JP2005505748A - 核酸の配列決定のための装置および方法 - Google Patents
核酸の配列決定のための装置および方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005505748A JP2005505748A JP2002575327A JP2002575327A JP2005505748A JP 2005505748 A JP2005505748 A JP 2005505748A JP 2002575327 A JP2002575327 A JP 2002575327A JP 2002575327 A JP2002575327 A JP 2002575327A JP 2005505748 A JP2005505748 A JP 2005505748A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- array
- reaction chamber
- nucleic acid
- reaction
- cavity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
- G01N21/03—Cuvette constructions
- G01N21/0303—Optical path conditioning in cuvettes, e.g. windows; adapted optical elements or systems; path modifying or adjustment
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
- G01N21/7703—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator using reagent-clad optical fibres or optical waveguides
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
- B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
- B01L2300/0654—Lenses; Optical fibres
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
- B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
- B01L2300/0819—Microarrays; Biochips
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
- B01L2300/0822—Slides
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
- B01L2300/0877—Flow chambers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0893—Geometry, shape and general structure having a very large number of wells, microfabricated wells
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L9/00—Supporting devices; Holding devices
- B01L9/52—Supports specially adapted for flat sample carriers, e.g. for plates, slides, chips
- B01L9/527—Supports specially adapted for flat sample carriers, e.g. for plates, slides, chips for microfluidic devices, e.g. used for lab-on-a-chip
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Composite Materials (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Description
【0001】
(発明の分野)
本発明は、核酸の配列を決定するための装置および方法に関する。
【背景技術】
【0002】
(発明の背景)
多くの疾患は、特定のDNA配列に関連する。このDNA配列は、しばしば、DNA多型と呼ばれ、非罹患個体における対応するDNA配列と異なる疾患状態に関連するDNA配列を示す。DNA配列多型は、例えば、1つの配列における、第2の配列と比較してのヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。特定のDNA配列多型の例は、ヒトゲノムの特定の位置での、5’−ATGG−3’に対する5’−ATCG−3’である。後者の配列における第1ヌクレオチド「G」は、前者の配列においてヌクレオチド「C」で置換されている。前者の配列は、特定の疾患状態に関連し、後者の配列は、その疾患に罹患していない個体において見出される。従って、ヌクレオチド配列「5’−ATCG−3’」の存在は、個体が特定の疾患を有することを示す。この特定の型の配列多型は、配列の差が、1つのヌクレオチドにおける変化に起因することから、単一ヌクレオチド多型(SNP)として公知である。
【0003】
従って、単一DNA塩基変化の迅速な検出を可能にする技術は、遺伝子分析において使用するための重要な方法である。ヒトゲノムの大きさは大きい(30億塩基対のオーダー)ので、多型を同定する技術は、核酸の潜在的に大きな集団において多型を含む配列を特異的に同定するのに十分高感度でなければならない。
【0004】
代表的に、DNA配列多型分析は、個体からDNAを単離し、単離したDNAを、例えば、制限酵素でそのDNAを消化することによって操作し、そして/または単離したDNAにおける配列のサブセットを増幅することにより実施される。次いで、操作したDNAは、特定の配列が存在するか否かを決定するためにさらに試験される。
【0005】
DNAを分析するために一般的に使用される手順としては、電気泳動が挙げられる。電気泳動の一般的な適用としては、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動が挙げられる。DNA配列は、ゲルに挿入または充填され、そして電場に供される。DNAは、均一な負電荷を有するので、DNAは、電場の適用の際に、配列の長さ、三次元構造、およびゲルマトリクスとの相互作用を含む特性に基づきゲルを通って移動する。ほとんどの適用において、より小さいDNA分子は、より大きいフラグメントよりも迅速にゲルを通って移動する。電気泳動が十分な時間継続された後、DNA配列の最初の集団のDNAは、それらの相対的な大きさに従って分離される。
【0006】
次いで、特定のDNA分子が、種々の検出方法を用いて検出され得る。いくつかの適用について、特定のDNA配列は、特定のDNA分子に結合された検出可能なタグ(例えば、放射性標識)の存在により同定される。
【0007】
電気泳動に基づく分離分析は、特定の配列多型について多くの核酸サンプルを迅速、経済的、および正確に分析することが望まれる適用には望ましくない。例えば、電気泳動に基づく分析は、多量の注入DNAを必要とする。さらに、電気泳動に基づく核酸に基づく分析に必要とされる多量のサンプルを処理することは、労働力を要し得る。さらに、これらの技術は、同一のDNA分子のサンプルを必要とし得、電気泳動の前に、多額であり得る費用を取り繕わなければならない。
【0008】
近年、自動電気泳動システムが入手可能となった。しかし、電気泳動は、高スループットを有する比較的コスト効果のある装置が必要とされる臨床的配列決定のような適用には不向きであり得る。従って、配列決定のための非電気泳動方法に対する必要性が大きい。多くの適用について、電気泳動は、DNA配列分析と組み合わせて使用される。
【0009】
電気泳動に基づく配列決定に対するいくつかの代替法が記載されている。これらの方法としては、走査型トンネル顕微鏡、ハイブリダイゼーションによる配列決定、および単一ヌクレオチド検出法が挙げられる。
【0010】
電気泳動に基づく分離分析に対する別の代替法は、固体基質に基づく核酸分析である。これらの方法は、代表的に、固体支持体上の異なる位置に固定された多量の核酸プローブの使用に基づく。これらの固体支持体としては、例えば、ガラス表面、プラスチックマイクロタイタープレート、プラスチックシート、薄層ポリマー、または半導体が挙げられる。これらのプローブは、例えば、支持体に吸着または共有結合され得るか、あるいは基質マトリクス、膜、またはフィルムでマイクロカプセル化またはそうでなければ捕捉され得る。
【0011】
基質に基づく核酸分析は、特定の配列多型を含むことが既知であるかまたはその疑いのあるサンプル核酸を、固体支持体に結合したプローブのアレイに適用する工程を包含し得る。集団中の多型は、存在する場合、基質に取り付けられた相補配列にハイブリダイズする。次いで、核酸配列のハイブリダイズは、検出工程において検出される。
【0012】
固体支持体マトリックスに基づくハイブリダイゼーションおよび配列決定法は、高いサンプルDNA濃度を必要とし得、そして核酸サンプルと、固定化されたオリゴヌクレオチドプローブとの比較的遅いハイブリダイゼーション速度により阻まれ得る。しばしば、少量のみの鋳型DNAが入手可能であり、そして標的核酸配列の高い濃度を有することが望ましくあり得る。従って、基質に基づく検出分析は、しばしば、標的核酸のコピー、または標的核酸中の配列のサブセットが増幅される工程を包含する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく方法は、例えば、溶液中で、少量のプローブ標的を、数オーダー増加させ得る。しかし、PCRは、固相アプローチに組み込むのが困難であり得る。なぜならば、増幅したDNAが固体支持体マトリクスの表面上に固定されないからである。
【0013】
固相に基づく配列多型の検出は、記載されている。例としては、Hultmanら、1988、Nucl.Acid.Res.17:4937−4946;Syvanenら、1990、Genomics 8:684−692により記載される固相原理に基づく「ミニシーケンス」プロトコルである。この研究において、放射標識ヌクレオチドの取り込みが測定され、そしてヒトアポリポタンパク質E遺伝子の三対立遺伝子多型の分析のために使用された。しかし、このような放射性方法は、慣用的な臨床的適用に十分適しておらず、従って、迅速なDNA配列分析のための簡単で、高感度の非放射性方法の開発もまた、大きな目的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0014】
(発明の要旨)
本発明は、一部、核酸の配列を決定するためのアレイの使用に基づく。
【0015】
従って、1つの局面において、本発明は、平坦表面を備えるアレイに関し、この平坦表面に複数の反応チャンバが配置されている。反応チャンバは、5〜200μmの中心間距離を有し、そして各チャンバは、0.3μmと100μmとの間の少なくとも1つの寸法の幅を有する。いくつかの実施形態において、アレイは、複数の空洞を有する平坦表面であり、各空洞は、分析物反応チャンバを形成する。好ましい実施形態において、アレイは、スライスした光ファイバー束(すなわち、融着した光ファイバーケーブルの束)から形成され、そして反応チャンバは、光ファイバー反応器アレイ(「FORA」)の1つの表面をエッチングすることにより形成される。空洞がまた、エッチング、成形、またはミクロ機械加工を通じて基板上に形成され得る。
【0016】
詳細には、アレイの各反応チャンバは、代表的に、0.3μmと100μmとの間、好ましくは、0.3μmと20μmとの間、最も好ましくは、0.3μmと10μmとの間の少なくとも1つの寸法の幅を有する。別の実施形態において、本発明者らは、より大きい反応チャンバ(好ましくは、20μmと70μmとの間の少なくとも1つの寸法の幅を有する)を企図している。
【0017】
このアレイは、代表的に、1,000より多い反応チャンバ、好ましくは、400,000より多い反応チャンバ、より好ましくは、400,000と20,000,000との間、そして最も好ましくは、1,000,000と16,000,000との間の空洞または反応チャンバを含む。各空洞の形状は、しばしば、実質的に六角形であるが、空洞はまた円錐形であり得る。いくつかの実施形態において、各空洞は、平滑な壁表面を有する。しかし、本発明者らは、各空洞がまた、少なくとも1つの不規則な壁表面を有し得ることを企図している。各々の空洞の底は、平坦であってもくぼんでいてもよい。
【0018】
このアレイは、代表的に、中心間距離が10〜150μm、好ましくは、50〜100μmの空洞または反応チャンバを有するよう構築される。
【0019】
各空洞または反応チャンバは、代表的に、10μmと100μmとの間の深さを有する;あるいは、深さは、空洞の幅の0.25倍と5倍との間の大きさ、好ましくは、空洞の幅の0.3倍と1倍との間の大きさである。
【0020】
1つの実施形態において、本明細書中に記載されるアレイは、代表的に、平坦上表面および平坦底表面を備え、反応チャンバからの光学的シグナルが底平坦表面を通じて検出され得るように光学的に伝導性である。これらのアレイにおいて、代表的に、上表面と底表面との間の距離は、10cm以下であり、好ましくは、3cm以下であり、最も好ましくは、2cm以下であり、そして通常は、0.5mmと5mmとの間である。
【0021】
1つの実施形態において、アレイの各空洞は、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を含む。このアレイはまた、この平坦アレイから離れており、そしてそれらと対向して接触している第2表面を備え、その結果フローチャンバが、アレイ上に形成される。
【0022】
別の局面において、本発明は、水性環境における別々の平行共通反応を実施するためのアレイ手段に関する。このアレイ手段は、少なくとも1,000の異なる反応チャンバを有する基板を備える。これらのチャンバは、試薬と反応し得る出発材料を含む。各反応チャンバは、少なくとも1つの試薬を含む1以上の流体が各反応チャンバに送達される場合に、その試薬が壁の外側に拡散する拡散時間が、出発物質が試薬と反応して生成物を形成するのに必要とされる時間を超えるように寸法決めされている。この反応チャンバは、基板上に複数の空洞を作製することによるか、または複数の表面上に異なるパッチを作製することにより形成され得る。これらのパッチは、周囲の平坦表面と異なる表面化学を有する。
【0023】
1つの実施形態において、アレイの各空洞または反応チャンバは、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を含む。代表的に、核酸を含むこれらの反応チャンバ(アレイにおける全ての反応チャンバが必要とされるわけではない)が、1種のみの核酸(すなわち、目的の単一の配列)を含む。この種の核酸の単一のコピーが任意の特定の反応チャンバに存在し得るか、またはこれらは、複数のコピーであり得る。一般的に、反応チャンバは、少なくとも100コピーの核酸配列、好ましくは少なくとも100,000コピー、そして最も好ましくは、100,000〜1,000,000コピーの核酸を含むことが好ましい。1つの実施形態において、核酸種は、PCR、RCA、リガーゼ鎖反応、他の等温増幅、または他の従来の核酸増幅手段を用いて、所望の数のコピーを提供するように増幅される。1つの実施形態において、核酸は、一本鎖である。他の実施形態において、一本鎖DNAは、各コピーが末端同士で共有結合したコンカテマーである。
【0024】
核酸は、チャンバ自体への結合によるかまたはチャンバに送達される移動性固体支持体への結合のよるかのいずれかによって、反応チャンバ中で固定され得る。生物活性剤は、アレイにわたって複数の移動性固体支持体を分散させることにより、アレイに送達され得、各移動性固体支持体は、それらに固定された少なくとも1つの試薬を有し、この試薬は、核酸配列決定反応における使用に適している。
【0025】
アレイはまた、反応チャンバに配置された移動性固体支持体の集団を含み得る。各移動性固体支持体は、それらに結合された1つ以上の生物活性剤(例えば、核酸または配列決定酵素)を有する。各移動性固体支持体の直径は変化し得、本発明者らは、移動性固体支持体の直径が、各空洞の幅の0.01〜0.1倍であることを好む。各々の反応チャンバが、1つ以上の移動性固体支持体を含む必要はない。3つの企図されている実施形態が存在する。1つ目は、反応チャンバの少なくとも5%〜20%が、少なくとも1つの試薬が固定された移動性固体支持体を有し得る場合であり;2つ目の実施形態は、反応チャンバの少なくとも20%〜60%が、少なくとも1つの試薬が固定された移動性固体支持体を有し得る場合であり;そして3つ目の実施形態は、反応チャンバの少なくとも50%〜100%が、少なくとも1つの試薬が固定された移動性固体支持体を有し得る場合である。
【0026】
移動性固体支持体は、代表的に、それらに固定された少なくとも1つの試薬を有する。ピロシーケンス反応またはより一般的にはATP検出に関する実施形態について、この試薬は、スルフリラーゼまたはルシフェラーゼ活性、あるいはそれらの両方を有するポリペプチドであり得る。移動性固体支持体は、アレイにわたって、1つ以上の核酸配列またはタンパク質または酵素が固定された複数の移動性固体支持体を分散させる方法において使用され得る。
【0027】
別の局面において、本発明は、光生成のための反応チャンバのアレイを同時にモニタリングするための装置に関する。この光生成は、反応が、特定の部位で起こっていることを示す。この実施形態において、反応チャンバはセンサであり、分析物および反応チャンバ中で光を生成する酵素的手段または蛍光手段を含むよう適合されている。本発明のこの実施形態において、センサは、生化学的アッセイまたは細胞に基づくアッセイにおける使用に適している。この装置はまた、使用の際に特定の反応チャンバからの光が、光学的に感受性のデバイスの特定の予め決定された領域に衝突するよう配置された光学的に感受性のデバイス、ならびに予め決定された領域の各々に衝突する光のレベルを決定するための手段および各々の反応チャンバについて、時間と共に光のレベルの変化を記録する手段を備える。
【0028】
1つの特定の実施形態において、この機器は、光捕捉手段を有する光検出手段および光を光検出手段に移送するための第2の光ファイバー束を備える。本発明者らは、光捕捉手段がCCDカメラであることを企図している。第2の光ファイバー束は、代表的に、アレイと光学的に接触しており、その結果、個々の反応チャンバにおいて発生した光は、光捕捉手段への移送のための第2の光ファイバー束の別のファイバーまたは別のファイバーの群により捕捉される。
【0029】
上記アレイは、水性環境における別の平行する共通の反応を実施するために使用され得る。この方法は、少なくとも1つの試薬を含む流体を記載されるアレイに送達する工程を包含する。ここで、アレイ上の特定の反応チャンバ(必ずしも全てではない)は、試薬と反応し得る出発材料を含む。各反応チャンバは、液体が各反応チャンバに送達される場合、試薬が壁の外側へ拡散するための拡散時間が、出発材料が、試薬と反応して生成物を形成するのに必要とされる時間を超えるような寸法である。この方法はまた、出発材料が各反応チャンバにおいて試薬と反応して生成物を形成した後であるが、任意の1つの反応チャンバに送達された試薬が反応チャンバから任意の他の反応チャンバへと拡散する前の期間に、アレイからの流体を洗浄する工程を包含する。1つの実施形態において、任意の1つの反応チャンバにおいて形成される生成物は、任意の他の反応チャンバにおいて形成さえる生成物から独立しているが、1つ以上の共通の試薬を用いて生成される。この出発材料は、核酸配列であり得、そして流体中の少なくとも1つの試薬は、核酸またはヌクレオチドアナログである。流体はさらに、核酸配列およびヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログと反応し得るポリメラーゼを有し得る。この方法の工程は、連続的に反復され得る。
【0030】
この装置は、アレイに液体試薬を提供するための、本明細書中に記載されるアレイと共に使用するのに適合された新規の試薬送達キュベット、および試薬送達キュベットと連通した試薬送達手段を備える。
【0031】
本発明の1つ以上の実施形態の開示は、付属の以下の説明に示される。本明細書に記載の方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料を、ここに記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、明細書および特許請求の範囲から明らかである。明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の参照を含む。他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する当業者に一般的に理解されているのと同一の意味を有する。他に明らかに記載されない限り、本明細書中で使用または企図される技術は、当業者に周知の標準的な方法である。実施形態の例は、例示の目的にすぎない。本明細書中で列挙される全ての特許および刊行物は、参照として援用される。
【0032】
(発明の詳細な説明)
本明細書中に記載される方法および装置は、最初に核酸をクローニングする必要性なしに、核酸配列情報の決定を可能にする。さらに、この方法は、高感度であり、そして核酸の出発集団においてほんの数コピー存在する鋳型核酸のヌクレオチド配列を決定するために使用され得る。さらに、この方法は、多量の核酸の配列を同時に決定するために使用され得る。
【0033】
記載される方法および装置は、一般的に、任意の特定の核酸配列の同定が所望される任意の適用に有用である。例えば、これらの方法は、単一染色体上での単一ヌクレオチド多型(SNP)、複数のSNPを含むハロタイプ、または他の多型の同定、および転写プロファイリングを可能にする。他の用途としては、一次配列を確認または顕在化するため、またはランダム変異誘発スクリーニングから特定の変異クローンを同定するため、およびその種からの遺伝子発現プロフィールを決定するための任意の発達段階または環境条件から単一細胞、全組織、または器官からcDNAの配列を獲得するための人工DNA構築物の配列決定が挙げられる。さらに、これらの方法は、任意の供給源から単離された任意の大きさのPCR産物および/またはクローン化されたDNAフラグメントの配列決定を可能にする。
【0034】
本明細書中で記載される方法は、サンプル調製プロセスを含み、このプロセスによって、標的核酸に相補的な1つ以上のコピーを含む核酸に共有結合した複数のアンカープライマーを含む固体アレイまたは移動性固体アレイが生成される。共有結合したアンカープライマーおよび標的核酸の1つ以上のコピーの形成は、好ましくは、環状核酸の相補領域にアンカープライマーをアニーリングし、次いで、アニールしたアンカープライマーをポリメラーゼで伸長して、この環状核酸に相補的な配列の1つ以上のコピーを含む核酸を形成することにより生じる。
【0035】
固体支持体または移動性固体支持体へのアンカープライマーの結合は、アニールしたアンカープライマーの伸長の前、最中、および後に起こり得る。従って、1つの実施形態において、1つ以上のアンカープライマーが固体基板または移動性固体基板に連結され、その後、アンカープライマーは、標的核酸にアニールされ、そしてポリメラーゼの存在下で伸長される。あるいは、第2の実施形態において、アンカープライマーは、標的核酸に最初にアニールされ、そしてアニールしたアンカープライマーの3’OH末端がポリメラーゼにより伸長される。次いで、伸長したアンカープライマーは、固体基板または移動性固体基板に連結される。アンカープライマーの配列を変化させることにより、核酸の集団に存在する異なる標的核酸を特異的に増幅することが可能である。
【0036】
標的核酸における配列は、多数の方法で同定され得る。好ましい配列決定プライマーは、増幅された核酸にアニーリングされ、そしてそれを使用して、配列決定産物を生成する。次いで、この配列決定産物のヌクレオチド配列が決定され、それによって、核酸の決定が可能になる。同様に、1つの実施形態において、テンプレート核酸が増幅され、その後、ビーズまたは他の移動性固体支持体に結合される。他の実施形態において、このテンプレート核酸は、ビーズに結合され、その後、増幅される。
【0037】
本発明の方法はまた、分析技術によって作製されるDNAフラグメントの配列決定のために使用され得、この分析技術は、酵素処理、放射線処理または化学処理(例えば、クロマチンの部分的なDNase処理)に対するDNA構築物の異なる感受性によってか、あるいは、化学物質(これは、ポリメラーゼによって認識される有効な塩基として、メチル−シトシンをチミジン(または他のヌクレオチド)に転換する)での前処理を行ったかまたは行っていない所定の組織から生じる配列を比較することによってDNAのメチル化状態を決定するために、より高いオーダーのDNA構築物を調査する。さらに、本発明の方法を使用して、一次配列のレベルにおける発達または老化の間に生じる細胞の生理学的変化をアッセイし得る。
【0038】
本発明はまた、引き続く分析(例えば、配列決定)のための核酸配列を調製する方法を提供する。
【0039】
(1.核酸の配列決定のための装置)
本発明は、核酸を配列決定するための装置を提供し、この装置は、一般に、配列決定反応を行うための1個以上の反応チャンバ、この反応チャンバにかまたはこの反応チャンバから反応物を送達するための手段、および配列決定反応事象を検出するための手段、を備える。別の実施形態において、この装置は、試薬送達キュベットを備え、このキュベットは、平面上に複数の空洞を備える。好ましい実施形態において、この装置は、この装置の個々の構成要素を制御するため、ならびに配列反応事象の検出から得られる情報を保存および/または分析するための、少なくとも1つコンピューターに接続されている。
【0040】
本発明はまた、1個以上の反応チャンバを提供し、このチャンバは、不活性基材材料(これはまた、本明細書中で「固体支持体」とも呼ばれる)上にアレイの形態で配置され、規定空間内での配列決定反応において反応物を組み合わせ、そして配列決定反応事象を検出するのを可能にする。したがって、本明細書中で使用される場合、用語「反応チャンバ」または「分析物反応チャンバ」とは、例えば、核酸の配列決定反応において、反応物の相互作用を容易にする基材材料上の局在化された領域をいう。以下でより完全に議論されるように、本発明によって企図される配列決定反応は、好ましくは、タンデムな多数の個々の核酸サンプルで生じる(特に、ゲノムDNAおよび染色体DNA由来の多数の核酸サンプルの同時配列決定)。従って、本発明の装置は、好ましくは、アレイを備え、このアレイは、このような多数の個々の配列決定反応を行うために、十分な数の反応チャンバを有する。1つの実施形態において、このアレイは、少なくとも1,000個の反応チャンバを備える。別の実施形態において、このアレイは、400,000個より多い反応チャンバを備え、好ましくは、400,000個と20,000,000個との間の反応チャンバを備える。より好ましい実施形態において、このアレイは、1,000,000個と16,000,000個との間の反応チャンバを備える。
【0041】
アレイ上の反応チャンバは、代表的には、基材材料において空洞の形態かまたはウェルの形態をとり、このチャンバは、反応物が沈着され得る幅および深さを有する。1種以上の反応物は、代表的には、反応チャンバ内の基材材料に結合され、そして反応の残余物は、この反応を促進しそして反応チャンバを通って流れる媒介物中に存在する。空洞またはウェルとして形成される場合、このチャンバは、好ましくは、以下を可能にするのに、十分な寸法およびオーダーである:(i)チャンバ内への、必要な反応物の導入、(ii)チャンバ内で生じる反応、ならびに、(iii)チャンバ間での反応物の混合の阻害。ウェルまたは空洞の形状は、好ましくは、環状または円筒状であるが、環状または円筒状の形状に近づくように多面化(multisided)され得る。別の実施形態において、ウェルまたは空洞の形状は、実質的に六角形である。この空洞は、滑らかな壁面を有し得る。さらなる実施形態において、この空洞は、少なくとも1つの不規則な壁面を有し得る。この空洞は、平面底部または凹面底部を有し得る。反応チャンバは、5μmと200μmとの間、離れて間隔を空けられ得る。2個の隣接した反応チャンバ間の中心間距離を測定することによって、空間が決定される。代表的には、この反応チャンバは、10μmと150μmとの間、好ましくは、50μmと100μmとの間、離れて間隔を空けられ得る。1つの実施形態において、この反応チャンバは、0.3μmと100μmとの間の寸法幅を有する。この反応チャンバは、0.3μmと20μmとの間、好ましくは、0.3μmと10μmとの間、そして最も好ましくは、約6μmの寸法幅を有し得る。別の実施形態において、この反応チャンバは、20μmと70μmとの間の幅を有する。最終的には、チャンバの幅は、核酸サンプルが増幅を必要とするか否かに依存し得る。増幅が必要ではない場合、より小さい幅(例えば、0.3μm)が好ましい。増幅が必要な場合、より大きい幅(例えば、6μm)が好ましい。この反応チャンバの深さは、好ましくは、10μmと100μmとの間である。あるいは、この反応チャンバは、反応チャンバの寸法幅の0.25倍と5倍との間の深さ、または別の実施形態において、この反応チャンバの寸法幅の0.3倍と1倍との間の深さを有し得る。
【0042】
別の局面において、本発明は、テンプレート核酸ポリマーにおいて核酸配列を決定するための装置を包含する。この装置は、アレイを備え、このアレイは、複数の空洞を平面上に有する。各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここでこの反応チャンバは、5μm〜200μmの間の中心間距離を有する。この装置はまた、テンプレート核酸ポリマーを反応チャンバ内に導入するための、核酸送達手段;および、試薬を反応チャンバ内に送達して重合環境を作るための、核酸送達手段を備える(ここで、この核酸ポリマーは、ヌクレオチドが添加される場合、相補的な核酸ポリマーの合成のためのテンプレートポリマーとして作用する)。この装置はまた、一連の供給原料を重合環境に連続的に提供するための、試薬送達手段を備え、この各供給原料は、相補的な核酸ポリマーが形成されるヌクレオチド間から選択されるヌクレオチドを含有し、その結果、この供給原料中のヌクレオチドが、配列決定されるテンプレートポリマー中の次のヌクレオチドに相補的である場合、このヌクレオチドは、その相補的なポリマー内に組み込まれ、そして無機ピロリン酸が放出される。この装置はまた、無機ピロリン酸の形成を酵素学的に検出するための、検出手段;および、相補的なポリマー内の各ヌクレオチドの同一性を決定し、それによってテンプレートポリマーを配列決定するための、データ処理手段を備える。
【0043】
別の局面において、本発明は、アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定するための装置を包含する。この装置は、複数の空洞を平面上に備える、試薬キュベットを備える。各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、この反応チャンバは、5μm〜200μmの中心間距離を有する。この装置はまた、公知の窒素性塩基の1つである活性化ヌクレオチド5’−トリホスフェート前駆体を、各反応チャンバ内の反応混合物に加えるための、試薬送達手段を備える。各反応混合物は、テンプレート特異的ヌクレオチドポリメラーゼおよび1本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを有し、この1本鎖ポリペプチドテンプレートは、相補的なオリゴヌクレオチドプライマー鎖(このテンプレートよりも小さい少なくとも1つのヌクレオチド残基)にハイブリダイズされ、活性化ヌクレオシド5’−トリホスフェート前駆体をプロモーター鎖の3’末端上に組み込むのを可能にする反応条件下で、このプライマー鎖の3’末端にて、各テンプレート内で少なくとも1つの不対ヌクレオチド残基を形成するが、但し、この活性化ヌクレオシド5’トリホスフェート前駆体の窒素性塩基は、テンプレートの不対ヌクレオチド残基の窒素性塩基に相補的である。この装置はまた、ヌクレオシド5’トリホスフェート前駆体がプライマー鎖に組み込まれたか否かを検出するための検出手段を備え、このプライマー鎖において、このヌクレオシド5’トリホスフェート前駆体の組み込みは、テンプレートの不対ヌクレオチド残基が、この組み込まれたヌクレオシド5’トリホスフェート前駆体の組成と相補的な窒素性塩基組成物を有することを示す。この装置はまた、第二工程および第三工程を連続して繰り返すための手段を備え、ここで、各連続した繰返しは、公知の窒素性塩基組成物の活性化ヌクレオシド5’トリホスフェート前駆体の1つの型を加えて、その型の組み込みを検出する。この装置はまた、ヌクレオシド前駆体を組み込んだ配列から、各反応チャンバ内のテンプレートの不対ヌクレオチド残基の塩基配列を決定するための、データ処理手段を備える。
【0044】
(固体支持体材料)
任意の材料の表面がプライマーの安定な結合および核酸配列の検出を可能にする限り、この任意の材料は、固体支持体材料として使用され得る。固体支持体材料は、平面であり得るか、または空洞形成され(cavitated)得る(例えば、光ファイバーの空洞形成された末端においてか、またはエッチングされたか、成形されたか、さもなければ、例えば、超小型電気機械系の構成において通常使用される技術を使用して平面内に微細加工された、ミクロウェルにおいて)。例えば、Rai−Choudhury,HANDBOOK OF MICROLITHOGRAPHY,MICROMACHINING,AND MICROFABRICATION,VOLUME 1:MAICROLITHOGRAPHY,Volume PM39,SPIE Press(1997);Madou,CRC Press(1997),Aoki,Biotech,Histochem.67:98−9(1992);Kaneら、Biomaterials.20:2363−76(1999);Dengら、Anal.Chem.72:3176−80(2000);Zhuら、Nat.Genet.26:283−9(2000)を参照のこと。いくつかの実施形態において、固体支持体は、光学的に透過性(例えば、ガラス)である。
【0045】
光学的に透過な固体支持体上の結合部位のアレイは、例えば、米国特許第5,143,854号、同第5,445,934号、同第5,744,305号および同第5,800,992号:Cheeら、Science 274:610−614(1996);Fodorら、Nature 364:555−556(1993);Fodorら、Science 251:767−773(1991);Gushinら、Anal.Biochem.250:203−211(1997);Kinositaら、Cell 93:21−24(1998);Kato−Yamadaら、J.Biol.Chem.273:19375−19377(1998);およびYasudaら、Cell 93:1117−1124(1998)に記載される結合技術において記載される電気集積回路の構成において通常使用されるリソグラフィー技術を使用して、構成され得る。光リソグラフィーおよび電子ビームリソグラフィーは、改変された生体分子(例えば、タンパク質または核酸)の結合を可能にする連結基を用いて、固体支持体または基材を感作する。例えば、Service,Science 283:27−28(1999);Rai−Choudhury,HANDBOOK OF MICROLITHOGRAPHY,MICROMACHINING,AND MICROFABRICATION,VOLUME 1:MICROLITHOGRAPHY,Volume PM39,SPIE Press(1997)を参照のこと。あるいは、感作部位のアレイは、Zasadzinskiら、Science 263:1726−1733(1994)に記載されるような薄膜技術を使用して作製され得る。
【0046】
(光ファイバー基材アレイ)
基材材料は、好ましくは、反応事象の検出を容易にする材料から作製される。例えば、代表的な配列決定反応において、dNTPの、配列決定されたサンプル核酸への結合は、配列決定反応において遊離されたホスフェートに対する酵素作用によって生じる光子を検出することによって、モニタリングされ得る。従って、透過性材料または光学的に(すなわち、光)導線性の材料から作製される基材材料を用いると、光子の検出が容易になる。
【0047】
いくつかの実施形態において、固体支持体は、光生成物を検出および透過するのに使用される光ファイバーのバンドルに連結され得る。このバンドル内の光ファイバーの総数は、配列決定反応において使用されるアレイ内の個々の反応チャンバ数に一致するように変更され得る。バンドル内に組み込まれた光ファイバーの数は、1:1の画像化を可能にするような検出デバイスの解像度に整合するように設計される。バンドルの全体のサイズは、反応チャンバ内の所望の試薬の特性(流れ)を維持しながら、検出デバイスの有効領域を最適化するように選択される。従って、15μm画素を有する4096×4096画素のCCD(電荷結合素子)アレイについて、ファイバーバンドルは、約60mm×60mmに選択され得るか、または約90mmの寸法を有するように選択される。所望の数の光ファイバーが、最初に、バンドルまたは光ファイバーアレイ内に溶接され(fused)、次いで、この末端が、必要な厚さ(例えば、1.5mm)の「ウエハ」を形成するように切断および研磨され得る。得られる光ファイバーウエハは、ガラス平面のハンドリング特性と類似のハンドリング特性を有する。個々のファイバーは、任意のサイズ寸法(例えば、3μm〜100μm)であり得る。
【0048】
2つの光ファイバーバンドルが使用されるいくつかの実施形態において、第一のバンドル(本明細書中において、ファイバーバンドルまたはコネクターとも呼ばれる)は、検出デバイスに直接取り付けられ、そして第二のバンドルは、反応チャンバ基材(ウエハまたは基材)として使用される。この場合において、2つのバンドルは、直接接触して配置され、検出デバイス上で反応中心を画像化するために、必要に応じて、光学カップリング流体が使用される。CCDが検出デバイスとして使用される場合、ウエハは、このCCD領域の使用を最大にするためにわずかに大きいか、または代表的な顕微鏡スライドの形式(25mm×75mm)に一致するためにわずかに小さい。バンドル内の個々のファイバーの直径は、最新技術の制限内で、単一反応が検出デバイス内の単一画素で画像化される可能性を最大にするように選択される。例示的な直径は、ファイバーバンドルについては6〜8μmであり、そしてウエハについては6〜50μmであるが、3〜100μmの範囲内の任意の直径が使用され得る。ファイバーバンドルは、CCDカメラの製造業者から市販され得る。これらのアレイにおいて、代表的には、上面と底面との間の距離は、10cmより小さく、好ましくは、3cmよりも小さく、最も好ましくは、2cmよりも小さく、そして通常は、0.5mmと5mmとの間である。例えば、ウエハは、Incom,Inc.(Charlton,MA)から得られ、切断され、そして光ファイバーの巨大な溶接物から研磨され得る(代表的には、2mm厚であるが、おそらく0.5〜5mm厚である)。ウエハは、窓ガラスまたはガラス顕微鏡スライドと類似のハンドリング特性を有する。
【0049】
反応チャンバは、光ファイバー材料から作製される基材に形成され得る。この光ファイバーの表面は、ファイバーのバンドルの末端を処理して(例えば、酸を用いて)、光ファイバー材料に窪みを形成することによって空洞形成される。従って、空洞が光ファイバーバンドルから形成される実施形態において、好ましくは、この空洞は、この光ファイバーバンドルの一端をエッチングすることによって形成され得る。空洞形成された各表面は、反応チャンバを形成し得る。このようなアレイは、光ファイバー反応アレイまたはFORAとして本明細書中で参照される。この深さにおける窪みは、個々の光ファイバーの約1/2の直径からこのファイバーの2/3倍の直径までの範囲である。空洞は、光ファイバーウエハの一端を酸性浴中に種々の時間量置くことによって、このファイバーの末端に導入され得る。時間量は、所望の反応空洞の全体の深さに依存して、変化し得る(例えば、Waltら、1996、Anal.Chem.70:1888を参照のこと)。広いチャネル空洞は、約14mm×43mmの均一な流速の大きさを有し得る。従って、この適切な寸法と適切な4.82×10−4空洞/μm2の密度において、この装置は、約290,000の流体的に受容可能な空洞を有し得る。光ファイバーバンドルの端部においてエッチングされた空洞において、分子を結合する(および、この結合した分子を検出する)ためのいくつかの方法が、当該分野で公知である。例えば、Michaelら、Anal.Chem.70:1242−1248(1998);Fergusonら、Nature Biotechnology 14:1681−1684(1996);HealeyおよびWalt,Anal.Chem.69:2213−2216(1997)を参照のこと。反応性部位のパターンはまた、平面支持体上に反応性パッドのパターンを作製する際に使用される光リソグラフィー技術と類似の光リソグラフィー技術を使用して、ミクロウェルに作製され得る。Healeyら、Science 269:1078−1080(1995);MunkholmおよびWalt.Anal.Chem.58:1427−1430(1986)、ならびにBronkら、Anal.Chem.67:2750−2757(1995)を参照のこと。
【0050】
光ファイバーウエハの反対面(すなわち、非エッチング面)は、代表的には、(例えば、浸漬油または他の光学カップリング流体によって)第二の光ファイバーバンドルへの光学カップリングを可能にするように、高度に研磨される。この第二の光ファイバーバンドルは、反応チャンバを備える光学ウエハの直径と正確に一致し、かつ取り付けられた検出デバイス(例えば、CCD画像化システムまたはカメラ)に光産物を伝達するためのコンジットとして作動するのに役立つ。
【0051】
1つの好ましい実施形態において、光ファイバーウエハは、例えば、15% H2O2/15% NH4OH(容量:水溶液中の容量)、次いで6回の脱イオン水でのリンス、次いで0.5M EDTA、次いで6回の脱イオン水、次いで15% H2O2/15% NH4OH、次いで6回の脱イオン水(各洗浄において、1/2時間のインキュベーション)の連続的な洗浄によって、全体にわたって洗浄される。
【0052】
光ファイバーウエハの表面は、好ましくは、配列決定反応におけるその使用を容易にするようにコーティングされる。このコーティングされた表面は、好ましくは、光学的に透過であり、タンパク質および核酸の結合を容易にし、そして固定化されたタンパク質の活性に負の影響を及ぼさない。さらに、この表面は、好ましくは、高分子の非特異的吸収を最小にし、そして連結された高分子(例えば、結合された核酸およびタンパク質)の安定性を増強する。
【0053】
アレイをコーティングするのに適切な材料としては、例えば、プラスチック(例えば、ポリスチレン)が挙げられる。プラスチックは、好ましくは、スピンコーティングされるかまたはスパッタリングされ得る(0.1μ厚)。アレイをコーティングための他の材料としては、金の層(例えば、24カラットの金0.1μm厚)が挙げられ、これは、長鎖チオールアルカンの自己アセンブリングした単層に吸収される。次いで、ビオチンが、この表面に共有的にカップリングされ、そしてビオチン結合タンパク質(例えば、ストレプトアビジンまたはアビジン)で飽和される。
【0054】
コーティング材料としては、さらに、基材にプライマーを固着するために使用される系が挙げられる。オルガノシラン剤(これは、アミノ基、スルフヒドリル基またはカルボキシ基を介してタンパク質の直接的な共有カップリングを可能にする)もまた、アレイをコーティングするために使用され得る。さらなるコーティング物質としては、以下が挙げられる:光反応性リンカー(例えば、光ビオチン(photobiotin))(Amosら、「Biomaterial Surface Modification Using Photochemical Coupling Technology」Encyclopedic Handbook of Biomaterials and Bioengineering,Part A:Materials,Wiseら(編)、New York,Marcel Dekker,pp.895926,1995)。
【0055】
さらなるカップリング材料としては、以下が挙げられる:好ましくは、表面上かまたは重合後に共有結合されたポリマー鎖上で直接重合化され得る、親水性ポリマーゲル(ポリアクリルアミド、ポリサッカリド)(Hjerten,J.Chromatogr.347,191(1985);Novotny,Anal.Chem.62.2478(1990))、ならびに、特に、ポリスチレンまたはシラン処理されたガラス表面のいずれかに吸収される、プルロニック(pluronic)ポリマー(トリブロックコポリマー(例えば、PPO−PEO−PPO);F−108としてもまた公知)(Hoら、Langmuir 14:3889−94,1998)、ならびに、ビオチン結合タンパク質の受動的吸収層。この表面はまた、アミン結合を介して試薬のカップリングを可能にするエポキシドでコーティングされ得る。
【0056】
さらに、上記材料のいずれかは、酵素およびヌクレオチドの固定化のために当該分野で一般的に公知の、1種以上の官能基(例えば、金属キレート基(例えば、ニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、五座キレート剤)(これらは、6×Hisタグ化タンパク質および核酸に結合する))で誘導体化され得る。
【0057】
二次元表面の理論的な結合能力を越えた、引き続く処理(例えば、酵素の結合(後で議論される))のために利用可能な結合部位の数を増加させる表面コーティングが、使用され得る。
【0058】
好ましい実施形態において、溶接された光ファイバーバンドル/ウエハを作製するために利用される個々の光ファイバーは、光学画像化システムにおいて利用され得る直径(すなわち、3μm)よりも大きい直径(すなわち、6μm〜12μm)である。従って、単一の反応性部位を画像化するために、いくつかの光学画像化ファイバーが使用され得る。
【0059】
(本発明のアレイの概要)
1つの局面において、本発明はアレイを包含し、このアレイは、その上に配置された複数の反応チャンバを有する平面を備え、ここで、この反応チャンバは、5〜200μmの中心間距離を有し、そして各チャンバは、0.3μmと100μmとの間の、少なくとも1つの寸法幅を有する。いくつかの実施形態において、このアレイは、その上に複数の空洞を備える平面であり、ここで、各空洞は、分析物反応チャンバを形成する。好ましい実施形態において、このアレイは、スライスされた光ファイバーバンドル(すなわち、溶接された光ファイバーケーブルのバンドル)から作製され、そしてこの反応チャンバは、その光ファイバー反応アレイ(「FORA」)の1つの表面をエッチングすることによって形成される。この空洞はまた、エッチング、成形または微細加工によって、基材に形成され得る。
【0060】
詳細には、このアレイにおける各反応チャンバは、代表的には、0.3μmと100μmとの間、好ましくは、0.3μmと20μmとの間、最も好ましくは、0.3μmと10μmとの間の、少なくとも1つの寸法幅を有する。別々の実施形態において、本発明者らは、好ましくは、20μmと70μmとの間の少なくとも1つの寸法幅を有する、巨大な反応チャンバを企図する。
【0061】
このアレイは、代表的には、1,000個より反応チャンバ、好ましくは、400,000個より多い、より好ましくは、400,000個と20,000,000個との間、そして最も好ましくは、1,000,000個と16,000,000個との間の、空洞または反応チャンバを備える。各空洞の形状は、しばしば実質的に六角形であるが、この空洞はまた、円筒状でもあり得る。いくつかの実施形態において、各空洞は、滑らかな壁面を有するが、本発明者らは、各空洞がまた、少なくとも1つの不規則壁面を有し得ることも企図する。空洞の各々の底面は、平面または凹面であり得る。
【0062】
このアレイは、代表的には、10μm〜150μmの間、好ましくは、50μm〜100μmの間の中心間距離を有する、空洞または反応チャンバを有するように構成される。
【0063】
各空洞または反応チャンバは、代表的には、10μm〜100μmの間の深さを有し、この深さは、空洞の幅の0.25倍と5倍との間のサイズであり、好ましくは、空洞の幅の0.3倍と1倍との間のサイズである。
【0064】
1つの実施形態において、本明細書中で記載されるアレイは、代表的には、平らな上面および平らな底面を備え、これは、光学的に導電性であり、その結果、反応チャンバからの光学シグナルは、この底平面を介して検出され得る。これらのアレイにおいて、代表的には、その上面と底面との間の距離は、10cmよりの小さく、好ましくは、3cmよりも小さく、最も好ましくは、2cmよりも小さい。
【0065】
1つの実施形態において、アレイの各空洞は、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を備える。このアレイはまた、平面アレイから離れて間隔を空け、それと対向して接触した第二の表面を備え、その結果、流動チャンバが、このアレイにわたって形成される。
【0066】
別の局面において、本発明は、水性環境において、別々の並列一般反応を行うための、アレイ手段を包含し、ここでこのアレイ手段は、少なくとも1,000個の別個の反応チャンバを有する基材を備える。これらのチャンバは、試薬と反応し得る出発材料を含む。反応チャンバの各々は、特定の寸法を有し、その結果、少なくとも1種の試薬を含有する1種以上の流体が各反応チャンバに送達される場合、試薬がウェルから拡散するための拡散時間は、出発材料が試薬と反応して生成物を形成するために必要とする時間を上回る。この反応チャンバは、基材上に複数の空洞を作製することによってか、または平面上に別個のパッチ(これは、周囲平面と異なる表面化学を有する)を作製することによって形成され得る。
【0067】
1つの実施形態では、アレイの各空洞または反応チャンバーは、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を含む。代表的には、核酸を含むこれらの反応チャンバーは、(アレイ中のすべての反応チャンバーがそうである必要はないが)単一種のみの核酸の(すなわち、目的である単一の配列)を含む。任意の特定の反応チャンバー内にこの種の核酸の単一コピーが存在し得るか、またはそれらは複数コピーであり得る。一般に、反応チャンバーが、少なくとも100コピーの核酸配列、好ましくは少なくとも100,000コピーの核酸配列、そして最も好ましくは100,000〜1,000,000コピーの核酸を含むことが好ましい。当業者は、任意の1つの反応チャンバー中の核酸種のコピー数における変化が、高温配列決定反応で発生する光子の数に影響し、そして必要に応じて慣用的に調節され、多かれ少なかれ光子シグナルを提供し得ることを認識する。
【0068】
1つの実施形態では、この核酸種は、PCR、RCA、リガーゼ連鎖反応、その他の等温増幅、または核酸増幅のその他の従来手段を用い、増幅されて所望のコピー数を提供する。1つの実施形態では、この核酸は一本鎖である。その他の実施形態では、この一本鎖DNAは、各コピーの端と端とが共有結合で連結されたコンカテマーである。
【0069】
(送達手段)
上記反応チャンバーに反応物を送達するための手段の例は、本発明の灌流チャンバーであり、図3に示される。この灌流チャンバーは、透明の上部スライドおよび下部スライドをもつシールされた区画を備える。これは、基板表面の表面上の溶液の流れを可能にし、そして試薬の迅速な交換を可能にするように設計されている。従って、これは、例えば、ピロリン酸配列決定反応を実施するために適切である。このチャンバーの形状および寸法は、バルク流れ交換、拡散的交換、または層流または乱流措置いずれかの両方を含む試薬交換を最適化するために調節され得る。
【0070】
この反応チャンバーへの反応物の正確な交換は、本発明における正確な測定のために重要である。バルク流体の対流不在下では、反応に関与する物質の輸送(および隣接反応部位間またはミクロベッセル間の交差汚染または「クロストーク」)は拡散によってのみ生じ得る。反応部位が2−D表面上の点源であると考えられるとき、目的の化学種(例えば、反応生成物)は、その生成の部位から半径方向に拡散し、上記表面上に実質的に半球形の濃度フィールドを生成する。
【0071】
化学物質(entity)が所定の時間tに拡散し得る距離は、拡散の数学(Crank、The Mathematics of Diffusion、第2版、1975)を考慮することにより概算様式で推定され得る。任意の所定の方向x(cm)の拡散輸送の速度は、Fickの法則により以下の式で与えられる。
【0072】
【数1】
ここで、jは、拡散係数D(cm2/s)をもつ種の単位面積あたりのフラックス(g−mol/cm2−s)であり、そして∂C/∂xは、その種の濃度勾配である。拡散の数学は、拡散単独により物質が移動し得る特徴または「平均」距離が、拡散係数および拡散が生じることを可能にする時間の両方の1/2べき乗で測定される。実際、オーダーの大きさまで、この特徴的拡散距離は、拡散係数と時間との積の平方根として(これは、システムの幾何学的構造および拡散プロセスに課せられる初期および/または境界条件の事項を考慮するオーダー一致(order unity)の数的因子により調節される)推定され得る。
【0073】
この特徴的拡散距離を、拡散物質が時間tにたどり得る、以下の2乗平均距離drmsとして推定することが便利である:
【0074】
【数2】
上記のように、拡散化学物質が代表的にたどる距離は、それが拡散するために利用可能な時間の平方根とともに変化し−−そして、反対に、拡散する化学物質が所定の距離をたどるために必要な時間は、拡散により横切られる距離の2乗で測定される。従って、オーダー1−10−5cm2/秒の拡散係数Dにより特徴付けられる単純な低分子量生体分子について、0.1秒、1.0秒、2.0秒、および10秒の時間間隔で横切られ得る2乗平均距離drmsは、式2により、それぞれ14μm、45μm、63μm、および141μmと推定される。
【0075】
対流および拡散の両方の機構が同時に起こることを含む輸送プロセスにおける対流と拡散の相対的重要性は、無次元数−すなわちPeclet数Peの助けにより測定され得る。このPeclet数は、2つの速度(rateまたはvelocity)の比−すなわち、対流流れの速度を拡散「流れ」またはフラックスで除する、として概算され得る。より詳細には、このPeclet数は、特徴的な流れ速度V(cm/秒)が特徴的な拡散速度D/L(これもまたcm/秒の単位で表される)で除された比である−両者を同じ方向にとると:
【0076】
【数3】
式3において、Vは、対流流れの平均または特徴的スピードであり、ほぼ、容量流れ速度Q(cm3/秒)を、流れが利用可能な断面積A(cm2)で除することにより決定される。特徴的な長さLは、流れの方向および拡散の方向に平行な方向(すなわち、最も急な濃度勾配の方向)に測定される代表的距離またはシステム寸法であり、そしてプロセス中で拡散が起こる代表的または「平均」距離を代表するように選択される。そして最終に、D(cm2/秒)は、問題の拡散種に対する拡散係数である。(代替であるが等価なPeclet数Peの公式は、それを、2つの特徴的な時間の比−すなわち、拡散および対流の代表的時間の比としてみる。Peclet数についての式3は、特徴的拡散時間L2/Dを、特徴的な対流時間L/Vで除することにより等しく良好に得られ得る。)
輸送の対流成分は、一であること(unity)と比較してPeclet数Peが大きい状況において、拡散成分より優勢であることが予期され得る。逆に、輸送の拡散成分は、一であることと比較してPeclet数Peが小さい状況において、対流成分より優勢であることが予期され得る。Peclet数が1よりかなり大きいか、またはかなり小さいかのいずれかの極端な状況では、輸送は、対流単独によるか、または拡散単独によるかのいずれかで生じると、それぞれ、正確に推測され得る。最後に、推定されたPeclet数が一であることのオーダーである状況では、そのときは、対流および拡散の両方が、輸送プロセスの全体に顕著な役割を演じていることが予期され得る。
【0077】
代表的な低分子量生体分子の拡散係数は、ほぼ、10−5cm2/秒のオーダーである(例えば、スクロースについて0.52・10−5cm/秒、そしてグリシンについて1.06・10−5cm/秒)。従って、100μm(すなわち、0.01cm)の距離だけ離れた反応中心、空洞、またはウェルについて、これらのような低分子量溶質に対するPeclet数Peは、約10μm/秒(0.001cm/秒)より大きい流れ速度について、一であることを超える。わずか10μm(すなわち、0.001cm)だけ離れた空洞については、低分子量溶質に対するPeclet数Peは、約100μm/秒(0.01cm/秒)より大きい流れ速度について、一であることを超える。従って、対流輸送は、非常に遅い流れ速度を除くすべて、および/または非常に短い拡散距離について拡散輸送に対して優勢であるように見える。
【0078】
拡散種の分子量が実質的により大きい場合−−例えば、DNA/RNA、DNAフラグメント、オリゴヌクレオチド、タンパク質、および前者の構築物のような大きな生体分子であるとき−−種の拡散度は、対応してより小さく、そして対流が、両方の機構を含む輸送プロセスにおいて、拡散に対してより重要な役割を演じる。例えば、タンパク質の水相拡散係数は、約10倍の範囲に入る(Tanford、Physical Chemistry of Macromolecules、1961)。タンパク質拡散度は、リボヌクレアーゼ(13,683ダルトンの分子量をもつ小タンパク質)について1.19×10−6cm2/秒の値で階層付けられ、そしてミオシン(493,000ダルトンの分子量をもつ大タンパク質)について1.16×10−7cm2/秒の値で階層付けられている。なおより大きな物質(例えば、4060万ダルトンのタバコモザイクウイルスまたはTMV)は、より低い拡散度(特に、TMVについて4.6×10−8cm2/秒)(Lehninger、Biochemistry、第2版、1975)により特徴付けられる。対流と拡散とがほぼ等しく輸送に寄与する流体速度(すなわち、一であることのオーダーのPe)は、種拡散度に直接比例して測定される。
【0079】
Peclet数の形式の助けにより、反応チャンバー、空洞またはウェルに供給される反応物−−およびそれから除去される生成物に対する対流のインパクトを測定することが可能である。その一方、最も穏やかな対流でさえ、アレイまたはFORA中の空洞の内部に反応物が送達される速度を認識し得るほど増大することは明らかである。特に、単純化のために、ほぼ等しい対流および拡散流れに対する規準がPe=1であると考えられると仮定する。そのときは、ほんの0.004cm/秒のオーダーの対流流れ速度は、反応物拡散度が1×10−5cm2/秒の推定値を仮定すると、拡散単独によりウェルの底に反応物が供給され得るのとほぼ同じ速度で、反応物を25μm深さのウェル中に運ぶために十分であることが推定され得る。2.5μm深さのマイクロウェルの底から頂部までのこのような種の拡散の速度に一致するために必要な対応する流れ速度は、0.04cm/秒のオーダーであると推定される。これよりかなり高いFORAを通る流れ速度が可能であり、それによって、最も穏やかな対流流れが、FORA反応中心、空洞またはウェルへの反応物の拡散的供給を増強し得る程度を例示する。
【0080】
好ましくは、灌流チャンバーは、イメージングシステムが準備される間それから離脱されており、そして配列決定分析が実施されるときのみイメージングシステム上に配置される。1つの実施形態では、固体支持体(すなわち、DNAチップまたはスライドグラス)が、金属またはプラスチックハウジングにより適所に保持され、これは、前記固体支持体の再配置を可能にするようにアセンブルまたは脱アセンブルされ得る。灌流チャンバーの固体支持体の下側は、反応チャンバーアレイを保持し、そして伝統的な光学を基礎にした焦点システム、高開口数対物レンズを用いて反応中心アレイのイメージをCCDイメージングシステム上に集める。
【0081】
分析のための代替システムは、サンプルが、表面、例えば、微細製作されたチップ上に分配され、そしてそれによって、配列されたサンプルのセットが2次元フォーマットで固定化され得るアレイフォーマットを用いることである。多くのサンプルがそれによって並行して分析され得る。本発明の方法を用い、多くの固定化されたテンプレートがこの中で分析され得、これは、酵素および1つのヌクレオチドを含む溶液を、上記表面上で流すことを可能すること、次いで各サンプルについて生成されるシグナルを検出することによった。次いでこの手順は繰り返され得る。あるいは、テンプレートに相補的ないくつかの異なるオリゴヌクレオチドを、上記表面上に分配し、次いでテンプレートとハイブリダイズする。デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの取り込みは、プライマーとして種々のオリゴヌクレオチドを用いて生成されたシグナルにより各オリゴヌクレオチドについてモニターされ得る。上記表面の異なる領域からのシグナルを組み合わせることにより、配列を基礎にした分析が、種々のジデオキシヌクレオチドを用いるポリメラーゼ反応の4つのサイクルにより実施され得る。
【0082】
上記支持体が空洞化されたアレイの形態、例えば、FORAの末端、またはマイクロウェルのその他のアレイであるとき、試薬のための適切な送達手段は、流すことおよび洗浄すること、そしてまた、例えば、流すこと、スプレーすること、エレクトロスプレーすること、インクジェット送達、スタンプすること、超音波微粒化(Sonotek Corp.、Milton、NY)およびローリングを含む。好ましくは、すべての試薬溶液は、10−20%エチレングリコールを含み、蒸発を最小にする。スプレーすることが用いられる場合、試薬は、工業タイプのスプレーノズル(Spraying Systems、Co.、Wheaton、IL)またはCAMAG TLC Sprayer(Camag Scientific Inc.、Wilmington、NC)のような薄層クロマトグラフィー(TLC)で用いられるアトマイザーにより生成される均一な薄層中のFORA表面に送達される。これらの噴霧器は、0.3〜10μmのサイズ範囲のエアロゾルスプレー粒子に試薬を微粒化する。
【0083】
タンパク質溶液およびDNA溶液のエレクトロスプレー沈着(ESD)は、現在、これら分子の質量スペクトル分析のためのイオンを生成するために用いられている。静電力の制御下でFORA基板の特定領域上への荷電したエレクトロスプレー生成物の沈着が示唆されている。ES沈着されたタンパク質およびDNAは、それぞれ、抗体に特異的に結合し、そしてDNAプローブにマッチするそれらの能力を保持し、ドットイムノ結合(DIB)中およびDNAハイブリダイゼーションアッセイ中で、ESD製造されたマトリックスの使用を可能にする(MorozovおよびMorozova Anal.Chem.71(15):3110−7(1999))。
【0084】
インクジェット送達は、文献中に記載されているように(例えば、Rodaら、Biotechniques 28(3):492−6(2000))、タンパク質溶液およびその他の生体高分子に適用可能である。これはまた、例えば、MicroFab Technologies,Inc.(Plano、TX)から市販されている。
【0085】
あるいは、試薬溶液は、リソグラフィーに類似の方法によりFORA表面に送達され得る。ローラー(スタンプ;親水性材料が用いられるべきである)は、最初、リザーバー中で湿潤スポンジを用いて試薬層で覆われ、そして次にFORA表面上にロールされる(それに対して押し付けられる)。
【0086】
好ましくは、連続的な試薬送達ステップは、当該分野で従来公知の技法を用いて洗浄ステップと分離されている。これらの洗浄は、例えば、高速流れ噴霧器またはFORAもしくはマイクロウェルアレイ表面上の液体流れによることを含む、上記に記載の方法を用いて実施され得る。これらの洗浄は、出発物質が試薬と反応し、各反応チャンバーで生成物を形成した後であるが、任意の1つの反応チャンバーに送達された試薬がその反応チャンバーから他の任意の反応チャンバー中に拡散する前の任意の時間に生じ得る。1つの実施形態では、任意の1つの反応チャンバーは、他の任意の反応チャンバー中で形成されるが、1つ以上の共通試薬を用いて生成される生成物とは独立している。
【0087】
完全な装置の実施形態は図2に示されている。この装置は、離脱可能な灌流チャンバー226と連通する入口導管200を備える。この入口導管200は、複数のチューブ202−212を経由して配列決定試薬の侵入を可能にし、この複数のチューブは、それぞれ、複数の配列決定調合試薬ベッセル214−224と連通している。
【0088】
試薬は、能動流れを駆動するために加圧システムまたはポンプのいずれかを用い、導管200を通じて灌流チャンバー226中に導入される。代表的には、この試薬の流速は、0.05〜50ml/分(例えば、1〜50ml/分)であり、0.100ml〜連続流れ(洗浄のため)の容量である。バルブは、ヌクレオチドおよび洗浄試薬のサイクリングを可能にするコンピューター制御下にある。配列決定試薬、例えば、ポリメラーゼは、ヌクレオチドと予備混合され得るか、または流れに添加され得る。多岐管は、6つのチューブ202−212のすべてを、灌流チャンバー供給のために1つにする。従って、いくつかの試薬送達ポートが灌流チャンバーへのアクセスを可能にする。例えば、ポートの1つを利用して水性配列決定試薬のインプットを可能にし得、その一方、別のポートが、これら試薬(および任意の反応生成物)を灌流チャンバーから引き抜かれることを可能にする。
【0089】
灌流チャンバー226は、複数の反応チャンバーを備える基板を備える。この灌流チャンバーは、増幅された核酸上に、要求される水溶液中の配列決定試薬の均一な直線状流れを可能にし、そしてこれら試薬の迅速かつ完全な交換を可能にする。従って、これは、ピロリン酸を基礎にした配列決定反応を実施するために好適である。灌流チャンバーはまた、アンカープライマーを調製し、増幅反応、例えば、本明細書に記載のRCA反応を実施するために用いられ得る。
【0090】
本発明はまた、アレイに、核酸配列決定酵素を送達するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、この核酸配列決定酵素の1つは、スルフリラーゼ(sulfurylase)活性をもつポリペプチドであり得るか、またはこの核酸配列決定酵素は、ルシフェラーゼ活性をもつポリペプチドであり得る。別の実施形態では、この核酸配列決定酵素の1つは、スルフリラーゼ活性およびルシフェラーゼ活性の両方をもつポリペプチドであり得る。より好適な実施形態では、この試薬は、核酸配列決定反応における使用に適切であり得る。
【0091】
好適な実施形態では、1つ以上の試薬が移動可能な固体支持体の集団、例えば、ビーズまたはマイクロスフェアに固定化または付着されたアレイに送達される。このビーズまたはマイクロスフェアは、球状である必要はなく、不規則形状のビーズが用いられ得る。代表的には、これらは多くの物質、例えば、プラスチック、ガラスまたはセラミックから構築され、そしてビーズのサイズは、ナノメーターからミリメーターの範囲にあり、これは反応チャンバーの幅に依存する。好ましくは、各移動固体支持体の直径は、各空洞の幅の0.01〜0.1倍の間であり得る。種々のビーズ化学物質、例えば、メチルスチレン、ポリスチレン、アクリルポリマー、ラテックス、常磁性体、トリアゾル、炭素グラファイトおよび二酸化チタンを用い得る。ビーズの構築または化学は、所望の試薬の付着を容易にするように選択され得る。
【0092】
別の実施形態では、最初に生体活性試薬が合成され、そして次にビーズに共有結合で付着される。当業者に認識されるように、これは、生体活性試薬およびビーズの組成に依存してなされ得る。チオール、アミン、カルボキシルなどのような化学的に反応性の基を用いる特定のポリマーのような固体支持体表面の官能化は当該分野で一般に公知である。従って、ユーザーにより所望の官能性の付着を容易にする表面化学を有する「ブランク」ビーズが用いられ得る。ブランクビーズのこれらの表面化学のさらなる例は、制限されずに、脂肪族アミンおよび芳香族アミンを含むアミノ基、カルボン酸、アルデヒド、アミド、クロロメチル基、ヒドラジド、ヒドロキシル基、スルホネートおよびスルフェートを含む。
【0093】
これらの官能基は、一般に、公知の化学物質を用い、ビーズに任意の数の異なる候補薬剤を付加するために用いられ得る。例えば、炭化水素を含む候補薬剤は、アミノ官能化支持体に付着され得る;炭化水素のアルデヒドを、標準的な技法を用いて作成し、そして次にこのアルデヒドを表面上のアミノ基と反応させる。代替の実施形態では、スルフヒドリルリンカーが用いられ得る。SPDP、マレイミド、α−ハロアセチル、およびピリジルジスルフィドのような、当該分野で公知の多くのスルフヒドリル反応性リンカーがあり(例えば、本明細書に参考として援用される、1994年のPierce Chemical Companyカタログ、架橋リンカーの技術セクション、155−200頁を参照のこと。)、これを用い、システインを含有するタンパク質の試薬を支持体に付着し得る。あるいは、候補試薬上のアミノ基を、表面上のアミノ基への付着のために用い得る。例えば、多数の安定な二官能性基が当該分野で周知であり、これにはホモ二官能性リンカーおよびヘテロ二官能性リンカーが含まれる(Pierce Catalog and Handbook、155−200頁を参照のこと)。さらなる実施形態では、カルボキシル基(表面由来であるか、または候補薬剤由来のいずれか)を、周知のリンカー(Pierceカタログを参照のこと)を用いて誘導体化し得る。例えば、カルボジイミドは、アミンなどの良好な求核試薬による攻撃のためにカルボキシル基を活性化する(Torchilinら、Critical Rev.Thereapeutic Drug Carrier Systems、7(4):275−308(1991)を参照のこと)。タンンパク質の候補試薬はまた、当該分野で公知である、例えば、ポリマーへの抗体の付着のための他の技法を用いて付着され得る;Slinkinら、Bioconj.Chem.2:342−348(1991);Torchilinら、前述;Trubetskoyら、Bioconj.Chem.3:323−327(1992);Kingら、Cancer Res.54:6176−6185(1994);およびWilburら、Bioconjugate Chem.5:220−235(1994)を参照のこと。候補薬剤は、上記に列挙したようなものを含む種々の方法で付着され得ることが理解されるべきである。好ましくは、付着の様式は、候補試薬の官能性を有意に改変しない;すなわち、候補試薬は、標的とのその相互作用を可能にするような柔軟な様式で付着されるべきである。
【0094】
ビーズ上に酵素を固定化する特別の技法は先行技術で公知である。1つの事例では、NH2表面化学ビーズが用いられる。表面活性化は、pH6.9を提供する(138mM NaCl、2.7mM KCl)リン酸緩衝化生理食塩水(10mM)中の2.5%グルタルアルデヒドで達成される。この混合物は、攪拌ベッド上で、約2時間、室温で攪拌される。次いで、ビーズを超純水+0.01%−0.02%Tween20(界面活性剤)ですすぎ、そしてpH7.7 PBS+0.01%Tween20で再びすすぐ。最後に、酵素を、好ましくは、0.45μmのアミコンマイクロポアフィルターを用いて予備濾過した後、溶液に添加する。
【0095】
移動固体支持体の集団は、反応チャンバー中に配置される。いくつかの実施形態では、5%〜20%の反応チャンバーが、移動固体支持体を、その上に少なくとも1つの試薬を固定化して有し得るか、20%〜60%の反応チャンバーが、試薬移動固体支持体を、その上に少なくとも1つの試薬を固定化して有し得るか、または50%〜100%の反応チャンバーが、試薬移動固体支持体を、その上に少なくとも1つの試薬を固定化して有し得る。好ましくは、少なくとも1つの反応チャンバーが、その上に固定化された少なくとも1つの試薬を有する移動固体支持体を有し、そしてこの試薬は、核酸配列決定反応における使用に適切である。
【0096】
いくつかの実施形態では、移動固体支持体に固定化された試薬は、スルフリラーゼ活性をもつポリペプチド、ルシフェラーゼ活性をもつポリペプチドまたはスルフリラーゼ活性およびルシフェラーゼ活性の両方をもつキメラポリペプチドであり得る。1つの実施形態では、それは、ATPスルフリラーゼおよびルシフェラーゼ融合タンパク質であり得る。スルフリラーゼ反応の生成物はルシフェラーゼにより消費されるので、これら2つの酵素間の近接は、2つの酵素を融合タンパク質の形態に共有結合することにより達成され得る。本発明は、基板チャネリングにおけるのみならず、生産コストを低減すること、およびストレプトアビジンでコートされたビーズ上の結合部位の数を潜在的に倍にすることにおいて有用である。
【0097】
別の実施形態では、スルフリラーゼは、熱安定性ATPスルフリラーゼである。好適な実施形態では、この熱安定性スルフリラーゼは、室温を超える温度で活性である(少なくとも50℃まで)。1つの実施形態では、このATPスルフリラーゼは好熱菌由来である。さらなる実施形態では、移動固体支持体は、その上に固定化された第1の試薬および第2の試薬を有し得、この第1の試薬はスルフリラーゼ活性をもつポリペプチドであり、そしてこの第2の試薬は、ルシフェラーゼ活性をもつポリペプチドである。
【0098】
別の実施形態では、移動固体支持体に固定化された試薬は核酸であり得;好ましくは、この核酸は一本鎖のコンカタマーである。好適な実施形態では、この核酸は、核酸の配列決定、例えば、熱配列決定反応のために用いられ得る。
【0099】
本発明はまた、移動固体支持体を用いてATP活性を検出または定量する方法を提供する;好ましくは、ATPは、核酸配列決定反応の一部として検出または定量され得る。
【0100】
核酸または試薬酵素のいずれかが付着した移動固体支持体で「じゅうたんをひかれた(carpeted)」FORAを図7に示す。
【0101】
固体支持体は、従来の光学的バンドルまたは光ファイバーバンドルと合わせたCCDシステムを備える画像化システム230に必要に応じて連結される。1つの実施形態において、灌流チャンバー基板としては、水性インターフェース付近で発生した光が、直接光ファイバーを通って基板またはチャンバーに伝達されるような光ファイバーアレイウェファーが挙げられる。CCDシステムが、光ファイバーコネクターを備える場合、画像化は、灌流チャンバー基板を、コネクターと直接接触して配置することによって達成され得る。あるいは、従来の光学が、例えば、I−I拡大複数孔レンズシステム(magnification high numerical aperture lens system)を用いることによって、光ファイバー基板の外側からの直接CCDセンサーへの光を画像化するために用いられ得る。この基板が光ファイバーとの組み合わせを提供しない場合、レンズシステムはまた、上記のように使用され得、この場合、基板または灌流チャンバーカバーのいずれかは、光学的に透明である。例示的なCCD画像化システムは、上記の通りである。
【0102】
画像化システム230は、基板表面上のリアクタからの光を収集するために使用される。光は、例えば、当該分野において公知の高感度、低ノイズの装置を用いてCCD上で画像化され得る。光ファイバーに基づく画像化のためには、光ファイバーを直接カバースリップに組み込むことが好ましく、また、マイクロウェルを形成する光ファイバーを有するFORAのためには、検出器に光を伝達する光ファイバーもまた好ましい。
【0103】
画像化システムは、コンピュータ制御およびデータ収集システム240に連結される。一般的に、任意の一般的に入手可能なハードウェアおよびソフトウェアパッケージが用いられ得る。コンピュータ制御およびデータ収集システムはまた、試薬の送達を制御するためのコンジット200に連結されている。
【0104】
ピロリン酸配列反応により発生した光子は、それらが収束デバイス(例えば、光学的レンズまたは光ファイバー)を通過し、そしてCCD素子に収束される場合のみ、CCDによって捕捉される。しかし、出力された光子は、全ての方向に均等に飛び出す。二次元アレイ(例えば、DNAチップ)を利用した場合の、これらの続く「捕捉」をおよび量を最大限にするために、光子が発生する点に可能な限り近くで(例えば、二次元の固体支持体に直接)それを収集することが好ましい。これは、(i)カバースリップと従来の光学レンズもしくは光ファイバーバンドルとの間に光学的浸漬オイルを利用すること、または、好ましくは、(ii)光ファイバーを直接カバースリップ自体に組み込むこと、のいずれかにより達成される。同様に、薄く、光学的に透明な二次元の表面が用いられる場合、光ファイバーバンドルはまた、その背面表面に対して配置され、反応/灌流チャンバー全体の深さを通して「画像化」する必要性を除外する。
【0105】
(検出手段)
この反応事象(例えば、ルシフェラーゼにより発生された光子)は、種々の検出装置(例えば、光電子増倍管、CCD、CMOS、吸収光計(absorbance photometer)、ルミノメーター、電荷注入デバイス(charge injection device)(CID)、または他の固体状態検出器および本明細書中に記載される装置)を用いて検出および定量され得る。好ましい実施形態において、出力された光子の定量は、融合された光ファイバーバンドルに適合したCCDカメラの使用によって達成される。別の好ましい実施形態において、出力された光子の定量は、マイクロチャネルプレート増強装置に適合したCCDカメラの使用によって達成される。背部を薄くした(back−thinned)CCDが、感度を増加させるために用いられ得る。CCD検出器は、例えば、Bronksら、1995.Anal.Chem.65:2750−2757に記載される。
【0106】
例示的なCCDシステムは、Lockheed−Martin LM485 CCDチップおよび6〜8μmの個々の光ファイバーの直径を有する1−1光ファイバーコネクター(バンドル)を有するSpectral Instruments,Inc.(Tucson,AZ)Series 600 4ポートカメラである。このシステムは、4096×4096(すなわち1600万ピクセルより多い)を有し、10%〜40%を超える範囲までの量子効率を有する。従って、波長に依存して、CCDセンサ上に画像化される光子の40%程度の多さのものが、検出可能な電子に変換される。
【0107】
他の実施形態において、蛍光部分が、標識として用いられ得、そして反応事象の検出は、アレイの表面を走査する共焦走査顕微鏡を用いて実施され得るか、またはより小さい光学分割が可能であり、それにより「より稠密な」アレイの使用を可能とする近視野光学顕微鏡(near−field optical microscopy)(SNOM)が利用可能である。例えば、SNOMを用いて、個々のポリヌクレオチドが、100nm未満(例えば、10nm×10nm)の距離、離れた場合に、区別され得る。さらに、走査性トンネル顕微鏡(Binningら、Helvetica Physica Acta、55:726−735、1982)および原子力顕微鏡(Hanswaら、Annu Rev BioPhys Biomol Struct、23:115−139、1994)が使用され得る。
【0108】
本発明は、反応チャンバーのアレイを、反応が特定の部位で起こっていることを示す光について、同時にモニターするための装置を提供する。これらの装置は、複数の空洞化された表面を有する平面基板から形成される反応チャンバーのアレイを備え得、各々の空洞化された表面は、分析物を含むように適合された反応チャンバーを形成する。これらの反応チャンバーは、5〜200μmの間の中心間距離を有し得、そしてこのアレイは、400,000より多い個々のチャンバーを有し得る。これらの装置はまた、使用の際に特定の反応チャンバーからの光が、この光学的に高感度なデバイスの特定の予め決定された領域に衝突するように構成された光学的に高感度なデバイスを備え得る。これらの装置は、各々の予め決定された領域上で衝突した光のレベルを決定するための手段およびこの反応チャンバーの各々について、経時的に、種々の光を記録するための手段をさらに備え得る。
【0109】
本発明はまた、光ファイバーのバンドルの一端に複数の空洞化した表面を有する、第一のバンドルの光ファイバーから形成されるアレイを備え得る分析センサを提供し、各々の空洞化表面は、分析物を含有するように適合された反応チャンバーを形成する。反応チャンバーは、5〜200μmの間の中心間距離を有し得、そしてこのアレイは、400,000より多い個々のチャンバーを有し得る。この分析センサはまた、反応チャンバー内で光を発生させるための酵素的手段または蛍光手段を有し得る。この分析センサは、光捕捉手段を備える光検出手段およびこの光検出手段に光を伝達するための第二の光ファイバーバンドルをさらに備え得る。この第二の光ファイバーバンドルは、個々の反応チャンバーで発生した光が光捕捉手段への光の伝達のために第二の光ファイバーバンドルの別々のファイバーまたは別々の光ファイバーの群により捕捉されるように、このアレイと光学的に接触され得る。光捕捉手段は、本明細書中で記載されるCCDカメラであり得る。反応チャンバーは、その上に生物活性薬剤と有する1つ以上の移動式固体支持体を備え得る。いくつかの実施形態において、分析センサは、生化学的アッセイにおける使用に適するか、または細胞ベースのアッセイにおける使用に適する。
【0110】
(核酸の配列決定法)
本発明はまた、核酸の配列決定をするための方法を提供し、この方法は、一般的に、以下:(a)複数の反応チャンバーまたは空洞内に配置された、1つ以上の核酸アンカープライマーおよび複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程;(b)少なくとも1つの一本鎖環状テンプレートに有効量の核酸アンカープライマーをアニーリングして、プライマーが結合されたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を産生する工程;(c)プライマーが結合されたアンカープライマー−環状テンプレート複合体と、ポリメラーゼを組み合わせて、環状核酸テンプレートに相補的な複数コピーの核酸を共有結合された伸長アンカープライマーを形成する工程;(d)1コピー以上の共有結合された相補的核酸に有効量の配列決定プライマーをアニーリングする工程;(e)ポリメラーゼおよび予め決定されたヌクレオチド三リン酸を用いて配列決定プライマーを伸長し、配列決定産物、および予め決定されたヌクレオチド三リン酸が配列決定プライマーの3’末端に組み込まれる場合、配列決定反応副産物、を生成する工程;および(f)配列決定反応副産物を同定する工程であって、これにより核酸の配列を決定する工程、を包含する。1つの実施形態において、配列決定副産物は、PPiである。別の実施形態において、dATPアナログまたはddATPアナログがデオキシアデノシン三リン酸またはジデオキシアデノシン三リン酸の代わりに用いられ得る。このアナログは、ポリメラーゼの基質としての役割を果たし得るが、PPi検出酵素の基質としての役割を果たし得ない。この方法は、水性環境における、別々の並行する一般的な反応において実施され得る。
【0111】
別の局面において、本発明は、アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法を含み、この方法は、一般的に、以下:(a)平面表面上の複数の空洞内に配置された複数のサンプルDNAを提供する工程;(b)各々の反応チャンバー中の反応混合物に、既知の窒素を含む既知の塩基の活性化ヌクレオチド5’三リン酸前駆体を添加する工程であって、各々の反応混合物は、テンプレートに指向されるヌクレオチドポリメラーゼおよび一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを含み、このテンプレートは、プライマー鎖の3’末端への活性化ヌクレオチド5’三リン酸前駆体の組み込みを可能にする反応条件下で、このテンプレートより少なくとも1ヌクレオチド残基短い相補的オリゴヌクレオチドプライマー鎖にハイブリダイズされて、各々のテンプレートにおいてプライマー鎖の3’末端で少なくとも1つの対形成しないヌクレオチド残基を形成するが、ただし、ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の窒素を含む塩基が、テンプレートの対形成しないヌクレオチド残基の窒素を含む塩基である、工程;(c)ヌクレオシド5’三リン酸前駆体がプライマー鎖に組み込まれたか否かを決定する工程であって、ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の組み込みは、テンプレートの対形成しないヌクレオチド残基が、組み込まれたヌクレオシド5’三リン酸前駆体の塩基に相補的な、窒素を含む塩基の組成を有すること示す、工程;ならびに(d)工程(b)および(c)を連続的に繰り返す工程であって、ここで各々の連続的な反復は、既知の窒素を含む塩基組成の活性化ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の1つの型を付加し、そしてその組み込みを検出する工程;ならびに(e)ヌクレオシド前駆体の組み込みの配列から、各々の反応チャンバーにおけるテンプレートの対形成しないヌクレオチド残基の塩基配列を決定する工程、を包含する。
【0112】
本発明の1つの実施形態において、アンカープライマーは、粒子に連結している。このアンカープライマーは、伸長アンカープライマーの形成の前または後に、粒子に連結され得る。配列決定副産物は、PPiであり得、そしてスルフリラーゼ/ルシフェラーゼ反応の組み合わせは、検出のための光を発生させるために用いられる。スルフリラーゼおよびルシフェラーゼのいずれかまたはそれらの両方が、各々の反応部位に配置された1つ以上の移動性固体支持体上に固定化され得る。
【0113】
別の局面において、本発明は、アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法に関連する。この方法は、複数のサンプルDNAを提供する工程を包含し、これらの各々のサンプルDNAは、平面表面上の複数の空洞内に配置され、これらの空洞の各々は、分析物反応チャンバーを形成し、ここでこの反応チャンバーは、5〜200μmの間の中心間距離を有する。次いで、既知の窒素を含む塩基の活性化ヌクレオチド5’三リン酸前駆体が、各々の反応チャンバーに反応混合物に添加される。各々の反応混合物は、テンプレート指向性ヌクレオチドポリメラーゼおよびテンプレートより少なくとも1ヌクレオチド残基一本鎖ポリヌクレオチド残基を含み、このテンプレートは、プライマー鎖の3’末端への活性化ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の組み込みを可能にする反応条件下で、このテンプレートより少なくとも1ヌクレオチド残基短い相補的オリゴヌクレオチドプライマー鎖にハイブリダイズされて、各々のテンプレートにおいてプライマー鎖の3’末端で少なくとも1つの対形成しないヌクレオチド残基を形成するが、ただし、ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の窒素を含む塩基が、テンプレートの対形成しないヌクレオチド残基の窒素を含む塩基である。次いで、ヌクレオシド5’三リン酸前駆体がプライマー鎖に組み込まれたか否かが決定され、ここで、ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の組み込みは、テンプレートの対形成しないヌクレオチド残基が、組み込まれたヌクレオシド5’三リン酸前駆体の塩基に相補的な、窒素を含む塩基の組成を有すること示す。次いで、これらの工程が連続的に繰り返され、ここで各々の連続的な反復は、既知の窒素を含む塩基組成の活性化ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の1つの型を付加し、そしてその組み込みを検出する。次いで、各々の反応チャンバーにおけるテンプレートの対形成しないヌクレオチド残基の塩基配列が、ヌクレオシド前駆体の組み込みの配列から、決定される。
【0114】
別の局面において、本発明は、テンプレート核酸重合体中の核酸配列を決定するための方法に関連する。この方法は、1つの平面表面上の複数の空洞に複数のテンプレート核酸重合体を導入する工程を包含し、各々の空洞は、分析物反応チャンバーを形成し、ここでこれらの反応チャンバーは、5〜200μmの間の中心間距離を有する。各々の反応チャンバーはまた、核酸重合体が、ヌクレオチドが添加されたときに相補的核酸重合体の合成のためのテンプレート重合体としての役割を果たす重合環境を有する。一連の供給原料が、重合環境に連続的に提供され、各々の供給原料は、相補的核酸重合体が形成されるヌクレオチドの中から選択されるヌクレオチドを有し、その結果、供給原料中のヌクレオチドが配列決定されるテンプレート重合体中の次のヌクレオチドに相補的である場合、そのヌクレオチドが、相補的重合体中に組み込まれ、そして無機ピロリン酸が放出される。次いで、無機ピロリン酸の形成が、相補的重合体中の各々のヌクレオチド(従ってテンプレート重合体の配列)の正体を決定するために検出される。
【0115】
別の局面において、本発明は、サンプルDNAのDNA配列における標的位置の塩基を同定する方法に関連する。この方法は、1つの平面表面上の複数の空洞内に配置されたDNAのサンプルを提供する工程を包含し、各々の空洞は、分析物反応チャンバーを形成し、ここでこの反応チャンバーは、5〜200μmの間の中心間距離を有し、DNAは、反応チャンバー中に配置される前または後のいずれかに一本鎖にされる。次いで、標的位置に直ぐに隣接する位置で固定化一本鎖DNAにハイブリダイズされる、伸長プライマーが、提供される。固定化された一本鎖DNAは、予め決定されたヌクレオチド三リン酸の存在下でポリメラーゼ反応に供され、ここでこの予め決定されたヌクレオチド三リン酸が配列決定プライマーの3’末端に組み込まれる場合、配列決定反応副産物が形成される。次いで、この配列決定反応副産物が、同定され、これにより、標的位置の塩基に相補的なヌクレオチドを決定する。
【0116】
別の局面において、本発明は、サンプルDNA配列中の標的位置の塩基を同定する方法に関連する。この方法は、1つの平面表面上の複数の空洞内に配置されたサンプルDNAを提供する工程を包含し、各々の空洞は、分析物反応チャンバーを形成し、ここでこの反応チャンバーは、5〜200μmの間の中心間距離を有し、DNAは、反応チャンバー中に配置される前または後のいずれかに一本鎖にされ、そして標的位置に直ぐに隣接してサンプルDNAにハイブリダイズする伸長プライマーを提供する。次いで、サンプルDNA配列および伸長プライマーは、ヌクレオチド三リン酸の存在下で、ポリメラーゼ反応に供され、これにより、ヌクレオチド三リン酸は、標的位置における塩基に相補的である場合にのみ、組み込まれ、そしてピロリン酸(PPi)を放出し、このヌクレオチド三リン酸は、サンプル−プライマー混合物の別々のアリコートにか、または同じサンプル−プライマー混合物に連続的にかのいずれかで添加される。次いで、ヌクレオチドが組み込まれたことを示すPPiの放出が、検出される。
【0117】
別の局面において、本発明は、一本鎖サンプルDNA配列中の標的位置の塩基を同定する方法に関連する。この方法は、標的位置に直ぐに隣接してサンプルDNAにハイブリダイズする伸長プライマーを提供する工程を包含し、このサンプルDNAは、1つの平面表面上の複数の空洞内に配置され、各々の空洞は、分析物反応チャンバーを形成し、ここで、反応チャンバーは、5〜200μmの間の中心間距離を有し、DNAは、反応チャンバーに配置される前または後のいずれかに一本鎖にされる。このサンプルDNAおよび伸長プライマーは、予め決定されたデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に供され、これによりデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドは、標的位置における塩基に相補的である場合にのみ組み込まれ、そしてピロリン酸(PPi)を放出し、予め決定されたデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドは、サンプル−プライマー混合物の別々のアリコートにか、または同じサンプル−プライマー混合物に連続的にかのいずれかに添加される。PPiの任意の放出は、酵素的に検出されて、どのデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが組み込まれているかを示す。これは、PPi検出酵素は、ポリメラーゼ反応工程に含まれ、そしてデオキシアデノシン三リン酸(ATP)またはジデオキシアデノシン三リン酸(ATP)の代わりに、ポリメラーゼの基質として作用し得るが、PPi検出酵素の基質としての役割を果たさないdATPアナログまたはddATPアナログが用いられるという点で特徴付けられる。
【0118】
別の局面において、本発明は、核酸の配列決定をするための方法に関連する。この方法は、1つ以上の核酸アンカープライマー;および上記のアレイ上の複数の空洞内に配置された複数の核酸テンプレートを提供する工程を包含する。有効量の核酸アンカープライマーが、少なくとも1つの一本鎖環状テンプレートにアニーリングされて、プライマーが結合されたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を産生する。次いで、プライマーが結合されたアンカープライマー−環状テンプレート複合体は、ポリメラーゼと合わされて、環状核酸テンプレートに相補的な複数コピーの核酸に共有結合した伸長したアンカープライマーを形成する;次いで、1コピー数以上の共有結合された相補的核酸に有効量の配列決定プライマーをアニーリングさせる。次いで、この配列決定プライマーは、プライマーおよび予め決定されたヌクレオチド三リン酸を用いて伸長されて、配列決定産物および、予め決定された三リン酸が、配列決定プライマーの3’末端上に組みこまれる場合、配列決定副産物を産生する。次いで、配列決定反応副産物が、同定され、これにより核酸の配列を決定する。
【0119】
(アンカープライマーの構造)
本発明のアンカープライマーは、一般的に、軸領域および少なくとも1つのアダプター領域を含む。好ましい実施形態において、このアンカープライマーは、少なくとも2つの連続するアダプター領域を含む。軸領域は、アンカープライマーの5’末端に存在し、そして固体基材にアンカープライマーを付着させるためのヌクレオチドの領域を含む。
【0120】
アダプター領域は、複数の核酸配列の1つ以上のメンバー中に存在する相補的配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アンカープライマーは、2つの隣接するアダプター領域を含み、これらの領域は、標的核酸配列の別々の末端に連結される相補的領域にハイブリダイズする。この実施形態は、図1に例示され、これは、以下でより詳細に議論される。さらなる実施形態において、アンカープライマー中のアダプター領域は、第二の核酸配列中に存在する配列の非連続的領域に相補的である。例えば、各々のアダプター領域は、1つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いた消化により産生されるフラグメントの各々の末端に相同であり得る。このフラグメントは、例えば、配列多型を含むことが既知または予想される配列を含み得る。さらに、アンカープライマーは、標的核酸配列のギャップの開いた(gapped)領域(すなわち、1つ以上のヌクレオチドの欠失に起因して非連続的である領域)に相同である2つのアダプター領域を含み得る。これらの配列を有するアダプター領域が用いられる場合、ギャップの開いた配列に対応する整列するオリゴヌクレオチドが、テンプレート核酸分子集団に沿ってアンカープライマーにアニーリングされ得る。
【0121】
アンカープライマーは、必要に応じて、更なるエレメント(例えば、1つ以上の制限酵素認識部位、RNAポリメラーゼ結合部位(例えば、T7プロモーター部位)、同定されたDNA配列中に存在する配列(例えば、既知の遺伝子中に存在する配列))を含み得る。アダプター領域はまた、配列多型に隣接することが知られている配列を含み得る。配列多型は、ヌクレオチドの置換、挿入、欠損、または2つの別の同一の核酸配列の間の配列の差異を生じる他の再構成を含む。配列多型の例は、単一ヌクレオチド多型(SNP)である。
【0122】
一般的に、塩基対形成し得る任意の核酸は、アンカープライマーとして用いられ得る。いくつかの実施形態において、アンカープライマーは、オリゴヌクレオチドである。本明細書中に使用される場合、用語オリゴヌクレオチドは、モノマー対モノマーの相互作用の通常のパターンにより標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、天然または改変されたモノマーまたは連結(例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらのアノマー形態、ペプチド核酸(PNA)など)の直鎖状のオリゴマーを含む。これらの型の相互作用としては、例えば、Watson−Crick型の塩基対形成、塩基スタッキング、Hoogsteenまたは逆Hoogsteen型の塩基対形成などが挙げられ得る。一般的に、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログにより連結して、例えば、3〜200、8〜150、10〜100、20〜80、または25〜50のモノマー単位の大きさの範囲をとるオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが文字列により表現される場合はいつも、そのヌクレオチドは、左から右へ5’→3’方向に方向付けられており、そして本明細書中で他に示されない限り、文字「A」が、デオキシアデノシンを示し、文字「T」が、チミジンを示し、文字「C」が、デオキシシトシンを示し、そして文字「G」が、デオキシグアノシンを示すことが理解される。本発明のオリゴヌクレオチドは、非天然のヌクレオチドアナログを含み得る。しかし、例えば、酵素によるプロセシングが必要とされる場合などは、天然に存在するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが、一般的に生物学的機能の保持に必要とされる。
【0123】
(固体基材へのプライマーの連結)
アンカープライマーは、増感部位で固体基材に連結される。連結されたプライマーを含む固体基材の領域は、本明細書中で、アンカーパッドと呼ばれる。従って、固体支持体上での増感状態を特定することによって、アンカーパッドのアレイまたはマトリクスを形成することが可能である。これらのアンカーパッドは、例えば、固体支持体上に等間隔でエッチングされた小さい直径のスポットであり得る。アンカーパッドは、この基材が空洞作成されているか、エッチングされているか、または上で議論されるような他のミクロ機械加工されている場合、空洞またはウェルの底部に配置され得る。
【0124】
1つの実施形態において、アンカープライマーは、粒子に連結される。アンカープライマーは、伸長したアンカープライマーの形成の前または伸長アンカープライマーの形成の後にその粒子に連結され得る。
【0125】
このアンカープライマーは、共有結合相互作用または非共有結合相互作用を介して固体支持体に付着され得る。一般的に、当該分野において認識されている任意の連結が、使用され得る。当該分野において一般的なそのような連結の例としては、任意の適切な金属(例えば、Co2+、Ni2+)−ヘキサヒスチジン複合体、ビオチン結合タンパク質(例えば、NEUTRAVIDINTM改変アビジン(Pierce Chemicals、Rockford、IL))、ストレプトアビジン/ビオチン、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)/グルタチオン、モノクローナル抗体/抗原、およびマルトース結合タンパク質/マルトース、およびプルロニック(pluronic)カップリング技術が挙げられる。適切なタグを含むサンプルが、増感された基板と共にインキュベートされて、その結果、0、1つ、または複数の分子が、各々の増感部位に付着する。
【0126】
あるビオチン−(ストレプト−)アビジン−ベースのアンカー方法は、固体表面上で乾燥された光活性ビオチン可能なアナログの薄層を使用する(HengsakulおよびCass,1996.Bioconjugate Chem.7:249〜254)。次いで、ビオチンアナログは、活性化ビオチンの規定された領域を作成するように、マスクを介して白色光に曝露される。次いで、アビジン(またはストレプトアビジン)が、添加され、そして活性化ビオチンに結合される。アビジンは、遊離ビオチン結合部位を保有し、これは、ビオチン−(ストレプト−)アビジン結合を介してビオチン化オリゴヌクレオチドを「アンカー」するために利用され得る。
【0127】
あるいは、アンカープライマーは、光除去可能な保護基を有するビオチン誘導体を用いて固体支持体に付着され得る。この部分は、固体支持体(例えば、ガラス表面)に付着されるウシ血清アルブミン(BSA)に共有結合される。PirrungおよびHuang,1996.Bioconjugate Chem.7:317〜321を参照のこと。ついで、マスクが、規定された照射領域内で活性化ビオチンを作製するために使用される。次いで、アビジンが、BSA−ビオチン−アビジン−ビオチン結合を介して実質的に付着されたビオチン化DNAと共に照射範囲に配置され得る。所望される場合、シランの中間層は、規定された領域におけるBSA結合を位置づけるためにパターン化され得るシリコンジオキシドシラン表面上の自己アセンブリした単層に沈着される。例えば、Mooneyら、1996.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:12287〜12291を参照のこと。
【0128】
プルロニック(pluronic)ベースの付着において、アンカープライマーは、プルロニック化合物としても公知であるまずポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシオトリブロックコポリマーの末端に付着される。プルロニック部分は、アンカープライマーを固体基材に付着するために使用され得る。プルロニックは、疎水性表面とポリプロピレンオキシドとの間の反応によって疎水性表面に付着する。残りのポリエチレンオキシド基は、表面から伸長し、これによって疎水性の環境を作る。ニトリロトリ酢酸(NTA)は、ポリエチレンオキシド鎖の末端に結合体化して、ヘキサヒスチジンタグ化アンカープライマーの付着を可能にし得る。別の実施形態において、ピリジルジスルフィド(PDS)は、ポリエチレン鎖の末端に結合体化して、ジスルフィド結合を介したチオール化アンカープライマーの付着を可能にし得る。1つの好ましい実施形態において、プルロニックF108(BASF Corp.)が、付着のために使用される。
【0129】
固体支持体上の各感光性部位は、潜在的に複数のアンカープライマーを付着し得る。従って、各アンカーパッドは、1つ以上のアンカープライマーを含み得る。単一の生産性反応中心のみを有するパッドの数(例えば、アンカープライマーから伸長された単一配列のみを有する、伸長反応後のパッドの数)を最大化することが好ましい。これは、以下を含むがそれらに限定されない技術によって達成され得る:(i)表面上で洗浄されるビオチン化アンカープライマーの希釈を変化させること;(ii)ビオチン化プライマーがアビジン表面と接触するインキュベーション時間を変化させること;(iii)平均で、各パッド上の1つのプライマーのみが伸長して配列決定テンプレートを作成するような、開環または閉環テンプレートの濃度を変化させること;あるいは(iv)単一分子の直径(<1μm)に接近するためにアンカーパッドのサイズを減少させ、その結果、1つのアンカーの結合が、別のアンカーの結合を阻害するか、または遮断すること(例えば、小さいスポットでの光活性化によって);あるいは(v)アンカーパッドのサイズを減少させて、その結果、1つの環状テンプレートの結合が、第2の環状テンプレートの結合を阻害または遮断すること。
【0130】
いくつかの実施形態において、それぞれ個々のパッドは、1個の連結したアンカープライマーのみを含む。1つのアンカープライマーのみを有するパッドは、固体支持体上で、選択されたアンカープライマーの限界希釈を実行することによって作成され得、その結果、平均で、1つのアンカープライマーのみが、各パッド上に沈着される。パッドに適用されるアンカープライマーの濃度は、例えば、ポアソン分布モデルを用いて計算され得る。
【0131】
単一のアンカープライマーを含む反応パッドの数を最大化するために、1連の希釈実験が実行され、ここで、アンカープライマー濃度または環状テンプレート濃度の範囲が変更される。高度に希釈されたプライマーの濃度について、同じパッドに結合しているプライマーおよび環状テンプレートは、互いに独立しており、そしてポアソン分布は、任意の1つのパッド上て伸長したアンカープライマーの数を特徴づける。実際に伸長されるプライマーの数は変化し得るが、最大37%のパッドが、単一の伸長したアンカープライマーを有する(単一のアンカーオリゴヌクレオチドを有するパッドの数)。この数は、以下のように得られ得る。
【0132】
Npを、パッド上のアンカープライマーの平均数とし、そしてfを、アンカープライマーが環状テンプレートで伸長される確率とする。次いで、1パッドあたりの伸長アンカープライマーの平均数は、Npfであり、これらは、量aとして規定される。実際に伸長されるプライマーの数は変化可能である。低濃度の限界において、同じパッドに結合しているプライマーおよび環状テンプレートは、互いに独立しており、そしてポアソン分布P(n)は、任意のパッド上で伸長したアンカープライマーの数nを特徴づける。この分布は、以下によって数学的に規定され得る:P(n)=(an/n!)exp(−a)、P(1)=a exp(−a)。確率P(1)は、a=1についてのその最大値exp(−1)のをパッドの37%が、仮定し、単一の伸長されたアンカープライマーを有する。
【0133】
アンカープライマー濃度および環状テンプレート濃度の範囲は、1に最も近いNpfの値を見出すために引き続いてスキャンされ得る。この分布を最適化する好ましい方法は、各反応パッド上の複数のアンカープライマーを可能にするが、環状テンプレートの限界希釈を使用し、その結果、平均で、各パッド上の1つのプライマーのみが伸長して配列決定テンプレートを生成する。
【0134】
あるいは、低濃度のアンカープライマーで、最大で1つのアンカープライマーは、各反応パッドにおそらく結合する。高濃度の環状テンプレートが使用され得、その結果、各プライマーがおそらく伸長される。
【0135】
反応パッドが平らな表面または光ファイバーアレイ上に整列される場合、個々のパッドは、1面が約10μmであり、隣接するパッド間で100μmの間隔を有する。故に、1cm2の表面上に、合計約10,000個のマイクロリアクターが沈着され得、そしてポアソン分布に従って、これらのうち約3700は、単一のアンカープライマーを含む。特定の実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドが、固体支持体に付着された後、改変(例えば、ビオチン化)酵素が沈着されて、この表面上の残りの使用されていないアビジン結合部位に結合する。
【0136】
他の実施形態において、複数のアンカープライマーが、アレイ中の任意の1つの個々のパッドに付着される。複数の環状核酸テンプレート(以下により詳細に記載される)の限界希釈は、このように固定化されたアンカープライマーにハイブリダイズされ得、その結果、平均で、各パッド上の1つのプライマーのみが核酸テンプレートにハイブリダイズされる。使用されるライブラリー濃度は、例えば、限界希釈およびPoisson分布モデルを利用して計算され得る。
【0137】
(核酸テンプレート)
本発明に従って配列決定され得る核酸テンプレート(例えば、核酸ライブラリー)は、一般に開環核酸分子または閉環核酸分子を含み得る。「閉環」は、共有結合的に閉じられた環状核酸分子(例えば、環状DNA分子または環状RNA分子)である。「開環」は、5’リン酸基および3’ヒドロキシル基を有する線状一本鎖核酸分子である。1つの実施形態において、一本鎖核酸は、少なくとも100コピーの核酸配列を含み、各コピーは、末端と末端で共有結合している。いくつかの実施形態において、開環は、線状の2本鎖核酸分子からインサイチュで形成される。所定の開環核酸分子の末端は、DNAリガーゼによって連結され得る。開環分子の5’末端および3’末端での配列は、第2の核酸分子中の隣接するヌクレオチドの2つの領域(例えば、アンカープライマーのアダプター領域、または第2のDNA分子に密接に隣接している2つの領域)に相補的である。従って、開環分子の末端は、DNAリガーゼを用いて連結され得るか、またはギャップ充填反応においてDNAポリメラーゼによって伸長され得る。開環は、Lizardi,米国特許第5,854,033号に詳細に記載される。開環は、DNAリガーゼ(DNA用)またはRNAリガーゼの存在下で、例えば、アンカープライマーへの開環のアニーリング後に閉環に転換され得る。
【0138】
所望の場合、核酸テンプレートは、南京錠(padlock)プローブとして提供され得る。南京錠プローブは、線状オリゴヌクレオチドであり、各末端に配置される標的−相補的配列を含み、そしてこれらはリンカー配列によって分離されている。このリンカーは、核酸配列のライブラリーのメンバーの末端に連結され得、この核酸配列は、例えば、物理学的に剪断されるか、制限エンドヌクレアーゼで消化されている。標的配列へのハイブリダイゼーションの際、これらの線状オリゴヌクレオチドの5’末端領域および3’末端領域は、近位に運ばれる。この近位は、2つのプローブセグメントが(適切にハイブリダイズする場合)酵素的ライゲーション(例えば、T4 DNAリガーゼを用いる)によって共有結合されることを可能にし、従って、プローブを、特異的標的配列に連結させた閉環分子に転換する(例えば、Nilssonら、1994,Science 265:2085〜2088を参照のこと)。得られたプローブは、遺伝子配列改変体に対するその特異性および選択性(例えば、Lizardiら、1998.Nat.Genet.19:225〜232;Nilssonら、1997,Nat.Genet.16:252〜255を参照のこと)、ならびに得られた反応産物が、特定の標的配列に局在したままであるという事実の両方に起因して、多くの遺伝子配列の同時分析に適切である。さらに、多くの異なるプローブの分子内連結は、多重PCRベースの方法論よりも非特異的交差反応性に対する感受性が低いと予測され、ここでプライマーの非同族対は、不適切な増幅産物を生じ得る(例えば、LandegrenおよびNilsson,1997.Ann.Med.299:585〜590を参照のこと)。
【0139】
出発ライブラリーは、一本鎖核酸分子、または二本鎖核酸分子のいずれかを含むように構築され得、但し、この核酸配列は、ライブラリー中に存在する場合、アニーリングのために利用可能な領域を含むか、またはアンカープライマー配列へのアニーリングのために利用可能にされ得る。例えば、ローリングサークル増幅のためのテンプレートとして使用する場合、二本鎖テンプレートの領域は、アンカープライマーの伸長のためのテンプレートとして作用するために、少なくとも過渡的に一本鎖である必要がある。
【0140】
ライブラリーのテンプレートは、複数のエレメントを含み得、このエレメントとしては、アンカープライマーに相補的な1つ以上の領域が挙げられるが、これに限定されない。例えば、テンプレートライブラリーは、配列決定プライマーに相補的な領域、コントロールヌクレオチド領域、および引き続いて特徴づけられる配列決定テンプレートから構成される挿入配列を含み得る。以下により詳細に説明されるように、コントロールヌクレオチド領域は、副産物の量と組み込まれたヌクレオチドの数との間の関連を較正するために使用される。本明細書中で使用される場合、用語「相補的」は、特定のヌクレオチド配列にハイブリダイズして、一致した二重鎖を形成し得るヌクレオチド配列をいう。
【0141】
1つの実施形態において、ライブラリーのテンプレートとしては、以下が挙げられる:(i)アンカープライマーに相補的な2つの別個の領域、(ii)配列決定プライマーに相同な1つの領域、(iii)1つの任意のコントロールヌクレオチド領域、(iv)配列決定される、例えば、30〜500、50〜200、または60〜100ヌクレオチドの挿入配列。当然、このテンプレートは、2つ、3つ、または4つ全てのこれらの特徴を備え得る。
【0142】
テンプレート核酸は、核酸の任意の供給源(例えば、任意の細胞、組織、または生物)から構築され得、そして当該分野で認識されている任意の方法によって生成され得る。適切な方法としては、例えば、ゲノムDNAの超音波処理、および核酸分子の最初の集団から所望の範囲の長さのフラグメントを生成するための1種以上の制限エンドヌクレアーゼ(RE)での消化が挙げられる。好ましくは、1種以上の制限酵素は、別個の4塩基の認識配列を有する。このような酵素の例としては、例えば、Sau3A1、Msp1、およびTaq1が挙げられる。好ましくは、この酵素は、対応する制限酵素についての認識配列を含む領域を有するアンカープライマーとの結合体化において使用される。いくつかの実施形態において、アンカープライマーの1つのアダプター領域または両方のアダプター領域は、既知の制限酵素認識配列に隣接しているさらなる配列を含み、これによって、アンカープライマーへの目的の特定の制限フラグメントのアンカープライマーへの捕捉またはアニーリングを可能にする。他の実施形態において、制限酵素が、IIS型制限酵素と共に使用される。
【0143】
あるいは、テンプレートライブラリーは、RNA(例えば、メッセンジャーRNA(mRNA))から相補的DNA(cDNA)ライブラリーを生成することによって作製され得る。所望される場合、cDNAライブラリーは、特定のRNA、内部フラグメント、または単離されたRNAの3’末端を含むフラグメントの3’末端特徴を得るために、制限エンドヌクレアーゼを用いてさらに処理される。アンカープライマー中のアダプター領域は、テンプレートライブラリー中に存在すると考えられる目的の配列(例えば、エンドヌクレアーゼ消化によって生成されるフラグメント内の既知または疑われる配列多型)に相補的であり得る。
【0144】
1つの実施形態において、索引オリゴヌクレオチドは、テンプレートライブラリーのメンバーに付着して、テンプレート核酸とこのテンプレート核酸が由来する核酸集団との実質的な相関を可能にし得る。例えば、出発DNA集団の1つ以上のサンプルは、任意の以前に開示された方法(例えば、制限消化、超音波処理)を用いて別々にフラグメント化され得る。各サンプルに特異的な指示オリゴヌクレオチド配列は、フラグメント化集団のメンバーの末端に付着、例えば、連結される。指示オリゴヌクレオチドは、環状化、増幅、および必要に応じて配列決定のための領域として作用し得、これは核酸を指示またはコード化するために使用され得るのを可能にし、これが由来する出発サンプルを同定する。
【0145】
複数の識別可能な指示プライマーを用いて作製される別個のテンプレートライブラリーは、実質的な反応のために一緒に混合され得る。ライブラリーのメンバーの配列決定は、指示オリゴヌクレオチドに対応する配列の同定を可能にする。この情報に基づいて、任意の所定のフラグメントの起源が、推測され得る。
【0146】
(プライマー−テンプレート核酸複合体のアニーリングおよび増幅)
核酸のライブラリーは、認識された技術を用いてアンカープライマー配列にアニーリングされる(例えば、Hatchら、1999,Genet.Anal.Biomol.Engineer.15:35〜40;Kool,米国特許第5,714,320号およびLizardi,米国特許第5,854,033号を参照のこと)。一般に、アンカープライマーをテンプレート核酸配列にアニーリングさせるための任意の手順は、アダプター領域、またはアンカープライマー配列中の領域とテンプレートライブラリーに特異的(すなわち、完全、またはほぼ完全)な相補性の形成を生じる限り、適切である。
【0147】
多数のインビトロでの核酸増幅技術を利用して、アンカープライマー配列を伸長し得る。増幅されたDNAのサイズは、好ましくは、アンカーパッドのサイズよりも小さく、そしてまたアンカーパッド間の距離よりも小さい。
【0148】
増幅は、代表的に、ポリメラーゼ(例えば、DNA指向型DNAポリメラーゼ、またはRNA指向型DNAポリメラーゼ、そして1つ、2つ、3つまたは4つの型のヌクレオチド三リン酸、そして必要に応じて補助的な結合タンパク質)の存在下で実行される。一般に、プライムされた3’−OH基を伸長し得る任意のポリメラーゼは、これが3’から5’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠損する限り使用され得る。適切なポリメラーゼとしては、例えば、Bacillus stearothermophilus、Thermus acquaticus、Pyrococcus furiosis、Thermococcus litoralis、およびThermus thermophilus由来のDNAポリメラーゼ、バクテリオファージT4およびT7、ならびにE.coli DNAポリメラーゼIクレノウフラグメントが挙げられる。適切なRNA指向型DNAポリメラーゼとしては、例えば、鳥類骨髄芽球症ウイルス由来の逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素、およびヒト免疫不全ウイルス−I由来の逆転写酵素が挙げられる。
【0149】
多数のインビトロでの核酸増幅技術が、記載されている。これらの増幅方法論は、以下の方法に区別され得る:(i)熱循環ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(例えば、Saikiら、1995.Science 230:1350〜1354を参照のこと)、リガーゼ連鎖反応(例えば、Barany,1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88:189〜193;Barringerら、1990.Gene 89:117〜122を参照のこと)、および転写ベースの増幅(例えば、Kwohら、1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173〜1177を参照のこと)を必要とする方法、ならびに(ii)等温増幅系−自己維持、配列複製(例えば、Guatelliら、1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874〜1878を参照のこと);QBレプリカーゼ系(例えば、Lizardiら、1988.BioTechnology 6:1197〜1202を参照のこと);鎖置換増幅(Nucleic Acids Res.1992 Apr 11;20(7):1691〜6);ならびにPNAS 1992 Jan 1;89(1):392〜6;およびNASBA J Virol Methods.1991 Dec;35(3):273〜86に記載される方法。
【0150】
等温増幅はまた、ローリングサークルベースの増幅(RCA)を含む。RCAは、例えば、Kool,米国特許第5,714,320号、およびLizardi,米国特許第5,854,033号;Hatchら、1999.Genet.Anal.Biomol.Engineer.15:35〜40で考察される。RCAの結果は、アンカープライマーの3’末端から伸長された単独のDNA鎖であり(従って、固体支持体マトリクスに連結され)、そしてプライマー配列にアニーリングされた複数コピーの環状テンプレートを含むコンカテマーを含む。代表的に、それぞれ、例えば、約30〜500、50〜200、または60〜100のヌクレオチドサイズ範囲のサイズを有する1,000〜10,000以上のコピー数の環状テンプレートが、RCAで得られ得る。
【0151】
アンカープライマーへの環状核酸分子のアニーリングに続くRCA増幅の産物は、図1Aに図式で示される。環状テンプレート核酸102は、アンカープライマー104にアニーリングされ、これはその5’末端で表面106に連結され、そして伸長のために利用可能な遊離3’OHを有する。環状テンプレート核酸102は、2つのアダプター領域108および110を含み、これらは、アンカープライマー104中の配列の領域に相補的である。配列決定プライマーに相同な挿入物112および領域114がまた、環状テンプレート核酸102に含まれ、これは、以下に記載される配列決定反応で使用される。
【0152】
アニーリングの際、アンカープライマー104上の遊離3’−OHは、テンプレート核酸102内の配列を用いて伸長され得る。アンカープライマー102は、複数回、テンプレートに沿って伸長され得、各々の反復は、アンカープライマーから伸長した配列に、環状テンプレート核酸に相補的な配列を添加する。4回の反復または4回のローリングサークル複製は、伸長されたアンカープライマー増幅産物114として図1Aに示される。アンカープライマーの伸長は、基材106に共有結合しているか、または別々の方法で物理学的に付着している増幅産物を生じる。
【0153】
環状テンプレートおよびアンカープライマーのさらなる実施形態は、図1B〜1D中に、より詳細に示される。図1Bは、ライゲーションの際にアンカープライマーの伸長のためのテンプレートとして働き得るアニーリングした開環線状基質へのアニーリングを例示する。配列5’−TCg TgT gAg gTC TCA gCA TCT TAT gTA TAT TTA CTT CTA TTC TCA gTT gCC TAA gCT gCA gCC A−3’(配列番号1)を有するテンプレート分子は、その5’末端にビオチンリンカーおよび配列5’−gAC CTC ACA CgA Tgg CTg CAg CTT−3’(配列番号2)を有するアンカープライマーにアニーリングする。テンプレートのアニーリングは、テンプレート分子の5’末端および3’末端を隣接させる。アンカープライマーの3’OHは、環状テンプレートを用いて伸長され得る。
【0154】
1ヌクレオチド多型の同定のための環状テンプレートおよびアンカープライマーの使用は、図1Cに示される。配列5’−gAC CTC ACA CgA Tgg CTg CAg CTT−3’(配列番号3)を有する一般的アンカープライマーが示される。このアンカープライマーは、配列5’−TTT ATA TgT ATT CTA CgA CTC Tgg AgT gTg CTA CCg ACg TCg AAT CCg TTg ACT CTT ATC TTC A−3’(配列番号4)を有するSNPプローブにアニーリングする。次に、このSNPプローブは、配列5’−CTA gCT CgT CgT ACA TAT AAA TgA AgA TAA gAT CCT g−3’(配列番号5)を有する遺伝子のSNP含有領域のある領域にハイブリダイズする。SNPプローブ複合体への多型含有核酸配列のハイブリダイゼーションは、SNPプローブの引き続くライゲーションおよび環状化を可能にする。図1Cに示されるように、SNPプローブは、多型部位の領域に接触するように、その5’末端および3’末端がゲノム領域にアニーリングするように設計される。環状化SNPプローブは、本明細書中に記載される方法を用いて引き続いて伸長および配列決定され得る。多型を欠く核酸は、SNPプローブの5’末端および3’末端を隣接させるようにハイブリダイズしない。この場合、SNPプローブは、引き続く伸長のために必要な環状基質を形成するようにはライゲーションされ得ない。
【0155】
図1Dは、環状テンプレート分子に沿ったギャップオリゴヌクレオチドの使用を例示する。配列5’−gAC CTC ACA CgA gTA gCA Tgg CTg CAg CTT−3’(配列番号6)を有するアンカープライマーは、ビオチンリンカーを介して表面に付着される。配列5’−TCg TgT gAg gTC TCA gCA TCT TAT gTA TAT TTA CTT CTA TTC TCA gTT gCC TAA gCT gCA gCC A−3’(配列番号7)を有するテンプレート分子は、アンカープライマーにアニーリングして、二本鎖領域が隣接したアンカープライマー中の部分的一本鎖領域、またはギャップ領域を生じる。次いで、配列5’−TgC TAC−3’を有するギャップ分子は、アンカープライマーにアニーリングする。テンプレート分子へのギャップオリゴヌクレオチドの両方の末端のライゲーションは、ローリングサークル増幅のためのテンプレートとして作用し得る環状核酸分子の形成を生じる。
【0156】
ポリメラーゼ媒介DNA複製の間に生成される環状オリゴヌクレオチドは、テンプレートと複製開始部位との間の関係に依存する。二本鎖DNAテンプレートにおいて、重要な特徴としては、天然でテンプレートが線状であるか、または環状であるかどうか、および複製の開始部位(すなわり、複製「フォーク」)が、DNAの両方の鎖の合成に関与するか、または単一の鎖の合成のみに関与するかどうかが挙げられる。従来の二本鎖DNA複製において、複製フォークは、DNAの新しい鎖が合成される部位として処理される。しかし、線状分子(一方向または二方向のいずれかで複製される)において、複製フォークの移動は、特定の型の構造モチーフを生成する。テンプレートが環状である場合、複製分子の1つの可能な空間的配向は、θ構造の形態をとる。
【0157】
あるいは、二本鎖分子の複製が起点で始まる場合、RCAが生じ得る。続いて、ニックが鎖の1方を開き、そしてニックによって生成される遊離3’−末端ヒドロキシル部分は、DNAポリメラーゼの作用によって伸長される。新しく合成された鎖は、実質的に元の親DNA鎖を置換する。この前述の型の複製は、ローリングサークル複製(RCR)として公知である。なぜならば、複製点が、環状テンプレート鎖のまわりを「回転する」と想定され得、そして理論的に、これは無制限に続き得るからである。さらに、新しく合成されたDNA鎖は、元のテンプレートに共有結合するので、置換された鎖は、その5’末端で元のゲノム配列(例えば、目的の遺伝子、または他の配列)を保有する。RCRにおいて、元のゲノム配列の後に、元のテンプレート配列に相補的な任意の数の「複製単位」が続き、ここで、各複製単位は、元のテンプレート配列の連続的な回転によって合成される。故に、各々の引き続く回転は、その前の複製サイクルで合成されたDNAを置換する。
【0158】
インビボで、RCRは、いくつかの生物学的系において利用される。例えば、いくつかのバクテリオファージのゲノムは、一本鎖の環状DNAである。複製の間に、この環状DNAは、最初に二重鎖形態に転換され、この二重鎖形態は、次いで、上記のローリングサークル(rolling−circle)複製機構によって複製される。置換された末端は、切断されてファージ粒子中に挿入され得る一連のゲノム単位を生じる。従って、置換された一本鎖のローリングサークルは、相補的DNA鎖の合成によって二重鎖DNAに転換され得る。この合成は、特定のファージDNAの成熟のために必要なコンカテマー二重鎖分子を生成するために使用され得る。例えば、これは、λバクテリオファージが成熟する基本的経路を提供する。RCRはまた、Xenopus卵母細胞において増幅されたrDNAを生成するためにインビボで使用され、そしてこの事実は、増幅されたrDNAが、多数の同一の反復単位からなる理由を説明することに役立ち得る。この場合、単一のゲノム反復単位は、ローリングサークルに転換される。次いで、置換された末端は、二重鎖DNAに転換され、引き続いてこの二重鎖DNAは環から切断されて、その結果、2つの末端は、増幅されたrDNA環を生成するように、一緒に連結され得る。
【0159】
RCA反応の使用によって、環状化分子と相補的な多くのタンデムコピーを提示する鎖が生成され得る。例えば、RCAは、最近、ヒトゲノムDNAサンプル中の単一コピー遺伝子を検出するために、インビトロの環状化パッドロックプローブの等温カスケード増幅反応物を得るために利用されている(Lizardiら、1998.Nat.Genet.19:225−232を参照のこと)。さらに、RCAはまた、固相ベースのアッセイにおいて単一のDNA分子を検出するために利用されているが、この技術がインサイチュハイブリダイゼーションに適用される場合には、困難が生じる(Lizardiら、1998.Nat.Genet.19:225−232を参照のこと)。
【0160】
所望の場合、RCAは、高い温度(例えば、37℃、42℃、45℃、50℃、60℃または70℃より高い温度)で、実施され得る。さらに、RCAは、より低い温度(例えば、室温)で最初に実施され得、次いで、高い温度に移行される。高い温度のRCAは、好ましくは、熱安定性核酸ポリメラーゼおよび高い温度で安定かつ特異的にアニールし得るプライマーを用いて実施される。
【0161】
RCAはまた、天然に存在しないオリゴヌクレオチド(例えば、ペプチド核酸)を用いて実施され得る。さらに、RCAは、一本鎖結合タンパク質のような補助的タンパク質の存在下で実施され得る。
【0162】
固体支持体に固定されている短いDNA分子を増幅する方法(RCAと称される)の開発は、最近文献中に記載されている(例えば、Hatchら、1999.Genet.Anal.Biomol.Engineer.15:35−40;Zhangら、1998.Gene 211:277−85;Banerら、1998.Nucl.Acids Res.26:5073−5078;Liuら、1995.J.Am.Chem.Soc.118:1587−1594;FireおよびXu、1995.Proc.Natl.Acad Sci.USA 92:4641−4645;Nilssonら、1994.Science 265:2085−2088を参照のこと)。RCAは、特異的DNA配列を、ハイブリダイゼーションおよびDNAリガーゼ反応によって標的化する。次いで、この環状産物は、ローリングサークル複製反応においてテンプレートとして引き続き使用される。
【0163】
DNAポリメラーゼによって駆動されるRCAは、等温条件下で、線形または幾何学的な反応速度論のいずれかで、環状化オリゴヌクレオチドプローブを複製し得る。2つのプライマー(1つはDNAの+鎖にハイブリダイズし、そして他方はDNAの−鎖にハイブリダイズする)の存在下で、短時間(すなわち、90分未満)に、ヒトゲノム内の単一点変異の検出を可能にする、1x109コピー以上の各サークルを生成する能力を有する複雑なパターンのDNA鎖置換が続く。単一のプライマーを使用して、RCAは、数分で共有結合的に閉じたサークルの、数百のランダムに連結したコピーを生じる。固体支持体マトリックス結合の場合、このDNA産物は、合成部位に結合したままであり、ここで、これは標識され、縮合され、そして点光源として画像化され得る。例えば、RCAシグナルを生じ得る線状オリゴヌクレオチドプローブは、ガラス表面上に共有結合されている。これらのプローブによって発生したシグナルの色は、特異的標的指向性の連結事象の結果に依存して、標的の対立遺伝子状態を示す。RCAにより、数百万の個々のプローブ分子の計数および分類が可能であるので、RCAは、まれな体細胞変異の分析のために、特に許容される。RCAはまた、細胞学的調製物中の単一コピーの遺伝子に結合したパッドロックプローブの検出についての展望を示す。
【0164】
さらに、固相RCA方法論もまた、溶液内の成分を検出する有効な方法を提供するために開発されている。最初に、認識工程を使用して、環状テンプレートが表面に結合した複合体hを生成する。次いで、ポリメラーゼ酵素を使用して、結合複合体を増幅する。RCAは、検出方法(これには、以下により詳細に記載される方法が挙げられる)を用いて、増幅される小さいDNA分子を使用して、強いシグナルを提供する。
【0165】
等温増幅系の他の例としては、例えば、(i)自己持続性の配列複製(例えば、Guatelliら、1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874−1878を参照のこと)、(ii)Qβ複製系(例えば、Lizardiら、1988.BioTechnology 6:1197−1202を参照のこと)、および(iii)核酸配列ベースの増幅(NASBATM;Kievitsら、1991.J.Virol.Methods 35:273−286を参照のこと)。
【0166】
(増幅産物のヌクレオチド配列を決定するための方法)
上記のような核酸テンプレートの増幅は、アンカープライマーに共有結合した複数コピーのテンプレート核酸配列を生じる。1つの実施形態において、配列決定産物のある領域は、テンプレート核酸のある領域に対する配列決定プライマーのアニーリング、次いで、DNAポリメラーゼおよび既知のヌクレオチド三リン酸(すなわち、dATP、dCTP、dGTP、dTTPまたはこれらのヌクレオチドの1つのアナログ)と、配列決定プライマーとを接触させることによって決定される。この配列は、以下に記載されるような配列決定反応副産物を検出することによって決定され得る。
【0167】
配列決定プライマーは、増幅された核酸テンプレートのある領域に特異的にアニールし得る限り、任意の長さまたは塩基組成であり得る。配列決定プライマーは、増幅されたテンプレート核酸上のある領域を特異的にプライムし得る限り、特定の構造を必要としない。好ましくは、この配列決定プライマーは、特徴付けられるべき配列とアンカープライマーにハイブリダイズ可能な配列との間にあるテンプレートのある領域に対して相補的である。配列決定プライマーは、DNAポリメラーゼによって伸長されて、配列決定産物を形成する。この伸長は、1種以上の型のヌクレオチド三リン酸、および所望の場合、補助的結合タンパク質の存在下で実施される。
【0168】
dNTPの取り込みは、好ましくは、配列決定産物の存在についてアッセイすることによって決定される。好ましい実施形態において、配列決定産物のヌクレオチド配列は、dNMPが、伸長した配列決定プライマーに取り込まれる場合にヌクレオチド三リン酸(dNTP)から遊離した無機ピロリン酸(PPi)を測定することによって決定される。PyrosequencingTM技術(PyroSequencing AB、Stockholm、Sweden)と称されるこの配列決定方法は、溶液中(液相)技術または固相技術で実施され得る。PPiベースの配列決定方法は、一般に、例えば、WO9813523A 1、Ronaghiら、1996.Anal.Biochem.242:84−89、およびRonaghiら、1998.Science 281:363−365(1998)において記載される。PPi配列決定のこれらの開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【0169】
これらの条件下で放出されるピロリン酸は、(例えば、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光の発生によって)酵素的に検出され得る。このような方法は、所定の標的部分においてヌクレオチドが同定されるのを可能にし、そしてDNAが、電気泳動および潜在的に危険な放射性標識の使用を必要とせずに単純かつ迅速に配列決定されることを可能にする。
【0170】
PPiは、多数の異なる方法論によって検出され得、そして種々の酵素的方法が以前に記載されている(例えば、Reevesら、1969.Anal.Biochem.28:282−287;Guilloryら、1971.Anal.Biochem.39:170−180;Johnsonら、1968.Anal.Biochem.15:273;Cookら、1978.Anal.Biochem.91:557−565;およびDrakeら、1979.Anal.Biochem.94:117−120を参照のこと)。
【0171】
ポリメラーゼによるdNTPの取り込みの結果として遊離したPPiは、例えば、ATPスルフリラーゼ(sulfurylase)を使用して、ATPに転換され得る。この酵素は、硫黄代謝に関与するとして同定された。還元形態および酸化形態の両方の硫黄は、植物および動物の成長に必須の無機栄養素である(例えば、SchmidtおよびJager、1992.Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.43:325−349を参照のこと)。植物および微生物の両方において、硫黄は能動的に取り込まれた後、硫化物に還元される。硫化物は、利用可能な細胞還元剤と比較して、非常に低い酸化/還元能を有するので、同化におけるその最初の工程は、ATP依存的反応を介したその活性化を必要とする(例えば、Leyh,1993.Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.28:515−542を参照のこと)。ATPスルフリラーゼ(ATP:硫酸アデニリルトランスフェラーゼ;EC 2.7.7.4)は、無機硫酸(SO4 −2)の代謝の最初の反応を触媒する;例えば、RobbinsおよびLipmann、1958.J.Biol.Chem.233:686−690;HawesおよびNicholas、1973.Biochem.J.133:541−550を参照のこと。この反応において、SO4 −2は、アデノシン5’−ホスホスルフェート(APS)に活性化される。
【0172】
ATPスルフリラーゼは、いくつかの供給源(例えば、Saccharomyces cerevisiae(例えば、HawesおよびNicholas,1973.Biochem.J.133:541−550を参照のこと);Penicil1ium chrysogenum(例えば、Renostoら、1990.J.Biol.Chem.265:10300−10308を参照のこと);ラット肝臓(例えば、Yuら、1989.Arch.Biochem.Biophys.269:165−174を参照のこと);および植物(例えば、ShawおよびAnderson,1972.Biochem.J.127:237−247;Osslundら、1982.Plant Physiol.70:39−45を参照のこと)から高度に精製されている。さらに、ATPスルフリラーゼ遺伝子は、原核生物(例えば、Leyhら、1992.J.Biol.Chem.267:10405−10410;SchwedockおよびLong,1989.Mol.Plant Microbe Interaction 2:181−194;LaueおよびNelson,1994.J.Bacteriol.176:3723−3729を参照のこと);真核生物(例えば、Cherestら、1987.Mol.Gen.Genet.210:307−313;MountainおよびKorch,1991.Yeast7:873−880;Fosterら、1994.J.Biol.Chem.269:19777−19786を参照のこと);植物(例えば、Leustekら、1994.Plant Physiol.105:897−90216を参照のこと);および動物(例えば、Liら、1995.J.Biol.Chem.270:29453−29459を参照のこと)からクローニングされている。この酵素は、特定の供給源に依存して、ホモオリゴマーまたはヘテロダイマーである(例えば、LeyhおよびSuo,1992.J.Biol.Chem.267:542−545を参照のこと)。
【0173】
いくつかの実施形態において、熱安定性スルフリラーゼが使用される。熱安定性スルフリラーゼは、例えば、ArchaeoglobusまたはPyrococcus spp.から獲得され得る。熱安定性スルフリラーゼの配列は、データベーズにおいて、登録番号028606、登録番号Q9YCR4および登録番号P56863で入手可能である。
【0174】
ATPスルフリラーゼは、多くの異なる適用(例えば、高濃度のATPでのADPの生体光度(bioluminometric)検出(例えば、Schultzら、1993.Anal.Biochem.215:302−304を参照のこと);DNAポリメラーゼ活性の連続的モニタリング(例えば、Nyrbn,1987.Anal.Biochem.167:235−238を参照のこと);およびDNA配列決定(例えば、Ronaghiら、1996.Anal.Biochem.242:84−89;Ronaghiら、1998.Science281:363−365;Ronaghiら、1998.Anal.Biochem.267:65−71を参照のこと))のために使用されてきた。
【0175】
いくつかのアッセイが、順方向のATPスルフリラーゼ反応の検出のために開発されてきた。比色モリブデン溶解(molybdolysis)アッセイは、リン酸検出に基づく(例えば、WilsonおよびBandurski,1958.J.Biol.Chem.233:975−981を参照のこと)が、連続的分光光度モリブデン溶解アッセイは、NADH酸化の検出に基づく(例えば、Seubertら、1983.Arch.Biochem.Biophys.225:679−691;Seubertら、1985.Arch.Biochem.Biophys.240:509−523を参照のこと)。後者のアッセイは、いくつかの検出酵素の存在を必要とする。さらに、いくつかの放射活性アッセイもまた、文献中に記載されてきた(例えば、Daleyら、1986.Anal.Biochem.157:385−395を参照のこと)。例えば、1つのアッセイは、32P標識ATPから放出された32PPiの検出に基づき(例えば、Seubertら、1985.Arch.Biochem.Biophys.240:509−523を参照のこと)、そして別のアッセイは、[35S]標識APSへの35Sの取り込みに基づく(このアッセイはまた、カップリング酵素として精製されたAPSキナーゼを必要とする;例えば、Seubertら、1983.Arch.Biochem.Biophys.225:679−691を参照のこと);そして第三の反応は、[35S]標識APSからの35SO4 −2の放出に依存する(例えば、Daleyら、1986.Anal.Biochem.157:385−395を参照のこと)。
【0176】
逆方向ATPスルフリラーゼ反応の検出のために、連続的分光光度アッセイ(例えば、Segelら、1987.Methods Enzymol.143:334−349を参照のこと);生体光度検出アッセイ(例えば、BalharryおよびNicholas,1971.Anal.Biochem.40:1−17を参照のこと);35SO4 −2放出アッセイ(例えば、Seubertら、1985.Arch.Biochem.Biophys.240:509−523を参照のこと);および32PPi取り込みアッセイ(例えば、Osslundら、1982.Plant Physiol.70:39−45を参照のこと)が、以前に記載されている。
【0177】
ATPスルフリラーゼによって生成されるATPは、酵素反応を使用して加水分解されて、光を発し得る。光放射化学反応(すなわち、化学発光)および生物学的反応(すなわち、生体発光)は、種々の代謝物の高感度の測定のために、分析的生化学において広く使用されている。生体発光反応において、光の放射を導く化学反応は、酵素触媒される。例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系は、ATPの特異的アッセイを可能にし、そして細菌性ルシフェラーゼ−オキシドレダクターゼ系は、NAD(P)Hのモニタリングのために使用され得る。両方の系は、ATPまたはNAD(P)Hの生成または利用に関与する組み合わされた反応によって、多数の物質の分析に拡張されている(例えば、Kricka,1991.Chemiluminescent and bioluminescent techniques.Clin Chem.37:1472−1281を参照のこと)。
【0178】
新規試薬の開発は、ATP濃度(例えば、Lundin,1982.Applications of firefly luciferase;Luminescent Assays(Raven Press,New York)を参照のこと)またはNAD(P)H濃度(例えば、Lovgrenら、Continuous monitoring of NADH−converting reactions by bacterial luminescence.J.Appl.Biochem.4:103−111を参照のこと)に比例する安定な光放射を獲得することを可能にする。このような適切な光放射試薬を使用して、終点アッセイを行い、そして既知の量のATPまたはNAD(P)Hの添加によって各個々のアッセイを較正することを可能にする。さらに、安定な光放射系はまた、ATP転換系またはNAD(P)H転換系の連続的モニタリングを可能にする。
【0179】
ATPを光に転換するために適切な酵素としては、ルシフェラーゼ(例えば、昆虫ルシフェラーゼ)が挙げられる。ルシフェラーゼは、触媒の最終産物として光を発生する。最も知られた光放射酵素は、ホタル(Photinus pyralis(Coleoptera))の酵素である。対応する遺伝子は、クローニングされ、そして細菌(例えば、de Wetら、1985.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:7870−7873を参照のこと)および植物(例えば、Owら、1986.Science 234:856−859を参照のこと)、ならびに昆虫細胞(例えば、Jhaら、1990.FEBS Lett.274:24−26を参照のこと)および哺乳動物細胞(例えば、de Wetら、1987.Mol.Cell.Biol.7:725−7373;Kellerら、1987.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3264−3268を参照のこと)において発現されている。さらに、Jamaican click beetle(Pyroplorus plagiophihalamus(Coleoptera))由来の多数のルシフェラーゼ遺伝子が、最近、クローニングされ、そして部分的に特徴付けられている(例えば、Woodら、1989.J.Biolumin.Chemilumin.4:289−301;Woodら、1989.Science 244:700−702を参照のこと)。別個のルシフェラーゼは、しばしば、異なる波長の光を発し得、このことは、異なる波長での光放射の同時モニタリングを可能にし得る。従って、これらの前述の特徴は、独自であり、そして現在のレポーター系の有用性に関して新たな次元を加える。
【0180】
ホタルルシフェラーゼは、ルシフェリン、アデノシン5’三リン酸(ATP)、マグネシウムイオンおよび酸素の存在下で生体発光を触媒し、0.88の量子収量を生じる(例えば、McElroyおよびSelinger,1960.Arch.Biochem.Biophys.88:136−145を参照のこと)。ホタルルシフェラーゼの生体発光反応は、約1x10−3Mの検出限界を有する、ATPの検出のためのアッセイとして利用され得る(例えば、Leach,1981.J.Appl.Biochem.3:473−517を参照のこと)。さらに、ルシフェラーゼ媒介性の検出系の感受性および簡便性の全体的な程度は、ホタルルシフェラーゼベースのバイオセンサの開発において、かなりの興味をかきたてた(例えば、GreenおよびKricka,1984.Talanta 31:173−176;Blumら、1989.J.Biolumin.Chemilumin.4:543−550を参照のこと)。
【0181】
上記の酵素を使用して、この配列決定プライマーは、ポリメラーゼおよび既知のdNTPに曝露される。dNTPがプライマー配列の3’末端に取り込まれる場合、このdNTPは切断され、そしてPPi分子が遊離する。次いで、PPiは、ATPスルフリラーゼによってATPに転換される。好ましくは、ATPスルフリラーゼは、PPiの転換がPPiに関して一次の反応速度論で進行する、十分に高い濃度で存在する。ルシフェラーゼの存在下で、ATPは、加水分解されて光子を生じる。この反応は、好ましくは、反応混合物内に存在する十分な濃度のルシフェラーゼを有し、その結果、この反応(ATP→ADP+PO4 −3+光子(光))は、ATPに関して一次の反応速度論で進行する。光子は、以下に記載される方法および装置を使用して測定され得る。1実施形態において、PPiおよびカップリングされたスルフリラーゼ/ルシフェラーゼ反応を使用して、検出のための光を発生させる。いくつかの実施形態において、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼのいずれかまたは両方は、各反応部位に配置された1以上の可動性固体支持体に固定化される。
【0182】
従って、本発明は、リアルタイムの信号を与えるポリメラーゼ反応の間に、PPi放出が検出されることを可能にする。配列決定反応は、リアルタイムで連続的にモニタリングされ得る。従って、PPi放出の迅速な検出のための手順は、本発明によって可能となる。これらの反応は、2秒未満で生じると概算されている(NyrenおよびLundin、前出)。律速段階は、ATPスルフリラーゼによるPPiのATPへの転換であるが、一方、ルシフェラーゼ反応は迅速であり、かつ0.2秒未満で生じると概算されている。ポリメラーゼについての取り込み速度はまた、種々の方法によって概算されており、そして例えば、クレノウポリメラーゼの場合には、1塩基の完全な取り込みが0.5秒未満で生じ得ることが見出されている。従って、1塩基の取り込みおよびこの酵素アッセイによる検出についての概算された総時間は、約3秒である。従って、リアルタイムの検出を可能にする、非常に速い反応時間が可能であることが理解される。この反応時間は、より熱安定性のルシフェラーゼを使用することによって、さらに減少され得る。
【0183】
ほとんどの適用について、ATPおよびPPiのような混入物を含まない試薬を使用することが所望される。これらの混入物は、樹脂に結合したアピラーゼおよび/またはピロホスファターゼを含むプレカラム(pre−column)に試薬を流すことによって除去され得る。あるいは、アピラーゼまたはピロホスファターゼは、磁気ビーズに結合され得、そして試薬中に存在する混入しているATPおよびPPiを除去するために使用され得る。さらに、拡散性の配列決定試薬(例えば、未取り込みdNTP)を、洗浄緩衝液で洗浄することが所望である。ピロリン酸配列決定において使用される任意の洗浄緩衝液が使用され得る。
【0184】
いくつかの実施形態において、配列決定反応中の反応物の濃度は、0.2mlの緩衝液中に1pmolのDNA、3pmolのポリメラーゼ、40pmolのdNTPを含む。Ronaghiら、Anal.Biochem.242:84−89(1996)を参照のこと。
【0185】
配列決定反応は、所望の場合、4種の所定のヌクレオチドを用いて実施され得る。「完全」サイクルは、一般に、所定の順序で、ヌクレオチド(dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP(またはdUTP))の各々についての配列決定試薬を連続的に投与する工程を包含する。取り込まれていないdNTPは、各ヌクレオチド添加の間に洗浄される。あるいは、取り込まれていないdNTPは、アピラーゼによって分解される(以下を参照のこと)。このサイクルは、所望される場合、配列決定産物の所望の量の配列が得られるまで繰り返される。いくつかの実施形態において、約10〜1000、約10〜100、約10〜75、約20〜50または約30ヌクレオチドの配列情報が、1つのアニールした配列決定プライマーの伸長から得られる。
【0186】
いくつかの実施形態において、このヌクレオチドは、ビオチンのようなハプテンのジスルフィド誘導体を含むように改変される。アンカー基材にアニールした新生プライマーへの改変ヌクレオチドの付加は、以下を含む重合後の工程によって分析される:i)この改変がビオチンである例における、酵素分子に連結されたアビジン結合体化部分またはストレプトアビジン結合体化部分の連続的結合、ii)過剰なアビジン連結酵素またはストレプトアビジン連結酵素の洗浄、iii)酵素活性を受けやすい条件下で適切な酵素基質を流すこと、およびiv)酵素基質反応産物の検出。ハプテンは、還元剤の添加によって、この実施形態において除去される。このような方法は、電気泳動および潜在的に危険な放射性標識の使用の必要性を回避しつつ、所定の標的部分においてヌクレオチドが同定され、そしてそのDNAが単純かつ迅速に配列決定されることを可能にする。
【0187】
ハプテンの検出に好ましい酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼである。所望の場合、本明細書中の種々の反応物の添加の間に、洗浄緩衝液が使用され得る。アピラーゼは、配列決定プライマーを伸長するために使用された、未反応のdNTPを除去するために使用され得る。この洗浄緩衝液は、必要に応じてアピラーゼを含み得る。
【0188】
例示的なハプテン(例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光色素分子cy3およびcy5、ならびにフルオレセイン)は、伸長したDNA分子中に、種々の効率で取り込まれる。ハプテンの結合は、ヌクレオチド上の糖、塩基を介する連結によって、そしてリン酸部分を介して、生じ得る。シグナル増幅のための例示的手段としては、蛍光手段、電気化学的手段および酵素的手段が挙げられる。酵素的増幅を用いる好ましい実施形態において、酵素(例えば、アルカリホスファターゼ(AP)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ)としては、発光基質が既知である酵素が挙げられ得、そしてこれらの発光(化学発光)基質の検出のための手段としては、CCDカメラが挙げられ得る。
【0189】
好ましい様式において、改変塩基が付加され、欠失が生じ、そしてハプテン結合体化部分は、切断剤または不活化剤のいずれかの使用によって除去または不活化される。例えば、切断可能なリンカーがジスルフィドである場合、この切断剤は還元剤(例えば、ジチオトレイトール(DTT)、β−メルカプトエタノールなど)であり得る。不活化の他の実施形態としては、加熱、冷却、化学的変性、界面活性剤、疎水性試薬および自殺インヒビターが挙げられる。
【0190】
ルシフェラーゼは、プロトンの同時放出と共にdATPを直接加水分解し得る。加水分解は、伸長した配列決定プライマーへのdATPの取り込みとは独立して生じるので、これは、偽陽性シグナルを生じる。この問題を回避するために、DNA中に取り込まれる、すなわち、DNAポリメラーゼの基質であるが、ルシフェラーゼの基質ではない、dATPアナログが使用され得る。1つのこのようなアナログは、α−チオ−dATPである。従って、α−チオ−dATPの使用は、成長する核酸鎖へと取り込まれることなくdATPが加水分解される場合に生じ得る、偽の光子発生を回避する。
【0191】
代表的に、PPiベースの検出は、配列決定プライマーの添加の直後の、配列決定反応混合物へのコントロールヌクレオチドの付加後に放出される光を測定することによって、較正される。これは、反応条件の正規化を可能にする。連続した2以上の同一のヌクレオチドの取り込みは、放出された光の量の対応する増加によって明らかになる。従って、放出された光における、コントロールヌクレオチドに対する2倍の増加は、伸長されたプライマーへの2つの連続的dNTPの取り込みを明らかにする。
【0192】
所望の場合、アピラーゼは、配列決定反応混合物内のいずれの残留非取り込みdNTPの分解をも促進するように、固体支持体の表面上で、「洗浄」または「流され」得る。アピラーゼはまた、生じたATPを分解し、従って、この反応から生じる光を「消す」。アピラーゼでの処理の際に、任意の残留反応物は、後のdNTPインキュベーション工程および光子検出工程のための調製において、洗い流される。あるいは、アピラーゼは、固体または可動性固体支持体に結合され得る。
【0193】
支持体が平面である場合、好ましくは、ピロリン酸配列決定反応は、必要に応じて、1つの透明な固相支持体表面および必要に応じて透明なカバーを包含する薄層反応チャンバ上で生じる。いくつかの実施形態において、アレイは、平面状上面および平面状下面を有し、この平面状上面は、その上に少なくとも1,000の空洞を有し、各空洞が、反応チャンバを形成する。さらなる実施形態において、平面状下面は、必要に応じて導電性であり、その結果、反応チャンバからの光学的シグナルは、平面状下面を介して検出され得る。好ましい実施形態において、上面と下面との距離は、10cm以下である。従って、配列決定試薬は、基材表面にわたるこの試薬の流れによって送達され得る。より好ましくは、空洞は、核酸またはタンパク質を分析するために試薬を含む。さらなる実施形態において、アレイは、平面状アレイから空間を空けて、そのアレイの反対側に接触する第2の表面を有し、それによって、流れチャンバがアレイの上に形成される。支持体が平面状でない場合、試薬は、固体支持体を任意の所定の試薬の浴に浸すことによって送達され得る。
【0194】
好ましい実施形態において、アレイを使用し、水性環境下で分離平行共通反応を実施し得る。アレイは、試薬と反応し得る開始物質を含有する少なくとも1,000の別々の反応チャンバを有する基材を有し得、各反応チャンバは寸法決めされており、その結果、少なくとも1つの試薬を包含する1つ以上の流体が、各反応チャンバに送達された場合、試薬がウェルから外に拡散するための拡散時間は、開始物質が試薬と反応して生成物を形成するために必要な時間を超える。この反応チャンバは、基材上に複数の空洞が生成されることによって形成され得る。複数の空洞は、エッチング技術、成型技術またはミクロ機械加工技術によって形成され得る。空洞は、平面状底部または凹状底部を有し得る。好ましい実施形態において、基材は、ファイバーオプティックバンドル(fiber optic bundle)である。さらなる実施形態において、平面状表面に分散したパッチを作製することによって反応チャンバが形成される。このパッチは、周囲の平面状表面とは異なる表面化学を有し得る。
【0195】
種々の実施形態において、反応のいくつかの構成成分が固定化されるのに対して、他の構成成分は、溶液として提供される。例えば、いくつかの実施形態において、ピロリン酸配列決定反応において使用される酵素(例えば、スルフリラーゼ(sulfurylase)、ルシフェラーゼ)は、所望される場合、固体支持体上に固定され得る。同様に、ピロリン酸配列決定反応において使用される酵素(例えば、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ)の1つ以上は、ファイバーオプティックリアクタアレイの末端に固定され得る。ルシフェラーゼが固定される場合、このルシフェラーゼは、アンカープライマーから50μm未満に存在する。反応の他の構成成分(例えば、ポリメラーゼ(例えば、クレノーフラグメント)、核酸テンプレート、およびヌクレオチド)は、流すこと、スプレーすること、または回転することによって、添加され得る。なおさらなる実施形態において、配列決定反応において使用される1つより多くの試薬は、ビーズ上に送達される。
【0196】
いくつかの実施形態において、試薬は、試薬を分配するための拡大可能な可撓性の膜を使用して分配され、伸長反応の間にFORA表面上でリアクタを密封する。試薬は、FORA表面上または可撓性の膜上いずれかにスプレーされ得るか回転され得る。次いで、可撓性の膜は、迅速に拡大されるかまたはFORAのごく近傍に物理的に移動され、それによってウェルを密封し得、その結果、PPiは,ウェルからウェルに拡散することができない。好ましくは、データ収集は、反応開始後の適当な時間に生じ、最大のシグナルを生成する。
【0197】
伸長されたアンカープライマー中の配列はまた、配列決定副生成物を検出する以外の配列決定方法を使用することによって同定され得る。例えば、配列決定は、標識ヌクレオチドまたは他のヌクレオチドアナログの取り込みを測定することによって実施され得る。これらの方法は、蛍光または電気化学蛍光ベースの方法と共に使用され得る。
【0198】
あるいは、配列決定副生成物は、3’炭素上に標識を有するジデオキシヌクレオチドを使用して産生され得る。好ましくは、この標識は、切断され、3’水酸基を現し得る。この方法において、所定のヌクレオチドの付加は、ポジティブまたはネガティブとしてスコアリングされ、1つの塩基が、各試行で決定される。この実施形態において、固相の酵素は、必要ではなく、複数回の測定が為され得る。
【0199】
別の実施形態において、伸長されたアンカープライマー生成物の正体は、標識化されたデオキシヌクレオチドを使用して決定される。標識されたデオキシヌクレオチドは、例えば、蛍光ヌクレオチドであり得る。好ましくは、蛍光ヌクレオチドは、レーザー照射の後、検出され得る。好ましくは、蛍光標識は、長期間の照射に対して不安定である。所望される場合、蛍光シグナルは、クエンチ(例えば、フォトブリーチ(photobleach))され、次の塩基の付加の前にバックグラウンドレベルまでシグナルを復帰させる。好ましい電気化学蛍光標識は、ルテニウム−トリス−ビ−ピリジルである。
【0200】
1つの実施形態において、一本鎖環状核酸は、反応チャンバに固定され;好ましくは、各反応チャンバは、その中に配置された1つを超えない一本鎖環状核酸を有する。より好ましくは、一本鎖環状核酸は、反応チャンバ中に配置された移動可能性固体支持体上に固定される。別の実施形態において、各一本鎖環状核酸は、少なくとも100コピーの核酸配列を含み、各コピーは、末端から末端に共有結合される。
【0201】
本発明はまた、本発明の方法の使用のためのキットを包含し、このキットは、1つ以上の以下の構成要素を包含する:(a)サンプルDNAへとハイブリダイズし、その結果、標的位置がプライマーの3’末端に直接隣接する、特異的試験プライマー;(b)ポリメラーゼ;(c)PPi放出を同定するための検出酵素手段;(d)dATPの代わりの、ポリメラーゼの基質として作用し得るが、上記PPi検出酵素の基質として作用することができない、dATPアナログ;および(e)必要に応じて、ddATPの代わりの、ジデオキシヌクレオチド、必要に応じて、ポリメラーゼの基質として作用し得るが、上記PPi検出酵素の基質として作用することができない、ddATPアナログ。このキットが、最初のPCR増幅と共に使用される場合、このキットはまた、以下の構成要素を含み得る:(i)少なくとも1つのプライマーが、このプライマーを固定化可能な手段を有する、PCRのためのプライマー対;(ii)好ましくは、熱安定性である、ポリメラーゼ(例えば、Taq1ポリメラーゼ);(iii)PCR反応のための緩衝液;および(iv)デオキシヌクレオチド。酵素標識が、PCRを評価するために使用される場合、このキットは、有利には、酵素の基質および検出系の他の構成要素を包含する。
【0202】
(ピロリン酸配列決定反応の最適化の基礎をなす数学的解析)
理論による束縛を所望しないが、反応条件の最適化は、以下の分析の基礎をなす仮定を使用して実施され得ると考えられる。
【0203】
固相ピロリン酸配列決定は、最初は、固相技術と生物発光を使用した合成技術による配列決定との組合せによって発達された(例えば、Ronaghiら、1996.Real−time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.Anal.Biochem.242:84−89を参照のこと)。この固相方法論において、固定化されプライマー結合された(primed)DNA鎖は、DNAポリメラーゼ、ATPスルフリラーゼ、およびルシフェラーゼと共にインキュベートされる。段階的にヌクレオチドを付加し(中間で洗浄する)、連続的な重合の事象が実施され得る。SN比は、系でα−チオdATPを使用することによって増加された。このdATPアナログは、DNAポリメラーゼによって効率的に組込まれるが、ルシフェラーゼの基質として作用しない。このことは、バックグラウンド生物発光を減少し、リアルタイムの配列決定反応の実施を容易にする。これらの初期の反応において、固相支持体として、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用したPCR産物の配列決定が示された。しかし、洗浄の間のビーズの損失が、この洗浄が各ヌクレオチドの添加と各酵素の添加との間に実施されるために、この技術は短い配列に限定されることが見出された。
【0204】
現在のところ、ピロリン酸配列決定方法論は、単一のDNA配列決定テンプレートの多くの同一のコピーからDNA配列を確かめる事に関する合理的に十分に確立された歴史を有する(例えば、Ronaghiら、1996.Real−Time DNA Sequencing Using Detection of Pyrophosphate Release,Anal.Biochem.242:84−89;Nyrenら、Method of Sequencing DNA,特許WO9813523A1(1998年4月2日に発行され;1997年9月26日に出願された);Ronaghiら、1998.A Sequencing Method Based on Real−Time Pyrophosphate Science 281:363−365(1998)を参照のこと)。ピロリン酸(PPi)生成反応は、生物発光に基づいた非常に高感度の技術によってモニターされ得る(例えば、Nyrenら、1996.466−496頁Proc.第9版Inter.Symp.Biolumin.Chemilumin.を参照のこと)。これらの生物発光アッセイは、異なる核酸修飾反応で放出されたPPiの検出による。これらのアッセイにおいて、生成されるPPiは、続いて、ATPスルフリラーゼによってATPへ転換され、ATP生成は、ルシフェラーゼによって連続的にモニターされる。例えば、ポリメラーゼ媒介性反応において、ヌクレオチドが、ポリメラーゼによって合成される伸長する核酸鎖に組込まれる場合、PPiが生成される。一般的に、DNAポリメラーゼが、ピロリン酸配列決定反応の間、PPiを生成するために使用される場合(例えば、Ronaghiら、1998.Doctoral Dissertation,The Royal Institute of Technology,Dept.of Biochemistry(Stockholm,Sweden)を参照のこと)、逆転写酵素(例えば、Karamohamamedら、1996.319−329頁(Proc.第9版Inter.Symp.Biolumin.Chemilumin.)を参照のこと)またはRNAポリメラーゼ(例えば、Karamohamamedら、1998.BioTechniques 24:302−306を参照のこと)を使用し、重合事象を実施することもまた可能である。
【0205】
例えば、生物発光的プライマー伸長アッセイは、3’末端での単一ヌクレオチドミスマッチを試験するために使用される(例えば、Nyrenら、1997.Anal.Biochem.244:367−373を参照のこと)。ファージプロモーターは、代表的には、任意のプライマーの少なくとも1つに付着し、増幅の後に、RNAポリメラーゼによる段階的な伸長に供され得る、転写単位が得られ得る。次いで、転写媒介性PPi放出が、生物発光学的アッセイ(例えば、ATPスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ)によって、検出され得る。この戦略を使用することによって、任意のさらなる特異的な配列決定プライマーを使用せずに、二重鎖DNAを配列決定することが可能であり得ると考えられる。一連の「実行−停止」アッセイにおいて、T7ファージRNAポリメラーゼによる伸長は、試験され、さらに遅いことが見出された(例えば、Kwokら、1990.Nucl.Acids Res.18:999−1005を参照のこと)。3’−ミスマッチ末端の後に、続く正確な天然のデオキシヌクレオチドのα−チオヌクレオチドアナログでの置換は、重合速度を5倍から13倍減少する。しかし、少しの塩基の取り込みの後、DNA合成の速度は、通常のテンプレート/プライマーに対して観察される速度に匹敵する。
【0206】
この技術による単一塩基検出は、アピラーゼの系への取り込みによって、改善され、このアピラーゼは、NTP加水分解を触媒し、DNAポリメラーゼのKmよりはるかに下にヌクレオチド濃度を減少し、先行する工程に由来するdNTPを効率的に除去した後に、続いてのdNTPの添加に進む上記の技術は、突然変異の検出および単一ヌクレオチド多型(SNP)分析の分野における適用に対して、迅速かつリアルタイムの分析を提供する。
【0207】
ピロリン酸配列決定系は、いくつかの酵素で連続的に触媒され、DNA合成をモニターする反応を使用する。酵素の特性(例えば、安定性、特異性、感受性、KMおよびkCAT)は、系の最適な性能に関して重要である。ピロリン酸配列決定系において、検出酵素(すなわち、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼ)の活性は、配列決定反応の間、一般的に一定のままであり、多量の生成物によって非常に僅かにのみ、阻害される(see例えば、Ronaghiら、1998.Doctoral Dissertation,The Royal Institute of Technology,Dept.of Biochemistry(Stockholm,Sweden))。スルフリラーゼは、約2.0秒間に、各PPiをATPに転換する(例えば、PyrenおよびLundin,1985.Anal.Biochem.151:504−509を参照のこと)。0.2mlの緩衝液中の1pmol PPi(5nM)に対する報告されている反応条件は、0.3U/ml ATPスルフリラーゼ(ATP:硫酸アデニリルトランスフェラーゼ;Prod.No.A8957;Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)および5μM APS(例えば、Ronaghiら、1996.Real−Time DNA Sequencing Using Detection of Pyrophosphate Release,Anal.Biochem.242:84−89を参照のこと)である。スルフリラーゼに関する製造業者の情報(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)によって、1mgのタンパク質あたり、5〜20単位の活性(すなわち、1ユニットは、30℃、pH8.0で、APSおよびPPiから1分あたり1.0μmolのATPを生成する)が報告されるのに対して、比活性は、他では1mgあたり140単位であると報告される(Karamohamedら、1999.Purification,およびLuminometric Analysis of Recombinant Soccharoniyees cerevisiae MET3 Adenosine Triphosphate Sulfurylase Expressed in Escherichia coli,Prot.Express.Purification 15:381−388を参照のこと)。本発明の実施において使用される反応条件が、前述の参考文献に報告される反応条件に類似するという事実に起因して、アッセイにおけるスルフリラーゼ濃度は、4.6nMと見積もられた。スルフリラーゼのKM値は、[APS]=0.5μMおよび[PPi]=7μMである。ルシフェラーゼによる光の生成は、0.2秒未満で生じる。最も重要な反応は、DNA重合およびヌクレオチドの分解である。ピロリン酸配列決定方法論において使用される酵素を特徴付ける定数の値を、参考のために以下に列挙する:
【0208】
【表1】
これら4つの反応に関与する酵素は、同じ基質に対して競合する。従って、基質濃度の変化は、結びついている。最初の反応は、dNTPの鎖伸長の間のポリメラーゼ/DNA複合体への結合である。この工程を迅速にするために、ヌクレオチド三リン酸濃度は、DNAポリメラーゼのKMより高くなければならない。しかし、ヌクレオチド三リン酸の濃度が、非常に高すぎる場合、ポリメラーゼのより低い忠実度が、観察され得る(例えば、Clineら、1996.PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases.Nucl.Acids Res.24:3546−3551を参照のこと)。適切な範囲の濃度が、取り込み間違いに対するKMによって確立され、通常は、非常により高い(例えば、Capsonら、1992.Kinetic characterization of the polymerase and exonuclease activity of the gene 43 protein of bacteriophage T4.Biochemistry 31:10984−10994を参照のこと)。非常に高い忠実度が、固有のエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用することによって達成され得るにも関わらず、これらの使用はまた、プライマー分解が生じ得る欠点を保持する。
【0209】
DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメント(クレノー)のエキソヌクレアーゼ活性が、低いにも関わらず、プライマーの3’末端は、ヌクレオチド三リン酸の非存在下でより長いインキュベーションによって分解され得ることが実証された(例えば、Ronaghiら、1998.Doctoral Dissertation,The Royal Institute of Technology,Dept.of Biochemistry(Stockholm,Sweden)を参照のこと)。重合工程における誘導適合結合機構(induced−fit binding mechanism)が、正確なdNTPに対して非常に効率的な選択性を提供するので、忠実度は、エキソヌクレアーゼ活性を有さずに維持される。1×105〜1×106の忠実度が報告されている(例えば、Wongら、1991.An induced−fit kinetic mechanism for DNA replication fidelity.Biochemistry 30:526−537を参照のこと)。ピロリン酸配列決定において、エキソヌクレアーゼ欠損(exo−)ポリメラーゼ(例えば、エキソ−クレノーまたはSequenase(登録商標))は、高い忠実度を有することが確認されている。
【0210】
本発明のピロリン酸配列決定方法論における空間的制限および一時的な制限に対する評価が、計算され、ここで、この系は、全容積5μlについて、1cm2の面積と高さ約50μmを有する。一時的な制限に関して、反応のカスケードにおける分子種の参入は、最初に規定され、ここで、以下のとおりである:
【0211】
【表2】
N(0)が、ヌクレオチドを添加されないDNAであり、N(1)は、1個のヌクレオチドを添加され、N(2)は、2個のヌクレオチドを添加される、などということが、さらに特定される。分子種の濃度に関連する偽1次速度定数は、以下のとおりである:
【0212】
【表3】
さらに、PPiに対する拡散定数(DP)およびATPに対する拡散定数(DA)もまた、特定されなければならない。これらの値は、希釈水溶液中の生体分子に対する、以下の例示的拡散定数から、評価され得る(Weisiger,1997.Impact of Extracellular and Intracellular Diffusion on Hepatic Uptake Kineticsを参照のこと)。
【0213】
【表4】
ここで、オリジナルの文献Iは、Longsworth,1954.Temperature dependence of diffusion in aqueous solutions,J.Phys.Chem.58:770−773であり;オリジナルの文献2は、Gaigalasら、1992.Diffusion of bovine serum albumin in aqueous solutions,J.Phyv.Chem.96:2355−2359であり;そしてオリジナルの文献3は、Cheng,1993.Quantitation of non−Einstein diffusion behavior of water in biological tissues by proton NMR diffusion imaging:Synthetic image calculations,Magnet.Reson.Imaging II:569−583である。
【0214】
PPiの拡散定数を評価するために、以下の例示的値が使用され得る(CRC Handbook of Chemistry and Physics,1983.(W.E.Weast.編)CRC Press,Inc.,Boca Raton,FLを参照のこと)。
【0215】
【表5】
PPiの分子量は、174amuである。前述の例示的な値に基づけば、PPiに対して約0.7×10−5cm2/secの拡散定数が予想される。
【0216】
3つのピロリン酸配列決定反応を触媒する酵素は、Michaelis−Menten反応速度論に近似すると考えられる(例えば、Stryer,1988.Biochemistry,W.H.FreemanおよびCompany,New Yorkを参照のこと)、これは、以下のとおりに記載される:
KM=[E][S]/[ES]、
速度=Vmax[S]/(KM+[S])、
Vmax=kCAT[ET]
ここで、[S]は、基質の濃度であり、[E]は、遊離酵素の濃度であり、[ES]は、酵素基質複合体の濃度であり、そして[ET](=[E]+[ES])は、酵素の全濃度である。
【0217】
反応時間は、文献中に記載される溶液相ピロリン酸ベースの配列決定と少なくとも同程度速いことが好ましい。基質が生成物に転換されるこの速度は、以下のとおりである:
−d[S]/dt=kCAT[ET][S]/(KM+[S])
基質の有効濃度は、複製されたDNA分子の大きさ(せいぜい(10μm)3)およびコピー数(約10,000)から評価され、約17nMの濃度を得る。この値は、前に記載された酵素のKMより小さく、従って、この速度は、以下のように評価される:
−d[S]/dt=(kCAT/KM)[ET][S]
従って、偽1次反応速度論を使用すれば、基質の消滅についての速度定数は、所定の酵素についての定数である、kCATおよびKMならびに[ET]に依存する。従って、文献中に報告されている同じ酵素濃度を使用して、同様の速度を生じる。
【0218】
ここで、ピロリン酸配列決定反応における第1の工程(すなわち、新規のヌクレオチドの取り込みおよびPPiの放出)は、詳細に試験される。好ましい反応条件は、0.2ml緩衝液中の1pmol DNA、3pmolポリメラーゼ、40pmol dNTPである。前に記載される好ましい反応条件下では、DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメントのヌクレオチド取り込みのKMは、0.2μMであり、シークエナーゼ2.0TM(US Biochemicals,Cleveland,OH)のKMは、0.4μMであり、1塩基の完全な取り込みは、15nMのポリメラーゼ濃度で、0.2秒未満(例えば、Ronaghiら、1996.Real−Time DNA Sequencing Using Detection of Pyrophosphate Release,Anal.Biochem.242:84−89を参照のこと)である。
【0219】
5μlの反応体積中で、各10,000の配列決定プライマー部位、または1×108の全伸長部位(=0.17fmol)を有する合計10,000のアンカープライマーが存在する。文献中で以前に公開された結果は、ポリメラーゼが、反応混合物中に3倍多く(すなわち、0.5fmol)存在するはずであることが示唆される。次いで、ポリメラーゼの最終濃度は、0.1nMである。これらの反応条件は、本発明の実施によって容易に得られる。
【0220】
以前に示されるように、ヌクレオチド付加反応に必要な時間は、1ヌクレオチド当たり0.2秒以下である。従って、反応は、合計でT秒間進行可能であり、次いで、ヌクレオチド付加は、(T/0.2)同一のヌクレオチドまでのストレッチが、ポリメラーゼの作用として完全に埋められるほどに十分迅速であるべきである。前に考察されるように、ピロリン酸配列決定反応の律速段階は、スルフリラーゼ反応であり、このスルフリラーゼ反応は、1つのPPiからATPに転換するために合計で約2秒必要である。従って、スルフリラーゼ反応の完了を可能にする反応時間は、ポリメラーゼが10までの同一のヌクレオチドのストレッチを「埋める」ことを可能にするのに十分であるはずである。ランダムDNA種において、10以上の同一のヌクレオチドの領域は、1ヌクレオチド当たり、約4−10の確率で生じることが実証され、この確率は、約1×10−6である。本発明の好ましい実施形態におけるアンカープライマーから伸長された10,000の配列において、各配列は、少なくとも30ヌクレオチド、好ましくは100ヌクレオチド伸長され、10の同一ヌクレオチドのうち約1回の実行が存在することが望ましい。従って、同一のヌクレオチドの実行は、本発明の実施において、困難を引き起こさないはずであると結論付けられ得る。
【0221】
得られたDNA分子の全体的な大きさは、好ましくは、アンカーパッドの大きさ(すなわち、10μm)よりも小さく、そして個々のアンカーパッド(すなわち、100μm)の間の距離より小さくなければならない。全Nヌクレオチドを有する一本鎖DNAコンカタマー(concatamer)の旋回半径は、以下の式によて数学的に評価され得る:半径=b(N/N0)0.6、ここで、bは、持続長さであり、N0は、持続長さ当たりのヌクレオチドの長さであり;指数0.6は、自己回避ウォーク(self−avoid walk)の特徴である(例えば、Doi,1986.The Theory of Polymer Dynamics(Clarendon Press,New York);Flory,1953.Principles of Polymer Chemistry(Cornell University Press,New York)を参照のこと)。例として単鎖DNAを使用する場合、bは、4nmであり、N0は、13.6ヌクレオチドである(例えば、Grosberg,1994.Statistical Physics of Macromolecules(AIP Press,New York)を参照のこと)。10,000コピーの100マーを使用する場合、N=1×10−6であり、旋回半径は、3.3μmである。
【0222】
PPiの拡散は、本明細書中で詳細に記載される。本発明で使用される反応条件において、[PPi]は、前に記載されるように、5μl中に約0.17fmol(すなわち、0.03nM)であり、[スルフリラーゼ]は、4.6nMである。反応の最初の2秒において、約7%(0.002nM)のPPiが、スルフリラーゼによって消費され、GEPASIシミュレーションソフトウェアを使用する(Mendes,P.(1993)GEPASI:a software package for modeling the dynamics, steady states and control of biochemical and other systems.Comput.Appl.Biosci.9,563−571を参照のこと)。シミュレーションで使用されるパラメーターは、KM(PPi)=7μM、kCAT=38s−1、および[スルフリラーゼ]=4.6nMであった。従って、少なくとも93%のPPi分子は、2秒の反応時間の間にATPに転換される前に、拡散し得る。
【0223】
各々のPPiが反応する平均時間は、l/kp=2秒である。各々の方向に拡散する平均空間距離は、約2Dp/kpまたは2.8×103μm2である。各々の方向のRMS距離は、53μmである。この値は、個々のアンカープライマーの各々が50μmより遠く離れなければならないか、または1つのアンカーから放出されるPPiがその隣りに拡散し得、そして検出され得ることを示す。
【0224】
上述の現象を説明するために使用される別の方法は、第1アンカーパッドで生成されるPPiの第1のアンカーパッド上方の量を、第2のアンカーパッドで生成され、次いでその第1アンカーパッドの位置に対して上側に拡散するPPiの量に対して評価することである。これらの2つの質量がお互いの大きさで接近する場合、バックグラウンドのシグナルの中から「真の」シグナルを区別することが困難になる。このことは、aをアンカーパッドの半径として、そして1/b2をアンカーパッドの密度として規定することによって、数学的に記載され得る。従来の出版されたデータに基づき、aはおよそ10μmに等しく、そしてbはおよそ100μmに等しい。先の第1アンカーパッドの上方に存在するPPiの量は、exp(−kPt)[1−exp(−a2/2DPt)]によって記載され得、そして第2パッド上方に存在するPPiの量は、数学的に:
(1/3)exp(−kPt)[pa2/b2]exp(−b2/2DPt)によって近似され得る。因数1/3は、1/4のDNA配列がIヌクレオチドを組み込み、次いで1/4のDNA配列が第2ヌクレオチドを組み込むなどであり、従って、このシリーズの合計は、1/3である。第1アンカーパッドおよび第2アンカーパッドの上方のPPiの量は、2DPtがおよそb2と等しい場合に同等の大きさになり、これにより、分子が拡散するRMS距離は、隣接のアンカーパッドの間の距離に等しいことを示す。従って、本発明の実施において利用されるアッセイ条件を基に、このアンカーパッドはおよそ50μm以上離して配置されなければならず、そして好ましくは、少なくとも3倍以上さらに離して(すなわち、150μm)配置される。
【0225】
上述の発見は、アンカーパッドの表面密度上に限定を設定するが、多くの異なるアプローチの使用によって、アンカーパッドの総表面濃度を同時に増加させながら、距離の必要性を低下させ得る。1つのアプローチは初期の発光のみを検出することであるが、このことは、特に、多くの連続した同一のヌクレオチドを有するDNA配列からのシグナルを喪失する欠点を有する。
【0226】
アンカーパッドの間の距離を減少させる第2のアプローチは、反応混合物中のスルフリラーゼの濃度を増加することである。反応速度kPは、スルフヒドリル濃度に直接比例しており、そしてkP −1/2として拡散距離スケールに比例する。従って、スルフヒドリル酵素濃度が4倍の因数によって増加される場合、個々のアンカーパッド間の距離はそれに伴って2倍の因数によって低下される。
【0227】
第3のアプローチは、アンカーパッドの表面に酵素を結合することによって、有効濃度のスルフリラーゼ(これはまた、本明細書中に記載される他の酵素に対しても作用する)を増加することである。このアンカーパッドは、配列決定反応中心を取り囲む立方体表面の1つの壁として概説され得る。このパッドを10μm×10μmの表面と仮定すると、1μMの濃度を生じるためにパッド結合される分子数は、約600,000個の分子である。
【0228】
アッセイにおけるスルフリラーゼ濃度は、5nMとして見積もられる。この有効濃度に達するための結合される分子数は、約3000個の分子である。従って、より多くの酵素分子を結合させることによって、より高い有効濃度が得られる。例えば、1つのアンカーパッドにつき10,000個の分子が結合され得る。
【0229】
これまでに見積もられたように、各々のスルフリラーゼ分子は、表面上で65nm2の総面積を占める。従って、表面上の10,000個のスルフリラーゼ酵素分子の総面積を繋げること(anchor)(すなわち、放出される10,000PPiに等価となるように)は、1.7μm2を必要とする。この値は、10μm×10μmのアンカーパッド上の利用可能な表面積のおよそ2%のみである。従って、酵素濃度は、ずっと大きな値に容易に増加され得る。
【0230】
個々のアンカーパッド間の距離を減少させることを可能にする第4のアプローチは、1つ以上の薬剤を利用して水相ベースのピロリン酸配列決定試薬(例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール(PEG)など)の粘度を増加させて、PPiが拡散するためにかかる時間を著しく増加させることである。しかし、これらの試薬はまた付随して、配列決定反応物中の他の未固定の成分に対する拡散時間を増加させ、従って総反応動態を遅滞させる。さらに、これらの試薬の使用はまた、配列決定反応物自体に化学的阻害を及ぼすように機能し得る。
【0231】
個々のアンカーパッド間の距離を減少させるための第5の好ましい方法論は、放出されるPPiが側方へと拡散するのを物理的に妨げる、空間ジオメトリ中のピロリン酸配列決定反応を行うことである。例えば、統合した空洞またはマイクロウェル(例えば、最適な繊維束の末端の酸エッチングによって作製される)を利用して、PPiのこのような側方への拡散を妨げ得る(Michaelら、1998,Randomly Orderd Addressive High−Density Optical Sensor Arrays,Anal.Chem.70:1242−1248を参照のこと)。この実施形態において、重要な変数は、PPiが高さhの空洞から出る、総拡散時間と関連し、ここで、hはエッチングされた空洞の深さである。この拡散時間は、等式:2DPt=h2を利用して計算され得る。上述の計算式において本発明の好ましいピロリン酸配列決定反応条件の使用によって、この空洞からのPPiの拡散を完了する前に配列決定反応が進行して完了するように、深さ50μmの空洞が必要とされることが、示され得る。さらに、この型のジオメトリは、隣接するアンカーパッドから放出されるPPi由来のバックグラウンドのシグナルを付随して低減させるというさらなる利点を有する。
【0232】
さらに、あるパッドから別のパッドへのPPiの拡散によって生じるバックグラウンドを防ぐために、パッド間の表面の領域は、固定化ホスファターゼでコーティングされ得る。
【0233】
引き続いて、一旦ATPが本発明の好ましい反応条件の利用によって形成されたら、反応時間l/kAは、0.2秒であることが示された。この反応時間は、PPiが自由に拡散する時間よりもずっと短いので、この反応時間は、本発明において利用されるアッセイのジオメトリおよび条件に関する、任意の上述の結論を有意に変更しない。
【0234】
バックグラウンドの光の生成を緩和するために、DNA配列決定テンプレートの領域のルシフェラーゼを(例えば、固定(anchoring)または結合によって)「局在させる」ことが好ましくあり得る。PPi分子がATPを生成する前に分散し得る距離によって詳細に説明される領域に、ルシフェラーゼを配置することが最も好ましくあり得る。ルシフェラーゼを固体支持体マトリクスに結合するための方法は、文献にて周知である(例えば、Wangら、1997.Specific Immobilization of Firefly Luciferase through a Biotin Carboxyl Carrier Protein Domain,Analytical Biochem.246:133−139を参照のこと)。従って、拡散時間の2秒間に、ルシフェラーゼはDNAの鎖から50μmの距離以内に固定される。しかし、拡散時間を減少させて、従ってルシフェラーゼの結合に必要とさせる表面領域をさらに限定することが好ましくあり得るということに留意するべきである。
【0235】
さらに、あるパッドから別のパッドへのATPの拡散によって生成されるパックグラウンドを妨げるために、パッド間の表面領域を、固定化ATPase、特にATPをADPへと加水分解するATPase(例えば、アルカリホスファターゼ)でコーティングし得る。
【0236】
結合することが必要であるルシフェラーゼ濃度を決定するために、ルシフェラーゼを0.1μmのATPに対して200mVの応答を生じる濃度で使用する、以前に公表された条件を利用し得る(Ronaghiら、1996,Real−Time DNA Sequencing Using Detection of Pyrophosphate Release,Analytical Biochem.242:84−89を参照のこと)。より具体的には、0.2mlの反応容量において、2ngのルシフェラーゼが0.1μMのATPに対して10mVの応答を生じることが文献より公知である(KaramohamedおよびNyren,1999,Real−Time Detection and Quantification of Adenosine Triphosphate Sulfurylase Activity by a Bioluminometric Approach,Analytical Biochem.271:81−85)。従って、0.2ml総反応容量中のルシフェラーゼの20ngの濃度は、これらの以前に公表された文献の条件を再現するために必要とされる。本発明の個々のアンカーパッド周辺の10μmの立方体の容量において、1×10−16gのルシフェラーゼ濃度が必要とされ、そしてルシフェラーゼの71kDaの分子量に基づき、この濃度は約1000個のルシフェラーゼ分子に匹敵する。前で言及されたように、ルシフェラーゼの表面積は50μm2と計算されている。従って、ルシフェラーゼ分子がビオチン化されてそしてアンカーパッドに結合されると推定すると、1000個の分子は、総面積0.05μm2を占める。これらの計算から、各々のアンカーパッド領域の面積が100μm2である場合、過剰のルシフェラーゼ分子がアンカーパッドに結合され得ることは容易に明らかになる。
【0237】
再度、文献において以前に公表された結果に基づくと、各々のヌクレオチドは配列決定のために約3秒かかる(すなわち、ヌクレオチドの付加に0.2秒;ATP生成に2秒;生物発光を取得するのに0.2秒)。従って、1ヌクレオチドにつき約60秒のサイクル時間が妥当であり、1つの配列決定テンプレートにつき、30ヌクレオチドの情報を作成するために、1回の実験あたり約30分を必要とする。
【0238】
上述の配列決定方法論(すなわち、ポリメラーゼ→PPi→スルフリラーゼ→→ATP→ルシフェラーゼ→光)に対する代替の実施形態において、ポリメラーゼがDNA鎖の伸長中にヌクレオチドを取り込む場合、光を生成する能力を有するポリメラーゼを(例えば、タンパク質融合の利用などによって)開発し得る。なお別の代替の実施形態において、配列決定反応においてPPiの産生を直接的に測定するセンサを開発し得る。PPiの産生が周囲の緩衝液の電位を変化させるので、この変化は、産生されたPPi濃度を定量するために測定され得、そして換算され得る。
【0239】
以前に考察されたように、ピロリン酸配列決定反応におけるヌクレオチド配列中へのdNTPのポリメラーゼ媒介性の取り込みは、光子(すなわち、光)の放出を生じる。次いで、ピロリン酸配列決定反応によって生成される光子は、種々の方法によって「捕捉」されそして定量され得、これらの方法論としては:フォトマルチプライヤーチューブ、CCD、吸光度計、ルミノメーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0240】
ピロリン酸配列決定反応によって生成された光子は、CCDによって捕捉される。焦点合わせ装置(focusing device)(例えば、光学レンズまたは光ファイバー)を通過して、そしてCCD素子に焦点を合わせる場合、光捕捉の効率は増加する。捕捉されるこれらの光子の画分は、以下の計算によって見積もられ得る。第1に、励起された光子を集束させるレンズは固体表面(すなわち、DNAチップまたはエッチングされた光ファイバー壁)の表面から距離rの位置にあり、ここで、r=1cmであること、そしてアレイエレメント上に集束されるように光子は直径bの領域(面積=πb2/4)を通らねばならず、ここでb=100μmであることが、想定される。(このことは、大気中で約0.01の開口数を有する光学系を生じる)。励起された光子があらゆる方向に均等に逃げることもまた記すべきである。距離rの位置では、この光子は4πr2に等しい面積に渡って拡散する。従って、レンズを通過する光子の画分は:(1/2)[1−(1+b2/4r2)−1/2]によって記載される。rの値がbの値よりもずっと大きい場合、レンズを通過する画分は:b2/16r2によって記され得る。rおよびbの上述の値については、光子のこの画分は6×10−6である。bの増加またはrの低下に伴って(すなわち、画像化システムの開口数が増加するにつれて)、捕捉された光子の画分が増加することに留意のこと。マイクロウェルが光ファイバーの末端中にエッチングされ、次いでこれら光ファイバーがまたCCD上に光を集束させるように働くFORAの使用は、多くの光ファイバーの開口数を0.7の範囲内にある状態で、上記の所定の例からの開口数を大いに増加させる。各々のヌクレオチドの添加について、約10,000個のPPi分子が生成されることが予想され、そして全てのPPiがスルフリラーゼおよびルシフェラーゼによって転換される場合、これらのPPiは、約1×104個の光子の励起を生じる。平面アレイ(例えば、DNAチップ)を利用する場合のそれら光子のその後の「捕捉」および定量を最大にするために、平面固体支持体(例えば、カバースリップ)で直ちに光子を収集することが好ましくあり得る。このことは:(i)カバースリップと、慣用的な光学レンズもしくは光ファイバーの束との間に光学的な液浸(immersion)オイルを利用すること、または好ましくは、(ii)カバースリップ自体の中へと直接的に光ファイバーを組み込むこと、のいずれかによって達成され得る。これまでに記載の計算(この場合、b=100μmおよびr=50μm)を実施すると、収集される画分は0.15であることが見出され、このことは、約1×103個の光子の捕捉に匹敵する。この値は、適切なシグナルを提供するのに十分である。
【0241】
以下の実施例は、本発明の例示の手段であって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【0242】
(実施例1.空洞化された末端ファイバー光学アレイに結合したアンカープライマーの構築)
薄いウェハーのファイバー光学アレイの末端を、Healeyら、Anal.Chem.69:2213−2216(1997)によって記載されるように、酸の中にこの末端を入れることによって空洞化する。
【0243】
光活性化可能なビオチンアナログの薄層を、HengsakulおよびCass(Bioconjugate Chem.7:249−254,1996)において記載されるように、空洞化された表面上で乾燥させて、そして規定されたパッドまたは活性なビオチンの領域を作製するために、マスクを通して白色光に曝す。次に、アビジンを添加して、そしてこのビオチンに結合させる。次いで、ビオチン化オリゴヌクレオチドを添加する。このアビジンは、ビオチン−アビジン−ビオチンの結合を介してビオチン化オリゴヌクレオチドを固定化し得る、有離のビオチン結合部位を有する。
【0244】
パッドは100μmの間隔で約10μmの幅である。約37%のパッドが1つのアンカープライマーを備えるように、オリゴヌクレオチドを添加する。1cm2の表面上に10,000個のパッドを配置して、単一のアンカープライマーを有する約3700個のパッドを作製する。
【0245】
(実施例2.環状核酸ライブラリーのメンバーのアニーリングおよび増幅)
開環ライブラリーテンプレートのライブラリーを、70bpのSau3A1−MspIフラグメントの単一の核酸形態を含むと推定される核酸集団から調製する。このテンプレートは、アンカープライマーに相補的であるアダプター、配列決定プライマーに相補的である領域、および特定されるべき挿入配列を含む。ゲノムDNAを消化するためのSau3A1およびMspIを使用して、ライブラリーを作製した。約65〜75ヌクレオチドのインサートを選択して、そして12ヌクレオチド長のアダプターオリゴヌクレオチドにライゲーションした。アダプターオリゴヌクレオチドは、実施例1に記載されるように、基材表面に結合したアンカープライマーの配列に相補的な配列を有する。
【0246】
このライブラリーをアンカープライマーのアレイとアニールする。DNAポリメラーゼをdNTPと一緒に添加して、そして巻き込みの(rolling)環状複製を使用して、アンカープライマーを伸長させた。生じたものは、環状テンプレートの複数のコピーの連鎖である、依然として固体支持体に固定されている単一のDNA鎖である。数百ヌクレオチドのサイズ範囲の、10,000個またはそれ以上のコピーの環状テンプレートである。
【0247】
(実施例3.ファイバー光学基材の末端に結合した核酸の配列分析)
実施例2に記載されるように、増幅された核酸を含むファイバー光学アレイのウェハーを、灌流チャンバー内に配置して、これらファイバーはそれ自体が1600万画素のCCDカメラに連結されたファイバー光学アレイの束に取り付けられる。配列決定プライマーを灌流チャンバー内に送達して、そして増幅された配列とアニールし得るようにする。次いで、スルフリラーゼ、アピラーゼおよびルシフェラーゼを、ビオチン−アビジンを使用して空洞化された基材に取り付ける。
【0248】
配列決定プライマーは、図1に示されるように、多型を有すると推定されるインサート中へと延びるDNA合成を開始する。配列決定プライマーを、第1に、連続的に、洗浄溶液、DNAポリメラーゼ、およびdTTP、dGTP、dCTPまたはαチオdATP(dATPのアナログ)のうちの1つを、灌流チャンバー内へと送達することによって、伸長する。末端に結合したスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、およびアピラーゼは、配列決定反応の一部として遊離された任意のPPiを、検出可能な光に変換する。アピラーゼの存在は、任意の未反応のdNTPを低下させる。光は代表的には、ファイバー画像化束(fiber imaging bundle)に連結されたCCDカメラによって3秒間(一方で、1〜100秒、例えば2〜10秒もまた適切である)回収され得、その後、追加の洗浄溶液を灌流チャンバーに添加して、過剰なヌクレオチドおよび副産物を取り除く。次いで、次のヌクレオチドをポリメラーゼと一緒に添加して、これによってサイクルを繰り返す。
【0249】
洗浄中に、収集された光画像をCCDカメラからコンピューターに転送する。光励起をコンピューターによって分析しそしてそれを使用して、対応するdNTPが伸長された配列プライマー中に取り込まれたかどうかを決定する。推定の多型を含むインサート領域の配列を得るまで、dNTPおよびピロリン酸配列決定試薬の添加を繰り返す。
【0250】
(実施例4.巻き込みの(rolling)環状増幅を使用して生成されたタンデム反復テンプレートの配列分析)
配列5’−gAC CTC ACA CgA Tgg CTg CAg CTT−3’(配列番号2)を有するプライマーを、配列5’−TCg TgT gAg gTC TCA gCA TCT TAT gTA TAT TTA CTT CTA TTC TCA gTT gCC TAA gCT gCA gCC A−3’(配列番号1)を有する88ヌクレオチドのテンプレート分子にアニールさせた。プライマーへのテンプレートのアニーリングは、テンプレート分子の5’末端および3’末端の並列を生じた。アニーリングされたテンプレートをリガーゼに曝し、この結果、環状分子を生成するために、テンプレートの5’末端および3’末端のライゲーションを生じた。
【0251】
アニーリングされたプライマーは、巻き込みの環状増幅において、クレノウフラグメントおよびヌクレオチドを使用して37℃で12時間伸長した。生成物をSPR1技術(Seradyn,Indianapolis,IN)を使用して精製した。巻き込みの環状増幅は、環状テンプレート配列に相補的な配列のタンデム反復の形成を生じた。
【0252】
伸長された配列中のタンデム反復の生成物を、配列5’−AAgCTgCAgCCATCgTgTgAgg−3’(配列番号8)を有する配列決定プライマーにアニールすること、およびこのアリーリングされたプライマーを、1Mのベタインの存在下でETターミネーター化学物(Amersham−Pharmacia)を使用して、40回の交互のサイクル(95℃で1分、60℃で20秒)に供することによって同定した。
【0253】
次いで、配列決定生成物を、1/5容量まで希釈して、そして直鎖ポリアクリルアミドを有するMegaBACE配列決定システム(Amersham−Pharmacia)へと注入する前に、G−50セファデックスカラムで精製した。
【0254】
配列決定分析の電気泳動図を、図5に示す。追跡は、88bpの環状テンプレート分子の複数のコピーをタンデムに生成すること、そしてこれらのコピーをDNA配列決定反応において検出し得ることを、実証する。
【0255】
(実施例5.FORAの調製)
DNAビーズ:デオキシオリゴヌクレオチド−ggggAATTCAAAATTTggC(配列番号9)をアニーリングしてプローブを捕捉し、これを5’末端でビオチン化して、次いでDynal M−280(Dynal)またはMPGビーズ(CPG)(ビーズ濃度は1mg/mlであった)のどちらかの上に固定した。ビーズを30分間一定量のオリゴヌクレオチドとインキュベートすることによって固定化を実施した。インキュベート中に使用されるオリゴヌクレオチドの量を変化させることによって、オリゴヌクレオチドの異なる装填物(loading)を得た。インキュベーション後、ビーズをそれぞれの容量のTE緩衝液中で洗浄し、そして等容量のTE中に懸濁した。
【0256】
酵素ビーズ:スルフリラーゼ(1mg/ml)およびN末端にBBCPドメインを有するルシフェラーゼ(3mg/ml)の1:1(容量/容量)の混合物を、等容量のDynal M−280(Dynal)(濃度:10mg/ml)と4℃で1時間インキュベートした。1時間のインキュベーションの後、このビーズをアッセイ緩衝液(25mM Tricine、5mM MgOAcおよび1mg/mL BSA)で4回洗浄し、次いで等容量のアッセイ緩衝液中に懸濁した。
【0257】
FORAの調製:DNAビーズを、使用前に最終濃度0.1mg/mLまで10倍に希釈した。酵素ビーズを10mg/mLの濃度で使用した。FORAをO−リング(直径3mm)によって作製された10個のスポットを有するジグ(jig)に設置した。5μLのDNAビーズを9個のスポット中に送達した。入口上の第1のスポットは、DNAを全く含まない、試薬中の任意のバックグラウンドを検出するためのコントロールスポットであった。ジグを遠心分離機に設置して、そして2000rpmで5分間回転させる。遠心力は、ビーズをウェルの底に移動させる(1ウェル当たり約5〜10個のビーズ)。このジグを遠心機から取り出し、そして5μLのSLビーズを添加し、そしてジグを遠心分離機に設置して、そして2000rpmで5分間回転させる。このプロセスを5μLのSLビーズを用いて繰り返す。FORAをジグから除去し、そしてアッセイ緩衝液を含むfalconチューブ中に置いて、そして穏やかな揺らし動作によって3〜4回洗浄する。このようにして調製されたFORAは、ピロリン酸配列決定による配列分析の準備用に準備する。
【0258】
(実施例6.光ファイバー基材の末端に連結された核酸の配列分析)
試薬:配列分析用で、かつコントロールとしての試薬は、4つのヌクレオチドであり0.1μMのピロリン酸(PPi)を、基質溶液中に作製し、ここで、基質とは、300μMのルシフェリンおよび4μMのアデノシン5’−ホスホスルフェート(APS)の混合物をいい、これらはPPi、ルシフェラーゼおよびスルフリラーゼを関連付ける反応のカスケードのための基質である。基質はアッセイ緩衝液中で作製される。酵素を試験して、そしてチャンバーを通る試薬のバックグラウンドのレベルを決定するために使用されるPPi濃度は、0.1μMであった。ヌクレオチドdTTP、dGTP、dCTPの濃度は、6.5μMであり、そしてαdATPの濃度は50μMであった。各々のヌクレオチドは、100U/mLの濃度のDNAポリメラーゼ、クレノウと混合した。
【0259】
FORAを具現化された装置の流動チャンバー内に設置して、そしてこの流動チャンバーをCCDカメラの面板に取り付けた。このFORAをチャンバーを介して基質を流動すること(1分間につき3mlを2分間)によって洗浄した。次いで、試薬の配列を、アクチュエーターに接続したポンプによってチャンバーを介して流し、このアクチュエーターを、異なる試薬に挿入されたチューブを有する位置をスイッチするようにプログラムした。カメラを露光時間2.5sの高速取得モードに設定した。
【0260】
パッドから出力されるシグナルは、パッド内の全ての画素上の平均のカウントである。フレーム番号は、実験中の経過時間に等しい。グラフは、異なる試薬の流動を示す。
【0261】
(他の実施形態)
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前述の記載は例示のために意図されるものであって、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義されることが、理解されるべきである。他の局面、利点および改変は、その特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【0262】
【図1A】図1Aは、アンカープライマーを使用する回転環に基づく増幅の概略図である。
【図1B】図1Bは、アンカープライマーを使用する回転環に基づく増幅の概略図である。
【図1C】図1Cは、アンカープライマーを使用する回転環に基づく増幅の概略図である。
【図1D】図1Dは、アンカープライマーを使用する回転環に基づく増幅の概略図である。
【図2】図2は、本発明に従う配列決定装置の図である。
【図3】図3は、本発明に従う潅流チャンバの図である。
【図4】図4は、本発明の空洞性の光ファイバー端の図である。
【図5】図5は、回転環増幅を用いて生成されたコンカテマー鋳型の配列生成の追跡である。
【図6】図6は、光ファイバー反応器アレイ(FORA)の顕微鏡図である。
【図7】図7は、下敷きにされるFORAの調製のために概略図である。
【図8】図8は、単一ウェルDNA送達のための顕微鏡図である。
【図9】図9は、フローチャンバおよびFORAの概略図である。
【図10】図10は、本発明の分析機器の図である。
【図11】図11は、FORA内での微視的な平行配列決定反応の概略図である。
【図12】図12は、単一ウェル反応の顕微鏡図である。
Claims (181)
- 複数の反応チャンバが配置された平坦な表面を備えるアレイであって、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、そして各チャンバは、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、アレイ。
- 複数の空洞を有する平坦な表面を備えるアレイであって、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、そして各空洞は、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、アレイ。
- 複数の空洞を有する平坦な表面を備えるアレイであって、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、そして各反応チャンバは、その中にたった1つの一本鎖環状核酸が配置されている、アレイ。
- 各一本鎖環状核酸が、少なくとも100コピーの核酸配列を含み、各コピーは、末端同士で共有結合されている、請求項3に記載のアレイ。
- 前記一本鎖環状核酸が、前記反応チャンバ中に固定されている、請求項3に記載のアレイ。
- 前記一本鎖環状核酸が、前記反応チャンバ中に配置された可動固体支持体に固定されている、請求項5に記載のアレイ。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、請求項3に記載のアレイ。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと20μmとの間の幅を有する、請求項3に記載のアレイ。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと10μmとの間の幅を有する、請求項3に記載のアレイ。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、20μmと70μmとの間の幅を有する、請求項3に記載のアレイ。
- 前記空洞が、400,000よりも多い数に達する、請求項3に記載のアレイ。
- 前記空洞が、400,000と20,000,000との間の数に達する、請求項3に記載のアレイ。
- 前記空洞が、1,000,000と16,000,000との間の数に達する、請求項3に記載のアレイ。
- 各空洞の形状が、実質的に六角形である、請求項3に記載のアレイ。
- 前記中心間間隔が、10〜150μmの間である、請求項3に記載のアレイ。
- 前記中心間間隔が、50〜100μmの間である、請求項3に記載のアレイ。
- 各空洞が、10μmと100μmとの間の深さを有する、請求項3に記載のアレイ。
- 各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.25倍と5倍との間である深さを有する、請求項3に記載のアレイ。
- 各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.3倍と1倍との間である深さを有する、請求項3に記載のアレイ。
- 平坦な上面および平坦な底面を備えるアレイであって、該平坦な上面は、少なくとも1,000個の空洞を有し、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、該平坦な底面は、光学的に伝導性であって、その結果、該反応チャンバからの光学的シグナルが該平坦な底面を通して検出され得、該上面と該底面との間の距離は、10cm以下であり、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、そして各チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、アレイ。
- 前記中心間間隔が、10〜150μmの間である、請求項20に記載のアレイ。
- 前記中心間間隔が、50〜100μmの間である、請求項20に記載のアレイ。
- 前記空洞が、400,000より多い数に達する、請求項20に記載のアレイ。
- 前記空洞が、400,000と20,000,000との間の数に達する、請求項20に記載のアレイ。
- 前記空洞が、1,000,000と16,000,000との間の数に達する、請求項20に記載のアレイ。
- 各空洞の形状が、実質的に六角形である、請求項20に記載のアレイ。
- 各空洞が、少なくとも1つの次元において、0.3μmと10μmとの間の幅を有する、請求項20に記載のアレイ。
- 各空洞が、少なくとも1つの次元において、0.3μmと20μmとの間の幅を有する、請求項20に記載のアレイ。
- 各空洞が、少なくとも1つの次元において、20μmと70μmとの間の幅を有する、請求項20に記載のアレイ。
- 各空洞が、10μmと100μmとの間の深さを有する、請求項20に記載のアレイ。
- 各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.25倍と5倍との間である深さを有する、請求項20に記載のアレイ。
- 各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.3倍と1倍との間である深さを有する、請求項20に記載のアレイ。
- 各空洞が、少なくとも1つの不規則な壁表面を有する、請求項20に記載のアレイ。
- 各空洞が、平滑な壁表面を有する、請求項20に記載のアレイ。
- 前記空洞が、光ファイバの束から形成されている、請求項20に記載のアレイ。
- 前記空洞が、前記光ファイバの束の一方の末端をエッチングすることによって形成される、請求項35に記載のアレイ。
- 各空洞が、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を含む、請求項20に記載のアレイ。
- 前記平坦なアレイから間隔があけられており、かつ対向接触しており、その結果、フローチャンバが該アレイ上に形成されている第二表面をさらに備える、請求項20に記載のアレイ。
- 水性環境中で別個の並行共通反応を実施するためのアレイ手段であって、
該アレイ手段は、試薬と反応し得る出発材料を含む少なくとも1,000個の別個の反応チャンバを備える基板を含み、該反応チャンバの各々は、少なくとも1つの試薬を含む1以上の流体が各反応チャンバに送達された場合に、該試薬がウェルの外に拡散する拡散時間が、該出発材料が該試薬と反応して生成物を形成するに必要な時間を超えるような寸法である、アレイ手段。 - 前記反応チャンバが、前記基板に複数の空洞を生成することによって形成される、請求項39に記載のアレイ。
- 前記反応チャンバが、平坦な表面に別個のパッチを生成することによって形成され、該パッチは、周囲の平坦な表面とは異なる表面化学を有する、請求項39に記載のアレイ。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、請求項39または41に記載のアレイ。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと20μmとの間の幅を有する、請求項39または41に記載のアレイ。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと10μmとの間の幅を有する、請求項39または41に記載のアレイ。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、20μmと70μmとの間の幅を有する、請求項39または41に記載のアレイ。
- 前記中心間間隔が、5〜200μmの間である、請求項39または41に記載のアレイ。
- 前記中心間間隔が、10〜150μmの間である、請求項39または41に記載のアレイ。
- 前記中心間間隔が、50〜100μmの間である、請求項39または41に記載のアレイ。
- 前記空洞が、400,000よりも多い数に達する、請求項39または41に記載のアレイ。
- 前記空洞が、400,000と20,000,000との間の数に達する、請求項39または41に記載のアレイ。
- 前記空洞が、1,000,000と16,000,000との間の数に達する、請求項39または41に記載のアレイ。
- 各空洞の形状が、実質的に六角形である、請求項39または41に記載のアレイ。
- 各空洞が、10μmと100μmとの間の深さを有する、請求項39または41に記載のアレイ。
- 各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.25倍と5倍との間である深さを有する、請求項39または41に記載のアレイ。
- 各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.3倍と1倍との間である深さを有する、請求項39または41に記載のアレイ。
- 各空洞が、少なくとも1つの不規則な壁表面を有する、請求項39または41に記載のアレイ。
- 各空洞が、平滑な壁表面を有する、請求項39または41に記載のアレイ。
- 前記空洞が、光ファイバの束から形成されている、請求項39または41に記載のアレイ。
- 前記空洞が、前記光ファイバの束の一方の末端をエッチングすることによって形成される、請求項58に記載のアレイ。
- 各空洞が、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を含む、請求項39または41に記載のアレイ。
- 前記反応チャンバ中に配置された可動固体支持体の集団をさらに含み、各可動固体支持体には、1以上の生物活性因子が結合している、請求項39または41に記載のアレイ。
- 前記空洞が、エッチング、成形または微細加工によって前記基板中に形成される、請求項40に記載のアレイ。
- 前記基板が、光ファイバの束である、請求項40に記載のアレイ。
- 前記空洞が、円筒状である、請求項40に記載のアレイ。
- 前記空洞の各々の底部が、平坦である、請求項40に記載のアレイ。
- 前記空洞の各々の底部が、凹面状である、請求項40に記載のアレイ。
- 複数の反応チャンバが配置された平坦な表面を備えるアレイであって、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、そして各チャンバは、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有し、少なくとも1つの反応チャンバが、少なくとも1つの試薬が固定された可動固体支持体を有し、該試薬は、核酸配列決定反応における使用に適切である、アレイ。
- 各可動固体支持体の直径が、各空洞の幅の0.01倍〜0.1倍の間である、請求項67に記載のアレイ。
- 前記反応チャンバの少なくとも5%〜20%が、少なくとも1つの試薬が固定されている可動固体支持体を有する、請求項67に記載のアレイ。
- 前記反応チャンバの少なくとも20%〜60%が、少なくとも1つの試薬が固定されている可動固体支持体を有する、請求項67に記載のアレイ。
- 前記反応チャンバの少なくとも50%〜100%が、少なくとも1つの試薬が固定されている可動固体支持体を有する、請求項67に記載のアレイ。
- 前記可動固体支持体には、少なくとも1つの試薬が固定されており、該試薬は、スルフリラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項67に記載のアレイ。
- 前記可動固体支持体には、少なくとも1つの試薬が固定されており、該試薬は、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項67に記載のアレイ。
- 前記可動固体支持体には、少なくとも1つの試薬が固定されており、該試薬は、スルフリラーゼ活性およびルシフェラーゼ活性の両方を有するキメラポリペプチドである、請求項67に記載のアレイ。
- 前記可動固体支持体には、少なくとも第一試薬および第二試薬が固定されており、該第一試薬が、スルフリラーゼ活性を有するポリペプチドであり、そして該第二試薬が、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項67に記載のアレイ。
- 前記中心間間隔が、10〜150μmの間である、請求項67に記載のアレイ。
- 前記中心間間隔が、50〜100μmの間である、請求項67に記載のアレイ。
- 前記空洞が、400,000よりも多い数に達する、請求項67に記載のアレイ。
- 前記空洞が、400,000と20,000,000との間の数に達する、請求項67に記載のアレイ。
- 前記空洞が、1,000,000と16,000,000との間の数に達する、請求項67に記載のアレイ。
- 各空洞の形状が、実質的に六角形である、請求項67に記載のアレイ。
- 各空洞が、少なくとも1つの次元において、0.3μmと10μmとの間の幅を有する、請求項67に記載のアレイ。
- 各空洞が、少なくとも1つの次元において、0.3μmと20μmとの間の幅を有する、請求項67に記載のアレイ。
- 各空洞が、少なくとも1つの次元において、20μmと70μmとの間の幅を有する、請求項67に記載のアレイ。
- 各空洞が、10μmと100μmとの間の深さを有する、請求項67に記載のアレイ。
- 各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.25倍と5倍との間である深さを有する、請求項67に記載のアレイ。
- 各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.3倍と1倍との間である深さを有する、請求項67に記載のアレイ。
- 複数の反応チャンバが配置された平坦な表面を備えるアレイであって、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、そして各チャンバは、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有し、少なくとも1つの反応チャンバは、少なくとも1つの試薬が固定された可動固体支持体を有し、該試薬は、核酸であり、該核酸は、一本鎖コンカテマーを含む、アレイ。
- 前記核酸が、ピロ配列決定反応における使用に適切である、請求項88に記載のアレイ。
- ATP活性を検出するために請求項67に記載の可動固体支持体を使用する方法。
- 前記ATPが、核酸配列決定反応の一部として検出される、請求項90に記載の方法。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと20μmとの間の幅を有する、請求項88に記載のアレイ。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと10μmとの間の幅を有する、請求項88に記載のアレイ。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、20μmと70μmとの間の幅を有する、請求項88に記載のアレイ。
- 前記空洞が、400,000よりも多い数に達する、請求項88に記載のアレイ。
- 前記空洞が、400,000と20,000,000との間の数に達する、請求項88に記載のアレイ。
- 前記空洞が、1,000,000と16,000,000との間の数に達する、請求項88に記載のアレイ。
- 前記中心間間隔が、10〜150μmの間である、請求項88に記載のアレイ。
- 前記中心間間隔が、50〜100μmの間である、請求項88に記載のアレイ。
- 各空洞が、10μmと100μmとの間の深さを有する、請求項88に記載のアレイ。
- 各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.25倍と5倍との間である深さを有する、請求項88に記載のアレイ。
- 各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.3倍と1倍との間である深さを有する、請求項88に記載のアレイ。
- 生物活性因子をアレイに送達するための方法であって、該アレイに複数の可動固体支持体を分配する工程を包含し、各可動固体支持体には、少なくとも1つの試薬が固定されており、該試薬は、核酸配列決定反応における使用に適切であり、該アレイは、複数の反応チャンバが配置された平坦な表面を含み、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、そして各チャンバは、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、方法。
- 反応チャンバのアレイを、反応が特定の部位で生じたことを示す光について同時にモニタリングするための装置であって、該装置は、以下:
(a)複数の空洞のある表面を備える平坦な基板から形成された反応チャンバのアレイであって、各空洞のある表面は、分析物を含むように適合させた反応チャンバを形成し、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、該アレイは、400,000を超える別個の反応チャンバを含む、アレイ;
(b)感光性デバイスであって、使用時に、特定の反応チャンバからの光が、該感光性デバイスの特定の所定の領域に衝突するように配置された、デバイス;
(c)該所定の領域の各々に衝突する光レベルを決定するための手段、および
(d)該反応チャンバの各々について時間にともなった該光レベルの変動を記録するための手段
を備える、装置。 - 分析センサであって、以下:
(a)一方の末端に複数の空洞のある表面を有する光ファイバの第一の束から形成されたアレイであって、各空洞のある表面は、分析物を含むように適合された反応チャンバを形成し、そして該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、該アレイは、400,000を超える別個の反応チャンバを含む、アレイ;
(b)該反応チャンバ中で光を生じるための、酵素的手段または蛍光的手段;
(c)光検出手段であって、光捕獲手段および光を該光検出手段へと伝送するための第二光ファイバの束を備え、該第二光ファイバの束は、該アレイと光学的に接触しており、その結果、個々の反応チャンバにおいて生じた光は、該光捕獲手段への伝送のために該第二光ファイバの束の別々のファイバまたは別々のファイバの群によって捕獲される、手段
を備える、センサ。 - 前記センサが、生化学的アッセイにおける使用のために適切である、請求項105に記載のセンサ。
- 前記センサが、細胞ベースのアッセイにおける使用のために適切である、請求項105に記載のセンサ。
- 前記光捕獲手段が、CCDカメラである、請求項105に記載のセンサ。
- 前記反応チャンバが、生物活性因子が固定された1以上の可動固体支持体を含む、請求項105に記載のセンサ。
- 一方の末端に複数の空洞のある表面を有する融合した光ファイバアレイ中に複数の光ファイバを含む組成物であって、各空洞のある表面は、分析物を含むように適合させた反応チャンバを形成し、そして該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、該アレイは、400,000を超える別個の反応チャンバを含み、各反応チャンバは、1以上の可動固体支持体を含み、該可動固体支持体の直径は、各反応チャンバの幅の0.01倍〜0.1倍の間である、組成物。
- 水性環境中で別個の並行共通反応を実施するための方法であって、以下:
(a)少なくとも1つの試薬を含む流体をアレイに送達する工程であって、該アレイは、該試薬と反応し得る出発材料を含む少なくとも400,000個の別個の反応チャンバを備える基板を含み、該反応チャンバの各々は、該流体が各反応チャンバに送達された場合に、該試薬がウェルの外に拡散する拡散時間が、該出発材料が該試薬と反応して生成物を形成するに必要な時間を超えるような寸法である、工程;および
(b)(i)該出発材料が該試薬と反応して各反応チャンバ中で生成物を形成した後であるが、(ii)任意の1つの反応チャンバに送達された該試薬が、該反応チャンバの外で任意の他の反応チャンバへと拡散する前、の時期に該流体を該アレイから洗浄する工程
を包含する、方法。 - 任意の1つの反応チャンバにおいて形成された生成物が、任意の他の反応チャンバにおいて形成された生成物とは独立しているが、1以上の共通試薬を用いて作製される、請求項111に記載の方法。
- 前記出発材料が、核酸配列であり、そして前記流体中の少なくとも1つの試薬が、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである、請求項111に記載の方法。
- 前記流体が、前記核酸配列および前記ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを反応させ得るポリメラーゼをさらに含む、請求項113に記載の方法。
- 工程(a)および工程(b)を順次反復する工程をさらに包含する、請求項111に記載の方法。
- 核酸配列決定酵素をアレイに送達するための方法であって、該アレイは、複数の空洞を有する平坦な表面を備え、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し;該方法は、1つ以上の核酸配列決定酵素が固定された複数の可動固体支持体を該アレイに分配しを有し、その結果、少なくとも1つの可動固体支持体が、各反応チャンバ内に含まれる工程を包含する、方法。
- 前記核酸配列決定酵素の1つが、スルフリラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項116に記載の方法。
- 前記核酸配列決定酵素の1つが、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項116に記載の方法。
- 前記核酸配列決定酵素の1つが、スルフリラーゼ活性およびルシフェラーゼ活性の両方を有するポリペプチドである、請求項116に記載の方法。
- 前記複数の可動固体支持体が、スルフリラーゼ活性を有するポリペプチドが固定されているか、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドが固定されているか、または、スルフリラーゼ活性を有するポリペプチドおよびルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドの両方が固定されている可動固体支持体を含む、請求項116に記載の方法。
- 核酸配列をアレイに送達するための方法であって、該アレイは、複数の空洞を有する平坦な表面を備え、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し;該方法は、1つ以上の核酸配列が固定された複数の可動固体支持体を該アレイに分配する工程を包含する、方法。
- 前記核酸配列が、一本鎖環状核酸である、請求項121に記載の方法。
- 各一本鎖環状核酸が、少なくとも100コピーの核酸配列を含み、各コピーは、末端同士で共有結合されている、請求項122に記載の方法。
- 核酸配列をアレイに送達するための方法であって、該アレイは、複数の空洞を有する平坦な表面を備え、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し;該方法は、たった1つの核酸配列を各空洞内に固定する工程を包含する、方法。
- 前記核酸配列が、一本鎖環状核酸である、請求項124に記載の方法。
- 各一本鎖環状核酸が、少なくとも100コピーの核酸配列を含み、各コピーは、末端同士で共有結合されている、請求項124に記載の方法。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと20μmとの間の幅を有する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと10μmとの間の幅を有する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、20μmと70μmとの間の幅を有する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。
- 前記空洞が400,000よりも多い数に達する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。
- 前記空洞が400,000と20,000,000との間の数に達する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。
- 前記空洞が1,000,000と16,000,000との間の数に達する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。
- 前記中心間間隔が、10〜150μmの間である、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。
- 前記中心間間隔が、50〜100μmの間である、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。
- 各空洞が、10μmと100μmとの間の深さを有する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。
- 各空洞が、該空洞の幅のサイズの、0.25倍と5倍との間の深さを有する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。
- 各空洞が、該空洞の幅のサイズの、0.3倍と1倍との間の深さを有する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応チャンバに配置された後にさらに増幅して、前記核酸配列を、多コピーの該核酸配列を生成する、請求項121または124に記載の方法。
- 前記核酸配列が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、および等温DNA増幅からなる群から選択される増幅技術を使用して増幅される、請求項139に記載の方法。
- 核酸を配列決定するための方法であって、該方法は、以下:
(a)1つ以上の核酸アンカープライマーを提供する工程;
(b)平坦な表面の複数の空洞内に配置された複数の一本鎖環状核酸鋳型を提供する工程であって、各空洞が分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有する、工程;
(c)有効量の該核酸アンカープライマーを、少なくとも1つの該一本鎖環状鋳型にアニーリングして、プライムされたアンカープライマー−環状鋳型複合体を生じる、工程;
(d)該プライムされたアンカープライマー−環状鋳型複合体をポリメラーゼと合わせて、該環状核酸鋳型に相補的な多コピーの核酸に共有結合した伸長されたアンカープライマーを形成する、工程;
(e)有効量の配列決定プライマーを、該共有結合した相補的な核酸の1つ以上のコピーにアニーリングする、工程;
(f)該配列決定プライマーを、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて伸長して、配列決定産物、および、該所定のヌクレオチド三リン酸が該配列決定プライマーの3’末端に組み込まれる場合、配列決定反応副産物を生じる、工程;ならびに
(g)該配列決定反応副産物を同定して、これによって、核酸の該配列を決定する、工程、
を包含する、方法。 - 各一本鎖環状核酸が、少なくとも100コピーの核酸配列を含み、各コピーは、末端同士で共有結合している、請求項141に記載の方法。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、請求項141に記載の方法。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと20μmとの間の幅を有する、請求項141に記載の方法。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと10μmとの間の幅を有する、請求項141に記載の方法。
- 各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、20μmと70μmとの間の幅を有する、請求項141に記載の方法。
- 前記空洞が、400,000よりも多い数に達する、請求項141に記載の方法。
- 前記空洞が、400,000と20,000,000との間の数に達する、請求項141に記載の方法。
- 前記空洞が、1,000,000と16,000,000の間の数に達する、請求項141に記載の方法。
- 前記中心間間隔が、10〜15μmの間である、請求項141に記載の方法。
- 前記中心間間隔が、50〜100μmの間である、請求項141に記載の方法。
- 各空洞が、10μmと100μmとの間の深さを有する、請求項141に記載の方法。
- 各空洞が、該空洞の幅のサイズの、0.25倍と5倍との間の深さを有する、請求項141に記載の方法。
- 各空洞が、該空洞の幅のサイズの、0.3倍と1倍との間の深さを有する、請求項141に記載の方法。
- 前記反応チャンバに配置された後に、前記核酸配列をさらに増幅して、多コピーの該核酸配列を生成するために、請求項141に記載の方法。
- 前記核酸配列が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、および等温DNA増幅からなる群から選択される増幅技術を使用して増幅される、請求項155に記載の方法。
- 前記一本鎖環状核酸が、前記反応チャンバ中に固定される、請求項141に記載の方法。
- 前記一本鎖環状核酸が、前記反応チャンバ中に配置される1以上の可動固体支持体上に固定される、請求項141に記載の方法。
- 核酸を配列決定する方法であって、該方法は、以下:
(a)少なくとも1つの核酸アンカープライマーを提供する工程;
(b)少なくとも400,000の別個の反応部位を備えるアレイにおいて、複数の一本鎖環状核酸鋳型を提供する、工程;
(c)第1の量の該核酸アンカープライマーを、少なくとも1つの該一本鎖環状鋳型にアニーリングして、プライムされたアンカープライマー−環状鋳型複合体を生じる、工程;
(d)該プライムされたアンカープライマー−環状鋳型複合体をポリメラーゼと合わせて、該環状核酸鋳型に相補的な多コピーの核酸に共有結合した伸長したアンカープライマーを形成する、工程;
(e)第2の量の配列決定プライマーを、該共有結合した相補的な核酸の1つ以上のコピーにアニーリングする、工程;
(f)該配列決定プライマーを、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて伸長して、配列決定産物、および、該所定のヌクレオチド三リン酸が該配列決定プライマーの3’末端に組み込まれる場合、配列決定反応副産物を生じる、工程;ならびに
(g)該配列決定反応副産物を同定して、これによって、核酸鋳型を含む核反応部位での該核酸の配列を決定する、工程、
を包含する、方法。 - 前記アンカープライマーが粒子に連結される、請求項159に記載の方法。
- 前記アンカープライマーが、前記伸長されたアンカープライマーの形成の前に前記粒子に連結される、請求項159に記載の方法。
- 前記アンカープライマーが、前記伸長されたアンカープライマーの形成後に、前記粒子に連結される、請求項159に記載の方法。
- 前記配列決定反応副産物が、PPiであり、共役スルフリラーゼ/ルシフェラーゼ反応を用いて、検出するための光を生成する、請求項159に記載の方法。
- 前記スルフリラーゼおよびルシフェラーゼのいずれかまたは両方が、各反応部位に配置された1つ以上の可動固体支持体上に固定されている、請求項159に記載の方法。
- アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定するための方法であって、該方法は以下:
(a)複数のサンプルDNAを提供する工程であって、各々は、平坦な表面の複数の空洞内に配置されており、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有する、工程;
(b)ある既知の含窒素塩基の活性化ヌクレオチド5’−三リン酸前駆体を、該活性化ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の該含窒素塩基が、一本鎖ポリヌクレオチド鋳型の不対ヌクレオチド残基の該含窒素塩基に相補的である場合に、相補的オリゴヌクレオチドプライマー鎖の3’末端への該活性化ヌクレオシド5’−三リン酸前駆体の組み込みを可能にする反応条件下で、各反応チャンバ中の反応混合物に添加する工程であって、各反応混合物は、鋳型特異的ヌクレオチドポリメラーゼおよび一本鎖ポリヌクレオチド鋳型を含み、該一本鎖ポリヌクレオチド鋳型は、該鋳型よりも少なくとも1つのヌクレオチド残基短い、相補的オリゴヌクレオチドプライマー鎖にハイブリダイズして、該プライマー鎖の3’末端にて、各鋳型中に少なくとも1つの不対ヌクレオチド残基を形成している、工程;
(c)該ヌクレオシド5’−三リン酸前駆体が、該プライマー鎖へ組み込まれたか否かを決定する工程であって、該ヌクレオシド5’−三リン酸前駆体の組み込みは、該鋳型の該不対ヌクレオチド残基が、該組み込まれたヌクレオシド5’−三リン酸前駆体の不対ヌクレオチド残基に相補的である含窒素塩基構成物を有することを示す、工程;ならびに
(d)工程(b)および工程(c)を順次に反復する工程であって、各順次の反復が、既知の含窒素塩基構成物の組み込み活性化ヌクレオシド5’三リン酸前駆体を添加して、そして該活性化ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の1つの型を検出する、工程;ならびに
(e)各反応チャンバにおける該鋳型の該不対ヌクレオチド残基の該塩基配列を、該ヌクレオシド前駆体の組み込みの順序から決定する、工程、
を包含する、方法。 - 鋳型核酸ポリマーにおける核酸配列を決定するための方法であって、以下:
(a)複数の鋳型核酸ポリマーを平坦な表面の複数の空洞に導入する工程であって、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、各反応チャンバは、該核酸ポリマーが、ヌクレオチドが添加される場合に相補的核酸ポリマーの合成のための鋳型ポリマーとして作用する重合環境を備える、工程;
(b)一連の供給原料を該重合環境に順次提供する工程であって、各供給原料は、該相補的核酸ポリマーが形成される該ヌクレオチドから選択されるヌクレオチドを含み、その結果、該供給原料中の該ヌクレオチドが、配列決定されるべき該鋳型ポリマー中の隣のヌクレオチドに対して相補的である場合、該ヌクレオチドが該相補的ポリマーに組み込まれ、そして、無機ピロリン酸が放出される、工程;
(c)無機ピロリン酸の形成を検出して、該相補的ポリマー中の各ヌクレオチドの正体、従って、該鋳型ポリマーの配列を決定する、工程、
を包含する、方法。 - サンプルDNAのDNA配列における標的位置の塩基を同定する方法であって、ここで:
(a)サンプルDNAは、平坦な表面の複数の空洞内に配置され、各空洞が分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは5〜200μmの間の中心間間隔を有し、該DNAは、該反応チャンバ中に配置される前または後のいずれかで一本鎖にされ、
(b)該標的位置にすぐ隣接する位置にて、固定された一本鎖DNAにハイブリダイズする伸長プライマーが、提供され、
(c)該固定された一本鎖DNAは、所定のヌクレオチド三リン酸の存在下でポリメラーゼ反応に供され、ここで、該所定のヌクレオチド三リン酸が、該配列決定プライマーの3’末端に組み込まれる場合、配列決定反応副産物が形成され;そして
(d)該配列決定反応副産物を同定して、それによって、該標的位置の該塩基に相補的なヌクレオチドを決定する、
方法。 - サンプルDNA配列における標的位置の塩基を同定する方法であって、以下:
(a)平坦な表面の複数の空洞内に配置されたサンプルDNAを提供する工程であって、各空洞が分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバが5〜200μmの間の中心間間隔を有し、該DNAは、該反応チャンバ中に配置される前または後のいずれかで一本鎖にされる、工程、
(b)該標的位置にすぐ隣接した位置で該サンプルDNAにハイブリダイズする伸長プライマーを提供する、工程、
(c)該サンプルDNA配列および該伸長プライマーを、ヌクレオチド三リン酸の存在下でポリメラーゼ反応に供し、これによって、該ヌクレオチオ三リン酸は、該標的位置の該塩基に相補的である場合にのみ、組み込まれ、そして、ピロリン酸(PPi)を放出する工程であって、該ヌクレオチド三リン酸は、サンプル−プライマー混合物の別々のアリコートにか、または、同じサンプル−プライマー混合物に順次添加される、工程、
(d)PPiの放出を検出して、どのヌクレオチドが組み込まれたかを示す、工程、
を包含する、方法。 - 一本鎖サンプルDNA配列における標的位置の塩基を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)該標的位置にすぐ隣接した位置でサンプルDNAにハイブリダイズする伸長プライマーを提供する工程であって、該サンプルDNAは、平坦表面の複数の空洞内に配置されており、各空洞は分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは5〜200μmの間の中心間間隔を有し、該DNAは、該反応チャンバ中に配置される前または後のいずれかで一本鎖にされる、工程、
(b)該サンプルDNAおよび伸長プライマーを、所定のデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下で、ポリメラーゼ反応に供し、これによって、該デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが、該標的位置の該塩基に相補的である場合にのみ、組み込まれ、そして、ピロリン酸(PPi)を放出する工程であって、該所定のデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドは、サンプル−プライマー混合物の別々のアリコートにか、または、同じサンプル−プライマー混合物に順次添加される、工程、
(c)PPiの任意の放出を酵素的に検出して、どのデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが組み込まれているかを示す、工程、
を包含し、該PPi検出酵素が、該ポリメラーゼ反応工程に含まれるという点で、および、デオキシアデノシン三リン酸(ATP)またはジデオキシアデノシン三リン酸の代わりに、ポリメラーゼの基質として作用し得るが、該PPi検出酵素の基質として作用し得ない、dATPまたはddATPアナログが使用されるという点で、特徴付けられる、方法。 - 核酸配列を分析するための装置であって、該装置は、以下:
(a)試薬送達キュベットであって、該キュベットは、複数の空洞を有する平坦な表面を備えるアレイを備え、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは5〜200μmの間の中心間間隔を有し、ここで、該試薬送達キュベットは、配列決定反応における使用のための試薬を含む、キュベット;
(b)該試薬送達キュベットと連絡している、試薬送達手段;
(c)該試薬送達チャンバと連絡している、画像化システム;ならびに
(d)該画像化システムと連絡している、データ収集システム
を備える、装置。 - アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定するための装置であって、該装置が、以下:
(a)平坦な表面に複数の空洞を備える試薬キュベットであって、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは5〜200μmの間の中心間間隔を有する、キュベット;
(b)1つの既知の含窒素塩基の活性化ヌクレオチド5’−三リン酸前駆体を、該活性化ヌクレオシド5’−三リン酸前駆体の該含窒素塩基が、一本鎖ポリヌクレオチド鋳型の不対ヌクレオチド残基の該含窒素塩基に相補的である場合に、相補的オリゴヌクレオチドプライマー鎖の3’末端への該活性化ヌクレオシド5’−三リン酸前駆体の組み込みを可能にする反応条件下で、各反応チャンバにおいて反応混合物に添加するための試薬送達手段であって、各反応混合物は、鋳型特異的ヌクレオチドポリメラーゼおよび一本鎖ポリヌクレオチド鋳型を含み、該一本鎖ポリヌクレオチド鋳型は、該鋳型よりも少なくとも1つのヌクレオチド残基短い、相補的オリゴヌクレオチドプライマー鎖にハイブリダイズしており、該プライマー鎖の3’末端にて、各鋳型中に少なくとも1つの不対ヌクレオチド残基を形成している、試薬送達手段;
(c)該ヌクレオシド5’−三リン酸前駆体が、該プライマー鎖へ組み込まれたか否かを検出するための検出手段であって、該ヌクレオシド5’−三リン酸前駆体の組み込みは、該鋳型の該不対ヌクレオチド残基が、該組み込まれたヌクレオシド5’−三リン酸前駆体の不対ヌクレオチド残基に相補的である含窒素塩基構成物を有することを示す、検出手段、
(d)工程(b)および工程(c)を順次反復するための手段であって、ここで、各順次反復が、既知の含窒素塩基構成物の1つの型の活性化ヌクレオシド5’−三リン酸前駆体を追加して、そして組み込みを検出する、手段;ならびに、
(e)各反応チャンバにおける該鋳型の該不対ヌクレオチド残基の該塩基配列を、該ヌクレオシド前駆体の組み込みの順次から決定するためのデータ処理手段、
を備える、装置。 - 鋳型核酸ポリマー中の核酸配列を決定するための装置であって、以下:
(a)平坦な表面に複数の空洞を備えるアレイであって、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは5〜200μmの間の中心間間隔を有する、アレイ、
(b)鋳型核酸ポリマーを該反応チャンバに導入するための、核酸送達手段;
(c)該核酸ポリマーが、ヌクレオチドが添加される場合に相補的な核酸ポリマーの合成のための鋳型ポリマーとして作用する重合環境を作成するために、該反応チャンバに試薬を送達するための、核酸送達手段;
(d)一連の供給原料を該重合環境に順次提供するための試薬送達手段であって、各供給原料は、該相補的核酸ポリマーが形成されるヌクレオチドから選択されるヌクレオチドを含み、その結果、該供給原料中の該ヌクレオチドが、配列決定されるべき該鋳型ポリマー中の隣のヌクレオチドに対して相補的である場合、該ヌクレオチドが該相補的ポリマーに組み込まれ、そして、無機ピロリン酸が放出される、試薬送達手段;
(e)無機ピロリン酸の形成を酵素的に検出するための検出手段;ならびに、
(f)該相補的ポリマー中の各ヌクレオチドの正体、従って、鋳型ポリマーの該配列を決定するための、データ処理手段、
を備える、装置。 - 複数の分析物を処理するための手段であって、該装置は、以下:
(a)複数の空洞のある表面基板が配置されたフローチャンバであって、各空洞のある表面が、分析物をふくむように適合された反応チャンバを形成し、ここで、該チャンバが、5〜200μmの間の中心間間隔を有する、フローチャンバ;
(b)1つ以上のレザバから該フローチャンバまで処理試薬を送達する流体手段であって、その結果、該フローチャンバ中に配置された該分析物が、該試薬に曝露される、流体手段;ならびに、
(c)該反応チャンバの各々から光学的シグナルの配列を検出するための検出手段であって、該配列の各光学的シグナルが、処理試薬と該反応チャンバ中に配置された該分析物との間の相互作用を示し、ここで、該検出手段が、該空洞のある表面と連絡している、検出手段、
を備える、装置。 - 前記検出手段がCCDカメラである、請求項173に記載の装置。
- 前記分析物が核酸である、請求項173に記載の装置。
- 前記分析物が、前記反応チャンバ中に配置された1以上の可動固体支持体上に固定される、請求項173に記載の装置。
- 前記処理試薬が、1以上の可動固体支持体上に固定される、請求項173に記載の装置。
- 複数の空洞を有する平坦な表面を備えるアレイであって、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの中心間間隔を有し、各空洞が、該反応チャンバに残るいずれの水溶液についての拡散係数が1.6667×10−9 m2/sとなるように形成される、アレイ。
- アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法であって、該方法は、以下:
(a)複数のサンプルDNAを提供する工程であって、各DNAは、平坦な表面上の複数の空洞内に配置されており、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有する、工程;
(c)感光性デバイスの各々の部分上の複数の反応部位から放射される光レベルを検出する、工程;
(d)該感光性デバイスの該部分の各々に衝突する光を、他の全ての領域からの信号から区別可能な電気信号に変換する、工程;
(e)対応する電気信号から、別々の領域の各々についての光強度を決定する、工程;
(f)時間にともなった該電気信号の変動を記録する、工程、
を包含する、方法。 - 核酸を配列決定するための方法であって、該方法は、以下:
(a)1つ以上の核酸アンカープライマーを提供する、工程;
(b)平坦な表面の複数の空洞内に配置された複数の一本鎖環状核酸鋳型を提供する工程であって、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有する、工程;
(c)感光性デバイスの各々の部分の複数の反応部位から放射される光レベルを検出する工程;
(d)該感光性デバイスの該部分の各々に衝突する光を、他の全ての領域からの信号から区別可能な電気信号に変換する、工程;
(e)対応する電気信号から、別々の領域の各々についての光強度を決定する、工程;
(f)時間にともなう該電気信号の変動を記録する工程、
を包含する、方法。 - 核酸を配列決定するための方法であって、該方法は、以下:
(a)少なくとも1つの核酸アンカープライマーを提供する工程;
(b)少なくとも400,000の別個の反応部位を有するアレイ中に、複数の一本鎖環状核酸鋳型を提供する、工程;
(c)感光性デバイスの各々の部分の複数の反応部位から放射される光レベルを検出する工程;
(d)該感光性デバイスの該部分の各々に衝突する光を、他の全て領域のからの信号から区別可能な電気信号に変換する、工程;
(e)対応する電気信号から、別々の領域の各々についての光強度を決定する、工程;
(f)時間にともなう該電気信号の変動を記録する、工程、
を包含する、方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/814,338 US7244559B2 (en) | 1999-09-16 | 2001-03-21 | Method of sequencing a nucleic acid |
PCT/US2002/008700 WO2002077287A1 (en) | 2001-03-21 | 2002-03-21 | Apparatus and method for sequencing a nucleic acid |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005505748A true JP2005505748A (ja) | 2005-02-24 |
JP4354184B2 JP4354184B2 (ja) | 2009-10-28 |
Family
ID=25214762
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002575327A Expired - Fee Related JP4354184B2 (ja) | 2001-03-21 | 2002-03-21 | 核酸の配列決定のための装置および方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US7244559B2 (ja) |
EP (1) | EP1381693B1 (ja) |
JP (1) | JP4354184B2 (ja) |
AT (1) | ATE468915T1 (ja) |
AU (1) | AU2002247390B9 (ja) |
CA (1) | CA2441603C (ja) |
DE (1) | DE60236502D1 (ja) |
ES (1) | ES2348435T3 (ja) |
WO (1) | WO2002077287A1 (ja) |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008537679A (ja) * | 2005-04-07 | 2008-09-25 | 454 ライフ サイエンシーズ コーポレイション | 薄膜コーティングで被覆されたマイクロウェルアレイおよびそれを製造する方法 |
JP2009500004A (ja) * | 2005-06-15 | 2009-01-08 | カリダ・ジェノミックス・インコーポレイテッド | 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ |
JP2009033988A (ja) * | 2007-07-31 | 2009-02-19 | Hitachi High-Technologies Corp | 核酸解析方法及び装置 |
WO2010026950A1 (ja) * | 2008-09-08 | 2010-03-11 | 株式会社日立製作所 | Dna検出装置、及びdna検出デバイス、並びにdna検出方法 |
JP2011097884A (ja) * | 2009-11-06 | 2011-05-19 | Japan Advanced Institute Of Science & Technology Hokuriku | 試料解析装置 |
JP2012507990A (ja) * | 2008-11-07 | 2012-04-05 | インダストリアル テクノロジー リサーチ インスティテュート | 正確な配列データおよび修飾塩基位置決定の方法 |
JP2014518638A (ja) * | 2011-06-07 | 2014-08-07 | コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ | ヌクレオチド配列データの提供 |
JP2015139373A (ja) * | 2014-01-27 | 2015-08-03 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 生体分子分析デバイス、及び生体分子分析装置 |
Families Citing this family (521)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6261808B1 (en) * | 1992-08-04 | 2001-07-17 | Replicon, Inc. | Amplification of nucleic acid molecules via circular replicons |
WO1994003624A1 (en) * | 1992-08-04 | 1994-02-17 | Auerbach Jeffrey I | Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules |
US7875440B2 (en) | 1998-05-01 | 2011-01-25 | Arizona Board Of Regents | Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules |
US6780591B2 (en) | 1998-05-01 | 2004-08-24 | Arizona Board Of Regents | Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules |
US7244559B2 (en) * | 1999-09-16 | 2007-07-17 | 454 Life Sciences Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
US7211414B2 (en) | 2000-12-01 | 2007-05-01 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity |
JP2002306180A (ja) * | 2001-04-16 | 2002-10-22 | Hitachi Ltd | 核酸塩基配列解析法および核酸塩基配列解析試薬キットおよび核酸塩基配列解析装置 |
US20050009022A1 (en) * | 2001-07-06 | 2005-01-13 | Weiner Michael P. | Method for isolation of independent, parallel chemical micro-reactions using a porous filter |
US7595883B1 (en) * | 2002-09-16 | 2009-09-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Biological analysis arrangement and approach therefor |
US7575865B2 (en) * | 2003-01-29 | 2009-08-18 | 454 Life Sciences Corporation | Methods of amplifying and sequencing nucleic acids |
JP4480715B2 (ja) | 2003-01-29 | 2010-06-16 | 454 コーポレーション | 二重末端シーケンシング |
AU2004212464A1 (en) * | 2003-02-05 | 2004-08-26 | Board Of Regents, The University Of Texas System | A microchip-based system for HIV diagnostics |
US8003374B2 (en) | 2003-03-25 | 2011-08-23 | The Regents Of The University Of California | Reagentless, reusable, bioelectronic detectors |
US20040191801A1 (en) * | 2003-03-25 | 2004-09-30 | Heeger Alan J. | Reagentless, reusable bioelectronic detectors and their use as authentication devices |
EP2532745B1 (en) | 2003-07-05 | 2015-09-09 | The Johns Hopkins University | Method and Compositions for Detection and Enumeration of Genetic Variations |
US7169560B2 (en) | 2003-11-12 | 2007-01-30 | Helicos Biosciences Corporation | Short cycle methods for sequencing polynucleotides |
WO2005054431A2 (en) * | 2003-12-01 | 2005-06-16 | 454 Corporation | Method for isolation of independent, parallel chemical micro-reactions using a porous filter |
CN1942590B (zh) * | 2004-02-18 | 2012-09-05 | 周小川 | 多元化学和生化反应的流体装置和方法 |
US7981604B2 (en) | 2004-02-19 | 2011-07-19 | California Institute Of Technology | Methods and kits for analyzing polynucleotide sequences |
GB2413796B (en) * | 2004-03-25 | 2006-03-29 | Global Genomics Ab | Methods and means for nucleic acid sequencing |
US7622281B2 (en) | 2004-05-20 | 2009-11-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for clonal amplification of nucleic acid |
US8536661B1 (en) | 2004-06-25 | 2013-09-17 | University Of Hawaii | Biosensor chip sensor protection methods |
US20060024711A1 (en) * | 2004-07-02 | 2006-02-02 | Helicos Biosciences Corporation | Methods for nucleic acid amplification and sequence determination |
US7170050B2 (en) | 2004-09-17 | 2007-01-30 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Apparatus and methods for optical analysis of molecules |
CN101914620B (zh) * | 2004-09-17 | 2014-02-12 | 加利福尼亚太平洋生命科学公司 | 核酸测序的方法 |
WO2007008246A2 (en) | 2004-11-12 | 2007-01-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Charge perturbation detection system for dna and other molecules |
US7629173B2 (en) * | 2004-12-29 | 2009-12-08 | Corning Incorporated | Optical reader system and method for monitoring and correcting lateral and angular misalignments of label independent biosensors |
EP2239342A3 (en) * | 2005-02-01 | 2010-11-03 | AB Advanced Genetic Analysis Corporation | Reagents, methods and libraries for bead-based sequencing |
EP2241637A1 (en) | 2005-02-01 | 2010-10-20 | AB Advanced Genetic Analysis Corporation | Nucleic acid sequencing by performing successive cycles of duplex extension |
US7964413B2 (en) * | 2005-03-10 | 2011-06-21 | Gen-Probe Incorporated | Method for continuous mode processing of multiple reaction receptacles in a real-time amplification assay |
US7785862B2 (en) | 2005-04-07 | 2010-08-31 | 454 Life Sciences Corporation | Thin film coated microwell arrays |
US20060228721A1 (en) * | 2005-04-12 | 2006-10-12 | Leamon John H | Methods for determining sequence variants using ultra-deep sequencing |
EP1922419A4 (en) * | 2005-06-10 | 2010-11-17 | Life Technologies Corp | METHOD AND SYSTEM FOR GENETIC MULTIPLEX ANALYSIS |
US7666593B2 (en) | 2005-08-26 | 2010-02-23 | Helicos Biosciences Corporation | Single molecule sequencing of captured nucleic acids |
US7981365B2 (en) * | 2005-09-15 | 2011-07-19 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Electrospray coating of aerosols for labeling and identification |
US7960104B2 (en) * | 2005-10-07 | 2011-06-14 | Callida Genomics, Inc. | Self-assembled single molecule arrays and uses thereof |
EP2546360A1 (en) * | 2005-10-07 | 2013-01-16 | Callida Genomics, Inc. | Self-assembled single molecule arrays and uses thereof |
WO2007120208A2 (en) * | 2005-11-14 | 2007-10-25 | President And Fellows Of Harvard College | Nanogrid rolling circle dna sequencing |
DE102005056016A1 (de) * | 2005-11-17 | 2007-05-31 | Leibniz-Institut Für Polymerforschung Dresden E.V. | Strukturierbarer Polymer-Schichtverbund, Verfahren zu seiner Herstellung und Anwendung |
WO2007120299A2 (en) * | 2005-11-29 | 2007-10-25 | The Regents Of The University Of California | Signal-on architecture for electronic, oligonucleotide-based detectors |
US20070168197A1 (en) * | 2006-01-18 | 2007-07-19 | Nokia Corporation | Audio coding |
CN101415813B (zh) | 2006-02-03 | 2013-04-10 | 微芯片生物工艺学股份有限公司 | 微流体装置 |
CN101390101B (zh) * | 2006-02-16 | 2012-05-23 | 454生命科学公司 | 用于校正核酸序列数据中的引物延伸误差的系统和方法 |
US8364417B2 (en) | 2007-02-15 | 2013-01-29 | 454 Life Sciences Corporation | System and method to correct out of phase errors in DNA sequencing data by use of a recursive algorithm |
US8460879B2 (en) | 2006-02-21 | 2013-06-11 | The Trustees Of Tufts College | Methods and arrays for target analyte detection and determination of target analyte concentration in solution |
US11237171B2 (en) | 2006-02-21 | 2022-02-01 | Trustees Of Tufts College | Methods and arrays for target analyte detection and determination of target analyte concentration in solution |
EP1994180A4 (en) * | 2006-02-24 | 2009-11-25 | Callida Genomics Inc | GENOME SEQUENCING ON DNA ARRAYS WITH HIGH THROUGHPUT |
SG10201405158QA (en) * | 2006-02-24 | 2014-10-30 | Callida Genomics Inc | High throughput genome sequencing on dna arrays |
US8071296B2 (en) | 2006-03-13 | 2011-12-06 | Agency For Science, Technology And Research | Nucleic acid interaction analysis |
US8247026B2 (en) * | 2006-03-20 | 2012-08-21 | Mitsui Chemicals, Inc. | Optical film and method for producing same |
CA2649725A1 (en) * | 2006-04-19 | 2007-10-25 | Applera Corporation | Reagents, methods, and libraries for gel-free bead-based sequencing |
US10522240B2 (en) | 2006-05-03 | 2019-12-31 | Population Bio, Inc. | Evaluating genetic disorders |
US7702468B2 (en) | 2006-05-03 | 2010-04-20 | Population Diagnostics, Inc. | Evaluating genetic disorders |
US8569416B2 (en) | 2006-06-06 | 2013-10-29 | Dow Corning Corporation | Single phase silicone acrylate formulation |
US8614278B2 (en) | 2006-06-06 | 2013-12-24 | Dow Corning Corporation | Silicone acrylate hybrid composition and method of making same |
EP2024406B1 (en) | 2006-06-06 | 2012-08-01 | Dow Corning Corporation | A silicone acrylate hybrid composition |
WO2007147076A2 (en) | 2006-06-14 | 2007-12-21 | Living Microsystems, Inc. | Methods for the diagnosis of fetal abnormalities |
US8372584B2 (en) | 2006-06-14 | 2013-02-12 | The General Hospital Corporation | Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags |
US8137912B2 (en) | 2006-06-14 | 2012-03-20 | The General Hospital Corporation | Methods for the diagnosis of fetal abnormalities |
US20080050739A1 (en) | 2006-06-14 | 2008-02-28 | Roland Stoughton | Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats |
US20080070792A1 (en) | 2006-06-14 | 2008-03-20 | Roland Stoughton | Use of highly parallel snp genotyping for fetal diagnosis |
WO2008070352A2 (en) | 2006-10-27 | 2008-06-12 | Complete Genomics, Inc. | Efficient arrays of amplified polynucleotides |
JP2008109864A (ja) * | 2006-10-30 | 2008-05-15 | Hitachi Ltd | 遺伝子配列解析システム |
US8338109B2 (en) | 2006-11-02 | 2012-12-25 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Predicting cancer outcome |
US20080221832A1 (en) * | 2006-11-09 | 2008-09-11 | Complete Genomics, Inc. | Methods for computing positional base probabilities using experminentals base value distributions |
US20090111706A1 (en) | 2006-11-09 | 2009-04-30 | Complete Genomics, Inc. | Selection of dna adaptor orientation by amplification |
EP2518162B1 (en) | 2006-11-15 | 2018-03-07 | Biospherex LLC | Multitag sequencing and ecogenomics analysis |
US7813013B2 (en) * | 2006-11-21 | 2010-10-12 | Illumina, Inc. | Hexagonal site line scanning method and system |
US20080242560A1 (en) * | 2006-11-21 | 2008-10-02 | Gunderson Kevin L | Methods for generating amplified nucleic acid arrays |
US20100190654A1 (en) * | 2006-12-05 | 2010-07-29 | Liquidia Technologies , Inc. | Nanoarrays and methods and materials for fabricating same |
WO2008073378A2 (en) * | 2006-12-11 | 2008-06-19 | Thomas Jefferson University Medical College | High throughput dna sequencing method and apparatus |
US8262900B2 (en) | 2006-12-14 | 2012-09-11 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays |
US8349167B2 (en) | 2006-12-14 | 2013-01-08 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays |
EP2092322B1 (en) | 2006-12-14 | 2016-02-17 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays |
US11339430B2 (en) | 2007-07-10 | 2022-05-24 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays |
US7932034B2 (en) | 2006-12-20 | 2011-04-26 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Heat and pH measurement for sequencing of DNA |
JP2010521156A (ja) * | 2007-03-16 | 2010-06-24 | 454 ライフ サイエンシーズ コーポレイション | Hiv薬物耐性バリアントの検出のためのシステムおよび方法 |
US20080243865A1 (en) * | 2007-03-28 | 2008-10-02 | Oracle International Corporation | Maintaining global state of distributed transaction managed by an external transaction manager for clustered database systems |
US20090105959A1 (en) * | 2007-06-01 | 2009-04-23 | Braverman Michael S | System and method for identification of individual samples from a multiplex mixture |
US20110105366A1 (en) * | 2007-06-18 | 2011-05-05 | Illumina, Inc. | Microfabrication methods for the optimal patterning of substrates |
CN101802218A (zh) * | 2007-06-28 | 2010-08-11 | 454生命科学公司 | 在核酸测序中用于自适应试剂控制的系统和方法 |
JP5503540B2 (ja) * | 2007-08-30 | 2014-05-28 | トラスティーズ・オブ・タフツ・カレッジ | 溶液中の分析物濃度を決定する方法 |
MX2010003724A (es) * | 2007-10-04 | 2010-09-14 | Halcyon Molecular | Secuenciacion de polimeros de acido nucleico con microscopia electronica. |
US8951731B2 (en) * | 2007-10-15 | 2015-02-10 | Complete Genomics, Inc. | Sequence analysis using decorated nucleic acids |
US7767441B2 (en) * | 2007-10-25 | 2010-08-03 | Industrial Technology Research Institute | Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules |
US7811810B2 (en) | 2007-10-25 | 2010-10-12 | Industrial Technology Research Institute | Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules |
US8415099B2 (en) | 2007-11-05 | 2013-04-09 | Complete Genomics, Inc. | Efficient base determination in sequencing reactions |
US7897344B2 (en) * | 2007-11-06 | 2011-03-01 | Complete Genomics, Inc. | Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors into library constructs |
US8518640B2 (en) * | 2007-10-29 | 2013-08-27 | Complete Genomics, Inc. | Nucleic acid sequencing and process |
US8617811B2 (en) | 2008-01-28 | 2013-12-31 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions |
US7901890B2 (en) * | 2007-11-05 | 2011-03-08 | Complete Genomics, Inc. | Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors employing selective methylation |
US20090263872A1 (en) * | 2008-01-23 | 2009-10-22 | Complete Genomics Inc. | Methods and compositions for preventing bias in amplification and sequencing reactions |
DK2215209T3 (en) | 2007-10-30 | 2018-09-03 | Complete Genomics Inc | DEVICE FOR HIGH-THROUGHPUT SEQUENCE OF NUCLEIC ACIDS |
WO2009073629A2 (en) | 2007-11-29 | 2009-06-11 | Complete Genomics, Inc. | Efficient shotgun sequencing methods |
US9551026B2 (en) | 2007-12-03 | 2017-01-24 | Complete Genomincs, Inc. | Method for nucleic acid detection using voltage enhancement |
US8592150B2 (en) | 2007-12-05 | 2013-11-26 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for long fragment read sequencing |
EP3561494B1 (en) * | 2007-12-06 | 2022-03-02 | Genalyte, Inc. | METHOD FOR IDENTIFYING A SEQUENCE OF NUCLEOTIDES IN AN UNKNOWN SPECIES OF NUCLEIC ACID 
AND DEVICE FOR CARRYING OUT THE METHOD |
US8815576B2 (en) * | 2007-12-27 | 2014-08-26 | Lawrence Livermore National Security, Llc. | Chip-based sequencing nucleic acids |
US20090181390A1 (en) * | 2008-01-11 | 2009-07-16 | Signosis, Inc. A California Corporation | High throughput detection of micrornas and use for disease diagnosis |
EP2245191A1 (en) | 2008-01-17 | 2010-11-03 | Sequenom, Inc. | Single molecule nucleic acid sequence analysis processes and compositions |
US20090203086A1 (en) * | 2008-02-06 | 2009-08-13 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for improved signal detection in nucleic acid sequencing |
MX2010010600A (es) | 2008-03-28 | 2011-03-30 | Pacific Biosciences California Inc | Composiciones y metodos para secuenciacion de acidos nucleicos. |
GB0809069D0 (en) | 2008-05-19 | 2008-06-25 | Univ Leuven Kath | Gene signatures |
WO2009132028A1 (en) * | 2008-04-21 | 2009-10-29 | Complete Genomics, Inc. | Array structures for nucleic acid detection |
DE102008001322A1 (de) * | 2008-04-22 | 2009-10-29 | Linos Photonics Gmbh & Co. Kg | System zur optischen Analyse von Probenarrays |
US8039817B2 (en) | 2008-05-05 | 2011-10-18 | Illumina, Inc. | Compensator for multiple surface imaging |
EP2294214A2 (en) * | 2008-05-07 | 2011-03-16 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for providing substances to and from an array |
WO2009143603A1 (en) | 2008-05-28 | 2009-12-03 | Genomedx Biosciences, Inc. | Systems and methods for expression-based discrimination of distinct clinical disease states in prostate cancer |
US10407731B2 (en) | 2008-05-30 | 2019-09-10 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Biomarker panels for predicting prostate cancer outcomes |
JP5667049B2 (ja) | 2008-06-25 | 2015-02-12 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 大規模なfetアレイを用いて分析物を測定するための方法および装置 |
CN101368206B (zh) * | 2008-07-16 | 2012-08-22 | 深圳华因康基因科技有限公司 | 测序反应小室、基因测序反应台及基因测序设备 |
WO2010009426A2 (en) * | 2008-07-17 | 2010-01-21 | Life Technologies Corporation | Devices and methods for reagent delivery |
US20100227327A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-09-09 | Xiaoliang Sunney Xie | Methods and compositions for continuous single-molecule nucleic acid sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides |
US20100036110A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-02-11 | Xiaoliang Sunney Xie | Methods and compositions for continuous single-molecule nucleic acid sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides |
US20100035252A1 (en) | 2008-08-08 | 2010-02-11 | Ion Torrent Systems Incorporated | Methods for sequencing individual nucleic acids under tension |
US8583380B2 (en) | 2008-09-05 | 2013-11-12 | Aueon, Inc. | Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options |
US8383345B2 (en) | 2008-09-12 | 2013-02-26 | University Of Washington | Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads |
ES2620012T3 (es) | 2008-09-20 | 2017-06-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Diagnóstico no invasivo de la aneuploidia fetal por secuenciación |
US20100075862A1 (en) * | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Quanterix Corporation | High sensitivity determination of the concentration of analyte molecules or particles in a fluid sample |
US8222047B2 (en) * | 2008-09-23 | 2012-07-17 | Quanterix Corporation | Ultra-sensitive detection of molecules on single molecule arrays |
US20100075439A1 (en) * | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Quanterix Corporation | Ultra-sensitive detection of molecules by capture-and-release using reducing agents followed by quantification |
US20100301398A1 (en) | 2009-05-29 | 2010-12-02 | Ion Torrent Systems Incorporated | Methods and apparatus for measuring analytes |
US20100137143A1 (en) | 2008-10-22 | 2010-06-03 | Ion Torrent Systems Incorporated | Methods and apparatus for measuring analytes |
EP2347247B1 (en) | 2008-10-27 | 2019-06-26 | Genalyte, Inc. | Biosensors based on optical probing and sensing |
US10236078B2 (en) | 2008-11-17 | 2019-03-19 | Veracyte, Inc. | Methods for processing or analyzing a sample of thyroid tissue |
US9495515B1 (en) | 2009-12-09 | 2016-11-15 | Veracyte, Inc. | Algorithms for disease diagnostics |
CN105039523A (zh) * | 2008-11-17 | 2015-11-11 | 威拉赛特公司 | 用于疾病诊断的分子表达谱的方法和组合物 |
WO2010068702A2 (en) * | 2008-12-10 | 2010-06-17 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for hybridizing nucleic acids |
JP2012515533A (ja) * | 2009-01-20 | 2012-07-12 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 診断、予後診断、および創薬ターゲットの同定のための単細胞遺伝子発現の方法 |
US9074258B2 (en) | 2009-03-04 | 2015-07-07 | Genomedx Biosciences Inc. | Compositions and methods for classifying thyroid nodule disease |
US20100285970A1 (en) * | 2009-03-31 | 2010-11-11 | Rose Floyd D | Methods of sequencing nucleic acids |
CA2760439A1 (en) | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Good Start Genetics, Inc. | Methods and compositions for evaluating genetic markers |
US9085798B2 (en) | 2009-04-30 | 2015-07-21 | Prognosys Biosciences, Inc. | Nucleic acid constructs and methods of use |
EP3360978A3 (en) | 2009-05-07 | 2018-09-26 | Veracyte, Inc. | Methods for diagnosis of thyroid conditions |
US20120261274A1 (en) | 2009-05-29 | 2012-10-18 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes |
US8574835B2 (en) | 2009-05-29 | 2013-11-05 | Life Technologies Corporation | Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using |
US8776573B2 (en) | 2009-05-29 | 2014-07-15 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes |
US8673627B2 (en) | 2009-05-29 | 2014-03-18 | Life Technologies Corporation | Apparatus and methods for performing electrochemical reactions |
US9524369B2 (en) | 2009-06-15 | 2016-12-20 | Complete Genomics, Inc. | Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data |
EP2280080A1 (en) * | 2009-07-31 | 2011-02-02 | Qiagen GmbH | Method of normalized quantification of nucleic acids using anchor oligonucleotides and adapter oligonucleotides |
CN102858995B (zh) | 2009-09-10 | 2016-10-26 | 森特瑞隆技术控股公司 | 靶向测序方法 |
US10174368B2 (en) * | 2009-09-10 | 2019-01-08 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Methods and systems for sequencing long nucleic acids |
AU2010351560C1 (en) | 2009-09-23 | 2015-10-08 | Celmatix Inc. | Methods and devices for assessing infertility and/or egg quality |
JP2013509883A (ja) | 2009-11-06 | 2013-03-21 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 臓器移植患者における移植片拒絶反応の非侵襲的診断方法 |
US8772016B2 (en) | 2009-11-13 | 2014-07-08 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Sealed chip package |
US10446272B2 (en) | 2009-12-09 | 2019-10-15 | Veracyte, Inc. | Methods and compositions for classification of samples |
US20110312503A1 (en) | 2010-01-23 | 2011-12-22 | Artemis Health, Inc. | Methods of fetal abnormality detection |
WO2011094865A1 (en) * | 2010-02-02 | 2011-08-11 | Arash Zarrine-Afsar | Fluid sampling device and method of use thereof |
WO2011103421A1 (en) | 2010-02-18 | 2011-08-25 | Shuber Anthony P | Compositions and methods for treating cancer |
US8415171B2 (en) * | 2010-03-01 | 2013-04-09 | Quanterix Corporation | Methods and systems for extending dynamic range in assays for the detection of molecules or particles |
US9678068B2 (en) * | 2010-03-01 | 2017-06-13 | Quanterix Corporation | Ultra-sensitive detection of molecules using dual detection methods |
ES2544635T3 (es) | 2010-03-01 | 2015-09-02 | Quanterix Corporation | Métodos para extender el rango dinámico en ensayos para la detección de moléculas o partículas |
US8236574B2 (en) | 2010-03-01 | 2012-08-07 | Quanterix Corporation | Ultra-sensitive detection of molecules or particles using beads or other capture objects |
US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
CA2794522C (en) | 2010-04-05 | 2019-11-26 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
WO2011140433A2 (en) | 2010-05-07 | 2011-11-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Measurement and comparison of immune diversity by high-throughput sequencing |
US20110312520A1 (en) | 2010-05-11 | 2011-12-22 | Veracyte, Inc. | Methods and compositions for diagnosing conditions |
US20110287432A1 (en) | 2010-05-21 | 2011-11-24 | 454 Life Science Corporation | System and method for tailoring nucleotide concentration to enzymatic efficiencies in dna sequencing technologies |
EP2952590B1 (en) | 2010-06-11 | 2017-07-26 | Life Technologies Corporation | Alternative nucleotide flows in sequencing-by-synthesis methods |
WO2012003363A1 (en) | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Life Technologies Corporation | Ion-sensing charge-accumulation circuits and methods |
US20120001646A1 (en) | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for testing isfet arrays |
TWI465716B (zh) | 2010-06-30 | 2014-12-21 | Life Technologies Corp | 用於檢測及測量化學反應及化合物之電晶體電路 |
US11307166B2 (en) | 2010-07-01 | 2022-04-19 | Life Technologies Corporation | Column ADC |
JP5876044B2 (ja) | 2010-07-03 | 2016-03-02 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 低濃度ドープドレインを有する化学的感応性センサ |
US8862410B2 (en) | 2010-08-02 | 2014-10-14 | Population Diagnostics, Inc. | Compositions and methods for discovery of causative mutations in genetic disorders |
WO2012024658A2 (en) | 2010-08-20 | 2012-02-23 | IntegenX, Inc. | Integrated analysis system |
WO2012036679A1 (en) | 2010-09-15 | 2012-03-22 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes |
US8483969B2 (en) | 2010-09-17 | 2013-07-09 | Illuminia, Inc. | Variation analysis for multiple templates on a solid support |
US8796036B2 (en) | 2010-09-24 | 2014-08-05 | Life Technologies Corporation | Method and system for delta double sampling |
IN2013MN00522A (ja) | 2010-09-24 | 2015-05-29 | Univ Leland Stanford Junior | |
US8759038B2 (en) | 2010-09-29 | 2014-06-24 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for sequencing nucleic acids |
US20120077716A1 (en) | 2010-09-29 | 2012-03-29 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for producing functionally distinct nucleic acid library ends through use of deoxyinosine |
EP2633470B1 (en) | 2010-10-27 | 2016-10-26 | Life Technologies Corporation | Predictive model for use in sequencing-by-synthesis |
US10273540B2 (en) | 2010-10-27 | 2019-04-30 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatuses for estimating parameters in a predictive model for use in sequencing-by-synthesis |
US9074251B2 (en) | 2011-02-10 | 2015-07-07 | Illumina, Inc. | Linking sequence reads using paired code tags |
EP3266881B1 (en) | 2010-11-05 | 2019-12-25 | Genalyte, Inc. | Optical analyte detection systems and methods of use |
EP2561102A1 (en) | 2010-12-02 | 2013-02-27 | Katholieke Universiteit Leuven K.U. Leuven R&D | Irak-related interventions and diagnosis |
EP3709303A1 (en) | 2010-12-14 | 2020-09-16 | Life Technologies Corporation | Systems and methods for run-time sequencing run quality monitoring |
US9163281B2 (en) | 2010-12-23 | 2015-10-20 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction |
US9594870B2 (en) | 2010-12-29 | 2017-03-14 | Life Technologies Corporation | Time-warped background signal for sequencing-by-synthesis operations |
WO2012092515A2 (en) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, and computer readable media for nucleic acid sequencing |
US20130060482A1 (en) | 2010-12-30 | 2013-03-07 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, and computer readable media for making base calls in nucleic acid sequencing |
WO2012092455A2 (en) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Life Technologies Corporation | Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations |
CN102146442B (zh) * | 2010-12-31 | 2014-10-22 | 深圳华因康基因科技有限公司 | 一种对基因测序仪的测序过程进行控制的方法及系统 |
CN102174384B (zh) * | 2011-01-05 | 2014-04-02 | 深圳华因康基因科技有限公司 | 对基因测序仪的测序及信号处理进行控制的方法及系统 |
WO2012100194A1 (en) | 2011-01-20 | 2012-07-26 | Ibis Biosciences, Inc. | Microfluidic transducer |
US9952237B2 (en) | 2011-01-28 | 2018-04-24 | Quanterix Corporation | Systems, devices, and methods for ultra-sensitive detection of molecules or particles |
WO2012106385A2 (en) | 2011-01-31 | 2012-08-09 | Apprise Bio, Inc. | Methods of identifying multiple epitopes in cells |
EP2670894B1 (en) | 2011-02-02 | 2017-11-29 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Massively parallel continguity mapping |
AU2012225310B2 (en) | 2011-03-09 | 2017-08-03 | Cell Signaling Technology, Inc. | Methods and reagents for creating monoclonal antibodies |
US20120252682A1 (en) | 2011-04-01 | 2012-10-04 | Maples Corporate Services Limited | Methods and systems for sequencing nucleic acids |
EP3878975A1 (en) | 2011-04-08 | 2021-09-15 | Life Technologies Corporation | Phase-protecting reagent flow orderings for use in sequencing-by-synthesis |
WO2012142301A2 (en) | 2011-04-12 | 2012-10-18 | Quanterix Corporation | Methods of determining a treatment protocol for and/or a prognosis of a patients recovery from a brain injury |
GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
EP2697397B1 (en) | 2011-04-15 | 2017-04-05 | The Johns Hopkins University | Safe sequencing system |
US8778848B2 (en) | 2011-06-09 | 2014-07-15 | Illumina, Inc. | Patterned flow-cells useful for nucleic acid analysis |
US10704164B2 (en) | 2011-08-31 | 2020-07-07 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, computer readable media, and kits for sample identification |
DE102011054101A1 (de) | 2011-09-30 | 2013-04-04 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Verfahren zur räumlichen Anordnung von Probenfragmenten zur Amplifikation und Immobilisierung für weitere Derivatisierungen |
DK2766483T3 (da) | 2011-10-10 | 2022-04-19 | Hospital For Sick Children | Fremgangsmåder og sammensætninger til screening for og behandling af udviklingsforstyrrelser |
WO2013058907A1 (en) | 2011-10-17 | 2013-04-25 | Good Start Genetics, Inc. | Analysis methods |
US9206418B2 (en) | 2011-10-19 | 2015-12-08 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing |
US20150136604A1 (en) | 2011-10-21 | 2015-05-21 | Integenx Inc. | Sample preparation, processing and analysis systems |
US10865440B2 (en) | 2011-10-21 | 2020-12-15 | IntegenX, Inc. | Sample preparation, processing and analysis systems |
CA2856163C (en) | 2011-10-28 | 2019-05-07 | Illumina, Inc. | Microarray fabrication system and method |
DE102011085473A1 (de) | 2011-10-28 | 2013-05-02 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Verfahren zur Identifikation von Aptameren |
US10837879B2 (en) | 2011-11-02 | 2020-11-17 | Complete Genomics, Inc. | Treatment for stabilizing nucleic acid arrays |
EP2773779B1 (en) | 2011-11-04 | 2020-10-14 | Population Bio, Inc. | Methods and compositions for diagnosing, prognosing, and treating neurological conditions |
EP3836149A1 (en) | 2011-11-07 | 2021-06-16 | QIAGEN Redwood City, Inc. | Methods and systems for identification of causal genomic variants |
US9970984B2 (en) | 2011-12-01 | 2018-05-15 | Life Technologies Corporation | Method and apparatus for identifying defects in a chemical sensor array |
WO2013090620A1 (en) | 2011-12-13 | 2013-06-20 | Genomedx Biosciences, Inc. | Cancer diagnostics using non-coding transcripts |
JP6093498B2 (ja) * | 2011-12-13 | 2017-03-08 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸増幅方法 |
US9823246B2 (en) | 2011-12-28 | 2017-11-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescence enhancing plasmonic nanoscopic gold films and assays based thereon |
EP2802666B1 (en) | 2012-01-13 | 2018-09-19 | Data2Bio | Genotyping by next-generation sequencing |
US8821798B2 (en) | 2012-01-19 | 2014-09-02 | Life Technologies Corporation | Titanium nitride as sensing layer for microwell structure |
US8747748B2 (en) | 2012-01-19 | 2014-06-10 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with conductive cup-shaped sensor surface |
CN105861487B (zh) | 2012-01-26 | 2020-05-05 | 纽亘技术公司 | 用于靶向核酸序列富集和高效文库产生的组合物和方法 |
DK2812452T3 (da) | 2012-02-09 | 2020-06-29 | Population Bio Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger til screening og behandling af udviklingsforstyrrelser |
RS61631B1 (sr) | 2012-02-17 | 2021-04-29 | Hutchinson Fred Cancer Res | Kompozicije i postupci za preciznu identifikaciju mutacija |
US9803239B2 (en) | 2012-03-29 | 2017-10-31 | Complete Genomics, Inc. | Flow cells for high density array chips |
US8209130B1 (en) | 2012-04-04 | 2012-06-26 | Good Start Genetics, Inc. | Sequence assembly |
US8812422B2 (en) | 2012-04-09 | 2014-08-19 | Good Start Genetics, Inc. | Variant database |
US20130274148A1 (en) | 2012-04-11 | 2013-10-17 | Illumina, Inc. | Portable genetic detection and analysis system and method |
US8906320B1 (en) * | 2012-04-16 | 2014-12-09 | Illumina, Inc. | Biosensors for biological or chemical analysis and systems and methods for same |
US10227635B2 (en) | 2012-04-16 | 2019-03-12 | Molecular Loop Biosolutions, Llc | Capture reactions |
EP2659977B1 (en) * | 2012-05-02 | 2019-04-24 | IMEC vzw | Microfluidics system for sequencing |
US9487828B2 (en) | 2012-05-10 | 2016-11-08 | The General Hospital Corporation | Methods for determining a nucleotide sequence contiguous to a known target nucleotide sequence |
US9646132B2 (en) | 2012-05-11 | 2017-05-09 | Life Technologies Corporation | Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations |
US10192024B2 (en) | 2012-05-18 | 2019-01-29 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for generation and use of optimal nucleotide flow orders |
CN102703311B (zh) * | 2012-05-24 | 2013-08-21 | 中国科学院北京基因组研究所 | 用于dna测序仪的自适应调整的反应仓 |
CN102703301A (zh) * | 2012-05-24 | 2012-10-03 | 中国科学院北京基因组研究所 | 用于测序芯片的安装座与ccd相机间的暗室 |
CN102703302B (zh) * | 2012-05-24 | 2013-11-27 | 中国科学院北京基因组研究所 | 自动卡持测序芯片的安装座 |
CN102703310B (zh) * | 2012-05-24 | 2013-10-16 | 中国科学院北京基因组研究所 | 与测序芯片直接耦合的ccd相机 |
US8786331B2 (en) | 2012-05-29 | 2014-07-22 | Life Technologies Corporation | System for reducing noise in a chemical sensor array |
US9012022B2 (en) | 2012-06-08 | 2015-04-21 | Illumina, Inc. | Polymer coatings |
US8895249B2 (en) | 2012-06-15 | 2014-11-25 | Illumina, Inc. | Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries |
DE102012210183B4 (de) * | 2012-06-18 | 2017-03-23 | Siemens Healthcare Gmbh | Anordnung und Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen |
SG11201408478QA (en) | 2012-06-18 | 2015-02-27 | Nugen Technologies Inc | Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences |
US20150011396A1 (en) | 2012-07-09 | 2015-01-08 | Benjamin G. Schroeder | Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing |
WO2014026032A2 (en) | 2012-08-08 | 2014-02-13 | Apprise Bio, Inc. | Increasing dynamic range for identifying multiple epitopes in cells |
CA2881627A1 (en) | 2012-08-16 | 2014-02-20 | Genomedx Biosciences Inc. | Cancer diagnostics using biomarkers |
CN103092090B (zh) * | 2012-09-14 | 2015-04-08 | 盛司潼 | 一种测序控制系统 |
EP2895621B1 (en) | 2012-09-14 | 2020-10-21 | Population Bio, Inc. | Methods and compositions for diagnosing, prognosing, and treating neurological conditions |
EP2900835A4 (en) | 2012-09-27 | 2016-05-11 | Population Diagnotics Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING AND TREATING DEVELOPMENTAL DISORDERS |
US10329608B2 (en) | 2012-10-10 | 2019-06-25 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, and computer readable media for repeat sequencing |
US9177098B2 (en) | 2012-10-17 | 2015-11-03 | Celmatix Inc. | Systems and methods for determining the probability of a pregnancy at a selected point in time |
US10162800B2 (en) | 2012-10-17 | 2018-12-25 | Celmatix Inc. | Systems and methods for determining the probability of a pregnancy at a selected point in time |
US9181583B2 (en) | 2012-10-23 | 2015-11-10 | Illumina, Inc. | HLA typing using selective amplification and sequencing |
ES2886507T3 (es) | 2012-10-29 | 2021-12-20 | Univ Johns Hopkins | Prueba de Papanicolaou para cánceres de ovario y de endometrio |
US9836577B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-12-05 | Celmatix, Inc. | Methods and devices for assessing risk of female infertility |
EP2746405B1 (en) | 2012-12-23 | 2015-11-04 | HS Diagnomics GmbH | Methods and primer sets for high throughput PCR sequencing |
US9080968B2 (en) | 2013-01-04 | 2015-07-14 | Life Technologies Corporation | Methods and systems for point of use removal of sacrificial material |
US9841398B2 (en) | 2013-01-08 | 2017-12-12 | Life Technologies Corporation | Methods for manufacturing well structures for low-noise chemical sensors |
US9683230B2 (en) | 2013-01-09 | 2017-06-20 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation on a solid support |
WO2014113502A1 (en) | 2013-01-15 | 2014-07-24 | Quanterix Corporation | Detection of dna or rna using single molecule arrays and other techniques |
EP2946345B1 (en) | 2013-01-17 | 2024-04-03 | Personalis, Inc. | Methods and systems for genetic analysis |
WO2014116729A2 (en) | 2013-01-22 | 2014-07-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Haplotying of hla loci with ultra-deep shotgun sequencing |
US8962366B2 (en) | 2013-01-28 | 2015-02-24 | Life Technologies Corporation | Self-aligned well structures for low-noise chemical sensors |
WO2014121091A1 (en) | 2013-02-01 | 2014-08-07 | The Regents Of The University Of California | Methods for genome assembly and haplotype phasing |
US9411930B2 (en) | 2013-02-01 | 2016-08-09 | The Regents Of The University Of California | Methods for genome assembly and haplotype phasing |
US9512422B2 (en) | 2013-02-26 | 2016-12-06 | Illumina, Inc. | Gel patterned surfaces |
US8963216B2 (en) | 2013-03-13 | 2015-02-24 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with sidewall spacer sensor surface |
US8841217B1 (en) | 2013-03-13 | 2014-09-23 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with protruded sensor surface |
ES2887177T3 (es) | 2013-03-13 | 2021-12-22 | Illumina Inc | Método de preparación de una biblioteca de secuenciación de ácidos nucleicos |
US20140296080A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Life Technologies Corporation | Methods, Systems, and Computer Readable Media for Evaluating Variant Likelihood |
WO2014152421A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for analyzing nucleic acids |
US10421996B2 (en) | 2013-03-14 | 2019-09-24 | Illumina, Inc. | Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues |
BR112015022490A2 (pt) | 2013-03-15 | 2017-07-18 | Veracyte Inc | métodos e composições para classificação de amostras |
JP6671274B2 (ja) | 2013-03-15 | 2020-03-25 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 薄伝導性素子を有する化学装置 |
CN105283758B (zh) | 2013-03-15 | 2018-06-05 | 生命科技公司 | 具有一致传感器表面区域的化学传感器 |
US20140274747A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Illumina, Inc. | Super resolution imaging |
US11976329B2 (en) | 2013-03-15 | 2024-05-07 | Veracyte, Inc. | Methods and systems for detecting usual interstitial pneumonia |
EP2971152B1 (en) | 2013-03-15 | 2018-08-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Identification and use of circulating nucleic acid tumor markers |
US9822408B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-11-21 | Nugen Technologies, Inc. | Sequential sequencing |
US9193998B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-11-24 | Illumina, Inc. | Super resolution imaging |
EP3388442A1 (en) | 2013-03-15 | 2018-10-17 | Illumina Cambridge Limited | Modified nucleosides or nucleotides |
US9835585B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-12-05 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with protruded sensor surface |
US9116117B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-08-25 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with sidewall sensor surface |
WO2014149780A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with consistent sensor surface areas |
DK2970959T3 (en) | 2013-03-15 | 2018-08-06 | Lineage Biosciences Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR MARKING AND ANALYSIS OF SAMPLES |
US9983206B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-05-29 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Methods and compositions for enhancing immunoassays |
US20140336063A1 (en) | 2013-05-09 | 2014-11-13 | Life Technologies Corporation | Windowed Sequencing |
EP3005200A2 (en) | 2013-06-03 | 2016-04-13 | Good Start Genetics, Inc. | Methods and systems for storing sequence read data |
US10458942B2 (en) | 2013-06-10 | 2019-10-29 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor array having multiple sensors per well |
US9879313B2 (en) | 2013-06-25 | 2018-01-30 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
TR201816438T4 (tr) | 2013-07-01 | 2018-11-21 | Illumina Inc | Katalizörsüz yüzey işlevselleştirme ve polimer aşılama. |
US9926597B2 (en) | 2013-07-26 | 2018-03-27 | Life Technologies Corporation | Control nucleic acid sequences for use in sequencing-by-synthesis and methods for designing the same |
TWI646230B (zh) | 2013-08-05 | 2019-01-01 | 扭轉生物科技有限公司 | 重新合成之基因庫 |
EP3039161B1 (en) | 2013-08-30 | 2021-10-06 | Personalis, Inc. | Methods and systems for genomic analysis |
CN105916689A (zh) | 2013-08-30 | 2016-08-31 | Illumina公司 | 在亲水性或斑驳亲水性表面上的微滴操纵 |
SG11201600645SA (en) | 2013-09-05 | 2016-03-30 | Jackson Lab | Compositions for rna-chromatin interaction analysis and uses thereof |
US9352315B2 (en) | 2013-09-27 | 2016-05-31 | Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. | Method to produce chemical pattern in micro-fluidic structure |
GB2535066A (en) | 2013-10-03 | 2016-08-10 | Personalis Inc | Methods for analyzing genotypes |
WO2015051338A1 (en) | 2013-10-04 | 2015-04-09 | Life Technologies Corporation | Methods and systems for modeling phasing effects in sequencing using termination chemistry |
WO2015057565A1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-23 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for assessing a genomic region of a subject |
US10851414B2 (en) | 2013-10-18 | 2020-12-01 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for determining carrier status |
IL285106B (en) | 2013-11-07 | 2022-09-01 | Univ Leland Stanford Junior | Clean nucleic acids are suitable for analyzing the human microbiome and its parts |
EP2891722B1 (en) | 2013-11-12 | 2018-10-10 | Population Bio, Inc. | Methods and compositions for diagnosing, prognosing, and treating endometriosis |
CA2929596C (en) | 2013-11-13 | 2022-07-05 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read |
CN110560187B (zh) | 2013-11-18 | 2022-01-11 | 尹特根埃克斯有限公司 | 用于样本分析的卡盒和仪器 |
EP3628747B1 (en) | 2013-12-05 | 2022-10-05 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Fabrication of patterned arrays |
EP3077545B1 (en) | 2013-12-05 | 2020-09-16 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Methods for sequencing nucleic acids |
US10385335B2 (en) | 2013-12-05 | 2019-08-20 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Modified surfaces |
US11091758B2 (en) | 2013-12-11 | 2021-08-17 | The Regents Of The University Of California | Methods for labeling DNAa fragments to reconstruct physical linkage and phase |
EP3957750A1 (en) | 2013-12-20 | 2022-02-23 | Illumina, Inc. | Preserving genomic connectivity information in fragmented genomic dna samples |
WO2015100373A2 (en) | 2013-12-23 | 2015-07-02 | Illumina, Inc. | Structured substrates for improving detection of light emissions and methods relating to the same |
AU2014377537B2 (en) | 2014-01-16 | 2021-02-25 | Illumina, Inc. | Amplicon preparation and sequencing on solid supports |
US9677132B2 (en) | 2014-01-16 | 2017-06-13 | Illumina, Inc. | Polynucleotide modification on solid support |
CN106661612A (zh) | 2014-01-27 | 2017-05-10 | 通用医疗公司 | 制备用于测序的核酸的方法 |
US20150211061A1 (en) * | 2014-01-27 | 2015-07-30 | The General Hospital Corporation | Methods for determining a nucleotide sequence |
EP3110973B1 (en) | 2014-02-27 | 2019-02-06 | Katholieke Universiteit Leuven | Oxidative stress and cardiovascular disease events |
US10704097B2 (en) | 2014-02-27 | 2020-07-07 | Katholieke Universiteit Leuven | Oxidative stress and cardiovascular disease events |
US9745614B2 (en) | 2014-02-28 | 2017-08-29 | Nugen Technologies, Inc. | Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors |
US11060139B2 (en) | 2014-03-28 | 2021-07-13 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Methods for sequencing nucleic acids |
SG11201608486SA (en) * | 2014-04-11 | 2016-11-29 | Redvault Biosciences Lp | Systems and methods for clonal replication and amplification of nucleic acid molecules for genomic and therapeutic applications |
US11053548B2 (en) | 2014-05-12 | 2021-07-06 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for detecting aneuploidy |
US10208332B2 (en) | 2014-05-21 | 2019-02-19 | Integenx Inc. | Fluidic cartridge with valve mechanism |
CA3172086A1 (en) | 2014-06-13 | 2015-12-17 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for preparing sequencing libraries |
US10017759B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-07-10 | Illumina, Inc. | Library preparation of tagged nucleic acid |
EP3161154B1 (en) | 2014-06-27 | 2020-04-15 | Illumina, Inc. | Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues |
DK3161152T3 (en) | 2014-06-30 | 2019-03-25 | Illumina Inc | Methods and compositions using one-sided transposition |
US10208350B2 (en) | 2014-07-17 | 2019-02-19 | Celmatix Inc. | Methods and systems for assessing infertility and related pathologies |
WO2016014409A1 (en) | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Illumina, Inc. | Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems |
CA2956925C (en) | 2014-08-01 | 2024-02-13 | Dovetail Genomics, Llc | Tagging nucleic acids for sequence assembly |
US10102337B2 (en) | 2014-08-06 | 2018-10-16 | Nugen Technologies, Inc. | Digital measurements from targeted sequencing |
GB201414098D0 (en) | 2014-08-08 | 2014-09-24 | Illumina Cambridge Ltd | Modified nucleotide linkers |
CN106796212A (zh) | 2014-08-12 | 2017-05-31 | 新生代吉恩公司 | 用于基于收集的体液而监测健康的系统和方法 |
CN107076739B (zh) | 2014-08-21 | 2018-12-25 | 伊卢米纳剑桥有限公司 | 可逆表面官能化 |
CA2996445A1 (en) | 2014-09-05 | 2016-03-10 | Eli Hatchwell | Methods and compositions for inhibiting and treating neurological conditions |
WO2016040446A1 (en) | 2014-09-10 | 2016-03-17 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for selectively suppressing non-target sequences |
WO2016040607A1 (en) | 2014-09-12 | 2016-03-17 | Illumina, Inc. | Compositions, systems, and methods for detecting the presence of polymer subunits using chemiluminescence |
CA2999708A1 (en) | 2014-09-24 | 2016-03-31 | Good Start Genetics, Inc. | Process control for increased robustness of genetic assays |
ES2747227T3 (es) | 2014-09-30 | 2020-03-10 | Illumina Inc | Polimerasas modificadas para la incorporación mejorada de análogos de nucleótidos |
US10676787B2 (en) | 2014-10-13 | 2020-06-09 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, and computer-readable media for accelerated base calling |
AU2014409073B2 (en) * | 2014-10-14 | 2019-04-04 | Bgi Shenzhen Co., Limited | Linker element and method of using same to construct sequencing library |
BR112017007912A2 (pt) | 2014-10-17 | 2018-01-23 | Illumina Cambridge Limited | transposon de preservação de contiguidade |
EP3209410A4 (en) | 2014-10-22 | 2018-05-02 | IntegenX Inc. | Systems and methods for sample preparation, processing and analysis |
EP3212808B1 (en) | 2014-10-30 | 2022-03-02 | Personalis, Inc. | Methods for using mosaicism in nucleic acids sampled distal to their origin |
WO2016066586A1 (en) | 2014-10-31 | 2016-05-06 | Illumina Cambridge Limited | Novel polymers and dna copolymer coatings |
CN111024936A (zh) | 2014-11-05 | 2020-04-17 | 纳迈达斯生物科技中心 | 用于增强成像的金属复合物 |
CN114606309A (zh) | 2014-11-05 | 2022-06-10 | 威拉赛特公司 | 使用机器学习和高维转录数据的诊断系统和方法 |
CA2967351A1 (en) | 2014-11-11 | 2016-05-19 | Illumina, Inc. | Polynucleotide amplification using crispr-cas systems |
WO2016081712A1 (en) | 2014-11-19 | 2016-05-26 | Bigdatabio, Llc | Systems and methods for genomic manipulations and analysis |
KR101750464B1 (ko) * | 2014-11-28 | 2017-06-28 | 케이맥바이오센터주식회사 | 바이오물질의 실시간 정량 및 정성 분석을 위한 프로브 시스템, 상기 프로브 시스템을 구비한 반응용기 및 이를 이용한 분석 방법 |
CN111505087A (zh) | 2014-12-18 | 2020-08-07 | 生命科技公司 | 使用大规模 fet 阵列测量分析物的方法和装置 |
US10077472B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-09-18 | Life Technologies Corporation | High data rate integrated circuit with power management |
TWI756167B (zh) | 2014-12-18 | 2022-03-01 | 美商生命技術公司 | 積體電路裝置、感測器裝置及積體電路 |
JP6806683B2 (ja) | 2014-12-19 | 2021-01-06 | ヴリジェ ユニヴェルシテ ブリュッセル | 哺乳動物の卵丘細胞卵母細胞複合体の体外成熟 |
CA3010579A1 (en) | 2015-01-06 | 2016-07-14 | Good Start Genetics, Inc. | Screening for structural variants |
WO2016125236A1 (ja) | 2015-02-02 | 2016-08-11 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 多色蛍光分析装置 |
CA2975852A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Twist Bioscience Corporation | Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly |
CA2975855A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Twist Bioscience Corporation | Compositions and methods for synthetic gene assembly |
WO2016134034A1 (en) | 2015-02-17 | 2016-08-25 | Dovetail Genomics Llc | Nucleic acid sequence assembly |
CN112326557A (zh) * | 2015-03-24 | 2021-02-05 | 伊鲁米那股份有限公司 | 对样品成像用于生物或化学分析的方法、载体组件和系统 |
US11807896B2 (en) | 2015-03-26 | 2023-11-07 | Dovetail Genomics, Llc | Physical linkage preservation in DNA storage |
EP4119677B1 (en) | 2015-04-10 | 2023-06-28 | Spatial Transcriptomics AB | Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens |
CN112229834A (zh) | 2015-04-14 | 2021-01-15 | 亿明达股份有限公司 | 用于改进对光发射的检测的结构化基底及涉及其的方法 |
US9981239B2 (en) | 2015-04-21 | 2018-05-29 | Twist Bioscience Corporation | Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis |
US11085073B2 (en) | 2015-04-24 | 2021-08-10 | Qiagen Gmbh | Method for immobilizing a nucleic acid molecule on a solid support |
US11220705B2 (en) | 2015-04-24 | 2022-01-11 | Qiagen Gmbh | Method for immobilizing a nucleic acid molecule on solid support |
KR102333255B1 (ko) | 2015-05-11 | 2021-12-01 | 일루미나, 인코포레이티드 | 치료제의 발견 및 분석을 위한 플랫폼 |
EP3295345B1 (en) | 2015-05-14 | 2023-01-25 | Life Technologies Corporation | Barcode sequences, and related systems and methods |
EP3103885B1 (en) | 2015-06-09 | 2019-01-30 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Methods for sequencing nucleic acids |
US10344336B2 (en) | 2015-06-09 | 2019-07-09 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, compositions, kits, apparatus and computer-readable media for molecular tagging |
CN107924121B (zh) | 2015-07-07 | 2021-06-08 | 亿明达股份有限公司 | 经由纳米压印的选择性表面图案化 |
WO2017015018A1 (en) | 2015-07-17 | 2017-01-26 | Illumina, Inc. | Polymer sheets for sequencing applications |
US11214829B2 (en) | 2015-07-23 | 2022-01-04 | Asuragen, Inc. | Methods, compositions, kits, and uses for analysis of nucleic acids comprising repeating A/T-rich segments |
WO2017024138A1 (en) | 2015-08-06 | 2017-02-09 | Arc Bio, Llc | Systems and methods for genomic analysis |
WO2017027653A1 (en) | 2015-08-11 | 2017-02-16 | The Johns Hopkins University | Assaying ovarian cyst fluid |
EP3344389B1 (en) | 2015-09-02 | 2020-06-10 | Illumina Cambridge Limited | Method of fixing defects in a hydrophobic surface of a droplet actuator |
CA2998169A1 (en) | 2015-09-18 | 2017-03-23 | Twist Bioscience Corporation | Oligonucleic acid variant libraries and synthesis thereof |
CN108698012A (zh) | 2015-09-22 | 2018-10-23 | 特韦斯特生物科学公司 | 用于核酸合成的柔性基底 |
AU2016341198B2 (en) | 2015-10-19 | 2023-03-09 | Dovetail Genomics, Llc | Methods for genome assembly, haplotype phasing, and target independent nucleic acid detection |
EP3384077A4 (en) | 2015-12-01 | 2019-05-08 | Twist Bioscience Corporation | FUNCTIONALIZED SURFACES AND THEIR PREPARATION |
WO2017127670A1 (en) | 2016-01-22 | 2017-07-27 | Purdue Research Foundation | Charged mass labeling system |
FR3047251A1 (fr) * | 2016-02-02 | 2017-08-04 | Dna Script | Installation pour la mise en œuvre d'un procede de synthese enzymatique d'acides nucleiques |
US10975417B2 (en) | 2016-02-23 | 2021-04-13 | Dovetail Genomics, Llc | Generation of phased read-sets for genome assembly and haplotype phasing |
EP3978627A1 (en) | 2016-03-25 | 2022-04-06 | Karius, Inc. | Methods using synthetic nucleic acid spike-ins |
EP3377226B1 (en) | 2016-03-28 | 2021-02-17 | Illumina, Inc. | Multi-plane microarrays |
WO2017180871A1 (en) | 2016-04-13 | 2017-10-19 | Purdue Research Foundation | Systems and methods for isolating a target in an ion trap |
WO2017180909A1 (en) | 2016-04-13 | 2017-10-19 | Nextgen Jane, Inc. | Sample collection and preservation devices, systems and methods |
US10619205B2 (en) | 2016-05-06 | 2020-04-14 | Life Technologies Corporation | Combinatorial barcode sequences, and related systems and methods |
WO2017197027A1 (en) | 2016-05-11 | 2017-11-16 | Illumina, Inc. | Polynucleotide enrichment and amplification using argonaute systems |
JP7497976B2 (ja) | 2016-05-13 | 2024-06-11 | ダブテイル ゲノミクス エルエルシー | 保存されたサンプルからの長距離連鎖情報の回復 |
US11299783B2 (en) | 2016-05-27 | 2022-04-12 | Personalis, Inc. | Methods and systems for genetic analysis |
CN107619859A (zh) * | 2016-07-13 | 2018-01-23 | 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 | 基因测序反应装置 |
KR102212257B1 (ko) | 2016-08-22 | 2021-02-04 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 드 노보 합성된 핵산 라이브러리 |
CN109890198A (zh) | 2016-08-22 | 2019-06-14 | 拜欧卢米克有限公司 | 种子处理系统、装置和方法 |
WO2018039490A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | Genomedx Biosciences, Inc. | Use of genomic signatures to predict responsiveness of patients with prostate cancer to post-operative radiation therapy |
WO2018053362A1 (en) | 2016-09-15 | 2018-03-22 | ArcherDX, Inc. | Methods of nucleic acid sample preparation |
AU2017328953B2 (en) | 2016-09-15 | 2023-09-14 | Archerdx, Llc | Methods of nucleic acid sample preparation for analysis of cell-free DNA |
US10417457B2 (en) | 2016-09-21 | 2019-09-17 | Twist Bioscience Corporation | Nucleic acid based data storage |
EP4361287A2 (en) | 2016-09-28 | 2024-05-01 | Life Technologies Corporation | Methods for sequencing nucleic acids using termination chemistry |
US10190155B2 (en) | 2016-10-14 | 2019-01-29 | Nugen Technologies, Inc. | Molecular tag attachment and transfer |
US11725232B2 (en) | 2016-10-31 | 2023-08-15 | The Hong Kong University Of Science And Technology | Compositions, methods and kits for detection of genetic variants for alzheimer's disease |
US10907274B2 (en) | 2016-12-16 | 2021-02-02 | Twist Bioscience Corporation | Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof |
EP3559269B1 (en) * | 2016-12-20 | 2020-09-16 | F. Hoffmann-La Roche AG | Single stranded circular dna libraries for circular consensus sequencing |
HUE059673T2 (hu) | 2017-01-04 | 2022-12-28 | Mgi Tech Co Ltd | Nukleinsav-szekvenálás affinitási reagensek felhasználásával |
GB201704754D0 (en) | 2017-01-05 | 2017-05-10 | Illumina Inc | Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries |
AU2018210695A1 (en) | 2017-01-20 | 2019-08-08 | The University Of British Columbia | Molecular subtyping, prognosis, and treatment of bladder cancer |
WO2018137826A1 (en) | 2017-01-26 | 2018-08-02 | Qiagen Gmbh | Method for enriching template nucleic acids |
US10240205B2 (en) | 2017-02-03 | 2019-03-26 | Population Bio, Inc. | Methods for assessing risk of developing a viral disease using a genetic test |
US11550939B2 (en) | 2017-02-22 | 2023-01-10 | Twist Bioscience Corporation | Nucleic acid based data storage using enzymatic bioencryption |
WO2018165600A1 (en) | 2017-03-09 | 2018-09-13 | Genomedx Biosciences, Inc. | Subtyping prostate cancer to predict response to hormone therapy |
US10894959B2 (en) | 2017-03-15 | 2021-01-19 | Twist Bioscience Corporation | Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof |
WO2018183942A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Grail, Inc. | Improved library preparation and use thereof for sequencing-based error correction and/or variant identification |
CA3059370C (en) | 2017-04-12 | 2022-05-10 | Karius, Inc. | Methods for concurrent analysis of dna and rna in mixed samples |
US20210371918A1 (en) | 2017-04-18 | 2021-12-02 | Dovetail Genomics, Llc | Nucleic acid characteristics as guides for sequence assembly |
US11078542B2 (en) | 2017-05-12 | 2021-08-03 | Decipher Biosciences, Inc. | Genetic signatures to predict prostate cancer metastasis and identify tumor aggressiveness |
US20200165662A1 (en) * | 2017-05-12 | 2020-05-28 | Seoul National University R&Db Foundation | Method and apparatus for capturing high-purity nucleotides |
EP3638782A4 (en) | 2017-06-12 | 2021-03-17 | Twist Bioscience Corporation | SEALLESS NUCLEIC ACID ASSEMBLY METHODS |
WO2018231864A1 (en) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
US11542540B2 (en) | 2017-06-16 | 2023-01-03 | Life Technologies Corporation | Control nucleic acids, and compositions, kits, and uses thereof |
EP3642358A1 (en) | 2017-06-21 | 2020-04-29 | Bluedot LLC | Systems and methods for identification of nucleic acids in a sample |
US11217329B1 (en) | 2017-06-23 | 2022-01-04 | Veracyte, Inc. | Methods and systems for determining biological sample integrity |
KR102480894B1 (ko) | 2017-08-01 | 2022-12-23 | 일루미나, 인코포레이티드 | 뉴클레오티드 서열분석용 하이드로겔 비드 |
WO2019038594A2 (en) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | Biolumic Limited | TRANSGENIC PLANTS WITH HIGH GROWTH AND HIGH RUSTICITY |
CN111566125A (zh) | 2017-09-11 | 2020-08-21 | 特韦斯特生物科学公司 | Gpcr结合蛋白及其合成 |
WO2019060716A1 (en) | 2017-09-25 | 2019-03-28 | Freenome Holdings, Inc. | SAMPLE EXTRACTION METHODS AND SYSTEMS |
US11099202B2 (en) | 2017-10-20 | 2021-08-24 | Tecan Genomics, Inc. | Reagent delivery system |
KR20240024357A (ko) | 2017-10-20 | 2024-02-23 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 가열된 나노웰 |
WO2019086531A1 (en) * | 2017-11-03 | 2019-05-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Linear consensus sequencing |
MY194772A (en) | 2017-12-26 | 2022-12-15 | Illumina Inc | Sensor System |
US10936953B2 (en) | 2018-01-04 | 2021-03-02 | Twist Bioscience Corporation | DNA-based digital information storage with sidewall electrodes |
WO2019152543A1 (en) | 2018-01-31 | 2019-08-08 | Dovetail Genomics, Llc | Sample prep for dna linkage recovery |
WO2019160820A1 (en) | 2018-02-13 | 2019-08-22 | Illumina, Inc. | Dna sequencing using hydrogel beads |
EP3765592A4 (en) | 2018-03-16 | 2021-12-08 | Karius Inc. | SERIES OF SAMPLES TO DIFFERENTIATE TARGET NUCLEIC ACIDS FROM CONTAMINATING NUCLEIC ACIDS |
EP3553182A1 (en) | 2018-04-11 | 2019-10-16 | Université de Bourgogne | Detection method of somatic genetic anomalies, combination of capture probes and kit of detection |
BR112019028109A2 (pt) | 2018-04-20 | 2020-07-28 | Illumina, Inc. | métodos de encapsular células individuais, as células encapsuladas e seus usos |
CN108765247B (zh) * | 2018-05-15 | 2023-01-10 | 腾讯科技(深圳)有限公司 | 图像处理方法、装置、存储介质及设备 |
EP3814497A4 (en) | 2018-05-18 | 2022-03-02 | Twist Bioscience Corporation | POLYNUCLEOTIDES, REAGENTS, AND METHODS FOR NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION |
US10801064B2 (en) | 2018-05-31 | 2020-10-13 | Personalis, Inc. | Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples |
US11814750B2 (en) | 2018-05-31 | 2023-11-14 | Personalis, Inc. | Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples |
WO2019238939A1 (en) | 2018-06-15 | 2019-12-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | A system for identification of antigens recognized by t cell receptors expressed on tumor infiltrating lymphocytes |
EP3625368B8 (en) | 2018-08-08 | 2022-12-14 | PML Screening, LLC | Methods for assessing the risk of developing progressive multifocal leukoencephalopathy caused by john cunningham virus by genetic testing |
WO2020047005A1 (en) | 2018-08-28 | 2020-03-05 | 10X Genomics, Inc. | Resolving spatial arrays |
CN113286893A (zh) | 2018-08-28 | 2021-08-20 | 10X基因组学股份有限公司 | 生成阵列的方法 |
US11519033B2 (en) | 2018-08-28 | 2022-12-06 | 10X Genomics, Inc. | Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample |
SG11202102703VA (en) | 2018-10-26 | 2021-04-29 | Illumina Inc | Modulating polymer beads for dna processing |
SG11202012493WA (en) | 2018-10-31 | 2021-01-28 | Illumina Inc | Polymerases, compositions, and methods of use |
CN112867801A (zh) | 2018-11-30 | 2021-05-28 | Illumina公司 | 使用单一测定分析多种分析物 |
KR20210098844A (ko) | 2018-12-05 | 2021-08-11 | 일루미나, 인코포레이티드 | 중합효소, 조성물, 및 사용 방법 |
WO2020114918A1 (en) | 2018-12-05 | 2020-06-11 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for cluster generation by bridge amplification |
US20220162667A1 (en) | 2018-12-07 | 2022-05-26 | Octant, Inc. | Systems for protein-protein interaction screening |
US20220025447A1 (en) | 2018-12-10 | 2022-01-27 | 10X Genomics, Inc. | Generating spatial arrays with gradients |
SG11202012807YA (en) | 2018-12-18 | 2021-01-28 | Illumina Cambridge Ltd | Methods and compositions for paired end sequencing using a single surface primer |
PT3899037T (pt) | 2018-12-19 | 2023-12-22 | Illumina Inc | Métodos para melhorar a prioridade de clonalidade de agrupamento polinucleotídico |
US11649485B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-05-16 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
US11926867B2 (en) | 2019-01-06 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
US11492727B2 (en) | 2019-02-26 | 2022-11-08 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for GLP1 receptor |
SG11202109283UA (en) | 2019-02-26 | 2021-09-29 | Twist Bioscience Corp | Variant nucleic acid libraries for antibody optimization |
CN114174531A (zh) | 2019-02-28 | 2022-03-11 | 10X基因组学有限公司 | 用空间条码化寡核苷酸阵列对生物分析物进行概况分析 |
CN114127309A (zh) | 2019-03-15 | 2022-03-01 | 10X基因组学有限公司 | 使用空间阵列进行单细胞测序的方法 |
WO2020198071A1 (en) | 2019-03-22 | 2020-10-01 | 10X Genomics, Inc. | Three-dimensional spatial analysis |
CN114585741A (zh) | 2019-05-28 | 2022-06-03 | 奥科坦特公司 | 转录中继系统 |
WO2020243579A1 (en) | 2019-05-30 | 2020-12-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample |
EP3987019A4 (en) | 2019-06-21 | 2023-04-19 | Twist Bioscience Corporation | BARCODE-BASED NUCLEIC ACID SEQUENCE ARRANGEMENT |
EP3997223A1 (en) | 2019-07-12 | 2022-05-18 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for preparing nucleic acid sequencing libraries using crispr/cas9 immobilized on a solid support |
US11287422B2 (en) | 2019-09-23 | 2022-03-29 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
US11919000B2 (en) | 2019-10-10 | 2024-03-05 | 1859, Inc. | Methods and systems for microfluidic screening |
CN113939590A (zh) | 2019-10-25 | 2022-01-14 | 因美纳剑桥有限公司 | 用于在包含发夹环的多核苷酸模板的末端上产生非对称接头并从其测序的方法 |
EP4055185A1 (en) | 2019-11-08 | 2022-09-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing |
GB201919032D0 (en) | 2019-12-20 | 2020-02-05 | Cartana Ab | Method of detecting an analyte |
GB201919029D0 (en) | 2019-12-20 | 2020-02-05 | Cartana Ab | Method of detecting an analyte |
EP4081653A4 (en) | 2019-12-23 | 2023-07-26 | Singular Genomics Systems, Inc. | LONG FRAGMENT SEQUENCING METHODS |
CA3166578A1 (en) | 2019-12-31 | 2021-07-08 | Singular Genomics Systems, Inc. | Polynucleotide barcodes for long read sequencing |
WO2021167986A1 (en) | 2020-02-17 | 2021-08-26 | 10X Genomics, Inc. | In situ analysis of chromatin interaction |
AU2021225020A1 (en) | 2020-02-21 | 2022-08-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for integrated in situ spatial assay |
EP4114978A2 (en) | 2020-03-06 | 2023-01-11 | Singular Genomics Systems, Inc. | Linked paired strand sequencing |
EP4153775A1 (en) | 2020-05-22 | 2023-03-29 | 10X Genomics, Inc. | Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity |
CA3190588A1 (en) | 2020-08-06 | 2022-02-10 | Illumina, Inc. | Preparation of rna and dna sequencing libraries using bead-linked transposomes |
CN116323971A (zh) | 2020-08-18 | 2023-06-23 | Illumina公司 | 核酸的序列特异性靶向转座和选择以及分选 |
US11200446B1 (en) | 2020-08-31 | 2021-12-14 | Element Biosciences, Inc. | Single-pass primary analysis |
MX2023001400A (es) | 2020-09-11 | 2023-04-25 | Illumina Cambridge Ltd | Metodos para enriquecer una secuencia diana a partir de una genoteca de secuenciación usando adaptadores de horquilla. |
EP4012046A1 (en) | 2020-12-11 | 2022-06-15 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for multimodal in situ analysis |
CN116848263A (zh) | 2020-12-23 | 2023-10-03 | 10X基因组学有限公司 | 用于分析物检测的方法和组合物 |
US20220228210A1 (en) | 2020-12-30 | 2022-07-21 | 10X Genomics, Inc. | Molecular array generation using photoresist |
US20220314187A1 (en) | 2020-12-30 | 2022-10-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for light-controlled surface patterning using a polymer |
WO2022147134A1 (en) | 2020-12-30 | 2022-07-07 | 10X Genomics, Inc. | Molecular arrays and methods for generating and using the arrays |
CN116724125A (zh) | 2021-01-26 | 2023-09-08 | 10X基因组学有限公司 | 用于原位分析的核酸类似物探针 |
CN116829731A (zh) | 2021-02-04 | 2023-09-29 | Illumina公司 | 转座体结合珠粒上的长带索引连接的读段生成 |
US20240043915A1 (en) | 2021-02-13 | 2024-02-08 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for in situ macromolecule detection and uses thereof |
US20220282319A1 (en) | 2021-03-03 | 2022-09-08 | 10X Genomics, Inc. | Analyte detection in situ using nucleic acid origami |
US20220333178A1 (en) | 2021-03-22 | 2022-10-20 | Illumina Cambridge Limited | Methods for improving nucleic acid cluster clonality |
MX2023010814A (es) | 2021-03-29 | 2023-09-27 | Illumina Inc | Metodos mejorados de preparacion de genotecas. |
EP4314328A1 (en) | 2021-03-29 | 2024-02-07 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for assessing dna damage in a library and normalizing amplicon size bias |
WO2022208171A1 (en) | 2021-03-31 | 2022-10-06 | UCL Business Ltd. | Methods for analyte detection |
CA3211172A1 (en) | 2021-03-31 | 2022-10-06 | Illumina, Inc. | Methods of preparing directional tagmentation sequencing libraries using transposon-based technology with unique molecular identifiers for error correction |
US20220380838A1 (en) | 2021-06-01 | 2022-12-01 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for analyte detection and probe resolution |
CN117751197A (zh) | 2021-06-02 | 2024-03-22 | 10X基因组学有限公司 | 使用不对称可环化探针的样品分析 |
US11859241B2 (en) | 2021-06-17 | 2024-01-02 | Element Biosciences, Inc. | Compositions and methods for pairwise sequencing |
US11535892B1 (en) | 2021-06-17 | 2022-12-27 | Element Biosciences, Inc. | Compositions and methods for pairwise sequencing |
KR20240055718A (ko) | 2021-06-18 | 2024-04-29 | 엘리먼트 바이오사이언스, 인크. | 조작된 폴리머라제 |
EP4367262A1 (en) | 2021-07-09 | 2024-05-15 | 10X Genomics, Inc. | Methods for detecting analytes using sparse labelling |
US20230057571A1 (en) | 2021-08-03 | 2023-02-23 | 10X Genomics, Inc. | Nucleic acid concatemers and methods for stabilizing and/or compacting the same |
US20230047225A1 (en) | 2021-08-14 | 2023-02-16 | Illumina, Inc. | Polymerases, compositions, and methods of use |
WO2023023484A1 (en) | 2021-08-16 | 2023-02-23 | 10X Genomics, Inc. | Probes comprising a split barcode region and methods of use |
WO2023102313A1 (en) | 2021-11-30 | 2023-06-08 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for identifying regions of aneuploidy in a tissue |
WO2023108139A2 (en) | 2021-12-10 | 2023-06-15 | 10X Genomics, Inc. | Multi-resolution in situ decoding |
WO2023114203A1 (en) | 2021-12-13 | 2023-06-22 | Cornell University | Genotyping of targeted loci with single-cell chromatin accessibility |
US20230212667A1 (en) | 2021-12-29 | 2023-07-06 | Illumina Cambridge Limited | Methods of nucleic acid sequencing using surface-bound primers |
US20230279475A1 (en) | 2022-01-21 | 2023-09-07 | 10X Genomics, Inc. | Multiple readout signals for analyzing a sample |
WO2023159028A1 (en) | 2022-02-15 | 2023-08-24 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for spatial analysis of analytes using fiducial alignment |
WO2023172915A1 (en) | 2022-03-08 | 2023-09-14 | 10X Genomics, Inc. | In situ code design methods for minimizing optical crowding |
WO2023192302A1 (en) | 2022-03-29 | 2023-10-05 | 10X Genomics, Inc. | Spectral unmixing combined with decoding for super-multiplexed in situ analysis |
EP4253550A1 (en) | 2022-04-01 | 2023-10-04 | GenCC GmbH 6 Co. KG | Method for the manufacture of a viral system, a vector system or any transport system for cancer-specific crispr complexes |
WO2023196526A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | 10X Genomics, Inc. | Methods for multiplex cell analysis |
WO2023245190A1 (en) | 2022-06-17 | 2023-12-21 | 10X Genomics, Inc. | Catalytic de-crosslinking of samples for in situ analysis |
WO2024006830A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for patterned molecular array generation by directed bead delivery |
WO2024006827A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for light-controlled surface patterning using photomasks |
EP4370242A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-05-22 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for generating molecular arrays using oligonucleotide printing and photolithography |
WO2024006814A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | 10X Genomics, Inc. | Method of generating arrays using microfluidics and photolithography |
WO2024006797A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for refining feature boundaries in molecular arrays |
WO2024006798A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | 10X Genomics, Inc. | High definition molecular array feature generation using photoresist |
WO2024006799A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | 10X Genomics, Inc. | Covalent attachment of splint oligonucleotides for molecular array generation using ligation |
US20240076722A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-03-07 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for oligonucleotide inversion on arrays |
WO2024006832A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | 10X Genomics, Inc. | Click chemistry-based dna photo-ligation for manufacturing of high-resolution dna arrays |
US20240141427A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-05-02 | Illumina, Inc. | Polymerases, compositions, and methods of use |
WO2024081869A1 (en) | 2022-10-14 | 2024-04-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for analysis of biological samples |
US20240158852A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-16 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for assessing performance of in situ assays |
WO2024123733A1 (en) | 2022-12-05 | 2024-06-13 | Twist Bioscience Corporation | Enzymes for library preparation |
Family Cites Families (131)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3010971A1 (de) | 1980-03-21 | 1981-10-08 | Siemens AG, 1000 Berlin und 8000 München | Verfahren zur herstellung eines optischen 4-tor-kopplers |
US5171534A (en) | 1984-01-16 | 1992-12-15 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
US5821058A (en) | 1984-01-16 | 1998-10-13 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
US5354825A (en) * | 1985-04-08 | 1994-10-11 | Klainer Stanley M | Surface-bound fluorescent polymers and related methods of synthesis and use |
US4863849A (en) | 1985-07-18 | 1989-09-05 | New York Medical College | Automatable process for sequencing nucleotide |
US4811218A (en) * | 1986-06-02 | 1989-03-07 | Applied Biosystems, Inc. | Real time scanning electrophoresis apparatus for DNA sequencing |
US5254477A (en) | 1986-06-25 | 1993-10-19 | Trustees Of Tufts College | Flourescence intramolecular energy transfer conjugate compositions and detection methods |
US4822746A (en) * | 1986-06-25 | 1989-04-18 | Trustees Of Tufts College | Radiative and non-radiative energy transfer and absorbance modulated fluorescence detection methods and sensors |
US5143853A (en) | 1986-06-25 | 1992-09-01 | Trustees Of Tufts College | Absorbance modulated fluorescence detection methods and sensors |
US5252494A (en) | 1986-06-25 | 1993-10-12 | Trustees Of Tufts College | Fiber optic sensors, apparatus, and detection methods using controlled release polymers and reagent formulations held within a polymeric reaction matrix |
US5114864A (en) * | 1986-06-25 | 1992-05-19 | Trustees Of Tufts College | Fiber optic sensors, apparatus, and detection methods using fluid erodible controlled release polymers for delivery of reagent formulations |
US5525464A (en) * | 1987-04-01 | 1996-06-11 | Hyseq, Inc. | Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes |
SE8801070D0 (sv) * | 1988-03-23 | 1988-03-23 | Pharmacia Ab | Method for immobilizing a dna sequence on a solid support |
US4971903A (en) | 1988-03-25 | 1990-11-20 | Edward Hyman | Pyrophosphate-based method and apparatus for sequencing nucleic acids |
US5700637A (en) | 1988-05-03 | 1997-12-23 | Isis Innovation Limited | Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays |
US6054270A (en) * | 1988-05-03 | 2000-04-25 | Oxford Gene Technology Limited | Analying polynucleotide sequences |
GB8822228D0 (en) * | 1988-09-21 | 1988-10-26 | Southern E M | Support-bound oligonucleotides |
US5871928A (en) * | 1989-06-07 | 1999-02-16 | Fodor; Stephen P. A. | Methods for nucleic acid analysis |
US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
US6040138A (en) * | 1995-09-15 | 2000-03-21 | Affymetrix, Inc. | Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays |
US5744101A (en) * | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
US5302509A (en) | 1989-08-14 | 1994-04-12 | Beckman Instruments, Inc. | Method for sequencing polynucleotides |
US5545522A (en) * | 1989-09-22 | 1996-08-13 | Van Gelder; Russell N. | Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex |
US5244813A (en) | 1991-01-25 | 1993-09-14 | Trustees Of Tufts College | Fiber optic sensor, apparatus, and methods for detecting an organic analyte in a fluid or vapor sample |
US5244636A (en) | 1991-01-25 | 1993-09-14 | Trustees Of Tufts College | Imaging fiber optic array sensors, apparatus, and methods for concurrently detecting multiple analytes of interest in a fluid sample |
US5320814A (en) * | 1991-01-25 | 1994-06-14 | Trustees Of Tufts College | Fiber optic array sensors, apparatus, and methods for concurrently visualizing and chemically detecting multiple analytes of interest in a fluid sample |
US5250264A (en) | 1991-01-25 | 1993-10-05 | Trustees Of Tufts College | Method of making imaging fiber optic sensors to concurrently detect multiple analytes of interest in a fluid sample |
US5888819A (en) * | 1991-03-05 | 1999-03-30 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining nucleotide identity through primer extension |
US5114984A (en) * | 1991-04-26 | 1992-05-19 | Olin Corporation | Process for producing an antimicrobially effective polyurethane |
US5605662A (en) * | 1993-11-01 | 1997-02-25 | Nanogen, Inc. | Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics |
DE69233087T2 (de) * | 1991-11-22 | 2003-12-24 | Affymetrix Inc N D Ges D Staat | Verfahren zur Herstellung von Polymerarrays |
US5445971A (en) | 1992-03-20 | 1995-08-29 | Abbott Laboratories | Magnetically assisted binding assays using magnetically labeled binding members |
US5587128A (en) * | 1992-05-01 | 1996-12-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Mesoscale polynucleotide amplification devices |
GB9210176D0 (en) * | 1992-05-12 | 1992-06-24 | Cemu Bioteknik Ab | Chemical method |
US6114114A (en) | 1992-07-17 | 2000-09-05 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Comparative gene transcript analysis |
US5298741A (en) * | 1993-01-13 | 1994-03-29 | Trustees Of Tufts College | Thin film fiber optic sensor array and apparatus for concurrent viewing and chemical sensing of a sample |
US5714320A (en) * | 1993-04-15 | 1998-02-03 | University Of Rochester | Rolling circle synthesis of oligonucleotides and amplification of select randomized circular oligonucleotides |
US5837832A (en) | 1993-06-25 | 1998-11-17 | Affymetrix, Inc. | Arrays of nucleic acid probes on biological chips |
US5861242A (en) * | 1993-06-25 | 1999-01-19 | Affymetrix, Inc. | Array of nucleic acid probes on biological chips for diagnosis of HIV and methods of using the same |
US6027880A (en) * | 1995-08-02 | 2000-02-22 | Affymetrix, Inc. | Arrays of nucleic acid probes and methods of using the same for detecting cystic fibrosis |
GB9315847D0 (en) * | 1993-07-30 | 1993-09-15 | Isis Innovation | Tag reagent and assay method |
US5482845A (en) | 1993-09-24 | 1996-01-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for construction of normalized cDNA libraries |
US7375198B2 (en) * | 1993-10-26 | 2008-05-20 | Affymetrix, Inc. | Modified nucleic acid probes |
US6156501A (en) | 1993-10-26 | 2000-12-05 | Affymetrix, Inc. | Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use |
US5429807A (en) * | 1993-10-28 | 1995-07-04 | Beckman Instruments, Inc. | Method and apparatus for creating biopolymer arrays on a solid support surface |
GB9401833D0 (en) * | 1994-02-01 | 1994-03-30 | Isis Innovation | Method for discovering ligands |
US5834252A (en) | 1995-04-18 | 1998-11-10 | Glaxo Group Limited | End-complementary polymerase reaction |
US5928905A (en) | 1995-04-18 | 1999-07-27 | Glaxo Group Limited | End-complementary polymerase reaction |
JP2556293B2 (ja) * | 1994-06-09 | 1996-11-20 | 日本電気株式会社 | Mos ota |
US5512490A (en) * | 1994-08-11 | 1996-04-30 | Trustees Of Tufts College | Optical sensor, optical sensing apparatus, and methods for detecting an analyte of interest using spectral recognition patterns |
US5604097A (en) * | 1994-10-13 | 1997-02-18 | Spectragen, Inc. | Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags |
US6013445A (en) * | 1996-06-06 | 2000-01-11 | Lynx Therapeutics, Inc. | Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors |
US5795716A (en) * | 1994-10-21 | 1998-08-18 | Chee; Mark S. | Computer-aided visualization and analysis system for sequence evaluation |
US5919673A (en) | 1995-03-22 | 1999-07-06 | The Scripps Research Institute | One-pot enzymatic sulfation process using 3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate and recycled phosphorylated adenosine intermediates |
GB9507238D0 (en) * | 1995-04-07 | 1995-05-31 | Isis Innovation | Detecting dna sequence variations |
US5750341A (en) * | 1995-04-17 | 1998-05-12 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions |
US5648245A (en) * | 1995-05-09 | 1997-07-15 | Carnegie Institution Of Washington | Method for constructing an oligonucleotide concatamer library by rolling circle replication |
US5690894A (en) | 1995-05-23 | 1997-11-25 | The Regents Of The University Of California | High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor |
US5728529A (en) * | 1995-06-23 | 1998-03-17 | Baylor College Of Medicine | Alternative dye-labeled ribonucleotides, deoxyribonucleotides, and dideoxyribonucleotides for automated DNA analysis |
US6200737B1 (en) * | 1995-08-24 | 2001-03-13 | Trustees Of Tufts College | Photodeposition method for fabricating a three-dimensional, patterned polymer microstructure |
US5843655A (en) * | 1995-09-18 | 1998-12-01 | Affymetrix, Inc. | Methods for testing oligonucleotide arrays |
US5871697A (en) * | 1995-10-24 | 1999-02-16 | Curagen Corporation | Method and apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing |
US5780231A (en) * | 1995-11-17 | 1998-07-14 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA extension and analysis with rolling primers |
US5962228A (en) | 1995-11-17 | 1999-10-05 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA extension and analysis with rolling primers |
DK0862656T3 (da) * | 1995-11-21 | 2001-04-09 | Univ Yale | Unimolekylær segmentamplifikation og -detektering |
US5854033A (en) | 1995-11-21 | 1998-12-29 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
US5633972A (en) * | 1995-11-29 | 1997-05-27 | Trustees Of Tufts College | Superresolution imaging fiber for subwavelength light energy generation and near-field optical microscopy |
US5814524A (en) | 1995-12-14 | 1998-09-29 | Trustees Of Tufts College | Optical sensor apparatus for far-field viewing and making optical analytical measurements at remote locations |
GB9526352D0 (en) * | 1995-12-22 | 1996-02-21 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
EP0880598A4 (en) * | 1996-01-23 | 2005-02-23 | Affymetrix Inc | RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM |
US5837196A (en) * | 1996-01-26 | 1998-11-17 | The Regents Of The University Of California | High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor |
US5851772A (en) | 1996-01-29 | 1998-12-22 | University Of Chicago | Microchip method for the enrichment of specific DNA sequences |
EP0937159A4 (en) * | 1996-02-08 | 2004-10-20 | Affymetrix Inc | SPECIATION OF MICROORGANISMS FROM MICROPLATES AND CHARACTERIZATION OF THE PHENOTYPES THEREOF |
US6013440A (en) * | 1996-03-11 | 2000-01-11 | Affymetrix, Inc. | Nucleic acid affinity columns |
US5846727A (en) | 1996-06-06 | 1998-12-08 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural & Mechanical College | Microsystem for rapid DNA sequencing |
US5846721A (en) | 1996-09-19 | 1998-12-08 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Efficient and simpler method to construct normalized cDNA libraries with improved representations of full-length cDNAs |
GB9620209D0 (en) * | 1996-09-27 | 1996-11-13 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
US5856104A (en) * | 1996-10-28 | 1999-01-05 | Affymetrix, Inc. | Polymorphisms in the glucose-6 phosphate dehydrogenase locus |
US5900481A (en) * | 1996-11-06 | 1999-05-04 | Sequenom, Inc. | Bead linkers for immobilizing nucleic acids to solid supports |
US6133436A (en) | 1996-11-06 | 2000-10-17 | Sequenom, Inc. | Beads bound to a solid support and to nucleic acids |
US6887665B2 (en) * | 1996-11-14 | 2005-05-03 | Affymetrix, Inc. | Methods of array synthesis |
US6519583B1 (en) * | 1997-05-15 | 2003-02-11 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Graphical viewer for biomolecular sequence data |
GB9626815D0 (en) | 1996-12-23 | 1997-02-12 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
US6136543A (en) | 1997-01-31 | 2000-10-24 | Hitachi, Ltd. | Method for determining nucleic acids base sequence and apparatus therefor |
ATE273381T1 (de) * | 1997-02-12 | 2004-08-15 | Eugene Y Chan | Verfahren zur analyse von polymeren |
US20030027126A1 (en) * | 1997-03-14 | 2003-02-06 | Walt David R. | Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions |
US6023540A (en) * | 1997-03-14 | 2000-02-08 | Trustees Of Tufts College | Fiber optic sensor with encoded microspheres |
US6327410B1 (en) * | 1997-03-14 | 2001-12-04 | The Trustees Of Tufts College | Target analyte sensors utilizing Microspheres |
WO1998041657A1 (en) * | 1997-03-20 | 1998-09-24 | Affymetrix, Inc. | Iterative resequencing |
US6406845B1 (en) * | 1997-05-05 | 2002-06-18 | Trustees Of Tuft College | Fiber optic biosensor for selectively detecting oligonucleotide species in a mixed fluid sample |
JP3693352B2 (ja) * | 1997-06-13 | 2005-09-07 | アフィメトリックス インコーポレイテッド | プローブアレイを使用して、遺伝子多型性を検出し、対立遺伝子発現をモニターする方法 |
AU755913B2 (en) * | 1997-06-18 | 2003-01-02 | Masad Damha | Nucleic acid biosensor diagnostics |
US20010006630A1 (en) * | 1997-09-02 | 2001-07-05 | Oron Yacoby-Zeevi | Introducing a biological material into a patient |
US6036597A (en) * | 1998-02-11 | 2000-03-14 | Agco Corporation | Combine harvester rotor load control |
US6013449A (en) * | 1997-11-26 | 2000-01-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Probe-based analysis of heterozygous mutations using two-color labelling |
US6232066B1 (en) * | 1997-12-19 | 2001-05-15 | Neogen, Inc. | High throughput assay system |
WO1999032660A1 (en) * | 1997-12-19 | 1999-07-01 | Affymetrix | Exploiting genomics in the search for new drugs |
US6050719A (en) * | 1998-01-30 | 2000-04-18 | Affymetrix, Inc. | Rotational mixing method using a cartridge having a narrow interior |
US5882874A (en) * | 1998-02-27 | 1999-03-16 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Reciprocal subtraction differential display |
US6210910B1 (en) * | 1998-03-02 | 2001-04-03 | Trustees Of Tufts College | Optical fiber biosensor array comprising cell populations confined to microcavities |
US6263286B1 (en) | 1998-08-13 | 2001-07-17 | U.S. Genomics, Inc. | Methods of analyzing polymers using a spatial network of fluorophores and fluorescence resonance energy transfer |
US6210896B1 (en) * | 1998-08-13 | 2001-04-03 | Us Genomics | Molecular motors |
US6306643B1 (en) | 1998-08-24 | 2001-10-23 | Affymetrix, Inc. | Methods of using an array of pooled probes in genetic analysis |
US20020012913A1 (en) * | 1998-09-15 | 2002-01-31 | Kevin L. Gunderson | Nucleic acid analysis using complete n-mer arrays |
US6203989B1 (en) * | 1998-09-30 | 2001-03-20 | Affymetrix, Inc. | Methods and compositions for amplifying detectable signals in specific binding assays |
US6285807B1 (en) | 1998-11-16 | 2001-09-04 | Trustees Of Tufts College | Fiber optic sensor for long-term analyte measurements in fluids |
US6255476B1 (en) | 1999-02-22 | 2001-07-03 | Pe Corporation (Ny) | Methods and compositions for synthesis of labelled oligonucleotides and analogs on solid-supports |
US6225061B1 (en) * | 1999-03-10 | 2001-05-01 | Sequenom, Inc. | Systems and methods for performing reactions in an unsealed environment |
US20030108867A1 (en) * | 1999-04-20 | 2003-06-12 | Chee Mark S | Nucleic acid sequencing using microsphere arrays |
US6355431B1 (en) * | 1999-04-20 | 2002-03-12 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays |
US6221653B1 (en) * | 1999-04-27 | 2001-04-24 | Agilent Technologies, Inc. | Method of performing array-based hybridization assays using thermal inkjet deposition of sample fluids |
US6544732B1 (en) * | 1999-05-20 | 2003-04-08 | Illumina, Inc. | Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals |
AU779835B2 (en) * | 1999-05-20 | 2005-02-10 | Illumina, Inc. | Method and apparatus for retaining and presenting at least one microsphere array to solutions and/or to optical imaging systems |
US20020051971A1 (en) * | 1999-05-21 | 2002-05-02 | John R. Stuelpnagel | Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays |
US7244559B2 (en) * | 1999-09-16 | 2007-07-17 | 454 Life Sciences Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
US6274320B1 (en) * | 1999-09-16 | 2001-08-14 | Curagen Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
ATE527053T1 (de) * | 1999-12-13 | 2011-10-15 | Illumina Inc | Syntheseeinrichtung für oligonukleotide unter nutzung von fliehkraft |
US7390459B2 (en) * | 1999-12-13 | 2008-06-24 | Illumina, Inc. | Oligonucleotide synthesizer |
ATE492652T1 (de) * | 2000-02-07 | 2011-01-15 | Illumina Inc | Nukleinsäuredetektionsverfahren mit universellem priming |
US7361488B2 (en) * | 2000-02-07 | 2008-04-22 | Illumina, Inc. | Nucleic acid detection methods using universal priming |
US20040121364A1 (en) * | 2000-02-07 | 2004-06-24 | Mark Chee | Multiplex nucleic acid reactions |
WO2001059432A2 (en) * | 2000-02-10 | 2001-08-16 | Illumina, Inc. | Array of individual arrays as substrate for bead-based simultaneous processing of samples and manufacturing method therefor |
EP1967595A3 (en) * | 2000-02-16 | 2008-12-03 | Illumina, Inc. | Parallel genotyping of multiple patient samples |
US20030096239A1 (en) * | 2000-08-25 | 2003-05-22 | Kevin Gunderson | Probes and decoder oligonucleotides |
US6720007B2 (en) * | 2000-10-25 | 2004-04-13 | Tufts University | Polymeric microspheres |
US20040018491A1 (en) * | 2000-10-26 | 2004-01-29 | Kevin Gunderson | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
US7078168B2 (en) * | 2001-02-27 | 2006-07-18 | Biotage Ab | Method for determining allele frequencies |
-
2001
- 2001-03-21 US US09/814,338 patent/US7244559B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-03-21 JP JP2002575327A patent/JP4354184B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-21 DE DE60236502T patent/DE60236502D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-21 EP EP02715174A patent/EP1381693B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-21 AU AU2002247390A patent/AU2002247390B9/en not_active Ceased
- 2002-03-21 ES ES02715174T patent/ES2348435T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-21 US US10/104,280 patent/US20030068629A1/en not_active Abandoned
- 2002-03-21 CA CA2441603A patent/CA2441603C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-21 AT AT02715174T patent/ATE468915T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-03-21 WO PCT/US2002/008700 patent/WO2002077287A1/en active Application Filing
- 2002-08-15 US US10/222,592 patent/US7335762B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-08-15 US US10/222,298 patent/US20070092872A1/en not_active Abandoned
- 2002-11-19 US US10/299,180 patent/US7264929B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008537679A (ja) * | 2005-04-07 | 2008-09-25 | 454 ライフ サイエンシーズ コーポレイション | 薄膜コーティングで被覆されたマイクロウェルアレイおよびそれを製造する方法 |
JP2011234723A (ja) * | 2005-06-15 | 2011-11-24 | Callida Genomics Inc | 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ |
JP2009500004A (ja) * | 2005-06-15 | 2009-01-08 | カリダ・ジェノミックス・インコーポレイテッド | 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ |
JP2009033988A (ja) * | 2007-07-31 | 2009-02-19 | Hitachi High-Technologies Corp | 核酸解析方法及び装置 |
WO2010026950A1 (ja) * | 2008-09-08 | 2010-03-11 | 株式会社日立製作所 | Dna検出装置、及びdna検出デバイス、並びにdna検出方法 |
JP2012507990A (ja) * | 2008-11-07 | 2012-04-05 | インダストリアル テクノロジー リサーチ インスティテュート | 正確な配列データおよび修飾塩基位置決定の方法 |
US9747414B2 (en) | 2008-11-07 | 2017-08-29 | Industrial Technology Research Institute | Methods for accurate sequence data and modified base position determination |
US9767251B2 (en) | 2008-11-07 | 2017-09-19 | Industrial Technology Research Institute | Methods for accurate sequence data and modified base position determination |
US10515714B2 (en) | 2008-11-07 | 2019-12-24 | Industrial Technology Research Institute | Methods for accurate sequence data and modified base position determination |
US11676682B1 (en) | 2008-11-07 | 2023-06-13 | Industrial Technology Research Institute | Methods for accurate sequence data and modified base position determination |
JP2011097884A (ja) * | 2009-11-06 | 2011-05-19 | Japan Advanced Institute Of Science & Technology Hokuriku | 試料解析装置 |
JP2014518638A (ja) * | 2011-06-07 | 2014-08-07 | コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ | ヌクレオチド配列データの提供 |
JP2015139373A (ja) * | 2014-01-27 | 2015-08-03 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 生体分子分析デバイス、及び生体分子分析装置 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2002247390A1 (en) | 2002-10-08 |
CA2441603A1 (en) | 2002-10-03 |
US20030100102A1 (en) | 2003-05-29 |
US20030148344A1 (en) | 2003-08-07 |
ATE468915T1 (de) | 2010-06-15 |
DE60236502D1 (de) | 2010-07-08 |
US20020012930A1 (en) | 2002-01-31 |
EP1381693A1 (en) | 2004-01-21 |
AU2002247390B9 (en) | 2007-03-22 |
EP1381693B1 (en) | 2010-05-26 |
US20070092872A1 (en) | 2007-04-26 |
ES2348435T3 (es) | 2010-12-07 |
US7264929B2 (en) | 2007-09-04 |
JP4354184B2 (ja) | 2009-10-28 |
CA2441603C (en) | 2012-01-10 |
US7335762B2 (en) | 2008-02-26 |
US7244559B2 (en) | 2007-07-17 |
EP1381693A4 (en) | 2005-12-21 |
AU2002247390B2 (en) | 2007-01-25 |
WO2002077287A1 (en) | 2002-10-03 |
US20030068629A1 (en) | 2003-04-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4354184B2 (ja) | 核酸の配列決定のための装置および方法 | |
JP4727109B2 (ja) | 核酸を配列決定する方法 | |
US7211390B2 (en) | Method of sequencing a nucleic acid | |
US20030054396A1 (en) | Enzymatic light amplification | |
JP5495399B2 (ja) | 核酸を増幅および配列決定する方法 | |
JP2007523627A6 (ja) | 核酸を増幅および配列決定する方法 | |
EP1922664A2 (en) | Methods of amplifying sequencing nucleic acids |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050318 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20050801 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20050801 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20050801 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20060322 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20070608 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070608 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080314 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080613 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080620 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080711 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080718 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080814 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080821 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080916 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090225 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090521 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090528 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090605 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090706 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090729 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120807 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130807 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |