CN111041077A - 用于高通量测序中的样品加载方法、测序方法和测序系统 - Google Patents

用于高通量测序中的样品加载方法、测序方法和测序系统 Download PDF

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Abstract

一种用于高通量测序中的样品加载方法、测序方法和测序系统，该样品加载方法包括：将需要加载的样品制备成雾滴，然后将雾滴喷洒在用于高通量测序的芯片表面使雾滴与芯片结合，获得加载有样品的芯片。该样品加载方法是一种非管道式流体加载方案，避免样品加载不均匀问题，提高数据产出量，对样品需求量少并且可避免外源杂质问题。

Description

用于高通量测序中的样品加载方法、测序方法和测序系统
技术领域
本发明涉及测序技术领域，具体涉及一种用于高通量测序中的样品加载方法、测序方法和测序系统。
背景技术
DNA测序技术包括以桑格(Sanger)测序法为代表的第一代DNA测序技术和以Illumina Hiseq2500、Roche 454、ABI Solid、BGISEQ-500等为代表的第二代DNA测序技术。桑格测序法具有实验操作简单、结果直观准确和实验周期短等特点，在对检测结果时效性要求很高的临床基因突变检测以及基因分型等领域有着广泛的应用。
与第一代DNA测序技术相比，第二代DNA测序技术在序列读取前，需要将目的序列进行特殊处理，使待测片段锚定到测序芯片表面。如Roche 454利用乳液PCR(e-PCR)和微磁珠等核心技术；Illumina Hiseq主要是利用桥式PCR原理将目的序列固定到测序芯片表面；CG(Complete Genomics)开发的组合探针锚定连接法(cPAL)和华大基因(BGI)开发的组合探针锚定合成法(cPAS)则主要利用DNA纳米球(以下简称DNB)技术将待测DNA序列通过物理和化学手段固定在矩阵列的芯片表面。
以上测序平台的样品加载都是通过一套复杂的流体控制设备，将特定试剂在特定时间点的特定位置泵入对应的流动槽来完成，反应好坏一定程度上需要依赖于流体的均匀性。以BGI测序仪为例，其样品加载采用的是传统管道式流体控制设备，通过流体扩散与交换，将制备好的DNB通过流体作用分布在矩阵列的芯片表面，在加载缓冲液环境中具有特殊的空间折叠和带电性，与芯片特殊表面修饰的区域产生分子间作用力，使DNB通过偶联作用固定在规则阵列芯片表面。随后，将生物大分子覆盖在已固定于芯片表面的DNB，使DNB进一步稳固在矩阵芯片表面。此外，利用电磁场辅助的样品加载方式仍旧沿用了管道式流体控制设备。管道式流体加载技术具有以下缺陷：覆盖于裸芯片表面的盖板有携带杂质风险，容易使芯片表面吸附杂质，直接影响测序质量与通量；盖板与芯片形成的流体通路差异大，相同体积的试剂量在不同的芯片上产生不同的交换倍数，影响DNB加载的测序质量；为满足试剂的充分交换，试剂使用量大，利用率低，一定程度上增加了DNB加载过程的时间成本与生化试剂成本，且芯片边缘地区易出现DNB加载不均匀风险。
有报道显示，利用非管道式流体控制设备的样品加载方式已经成功应用生物检测领域，如ThermoFisher的涂布装置用于微孔阵列芯片的样品装载；清华大学郭永教授利用微滴技术实现高通量微孔阵列芯片的数字PCR(digital-PCR)检测。此类型的样品加载技术规避了管道式的流体扩散与交换原理，可以弥补由流体扩散与交换不充分产生的反应不均匀性缺陷。然而，目前尚无非管道式流体加载技术在第二代DNA测序技术中的应用，尤其是没有这种加载技术将DNB加载到测序芯片表面上的先例。
发明内容
本发明提供一种用于高通量测序中的样品加载方法、测序方法和测序系统，该样品加载方法是一种非管道式流体加载方案，避免样品加载不均匀问题，提高数据产出量，对样品需求量少并且可避免外源杂质问题。
根据第一方面，一种实施例中提供一种用于高通量测序中的样品加载方法，包括：将需要加载的样品制备成雾滴，然后将上述雾滴喷洒在用于高通量测序的芯片表面使上述雾滴与上述芯片结合，获得加载有样品的芯片。
作为本发明的优选方案，上述样品是包含DNA纳米球的样品。
作为本发明的优选方案，上述雾滴的直径为1至3μm，优选2μm。
作为本发明的优选方案，上述用于高通量测序的芯片是具有规则矩阵的裸芯片。
作为本发明的优选方案，通过雾化器将需要加载的样品制备成雾滴。
作为本发明的优选方案，上述雾化器在稳定状态的雾化速率为100至400μL/min，优选229μL/min。
作为本发明的优选方案，上述雾化器的喷雾出口直径为0.2cm至1cm，优选0.5cm。
作为本发明的优选方案，上述雾化器的雾滴喷口与上述芯片的距离是0.75cm至1.5cm，优选1cm。
作为本发明的优选方案，上述雾化器的喷雾方向向上，上述芯片在上述雾化器的雾滴喷口上方，且上述喷雾方向与上述芯片的工作面形成一个锐角角度，优选地，上述角度是30°至60°，优选30°至45°，更优选45°。
作为本发明的优选方案，上述芯片在上述雾化器的雾滴喷口上方左右移动接收上述雾滴。
作为本发明的优选方案，上述芯片接收上述雾滴的时间是5s至60s，优选30s。
根据第二方面，一种实施例中提供一种高通量测序方法，包括：
将需要加载的样品制备成雾滴，然后将上述雾滴喷洒在用于高通量测序的芯片表面使上述雾滴与上述芯片结合，获得加载有样品的芯片；
对上述加载有样品的芯片上的样品进行高通量测序获取测序数据。
作为本发明的优选方案，上述样品是包含DNA纳米球的样品。
作为本发明的优选方案，上述雾滴的直径为1至3μm，优选2μm。
作为本发明的优选方案，上述用于高通量测序的芯片是具有规则矩阵的裸芯片。
作为本发明的优选方案，通过雾化器将需要加载的样品制备成雾滴。
作为本发明的优选方案，上述雾化器在稳定状态的雾化速率为100至400μL/min，优选229μL/min。
作为本发明的优选方案，上述雾化器的喷雾出口直径为0.2cm至1cm，优选0.5cm。
作为本发明的优选方案，上述雾化器的雾滴喷口与上述芯片的距离是0.75cm至1.5cm，优选1cm。
作为本发明的优选方案，上述雾化器的喷雾方向向上，上述芯片在上述雾化器的雾滴喷口上方，且上述喷雾方向与上述芯片的工作面形成一个锐角角度，优选地，上述角度是30°至60°，优选30°至45°，更优选45°。
作为本发明的优选方案，上述芯片在上述雾化器的雾滴喷口上方左右移动接收上述雾滴。
作为本发明的优选方案，上述芯片接收上述雾滴的时间是5s至60s，优选30s。
根据第三方面，一种实施例中提供一种高通量测序系统，包括高通量测序仪和与其配套的样品加载装置，上述样品加载装置用于将需要加载的样品制备成雾滴，然后将上述雾滴喷洒在用于高通量测序的芯片表面使上述雾滴与上述芯片结合，以获得加载有样品的芯片。
作为本发明的优选方案，上述样品加载装置是雾化器。
作为本发明的优选方案，上述样品是包含DNA纳米球的样品。
作为本发明的优选方案，上述雾滴的直径为1至3μm，优选2μm。
作为本发明的优选方案，上述用于高通量测序的芯片是具有规则矩阵的裸芯片。
作为本发明的优选方案，上述雾化器在稳定状态的雾化速率为100至400μL/min，优选229μL/min。
作为本发明的优选方案，上述雾化器的喷雾出口直径为0.2cm至1cm，优选0.5cm。
作为本发明的优选方案，上述雾化器的雾滴喷口与上述芯片的距离是0.75cm至1.5cm，优选1cm。
作为本发明的优选方案，上述雾化器的喷雾方向向上，上述芯片在上述雾化器的雾滴喷口上方，且上述喷雾方向与上述芯片的工作面形成一个锐角角度，优选地，上述角度是30°至60°，优选30°至45°，更优选45°。
作为本发明的优选方案，上述芯片在上述雾化器的雾滴喷口上方左右移动接收上述雾滴。
作为本发明的优选方案，上述芯片接收上述雾滴的时间是5s至60s，优选30s。
本发明的用于高通量测序中的样品加载方法，不需要像现有高通量测序仪配套使用的样品加载仪的复杂流体控制系统，也不需要像当前样品加载方案采用的流道式流体，避免流体产生的样品加载不均匀问题，提高数据产出量；本方法对样品需求量少，可降低样品损耗，降低生化成本；并且本方法可避免外源杂质问题，进一步提高测序质量和数据产出量。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
针对BGI研发的DIP系列测序仪平台现有的DNB加载存在的问题，本发明提供一种雾滴式的加载方案，该方案相比现有方案具有如下几方面的明显优势：(1)样品加载过程无需芯片盖板，避免外源杂质的产生；(2)不需要复杂的流体控制系统，避免流体扩散与交换产生的样品加载不均匀问题；(3)样品和试剂使用量少，可满足量少或珍贵样品测序需求。
应当理解的是，本发明的方法广泛适用于各种高通量测序中的样品加载，例如Illumina Hiseq2500、Roche 454、ABI Solid、BGISEQ-500等第二代测序技术中的样品加载。
本发明的一种实施例中提供一种用于高通量测序中的样品加载方法，包括：将需要加载的样品制备成雾滴，然后将上述雾滴喷洒在用于高通量测序的芯片表面使上述雾滴与上述芯片结合，获得加载有样品的芯片。
本发明实施例中，样品可以是各种第二代测序技术平台中的样品。在本发明一个实施例中，样品是包含DNA纳米球(DNB)的样品。
本发明实施例中，将雾滴直径控制在一定大小范围内具有有利效果，如果雾滴直径较大，对样品需求量会增大，不利于实现低投入这一目标。同时雾滴直径也与芯片规格有关，尤其是对于具有规则矩阵的芯片，与芯片矩阵的间距有关。在本发明一个实施例中，雾滴的直径为1至3μm，优选2μm，同时所选用的芯片矩阵的间距也在该范围内。
本发明实施例中，用于高通量测序的芯片可以是任何第二代高通量测序芯片，其材质包括但不限于玻璃、石英等。在本发明一个实施例中，用于高通量测序的芯片是具有规则矩阵的裸芯片，即在芯片表面形成有按照一定规则排列的矩阵，雾滴通过喷雾的方式加载在矩阵上。例如，在本发明一个实施例中，具有规则矩阵的裸芯片是华大智造生产的DipseqV2芯片，其规格是25mm*75mm，芯片矩阵点间距(pitch值)为900nm。
本发明实施例中，通过雾化器将需要加载的样品制备成雾滴。雾化器的种类和型号没有特别限制，只要能够满足本发明将需要加载的样品制备成雾滴的需求即可，尤其是能够将需要加载的样品制备成直径为1至3μm(优选2μm)的雾滴。在本发明一个实施例中，可用于本发明的雾化器是欧姆龙(OMRON)的型号为Comp-A-I-R的雾化器，该雾化器能够形成直径大约2μm的雾滴，并以一定的雾化速率将雾滴喷洒到芯片上。
本发明实施例中，雾化速率可以控制在100至400μL/min，由于从雾滴形成到喷出的管道有一定的长度，如果雾化速率太低，雾滴在喷口就会凝聚成液滴回流。如果雾化速率太高，也会影响喷洒效果。在本发明一个实施例中，采用欧姆龙(OMRON)的型号为Comp-A-I-R的雾化器，其在稳定状态的雾化速率为229μL/min。
本发明实施例中，将雾化器的喷雾出口直径控制在一定范围是有利的，例如，在本发明一个实施例中，雾化器的喷雾出口直径控制在0.2cm至1cm，优选0.5cm。
本发明实施例中，将雾化器的雾滴喷口与芯片的距离控制在一定范围是有利的，例如，雾化器的雾滴喷口与芯片的距离在0.75cm至1.5cm能取得良好喷洒效果。在本发明一个实施例中，采用欧姆龙(OMRON)的型号为Comp-A-I-R的雾化器，雾化器的雾滴喷口与芯片的距离是1cm。
本发明实施例中，雾化器的喷雾方向大体上朝向芯片的工作面(即样品的加载面)，对于喷雾方向可以不做特别限定。但是，一个比较好的实施例中，雾化器的喷雾方向向上，芯片在雾化器的雾滴喷口上方，且喷雾方向与芯片的工作面形成一定角度，即一个锐角角度，这个角度可以是30°至60°，优选30°至45°，更优选45°。
本发明实施例中，为了比较均匀地将雾化的样品(即雾滴)加载在芯片的工作面上，需要移动芯片的位置使得芯片各个部位均能接受雾滴。在本发明一个实施例中，芯片在雾化器的雾滴喷口上方左右移动接收雾滴。芯片接收雾滴的时间可以控制在5s至60s，该时间一般取决于雾化速率和雾滴直径等因素，可以根据具体需求进行调整。在本发明一个实施例中，芯片接收雾滴的时间是30s。
除了上述样品加载方法以外，本发明一种实施例中提供一种高通量测序方法，包括：将需要加载的样品制备成雾滴，然后将雾滴喷洒在用于高通量测序的芯片表面使雾滴与芯片结合，获得加载有样品的芯片；然后对加载有样品的芯片上的样品进行高通量测序获取测序数据。
在本发明一个实施例中，样品是包含DNA纳米球的样品。在本发明一个实施例中，雾滴的直径为1至3μm，优选2μm。在本发明一个实施例中，用于高通量测序的芯片是具有规则矩阵的裸芯片。在本发明一个实施例中，通过雾化器将需要加载的样品制备成雾滴。在本发明一个实施例中，雾化器在稳定状态的雾化速率为100至400μL/min，优选229μL/min。在本发明一个实施例中，雾化器的雾滴喷口与芯片的距离是0.75cm至1.5cm，优选1cm。在本发明一个实施例中，雾化器的喷雾方向向上，芯片在雾化器的雾滴喷口上方，且喷雾方向与芯片的工作面形成一个锐角角度，该角度是30°至60°，优选30°至45°，更优选45°。在本发明一个实施例中，芯片在雾化器的雾滴喷口上方左右移动接收雾滴。在本发明一个实施例中，芯片接收雾滴的时间是5s至60s，优选30s。
本发明一种实施例中还提供一种高通量测序系统，包括高通量测序仪和与其配套的样品加载装置，该样品加载装置用于将需要加载的样品制备成雾滴，然后将雾滴喷洒在用于高通量测序的芯片表面使雾滴与芯片结合，以获得加载有样品的芯片。
需要说明的是，本发明实施例的高通量测序系统相比现有的高通量测序系统的区别主要在于其样品加载装置是一个喷雾装置，至于高通量测序仪的结构组成相比现有仪器没有变化。
在本发明一个实施例中，样品加载装置是雾化器，尤其是欧姆龙(OMRON)的型号为Comp-A-I-R的雾化器。在本发明一个实施例中，样品是包含DNA纳米球的样品。在本发明一个实施例中，雾滴的直径为1至3μm，优选2μm。在本发明一个实施例中，用于高通量测序的芯片是具有规则矩阵的裸芯片。在本发明一个实施例中，雾化器在稳定状态的雾化速率为100至400μL/min，优选229μL/min。在本发明一个实施例中，雾化器的雾滴喷口与芯片的距离是0.75cm至1.5cm，优选1cm。在本发明一个实施例中，雾化器的喷雾方向向上，芯片在雾化器的雾滴喷口上方，且喷雾方向与芯片的工作面形成一个锐角角度，该角度是30°至60°，优选30°至45°，更优选45°。在本发明一个实施例中，芯片在雾化器的雾滴喷口上方左右移动接收雾滴。在本发明一个实施例中，芯片接收雾滴的时间是5s至60s，优选30s。
以下通过一个实施例对本发明进行详细描述，需要说明的是，该实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例
本实施例是基于BGI研发的DIP系列测序仪平台的具有规则矩阵裸芯片的DNB样品加载方法。该样品加载方法利用雾化器，将所需加载的DNB制备成雾滴喷洒在具有规则矩阵的裸芯片表面，完成样品加载过程，然后在BGI研发的DIP测序仪上对该方法加载的样品进行检测。
本实施例中所使用的雾化器为欧姆龙(OMRON)Comp-A-I-R雾化器，所产生的雾滴直径约2μm，稳定状态的雾化速率约229.00μL/min。
本实施例中所使用的芯片是具有规则矩阵的裸芯片，来源于华大智造公司，芯片规格为DipseqV2，25mm*75mm，pitch值(芯片矩阵点间距)为900nm。
为了确定本实施例能够减少DNB样品需求量，首先利用称重法确定DipseqV2芯片铺满DNB样品所需试剂的体积。
1)目前管道式流体交换加载法所需的样品用量(以纯水为例)——称重法(单位：g)，测试结果如下表1所示，其中加载间隙(loader gap)表示用目前管道式流体交换加载法时芯片与盖板间形成的距离，由于操作不同，加载间隙值大小会有区别，本实施例假设加载间隙波动范围为0.1mm-0.3mm，并理论上计算最小和最大加载间隙时，所需的加载样品理论体积。并实测加载样品所需体积，重复三次(#1、#2和#3)，可推测出加载间隙一般在0.2mm-0.3mm。
表1
Figure BDA0001829349100000101
加上管道损失量，实际样品需求量为700μL至850μL。表明目前管道式流体交换加载法所需的样品用量较大。
2)喷雾法所需的样品用量(以纯水为例)——称重法(单位：g)。
选用芯片规格为DipseqV2的芯片，芯片号DP200000020(华大智造公司)干重16.497g(五次称量结果一样)。采用欧姆龙(OMRON)Comp-A-I-R雾化器，所产生的雾滴直径约2μm，稳定状态的雾化速率约229.00μL/min，喷雾时间为60s，喷雾出口直径0.5cm(约1mL规格蓝色枪头的最粗内径大小)，喷口距离芯片大约1cm，喷雾方向向上(手持芯片，工作面朝下45°左右移动接收雾滴)。测试结果如下表2所示，进行两轮测试，每轮测试同一张芯片进行5次测试，表中数据表示芯片铺满试剂后，芯片与试剂的总重量(单位：g)。
表2
Figure BDA0001829349100000111
注：重量恢复至干重的时间约2分13秒。该结果显示喷雾230μL样品，芯片实际仅接受了10-15μL(即8.6％-13.04％，以雾化速率229.00μL/min计算)，损失量较大且芯片上接收到的雾滴蒸发快速。喷雾时间为30s时，称量测得芯片接受的样品体积范围也在10-15μL，与喷雾时间为60s时基本一致。
3)根据DipseqV2芯片的尺寸大小，实际计算所需要的DNB样品量为4fmol。在流路式DNB样品加载情况下，实际所消耗DNB量为80fmol。喷雾式加载所需DNB单位浓度为0.27fmol/μL～0.4fmol/μL，考虑到损失情况，实际所需DNB量为31fmol～46fmol(按115μL体积计算，即喷雾时间为30s的喷雾量)。如果将芯片接受率提高，可以进一步降低样品消耗。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (10)

1.一种用于高通量测序中的样品加载方法，其特征在于，所述方法包括：将需要加载的样品制备成雾滴，然后将所述雾滴喷洒在用于高通量测序的芯片表面使所述雾滴与所述芯片结合，获得加载有样品的芯片。
2.根据权利要求1所述的样品加载方法，其特征在于，所述样品是包含DNA纳米球的样品。
3.根据权利要求1所述的样品加载方法，其特征在于，所述雾滴的直径为1至3μm，优选2μm。
4.根据权利要求1所述的样品加载方法，其特征在于，所述用于高通量测序的芯片是具有规则矩阵的裸芯片。
5.根据权利要求1所述的样品加载方法，其特征在于，通过雾化器将需要加载的样品制备成雾滴。
6.根据权利要求5所述的样品加载方法，其特征在于，所述雾化器在稳定状态的雾化速率为100至400μL/min，优选229μL/min；
任选地，所述雾化器的喷雾出口直径为0.2cm至1cm，优选0.5cm；
任选地，所述雾化器的雾滴喷口与所述芯片的距离是0.75cm至1.5cm，优选1cm；
任选地，所述雾化器的喷雾方向向上，所述芯片在所述雾化器的雾滴喷口上方，且所述喷雾方向与所述芯片的工作面形成一个锐角角度，优选地，所述角度是30°至60°，优选30°至45°，更优选45°；
任选地，所述芯片在所述雾化器的雾滴喷口上方左右移动接收所述雾滴；
任选地，所述芯片接收所述雾滴的时间是5s至60s，优选30s。
7.一种高通量测序方法，其特征在于，所述方法包括：
将需要加载的样品制备成雾滴，然后将所述雾滴喷洒在用于高通量测序的芯片表面使所述雾滴与所述芯片结合，获得加载有样品的芯片；
对所述加载有样品的芯片上的样品进行高通量测序获取测序数据。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述样品是包含DNA纳米球的样品；
任选地，所述雾滴的直径为1至3μm，优选2μm；
任选地，所述用于高通量测序的芯片是具有规则矩阵的裸芯片；
任选地，通过雾化器将需要加载的样品制备成雾滴；
任选地，所述雾化器在稳定状态的雾化速率为100至400μL/min，优选229μL/min；
任选地，所述雾化器的喷雾出口直径为0.2cm至1cm，优选0.5cm；
任选地，所述雾化器的雾滴喷口与所述芯片的距离是0.75cm至1.5cm，优选1cm；
任选地，所述雾化器的喷雾方向向上，所述芯片在所述雾化器的雾滴喷口上方，且所述喷雾方向与所述芯片的工作面形成一个锐角角度，优选地，所述角度是30°至60°，优选30°至45°，更优选45°；
任选地，所述芯片在所述雾化器的雾滴喷口上方左右移动接收所述雾滴；
任选地，所述芯片接收所述雾滴的时间是5s至60s，优选30s。
9.一种高通量测序系统，其特征在于，所述系统包括高通量测序仪和与其配套的样品加载装置，所述样品加载装置用于将需要加载的样品制备成雾滴，然后将所述雾滴喷洒在用于高通量测序的芯片表面使所述雾滴与所述芯片结合，以获得加载有样品的芯片。
10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，所述样品加载装置是雾化器；
任选地，所述样品是包含DNA纳米球的样品；
任选地，所述雾滴的直径为1至3μm，优选2μm；
任选地，所述用于高通量测序的芯片是具有规则矩阵的裸芯片；
任选地，所述雾化器在稳定状态的雾化速率为100至400μL/min，优选229μL/min；
任选地，所述雾化器的喷雾出口直径为0.2cm至1cm，优选0.5cm；
任选地，所述雾化器的雾滴喷口与所述芯片的距离是0.75cm至1.5cm，优选1cm；
任选地，所述雾化器的喷雾方向向上，所述芯片在所述雾化器的雾滴喷口上方，且所述喷雾方向与所述芯片的工作面形成一个锐角角度，优选地，所述角度是30°至60°，优选30°至45°，更优选45°；
任选地，所述芯片在所述雾化器的雾滴喷口上方左右移动接收所述雾滴；
任选地，所述芯片接收所述雾滴的时间是5s至60s，优选30s。
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