적으로 고정하는 것이 바람직하다. 고정은 시약을 표면 상에 고착시키는 임의의 방법에 의해 가능한데, 이는 공유 화학 결합; 비-특이성 흡수; 표면 상에서의 시약의 건조; 정전기적 상호작용; 소수성 및/또는 친수성 상호작용; 액체 또는 겔 내 봉쇄(confinement) 또는 승차(entrainment), 생특이적 결합(예; 리간드/수용체 상호작용 또는 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드); 금속/리간드 결합; 킬레이션 및/또는 중합체내 얽힘을 포함하나, 여기에 한정되지는 않는다.
표면 상에 고정되는 시약의 양은 여러 방식으로서 선결정될 수 있다. 예를 들면, 표면 상의 시약의 양은 시약이 존재하는 하나 이상의 부피 및/또는 지역 요소에 의해 특정될 수 있다. 또한, 이는 표면 상에 고정되는 시약 개별 분자의 수에의해서도 특정될 수 있다. 시약의 양은 주어진 영역에서의 특정 시약의 밀도에 의해서도 특정될 수 있다. 시약의 양은 표면 총 지역 또는 표면 상에 존재하는 다른 시약의 상대적인 양에 관해, 특정 시약을 품고 있는 표면 %로서 특정될 수 있다. 시약의 양은 분석이 바람직한 특이성을 달성하도록 하기 위해 충분한 ECL 강도를 제공하고자 특정 표면에 존재해야 하는 시약의 양으로서도 규정될 수 있다. 특정 예에서, 금 표면의 1㎠ 지역이 알칸티올의 단일층으로 코팅될 수 있다.
시약은 또한, 코팅된 표면 상에 재생산적으로 고정될 수도 있다. 코팅은 일부 시약을 위해 고정화를 향상시키거나 및/또는 다른 시약를 위해 고정화를 방해할 수 있다. 표면은 완전히 코팅되거나 표면이 부분적으로 코팅될 수도 있다(즉, 유형화된 코팅). 코팅은 조성물에 있어서 일정할 수 있거나 또는 상이한 조성물 요소를 함유할 수도 있다. 특정예에서, 코팅은 몇 지역에서는 공유 화학 결합을 통해 면역글로불린 G를 고정하며 기타 지역에서는 고정화를 방해하는, 유형화된 단일층 필름일 수 있다.
또한, 코팅은 후속 단계 또는 공정에서 표면 상에 존재하는 고정된 하나 이상의 시약의 양을 선결정하는 역할을 수행할 수도 있다. 대안적으로, 특정 시약의 양은 침착된 시약의 양을 제한함에 의해 조절될 수도 있다.
양적으로 재생산하는 방식으로 고정된 시약(또는 코팅)을 가지는 표면을 가짐으로써, 샘플로부터 ECL 시그널을 재생산적으로 및 양적으로 측정하는 능력을 제공하며, 따라서 검정을 허용한다.
바람직하게, 전극/역전극 쌍(16)은 센티미터 규모 이하이며, 액정 표시 및전기화학 표시 패널의 제조를 위해 공지된 방법에 의해 전극 리드(20)(예; 투명 금속 필름)와 더불어 제조된다. 전극 리드(20)는 전기 접속부(19)에 의해 파형 발생 수단(18)에 접속된다. 유리하게도, 전극/역전극 쌍은 컴퓨터 조절하에서 개별적으로 애드레스할 수 있어서 전기 전위는 분리된 결합 영역에 선택적으로 적용할 수 있다. ECL 방출이 결합 영역에 결합된 적절한 표지로부터 자극될때, 광 검출 수단(22) 및 디지탈 컴퓨터 수단(24)은 결과를 기록하고 분석하는데 제공된다.
도 1a는 하우징(11)을 함유하는 도 1에 도시된 바와 같은 카세트, 전기 리드, 파형 발생기, 광 검출 수단 및 디지탈 컴퓨터로 이루어진 시스템을 나타낸다. 카세트는 개구(15)를 통해 하우징 내로 삽입된다.
또 다른 양태에서, 하나의 작동 전극은 다수의 결합 영역에서 ECL 시그널을 동시적으로 발생시키는데 사용된다. 이 양태에서, 결합 영역으로부터의 ECL 시그널은 광 이미지 장치의 사용을 통해 확인된다.
광범위하게, 본 발명에 따라 카세트를 사용하여 수행된 분석법은 다수의 분리된 결합 영역의 사용으로부터 이로운 분석법이다. 예를 들면, 상기 카세트의 사용은 광범위한 해당 분석물을 빠르게 또는 동시적으로 검출 또는 측정하는 것을 허용한다. 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 분석법은 또한 ECL 표지된 시약, 분석물 또는 결합 표면의 사용으로부터 이로운 것이기도 하다. 본 발명에 따른 ECL 분석법은 다수의 결합 영역을 해당 분석물을 함유하는 샘플과 접촉시키고, 결합된 ECL 표지로부터 ECL 방출을 개시하는 것으로 이루어지는데, 상기에서 ECL 표지는 분석물 상에 또는 분석물의 경쟁자상에, 분석물과 결합하는 시약상에, 또는 다수의결합 영역상에 있다.
또한, 본 발명은 해당 분석물을 검출 또는 측정하기 위한 ECL 분석 방법을 제공하는데, 이는 (a) 하나 이상의 지지체 표면 상에 고정된 다수의 분리된 결합 영역을 전기화학발광 표지에 연결된 분자로 이루어진 샘플과 접촉하는 단계; (상기 샘플은 접촉 단계 동안 임의의 전극 또는 역전극과 접촉하지 않는다.) (b) 전극을 상기 하나 이상의 다수 결합 영역으로 근접시키는 단계; (c) ECL을 개시하기에 효과적인 전압 파형을 상기 하나 이상의 다수 결합 영역에 적용시키는 단계; (d) ECL를 검출 또는 측정하는 단계로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) (i) 하나 이상의 지지체 상에 고정되고 (ii) 다수 전극 및 역전극 쌍에 근접하여 공간적으로 배열된, 하나 이상의 다수 분리된 결합 영역을 전기화학발광 표지로 연결된 분자를 이루어진 샘플과 접촉시키는 단계; (b) 전극 및 역전극을 상기 하나 이상의 다수 결합 영역으로 근접시키는 단계; (c) 전기화학발광을 개시하기에 효과적인 전압 파형을 상기 하나 이상의 다수 결합 영역에 적용시키는 단계; (d) 전기화학발광을 검출 또는 측정하는 단계로 이루어진 ECL 분석 방법을 제공한다.
지지체 상의 다수 결합 영역은 분석되는 샘플과 상호작용하도록 허용된다. PMAMS는 분석을 완성하는데 필요한 시약을 함유하는 용액과 추가 접촉할 수 있다. 이후, 결합 표면은 이후에 ECL을 자극하는 전기 전위에 적용하기 위해 사용되는 상보적 전극(깨끗하거나 새 전극이 바람직하다)의 표면과 접촉한다.
도 1의 장치를 사용한 분석을 수행하는 바람직한 방법에서, 해당 분석물을함유하는 샘플은 분석물을 검출하기에 적절한 ECL 표지된 시약과 함께 다수 결합 영역(14)에 적용된다. 이후, 지지체(11) 및 지지체(12)는 각각의 결합 영역이 다수의 전극/역전극 쌍(16) 중 상이한 전극/역전극과 그들 사이에 함유된 샘플 사이에 위치하도록 하기 위해 접근한다. 전극 및 역전극 쌍은, 적절한 전위가 전극 및 역전극 쌍을 가로질러 적용될때, ECL를 자극하기 위해서 결합부위와 기계적 접촉을 만들 필요가 없음을 숙지하여야 한다. ECL 방출을 개시하기에 적절한 전기 전위 파형은 전기 접속부(19)를 통해 파형 발생 수단(18)으로부터 다수 전극/역전극 쌍(16) 까지 적용된다. 다수 결합 영역(14)상에 존재하는 ECL 표지에 의해 방출되는 임의의 시그널은 광 검출 수단(22)에 의해 검출되고 디지탈 컴퓨터 수단(24)에 의해 분석된다.
본 발명은 다성분요소, 액체 샘플의 부피내에서 샘플내 다양한 농도로 존재할 수 있는 해당 다수의 분석물을 검출하는 방법을 제공한다.
다수의 분석물은 10-3몰농도 이하에서 다성분요소 샘플로부터 검출될 수 있다. 바람직하게는, 다수 분석물은 다성분요소 샘플로부터 10-12몰농도에서 검출될 수 있다.
본 발명은 이질 분석법(heterogeneous assays), 즉, 다수의 비결합 표지된 시약이, 전기화학 에너지에 결합 표지된 시약의 노출 이전에, 다수 결합 표지된 시약로부터 분리되는 분석법 및 동질분석법(homogeneous assays), 즉, 다수 비결합 표지된 시약과 결합 표지된 시약이 전기화학 에너지에 함께 노출되는 분석법으로서수행될 수 있는 다성분요소 샘플로부터 검출용으로 제공한다.
본 발명의 분석법에서, 특정 분석물을 검출하는데 사용되는 전자기 방사는 하나 이상의 유형 특징으로서 위치 및/또는 자리를 확인함에 의하여, 다른 분석물에 상응하는 전자기 방사로부터 구별되는데, 상기 유형은 PMAMS 내에서 결합 영역의 유형에 상응한다.
본 발명의 동질 분석법에서, 비결합제과 비교시 결합 표지된 시약에 의해 방사된 전자기 방사의 양에 있어서의 증가 또는 감소로서, 또는 공간내 상응하는 공급원으로부터 PMAMS 내 결합 영역 유형에 상응하는 하나 이상의 유형 특징으로 방출된 전자기 방사의 검출에 의해, 전자기 방사가 결합 표지된 시약에 의해 방출된다.
도 20에 도시된 본 발명의 방법의 특정예에서, 샌드위치 분석법은 특정 분석물(An)을 결합하는데 특이적인 표면 상에 다수 결합 영역(BD)를 지닌 지지체(5)상에서 수행된다. 분석물을 포함하는 샘플이 결합 영역에 적용될때, 분석물은 결합 영역에 결합된다. 선택적으로 분석물(An)를 결합하는데 적절하며 ECL 부분 (TAG)로 표지되어 Ab-TAG를 형성하는 항체(Ab)는 이후, 결합 영역상의 분석물에 적용된다. 과량의 비결합 Ab-TAG를 결합 영역으로부터 떨어지도록 세척한 후에, 전기화학발광을 개시하는데 적절한 전위 파형은 결합 영역상의 임의의 TAG로부터 ECL 방출을 개시하는 전극(비도시)에 의해 TAG에 적용된다. ECL 시그널은 광 검출 수단에 의해 검출되고 디지탈 컴퓨터 수단에 의해 기록된다(예; 도 1의 (22) 및 (24)에 도시됨).
추가 양태에서, 본 발명의 특징 및 다양성이 하기에 기술된 바와 같이 제공된다.
5.1. 결합 표면의 제조
본 발명에 대한 이해를 돕기 위해, 지지체 상에 결합 영역을 제조하는 방법을 보다 상세하게 기술한다. 표면 상에 존재하는 다수의 분석물에 특이적인 결합 영역의 유형화된 배열을, 본원에서는 유형화된 다-배열 다 특이적 표면 또는 PMAMS로 언급하기로 한다. PMAMS는 예를 들면, 자동-어셈블되는 단일층("SAM")을 유형화함으로써, 제조된다[참고문헌; Ferguson et al, 1993, Macromolecules 26(22):5870-5875: Prime et al., 1991, Science 252:1164-1167: Laibinis et al., 1989, Science 245:845-847; Kumar et al., 1984, Langmuir 10(5):1498-1511; Bain et al., 1989, Angew. Chem.101:522-528]. 또한, 표면 유형화 방법은 물리적 에칭(예; 미세장치)[참고문헌; Abbott et al., 1992, Science 257:1380-1382; Abbott, 1994, Chem. Mater. 6(5):596-602], 미세석판술[참고문헌; Laibinis et al., 1989, Science 245:845-847], 광활성 화학물질의 사용을 통한 화학 그룹의 표면 부착[참고문헌; Sundberg et al., 1995, J. Am. Chem. Soc. 117(49):12050-12057], 및 마이크로-스탬핑 기술[참고문헌; Kumar et al., 1994, Langmuir 10(5):1498-1511; Kumar et al., 1993, Appl. Phys. Lett. 63(14):2002-2004]의 사용을 포함한다. 기타 표면 유형화 방법은 유체 또는 입자의 분배를 공간적으로 조절하는 방법(예; 마이크로펜 침착(X-Y 병진운동을 사용하여 표면 상으로 전달하는 미세유체 가이드를 사용하여)), 미세모세관 필링[참고문헌; Kim et al., 1995, Nature 376:581],잉크-젯 기술, 또는 주사기 용기를 포함한다. 이러한 기술들의 조합은 복합체 표면 유형을 제공하는데 사용될 수 있다. 도 5a에서, 지지체(600)는, 기하학 모양(602)이 상이한 결합 특이성이 하나의 지지체 상에 존재할 수 있다는 것을 가리키기 위한 기하학 모양(602)으로서, 표현된 결합 영역과 독립적인 모양과 함께 단지 예시 목적으로 도시되어 있다. 결합 영역 사이의 표면(604)은 결합 영역을 형성하는 결합제의 침착을 봉쇄하는 선택적으로 소수성 또는 친수성일 수 있다. 결합 영역 및/또는 결합 영역 사이의 표면은 대안적으로 비특이성 결합 경향이 있고 저항적일 수 있으며, 또는 그들은 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 결합제의 부착에 저항적 경향이 있을 수 있다. 소수성 상호작용을 통한 비-특이적 결합이 표면에 결합 화학성질을 부착하기 위한 바람직한 방법이 아닌 경우에 있어서, 세정제는 우발적인 비-특이성 결합이 일어나는 것을 방해하기 위해서 첨가될 수 있다.
결합 영역은 0.1 ㎍ 내지 1 mm의 폭 또는 직경이며, 결합 영역의 기하학에 의존하여 폭 차원을 가진다. 표면은 예컨대, ECL 분석 용액에 노출된 특이적 결합 구성요소를 가지도록 선택적으로 유도된다. 부가적으로, 결합 영역에서의 비-특이적 상호작용은, 분리된 결합 영역의 노출 표면 상의 폴리에틸렌글리콜과 같은 부분을 통합함에 의하여 특이적 결합 부분을 유지시키는 동안에 감소된다[참고문헌; Prime et al., 1993, J. Chem. Soc. 11510714-10721; Prime et al., 1991 Science 252:1164-1167; Pale-Grosdemange et al., 1991, J. Am. Chem. Soc. 113: 12-20].
PMAMS은 넓게 2 내지 1018개의 결합 영역을 포함할 수 있다. 바람직하게는,결합 영역의 수는 50 내지 500이다. 다른 양태에서, 결합 영역의 수는 25 내지 100이다.
지지체는 다양한 물질들일 수 있는데, 이는 유리, 플라스틱, 세라믹, 중합체 물질, 탄성체, 금속, 합금, 호일 구성분, 반도체, 절연체, 실리콘 및/또는 층 물질 등을 포함하나, 여기에 한정되지는 않는다. 유도된 탄성 지지체는 문헌[참조; Ferguson et al., 1993, Macromolecules 26:5870-5875; Ferguson et al., 1991, Science 253:776-778: Chaudhury et al., 1992, Science 255;1230-1232]에 따라 제조될 수 있다.
PMAMS가 그 위에서 제조되는 지지체의 표면은 예컨대, 메쉬, 필트, 섬유성 물질, 겔, 고체(예컨대, 금속으로 이루어짐) 탄성체 등과 같은 다양한 물질을 함유할 수 있다. 지지체 표면은 다양한 구조적, 화학적 및/또는 광학적 성질을 가질 수 있다. 예를 들면, 표면은 견고하거나 가요적(flexible)이며, 평평하거나 일그러진 형태이며, 투명하거나, 반투명이며, 일부 또는 전부 반사적이거나 흐릿할 수 있으며, 복합체 성질, 즉, 상이한 성질을 지닌 영역들을 가질수도 있으며, 하나 이상의 물질의 복합체일수도 있다. 표면은 유형화된 표면 결합 영역 및/또는 촉매가 하나 이상의 표면 상에서 본 발명에 따라 일어날 수 있는 유형화된 영역, 및/또는 하나 이상의 표면 상에서 애드레스할 수 있는 전극 배열을 가질 수도 있다. 지지체의 표면은 평면, 구형, 큐빅, 기둥형의 임의의 적절한 모양으로 구성될 수 있다. 특정 양태에서, PMAMS를 품고 있는 지지체는 계량봉(dipstick)이다. 또 다른 양태에서, PMAMS를 품고 있는 지지체는 탄소, 예컨대, 흑연, 유리성 탄소 또는 흑탄소를 함유한다.
한 양태에서, PMAMS를 품고 있는 지지체는 하나 이상의 탄소 섬유를 함유한다. 이들 섬유들은 무정형 또는 흑연성 탄소일 수 있다. 또한, 그들은 탄소 나노튜브, 벅키튜브 또는 풀러렌 층 류일 수도 있다.
바람직한 양태에서, PMAMS를 품고 있는 지지체는 하나 이상의 탄소 피브릴(Hyperion FibrilsTM)을 함유한다[참고문헌; 미국 특허 No. 4,663,230]. 개별적 탄소 피브릴은 3.5 nm 내지 70 nm 범위의 직경, 직경의 102배 이상의 길이, 규칙적인 탄소 원자로 이루어진 다 연속층의 외부 영역 및 분리성 내부 코아 영역을 가질 수 있다. 예시의 목적으로 간단하게, 탄소 피브릴의 전형적인 직경은 대략 7 내지 25 nm 이고, 길이는 1 ㎛ 내지 10 ㎛ 범위일 수 있다.
탄소 물질은 집합체를 형성하도록 만들어질 수 있다. 본원에서 참조되는 미국 특허 No. 5,110,693에 개시된 바와 같이, 두 개 이상의 개별 탄소 피브릴은 얽혀진 피브릴의 미세성 집합체를 만들 수 있다. 이들 집합체는 5 nm 내지 수 cm의 범위의 차원을 가진다. 단지 예시할 목적으로, 미세성 집합체의 한 유형("면사탕 또는 CC")은 5 nm 내지 20 ㎛의 직경 및 0.1 ㎛ 내지 1000 ㎛의 길이를 지닌 얽혀진 섬유의 축 또는 막대기를 닮았다. 역시 예시의 목적으로, 피브릴의 미세성 집합체의 또 다른 유형("새 둥지, BN")은 0.1 ㎛ 내지 1000 ㎛ 범위의 직경을 지닌 구형일 수 있다. 각 유형(CC 및/또는 BN)의 보다 큰 집합체 또는 이들의 혼합물도 형성될 수 있다(vide infra).
지지체에서 사용될 수 있는 피브릴은 개별 피브릴, 하나 이상의 피브릴 집합체, 하나 이상의 피브릴 현탁액, 피브릴 분산제, 피브릴과 다른 물질(예컨대, 오일, 파라핀, 왁스, 중합체, 겔, 플라스틱, 접착제, 에폭시, 테플론, 금속, 유기 액체, 유기 고체, 무기 고체, 산, 염기, 세라믹, 유리, 고무, 탄성체, 생물학적 분자 및 매질 등)의 혼합물 및 이들의 조합을 포함하나, 여기에 한정되지는 않는다.
피브릴은 일부 경우에서 자기성이며 기타 경우에서는 비-자기성일 수 있다. 자기성 또는 비-자기성으로 만들어질 수 있는 피브릴의 양은, 미국 특허 No. 4,663,230, 5,165,909, 및 5,171,560에 개시된 공정과 같이 피브릴 생산 공정 결과로서 피브릴내 존재하는 촉매의 양에 의해서 조절된다. PMAMS는 상기 기술된 지지체 위에, 안에 또는 근접하여 위치한다.
PMAMS는 상이한 유형의 표면 결합 그룹으로부터 발생될 수 있다. 결합하는 표면 상에 단일층을 만들기 위해 사용될 수 있는 자동-어셈블리되는 단일층은 알칸티올(금 및 기타 금속에 결합), 알킬트리클로로실란(예; 실리콘/실리콘 디옥사이드에 결합), 알칸 카르복실산(예; 알루미늄 옥사이드에 결합) 및 이들의 조합을 포함하나, 여기에 한정되지는 않는다. 단일층은 먼저 형성될 수 있으며, 이후 연결 화학물질이 결합제를 부착하는데 사용된다. 자동-어셈블리 후에 유도는 지지 표면 상에 더 적은 핀 홀 또는 흠을 가지는 더 완전한 이-차원 결정질 패킹을 만든다. 단일층은 자동-어셈블리 되기 이전 또는 이후에 결합제과 함께 유도될 수 있다. 단일층내 정형화된 흠이 바람직할 수 있으며, 단일층 또는 지지 표면의 자동-어셈블리 이전에 유도에 의해서 수득될 수 있다. 결합제상에 유도된 그룹(예; 노출된 결합그룹)이 입체적으로 넓다면, 이는 금속 표면에 규칙적인 갭을 가지기는 하나, 노출된 말단에서 밀집된 표면을 창출할 수 있다. 이는 이들 정형화된 갭을 통해 전하를 샘플 용액과 접촉하는 부분에 결합된 ECL 표지된 부분으로 보내도록 하는데 유용하다.
불완전한 단일층의 제조는 당업계에서 공지되어있다. 불완전한 단일층을 제조하는 기타 방법은 결합제의 희석 용액으로부터 단일층의 형성, 완성 이전에 반응을 형성하는 단일층의 종결, 방사선(예컨대; 이온 입자), 광 또는 화학 시약에 의한 보다 많은 완전 단일층의 손상을 포함하나, 여기에 제한되지는 않는다. 한 양태에서, 스탬프의 재-연결없이 반복되는 스탬핑은 넓은 범위의 결함있는 단일층을 제공할 수 있다[참고문헌; Wilbur et al., 1995, Langmuir, 11:825].
PMAMS는 매트릭스의 표면 상에서 발생될 수 있다. 매트릭스는 고도로 전도성, 예컨대, 금속 전극 또는 전도성 중합체 필름일 수 있으며; 또는 매트릭스는 절연체일 수 있으며; 또는 매트릭스는 반-도체 및/또는 중간 전도체일 수 있다. 매트릭스 물질은 이온성 도체 또는 다공성 금속일 수 있다. 상기 다공성 물질은 지지 물질 및/또는 전도 물질 및/또는 여과 물질 및/또는 채널 물질(예; 유체, 이온족 등을 통과시키는 물질)로서 활용될 수 있다.
다공성 물질은 부가적 물질과 결합될 수 있다. 예를 들면, 복합체 구조는 부가적 다공성 물질, 전도성 물질, 반도체성 물질, 채널 구조 및/또는 용액(예컨대; 이온 유체)과 함께 다공성 물질로 제조될 수 있다. 상기 복합체는 라벨라 구조, 샌드위치 구조 및/또는 섞여 있는 복합체일 수 있다. 고체 매트릭스는 다공성 물질이금속 전극상에 지지하는데 사용될 수 있다. 대안적으로 다공성 물질은 전도 물질, 반도체 물질 또는 반도체 및 도체 물질의 조합체 사이의 샌드위치이다.
하나 이상의 결합 영역은 다공성 물질의 한 연속 슬랩상에 함유될 수 있거나, 하나 이상의 결합 영역을 지닌 각 지지체 상에 다수 분리성 목표물상에 위치할 수 있다. 다공성 물질(예컨대; 겔) 표면은 평평, 반구형 또는 정형 또는 비정형 모양일 수 있으며, 다양한 물리적 성질(예컨대; 탄성, 견고, 저 밀도, 고 밀도, 밀도 구배, 건조, 습윤 등) 및/또는 광학 성질(예컨대; 투명, 반투명, 흐릿, 반사, 굴절 등) 및/또는 전기적 성질(예; 도체성, 반도체성, 절연성, 다양한 전도체성, 예를 들면 습윤 대 건조 등)을 가질 수 있다.
채널의 유형은 매트릭스내에서 형성될 수 있다. 다공성 물질 층은 5 마이크론 내지 2000 마이크론 두께일 수 있다. 다공성 물질 층은 또한 2 nm 이상의 두께일 수도 있다.
구멍은 물질을 통해 부분적으로 및/또는 완전히 연장될 수 있거나 구멍의 네트워크의 일부일 수 있다. 이들 구멍은 50 Å 내지 10000 ㎛ 의 넓은 범위의 차원을 가질 수 있다. 바람직한 양태에서, 물질은 200 Å 내지 500 Å 범위의 차원을 지닌 일부 구멍 및 0.5 ㎛ 내지 100 ㎛ 범위의 차원을 지닌 일부 구멍을 가진다.
물질의 다공성은 물질내에서 일정할 수 있거나 물질내 위치 함수로서 증가 또는 감소할 수 있다. 물질은 비조직화되거나 랜덤한 방식으로 분포되는 상이한 크기의 다양한 구멍을 가질 수 있다.
다공성 물질은 하나 이상의 물질의 복합체일 수 있다.
예를 들면, 물질은, 생물학적 세포 만큼 큰 물질을 통과시킬 수 있도록 충분히 넓은 구멍, 단백질 또는 항체만큼 넓은 생물학적 매질을 통과시킬 수 있는 구멍, 작은 유기 분자(<1000 분자량) 및/또는 이들의 조합만을 통과시킬 수 있는 구멍을 가질 수 있다.
물질의 다공성은 하나 이상의 분자, 액체, 고체, 에멀젼, 현탁액, 가스, 겔 및/또는 분산제가 물질 안으로 및/또는 통하여 통과할 수 있는 그러한 것이다. 물질의 상기 다공성은 생물학적 매질이 확산할 수 있거나(능동 또는 수동) 또는 물질 안으로 및/또는 통하는 일부 수단에 의해 강요될 수 있도록 하는 그런 것이다. 생물학적 매질의 예는 전혈액, 분획된 혈액, 원형질, 혈청, 뇨, 또는 단백질, 항체 또는 이들의 단편의 용액, 세포, 하위세포 입자, 바이러스, 핵산, 항원, 지질단백질, 지질당, 지질, 당단백질, 탄수화물, 펩타이드, 호르몬 또는 약물제를 포함하나, 여기에 한정되지는 않는다. 다공성 물질은 생물학적 매질이 하나 또는 그 이상의 층을 통과할 수 있으나 기타 층을 통과하지 않도록 하는 하나 이상의 상이한 다공성 층을 가질 수 있다.
다공성 물질은 이온족의 흐름에 기인하여 전류를 지지할 수 있다. 추가 정련에서, 다공성 물질은 다공성 물-팽창 겔, 예를 들면, 폴리아크릴아미드 또는 한천이다. 기타 다양한 겔 조성물이 이용가능하다[참고문헌; Soane, D. S. Polymer Application for Biotechnology; Soane, D. S., Ed.; Simon & Schuster; Englewood Cliffs, NJ, 1992 or Hydrogels in Medicine and Pharmarcy, Vol. 1-III; Peppas, N.A. Ed; CRC Press: Boca Raton, FL, 1987]. 결합 영역은 공유 및 비공유 결합에의해 매트릭스에 부착될 수 있다[많은 리뷰와 책이 이 주제에 관하여 저술되었다; Tampion J. and Tampion M.D. Immobilized Cells: Principles and Applications Cambridge University Press: NY, 1987; Solid Phase Biochemistry: Analytical and Synthetic Aspects Scouten, W.H. Ed., John Wiley and Sons: NY, 1983; Methods in Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells, Pt. B Mosbach, K. Ed., Elsevier Applied Science: London, 1988; Methods in Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells, Pt. C Mosbach, K. Ed., Elsevier Applied Science: London, 1987; Methods in Enzymolgy, Immobilized Enzymes and Cells, Pt. C Mosbach, K. Ed., Elsevier Applied Science: London, 1987; Hydrogels in Medicine and Pharmacy]. 예를 들면, 단백질은 폴리아크릴아미드와 N-아크릴로일숙신이미드의 가교 연결된 공중합체에 단백질 용액의 처리에 의해 부착될 수 있다. 결합 영역은 또한, 중합화 또는 겔화하기 이전 단계에서 다공성 매트릭스로 통합될 수도 있다. 한 양태에서, 결합 영역은 많은 연결 화학물질에 의해 비가교연결된 중합체에 부착될 수도 있다. 그리고나서, 중합체는 가교연결된다(예를 들면, 아미드 결합, 디설피드, 에폭시드에의 친핵성 공격, 등을 포함하는 화학물질을 사용)[참고문헌; Pollack et. al., 1980. J. Am. Chem. Soc. 102(20):6324-36]. 결합 영역은 중합화 동안 중합체 체인으로 통합되는 단량체 족에 부착될 수도 있다[참고문헌; Adalsteinsson, O., 1979, J. Mol. Catal. 6(3):199-225]. 또다른 양태에서, 결합 영역은 중합화/겔화 동안에 구멍내 결합 영역을 트랩함에 의해, 또는 다공성 매트릭스 및/또는 필름 안으로 결합 영역을 투과시킴에 의해 겔 안으로 통합될 수 있다. 부가적으로, 결합 영역은 예를 들면, 소수성 및/또는 이온 상호작용에 의해 야기되는 비특이적 흡수에 의해 다공성 매트릭스(예; 중합체 겔 및 필름)의 표면 상으로 흡수될 수도 있다. 바이오틴은 유리하게도 연결제 또는 결합제로서 사용될 수도 있다. 아비딘, 스트렙타비딘 또는 기타 바이오틴 결합제는 결합 영역으로 통합될 수도 있다.
PMAMS는 다양한 구멍 크기 및 용매량을 지닌 다공성 물질(예; 겔)상에서 생성될 수 있다. 예를 들면, 구멍 크기에 있어서 다양한 폴리아크릴아미드 겔은 아크릴아미드의 농도 및 가교 정도를 변화시킴에 의해서 만들어질 수 있다.
분석물 보다 작은 크기의 구멍을 가진 PMAMS 상에서, 결합 반응은 겔 표면 상에서 실질적으로 일어날 것이다. 이런 경우에, 겔을 통한 여과 및/또는 전기영동은 겔 표면에서의 분석물을 농축시키고 결합 반응의 카이네틱스(예; 속도 증가)를 조절하는데 사용될 수 있다. 보다 빠른 카이네틱스가 빠른 분석법(예; 결과까지 짧은 시간)에서 유리하며, 더 짧은 시간동안 증가된 민감도를 발생시킬 수 있다.
분석물보다 큰 크기의 구멍을 지닌 PMAMS 상에서, 결합 반응은 겔의 벌크내에서 뿐만 아니라 표면 상에서도 일어날 수 있다. 이런 경우에, 여과가 사용될 수 있으며, 또는 전기 영동이 결합 카이네틱스를 증가시키고 표면으로부터 비결합된 족을 제거하고자 사용될 수 있다.
겔상에서 형성된 PMAMS는 습하게 저장될 수 있으며, 또는 그들은 건조된 상태로 저장될 수도 있으며 분석동안 재구성될 수도 있다. ECL 분석을 위해 필요한 시약은 저장되기 이전에 겔 내에서 통합될 수 있으며(겔 안으로 투과 또는 겔 형성동안 통합에 의해), 또는 그들은 분석 동안 첨가될 수도 있다.
PMAMS의 유형화된 결합 영역은 매트릭스내의 각 결합 영역을 액체유형으로 함유하는 드롭(drop) 또는 미세드롭(microdrop)을 기질에 적용시킴으로써 생겨날 수도 있다. 그리고나서, 고체화 및/또는 액체의 겔화는 공지된 다양한 기술(중합화, 가교화, 겔 변환 이하로의 냉각, 열)에 의해 일어날 수 있다. 고체화 또는 겔화를 일으키는 약제가 조제 후 일정 시간에 드롭을 겔을 고체화 및/또는 겔화하기 위해, 드롭내에 함유될 수도 있다. 후속 처리(예컨대; 광에의 노출, 방사 및/또는 레독스 전위차계)가 고체화 및/또는 겔화를 야기하기 위해 사용될 수도 있다. 다른 양태에서, 상기 드롭 또는 미세드롭은 슬러리, 선-중합 복합체, 고형 그룹, 및/또는 실질적 고체 드롭일 수 있다. 부가적으로, 증기상 침착이 활용될 수도 있다.
또한, 유형화는 하나 이상의 결합 영역을 함유하는 각 매트릭스의 층 구조를 형성함에 의해 달성될 수도 있다. 예를 들면, 항체에 연결된 아가로스(표준 화학 물질에 의해)를 컨테이너에 부어 냉각에 의해 겔을 만들 수 있다. 이후, 다른 항체를 포함하는 후속 층을 첫째 층상에 부어 겔이 되도록 한다. 이러한 층 구조의 횡단면은 다수의 뚜렷한 결합 영역이 존재하는 연속 표면을 제공한다. 상기 횡단면은 축적될 수 있으며, 또 다른 횡단면은 결합 영역의 밀도보다 훨씬 큰 PMAMS 표면을 만들도록 잘릴 수 있다. 대안적으로, 주어진 결합 성분을 함유하는 매트릭스의 라인은 또 다른 매트릭스에 근접하게 축적된다. 상기 구조는 또한 횡단면내에서 잘려질 수도 있으며 PMAMS 표면으로 활용될 수도 있다.
또한, 유형화는 분리를 얻기 위해 일부 매트릭스의 능력을 유리하게 취함으로써 달성될 수도 있다. 예를 들면, 핵산 탐침의 혼합물은 다수의 뚜렷한 결합 영역이 존재하는 표면을 만드는 폴리아크릴아미드 슬랩내에서 전기영동에 의해 분리될 수 있다.
미세유체 가이드는 또한, 지지체 상에 PMAMS 결합 영역을 제조하기 위해 사용될 수도 있다. 미세유체 가이드의 부분적 목록은 공동(空洞)의 모세관, 매트릭스(예; 다공성 또는 용매 팽창 매질)로 만들어지거나 충진된 모세관, 또는 얇은 필름을 지지할 수 있는 고체 지지체 또는 액체 드롭을 포함한다. 모세관은 고체일 수 있으며, 시약은 모세관의 외부 표면을 따라서 흐르며, 시약 유체 저장고는 PMAMS 표면과 접촉하는 다공성 매트릭스 팁에 노출될 수 있다. 예를 들면, 시약 저장고는 다수 시간동안 주어진 다공성 매트릭스 팁이 재생산적으로 시약(예; 단일 층을 형성하는 알칸 티올 및/또는 결합제 등)을 침착할 수 있도록 연속적으로 또는 주기적으로 재충진될 수 있다. 부가적으로, 팀내 다양한 다공성은 시약이 표면을 흐르는 것을 조절하는데 활용될 수 있다. 상이하거나 동일한 결합제는 다수의 모세관에 존재할 수도 있으며, 또는 다 뚜렷한 결합제는 주어진 모세관에 존재할 수 있다. 모세관은 PMAMS(예; 유형화된 SAM)와 접촉하여 일정 영역이 분리된 결합 영역을 만들도록 결합제에 노출된다. 상이한 미세유체 가이드내에 존재하는 각 상이한 결합제는 유체 가이드 배열로부터 바람직하게 금속 표면, SAM 등 위로 동시적으로 전달된다. 미세유체 가이드는 또한, 지지 표면에 적용하기 이전에 바람직한 분자를 지닌 미세스탬프를 잉크하는데 사용될 수도 있다. 예를 들면, 개별적인 미세유체 가이드는 지지체의 표면에의 흡수를 촉진하는 부분에 연결된 상이한 결합제에 적용되어(예; 탄화수소 연결부상의 자유 티올은 금에의 흡수를 촉진), PMAMS를 형성할 수도 있다. 이리하여, 예를 들면, 자유 티올과 함께 연결부로 통합되는 상이한 특이성의 항체를 지닌 미세유체 가이드의 사용을 통해 잉크된 미세스탬프는, 금 표면 상의 바람직한 지역내에 상기 항체를 적용하는데 사용되어 PMAMS의 분리된 결합 영역을 형성할 수 있다.
유형화된 유체 전달의 또다른 접근은 작은 오리피스를 통한 드롭의 분사에 의해 유체의 미세드롭을 전달하는 마이크로프린팅 장치의 사용을 수반한다(예; 잉크-젯 프린터). 이들 장치내에서 드롭의 분사는 가열, 정전기 전하 및/또는 피에조(piezo) 장치로부터의 압력을 포함하는 상이한 기작에 의해 야기될 수 있다. 하나 이상의 액체 유형은 다수 오리피스 및/또는 하나의 오리피스 및 적절한 밸브의 사용을 통해 수행될 수 있다.
PMAMS의 제조를 위한 한 가지 방법에서, 미세유체 가이드는 표면 상의 분리성 영역 상으로 분리된 결합 영역을 형성하는 바람직한 결합제를 함유하는 드롭을 직접 전달하는데 사용된다. 결합제는 적용되는 표면 상의 화학 그룹과 결합을 형성하는 작용적 화학 그룹을 함유할 수 있다. 또 다른 변형에서, 드롭내 결합제는 표면에 비특이적으로 흡수되거나 결합될 수 있다(예; 표면 상으로 건조).
대안적으로 표면 상에 침착된 드롭(들)은 매트릭스를 형성할 수 있는 시약을 함유한다. 이 매트릭스는 고체, 중합체 또는 겔일 수 있다. 매트릭스의 형성은 용매의 증발에 의할 수 있다. 이는 단량체 족의 중합화에 의할 수 있다. 이는 미리 형성된 중합체의 가교에 의할 수 있다. 이는 온도 조절(예; 냉각 및/또는 가열)에의할 수 있다. 이는 다른 방법에 의할 수 있다. 예를들면, 중합체 족은 냉각 전환을 통해 또는 겔화를 야기화는 시약의 첨가에 의해 냉각될 수 있다. 고체 매트릭스의 형성은 전극에서의 반응족의 생성에 의해(기질 포함), 광에 의해 (또는 다른 방사), 고체화 또는 겔화를 유도하는 시약의 첨가에 의해, 냉각 또는 가열에 의해 유도될 수 있다. 부가적으로, 표면은 매트릭스 형성을 개시(예; 겔화 또는 중합화)할 수 있는 촉매를 포함할 수 있다.
바람직한 기술에 있어서, 적용되는 유체 또는 겔의 발산을 방해하는 유형화된 친수성/소수성 영역이 사용될 수 있다. 상기 유체 또는 겔은 PMAMS의 결합 영역을 형성하는 지지체 상의 표면에 연결되는 결합제를 함유할 수 있다. 이 경우에, 상기 친수성/소수성 경계의 사용은 만들어진 결합 영역을 분리성 지역으로 봉쇄하는데 도움을 준다. 대안적으로, 유체는 표면 상에 매트릭스를 형성할 수 있는 시약을 함유하며 결합제는 표면 상에 침착될때 제한 영역내에 함유된다. 예를 들면, 친수성/소수성 경계 보조제은 제한 영역으로 드롭을 봉쇄하는데 활용될 수 있다. 부가적으로, 친수성 또는 소수성 지역은 매트릭스로 통합(예; 공유 또는 비-공유 결합)될 수 있는 그룹에 존재할 수 있어서, 매트릭스의 기질로의 보다 안정한 접착을 가능케한다[참고문헌; Itaya and Bard, 1978, Anal. Chem. 50(11):1487-1489]. 또 다른 기술에서, 적용되는 유체 또는 겔은 해당 분석물을 함유한 샘플이며, 샘플은 제조된 PMAMS로 적용된다. 하나의 바람직한 양태에서, 친수성 용액을 함유하는 모세관은 용액을 분리성 지역 상으로 침착하는데 사용되어, 소수성 영역에 의해 둘러싸인 친수성 영역을 만들 수 있다. 대안적으로, 친수성 영역에 의해 둘러싸인 소수성 결합 영역이 결합제 또는 분석물(들)을 함유하는 소수성 유체와 함께 사용될 수 있다. 소수성 및 친수성은 적용되는 샘플에서 서로서로에 대한 상대적 용어로서, 즉, 결합 영역에 적용되는 유체 또는 겔 샘플의 방사 또는 습윤이 조절된다. 추가로, 미세유체 배열로부터 조절되는 용액 침착은 표면 특징(예, 표면 상의 웰 또는 채널)을 사용하여 달성될 수 있다. 미세유체 가이드는 카세트내에 함유될 수 있거나, 보다 바람직하게는, 사용 이전에 특이적 시약을 지지체에 적용하는데 사용될 수 있다.
하나 이상의 연결 화학물질이 동일 지지 표면에 적용될 수 있으며, 또는 친수성 및 소수성 결합 영역을 지닌 표면이 다 스탬프를 사용하여 만들어질 수 있다.
예를 들면, 친수성 결합 영역이 1번 위치에서 바람직하고 소수성 결합 영역이 2번 위치에서 바람직한 지역은 다음과 같이 제조될 수 있다. 제 1 친수성 스탬프는 1번 위치에서 디스크 및 2번 위치에서 보다 넓은 링을 가지도록 만들어진다. 제 2 소수성 스탬프는 스탬프 1에 의해 남겨진 링 단일층 내측에 들어맞는 2번 위치에서 디스크를 지니도록 만들어진다. 마지막으로, 표면은 단일층 성분의 소수성 용액으로 세척된다.
특히, PMAMS는 마이크로-접촉 프린팅, 즉, 스탬핑에 의해 만들어진다. 이렇게 적용되는 단일층은 표면-결합 그룹, 예, 금 표면으로 이루어지며, 알칸(예; (CH2)n) 스페이서를 지닌 티올이 바람직하다. 스페이서 그룹은 연결 그룹 A에 연결된다(바람직하게는 공유 결합). "A"는 예를 들면, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 바이오틴 또는 파트너 "B"에 상보적으로 결합가능한 임의의 적절한 결합제일 수 있다. A:B 연결은 공유 또는 비-공유일 수 있으며, 이용될 수 있는 당업계에서 공지된 일부 연결 화학물질이 문헌에 개시되어있다[참고문헌; Bard et al., 미국 특허 Nos. 5,221,605 및 5,310,687]. "B"는 항체, 항원, 핵산, 시험되는 샘플내에서 해당 하나 이상의 분석물에 결합할 수 있는 결합 영역을 형성하기에 적절한 기타 약학적 물질과 같은 결합제에 추가로 연결된다. B는 또한, ECL TAG 또는 표지에도 연결될 수 있다. 연결 그룹 B는 단일층 "A" 연결 상에 상이한 결합 표면 특이성을 지닌 다수의 "B" 시약을 위치할 수 있는 모세관 또는 미세유체 가이드 배열(도 5a-5C)의 수단에 의해 SAM에 전달될 수 있다. 또한, A 및 B는 단일층에 결합하기 이전에 연결될 수도 있다. 도 5a에서 논의될 바와 같이, 결합 영역과 독립적인 모양은, 상이한 결합 특이성이 하나의 지지체(600)상에 존재할 수 있음을 나타내기 위한 기하학 모양(602)으로서, 단지 예시의 목적으로만 제시된다. 도 5b는 미세유체 가이드(예; 모세관) 배열(606)의 윗면도를 나타낸다. 도트(610)는 횡단면에서의 가이드이다. 도 5c는 미세유체 가이드 배열(608)의 측면도를 제공한다. 꼭대기 및 바닥으로부터 출현하는 라인은 개별적인 미세유체 가이드(610)이다. 하측면상의 기하학 모양(610)은 개별적인 모세관으로부터 결합제의 전달시 형성된 특이적 결합 영역을 나타낸다.
예에 의하면, 첫째 스탬핑 후에, 층이 없는 맨 표면(예; 금) 영역은 연결 화학물질 A와 연결되지 않으며 또한 첫째 단일층의 소수성/친수성과 반대되는, 이차 알칸 티올과 반응할 수 있다. 이러한 방식에서, 특이적 연결 부위는 표면 상에 제조된다.
하나의 해당 분석물에 특이적인 결합제는 각각의 결합 영역에 사용될 수 있으며, 또는 결합제는 다수의 해당 분석물에 특이적으로 결합하는데 사용될 수 있다.
또 다른 변환에서, 지지 표면은 상기 도 5a 에서 도시된 상이한 연결 화학 물질 및/또는 결합부를 가지는 물질(예; 결합제, ECL 표지, SAM) 에 의해 수 회 스탬프될 수 있다.
유형화된 결합제는 덜 안정하고 견고한 결합 그룹에 나중 연결되는 안정하거나 견고한 화학 그룹(예; 처해진 조건에서 생존하는)일 수 있다. 다 결합 연결은 PMAMS 표면을 제조하는 과정의 각 단계 조건을 최적화하거나 PMAMS 표면의 제조를 단순화하기 위하여 활용될 수 있다. 예를 들면, 첫째 PMAMS 표면은 일반적인 방식으로 제조되며, 이후 상이한 PMAMS 표면을 만들기 위하여 변형된다. 또 다른 예에서, 일반적인 PMAMS 표면은 PMAMS 표면 상의 특정 영역(예; 결합 영역)과 직접 결합하는 결합 영역을 스스로 함유하는 결합제의 혼합 용액과 반응할 수 있다. 예를 들면, 상이한 올리고(핵산) 서열을 제시하는 각 결합 영역 유형은 표면에 연결된다. 이후, 이 표면은 이차 결합제의 혼합물을 함유하는 용액으로 처리되고, 각각은 표면 상의 서열에 상보적인 올리고(핵산) 서열에 연결된다. 이러한 방식에서, 이들 이차 결합 요소의 유형이 달성될 수 있다. 바람직하게는, 올리고(핵산) 서열은 6-30머의 DNA이다. 6-30머 세트는 실질적으로 유사한 상보적 서열을 함유함으로써, 하이브리드화를 위한 대략 결합 상수가 주어진 세트내에서 유사하고, 덜 상보적인서열로부터 구별할 수 있을 정도로 상이하도록 할 수 있다. 또 다른 양태에서, 이차 결합 요소는 단백질(예를 들면, 항체)이다.
섹션 5.13에서 기술된 표면 상에서 적용된 시약 또는 샘플을 습하게 하거나 퍼지도록 하는 것을 방해하는 것으로 기술된 방법은 또한, PMAMS의 제조(및/또는 샘플 적용에서)에서 사용될 수도 있다. 적용된 전위(예; 전극/역전극 쌍으로부터)는 시약 및/또는 샘플의 침착 및/또는 퍼짐을 조절하는데 추가로 사용될 수도 있다[참고문헌; Abbott et al., 1994, Langmuir 10(5):1493-1497].
PMAMS 결합제는 탄소를 함유하는 물질상에 위치할 수 있다. 또한, 그들은 개별적인 탄소 피브릴에 위치할 수도 있거나, 또는 PMAMS 결합제는 하나 이상의 피브릴의 집합체상에 위치할 수도 있다. 많은 양태에서, PMAMS 결합제는 하나 이상의 피브릴의 현탁액, 피브릴의 분산액, 피브릴과 다른 물질의 혼합액 및 이들의 조합물상에 위치할 수도 있다.
PMAMS 결합제는 지지체 상에 또는 안에 또는 근접하게 위치된 다수의 개별 피브릴 및/또는 피브릴의 집합체상에 위치할 수 있다. 한 예에서, 결합제는 분산된 개별 피브릴 또는 피브릴 집합체상에 위치한다. 이들 피브릴 또는 피브릴의 집합체는 지지체 상의 뚜렷한 부위로 공간상 위치될 수 있으며, 본 출원에서 한정되는 결합 영역을 구성할 수 있다.
또 다른 예에서, 개별 상기 결합 영역 또는 다수의 상기 결합 영역은 지지체의 공간적으로 뚜렷한 영역에 위치한다. 비-제한적 예에 의해, 개별 상기 결합 영역 또는 집합적 결합 영역은 지지체내의 함몰, 구덩이 및/또는 홀에 위치할 수 있다. 또 다른 예에서, 개별 결합 영역 또는 다수 부위는 지지체의 표면 상에 위치한 물 드롭, 겔, 탄성체, 플라스틱, 오일 등에 위치할 수 있다. 또 다른 예에서, 개별 결합 영역은 상이한 결합제 및/또는 결합제/피브릴 앙상블을 위한 상이한 결합 친화도를 가진 코팅(유형화될 수 있다)에 의해 지지체 상에 위치할 수 있다.
결합 영역은 다수의 개별 피브릴 상에 바람직하게 위치되며 또는 피브릴 집합체는 하나 이상의 미세유체 가이드(예; 모세관)에 의해 지지체 상에서 제조될 수 있다. 상이하거나 동일한 결합제는 다수의 미세유체 가이드 내에 또는 위에 존재할 수 있으며, 또는 다수 뚜렷한 결합제는 주어진 미세유체 가이드 내에 또는 위에 존재할 수 있다. 모세관은 지지체(스포팅)와 접촉하도록 할 수 있으며, 또는 미세유체 가이드 및/또는 표면이 서로에 상대적으로 스캐닝되거나 번역될때(즉, 글쓰기의 펜과 같은 방법) 시약을 전달할 수 있다. 미세유체 가이드는 피브릴 상에 위치한 결합제를 지지체로 전달하여, 지지체의 일정 영역이 피브릴-결합제 복합체에 노출되어 분리된 결합 영역(들)를 형성할 수 있도록 할 수 있다. 바람직한 일면에서, 상이한 미세유체 가이드내에 존재하는 각 결합제는 가이드 배열로부터 지지체로 동시적으로 전달된다. 한 예에서, 결합제 및/또는 결합제가 위치하는 피브릴은 지지체의 표면과 결합(예; 공유 또는 비공유 상호작용)을 형성하는 화학 작용기와 함께 유도된다. 일부 양태에서는, 결합제과 피브릴은 표면에 비-특이적으로 결합되거나 흡수된다. 또 다른 양태에서, 피브릴상에 위치한 결합제는 지지체의 표면내의 함몰, 구덩이 및/또는 홀로 전달될 수 있다. 또 다른 예에서, 결합제는 어떤 결합제 또는 결합제/피브릴 앙상블에 강 또는 약 결합 친화도를 가진 물질로 코팅되는 표면으로 전달되며, 이리하여 다른 결합제로부터 공간적으로 뚜렷하게 위치되는 시약의 부위를 만들어낸다.
결합제는 자기성인 하나 이상의 개별적인 피브릴 또는 피브릴들의 집합체상에 위치한다. 이런 경우에 있어서, 자기성 지지체는 자기성 피브릴상에 위치한 결합제를 지지체로 끌어당길 수 있다.
지지체는 자기성인 여러 개의 별개 영역을 함유할 수 있으며, 비자기성 영역에 의해 둘러싸인다. 자기성 피브릴상에 위치한 결합제는 지지체의 자기성 영역에 위치할 수 있다. 한 예에서, 지지체는 자기성인 하나 이상의 뚜렷한 영역을 함유할 수 있으며, 비자기성 영역에 의해 둘러싸이며, 자기성 영역내에서 자기장의 세기는 변조 또는 전환될 수 있다. 이러한 면에서, 상기 변조되거나 전환되는 자기장의 사용은 지지 표면으로부터 피브릴 상에 위치한 결합제를 붙이거나 풀어주는데 도움을 주며, 따라서 상기 부위를 휘젓거나 혼합하도록 역할한다.
넓게는 2 내지 108개의 결합 영역이 있으며, 바람직하게는 25 내지 500 개의 결합 영역이 있다.
결합 영역은 작동 전극 및/또는 역전극 상에 위치할 수 있다.
상이한 유형의 PMAMS, 지지체 및 전극 및 이의 구조(배열)를 위해 본원에서 기술되는 상이한 양태는, 또한 서로 조합하여 실행될 수도 있다.
PMAMS 지지체는 나중 사용을 위해 보존될 수 있다(예; 보호 표면 코팅, 표면 건조, 진공 또는 불활성 대기하에서의 견고한 패키지, 냉각 및 관련 방법을 통해).
5.2. 결합제
본 발명의 결합 영역은 적어도 하나의 해당 분석물(리간드)에 특이적으로 결합할 수 있는 결합제를 함유하도록 제조된다. 분리된 결합 영역내 결합제는 결합 영역이 바람직한 결합 특이성을 가지도록 선택된다. 결합제는 해당 분석물에 특이적으로 결합할 수 있거나 추정적으로 결합할 수 있는, 당업계에 공지된 임의의 화합물 중에서 선택된다. 해당 분석물은 섹션 5.10 "수행될 수 있는 ECL 분석"에서 기술되는 것들로부터 선택될 수 있다. 이리하여, 결합제는 수용체, 수용체에 대한 리간드, 항체 또는 이의 결합 부분(예; Fab, (Fab)'2), 단백질 또는 이의 단편, 핵산, 올리고핵산, 당단백질, 다당류, 항원, 에피톱, 세포 및 세포내 기관, 하위세포 입자, 탄수화물 부분, 효소, 효소 기질, 렉틴, 단백질 A, 단백질 G, 유기 화합물, 유기금속 화합물, 바이러스, 프리온, 비로이드, 지질, 지방산, 지질다당류, 펩타이드, 세포내 대사물, 호르몬, 약학제, 진정제, 최면제, 알칼로이드, 스테로이드, 비타민, 아미노산, 당, 비생물학적 중합체, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 중합체 수지와 같은 유기 연결 화합물, 지질단백질, 사이토카인, 림포카인, 호르몬, 합성 중합체, 유기 및 무기 분자 등을 포함하나, 여기에 한정되지는 않는다. 핵산 및 올리고핵산은 DNA, RNA 및/또는 올리고핵산 유사체를 언급할 수 있으며, 이중, 올리고핵산 유사체는 변형된 염기 또는 변형된 당을 함유하는 올리고핵산, 포스포디에스테르 연결이 아닌 다른 골격 화학물질을 함유한 올리고핵산[참고문헌; Nielsen, P. E. (1995) Annu Rev. Biophys. Biomcl. Street. 24 167-183], 및/또는 부속물을형성하는데(공유 또는 비-공유) 사용될 수 있는 화학 그룹을 제시하도록 합성 또는 변형된 올리고핵산(여기에서, 우리는 핵산 또는 올리고(핵산)을 두 개 이상의 핵산 염기 및/또는 핵산 염기의 유도체를 함유한 것으로 정의한다.)을 포함하나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 PMAMS는 다른 결합 영역내 함유된 결합제과는 서로 동일하고 다른 결합제를 함유하는 적어도 하나의 결합 영역을 포함하는 다수의 분리된 결합 영역을 가짐으로써, 상이한 결합 영역에 의해 해당 상이한 분석물의 결합을 제공할 수 있다. 실시예에 의하면, 상기 PMAMS는 갑상선 자극 호르몬(TSH)에 대한 항체를 포함하는 결합 영역, C형 감염 바이러스(HCV)와 하이브리드할 수 있는 올리고핵산을 함유하는 결합 영역, HIV와 하이브리드할 수 있는 올리고핵산을 함유하는 결합 영역, HIV 단백질 또는 당단백질에 대한 항체를 포함하는 결합 영역, 전립선 특이성 항원(PSA)에 대한 항체를 포함하는 결합 영역, 및 B형 감염 바이러스(HBV) 에 대한 항체를 포함하는 결합 영역, 또는 전술한 것들의 임의의 하위세트를 포함한다.
PMAMS는 하나의 결합 영역이 해당 다수의 분석물에 결합할 수 있도록, 결합 특이성이 다른 결합제내에 함유되는 적어도 하나의 결합 영역을 포함하는 다수의 분리된 결합 영역을 가질 수 있다. 실시예에 의하면, 상기 PMAMS는 T 세포 항원 수용체에 대한 항체와 CD4와 같은 T 세포 표면 항원에 대한 항체 모두를 함유하는 결합 영역을 포함할 수 있다.
PMAMS는 (i) 다른 결합 영역내 함유된 적어도 하나의 결합제로부터 특이성면에서 서로 다른 결합제 및 서로 동일한 결합제를 함유하는 적어도 하나의 결합 영역; (ii) 결합 특이성면에서 서로 다른 결합제를 함유하는 적어도 하나의 결합 영역으로 이루어진 다수의 분리된 결합 영역을 가질 수 있다. 실시예에 의하면, PMAMS는 (a) 하나의 동일성의 결합제(예; T 세포 항원 수용체에 대한 항체, 예, α, β T 세포 항원 수용체 또는
Figure pct00001
, δ T 세포 항원 수용체)을 함유하는 적어도 하나의 결합 영역이 상기 T 세포 항원 수용체를 발현하는 모든 세포로 결합하도록 하는 것; (b) 두 개의 상이한 결합제(예; T 세포 항원 수용체에 대한 항체 및 CD4에 대한 항체)을 함유하는 적어도 하나의 결합 영역을 T 세포 항원 수용체(즉, T 림프구의 하위군)를 발현하는 CD4+T 림프구에 결합시키는 것으로 만들어진다.
또 다른 양태에서, 적어도 하나의 결합 영역은 상이한 분자이지만 동일 결합 특이성(예; 피하 성장 인자 및 피하 성장 인자 수용체에 대한 항체와 같은 결합제)을 가진 결합제를 함유한다.
다수의 결합제는 비록, 결합제가 다르고 상이한 결합 특이성을 가짐에도 불구하고 그들이 동일 분석물을 인식하도록 선택될 수 있다(대안적인 양태에서, 상이한 분석물이 인식된다). 예를 들면, 분석물이 수많은 결합부를 가진 분석물(예; 상이한 세포 표면 항원을 가지는 세포)인 경우, 상이한 결합부에 결합하는 상이한 결합제들은 동일한 분석물을 인식할 것이다. 다른 예로서, 하나의 세포상의 상이한 세포 표면 항원에 대한 항체들은 동일한 세포를 인식할 것이다. 또 다른 예로서, 하나의 항원의 서로 다른 에피톱에 대한 항체들은 그 항원을 인식하는 결합제로서 사용될 것이다.
추가 양태에서, 하나의 해당 분석물에 특이적으로 결합하는 오직 결합제(들)은 하나 이상의 결합 영역내에 존재한다. 대안적으로, 해당 하나 이상의 분석물에 특이적으로 결합하는 결합제들은 하나 이상의 결합 영역(예; 가교-반응 항체)내에 존재한다. 특별한 고안에 있어서, 결합제는 분석물, 예컨대, 유사한 특징을 가지는 부류에 결합하는데 사용될 수 있다.
또한, 결합 영역은 바람직한 표준 분석물을 위해 특이적이고, 내부 표준(예; 결합제가 결합하는 분석물을 한정된 양으로 함유하는 샘플과 접촉될 수 있는 결합 영역)으로 활용되는 결합제를 함유하는 PMAMS 내로 통합될 수도 있다. 또한, 동일 분석물(들)에 특이적인 결합제를 함유하는 다수 결합 영역은 PMAMS내로 통합됨으로써, 분석 결과의 통계 평균을 가능케 할 수 있다. 결합제는 동일 분석물에 특이적일 뿐만 아니라, 동일할 수 있으며, 이리하여 분석물 상의 동일 결합부를 인식할 수 있다. 따라서, 다수 결합 영역(예; 2 내지 108범위내)는 동일 결합부에 특이적으로 결합하도록 제조될 수 있으며, ECL 판독이 분산을 조절하고 정확도를 개선시키고자 통계적으로 평균화된다. PMAMS상의 다수의 결합 영역은 하나의 지지체 상의 분석물, 해당 분석물, 또는 모두를 조절하기 위해 특이적일 수 있다.
또 다른 예로서, 하나 이상의 분리된 결합 영역은 ECL 표지의 공지된 초기 농도수로 제조될 수 있다. 짜맞춘 ECL 층은 예컨대, 표지 분해 및 온도 효과를 모니터하는 컨트롤로서 역할한다.
결합제는 기질에 특이적인 효소로 사용될 수 있으며, 기질에 대한 효소반응의 생성물은 리포터 약제(검출가능한 약제), 예컨대, ECL 반응을 개시하는 생성물, 형광 분자, 적절한 효소와의 접촉에 의존하여 색이 변하는 물질(예; 호스라디쉬 퍼옥시다아제에 대한 색원성 물질) 등이다. 상기 양태의 한 예에서, 결합제로 사용되는 효소는 글루코스 디하이드로제나아제(GDH)로서, 샘플내 글루코스를 검출하거나 측정하는데 사용될 수 있다. ECL 표지는 GDH를 함유하는 결합 영역 내에 또는 근처에 설정된다. NADH는 글루코스에 대한 효소 작용에 의해 생성되며, NADH는 ECL를 촉진하는 ECL 표지와 함께 반응할 수 있다[참고문헌; Martin et al., 1993, Anal. Chim. Acta 281:475].
주변 결합을 증가시키는(즉, 샘플내에서 해당 분석물 및 기타 분석물에 존재하는 결합부에 결합하는) 결합제를 함유하는 결합 영역이 전기화학발광성을 검출 또는 측정하는 동안 시그널 대 잡음 비율을 증가시키는데 사용될 수 있다. 실시예에 의하면, 해당 분석물이 특수한 세포 하위군(예; CD4+세포)이고 샘플이 환자로부터 얻은 세포를 함유하는 유체 샘플(예; 혈액)인 경우, 시알산에 대한 항체는 샘플내 실질적인 모든 세포로의 주변 결합을 증가시키는 결합제로서 사용될 수 있으며, 세포내 하위군(예; CD4에 대한 항체)에 특이적인 세포 표면 항원에 대한 항체는 결합제로서(동일 또는 상이한 결합 영역에서 시알산에 대한 항체를 함유하는 것으로서)사용될 수 있다.
5.3. 전압 파형
ECL 전지의 다수의 전극/역전극 쌍에 가해진 전압 파형(시간당 전기 전위의변화)은 ECL 반응을 개시하기에 충분하여야 한다. 이러한 전압 파형은 대개 일차 전압에서 개시하여, 이차 전압으로 이동하고, 다시 일차 전압을 경유하여 삼차 전압으로 이동하고, 이후 다시 일차 전압으로 되돌아가는 일정한 전압 스위프의 유형이다. 예를 들면, 파형은 일차 전압시 -0.5 내지 0.5 볼트의 범위에서 개시하여 1 내지 2.5 볼트의 범위의 이차전압으로 상승하며, 다시 일차 전압을 경유하여 0.0 내지 -1 볼트 범위의 삼차 전압으로 이동한다. 또 다른 예로서, 좀 더 단순한 파형에서, 전압은 0.0 부터 +3.5 까지 변경될 수 있다. 전압 파형은 선형 램프, 단계 기능, 및/또는 기타 기능을 통합시킬 수 있다. 전압 파형은 전압이 한 전위에서 고정된 채로 있을때 시간 범위를 통합시킬 수 있다. 적용된 전위는 하나 이상의 검정 전극에 상대적으로 조절될 수 있거나, 검정 전극이 하나도 사용되지 않을 수도 있다. 부가적으로, 음 전위가 사용될 수 있다. 이리하여, 본 발명의 카세트로부터 ECL 방출을 유도하는데 사용되는 전압은 최적 ECL 시그널 강도를 위해, 그리고 ECL 표지 및 분석 매질을 위한 특이성을 위해 쉽게 선택될 것이다.
몇몇 적용에서, 결합 영역으로부터 방출된 광이 측정됨에 따라, 전압은 바람직하게 변화된다. 이는 결합 영역이 광 방출을 야기하도록 하는데 필요한 전기장의 역치값을 결정하는데 특히 중요하다. 이러한 경우에, 결합 영역에 적용된 전기 전위는 광을 방출하는데 필요한 역치 이하로 여겨지는 값에서 개시하며, 일차 측정은 방출된 광으로 만들어진다. 광이 측정되지 않거나 광이 선결정된 역치 이하이면, 전극쌍을 통해 적용된 전기 전위는 컴퓨터 조절된 전압원과 같은 컴퓨터 조절하에 증가되며, 또 다른 광 측정이 이루어진다. 상기 과정은 선결정된 적절량의 광을 받을때가지 반복될 수 있다. 상기 방식에서, 적용된 전압은 분석 시그널로서 사용될 수 있다.
ECL 시그널은 전극쌍에 적용된 AC 전압으로부터 발생될 수 있다.
전압과 전류 세팅[참고문헌; 미국 특허 No. 5,324,457 및 5,068,088]에 익숙한 통상의 기술자는 ECL 방출을 개시하기 위한 최적의 작동 전압 및 전압 스위프를 쉽게 선택할 수 있을 것이다.
ECL를 발생시키는데 필요한 전위는, 작동 전극이 반도체이거나 광에 반응하여 전기 전류를 발생시키는 또 다른 부분을 함유하는 경우에, 작동 전극 표면의 투광에 의해 발생될 수 있다.
5.4. 애드레스할 수 있는 전극 및 이를 사용하기 위한 방법
다수의 전극/역전극 쌍을 애드레스하기 위해 수많은 방법들이 사용될 수 있다. 이러한 기술에 대한 몇가지 예가 도 14 내지 도 18에 도시되어 있다. 이들 도면에서는, 4가지 전극/역전극 쌍(101, 102, 103, 104) 및 전형적으로 디지탈 컴퓨터이며, 바람직하게는 검출 수단에 의해 검출된 ECL을 처리하기 위해 사용된 동일한 컴퓨터인 파형 발생기가 예로서 도시되어 있다.
도 14에서, 각 전극/역전극 쌍(101-104)은 파형 발생기에 접속된 라인 쌍에 의해 개별적으로 애드레스된다. 실시예에 의하면, 라인(105, 106)이 전극/역전극 쌍(101)에 접근한다. 적절한 파형은 주어진 시간에 파형 발생기에 의해서 다양한 전극/역전극 쌍에 접속된 하나 이상의 라인 쌍에 적용될 수 있다.
전극쌍에 애드레스하기에 필요한 접속 수를 감소시키고자, 도 14의 대안적인직 접속 도식이 제공된다. 예를 들면, 열-및-행 접근 도식은 일부 또는 전부의 전극을 전기적으로 에너지하기 위해 도 15에 도시되어 있다. 상기 도식에서, 다수의 전극/역전극 쌍의 각 행에서 전극(201,202) 중 하나는 지지체(200)상의 통상의 전기 전도체(205)에 접속되며, 다수의 전극/역전극 쌍의 각 열에서 역전극 중 각각은 지지체(200)상의 전도체(207, 208)에 접속된다. 전도체(205, 206)는 각각 지지체(200)의 가장자리에서 접속 C1, C2에 접속하며, 전도체 (207, 208)는 각각 접속 R1, R2에 접속한다. 이후, 이들 접속 각각은 분리 라인에 의해 파형 발생기로 접속된다. 그 결과, 도 15의 도시에서, 파형 발생기로부터의 필요한 접속 및 시그널 라인의 수가 8에서 4로 감소되었다.
각 전극 쌍의 빠르고 순차적인 에너지를 가능케하기 위하여, 컴퓨터 조절되는 스위치 장치가 유익하다. 도 16의 배열은 제 1 멀티플렉서(310)에 접속된 다수 전극을 나타낸다. 다수의 역전극은 제 2 멀티플렉서(320)에 접속된다. 제 1 멀티플렉서는 또한, 전형적으로 시간 변화성 전기 전위를 제공하는 전압원(330)의 제 1 극에도 접속된다. 제 2 멀티플렉서도 또한 전압원의 제 2 극에 접속된다. 멀티플렉서 각각에 전기적으로 접속되고 래치(34)에 접속되는 애드레스할 수 있는 라인 A0-A3을 사용하여, 컴퓨터 프로세서(350)는 전압원의 제 1 극으로 일부 또는 전부의 제 1 전극이 선택적으로 접속되고, 전압원의 제 2 극으로 일부 또는 전부의 제 2 전극이 접속되도록 멀티플렉서를 지시할 수 있다.
도 17에 도시된 바와 같이, 다수의 전압원은 각 전극의 멀티플렉서의 분리 세트를 통하여 접속된다. 제 1 전기 전위 또는 전기 전위의 범위가 특정 전극 쌍에서 요구된다면, 그 전위를 제공하는 전압원(430)과 결합된 멀티플렉서(410, 420)는 컴퓨터 프로세서에 의해, 전형적으로 래치(340)를 통해, 애드레스됨으로써, 특정 전압원을 문제의 전극 쌍으로 접속시킨다. 상이한 전기 전위 또는 전기 전위 범위가 또 다른 전극 쌍을 위해 요구된다면, 그 상이한 전압원(460)과 결합된 멀티플렉서(440, 450)는 컴퓨터 프로세서에 의해 애드레스됨으로써, 결합된 멀티플렉서(440, 450)를 통한 전압원을 전극 쌍에 접속시킬 수 있다.
양태에서 전극 배열이 도 14 또는 도 15에 도시된 독립적으로 유도할 수 있는 전극 쌍의 적어도 일부를 가진다면, 하나의 전극 쌍은 하나의 전압원에 의해 유도될 수 있는 반면에, 다른 전극 쌍은 다른 전압원으로 동시에 유도된다. 대안적으로, 도 17의 두 개의 전압원은 평행한 멀티플렉서의 양 세트에 접속된 하나의 전압원으로 대체될 수 있어서, 두 개의 전극 쌍이 동일 전압원으로부터 유도되는 것을 가능케한다.
도 17에 도시된 바와 같이 각 전압을 위해 멀티플렉서의 이중 세트 대신에, 도 18에 도시된 바와 같이 다수의 전압원(520, 530)이 제공될 수 있다. 이들 전압원은 컴퓨터 조절되는 전기 스위치(들)(510)를 통해 멀티플렉서(310,320)의 하나의 세트로 접속될 수 있다. 도 18에 도시된 바와 같이, 컴퓨터는 특정 전압원이 멀티플렉서로 접속하도록 스위치(510)를 지시하며, 또한 선택된 전압원이 바람직한 특정 전극 쌍으로 접속하도록 멀티플렉서를 지시(이들의 애드레스 라인 A0-A3 시그널에 의해)할 것이다.
대안적으로, 임의의 양태에서 전극 쌍 각각에 적용된 전기 전위는 변할 수있다. 이는 다수의 상이한 결합 영역을 가진 카세트가 사용될때 특히 유리하다. 상기 카세트는 상이한 결합 영역에서 상이한 범위의 적용된 전기 전위를 필요로 할 수 있다. 각 전극에 적용된 전기 전위의 변화가 가능한 여러 상이한 양태가 고려된다.
유리하게도, 컴퓨터 조절된 전압원이 사용될 수 있다. 컴퓨터 조절된 전압원은 공급된 특정 전기 전위를 선택하도록 컴퓨터에 의해 애드레스될 수 있는 것이다. 대안적으로, 이는 선결정된 시간에 걸쳐서 전기 전위의 특정 범위를 순차적으로 적용하도록 프로그래밍될 수 있다. 상기 시스템에서, 컴퓨터 및 전압에 전기적으로 접속된 애드레스 라인은 에너지화된 전극 쌍에 적용되는 특정 전기 전위를 생산하도록 컴퓨터가 전압원을 프로그램하는 것을 가능케 할 것이다.
다수의 전극 쌍을 애드레스하기 위한 부가적인 방법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 다수의 검정 전극을 전극 및 역전극 각각에 근접하게 위치시켜 이로부터 적용되는 전압을 감지토록 할 수 있다. 이런 방식에서, 전압 파형의 부가적 조절이 유지될 것이다.
도 36은 본 발명의 또 다른 양태를 도시한다: 전극 배열(3600, 3601)이 절연체(3604)(예를 들면, 펀치된 구멍(3605)을 지닌 플라스틱 시이트)내 갭 유형에 의해 분리된 두 개의 표면(3602, 3603) 각각에 지지된다. 각각의 전극은 다수의 갭을 통해 지날 수 있다. 전위가 각 표면 상의 하나의 전극 사이로 적용된다면, 전류는 양 전극과 접촉한 갭을 통해서만 흐를 것이며, 따라서 발생할 수 있는 임의의 전기화학 또는 ECL 위치를 제한할 것이다. 도면에 나타난 바람직한 양태에서,전극(3600, 3601)은 지지체 상에서 라인의 배열이다. 두 개의 표면 상의 두 세트의 전극은 서로 직각으로 위치한다. 절연 시이트 내 갭은 각 표면으로부터 전극의 교차에만 위치한다.
이러한 양태는 전기 리드가 덜 필요한 개별 애드레스된 전극 쌍에 걸쳐서 잇점을 가진다.
대안적인 양태에서, 절연체(3604)는 생략되며, 표면은 근접하게 위치하여, 협소한 갭이 두 개의 표면 사이에 존재하도록 한다. 상기 양태에서, 각 표면 상의 전극 사이에 적용된 전위는 전류가 바람직하게는 전극의 교차(즉, 전극 사이의 거리가 최소인 곳)에서 통과하도록 야기함으로써, 일어날 수 있는 임의의 전기화학 또는 ECL의 위치를 제한할 것이다.
5.5. 광 검출
개시된 ECL 방출에 의해 생성되는 광은 본 발명의 장치에 근접하게 위치하는 적절한 광 검출기(들)에 의해 검출된다. 광 검출기는, 예를 들면, 필름, 포토멀티플러 튜브, 포토다이오드, 애벌랜치 포토 다이오드, 전하 연결 장치("CCD") 또는 기타 광 검출기 또는 카메라일 수 있다. 광 검출기는 순차적인 방출을 검출하는 단순 검출기일 수 있거나, 한 지점에서 동시적 방출 또는 방출된 광의 다 파장을 검출하고 공간적으로 분해할 수 있는 복수 검출기일 수 있다. 방출되고 검출된 광은 가시광선일 수 있거나 적외선 또는 자외선과 같이 비-가시광선으로 방출될 수도 있다. 검출기(들)는 정적이거나 동적일 수 있다. 방출된 광 또는 기타 방사가 카세트의 결합 표면에 근접하게 위치된 렌즈, 유리 및 섬유광학 광 가이드 또는 광 전선(단순, 복합, 고정 또는 이동성)의 수단에 의해 검출기(들)로 전도될 수 있거나, 검출기가 직접 광을 받을 수도 있다. 게다가, 지지체, PMAMS 및 전극 표면 자신은 광의 전파를 가이드 또는 허용하도록 활용될 수 있다.
PMAMS는 각각의 검출기만이 하나의 결합 영역으로부터 광을 받도록 하기 위해 광 검출기의 배열 표면 상에 형성될 수 있다. 광 검출기의 배열은 CCD 칩일 수 있으며, 결합 영역은 반도체 장치의 표면으로 부착될 수 있다(표준 연결 화학기를 사용하여).
결합 영역 상에, 또는 제 2 표면 근처상에 침착된 드롭은 방출된 광을 지시 및 조절하기 위한 마이크로렌즈로 사용될 수 있다. 대안적으로, 광 검출기는 카세트의 정면에 직접 향할 수 있으며; 비유 반사기 또는 렌즈와 같은 다양한 광 포커스 장치는 광을 임의의 다수 결합 영역으로부터 검출기로 향하도록 광 전선 대신에 사용될 수 있다. 적어도 두 개의 분리된 결합 영역으로부터 방출된 광은 동시적으로 순차적으로 측정될 수 있다.
광 검출기 내 고유의 열 흐름, 장치의 노화, 또는 전기적 잡음에 기인한 오류가, 측정되는 광 검출 장치 및 결합 영역 사이의 "초퍼(chopper)"수단에 의해 조절될 수 있다. 초퍼는 광을 통과하도록 하는 슬롯 도는 컷아웃을 지닌 스핀 디스크와 같이 당업계에서 통상의 기술을 가진 이에게 공지된 통상의 기계적 초퍼일 수 있다. 대안적으로, 광은 LCD 셔터, LCD 셔터의 배열, 고체상 광 밸브(들) 등등에 의해 초핑될 수 있다. 대안적으로, 광학 컴퓨터의 기술내에 공지된 것들과 같은 LCD 셔터의 평면 배열 또는 고체상 밸브가 사용될 수 있다. 이러한 장치는 바람직하게는 카세트의 평면과 광을 결합 영역으로부터 광 검출기로 지시하는 광 전선(들) 또는 광 포커스 장치 사이에 위치된다. 한 양태에서, 셔터는 각 결합 영역 위에 위치한다. LCD 셔터 또는 광 밸브를 사용할때, 셔터는 상이한 빈도에서 변조되어 결합 영역을 방출하는 상이한 광을 위한 상이한 초핑된 속도를 제공할 수 있다. 이러한 기술을 이용하여, 다수의 상이한 광 시그널은 하나의 검출기에 의해 겹쳐지며 동시적으로 측정될 수 있다. 광 검출기로 전기적으로 접속된 필터를 통과하는 전기 밴드는 이후, 전기적 단일 시그널을 다수 개별 광 성분 중 하나에 각각 상응하는 여러 전기 성분으로 분리하는데 사용된다. 상기와 같이, 또는 당 업계에 공지된 다른 기작을 이용하여 광을 쵸핑함으로써, AC 광 파형은 DC 잡음 성분이 전기적으로 필터링되어 제거되도록 만들어진다.
또한 ECL 시그널은 시약 소모에 기인한 시그널 변조를 수정하기 위해서 사전에 측정된 결과를 표준 시약과 비교함으로써 검정할 수 있다.
5.6. ECL 시그널의 분석
주어진 결합 영역으로부터 발생한 시그널은 수치의 범위를 지닐 수 있고, 이러한 수치는 '아날로그' 시그널을 제공하는 양적인 측정과 상호 관련이 있다. 다른 기술에서 '디지탈' 시그널은 분석물이 존재하거나 존재하지 않는다는 것을 나타내는 각각의 부위로부터 수득된다.
통계적인 분석은 두 기술 모두에 사용되고, 특히 양적인 결과를 제공하기 위해서 다수의 디지탈 시그널을 번역하는 데에 유용하다. 그러나, 일부 분석물은 역치 농도를 나타내는 디지탈 존재/비존재 시그널을 요구한다. '아날로그' 및/또는 '디지탈' 포멧은 개별적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 다른 통계학적 방법은 PMAMS를 가지고 사용할 수 있다. 예를 들면, 표면상의 PMAMS의 농도 구배를 생성하는 것이 가능하다 (참고문헌 : Chaudhury et al., 1992, Science 256:1539-1541). 이러한 기술은 농도 구배에 대한 결합의 통계학적 분석을 통하여 농도를 측정하는 데에 사용된다. 농도 구배를 갖는 PMAMS의 다중 선형 배열은 상이한 특이 결합 시약의 다중성으로 생성할 수 있다. 농도 구배는 상이한 농도의 결합 시약을 제시하는 분리된 결합 영역로 이루어질 수 있다.
카세트 결합 표면의 통제 배열 시스템의 존재는 또한 시그널 변이(예를 들면, 분해에 기인한 변이, 파동, 카세트와 기타 성분의 노화, 열적 쉬프트, 전자 회로의 잡음, 및 광검출 장치의 잡음 등)에 대해 통제하기 위한 각각의 분석의 균일성을 보장하기 위해서 중요하다. 예를 들면, 동일한 분석물에 대해 다수의 여분의 결합 영역(동일한 결합 시약 또는 동일한 분석물에 특이적인 상이한 결합 시약을 함유)을 활용할 수 있다. 다른 실시예에서, 기지 농도의 분석물을 사용하거나 PMAMS의 통제 부위를 ECL 표지의 기지의 양에 결합시키거나 용액 중의 ECL 표지의 기지의 양을 사용한다.
본 발명에 따라 수행된 분석은 예를 들면 임상 또는 조사 정보의 수집물로 이루어진 데이터베이스의 형태로 저장될 수 있는 대량의 데이터를 수월하고 효율적으로 수집할 것이다. 수집된 데이터는 또한 신속한 법정 또는 개인적 신원확인에 사용할 수 있다. 예를 들면, 사람 DNA에 노출시 다수의 핵산 탐침의 용도는 임상 또는 조사 샘플을 증명하기 위해 수월하게 사용할 수 있는 DNA 핑거프린트로 사용할 수 있다.
5.7. 다중 전극 배열의 제조
전극은 광범위하게 폭 또는 직경으로 0.001 내지 10 mm일 수 있다. 바람직한 범위에서 전극 쌍은 크기(폭 또는 직경 또는 전극쌍의 입체에 따른 가장 광범위한 크기)로 0.01 내지 1 mm이다.
바람직하게는, 전극은 당분야에 익히 공지된 바와 같이 예를 들면 액정 진열물 등의 제조를 위한 투명한 금속 필름 또는 반도체(예를 들면, 각각 금 또는 인듐-틴 옥사이드)와 같은 적합한 도체 물질로부터 제작된다. 카세트의 조립된 형태에서, 예를 들면 얇은 필름 또는 가습된 표면과 같은 분석 샘플을 함유하기 위해서 제 1 지지체와 제 2 지지체 사이에 충분한 공간이 잔존한다.
전극은 탄소, 탄소 섬유, 탄소 나노튜브 및/또는 이들의 집합체를 함유하는 물질로부터 제조할 수 있다.
전극은 탄소 피브릴로부터 제조할 수 있다. 하나 이상의 개별적인 피브릴 및/또는 하나 이상의 피브릴의 집합체는 나아가서 더욱 대규모의 집합체를 형성할 수 있다 (미국 특허 제 5,124,075호).
이러한 더욱 대규모의 집합체는 피브릴이 얽히고 서로 짜여진 매트 또는 직물(이후 본원에서 "피브릴 매트"로 언급함)이다. 피브릴 매트는 전형적으로 50 내지 400 M2/g의 표면적을 갖는다.
실시예에 의해서, 피브릴 매트를 분석적 및/또는 제조 전기화학에서 작동 전극, 역전극 또는 검정 전극으로 사용할 수 있다. 하나의 실시예에서, 피브릴 매트를 전기화학발광(ECL)을 위한 전극으로서 사용한다.
PMAMS의 결합 영역를 피브릴 매트에 의해서 지지할 수 있다. 본 발명의 PMAMS는 둘 이상이 서로 동일할 수 있거나 상이할 수 있는 다수의 분리된 결합 영역를 갖는다. 피브릴 매트는 하나 이상의 결합 영역를 지지한다.
하나 이상의 미세유체 가이드는 피브릴 매트 상의 다수의 결합 영역를 제조하기 위해서 사용할 수 있다. 상이하거나 동일한 결합 시약이 다수의 미세유체 가이드에 존재할 수 있고/거나 다수의 분리된 결합제가 미세유체 가이드에 존재할 수 있다.
도 22a와 22b에서, 바람직하게는 배열의 다수의 미세유체 가이드 2201을 분리된 결합 영역 2202를 형성하기 위해서 피브릴 매트 2200의 부위에, 바람직한 결합 시약을 함유하는 드롭에 바람직하게는 동시에 전하는 데에 사용한다. 결합 시약은 피브릴 매트에 존재하는 잔기와 결합을 형성한다. 결합 시약은 표면의 매트 또는 건조부위로 비-특이적으로 흡수할 수 있다.
흡입 여과가 매트에 적용되는 동안 바람직한 결합 시약을 피브릴 매트에 운반한다. 이러한 경우에, 흡입 여과는 매트 안으로 또는 매트를 통하여 어떤 결합 시약도 끌어 넣지 않거나 일부 또는 모든 결합 시약을 끌어 넣고, 그렇게 하여 유형화 과정 동안 매트 표면에의 결합 시약의 측면 분산의 양을 감소시킨다.
피브릴 매트는 현탁액이 통과하는 물질(예를 들면, 필터) 상의 탄소 피브릴의 현탁물을 압축함으로써 제조한다. 피브릴 매트를 형성하기 위해 사용할 수 있는필터의 예에는 필터지, 중합체(예를 들면, 나일론) 막으로부터 형성된 필터, 금속 미세망, 세라믹 필터, 유리 필터, 탄성중합체성 필터, 섬유유리 필터 및/또는 이러한 필터 물질의 둘 이상의 조합이 포함된다. 여과에 대한 당분야의 전문가는 이러한 물질이 고체의 현탁물의 여과에 적합한 다수의 가능한 물질의 단순한 예임을 인식할 것이다.
도 23a 와 23b는 피브릴 매트가 흡입 여과에 의해서 제조될 수 있는 양태를 도시한다. 탄소 피브릴 2301의 분산액 및/또는 현탁액을 임의로 필터 막 2303 및/또는 필터 지지체 2302로 구비된 필터 2300을 사용하여 여과한다. 현탁액을 진공원 2305에 의해 필터, 예를 들면 필터 플라스크 2306에 의해 적용된 흡입을 사용하여 여과한다. 피브릴 매트 2304는 필터 막 2303 및/또는 필터 지지체 2302에서 수집한다. 필터 막 2303을 갖거나 갖지 않는 피브릴 매트 2304를 필터로부터 제거할 수 있다.
다른 양태에서, 피브릴의 현탁액을 압력을 사용하여 필터를 통과하게 한다. 하나의 실시예에서, 피스톤으로 현탁액 상부의 공기 및/또는 액체의 제한된 층을 압축함으로써 피브릴의 제한된 현탁액 상에 압력을 가한다. 특정 실시예에서, 피브릴의 현탁액은 주사기내에 봉쇄되고, 피스톤은 주사기 플런저이고, 필터는 일회용 주사기 필터이다 (이러한 다수의 필터가 당분야의 전문가들에게 익히 공지되어 있다).
피브릴의 현탁액을 모세관 작용에 의해 필터를 통과하게 하거나 현탁액을 필터 안으로 또는 필터를 통하여 위킹함으로써 여과한다.
다른 양태에서, 개별적인 피브릴 또는 피브릴의 집합체는 공유적으로 가교결합하여 매트로 될 수 있다. 빛에 노출시 중합하는 광민감성 잔기로 유도된 피브릴은 빛으로 조사된다.
필터는 피브릴을 포어 내에 가두어 필터가 지지체로서 작용하는 복합체 매트를 형성하는 데에 사용할 수 있다. 도 24에서, 피브릴 매트 2400은 두개의 대규모의 롤러 2403 사이에, 원 2402에 의해 운반된 피브릴 2401의 슬러리를 통과함으로써 제조할 수 있다. 종이 또는 중합체 시트의 제조에서 발견된 방법과 유사할 수 있는 이러한 방법에서, 롤러는 현탁액으로부터 액체를 나오게하고 더 작은 매트로 절단 될 수 있는 피브릴의 대규모의 연속적인 매트가 생성된다.
피브릴 매트는 프리스탠딩(예를 들면, 비지지)하거나 지지할 수 있다.
여과율은 매트의 바람직한 성질을 이루기 위해서 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 변화시킬 수 있는 성질에는 구조의 균일성 또는 비-균일성, 피브릴 또는 피브릴 집합체의 엉김도, 두께, 매트의 다공성, 및/또는 이의 조합이 포함된다.
탄소 피브릴의 현탁액은 제한되고 피브릴이 현탁된 액체가 제거된다. 하나의 실시예에서, 피브릴이 현탁된 액체를 증발시키도록 한다. 다른 실시예에서, 액체를 가열함으로써 제거한다. 다른 실시예에서, 현탁액을 원심분리하도록 하고, 생성된 액체(예를 들면, 상층액)를 제거한다. 다른 실시예에서, 액체를 배출에 의해 제거한다.
현탁액을 상기에 기재된 하나 이상의 필터에 배치하고 현탁액을 증발에 의해 건조한다. 현탁액은 오븐에서 가열 또는 베이킹함으로써 건조할 수 있거나 액체는액체를 냉동하고 추출함으로써 제거할 수 있다. 다른 실시예에서, 액체를 펌프를 이용한 배출에 의해 제거할 수 있다. 당분야 전문가들에게 익히 공지되어 있는 다수의 다른 방법은 현탁액으로부터 액체를 제거하기 위해 이용할 수 있다.
여과에 의한 피브릴을 형성하는 데에 적합한 피브릴의 현탁액은 하나 이상의 탄소 피브릴을 적합한 액체, 준(quasi) 고체 또는 겔에 분산시킴으로써 형성할 수 있다. 적합한 액체의 예에는 물, 에탄올, 메탄올, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 완충된 용액, 계면활성제, 유기 용매, 생물학적 매질(예를 들면, 단백질, 항생제 또는 이의 분획, 세포, 아세포 입자, 바이러스, 핵산, 항원, 지단백질, 지당류, 지질, 당단백질, 탄수화물, 펩티드, 호르몬 또는 약제, 소입자의 용액, 중합체 전구체, 산 또는 염기의 용액, 오일 및/또는 이의 배합)를 함유하는 용액이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
피브릴의 현탁액은 초음파 분해에 의해 탄소 피브릴을 수용액에 분산시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 양태에서, 계면활성제 및/또는 세정제를 첨가할 수 있다.
피브릴 매트는 광범위하게 0.01 ㎛ 내지 10,000 ㎛의 두께를 지닐 수 있다.
바람직한 양태에서, 피브릴 매트는 1 ㎛ 내지 100 ㎛의 두께를 지닐 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 피브릴 매트는 폭 또는 직경으로 10 mm 내지 200 mm의 범위이다.
피브릴 매트는 현탁액으로부터 잔존하는 잔여 물질을 제거하기 위해서 반복적으로 세척하고 재여과할 수 있다.
여과 또는 증발에 의해 제조된 피브릴 매트는 여과에 의해 제거되지 않은 현탁액으로부터의 잔여 액체를 제거하기 위해서 가열(예를 들면, 오븐에서)한다.
하나 이상의 다른 층에 접촉하거나 아주 근접하는 하나 이상의 분리된 층으로 구성된 피브릴의 매트를 형성하기 위해서 연속적인 여과 단계를 사용할 수 있다. 층들은 다공성, 밀도, 두께, 개별적인 피브릴 및/또는 피브릴의 초소형 집합체의 크기의 분포, 유형, 피브릴 집합체의 수 및/또는 크기, 피브릴의 화학적인 유도 작용(하기 참조), 및/또는 피브릴에 부착한 다른 물질의 존재에 포함되는 여러 성질에서의 차이에 의해서 구별될 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
도 25, 다층 피브릴 매트 2500은 연속적인 여과 단계에 의해 제조된다. 평평한 피브릴의 0.5 ㎛ 내지 100 ㎛ 두께의 층 2501이 제 1 층을 형성한다; 단백질과 기타 분자의 흡수를 저지하는 폴리-(에틸렌글리콜)과 같은 잔기를 혼입하는 피브릴 2502의 0.5 내지 10 ㎛ 두께의 층이 제 2 층을 형성한다; 하나 이상의 결합 영역(하기 참조)을 혼입하는 0.5 내지 5 ㎛ 두께의 층 2503은 제 3 층을 형성한다. 결합 영역은 분석물 2505에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 2504를 함유한다. 이러한 항체/분석물 복합체는 표지된 항체 2506에 결합할 수 있다. 표지는 ECL 표지일 수 있다. 다른 양태에서, 표지는 본 출원 외에서 기재된 하나 이상의 다수의 표지일 수 있다. 이러한 다층 매트는 프리스탠딩하거나 상기에 기재된 다수의 가능한 지지체 중의 하나에서 지지될 수 있다.
일부 또는 모든 층이 상이할 수 있는 층의 조합이 존재하는 다층 매트를 형성할 수 있다.
피브릴 매트, 피브릴, 및/또는 피브릴 매트에 사용되는 필터는 코팅할 수 있다. 특정 양태에서, 코팅은 금속이다. 이러한 코팅을 유형화하여 특정 부위를 코팅하고 다른 부위를 코팅하지 않을 수 있다. 하나의 실시예에서, 코팅은 전기 침착에 의해 적용한다. 다른 실시예에서, 코팅은 비전기 침착에 의해 적용한다.
필터를 금속으로 코팅하고, 피브릴을 금속과의 결합을 형성하는 화학적 작용기로 유도한다. 필터는 금속 스크린 또는 금속 시트이다.
피브릴 매트는 평평하거나 일그러지고, 규칙적이거나 비규칙적이고, 원형, 타원형, 직사각형, 또는 다수의 형태 중의 하나이거나 경성 또는 가요성, 투명, 반투명, 부분적으로 또는 완전히 불투명할 수 있고, 복합체 성질 또는 상이한 개별성 또는 상이한 복합체 성질을 지닐 수 있다.
매트는 디스크이거나 시트로부터 수득된 조각일 수 있다.
다수의 피브릴 매트를 바람직하게는 동시에, 바람직하게는 배열로 제조할 수 있다. 하나의 실시예에서, 미세유체 가이드의 배열은 상기에 기재되어 있는 바와 같이 지지체 상의 다수의 피브릴 매트를 형성한다. 다른 실시예에서, 필터의 배열 또는 유형화된 필터는 피브릴 매트의 배열을 제조하기 위해서 사용된다.
홀의 배열을 갖는 마스크(예를들면, 체)는 필터 또는 지지체의 특정 부위를 덮기 위해서 사용되고, 다수의 분리된 피브릴 매트는 여과 및/또는 증발에 의해서 동시에 제조된다.
피브릴 매트는 0.1 내지 3.0 g/㎠의 밀도를 지닐 수 있다. 매트는 다양한 밀도를 지닐 수 있다. 예를 들면, 기계적 힘 또는 압력을 밀도를 증가시키거나 감소시키기 위해서 상이한 횟수로 매트에 적용할 수 있다.
피브릴 매트는 포어를 지닐 수 있다. 이러한 포어는 매트를 통하여 부분적으로 및/또는 완전히 확장할 수 있거나 네트워크 또는 포어들의 일부가 될 수 있다. 이러한 포어는 광범위하게 50 A 내지 1000 ㎛ 범위의 크기를 지닐 수 있다.
바람직한 양태에서, 피브릴 매트는 광범위하게 200 A 내지 500 ㎛ 범위의 크기를 갖는 포어를 지닌다. 매트의 다공성은 기타 요인들 중에서 매트의 밀도에 좌우될 수 있다.
매트의 다공성은 전 매트에 걸쳐 일정하거나 매트에서 위치의 작용으로서 증가하거나 감소할 수 있다. 피브릴 매트는 비조직 및/또는 임의의 방법으로 분포된 상이한 크기의 매우 다양한 포어를 지닐 수 있다.
피브릴 매트는 상이한 다공성의 분리된 부위를 함유할 수 있다. 예를 들면, 피브릴 매트는 하나 이상의 층을 가질 수 있고, 각각은 상이한 다공성을 지닌다. 피브릴 매트는 매트를 통과하는 상이한 다공성의 컬럼을 지닐 수 있다.
매트의 다공성은 집합체가 상이한 크기, 형태, 조성물 또는 조합을 갖는 탄소 피브릴의 상이한 양의 집합체를 포함함으로써 변화시킬 수 있다. 특정한 실시예에서, 매트는 개별적인 피브릴, (상기에 기재된)CC 피브릴 및 (상기에 기재된)BN 피브릴, 또는 상이한 조합으로부터 제조된다. 예를 들면, 피브릴 매트는 생물학적 세포만큼 큰 물체를 통과시키기에 충분히 큰 구멍, 단백질 또는 항체만큼 큰 생물학적 매질을 통과시킬 수 있는 구멍, 단지 작은(1000 분자량 이하) 유기 분자를 통과시킬 수 있는 구멍, 및/또는 이들의 조합을 지닐 수 있다.
매트의 유공성이 그러하므로 하나 이상의 분자, 액체, 고체, 유제, 현탁액, 가스, 겔 및/또는 분산액은 매트 안으로, 매트 이내에 및/또는 매트를 통하여 분산시킬 수 있다. 피브릴 매트의 유공성이 그러하므로 생물학적 매질이 분산(능동적 또는 수동적으로) 시킬 수 있거나 일부 방법에 의해서 매트 안으로, 매트 이내에 및/또는 매트를 통하게 할 수 있다. 생물학적 매질의 예에는 전체 혈액, 분획화된 혈액, 플라즈마, 혈청, 뇨, 단백질 용액, 항체 또는 이의 분획, 세포, 아세포 입자, 바이러스, 핵산, 항원, 지단백질, 지당류, 지질, 당단백질, 탄수화물, 펩티드, 호르몬, 또는 약제가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 피브릴 매트는 하나 이상의 상이한 유공성의 층을 지닐 수 있어 물질이 하나 이상의 층을 통과할 수 있지만 다른 층을 통과할 수 없다.
피브릴 매트는 다른 물질에 의해서 또는 다른 물질 상에서 지지된다. 실시예에 의해서, 지지 물질은 금속, 플라스틱, 중합체, 탄성중합체, 겔, 종이, 세라믹, 유리, 액체, 왁스, 오일, 파라핀, 유기 고체, 탄소 또는 이들 각각의 둘 이상의 혼합물 일 수 있다. 물질은 고체이거나 액체일 수 있다. 이것이 고체일 경우, 이것은 하나 또는 다수의 홀 또는 포어를 함유할 수 있다. 특정 실시예에서, 지지체는 금속 망, 나일론 필터 막 또는 필터지일 수 있다. 지지체는 도체, 반도체 및/또는 절연체일 수 있다. throw
미국 특허 제 5,304,326호와 제 5,098,771호에 기재되어 있는 양태에서, 피브릴을 다른 물질에 분산시킬 수 있다. 예를 들면, 피브릴은 오일, 왁스, 파라핀, 플라스틴(예를 들면, ABS, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 아크릴로니트릴 등), 세라믹,테플론, 중합체, 탄성중합체, 겔, 및/또는 이들의 배합에 분산시킬 수 있다. 기타 물질에서 피브릴의 분산액은 전도한다. 바람직한 형태 및/또는 형상의 대상을 형성하기 위해서 기타 물질에서 퍼브릴의 분산액을 성형하고, 압밥하고, 형성하고, 주조하고, 자아내고, 짜고/거나 비튼다. 피브릴 매트는 매트의 전도성을 증가시키기 위해서 다른 물질, 예를 들면 얇은 섬유, 사금파리 또는 금속의 볼에 혼입할 수 있다. 다른 실시예에서, 피브릴 매트는 피브릴 자체로만 이루어낼 수 있는 것보다 상이한 유공성을 생성하는 다양한 크기, 형태 및 밀도의 다른 탄소, 유리 및/또는 금속 섬유를 혼입할 수 있다. 다른 견지에서, 매트는 자기 비드(예를 들면, DYNAL 비드)를 혼입할 수 있다. 후자의 실시예에서, 비드는 매트의 성질을 변화시키기 위해서 제공할 수 있거나 그들 자체로 결합 영역를 고정하기 위해서 지지체로서 사용될 수 있다.
기타 탄소 섬유(예를 들면, 탄소 나노구조, 탄소 나노튜브, 벅민스터풀러렌, 벅키튜브, 풀러렌, 또는 이들의 조합)를 탄소 피브릴을 대신하여 사용할 수 있다.
탄소 피브릴은 이들의 표면에 공유적으로 부착된 화학적 작용기로 제조할 수 있다. 국제 공개 제 WO 90/14221호에 기재된 바와 같이, 이러한 화학적 작용기에는 COOH, OH, NH2N-하이드록시 숙신이미드 (NHS)-에스테르, 폴리-(에틸렌 글리콜), 티올, 알킬 ((CH2)n) 그룹, 및/또는 이들의 조합이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 이들 및 기타 화학적 작용기는 기타 물질을 피브릴의 표면에 부착시키는 데에 사용할 수 있다.
특정 화학 작용기(예를 들면, COOH, NH2, SH, NHS-에스테르)는 다른 작은 분자를 피브릴에 커플링시키기 위해 사용할 수 있다. 이러한 화학적 작용기와 작은 분자의 가능한 다수의 조합이 존재한다.
다수의 양태에서, NHS-에스테르 그룹은 친핵성 화학 작용기(예를 들면, 아민)를 생성하는 다른 분자 또는 물질을 부착시키는 데에 사용한다. 바람직한 양태에서, 친핵성 화학 작용기는 생분자 상에 및/또는 생분자 내에 자연적으로 및/또는 화학적 유도작용에 의해 존재한다. 적합한 생분자의 예에는 아미노산, 단백질 및 이의 작용성 분획, 항체, 항체의 결합 분획, 효소, 핵산, 및 이들의 조합이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 이것은 다수의 이러한 가능한 기술들 중의 하나이고, 일반적으로 본원에 주어진 실시예와 다수의 다른 유사 물질 및/또는 생분자에 적용할 수 있다. 바람직한 양태에서, ECL에 사용할 수 있는 시약은 NHS-에스테르 그룹에 의해서 피브릴에 부착할 수 있다.
ECL 분석에 사용할 수 있는 항체는 공유 결합(예를 들면, NHS-에스테르와의 반응)에 의해서, 적합한 링커와의 반응에 의해서(하기 참조), 비-특이 결합에 의해서 및/또는 이들의 조합에 의해서 하나 이상의 피브릴 또는 피브릴 매트에 부착할 수 있다. 핵산 및/또는 세포는 피브릴에 부착된 NHS-에스테르에의 공유 결합에 의해 피브릴 또는 피브릴 매트에 부착할 수 있다.
물질의 피브릴 및/또는 피브릴 매트에의 비-특이 결합의 정도를 조절하는 것이 바람직하다. 비-제한 실시예에 의해서 단순히, 단백질, 항체, 항체의 단편, 세포, 아세포 입자, 바이러스, 혈청 및/또는 하나 이상의 성분, ECL 택(예를 들면, RuII(bpy)3과 RuIII(bpy)3유도체), 옥살레이트, 트리알킬아민, 항원, 분석물, 및/또는 이의 조합의 비-특이 흡수를 감소시키거나 저지하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 실시예에서, 생분자의 결합을 개선하는 것이 바람직할 수 있다.
비-특이 결합을 감소시키거나 저지하는 하나 이상의 화학적 잔기는 하나 이상의 피브릴 내에, 피브릴 상에, 또는 피브릴에 아주 인접하여 존재할 수 있다. 비-특이 결합은 PEG 잔기를 하나 이상의 피브릴 및/또는 피브릴 매트에 공유적으로 부착시킴으로써 조절한다. 하전된 잔사(예를 들면, 포스페이트, 암모늄 이온)는 하나 이상의 피브릴 또는 피브릴 매트에 공유적으로 부착할 수 있다.
지지체, 전극 및/또는 결합 영역에 사용되는 물질은 비-특이 결합을 감소시키기 위해서 계면활성제로 처리할 수 있다. 예를 들면, 피브릴 또는 피브릴 매트는 당분야의 통상적인 기술(예를 들면, the Tween series, Triton, Span, Brij) 중의 하나로 익히 공지되어 있는 계면활성제 및/또는 세정제로 처리할 수 있다. 피브릴 또는 피브릴 매트를 계면활성제 및/또는 세정제의 용액으로 및/또는 이의 조합으로 세정하고, 적시고, 배양한다.
PEG에 유사한 방법으로 행동하는 PEG 및/또는 분자(예를 들면, 올리고-또는 다당류, 기타 친수성 올리고머 또는 중합체)의 용액("Polyethylene glycol chemistry: Biotechnical and biomedical applications, Harris, J.M. Editor, 1992, Plenum Press)을 계면활성제 및/또는 세정제 대신에 및/또는 접합하여 사용할 수 있다.
상기에 기재된 물질과 같은 특정 물질의 바람직하지 않은 비-특이 흡수는 결쟁적 비-특이 흡수에 의해 블록킹될 수 있다. 이러한 경쟁적인 결합 종은 보빈 혈청 알부민(BSA) 면역글로불린 G(IgG)일 수 있다.
ECL-TAG의 비-특이 결합은 TAG의 화학적 변형에 의해 감소할 수 있다. 예를 들면, TAG는 이의 친수성을 증가시키기 위해서(예를 들면, 친수성, 극성, 수소 결합, 및/또는 하전된 작용기를 Ru(bpys)의 바이피리딜 리간드에 첨가함으로써) 변형할 수 있고 따라서 TAG의 다른 표면에의 비-특이 결합을 감소시킨다.
생분자 또는 기타 매질을 피브릴 또는 피브릴 매트에 고정시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체, 항체의 분획, 단백질, 효소, 효소 기질, 억제제, 조인자, 항원, 헵텐, 지단백질, 지당류, 세포, 아세포 성분, 세포 수용체, 바이러스, 핵산, 항원, 지질, 당단백질, 탄수화물, 펩티드, 아미노산, 호르몬, 단백질-결합 리간드, 약제, 및/또는 이들의 조합을 부착할 수 있다.
또한 탄성중합체, 겔, 코팅, ECL 택, 산화 환원 반응 종(예를 들면, 트리프로필아민, 옥살레이트), 무기 물질, 킬레이팅제, 링커 등에 제한되지 않는 이같은 비-생물학적 물질을 피브릴에 부착하는 것이 바람직할 수 있다.
하나 이상의 다수의 종이 피브릴 또는 피브릴 매트의 표면에 비-특이적으로 결합할 수 있다 (예를 들면, 흡수).
생물학적 분자 또는 기타 매질은 비-특이 흡수에 의해 피브릴 또는 피브릴 매트에 부착할 수 있다. 주어진 피브릴, 피브릴 매트 및/또는 생분자에 대한 비-특이 흡수의 정도는 각각의 특정한 성질에 의해 측정될 것이다. 피브릴에 존재하는 특정 화학적 작용기 또는 생물학적 잔기는 비-특이적 결합을 감소시키거나 개선할 수 있다. 단백질 표면의 소수성 및/또는 친수성 패치의 존재는 단백질의 피브릴 또는 피브릴 매트에의 비-특이 결합을 개선하거나 감소시킬 수 있다. 친수성 및/또는 소수성 패치는 통제된 부위내에서 비-특이 결합을 조절하는 데에 사용된다.
피브릴은 생물학적 분자 또는 매질 또는 기타 물질의 비-특이 결합을 개선하기 위해서 알킬 (CH2) 쇄 및/또는 카복실산 그룹으로 유도할 수 있다.
도 26은 단일 피브릴의 경우에 상기 양태를 도시하여 설명한다. 피브릴 2600은 알킬쇄 2601로 유도한다. 생분자 2602, 2603, 및 2604는 알킬 쇄에 비-특이적으로 결합한다. 중합체/탄성중합체 2605가 또한 결합된다.
비유도된 피브릴, 피브릴 집합체 및/또는 피브릴 매트는 비-특이 결합에 의한 생분자, 생물학적 매질, 및 기타 물질의 고정을 위해 사용한다.
ECL TAG는 하전된 잔사를 함유한다. ECL TAG를 지지체 및/또는 전극에 선택적으로 부착되도록 한다. 예를 들면, 네트 음전하인 유도된 ECL TAG는 환원하는 전위에서 전극에 대해 상대적으로 낮은 친화력을 지니고, 이어서 전극 전위가 좀더 산화됨에 따라 전극에 대해 더 높은 친화력을 지닌다. ECL 택 및/또는 결합 시약의 전극에의 친화력을 조정하도록 (예를 들면, 결합 및/또는 세척 단계 동안 친화력을 감소시키도록 하고, ECL 해독 동안 ECL TAG에 의해 검출된 효과적인 전위를 증가시키기 위해서 ECL TAG 및/또는 결합 시약의 친화력을 증가시키도록) 한다.
도 28에서 (생물학적 및 비-생물학적) 분자가 공유 결합에 의해서 피브릴에 부착될 수 있다. NHS-에스테르 화학적 작용기를 생성하는 피브릴 2800은 생분자 또는 생물학적 매질 2802,2803에 공유 결합을 형성할 수 있다. 이러한 생물학적 매질은 NHS-에스테르 그룹과의 반응에 의해 공유 결합을 형성하기 위해서 아미노 그룹을 사용할 수 있다. 중합체 2808을 고정한다. 당분야의 통상의 기술자가 분자의 커플링제로서 NHS-에스테르 그룹의 일반성을 알아내었고 고정을 이루기 위한 적합한 생분자와 적합한 반응 조건을 선별할 수 있었다.
하나 이상이 피브릴에 부착되어 있는 한 쌍의 잔기 및/또는 분자 "M1"과 "S1"은 상호 친화력 또는 결합 역량을 나타낸다. M1/S1은 항체/항원, 항체/햅텐, 효소/기질, 효소/조효소, 효소/억제제, 렉틴/탄수화물, 수용체/호르몬, 수용체/작동제, 핵산/핵산, 단백질/핵산, 바이러스/리간드, 세포/세포 수용체 등일 수 있다. "결합쌍" M1/S1의 다수의 조합은 바람직한 결합을 달성하기 위해서 적합한 조합을 선별할 수 있다. M1 또는 S1을 하나 이상의 피브릴에 부착할 수 있다.
도 27과 28은 이러한 양태에 가능한 다수의 가능한 배치 중의 일부를 도시한다. 도 27에서, 알킬쇄 2701로 비-특이적으로 유도된 피브릴 2700은 다른 분자 2703에 대해 상호 친화력 또는 결합 역량을 갖는 분자 2702를 결합시킨다. 분자 2703을 또한 다른 분자 2704에 부착한다. 블록킹 분자 2705는 피브릴에 비특이적으로 흡수될 수 있다. 분자 2709에 대해 친화력을 갖는 리간드(2708)를 지닌 블록킹 중합체 2706 및/또는 중합체 2707은 비-특이적으로 흡수된다.
도 28에서, 피브릴 2800은 2801에 의해서 분자 2802와 2803 및 링커 분자2804에 공유적으로 결합된다. 링커 분자 2804는 다른 생분자 2805에 대해 상호 친화력 또는 결합 역량을 갖는다. 생분자 2803은 2807에 공유적으로 결합된 다른 링커 분자 2806에 대해 상호 친화력 또는 결합 역량을 갖는다. 결합 파트너 2809에 특이적인 리간드 2812를 갖는 중합체 2808은 피브릴에 공유적으로 결합한다. 블록킹 분자(예를 들면, BSA) 2811과 블록킹 중합체 2810이 공유적으로 부착된다.
피브릴은 바이오틴 및/또는 바이오틴화된 링커로 유도될 수 있고 아비딘 및/또는 스트렙타비딘은 이러한 링커에 결합할 수 있다. 아비딘 및/또는 스트렙타비딘은 피브릴에 결합할 수 있고, 바이오틴화된 항체 및/또는 단백질이 결합할 수 있다. 아비딘 및/또는 스트렙타비딘은 비-특이적 결합, 공유 결합, 다른 또는 동일한 커플링 쌍, 또는 이들의 조합에 의해 피브릴에 고정될 수 있다. "결합 쌍"으로서 (스트렙트)아비딘과 바이오틴의 사용은 생분자 또는 생물학적 매질을 다른 물질에 부착시키는 광범위하게 적용된 방법이고 당분야의 전문가에게 익히 공지되어 있다 (참고 문헌 : Spinke et al., 1993, Langmuir 9 : 1821).
결합 쌍은 모노클론 항체와 이 항체에 결합하는 항원일 수 있다.
다중 결합 쌍(예를 들면, M1/S1/M2)을 형성할 수 있다. M1은 모노클론 항체이고, S1은 M1의 항원이고, M2는 S1에 결합하는 항체이다. 이러한 복합체는 항체/항원/항체 "샌드위치" 복합체를 구성할 수 있다 (이러한 항체는 모노클론이거나 아닐 수 있다). M2는 ECL-반응 택(하기 참조), 형광 표지, 방사선 표지, 효소 택, 및/또는 이들의 조합을 덧붙인 항체일 수 있다.
M1은 금속, 금속 이온, 또는 유기금속 화합물("킬레이팅제")과 복합할 수 있는 잔기일 수 있고 S1은 M1과 복합체를 형성하는 금속, 금속 이온, 또는 유기금속 화합물("킬레이트")이고, M2는 M1/S1 복합체에 결합하는 생물학적 분자의 잔기이다(Gerhon and Khilko, 1995, Journal of Immunogical Methods, 7371).
전류를 표면상의 이러한 전극에 분포시키는 금속 전극 유형과 전도성 전지의 제조는 당분야에 익히 공지된 방법에 의해 수행된다 (Leventis et al., U.S. 특허 제 5,189,549호 참조). 투명한 표면상에 금속 필름의 제조는 액정 진열물을 생성하는 데에 사용되고 본 발명에 따른 전극의 제조에 수월하게 적용된다 (Haneko, 1987, Liquid Crystal TV Displays, Principles and Applications of Liquid Crystal Displays, KTK Scienific Publishers, Tokyo, D. Reidel Publishing). 예를 들면, DiMilla et al., 1994, J. Am. Chem. Soc. 116(5):2225-2226의 방법에 따라서 투명한 전극 표면을 또한 제조할 수 있다. 0.5 nm의 티타늄과 5 nm의 금을 투명한 물질(유리 또는 플라스틴)에 침착시킨다. 상기의 DiMilla의 방법에 의해 제조된 얇은 금층은 상기의 Kumar의 방법에 의한 투명한 전기적 구조를 제조하기 위해서 사용할 수 있다. 바람직하게는 투명도를 유지하면서 향상된 전류 운반 역량을 위해 도체 층의 두께를 증가시키기 위한 이러한 절차의 변형이 바람직하고 통상의 기능공에게 수월하게 이해된다. 이러한 기술은 PMAMS의 분리된 결합 영역과 인접하도록 정렬된 전극 표면을 제조하는 데에 사용할 수 있다.
추가로, 필름 및/또는 단일층은 Zhang와 Bard에 의해 교지된 바와 같이 절연체 잔기(예를 들면, 알킬쇄)를 사용하기보다는 전극 표면으로부터 ECL 표지까지 전기적 전위의 전달을 촉진하는 잔기로 구성될 수 있다. 예를 들면, 광범위하게 접합된 시스템에서 pi 오비탈 오버랩을 전자 전달에 사용할 수 있다. 이러한 pi 오비탈 전극 전달은 폴리-피롤 또는 기타 접합된 환 또는 이중 결합된 구조에 의해 제공된다.
올리고뉴클레오티드는 전자 전달을 조정하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들면, 이중 가닥 DNA에서의 오버랩핑 pi 결합은 전자 전달율을 증가시키기 위해서 사용할 수 있다. 전극 표면에 결합된 올리고뉴클레오티드는 결합 역역에서 결합제로서 사용할 수 있다. 보충 올리고뉴클레오티드 서열을 결합시킬 경우, 조직화된 오버랩핑 pi 결합을 갖는 이중 가닥이 형성된다. 특정 양태에서, 제 1의 또는 1차의 고정된(예를 들면, 지지체에 공유적으로 결합된) 올리고뉴클레오티드를 ECL 로 표지한다. 다른 양태에서, 2차 보완적 올리고뉴클레오티드 또는 1차 올리고뉴클레오티드에 부분적으로 보완적인 서열을 ECL로 표지한다. 2차 올리고뉴클레오티드에 보완적인 3차 올리고뉴클레오티드 또는 부분적으로 보완적인 3차 올리고뉴클레오티드를 표지한다 (예를 들면, 샌드위치 분석). 올리고뉴클레오티드의 측쇄를 또한 사용할 수 있다. 다양한 올리고뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모조물을 사용할 수 있다 (예를 들면, 질소 및/또는 황을 함유하는 변형된 염기 및/또는 변형된 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드). 차별적인 연구를 수행할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드 복합체의 pi 오버랩의 다양한 안정성은 전자 전달의 조정을 통하여 모니터링할 수 있다. pi 결합 안정화된 ECL 표지 이중 나선 올리고뉴클레오티드 쌍으로 표지된 은으로부터 생성된 시그널(예를 들면, 생성된 ECL 광 및/또는 임피던스 측정)은 더욱 혼란된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로부터 단일 및/또는 예상되는 시그널에 대해 상호 연관될 수 있다. 완전히 보완적인 ECL 표지 이중 가닥 올리고뉴클레오티드와 부분적으로 보완적인 ECL 표지 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 사이의 ECL 시그널의 변이를 상호 연관시킬 수 있다. 부가적으로, 다수의 올리고뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 복합체를 사용할 수 있다. 예를 들면, 삼중 나선을 사용할 수 있다.
전자 전달율의 조정은 전자적 방법 및 ECL 검출를 사용하여 측정할 수 있다. ECL 표지는 올리고뉴클레오티드 가닥에 결합하고/거나 비-공유적으로 연결될 수 있다 (예를 들면, 사이에 끼워 넣음). DNA는 링커를 사용하지 않고(금에서 5' 티올화된 DNA의 흡수) 또는 DNA로부터 전극까지 전자 전달의 낮은 저항성을 보장하는 짧은(10 원자 이하) 링커로 전극에 커플링할 수 있다. 전극으로부터 DNA 가닥(예를 들면, 폴리아세틸렌 쇄)까지 전자를 효율적으로 전달할 수 있는 연결쇄를 사용할 수 있다.
혼합된 단일층 및/또는 필름을 단일층 또는 필름의 적어도 하나의 성분이 경우에 따라서 전위의 전달을 촉진하는 데에 사용할 수 있다. 이와는 달리, 전위의 전달을 촉진하는 분자 또는 입자가 단일층 또는 필름에 흡수된다. 전술한 실시예로서, pi 접합된 단일층 및/또는 흡수하고/거나 전극 표면에 적합한 전도하는 마이크로-입자를 사용할 수 있다. 유형화된 규칙적인 갭을 단일층 또는 필름에 생성한다. ECL 표지가 연속적으로 부착된 장쇄 알칸 티올로 구성된 (즉, 절연하는) 정연한 실질적으로 수직의 SAM에서 갭의 조절된 유형을 사용함으로써 ECL 표지에 부과된 효과적인 전위를 조절할 수 있다. 예를 들면, 도 11은 금속층 1204를 갖는 단일 지지체 1202로 형성된 카세트 1200, SAM 유형 1206 및 SAM 유형 사이의 갭 1208을 나타낸다.
ECL 표지 단백질은 단일층 표면에 비-공유적으로 결합할 수 있다. ECL 표지 단백질은 금 표면에 유도된 메틸 종결된 알칸 티올의 표면에 흡수될 수 있다. 금 표면은 작동 전극 또는 역전극으로서 작용할 수 있다. 다수의 결합 영역은 도 11 내지 13에서 도시되는 바와 같이 단일 지지체 상에 혼입될 수 있다. 바람직한 양태에서 결합 영역은 표지 및/또는 비표지 단백질 및/또는 핵산 및/또는 세포 및/또는 화학적 종을 함유한다.
이와는 달리, 단일층의 성분의 길이(예를 들면, 알칸 티올 단일층의 알칸 쇄의 길이)는 단일층의 노출된 표면에서 효과적인 전위를 조절하기 위해서 변화할 수 있다.
광범위하게는, 알칸 티올은 1개 내지 100개 탄소 길이의 탄소쇄를 지닐 수 있다. 바람직한 양태에서, 알칸 티올의 탄소 길이는 2 내지 24개의 탄소를 함유한다. 알칸 티올의 탄소쇄 길이는 2 내지 18개의 탄소이다. 탄소쇄 길이는 7 내지 11개의 탄소이다. 이러한 알칸 티올은 메틸 그룹, 하이드록시 그룹, 아민, 카복실산, 올리고(에틸렌 글리콜), 포스페이트 그룹, 포스포릴 그룹, 바이오틴, 니트릴로트리아세트산, 글루타티온, 에폭사이드 디니트로페닐, 및/또는 NHS 에스테르가 포함되는 분석 매질에 노출된 다양한 헤드 그룹을 지닐 수 있다. 기타 헤드 그룹에는 재조합 융합 단백질의 정제와 고정에 보편적으로 사용되는 리간드가 포함된다 (예를 들면, Sassenfeld, 1990, TIBTECH 8:88-93). 결합 영역은 결합 시약의 다양한 밀도를 이루기 위해서 다양한 정도로 유도될 수 있다. 예를 들면, 활성화할 수 있는 화학물질의 상이한 밀도를 사용할 수 있고/거나 유도를 다양한 정도로 수행할 수 있다. 혼합된 화학물질은 바람직한 결합 밀도를 생성하기 위해서 사용할 수 있다. 혼합된 단일층은 활성화할 수 있는 그룹 및/또는 결합 시약의 밀도를 조절하기 위해서 사용할 수 있다. 결합 그룹의 밀도는 ECL 시그널을 잡음율로 최고로 활용하기 위해서 조절한다. ECL 광 시그널이 순차적으로 또는 동시에 및/또는 광 검출 수단에 관해 검출되든지 간에 다른 결합 영역으로부터 다른 ECL 광 시그널에 관해 광 시그널의 강도를 최고로 활용하기 위해서 결합 영역내의 결합 영역의 총수를 조절한다.
전압 파형은 한번 이상의 시간에 PMAMS 내에 결합 영역과 연계된 ECL 표지를 활성화시키기 위해서 적용할 수 있다. ECL 광 생성을 활성화 하기에 충분한 전위는 다중 ECL 광 시그널을 생성하기 위해서 결합된 ECL 표지를 갖는 동일한 알칸티올 유도 표면에 여러 번 적용할 수 있다. 전위는 ECL을 가역적으로 생성하기 위해서 충분히 적용된다. 전위는 ECL을 준-가역적으로 생성하기 위해서 적용한다. 전압 파형의 준-가역적 시리즈에서, ECL 표지가 연계된(예를 들면, 결합된) 결합 영역를 화학적으로 및/또는 물리적으로 변경할 수 있다. 적용된 전압 파형 시리즈는 비가역적인 ECL 광 생성을 수득할 수 있다.
또한, 단일층의 성분을 방출하기에 충분한 전위를 적용할 수 있다. 전극 표면 위의 용적이 작은 단일층 성분(예를 들면, 전극 표면 상에서 휴지하는 다른 지지체 또는 플레이트)을 방출하는 것이 바람직하다. 이러한 방법에서, 단일층이 붕괴됨에 따라, 효율적으로 여기되지 않은 일부의 ECL 표지는 전기화학발광 시그널을 생성하기 위해 전극 표면에 의해 여기될 수 있고 ECL 표지는 전극으로부터 확산을 제한하는 작은 용량으로 제한된다. 다양한 단일층 조성물은 주어진 전위에 대한 단일층의 붕괴 정도를 조절하기 위해서 사용할 수 있다. 강한 상호-성분 친화력을 갖는 성분을 지닌 단일층은 단일층 붕괴에 더욱 저항적일 것이다. 더욱 긴 알칸쇄 티올은 짧은 알칸쇄 티올보다 더욱 효율적으로 붕괴에 저항한다. 쇄 길이를 변화시킴으로써 바람직한 안정성을 이루어낼 수 있다.
PMAMS 내의 결합 영역의 변형은 ECL 시그널을 조정하기 위해서 사용할 수 있다. 전압 파형 시리즈는 ECL 시그널의 다중성을 생성하기 위해서 적용된다. ECL 시그널의 다중성은 여분 및/또는 더 나은 결과를 수득하기 위해서 사용할 수 있다. ECL 시그널의 변형율의 통계적인 분석은 하나 이상의 결합 영역의 전반적인 양과 관련될 수 있다. 추가로, ECL 시그널의 다중성은 예를 들면, 시리즈의 특정 ECL 시그널을 여과함으로써 시그널을 잡음에 증가시키는 데에 사용할 수 있다. 또한, 다중 전자 전위 파형 펄스는 비-특이 결합에 기인한 바람직하지 않은 조정을 감소시키는 데에 사용할 수 있다. 전자적 전위는 특정 하전된 종의 비-특이 결합을 저지하기 위해서 적용할 수 있다. 추가로, 전자적 전위는 특정 분석물 또는 관심이 되는 화학적 종의 결합 영역 가까이에서 구역화를 촉진하기 위해서 적용할 수 있다. 적용된 전압 파형은 대규모의 오버-전위(예를 들면, ECL을 생성하기 위해서 요구되는 것보다 더욱 높은 전위)를 공급한다. 오버-전위는 전압 파 시리즈에서 또는 단일 전압 파 펄스에서 ECL 시그널을 조정하는 데에 사용할 수 있다. 또한, 오버-전위는 ECL 반응 카이네틱스를 조정하기 위해서 및/또는 결합 전위를 화학적으로 및/또는 물리적으로 조정하기 위해서 사용할 수 있다. 또한, 하나 이상의 전압 파형 및/또는 당분야 전문가들에게 공지되어 있는 기타 전자적 실험은 전극의 양 및/또는 전극의 전자적 성질에 대한 정보를 평가하고/거나 연관시키고/거나 추정하는 데에 사용할 수 있다.
바람직하게는, ECL 반응의 효율은 전극과 접촉하여 부가적인 전도 방법을 제공함으로써 작동 전극 표면 부위를 확장함으로써 개선할 수 있다. 전도 물질 또는 전도 입자의 전극(예를 들면, 와이어 또는 위스커)으로부터의 주입 또는 확장은 전극 표면 면적을 증가시키기 위해 사용하여 전기장과 ECL 표지를 더욱 밀접하게 접근시킨다. 또한, 전극 구조에서 결각부 또는 웰은 동일한 목적을 제공할 수 있다.
특히, 전도성 입자는 전극 표면의 갭을 채울 수 있고/거나 지지체 또는 단일 층을 커버하여 도 12에서 도시된 바와 같이 ECL 표지 주위의 전기장을 절대적인 등급으로 증가시킨다. 이러한 전도성 입자는 전극 표면 부위를 확장하여 이로 인해 ECL 반응의 효율을 증가시킨다. 도 12는 금속 층 1304 상에 유형화된 SAM 1306을 생성하는 지지체 1302를 갖는 카세트를 도시하고, 갭(예를 들면, 도 11에서 1208)에서 채우고 SAM 유형 사이에 금속 표면 위로 확장하는 미세입자를 전도하는 것을 나타낸다. 자기 전도 입자에 대해서, 자기 또는 자기장은 입자를 표면으로 당기는 데에 사용할 수 있다. 전도성 입자는 또한 전극 표면과 2개의 적합한 지지체를 갖는 PMAMS의 결합 영역 사이에 전기적 전위를 확장하기 위해서 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. 도 8에서, 카세트 900은 전극의 다중 배열을 갖는 제 1 지지체 902와 PMAMS를 갖는 제 2 지지체 904로 이루어진다. 전도 미세-입자 906을 전도하는 것은 결합 영역(도시되지 않음)의 ECL 표지를 향하여 전위를 확장하기 위해서 대응하는 면 사이에 위치된다.
이와는 달리, 전도 중합체는 도 13에서 도시되는 바와 같이 샘플의 ECL 표지 주위의 전위를 확장하는 것을 촉진하기 위해서 전극 표면의 노출된 갭으로부터 성장된다. 도 13은 유형화된 SAM 표면 1406의 금속 층 1404를 생성하는 지지체 1402를 갖는 카세트 1400를 도시한다. 전도 중합체 1408은 SAM 표면을 연장하여 SAM 표면의 결합 영역(도시되지 않음)으로의 전극의 다중 배열(도시되지 않음)에 의해 제공된 전기장을 확장한다. 전도성 중합체는 또한 도 7에서 도시된 바와 같이 두개의 접근된 지지체의 PMAMS의 결합 영역과 전극 표면 사이에서 전위를 확장하는 것으로 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. 도 7에서, 카세트 800은 접근된 지지체 802 및 804로 이루어진다. 전도성 중합체 806은 결합 영역(도시되지 않음)의 ECL 표지를 향하여 전위를 확장하기 위해서 대응하는 표면 사이에 연장된다.
도 9는 다중전극 배열을 갖는 제 1지지체 1002, PMAMS 결합 표면을 갖는 제2 지지체 1004로 형성되고, 작동 전극의 전도성 주입부(1006)(예를 들면, 미세 와이어 또는 기타 돌출부)가 PMAMS 결합 영역의 ECL 표지 주위에서 전기장을 확장하는 카세트 1000을 도시한다.
전극 쌍은 다양한 배치로 생성할 수 있다. 본 명세서에 수반된 도에서 도시된 가장 단순한 배치는 비-전도 평면에 적용된 금속 및/또는 금속 옥사이드 필름 및/또는 반도체 필름으로 구성되어 있다. 이러한 전극 쌍의 전극은 상대적으로 연속적인 전기장을 제공함으로써 바람직하게는 이들 사이에서 상대적으로 연속적인 폭의 범위를 제한한다.
전극의 기타 배치가 제공된다. 여러 이러한 배치는 도 19(a) 내지 (e)의 평면도에 도시되어 있다. 도 19(a)는 인터-디지테이티드 콤(inter-digitated comb)-유사 전극 쌍을 도시한다. 이러한 구조에서, 각각의 전극은 콤-유사 형태를 형성하는 도체로부터 확장하는 다수의 디지트를 갖는다. 전극 및 역전극 쌍은 결합 영역에 인접하여 위치될 수 있거나 결합 영역은 전극과 역전극 사이에서 위치될 수 있다. 도 19(b)는 한 쌍의 중심이 같은 전극, 하나의 서큘러, 및 하나의 세미서큘러를 도시한다. 도 19(c)는 서로 직면하는 이들의 직선 가장자리를 갖는 두개의 세미서큘러 전극을 도시한다. 도 19(d)는 한쌍의 직사각형 전극을 도시한다. 도 19(e)는 그 사이에 구불구불한 갭을 형성하기 위해서 보완적인 대응하는 곡선의 표면을 갖는 인터디지테이티드 쌍을 도시한다.
전극/역전극 쌍은 또한 정렬 목적으로 PMAMS 결합 표면의 형태에 보완적인 특이한 형태로 형성할 수 있다. 예가 되는 형태가 도 6b에 도시된다. 전극쌍 714 내지 720을 생성하는 지지체 712가 도시된다. 전극쌍은 예를 들면 서큘러 714, 인터디지테이티드 716 삼각 인터디지테이팅 718 또는 다중 전극 인터디지테이팅 720일 수 있다.
상기에 기재된 도 14 내지 19에 도시된 양태에서, 전극 쌍은 단일 지지체에 위치한다. 이와는 달리, 전극쌍은 도 2에 도시된 바와 같은 제 1 및 제 2 대응하는 지지체에 위치한다.
5.8. 카세트
카세트는 본 발명의 하나 이상의 지지체를 함유한다. 카세트에는 다수의 결합 영역과 하나 이상의 작동 전극이 포함될 수 있다.
도 2에서 지지체 26의 각각의 복수의 결합 영역 30은 복수의 전극 32 중의 하나에 인접한다. 역전극 38은 제 2 지지체 28에 형성된다. ECL 분석은 샘플을 결합 영역 30에 배치하고 이어서 지지체 26과 28을 함께 이동시킴에 의해 상기에 기재된 바와 같이 실행됨으로써 역전극 38 각각은 각각의 결합 영역 30에 인접하며 ECL 반응은 리드 34를 경유한 파형 생성기 수단에 의해 상기 기술된 바와 같이 개시되어, ECL 시그널은 광 검출 수단 40, 와이어 41, 및 디지탈 컴퓨터 수단 42에 의해 검출되고 기록될 수 있다.
도 3은 각각의 복수의 결합 영역 48이 지지체 44 상에서 이에 인접한 복수 전극/역전극 쌍 50중에서 상이한 것을 갖는 카세트를 도시한다. 지지체 46은 임의로 지지체 44에 인접하여 배치되어 지지체 46이 복수 결합 영역 48과 복수 전극 50에 인접한 수단을 함유하는 샘플을 형성할 수 있다. 따라서, ECL 반응은 전기 접속(52)을 통해 파형 생성 수단에 의해 개시되며, ECL 시그널은 광 검출 수단(56)에 의해 탐지되며, 디지탈 컴퓨터 수단(58)에 의해 기록, 분석될 수 있다.
도 21에 도시된 바와 같은 한 쌍 이상의 지지체를 함유하는 카세트가 제공되고, 이들 지지체의 각 쌍은 배치되어 결합 영역를 함유하는 제 1 지지체 1501의 표면을 각각의 표면이 전극 1504와 결합 영역 1506을 함유하는 제 2 지지체 1502 상의 결합 영역를 함유하는 표면에 직면하고, 각각의 표면은 전극 1504와 결합 영역1506을 함유하며, 제 1 지지체 상의 각각의 결합 영역은 제 2 지지체 상의 전극과 직면하여 정렬되며, 제 2 지지체 표면 상의 각각의 결합 영역은 제 1 지지체 상의 전극과 정렬된다.
도 4는 ECL 전극이 임의적인 카세트를 도시한다. 지지체 60의 결합 영역 64는 분석물을 함유하는 샘플과 접촉된다. 지지체 62의 영역 66은 관심의 대상이 되는 분석물을 검출하거나 측정하기 위한 또는 바람직한 반응을 수행하기 위한 반응 매질을 함유한다. 지지체 60과 지지체 62를 함께 옮겨서 결합 영역 64와 영역 66을 접촉시키고 분석물 또는 반응 산물의 존재를, 예를 들면 광검출기 68에 의해 탐지하고 디지탈 컴퓨터 수단 70에 의해 분석할 수 있는 비색계 화학발광 또는 형광 시그널인 보고 시스템에 의해 측정한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 카세트 또는 장치는 다수의 분리된 결합 영역에 샘플 운반을 위한 수단을 포함한다 (예를 들면, 미국 특허 제 5,147,806 호의 도 1의 전지 1; 미국 특허 제 5,068,088 호의 도 1의 전지 1; 각각은 완전히 참고 문헌으로 인용됨). 하나 이상의 주입부, 홀, 포어, 채널, 파이프, 미세유체 가이드(예를 들면, 모세관), 튜브, 스피고트 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 샘플 운반을 위한 수단은 고정가능하거나 이동가능하고, 당분야에 공지될 수 있다. 유체는 익히 공지된 방법에 다양한 의한 시스템, 예를 들면 펌프, 피펫, 주사기, 중력 유동, 모세관 작용, 위킹, 전기 영동, 압력, 진공 등을 통하여 이동시킬 수 있다. 유체 이동을 위한 방법은 카세트 또는 개별적인 단위에 위치할 수 있다. 샘플은 결합 영역 모두에 함께 배치할 수 있다. 대안적으로, 모세관 유체 전달 수단에 의해 특정한 결합 영역에 배치할 수 있다. 대안적으로, 샘플을 유체 샘플의 지지체 상의 PMAMS로의 직접적인 운반을 위한 자동 피펫터에 의해 지지체에 배치하거나, 결합 표면으로의 추후의 직접적인 운반을 위한 카세트 또는 카세트 홀더의 저장기로 배치할 수도 있다.
지지체는 유리, 플라스틱, 세라믹, 중합체 물질, 탄성중합체성 물질, 금속, 탄소 또는 물질을 함유하는 탄소, 합금, 복합재 호일, 실리콘 및/또는 층 물질이 포함되지만 이에 제한되지 않는 물질로부터 제조할 수 있다. 지지체는 매우 다양한 구조적, 화학적 및/또는 광학적 성질을 지닐 수 있다. 이들은 경성 또는 가요성이고, 평평하거나 일그러지고, 투명, 반투명, 부분적으로 또는 완전히 반사적이거나 불투명할 수 있고, 복합체 성질, 상이한 성질을 갖는 영역을 가질 수 있고 한물질 이상의 복합체일 수 있다.
분석을 실행하기 위한 시약을 카세트에 및/또는 개별적인 컨테이너에 저장할 수 있다. 시약을 건조 및/또는 습윤상태에서 저장할 수 있다. 하나의 양태에서, 카세트의 건조 시약은 탐침 샘플의 첨가에 의해 재수화된다. 상이한 양태에서, 시약을 이동가능한 롤러 또는 피스톤으로부터의 압력에 기인하여 열리게 된 "블리스터 팩(blister packs)"의 용액에 저장한다. 카세트는 폐기 부분 또는 분석의 완료 후 액체 폐기물의 저장을 위한 스폰지를 함유할 수 있다. 하나의 양태에서, 카세트는 시험될 생물학적 샘플의 제조를 위한 장치를 포함한다. 혈액으로부터 세포를 제거하기 위해 필터를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 카세트에는 샘플을 측정하기 위한 정확한 모세관과 같은 장치가 포함될 수 있다.
지지체 상의 다수의 결합 영역과 다수의 전극/역전극은 전형적으로 기계적인 수단에 의해, 예를 들면, 가이드 포스트, 정렬 핀, 힌지(각각의 지지체 사이의) 또는 가이드 가장자리를 사용함으로써 서로 레지스터링되어 밀접하게 배치된다. 광학적 가이드 수단은 두개의 지지체와 지지체에 제한된 광학적 가이드 마크를 사용하는 전자적 수단을 배치하는 데에 사용할 수 있다. 전기적 또는 자기 정합 수단을 사용하는 기타 시스템이 또한 이용가능하다.
카세트의 지지체는 ECL 반응을 개시하기 위해서 요구될 때까지 샘플과의 접촉으로부터 전극쌍을 보호하기 위해서 배치할 수 있다. 예를 들면, 전극은 샘플과 접촉한 전극이 제거가능한 전극 보호 수단과 같은 다양한 기계적 수단을 사용함으로써 요구될 때까지 결합 영역으로부터 분리되어 있도록 유지할 수 있다.
본 발명의 카세트와 장치는 검정 전극, 예를 들면 Ag/AgCl 또는 포화된 칼로멜 전극(SCE)을 포함할 수 있다.
지지체는 클립, 접착제, 리벳, 핀 또는 다른 적합한 기계적인 부착물에 의해 함께 지속할 수 있다. 이것은 또한 액체 샘플의 표면 장력에 의해서 또는 두개의 지지체의 대응하는 면에 제거가능하게 배치된 압력 수단에 의해 함께 지속할 수 있다.
카세트는 또한 예를 들면, 결합 영역의 층과 전극 또는 단일 지지체에 결합 표면과 전극 표면을 포함하는 다중 지지체를 변경하면서 2개 이상의 지지체를 포함할수 있다. 이것을 ECL 분석 세포의 3차원의 배열을 형성할 것이다. 카세트의 모든 전술한 성분은 임의로 결합 영역 사이의 일부 구역을 제외하고는 투명하다. 예를들면, 다중 투명한 결합 표면, 전극 표면, 및 지지체를 쌓을 수 있다.
제 1 및 제 2 지지체는 이들 사이에 샘플-유지 용적을 제한하기 위해서 평평하게 마주볼 수 있다. 대안적으로, 두 지지체 및 임의의 기타 구성성분이 동일 모양에 따른다는 조건으로 제 1 및 제 2 지지체 층을 타원체형, 입방형, 원통형을 포함하는 기타 적합한 형태로 배치할 수 있다. 예를 들면, 도 10은 두개의 인접한 비-평형 지지체 1102와 1104로부터 형성된 카세트 1100을 도시한다. 각각의 지지체는 배치에서 다른 것에 상보적인 표면을 갖는다. 지지체는 PMAMS 표면 또는 다중 전극 배열 또는 둘 모두를 가질 수 있다. 하나 또는 둘 모두의 지지체는 다른 지지체의 형태를 형성하기 위해서 탄성중합체성일 수 있다. 지지체 또는 카세트는 또한 예비절단 포맷으로 제조되거나 롤 분배기로부터 적합한 길이로 절단될 수 있다. 카세트는 또한 샘플-유지 용적과 샘플 분배 홈, 채널, 결각부 등과 같은 샘플 수령 수단을 포함할 수 있다.
도 37은 매트릭스 (3703) 내 및/또는 매트릭스 상의 결합 영역(3702)이 표면(3701) 상에 제시되는 카세트를 도시한다. 작동 전극 (3704)과 역전극(3705)를 지지하는 제 2 표면 (3700)이 배치되어 결합 영역이 작동 전극에 아주 밀접하게 된다. 결합 영역에 결합된 ECL 표지로부터 광생성을 일으키는 조건하에서, 빛은 표면을 통하여 검출할 수 있다. 광 검출기의 배열(3706, 예를 들면, CCD 배열, 강화된 CCD 배열, 또는 쇄도 포토다이오드 배열)은 각각의 결합 영역으로부터 다수의 광 시그널을 동시에 측정하기 위해서 사용한다. 광 검출기 배열은 결합 영역으로부터 생성된 광의 상을 만든다. 상생성을 개선하기 위해서 렌즈, 반사기 및/또는 광학적가이드를 사용할 수 있다. 다른 실시예에서, 광 검출기(예를 들면, 광 검출 픽셀)의 존 또는 영역으로부터 검출된 빛은 결합 영역에 연관되어 있다. 상 분석은 결합 영역과 검출된 광의 연관에 보조를 위해서 사용할 수 있다. 하나의 바람직한 양태에서, 표면은 탄성중합체성이거나 순수하고 따라서 전극 표면과 접촉한 접촉물을 생성할 수 있다. 결합 영역은 역전극으로부터 작동 전극까지 이온 전류를 이동시킬 수 있는 중합체에 결합한다. 좀더 바람직한 양태에서, 물체는 역전극으로부터 작동 전극까지 이온 전류를 이동시킬 수 있는 물로 불어난 중합체이다.
도 38은 결합 영역(3805, 3806, 3807)이 역전극(3800)에 지지된 분리된 물체(3808, 3809, 3810)의 표면에 제시되는 카세트를 도시한다. 작동 전극(3801)은 물체의 표면에 밀접하게 배치된다. 결합 영역에 결합된 TAGged 그룹으로부터 ECL을 일으키는 조건하에서, 빛은 둘 중 하나 또는 둘 모두의 전극(하나 또는 둘 모두의 전극이 투명하거나 또는 반-투명할 경우)을 통하여 및/또는 측면으로부터 검출될 수 있다. 광 검출기(3802)의 배열은 각각의 결합 영역으로부터 다수의 광 시그널을 동시에 측정하기 위해서 사용한다. 대상은 탄성중합체성이고/거나 순수하며 그러므로 작동 전극과 접촉한 접촉물을 형성할 수 있다. 대상은 역전극으로부터 작동 전극까지 이온 전류를 이동시킬 수 있는 중합체일 수 있다. 물체는 역전극으로부터 작동 전극까지 이온 전류를 이동시킬 수 있는 물로 불어난 중합체일 수 있다.
하나 이상의 결합 영역를 함유하는 투명한 지지체를 피브릴 매트 전극과 접촉하게 한다. 시약을 지지체/결합 영역과 피브릴 매트 사이에서 또는 매트를 통하여 결합 영역로 흐르게 할 수 있다. 빛은 결합 영역으로부터 투명한 지지체를 통하여 검출기로 통과할 수 있다.
다른 바람직한 양태에서, 전극은 전극의 효과적인 표면적을 증가시키기 위해서 광학적으로 탄소 피브릴의 반투명 또는 투명 층으로 코팅할 수 있다.
유익하게도, 본 발명의 PMAMS 지지체 및/또는 카세트를 키트로서 패키지 수 있다. 키트는 분석, 조절 등을 포함하는 ECL 반응을 수행하기 위해서 본 발명에 따라 제조된 하나 이상의 PMAMS 지지체를 포함한다. 시약은 임으로 조절 시약, ECL 분석 및 검정 시약 등을 포함하는 키트에 포함될 수 있다. 다수의 상이한 분석물에 특이한 다수의 결합 시약을 함유하는 시약 혼합물이 포함될 수 있다.
5.9. ECL 반응을 수행하는 장치
하나의 양태에서, 지지체 상의 PMAMS와 동일물을 함유하는 카세트가 하나 이상의 탐침 샘플을 PMAMS 결합 영역에 적용시키고 다수의 ECL 반응을 개시하기 위한 수단을 함유하는 장치에 삽입되도록 설계된다. 이러한 장치는 지지체 또는 카세트에 기초한 다수의 ECL 분석을 수행하도록 본 발명에 따라 적합하게 변형된 통상적인 장치로부터 유도될 수 있다. 본 발명은 상기의 장에서 기재된 PMAMS 의 각각의 특이 양태를 사용하는 ECL 분석을 실행하도록 계조된 다양한 장치를 제공한다. ECL 반응을 수행하기 위한 장치가 Zoski 등에 의해 기재되었다 (미국 특허 제 5,061,445호). 요구되는 변형에는 지지체 및/또는 카세트 조작, 다수의 샘플 운반, 전압 파형의 원에 의한 다중 전극 애드레싱 및 다중 ECL 시그널 습득 및 가공의 공급이 포함된다.
본 발명에 따른 도시된 장치의 요소는 도 6a에 도시되어 있다. 이러한 장치700은 상부 및 하부 지지체 702, 704 및 전극 가드 710을 포함한다. 상부 지지체는 다수의 전극/역전극 쌍(도시되지 않음)을 생성한다. 하부 지지체는 결합 영역 706을 생성한다. 장치는 카세트로부터 전극을 제거하고 전극/역전극을 결합 영역에 결합된 분석물을 접촉시키도록 배치할 수 있다. 시약 또는 유체 유동 공간 708은 결합 영역를 생성하는 지지체에 인접한다. 장치는 또한 동시에 또는 연속적으로 동일하거나 개별적으로 측정된 전압파를 카세트에서 ECL 반응을 개시하는 각각의 다수의 전극/역전극 쌍으로 보낼 수 있고 이어서 방출된 ECL 조사를 광 검출, 예를 들면 광 검출기 수단에 의해 측정할 수 있다. 장치는 또한 지지체 및/또는 카세트의 온도 또는 이의 환경을 유지하고 ECL 반응 조건을 최적화하기 위해 필요한 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단을 포함할 수 있다. 온도 조절 수단은 바람직하게는 가열 및 냉각 수단, 예를 들면 전기적 저항 가열 전지, 냉각 팬, 냉장 수단, 및 기타 적합한 가열 또는 냉각원이다. 온도 조절 수단에는 또한 온도 센서, 예를 들면 서머스탯 또는 서머커플 장치와 검출된 온도 변화에 대해 가열 또는 냉각 수단을 가동 또는 중단하게 하는 수단이 포함된다.
장치는 또한 ECL 반응을 수행하는 하나 이상의 지지체 또는 카세트를 유지, 이동 및 조정하는 수단을 제공한다. 장치는 또한 상기에서 카세트에 대해 기재된 바와 같이 PMAMS 결합 영역에 샘플을 배치하기 위한 고정 또는 이동가능한 샘플 운반 수단을 포함할 수 있다.
장치는 또한 전극의 전압 파형 생성 수단, 예를 들면 포텐쇼스태트로 카세트의 개별적으로 애드레스할 수 있는 전극 접속의 배열을 전기적으로 접속할 수 있는전극 접촉 수단을 포함한다 (미국 특허 제 5,068,088호의 도 5 참조). 파형 생성 수단은 카세트에서 다수의 ECL 반응을 비단독적으로 개시하기 위해서 시그널을 순차적으로 또는 동시에 운반한다.
ECL 분석 동안, 작동 및 역전극 사이의 이온 전류는 이온적으로 전도된 액체를 통하여, 이러한 액체의 얇은 필름을 통하여, 및/또는 이온적으로 전도하는 고체 매트릭스를 통하여 흐를 수 있다.
따라서, 샘플에서 전기화학발광을 측정하기 위한 장치는 전지가 하나 이상의 전극과 하나 이상의 역전극과 다수의 분리된 결합 영역를 포함하는 제 1 지지체으로부터 형성될 수 있는 적어도 하나의 샘플을 유지하기 위한 다수의 전지를 포함할 수 있다. 전극과 역전극은 제 1 지지체의 표면에 제 1 지지체의 결합 영역에 아주 밀접한 또는 제 2 지지체의 표면에 제공할 수 있다. 전극과 역전극은 쌍으로 발생할 수 있다. 전지는 또한 작동 전극에 인접한 전압을 감지하는 다수의 감지 전극을 포함할 수 있다. 카세트는 또한 검정 전극을 함유하는 전지를 포함할 수 있다.
장치는 또한 카세트에서 예를 들면, 하나 또는 다수의 검출 수단에 의해 수행된 ECL 반응을 검출할 수 있는 광 검출 수단을 포함한다. 이러한 검출 수단은 실시예에 의해 단순히 전극 배열을 갖는 레지스터에서 섬유광학 채널의 배열을 포함하고, 이에 인접하게 배치되고, 광검출기 수단의 배열에 연결되거나 방출된 ECL 시그널의 배열을 스캐닝할 수 있는 단일 광 검출기에 접속된다.
장치는 임으로 장치의 다양한 성분의 작용을 조절하기 위해서 디지탈 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 포함한다.
장치는 또한 시그널 프로세싱 수단을 포함한다. 하나의 양태 및 단순히 실시예에 의해서, 단일 프로세싱 장치는 각각의 ECL 분석 결과의 전달, 기록, 분석 및/또는 제시를 위한 디지탈 컴퓨터를 포함한다.
대안적으로, 장치는 예를 들면, 순차적으로 ECL을 개시하는 결합 표면을 가로질러 하나 이상의 전극/역전극 쌍을 스캐닝하는 전극 해독 수단을 포함한다.
크기 배제 필터는 PMAMS의 배열과 병행하여 사용할 수 있다.
5.10. 지속할 수 있는 ECL 분석
본 발명에 따라 사용되는 ECL 표지는 당분야에 공지되어 있는 ECL로부터 선별할 수 있다 (상기의 장 2.2, 및 미국 특허 제 5,310,687호 참조). ECL 표지는 예를 들면 금속이 루테늄, 오스뮴, 레늄, 이리듐, 로듐, 플래티늄, 팔라듐, 몰리브데늄, 테크네튬, 및 텅스텐으로 이루어진 그룹 중에서 선별된 금속-함유 유기 화합물을 포함할 수 있다. ECL TAG 시약을 제조하기 위한 적합한 결합 화학 물질은 익히 공지되어 있고, 예를 들면 Bard 등에 의하여 기재되었다 (미국 특허 제 5,310,687호 및 5,221,605호 참조). ECL 표지의 결합 시약으로의 부착 수단은 공유적 및/또는 비공유적일 수 있다. ECL 표지는 결합 시약에 비-공유적으로 결합할 수 있다 (예를 들면, 소수성 효과 또는 이온성 상호작용을 통하여). 비공유 부착의 다른 실시예에서, ECL 표지는 결합-시약에 비-공유적으로 순차적으로 결합된 복합체에 (공유적으로 또는 비-공유적으로) 결합된다. 더욱 특이한 예는 Ru(bpy)3의 링커를 통한 Ni(II)-트리니트릴로트리아세트산 복합체로의 공유적 부착일 것이다. 이러한 분자는 다수의 히스티딘을 함유하는 펩티드 서열을 포함하는 결합 시약에 부착할 것이다. 유사한 방법(참고문헌; Sassenfeld, 1990, TIBTECH 8:99-93)으로 사용할 수 있는 기타 수용체 리간드 쌍이 당분야에 공지되어 있다. 추가로, (예를 들면, 탄화수소 링커를 통하여) 분지된 네트워크로서 배치된 다수의 유기 금속 화합물(예를 들면, Ru-함유)을 함유하는 ECL 표지를 사용할 수 있다. ECL이 가능한 다수의 유기금속 잔기를 함유하는 이러한 분지된 네트워크를 한번 부착시키거나 분자의 다수의 위치에 ECL이 표지되도록 부착시킬 수 있다. 다른 양태에서, 다수의 유기금속 화합물을 함유하는 ECL 표지는 중합체 쇄(예를 들면, 선형, 측쇄형 또는 사이클릭 중합체)의 길이에 따라 다수의 위치에 부착된 유기금속 그룹을 갖는 선형 중합체이다.
다수의 결합 영역를 당분야에 익히 공지되어 있는 다양한 부가적인 ECL 분석 포맷에서 사용할 수 있다. 양적 분석에서, ECL 표지된 시약의 기지량을 사용하고, 측정된 ECL의 양을 존재하는 분석물의 양을 측정하기 위해서 기지의 표준에 연관시킨다. 전문가들에게 익히 공지되어 있는 방법에 의해 진행, 역, 경쟁적 및 샌드위치 배열을 실행할 수 있다. 경쟁적인 배열에서, 예를 들면 해당 분석물의 양을 다중성분의 양적으로 측정하기 위한 방법에서, 액체 샘플은 하기와 같이 실행된다. 결합 표면을 (a) 결합 영역에 존재하는 결합 시약으로의 결합에서 해당 분석물의 기지량 및 (b) 해당 분석물을 함유하는 것으로 추측되는 샘플과 동시에 접촉시키고, 접촉을 적합한 조건하에서 실행하여 해당 분석물과 리간드가 결합 시약에 경쟁적으로 결합한다. 샘플의 분석물의 존재는 결합 영역에 결합하여 경쟁하는 ECL-표지 리간드의 양을 감소시키고, 따라서 생성되는 ECL의 양을 감소시킬 것이다(어떠한 분석물도 샘플에 존재하지 않을 경우 상대적임). 생성된 결합 영역의 ECL을 개시하고, 방출된 빛의 양이 양적으로 측정하며, 이로 인해 샘플에 존재하는 해당 분석물의 양을 양적으로 측정한다. 이와는 달리, 결합 표면을 ECL 표지된 리간드에 결합시키기에 앞서 샘플을 결합 표면과 접촉시킬 수 있고; 이어서 ECL 표지된 리간드를 PMAMS 표면 상의 샘플로부터 미리 결합된 분석물과 경쟁시키고 일부의 미리 결합된 분석물을 제거한다. 이와 다른 양태에서, 샘플을 ECL-표지된 물질/분자를 함유하기 위해서 처리할 수 있고, 경쟁 분석을 실행하기 위해서 결합 표면을 샘플과 접촉시키는 동시에 또는 이에 앞서 해당 비표지된 분석물의 표준량을 결합 표면과 접촉시킬 수 있다.
샌드위치 분석에서, ECL 표지된 리간드는 해당 분석물의 제 2 결합 잔기에 특이적으로 결합하는 결합 파트너이다. 따라서, PMAMS의 결합 영역의 결합 시약에 특이적으로 결합한 분석물이 샘플에 존재할 경우, 따라서 샘플로부터 분석물에 결합되고 ECL 표지된 결합 파트너에 결합된 결합 영역의 결합 시약으로 이루어진 "샌드위치"가 형성된다. 다른 경쟁적인 샌드위치 분석에서, 분석물 그 자체의 카피는 샘플에의 노출에 앞서 다중배열 결합표면의 결합 영역에 부착된다. (분석물에 특이적으로 결합할 수 있는) ECL 표지된 결합 파트너는 분석 용액 중의 (샘플로부터의) 유리 분석물의 부재시 분석물을 결합시킬 것이지만, 분석 용액 중의 (샘플로부터의) 유리 분석물의 존재시 경쟁적으로 억제될 것이다.
선택적인 양태에서, 순차적인 표지가 수행된다. 예를 들면, 샌드위치 분석의 특정 양태에서, 결합 영역에 결합된 분석물이 연속적으로 분석물의 다수의 ECL 표지된 결합 파트너에 접촉된다. ECL 측정 및 임의적인 세척 단계는 각각의 상이한 결합 파트너와 접촉시키는 사이에 수행된다. 이러한 방법으로 분석물의 다수의 상이한 결합 잔기의 ECL 측정을 실행할 수 있다(예를 들면, CD8+, a, b T 세포 항원 수용체 양성 T 세포). 이와는 달리, 구별할 수 있는 파장의 빛을 방출시키는 다중 ECL 표지는 각각 분석물의 상이한 잔기에 특이적인 상이한 결합 시약에 결합될 수 있다. 또한, 분석물의 상이한 결합 잔기에 특이적인 상이한 결합 시약에 부착된 다수의 구별할 수 있는 보고 수단(예를 들면, ECL 표지, 형광 표지 및 효소 결합 표지)이 각각 예를 들면 CD4+, a, b T 세포 항원 수용체-양성 세포를 CD8+ a, b, T세포 항원 수용체-양성 세포와 구별하는 데에 사용될 수 있다.
바람직한 양태에서 결합 영역은 표지된 단백질 및/또는 핵산 및/또는 세포 및/또는 화학적 종을 함유한다. 이러한 표지된 성분(예를 들면, ECL 표지)을 제조 동안, 분석의 개시에 앞서, 분석 동안 및/또는 분석 말기에 결합 영역에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 다중 표지된 성분을 다양한 시간에 첨가할 수 있고, 순차적인 해독을 할 수 있다. 이러한 해독은 누적적인 정보를 제공할 수 있다. 다른 양태에서, PMAMS의 결합 영역를 여러번 재사용할 수 있다. 주어진 분석을 실행한 후, 표면을 PMAMS 표면의 하나 이상의 결합 영역를 활성을 회복시키는 조건 하에서 세척할 수 있다. 실시예에 의해서, 일부 결합 반응은 반응 용액의 이온 강도를 변화시킴으로써 역전될 수 있다. 대안적으로, 결합 복합체를 해리시키기 위해서 열을 사용할 수 있다. 일부 결합 영역은 본래대로 자기-재생할 수 있다. 촉매(예를 들면, 효소) 작용성을 함유하는 결합 영역은 한번 이상 사용할 수 있다. 결합 영역를 연속적으로 사용하고, 따라서 바이오센서 적용에 사용할 수 있다.
추가로, 분석을 포멧하여 다-배열 다-특이적 유형화된 표면에 부착된 결합 시약을 ECL로 표지한다. 샘플의 해당 특정 분석물에 결합시킬 경우, ECL 시그널이 양적으로 조정될 것이다. 예를 들면, 표면에 부착된 ECL 표지된 결합 시약은 세포 표면상의 분석물, 예를 들면 알파 및 베타 T 세포 항원 수용체 항원, 또는 CD4 또는 CD8 항원과 같은 항원에 특이적일 것이다. 세포의 혼합물에 노출시, 표면에 결합된 세포는 다중-배열 다중-특정 표면과 인접한 전극 표면의 능력이 ECL 표지된 결합 시약을 여기 시키는 것을 입체적으로 저지할 것이고, 따라서 ECL 시그널이 다운-조절된다.
동질 및 이질 분석을 수행할 수 있다. 이질 분석에서, 결합 또는 비결합 표지된 시약을 전기 전위에 함께 노출시키기에 앞서 비결합 표지된 시약을 결합된 표지된 시약으로부터 분리한다 (예를 들면, 세척 단계에 의해). 동질 분석에서, 비결합된 표지된 시약과 결합된 표지된 시약을 전위에 함께 노출시킨다. 동질 분석에서, 결합된 표지된 시약에 의해 방출된 시그널의 강도 또는 스펙트럼 특성은 비결합된 표지된 시약에 의해 방출된 시그널의 강도 이상 또는 이하이다. 각각의 결합 및 비결합된 성분의 존재 또는 부재를 강도에 있어서의 차이를 측정함으로써 결정할 수 있다.
일단 결합 시약을 분석물 또는 이의 경쟁자 및 이의 결합 파트너와 접촉시키는 바람직한 단계가 완료되면, 이어서 ECL 표지는 ECL에 도움이 되는 환경에 처해진다. 적합한 ECL 분석 매질이 당분야에 공지되어 있다. 이러한 분석 매질은 유리하게는 ECL 표지의 ECL을 촉진하는 분자를 포함하고, 옥살레이트, NADH, 및 가장 바람직하게는 트리프로필아민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 "프로모터" 분자는 용액에 유리되어 제공될 수 있거나 앞선 결합에 의해 또는 PMAMS 표면, 표면의 단일층, 결합 영역, 전극 표면, 결합 시약, 및/또는 ECL 표지 등에의 생성에 의해(예를 들면, 화학 반응의 산물로서) 제공될 수 있다. 접촉 단계로부터 생성된 결합 영역에 결합된 ECL 표지를 둘러싼 매질이 ECL에 도움이 될 경우, 매질에의 어떠한 변화도 생겨날 필요가 없다. 대안적으로, 매질은 ECL에 도움이 되는 매질을 제공하기 위해서 조정하거나 대치할 수 있다. 전극 및 역전극을 결합 영역에 근접시키거나 또는 결합 영역과 접촉하도록 가까이 가져와서, 파형을 적용시켜 ECL을 검출하거나 측정한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 결합 시약을 분석물 또는 이의 경쟁자 및 이의 결합 파트너와 접촉시키는 상기에 기재된 단계를 전극 및 역전극의 부재시에 실행하여 샘플을 전극 또는 역전극에 접촉시키지 않는다. 이러한 접촉 단계에 후속적으로, 전극 및 역전극을 ECL 반응을 개시하기 위해서 결합 영역에 결합된 ECL 표지에 충분히 근접하게 한다.
PMAMS를 갖는 지지체는 핵산 가닥을 서열화하기 위해서 사용할 수 있다. 예를 들면, 다수의 결합 영역를 갖는 PMAMS는 상이한 결합 영역의 결합 시약으로서 공지되어 있는 뉴클레오티드 서열의 상이한 올리고뉴클레오티드 탐침으로 제조된다. 즉, 상이한 결합 영역은 상이한 공지되어 있는 뉴클레오티드 서열의 결합 시약을 함유할 것이다. 이어서 서열화되어 있는 올리고뉴클레오티드 쇄 또는 올리고뉴클레오티드 쇄의 분획 PMAMS 결합 영역에 결합(하이브리드화)하게 한다. 서열화된 핵산을 ECL 표지한다. 결합 분석을 PMAMS 상에서 수행하고 PMAMS의 분리된 결합 영역으로부터의 ECL 시그널의 분포는 올리고뉴클레오티드 쇄를 서열화하기 위해서 사용한다.
상기-기재된 방법은 이들의 상보적이거나 다른 핵산 분자에서 실질적으로 상보적인 서열을 하이브리드화하는 짧은 올리고뉴클레오티드의 능력에 기초한다 (참고문헌: 본원에 참고문헌으로 인용되어 있는 Strezoska et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1089-1093; Bains, 1992, Bio/Technology 10: 757-58). 서열 상보성의 바람직한 정도는 성공적인 하이브리드화를 위해 필수적이도록 조건을 선별할 수 있다. 미지 서열의 DNA 분자의 비결정된 서열의 탐침으로의 하이브리드화는 DNA 분자의 상보적인 서열의 존재를 검출한다. 방법은 하이브리드화 반응을 용액 중의 결합 영역 및 샘플 DNA에 결합된 올리고뉴클레오티드 탐침과 함께 실행되도록 바람직하게 실행된다.
PMAMS는 또한 신규한 분자 또는 바람직한 작용(예를 들면, 결합 또는 촉매)의 복합체를 분리하고, 거르고/거나 선별하는 데에 사용할 수 있다. PMAMS는 화합물 및/또는 처치 용도의 납 화합물을 분리하는 데에 사용할 수 있다. 다양한 조합의 화학물질에 의해 합성된 다수의 펩티드, 핵산, 바이러스 벡터, 또는 중합체를 함유하는 PMAMS를 본 발명의 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 광범위하게 다양한 PMAMS 처리된 지지체는 예를 들면, ECL 표지 세포 수용체에 결합시키기 위해 수월하게 거르는 데에 사용할 수 있다. 하나의 방법으로 매우 다양한 무관한 펩티드 서열을 갖는 제 1 PMAMS는 납 결합 펩티드 서열을 분리하기 위해서 사용한다. 이어서 제 1 PMAMS의 해당 분자(예를 들면, 세포 수용체)에의 결합을 나타내는 것에 관련된 서열의 펩티드를 갖는 PMAMS를 사용한다. 바람직한 결합 특성을 갖는 펩티드를 발견할 때까지 과정을 반복한다.
해당 분석물은 예를 들면, 전체 세포, 아세포 입자, 바이러스, 프리온, 비로이드 핵산, 단백질, 항원, 지단백질, 지당류, 지질, 당단백질, 탄수화물 잔기, 셀룰로스 유도체, 항체 또는 이의 분획, 펩티드, 호르몬, 약제, 세포 또는 세포 성분, 유기 화합물, 비-생물학적 중합체, 합성 유기 분자, 유기-금속 화합물 또는 샘플에 존재하는 유기 분자일 수 있다.
샘플은 예를 들면 고체, 유액, 현탁액, 액체 또는 가스로부터 유도할 수 있다. 더욱이, 샘플은 예를 들면 생체 유체 또는 조직, 물, 식품, 혈액, 혈청, 플라즈마, 뇨, 페스, 조직, 타액, 오일, 유기 용매 또는 공기로부터 유도할 수 있다. 샘플은 환원제 또는 산화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 의해서 하기 물질을 검출하거나 측정하는 분석은 물질에 특이한 결합 시약을 본 발명의 결합 표면의 결합 영역로 혼입시킴으로써 수행할 수 있다: 알부민, 알칼라인 포스페이트, 알트/SGPT, 암모니아, 아밀라아제, AST/SGOT, 빌리루빈-토탈, 혈액에 사용된 질소, 칼슘, 이산화탄소, 클로라이드, 콜레스테롤-토탈, 크레아티닌, GGT, 글루코스, HDL 콜레스테롤, 철, LDH, 마그네슘, 인, 칼륨, 단백질-토탈, 나트륨, 트리글리세라이드, 요산, 남용한 약, 호르몬, 심장 혈관의 시스템 조정제, 종양 마커, 감염 질병 항원, 알러지 발병 항원, 면역단백질, 사이토카인 빈혈증/대사 마커, 카바마제핀, 디곡신, 젠타마이신, 리튬, 페노바비탈, 페니토인, 프로카인아미드, 퀴니딘, 테오필린, 토브라마이신, 발프로산, 밴코마이신, 암페타민, 항억제제, 바르비튜레이트, 벤조디아제핀, 카나비노이드, 코카인, LSD, 메타돈, 메타쿠알론, 오피에이트, 페네일린딘, 프로폭시펜, 에탄올, 살리실레이트, 아세타미노펜, 에스타라디올, 프로게스테론, 테스토스테론, hCG/bhCG, 여포 자극 호르몬, 루테인화 호르몬, 프로락틴, 갑상선 자극 호르몬과 같은 티로이드 호르몬, T4, TUP, 토탈-T3, 프리-T4, 프리-T3, 콜티솔, 크레아티닌 키나제-MB, 토탈-크레아티닌 키나제, PT, APTT/PTT, LD ISOs, 크레아티닌 키나제 ISOs, 미오글로빈, 미오광쇄, 트로포닌 1, 트로포닌 T, 클라미디아, 고노레아, 허프스 바이러스, 라임 질환, 엡스타인 바 바이러스, IgE, 루벨라-G, 루벨라-M, CMV-G, CMV-M, 톡소-G, 톡소-M, HBsAg(헤파티티스 B 바이러스 표면 항원), HIV 1, HIV 2, 안티-HBc, 안티-HBs, HCV, 안티-HAV IgM, 안티-HBc IgM, 안티-HAV, HBeAg, 안티-HBeAg, TB, 전립선 특이 항원, CEA, AFP, PAP, CA125, CA15-3, CA19-9, b2-마이크로글로불린, 헤모글로빈, 적혈구 세포, HBcAb, HTLV, ALT, STS 매독, ABO 혈액형 항원 및 기타 혈액형 항원, 사이토메갈로바이러스, 페리틴, B-12, 폴레이트, 글리켈레이티드 헤모글로빈, 암페타민, 항억제제 및 기타 향정신제.
상이한 결합 영역에서의 ECL 측정은 순차적으로 또는 동시에 수행할 수 있다.
세포-표면 단백질인 해당 분석물에 특이한 PMAMS를 먼저 샘플에서 세는 것이바람직한 세포를 함유하는 샘플에 노출시킨다. 바람직한 양태에서, 기지의 샘플 용적 및/또는 희석된 샘플을 적어도 하나의 세포 표면 항원에 특이적인 다수의 결합 영역를 갖는 PMAMS에 노출시킨다. 이어서 결합된 세포를 ECL 택에 결합된 2차 결합 그룹의 부착에 의해 정량할 수 있다. 이것은 세포 유형의 광범위와 상호작용할 수 있는 그룹, 예를 들면 세포막으로 삽입할 수 있는 소수성 그룹 또는 세포 표면 당에 대하여 향하는 렉틴에 결합된 ECL-택이다. ECL-택은 세포 표면 항체에 대하여 향하는 제 2 항체에 결합한다. 좀더 특이한 양태에서, 동일한 부위에 결합한 여러 세포 유형은 다중 ECL-택 표지된 제 2 항체를 사용함으로써 구별할 수 있다. 바람직하게는 세포 표면의 해당 분석물에 특이적인 분리된 결합 영역의 수가 샘플에 존재하여 결합할 세포의 평균 수를 초가한다는 것을 확증한다. 이어서 통계적인 기술을 샘플 용적 당 세포의 수를 측정하기 위해서 사용할 수 있다. 이러한 기술은 또한 예를 들면, 결합 시약이 바이러스 상의 항원을 인식하는 곳에서 바이러스와 같은 기타 입자 수를 세기 위해서 사용할 수 있다. 부위는 세포 크기에 비교하면 작아서 하나의 세포만이 부위에 결합할 수 있고 따라서 통계적인 방법을 사용하여 부위의 총계를 분석할 수 있는 각각의 부위에 대한 디지탈 시그널을 발생시킨다. 부위는 세포의 크기에 비교하면 커서 다수의 세포가 부위에 결합할 수 있다. 이러한 경우에, 각 부위로부터 시그널의 수준은 샘플 용적당 세포의 수를 부여하기 위해 검정할 수 있다. 광 검출기(예를 들면, CCD 카메라 또는 쇄도 포토다이오드 배열)를 사용한 상 분석은 세포를 세고 세포 형태를 측정하기 위해서 사용할 수 있다.
본 발명은 바람직하게는 ECL 반응, 예를 들면 배열을 1000 ECL 반응율로 5내지 15분 동안 수행하기 위한 방법도 제공한다.
5.11. 기타 분석적 방법 및/또는 ECL로 사용하기 위한 PMAMS
검출를 기초로 하는 ECL에 대해 상기에 기재된 기술을 기타 배열 기술과 접합하여, 예를 들면 촉매와 기타 화학 반응을 발생시킬 수 있는 부위로서 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 분리된 결합 영역은 임상 화학적 화학물질 배열, 예를 들면 전기물 측정, 임상적 효소 측정, 혈액 단백질 측정, 글루코스, 뇨, 및 크레아티닌 측정 등과 같은 기타 배열 기술에서 이용할 수 있다. ECL 배열과 결합할 수 있거나 본 발명의 PMAMS와 단독으로 사용할 수 있는 기타 분석 기술에는 화학발광 기초 표지, 형광 기초 분석, 효소-결합 분석 시스템, 전기화학 분석(참고문헌 : Hickman et al., 1991, Science 252:688-691) 및/또는 공명성 검출(예를 들면, 표면 플라스몬 및 음향 기술) 분석 시스템이 포함된다.
드롭의 배열안에 다수의 상이한 화학물질이 존재하는 경사를 갖는 PMAMS 지지체를 사용할 수 있다. 각각의 드롭은 상이한 결합 시약 및/또는 상이한 화학분석(예를 들면, 동일물에 대한 반응 매질)을 함유할 수 있다. 예를 들면, 드롭은 친수성이고, 소수 표면 부위에 의해 둘러싸인 친수성 표면 결합 영역에서 휴지할 수 있다. 드롭은 표면을 덮고 있는 소수성 용액에 의해 보호된다. 분석될 친수성 용액은 소수성 부위에 의해 둘러싸인 친수성 결합 영역를 갖는 제 2 PMAMS에 침착된다. 두 표면은 대응하는 면의 친수성 부위를 접촉시키도록 하기 위해서 근접하게 레지스터링되고 스펙트럼 분석은 화학적 분석의 반응 산물을 검출하기 위해서 실행된다.
피브릴 매트는 친수성 및/또는 소수성 부위에 의해 둘러싸인 다수의 분리된 소수성 부위 및/또는 친수성 부위가 존재하도록 유형화될 수 있다. 결합 시약을 함유하는 수용액의 드롭은 친수성 부위에서 휴지할 수 있고 둘러싸고 있는 소수성 부위에 의해 제한된다. 이러한 드롭은 예를 들면, 피브릴, 피브릴의 집합체, 결합 시약, ECL 시약, 분석용 시약, 계면활성제, PEGs, 세정제, 실시예에 의해서 상기에 언급된 다수의 생물학적 분자 및/또는 이들의 조합을 함유할 수 있다.
제 1 PMAMS를 덮고 있는 소수성 용액은 상단의 친수성 드롭의 부분을 환경으로 노출하기 위해서 통제가능하게 제거한다 (예를 들면, 증발, 위킹). 이어서 광학적 화학 반응에 대해 분석될 친수성 용액을 PMAMS 표면에 노출시키고 분석될 친수성 마이크로-드롭 및 용액을 혼합하고 분석(예를 들면, 스펙트럼)을 수행한다.
PMAMS 결합 영역은 또한 예비-필터 또는 필터로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 세포 특이 PMAMS는 크기 배제 필터와 결합하여 및 특정 세포 유형에 대한 필터로서 단독으로 특정 사례에서 사용할 수 있다. 이어서 생성된 분석물 용액을 아세포 미립자 물질(예를 들면, 바이러스)에 특정한 PMAMS에 노출시킨다. 미립자 아세포 PMAMS 및/또는 크기 배제 필터는 작은 분자(예를 들면, 단백질, 작은 화학적 물체) 분석물 용액을 생성하기 위해서 사용된다. 일련의 PMAMS 분석 시스템을 사용함으로써 분석물 용액을 비-특정 분석물 상호작용을 감소시키기 위해서 순차적으로 정제할 수 있다.
지지체, 전극 및/또는 결합 영역에 사용되는 물질의 광학적 불투명도를 바람직한 성질을 달성하기 위해서 변화시킬 수 있다. 이러한 물질은 두께, 조성, 및/또는 물질의 광학적 밀도에 따라 반투명, 투명 또는 실질적으로 불투명할 수 있다.
피브릴 매트의 광학적 불투명도는 매트의 두께가 증가하면서 증가한다. 매우 얇은 매트는 광학적으로 반투명하다. 더욱 두꺼운 매트는 실질적으로 불투명할 것이다. 일부 실시예에서, 두께가 0.01 ㎛ 내지 0.5 ㎛ 범위인 매트는 실질적으로 반투명할 수 있다. 다른 실시예에서, 20 ㎛ 이상의 두께를 갖는 매트는 실질적으로 불투명하다. 0.5 ㎛ 내지 20 ㎛ 사이의 두께를 갖는 매트는 피브릴 매트의 두께가 증가하면서 증가하는 중간적인 불투명성을 지닌다. 매트의 특정 두께의 광학적 불투명성은 조성, 밀도, 유도작용, 층의 수, 유형 및 매트에 분산된 물질의 양, 및/또는 이의 조합에 좌우될 수 있다. 이것은 또한 사용된 빛의 파장에 좌우될 수 있다.
물질이 해당 두께에서 실질적으로 반투명하고 다른 두께에서 실질적으로 불투명할 경우, 다른(더욱) 깊이로부터 방출된 빛이 실질적으로 물질에 의해 흡수되거나 분산될 수 있는 반면, 물질의 특정 깊이로부터 방출된 빛은 물질 밖으로 통과하여 나갈 수 있다. 하나의 실시예에서, 물질의 변하기 쉬운 불투명성은 물질을 광학적 필터로서 사용되도록 한다.
피브릴 매트에서 특정 깊이로부터 방출된 빛은 실질적으로 매트를 통과하고 검출기가 피브릴 매트의 표면 상에 또는 인접하여 배치된 검출기로 관찰할 수 있다. 다른 깊이로부터 방출된 빛을 매트에 의해 실질적으로 흡수되고/거나 산란될 수 있고 매트의 표면 상에 또는 인접하여 배치된 검출기에 의해 관찰되지 않는다. 피브릴 매트(및/또는 광학적으로 유사한 물질)의 이러한 성질은 ECL 분석의 결합및 비결합 시약을 구별하기 위해서 사용할 수 있다.
특정 시약이 이러한 시약으로부터의 방출이 매트에 의해 실질적으로 또는 전적으로 흡수되거나 산란되는 유공성 물질에서 충분한 깊이로 압력에 의해 (수동적으로 또는 능동적으로) 분산되거나, (예를 들면, 흡입 여과 및/또는 모세관 작용에 의해) 당겨지거나, 윅되거나, 밀릴 수 있다. 하나의 실시예에서, 피브릴 매트는 특정 시약이 통과하고, 특정 시약이 동반되고/거나 특정 시약이 매트의 표면 및 이에 인접하여 얇은 층에 결합하는 물리적 및 광학적 필터로서 작용한다. 하나 이상의 결합 영역에 결합된 시약 및/또는 하나 이상의 결합 영역에 결합된 종에 결합된 종(이러한 부위는 피브릴 매트의 표면에 또는 PMAMS의 매트 표면 가까이의 매우 얇은 층에 위치한다.)은 매트로의 또는 매트를 통한 분산 및 당김 등으로부터 저지된다. 시약 및/또는 기타 용액이 피브릴 매트의 표면 상 및/또는 그 위로 흐르거나 현탁되어 시약은 매트 표면의 매우 얇은 층에만 결합한다. 시약을 매트를 통하여 한번 또는 여러번, 한 방향 또는 그 이상의 방향으로 세척할 수 있다. 시약은 피브릴 매트, 하나 이상의 결합 영역, 하나 이상의 결합 영역에 결합된 다르거나 동일한 시약 에 결합할 수 있거나, 매트의 내부로 끌어들여지거나 매트를 통과할 수 있거나, 이들의 조합이다.
지지체 및/또는 전극으로 사용되는 유공성 물질은 상층이 결합 영역를 갖고 매트내의 다른 층이 결합 영역를 갖지 않는 한 층 이상을 지닐 수 있다. 하나의 실시예에서, (도 29에 개략적으로 도시되어 있는) 피브릴 매트, 상층 2900은 이러한 층 아래로 매트로부터 층 2901, 2902에서 생성된 빛의 통과를 저지하기에 충분히두껍다. 이러한 상층에 결합된 원 2904, 2905로부터 생성된 빛 2903은 매트의 표면에 또는 인접하여 위치한 검출기 2906에 의해 검출될 수 있다. 하부 층 2901, 2902의 원 2907, 2908, 2909로부터 생성된 빛은 일부 또는 모든 층에 의해 흡수되고/거나 산란되고, 검출기 2906, 2910에 의해 검출될 수 있다.
예비-여과 단계는 매트가 제조되기 전에 피브릴 및/또는 피브릴 집합체의 특정한 크기, 유형, 유도체를 선별하기 위해서 사용할 수 있다. 피브릴의 현탁액을 여과하기 위해 사용되는 여과제는 특정 및 다수의 유공성의 피브릴의 매트이다.
유공성 물질(예를 들면, 피브릴 매트)을 결합 영역의 지지체, ECL, 기타 전기화학 적용 또는 시약의 운반을 조절하기 위해 사용될 수 있는 필터 및/또는 빛을 다양한 정도로 전달, 흡수 및/또는 산란 시킬 수 있는 광학적 필터로서 사용할 수 있다.
5.12. 전기크롬 ECL 진열 패널
본 발명은 또한 평평한 패널 진열물에서 사용되는 분리된 전기화학 픽셀의 생성에 대해 제공한다. 석판술은 전기화학적으로 애드레스할 경우 이웃 픽셀에서 제한된 영향을 지니는(즉, 제한된 크로스-토크) 픽셀을 생성하기 위해서 평평한 패널 진열물에 기초한 전기크롬 및 전기화학발광에서 사용되도록 고안되었다 (미국 특허 제 5,189,549호 참조). 이러한 크로스-토크를 감소시키기 위한 석판술의 한계는 전해 물질을 빛의 노출시 틀림없이 이의 전도성을 변화시킬 수 있다는 것이다. 광-유도 전도성 조정을 가능하게 하는 물질을 사용할 필요없이 픽셀 사이에서 크로스-토크를 감소시키고 이로 인해 광범위의 상이한 용액, 겔 또는 필름을 사용하게하는 것이 본 발명의 특징이다.
픽셀의 능동적인 구역인 두개의 전극 표면이 샌드위치 배치에서 서로 직면하는 두개의 표면 상에 있다. 전극 표면을 예를 들면, 보완적인 전극 크롬 물질로 코팅한다. 크로스-토크를 감소시키기 위해서 전도 전해 필름을 전극 표면과 상이한 전극 쌍 사이에(예를 들면, 픽셀 전지 사이) 비-전도성 영역을 갖는 전극 표면 사이에 배치한다. 코팅된 전극 표면이 친수성일 경우, 전극 주위의 표면적은 (예를 들면, 스탬플링 또는 마스크를 통한 침착에 의해) 소수성으로 되도록 하고, 친수성 전도성 미세드롭을 제 1 표면의 전극에 배치하고, 이어서 제 2 표면이 로봇식으로 정렬되고 제 1 표면과 접촉하게 되어 전극이 레지스터하게 된다. 따라서 전해성 미세드롭을 픽셀 사이의 전도성 물질이 없이 하나의 픽셀 내의 부위로 밀어넣을 수 있다. 픽셀의 전극 쌍은 동일한 표면에 아주 밀접하게 나란한다. 코팅된 전극쌍이 친수성일 경우, 두 전극을 포함하는 면적은 친수성 전극 부위 주위의 소수성 환과 함께 친수성으로 되게 한다 (예를 들면, 스탬플링 또는 마스크를 통한 침착에 의해서). 상기의 두 양태에 기재된 미세드롭은 소수성 용액을 사용하여 안정화된다. 용액의 점성은 미세드롭 배열의 안정성을 증가시키기 위해서 증가할 수 있다. 친수성과 소수성이 역전될 수 있다. 다른 양태에서, 미세드롭은 전극쌍 사이 또는 상에서 필름의 안정성 및/또는 전도성(예를 들면, 전도 중합체)을 증가시키기 위해서 중합할 수 있는 용액을 함유할 수 있다. 추가로, 구조적 특색을 픽셀 사이의 크로스-토크를 제한하기 위해서 사용할 수 있다. 예를 들면, 표면 상의 전극 픽셀 쌍을 나란히 둘러쌀 수 있는 환 형태 스탬프 돌출 특색을 갖는 탄성중합체성 스탬프(예를 들면, 폴리(디메틸실옥산))는 전해 용액, 겔, 또는 픽셀 사이의 필름을 분리하기 위해서 사용할 수 있다. 이와는 달리, 나란한 전극 픽셀 쌍을 전극 위의 웰에 배치된 표면, 전해 용액, 겔 또는 필름 상의 전기적 절연 유사 구조에 배치할 수 있고, 전면은 각각의 픽셀의 전해 성분을 분리하고 함유하기 위해서 커버하거나 코팅한다.
5.13. 다른 화학 반응에서 사용하기 위한 PMAMS
본 발명의 PMAMS는 또한 ECL과 조합하지 않고 화학반응을 수행하기 위해서 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기의 5.11 장에 기재된 모든 기술과 비-ECL 분석을 사용할 수 있다.
카세트는 (a) 적어도 하나의 결합 표면, 다른 결합 영역보다 상이한 결합 특이성이 있는 적어도 일부의 분리된 결합 영역, 친수성 및 소수성 부위에 의해 둘러싸인 각각의 다수의 분리된 결합 영역를 형성하기 위해서 표면에 다수의 분리된 결합 영역를 갖는 제 1 지지체 및 (b) 다수의 분리된 결합과 다수의 반응 매질이 접촉하게 하여 각각의 결합 영역에 존재하는 분석될 샘플을 해당 분석물을 검출하거나 측정하기 위해 반응 매질과 접촉시키는 분석 표면을 형성하기 위해서 화학적 분석을 수행하기에 적합한 반응 매질을 포함하는 다수의 친수성 부위를 갖는 제 2 지지체를 포함하는 샘플의 해당 분석물을 검출하거나 측정하기 위해서 제공한다. 이와는 달리, 결합 영역은 소수성이고, 제 2 지지체는 반응 매질을 함유하는 다수의 소수성 부위를 갖는다.
본 발명은 또한 (a) 다수의 분리된 결합 영역이 서로 동일하고 다른 결합 영역 내에 함유된 결합 시약과 특이성에 있어서 상이한 결합 시약을 함유하는 적어도하나의 결합 영역를 포함하는 지지체 표면의 다수의 분리된 결합 영역에서 검출되거나 측정될 분석물을 함유하는 샘플의 드롭을 배치하고, 이때 각각의 분리된 결합 영역은 소수성이거나 친수성임을 특징으로하고, 단 각각의 결합 영역를 둘러싸는 각각의 지지체 표면의 영역은 샘플의 해당 하나 이상의 분석물을 결합 영역에 결합하게 하기 위해서 (i) 결합 영역이 친수성일 경우, 소수성이고 (ii) 결합 영역이 소수성일 경우, 친수성이며, (b) 제 1 지지체의 드롭을 화학적 분석을 수행하기에 적합한 반응 매질을 포함하는 다수의 분리된 친수성 부위를 갖는 제 2 지지체의 표면과 접촉시키며, (c) 결합 영역에 결합한 해당 분석물의 존재를 측정함을 포함하는 샘플의 해당 분석물을 검출하거나 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 다수의 분리된 결합 영역이 서로 동일하고 다른 결합 영역 내에 함유된 결합 시약과 특이성에 있어서 상이한 결합 시약을 함유하는 적어도 하나의 결합 영역를 포함하는 지지체 표면의 다수의 분리된 결합 영역에서 검출되거나 측정될 분석물을 함유하는 샘플의 드롭을 배치하고, 이때 각각의 분리된 결합 영역은 소수성이거나 친수성임을 특징으로 하고, 단 각각의 결합 영역를 둘러싸는 각각의 지지체 표면의 영역은 샘플의 해당 하나 이상의 분석물을 결합 영역에 결합하게 하기 위해서 (i) 결합 영역이 친수성일 경우, 소수성이고 (ii) 결합 영역이 소수성일 경우, 친수성이며, (b) 샘플의 드롭에 반응 배질의 드롭을 배치하며 (c) 결합 영역에 결합한 해당 분석물의 존재를 측정함을 포함하는 샘플의 해당 분석물을 검출하거나 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이러한 양태의 특정 실시예에서, 각각이 화학적 반응에서 기질로서 연속적인 중간물을 이용하는 상이한 효소를 혼입하는 결합 영역은 PMAMS 표면에 위치하여, 연속적인 효소에 대한 반응물인 해당 효소 반응의 산물이 반응 경로에서 다음 효소로 이동한다. 본 발명은 또한 상기에 기재된 방법을 사용하여 자기-조립 단일층의 벌크 고정에 대해, 예를 들면 산업적인 적용에 대해 제공한다.
예를 들면, 한면 또는 두면에 이렇게 고정된 효소를 갖는 시트는 높은 표면적 대 용액 용적 비를 달성하기 위해서 쌓을 수 있다. 이와는 달리, 이러한 고정된 효소는 유공성 물질에 부착될 수 있다. 추가로, 이러한 고정된 효소는 딥스틱, 교반제 상에, 튜브 또는 모세관의 벽에, 또는 배양실과 같은 컨테이너의 벽에 존재할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 상기에서 기재된 바와 같은 비-ECL 분석은 비-ECL 반응을 수행하기 위한, 반드시 결합 시약을 혼입한 것은 아니며 따라서 반드시 결합 영역이 존재하는 것은 아닌 분리된 부위를 함유한다는 점에서 상기에 기재된 바와 같은 PMAMS와는 다른 PMAMS 동족체에서 실행할 수 있다. 이러한 PMAMS 동족체는 반응을 수행하기 위한 분리된 부위를 갖고 분리된 부위로 적용된 용액의 확산 및/또는 분산을 억제하기 위해서 제조된다. 하나의 양태에서, 부위는 반응 매질 및/또는 샘플을 분리된 부위로 제한하는 것을 돕기 위해서 지지체 표면상의 둘러싼 부위에 대하여 소수성이거나 친수성이다. 웰의 용도, 펠트 또는 유공성 물질의 반응 매질 또는 샘플의 침착, 겔, 필름 등의 반응 매질 또는 샘플의 침착 또는 건조를 확산 또는 분산을 억제하기 위해서 사용할 수 있다. 이러한 분리된 부위 각각은 직경 또는 폭으로 1 mm 이하이고 바람직하게는 50 nm 내지 1 mm 범위이고, 가장 바람직하게는 1 ㎛ 내지 1 mm 범위이다. 동일하거나 상이한 반응 매질이 샘플 적용에 앞서 각각의 분리된 부위에 침착될 수 있거나 샘플 적용이 반응 매질의 침착을 진행시킬 수 있다.
비-ECL 분석을 수행하는 PMAMS 동족체 용도의 바람직한 양태에서, 반응 매질의 드롭을 다수의 분리된 부위에 배치하고, 바람직하게는 미세유체 가이드의 배열로부터 동시에 운반되고; 이어서 임의로 안정성을 개선하고/거나 드롭을 보호하기 위해서, 점성 용액(예를 들면, 오일)을 반응 매질의 상단, 또는 이와는 달리 분리된 부위 사이에 배치하며; 이어서 검출되거나 측정될 분석물을 함유하는 샘플을 각각의 분리된 부위로의 분리된 적용에 의해, 또는 벌크로, 부위를 함유하는 PMAMS 동족체의 전면을 유체 샘플에 노출시킴으로써 각각의 부위에 적용한다. 결합 영역에서 생성된 반응이 진행하게 되고, 생성물은 당분야에서 공지되어 있는 것들 중에서 선택된 보고 및 검출 시스템의 사용에 의해 관찰된다.
본 발명은 또한 하기 실시예에 기재되어 있으나 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.
6.1. 마이크로 스탬핑에 의한 MAB PMAMS 표면의 제조
1 내지 2 ㎛ 두께의 노출되고 현상된 포토레지스트 물질을 익히 공지되어 있는 절차에 따라서 사각 배열 유형으로 제조한다. SYLGARD 실리콘 탄성중합체 184(폴리(디메틸실록산); Dow Corning으로부터 시판)와 상응하는 SYLGARD 184 경화제의 10 : 1 혼합물을 물질에 따르고, 경화한다. 중합된 SYLGARD 184를 실리콘 물질로부터 조심스럽게 제거한다. 생성된 탄성중합체성 스탬프는 친수성 OH-종결 알칸 티올로의 노출에 의해 "잉크트" 되고, 에탄올 용액 (1 내지 10 mM) 중의 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH를 정렬된 금 표면에 접촉하여 레지스터된 핀에 로봇식으로 되게 하고 제거한다. 이어서 물질을 소수성 CH3-종결 알칸 티올, SH(CH2)10CH3(에탄올 중의 1 내지 10 mM)의 용액으로 몇 초간 세척한다 (참고문헌 : Kumar et al., supra and Prime et al., Science 252:1164-7). 이어서 생성된 표면을 질소 스트림하에 부드럽게 건조한다. 이어서 친수성 용액을 함유하는 모세관 배열을 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH 부위를 갖는 모세관을 정렬시키는 정렬된 표면과 접촉한 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관은 해당 분석물에 특이적이고 아미노 결합을 통하여 친수성 부위의 반응성 OH 그룹에 공유적으로 결합할 수 있는 모노클론 항체를 함유한다.
6.2. 마이크로-스탬핑에 의한 MAB와 핵산 PMAMS의 제조
1 내지 2 ㎛ 두께의 노출되고 현상된 포토레지스트 물질을 익히 공지된 절차에 따라 사각 배열 유형으로 제조한다. SYLGARD 실리콘 탄성중합체 184와 상응하는 SYLGARD 184 경화제의 10 : 1 혼합물을 물질에 따르고, 경화한다. 중합된 SYLGARD 184를 실리콘 물질로부터 조심스럽게 제거한다. 생성된 탄성중합체성 스탬프는 친수성 OH-종결 알칸 티올로의 노출에 의해 "잉크트" 되고, 에탄올 용액(1 내지 10 mM) 중의 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH를 정렬된 금 표면에 접촉하여 레지스터된 핀에 로봇식으로 되게 하고 제거한다. 이어서 물질을 소수성 CH3-종결 알칸 티올, SH(CH2)10CH3(에탄올 중의 1 내지 10mM)의 용액으로 몇 초간(예를 들면, 2 내지 10 초) 세척한다 (참고문헌 : Kumar et al., supra and Prime et al., Science 252:1164-7). 이어서 생성된 표면을 질소 스트림하에 부드럽게 건조한다. 이어서 친수성 용액을 함유하는 모세관 배열을 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH 부위를 갖는 모세관을 정렬시키는 정렬된 표면과 접촉한 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관은 해당 분석물에 특이적이고 아미노 결합을 통하여 친수성 부위의 반응성 OH 그룹에 공유적으로 결합할 수 있는 클론 항체 또는 변형된 핵산을 함유한다.
6.3. 에칭에 의한 PMAMS의 제조
깨끗한 금 표면을 친수성 OH-종결 알칸 티올, 에탄올 용액(1 내지 10 mM) 중의 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH에 노출시킨다 (Prime et al., Science 252:1164-1167). 미세한 티핑된 에칭 우텐실의 선형 배열을 정렬된 금 표면과 접촉하여 광학적으로 레지스터되도록 로봇식으로 하고, 선형 배열을 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH 부위의 2차원 그리드 배열을 생성하는 표면의 X와 Y 차원 모두에서 에칭하기 위해서 사용한다. 이어서 물질을 소수성 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH(에탄올 중의 1 내지 10mM)의 용액으로 몇초간(예를 들면, 2 내지 10초) 세척한다. 이어서 생성된 표면을 질소 스트림하에 부드럽게 건조한다. 이어서 친수성 용액을 함유하는 모세관 배열을 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH 부위를 갖는 모세관을 정렬시키는 정렬된 표면과 접촉한 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관은 해당 분석물에 특이적이고 아미노 결합을 통하여 친수성 부위의 반응성 OH 그룹에 공유적으로 결합할 수 있는 모노클론 항체 또는 핵산을 함유한다.
6.4. PMAMS 표면 상의 샌드위치 분석
표면에 결합된 1차 항체의 유형화된 다중-특이 배열을 갖는 실질적으로 투명한 투명한 PMAMS 표면을 상기에 기재된 바와 같이 제조한다. 지지체, 전극 분석, 단일층 표면을 투명하도록 선별하여 사용한다. PMAMS 표면을 분석된 해당 분석물을 함유하는 것으로 보이는 용액 샘플에 노출시킨다. 이어서 표면상의 분석물에 결합된 항체를 남긴채로 샘플을 세척한다. 이어서 PMAMS 표면을 표면 상의 결합된 분석물에 특이적인 2차 ECL-표지 항체를 함유하는 용액에 노출시킨다. 이어서 이러한 용액을 분석물이 존재하는 부위에 결합된 ECL 표지 2차 항체를 남긴채로 PMAMS 표면으로부터 세척한다.
전극 분석을 오염 효과를 피하기 위해서 전극 표면과의 샘플의 조급한 접촉을 저지하는 제거할 수 있는 장애물에 의해 보호된다. 이어서 장애물을 제거하고 전극 배열, 즉 분석 완충제로 가습된 것을 PMAMS 표면과 접촉하여 정렬되도록 하다. 전극 배열을 전위 파형 생성기에 연결하고 전위를 작동 전극/역전극 쌍에 적용한다. 이어서 CCD가 방출된 빛을 판독하고 시그널은 시그널을 바람직한 판독된 정보 형태로 전환하는 마이크로프로세서로 전달한다.
판독된 정보를 분석물의 실재량을 측정하기 위해서 해당 분석물의 기지 량의 형태에서 대조군을 사용하여 획득된 판독된 정보와 비교한다.
6.5. 제 1 및 제 2 PMAMS 표면의 분석
표면에 결합된 1차 항체의 유형화된 다중-특이 배열을 갖는 투명한 PMAMS 표면을 상기에 기재된 바와 같이 제조한다. PMAMS 표면을 분석된 해당 분석물을 함유하는 것으로 추측되는 용액 샘플에 노출시킨다. 이어서 표면상의 분석물에 결합된 항체를 남긴채로 샘플을 세척한다.
보호 커버하의 제 2 PMAMS는 ECL 택으로 표지된 다수의 2차 항체의 유형화된 마이크로-드롭이 존재하는 엇갈리는 소수성/친수성 유형과 함께 제공된다.
제 1 PMAMS를 갖는 레지스터의 제 2 PMAMS를 보호하는 장애물을 제거하고 마이크로-드롭을 제 1 PMAMS 상에 1차 항체 결합 영역를 갖는 레지스터로 되게 한다. 제 2 PMAMS를 들어 올리고 전극 배열을 제 1 PMAMS 표면과 접촉하여 정렬되도록 부여한다. 전극 배열을 전위 파형 생성기에 연결하고, 전위를 작동 전극/역전극 쌍에 적용한다. 광 멀티플라이어 튜브는 방출된 빛을 판독하고 시그널을 바람직한 판독된 정보 형태로 전환하는 마이크로프로세서로 전달한다.
판독된 정보를 분석물의 실재량을 측정하기 위해서 해당 분석물의 기지 량의 형태에서 대조군을 사용하여 획득된 판독된 정보와 비교한다.
6.5. PMAMS 표면 상의 핵산 분석
투명한 PMAMS 표면을 표면에 결합된 단일-가닥 핵산 탐침의 유형화된 다중-특이 배열로 상기에 기재된 바와 같이 제조한다. 탐침은 해당 핵산 분석물의 5' 부위에 상보적이다. PMAMS 표면을 분석될 해당 하이브리드화 할 수 있는 핵산 분석물을 함유하는 것으로 추측되고 미리 변성되고, 즉 해당 단일 가닥의 분석물이 되도록 처리된 용액 샘플에 노출시킨다. 이어서 샘플을 하이브리드화된 분석물을 표면에 남긴채로 세척한다. PMAMS 표면을 표면에 결합된 핵산 분석물의 3' 말단에 특이적인 2차 ECL 표지된 핵산 탐침을 함유하는 용액으로 노출시킨다. 이러한 용액을 분석물이 존재하는 부위에 결합된 ECL 표지 핵산 탐침을 남긴채로 PMAMS로 부터 세척한다.
제 1 PMAMS를 갖는 레지스터에서 제 2 PMAMS를 보호하는 장애물을 제거하고 마이크로-드롭을 제 1 PMAMS 상에 1차 항체 결합 영역를 갖는 레지스터로 되게 한다. 제 2 PMAMS를 들어 올리고 전극을 배열하고 제 1 PMAMS 표면과 접촉하여 정렬되도록 한다.
전극 배열을 전위 파형을 생성기에 연결하고, 전위를 작동 전극/역전극 쌍에 연결한다. 이어서 CCD가 방출된 빛을 판독하고 시그널을 바람직한 판독된 정보 형태로 전환하는 마이크로프로세서로 전달한다.
판독된 정보를 분석물의 실재량을 측정하기 위해서 해당 분석물의 기지 량의 형태에서 대조군을 사용하여 획득된 판독된 정보와 비교한다.
6.7. 광멀티플라이어 검출기를 갖는 PMAMS 표면의 경쟁적 분석
투명한 PMAMS 표면을 표면에 결합된 해당 분석물에 특이적인 유형화된 1차 항체의 다중-특이 배열로 상기에 기재된 바와 같이 제조한다. PMAMS 표면을 해당 분석물과 항체에의 결합을 위해 해당 분석물과 경쟁하는 ECL 표지 분자의 기지량을함유하는 것으로 추측되는 샘플의 혼합물인 분석될 용액 샘플에 노출시킨다. 이어서 샘플을 표면에 분석물에 결합된 항체 및/또는 표지된 경쟁적 결합물 남긴채로 세척한다.
전극 배열을 오염 영향을 피하기 위해서 샘플의 전극 표면과의 접촉을 저지하기 위해서 제거가능한 장애물로 보호한다. 이어서 장애물을 제거하고 배열 완충제로 가습된 전극을 배열하고, PMAMS 표면과 접촉하여 정렬되도록 한다. 전극 배열을 전위 파형을 생성기에 연결하고, 전위를 작동 전극/역전극 쌍에 적용한다. 이어서 광멀티플라이어 튜브가 방출된 빛을 판독하고 시그널을 바람직한 판독된 정보 형태로 전환하는 마이크로프로세서로 전달한다.
판독된 정보를 분석물의 실재량을 측정하기 위해서 해당 분석물의 기지 량의 형태에서 대조군을 사용하여 획득된 판독된 정보와 비교한다.
6.8. CCD 검출기를 갖는 PMAMS 표면상의 경쟁적 분석
투명한 PMAMS 표면을 표면에 결합된 1차 항체의 유형화된 다중-특이 배열로 상기에 기재된 바와 같이 제조한다. PMAMS 표면을 분석된 해당 분석물을 함유하는 것으로 추측되는 용액 샘플에 노출시킨다. 이어서 표면상의 분석물에 결합된 항체를 남긴채로 샘플을 세척한다.
보호 커버하의 제 2 PMAMS는 해당 분석물과 경쟁적인 표지된 ECL의 다수의 기지량의 유형화된 마이크로-드롭이 존재하는 엇갈리는 소수성/친수성 유형과 함께 제공된다.
제 1 PMAMS를 갖는 레지스터의 제 2 PMAMS를 보호하는 장애물을 제거하고 마이크로-드롭을 제 1 PMAMS 상에 주요한 항체 결합 영역를 갖는 레지스터로 되게 한다. 제 2 PMAMS를 들어 올리고 전극 배열을 PMAMS 표면과 접촉하여 정렬되도록 한다. 전극 배열을 전위 파형 생성기에 연결하고, 전위를 작동 전극/역전극 쌍에 적용한다. CCD는 방출된 빛을 판독하고 시그널을 바람직한 판독된 정보 형태로 전환하는 마이크로프로세서로 전달한다.
판독된 정보를 분석물의 실재량을 측정하기 위해서 해당 분석물의 기지 량의 형태에서 대조군을 사용하여 획득된 판독된 정보와 비교한다.
6.9. SH(CH2)10CH3알칸 티올을 갖는 마이크로 스탬핑에 의한
MAB PMAMS 표면의 제조
1 내지 2 ㎛ 두께의 노출되고 현상된 포토레지스트 물질을 익히 공지되어 있는 절차에 따라서 사각 배열 유형으로 제조한다. SYLGARD 실리콘 탄성중합체 184(폴리(디메틸실록산); Dow Corning으로부터 시판)과 상응하는 SYLGARD 184 경화제의 10 : 1 혼합물을 물질에 따르고, 경화한다. 중합된 SYLGARD 184를 실리콘 물질로부터 조심스럽게 제거한다. 생성된 탄성중합체성 스탬프는 친수성 OH-종결 알칸 티올로의 노출에 의해 "잉크트" 되고, 에탄올 용액 (1 내지 10 mM) 중의 SH(CH2)11OH를 정렬된 금 표면에 접촉하여 레지스터된 핀에 로봇식으로 되게 하고 제거한다. 이어서 물질을 소수성 CH3-종결 알칸 티올, SH(CH2)10CH3(에탄올 중의 1 내지 10 mM)의 용액으로 몇 초간(예를 들면, 2 내지 10초) 세척한다 (참고문헌 : Kumar et al., supra). 이어서 생성된 표면을 질소 스트림하에 부드럽게 건조한다. 이어서 친수성용액을 함유하는 모세관 배열을 SH(CH2)11OH 부위를 갖는 모세관을 정렬시키는 정렬된 표면과 접촉한 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관은 해당 분석물에 특이하고 아미노 결합을 통하여 친수성 부위의 반응성 OH 그룹에 공유적으로 결합할 수 있는 모노클론 항체를 함유한다.
6.10. SH(CH2)10CH3알칸 티올을 갖는 마이크로 스탬핑에 의한
MAB 및 핵산 PMAMS 표면의 제조
1 내지 2 ㎛ 두께의 노출되고 현상된 포토레지스트 물질을 익히 공지되어 있는 절차에 따라서 사각 배열 유형으로 제조한다. SYLGARD 실리콘 탄성중합체 184 와 상응하는 SYLGARD 184 경화제의 10 : 1 혼합물을 물질에 따르고, 경화한다. 중합된 SYLGARD 184를 실리콘 물질로부터 조심스럽게 제거한다. 생성된 탄성중합체성 스탬프는 친수성 OH-종결 알칸 티올로의 노출에 의해 "잉크트" 되고, 에탄올 용액 (1 내지 10 mM) 중의 SH(CH2)11OH를 정렬된 금 표면에 접촉하여 레지스터된 핀에 로봇식으로 되게 하고 제거한다. 이어서 물질을 소수성 CH3-종결 알칸 티올, SH(CH2)10CH3(에탄올 중의 1 내지 10 mM)의 용액으로 몇 초간(예를 들면, 2 내지 10 초) 세척한다 (참고문헌 : Kumar et al., supra). 이어서 생성된 표면을 질소 스트림하에 부드럽게 건조한다. 이어서 친수성 용액을 함유하는 모세관 배열을 특이한 항체 및/또는 각각의 부위에 혼성화할 수 있는 핵산을 배치하기 위해서 SH(CH2)11OH 부위를 갖는 모세관을 정렬시키는 정렬된 표면과 접촉한 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관은 해당 분석물에 특이하고 아미노 결합을 통하여 친수성 부위의 반응성 OH 그룹에 공유적으로 결합할 수 있는 항체 또는 변형된 핵산을 함유한다.
6.11. 스트렙타비딘-바이오틴 링커를 사용한 PMAMS 표면의 제조
1 내지 2 mm 두께의 노출되고 현상된 포토레지스트 물질을 익히 공지되어 있는 절차에 따라서 사각 배열 유형으로 제조한다. SYLGARD 실리콘 탄성중합체 184 와 상응하는 SYLGARD 184 경화제의 10:1 혼합물을 물질에 따르고, 경화한다. 중합된 SYLGARD 184를 실리콘 물질로부터 조심스럽게 제거한다. 생성된 탄성중합체성 스탬프는 바이오틴화된 티올의 물 분획이 0.1인 머캡토언데캐놀과 12-머캡토(8-바이오틴아미드-3,6-디옥사옥틸)도데칸아미드의 혼합물로의 노출에 의해 "잉크트" 된다 (참고 문헌 : Spinke et al., 1993, Langmuir 9: 1821-5 and Spinke et al., 1993, J. Chem. Phys. 99(9): 7012-9). 이어서 물질을 소수성 CH3-종결 알칸 티올, HS(CH2)10CH3알칸 티올(에탄올 중의 1 내지 10 mM)의 용액으로 몇 초간(예를 들면, 2 내지 10초) 세척한다 (참고문헌 : Kumar et al., supra). 이어서 생성된 표면을 질소 스트림하에 부드럽게 건조한다. 이어서 각각의 모세관에 스트렙타비딘 용액을 함유하는 모세관 배열을 정렬된 표면과 접촉한 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관을 정렬하고 바이오틴화된 부위와 접촉하게 하고 모세관 배열을 제거하고 표면을 세척한다. 다수의 바이오틴화된 항체와 바이오틴화된 핵산 용액을 함유하는 제 2 모세관 배열을 특이한 항체 및 핵산을 각각의부위에 배치하기 위해서 접촉하여 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다.
6.12. MAB 단일 표면의 제조
실리콘 표면의 금 상의 인터디지테이팅 작동 및 역전극의 전극 배열은 당분야에 공지되어 있는 방법(예를 들면, Kumar et al supra)을 통하여 제조된다. 이러한 실시예에서, 전극 배열 및 분리된 결합 배열은 지지체의 동일한 표면에 존재한다. 1 내지 2 ㎛ 두께의 노출되고 현상된 포토레지스트 물질을 익히 공지되어 있는 절차에 따라서 작동 전극의 유형으로 제조한다. SYLGARD 실리콘 탄성중합체 184(폴리(디메틸실록산(PDMS)); Dow Corning으로부터 시판)와 상응하는 SYLGARD 184 경화제의 10 : 1 혼합물을 물질에 따르고, 경화한다. 중합된 SYLGARD 184를 실리콘 물질로부터 조심스럽게 제거한다. 생성된 탄성중합체성 스탬프는 친수성 OH-종결 알칸 티올로의 노출에 의해 "잉크트" 되고, 에탄올 용액 (1 내지 10 mM) 중의 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH를 정렬된 금 전극 배열 표면의 정렬된 작동 전극에 접촉하여 레지스터된 핀에 로봇식으로 되게 하고 제거한다. 이어서 친수성 용액을 함유하는 모세관 배열을 각각의 부위에 특이한 항체를 배치하기 위해서 전극 배열 표면 상의 SH(CH2)11OH- (OCH2CH2)6OH 부위를 갖는 모세관을 정렬시킴으로써 접촉한 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관은 해당 분석물에 특이하고 아미노 결합을 통하여 친수성 부위의 반응성 OH 그룹에 공유적으로 결합할 수 있는 모노 클론 항체를 함유한다.
6.13. MAB 단일 표면 상에서 수행된 분석
상기 6.12에 기재되어 있는 지지체가 제조된다. PDMS 스탬프는 각각이 단독적으로 작동 전극/역전극 쌍을 둘러싸는 환으로 유형화된 포토레지스트 물질로부터 상기에 기재된 바와 같이 제조된다. 이어서 전극 배열 표면을 분석될 샘플에 노출시키고 ECL 표지된 2차 항체의 혼합물로 세척하고 이어서 트리프로필 아민을 함유하는 분석 완충제 용액으로 세척한다. PMS 스탬프를 정렬하고 각각의 전극 쌍 위로 분석 완충제의 각각의 용적 전지를 둘러싸고 제한하기 위해서 PDMS 스탬프의 링을 정렬하면서 접촉하여 레지스트되도록 한다. 오버전위를 작동 전극을 ECL 표지 2차 항체에 노출시키는 표면으로부터 단일층을 방출시키기 위해서 전극쌍에 적용한다. 이어서 광멀티플라이어 튜브가 투명한 PDMS를 통하여 방출된 빛을 판독하고 시그널을 바람직한 판독된 정보 형태로 전환하는 마이크로프로세서로 전달한다.
판독된 정보를 분석물의 실재량을 측정하기 위해서 해당 분석물의 기지 량의 형태에서 대조군을 사용하여 획득된 판독된 정보와 비교한다.
6.14. 작동 전극 및 역전극을 갖는 단일 표면의 제조
실리콘 지지체의 금의 인터디지테이팅 전극 사이에 금 결합 영역를 갖는 인터디지테이팅 작동 및 카운터 금 전극쌍의 전극 배열이 당분야에 공지된 방법(예를 들면 Kumar et al., supra)을 통해 제조한다. 이러한 실시예에서, 전극 배열과 분리된 결합 영역 배열이 동일한 표면에 존재한다. 1 내지 2 ㎛ 두께의 노출되고 현상된 포토레지스트 물질을 익히 공지되어 있는 절차에 따라서 인터디지테이팅 전극 쌍 사이에서 결합 영역의 유형으로 제조한다. SYLGARD 실리콘 탄성중합체 184(폴리(디메틸실록산(PDMS)); Dow Corning으로부터 시판)와 상응하는 SYLGARD184 경화제의 10 : 1 혼합물을 물질에 따르고, 경화한다. 중합된 SYLGARD 184를 실리콘 물질로부터 조심스럽게 제거한다. 생성된 탄성중합체성 스탬프는 친수성 OH-종결 알칸 티올로의 노출에 의해 "잉크트" 되고, 에탄올 용액 (1 내지 10 mM) 중의 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH를 정렬된 금 전극 배열 표면에 접촉하여 레지스터된 핀에 로봇식으로 되게 하고 제거한다. 이어서 친수성 용액을 함유하는 모세관 배열을 각각의 부위에 특이한 항체를 배치하기 위해서 전극 배열 표면 상의 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH 부위를 갖는 모세관을 정렬시키며 접촉한 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관은 해당 분석물에 특이하고 아미노 결합을 통하여 친수성 부위의 반응성 OH 그룹에 공유적으로 결합할 수 있는 항체를 함유한다.
6.15. 작동 및 역전극을 갖는 단일 표면에서 수행된 분석
상기 6.14에 기재된 바와 같은 지지체 표면이 기재된 방법에 의해 제조된다. 제조된 표면을 분석될 샘플에 노출시키고, ECL 표지된 2차 항체의 혼합물로 세척하고, 트리프로필 아민을 함유하는 분석 완충제 용액으로 세척한다. 전극 배열을 전위 파형 생성기에 연결하고, 전위를 작동 전극/역전극 쌍에 적용한다. 광멀티플라이어 튜브가 방출된 빛을 판독하고 시그널을 바람직한 판독된 정보 형태로 전환한다.
판독된 정보를 분석물의 실재량을 측정하기 위해서 해당 분석물의 기지 량의 형태에서 대조군을 사용하여 획득된 판독된 정보와 비교한다.
6.16. 역전극을 갖는 표면의 제조
1 내지 2 ㎛ 두께의 노출되고 현상된 포토레지스트 물질을 익히 공지되어 있는 절차에 따라서 사각 배열 유형으로 제조한다. SYLGARD 실리콘 탄성중합체 184 와 상응하는 SYLGARD 184 경화제의 10 : 1 혼합물을 물질에 따르고, 경화한다. 중합된 SYLGARD 184를 실리콘 물질로부터 조심스럽게 제거한다. 생성된 탄성중합체성 스탬프는 친수성 OH-종결 알칸 티올로의 노출에 의해 "잉크트" 되고, 에탄올 용액 (1 내지 10 mM) 중의 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH를 정렬된 유형화된 역전극 및 금 표면의 사각 결합 영역에 접촉하는 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 하고 제거한다. 유형화된 금 표면은 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH가 스탬프팅한 결합 영역를 둘러싸는 애드레스할 수 있는 환 역전극으로 이루어진다. 갭 또는 분리 공간이 각각의 금 역전극 및 각각의 단일층 결합 영역에 대한 각각의 사각 금 물질 사이에 존재한다. 결합 시약 용액을 함유하는 모세관 배열을 각각의 부위에 특이한 항체 또는 핵산을 배치하기 위해서 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH 부위를 갖는 모세관을 레지스터링한 정렬된 표면과 접촉하여 레지스터된 핀으로 로봇식으로 부여한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관은 해당 분석물에 특이하고 아미노 결합을 통하여 친수성 부위의 반응성 OH 그룹에 공유적으로 결합할 수 있는 항체 또는 핵산을 함유한다.
6.17. 상이한 표면에서 작동 및 역전극을 갖는
단일 표면에서 수행되는 분석
실시예 6.16에서 상기에 기재된 지지체 표면을 분석될 샘플 용액에 노출시킨다. 이어서 지지체 표면을 세척하고 다수의 ECL 표지된 모노클론 항체 또는 상이한 특이성의 ECL 표지된 핵산을 함유하는 용액에 노출하고 트리프로필 아민을 함유하는 분석 완충제로 세척한다. 투명한 애드레스 할 수 있는 작동 전극 배열을 6.16.장에서 상기에 기재된 바와 같은 지지체의 분리된 결합 영역/역전극 부위에 상응하는 배열의 각각의 작동 전극으로 제조한다. 두개의 지지체를 분석 완충제로 가습하고 레지스터 된 정렬 등각 접촉으로 되게 한다. 전극 배열을 전위 파형 생성기에 연결하고, 전위를 두개의 지지체 사이에 전위장을 생성하는 정렬된 작동 전극/역전극 쌍에 적용한다. CCD가 투명한 작동 전극을 통하여 방출된 빛을 판독하고 시그널을 바람직한 판독된 정보 형태로 전환한다.
판독된 정보를 분석물의 실재량을 측정하기 위해서 해당 분석물의 기지 량의 형태에서 대조군을 사용하여 획득된 판독된 정보와 비교한다.
6.18. 진공 여과에 의해 CC(분산된) 피브릴 매트의 제조
1 mg 피브릴/ml 용액을 갖는 CC 피브릴의 수성 슬러리를 0.1% w/w CC 피브릴/탈이온수를 혼합함으로써 제조한다. CC 피브릴을 10분 내지 1시간 동안 슬러리의 400 와트 초음파 처리 혼을 탐침시킴으로써 슬러리에 분산한다(더욱 크고, 마이크론-스케일 집합체를 작은 집합체 또는 개별적인 섬유로 분산한다). 분산의 정도를 광학 현미경에 의해 모니터링한다.
나일론 여과 막(0.47 ㎛ 포어 크기, 25 mm 직경)을 25 mm 직경 프릿화된 필터에 배치한다. 분산된 피브릴 슬러리를 막/필터 설치를 통하여 흡입 여과(도 23a)에 의해 여과한다. 슬러리의 분취량(5 ㎖)을 20 ㎖의 탈이온수로 세척하고, 막/필터 장치를 통하여 희석한다. 약 0.25 내지 0.3 g/cc의 평균 매트에 대해서, 약 100 ㎛의 매트는 6 분취량을 요구한다.
분산액으로부터의 모든 물을 매트로부터 제거할 때까지(시각적 검사에 의해) 흡입 여과를 지속한다. 매트를 여과막으로부터 직접적으로 (손으로) 필링한다.
매트를 약 10 내지 15분 동안 60℃ 오븐에서 건조한다. 매트를 이용하기 위해 절단하고, 펀칭하거나 섹션한다.
6.19. 증발에 의한 금속 망 지지체의 피브릴 매트의 제조
1 mg 피브릴/ mL 용액을 갖는 CC 피브릴의 수성 슬러리를 0.1% w/w CC 피브릴/탈이온수를 혼합함으로써 제조한다. CC 피브릴을 10분 내지 1시간 동안 슬러리의 400 와트 초음파 처리 혼을 탐침시킴으로써 슬러리에 분산시킨다(더욱 큰 마이크론-스케일 집합체를 작은 집합체 또는 개별적인 섬유로 분산한다). 분산의 정도를 광학 현미경에 의해 모니터링한다.
스텐레스 스틸 망의 1 ㎠ 섹션을 25 mm 직경 종이 필터에 배치한다. 슬러리의 5 ml 분취량을 스크린/필터 인셈블 표면에 피펫팅한다. 슬러리 중의 물을 실온 및 압력으로 또는 가열된 오븐에서 증발시키도록 한다.
일단 피브릴 매트를 건조하면, 부가적인 분취량을 첨가한다. 피브릴과 스크린을 여과지로부터 단일 단위로서 필링한다.
매트를 매트를 이용하기 위해 절단하고, 펀칭하거나 섹션한다.
6.20. NHS-에스테르 작용 그룹을 생성하는 피브릴 상의 아비딘의 고정
(Hyperion Catalysts Inc.에 의해 제공된)COOH로 유도된 피브릴을 연속적으로 교반하면서 무수 디옥산 10 mg/ml에 현탁한다. N-하이드록시숙신이미드의 20-폴드 몰 초과량을 첨가하고 용해시키도록 한다. 이어서, 에틸-디아미노-프로필-카보디이미드(EDAC)의 20-폴드 몰 초과량을 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반한다.
교반한 후, 상층액을 빨아 들이고 고체를 무수 디옥산으로 세번 세척하고 무수 메탄올로 한번 세척하고 0.45 ㎛ 폴리설폰 막으로 여과한다. 여과물을 첨가한 메탄올로 세척하고 질량에의 감소가 관찰되지 않을 때까지 진공하에서 유리 바이얼에 방치한다.
10.4 mg의 NHS-에스테르 피브릴을 PBS-1(내지 70 mM 포스페이트, 150 mM NaCl)(ORIGEN 시약 402-130-01, pH 7.8, IGEN, Inc.)로 세척한다. 세척된 피브릴을 아비딘의 2.3 ㎖ 용액(8.5 mg 아비딘/ml PBS-1)으로 현탁한다.
현탁액을 교반을 제공하기 위해서 플라스크를 연속적으로 회전시키면서 실온에서 1.5 시간 동안 가라앉힌다.
1.5 시간 후, 현탁액을 4 ℃에서 16시간 동안 저장하고, 실온이 되게하고 PBS-1으로 세척하고 PBS-1에 현탁액으로서 4℃에서 저장한다.
6.21. 탄소 피브릴의 모노 클론 (항-AFP)의 고정
NHS 에스테르로 작용화된 탄소 피브릴을 실시예 6.20.에 기재된 바와 같이 제조한다.
피브릴-NHS 에스테르 14mg을 500 ㎖의 PBS-1 완충제와 혼합한다. 혼합물을 점성의 슬러리가 될 때까지 20분 동안 초음파 처리한다. 부가적인 500 ㎖의 PBS-1완충액을 첨가한다.
80 ㎖ PBS-1 중의 총 1.6 mg의 항-AFT(알파-태 단백질) 항체를 슬러리에 첨가한다. 반응물은 실온에서 2.5 시간 동안 가라앉히도록 한다.
6 ㎖의 PBS-1 완충제를 첨가하고 반응 혼합물을 4℃에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 피펫에 의해 제거한다. 이러한 절차를 아홉 번 반복한다.
최종 세척 후, 상층액을 제거하고, 피브릴-항 AFT 산물을 4 ℃에 저장한다.
6.22. 피브릴 매트의 사이클릭 볼타모그램;
피블리 매트와 금 호일 전극의 비교
0.5 M K2SO4중의 사이클릭 볼타모그램의 6mM Fe3+/2+(CN)6을 측정한다. 도 30 A에서, (분산된) CC의 평평한 피브릴 매트에 대한 CV를 10, 25 및 50 mV/초에서 0.10 mA/cm으로 측정한다. 매트를 실시예 6.18에 기재된 바와 같이 제조한다. 도 30b에서, CV를 10, 25 및 50 mV/초에서 0.10 mA/cm으로 금 호일 전극에 대해 측정한다. 모든 전위는 볼트 대 Ag/AgCl이다.
6.23. 피브릴 매트 전극의 전기화학적 성질;
매트의 두께와 아노딕 피크 전류와의 비교
0.5 M K2SO4중의 사이클릭 볼타모그램의 6mM Fe3+/2+(CN)6을 동일한 기하 면적(0.20 ㎠)이지만 상이한 두께의 피브릴 매트에 대해 측정한다. 아노딕 피크 전류(도 31)은 두께에 대해 24 내지 425 ㎛의 매트의 두께가 증가함과 함께 증가한다. 각각의 두께에 대해, 아노딕 피크 전류는 또한 (10 내지 150 mV/초 범위의) 스캔율이 증가함과 함께 증가한다. 두께의 작용으로서의 아노딕 피크 전류의 증가율은 또한 두께를 증가시킴과 함께 증가한다. 24 ㎛ 두께의 피브릴 매트는 금 호일 전극에 비하여 행동한다.
6.24. 단백질의 피브릴에의 비-특이 결합
단백질의 탄소 피브릴에의 비-특이 결합을 하기와 같이 측정한다 : i) Ru(bipy)3 2+("TAG1") 표지된 단백질의 용액을 평형에 도달할 때까지 탄소 피브릴의 기지량에 노출시킨다 ; ii) 비표지-단백질/피브릴 용액을 원심분리하고, 상층액을 수집하고, iii) 비표지-단백질의 상층액에서의 잔여량을 전기화학발광(ECL)을 사용하여 분석한다.
도 32에 도시된 곡선을 생성하기 위해서, 유도된 TAG1 3 ㎍/㎖에 부착된 항-CEA 항제(항체 대 유도된 TAG1 ECL 표지에 부착된 카시노배 항원)을 0.1 M 칼륨 포스페이트 완충액의 CC(평평한) 피브릴의 연속적인 희석액에 첨가한다. 피브릴을 20분 동안 와동한 후 원심분리에 의해 제거한다. 상충액에 잔여하는 (비결합) 단백질 양을 측정하는 ECL 분석을 ORIGEN 분석 완충제로 5번 희석된 반응 혼합물 상층액의 분취량의 ORIGEN 1.5(IGEN, Inc.) 분석기에서 실행한다. (피브릴에 노출되지 않은 반응 혼합물의 대상에 대한 ECL 시그널에 대하여) ECL 시그널의 감소가 탄소 피브릴의 더 높은 농도가 존재할 경우, 유도된 TAG1으로 표지된 단백질의 증가된 결합으로부터 생성된다.
6. 25. 세제/계면 활성제를 이용한 비특이적 피브릴 결합 단백질의 감소
실시예 6.2.4에 기술된 방법을 이용하여, 피브릴 결합 단백질에 대한 계면 활성제의 영향을 분석한다. 유도 TAG1/피브릴 혼합물에 부착된 안티-CEA에 트리톤X-100을 가하고, 상기 용액을 20 분간 배양시키고, 튜브를 여과하여, 분취량의 상청액을 ORIGEN 정량 완충제로 5 회 희석하여 ECL에 의하여 분석한다. 결과를 하기의 표 1 및 도 33에 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00002
용액 내의 유도 TAG1로 표지된 단백질의 ECL 강도 대 트리톤 X-100 농도를 도시한 결과 곡선을 도 33에 나타낸다. 높은 ECL 시그널은 상층액 내에 유도-TAG1-표지 단백질이 더 많음을 나타내는 것이며, 이는 피브릴에 결합된 유도-TAG1-표지 단백질이 더 적음을 나타내는 것이다. 10 ppm 내지 100 ppm의 농도의 트리톤X-100은 결합 정도를 감소시킨다; 농도를 100 내지 2000 ppm으로 증가시키면 더 이상 결합 정도를 감소시키지 않는다.
6. 26. 피브릴 매트 전극을 가진 용액 내의 자유 TAG의 ECL
도 34에 나타난 "피브릴 전지" 설비의 작동 전극 홀더 3401의 정점 지역 3403 내에, 실시예 6. 18에서 제조한 피브릴 매트를 설치한다. 홀더 3401을 전기화학 전지 구획 3400의 바닥으로 미끄러지게 한다. 3 M Ag/AgCl 기준 전극(Cyprus # EE 008)을 기준 전지 홀 3402를 통하여 전기화학 전지 내에 설치한다. 전지를 정량 완충제 (IGEN # 402-005-01 lot# 5298)로 충진시키고, PMT 홀더 3404에 부착시킨다. EG&G PARC 모델 175 만능 프로그래머 및 EG&G 모델 175 일정전위기/검류전위기를 이용하여, 전위를 100 mV/s로 0 V 내지 +3 V vs. Ag/AgCl로 스위핑한다. Pac ific Instrument 모델 126 광도계에 의하여 900 V의 동력이 공급되는 Hamamatsu R5 600U-01을 이용하여 ECL을 측정한다. HEM Snap-Master에 의하여 작동되는 CIO-DAS-1601 A/D 보드를 이용하여, 10 Hz에서 아날로그 데이타를 계수화한다. 피브릴 전지를 유출시키고, 1000 pM TAG1 (IGEN # 402-004-C lot# 4297)로 플러싱하고, 1000 pM TAG1으로 충진시킨다. 전위를 정량 완충제를 이용하여 스위핑한다. 정량 완충제 3501 및 1000 pM TAG1 3502에 대한 ECL선(24.0 ±0.2 ℃에서 측정)을 도 35에 나타낸다. 흑색으로 수정된 ECL 피크 면적은 정량 완충제에 대하여 22.10 nAs이며, 1000 pM TAG1에 대하여 46.40 nAs이다.
6. 27. 피브릴 매트 전극을 이용한 흡수 표지된 항체의 ECL
피브릴 매트를 실시예 6. 18에 기술한 방식으로 평평한 cc-분산 피브릴로부터 0.0035 inch의 두께로 제조한다. 그리고 나서, 건조 매트를 3 mm 디스크로 펀칭하고, 지지체 상에 고정시킨다. 본 실험에 사용되는 지지체는 전도성 금 잉크가 프린팅된 스크린을 따라 만들어진 0.03 inch의 폴리에스테르로부터 제조된 것이다. 이러한 전도성 금 잉크는 역전극, 기준 전극을 형성하고, 작동을 위한 납과 기타 전극을 제공한다. 두 개의 피브릴 디스크를 전도성 테이프(Adhesives Reaserch)를 함유한 양면 탄소를 이용하여 각각 유형화된 지지체 상에 고정시킨다. 고정시킨 후, 탈이온수 내의 유도 TAG1에 부착된 10 ㎍/ml의 항-TSH 항체 디스크 0.5 ㎕ (Ru-TSH mono 1:2 26JUN95, IGEN, Inc.) 또는 탈이온수 내의 10 ㎍/ml의 항-TSH unTAG1'ed 포착 항체 0.5 ㎕ (TSH poly 25JUN95, IGEN, Inc.)를 이용하여 점적하고, 건조시킨다. 건조 후, 매트를 IGEN 정량 완충제로 충진시킨다. 지지체 상에 충진된 매트를 IGEN Origen 1.5 기제 장치 내에 적재하고, 500 mV/s의 스캔 율로 0 내지 4500 mV의 ECL을 판독한다. 도 43은 매트 4301을 함유한 TAG1-항체로부터의 피크 ECL 시그널과 매트 4302를 함유한 unTAG1'ed 포착 항체를 대조한다.
6. 28. 샌드위치 분석을 위한 피브릴 매트 전극을 이용한 ECL
상기와 같이 항-AFP 포착 항체를 피브릴 상에 고정시킨다. 항-AFP 피브릴을 탈이온수(dI) 내에서 세척하고, 1 mg/ml의 밀도로 재현탁시킨다. 실시예 6. 18에 기술한 바와 같이 진공 여과를 이용하여 네 개의 층의 피브릴 매트를 제조한다. 2 mg의 항-AFP 피브릴을 3 mg의 평평한 CC 분산 피브릴에 가하고, 혼합물을 dI 내의 전체 부피 20 ml로 희석시킨다. 희석된 혼합물을 0.45 ㎛ 나일론 필터 상으로 여과한다. 그리고 나서, 이러한 초기의 매트 층 다음에 각각 5 mg의 평평한 CC 분산 피브릴로 구성되는 두 개의 코어 층을 위치시킨다. 그리고 나서, 매트 코어의 상부에초기 층과 동일한 혼합 피브릴 층을 위치시킨다. 이는 상부 및 하부 표면 상에 40%의 항-AFP 피브릴과 코어 내에 100%의 평 피브릴의 결과를 초래한다. 상기 혼합 매트를 진공하에서 공기 건조시키고, 3 mm 디스크로 펀칭한다. 그리고 나서, 실시예 6. 27에 기술한 바와 같이 상기 디스크를 지지체 상에 고정시킨다. 건조, 지지된 항-AFP 매트를 AFP 눈금 측정기 A, C 및 F로 충진시키고, 벤치 상부에서 실온하에 15 분 간 배양시킨다. 배양 후, 지지된 전극을 dI 증기로 10 초 동안 세척한 후, 린트 프리 와이프로 건조되도록 닦아낸다. 그리고 나서, 피브릴 매트를 유도 TAG1 (IGEN, Inc.)로 표지된 항체에 부착된 항-AFP로 충진시키고, 벤치 상부에서 실온하에 15 분 간 배양시킨다. 배양 후, 지지된 전극을 dI로 세척하고, 와이프로 건조시킨다. 그리고 나서, 피브릴 매트를 IGEN 정량 완충제로 충진시키고, 실시예 6. 27에 기술한 바와 같이 판독한다.
6. 29. 폴리아크릴아미드 표면 상에서 TAG1 표지 아비딘의 ECL 검출
공지의 조건(암모늄 퍼설페이트 및 TEMED로 개시)을 이용하여, 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드와 N-아크릴로일-N'-바이오티닐-3,6-디옥소옥탄-1,9-디아민(트리(에틸렌 글리콜) 링커를 통하여 아크릴아미드 부분에 결합된 바이오틴)을 공중합함으로써, 공유 결합 바이오틴을 함유한 가교 폴리아크릴아미드 겔을 제조한다. 본 실험에서, 세 단량체의 농도는 각각 2.6 M, 0.065 M 및 0.023 이다(이러한 아크릴아미드 및 비스-아크릴아미드의 농도는 대부분의 단백질보다 기공 크기가 작은 겔을 생성하는 것으로 보고되었다). 약 0.7 mm의 거리를 둔 두 유리 판 사이에 단량체를 함유한 용액의 중합은 동일한 두께의 슬랩 겔을 형성시킨다. 중합 반응의완결 후, 네 개의 PBS 체인지 내에 겔을 침지함으로써 비함침 바이오틴을 세척하여 제거시킨다. 유도 TAG1 표지 아비딘( 본 실험에서는 NeutrAvidin이라 언급되는, NSB 감소를 위하여 변형된 아비딘을 사용한다)을 PBS 내 50 ㎍/mL의 농도로 단백질을 함유하는 용액 내에 20 분 간 침지함으로써 겔 표면에 결합시킨다. 그리고 나서, ECL 정량 완충제(200 mM 인산 나트륨, 100 nM 트리프로필아민, 0.02% (w/v) Tween-20, pH 7.2)의 네 개의 체인지 내에 겔을 침지함으로써, 과량의 TAG1-표지 아비딘을 세척하여 제거시킨다. 도 39에 도시한 바와 같이, 겔을 유리 지지체(1903) 상에 유형화된 금 작동 (3901) 및 역전극(3902)과 접촉하도록 위치시킨다. 500 m V/s의 비율로 두 전극을 통하여 0.0 에서 3.0 V로, 다시 0.0 V로 전압을 램핑시키면 겔 위에 위치한 PMT(3904)로부터 측정된 ECL 광 시그널이 유도된다. 아크릴아미드 유도체를 함유한 바이오틴을 포함하지 않고 제조된 겔은 ECL 시그널을 보이지 않는다(도 41). 바이오틴 함유 중합체에 대하여 얻어진 시그널은 완전한 단백질 단일층이 겔 표면 상에 존재함을 암시한다.
6. 30. 폴리아크릴아미드 표면 상의 ECL 샌드위치 면역분석
실시예 6. 29에 기술한 바와 같이, 공유 결합된 바이오틴을 함유하는 가교 폴리아크릴아미드 겔을 제조한다. 겔 표면에 스트렙타비딘을 흡착하여, 바이오틴 표지 종을 포착할 수 있는 결합 영역을 형성시킨다. 상기 표면을, 트리프로필아민, 미지의 농도의 분석물, 분석물에 대한 바이오틴 표지 항체, 및 분석물에 대한 상이한 ECL TAG1 표지 항체를 함유한 용액으로 처리한다. 분석물의 존재는 분석물 복합체 및 스트렙타비딘 표면 상에 포착되는 두 항체의 형성을 야기시킨다. 실시예 6.29에 기술된 바와 같이, 표면 상에 존재하는 2 차 항체에 결합된 ECL 표지를 측정한다.
6. 31 전극 상에 지지된 폴리아크릴아미드 표면 상에서 다수 ECL 샌드위치 면역분석
공지된 방법에 따라 1 내지 2 미크론 두께의 노출, 현상된 감광성 내식막 마스터를 제조하여, 배열 내에 원형 침강의 유형을 생성한다. SYLGARD 실리콘 탄성체 184와 대응 SYLGARD 184 경화제의 10:1 혼합물을 마스터에 부은 다음, 경화시킨다. 중합된 SYLGARD를 실리콘 마스터로부터 제거한다. 생성되는 탄성 스탬프를 에탄올 내에 히드록실 말단 티올 HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH (1내지 10 mM)을 함유한 용액에 노출시킴으로써 잉킹하고, 정렬된 금 기질과 접촉시킨후, 제거한다. 상기 기질을 티올 HS-(CH2)10-CH3(에탄올 내에 1 내지 10 nM)을 함유한 용액으로 수 초 동안 세척한다. 그리고 나서, 결과적인 표면을 에탄올로 헹구어 내고, 질소 스트림 하에서 건조시킨다. 디옥산 내에 아크릴로일 클로라이드 및 트리에틸아민을 함유한 용액으로 표면을 처리하면, 아크릴레이트 그룹을 가진 히드록실 말단 영역이 작용화된다. 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드, N-아크릴로일석신이미드, 아조-비스-시아노발레 산, 및 아미노기를 제시하는 항체의 혼합물을 함유한 모세관 배열을 아크릴레이트 말단 영역으로 모세관을 정렬하는 정렬된 표면과 접촉시켜, 특이적 항체를 각 영역에 함유하는 예비 중합체 용액을 위치시킨다. 모세관 배열 내의 각 모세관은 상이한 해당 분석물 특이성 항체를 함유한다. 소량의 유형화된 예비 중합체를 UV 선에노출시키면, 표면의 결합 영역을 제시하는 기질 상에 가교 겔을 형성한다. 트리프로필아민과 ECL-TAG1 표지 2 차 항체를 함유하는 완충 용액 내에서 겔 표면 상에 제시된 하나 이상의 결합 영역에 결합할 수 있는 분석물의 혼합물로 기질을 처리함으로써, 분석을 수행한다. 결합 영역 (4200, 4201, 4202) (폴리아크릴아미드 상(4203) 금 전극 상(4232))을 도 42 A-B에 도시하는 바와 같이 ITO 작동 전극(4204)과 근접하여 위치시킨다. 각 결합 영역으로부터 발산된 광을 CCD 카메라를 이용하여 분석하고, 시료 용액 내에 포함된 내부 표준에 대한 결합 영역과 비교한다.
6. 32. 전극 상에 지지된 폴리아크릴 표면 상에서의 다수 ECL 경쟁 면역학적 분석
공지된 방법에 따라 1 내지 2 미크론 두께의 노출, 현상된 감광성 내식막 마스터를 제조하여, 배열 내에 원형 침강의 유형을 생성한다. SYLGARD 실리콘 탄성체 184와 대응 SYLGARD 184 경화제의 10:1 혼합물을 마스터에 부은 다음, 경화시킨다. 중합된 SYLGARD를 실리콘 마스터로부터 제거한다. 생성되는 탄성 스탬프를 에탄올 내에 히드록실 말단 티올 HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH(1 내지 10 mM)을 함유한 용액에 노출시킴으로써 잉킹하고, 정렬된 금 기질과 접촉시킨후, 제거한다. 상기 기질을 티올 HS-(CH2)10-CH3(에탄올 내에 1 내지 10 mM)을 함유한 용액으로 수 초 동안 세척한다. 그리고 나서, 생성되는 표면을 에탄올로 헹구어 내고, 질소 스트림 하에서 건조시킨다. 디옥산 내에 아크릴로일 클로라이드 및 트리에틸아민을 함유한 용액으로 표면을 처리하면, 아크릴레이트 그룹을 가진 히드록실 말단 영역이 작용화된다. 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드, N-아크릴로일석신이미드, 아조-비스-시아노발레 산, 및 아미노기를 제시하는 항체의 혼합물을 함유한 모세관 배열을 아크릴레이트 말단 영역으로 모세관을 정렬하는 정렬된 표면과 접촉시켜, 특이적 항체를 각 영역에 함유하는 예비 중합체 용액을 위치시킨다. 모세관 배열 내의 각 모세관은 상이한 해당 분석물 특이성 항체를 함유한다. 유형화된 예비 중합체 적(droplet)을 UV 선에 노출시키면, 표면의 결합 영역을 제시하는 기질 상에 가교 겔을 형성한다. 분석물의 트리프로필아민과 ECL-TAG1 표지 아날로그를 함유하는 완충 용액 내에서 겔 표면 상에 제시된 하나 이상의 결합 영역에 결합할 수 있는 분석물의 혼합물로 기질을 처리(예를 들면, 결합 영역에의 결합을 위하여 경쟁 ECL-TAG1 표지 및 표지되지 않은 분석물를 설치)함으로써, 분석을 수행한다. 결합 영역(4200, 4201, 4202) (폴리아크릴아미드 상(4203) 금 전극 상(4232))을 도 42 에 도시하는 바와 같이 ITO 작동 전극(4204)과 근접하여 위치시킨다. 각 결합 영역으로부터 발산된 광을 CCD 카메라를 이용하여 분석하고, 시료 용액 내에 포함된 내부 표준에 대한 결합 영역과 비교한다.
6. 33. 전극 상에 지지된 폴리아크릴아미드 표면 상의 전지 결합을 위한 다수의 ECL 분석
공지된 방법에 따라 1 내지 2 미크론 두께의 노출, 현상된 감광성 내식막 마스터를 제조하여, 배열 내에 원형 침강의 유형을 생성한다. SYLGARD 실리콘 탄성체 184와 대응 SYLGARD 184 경화제의 10:1 혼합물을 마스터에 부은 다음, 경화시킨다.중합된 SYLGARD를 실리콘 마스터로부터 제거한다. 생성되는 탄성 스탬프를 에탄올 내에 히드록실 말단 티올 HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH (1 내지 10 mM)을 함유한 용액에 노출시킴으로써 잉킹하고, 정렬된 금 기질과 접촉시킨 후, 제거한다. 상기 기질을 티올 HS-(CH2)10-CH3(에탄올 내에 1 내지 10 mM)을 함유한 용액으로 수 초 동안 세척한다. 그리고 나서, 결과적인 표면을 에탄올로 헹구어 내고, 질소 스트림 하에서 건조시킨다. 디옥산 내에 아크릴로일 클로라이드 및 트리에틸아민을 함유한 용액으로 표면을 처리하면, 아크릴레이트 그룹을 가진 히드록실 말단 영역이 작용화된다. 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드, N-아크릴로일석신이미드, 아조-비스-시아노발레 산, 및 아미노기를 제시하는 항체의 혼합물을 함유한 모세관 배열을 아크릴레이트 말단 영역으로 모세관을 정렬하는 정렬된 표면과 접촉시켜, 특이적 항체를 각 영역에 함유하는 예비 중합체 용액을 위치시킨다. 모세관 배열 내의 각 모세관은 상이한 해당 분석물 특이성 항체를 함유한다. 유형화된 예비 중합체 적을 UV 선에 노출시키면, 표면의 결합 영역을 제시하는 기질 상에 가교 겔을 형성한다. 트리프로필아민과 ECL-TAG1 표지 2 차 항체 및/또는 기타 분석물 특이성 결합제를 함유하는 완충 용액 내에서 겔 표면 상에 제시된 하나 이상의 결합 영역에 결합할 수 있는 분석물의 혼합물로 기질을 처리함으로써, 분석을 수행한다. 결합 영역 (4200, 4201, 4202) (폴리아크릴아미드 상(4203) 금 전극 상(4232))을 도 42 A-B에 도시하는 바와 같이 ITO 작동 전극(4204)과 근접하여 위치시킨다. 각 결합 영역으로부터 발산된 광을 CCD 카메라를 이용하여 분석하고, 시료 용액 내에 포함된 내부 표준에대한 결합 영역과 비교한다.
6. 34. 전극 상에 지지된 폴리아크릴아미드 표면 상에서 분석물의 전지에의 결합을 위한 다수 ECL 분석
공지된 방법에 따라 1 내지 2 미크론 두께의 노출, 현상된 감광성 내식막 마스터를 제조하여, 배열 내에 원형 침강의 유형을 생성한다. SYLGARD 실리콘 탄성체 184와 대응 SYLGARD 184 경화제의 10:1 혼합물을 마스터에 부은 다음, 경화시킨다. 중합된 SYLCARD를 실리콘 마스터로부터 제거한다. 생성되는 탄성 스탬프를 에탄올 내에 히드록실 말단 티올 HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH (1 내지 10 nM)을 함유한 용액에 노출시킴으로써 잉킹하고, 정렬된 금 기질과 접촉시킨 후, 제거한다. 상기 기질을 티올 HS-(CH2)10-CH3(에탄올 내에 1 내지 10 mM)을 함유한 용액으로 수 초 동안 세척한다. 그리고 나서, 결과적인 표면을 에탄올로 헹구어 내고, 질소 스트림 하에서 건조시킨다. 디옥산 내에 아크릴로일 클로라이드 및 트리에틸아민을 함유한 용액으로 표면을 처리하면, 아크릴레이트 그룹을 가진 히드록실 말단 영역이 작용화된다. 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드, N-아크릴로일석신이미드, 아조-비스-시아노발레 산, 및 아미노기를 제시하는 항체의 혼합물을 함유한 모세관 배열을 아크릴레이트 말단 영역으로 모세관을 정렬하는 정렬된 표면과 접촉시켜, 특이적 항제를 각 영역에 함유하는 예비 중합체 용액을 위치시킨다. 모세관 배열 내의 각 모세관은 상이한 해당 분석물 특이성 항체를 함유한다. 유형화된 예비 중합체 적을 UV선에 노출시키면, 표면의 결합 영역을 제시하는 기질 상에 가교 겔을 형성한다. 트리프로필아민과 ECL-Tag 표지 2차 항체 및/또는 기타 분석물 특이성 결합제를 함유하는 완충 용액 내에서 겔 표면 상에 제시된 하나 이상의 결합 영역에 결합할 수 있는 분석물의 혼합물로 기질을 처리함으로써, 분석을 수행한다. 결합 영역 (4200, 4201, 4202) (폴리아크릴아미드 상(4203) 금 전극 상(4232))을 도 42 A-B에 도시하는 바와 같이 ITO 작동 전극(4204)과 근접하여 위치시킨다. 각 결합 영역으로부터 발산된 광을 CCD 카메라를 이용하여 분석하고, 시료 용액 내에 포함된 내부 표준에 대한 결합 영역과 비교한다.
6. 35. 전극 상에 지지된 폴리아크릴아미드 표면 상에서의 다수 ECL 경쟁 하이브리드화 분석
공지된 방법에 따라 1 내지 2 미크론 두께의 노출, 현상된 감광성 내식막 마스터를 제조하여, 배열 내에 원형 침강의 유형을 생성한다. SYLGARD 실리콘 탄성체 184와 대응 SYLGARD 184 경화제의 10:1 혼합물을 마스터에 부은 다음, 경화시킨다. 중합된 SYLGARD를 실리콘 마스터로부터 제거한다. 생성되는 탄성 스탬프를 에탄올 내에 히드록실 말단 티올 HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH (1 내지 10 mM)을 함유한 용액에 노출시킴으로써 잉킹하고, 정렬된 금 기질과 접촉시킨후, 제거한다. 상기 기질을 티올 HS-(CH2)10-CH3(에탄올 내에 1 내지 10 mM)을 함유한 용액으로 수 초 동안 세척한다. 그리고 나서, 결과적인 표면을 에탄올로 헹구어 내고, 질소 스트림 하에서 건조시킨다. 디옥산 내에 아크릴로일 클로라이드 및 트리에틸아민을 함유한 용액으로 표면을 처리하면, 아크릴레이트 그룹을 가진 히드록실 말단 영역이 작용화된다.아크릴아미드, 비스-아크릴아미드, N-아크릴로일석신이미드, 아조-비스-시아노발레 산, 및 아미노기를 제시하는 항체의 혼합물을 함유한 모세관 배열을 아크릴레이트 말단 영역으로 모세관을 정렬하는 정렬된 표면과 접촉시켜, 특이적 항체를 각 영역에 함유하는 예비 중합체 용액을 위치시킨다. 모세관 배열 내의 각 모세관은 상이한 해당 분석물 특이성 항체를 함유한다. 유형화된 예비 중합체 적을 UV 선에 노출시키면, 표면의 결합 영역을 제시하는 기질 상에 가교 겔을 형성한다. 트리프로필아민과 표면에 결합을 위하여 해당 분석물과 경쟁할 수 있는 ECL-TAG1 표지 서열을 함유하는 완충 용액 내에서 겔 표면 상에 제시된 하나 이상의 결합 영역에 결합할 수 있는 분석물의 혼합물로 기질을 처리함으로써, 분석을 수행한다. 결합 영역 (4200, 4201, 4202) (폴리아크릴아미드 상(4203) 금 전극 상(4232))을 도 42 A-B에 도시하는 바와 같이 ITO 작동 전극(4204)과 근접하여 위치시킨다. 각 결합 영역으로부터 발산된 광을 CCD 카메라를 이용하여 분석하고, 시료 용액 내에 포함된 내부 표준에 대한 결합 영역과 비교한다.
6.36. 전극 상에 지지된 폴리아크릴아미드 표면 상에서의 다수 ECL 하이브리드화 샌드위치 분석
공지된 방법에 따라 1 내지 2 미크론 두께의 노출, 현상된 감광성 내식막 마스터를 제조하여, 배열 내에 원형 침강의 유형을 생성한다. SYLGARD 실리콘 탄성체 184와 대응 SYLGARD 184 경화제의 10:1 혼합물을 마스터에 부은 다음, 경화시킨다. 중합된 SYLGARD를 실리콘 마스터로부터 제거한다. 생성되는 탄성 스탬프를 에탄올내에 히드록실 말단 티올 HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH (1 내지 10 mM)을 함유한 용액에 노출시킴으로써 잉킹하고, 정렬된 금 기질과 접촉시킨후, 제거한다. 상기 기질을 티올 HS-(CH2)10-CH3(에탄올 내에 1 내지 10 mM)을 함유한 용액으로 수 초 동안 세척한다. 그리고 나서, 결과적인 표면을 에탄올로 헹구어 내고, 질소 스트림 하에서 건조시킨다. 디옥산 내에 아크릴로일 클로라이드 및 트리에틸아민을 함유한 용액으로 표면을 처리하면, 아크릴레이트 그룹을 가진 히드록실 말단 영역이 작용화된다. 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드, N-아크릴로일석신이미드, 아조-비스-시아노발레 산, 및 아미노기를 제시하는 항체의 혼합물을 함유한 모세관 배열을 아크릴레이트 말단 영역으로 모세관을 정렬하는 정렬된 표면과 접촉시켜, 특이적 항체를 각 영역에 함유하는 예비 중합체 용액을 위치시킨다. 모세관 배열 내의 각 모세관은 상이한 해당 분석물 특이성 항체를 함유한다. 유형화된 예비 중합체 적을 UV 선에 노출시키면, 표면의 결합 영역을 제시하는 기질 상에 가교 겔을 형성한다. 트리프로필아민과 표면 결합 탐침과 보족성이 아닌 서열에서 분석물과 결합할 수 있는 ECL-TAG1 표지 서열을 함유하는 완충 용액 내에서 겔 표면 상에 제시된 하나 이상의 결합 영역에 결합할 수 있는 분석물의 혼합물로 기질을 처리함으로써, 분석을 수행한다. 결합 영역 (4200, 4201, 4202) (폴리아크릴아미드 상(4203) 금 전극 상(4232))을 도 42 a-b에 도시하는 바와 같이 ITO 작동 전극(4204)과 근접하여 위치시킨다. 각 결합 영역으로부터 발산된 광을 CCD 카메라를 이용하여 분석하고, 시료 용액 내에 포함된 내부 표준에 대한 결합 영역과 비교한다.
6. 37. 전극 상에 지지된 폴리아크릴아미드 표면 상에서의 상이한 유형의 다수 분석
공지된 방법에 따라 1 내지 2 미크론 두께의 노출, 현상된 감광성 내식막 마스터를 제조하여, 배열 내에 원형 침강의 유형을 생성한다. SYLGARD 실리콘 탄성체 184와 대응 SYLGARD 184 경화제의 10:1 혼합물을 마스터에 부은 다음, 경화시킨다. 중합된 SYLGARD를 실리콘 마스터로부터 제거한다. 생성되는 탄성 스탬프를 에탄올 내에 히드록실 말단 티올 HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH (1 내지 10 mM)을 함유한 용액에 노출시킴으로써 잉킹하고, 정렬된 금 기질과 접촉시킨 후, 제거한다. 상기 기질을 티올 HS-(CH2)10-CH3(에탄올 내에 1 내지 10 mM)을 함유한 용액으로 수 초 동안 세척한다. 그리고 나서, 결과적인 표면을 에탄올로 헹구어 내고, 질소 스트림 하에서 건조시킨다. 디옥산 내에 아크릴로일 클로라이드 및 트리에틸아민을 함유한 용액으로 표면을 처리하면, 아크릴레이트 그룹을 가진 히드록실 말단 영역이 작용화된다. 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드, N-아크릴로일석신이미드, 아조-비스-시아노발레 산, 및 아미노기를 제시하는 항체의 혼합물을 함유한 모세관 배열을 아크릴레이트 말단 영역으로 모세관을 정렬하는 정렬된 표면과 접촉시켜, 특이적 항체를 각 영역에 함유하는 예비 중합체 용액을 위치시킨다. 모세관 배열 내의 각 모세관은 상이한 해당 분석물 특이성 항체를 함유한다. 유형화된 예비 중합체 적을 UV 선에 노출시키면, 표면의 결합 영역을 제시하는 기질 상에 가교 겔을 형성한다. 트리프로필아민과 결합 영역에의 결합을 위하여 분석물과 경쟁할 수 있는 ECL-TAG1 표지 아날로그 및/또는 해당 분석물로의 ECL-TAG1 표지 2차 결합제를 함유하는 완충 용액 내에서 겔 표면 상에 제시된 하나 이상의 결합 영역에 결합할 수 있는 분석물의 혼합물로 기질을 처리함으로써, 분석을 수행한다. 결합 영역 (4200, 4201, 4202) (폴리아크릴아미드 상(4203) 금 전극 상(4232))을 도 42 A-B에 도시하는 바와 같이 ITO 작동 전극(4204)과 근접하여 위치시킨다. 각 결합 영역으로부터 발산된 광을 CCD 카메라를 이용하여 분석하고, 시료 용액 내에 포함된 내부 표준에 대한 결합 영역과 비교한다.
6. 38. 고도의 가역적 ECL
다결정성 금 전극(Bio-Analytical Services로부터 구입, 2 mm2)을 0.5 ㎛ 및 0.03 ㎛ 알루미나 슬러리로 연속적으로 핸드 폴리싱한 다음, 1:3 H2O2/H2SO4내에서 화학적으로 부식시키고, 희석된 H2SO4내에서 -0.2 V 내지 1.7 V vs. Ag/AgCl 사이에서 전기화학적으로 사이클링함으로써 세척한다. 세척된 전극을 밤새 에탄올 내에 용해되어 있는 희석된 옥틸티올 (C8SH) 용액 내에 침치시킨다. C8SH-변형 전극을, 인산 완충염(PBS, 0.15 M NaCl/0.1 M NaPi, pH 7.2)내에 용해되어 있는 20 ㎕의 TAG1-표지 송아지 혈청 알부민(BSA)으로 피복하고, 표면을 10분 간의 배양 후에 동일한 완충제로 세척함으로써 단백질 흡착을 수행한다.
ECL을 Ag/AgCl 기준 전극, 백금 전선 역전극 및 EG&G 283 일정 전위기가 구비된 3-전극 전지 내에서 ECL을 수행한다. 전기화확 전지의 하부에 위치한 Pacific instrument 광도계 및 Hamamatsu 광전 증배관 튜브로 빛의 강도를 측정한다. 흡착된 단백질을 0.1 M TPA 및 0.2 M 인산염, pH 7.2 의 용액 내에 침지한다. 전극 전위를 0.0 V에서 1.2 V 사이로 사이클링하면, 고도의 가역 ECL 반응(전후방의 스캔 상에 실질적으로 유사한 강도)이 관찰되며, 도 44a에 도시하는 바와 같이 이는 ECL 과정의 가역 특성 및 전극 상의 티올과 단백질 층의 안정성을 가리키는 것이다.
PMT와 감광계를 사용하지 않고 ECL에서와 동일한 설비 상에서 순환 전압 전류 실험을 수행한다. 실험에서, C8SH 피복 전극(단백질 없음)을 1 mM 포타슘 페리시아나이드 용액 (PBS 내의) 내에 위치시키고, 전극을 +0.5 V에서 1.2 V로 또한 반대로 스캐닝한 다음, +0.5 V 내지 -0.3 V 사이에서 다른 사이클링을 행한다. +0.5 V에서 -0.3 V 사이의 볼타모그람(voltammogram) 내에 용량성 전류만이 있고 페리시아나이드의 유도 전류가 존재하지 않으므로, 이는 단일층이 여전히 손상되지 않은 것이며 1.2 V에서 탈착하지 않음을 나타내는 것이다(도 44b).
6. 39. 준-가역적 ECL
상기한 바와 동일한 방식으로 전극 변형 및 단백질 흡착을 행한다. ECL 실험에서, 전위를 0.0 V 에서 1.5 V사이로 스캐닝하고, 상응하는 광의 강도를 기록한다. 도 45a에 도시하는 바와 같이, 상이한 사이클뿐 아니라 동일한 사이클의 전후방 스캔 간에 약간의 ECL 손실이 있다. 1.5 V에서 산화 후, 페리시아나이드 내의 티올/Au의 순환 볼타모그람은 상당량의 유도 전류를 보이며, 이는 1.5 V에서 티올 단일층의 적어도 부분적 탈착을 가리키는 것이다(도 45b).
6. 40. 비가역적 ECL
본 실험에서는, 실시예 6. 38과 동일한 방식으로 전극 변형 및 단백질 흡착을 수행한다. ECL을 측정하기 위하여, 전극 전위를 2.0 V 까지 상승시켰다가 0.0 V로 하강시켜 스캐닝한다. 전방의 스캔 상에서 강렬한 광이 발견되나(실시예 6. 38에서의 가역적 조건하에서 관찰된 것보다 다량), 이는 도 46a에 도시하는 바와 같이 역 스캔 상에서 배경으로 떨어진다. 2.0 V에서의 산화가 대부분의 티올 단일층을 나타낸 후, 페리시아나이드 내의 변형된 전극의 순환 볼타모그람이 탈착된다(도 46b).
6.41. 유형화된 금 전극 상에 고정된 1 차 항체를 이용한 ECL 샌드위치 면역학적 분석
본 실험에서는, PSA의 면역학적 분석에의 사용을 위하여, 프로스트레이트(prostrate) 특이성 항원(PSA)에 대한 항체를 유형화된 금 전극 상에 고정시킨다.
1 내지 2 미크론 두께의 노출, 현상된 감광성 내식막을 공지된 방법에 따라 제조함으로써 감광성 내식막이 제거되는 1 mm ×1 mm 정방형의 조각을 가지는 실리콘 지지체 상에 감광성 내식막 층을 형성한다. SYLGARD 실리콘 탄성체 184와 이에 상응하는 경화제의 10:1 혼합물을 마스터에 부은 후, 경화시킨다. 중합된 SYLGARD를 실리콘 마스터로부터 조심스럽게 제거한다. 생성되는 탄성 "스탬프"를 에탄올 내의 히드록시-말단 티올 HS-(CH2)11(OCH2CH2)3-OH 및 니트릴로트리아세트산 (NTA) 말단 티올 HS-(CH2)11(OCH2CH2)3OC(O)NH(CH2)4CH(CO2H)N(CH2CO2H)을 함유한 용액에 노출시킴으로써 "잉킹"한다. 잉킹된 스탬프를 금 기질과 접촉시키고, 제거시켜 1mm×1mm SAM을 형성시킨다. 기질을 수 초 동안 에탄올 내에 히드록시 말단 티올만을 함유한 용액으로 세척함으로써, 단백질의 외부 영역에의 비특이적 결합을 방지한다. 그리고 나서, 생성되는 표면을 에탄올로 헹구어 내고, 질소 스트림하에서 건조시킨다. NiCl2용액으로 표면을 처리한 다음, 항-PSA 마우스 단일클론의 결합 영역을 제시하는 융합 단백질 및 펩티드 (His)6를 함유하는 용액으로 처리하면, 조절된 방식으로 표면 상에 융합 단백질이 고정된다. 이러한 방법은 표면 상에 재생산할 수 있고 예측 가능한 양의 고정된 단백질을 생산한다. 표면 상에서 단백질의 방향은 융합 단백질의 1 차 구조 내의 (His)6서열의 위치에 의하여 조절된다. 고정된 단백질의 실제적인 양은 스탬프 SAM 내의 NEA 말단-티올 대 히드록시-말단 티올의 비율 및 스탬프 특성의 표면적에 의하여 조절된다. 혈청 내의 공지 농도(1fM 내지 1 uM의 농도)의 PSA를 함유하는 용액을 제조함으로써, PSA에 대한 검정 곡선을 결정한다. 상기한 바에 따라 제조된 다수의 표면을 PSA 검정 표본으로 처리한 다음, PSA에 대한 최적 농도의 2 차 항체를 함유하는 용액(TAG1의 유도체로 표지)으로 처리한다. 표면을 0.1 M TPA 및 0.2 M 인산염(pH 7.2)을 함유하는 용액 내에 침지시키고, 전기 전위가 금 표면에서 0.5V/초의 스캔율로 0.0 에서 2.0 V 사이를 순환할 때 발산되는 광의 피크 강도를 측정함으로써 검정 곡선을 결정한다. PSA 농도가 검정 곡선을 참조하여 피크 ECL 시그널로부터 계산되는 점을 제외하고는 동일한 방법으로 샘플의 혈청 내 미지 농도의 PSA의 측정을 수행한다.
7. 참고 자료의 통합
본 발명은 본원에 기술되어 있는 특정 구체예에 의하여 그 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본원에 기술되어 있는 것 외에 본 발명에 대한 다양한 변형이 전술한 상세한 설명 및 도면으로부터 당업자에게 분명해질 것이다. 그러한 변형은 청구 범위의 범위 내이어야 한다. 다양한 문헌이 본원에 인용되고 있으며, 그 개시는 그 자체로 본원에 참고 자료로서 통합되어 있다.

Claims (56)

  1. (a) 하나 이상의 전극;
    (b) 각각의 결합 영역이 결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 결합 시약(binding reagents)을 함유하는, 지지체 상에 고정된 다수의 분리된 결합 영역을 갖는 지지체; 및
    (c) 광 검출기
    를 포함하는 전기화학발광에 의한 분석물 검출용 장치.
  2. 광 검출기 및 하나 이상의 전극을 포함하고, 상기 전극은 그 표면에 고정된 다수개의 분리된 결합 영역을 갖고, 상기 결합 영역은 결합 전기화학 발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 결합 시약을 포함하는, 전기화학발광에 의한 분석물 검출용 장치.
  3. (a) 하나의 전극 또는 다수의 전극상의 다수의 분리된 결합 영역; 및
    (b) 전기화학발광 표지를 포함하는 결합 시약
    을 함유하는 전기화학발광에 의해 샘플내 분석물 검출용 카세트.
  4. (a) 지지체 상에 다수개의 분리된 결합 영역을 함유하는 지지체;
    (b) 전기화학발광을 유도할 수 있는 하나 이상의 전극; 및
    (c) 전기화학발광 표지를 포함하는 결합 시약
    을 함유하는 전기화학발광에 의한 샘플내 분석물 검출용 카세트.
  5. (a) 지지체 상의 다수개의 분리된 결합 영역;
    (b) 상기 결합 영역으로부터 전기화학발광을 유도할 수 있는 하나 이상의 전극
    을 함유하는 전기화학발광에 의한 샘플내 분석물 검출용 카세트.
  6. 제3항에 있어서, 상기 결합 영역은 친수성이고 친수성 영역에 의해 둘러싸여 있으며, 또는 상기 결합 영역은 소수성이고 소수성 영역에 의해 둘러싸인 카세트.
  7. (a) 하나 이상의 지지체의 표면상에 고정된 다수의 분리된 결합 영역을, 다수의 분석물을 함유하는 샘플 및 전기화학발광 표지에 연결된 상기 분석의 구성요소와 접촉시키는 단계;
    (b) 전기화학발광 분석을 수행하기에 적합한 반응 매질의 존재하에 하나 이상의 상기 분리된 결합 영역에서 전기화학발광을 유발하기에 효율적인 전압 파형을 적용하는 단계; 및
    (c) 상기 다수의 분리된 결합 영역으로부터 전기화학발광을 검출 또는 측정하는 단계
    를 포함하는 전기화학발광 결합 분석에 의한 분석물의 검출 또는 측정 방법으로서,
    상기 검출 또는 측정된 전기화학발광은 상기 대상 분석물의 존재 또는 양과 상호관련된, 전기화학발광 결합 분석에 의한 분석물의 검출 또는 측정 방법.
  8. (a) (i) 각 결합 영역이 결합 시약을 포함하는, 하나 이상의 지지체상의 다수의 결합 영역, (ⅱ) 분석물, 및 (ⅲ) ECL(전기화학발광; electrochemiluminescence) 부분에 연결된 결합 시약을 포함하는 조성물을 형성하는 단계;
    (b) 상기 결합 영역내의 상기 결합 시약 및 ECL 부분에 연결된 결합 시약을 포함하는 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 상기 복합체내의 상기 ECL 부분이 전기화학발광을 방출하도록 유도하는 단계; 및
    (d) 상기 전기화학발광을 검출 또는 측정하는 단계
    를 포함하는 전기화학발광 결합 분석에 의한 분석물의 검출 또는 측정 방법으로서,
    상기 검출 또는 측정된 전기화학발광은 상기 대상 분석물의 존재 또는 양과 상호관련된, 전기화학발광 결합 분석에 의한 분석물의 검출 또는 측정 방법.
  9. 제3항에 있어서, 상기 다수의 분리된 결합 영역과 접촉하는 샘플을 함유한 구획을 추가적으로 포함하는 카세트.
  10. 제3항에 있어서, 하나의 전극상에 다수개의 분리된 결합 영역을 함유하는 카세트.
  11. 제3항에 있어서, 다수개의 전극상에 다수개의 분리된 결합 영역을 함유하는 카세트.
  12. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전극이 탄소를 포함하는 카세트.
  13. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전극이 탄소 나노튜브 또는 세섬유(fibril)를 포함하는 카세트.
  14. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전극이 카본 블랙(carbon black)을 포함하는 카세트.
  15. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기화학발광 표지가 루테늄 또는 오스뮴을 포함하는 카세트.
  16. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 전기화학발광 공반응체(coreactant)를 추가적으로 포함하는 카세트.
  17. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카세트는 외부 광 검출기에 의해 상기 카세트에서 발생된 전기화학발광을 검출할 수 있도록 형성된 카세트.
  18. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 역 전극을 추가적으로 포함하는 카세트.
  19. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 역 전극이 역 전극/전극 쌍을 형성하는 카세트.
  20. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 여과용 필터를 추가적으로 포함하는 카세트.
  21. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 전기화학발광 분석의 하나 이상의 용해성 성분이 건조 형태로 존재하는 카세트.
  22. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 내부 표준을 추가적으로 포함하는 카세트.
  23. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 광 검출기를 추가적으로 포함하는 카세트.
  24. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 두 개 이상의 상기 결합 영역이 분석물에 대한 특이성이 상이하거나, 분석물에 대한 결합 친화도가 상이하거나, 분석물에 대한 특이성 및 결합 친화도가 상이한 카세트.
  25. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 영역이 단백질 및 그 단편 및 그 유도체; 핵산 및 그 단편 및 그 유도체; 항체 및 그 결합 단편; 항원; 에피토프; 세포 성분; 효소; 효소 기질; 렉틴(lectins); 단백질 A; 단백질 G; 유기 화합물; 유기금속 화합물; 및 탄수화물 부분(moeity)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 제제(reagent)를 포함하는 카세트.
  26. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 분리된 결합 영역이 5 내지 1000개 범위의 결합 영역인 카세트.
  27. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카세트는 상기 전극이 하나 이상의 상기 결합 영역으로부터 동시에 전기화학발광을 유도할 수 있도록 형성된 카세트.
  28. 전기화학 에너지를 전극에 적용하는 단계 및 전기화학발광을 검출하는 단계를 포함하는, 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 카세트를 사용하여 분석을 수행하는 방법.
  29. 제2항에 있어서, 상기 전극은 탄소 나노튜브, 카본 블랙, 매트릭스상의 탄소 나노튜브, 매트릭스상의 카본 블랙 또는 이들의 조합을 포함하는 장치.
  30. 제2항에 있어서, 상기 전극은 매트릭스내에서 분산된 탄소 입자를 포함하는 장치.
  31. 제1항, 제2항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 전극을 포함하고, 상기 결합 영역은 상기 다수의 전극과 공간적으로 정렬된 장치.
  32. 제1항, 제2항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 역 전극을 추가적으로 포함하는 장치.
  33. 제1항, 제2항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 전기화학발광 부분을 추가적으로 포함하는 장치.
  34. 제1항, 제2항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 유기금속 화합물을 함유하는 전기화학발광 부분을 추가적으로 포함하는 장치.
  35. 제1항, 제2항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, Ru-함유 또는 Os-함유 유기금속 화합물을 함유하는 전기화학발광 부분을 추가적으로 포함하는 장치.
  36. 제1항, 제2항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 분리된 결합 영역은 5 내지 1000개 범위의 결합 영역인 장치.
  37. 제1항, 제2항, 제3항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 분리된 결합 영역은 50 내지 500개 범위의 결합 영역인 장치.
  38. 제1항, 제2항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 시약이 공유결합에 의해 고정된 장치.
  39. 제1항, 제2항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 시약은 단백질 및 그 단편 및 그 유도체; 핵산 및 그 단편 및 그 유도체; 항체 및 그 결합 단편; 항원; 에피토프; 보조인자(cofactor); 세포 성분; 효소; 효소 기질,렉틴(lectins); 단백질 A; 단백질 G; 유기 화합물; 유기금속 화합물; 및 탄수화물 부분(moeity)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 장치.
  40. 제1항, 제2항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 영역은 패턴화된 자가 집합(self-assembled) 단일층을 포함하는 장치.
  41. 제1항, 제2항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 영역은 패턴화된 자가 집합 단일층을 포함하고, 상기 패턴화된 자가 집합 단일층은 알칸 디올을 포함하는 장치.
  42. 제1항, 제2항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 영역은 지지체 또는 전극 표면에 비하여 친수성 또는 소수성인 장치.
  43. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 카세트 및 광 검출기를 포함하는 장치.
  44. 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 카세트 및 전기화학발광 표지, 전기화학발광 공반응체(coreactant), 결합 시약 또는 이들의 조합을 포함하는 제제를 포함하는, 대상 분석물에 대한 다수의 전기화학발광 분석 수행용 키트.
  45. 제7항에 있어서, 상기 다수의 분리된 결합 영역은 상기 지지체 상의 하나의 전극에 고정되는 방법.
  46. 제7항에 있어서, 상기 다수의 분리된 결합 영역은 상기 지지체 상의 다수의 전극에 고정되는 방법.
  47. 제7항, 제8항, 제45항 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 다수개의 분석물을 함유하는 방법.
  48. 제46항에 있어서, 상기 다수의 전극 각각은 하나의 결합 영역을 그 위에 갖는 방법.
  49. 제46항에 있어서, 상기 다수의 전극 각각은 다수의 결합 영역을 그 위에 갖는 방법.
  50. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 전극은 탄소를 포함하는 방법.
  51. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 전극은 탄소 나노튜브 또는 세섬유를 포함하는 방법.
  52. 제7항, 제8항, 제45항 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기화학발광은 다수의 상기 결합 영역으로부터 동시에 검출되는 방법.
  53. 제7항, 제8항, 제45항 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전압이 다른 시간에 두 전극에 적용되는 방법.
  54. 제7항, 제8항, 제45항 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 두개 이상의 결합 영역이 분석물에 대한 그들의 특이성이 상이한 방법.
  55. 제7항, 제8항, 제45항 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 영역은 결합 반응에서 분석물과 결합할 수 있거나, 분석물과 경쟁할 수 있는 결합 시약을 포함하는 방법.
  56. 제7항, 제8항, 제45항 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 영역은 단백질 또는 그 단편; 핵산, 핵산 결합 분자 또는 그 단편을 포함하는 결합 시약을 함유하는 방법.
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