ES2348435T3

ES2348435T3 - Aparato y procedimiento para la secuenciacion de acidos nucleicos.

Info

Publication number: ES2348435T3
Application number: ES02715174T
Authority: ES
Inventors: Scott B. Dewell; John W. Simpson; Michael Philip Weiner; Jonathan M. Rothberg; Joel S. Bader; Jane Berka; Christopher M. Colangelo; Keith Mcdade
Original assignee: 454 Life Science Corp
Current assignee: 454 Life Science Corp
Priority date: 2001-03-21
Filing date: 2002-03-21
Publication date: 2010-12-07
Anticipated expiration: 2022-03-21
Also published as: US20070092872A1; CA2441603A1; JP4354184B2; JP2005505748A; US20020012930A1; AU2002247390B2; US7335762B2; US7244559B2; US7264929B2; EP1381693A1; CA2441603C; AU2002247390B9; WO2002077287A1; AU2002247390A1; EP1381693A4; EP1381693B1; DE60236502D1; US20030068629A1; US20030100102A1; ATE468915T1

Abstract

Matriz para secuenciar un ácido nucleico, que comprende: una oblea cavitada de fibras ópticas formadas a partir de un haz de una pluralidad de fibras ópticas individuales, presentando cada fibra óptica individual un diámetro de entre 3 y 100 µm, comprendiendo la oblea una superficie superior y una superficie inferior, comprendiendo la superficie superior más de 400.000 cámaras de reacción, en la que las cámaras de reacción se encuentran grabadas en la superficie superior de la oblea cavitada de fibras ópticas y en el que el grosor de la oblea entre la superficie superior y la superficie inferior presenta un grosor de entre 0,5 mm y 5,0 mm; en el que la profundidad de cada cámara de reacción se encuentra comprendida entre una mitad del diámetro de la fibra óptica individual y tres veces el diámetro de la fibra óptica individual, y en el que una pluralidad de cámaras de reacción sobre la superficie superior de la oblea cavitada presenta un ácido nucleico en las mismas, y en el que 50% a 100% de las cámaras de reacción puede presentar un soporte sólido móvil con un enzima de secuenciación inmovilizado sobre el mismo.

Description

CAMPO TÉCNICO [0001] La invención se refiere a un aparato y a métodos para determinar la secuencia de un ácido nucleico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] Muchas enfermedades se asocian a secuencias particulares de ADN. Las secuencias de ADN con frecuencia se denominan polimorfismos de secuencia de ADN para indicar que la secuencia de ADN asociada a un estado de enfermedad difiere de la secuencia de ADN correspondiente en individuos no afectados. Entre los polimorfismos de secuencia de ADN se incluyen, por ejemplo, inserciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos en una secuencia respecto a una segunda secuencia. Un ejemplo de un polimorfismo de secuencia de ADN particular es 5'-ATGC-3' respecto a la secuencia 5'-ATGG-3' en una localización particular en el genoma humano. El primer nucleótido 'G' en la última secuencia ha sido sustituido por el nucleótido 'C' en la primera secuencia. La primera secuencia se asocia a un estado de enfermedad particular, mientras que la última secuencia se encuentra en individuos que no padecen la enfermedad. De esta manera, la presencia de la secuencia de nucleótidos 5'-ATCG-3' indica que el individuo presenta una enfermedad particular. Este tipo particular de polimorfismo de secuencia es conocido como polimorfismo de nucleótido único,

o SNP, debido a que la diferencia entre las secuencias se debe a un cambio de un único nucleótido. [0003] Las técnicas que permiten la rápida detección de tan sólo un único cambio de base de ADN resultan, por lo tanto, metodologías importantes para la utilización en el análisis genético. Debido al gran tamaño del genoma humano, del orden de 3.000 millones de pares de bases, las técnicas para identificar polimorfismos deben ser suficientemente sensibles para identificar específicamente la secuencia que contiene el polimorfismo en una población potencialmente grande de ácidos nucleicos. [0004] Típicamente, se lleva a cabo un análisis de polimorfismo de secuencias del ADN mediante el aislamiento del ADN de un individuo, la manipulación del ADN aislado, por ejemplo mediante digestión del ADN con enzimas de restricción y/o la amplificación de un subconjunto de secuencias en el ADN aislado. A continuación, se examina adicionalmente el ADN manipulado para determinar si se encuentra presente una secuencia particular. [0005] Entre los procedimientos utilizados comúnmente para analizar el ADN se incluyen la electroforesis. Entre las aplicaciones comunes de la electroforesis se incluyen la electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida. Las secuencias de ADN se insertan, o se cargan, en los geles y se someten a un campo eléctrico. Debido a que el ADN porta una carga negativa uniforme, el ADN migra a través del gel basado en propiedades que incluyen la longitud de la secuencia, la conformación tridimensional e interacciones con la matriz de gel tras la aplicación del campo eléctrico. En la mayoría de aplicaciones, las moléculas de ADN más pequeñas migrarán más rápidamente a través del gel que los fragmentos más grandes. Tras prolongar la electroforesis durante un periodo de tiempo suficientemente largo, las moléculas de ADN en la población inicial de secuencias de ADN se habrán separado según sus tamaños relativos. [0006] De esta manera pueden detectarse moléculas particulares de ADN utilizando una diversidad de metodologías de detección. Para algunas aplicaciones, se identifican secuencias particulares de ADN a partir de la presencia de etiquetas detectables, tales como marcajes radioactivos, unidos a molécula de ADN específicas. [0007] Los análisis de separación de tipo electroforético pueden resultar menos deseables para aplicaciones en las que resulta deseable analizar rápida, económica y exactamente un gran número de muestras de ácidos nucleicos para polimorfismos de secuencia particulares. Por ejemplo, el análisis de tipo electroforético puede requerir una gran cantidad de ADN de entrada. Además, el procesamiento de un gran número de muestras, requerido para los análisis de ácidos nucleicos basados en la electroforesis, puede ser laboriosa. Además, estas técnicas pueden requerir muestras de moléculas de ADN idénticas, que deben crearse antes de la electroforesis a costes que pueden ser considerables. [0008] Recientemente se han puesto a disposición del público sistemas automáticos de electroforesis. Sin embargo, la electroforesis puede resultar poco adecuada para aplicaciones tales como la secuenciación clínica, en la que resultan necesarias unidades relativamente rentables de alto rendimiento. De esta manera, la necesidad de métodos no electroforéticos para la secuenciación es grande. Para muchas aplicaciones, se utiliza la electroforesis conjuntamente con el análisis de secuencias de ADN. [0009] Se han descrito varias alternativas a la secuenciación de tipo electroforético. Entre ellas se incluyen la microscopía electrónica de barrido de efecto túnel, la secuenciación mediante hibridación y los métodos de detección de moléculas individuales. [0010] Otra alternativa al análisis de separación de tipo electroforético son los análisis de ácidos nucleicos basados en un sustrato sólido. Estos sustratos típicamente se basan en la utilización de grandes números de sondas de ácidos nucleicos fijados en diferentes localizaciones en un soporte sólido. Entre estos soportes sólidos se incluyen, por ejemplo, superficies de vidrio, placas de microtitulación de plástico, hojas de plástico, polímeros delgados o semiconductores. [0011] Las sondas pueden, por ejemplo, adsorberse o unirse covalentemente al soporte, o pueden microencapsularse o de otro modo atraparse dentro de una matriz de sustrato, membrana o película.

[0012] Entre los análisis de ácidos nucleicos basados en un sustrato pueden incluirse aplicar un ácido nucleico de muestra que se conoce o se sospecha que contiene un polimorfismo de secuencia particular a una matriz o a sondas unidas al sustrato sólido. Los ácidos nucleicos en la población se dejan hibridar a secuencias complementarias unidas al sustrato, en caso de encontrarse presente. A continuación, se detectan las secuencias de ácidos nucleicos hibridantes en una etapa de detección. [0013] Las metodologías de hibridación basadas en una matriz de soporte sólido y de secuenciación pueden requerir una concentración elevada de ADN de muestra y pueden resultar afectadas negativamente por la cinética relativamente lenta de la hibridación de las muestras de ácidos nucleicos con las sondas oligonucleótidas inmovilizadas. Con frecuencia, únicamente se dispone de una cantidad reducida de ADN de molde, y puede resultar deseable disponer de concentraciones elevadas de la secuencia diana de ácidos nucleicos. De esta manera, los análisis de detección basados en un sustrato con frecuencia incluyen una etapa en la que se amplifican copias del ácido nucleico diana, o un subconjunto de secuencias en el ácido nucleico diana. Los métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo, pueden incrementar un número pequeño de sondas diana en varios órdenes de magnitud en solución. Sin embargo, la PCR puede reusltar difícil de incorporar en un enfoque de fase sólida debido a que el ADN amplificado no se encuentra inmovilizado sobre la superficie de la matriz de soporte sólido. [0014] La detección basada en una fase sólida de los polimorfismos de secuencia ha sido descrita. Un ejemplo es un protocolo de "mini-secuenciación" basado en un principio de fase sólida descrito por Hultman et al., Nucl. Acids Res. 17:4937-4946, 1988; Syvanen et al., Genomics 8:684-692, 1990. En este estudio, la incorporación de un nucleótido marcado radioactivamente se mide y se utiliza para el análisis de un polimorfismo de tres alelos del gen de la apolipoproteína E humana. Sin embargo, dichos métodos radioactivos no resultan muy adecuados para las aplicaciones clínicas rutinarias, y por lo tanto, el desarrollo de un método no radioactivo simple y altamente sensible para el análisis rápido de la secuencia del ADN también ha despertado un gran interés. [0015] Walt D. et al., Anal. Chem. 72:5618-5624, 2000, dan a conocer una matriz aleatoria de microesferas de ADN de fibra óptica de alta densidad. [0016] Walt D. et al., Anal. Chem. 70:1242-1248, 1998, dan a conocer matrices detectoras ópticas direccionables de alta densidad ordenadas aleatoriamente. [0017] Winograd N. et al., Anal. Chem. 71:3318-3324, 1999, dan a conocer matrices con

10.000 nanoviales/cm2. [0018] Walt D. et al., Nature Biotech. 14:1681-1684, 1996, dan a conocer una micromatriz biodetectora de ADN de fibra óptica para el análisis de la expresión génica. [0019] La patente WO nº 97/27326 da a conocer un método de fabricación y lectura de una

matriz de alta densidad para un método de fibra óptica. [0020] La patente WO nº 98/50782 (Walt D. et al.) se refiere a un biosensor de fibra óptica para detectar selectivamente especies oligonucleótidas en una muestra líquida mixta. [0021] La patente WO nº 97/19193 da a conocer composiciones y un método para la amplificación y detección múltiplex de moléculas de interés que implica la replicación por círculo rodante. [0022] Smith C. et al., Gen. Anal. Biomol. Engineer. 15:35-40, 1999, dan a conocer la amplificación por círculo rodante de ADN inmovilizado sobre superficies sólidas y su aplicación a la detección múltiplex de mutaciones.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN [0023] La invención se basa en parte en la utilización de matrices para determinar las secuencias de ácidos nucleicos. [0024] De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, la invención implica una matriz que incluye una superficie plana con una pluralidad de cámaras de reacción dispuestas sobre la misma, en la que las cámaras de reacción presentan un espaciado de centro a centro de entre 5 y 200 µm y cada cámara presenta una anchura en por lo menos una dimensión de entre 0,3 µm y 100 µm. En algunas realizaciones, la matriz es una superficie plana con una pluralidad de cavidades sobre la misma, en donde cada cavidad forma una cámara de reacción de analito. En una realización preferente, la matriz se construye a partir de un haz seccionado de fibras ópticas (es decir, un haz de cables de fibra óptica fusionados) y las cámaras de reacción se forman mediante grabado de una superficie de la matriz reactora de fibras ópticas ("FORA"). Las cavidades también pueden formarse en el sustrato mediante grabado, moldeo o micromecanización. [0025] Específicamente, cada cámara de reacción en la matriz típicamente presenta una anchura en por lo menos una dimensión de entre 0,3 µm y 100 µm, preferentemente de entre 0,3 µm y 20 µm, más preferentemente de entre 0,3 µm y 10 µm. En una realización separada, los presentes inventores contemplan cámaras de reacción más grandes, preferentemente que presentan una anchura en por lo menos una dimensión de entre 20 µm y 70 µm. [0026] La matriz típicamente contiene más de 1.000 cámaras de reacción, preferentemente más de 400.000, más preferentemente entre 400.000 y 20.000.000, y más preferentemente entre 1.000.000 y 16.000.000 cavidades o cámaras de reacción. La forma de cada cavidad con frecuencia es sustancialmente hexagonal, aunque las cavidades también pueden ser cilíndricas. En algunas realizaciones, cada cavidad presenta una superficie de pared lisa; sin embargo, los presentes inventores contemplan que cada cavidad también pueda presentar por lo menos una superficie de pared irregular. El fondo de cada una de las cavidades puede ser plano o cóncavo. [0027] La matriz se construye típicamente para que presente cavidades o cámaras de reacción con un espaciado centro a centro de entre 10 y 150 µm, preferentemente de entre 50 y100 µm. [0028] Cada cavidad o cámara de reacción típicamente presenta una profundidad de entre 10 µm y 100 µm; alternativamente, la profundad es entre 0,25 y 5 veces la anchura de la cavidad, preferentemente entre 0,3 y 1 vez la anchura de la cavidad. [0029] En una realización, las matrices indicadas en la presente memoria típicamente incluyen una superficie superior plana y una superficie inferior plana, que es ópticamente conductora de manera que las señales ópticas procedentes de las cámaras de reacción pueden detectarse a través de la superficie plana del fondo. En estas matrices, típicamente la distancia entre la superficie superior y la superficie inferior no es superior a 10 cm, preferentemente no superior a 3 cm, más preferentemente no superior a 2 cm, y habitualmente de entre 0,5 mm y 5 mm. [0030] En una realización, cada cavidad de la matriz contiene reactivos para analizar un ácido nucleico o proteína. La matriz también puede incluir una segunda superficie separada de la matriz plana y en contacto frontal con la misma de manera que se forma una cámara de flujo sobre la matriz. [0031] En otro aspecto, la invención implica una matriz para llevar a cabo reacciones comunes separadas en paralelo en un ambiente acuoso, en la que la matriz incluye un sustrato que presenta por lo menos 1.000 cámaras de reacción discretas. Estas cámaras contienen un material de partida que es capaz de reaccionar con un reactivo. Cada una de las cámaras de reacción se dimensiona de manera que, al administrar uno o más líquidos que contienen por lo menos un reactivo en cada cámara de reacción, el tiempo de difusión para que el reactivo se difunda hacia el exterior del pocillo excede el tiempo necesario para que el material de partida reaccione con el reactivo para formar un producto. Las cámaras de reacción pueden formarse mediante la generación de una pluralidad de cavidades sobre el sustrato, o mediante la generación de áreas discretas sobre una superficie plana, presentando las áreas unas propiedades químicas de la superficie diferentes de las de la superficie plana circundante. [0032] En una realización, cada cavidad o cámara de reacción de la matriz contiene reactivos para analizar un ácido nucleico o proteína. Típicamente aquellas cámaras de reacción que contienen un ácido nucleico (no resulta necesario que la totalidad de las cámaras de reacción en la matriz contengan un ácido nucleico) contienen únicamente una especie de ácido nucleico (es decir, una única secuencia que resulta de interés). Puede encontrarse una única copia de esta especie de ácido nucleico en cualquier cámara de reacción particular, o pueden encontrarse múltiples copias. Resulta generalmente preferente que una cámara de reacción contenga por lo menos 100 copias de una secuencia de ácidos nucleicos, preferentemente por lo menos 100.000 copias, y más preferentemente entre 100.000 y

1.000.000 copias del ácido nucleico. En una realización, la especie de ácido nucleico se amplifica para proporcionar el número deseado de copias utilizando PCR, RCA, reacción en cadena de la ligasa, otro tipo de amplificación isotérmica, u otros medios convencionales de amplificación de ácidos nucleicos. En una realización, el ácido nucleico es de una cadena. En otras realizaciones, el ADN de una cadena es un concatámero con cada copia unida covalentemente extremo con extremo. [0033] El ácido nucleico puede inmovilizarse en la cámara de reacción, mediante unión a la cámara misma o mediante unión a un soporte sólido móvil que se administra en la cámara. Podría administrarse un agente bioactivo en la matriz mediante la dispersión sobre la matriz de una pluralidad de soportes sólidos móviles, presentando cada soporte sólido móvil por lo menos un reactivo inmovilizado sobre el mismo, en el que el reactivo resulta adecuado para la utilización en una reacción de secuenciación de ácidos nucleicos. [0034] La matriz también puede incluir una población de soporte sólidos móviles dispuestos en las cámaras de reacción, presentando cada soporte sólido móvil uno o más agentes bioactivos (tal como un ácido nucleico o un enzima de secuenciación) unidos al mismo. El diámetro de cada soporte sólido móvil puede variar; los presentes inventores prefieren que el diámetro del soporte sólido móvil sea de entre 0,01 y 0,1 veces la anchura de cada cavidad. No todas las cámaras de reacción deben contener uno o más soportes sólidos móviles. Existen tres realizaciones contempladas: una en la que por lo menos 5% a 20% de las cámaras de reacción pueden presentar un soporte sólido móvil que presenta por lo menos un reactivo inmovilizado sobre el mismo, una segunda realización en la que 20% a 60% de las cámaras de reacción pueden presentar un soporte sólido móvil que presenta por lo menos un reactivo inmovilizado sobre el mismo, y una tercera realización en la que 50% a 100% de las cámaras de reacción puede presentar un soporte sólido móvil que presenta por lo menos un reactivo inmovilizado sobre el mismo. [0035] El soporte sólido móvil típicamente presenta por lo menos un reactivo inmovilizado sobre el mismo. Para las realizaciones referentes a reacciones de pirosecuenciación, o más generalmente a la detección del ATP, el reactivo puede ser un polipéptido con actividad de sulfurilasa o de luciferasa, o ambas. Los soportes sólidos móviles pueden utilizarse en métodos para dispersar sobre la matriz una pluralidad de soportes sólidos móviles que presentan una o más secuencias de ácidos nucleicos o proteínas o enzimas inmovilizados sobre los mismos. [0036] En otro aspecto, la invención implica un aparato para el seguimiento simultáneo de la matriz de cámaras de reacción para la generación de luz, indicando que tiene lugar una reacción en un sitio particular. En la presente realización, las cámaras de reacción son sensores, adaptados para contener analitos y un medio enzimático o fluorescente para generar luz en las cámaras de reacción. En la presente realización de la invención, el sensor resulta adecuado para la utilización en un ensayo bioquímico o de tipo celular. El aparato también incluye un dispositivo ópticamente sensible dispuesto de manera que, durante la utilización, la luz procedente de una cámara de reacción particular incide en una región predeterminada particular del dispositivo ópticamente sensible, así como un medio para determinar el nivel de luz que incide en cada una de las regiones predeterminadas y un medio para registrar la variación del nivel lumínico durante el tiempo para cada una de las cámaras de reacción. [0037] En una realización específica, el instrumento incluye un medio de detección de luz que presenta un medio de captura de luz y un segundo haz de fibras ópticas para transmitir luz al medio detector de luz. Los presentes inventores contemplan que el medio de captura de luz sea una cámara CCD. El segundo haz de fibras ópticas típicamente se encuentra en contacto óptico con la matriz, de manera que la luz generada en una cámara de reacción individual es capturada por una fibra separada o grupo de fibras separadas del segundo haz de fibras ópticas para la transmisión al medio de captura de luz. [0038] Las matrices anteriores pueden utilizarse para llevar a cabo reacciones comunes en paralelo separadas en un ambiente acuoso. El método incluye administrar un líquido que contiene por lo menos un reactivo en las matrices indicadas, en el que determinadas cámaras de reacción (no necesariamente todas) en la matriz contienen un material de partida que es capaz de reaccionar con el reactivo. Cada una de las cámaras de reacción se dimensiona de manera que, al administrar el líquido en cada cámara de reacción, el tiempo de difusión para que el reactivo difunda hacia el exterior del pocillo exceda el tiempo necesario para que el material de partida reaccione con el reactivo para formar un producto. El método también incluye lavar el líquido de la matriz durante el periodo de tiempo tras reaccionar el material de partida con el reactivo para formar un producto en cada cámara de reacción, aunque antes de que el reactivo administrado en una cámara de reacción cualquiera haya difundido hacia el exterior de dicha cámara de reacción hacia el interior de cualquier otra cámara de reacción. En una realización, el producto formado en una cámara de reacción cualquiera es independiente del producto formado en cualquier otra cámara de reacción, sino que se genera utilizando uno o más reactivos comunes. El material de partida puede ser una secuencia de ácidos nucleicos y por lo menos un reactivo en el líquido es un nucleótido o análogo de nucleótido. El líquido adicionalmente puede presentar una polimerasa capaz de hacer reaccionar la secuencia de ácidos nucleicos y el nucleótido o análogo de nucleótido. Las etapas del método pueden repetirse secuencialmente. [0039] El aparato incluye un nueva cubeta de administración de reactivo para la utilización con las matrices descritas en la presente memoria, para proporcionar reactivos líquidos a la matriz, y un medio de administración de reactivo en comunicación con la cubeta de administración de reactivo. [0040] Las exposiciones de una o más realizaciones de la invención se proporcionan en la descripción adjunta, posteriormente. Aunque puede utilizarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen los métodos y materiales preferentes. Otras características, objetivos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y de las reivindicaciones. En la memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan el significado entendido comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que pertenece la presente invención. A menos que se indique expresamente lo contrario, las técnicas utilizadas o contempladas en la presente invención son metodología estándares bien conocidas por el experto ordinario en la materia. Los ejemplos de realizaciones se proporcionan únicamente con fines ilustrativos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS [0041]

Las Figs. 1A-D son ilustraciones esquemáticas de la amplificación de tipo círculo rodante

utilizando un cebador de anclaje.

La Fig. 2: es un dibujo de un aparato de secuenciación según la presente invención.

La Fig. 3: es un dibujo de una cámara de perfusión según la presente invención.

La Fig. 4: es un dibujo de un extremo de una fibra óptica cavitada de la presente in

vención.

La Fig. 5: es una línea de un resultado de secuencia de un molde concatamérico

generado utilizando la amplificación por círculo rodante (SEC ID nº 12).

La Fig. 6: es una micrografía de una matriz de reactores de fibras ópticas (FORA).

La Fig. 7: es una ilustración esquemática para la preparación de una FORA recubierta.

La Fig. 8: es una micrografía de la administración de ADN en pocillos individuales.

La Fig. 9: es una ilustración esquemática de la cámara de flujo y de la FORA.

La Fig. 10: es un diagrama del instrumento analítico de la presente invención.

La Fig. 11: es una ilustración esquemática de reacciones microscópicas de secuencia

ción en paralelo dentro de una FORA.

La Fig. 12: es una micrografía de reacciones en pocillos individuales.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN [0042] Los métodos y aparatos descritos en la presente memoria permiten determinar información de secuencias de ácidos nucleicos sin necesidad de clonar en primer lugar un ácido nucleico. Además, el método es altamente sensible y puede utilizarse para determinar la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico molde, que se encuentra presente en únicamente unas cuantas copias en una población inicial de ácidos nucleicos. Además, el método puede utilizarse para determinar simultáneamente las secuencias de un gran número de ácidos nucleicos. [0043] Los métodos y aparatos descritos resultan generalmente útiles para cualquier aplicación en la que se desee la identificación de cualquier secuencia particular de ácidos nucleicos. Por ejemplo, los métodos permiten la identificación de polimorfismos de un único nucleótido (SNPs), haplotipos que implican múltiples SNPs u otros polimorfismos en un único cromosoma, y perfilado de transcritos. Entre otros usos se incluyen la secuenciación de constructos artificiales de ADN para confirmar o inducir su secuencia primaria, o para identificar clones mutantes específicos a partir de cribados de mutagénesis aleatoria, así como para obtener la secuencia de ADNc a partir de células individuales, tejidos completos u organismos en cualquier etapa del desarrollo o circunstancia ambiental con el fin de determinar el perfil de expresión génica de dicho espécimen. Además, los métodos permiten la secuenciación de productos de PCR y/o de fragmentos de ADN clonados de cualquier tamaño, aislados a partir de cualquier fuente. [0044] Entre los métodos descritos en la presente memoria se incluyen un procedimiento de preparación de muestras que resulta en una matriz de sustratos sólidos o sólidos móviles que contienen una pluralidad de cebadores de anclaje unidos covalentemente a un ácido nucleico que contiene una o más copias complementarias a un ácido nucleico diana. La formación del cebador de anclaje unido covalentemente y una o más copias del ácido nucleico diana preferentemente se produce mediante la hibridación del cebador de anclaje a una región complementaria de un ácido nucleico circular, y después extendiendo el cebador de anclaje hibridado con una polimerasa, resultando en la formación de un ácido nucleico que contiene una o más copias de una secuencia complementaria al ácido nucleico circular. [0045] La unión del cebador de anclaje a un sustrato sólido o sólido móvil puede producirse antes, durante o después de la expresión del cebador de anclaje hibridado. De esta manera, en una realización, se unen uno o más cebadores de anclaje al sustrato sólido o sólido móvil, después de los cual se hibrida el cebador de anclaje a un ácido nucleico diana y se extiende en presencia de una polimerasa. Alternativamente, en una segunda realización, en primer lugar se hibrida un cebador de anclaje a un ácido nucleico diana, y se extiende el extremo 3'OH del cebador de anclaje hibridado con una polimerasa. El cebador de anclaje extendido después se une al sustrato sólido o sólido móvil. Mediante la modificación de la secuencia de los cebadores de anclaje resulta posible amplificar específicamente ácidos nucleicos diana diferentes presentes en una población de ácidos nucleicos. [0046] Las secuencias en el ácido nucleico diana pueden identificarse de varias maneras.

Preferentemente, se hibrida un cebador de secuenciación al ácido nucleico amplificado y se utiliza para generar un producto de secuenciación. La secuencia de nucleótidos del producto secuencia seguidamente se determina, permitiendo de esta manera la determinación del ácido nucleico. De manera similar, en una realización, se amplifica el ácido nucleico molde antes de su unión a una perla u otro soporte sólido móvil. En otras realizaciones, el ácido nucleico molde se une a la perla antes de su amplificación. [0047] Los métodos de la presente invención también pueden utilizarse para la secuenciación de fragmentos de ADN generados mediante técnicas analíticas que sondean estructura de ADN de orden superior a partir de su sensibilidad diferencial a enzimas, radiación o tratamiento químico (por ejemplo tratamiento parcial de ADNasa de la cromatina) o para la determinación del estado de metilación del ADN mediante la comparación de la secuencia generado a partir de un tejido dado con o sin tratamiento previo con compuestos químicos que convierten la metil-citosina en timidina (u otro nucleótido) como la base efectiva reconocida por la polimerasa. Además, los métodos de la presente invención pueden utilizarse para someter a ensayo los cambios fisiológicos en la célula que se producen durante el desarrollo

: o senescencia al nivel de la secuencia primaria. [0048] La invención también proporciona métodos para preparar secuencias de ácidos nucleicos para el análisis posterior, por ejemplo la secuenciación.

I.: Aparato para la secuenciación de ácidos nucleicos [0049] La presente invención proporciona un aparato para la secuenciación de ácidos nucleicos, que generalmente comprende una o más cámaras de reacción para llevar a cabo una reacción de secuenciación, un medio para administrar reactivos en la cámara o cámaras de reacción y para extraerlos de las mismas, y un medio para detectar un suceso de reacción de secuenciación. En otra realización, el aparato incluye una cubeta de administración de reactivo que contiene una pluralidad de cavidades sobre una superficie plana. En una realización preferente, el aparato se conecta a por lo menos un ordenador para controlar los componentes individuales del aparato y para almacenar y/o analizar la información obtenida de la detección del suceso de reacción de secuencia. [0050] La invención también proporciona una o más cámaras de reacción dispuestas en forma de una matriz sobre un material de sustrato inerte, también denominado en la presente memoria "soporte sólido", que permite la combinación de los reactivos en una reacción de secuenciación en un espacio definido y para la detección del suceso de reacción de secuenciación. De esta manera, tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "cámara de reacción" o "cámara de reacción de analito" se refieren a un área localizada en el material de sustrato que facilita la interacción de los reactivos, por ejemplo en una reacción de secuenciación de ácidos nucleicos. Tal como se comenta en mayor detalle posteriormen

te, las reacciones de secuenciación contempladas por la invención preferentemente se producen en numerosas muestras individuales de ácidos nucleicos en tándem, en particular secuenciando simultáneamente numerosas muestras de ácidos nucleicos derivadas de ADN genómico o cromosómico. Por lo tanto, el aparato de la invención preferentemente comprende una matriz que presenta un número suficiente de cámaras de reacción para llevar a cabo dichas numerosas reacciones individuales de secuenciación. En una realización, la matriz comprende por lo menos 1.000 cámaras de reacción. En otra realización, la matriz comprende más de 400.000 cámaras de reacción, preferentemente entre 400.000 y

20.000.000 cámaras de reacción. En una realización más preferente, la matriz comprende entre 1.000.000 y 16.000.000 cámaras de reacción. [0051] Las cámaras de reacción en la matriz típicamente adoptan la forma de una cavidad

o pocillo en el material de sustrato que presenta una anchura y profundidad, en la que pueden depositarse reactivos. Típicamente se unen uno o más de los reactivos al material de sustrato en la cámara de reacción y el resto de los reactivos se encuentran en un medio que facilita la reacción y que fluye a través de la cámara de reacción. Al formarse como cavidades o pocillos, las cámaras preferentemente son de dimensión y orden suficientes para permitir: (i) la introducción de los reactivos necesarios en las cámaras, (ii) que tengan lugar las reacciones dentro de la cámara, e (iii) la inhibición de la mezcla de los reactivos entre cámaras. La forma del pocillo o cavidad preferentemente es circular o cilíndrica, pero puede presentar múltiples caras de manera que se aproxime a una forma circular o cilíndrica. En otra realización, la forma del pocillo o cavidad es sustancialmente hexagonal. La cavidad puede presentar paredes de superficie lisa. En una realización adicional, la cavidad puede presentar por lo menos una superficie de pared irregular. Las cavidades pueden presentar un fondo plano o cóncavo. Las cámaras de reacción pueden separarse entre 5 µm y 200 µm. El espaciado se determina midiendo la distancia de centro a centro de dos cámaras de reacción contiguas. Típicamente, las cámaras de reacción pueden espaciarse entre 10 µm y 150 µm, preferentemente entre 50 µm y 100 µm. En una realización, las cámaras de reacción presentan una anchura en una dimensión de entre 0,3 µm y 100 µm. Las cámaras de reacción pueden presentar una anchura en una dimensión de entre 0,3 µm y 20 µm, preferentemente de entre 0,3 µm y 10 µm, y más preferentemente de aproximadamente 6 µm. En otra realización, las cámaras de reacción presentan una anchura de entre 20 µm y 70 µm. Finalmente la anchura de la cámara puede depender de si las muestras de ácidos nucleicos requieren la amplificación. En el caso de que no resulte necesaria la amplificación, resultan preferentes las de menor tamaño, por ejemplo de 0,3 µm. En el caso de que resulte necesaria la amplificación, resultan preferentes las de mayor tamaño, por ejemplo de 6 µm. La profundidad de las cámaras de reacción preferentemente es de entre 10 µm y 100 µm. Alternativamente, las cámaras de reacción pueden presentar una profundidad de entre 0,25 y 5 veces la anchura en una dimensión de la cámara de reacción o, en otra realización, de entre 0,3 y 1 vez la anchura en una dimensión de la cámara de reacción. [0052] En otro aspecto, la invención implica un aparato para determinar la secuencia de ácidos nucleicos en un polímero de ácido nucleico de molde. El aparato incluye una matriz que presenta una pluralidad de cavidades sobre una superficie plana. Cada cavidad forma una cámara de reacción de analito, en la que las cámaras de reacción presentan un espaciado de centro a centro de entre 5 y 200 µm. También incluye un medio de administración de ácidos nucleicos para introducir un polímero de ácido nucleico de molde en las cámaras de reacción, y un medio de administración de ácidos nucleicos para administrar reactivos en las cámaras de reacción para crear un ambiente de polimerización en el que los polímeros de ácidos nucleicos actuarán como polímeros de molde para la síntesis de polímeros de ácidos nucleicos complementarios al añadirse nucleótidos. El aparato incluye también un medio de administración de reactivo para proporcionar sucesivamente al ambiente de polimerización una serie de soluciones madre de alimentación, comprendiendo cada solución madre de alimentación un nucleótido seleccionado de entre los nucleótidos a partir de los que se formará el polímero de ácidos nucleicos complementario, de manera que, en el caso de que el nucleótido en la solución madre de alimentación sea complementario al siguiente nucleótido en el polímero de molde que debe secuenciarse, se incorporará el nucleótido en el polímero complementario y se liberará un pirofosfato inorgánico. También incluye un medio de detección para detectar la formación de pirofosfato inorgánico enzimáticamente, y un medio de procesamiento de los datos para determinar la identidad de cada nucleótido en los polímeros complementarios y de esta manera la secuencia de los polímeros de molde. [0053] En otro aspecto, la invención implica un aparato para determinar la secuencia de bases de una pluralidad de nucleótidos en una matriz. El aparato incluye una cubeta de reactivos que contiene una pluralidad de cavidades sobre una superficie plana. Cada cavidad forma una cámara de reacción de analito, en la que las cámaras de reacción presentan un espaciado de centro a centro de entre 5 y 200 µm. El aparato también incluye un medio de administración de reactivo para añadir un precursor de nucleótido 5'-trifosfato activado de una base nitrogenada conocida a una mezcla de reacción en cada cámara de reacción. Cada mezcla de reacción presenta una nucleótido polimerasa dirigida por molde y un molde polinucleótido de una cadena hibridado a una cadena de cebador oligonucleótido complementaria que es por lo menos un residuo nucleótido más corta que los moldes, para formar por lo menos un residuo nucleótido no apareado en cada molde en el extremo 3' de la cadena del cebador, bajo condiciones de reacción que permiten la incorporación del precursor activado de nucleótido 5'-trifosfato en el extremo 3' de las cadenas de cebador, con la condición de que la base nitrogenada del precursor activado nucleótido 5'-trifosfato sea complementaria a la base nitrogenada del residuo nucleótido no apareado de los moldes. El aparato también incluye un medio de detección para detectar si se ha incorporado o no el precursor nucleótido 5'-trifosfato en las cadenas de cebador en las que la incorporación del precursor nucleótido 5'-trifosfato indica que le residuo nucleótido no apareado del molde presenta una composición de bases nitrogenadas que es complementaria a la del precursor nucleótido 5'-trifosfato incorporado. El aparato también incluye un medio para repetir secuencialmente la segunda y tercera etapas en las que cada repetición secuencial añade y detecta la incorporación de un tipo de precursor activado nucleósido 5'-trifosfato de composición de bases nitrogenada conocida. El aparato también incluye un medio de procesamiento de los datos para determinar la secuencia de bases de los residuos nucleótidos no apareados del molde en cada cámara de reacción a partir de la secuencia de incorporación de los precursores nucleósidos.

Material de soporte sólido [0054] Puede utilizarse cualquier material como el material de soporte sólido, con la condición de que la superficie permita la unión estable de los cebadores y la detección de secuencias de ácidos nucleicos. El material de soporte sólido puede ser plano o puede encontrarse cavitado, por ejemplo en un extremo cavitado de una fibra óptica o en un micropocillo grabado, moldeado o de otro micromecanizado en la superficie plana, por ejemplo utilizando técnicas utilizadas comúnmente en la construcción de sistemas microelectromecánicos (ver, por ejemplo, Rai-Choudhury, HANDBOOK OF MICROLITHOGRAPHY, MICROMACHINING, AND MICROFABRICATION, volumen I: MICROLITHOGRAPHY, volumen PM39, SPIE Press, 1997; Madou, CRC Press, 1997; Aoki, Biotech. Histochem. 67:98-9, 1992; Kane et al., Biomaterials 20:2363-76, 1999; Deng et al., Anal. Chem. 72:3176-80, 2000; Zhu et al., Nat. Genet. 26:283-9, 2000). En algunas realizaciones, el soporte sólido es ópticamente transparente, por ejemplo vidrio. [0055] Puede construirse una matriz de sitio de unión sobre un soporte sólido ópticamente transparente utilizando técnicas litográficas utilizadas comúnmente en la construcción de circuitos electrónicos integrados, tal como se describen en, por ejemplo, las técnicas para la unión descritas en las patentes US nº 5.143.854, nº 5.445.934, nº 5.744.305 y nº 5.800.992; Chee et al., Science 274:610-614, 1996; Fodor et al., Nature 364:555-556, 1993; Fodor et al., Science 251:767-773, 1991; Gushin et al., Anal. Biochem. 250:203-211, 1997; Kinosita et al., Cell 93:21-24, 1998; Kato-Yamada et al., J. Biol. Chem. 273:19375-19377, 1998; y Ya-suda et al., Cell 93:1117-1124, 1998. La fotolitografía y la litografía de haz electrónico sensibilizan el soporte sólido o sustrato con un grupo de enlace que permite la unión de una biomolécula modificada (por ejemplo proteínas o ácidos nucleicos) (ver, por ejemplo, Service, Science 283:27-28, 1999; Rai-Choudhury, HANDBOOK OF MICROLITHOGRAPHY, MICROMACHINING, AND MICROFABRICATION, volumen I: MICROLITHOGRAPHY, volumen PM39, SPIE Press, 1997. Alternativamente, puede generarse una matriz de sitios sensibilizados utilizando tecnología de capa fina, tal como se describe en Zasadzinski et al., Science 263:1726-1733, 1994.

Matrices de sustrato de fibra óptica [0056] El material de sustrato preferentemente se realiza de un material que facilite la detección del suceso de reacción. Por ejemplo, en una reacción de secuenciación típica, puede realizarse un seguimiento de la unión de un dNTP a una muestra de ácido nucleico que debe secuenciarse, mediante la detección de los fotones generados por la acción enzimática sobre el fosfato liberado en la reacción de secuenciación. De esta manera, la construcción del material de sustrato de un material transparente u ópticamente conductor (es decir conductor de la luz) facilita la detección de los fotones. [0057] En algunas realizaciones, el soporte sólido puede acoplarse a un haz de fibras ópticas que se utilizan para detectar y transmitir el producto luz. El número total de fibras ópticas en el haz puede modificarse de manera que se corresponda al número de cámaras de reacción individuales en la matriz utilizada en la reacción de secuenciación. El número de fibras ópticas incorporado en el haz se diseña para que corresponda a la resolución de un dispositivo de detección, de manera que permita la formación de imágenes 1:1. Los tamaños globales de los haces se seleccionan de manera que optimicen el área utilizable del dispositivo de detección, manteniendo simultáneamente las características deseables del reactivo (de flujo) en la cámara de reacción. De esta manera, para una matriz de 4.096 x 4.096 píxels CCD (dispositivo de carga acoplada) con píxels de 15 µm, el haz de fibras se selecciona para que sea de aproximadamente 60 mm x 60 mm, o para que presente un diámetro de aproximadamente 90 mm. El número deseado de fibras ópticas se fusiona inicialmente en un haz o matriz de fibra óptica, el extremo del cual seguidamente puede cortarse y pulirse para formar una "oblea" del grosor requerido (por ejemplo de 1,5 mm). Las obleas de fibra óptica resultantes presentan propiedades de manipulación similares a las de una lámina de vidrio. Las fibras individuales pueden presentar cualquier diámetro (por ejemplo entre 2 µm y 100 µm). [0058] En algunas realizaciones, se utilizan dos haces de fibras ópticas. Un primer haz se une directamente al dispositivo de detección (también denominado en la presente memoria "haz de fibras" o "conector") y se utiliza un segundo haz como el sustrato de cámaras de reacción (la "oblea" o "sustrato"). En este caso, los dos se mantienen en contacto directo, opcionalmente utilizando un líquido de acoplamiento óptica con el fin de formar las imágenes de los centros de reacción en el dispositivo de detección. En el caso de que se utilice un CCD como dispositivo de detección, la oblea podría ser ligeramente más grande para maximizar la utilización del área del CCD, o ligeramente menor con el fin de corresponder al formato de un portaobjetos de microscopía típico (25 mm x 75 mm). Los diámetros de las fibras individuales en los haces se seleccionan de manera que maximicen la probabilidad de una se forme una imagen de una reacción individual en un único píxel en el dispositivo de detección, dentro de las limitaciones del estado de la técnica. Los diámetros ejemplares son de 6 a 8 µm para el haz de fibras y de 6 a 50 µm para la oblea, aunque puede utilizarse cualquier diámetro en el intervalo de 3 a 100 µm. Pueden obtenerse haces de fibras comercialmente de fabricantes de cámaras CCD. En estas matrices, típicamente la distancia entre la superficie superior y la superficie inferior no es superior a 10 cm, preferentemente no es superior a 3 cm, más preferentemente no es superior a 2 cm, y habitualmente es de entre 0,5 mm y 5 mm. Por ejemplo, la oblea puede obtenerse de Incom Inc. (Charlton, MA) y cortarse y pulirse a partir de una fusión grande de fibras ópticas, típicamente de 2 mm de grosor, aunque posiblemente de entre 0,5 y 5 mm de grosor. La oblea presenta propiedades de manipulación similares a las de una lámina de vidrio o de un portaobjetos de microscopía de vidrio. [0059] Las cámaras de reacción pueden formarse en el sustrato realizado en material de fibra óptica. La superficie de la fibra óptica se cavita mediante tratamiento de los extremos de un haz de fibras, por ejemplo con ácido, para formar una depresión en el material de fibra óptica. De esta manera, en una realización, se forman cavidades a partir de un haz de fibras ópticas, preferentemente pueden formarse cavidades mediante grabado de un extremo del haz de fibras ópticas. Cada superficie cavitada puede formar una cámara de reacción. Dichas matrices se denominan en la presente memoria matrices reactoras de fibra óptica, o FORA. Las depresiones presentan una profundidad comprendida entre aproximadamente una mitad del diámetro de una fibra óptica individual y dos a tres veces el diámetro de la fibra. Las cavidades pueden introducirse en los extremos de las fibras mediante la introducción de un lado de la oblea de fibras ópticas en un baño de ácido durante periodo variable de tiempo. El periodo de tiempo puede variar dependiendo de la profundidad global de la cavidad de reacción deseada (ver, por ejemplo, Walt et al., Anal. Chem. 70:1888, 1996). Una cavidad en canal amplia puede presentar dimensiones de velocidad del flujo uniforme de aproximadamente 14 mm x 43 mm. De esta manera, con estas dimensiones aproximadas y una densidad de aproximadamente 4,82 x 10-4 cavidades/µm2, el aparato puede presentar aproximadamente 290.000 cavidades fluidamente accesibles. Son conocidos de la técnica varios métodos para unir moléculas (y detectar las moléculas unidas) en las cavidades grabadas en los extremos de los haces de fibras ópticas (ver, por ejemplo, Michael et al., Anal. Chem. 70:1242-1248, 1998; Ferguson et al., Nature Biotechnology 14:1681-1684, 1996; Healey y Walt, Anal. Chem. 69:2213-2216, 1997). También puede crearse un patrón de sitios reactivos en el micropocillo utilizando técnicas fotolitográficas similares a las utilizadas en la generación de un patrón de almohadillas de reacción sobre un soporte plano (ver Healey et al., Science 269:1078-1080, 1995; Munkholm y Walt, Anal. Chem. 58:1427-1430, 1986; y Bronk et al., Anal. Chem. 67:2750-2757, 1995). [0060] El lado opuesto de la oblea de fibras ópticas (es decir, la cara no grabada) típicamente se encuentra altamente pulida de manera que permita el acoplamiento óptico (por ejemplo mediante aceite de inmersión u otro líquido de acoplamiento óptico) a un segundo haz de fibras ópticas. Este segundo haz de fibras ópticas se corresponde exactamente al diámetro de la oblea óptica que contiene las cámaras de reacción, y sirve para conducir la transmisión de la luz producida al dispositivo de detección unido, tal como un sistema CCD de formación de imágenes o cámara. [0061] En una realización preferente, la oblea de fibras ópticas se limpia exhaustivamente, por ejemplo mediante lavados en serie de H2O2 al 15%/NH4OH al 15% volumen:volumen en solución acuosa, seguido de seis enjuagues con agua desionizada, seguido de EDTA 0,5 M, seguido de seis de agua desionizada, seguido de H2O2 al 15%/NH4OH al 15%, seguido de seis de agua desionizada (incubaciones de media hora en cada lavado). [0062] La superficie de la oblea de fibra óptica preferentemente se recubre para facilitar su utilización en las reacciones de secuenciación. Una superficie recubierta preferentemente es ópticamente transparente, permite la fácil unión de proteínas y ácidos nucleicos, y no afecta negativamente a la actividad de las proteínas inmovilizadas. Además, la superficie preferentemente minimiza la adsorción no específica de macromoléculas e incrementa la estabilidad de las macromoléculas unidas (por ejemplo ácidos nucleicos y proteínas unidas). [0063] Entre los materiales adecuados para el recubrimiento de la matriz se incluyen, por ejemplo, plástico (por ejemplo poliestireno). El plástico puede preferentemente recubrirse mediante centrifugación o pulverización (grosor de 0,1 µm). Entre otros materiales para el recubrimiento de la matriz se incluyen capas de oro, por ejemplo oro de 24 quilates, de 0,1 µm de grosor, con monocapas autoensamblantes adsorbidas de tiol-alcanos de cadena larga. A continuación, se acopla covalentemente biotina a la superficie y se satura con una proteína ligante de biotina (por ejemplo estreptavidina o avidina). [0064] Entre los materiales de recubrimiento además pueden incluirse aquellos sistemas utilizados para unir un cebador de anclaje a un sustrato. También pueden utilizarse para recubrir la matriz reactivos organosilano, que permiten el acoplamiento covalente directo de proteínas mediante grupos amino, sulfhidrilo o carboxilo. Entre las sustancias de recubrimiento adicionales se incluyen línkers fotorreactivos, por ejemplo fotobiotina (Amos et al., "Biomaterial Surface Modification Using Photochemical Coupling Technology", en: Encyclopedic Handbook of Biomaterials and Bioengineering, parte A: Material, Wise et al. (editores), New York, Marcel Dekker, páginas 895-926, 1995). [0065] Entre los materiales de recubrimiento adicionales se incluyen geles de polímero hidrofílico (poliacrilamida, polisacáridos), que preferentemente se polimerizan directamente sobre la superficie, o cadenas de polímero unidas covalentemente después de la polimerización (Hjerten, J. Chromatogr. 347:191, 1985; Novotny, Anal. Chem. 62:2478, 1990), así como polímeros plurónicos (copolímeros tribloque, por ejemplo PPO-PEO-PPO, también conocido como F-108), adsorbidos específicamente a poliestireno o a superficies de vidrio silanizado (Ho et al., Langmuir 14:3889-94, 1998), así como capas pasivamente adsorbidas de proteínas ligantes de biotina. La superficie también puede recubrirse con un epóxido que permite el acoplamiento de reactivos mediante un enlace amina. [0066] Además, cualquiera de los materiales anteriormente indicados puede derivatizarse con uno o más grupos funcionales, comúnmente conocidos de la técnica para la inmovilización de enzimas y nucleótidos, por ejemplo grupos quelantes de metales (por ejemplo ácido nitrilo-triacético, ácido iminodiacético, quelador pentadentado), que ligará las proteínas etiquetadas con 6xHis y los ácidos nucleicos. [0067] Pueden utilizarse recubrimientos superficiales que incrementan el número de sitios de unión disponibles para tratamientos posteriores, por ejemplo para la unión de enzimas (comentado posteriormente), más allá de la capacidad de unión teórica de una superficie 2D. [0068] En una realización preferente, las fibras ópticas individuales utilizadas para generar el haz de fibras ópticas fusionada/oblea son de diámetro mayor (es decir, de entre 6 y 12 µm) que las utilizadas en el sistema óptico de formación de imágenes (de 3 µm). De esta manera, pueden utilizarse algunas de las fibras ópticas de formación de imágenes para formar la imagen de un único sitio de reacción.

Resumen de las matrices de la presente invención [0069] En un aspecto, la invención implica una matriz que incluye una superficie plana con una pluralidad de cámaras de reacción dispuestas sobre la misma, en la que las cámaras de reacción se encuentran espaciadas de centro a centro entre 5 y 200 µm, y cada cámara presenta una anchura en por lo menos una dimensión de entre 0,3 y 100 µm. En algunas realizaciones, la matriz es una superficie plana con una pluralidad de cavidades sobre la misma, en la que cada cavidad forma una cámara de reacción de analito. En una realización preferente, la matriz se forma a partir de un haz de fibras ópticas seccionado transversal-mente (es decir, un haz de cables de fibra óptica fusionados) y las cámaras de reacción se forman mediante grabado de una superficie de la matriz reactora de fibras ópticas ("FORA"). Las cavidades también pueden formarse en el sustrato mediante grabado, moldeo o micromecanizado. [0070] Específicamente, cada cámara de reacción en la matriz típicamente presenta una anchura en por lo menos una dimensión de entre 0,3 µm y 100 µm, preferentemente entre 0,3 µm y 20 µm, más preferentemente entre 0,3 µm y 10 µm. En una realización separada, los presentes inventores contemplan cámaras de reacción de mayor tamaño, preferentemente que presentan una anchura en por lo menos una dimensión de entre 20 µm y 70 µm. [0071] La matriz típicamente contiene más de 1.000 cámaras de reacción, preferentemente más de 400.000, más preferentemente entre 400.000 y 20.000.000, y todavía más preferentemente entre 1.000.000 y 16.000.000 cavidades o cámaras de reacción. La forma de cada cavidad frecuentemente es sustancialmente hexagonal, aunque las cavidades también pueden ser cilíndricas. En algunas realizaciones, cada cavidad presenta paredes de superficie lisa; sin embargo, los presentes inventores contemplan que cada cavidad también pueda presentar por lo menos una pared de superficie irregular. El fondo de cada una de las cavidades puede ser plano o cóncavo. [0072] La matriz típicamente se construye para que presente cavidades o cámaras de reacción con un espaciado de centro a centro de entre 10 y 150 µm, preferentemente de entre 50 y 100 µm. [0073] Cada cavidad o cámara de reacción típicamente presenta una profundidad de entre 10 µm y 100 µm; alternativamente, la profundidad es de entre 0,25 y 5 veces la anchura de la cavidad, preferentemente de ente 0,3 y 1 vez el la anchura de la cavidad. [0074] En una realización, las matrices descritas en la presente memoria típicamente incluyen una superficie superior plana y una superficie inferior plana, que es ópticamente conductora, de manera que las señales ópticas procedentes de las cámaras de reacción pueden detectarse a través de la superficie inferior plana. En estas matrices, típicamente la distancia entre la superficie superior y la superficie inferior no es superior a 10 cm, preferentemente no superior a 3 cm, más preferentemente no superior a 2 cm. [0075] En una realización, cada cavidad de la matriz contiene reactivos para analizar un ácido nucleico o proteína. La matriz también puede incluir una segunda superficie espaciada respecto a la matriz plana y en contacto frontal con la misma, de manera que se forma una cámara de flujo sobre la matriz. [0076] En otro aspecto, la invención implica un medio de matriz para llevar a cabo reacciones comunes separadas en paralelo en un ambiente acuoso, en la que el medio de matriz incluye un sustrato que presenta por lo menos 1.000 cámaras de reacción discretas. Estas cámaras contienen un material de partida que es capaz de reaccionar con un reactivo. Cada una de las cámaras de reacción se dimensiona de manera que, al administrar uno o más líquidos que contiene por lo menos un reactivo en cada cámara de reacción, el tiempo de difusión para que el reactivo difunda hacia el exterior del pocillo excede el tiempo requerido para que el material de partida reaccione con el reactivo para formar un producto. Las cámaras de reacción pueden formarse mediante la generación de una pluralidad de cavidades sobre el sustrato, o mediante la generación de áreas discretas sobre una superficie plana, presentando las áreas unas propiedades químicas de la superficie diferentes de las de la superficie plana circundante. [0077] En una realización, cada cavidad o cámara de reacción de la matriz contiene reactivos para analizar un ácido nucleico o proteína. Típicamente, aquellas cámaras de reacción que contienen un ácido nucleico (no resulta necesario que todas las cámaras de reacción en la matriz contengan uno), contienen únicamente una especie de ácido nucleico (es decir, una única secuencia que resulta de interés). Puede existir una única copia de dicha especie de ácidos nucleicos en cualquier cámara de reacción particular, o pueden existir múltiples copias. Generalmente resulta preferente que una cámara de reacción contenga por lo menos 100 copias de una secuencia de ácidos nucleicos, preferentemente por lo menos

100.000 copias, y más preferentemente entre 100.000 y 1.000.000 de copias del ácido nucleico. El experto ordinario en la materia apreciará que las modificaciones del número de copias de una especie de ácidos nucleicos en cualquier cámara de reacción afectará al número de fotones generados en una reacción de pirosecuenciación, y podrá ajustarse rutinariamente para proporcionar más o menos señal fotónica según resulte necesario. [0078] En una realización, la especie de ácidos nucleicos se amplifica para proporcionar el número deseado de copias utilizando PCR, RCA, reacción en cadena de la ligasa, otra amplificación isotérmica, u otro medio convencional de amplificación de ácidos nucleicos. En una realización, el ácido nucleico es de una cadena. En otras realizaciones, el ADN de una cadena es un concatámero, encontrándose cada copia unida covalentemente extremo con extremo.

Medio de administración [0079] Un ejemplo de un medio para administrar reactivos en la cámara de reacción es la cámara de perfusión de la presente invención, ilustrada en la Fig. 3. La cámara de perfusión incluye un compartimiento sellado con un portaobjetos superior y uno inferior. Está diseñado para permitir el flujo de solución sobre la superficie del sustrato y para permitir un rápido intercambio de reactivos. De esta manera, resulta adecuado para llevar a cabo, por ejemplo, reacciones de secuenciación de pirofosfato. La forma y dimensiones de la cámara pueden ajustarse para optimizar el intercambio de reactivos, para incluir el intercambio de la masa de flujo, el intercambio difusivo o ambos en un régimen de flujo laminar o turbulento. [0080] El intercambio correcto de reactivos con la cámara de reacción resulta importante para realizar mediciones exactas en la presente invención. En ausencia de flujo convectivo de masa de líquido, el transporte de los participantes en la reacción (y la contaminación cruzada o "comunicación cruzada" entre sitios de reacción contiguos o microvasos) puede tener lugar únicamente mediante difusión. En el caso de que el sitio de reacción se considere una fuente puntual sobre una superficie 2-D, la especie química de interés (por ejemplo un producto de reacción) se difundirá radialmente a partir del sitio de su producción, creando una concentración sustancialmente hemiesférica por encima de la superficie. [0081] La distancia a la que puede difundirse una entidad química en cualquier tiempo dado t puede estimarse de un modo rudimentario mediante consideración de las matemáticas de la difusión (Crank, The Mathematics of Diffusion, 2a edición, 1975). La tasa de transporte difusivo en cualquier dirección dada x (cm) se define mediante la ley de Fick:

imagen1

en la que j es el flujo por unidad de área (g·mol/cm2·s) de una especie con un coeficiente de difusión D (cm2/s) y δC/δx es el gradiente de concentración de dicha especie. Las matemáticas de la difusión son tales que una característica o distancia "media" que puede recorrer 10 una entidad mediante difusión sola se incrementa en una relación de raíz cuadrada de tanto el coeficiente de difusión como el tiempo durante el que se produce la difusión. En efecto, hasta un orden de magnitud puede estimarse dicha distancia de difusión característica como la raíz cuadrada del producto de coeficiente de difusión y tiempo, según se ajusta con un factor numérico de orden unidad que considera los rasgos particulares de la geometría del

15 sistema y las condiciones iniciales y/o límite impuestas sobre el proceso de difusión. [0082] Resulta conveniente estimar dicha distancia de difusión característica como la raíz del valor cuadrático medio de la distancia drms que puede recorrer una entidad en difusión durante un tiempo t:

imagen2

20 [0083] Tal como se ha indicado anteriormente, la distancia que puede recorrer una entidad química en difusión típicamente varia con la raíz cuadrada del tiempo disponible para que difunda, y a la inversa, el tiempo necesario para que una entidad química en difusión recorrer una distancia dada se incrementa con el cuadrado de la distancia que debe atravesarse mediante difusión. De esta manera, para una biomolécula simple, de bajo peso molecular,

25 caracterizada por un coeficiente de difusión D del orden de 1·10-5 cm2/s, el valor cuadrático medio de las distancias de difusión drms que pueden atravesarse en los intervalos de tiempo de 0,1 s, 1,0 s, 2,0 s y 10 s se estiman mediante la ecuación 2 como 14 µm, 45 µm, 63 µm y 141 µm, respectivamente. [0084] La importancia relativa de convección y difusión en un proceso de transprote que

30 implica que se producen simultáneamente ambos mecanismos puede evaluarse con ayuda de un número adimensional, el número de Peclet, Pe. El número de Peclet puede interpretarse como una proporción entre dos tasas o velocidades, concretamente la tasa de flujo convectivo dividido por la tasa de un "flujo" difusivo o flujo. Más particularmente, el número de Peclet es una proporción entre una velocidad de flujo característica V (en cm/s) dividido por una velocidad de difusión característica DIL (también expresada en unidades de cm/s), ambas consideradas en la misma dirección:

imagen3

[0085] En la ecuación 3, V es la velocidad media o característica del flujo convectivo,

5 generalmente determinada mediante división de la tasa de flujo volumétrico Q (en cm3/s) y el área de la sección transversal A (cm2) disponible para el flujo. La longitud característica L es una distancia o dimensión del sistema representativa media en una dirección paralela a las direcciones de flujo y de difusión (es decir, en la dirección del gradiente de concentración más acusado) y se selecciona para que resulte representativo de la distancia típica o "me

10 dia" a lo largo de la cual se produce la difusión. Finalmente, D (cm2/s) es el coeficiente de difusión para la especie que difunde en cuestión (una formulación alternativa, aunque equivalente, del número de Peclet Pe la considera la proporción entre dos tiempos característicos: los tiempos representativos para la difusión y para la convección. La ecuación 3 para el número de Peclet puede obtenerse igualmente bien mediante división del tiempo de difusión

15 característico L2/D y el tiempo de convención característico L/V). [0086] El componente convectivo de transporte puede esperarse que domine sobre el componente difusivo en situaciones en las que el número de Peclet Pe es grande en comparación con la unidad. A la inversa, el componente difusivo de transporte puede esperarse que domine sobre el componente convectivo en situaciones en las que el número de Peclet

20 Pe es pequeño en comparación con la unidad. En situaciones extremas, en las que el número de Peclet es mucho más grande o mucho más pequeño que la unidad, el transporte puede suponerse con exactitud que se produce sólo mediante convección o sólo mediante difusión, respectivamente. Finalmente, en situaciones en las que el número de Peclet estimado es del orden de la unidad, tanto la convección como la difusión puede esperarse que

25 desempeñen papeles significativos en el proceso de transporte global. [0087] El coeficiente de difusión de una biomolécula de bajo peso molecular típica generalmente será del orden de 10-5 cm2/s (por ejemplo 0,52·10-5 cm/s para la sacarosa y 1,06·105 cm/s para la glicina). De esta manera, para centros, cavidades o pocillos de reacción separados por una distancia de 100 µm (es decir, 0,01 cm), el número de Peclet Pe para solutos

30 de bajo peso molecular tales como los indicados excederá la unidad para velocidades de flujo superiores a aproximadamente 10 µm/s (0,001 cm/s). Para cavidades separadas por únicamente 10 µm (es decir, 0,001 cm), el número de Peclet Pe para solutos de bajo peso molecular excederá la unidad para velocidades de flujo superiores a aproximadamente 100 µm/s (0,01 cm/s). De esta manera, se considera que el transporte convectivo domina sobre

35 el transporte difusivo bajo todas las condiciones excepto en tasas de flujo muy lentas y/o distancias de difusión muy cortas. [0088] En el caso de que el peso molecular de una especie difundible sea sustancialmente más grande (por ejemplo tal como ocurre con biomoléculas de gran tamaño como ADN/ARN, fragmentos de ADN, oligonucleótidos, proteínas, y constructos de los mismos), la difusividad de la especie será correspondientemente menor, y la convección desempeñará un papel todavía más importancia en comparación con la difusión en un proceso de transporte que implique ambos mecanismos. Por ejemplo, los coeficientes de difusión en fase acuosa de las proteínas se encuentran comprendidos en un intervalo de aproximadamente factor 10 (Tanford, Physical Chemistry of Macromolecules, 1961). Las difusividades de las proteínas se encuentran comprendidas entre los valores de 1,19 x 10-6 cm2/s para la ribonucleasa (una proteína pequeña que presenta un peso molecular de 13.683 daltons) y 1,61x10-7 cm2/s para la miosina (una proteína de gran tamaño, que presenta un peso molecular de 483.000 daltons). Las entidades de tamaño todavía mayor (por ejemplo el virus del mosaico del tabaco, o TMV, de 40,6 millones de daltons) se caracterizan por difusividades todavía menores (en particular de 4,6x10-8 cm2/s para el TMV) (Lehninger, Biochemistry, 2a edición, 1975). La velocidad de fluido a la que la convección y la difusión contribuyen aproximadamente en la misma medida al transporte (es decir, Pe del orden de la unidad) se incrementa de manera directamente proporcional a la difusividad de la especie. [0089] Con ayuda del formalismo del número de Peclet, resulta posible evaluar el impacto de la convección sobre el suministro de reactivo (y la retirada de producto) a cámaras, cavidades o pocillos de reacción. Por otra parte, resulta evidente que incluso flujos convectivos modestos pueden incrementar apreciablemente la velocidad a la que se administran reactivos al interior de las cavidades en una matriz o FORA. En particular, considérese, en aras de la simplicidad, que el criterio para flujos convectivos y difusivos aproximadamente iguales es Pe=1. En este caso puede estimarse que una velocidad de flujo convectivo del orden de únicamente 0,004 cm/s resultará suficiente para transportar reactivo al interior de un pocillo de 25 µm de profundidad a aproximadamente la misma tasa a la que podría suministrarse al fondo del pocillo mediante difusión únicamente, suponiendo un valor para la difusividad del reactivo de 1x10-5 cm2/s. La velocidad de flujo correspondiente necesaria para alcanzar la tasa de difusión de dicha especie desde el fondo hasta el tope de un micropocillo de 2,5 µm de profundidad se estima que es del orden de 0,04 cm/s. Las velocidades de flujo a través de una FORA mucho más alta que la indicada también resultan posibles, ilustrando de esta manera el grado con el que puede incrementarse un flujo convectivo modesto el suministro difusivo de reactivos a centros, cavidades o pocillos de reacción de una FORA. [0090] La cámara de perfusión preferentemente se encuentra desconectada del sistema de formación de imágenes durante su preparación y únicamente se conecta al sistema de formación de imágenes durante la realización del análisis de secuenciación. En una realización, el soporte sólido (es decir, un chip de ADN o un portaobjetos de vidrio) se mantiene fijo mediante una carcasa de metal o plástico que puede ensamblarse y desmontarse para permitir la sustitución de dicho soporte sólido. La cara inferior del soporte sólido de la cámara de perfusión incluye la matriz de cámaras de reacción y, con un sistema focal de tipo óptico tradicional, se utiliza una lente objetivo de apertura numérica alta para enfocar la imagen de la matriz de centros de reacción sobre el sistema CCD de formación de imágenes. [0091] Un sistema alternativo para el análisis es la utilización de un formato de matriz en el que las muestras se distribuyen sobre una superficie, por ejemplo un chip microfabricado, y de esta manera puede inmovilizarse un conjunto ordenado de muestras en un formato bidimensional. De esta manera pueden analizarse en paralelo muchas muestras. Utilizando el método de la invención, pueden analizarse de esta manera muchos moldes inmovilizados al permitir que la solución que contiene los enzimas y un nucleótido fluya sobre la superficie, detectando a continuación la señal producida por cada muestra. Este procedimiento seguidamente puede repetirse. Alternativamente, pueden distribuirse sobre la superficie varios oligonucleótidos diferentes complementarios al molde, seguido de la hibridación del molde. Puede realizarse un seguimiento de la incorporación de desoxinucleótidos o dideoxinucleótidos para cada oligonucleótido a partir de la señal producida utilizando los diversos oligonucleótidos como cebador. Mediante la combinación de las señales de diferentes áreas de la superficie, pueden llevarse a cabo análisis basados en la secuencia mediante cuatro ciclos de reacciones de la polimerasa utilizando los diversos dideoxinucleótidos. [0092] En el caso de que el soporte presente la forma de una matriz cavitada, por ejemplo en los extremos de una FORA u otra matriz de micropocillos, entre los medios de administración adecuados para los reactivos se incluyen el flujo y el lavado y también, por ejemplo, el flujo, la pulverización, la electropulverización, la administración por inyección de tinta, el estampado, la atomización ultrasónica (Sonotek Corp., Milton, NY) y el desplazamiento de un rodillo. Preferentemente, todas las soluciones de reactivo contienen etilenglicol al 10-20% para minimizar la evaporación. Al utilizar la pulverización, se administran reactivos a la superficie de la FORA en una capa delgada homogénea producida mediante boquillas de pulverización de tipo industrial (Spraying Systems Co., Wheaton, IL) o atomizadores utilizados en cromatografía en capa fina (TLC), tales como CAMG TLC Sprayer (Camag Scientific Inc., Wilmington, NC). Estos pulverizadores atomizan reactivos en partículas pulverizadas de aerosol en el intervalo de tamaños de 0,3 a 10 µm. [0093] La deposición por electropulverización (ESD) de soluciones de proteínas y de ADN se utiliza actualmente para generar iones para el análisis de espectrometría de masas de estas moléculas. Se sugiere la deposición de productos de electropulverización cargados sobre áreas determinadas de un sustrato FORA bajo el control de fuerzas electrostáticas.

También se demostró que las proteínas y ADN depositados mediante ES conservan su capacidad de unirse específicamente a anticuerpos y sondas de ADN correspondientes, respectivamente, permitiendo la utilización de las matrices fabricadas mediante ESD en ensayos Dot Immune-Binding (DIB) y de hibridación de ADN (Morozov y Morozova, Anal. Chem. 71(15):3110-7, 1999). [0094] La administración de inyección de tinta resulta aplicable a soluciones de proteínas y a otras biomacromoléculas, tal como se documenta en la literatura (por ejemplo, Roda et al., Biotechniques 28(3):492-6, 2000). También se encuentra comercialmente disponible, por ejemplo, de MicroFab Technologies Inc. (Plano, TX). [0095] Las soluciones de reactivo pueden administrarse alternativamente a la superficie de la FORA mediante un método similar a la litografía. En primer lugar se recubren rodillos (estampadores; deben utilizarse materiales hidrofílicos) con una capa de reactivo en reservorios con esponjas humectantes y después se harían rodar (haciendo presión) sobre la superficie de la FORA. [0096] Las etapas de administración sucesiva de reactivos preferentemente se separan por etapas de lavado utilizando técnicas comúnmente conocidas de la técnica. Estos lavados pueden realizarse, por ejemplo, utilizando los métodos anteriormente indicados, incluyendo pulverizadores de flujo elevado o mediante un flujo de líquido sobre la FORA o superficie de la matriz de micropocillos. Los lavados pueden realizarse en cualquier periodo de tiempo tras reaccionar el material de partida con el reactivo para formar un producto en cada cámara de reacción pero antes de que el reactivo administrado en una cámara de reacción cualquiera se haya difundido hasta el exterior de dicha cámara de reacción y hacia el interior de cualquier otra cámara de reacción. En una realización, cualquier cámara de reacción es independiente del producto formado en cualquier otra cámara de reacción, pero se genera utilizando uno o más reactivos comunes. [0097] Se ilustra en la Fig. 2 una realización de un aparato complejo. El aparato incluye un conducto de introducción 200 en comunicación con una cámara de perfusión desconectable

226. El conducto de introducción 200 permite la introducción de reactivos de secuenciación mediante una pluralidad de tubos 202-212, cada uno de los cuales se comunica con una pluralidad de recipientes de dispensación de reactivos de secuenciación 214-224. [0098] Los reactivos se introducen a través del conducto 200 en el interior de la cámara de perfusión 226 utilizando un sistema presurizado o bombas para impulsar un flujo positivo. Típicamente, las tasas de flujo de reactivo son de entre 0,05 y 50 ml/minuto (por ejemplo de 1 a 50 ml/minuto) con volúmenes de entre 0,100 ml y flujo continuo (para los lavados). Las válvulas se encuentran bajo control computerizado para permitir el ciclado de nucleótidos y reactivos de lavado. Los reactivos de secuenciación, por ejemplo la polimerasa, pueden premezclarse con nucleótidos o añadirse en el flujo. Un distribuidor reúne la totalidad de los seis tubos 202-212 para la alimentación de la cámara de perfusión. De esta manera, varias aberturas de administración de reactivo permiten el acceso a la cámara de perfusión. Por ejemplo, puede utilizarse una de las aberturas para permitir la introducción de los reactivos acuosos de secuenciación, mientras que otra abertura permite extraer dichos reactivos (y cualquier producto de reacción) de la cámara de perfusión. [0099] La cámara de perfusión 226 contiene el sustrato que comprende la pluralidad de cámaras de reacción. La cámara de perfusión permite un flujo lineal uniforme de los reactivos de secuenciación requeridos, en solución acuosa, sobre los ácidos nucleicos amplificados y permite un intercambio rápido y completo de dichos reactivos. De esta manera, resulta adecuado para llevar a cabo reacciones de secuenciación basadas en el pirofosfato. La cámara de perfusión también puede utilizarse para preparar los cebadores de anclaje y para llevar a cabo reacciones de amplificación, por ejemplo las reacciones RCA descritas en la presente memoria. [0100] La invención también proporciona un método para administrar enzimas de secuenciación de ácidos nucleicos en una matriz. En algunas realizaciones, uno de los enzimas de secuenciación de ácidos nucleicos puede ser un polipéptido con actividad de sulfurilasa o el enzima de secuenciación de ácidos nucleicos puede ser un polipéptido que presenta actividad de luciferasa. En otra realización, uno de los enzimas de secuenciación de ácidos nucleicos puede ser un polipéptido con actividad tanto de sulfurilasa como de luciferasa. En una realización más preferente, el reactivo puede resultar adecuado para la utilización en una reacción de secuenciación de ácidos nucleicos. [0101] En una realización preferente, se administran uno o más reactivos en una matriz inmovilizada o unida a una población de soportes sólidos móviles, por ejemplo perlas o microesferas. Las perlas o microesferas no son necesariamente esféricas, pueden utilizarse perlas de forma irregular. Típicamente se construyen a partir de numerosas sustancias, por ejemplo, plástico, vidrio o cerámica, y de tamaños de perla comprendidos entre nanómetros y milímetros, dependiendo de la anchura de la cámara de reacción. Preferentemente, el diámetro de cada soporte sólido móvil puede encontrarse comprendido entre 0,01 y 0,1 veces la anchura de cada cavidad. Pueden utilizarse perlas de diversa química, por ejemplo de metilestireno, poliestireno, polímero acrílico, látex, paramagnéticas, solución de dióxido de torio, carbono grafito y dióxido de titanio. La construcción o química de la perla puede seleccionarse para facilitar la unión del reactivo deseado. [0102] En otra realización, los agentes bioactivos se sintetizan en primer lugar, y después se unen covalentemente a las perlas. Tal como apreciará el experto en la materia, lo anterior se realiza dependiendo de la composición de los agentes bioactivos y de las perlas. La funcionalización de las superficies de soporte sólidas, tales como determinados polímeros con grupos químicamente reactivos, tales como tioles, aminas, carboxilos, etc., es generalmente conocida de la técnica. Por consiguiente, pueden utilizarse perlas "de blanco" que presentan químicas de superficie que facilitan la unión de la funcionalidad deseada por parte del usuario. Entre los ejemplos adicionales de dichas químicas de superficie para las perlas de blanco se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, grupos amino, incluyendo aminas alifáticas y aromáticas, ácidos carboxílicos, aldehídos, amias, grupos clorometilo, hidrazida, grupos hidroxilo, sulfonatos y sulfatos. [0103] Dichos grupos funcionales pueden utilizarse para añadir cualquier número de agentes candidatos diferentes a las perlas, generalmente utilizando químicas conocidas. Por ejemplo, pueden unirse agentes candidatos que contienen carbohidratos a un soporte ami-no-funcionalizado; el aldehído del carbohidrato se prepara utilizando técnicas estándares y después se hace reaccionar el aldehído con un grupo amino sobre la superficie. En una realización alternativa, puede utilizarse un línker sulfhidrilo. Existen varios línkers reactivos con sulfhidrilo conocidos de la técnica, tales como SPDP, maleimidas, α-haloacetilos y disulfuros de piridilo (ver, por ejemplo, el catálogo 1994 de la Pierce Chemical Company, sección técnica sobre reticuladores, páginas 15 a 200, que pueden utilizarse para unir agentes proteicos que contienen cisteínas al soporte). Alternativamente, un grupo amino en el agente candidato se puede utilizar para unirse a un grupo amino en la superficie. Por ejemplo, son bien conocidos de la técnica un gran número de grupos bifuncionales estables, incluyendo línkers homobifuncionales y heterobifuncionales (ver el catálogo y el manual de Pierce, páginas 155 a 200). En una realización adicional, pueden derivatizarse los grupos carboxilo (de la superficie o del agente candidato) utilizando línkers bien conocidos (ver el catálogo de Pierce). Por ejemplo, las carbodiimidas activan los grupos carboxilo para el ataque por nucleófilos buenos, tales como las aminas (ver Torchilin et al., Critical Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 7(4):275-308, 1991). Los agentes proteicos candidatos también pueden unirse utilizando otras técnicas conocidas de la técnica, por ejemplo para la unión de anticuerpos a polímeros; ver Slinkin et al., Biocoj. Chem. 2:342-348, 1991; Torchilin et al., supra; Trubetskoy et al., Bioconj. Chem. 3:323-327, 1992; King et al., Cancer Res. 54:6176-6185, 1994; y Wilbur et al., Bioconjugate Chem. 5:220-235, 1994). Debe entenderse que los agentes candidatos pueden unirse de una diversidad de maneras, incluyendo las listadas anteriormente. Preferentemente, el modo de unión no altera significativamente la funcionalidad del agente candidato; es decir, el agente candidato debe unirse de manera flexible que permita la interacción con su diana. [0104] Las técnicas específicas para inmovilizar enzimas sobre perlas son conocidas de la técnica anterior. En un caso, se utilizan perlas de química superficial de NH2. La activación de superficie se consigue con glutaraldehído al 2% en solución salina tamponada con fosfato (10 mM), que proporciona un pH de 6,9 (NaCl 138 mM, KCl 2,7 mM). Esta mezcla se agita en un lecho de agitación durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, se enjuagan las perlas con agua ultrapura más Tween-20 al 0,01% (surfactante)-0,02%, y se enjuagó nuevamente con un PBS de pH 7,7 más Tween-20 al 0,01%. Finalmente, se añadió el enzima a la solución preferentemente tras prefiltrarse utilizando un filtro Micropure de Amicon de 0,45 µm. [0105] Se dispone la población de soporte sólidos móviles en las cámaras de reacción. En algunas realizaciones, 5% a 20% de las cámaras de reacción pueden presentar un soporte sólido móvil con por lo menos un reactivo inmovilizado en el mismo, 20% a 60% de las cámaras de reacción pueden presentar un soporte sólido móvil con por lo menos un reactivo inmovilizado sobre el mismo ó 50% a 100% de las cámaras de reacción pueden presentar un soporte sólido móvil con por lo menos un reactivo inmovilizado sobre las mismas. Preferentemente, por lo menos una cámara de reacción presenta un soporte sólido móvil que presenta por lo menos un reactivo inmovilizado sobre el mismo y el reactivo resulta adecuado para la utilización en una reacción de secuenciación de ácidos nucleicos. [0106] En algunas realizaciones, el reactivo inmovilizado en el soporte sólido móvil puede ser un polipéptido con actividad de sulfurilasa, un polipéptido con actividad de sulfurilasa o un polipéptido quimérico que presenta actividad tanto de sulfurilasa como de luciferasa. En una realización, puede ser una proteína de fusión de ATP sulfurilasa y de luciferasa. Debido a que el producto de la reacción de sulfurilasa resulta consumido por la luciferasa, puede conseguirse la proximidad entre estos dos enzimas mediante la unión covalente de los dos enzimas en la forma de una proteína de fusión. La presente invención resultaría útil no sólo en la canalización de sustrato sino también en la reducción de los costes de producción y potencialmente doblando el número de sitios de unión sobre las perlas recubiertas de estreptavidina. [0107] En otra realización, la sulfurilasa es una ATP sulfurilasa termoestable. En una realización preferente, la sulfurilasa termoestable se encuentra activa a temperaturas superiores a la ambiental (hasta por lo menos 50ºC). En una realización, la ATP sulfurilasa procede de un termófilo. En una realización adicional, el soporte sólido móvil puede presentar un primer reactivo y un segundo reactivo inmovilizados sobre el mismo, el primer reactivo es un polipéptido que presenta actividad de sulfurilasa y el segundo reactivo es un polipéptido que presenta actividad de luciferasa. [0108] En otra realización, el reactivo inmovilizado en el soporte sólido móvil puede ser un ácido nucleico; preferentemente, el ácido nucleico es un concatámero de una cadena. En una realización preferente, el ácido nucleico puede utilizarse para secuenciar un ácido nucleico, pro ejemplo una reacción de pirosecuenciación. [0109] La invención también proporciona un método para detectar o cuantificar la actividad de ATP utilizando un soporte sólido móvil; preferentemente el ATP puede detectarse o cuantificarse como parte de una reacción de secuenciación de ácidos nucleicos.

[0110] En la Fig. 7 se muestra una FORA que ha sido "recubierta" con soportes sólidos móviles con ácidos nucleicos o enzimas reactivos unidos a los mismos. [0111] El soporte sólido se conecta ópticamente a un sistema de formación de imágenes 230, que incluye un sistema CCD asociado a óptica convencional o a un haz de fibras ópticas. En una realización, el sustrato de la cámara de perfusión incluye una oblea de matriz de fibras ópticas de manera que la luz generada en el área próxima a la interfaz acuosa se transmite directamente a través de las fibras ópticas al exterior del sustrato o cámara. En el caso de que el sistema CCD incluya un conector de fibras ópticas, la formación de imágenes puede llevarse a cabo poniendo en contacto el sustrato de la cámara de perfusión en contacto directo con el conector. Alternativamente, puede utilizarse óptica convencional para formar una imagen de la luz, por ejemplo mediante la utilización de un sistema de lentes de elevada apertura numérica de magnificación 1-1, del exterior del sustrato de fibra óptica directamente sobre el sensor de CCD. En el caso de que el sustrato no permita el acoplamiento de las fibras ópticas, también puede utilizarse un sistema de lentes tal como se ha indicado anteriormente, en cuyo caso el sustrato o la tapa de la cámara de perfusión es ópticamente transparente. Se ha descrito anteriormente un sistema CCD ejemplar de formación de imágenes. [0112] El sistema de formación de imágenes 230 se utiliza para recoger luz de los reactores sobre la superficie del sustrato. Pueden formarse imágenes de la luz, por ejemplo sobre un CCD utilizando un aparato de alta sensibilidad y bajo nivel de ruido conocido de la técnica. Para la formación de imágenes basada en fibra óptica, resulta preferible incorporar las fibras ópticas directamente sobre el cubreobjetos o que en una FORA las fibras ópticas que forman los micropocillos también sean las fibras ópticas que envían luz al detector. [0113] El sistema de formación de imágenes se encuentra conectado a un sistema de recolección de datos y control computerizado 240. En general, puede utilizarse cualquier hardware o paquete de software disponible comúnmente. El sistema de recolección de datos y control computerizado también se encuentra conectado al conducto 200 para controlar la administración de reactivos. [0114] Los fotones generados por la reacción de secuenciación de pirofosfato resultan capturados por el CCD únicamente si pasan a través del dispositivo de enfoque (por ejemplo un lente óptico o una fibra óptica) y se enfocan en un elemento de CCD. Sin embargo, los fotones emitidos escapan igualmente en todas las direcciones. Con el fin de maximizar su "captura" y cuantificación posteriores al utilizar una matriz plana (por ejemplo un chip de ADN), resulta preferible recoger los fotones en un área tan próxima al punto en el que se generan, por ejemplo inmediatamente en el soporte sólido plano. Lo anterior se consigue mediante: (i) la utilización de aceite de inmersión óptica entre el cubreobjetos y una lente óptica tradicional o haz de fibras ópticas o, preferentemente, (ii) incorporando fibras ópticas directamente en el cubreobjetos mismo. De manera similar, en el caso de que se utilice una superficie plana delgada ópticamente transparente, el haz de fibras ópticas también puede situarse contra su superficie posterior, eliminando la necesidad de "formar imágenes" en toda la profundidad de la cámara de reacción/perfusión entera.

Medio de detección [0115] El suceso de reacción, por ejemplo fotones generados por la luciferasa, pueden detectarse y cuantificarse utilizando una diversidad de aparatos de detección, por ejemplo un tubo fotomultiplicador, un CCD, CMOS, fotómetro de absorbancia, un luminómetro, un dispositivo de inyección de carga (CID) u otro detector de estado sólido, así como los aparatos indicados en la presente memoria. En una realización preferente, la cuantificación de los fotones emitidos se lleva a cabo mediante la utilización de una cámara CCD dotada de un haz de fibras ópticas fusionadas. En otra realización preferente, la cuantificación de los fotones emitidos se lleva a cabo mediante la utilización de una cámara CCD dotada de un intensificador de placa de microcanales. Puede utilizarse un CCD con adelgazamiento posterior para incrementar la sensibilidad. Los detectores CCD se describen en, por ejemplo, Bronks et al., Anal. Chem. 65:2750-2757, 1995. [0116] Un sistema CCD ejemplar es una cámara de 4 puertos Series 6000 de Spectral Instruments Inc. (Tucson, AZ) con un chip CCD LM485 de Lockheed-Martin y un conector de fibra óptica 1-1 (haz) con diámetro de fibras individuales de 6 a 8 µm. Este sistema presenta 4.096x4.096, o más de 16 millones de píxels y presenta una eficiencia cuántica comprendida entre 10% y >40%. De esta manera, dependiendo de la longitud de onda, hasta 40% de los fotones que forman una imagen sobre el sensor CCD se convierten en electrones detectables. [0117] En otras realizaciones, puede utilizarse un grupo fluorescente como marcaje y puede llevarse a cabo la detección de un suceso de reacción utilizando un microscopio de barrido confocal para escanear la superficie de una matriz con un láser o se encuentran disponibles otras técnicas, tales como la microscopía óptica de barrido de campo cercano (SNOM), que son capaces de una mejor resolución óptica, permitiendo de esta manera la utilización de matrices "más densas". Por ejemplo, mediante la utilización de SNOM pueden distinguirse los polinucleótidos individuales en el caso de que se encuentren separados por una distancia inferior a 100 nm, por ejemplo 10 nm x 10 nm. Además, puede utilizarse la microscopía de barrido de efecto túnel (Binning et al., Helvetica Physica Acta 55:726-735, 1982) y la microscopía de fuerza atómica (Hanswa et al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 23:115-139, 1994). [0118] La invención proporciona un aparato para el realizar simultáneamente el seguimiento de una matriz de cámaras de reacción para luz indicadora de que tiene lugar una reacción en un sitio particular. El aparato puede incluir una matriz de cámaras de reacción formada de un sustrato plano que presenta una pluralidad de superficies cavitadas, formando cada superficie cavitada una cámara de reacción adaptada para contener analitos. Las cámaras de reacción pueden presentar un espaciado de centro a centro de entre 5 y 200 µm y la matriz puede presentar más de 400.000 cámaras de reacción discretas. El aparato también puede incluir un dispositivo ópticamente sensible dispuesto de manera que durante la utilización, la luz procedente de una cámara de reacción particular incidirá en una región predeterminada particular de dicho dispositivo ópticamente sensible. El aparato puede incluir además un medio para determinar el nivel de luz que incide en cada región predeterminada y un medio para registrar la variación de dicho nivel de luz durante el tiempo para cada una de dichas cámaras de reacción. [0119] La invención también proporciona un sensor analítico, que puede incluir una matriz formada de un primer haz de fibras ópticas con una pluralidad de superficies cavitadas en un extremo de las mismas, formando cada superficie cavitada una cámara de reacción adaptada para contener analitos. Las cámaras de reacción pueden presentar un espaciado de centro a centro de entre 5 y 200 µm y la matriz puede presentar más de 400.000 cámaras de reacción discretas. El sensor analítico también puede incluir un medio enzimático o fluorescente para generar luz en las cámaras de reacción. El sensor analítico puede incluir además un medio de detección de luz que comprende un medio de captura de luz y un segundo haz de fibras ópticas para transmitir luz al medio de detección de luz. El segundo haz de fibras ópticas puede encontrarse en contacto óptico con la matriz, de manera que la luz generada en una cámara de reacción individual resulta capturada por una fibra separada o grupos de fibras separadas del segundo haz de fibras ópticas para la transmisión al medio de captura de luz. El medio de captura de luz puede ser una cámara CCD tal como se describe en la presente memoria. Las cámaras de reacción pueden contener uno o más soportes sólidos móviles con un agente bioactivo inmovilizado en los mismos. En algunas realizaciones, el sensor analítico resulta adecuado para la utilización en un ensayo bioquímico o resulta adecuado para la utilización en un ensayo de tipo celular.

Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos [0120] La invención también proporciona un método para secuenciar ácidos nucleicos, que comprende generalmente: (a) proporcionar uno o más cebadores de anclaje de ácidos nucleicos y una pluralidad de moldes de ácidos nucleicos circulares de una cadena dispuestos dentro de una pluralidad de cámaras o cavidades de reacción, (b) hibridar una cantidad eficaz del cebador de anclaje de ácidos nucleicos a por lo menos uno de los moldes circulares de una cadena, rindiendo un complejo de cebador de anclaje cebado-molde circular, (c) combinar el complejo de cebador de anclaje cebado-molde circular con una polimerasa para formar un cebador de anclaje extendido unido covalentemente a múltiples copias de un ácido nucleico complementario al molde circular de ácidos nucleicos, (d) hibridar una cantidad eficaz de un cebador de secuenciación a una o más copias de dicho ácido nucleico complementario unido covalentemente, (e) extender el cebador de secuenciación con una polimerasa y un nucleótido trifosfato predeterminado para rendir un producto de secuenciación y, en el caso de que el nucleótido trifosfato predeterminado se encuentre incorporado en el extremo 3' de dicho cebador de secuenciación, un producto secundario de reacción de secuenciación, y (f) identificar el producto secundario de reacción de secuenciación, determinando de esta manera la secuencia del ácido nucleico. En una realización, el producto secundario de secuenciación es PPi. En otra realización, se utiliza un análogo de dATP o de ddATP en lugar de desoxiadenosina trifosfato o dideoxi adenosina trifosfato. Este análogo es capaz de actuar como sustrato para una polimerasa, pero es incapaz de actuar como sustrato para un enzima de detección de PPi. Este método puede llevarse a cabo en reacciones comunes separadas en paralelo en un ambiente acuoso. [0121] En otro aspecto, la invención incluye un método para determinar la secuencia de bases de una pluralidad de nucleótidos en una matriz, que generalmente comprende: (a) proporcionar una pluralidad de ADNs de muestra, cada una dispuesta en una pluralidad de cavidades sobre una superficie plana, (b) añadir un precursor 5'-trifosfato de nucleótido activo de una base nitrogenada conocida a una mezcla de reacción en cada cámara de reacción, comprendiendo cada mezcla de reacción una nucleótido polimerasa dirigida por molde y un molde polinucleótido de una cadena hibridado con una cadena complementaria de cebador oligonucleótido por lo menos un residuo nucleótido más corto que los moldes, formando por lo menos un residuo nucleótido no apareado en cada molde en el extremo 3' de la cadena del cebador, bajo condiciones de reacción que permiten la incorporación del precursor activado de nucleósido 5'-trifosfato en el extremo 3' de las cadenas del cebador, con la condición de que la base nitrogenada del precursor activado de nucleósido 5'trifosfato sea complementario a la base nitrogenada del residuo nucleótido no apareado de los moldes, (c) detectar si el precursor de nucleótido 5'-trifosfato ha sido incorporado o no en las cadenas de cebador, en las que la incorporación del precursor de nucleósido 5'-trifosfato indica que el residuo nucleótido no apareado del molde presenta una composición de base nitrogenadas que es complementaria a la del precursor del nucleótido 5'-trifosfato incorporado, y (d) repetir secuencialmente las etapas (b) y (c), en las que cada repetición secuencial añade y detecta la incorporación de un tipo de precursor activado de nucleósido 5'-trifosfato de composición de bases nitrogenadas conocida, y (e) determinar la secuencia de bases de los residuos nucleótidos no apareados del molde en cada cámara de reacción a partir de la secuencia de incorporación de dichos precursores de nucleósidos. [0122] En una realización de la invención, el cebador de anclaje se une a una partícula. El cebador de anclaje podría unirse a la partícula antes o después de la formación del cebador de anclaje extendido. El producto secundario de la reacción de secuenciación podría ser PPi y se utiliza una reacción acoplada de sulfurilasa/luciferasa para generar luz para la detección. Podrían inmovilizarse tanto la sulfurilasa como la luciferasa, o ambas, en uno o más soportes sólidos móviles dispuestos en cada sitio de reacción. [0123] En otro aspecto, la invención implica un método para determinar la secuencia de bases de una pluralidad de nucleótidos en una matriz. El método incluye proporcionar una pluralidad de ADNs de muestra, cada uno dispuesto en una pluralidad de cavidades en una superficie plana, formando cada cavidad una cámara de reacción d analito, en la que las cámaras de reacción presentan un espaciado de centro a centro de entre 5 y 200 µm. A continuación, se añade un precursor activado de nucleótido 5'-trifosfato de una base nitrogenada conocida a una mezcla de reacción en cada cámara de reacción. Cada mezcla de reacción incluye una nucleótido polimerasa dirigida por molde y un molde polinucleótido de una cadena hibridado con una cadena de cebador oligonucleótido complementaria por lo menos un residuo nucleótido más corta que los moldes, formando por lo menos un residuo nucleótido no apareado en cada molde en el extremo 3' de la cadena del cebador, bajo condiciones de reacción que permiten la incorporación del precursor activado de nucleósido 5'-trifosfato en el extremo 3' de las cadenas del cebador, con la condición de que la base nitrogenada del precursor activado del nucleótido 5'-trifosfato sea complementaria a la base nitrogenada del residuo nucleótido no apareado de los moldes. Seguidamente se detecta si el precursor de nucleósido 5'-trifosfato ha sido incorporado o no en las cadenas de cebador en las que la incorporación del precursor de nucleótido 5'-trifosfato indica que el residuo nucleótido no apareado del molde presenta una composición de bases nitrogenadas que es complementaria a la del precursor de nucleótido 5'-trifosfato incorporado. A continuación, se repiten secuencialmente estas etapas, en las que cada repetición secuencial añade y detecta la incorporación de un tipo de precursor activado de nucleósido 5'-trifosfato de composición de bases nitrogenadas conocidas. La secuencia de bases de los residuos nucleótidos no apareados del molde en cada cámara de reacción seguidamente se determina a partir de la secuencia de incorporación de los precursores de nucleósido. [0124] En otro aspecto, la invención implica un método para determinar la secuencia de ácidos nucleicos en un polímero de ácidos nucleicos de molde. El método incluye introducir una pluralidad de polímeros de ácido nucleico de molde en una pluralidad de cavidades sobre una superficie plana, formando cada cavidad una cámara de reacción de analito, en la que las cámaras de reacción presentan un espaciado de centro a centro de entre 5 y 200 µm. Cada cámara de reacción también presenta un ambiente de polimerización en el que el polímero de ácidos nucleicos actúa como un polímero de molde para la síntesis de un polímero de ácidos nucleicos complementario al añadirse nucleótidos. Se proporciona sucesivamente una serie de soluciones de alimentación al ambiente de polimerización, presentando cada solución de alimentación un nucleótido seleccionado de entre los nucleótidos a partir del que se formará el polímero de ácidos nucleicos complementario, de manera que, en el caso de que el nucleótido en la solución de alimentación sea complementaria al siguiente nucleótido en el polímero molde que debe secuenciarse, el nucleótido se incorporará en el polímero complementario y se liberará pirofosfato inorgánico. A continuación, se detecta la formación de pirofosfato inorgánico para determinar la identidad de cada nucleótido en el polímero complementario y de esta manera, la secuencia del polímero de molde. [0125] En otro aspecto, la invención implica un método para identificar la base en una posición diana en una secuencia de ADN de un ADN de muestra. El método incluye proporcionar una muestra de ADN dispuesta dentro de una pluralidad de cavidades en una superficie plana, formando cada cavidad una cámara de reacción de analito, en la que las cámaras de reacción presentan un espaciado de centro a centro de entre 5 y 200 µm, convirtiendo el ADN en monocatenario antes o después de introducirlo en las cámaras de reacción. A continuación, se proporciona un cebador de extensión que se hibrida con el ADN monocatenario inmovilizado en una posición inmediatamente contigua a la posición diana. El ADN monocatenario inmovilizado se somete a una reacción de polimerasa en presencia de un nucleótido trifosfato predeterminado, en el que, en el caso de que el nucleótido trifosfato predeterminado se incorpore en el extremo 3' del cebador de secuenciación, se forma un producto secundario de la reacción de secuenciación. A continuación, se identifica el producto secundario de la reacción de secuenciación, determinando de esta manera el nucleótido complementario a la base en la posición diana. [0126] En otro aspecto, la invención implica un método para identificar una base en una posición diana en una secuencia de ADN de muestra. El método incluye proporcionar ADN de muestra dispuesta dentro de una pluralidad de cavidades en una superficie plana, formando cada cavidad un cámara de reacción de analito, en el que las cámaras de reacción presentan un espaciado de centro a centro de entre 5 y 200 µm, convirtiendo el ADN en monocatenario antes o después de introducirlo en las cámaras de reacción, y proporcionando un cebador de extensión que se hibrida con el ADN de muestra inmediatamente contiguo a la posición diana. La secuencia de ADN de muestra y el cebador de extensión se someten seguidamente a una reacción de polimerasa en presencia de un nucleótido trifosfato, en la que el nucleótido trifosfato únicamente se incorpora, liberando pirofosfato (PPI), en el caso de que sea complementario a la base en la posición diana, añadiendo el nucleótido trifosfato a alícuotas separadas de mezcla de muestra-cebador o sucesivamente a la misma muestra de muestra-cebador. Seguidamente se detecta la liberación de PPi para indicar qué nucleótido se incorpora. [0127] En otro aspecto, la invención implica un método para identificar una base en una posición diana en una secuencia de ADN de muestra de una cadena. El método incluye proporcionar un cebador de extensión que se hibrida a ADN de muestra inmediatamente contiguo a la posición diana, encontrándose el ADN de muestra dentro de una pluralidad de cavidades en una superficie plana, formando cada cavidad una cámara de reacción de analito, en el que las cámaras de reacción presentan un espaciado de centro a centro de entre 5 y 200 µm, convirtiendo el ADN en monocatenario antes o después de introducirlo en las cámaras de reacción. El ADN de muestra y el cebador de extensión se someten a una reacción de polimerasa en presencia de un desoxinucleótido o dideoxinucleótido predeterminado, en la que el desoxinucleótido o dideoxinucleótido únicamente se incorporará y liberará pirofosfato (PPi) en el caso de que sea complementario a la base en la posición diana, añadiendo los desoxinucleótidos o dideoxinucleótidos predeterminados en alícuotas separadas de mezcla de muestra-cebador o sucesivamente a la misma mezcla de muestracebador. Cualquier liberación de PPi se detecta enzimáticamente para indicar qué desoxinucleótido o dideoxinucleótido se ha incorporado. Se caracteriza porque el enzima o enzimas de detección de PPi se incluyen en la etapa de reacción de polimerasa y porque, en lugar de la desoxiadenosina trifosfato o dideoxiadenosina trifosfato (ATP), se utiliza un análogo de dATP o de ddATP que es capaz de actuar como sustrato para una polimerasa pero es incapaz de actuar como sustrato para un enzima de detección de PPi. [0128] En otro aspecto, la invención implica un método para secuenciar un ácido nucleico. El método incluye proporcionar uno o más cebadores de anclaje de ácidos nucleicos, y una pluralidad de ácidos nucleicos de molde dispuestos en una pluralidad de cavidades en las matrices anteriormente indicadas. Se hibrida una cantidad efectiva del cebador de anclaje de ácidos nucleicos con por lo menos uno del os moldes circulares de una cadena, rindiendo un complejo de cebador de anclaje cebador-molde circular. A continuación, se combina el cebador de anclaje cebado-molde circular con una polimerasa para formar un cebador de anclaje extendido unido covalentemente a múltiples copias de un ácido nucleico complementario al molde de ácidos nucleicos circular, seguido de la hibridación de una cantidad efectiva de un cebador de secuenciación con una o más copias del ácido nucleico complementario unido covalentemente. A continuación, se extiende el cebador de secuenciación con una polimerasa y un nucleótido trifosfato predeterminado, rindiendo un producto de secuenciación y, en el caso de que se incorpore el nucleótido trifosfato predeterminado en el extremo 3' del cebador de secuenciación, un producto secundario de la reacción de secuenciación. A continuación, se identifica el producto secundario de la reacción de secuenciación, determinando de esta manera la secuencia del ácido nucleico.

Estructura de los cebadores de anclaje [0129] Los cebadores de anclaje de la invención generalmente comprenden una región de tallo y por lo menos una región adaptadora. En una realización preferente, el cebador de anclaje contiene por lo menos dos regiones adaptadoras contiguas. La región de tallo se encuentra presente en el extremo 5' del cebador de anclaje e incluye una región de nucleótidos para unir el cebador de anclaje al sustrato sólido. [0130] La región o regiones adaptadores comprenden secuencias de nucleótidos que se hibridan a una secuencia complementaria presente en uno o más miembros de una población de secuencias de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el cebador de anclaje incluye dos regiones adaptadoras contiguas, que se hibridan con regiones complementarias ligadas a extremos separados de una secuencia diana de ácidos nucleicos. La presente realización se ilustra en la Fig. 1, que se comenta en mayor detalle posteriormente. En realizaciones adicionales, las regiones adaptadoras en los cebadores de anclaje son complementarias a regiones no contiguas de secuencia presente en una segunda secuencia de ácidos nucleicos. Cada región adaptadora, por ejemplo, puede ser homóloga a cada extremo de un fragmento producido mediante digestión con una o más endonucleasas de restricción. El fragmento puede incluir, por ejemplo, una secuencia que se conoce o se sospecha que contiene un polimorfismo de secuencia. Además, el cebador de anclaje puede contener dos regiones adaptadoras que son homólogas a una región con hueco de una secuencia diana de ácidos nucleicos, es decir, una que es no contigua debido a una deleción de uno o más nucleótidos. En el caso de que se utilicen regiones adaptadoras que presenten dichas secuencias, puede hibridarse un oligonucleótido alineado correspondiente a la secuencia con hueco, con el cebador de anclaje conjuntamente con una población de moléculas molde de ácidos nucleicos. [0131] El cebador de anclaje opcionalmente puede contener elementos adicionales, tal como uno o más sitios de reconocimiento de enzima de restricción, sitios de unión de ARN polimerasa, por ejemplo un sitio de promotor de T7, o secuencias presentes en secuencias de ADN identificadas, por ejemplo secuencias presentes en genes conocidos. La región o regiones adaptadoras también pueden incluir secuencias que es conocido que flanquean polimorfismos de secuencia. Entre los polimorfismos de secuencia se incluyen sustituciones, inserciones, deleciones u otras reorganizaciones de nucleótidos que resultan en una diferencia de secuencia entre dos secuencias de ácidos nuclicos de otra manera idénticas. Un ejemplo de un polimorfismo de secuencia es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). [0132] En general, cualquier ácido nucleico capaz de apareamiento de bases puede ser utilizado como cebador de anclaje. En algunas realizaciones, el cebador de anclaje es un oligonucleótido. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "oligonucleótido" incluye oligómeros lineales de monómeros o enlaces naturales o modificados, por ejemplo desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, formas anoméricas de los mismos, ácidos péptidonucleicos (APNs) y similares, que son capaces de unirse específicamente a un polinucleótido diana mediante un patrón regular de interacciones monómero-con-monómero. Entre estos tipos de interacciones pueden incluirse, por ejemplo, el apareamiento de bases de tipo Watson-Crick, el apilamiento de bases, el apareamiento de bases de tipo Hoogsteen u Hoogsteen inverso, o similar. Generalmente, los monómeros se unen mediante enlaces fosfodiéster, o análogos de los mismos, formando oligonucléotidos de tamaños comprendidos entre, por ejemplo, 3 y 200, 8 y 150, 10 y 100, 20 y 80 ó 25 y 50 unidades monoméricas. En todo caso en que se represente un oligonucleótido por una secuencia de letras, se entiende que los nucleótidos se encuentran orientados en dirección 5' a 3', de izquierda a derecha, y que la letra "A" se refiere a desoxiadenosina, la letra "T" se refiere a timidina, la letra "C" se refiere a desoxicitosina y la letra "G" se refiere a desoxiguanosina, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria. Los oligonucleótidos de la presente invención pueden incluir análogos de nucleótidos no naturales. Sin embargo, en el caso de que se requiera, por ejemplo, el procesamiento por parte de enzimas, o similar, generalmente se requieren oligonucleótidos que comprenden nucleótidos naturales para el mantenimiento de la función biológica.

Unión de cebadores a sustratos sólidos [0133] Los cebadores de anclaje se unen al sustrato sólido en los sitios sensibilizados. Una región de un sustrato sólido que contiene un cebador ligado se denomina en la presente memoria como región de anclaje. De esta manera, mediante la especificación de los estados sensibilizados en el soporte sólido, resulta posible formar una serie o matriz de regiones de anclaje. Las regiones de anclaje pueden ser, por ejemplo, localizaciones de pequeño diámetro grabadas a intervalos uniformemente espaciados en el soporte sólido. Las regiones de anclaje pueden localizarse en los fondos de los cavitados o pocillos en el caso de que el sustrato haya sido cavitado, grabado o de otro modo micromecanizado tal como se ha comentado anteriormente. [0134] En una realización, el cebador de anclaje se une a una partícula. El cebador de anclaje puede unirse a la partícula antes de formarse del cebador de anclaje extendido o tras la formación del cebador de anclaje extendido. [0135] El cebador de anclaje puede unirse al soporte sólido mediante una interacción covalente o no covalente. En general, puede utilizarse cualquier enlace reconocido de la técnica. Entre los ejemplos de dichos enlaces comunes en la técnica se incluyen cualquier complejo adecuado de metal (por ejemplo Co2+, Ni2+)-hexahistidina, una proteína ligante de biotina, por ejemplo avidina modificada NEUTRAVIDINTM (Pierce Chemicals, Rockford, IL), estreptavidina/biotina, avidina/biotina, glutatión S-transferasa (GST)/glutatión, anticuerpo monoclonal/antígeno y proteína ligante de maltosa/maltosa, y tecnologías de acoplamiento de plurónico. Las muestras que contienen la etiqueta apropiada se incuban con el sustrato sensibilizado de manera que se unen cero, una o múltiples moléculas a cada sitio sensibilizado. [0136] Un método de anclaje de tipo biotin-(estrept)avidina utiliza una capa delgada de un análogo de biotina fotoactivable secado sobre una superficie sólida (Hengsakul y Cass, Bioconjugate Chem. 7:249-254, 1996). A continuación, se expone el análogo de biotina a luz blanca a través de una máscara, de manera que se crean áreas definidas de biotina activada. Seguidamente se añade avidina (o estreptavidina) y se deja que se una a la biotina activada. La avidina presenta sitios de unión a biotina libres que pueden utilizarse para "anclar" los oligonucleótidos biotinilados mediante un enlace de biotin-(estrept)avidina. [0137] Alternativamente, el cebador de anclaje puede unirse al soporte sólido con un derivado de biotina que presente un grupo protector fotoeliminable. Este grupo se encuentra covalentemente unido a la albúmina de suero bovina (BSA), que se encuentra unido al soporte sólido, por ejemplo una superficie de vidrio (ver Pirrung y Huang, Bioconjugate Chem. 7:317-321, 1996). A continuación, se utiliza una máscara para crear biotinas activadas dentro de las áreas irradiadas definidas. Seguidamente puede localizarse la avidina en el área irradiada, uniendo posteriormente ADN biotinilado mediante un enlace BSA-biotinaavidina-biotina. Si se desea, se deposita una capa intermedia de silano en una monocapa autoensamblada sobre una superficie de silano-dióxido de silicio que puede grabarse con un patrón para localizar la unión de BSA en regiones definidas (ver, por ejemplo, Mooney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12287-12291, 1996). [0138] En la unión basada en plurónico, los cebadores de anclaje en primer lugar se unen a los extremos de un copolímero tribloque de óxido de polietielno-óxido de polipropilenoóxido de polietileno, que también se conoce como compuesto plurónico. El grupo plurónico puede utilizarse para unir los cebadores de anclaje a un sustrato sólido. Los plurónicos se unen a superficies hidrofóbicas en virtud de la reacción entre la superficie hidrofóbica y el óxido de polipropileno. Los grupos de óxido de polietileno restantes se extienden hacia afuera de la superficie, creando de esta manera un ambiente hidrofílico. El ácido nitrilotriacético (NTA) puede conjugarse con los extremos terminales de las cadenas de óxido de polietileno para permitir que los cebadores de anclaje etiquetados con hexahistidinas puedan unirse. En otra realización, puede conjugarse disulfuro de piridilo (PDS) con los extremos de las cadenas de polietileno, permitiendo la unión de un cebador de anclaje tiolado mediante un enlace disulfuro. En una realización preferente, se utiliza Pluronic F108 (BASF Corp.) para la unión. [0139] Cada sitio sensibilizado en un soporte sólido es potencialmente capaz de unir múltiples cebadores de anclaje. De esta manera, cada región de anclaje puede incluir uno o más cebadores de anclaje. Resulta preferible maximizar el número de regiones que presentan únicamente un único centro de reacción productivo (por ejemplo el número de regiones que, tras la reacción de extensión, presentan únicamente una sola secuencia extendida a partir del cebador de anclaje). Lo anterior puede conseguirse mediante técnicas que incluyen, aunque sin limitación: (i) modificar la dilución de los cebadores de anclaje biotinilados que se lavan sobre la superficie, (ii) modificar el tiempo de incubación durante el que los cebadores biotinilados se encuentran en contacto con la superficie de avidina, (iii) modificar la concentración de molde circular abierto o cerrado de manera que, de promedio, únicamente un cebador en cada región resulte extendido para generar el molde de secuenciación, o (iv) reducir el tamaño de la región de anclaje para aproximarse a las dimensiones de una única molécula (<1 µm) de manera que la unión de un anclaje inhiba o bloquee la unión de otro anclaje (pro ejemplo mediante fotoactivación de una localización de tamaño reducido), o (v) reducir el tamaño de la región de anclaje de manera que la unión de un molde circular inhiba

o bloquee la unión de un segundo molde circular. [0140] En algunas realizaciones, cada región individual contiene únicamente un cebador de anclaje unido. Las regiones que presentan únicamente un cebador de anclaje pueden construirse mediante diluciones limitantes de un cebador de anclaje seleccionado sobre el soporte sólido de manera que, de promedio, únicamente se deposite un solo cebador de anclaje en cada región. La concentración de cebador de anclaje que debe aplicarse en una región puede calcularse utilizando, por ejemplo, un modelo de distribución de Poisson. [0141] Con el fin de maximizar el número de regiones de reacción que contienen un único cebador de anclaje, se lleva a cabo una serie de experimentos de dilución en los que se modifica un abanico de concentraciones de cebador de anclaje o de molde circular. Para las concentraciones altamente diluidas de cebadores, los cebadores y los moldes circulares que se unen a la misma región serán independientes entre sí, y una distribución de Poisson caracterizará el número de cebadores de anclaje extendidos en una región cualquiera. Aunque existirá variabilidad en el número de cebadores que se extiende realmente, un máximo de 37% de las regiones presentará un único cebador de anclaje extendido (el número de regiones con un único oligonucleótido de anclaje). Este número puede obtenerse de la manera siguiente. [0142] Sea Np el número medio de cebadores de anclaje en una región de anclaje, y f la probabilidad de que un cebador de anclaje resulte extendido con un molde circular. El número medio de cebadores de anclaje extendidos por cada región de anclaje será Npf, que se define como la cantidad a. Existirá variabilidad en el número de cebadores que se extenderán realmente. En el límite de baja concentración, los cebadores y moldes circulares que se unan a la misma región serán independientes entre sí, y una distribución de Poisson P(n) caracterizará el número de cebadores de anclaje n extendidos en una región de anclaje cualquiera. Esta distribución puede definirse matemáticamente como: P(n) = (an/n!)exp(-a), en donde P(1) = a exp(-a). La probabilidad P(1) adopta su valor máximo exp(-1) para a=1, presentando el 37% de las regiones un único cebador de anclaje extendido. [0143] Puede rastrearse seguidamente un abanico de concentraciones de cebador de anclaje y de molde circular para encontrar un valor de Npf próximo a 1. Un método preferente para optimizar esta distribución es permitir la existencia de múltiples cebadores de anclaje en cada región de reacción, aunque utilizando una dilución limitante de molde circular, de manera que, de promedio, únicamente un cebador en cada región se extienda para generar el molde de secuenciación. [0144] Alternativamente, a concentraciones bajas de cebadores de anclaje, probablemente se unirá como máximo un cebador de anclaje a cada región de reacción. Puede utilizarse una concentración elevada de molde circular de manera que resulte probable que se extienda cada cebador. [0145] En el caso de que las regiones de reacción se dispongan ordenadamente sobre una superficie plana o una matriz de fibras ópticas, las regiones individuales presentan un lado de aproximadamente 10 µm, con un espaciado de 100 µm entre regiones contiguas. Por lo tanto, en una superficie de 1 cm2 podría depositarse un total de aproximadamente 10.000 microrreactores, y según la distribución de Poisson, aproximadamente 3.700 de ellos contendrán un único cebador de anclaje. En determinadas realizaciones, tras unir el cebador oligonucleótido al soporte sólido, se depositan enzimas modificados, por ejemplo biotinilados, para unirse a los sitios de unión a avidina restantes no utilizados sobre la superficie. [0146] En otras realizaciones, se unen cebadores de anclaje a una región individual cualquiera en la matriz. Las diluciones limitantes de una pluralidad de ácidos nucleicos circulares de molde (descritos en mayor detalle posteriormente) pueden hibridarse con los cebadores de anclaje inmovilizados de manera que, de promedio, únicamente un cebador en cada región se hibride con un ácido nucleico de molde. Pueden calcularse las concentraciones de biblioteca que deben utilizarse, por ejemplo mediante limitaciones limitantes y un modelo de distribución de Poisson.

Ácidos nucleicos de molde [0147] Los ácidos nucleicos de molde que pueden secuenciarse según la invención, por ejemplo una biblioteca de ácidos nucleicos, en general pueden incluir moléculas circulares abiertas o cerradas de ácidos nucleicos. Un "círculo cerrado" es una molécula circular covalentemente cerrada de ácidos nucleicos, por ejemplo una molécula de ADN o ARN circular. Un "círculo abierto" es una molécula de ácidos nucleicos lineal de una cadena que presenta un grupo 5' fosfato y un grupo 3' hidroxilo. En una realización, el ácido nucleico de una cadena contiene por lo menos 100 copias de secuencia de ácidos nucleicos, cada copia unida covalentemente extremo con extremo. En algunas realizaciones, el círculo abierto se forma in situ a partir de una molécula de ácidos nucleicos de doble cadena. Los extremos de una molécula de ácidos nucleicos de círculo abierto dada pueden ligarse con una ADN ligasa. Las secuencias en los extremos 5' y 3' de la molécula de círculo abierto son complementarias a dos regiones de nucleótidos contiguas en una segunda molécula de ácidos nucleicos, por ejemplo una región adaptadora de un cebador de anclaje, o a dos regiones que son prácticamente contiguas en una segunda molécula de ADN. De esta manera, pueden ligarse los extremos de la molécula de círculo abierto utilizando ADN ligasa o extenderse con una ADN polimerasa en una reacción de rellenado de hueco. Los círculos abiertos se describen en detalle en Lizardi, patente US nº 5.854.033. Un círculo abierto puede convertirse en un círculo cerrado en presencia de una ADN ligasa (para el ADN) o una ARN ligasa tras, por ejemplo, la hibridación del círculo abierto con un cebador de anclaje. [0148] Si se desea, pueden proporcionarse ácidos nucleicos de molde en forma de sondas candado. Las sondas candado son oligonucleótidos lineales que incluyen secuencias complementarias a la diana situadas en cada extremo, y que se encuentran separadas por una secuencia de línker. Los línkers pueden ligarse a los extremos de miembros de una biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos que han sido, por ejemplo físicamente fragmentadas o digeridas con endonucleasas de restricción. Tras la hibridación a una secuencia diana, las regiones 5'-terminales y 3'-terminales de estos oligonucleótidos lineales se reúnen hasta yuxtaponerse. Esta yuxtaposición permite que los dos segmentos de sonda (en caso de que se hayan hibridado correctamente) se unan covalentemente mediante ligación enzimática (por ejemplo con ADN ligasa de T4), convirtiendo de esta manera las donas en moléculas circularmente cerradas que se encadenan a las secuencias diana específicas (ver, por ejemplo, Science. 265:2085-2088, 1994; Nilsson et al., 1997). Las pruebas resultantes son adecuadas para el análisis simultáneo de muchas secuencias de genes tanto debido a su especialidad y la selectividad para las variantes de secuencia de genes (ver ejemplo Lizardi et al., 1998 Nat.Genet. 19:225-232; Nilsson, et al. 1997 Nat.Gene16:252-255) y debido al hecho de que los productos de reacción resultantes permanecen localizados en las secuencias diana específicas. Además, la ligación intramolecular de muchas sondas diferentes se espera que resulte menos susceptible a la reactividad cruzada no específica que las metodologías de tipo PCR multiplex, en las que las parejas no afines de cebadores pueden dar lugar a productos de amplificación irrelevantes (ver, por ejemplo, Landegren y Nilsson, Ann. Med. 29:585-590, 1997). [0149] Puede construirse una biblioteca inicial que comprenda moléculas de ácidos nucleicos monocatenarios o bicatenarios, con la condición de que la secuencia de ácidos nucleicos incluya una región que, en caso de encontrarse presente en la biblioteca, se encuentre disponible para la hibridación, o pueda proporcionarse a la hibridación, con una secuencia de cebador de anclaje. Por ejemplo, al utilizarla como molde para la amplificación por círculo rodante, una región de un molde de doble cadena necesita ser por lo menos transitoriamente de una cadena con el fin de que actúe como molde para la extensión del cebador de anclaje. [0150] Los moldes de biblioteca pueden incluir múltiples elementos, incluyendo, aunque sin limitación, una o más regiones que son complementarias al cebador de anclaje. Por ejemplo, las bibliotecas de moldes pueden incluir una región complementaria a un cebador de secuenciación, una región de nucleótidos de control, y una secuencia insertada que comprende el molde de secuenciación que debe caracterizarse posteriormente. Tal como se explica en mayor detalle posteriormente, se utiliza la región de nucleótidos de control para calibrar la relación entre la cantidad de producto secundario y el número de nucleótidos incorporado. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "complemento" se refiere a secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridarse con una secuencia de nucleótidos específica para formar un dúplex correspondiente. [0151] En una realización, un molde de biblioteca incluye: (i) dos regiones claramente delimitadas que son complementarias al cebador de anclaje, (ii) una región homóloga al cebador de secuenciación, (iii) una región opcional de nucleótidos de control, (iv) una secuencia insertada de, por ejemplo, 30 a 500, 50 a 200 ó 60 a 100 nucleótidos, que debe secuenciarse. El molde puede, evidentemente, incluir dos, tres o las cuatro características indicadas. [0152] El ácido nucleico de molde puede construirse a partir de cualquier fuente de ácidos nucleicos, por ejemplo cualquier célula, tejido u organismo, y puede generarse mediante cualquier método reconocido de la técnica. Entre los métodos adecuados se incluyen, por ejemplo, la sonicación de ADN genómico y la digestión con una o más endonucleasas de restricción (RE) para generar fragmentos de un abanico deseado de longitudes a partir de una población inicial de moléculas de ácidos nucleicos. Preferentemente, uno o más de los enzimas de restricción presenta secuencias de reconocimiento de cuatro bases claramente delimitadas. Entre los ejemplos de dichos enzimas se incluyen, por ejemplo, Sau3A1, MspI y TaqI. Preferentemente, los enzimas se utilizan conjuntamente con cebadores de anclaje que presentan regiones que contienen secuencias de reconocimiento para los enzimas de restricción correspondientes. En algunas realizaciones, una o ambas regiones adaptadoras de los cebadores de anclaje contienen secuencias adicionales contiguas a secuencias de reconocimiento de enzima de restricción conocidas, permitiendo de esta manera la captura o la hibridación al cebador de anclaje de fragmentos de restricción específicos de interés con el cebador de anclaje. En otras realizaciones, el enzima de restricción se utiliza con un enzima de restricción de tipo IIS. [0153] Alternativamente, pueden construirse bibliotecas de moldes mediante la generación de una biblioteca de ADN complementario (ADNc) a partir de ARN, por ejemplo ARN mensajero (ARNm). La biblioteca de ADNc puede, si se desea, procesarse adicionalmente con endonucleasas de restricción para obtener un extremo 3' característico de un ARN específico, fragmentos internos, o fragmentos que incluyen el extremo 3' del ARN aislado. Las regiones adaptadoras en el cebador de anclaje pueden ser complementarias a una secuencia de interés que se cree que se encuentra presente en la biblioteca de moldes, por ejemplo un polimorfismo de secuencia conocido o sospechado dentro de un fragmento generado mediante digestión con endonucleasa. [0154] En una realización, puede unirse un oligonucleótido de indexado a miembros de una biblioteca de moldes para permitir la correlación posterior entre un ácido nucleico molde y una población de ácidos nucleicos a partir de la que se deriva el ácido nucleico molde. Por ejemplo, puede fragmentarse separadamente una o más muestras de una población inicial de ADN utilizando cualquiera de los métodos anteriormente dados a conocer (por ejemplo digestión de restricción y sonicación). Se une una secuencia oligonucleótida de indexado específica para cada muestra, por ejemplo se liga, a los extremos de miembros de la población fragmentada. El oligonucleótido de indexado puede actuar como región para la circularización, amplificación y, opcionalmente, secuenciación, que permite que se utilice para indexar, o codificar, un ácido nucleico de manera que se identifique la muestra de partida a partir de la que se deriva. [0155] Pueden mezclarse entre sí bibliotecas de moldes diferentes construidas con una pluralidad de cebadores de indexado distinguibles, para reacciones posteriores. La determinación de la secuencia del miembro de la biblioteca permite la identificación de una secuencia correspondiente al oligonucleótido de indexado. Basándose en esta información, puede inferirse el origen de cualquier fragmento dado.

Hibridación y amplificación de complejos de ácidos nucleicos cebadores-molde [0156] Se hibridan bibliotecas de ácidos nucleicos a secuencias de cebador de anclaje utilizando técnicas reconocidas (ver, por ejemplo, Hatch et al., Genet. Anal. Biomol. Engineer. 15:35-40, 1999; Kool, patente US nº 5.714.320, y Lizardi, patente US nº 5.854.033). En general, resulta adecuado cualquier procedimiento para hibridar los cebadores de anclaje a las secuencias de ácidos nucleicos molde con la condición de que resulte en la formación de complementariedad específica, es decir, perfecta o prácticamente perfecta, entre la región o regiones adaptadoras en la secuencia de cebador de anclaje y una secuencia presente en la biblioteca de moldes. [0157] Pueden utilizarse varias técnicas de amplificación in vitro de ácidos nucleicos para extender la secuencia de cebador de anclaje. El tamaño del ADN amplificado preferentemente es menor que el tamaño de la región de anclaje y también menor que la distancia entre regiones de anclaje. [0158] La amplificación típicamente se lleva a cabo en presencia de una polimerasa, por ejemplo una ADN polimerasa o ADN polimerasa dirigida por ARN, y uno, dos, tres o cuatro tipos de nucleótidos trifosfato y, opcionalmente, proteínas de unión auxiliares. En general, puede utilizarse cualquier polimerasas capaz de extender un grupo 3' OH cebdor con la condición de que no presente actividad exonucleasa 3' a 5'. Entre las polimerasas adecuadas se incluyen, por ejemplo, las ADN polimerasas de Bacillus stearothermophilus, Thermus acquaticus, Pyrococcus furiosis, Thermococcus litoralis,y Thermus thermophilus, bacteriófago T4 y T7 y el fragmento klenow de la ADN polimerasa I de E. coli. Entre las ADN polimerasas dirigidas por ARN adecuadas se incluyen, por ejemplo, la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar, la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney, y la transcriptasa inversa del virus 1 de la inmunodeficiencia humana. [0159] Se han descrito varias técnicas de amplificación in vitro de ácidos nucleicos. Estas metodologías de amplificación pueden diferenciarse en aquellos métodos: (i) que requieren ciclado de temperatura-reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (ver, por ejemplo, Saiki et al., Science 230:1350-1354, 1995), reacción en cadena de la ligasa (ver, por ejemplo, Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193, 1991; Barringer et al., Gene 89:117-122, 1990) y amplificación basada en transcripción (ver, por ejemplo, Kwoh et al., Proc. Natl. ACad. Sci. USA 86:1173-1177, 1989) e (ii) sistemas de amplificación isotérmica, replicación de secuencias autosostenida (ver, por ejemplo, Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878, 1990), el sistema de replicasa Qβ (ver, por ejemplo, Lizardi et al., BioTechnology 6:1197-1202, 1988), amplificación por desplazamiento de cadena (Nucleic Acids Res. 20(7):1691-6, 11 de abril de 1992), y los métodos descritos en PNAS 89(1):392-6, 1 de enero de 1992, y NASBA, J. Virol. Methods 35(3):273-86, diciembre de 1991. [0160] La amplificación isotérmica también incluye la amplificación de tipo círculo rodante (RCA). Se comenta la RCA en, por ejemplo, Kool, patente US nº 5.714.320, y en Lizardi, patente US nº 5.854.033; Hatch et al., Genet. Anal. Biomol. Engineer. 15:35-40, 1999. El resultado de la RCA es una única cadena de ADN extendida desde el extremo 3' del cebador de anclaje (y, de esta manera, unida a la matriz de soporte sólido) y que incluye un concatámero que contiene múltiples copias de molde circular hibridadas con una secuencia de cebador. Típicamente pueden obtenerse con la RCA 1.000 a 10.000 ó más copias de moldes circulares, presentando cada uno un tamaño de, por ejemplo, aproximadamente 30 a 500, 50 a 200 ó 60 a 100 nucleótidos. [0161] El producto de la amplificación mediante RCA tras la hibridación de una molécula circular de ácidos nucleicos con un cebador de anclaje se muestra esquemáticamente en la Fig. 1A. Se hibrida un ácido nucleico molde circular 102 con un cebador de anclaje 104, que se ha sido unido a una superficie 106 en su extremo 5' y que presenta un 3' OH libre disponible para la extensión. El ácido nucleico molde circular 102 incluye dos regiones adaptado-ras 108 y 110 que son complementarias a las regiones de secuencia en el cebador de anclaje 104. También se incluye en el ácido nucleico molde circular 102 una inserción 112 y una región 114 homóloga a un cebador de secuenciación, que se utiliza en las reacciones de secuenciación indicadas posteriormente. [0162] Tras la hibridación, el 3'-OH libre en el cebador de anclaje 104 puede extenderse utilizando secuencias en el ácido nucleico molde 102. El cebador de anclaje 102 puede extenderse a lo largo del molde múltiples veces, añadiendo cada iteración a la secuencia extendida a partir del cebador de anclaje una secuencia complementaria al ácido nucleico molde circular. En la Fig. 1A se muestran cuatro iteraciones, o cuatro rondas de replicación por círculo rodante, como el producto de amplificación extendido del cebador de anclaje 114. La extensión del cebador de anclaje resulta en un producto de amplificación unido covalentemente o de otro modo unido físicamente al sustrato 106. [0163] Se muestran en mayor detalle en las Figs. 1B-1D realizaciones adicionales de moldes circulares y cebadores de anclaje. La Fig. 1B muestra un sustrato lineal de círculo abierto hibridado que puede servir, tras la ligación, como molde para la extensión de un cebador de anclaje. Se hibrida una molécula molde que presenta la secuencia 5'-TCg TgT gAg gTC TCA gCA TCT TAT gTA TAT TTA CTT CTA TTC TCA gTT gCC TAA gCT gCA gCC A-3' (SEC ID nº 1) con un cebador de anclaje que presenta un línker de biotina en su extremo 5' y la secuencia 5'-gAC CTC ACA CgA Tgg CTg CAg CTT-3' (SEC ID nº 2). La hibridación del molde resulta en la yuxtaposición de los extremos 5' y 3' de la molécula molde. El 3'OH del cebador de anclaje puede extenderse utilizando el molde circular. [0164] La utilización de un molde circular y un cebador de anclaje para la identificación de polimorfismos de un solo nucleótidos se muestra en la Fig. 1C. Se muestra un cebador de anclaje genérico que presenta la secuencia 5'-gAC CTC ACA CgA Tgg CTg CAg CTT-3' (SEC ID nº 3). El cebador de anclaje se hibrida con una sonda SNP que presenta la secuencia 5'-TTT ATA TgT ATT CTA CgA CTC Tgg AgT gTg CTA CCg ACg TCg AAt CCg TTg ACT CTT ATC TTC A-3' (SEC ID nº 4). La sonda SNP a su vez se hibrida con una región de una región que contiene SNP de un gen que presenta la secuencia 5'-CTA gCT CgT ACA TAT AAA TgA AgA TAA gAT CCT g-3' (SEC ID nº 5). La hibridación de una secuencia de ácidos nucleicos que contiene el polimorfismo con el complejo de la sonda SNP permite la posterior ligación y circularización de la sonda SNP. La sonda SNP está diseñada de manera que sus extremos 5' y 3' se hibriden con la región genómica de manera que sobresalgan en la región del sitio polimórfico, tal como se indica en la Fig. 1C. La sonda SNP circularizada seguidamente puede extenderse y secuenciarse utilizando los métodos descritos en la presente memoria. Un ácido nucleico que no presente el polimorfismo no se hibrida de manera que resulta en la yuxtaposición de los extremos 5' y 3' de la sonda SNP. En este caso, la sonda SNP no puede ligarse para formar un sustrato circular necesario para la extensión posterior.

[0165] La Fig. 1D ilustra la utilización de un oligonucleótido de hueco con una molécula molde circular. Se une un cebador de anclaje que presenta la secuencia 5'-gAC CTC ACA CgA gTA gCA Tgg CTg CAg CTT-3' (SEC ID nº 6) a una superficie mediante un línker de biotina. Una molécula molde que presenta la secuencia 5'-TCg TgT gAg gTC TCA gCA TCT TAT gTA TAT TTA CTT CTA TTC TCA gTT gCC TAA gCT gCA gCC A-3' ( SEC ID nº 7) se hibrida con el cebador de anclaje, resultando en una región parcialmente monocatenario, o región con hueco, en el cebador de anclaje, flanqueada por una región de doble cadena. A continuación, una molécula de hueco que presenta la secuencia 5'-TgCTAC-3' se hibrida con el cebador de anclaje. La ligación de ambos extremos del oligonucleótido de hueco con la molécula molde resulta en la formación de una molécula circular de ácidos nucleicos que puede actuar como un molde para la amplificación por círculo rodante. [0166] Los oligonucleótidos circulares que se generan durante la replicación de ADN mediada por polimerasa dependen de la relación entre el molde y el sitio de inicio de replicación. En los moldes de ADN de doble cadena, entre las características críticas se incluyen que el molde sea de naturaleza lineal o circular, y si el sitio de inicio de replicación (es decir, la "horquilla" de replicación) se encuentra implicado en la síntesis de ambas cadenas de ADN o únicamente de una. En la replicación convencional de ADN de doble cadena, la horquilla de replicación se trata como el sitio en el que se sintetiza las nuevas cadenas de ADN. Sin embargo, en las moléculas lineales (se repliquen unidireccional o bidireccionalmente), el movimiento de la horquilla u horquillas de replicación genera un tipo específico de motivo estructural. En el caso de que el molde sea circular, una posible orientación espacial de la molécula en replicación adopta la forma de una estructura θ. [0167] Alternativamente, puede producirse la RCA al iniciarse en el origen la replicación de la molécula dúplex. A continuación, una muesca abre una de las cadenas y el grupo hidroxilo libre 3'-terminal generado por la muesca es extendido por la acción de la ADN polimerasa. La cadena nuevamente sintetizada finalmente desplaza la cadena de ADN parental original. Este tipo anteriormente mencionado de replicación se conoce como replicación por círculo rodante (RCR) debido a que el punto de replicación puede considerarse que "rueda" en torno a la cadena molde circular y, en teoría, podría continuar de esta manera indefinidamente. Además, debido a que la cadena de ADN nuevamente sintetizada se encuentra unido covalentemente al molde original, la cadena desplazada presenta la secuencia genómica original (por ejemplo el gen u otra secuencia de interés) en su extremo 5' terminal. En la RCR, tras la secuencia genómica original se encuentra un número indeterminado de "unidades de replicación" complementarias a la secuencia molde original, en la que cada unidad de replicación se sintetiza mediante giros continuos de dicha secuencia molde original. Por lo tanto, cada giro posterior desplaza el ADN que se ha sintetizado en el ciclo de replicación anterior.

[0168] In vivo, la RCR se utiliza en varios sistemas biológicos. Por ejemplo, el genoma de varios bacteriófagos es ADN circular monocatenario. Durante la replicación, el ADN circular se convierte inicialmente en una forma dúplex, que después se replica mediante el mecanismo de replicación anteriormente mencionado de círculo rodante. El extremo desplazado genera una serie de unidades genómicas que pueden cortarse e insertarse en las partículas fágicas. Además, la cadena individual desplazada de un círculo rodante puede convertirse en ADN dúplex mediante síntesis de una cadena de ADN complementaria. Esta síntesis puede utilizarse para generar las moléculas dúplex concataméricas necesarias para l maduración de determinados ADNs fágicos. Por ejemplo, lo anterior proporciona la ruta principal por la que madura el bacteriófago λ. La RCR también se utiliza in vivo para generar ADNr amplificado en oocitos de Xenopus, y este hecho podría ayudar a explicar por qué el ADNr amplificado comprende un gran número de unidades repetidas idénticas. En este caso, una única unidad genómica repetida se convierte en un círculo rodante. El extremo desplazado seguidamente se convierte en ADN dúplex que después se corta del círculo de manera que pueden ligarse entre sí dos extremos de manera que generen el círculo amplificado de ADNr. [0169] Mediante la utilización de la reacción de RCA, puede generarse una cadena que representa muchas copias en tándem del complemento de la molécula circularizada. Por ejemplo, se ha utilizado la RCA recientemente para obtener una reacción de amplificación en cascada isotérmica de sondas candado circularizadas in vitro con el fin de detectar genes de una copia en muestras de ADN genómico humano (ver Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225232, 1998). Además, también se ha utilizado RCA para detectar moléculas individuales de ADN en un ensayo basado en una fase sólida, aunque surgieron dificultades al aplicar esta técnica a la hibridación in situ (ver Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232, 1998). [0170] Si se desea, puede llevarse a cabo la RCA a temperaturas elevadas, por ejemplo a temperaturas superiores a 37ºC, 42ºC, 45ºC, 50ºC, 60ºC ó 70ºC. Además, puede llevarse a cabo RCA inicialmente a una temperatura más baja, por ejemplo a temperatura ambiente, y después modificarse por una temperatura elevada. La RCA a temperatura elevada preferentemente se lleva a cabo con ácido nucleico polimerasas termoestables y con cebadores que pueden hibridarse establemente y con especificidad a temperaturas elevadas. [0171] La RCA también puede llevarse a cabo con oligonucleótidos no naturales, por ejemplo ácidos péptido-nucleicos. Además, la RCA puede llevarse a cabo en presencia de proteínas auxiliares, tales como proteínas ligantes de una cadena. [0172] El desarrollo de un método para amplificar moléculas de ADN cortas que han sido inmovilizadas en un soporte sólido, denominado RCA, ha sido descrito recientemente en la literatura (ver, por ejemplo, Hatch et al., Genet. Anal. Biomol. Engineer. 15:35-40, 1999; Zhang et al., Gene 211:277-85, 1998; Baner et al., Nucl. Acids Res. 26:5073-5078, 1998; Liu et al., J. Am. Chem. Soc. 118:1587-1594, 1995, Fire y Xu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4641-4645, 1995; Nilsson et al., Science 265:2085-2088, 1994). La RCA presenta como diana secuencias específicas de ADN mediante hibridación y una reacción de ADN ligasa. A continuación, se utiliza el producto circular como molde en una reacción de amplificación por círculo rodante. [0173] La RCA controlada por ADN polimerasa puede replicar sondas oligonucleótidas circularizadas con una cinética lineal o geométrica bajo condiciones isotérmicas. En presencia de dos cebadores (una hibridante con la cadena +, y la otra, con la cadena + de ADN), se produce un patrón complejo de desplazamiento de cadena de ADN que presenta la capacidad de generar 1x109 ó más copias de cada círculo en un periodo corto de tiempo (es decir, menos de 90 minutos), permitiendo la detección de mutaciones puntuales individuales dentro del genoma humano. Mediante la utilización de un solo cebador, la RCA genera cientos de copias unidas aleatoriamente de un círculo covalentemente cerrado en varios minutos. En el caso de que se encuentre asociado a una matriz de soporte sólido, el producto ADN permanece unido al sitio de síntesis, en donde puede marcarse, condensarse y obtenerse una imagen del mismo como fuente puntual de luz. Por ejemplo, las sondas oligonucleótidas lineales, que pueden generar señales de RCA, se han unido covalentemente a una superficie de vidrio. El color de la señal generado por estas sondas indica el estado alélico de la diana, dependiendo del resultado de los sucesos de ligación específicos dirigidos por una diana. Debido a que la RCA permite contar y separar millones de moléculas individuales de sonda, resulta particularmente adecuado para el análisis de mutaciones somáticas raras. La RCA también resulta prometedora para la detección de sondas-candado unidas a genes de una sola copia en preparaciones citológicas. [0174] Además, también se ha desarrollado metodología de RCA en fase sólida para proporcionar un método efectivo para detectar constituyentes en una solución. Inicialmente se utiliza una etapa de reconocimiento para generar un complejo h un molde circular se une a una superficie. A continuación, se utiliza un enzima polimerasa para amplificar el complejo unido. La RCA utiliza sondas pequeñas de ADN que se amplifican para proporcionar una señal intensa utilizando métodos de detección, incluyendo los métodos descritos en mayor detalle posteriormente. [0175] Entre otros ejemplos de sistemas de amplificación isotérmica se incluyen, por ejemplo, (i) la replicación autosostenida de secuencias (ver, por ejemplo, Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878, 1990), (ii) el sistema de replicasa Qβ (ver, por ejemplo, Lizardi et al., BioTechnology 6:1197-1202, 1988), e (iii) la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA TM, ver Kievits et al., J. Virol. Methods 35:273-286, 1991).

Métodos para determinar la secuencia de nucleótidos del producto amplificado [0176] La amplificación de un ácido nucleico molde tal como se ha descrito anteriormente resulta en múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico molde covalentemente unida a un cebador de anclaje. En una realización, se determina una región del producto secuencia mediante hibridación de un cebador de secuenciación con una región del ácido nucleico molde, y después poniendo en contacto el cebador de secuenciación con una ADN polimerasa y un nucleótido trifosfato conocido, es decir, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, o un análogo de uno de dichos nucleótidos. La secuencia puede determinarse mediante la detección de un producto secundario de la reacción de secuenciación, tal como se describe posteriormente. [0177] El cebador de la secuencia puede presentar cualquier longitud o composición de bases, con la condición de que sea capaz de hibridarse específicamente con una región del ácido nucleico molde amplificado. No resulta necesaria ninguna estructura particular para el cebador de secuenciación con la condición de que sea capaz de cebar específicamente una región del ácido nucleico molde amplificado. Preferentemente, el cebador de secuenciación es complementario a una región del molde que se encuentra entre la secuencia que debe caracterizarse y la secuencia hibridable con el cebador de anclaje. El cebador de secuenciación se extiende con la ADN polimerasa para formar un producto secuencia. La extensión se lleva a cabo en presencia de uno o más tipos de nucleótidos trifosfato, y si se desea, proteínas ligantes auxiliares. [0178] La incorporación del dNTP se determina preferentemente mediante ensayo de la presencia de un producto secundario de la secuenciación. En una realización preferente, la secuencia de nucleótidos del producto de secuenciación se determina mediante la medición del pirofosfato inorgánico (PPi) liberado del nucleótido trifosfato (dNTP) al incorporarse el dNMP en un cebador extendido de la secuencia. Este método de secuenciación, denominado tecnología PyrosequencingTM (PyroSequencing AB, Stockholm, Suecia), puede llevarse a cabo en solución (fase líquida) o como técnica en fase sólida. Los métodos de secuenciación basados en PPi se describen de manera general en, por ejemplo, la patente WO nº 9813523A1; Ronaghi et al., Anal. Biochem. 242:84-89, 1996, y Ronaghi et al., Science 281.363-365, 1998. [0179] El pirofosfato liberado bajo estas condiciones puede detectarse enzimáticamente (por ejemplo mediante la generación de luz en la reacción de luciferasa-luciferina). Dichos métodos permiten identificar un nucleótido en una posición diana dada, y secuenciar simple y rápidamente el ADN, evitando simultáneamente la necesidad de electroforesis y la utilización de marcajes radioactivos, potencialmente peligrosos. [0180] Puede detectarse el PPi mediante varias metodologías diferentes, y se han descrito anteriormente diversos métodos enzimáticos (ver, por ejemplo, Reeves et al., Anal. Biochem. 28:282-287, 1969; Guillory et al., Anal. Biochem. 39:170-180, 1971; Johnson et al., Anal. Biochem. 15:273, 1968; Cook et al., Anal. Biochem. 91:557-565, 1978; y Drake et al., Anal. Biochem. 94:117-120, 1979). [0181] El PPi liberado como resultado de la incorporación de un dNTP por una polimerasa puede convertirse en ATP utilizando, por ejemplo, una ATP sulfurilasa. Se ha identificado que este enzima se encuentra implicado en el metabolismo del azufre. El azufre, tanto en forma reducida como oxidada, es un nutriente mineral esencial para el crecimiento vegetal y animal (ver, por ejemplo, Schmidt y Jager, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43:325349, 1992). Tanto en plantas como en microorganismos, tras la incorporación activa de sulfato se produce la reducción a sulfuro. Como sulfato presenta un potencial de oxidación/reducción muy bajo respecto a los reductores celulares disponibles, la etapa principal en la asimilación requiere su activación mediante una reacción dependiente de ATP (ver, por ejemplo, Leyh, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28:515-542, 1993). La ATP sulfurilasa (ATP:sulfato adenililtransferasa; EC 2.7.7.4) cataliza la reacción inicial en el metabolismo del sulfato inorgánico (SO42-); ver, por ejemplo, Robbins y Lipmann, J. Biol. Chem. 233:686-690, 1958; Hawes y Nicholas, Biochem. J. 133:541-550, 1973). En esta reacción, se activa SO42a adenosina-5'-fosfosulfato (APS). [0182] La ATP sulfurilasa ha sido altamente purificada a partir de varias fuentes, tales como Saccharomyces cerevisiae (ver, por ejemplo, Hawes y Nicholas, Biochem. J. 133:541550, 1973), Penicillium chrysogenum (ver, por ejemplo, Renosto et al., J. Biol. Chem. 265:10300-10308, 1990), hígado de rata (ver, por ejemplo, Yu et al., Arch. Biochem. Biophys. 269:165-174, 1989) y plantas (ver, por ejemplo, Shaw y Anderson, Biochem. J. 127:237-247, 1972; Osslund et al., Plant Physiol. 70:39-45, 1982). Además, se han clonado genes de ATP sulfurilasa a partir de procariotas (ver, por ejemplo, Leyh et al., J. Biol. Chem. 267:10405-10410, 1992; Schwedock y Long, Mol. Plant Microbe Interaction 2:181-194, 1989; Laue y Nelson, J. Bacteriol. 176:3723-3729, 1994), eucariotas (ver, por ejemplo, Cherest et al., Mol. Gen. Genet. 210:307-313, 1987; Mountain y Korch, Yeast 7:873-880, 1991; Foster et al., J. Biol. Chem. 269:19777-19786, 1994), plantas (ver, por ejemplo, Leustek et al., Plant Physiol. 105:897-90216, 1994) y animales (ver, por ejemplo, Li et al., J. Biol. Chem. 270:29453-29459, 1995). El enzima es un homo-oligómero o heterodímero, dependiendo de la fuente específica (ver, por ejemplo, Leyh y Suo, J. Biol. Chem. 267:542-545, 1992). [0183] En algunas realizaciones, se utiliza una sulfurilasa termoestable. Las sulfurilasas termoestables pueden obtenerse de, por ejemplo, Archaeoglobus o Pyrococcus spp. Las secuencias de las sulfurilasas termoestables se encuentran disponibles de la base de datos nº de acceso 028606, nº de acceso Q9YCR4 y nº de acceso P56863. [0184] La ATP sulfurilasa ha sido utilizada para muchas aplicaciones diferentes, por ejemplo la detección bioluminométrica de ADP a concentraciones elevadas de ATP (ver, por ejemplo, Schultz et al., Anal. Biochem. 215:302-304, 1993); el seguimiento continuo de la actividad de ADN polimerasa (ver, por ejemplo, Nyrbn, Anal. Biochem. 167:235-238, 1987) y la secuenciación de ADN (ver, por ejemplo, Ronaghi et al., Anal. Biochem. 242:84-89, 1996; Ronaghi et al., Science 281:363-365, 1998; Ronaghi et al., Anal. Biochem. 267:65-71, 1998). [0185] Se han desarrollado varios ensayos para la detección de la reacción de ATP sulfurilasa directa. El ensayo colorimétrico de molibdolisis se basa en la detección del fosfato (ver, por ejemplo, Wilson y Bandurski, J. Biol. Chem. 233:975-981, 1958), mientras que el ensayo de molibdosis espectrofotométrico continuo se basa en la detección de la oxidación de NADH (ver, por ejemplo, Seubert et al., Arch. Biochem. Biophys. 225:679-691, 1983; Seubert et al., Arch. Biochem. Biophys. 240:509-523, 1985). Este último ensayo requiere la presencia de varios enzimas de detección. Además, también se han descrito en la literatura varios ensayos radioactivos (ver, por ejemplo, Daley et al., Anal. Biochem. 157:385-395, 1986). Por ejemplo, un ensayo se basa en la detección del 32PPi liberado de ATP marcado con 32P (ver, por ejemplo, Seubert et al., Arch. Biochem. Biophys. 240:509-523, 1985) y otro en la incorporación de 35S en APS marcado con 35S (este ensayo también requiere APS quinasa purificada como enzima de acoplamiento; ver, por ejemplo, Seubert et al., Arch. Biochem. Biophys. 225:679-691, 1983) y una tercera reacción depende de la liberación de 35SO42 -de APS marcado con 35S (ver, por ejemplo, Daley et al., Anal. Biochem. 157:385395, 1986). [0186] Para la detección de la reacción de ATP sulfurilasa inversa se han descrito anteriormente un ensayo espectrofotométrico continuo (ver, por ejemplo, Segel et al., Methods Enzymol. 143:334-349, 1987), un ensayo bioluminométrico (ver, por ejemplo, Balharry y Nicholas, Anal. Biochem. 40:1-17, 1971), un ensayo de liberación de 35SO42 --(ver, por ejemplo Seubert et al., Arch. Biochem. Biophys. 240:509-523, 1985), y un ensayo de incorporación de 32PPi (ver, por ejemplo, Osslund et al., Plant Physiol. 70:39-45, 1982). [0187] El ATP producido por una ATP sulfurilasa puede hidrolizarse utilizando reacciones enzimáticas para generar luz. Las reacciones químicas emisoras de luz (es decir, la quimiluminiscencia) y las reacciones biológicas (es decir, la bioluminiscencia) se utilizan ampliamente en bioquímica analítica para mediciones precisas de diversos metabolitos. En las reacciones bioluminiscentes, la reacción química que conduce a la emisión de luz se encuentra catalizada enzimáticamente. Por ejemplo, el sistema luciferina-luciferasa permite un ensayo específico del ATP y puede utilizarse el sistema bacteriano de luciferasa oxidorreductasa para el seguimiento del NAD(P)H. Ambos sistemas han sido ampliados al análisis de numerosas sustancias por medio de reacciones acopladas que implican la producción o utilización de ATP o NAD(P)H (ver, por ejemplo, Kricka, Chemiluminiscente and bioluminiscent techniques, Clin. Chem. 37:1472-1281, 1991). [0188] El desarrollo de nuevos reactivos ha permitido obtener una emisión de luz estable proporcional a las concentraciones de ATP (ver, por ejemplo, Lundin, Applications of firefly luciferase, en: Luminiscent Assays (Raven Press, New York), 1982, o NAD(P)H (ver, por ejemplo, Lovgren et al., Continuous monitoring of NADH-converting reactions by bacterial luminiscence, J. Appl. Biochem. 4:103-111). Con dichos reactivos de emisión lumínica estable, resulta posible preparar ensayos de valoración y calibrar cada ensayo individual mediante la adición de una cantidad conocida de ATP o de NAD(P)H. Además, un sistema de emisión estable de luz también permite el seguimiento continuo de los sistemas de ATP o de conversión de NAD(P)H. [0189] Entre los enzimas adecuados para convertir ATP en luz se incluyen luciferasas, por ejemplo, luciferasas de insecto. Las luciferasas producen luz como producto final de la catálisis. El enzima emisor de luz mejor conocido es el de la luciérnaga, Photinus pyralis (Coleoptera). El gen correspondiente ha sido clonado y expresado en bacterias (ver, por ejemplo, de Wet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7870-7873, 1985) y en plantas (ver, por ejemplo, Ow et al., Science 234:856-859, 1986), así como en insectos (ver, por ejemplo, Jha et al., FEBS Lett. 274:24-26, 1990) y en células de mamífero (ver, por ejemplo, de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725-737, 1987; Keller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3264-3268, 1987). Además, recientemente se han clonado varios genes de luciferasa del escarabajo jamaicano, Pyroplorus plagiophihalamus (Coleoptera) y se han caracterizado parcialmente (ver, por ejemplo, Wood et al., J. Biolumin. Chemilumin. 4:289-301, 1989; Wood et al., Science 244:700-702, 1989). Diferentes luciferasas pueden producir en ocasiones luz de diferentes longitudes de onda, lo que podría permitir el seguimiento simultáneo de las emisiones de luz a diferentes longitudes de onda. Por consiguiente, estas características anteriormente mencionadas son únicas y añaden nuevas dimensiones a la utilización de los sistemas informadores actuales. [0190] La luciferasas de luciérnaga cataliza bioluminiscencia en presencia de luciferina, adenosina 5'-trifosfato (ATP), iones magnesio y oxígeno, resultando en un rendimiento cuántico de 0,88 (ver, por ejemplo, McElroy y Selinger, Arch. Biochem. Biophys. 88:136-145, 1960). La reacción bioluminiscente de luciferasa de luciérnaga puede utilizarse como ensayo para la detección de ATP con un límite de detección de aproximadamente 1x10-3 M (ver, por ejemplo, Leach, J. Appl. Biochem. 3:473-517, 1981). Además, el grado global de sensibilidad y conveniencia de los sitemas de detección mediados por luciferasa ha generado un interés considerable en el desarrollo de biosensores basados en la luciferasa de luciérnaga (ver, por ejemplo, Green y Kricka, Talanta 31:173-176, 1984; Blum et al., J. Biolumin. Chemilumin. 4:543-550, 1989). [0191] Mediante la utilización de los enzimas anteriormente indicados, se expone el cebador de la secuencia a una polimerasa y a un dNTP conocido. En el caso de que el dNTP se incorpore en el extremo 3' de la secuencia del cebador, se corta el dNTP y se libera una molécula de PPi. A continuación, el PPi es convertido en ATP por la ATP sulfurilasa. Preferentemente, la ATP sulfurilasa se encuentra presente a una concentración suficientemente alta para que la conversión del PPi transcurra con cinética de primer orden con respecto al PPi. En presencia de luciferasa, se hidroliza el ATP para generar un fotón. La reacción preferentemente presenta una concentración suficiente de luciferasa dentro de la mezcla de reacción para que la reacción ATP. ADP + PO43-+ fotón (luz) transcurra con cinética de orden uno con respecto al ATP. El fotón puede medirse utilizando métodos y aparatos descritos posteriormente. En una realización, el PPi y una reacción acoplada de sulfurilasa/luciferasa se utilizan para generar luz para la detección. En algunas realizaciones, cualquiera de entre sulfurilasa y luciferasa, o ambas, se inmovilizan sobre uno o más soporte sólidos móviles dispuestos en cada sitio de reacción. [0192] De esta manera, la presente invención permite detectar la liberación de PPi durante la reacción de polimerasa, proporcionando una señal en tiempo real. De esta manera, la presente invención permite un procedimiento para la detección rápida de la liberación de PPi. Se ha estimado que las reacciones tienen lugar en menos de 2 segundos (Nyren y Lundin, supra). La etapa limitante de la velocidad es la conversión de PPi en ATP por parte de la ATP sulfurilasa, mientras que la reacción de la luciferasa es rápida y se ha estimado que durante menos de 0,2 segundos. Las tasas de incorporación para las polimerasas también han sido estimadas mediante diversos métodos y se ha encontrado, por ejemplo, que en el caso de la polimerasa Klenow, la incorporación completa de una base puede requerir menos de 0,5 segundos. De esta manera, el tiempo total estimado para la incorporación de una base y la detección mediante dicho ensayo enzimático es de aproximadamente 3 segundos. Por lo tanto, se apreciará que resultan posibles tiempos de reacción muy rápidos, permitiendo la detección en tiempo real. Los tiempos de reacción podrían reducirse adicionalmente mediante la utilización de una luciferasas más termoestable. [0193] Para la mayoría de aplicaciones resulta deseable utilizar reactivos libres de contaminantes como ATP y PPi. Estos contaminantes pueden eliminarse haciendo fluir los reactivos a través de una precolumna que contiene apirasa y/o pirofosfatasa unida a resina. Alternativamente, la apirasa o pirofosfatasa puede unirse a perlas magnéticas y utilizarse para eliminar ATP y PPI contaminantes presentes en los reactivos. Además, resulta deseable lavar reactivos de secuenciación difundibles, por ejemplo dNTPs no incorporados, con un tampón de lavado. Puede utilizarse cualquier tampón de lavado utilizado en la secuenciación de pirofosfato. [0194] En algunas realizaciones, la concentración de los reactivos en la reacción de secuenciación incluye 1 pmol de ADN, 3 pmoles de polimerasa, 40 pmoles de dNTP en 0,2 ml de tampón (ver Ronaghi et al., Anal. Biochem. 242:84-89, 1996). [0195] La reacción de secuenciación puede llevarse a cabo con cada uno de los cuatro nucleótidos predeterminados, si se desea. Un ciclo "completo" generalmente incluye administrar secuencialmente reactivos de secuenciación para cada uno de los nucleótidos dATP, dGTP, dCTP y dTTP (o dUTP), en un orden predeterminado. Los dNTPs no incorporados se eliminan mediante lavado entre cada una de las adiciones de nucleótido. Alternativamente, se degradan los dNTPs no incorporados con apirasa (ver posteriormente). Se repite el ciclo según se desee hasta obtener la cantidad deseada de secuencia del producto secuencia. En algunas realizaciones, se obtienen aproximadamente 10 a 1.000, 10 a 100, 10 a 75, 20 a 50 ó aproximadamente 30 nucleótidos de información de secuencia a partir de la extensión de un cebador de secuenciación hibridado. [0196] En algunas realizaciones, el nucleótido se modifica para que contenga un derivado disulfuro de un hapteno, tal como biotina. La adición del nucleótido modificado al cebador naciente hibridado al sustrato anclado se analiza mediante una etapa posterior a la polimerización, que incluye: i) unión secuencial de, en el ejemplo en el que la modificación es una biotina, un grupo conjugado con avidina o con estreptavidina unido a una molécula de enzima, ii) el lavado del exceso de enzima unido a avidina o a estreptavidina, iii) el flujo de un sustrato adecuado de enzima bajo condiciones que permiten la actividad enzimática, e iv) detección del producto o productos de reacción del sustrato enzimático. Se elimina el hapteno en la presente realización mediante la adición de un agente reductor. Dichos métodos permiten identificar un nucleótido en una posición diana dada, y secuenciar simple y rápidamente el ADN evitando simultáneamente la necesidad de electroforesis y la utilización de marcajes radioactivos potencialmente peligrosos. [0197] Un enzima preferente para detectar el hapteno es la peroxidasa de rábano picante. Si se desea, puede utilizarse un tampón de lavado entre la adición de diversos reactivos en la presente memoria. Puede utilizarse apirasa para eliminar los dNTPs no reaccionados utilizados para extender el cebador de secuenciación. El tampón de lavado puede incluir opcionalmente apirasa. [0198] Los haptenos ejemplares, por ejemplo, la biotina, la digoxigenina, las moléculas de pigmento fluorescente cy3 y cy5, y la fluoresceína, se incorporan con diversas eficiencias en las moléculas de ADN extendidas. La unión del hapteno puede producirse a través de enlaces mediante el azúcar, la base y mediante el grupo fosfato del nucleótido. Entre los medios ejemplares para la amplificación de la señal se incluyen los medios fluorescentes, electro-químicos y enzimáticos. En una realización preferente utilizando la amplificación enzimática, el enzima, por ejemplo la fosfatasa alcalina (AP), la peroxidasa de rábano picante (HRP), la beta-galactosidasa, la luciferasa, puede incluir aquellos para los que se conocen sustratos generadores de luz, y entre los medios para detectar dichos sustratos generadores de luz (quimioluminiscentes) puede incluirse una cámara CCD. [0199] En un modo preferente, se añade la base modificada, se produce la detección, y se elimina el grupo conjugado con hapteno o se inactiva mediante la utilización de un agente de corte o inactivador. Por ejemplo, en el caso de que el línker escindible sea un disulfuro, el agente de escisión puede ser un agente reductor, por ejemplo ditiotreitol (DTT), betamercaptoetaol, etc. Entre otras realizaciones de inactivación se incluyen calor, frío, desnaturalizantes químicos, surfactantes, reactivos hidrofóbicos e inhibidores suicidas. [0200] La luciferasa puede hidrolizar el dATP directamente con la liberación concomitante de un fotón. Esto resulta en una señal falsa positiva debido a que la hidrólisis se produce de manera independiente de la incorporación del dATP en el cebador de secuenciación extendido. Para evitar este problema, puede utilizarse un análogo de dATP que se incorpora en ADN, es decir, es un sustrato para una ADN polimerasa, pero no es un sustrato para la luciferasa. Un análogo de este tipo es el α-tio-dATP. De esta manera, la utilización de α-tiodATP evita la generación espuria de fotones que puede producirse al hidrolizarse el dATP sin incorporarse en una cadena de ácidos nucleicos en crecimiento. [0201] Típicamente, la detección basada en PPi se calibra mediante la medición de la luz liberada tras la adición de nucleótidos de control a la mezcla de reacción de secuenciación inmediatamente después de la adición del cebador de secuenciación. Esto permite la normalización de las condiciones de reacción. La incorporación de dos o más nucleótidos idénticos en sucesión es revelada por un incremento correspondiente de la cantidad de luz liberada. De esta manera, un incremento de dos veces de la luz liberada respecto a los nucleótidos de control revela la incorporación de dos dNTPs sucesivos en el cebador extendido. [0202] Si se desea, la apirasa puede "lavarse" o "hacerse fluir" sobre la superficie del soporte sólido de manera que facilite la degradación de cualquier dNTPs no incorporados remanentes dentro de la mezcla de reacción de secuenciación. La apirasa también degrada el ATP generado y por lo tanto "desactiva" la luz generada en la reacción. Tras el tratamiento con apirasa, se elimina mediante lavado cualquier reactivo remanente en preparación para las etapas siguientes de incubación de dNTP y de detección de fotones. Alternativamente, la apirasa puede unirse al soporte sólido o sólido móvil. [0203] En el caso de que el soporte sea plano, las reacciones de secuenciación de pirofosfato preferentemente tienen lugar en una cámara de reacción delgada que incluye una superficie de soporte sólido ópticamente transparente y una tapa ópticamente transparente. En algunas realizaciones, la matriz presenta una superficie superior plana y una superficie de fondo plana, la superficie superior plana presenta por lo menos 1.000 cavidades en la misma, formando cada cavidad una cámara de reacción. En realizaciones adicionales, la superficie de fondo plana es ópticamente conductora, de manera que las señales ópticas procedentes de las cámaras de reacción pueden detectarse a través de la superficie de fondo plana. En una realización preferente, la distancia entre la superficie superior y la superficie de fondo no es superior a 10 cm. A continuación, pueden administrarse los reactivos de secuenciación haciéndolos fluir a través de la superficie del sustrato. Más preferentemente, las cavidades contienen reactivos para analizar un ácido nucleico o proteína. En una realización adicional, la matriz presenta una segunda superficie espaciada respecto de la matriz plana y en contacto frontal con la misma, de manera que se forma una cámara de flujo sobre la matriz. En el caso de que el soporte no sea plano, pueden administrarse los reactivos sumergiendo el soporte sólido en baños de cualesquiera reactivos dados. [0204] En una realización preferente, puede utilizarse una matriz para llevar a cabo reacciones comunes en paralelo separadas en un ambiente acuoso. La matriz puede presentar un sustrato que presenta por lo menos 1.000 cámaras de reacción discretas que contienen un material de partida que es capaz de reaccionar con un reactivo, dimensionando cada una de las cámaras de reacción de manera que, al administrar uno o más líquidos que contienen por lo menos un reactivo en cada cámara de reacción, el tiempo de difusión para que el reactivo salga por difusión del pocillo excede el tiempo necesario para que el material inicial reaccione con el reactivo para formar un producto. Las cámaras de reacción pueden formarse mediante la generación de una pluralidad de cavidades sobre el sustrato. La pluralidad de cavidades puede formarse en el sustrato mediante grabado, moldeo o micromecanizado. Las cavidades pueden presentar un fondo plano o un fondo cóncavo. En una realización preferente, el sustrato es un haz de fibras ópticas. En una realización adicional, las cámaras de reacción se forman mediante la generación de áreas discretas sobre una superficie plana. Las áreas pueden presentar una química superficial diferente a la de la superficie plana circundante. [0205] En diversas realizaciones, se inmovilizan algunos componentes de la reacción, mientras que otros componentes se proporcionan en solución. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los enzimas utilizados en la reacción de secuenciación de pirofosfato (por ejemplo sulfurilasa, luciferasa) pueden inmovilizarse si se desea sobre el soporte sólido. De manera similar, puede inmovilizarse uno o más de los enzimas utilizados en la reacción de secuenciación de pirofosfato, por ejemplo sulfurilasa o luciferasa, en los extremos de una matriz reactora de fibras ópticas. En el caso de que se inmovilice luciferasa, preferentemente se encuentra a menos de 50 µm de un cebador anclado. Pueden añadirse otros componentes de la reacción, por ejemplo una polimerasa (tal como fragmento Klenow), ácido nucleico molde y nucleótidos, mediante flujo, pulverización o desplazamiento de rodillo. En realizaciones todavía adicionales, se administra sobre perlas uno o más de los reactivos utilizados en las reacciones de secuenciación. [0206] En algunas realizaciones, los reactivos se dispensan utilizando una membrana flexible expandible para dispensar reactivos y sellar reactivos sobre la superficie de la FORA durante las reacciones de extensión. Los reactivos pueden pulverizarse o introducirse presionando con rodillos sobre la superficie de la FORA o sobre la membrana flexible. La membrana flexible podría expandirse rápidamente o desplazarse físicamente hasta encontrarse muy próxima a la FORA, sellando de esta manera los pocillos, de manera que PPi no podría difundirse de pocillo a pocillo. Preferentemente, la captación de datos tiene lugar en un tiempo razonable tras el inicio de la reacción para permitir la generación de la señal máxima. [0207] También puede identificarse una secuencia en un cebador de anclaje extendido utilizando métodos de secuenciación diferentes de la detección de un producto secundario de la secuencia. Por ejemplo, la secuenciación puede llevarse a cabo mediante la medición de la incorporación de nucleótidos marcados u otros análogos de nucleótidos. Estos métodos pueden utilizarse conjuntamente con métodos de tipo fluorescente o electroquimioluminiscente. [0208] Alternativamente, los productos secundarios de secuencia pueden generarse utilizando dideoxinucleótidos que presentan un marcaje en el carbono 3'. Preferentemente, el marcaje puede cortarse para revelar un grupo 3' hidroxilo. En este método, la adición de un nucleótido dado se puntúa como positiva o negativa, y se determina una base en cada prueba. En la presente realización, no resultan necesarios enzimas de fase sólida y pueden realizarse múltiples mediciones. [0209] En otra realización, la identidad del producto de cebador de anclaje extendido se determina utilizando desoxinucleótidos marcados. Los desoxinucleótidos marcados pueden ser, por ejemplo, nucleótidos fluorescentes. Preferentemente, los nucleótidos fluorescentes pueden detectarse tras la irradiación con láser. Preferentemente, el marcaje fluorescente no es estable durante periodos prolongados de exposición. Si se desea, la señal fluorescente puede refrescarse, por ejemplo puede fotodegradarse para devolver la señal a niveles de fondo antes de la adición de la base siguiente. Un marcaje electroquimioluminiscente preferente es el tris-bipiridilo de rutenio. [0210] En una realización, se inmoviliza un ácido nucleico circular de una cadena en la cámara de reacción; preferentemente, cada cámara de reacción no presenta más de un único ácido nucleico circular de una cadena dispuesto en la misma. Más preferentemente, se inmoviliza un ácido nucleico circular de una cadena sobre un soporte sólido móvil dispuesto en la cámara de reacción. En otra realización, cada ácido nucleico circular de una cadena contiene por lo menos 100 copias de una secuencia de ácidos nucleicos, encontrándose cada copia unida covalentemente extremo con extremo. [0211] La invención también comprende kits para la utilización en métodos de la invención, que podrían incluir uno o más de los componentes siguientes: (a) un cebador específico de ensayo que se hibrida con ADN de muestra de manera que la posición diana es directamente contigua al extremo 3' del cebador, (b) una polimerasa, (c) un medio de detección enzimática para identificar la liberación de PPi, (d) desoxinucleótidos, incluyendo, en lugar de dATP, un análogo de dATP que es capaz de actuar como sustrato para una polimerasa pero que es incapaz de actuar como sustrato para dicho enzima de detección de PPi, y (e) opcional-mente dideoxinucleótidos, opcionalmente sustituyendo ddATP por un análogo de ddATP que es capaz de actuar como sustrato para una polimerasa pero que es incapaz de actuar como sustrato para dicho enzima de detección de PPi. En el caso de que el kit se destine a la utilización con una amplificación inicial por PCR, también podría incluir los componentes siguientes: (i) una pareja de cebadores para PCR, presentando por lo menos un cebador un medio para permitir la inmovilización de dicho cebador, (ii) una polimerasa que es preferentemente termoestable, por ejemplo la polimerasa TaqI, (iii) tampones para la reacción de PCR, e (iv) desoxinucleótidos. En el caso de que se utilice un marcaje enzimático para evaluar la PCR, el kit contiene ventajosamente un sustrato para el enzima y otros componentes de un sistema de detección.

Análisis matemático subyacente a la optimización de la reacción de secuenciación de pirofosfato [0212] Sin restringirse a ninguna teoría en particular, se cree que la optimización de las condiciones de reacción puede llevarse a cabo bajo suposiciones subyacentes a los análisis siguientes. [0213] La secuenciación de pirofosfato en fase sólida se desarrolló inicialmente mediante combinación de una tecnología en fase sólida y una técnica de secuenciación por síntesis utilizando bioluminiscencia (ver, por ejemplo, Ronaghi et al., Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release, Anal. Biochem. 242:84-89, 1996). En la metodología de fase sólida, se incuba una cadena de ADN cebada inmovilizada con ADN polimerasa, ATP sulfurilasa y luciferasa. Mediante la adición por etapas de nucleótidos con lavados intermedios, puede realizarse un seguimiento del suceso de polimerización secuencial. Se incrementó la proporción de señal a ruido mediante la utilización de α-tio-dATP en el sistema. Este análogo de dATP resulta eficientemente incorporado por la ADN polimerasa pero no sirve como sustrato para la luciferasa. Esto reduce la bioluminiscencia de fondo y facilita la realización de la reacción de secuenciación en tiempo real. En estos primeros estudios, se introdujo la secuenciación de un producto de PCR utilizando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina como soporte sólido. Sin embargo, se encontró que la pérdida de las perlas durante el lavado, que se llevaba a cabo entre cada adición de nucleótido y enzima, limitaba la técnica a secuencias cortas. [0214] En la actualidad, las metodologías de secuenciación de pirofosfato presentan una historia razonablemente bien establecida para determinar la secuencia del ADN a partir de muchas copias idénticas de un único molde de secuenciación de ADN (ver, por ejemplo, Ronaghi et al., Real-Time DNA Sequencing Using Detection of Pyrophosphate Release, Anal. Biochem. 242:84-89, 1996; Nyrén et al., Methods of Sequencing DNA, patente nº WO9813523A1 (publicda el 2 de abril de 1998; presentada el 26 de septiembre de 1997); Ronaghi et al., A Sequencing Methods Based on RealTime Pyrophosphate, Science 281:363-365, 1998). Puede realizarse un seguimiento de las reacciones productoras de pirofosfato (PPi) mediante una técnica muy sensible basada en la bioluminiscencia (ver, por ejemplo, Nyrén et al., páginas 466 a 496, 1996 (Proc. 9th Inter. Symp. Biolumin. Chemilumin.). Estos ensayos bioluminométricos se basan en la detección del PPi liberado en las diferentes reacciones modificadoras de ácidos nucleicos. En estos ensayos, el PPi que se genera es posteriormente convertido en ATP por la ATP sulfurilasa y se realiza un seguimiento continuo de la producción de ATP con la luciferasa. Por ejemplo, en las reacciones mediadas por polimerasa, se genera PPi al incorporarse un nucleótido en una cadena de ácidos nucleicos en crecimiento que sintetiza la polimerasa. Aunque generalmente se utiliza una ADN polimerasa para generar PPi durante una reacción de secuenciación de pirofosfato (ver, por ejemplo, Ronaghi et al., tesis doctoral, 1998, The Royal Institute of Technology, Dept. of Biochemistry (Stockholm, Suecia)), también resulta posible utilizar transcriptasa inversa (ver, por ejemplo, Karamohamamed et al., páginas 319 a 329, 1996 (Proc. 9th Inter. Symp. Biolumin. Chemilumin.) o ARN polimerasa (ver, por ejemplo, Karamohamamed et al., BioTechniques 24:302-306, 1998) para realizar el seguimiento del suceso de polimerización. [0215] Por ejemplo, se ha utilizado un ensayo bioluminométrico de extensión de cebador para examinar los desapareamientos de nucleótidos individuales en el extremo 3' (ver, por ejemplo, Nyrén et al., Anal. Biochem. 244:367-373, 1997). Típicamente se une un promotor fágico a por lo menos uno de los cebadores aleatorios y, tras la amplificación, puede obtenerse una unidad transcripcional que seguidamente puede someterse a extensión por etapas mediante una ARN polimerasa. La liberación de PPi mediada por transcripción puede detectarse seguidamente mediante un ensayo bioluminométrico (por ejemplo ATP sulfurilasa-luciferasa). Mediante la utilización de esta estrategia, probablemente resultará posible secuenciar ADN de doble cadena sin ningún cebador de secuenciación específico adicional. En una serie de ensayos sin tope, se ha examinado la extensión por parte de la ARN polimerasa del fago T7 y se ha encontrado que es bastante lenta (ver, por ejemplo, Kwok et al., Nucl. Acids Res. 18:999-1005, 1990). La sustitución de un análogo de α-tio-nucleótido por el desoxinucleótido natural correcto posterior tras los extremos 3’ desapareados podría reducir la tasa de polimerización entre 5 y 13 veces. Sin embargo, tras la incorporación de unas cuantas bases, la tasa de síntesis de ADN es comparable a la tasa observada para un molde/cebador normales. [0216] La detección de bases individuales mediante está técnica ha mejorado mediante la incorporación de apirasa en el sistema, que cataliza la hidrólisis de NTP y reduce la concentración de nucleótidos muy por debajo de la Km de la ADN polimerasa, eliminando eficazmente los dNTPs de una etapa anterior antes de seguir con la adición del dNTP siguiente.

La técnica anteriormente descrita proporciona un análisis rápido y en tiempo real para aplicaciones en las áreas de la detección de mutaciones y el análisis de polimorfismos de nucleótidos individuales (SNP). [0217] El sistema de secuenciación de pirofosfato utiliza reacciones catalizadas secuen

5 cialmente por varios enzimas para realizar el seguimiento de la síntesis del ADN. Algunas propiedades del enzima, tales como la estabilidad, la especificidad, la sensibilidad, KM y KCAT resultan importantes para el rendimiento óptimo del sistema. En el sistema de secuenciación de pirofosfato, la actividad de los enzimas de detección (es decir la sulfurilasa y la luciferasa) generalmente permanece constante durante la reacción de secuenciación y únicamente

10 resulta muy ligeramente inhibida por cantidades elevadas de los productos (ver, por ejemplo, Ronaghi et al., tesis doctoral, The Royal Institute of Technology, Dept. of Biochemistry (Stockholm, Suecia), 1998)). La sulfurilasa convierte cada PPi en ATP en aproximadamente 2,0 segundos (ver, por ejemplo, Nyrén y Lundin, Anal. Biochem. 151:504-509, 1985). Las condiciones de reacción informadas para 1 pmol de PPI en 0,2 ml de tampón (5 nM) eran

15 0,3 U/ml de ATP sulfurilasa (ATP:sulfato adenililtransferasa; prod. nº A8957; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y APS 5 µM (ver, por ejemplo, Ronaghi et al., Real-Time DNA Sequencing Using Detection of Pyrophosphate Release, Anal. Biochem. 242:84-89, 1996). La información del fabricante (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) para la sulfurilasa informa de una actividad de entre 5 y 20 unidades por mg de proteína (es decir, una unidad produci

20 rá 1,0 µmol de ATP a partir de APS y PPi por minuto a pH 8,0 a 30ºC), mientras que se ha informado de una actividad específica en otras referencias de 140 unidades por mg (ver Karamohamed et al., Purification, and Luminometric Analysis of Recombinant Saccharomyces cerevisiae MET3 Adenosine Triphosphate Sulfurylase Expressed in Escherichia coli, Prot. Express. Purification 15:381-388, 1999). Debido al hecho de que las condiciones de

25 reacción utilizadas en la práctica de la presente invención son similares a las condiciones de reacción informadas en la referencia anteriormente mencionada, la concentración de sulfurilasa en el ensayo se estimó que era de 4,6 nM. Los valores de KM para la sulfurilasa eran [APS] = 0,5 µM y [PPi] = 7 µM. La generación de luz por la luciferasa tuvo lugar durante menos de 0,2 segundos. Las reacciones más críticas eran la polimerización del ADN y la

30 degradación de los nucleótidos. El valor de las constantes caracterizadoras de los enzimas utilizados en la metodología de secuenciación de pirofosfato se indica a continuación, como referencia:

Enzima KM (µM) KCAT (S-1)

Klenow 0,18 (dTTP) 0,92 ADN polimerasa de T7 0,36 (dTTP) 0,52 ATP sulfurilasa 0,56 (APS); 7,0 (PPi) 38 Luciferasa de luciérnaga 20 (ATP) 0,015 Apirasa 120 (ATP), 260 (ADP) 500 (ATP)

[0218] Los enzimas implicados en dichas cuatro reacciones compiten por los mismos sustratos. Por lo tanto, los cambios de las concentraciones de sustratos se encuentran acoplados. La reacción inicial es la unión de un dNTP a un complejo de polimerasa/ADN para el alargamiento de cadena. Para que esta etapa sea rápida, la concentración de nucleótido trifosfato debe ser superior a la KM de la ADN polimerasa. En el caso de que la concentración de nucleótidos trifosfato sea excesivamente alta, sin embargo, puede observarse una menor fidelidad de la polimerasa (ver, por ejemplo, Cline et al., PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases, Nucl. Acids Res. 24:3546-3551, 1996). La KM establece un intervalo adecuado de concentraciones para la incorporación errónea, que habitualmente es mucho más alta (ver, por ejemplo, Capson et al., Kinetic characterization of the polymerase and exonuclease activity of the gene 43 protein of bacteriophage T4, Biochemistry 31:10984-10994, 1992). Aunque puede conseguirse una fidelidad muy alta mediante la utilización de polimerasas con actividad exonucleasa inherente, su utilización también comporta la desventaja de que puede producirse la degradación del cebador. [0219] Aunque la actividad de exonucleasa del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I (Klenow) es reducida, se ha demostrado que el extremo 3' de un cebador puede degradarse con incubaciones más prolongadas en ausencia de nucleótidos trifosfato (ver, por ejemplo, Ronaghi et al., tesis doctoral, The Royal Institute of Technology, Dept. of Biochemistry (Stockholm, Suecia), 1998). La fidelidad se mantiene sin actividad de exonucleasa debido a que un mecanismo de unión de ajuste inducido en la etapa de polimerización proporciona una selectividad muy eficiente para el dNTP correcto. Se ha informado de fidelidades de entre 1x105 y 1x106 (ver, por ejemplo, Wong et al., An induced-fit kinetic mechanism for DNA replication fidelity, Biochemistry 30:526-537, 1991). En la secuenciación de pirofosfato, las polimerasas deficientes en exonucleasa (exo-), tales como oxo-Klenow o Sequenase® se ha confirmado que presentan una fidelidad elevada. [0220] Las estimaciones para las restricciones espaciales y temporales sobre la metodología de secuenciación de pirofosfato de la presente invención han sido calculadas, en las que el sistema presenta un área de 1 cm2 con una altura de aproximadamente 50 µm, para un volumen total de 5 µl. Con respecto a las restricciones temporales, la especie molecular participante en la cascada de reacciones se define inicialmente, en donde:

N = el ADN unido a la superficie

PPi = la molécula de pirofosfato liberada

ATP = el ATP generado a partir del pirofosfato

L = la luz liberada por la luciferasa [0221] Se especifica además que N(0) es ADN sin adición de nucleótidos, N(1) presenta 1 nucleótido añadido, N(2) presenta 2 nucleótidos añadidos, y de esta manera sucesivamente. Las constantes de tasa de pseudo-primer orden que relacionan las concentraciones de las especies moleculares son:

5 N(n) --> N(n+1) + PPi kN PPi --> ATP kp ATP-->L kA

[0222] Además, las constantes de difusión Dp para PPi y DA para ATP también deben especificarse. Estos valores pueden estimarse a partir de las constantes de fusión ejempla

10 res siguientes para biomoléculas en una solución diluida en agua (ver Weisiger, Impact of Extracellular and Intracellular Diffusion on Hepatic Uptake Kinetics, 1997).

Molécula D/10-5 cm2/s Método Original

Referencia

Albúmina 0,066 tiempo de retardo 1 Albúmina 0,088 dispersión lumínica 2 Agua 1,940 RMN 3

en la que, la referencia original 1 es: Longsworth, Temperature dependence of diffusion in aqueous solutions, J. Phys. Chem. 58:770-773, 1954; referencia original 2: Gaigalas et al., Diffusion of bovine serum albumin in aqueous solutions, J. Phys. Chem. 96:2355-2359,

15 1992, y referencia original 3: Cheng, Quantitation of non-Einstein diffusion behavior of water in biological tissues by proton NMR diffusion imaging: Synthetic image calculations, Magnet. Reson. Imaging 11:569-583, 1993. [0223] Con el fin de estimar la constante de difusión de PPi, pueden utilizarse los valores ejemplares siguientes (ver CRC Handbook of Chemistry and Physics, 1983 (W.E. Weast,

20 editor), CRC Press Inc., Boca Raton, FL):

Molécula D/10-5 cm2/s Peso molecular/amu

sacarosa: 0,5226 342,30

manitol: 0,682 182,18

penta-eritritol: 0,761 136,15

glicolamida: 1,142 N/A

glicina: 1,064 75,07

[0224] El peso molecular de PPi es 174 amu. Basándose en los valores ejemplares anteriormente mencionados, se espera una constante de difusión de aproximadamente 0,7x10-5 cm2/s. [0225] Los enzimas que catalizan las tres reacciones de secuenciación de pirofosfato se cree que se aproximan a la cinética de Michaelis-Menten (ver, por ejemplo, Biochemistry,

W.H. Freeman and Company, New York, 1988), que pueden describirse de la manera siguiente:

KM = [E][S]/[ES], velocidad = Vmax [S] / (KM + [S]), Vmax = kCAT[ET]

en las que [S] es la concentración de sustrato, [E] es la concentración de enzima libre, [ES]

es la concentración del complejo de enzima-sustrato, y [ET] es la concentración total de enzima = [E] + [ES]. [0226] Resulta preferible que los tiempos de reacción sean por lo menos tan rápidos como los de la secuenciación basada en pirofosfato en fase solución descritos en la literatura. La tasa a la que un sustrato se convierte en producto es:

-d[S]/dt = kCAT[ET][S]/(KM + [S]) [0227] La concentración efectiva de sustrato puede estimarse a partir del tamaño de una molécula de ADN replicada, como máximo (10 µm)3 y el número de copias (aproximadamente 10.000), rindiendo una concentración de aproximadamente 17 nM. Ésta es menor que la KM para los enzimas indicados anteriormente, y por lo tanto la tasa puede estimarse que es:

-d[S]/dt = (kCAT/KM)[ET][S] [0228] De esta manera, con cinética de pseudo-primer orden, la constante de tasa para la desaparición del sustrato depende de kCAT y KM, que son constantes para un enzima dado, y de [ET]. Utilizando las mismas concentraciones de enzima informadas en la literatura producirá, por lo tanto, tasas similares. [0229] La primera etapa en la reacción de secuenciación de pirofosfato (es decir, la incorporación de un nuevo nucleótido y la liberación de PPi) se examina ahora en detalle. Las condiciones de reacción preferentes son: 1 pmol de ADN, 3 pmoles de polimerasa, 40 pmoles de dNTP en 0,2 ml de tampón. Bajo las condiciones de reacción preferentes anteriormente mencionadas, la KM para la incorporación de nucleótidos para el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I es 0,2 µM y para la Sequenase 2,0TM (US Biochemicals, Cleveland, OH) es 0,4 µM, y se produce la incorporación completa de 1 base en menos de 0,2 segundos (ver, por ejemplo, Ronaghi et al., Real-Time DNA Sequencing Using Detection of Pyrophosphate Release, Anal. Biochem. 242:84-89, 1996) con una concentración de polimerasa de 15 nM. [0230] En un volumen de reacción de 5 µl, existe un total de 10.000 cebadores de anclaje con 10.000 sitios de cebador de secuenciación cada uno, ó 1x108 sitios de extensión totales = 0,17 fmoles. Los resultados que han sido publicados anteriormente en la literatura sugieren que la polimerasa debería encontrarse presente a 3 veces la abundancia, ó 0,5 fmoles, en la mezcla de reacción. La concentración final de la polimerasa en este caso es 0,1 nM. Debe indicarse que estas condiciones de reacción se obtienen fácilmente en la práctica de la presente invención.

[0231] Tal como se ha indicado anteriormente, el tiempo necesario para la reacción de adición de nucleótido no es superior a 0,2 segundos por nucleótido. Por lo tanto, si se deja que transcurra la reacción durante un total de T segundos, la adición de nucleótidos debería resultar suficientemente rápida para rellenar por completo tramos de hasta (T/0,2) nucleótidos idénticos por la acción de la polimerasa. Tal como se ha comentado anteriormente, la etapa limitante de tasa de la reacción de secuenciación de pirofosfato es la reacción de la sulfurilasa, que requiere un total de aproximadamente 2 segundos para convertir un PPi en ATP. Por consiguiente, un tiempo de reacción total que permita completar la reacción de sulfurilasa debería resultar suficiente para permitir que la polimerasa "rellenase" los tramos de hasta 10 nucleótidos idénticos. En especies aleatorias de ADN, se ha demostrado que las regiones de 10 ó más nucleótidos idénticos existen con una probablidad por nucleótido de aproximadamente 4-10, que es aproximadamente 1x10-6. En las 10.000 secuencias que se extienden a partir de cebadores de anclaje en una realización preferente de la presente invención, cada una de las cuales se extenderá por lo menos 30 nucleótidos y preferentemente 100 nucleótidos, se espera que se encontrará aproximadamente una aparición de 10 nucleótidos idénticos. De esta manera, puede concluirse que los tramos de nucleótidos idénticos no deberían plantear una dificultad para la práctica de la presente invención. [0232] El tamaño global de la molécula de ADN resultante es, preferentemente, menor que el tamaño de las regiones de anclaje (es decir, 10 µm) y debe ser menor que la distancia entre las regiones de anclaje individuales (es decir, 100 µm). El radio de giro de un concatámero de ADN de una cadena con un número total de nucleótidos N puede estimarse matemáticamente mediante la ecuación siguiente: radio = b (N/N0)0,6, en la que 'b' es la longitud de persistencia y N0 es el número de nucleótidos por longitud de persistencia; el exponente 0,6 es característico de un paseo autoevitante (ver, por ejemplo Doi, The Theory of Polymer Dynamics (Clarendon Press, New York), 1986; Flory, Principles of Polymer Chemistry (Cornell University Press, New York), 1953). Utilizando ADN de una cadena como ejemplo, 'b' es 4 nm y N0 es 13,6 nucleotidos (ver, por ejemplo, Grosberg, Statistical Physics of Macromolecules (AIP Press, New York), 1994). Utilizando 10.000 copias de un 100-mero, N=1x106 y el radio de giro es 3,3 µm. [0233] La difusión de PPi se comenta a continuación en detalle. En las condiciones de reacción utilizadas en la presente invención, [PPi] es aproximadamente 0,17 fmoles en 5 µl, ó 0,03 nM, y la [sulfurilasa] es 4,6 nM, tal como se ha indicado anteriormente. En los primeros 2 segundos de la reacción, la sulfurilasa consume aproximadamente 7% (0,002 nM) del PPi, según el software de simulación GEPASI (ver Mendes P., GEPASI: a software package for modeling the dynamics, steady states and control of biochemical and other systems, Comput. Appl. Biosci. 9:563-571, 1993). Los parámetros utilizados en la simulación fueron: KM(PPi)=7 µM, kCAT=38 s-1, y [sulfurilasa]=4,6 nM. Por lo tanto, puede concluirse que por lo menos 93% de las moléculas de PPi pueden alejarse por difusión antes de convertirse en ATP durante el tiempo de reacción de 2 segundos. [0234] El tiempo medio para que reaccione cada PPi es 1/kp=2 segundos. La distancia cuadrada media a la que difunde en cada dirección es igual a aproximadamente 2Dp/kp, ó 2,8x103 µm2. La distancia RMS en cada dirección es 53 µm. Este valor indica que cada uno de los cebadores de anclaje individuales debe encontrarse separado por más de 50 µm, o el PPi liberado de un anclaje debería difundirse hasta el siguiente, y resultar detectado. [0235] Otro método que puede utilizarse para explicar el fenómeno anteriormente mencionado es estimar la cantidad de PPi sobre una primera región de anclaje que ha sido generada en dicha primera región de anclaje respecto a la cantidad de PPi que se ha generado en una segunda región de anclaje y que posteriormente ha difundido sobre la localización de dicha primera región de anclaje. A medida que se igualan estas dos cantidades, resulta más difícil distinguir la señal "real" de la del fondo. Esto puede describirse matemáticamente definiendo 'a' como el radio de una región de anclaje y 1/b2 como la densidad de la misma. Basándose en datos anteriormente publicados, 'a' es aproximadamente igual a 10 µm y 'b' es aproximadamente igual a 100 µm. La cantidad de PPi que es encuentra presente sobre dicha primera región de anclaje puede describirse como: exp(-kpt)[1-exp(-a2/2Dpt)] y la cantidad de PPi presente sobe la segunda región de anclaje puede aproximarse matemáticamente como: (1/3)exp(-kpt)[pa2/b2]exp(-b2/2Dpt). El prefactor 1/3 supone que 1/4 de las secuencias de ADN incorporarán 1 nucleótido, 1/4 de ellas seguidamente incorporará un segundo nucleótido, etc. y de esta manera la suma de la serie es 1/3. Las cantidades de PPi sobre la primera y segunda regiones de anclaje se igualan en el caso de que 2Dpt sea aproximadamente igual a b2, indicando de esta manera que la distancia RMS a la que se difunde una molécula es igual a la distancia entre regiones de anclaje contiguas. Según lo anteriormente expuesto, basándose en las condiciones de ensayo utilizadas en la práctica de la presente invención, las regiones de anclaje deben situarse a no menos de aproximadamente 50 µm, y preferentemente por lo menos 3 veces más alejadas (es decir, 150 µm). [0236] Aunque los resultados anteriormente mencionados limitan la densidad superficial de las regiones de anclaje, resulta posible reducir las necesidades de distancia, incrementando concomitantemente la densidad superficial global de las regiones de anclaje, mediante la utilización de varios enfoques diferentes. Un enfoque es detectar únicamente la luz inicial, aunque ello presenta la desventaja de perder señal, particularmente de secuencias de ADN que presentan varios nucleótidos idénticos contiguos. [0237] Un segundo enfoque es reducir la distancia entre las regiones de anclaje es incrementar la concentración de sulfurilasa en la mezcla de reacción. La tasa de reacción kp es directamente proporcional a la concentración de sulfurilasa, y la distancia de difusión se incrementa como kp-1/2. Por lo tanto, en el caso de que se incrementa la concentración de enzima sulfurilasa en un factor de 4 veces, la distancia entre las regiones de anclaje individuales puede reducirse concomitantemente en un factor de 2 veces. [0238] Un tercer enfoque es incrementar la concentración efectiva de sulfurilasa (que también funcionará para otros enzimas indicados en la presnete memoria) mediante la unión del enzima a la superficie de las regiones de anclaje. La región de anclaje puede aproximarse a una pared de una superficie cúbica que circunda un centro de reacción de secuenciación. Suponiendo una superficie de 10 µm x 10 µm para la región, el número de moléculas unidas a la región para producir una concentración de 1 µM es aproximadamente 600.000 moléculas. [0239] La concentración de sulfurilasa en el ensayo se estima que es 5 nM. El número de moléculas unidas para alcanzar esta concentración efectiva es aproximadamente 3.000 moléculas. De esta manera, mediante la unión de más moléculas de enzima, puede alcanzarse una concentración efectiva más alta. Por ejemplo, podrían unirse 10.000 moléculas en cada región de anclaje. [0240] Tal como se ha estimado anteriormente, cada molécula de sulfurilasa ocupa un área total de 65 nm2 en una superficie. Por consiguiente, el anclaje de un total de 10.000 moléculas de enzima sulfurilasa sobre una superficie (es decir, para igualarse a las 10.000 PPi liberadas) requeriría 1,7 µm2. Este valor es sólo aproximadamente 2% del área superficial disponible en una región de anclaje de 10 µm x 10 µm. Por lo tanto, la concentración del enzima puede incrementarse fácilmente hasta un valor mucho más alto. [0241] Un cuarto enfoque que permite reducir la distancia entre regiones de anclaje individuales, es utilizar uno o más agentes para incrementar la viscosidad de los reactivos de secuenciación de pirofosfato de base acuosa (por ejemplo glicerol, polietilenglicol (PEG), y similar) de manera que se incremente marcadamente el tiempo para que difunda el PPi. Sin embargo, estos agentes también incrementan concomitantemente el tiempo de difusión para otros componentes no inmovilizados en la reacción de secuenciación, enlenteciendo de esta manera la cinética de reacción global. Además, estos agentes también pueden utilizarse para interferir químicamente en la reacción de secuenciación misma. [0242] Una quinta metodología, que es preferente, que permite reducir la distancia entre las regiones de anclaje individuales, es llevar a cabo una reacción de secuenciación de pirofosfato en una geometría espacial que evite físicamente la difusión lateral del PPi liberado. Por ejemplo, pueden utilizarse cavidades o micropocillos uniformes, tales como los generados mediante grabado con ácido de los extremos de haces de fibras ótpicas, para evitar dicha difusión lateral de PPi (ver Michael et al., Randomly Ordered Addressable High-Density Optical Sensor Arrays, Anal. Chem. 70:1242-1248, 1998). En la presente realización, la variable importante implica el tiempo total de difusión para que el PPi salga de una cavidad de altura h, en la que h es la profundidad de la cavidad grabada. Este tiempo de difusión puede calcularse utilizando la ecuación: 2Dpt=h2. Mediante la utilización de las condiciones preferentes de reacción de secuenciación de pirofosfato de la presente invención en los cálculos anteriormente mencionados, puede demostrarse que resultaría necesaria una cavidad de 50 µm de profundidad para que transcurra la reacción de secuenciación hasta completarse antes de la difusión completa del PPi de dicha cavidad. Además, este tipo de geometría presenta la ventaja adicional de reducir concomitantemente la señal de fondo del PPi liberado de regiones de anclaje contiguas. [0243] Además, para evitar el fondo generado mediante la difusión de PPi de una región a otra, la región de sustrato entre regiones de anclaje puede recubrirse con fosfatasa inmovilizada. [0244] Posteriormente, tras formarse ATP mediante la utilización de las condiciones de reacción preferentes de la presente invención, se ha demostrado que el tiempo de reacción, 1/kA, es de 0,2 segundos. Debido a que este tiempo de reacción es mucho menor que el tiempo durante el que el PPi puede difundirse libremente, no altera significativamente cualquiera de las conclusiones anteriormente mencionadas respecto a la geometría y condiciones de ensayo utilizadas en la presente invención. [0245] Con el fin de mitigar la generación de luz de fondo, resulta preferible "localizar” (por ejemplo mediante anclaje o unión) la luciferasa en la región de los moldes de secuenciación de ADN. Resulta más preferible localizar la luciferasa en una región delimitada por la distancia a la que puede difundirse una molécula de PPi antes de formar ATP. Los métodos para unir luciferasa a una matriz de soporte sólido son bien conocidos en la literatura (ver, por ejemplo, Wang et al., Specific Immobilization of Firefly Luciferase through a Biotin Carboxyl Carrier Protein Domain, Analytical Biochem. 246:133-139, 1997). De esta manera, durante un tiempo de difusión de 2 segundos, la luciferasa se ancla a menos de 50 µm de distancia de la cadena de ADN. Debe indicarse, sin embargo, que resultaría preferible reducir el tiempo de difusión y de esta manera limitar adicionalmente el área superficie necesaria para la unión de la luciferasa. [0246] Además, para evitar el fondo generado por la difusión del ATP de una región a otra, la región de sustrato entre regiones de anclaje puede recubrirse con ATPasa inmovilizada, especialmente una que hidrolice ATP a ADP, por ejemplo fosfatasa alcalina. [0247] Con el fin de determinar la concentración de luciferasa que resulta necesario ligar, se utilizaron condiciones anteriormente publicadas en las que se utilizaba luciferasa a una concentración que proporcionaba una respuesta de 200 mV para 0,1 µM de ATP (ver Ronaghi et al., Real-Time DNA Sequencing Using Detection of Pyrophosphate Release, Analytical Biochem. 242:84-89, 1996). Más específicamente, es conocido de la literatura que, en un volumen de reacción de 0,2 ml, 2 ng de luciferasa proporcionan una respuesta de 10 mV para 0,1 µM de ATP (ver Karamohamed y Nyrén, Real-Time Detection and Quantification of Adenosine Triphosphate Sulfurylase Activity by a Bioluminometric Approach, Analytical Biochem. 271:81-85, 1999). Por consiguiente, se requeriría una concentración de 20 ng de luciferasa en un volumen total de reacción de 0,2 ml para reproducir dichas condiciones anteriormente publicadas de la literatura. En el volumen de un cubo de 10 µm circundando a cada una de las regiones de anclaje individuales de la presente invención, se requeriría una concentración de luciferasa de 1x10-16 gramos, y basándose en el peso molecular de la luciferasa, de 71 kDa, esta concentración resultaría equivalente a aproximadamente 1.000 moléculas de luciferasa. Tal como se ha indicado anteriormente, se ha estimado que el área superficial de la luciferasa es de 50 nm2. De esta manera, suponiendo las moléculas de luciverasa se encuentran biotinilaadas y unidas a la región de anclaje, 1.000 moléculas ocuparían un área total de 0,05 µm2. A partir de estos cálculos se pone fácilmente de manifiesto que puede unirse una multitud de moléculas de luciferasa a la región de anclaje, debido a que el área de cada región de anclaje es 100 µm2. [0248] Nuevamente, basándose en los resultados anteriormente publicados en la literatura, cada nucleótido requeire aproximadamente 3 segundos para secuenciarse (es decir, 0,2 segundos para añadir un nucleótido; 2 segundos para producir ATP y 0,2 segundos para obtener bioluminiscencia). Por consiguiente, un tiempo de ciclo de aproximadamente 60 segundos por nucleótido resulta razonable, requiriendo aproximadamente 30 minutos por experimento para generar 30 nucleótidos de información por molde de secuenciación. [0249] En una realización alternativa a la metodología de secuenciación anteriormente mencionada (es decir, polimerasa -->PPi-->sulfurilasa-->ATP-->luciferasa-->luz), puede desarrollarse una polimerasa (por ejemplo mediante la utilización de una proteína de fusión y similar) que presenta la capacidad de generar luz al incorporar un nucleótido en una cadena de ADN en crecimiento. En todavía otra realización alternativa, puede desarrollarse un sensor que mide directamente la producción de PPi en la reacción de secuenciación. Debido a que la producción de PPi modifica el potencial eléctrico del tampón circundante, esta modificación podría medirse y calibrarse para cuantificar la concentración de PPi producido. [0250] Tal como se ha comentado anteriormente, la incorporación mediada por polimerasa de dNTPs en la secuencia de nucleótidos en la reacción de secuenciación de pirofosfato provoca la liberación de un fotón (es decir, luz). Los fotones generados por la reacción de secuenciación de pirofosfato pueden "capturarse" posteriormente y cuantificarse mediante una diversidad de metodologías, incluyendo, aunque sin limitación, un tubo fotomultiplicador, CCD, fotómetro de absorbancia, luminómetro y similares. [0251] Los fotones generados por la reacción de secuenciación de pirofosfato son capturados por el CCD. La eficiencia de la captura de luz se incrementa en el caso de que pasen a través de un dispositivo de enfoque (por ejemplo un lente óptico o una fibra óptica) y se enfocan en un elemento de CCD. La fracción de estos fotones que son capturados puede estimarse mediante los cálculos siguientes. En primer lugar, se supone que el lente que enfoca los fotones emitidos se encuentra a una distancia r desde la superficie de la superficie sólida (es decir, chip de ADN o pocillos grabado en fibra óptica), en donde r=1 cm, y que los fotones deben pasar a través de una región de diámetro b (área = πb2/4) de manera que se enfoque en el elemento de la matriz, en donde b=100 µm (esto produce un sistema óptico con una apertura numérica de aproximadamente 0,01 en aire). También debe indicarse que los fotones emitidos deberían escaparse igualmente en todas direcciones. A la distancia r, los fotones se dispersan en un área que es igual a 4πr2. De esta manera, la fracción de fotones que pasa a través del lente se describe como: (1/2)[1-(1+b2/4r2)-1/2]. En el caso de que el valor de r sea mucho mayor que el de b, la fracción que atraviesa el lente puede describirse como: b2/16r2. Para los valores anteriormente mencionados de r y b, esta fracción de fotones es 6x10-6. Obsérvese que la fracción de fotones capturados se incrementa a medida que se incrementa b o se reduce r (es decir, a medida que se incrementa la apertura numérica del sistema de formación de imágenes). La utilización de FORA en la que los micropocillos se han grabado en los extremos de las fibras ópticas, que también sirven para enfocar la luz en un CCD, incrementa mucho la apertura numérica del ejemplo proporcionado anteriormente, siendo la apertura numérica de muchas fibras ópticas del orden de 0,7. Por cada adición de nucleótido se espera que se generen aproximadamente 10.000 moléculas de PPi y, en el caso de que todas sean convertidas por la sulfurilasa y la luciferasa, estas PPi resultan en la emisión de aproximadamente 1x104 fotones. Con el fin de maximizar su “captura” y cuantificación posteriores al utilizar una matriz plana (por ejemplo un chip de ADN), resulta preferible recoger los fotones inmediatamente en el soporte sólido plano (por ejemplo el cubreobjetos). Esto puede conseguirse mediante: (i) la utilización de aceite de inmersión óptica entre el cubreobjetos y un lente óptico tradicional o haz de fibras ópticas o, preferentemente, (ii) la incorporación de fibras ópticas directamente en el cubreobjetos mismo. La realización de los cálculos anteriormente indicados (en los que, en este caso, b=100 µm y r=50 µm), se encuentra que la fracción recogida es 0,15, que equivale a la captura de aproximadamente 1x103 fotones. Este valor resultaría suficiente para proporcionar una señal adecuada. [0252] Los ejemplos siguientes pretenden ser ilustrativos, no limitativos, de la invención.

Ejemplo 1. Construcción de cebadores de anclaje unidos a una matriz de fibras ópticas de extremos cavitados [0253] Los extremos de una matriz de fibras ópticas en forma de oblea delgada se cavitan mediante la inserción de los extremos en ácido, tal como describen Healey et al., Anal. Chem. 69:2213-2216, 1997. [0254] Se seca una capa delgada de un análogo de biotina fotoactivable sobre la superficie cavitada tal como se describe en Hengsakul y Cass (Bioconjugate Chem. 7:249-254, 1996) y se expone a luz blanca a través de una máscara para crear regiones definidas o áreas de biotina activa. A continuación, se añade avidina y se permite que se una a la biotina. Seguidamente se añaden oligonucleótidos biotinilados. La avidina presenta sitios de unión a biotina libres que pueden anclarse a oligonucleótidos biotinilados mediante un enlace biotinaavidina-biotina. [0255] Las regiones presentan un lado de 104 µm y se encuentran espaciadas por 100 µm. Se añaden oligonucleótidos, de manera que aproximadamente 37% de las regiones incluyen un cebador anclado. En una superficie de 1 cm2 se depositan 10.000 regiones, rindiendo aproximadamente 3.700 regiones con un único cebador de anclaje.

Ejemplo 2. Hibridación y amplificación de miembros de una biblioteca de ácidos nucleicos circulares [0256] Se prepara una biblioteca de moldes circulares abiertos a partir de una población de ácidos nucleicos que se sospecha que contiene un polimorfismo de un solo nucleótido en un fragmento Sau3A1-MspI de 70 pb. El molde incluye adaptadores que son complementarios al cebador de anclaje, una región complementaria a un cebador de secuenciación, y una secuencia de inserción que debe caracterizarse. La biblioteca se genera utilizando Sau3A1 y MspI para digerir el ADN genómico. Se seleccionan inserciones de aproximadamente 65 a 75 nucleótidos y se ligan a oligonucleótidos adaptadores de 12 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos adaptadores presentan secuencias complementarias a secuencias de un cebador de anclaje unido a una superficie de sustrato tal como se indica en el Ejemplo 1. [0257] La biblioteca se hibrida a la matriz de cebadores de anclaje. Se añade una ADN polireasa, conjuntamente con dNTPs, y se utiliza la replicación de círculo rodante para extender en cebador de anclaje. El resultado es una única cadena de ADN, todavía anclada al soporte sólido, que es una concatenación de múltiples copias del molde circular. 10.000 ó más copias de moldes circulares en el orden de tamaño de cientos de nucleótidos.

Ejemplo 3. Análisis de secuencias de ácidos nucleicos unidos al extremo de un sus-trato de fibras ópticas [0258] La oblea matriz de fibras ópticas que contiene los ácidos nucleicos amplificados tal como se describe en el Ejemplo 2 se introduce en una cámara de perfusión y se une a un haz de matrices de fibras ópticas, las cuales se encuentran unidas a una cámara CCD de 16 millones de píxels. Se introduce un cebador de secuenciación en la cámara de perfusión y se deja que se hibride con las secuencias amplificadas. A continuación, se unen sulfurilasa, apirasa y luciferasa al sustrato cavitado utilizando biotina-avidina. [0259] El cebador de secuenciación ceba la síntesis de ADN que se extiende hasta el interior de la inserción que se sospecha que presenta un polimorfismo, tal como se muestra en la Fig. 1. En primer lugar se extiende el cebador de secuenciación mediante la administración sucesiva en la cámara de perfusión de una solución de lavado, una ADN polimerasa, y uno de entre dTTP, dGTP, dCTP o α-tio-dATP (un análogo de dATP). La sulfurilasa, luciferasa y apirasa, unidas a los extremos, convierten cualquier PPi liberado como parte de la reacción de secuenciación en luz detectable. La apirasa presente degrada cualquier dNTP no reaccionado. Típicamente se deja que una cámara CCD conectada al haz de fibras formador de imágenes recoja luz durante 3 segundos (aunque también resulta adecuado 1 a 100, por ejemplo 2 a 10 segundos), después de lo cual se añade solución de lavado adicional a la cámara de perfusión para eliminar el exceso de nucleótidos y productos secundarios. A continuación, se añade el nucleótido siguiente, conjuntamente con polimerasa, repitiendo de esta manera el ciclo. [0260] Durante el lavado, se transfiere la imagen de luz recogida desde la cámara CCD a un ordenador. Se analiza la emisión de luz en el ordenador y se utiliza para determinar si el dNTP correspondiente ha sido incorporado en el cebador de secuencia extendido. La adición de dNTPs y reactivos de secuenciación de pirofosfato se repite hasta obtener la secuencia de la región de inserción que contiene el polimorfismo sospechado.

Ejemplo 4. Análisis de secuencia de un molde de repetición en tándem generado utilizando la amplificación por círculo rodante [0261] Se hibridó un cebador que presentaba la secuencia 5’-gAC CTC ACA CgA Tgg CTg CAg CTT-3’ (SEC ID nº 2) a una molécula molde de 88 nucleótidos que presentaba la secuencia 5’-TCg TgT gAg Gtc TCA Gca TCT TAT gTA TAT TTA CTT CTA TTC TCA gTT gCC TAA gCT gCA gCC A-3' (SEC ID nº 1). La hibridación del molde al cebador resultó en la yuxtaposición de los extremos 5’ y 3’ de la molécula de molde. El molde hibridado se expuso a ligasa, resultando en la ligación de los extremos 5’ y 3’ del molde para generar una molécula circular. [0262] El cebador hibridado se extendió utilizando fragmento Klenow y nucleótidos en amplificación de círculo rodante durante 12 horas a 37ºC. Se purificó el producto utilizando la técnica SPRI (Seradyn, Indianapolis, IN). La amplificación de círculo rodante resultó en la formación de repeticiones en tándem de una secuencia complementaria a la secuencia de molde circular. [0263] El producto de repetición en tándem en la secuencia extendida se identificó mediante hibridación de un cebador de secuenciación que presentaba la secuencia 5’-AAgCTgCAgCCATCgTgTgAgg-3’ (SEC ID nº 8) y sometiendo el cebador hibridado a 40 ciclos alternantes de 95ºC, 1 minuto, 20 segundos a 60ºC utilizando química de terminador ET (Amersham-Pharmacia) en presencia de betaína 1 M.

[0264] A continuación, se diluyó el producto de secuenciación hasta un volumen 1/5 y se purificó en una columna Sephadex G-50 previamente a la inyección en un sistema de secuenciación MegaBACE con poliacrilamida lineal (Amersham-Pharmacia). [0265] En la Fig. 5 se muestra un electroferograma del análisis de secuenciación. La línea demuestra que se generan en tándem múltiples copias de la molécula de molde circular de 88 pb y que estas copias pueden detectarse en una reacción de secuenciación de ADN.

Ejemplo 5. Preparación de FORA [0266] Perlas de ADN: se hibridó desoxioligonucleótido – ggggAATTCAAAATTTggC (SEC ID nº 9) a sondas de captura, que se encontraban biotiniladas en el extremo 5’, y después se inmovilizaron en perlas Dynal M-280 (Dynal) o MPG (CPG) (la concentración de perlas era de 1 mg/ml). La inmovilización se llevó a cabo mediante la incubación de las perlas, con una cantidad fija de oligonucleótido durante 30 minutos. Se obtuvieron diferentes cargas de oligonucleótidos mediante la modificación de la cantidad de oligonucleótido utilizada durante la incubación. Tras la incubación, las perlas se lavaron en volúmenes respectivos de tampón TE y se resuspendieron en los mismos volúmenes de TE. [0267] Perlas de enzima: se incubó una mezcla 1:1 (v/v) de sulfurilasa (1 mg/ml) y luciferasa (3 mg/ml) con dominios BBCP en sus extremos N-terminales con un volumen igual de Dynal M-280 (Dynal) (concentración: 10 mg/ml) durante una hora a 4ºC. Tras una hora de incubación, las perlas se lavaron con tampón de ensayo (Tricina 25 mM, MgOAc 5 mM y BSA 1 mg/ml) cuatro veces y después se resuspendieron en el mismo volumen de tampón de ensayo. [0268] Preparación de FORA. se diluyeron las perlas de ADN 10 veces, hasta una concentración final de 0,1 mg/ml antes de la utilización. Se utilizaron las perlas de enzima a una concentración de 10 mg/ml. Se colocó la FORA en un soporte que presentaba 10 puntos creados por anillo en O (3 mm de diámetro). Se administraron 5 µl de perlas de ADN en 9 puntos. El primer punto en la entrada era un punto de control, sin ADN, para detectar cualquier fondo en los reactivos. Se introdujo el soporte en una centrífuga y se centrifugó a

2.000 rpm durante cinco minutos. La fuerza centrífuga fuerza las perlas hasta el fondo de los pocillos (aproximadamente 5 a 10 perlas/pocillo). Se retira el soporte de la centrífuga y se añaden 5 µl de perlas SL y se introdujo el soporte en la centrífuga y se centrifugó a 2.000 rpm durante cinco minutos. Se repitió el procedimiento con 5 µl de perlas SL. Se retiró la FORA del soporte, se introdujo en un tubo Falcon que contenía tampón de ensayo y se lavó mediante un movimiento oscilatorio suave tres a cuatro veces. La FORA preparada de esta manera se encuentra preparada para el análisis de secuencias mediante secuenciación de pirofosfato.

Ejemplo 6. Análisis de secuencia del ácido nucleico ligado al extremo de un sustrato de fibras ópticas [0269] Reactivos: los reactivos utilizados para el análisis de secuencias y como controles fueron los cuatro nucleótidos y pirofosfato (PPi) 0,1 µM preparado en solución de sustrato,

5 en la que el sustrato se refiere a una mezcla de luciferina 300 µM y adenosina 5’fosfosulfato, APS, 4 µM, que son los sustratos para la cascada de reacciones que implican PPi, luciferasa y sulfurilasa. Se preparó el sustrato en tampón de ensayo. La concentración de PPi utilizada para someter a ensayo los enzimas y para determinar los niveles de fondo de los reactivos que pasaban a través de la cámara era de 0,1 µM. La concentración de los

10 nucleótidos, dTTP, dGTP, dCTP era 6,5 µM y la de αdATP era de 50 µM. Cada uno de los nucleótidos se mezcló con ADN polimerasa Klenow a una concentración de 100 U/ml. [0270] Se introdujo la FORA en la cámara de flujo del instrumento de la realización, y la cámara de flujo se conectó al panel frontal de la cámara CCD. Se lavó la FORA haciendo fluir sustrato (3 ml por minuto, 2 minutos) a través de la cámara. A continuación, se hizo fluir

15 una secuencia de reactivos a través de la cámara mediante bombas conectadas a un accionador, que se programó a posiciones interruptoras, que presentaba tubos insertados en los diferentes reactivos. Se fijó la cámara en modo de captura rápida, con un tiempo de exposición = 2,5 segundos. [0271] La salida de señal procedente de la región es la media de pulsos de todos los píxels

20 dentro de la región. El número de cuadro es equivalente al tiempo transcurrido durante el experimento. El gráfico indica el flujo de los diferentes reactivos.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0272]

<110> Curagen Corporation

<120> Aparato y método para la secuenciación de ácidos nucleicos

<130> 21465-501 CIP2 019

<140> EP 02715174.5

<141> 2002-03-21

<150> PCT/US02/08700

<151> 2002-03-21

<150> US 09/814.338

<151> 2001-03-21

<160> 12

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 64

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<400> 1

imagen4

<210> 2

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> oligonucleótido

<400> 2 gacctcacac gatggctgca gctt: 24

<210> 3 <212> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> oligonucleótido

<400> 3 gacctcacac gatggctgca gctt: 24

<210> 4 <211> 64 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> oligonucleótido

<400> 4

imagen4

<210> 5

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<400> 5 <210> 8

-75

ctagctcgta catataaatg aagataagat cctg: 34

<210> 6 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> oligonucleótido

<400> 6 gacctcacac gagtagcatg gctgcagctt: 30

<210> 7 <211> 64 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> oligonucleótido

<400> 7

imagen4

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<400> 8 aagctgcagc catcgtgtga gg 22

<210> 9

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<400> 9 ggggaattca aaatttggc 19

<210> 10

<211> 64

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 10

imagen4

<210> 11

<211> 32

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 11 gtcctagaat agaagtaaat atacatgctc ga 32

<210> 12

<211> 340

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223> oligonucleótido

<400> 12

imagen4

5 LISTADO DE SECUENCIAS

[0273]

<110> Curagen Corporation 10 <120> Aparato y método para la secuenciación de ácidos nucleicos

<130> 21465-501 CIP2 019

<140> EP 02715174.5 15 <141> 2002-03-21

<150> PCT/US02/08700

<151> 2002-03-21 20 <150> US 09/814.338

<151> 2001-03-21

<160> 12 25 <170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 64

<212> ADN 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 1

imagen4

5: <210> 2 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> oligonucleótido

15 20: <400> 2 gacctcacac gatggctgca gctt <210> 3 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> oligonucleótido 24

25: <400> 3 gacctcacac gatggctgca gctt 24

30: <210> 4 <211> 64 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> oligonucleótido

35: <400> 4

imagen4

<210> 5 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> oligonucleótido

<400> 5 ctagctcgta catataaatg aagataagat cctg: 34

<210> 6 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> oligonucleótido

<400> 6 gacctcacac gagtagcatg gctgcagctt: 30

<210> 7 <211> 64 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> oligonucleótido

<400> 7

imagen4

<210> 8

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<400> 8 aagctgcagc catcgtgtga gg 22

<210> 9

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<400> 9 ggggaattca aaatttggc 19

<210> 10

<211> 64

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<400> 10

imagen4

<210> 11

<211> 32

<212> ADN

<213> Artificial

<223> oligonucleótido

-81

<400> 11 gtcctagaat agaagtaaat atacatgctc ga: 32

5: <210> 12 <211> 340 <212> ADN <213> Artificial

10: <220> <223> oligonucleótido

<400> 12

imagen4

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Matriz para secuenciar un ácido nucleico, que comprende:

una oblea cavitada de fibras ópticas formadas a partir de un haz de una pluralidad de fibras ópticas individuales, presentando cada fibra óptica individual un diámetro de entre 3 y 100 µm, comprendiendo la oblea una superficie superior y una superficie inferior, comprendiendo la superficie superior más de 400.000 cámaras de reacción, en la que las cámaras de reacción se encuentran grabadas en la superficie superior de la oblea cavitada de fibras ópticas y en el que el grosor de la oblea entre la superficie superior y la superficie inferior presenta un grosor de entre 0,5 mm y 5,0 mm; en el que la profundidad de cada cámara de reacción se encuentra comprendida entre una mitad del diámetro de la fibra óptica individual y tres veces el diámetro de la fibra óptica individual, y en el que una pluralidad de cámaras de reacción sobre la superficie superior de la oblea cavitada presenta un ácido nucleico en las mismas, y en el que 50% a 100% de las cámaras de reacción puede presentar un soporte sólido móvil con un enzima de secuenciación inmovilizado sobre el mismo.
2.

Matriz según la reivindicación 1, en la que el ácido nucleico se inmoviliza sobre las cámaras de reacción o sobre un soporte móvil.
3.

Matriz según la reivindicación 1 ó 2, en la que el diámetro de cada fibra óptica individual en la oblea cavitada de fibras ópticas es de entre 6 y 50 µm.
4.

Matriz según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que las cámaras de reacción presentan un espaciado centro a centro de entre 10 y 200 µm.
5.

Matriz según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que las cámaras de reacción presentan un espaciado centro a centro de entre 10 y 150 µm.
6.

Matriz según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que las cámaras de reacción presentan un espaciado centro a centro de entre 100 y 150 µm.
7.

Matriz según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la matriz presenta una superficie pulida de fibras ópticas situada delante de la superficie cavitada de fibras ópticas, y en la que la superficie pulida permite el acoplamiento óptica con una segunda fibra óptica.
8.

Matriz según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la oblea cavitada de fibras ópticas se encuentra recubierta.
9.

Matriz según la reivindicación 8, en la que el recubrimiento se selecciona de entre el grupo que consiste de plástico, capas de oro con monocapas autoensamblantes de tiol-alcanos de cadena larga, reactivos organosilano, línkers fotorreactivos, geles de polímero hidrofílico y polímeros plurónicos, encontrándose los polímeros plurónicos específicamente adsorbidos a una superficie de poliestireno o de vidrio silanizado.
10.

Matriz según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el enzima de secuenciación es la luciferasa.
11.

Matriz según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el enzima de secuenciación es la sulfurilasa.
12.

Aparato para secuenciar ácidos nucleicos, que comprende una matriz según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, un medio para administrar reactivos en las cámaras de reacción y desde las mismas, y un medio para detectar un suceso de reacción de secuenciación.
13.

Aparato según la reivindicación 12, comprendiendo el aparato:

una cámara de flujo en la que se ha dispuesto una matriz según la reivindicación

1, en la que las cámaras de reacción presentan un espaciado de centro a centro de

entre 5 y 200 µm,

un medio líquido para administrar reactivos de procesamiento procedentes de

uno o más reservorios a la cámara de flujo de manera que los ácidos nucleicos en

los mismos se encuentren expuestos a los reactivos, y

un medio de detección para detectar una secuencia de señales ópticas procedente de cada una de las cámaras de reacción, en el que

el medio de detección se encuentra en comunicación con las cámaras de reac

ción, siendo cada señal óptica de la secuencia indicativa de una interacción entre un

reactivo de procesamiento y el ácido nucleico en la cámara de reacción.
14.

Aparato según la reivindicación 12 ó 13, en el que el diámetro de cada fibra óptica individual en la oblea cavitada de fibras ópticas es de entre 6 y 50 µm.
15.

Aparato según la reivindicación 12, 13 ó 14, en el que el medio de detección es una cámara CCD.
16.

Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que la oblea cavitada de fibras ópticas se encuentra recubierta
17.

Aparato según la reivindicación 16, en el que el recubrimiento se selecciona de entre el grupo que consiste de plástico, capas de oro, reactivos organosilano, línkers fotorreactivos, geles de polímero hidrofílico y polímeros plurónicos, adsorbiéndose específicamente los polímeros plurónicos a una superficie de poliestireno o de vidrio silanizado.
18.

Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, en el que el enzima de secuenciación es la luciferasa.
19.

Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, en el que el enzima de secuenciación es la sulfurilasa.
20.

Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, en el que el ácido nucleico se inmoviliza en las cámaras de reacción o sobre un soporte móvil.
21.

Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, en el que las cámaras de reacción presentan un espaciado de centro a centro de entre 10 µm y 200 µm.
22.

Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, en el que las cámaras de reacción presentan un espaciado de centro a centro de entre 10 µm y 150 µm.
23.

Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, en el que las cámaras de reacción presentan un espaciado de centro a centro de entre 100 µm y 150 µm.
24.

Método para la secuenciación de un ácido nucleico, comprendiendo el método utilizar una matriz según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o en el que el método comprende utilizar un aparato según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 23.
25.

Método según la reivindicación 24, en el que la matriz se dispone en una cámara de

flujo y en el que las cámaras de reacción presentan un espaciado de centro a centro de entre 5 y 200 µm,

y en el que el método comprende administrar reactivos de procesamiento procedentes de uno o más reservorios a la cámara de flujo de manera que los ácidos nucleicos dispuestos en los mismos se encuentren expuestos a los re-activos, y

detectar una secuencia de señales ópticas de cada una de las cámaras de reacción utilizando un medio de detección que se encuentra en comunicación con las cámaras de reacción, siendo cada señal óptica de la secuencia indicativa de una interacción entre un reactivo de procesamiento y el ácido nucleico dispuesto en la cámara de reacción.
26.

Método según la reivindicación 24 ó 25, en el que el ácido nucleico se encuentra inmovilizado en las cámaras de reacción o sobre un soporte móvil.
27.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que se produce pirofosfato como producto secundario de secuenciación.
28.

Método según la reivindicación 27, en el que el pirofosfato se detecta mediante la puesta en contacto del producto secundario de secuenciación con una sulfurilasa bajo condiciones que permiten la formación de ATP.
29.

Método según la reivindicación 28, en el que la sulfurilasa es un sulfurilasa termoestable.
30.

Método según la reivindicación 27, que comprende además añadir apirasa para degradar los nucleótidos trifosfato no reaccionados.
31.

Método según la reivindicación 27, que comprende además eliminar mediante lavado los reactivos de secuenciación difundibles, por ejemplo dNTPs no incorporado, con un tampón de lavado tras la administración de dichos reactivos de secuenciación.
32.

Método según la reivindicación 31, en el que el tampón incluye apirasa.
33.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 32, en el que el diámetro de cada fibra óptica individual en la oblea cavitada de fibras ópticas es de entre6 y50 µm.
34.

Método según la reivindicación 24 ó 25, en el que las cámaras de reacción presentan un espaciado de centro a centro de entre 10 µm y 200 µm.
35.

Método según la reivindicación 34, en el que las cámaras de reacción presentan un espaciado de centro a centro de entre aproximadamente 50 µm y 150 µm.
36.

Método según la reivindicación 34, en el que las cámaras de reacción presentan un espaciado de centro a centro de entre 100 µm y 150 µm.
37.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 36, en el que el medio de detección es una cámara CCD.
38.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 37, en el que la matriz presenta una superficie pulida de fibras ópticas enfrentada a la superficie cavitada de fibras ópticas, y en el que la superficie pulida permite el acoplamiento óptica a una segunda fibra óptica.
39.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 38, en el que la oblea cavitada de fibras ópticas se encuentra recubierta.
40.

Método según la reivindicación 39, en el que el recubrimiento se selecciona de entre el grupo que consiste de plástico, capas de oro, reactivos organosilano, línkers fotorreactivos, geles de polímero hidrofílico y polímeros plurónicos, siendo los polímeros plurónicos específicamente adsorbidos a una superficie de poliestireno o de vidrio silanizado.
41.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 40, en el que el agente

-87de secuenciación de pirofosfato es la luciferasa.
42.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 40, en el que el agente de secuenciación es la sulfurilasa.