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Die Erfindung betrifft eine Anordnung und ein Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen mittels der sog. Sequenzierung durch Synthese.
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Auf dem Gebiet der Sequenzierungstechnik der nächsten Generation (NGS, engl.: „Next Generation Sequencing”) werden zwei Hauptziele verfolgt. Zum einen soll die Analysedauer deutlich verkürzt werden. Dies soll eine Analyse eines menschlichen Genoms zu einem Preis von unter 1000 $ ermöglichen. Zum anderen soll die Qualität der gewonnenen Daten bei schnellen Analysezeiten erhalten bleiben oder sogar noch verbessert werden.
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Zu den NGS-Methoden zählt die Sequenzierung durch Synthese (engl.: „Sequencing-by-Synthesis”), wie beispielsweise die Pyrosequenzierung und die Ionen-Halbleiter Sequenzierung (engl.: „Ion semiconductor sequencing”).
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Die Pyrosequenzierung basiert auf dem Einbau von Nukleotiden in einen DNA-Strang. Die zu sequenzierende DNA liegt dabei als Einzelstrang gebunden an Mikrokugeln (engl.: „microbead”) vor und dient als Templat. Die Zugabe der vier Arten an Nukleotiden erfolgt nacheinander. Bei Zugabe eines zum Templat passenden Nukleotids wird durch die DNA-Polymerase Pyrophosphat freigesetzt. Dieses führt zu einem durch eine Enzymkaskade ausgelösten Lichtblitz, welcher optisch detektiert wird. Um eine parallele Analyse zu ermöglichen, werden die Mikrokugeln in Mikro-Vertiefungen (sog. micro wells) in einem Array angeordnet. Das optische Signal einzelner Vertiefungen wird dann analysiert.
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Die Ionen-Halbleiter Sequenzierung basiert ebenfalls auf dem Einbau von Nukleotiden. Hier wird der erfolgreiche Einbau eines Nukleotids an den DNA-Matrizenstrang über die Freisetzung von Protonen nachgewiesen. Dazu erfolgt insbesondere eine Messung des pH-Wertes mit chemisch sensitiven Feldeffekttransistoren (chemFETs), auch ionenseselektive Feldeffekttransistoren (ISFETs) genannt.
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Die
US 2009/0026082 A1 verbindet diese beiden Methoden. Dabei werden Mikrokugeln mit DNA-Einzelsträngen in Vertiefungen angeordnet. Der Einbau des jeweiligen Nukleotids wird mit Hilfe des pH-Werts, gemessen mittels eines chemFETs, detektiert.
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Die
US 2009/0026082 A1 beschreibt ein Verfahren zum Sequenzieren einer Nukleinsäure, wobei der chemische Prozess des Bindens von Nukleotiden an die Nukleinsäure detektiert werden kann. Weitere Methoden der Sequenzierung durch Synthese sind aus der
US 2011/0172127 A1 und der
US 2010/0308843 A1 bekannt. Desweiteren beschreiben auch
US 2003/0148344 A1 ,
US 2007/0166729 A1 ,
US 2010/0034445 A1 ,
US 5296122 A ,
US 2007/0155037 A1 sowie
WO 2009/064166 A2 Methoden und Anordnungen mit Bezug zur Sequenzierung.
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Die genannten Sequenzierungstechniken benötigen eine Vielzahl unterschiedlicher Reagenzien, welche der jeweiligen Analyseeinheit nacheinander zugeführt werden. Dazu zählen insbesondere die Reagenzien, die jeweils eine der vier Arten an Nukleotid oder Nukleotidtriphosphat (NTP) umfassen. Die Zuführung der Reagenzien erfolgt typischerweise in Durchflusszellen. Der hierbei vorliegende laterale Fluss der Reagenzien über dem Sensorarray ist dabei für die Detektion der Stoffgruppe Pyrophosphat oder der freigesetzten Protonen nachteilig. Diese Stoffe können in Richtung des Flusses von einer ersten Vertiefung zu einer zweiten Vertiefung strömen und dort zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Weiterhin liegt in der ersten Vertiefung aufgrund der lateralen Strömung eine erniedrigte Konzentration der Nachweiskomponenten vor, was zu falsch-negativen Ergebnissen führt. Auch die Diffusion der Protonen weg vom chemFET führt zu sehr geringen pH-Wert Änderungen und kann nachteilig falsch-negative Ergebnisse liefern. Weiterhin erfolgt nachteiligerweise aufgrund sehr kleiner Messeffekte eine unzureichende Auflösung der Homopolymere. Als Homopolymere wird die Aneinanderreihung mehrerer Nukleotide der gleichen Art bezeichnet.
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Ein weiterer Nachteil der genannten Sequenzierungstechniken ist der hohe Verbrauch an Reagenzien. Dieser beruht darauf, dass das gesamte Volumen der Durchflusszelle inklusive aller Zu- und Ableitungen mit dem jeweiligen neuen Reagenz gefüllt werden muss. Weiterhin muss die Dicke der Flüssigkeitsschicht über dem Array ca. 100 μm betragen, um eine Versorgung aller Vertiefungen des Arrays mit dem neuen Reagenz zu ermöglichen.
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Aufgabe der Erfindung ist es, eine Anordnung und ein Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen anzugeben, welche die genannten Nachteile überwinden.
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Die Aufgabe wird hinsichtlich der Anordnung durch die in Anspruch 1 angegebene Anordnung gelöst. Hinsichtlich des Verfahrens wird sie durch ein Verfahren mit den Merkmalen von Anspruch 9 gelöst. Die abhängigen Ansprüche betreffen vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung.
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Die erfindungsgemäße Anordnung ist zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen mittels der sogenannten Sequenzierung durch Synthese ausgestaltet. Bei der Sequenzierung von Nukleinsäuresequenzen durch Synthese wird eine chemische Stoffgruppe detektiert, die bei Anbinden eines Nukleotids an eine zu sequenzierende Nukleinsäuresequenz freigesetzt wird. Die Anordnung umfasst dazu einen Sensor zur Detektion der freigesetzten Stoffgruppe. Schließlich umfasst die Anordnung eine Sprühvorrichtung zum Aufbringen von Reagenzien auf diesen Sensor.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen mittels der sogenannten Sequenzierung mittels Synthese wird ein nukleotidhaltiges Reagenz auf den Sensor aufgebracht. Das Aufbringen erfolgt in der Weise, dass das Reagenz auf den Sensor aufgesprüht wird.
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In dieser Anordnung und diesem Verfahren findet vorteilhaft kein lateraler Fluss statt. Vorteilhaft werden daher falsch negative und falsch positive Ergebnisse vermindert. Es werden auch größere Messeffekte erzielt, so dass die Analyse der Homopolymere verbessert wird. Weiterhin ist eine geringe Menge des Reagenz ausreichend, um den Sensor vollständig zu benetzen. Eine bevorzugte Dicke der Flüssigkeitsschicht des Reagenz auf dem Sensor beträgt 1 μm. Weiterhin ist ein Befüllen der Zu- und Ableitungen wie bei einer Durchflusszelle nicht nötig. Dies vermindert ebenso vorteilhaft den Verbrauch der Reagenzien.
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Die Anordnung umfasst eine Sensorhalterung, die gegenüber der Sprühvorrichtung rotierbar ausgestaltet ist. Der Sensor ist mit der Sensorhalterung fest verbunden. Vorteilhaft wird eine gleichmäßige Benetzung des Sensors durch Rotation der Sensorhalterung erreicht. Weiterhin kann überschüssiges Reagenz, insbesondere eine Waschflüssigkeit, durch hohe Rotationsgeschwindigkeiten zum äußeren Rand der Sensorhalterung getragen werden. Bevorzugt wird die Sensorhalterung während des Auftragens eines nukleotidhaltigen Reagenz nicht oder nur langsam rotiert. Dadurch wird vorteilhaft ein lateraler Fluss vermieden. In der Sensorhalterung kann außerdem vorteilhaft Elektronik eingebaut sein, welche die elektrischen Sensorsignale des Sensors aufnimmt und an ein externes Messwerterfassungs-System weiterleitet.
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Zweckmäßig ist der Sensor in einen Chip integriert.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung ist der Sensor ein ionenselektiver Feldeffekttransistor (ISFET). Vorteilhaft können damit während der Synthese frei werdende Protonen detektiert werden. Zu sequenzierende Nukleinsäuresequenzen werden zusammen mit einem Primer vor der Analyse auf dem ISFET aufgebracht. Weiterhin ist an die zu sequenzierende Nukleinsäuresequenz ein Enzym zur Nukleinsäuresynthese angelagert. Im Falle einer DNA als Nukleinsäuresequenz ist beispielsweise eine DNA-Polymerase angelagert. Im Falle anderer Nukleinsäuresequenzen wird das entsprechende synthetisierende Enzym angelagert. Alternativ oder zusätzlich kann ein Sensor verwendet werden, der ein chemilumineszenz Lichtsignal misst. Bevorzugt misst dieser das Lichtsignal, welches mittels einer Enzymkaskade basierend auf der Freisetzung eines Pyrophosphats erzeugt wird.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung umfasst die Anordnung zwei Sensoren. Vorteilhaft können so zeitgleich mehrere Messungen stattfinden, so dass eine schnelle, parallele Bestimmung vieler Sequenzen durchführbar ist. Ein Aufsprühen der Reagenzien erfolgt vorteilhaft für beide Sensoren gleichzeitig in einem Arbeitsschritt. Die Sensoren werden bevorzugt in einem Sensor-Array angeordnet.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung ist zwischen jeweils zwei Sensoren eine hydrophobe Grenzschicht angeordnet. Diese hydrophobe Grenzschicht dient als Kompartimentierung für die Reagenzien auf den Sensoren. Ein Ineinanderlaufen der Reagenzien der nebeneinander angeordneten Sensoren wird somit vorteilhaft vermieden. Weiterhin wird es vorteilhaft vermieden, die zu sequenzierenden Nukleinsäuren in Mikro-Vertiefungen anzuordnen.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung umfasst die hydrophobe Grenzschicht ein Metall, insbesondere Gold.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung stellt die hydrophobe Grenzschicht eine Referenzelektrode für den ionenselektiven Feldeffekttransistor dar. Vorteilhaft ist die Referenzelektrode dann örtlich nah an den Sensor angeordnet. Demzufolge tritt vorteilhaft nur ein geringer elektrischer Widerstand zwischen dem Sensor und der Referenzelektrode auf, wodurch ein Rauschen des Signals vorteilhaft vermindert wird.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung ist die Sprühvorrichtung ein Ultraschallzerstäuber. Vorteilhaft können damit Tropfengrößen von kleiner 1 μm erreicht werden.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung wird ein weiteres Reagenz auf den Sensor aufgesprüht, wobei das Reagenz eine Waschflüssigkeit oder eine Protektionsflüssigkeit ist. Vorteilhaft wird im Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen zunächst eine nukleotidhaltige Lösung, insbesondere eine dNTP-Lösung, auf den Sensor aufgebracht. Diese Lösung enthält nur eine einzelne Art von Nukleotid. Während des Aufbringens der nukleotidhaltigen Lösung kann die Sensorhalterung langsam rotieren. Die Nukleotidlösung wird vorteilhaft derart aufgebracht, dass sich auf jedem Sensor ein vom dessen Nachbarsensoren örtlich getrenntes Flüssigkeitsvolumen ausbildet, welches zwischen Sensor und dem Rand der Referenzelektrode einen elektrochemischen Kontakt bildet. Wird das Nukleotid in die zu sequenzierende Nukleinsäuresequenz eingebaut, entstehen Protonen. Diese Protonen erzeugen ein Signal nur in dem jeweiligen Sensor. Ein Verschleppen der Protonen von einem ersten zu einem zweiten Sensor wird vorteilhaft vermieden. Nach Erhalt des Signals wird die Rotationsgeschwindigkeit bevorzugt deutlich erhöht und die Waschflüssigkeit, typischerweise mit einem größeren Volumen als die Nukleotidlösung, auf den Sensor aufgespritzt und abgeschleudert. Die Waschflüssigkeit ist typischerweise der Art, dass sie die in der ersten Lösung enthaltenen Nukleotide vollständig entfernt. Die Sensorhalterung wird so lange rotiert, bis die Waschflüssigkeit nahezu vollständig getrocknet ist. Anschließend wird bevorzugt eine weitere nukleotidhaltige Lösung als Reagenz auf den Sensor aufgesprüht. Auch in dieser nukleotidhaltigen Lösung ist nur eine Art Nukleotid enthalten. Anschließend wird die nukleotidhaltige Lösung wiederum mittels einer Waschflüssigkeit entfernt.
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Die Sensoren können alternativ mit einer Protektionsflüssigkeit versehen werden. Diese Flüssigkeit umfasst einen wasserlöslichen Filmbindner, welcher das laterale Diffundieren der freigesetzten Stoffgruppe während der Sequenzierung vorteilhaft verhindert.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung wird das Reagenz als Aerosol auf den Sensor aufgesprüht.
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnung noch weiter erläutert.
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1 zeigt schematisch eine Anordnung zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen mit ISFET-Sensoren und Referenzelektroden.
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2 zeigt schematisch ein Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen.
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3 zeigt schematisch eine Anordnung zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen mit ISFET-Sensoren und hydrophoben Grenzstrukturen als Referenzelektrode.
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1 zeigt schematisch eine Anordnung zur Nukleinsäuresynthese. Diese umfasst einen Ultraschallzerstäuber 1, einen Microarray-Chip 2, eine Sensorhalterung 9, und einen Elektromotor 10 zur Rotation. Der Microarray-Chip 2 umfasst ionenselektive Feldeffekttransistoren (ISFET) 3, Referenzelektroden 4, und eine Signalverarbeitung 5. Der Microarray-Chip 2 ist mit einem ersten Mittel 6 zur Fixierung an die Sensorhalterung 9 fixiert. Dieses erste Mittel ist bevorzugt eine Klemmvorrichtung. Alternativ kann der Microarray-Chip 2 mittels Unterdruck and der Sensorhalterung 9 befestigt werden. Die Fläche eines Arrays beträgt typischerweise 1 cm2, wobei ein Array bevorzugt bis zu 1.000.000 Sensoren umfasst. Die Sensorhalterung 9 umfasst eine Stromversorgung 8 und eine Datenverarbeitung 7 für die ISFETs 3.
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Ein erstes Reagenz 11 wird auf den Microarray-Chip 2 mittels des Ultraschallzerstäubers 1 aufgesprüht. Das erste Reagenz stellt dabei typischerweise eine Waschflüssigkeit dar. Aufgrund der Verwendung von größeren Volumina der Waschflüssigkeit, kann dieses alternativ aus Düsen in Form eines Strahls aufgespritzt werden. Während das erste Reagenz 11 auf den Microarray-Chip 2 aufgesprüht wird, rotiert der Elektromotor 10. Durch die Rotation wird das erste Reagenz 11 gleichmäßig über den Microarray-Chip 2 verteilt. Eine anschließende Erhöhung der Rotationsgeschwindigkeit führt dazu, dass das erste Reagenz 11 radial weggeschleudert wird. Durch eine Variation der Rotationsgeschwindigkeit können definierte Trocknungszustände eingestellt werden.
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2 zeigt schematisch ein Verfahren zum Betrieb einer Anordnung zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen. Die Anordnung entspricht der in 1 beschriebenen Anordnung. Der Microarray-Chip 2 umfasst weiterhin aktive ISFETs 18 und passive ISFETs 19. Aktive ISFETs 18 umfassen die zu untersuchende DNA-Sequenz 14 mit einem Primer zur DNA-Synthese. Weiterhin ist an die zu untersuchenden DNA-Sequenz 14 eine DNA-Polymerase gebunden. Bevorzugt umfasst der Microarray-Chip 2 aktive ISFETs 18.
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Nach dem Reinigen des Microarray-Chips 2 mit einem ersten Reagenz 11 und dem sich anschließenden Trocknen des Microarray-Chips 2 wird in einem nächsten Schritt ein zweites Reagenz 13, eine Protektionsflüssigkeit, auf den Microarray-Chip 2 aufgebracht. Eine typische Protektionsflüssigkeit ist ein Waschpuffer mit einem die Viskosität erhöhenden Stoff, insbesondere ein Filmbildner wie Poly-viny-pyrrolidon. Die Rotationsgeschwindigkeit des Elektromotors 10 wird so eingestellt, dass eine erste Schicht 21 mit dem zweiten Reagenz 13 bevorzugt eine Dicke von 1 μm aufweist.
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Auf diese erste Schicht 21 mit dem zweiten Reagenz 13 wird, wie in Abschnitt A gezeigt, ein drittes Reagenz 12 aufgebracht. Das dritte Reagenz 12 umfasst eine erste Nukleotidart (typischerweise Adenin, Thymin, Cytosin oder Guanin, jeweils als Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTP)). Das dritte Reagenz 12 trifft dabei fein verteilt im Wesentlichen senkrecht auf die erste Schicht 21. Die Rotationsgeschwindigkeit des Elektromotors 10 wird dabei so eingestellt, dass eine zweite Schicht 20 mit dem dritten Reagenz 12 bevorzugt eine Dicke von 1 μm aufweist.
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Die Rotationsgeschwindigkeit des Elektromotors 10 wird nach Aufbringen des dritten Reagenz 12 verlangsamt. Das dritte Reagenz 12 diffundiert gleichmäßig senkrecht zur Schichtebene in die erste Schicht 21. Es bildet sich eine Mischschicht 15 aus dem zweiten und dritten Reagenz 12, 13. Dies zeigt Abschnitt B der 2.
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An die zu untersuchende DNA-Sequenz 14 können sich die Nukleotide des dritten Reagenz 12 anlagern. Dies ist in Abschnitt C der 2 gezeigt. Durch das Anlagern der an die Primer 14 passenden Nukleotide werden Protonen freigesetzt. Deren Konzentration lässt sich mit Hilfe der ISFET-Sensoren messen. Die Messgröße ist der pH-Wert. Aufgrund der durch den Filmbildner eingeschränkten lateralen Diffusion wird ein Verschleppen der freigesetzten Protonen weitgehend vermieden. Bei erfolgreicher Anlagerung eines Nukleotids an die Primer 14 erfolgt ein Signal 16.
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Nach Signalverarbeitung wird die Rotationsgeschwindigkeit deutlich erhöht und es wird wiederum Waschflüssigkeit als erstes Reagenz 11 aufgebracht. Der Microarray-Chip 2 wird so von Flüssigkeiten bzw. Reagenzien gereinigt. Alternativ wird mittels des Ultraschallzerstäubers 1 feuchte Luft zum Reinigen des Sensors aufgesprüht.
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In einem nächsten Schritt wird wiederum ein zweites Reagenz 13 als Protektionsflüssigkeit aufgetragen und ein drittes Reagenz 12 mit einer zweiten Nukleotidart aufgebracht. Durch den senkrechten Auftrag der Flüssigkeiten und darauf beruhende Vermeidung der lateralen Diffusion findet kein Übersprechen statt.
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3 zeigt schematisch eine alternative Anordnung zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen. Diese Anordnung umfasst einen Düsenvorrichtung 100 zum Zerstäuben des Reagenz, einen Microarray-Chip 2 und einen Elektromotor 10 zur Rotation, eine Signalverarbeitung 5, eine Stromversorgung 8 und eine Datenverarbeitung 7. Der Microarray-Chip 2 umfasst Feldeffekttransistoren 3. Die ISFETs 3 werden jeweils durch eine hydrophobe Grenzschicht 17 voneinander getrennt. Diese hydrophobe Grenzschicht 17 umfasst Gold. Sie dient deshalb auch als Referenzelektrode für den jeweiligen ISFET 3. Der Microarray-Chip 2 umfasst weiterhin aktive ISFETs 18 und passive ISFETs 19. Ein drittes Reagenz 12 mit Nukleotiden wird auf den Microarra-Chip 2 zerstäubt. Mittels langsamer Rotation der Sensorhalterung 9 wird das dritte Reagenz auf dem Microarray-Chip 2 verteilt. Die hydrophobe Grenzschicht 17 verhindert ein Zusammenfließen des dritten Reagenz 12 auf mehreren ISFETS. Es bilden sich Tröpfchen mit einer Größe von ca. 1 μm3.
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Bei erfolgreichem Einbau eines Nukleotids des dritten Reagenz 12 in die zu untersuchende DNA 14, wird mittels des freigesetzten Protons ein Signal 16 erzeugt. Nach erfolgreicher Verarbeitung des Signals 16 wird das erste Reagenz 11 als Waschflüssigkeit auf den Microarray-Chip 2 aufgesprüht. Mittels einer schnellen Rotationsgeschwindigkeit, wird der Microarray-Chip 2 vom dritten Reagenz 3, gereinigt. Nach erfolgreicher Reinigung, die mittels eines pH-Signals festgelegt wird, erfolgt das Aufsprühen eines vierten Reagenz mit einer weiteren Nukleotidart. Auf diese Weise ist eine schnelle Prozessführung aufgrund kurzer Aufsprühzeiten im Sekundenbereich möglich.
