FR2579895A1 - - Google Patents

Abstract

PREPARATIONS PHARMACEUTIQUES POUR L'ADMINISTRATION TOPIQUE CONTENANT UNE SUBSTANCE PHARMACOLOGIQUEMENT ACTIVE EN MEME TEMPS QUE DE L'ACIDE HYALURONIQUE OU UNE DE SES FRACTIONS MOLECULAIRES. L'ACIDE HYALURONIQUE PEUT EXISTER SOUS LA FORME D'ACIDE LIBRE OU SOUS LA FORME DE SEL AVEC UN METAL ALCALIN OU ALCALINO-TERREUX, LE MAGNESIUM, L'ALUMINIUM OU L'AMMONIUM OU SOUS LA FORME D'UN SEL AVEC UNE OU PLUSIEURS SUBSTANCES PHARMACOLOGIQUEMENT ACTIVES.

Description

La présente invention a pour objet de nouveaux médicaments à usage topique

et elle concerne, plus précisément, des médicaments contenant: 1.- une substance pharmacologiquement active ou un mélange de subs- tances pharmacologiques, soit actives, soit convenant a une administration topique; et 2.- un véhicule qui comprend l'acide hyaluronique ou une fraction moléculaire d'acide hyaluronique ou un de ses sels avec un métal alcalin, un métal alcalino-terreux, le magnésium, l'aluminium, l'ammonium ou une substance pharmacologique, éventuellement en même temps que des excipients supplémentaires classiquement employés pour l'obtention de préparations pharmaceutiques a usage topique. L'invention a, en outre, pour objet, l'utilisation de ces médicaments a

des fins thérapeutiques ou préventives.

L'utilisation d'un médicament à activité topique peut être un avantage et même servir de remède, notamment dans les traitements dermatologiques ainsi dans le traitement des membranes muqueuses en général et, notamment, des membranes des cavités orales et nasales, des de l'oreille externe et, notamment, le traitement de la surface externe

de l'oeil.

L'application de ces médicaments topiques est particulièrement recomman-

dable en pédiatrie et dans le domaine vétérinaire.

Les avantages d'une thérapie qui utilise les médicaments selon la présente invention résultent de ce que ces médicaments comportent un véhicule plus efficace des médicaments qui est à base de polysaccharide

acide de l'acide hyaluronique et conduisent par conséquent a une meilleu-

re disponibilité biologique de la substance active par comparaison à ce que l'on peut obtenir avec les formulations pharmaceutiques connues. Les nouveaux médicaments selon la présente invention prennent en outre, une

importance particulière lorsqu'ils sont employés dans le domaine ophtal-

mique du fait que les qualités mentionnées ci-dessus, conduisent à une compatibilité spécifique supplémentaire avec l'épithélium cornéen et, de ce fait, à un degré de tolérance très élevé sans donner d'effets de sensibilisation. Lorsque les médicaments sont administrés sous la forme de solutions concentrées présentant des caractéristiques visco-élastiques ou sous forme solide, il est possible d'obtenir sur l'épithélium cornéen des films qui soient homogènes, stables, parfaitement transparents et qui adhèrent bien, ce qui garantit une disponibilité biologique prolongée

du médicament et forment ainsi d'excellentes préparations à effet retard.

Ces médicaments ophtalmiques présentent une valeur exceptionnelle,

notamment dans le domaine vétérinaire, du fait qu'il n'existe actuelle-

ment pas de spécialités vétérinaires à usage oculaire qui contiennent des agents chimio-thérapeutiques. En fait, on utilise en général des

préparations destinées a l'usage humain; ces préparations ne correspon-

dent cependant pas toujours un intervalle d'activité spécifique ni ne

répondent toujours aux conditions particulières du traitement vétérinaire.

Ceci est, par exemple, le cas dans la thérapie des kêratoconjoncti-

vite infectieuse, l'oeil rose ou IBK, infection qui affecte principalement le bétail, les moutons et les chèvres. On présume que ces trois espèces

présentent, en commun, des facteurs étiologiques spécifiques. En particu-

lier, pour le bétail, le principal micro-organisme impliqué semble être Moraxella bovis (quoiqu'il ne faille pas exclure d'autres agents ou une origine virale, par exemple le Rhinotracheltis virus, Micoplasma, Rickettsia et Chlamydia dans le cas des moutons et Rickettsia dans le cas des chèvres). La maladie se manifeste sous une forme aiguë et tend à se répandre rapidement. Dans les stades initiaux, la symptomatologie se caractérise par un blépharospasme et une coulée de larmes excessive suivis d'un exudat purulent, d'une conjonctivite et d'une kératite, souvent accompagnés de fièvre, d'une diminution de l'appétit et de la production de lait. Les lésions de la cornée sont particulièrement sérieuses et, dans les étapes finales, elles peuvent même occasionner des perforations de la cornée elle-même. L'évolution clinique varie de quelques jours à plusieurs semaines. Une gamme importante d'agents chimio- thérapeutiques est utilisée pour le traitement et ces agents sont administre aussi bien par voie topique (souvent en association avec des stéroides anti-inflammatoires) que par voie systémique. Parmi ceux-ci, on citera les suivants: les tétracyclines, par exemple l'oxytétracycline, les pénicillines, par exemple la cloxacilline et la benzylpénicilline; les sulfamides, la polymyxine B (associée avec le miconazole et la prednisolone), le chloramphénicol, la tylosine et la chloromycétine. Le traitement topique de la maladie, en dépit de sa simplicité apparente, représente encore un problème non résolu, puisque, pour une raison ou une autre, il s'est avéré impossible jusqu'à maintenant d'obtenir des préparations oculaires présentant des concentrations d'antibiotiques ou de sulfamides qui soient thérapeutiquement efficaces pour la sécrétion des larmes. Ceci est tout à fait compréhensible dans le cas des solutions, si l'on a présent à l'esprit la position en général incliné de la tête

des animaux. Mais ceci est également vrai pour les médicaments semi-

solides, puisque les excipients que l'on utilise normalement pour eux ne présentent pas les qualités nécessaires leur permettant d'adhérer à la surface de la cornée, du fait qu'ils ne présentent habituellement pas une concentration suffisamment élevée en substances actives et ne peuvent pas donner lieu à une distribution parfaite (c'est-à-dire que se

produit un gradient de distribution). Ces défauts des collyres conven-

tionnels en utilisation ophtalmique ont été décrits par Slatter et col.

dans "Austr. vet. J.-, 1982, 59 (3), pages 69-72.

Un des avantages de la présente invention, est de proposer des nouveaux types perfectionnés de collyres dans lesquels on a remédié aux défauts cidessus. L'usage l'acide hyaluronique comme véhicule de

médicaments ophtalmiques permet la formulation d'excellentes prépara-

tions exemptes de gradients de concentrations de substances actives et, de ce fait, parfaitement homogènes, transparentes et adhérentes à l'épithélium cornéen, sans présenter d'effet de sensibilisation, donnant lieu à un excellent véhiculage de la substance active et à la possible

obtention d'un effet retard.

Les propriétés mentionnés ci-dessus des nouveaux médicaments peuvent, naturellement, être également utilisées dans d'autres domaines en dehors de l'ophtalmologie. Comme on l'a déjà mentionné, on peut les

appliquer en dermatologie et pour des maladies qui affectent les mem-

branes muqueuses, par exemple de la bouche, par exemple en odontologie.

On peut également les utiliser pour obtenir un effet systémique de la réabsorption trans-cutanée, par exemple dans les suppositoires. Toutes ces applications sont possibles à la fois en médecine humaine et en médecine vétérinaire. En médecine humaine, les nouveaux médicaments

selon l'invention conviennent particulièrement à un usage en pédiatrie.

La présente invention couvre également, bien entendu, n'importe quelle

application thérapeutique des médicaments précités.

La présente invention est donc, dans son aspect essentiel, basée sur l'utilisation de l'acide hyaluronique comme véhicule en association avec une substance pharmaceutique, pour procurer un système amélioré de fournitures d'un médicament. Les nouveaux médicaments, selon la présente invention, contiennent, fondamentalement, deux composants: Composant 1 formé d'une substance pharmaceutiquement active ou formé, comme on l'a décrit ci-dessus, de mélanges de plusieurs

de ces substances.

Composant 2 - acide hyaluronique, ainsi que, comme on l'a décrit ci-

dessus, des fractions de la molécule d'acide hyaluronique et divers sels d'acide hyaluronique ou de ces fractions

de molécules.

La présente invention peut, en outre, être caractérisée comme comprenant des mélanges physiques de composant (1) et de composant (2), des complexes de la substance active du composant (1) avec l'acide hyaluronique du composant (2) ou diverses combinaisons ou divers mélanges. Composant (1) - substance pharmaceutique: Le composant (1) peut, tout d'abord, être classé en fonction de son utilisation dans les divers domaines de la thérapeutique, selon qu'il s'agit de médecine humaine ou de médecine vétérinaire et, ensuite, par analyse des divers secteurs d'application en fonction des organes ou

des tissus à traiter, par exemple en ophtalmologie, dermatologie, obsté-

trique, oto-rhino-laryngologie, angiologie, neurologie ou n'importe quel type de pathologie des organes internes que l'on peut traiter par voie topique, par exemple pour les applications rectales. Selon un aspect

particulier de la présente invention, la substance (1) pharmacologique-

ment active est en premier lieu destinée surtout à un usage ophtalmique.

Selon un autre critère, la substance pharmacologiquement active (1) doit différer en ce qui concerne son effet et elle peut donc être, par exemple,

utilisée comme agents anesthésique, analgésique, vaso-constricteur, anti-

bactérien, antivirus ou anti-inflammatoire. Dans le domaine ophtalmique, elle peut être indiquée particulièrement, par exemple, pour ses effets

myotiques, anti-inflammatoires, cicatrisants et antimicrobiens.

Le composant (1) peut également être, selon la présente invention, un mélange de deux ou de plus de deux substances actives. Par exemple, en ophtalmologie, un antibiotique peut être associé à un antiphlogistique et à un vaso-constricteur ou bien plusieurs antibiotiques peuvent être associés à un ou plusieurs antiphlogistiques ou bien un ou plusieurs antibiotiques peuvent être associés avec un agent mydiatrique, un agent myotique, un agent cicatrisant ou un agent anti-allergique. Il est, par exemple, possible d'utiliser les associations suivantes de médicaments ophtalmiques: (a) kanamycine + phényléphrine + phosphate dexaméthasone; (b) kanamycine + phosphate bêtaméthasone + phényléphrine, ou des associations semblables avec d'autres antibiotiques utilisés en ophtalmologie, par exemple la rolitétracycline, la néomycine, la

gentamicine et la tétracycline.

En dermatologie, il est possible d'utiliser comme agent actif le composant (1) ou des mélanges de divers antibiotiques, par exemple l'érythromycine, la gentamicine, la néomycine, la gramicidine, la polymyxine B ou des mélanges de ces antibiotiques avec des agents anti- inflammatoires, par exemple des cortico-stéroTdes. Par exemple, des mélanges comprenant: (a) hydrocortisone + néomycine; (b) hydrocortisone + néomycine + polymyxine B + gramicidine; (c) dexaméthasone + néomycine; (d) fluorométholon + néomycine; (e) prednisolone + néomycine; (f) triamcinolone + néomycine + gramicidine + nistatine, ou tout autre

mélange utilisé dans des préparations classiques en dermatologie.

Les mélanges de diverses substances actives ne sont naturellement pas limités à ce domaine mais dans chacun des domaines de la médecine mentionnés ci-dessus, il est possible d'utiliser des mélanges semblables à ceux dejà en usage pour les préparations pharmaceutiques connues. On citera, comme exemple de substance (1) pharmacologiquement active à utiliser dans des médicaments ophtalmiques selon la présente invention:

les antibiotiques basiques et non basiques, par exemple les aminoglucosi-

diques, les macrolides, tétracycline et peptides tels que, par exemple, la gentamicine, la néomycine, la streptomycine, la dihydrostreptomycine,

la kanamycine, l'amikacine, la tobramycine, la spectinomycine, l'érythro-

mycine, l'oléandomycine, la carbomycine, la spiramycine, l'oxytétracycli-

ne, la rolitétracycline, la bacitracine, la polymyxine B, la gramicidine, la colistine, le chloramphénicol, la lincomycine, la vancomycine, la novobiocine, la ristocetine, la clindamycine, l'amphotéricine B, la griseofulvine, la nystatine et éventuellement leurs sels, par exemple des sulfates ou des nitrates ou leurs mélanges ou avec d'autres principes

actifs, par exemple ceux mentionnés ci-après.

D'autres médicaments ophtalmiques a utiliser avantageusement selon

la présente invention consistent, par exemple en d'autres agents anti-

infectieux, tels par exemple la diéthylcarbamazine, le mébendazole, les sulfamides tels que sulfacetamide, sulfadiazine, sulfisoxazole; des agents antiviraux et antitumoraux tels que l'iododéoxyuridine, adénine

arabinoside, trifluorothtmidine, aciclovire, éthyldéoxyuridine, bromovi-

nyldeoxyuridine, 5-iodo-5'-amino-2',5'-didéoxyuridine; des agents stéroTdes anti-inflammatoires tels que, par exemple, dexaméthasone,

hydrocortisone, prednisolone, fluorométholon, médrysone et éventuelle-

ment leurs esters par exemple des esters d'acide phosphorique, des agents anti-inflammatoires non stéroTdes, par exemple indométhacine, oxyphenbutazone, flurbiprofène; des agents cicatrisants tels que, par exemple le facteur de croissance épidermique EGF; des anesthésiques locaux tels que, par exemple, benoxinate, proparacaTne et éventuellement leurs sels; des médicaments (promoteurs) agonistes cholinergiques tels que, par exemple pilocarpine, métacholine, carbaylocholine, acéclidine, physiostigmine, neostigmine, démécarium et éventuellement leurs sels; des médicaments antagonistes cholinergiques tels que, par exemple

l'atropine et ses sels; les médicaments (promoteurs) agonistes adréner-

giques tels que, par exemple, la noradrénaline, l'adrénaline, la napho-

zoline, la méthoxamine et éventuellement leurs sels; et des médicaments antagonistes adrénergiques, par exemple propanolol, timolol, pindolo, bupranolol, atenolol, métoprolol, oxprenolol, practolol, butoxamine,

sotalol, budarine, labétalol et éventuellement leurs sels.

Comme noté ci-dessus, le composant (1) actif peut prendre la forme

d'un mélange de deux ou de plus de deux substances actives. Des subs-

tances actives à utiliser seules ou en mélange entre-elles ou avec d'autres principes actifs en dermatologie sont, par exemple: des agents thérapeutiques tels que des agents anti-infectieux, antibiotiques, antimicrobiens, anti-inflammatoires, cytostatiques, cytotoxiques, antiviraux, anesthésiques, et des agents prophylactiques tels que, par

exemple des écrans solaires, déodorants, antiseptiques et désinfectants.

Parmi les antibiotiques, il faut noter les suivants: érythromicine, bacitracine, gentamicine, néomycine, aureomycine, gramicidine et leurs mélanges, parmi les antibactériens et désinfectants, la nitrofurazone, le mafénide, la chlorhexidine et les dérivés de 8-hydroxyquinoline et éventuellement leurs sels; parmi les agents anti-inflammatoires, surtout

les cortico-stéroTdes tels que prednisolone, dexaméthasone, flumétha-

sone, clobétasol, triamcinolone, acétonide, bétaméthasone ou leurs esters, par exemple les valérianates, benzoates, dipropionates; parmi les cytotoxiques, bluorouracile, méthotrexate, podophylline; et parmi

les anesthésiques, la dibucaTne, lidocaTne, benzocaîne.

Cette liste n'est naturellement donnée qu'à des fins illustrative

et l'on peut utiliser tout autre agent décrit dans la littérature.

Parmi les exemples mentionnés pour l'ophtalmologie et la derma-

tologie, il est possible de conclure par analogie quels sont les médica-

ments selon la présente invention à utiliser dans les domaines de la médecine mentionnés ci-dessus, par exemple en oto-rhino-laryngologie, en odontologie, en médecine interne, par exemple en endocrinologie, ou il est possible d'effectuer des traitements avec des préparations par absorption intradermique ou absorption a travers les muqueuses, par exemple rectale ou absorption intranasale, par exemple sous forme de pulvérisations nasales ou inhalations dans la cavité orale et dans le

pharynx.

Ces préparations peuvent donc être, par exemple, anti-inflamma-

toires ou vaso-constrictrices ou vaso-suppressives telles que celles déjà mentionnées en ophtalmologie, des vitamines, des antibiotiques,

tels que ceux mentionnés ci-dessus, des hormones, des agents chimio-

thérapeutiques, antibactériens, etc., y compris ceux mentionnés ci-

dessus à utiliser en dermatologie.

Composant (2) - véhicule d'acide hyaluronique

Comme noté ci-dessus, les médicaments selon l'invention compren-

nent, comme composant (2), l'acide hyaluronique, des fractions de la molécule-de cet acide ou divers sels de celui-ci. L'acide hyaluronique (ci-après quelquefois dénommé "HY") est un hétéropolysaccharide naturel

composé de restes alternés d'acide D-glucuronique et de N-acétyl-D-

glucosamine. Le HY est présent dans les gels péricellulaires, dans la substance extra-cellulaire fondamentale des tissus conjonctifs, dans les organismes vertébrés, dans le fluide synovien des articulations, dans l'humeur vitrée, dans le tissu ombilical humain, dans les crêtes de coqs et dans quelques bactéries. Son poids moléculaire est d'environ 8 à

13 millions.

La première recherche effectuée sur le HY a été effectuée par Balazs (voir le brevet US n 4 141 973) qui a isolé une fraction d'HY susceptible de se substituer à des fluides endobulbaires et convenant à d'autres applications thérapeutiques. L'acide hyaluronique et ses fractions de poids moléculaires plus faibles se sont, en fait, avérés extrêmement utiles en médecine et une utilisation cosmétique a également été envisagée (voir, par exemple, Balazs et col., Cosmetics & Toiletries, Italian Edition NI 5/84). On l'a spécialement utilisé comme agent thérapeutique dans la thérapeutique des arthropathies, par exemple dans

le domaine vétérinaire pour guérir l'arthrite des chevaux (Acta Vet.

Scand. 167, 379 (1976).

L'acide hyaluronique et ses fractions moléculaires ont été utili-

sés en chirurgie ophtalmique comme agents thérapeutiques auxiliaires et de substitution pour des organes naturels et des tissus (voir, par exemple E. A. Balazs et col. Modern Problems in Ophtalmology, 10, 3

(1970), E.B. Strieff, S. Karger, eds. Basel et Balazs et col., Visco-

surgery and the Use of Sodium Hyaluronate During Intraocular Lens Implantation, article presenté à l'International Congress and Frist Film

Festival on Intraocular Implantation, Cannes, 1979).

Dans la demande de brevet européen publiée n 0138572 déposée le

octobre 1984, est décrite une fraction moléculaire d'acide hyaluroni-

que que l'on peut utiliser pour des injections intra-oculaires et intra-

articulaires respectivement, et qui est susceptible de se substituer au fluide endobulbaire et peut être utilisé pour la thérapeutique des

arthropathies.

Au contraire de cette utilisation thérapeutique ou de cette utilisation comme auxiliaires plastique en chirurgie ou en cosmétique, l'acide hyaluronique ou ses fractions moléculaires sont utilisés dans la présente invention, comme véhicules pour l'administration de substances

pharmacologiquement actives à usage topique.

A titre de véhicule utilisé comme composant (2) selon la présente invention, on peut utiliser un acide hyaluronique de n'importe quelle origine, par exemple les acides extraits des matières premières naturelles

mentionnées ci-dessus, y compris les crêtes de coqs. La préparation d'ex-

traits bruts de ces acides est décrite dans la littérature technique. On doit, de préférence, utiliser des acides hyaluroniques purifiés. Selon la présente invention, à la place des acides hyaluroniques obtenus directement par extraction des matières organiques, il est possible d'utiliser des fractions de celui-ci présentant des poids moléculaires qui peuvent varier énormément, par exemple d'environ 90 à 80% (PM = 11,7 A 10,4 millions) a 0,23% (PM = 30.000) d'une fraction moléculaire d'un acide hyalurique présentant un poids moléculaire de 13 millions, de préférence entre 5% et 0,23%. Ces fractions peuvent s'obtenir par divers modes opératoires, par exemple, par hydrolyse, oxydation ou à l'aide d'agents chimiques enzymatiques, par des modes opératoires physiques, par exemple par traitement mécanique ou par irradiation et, de ce fait, ils sont souvent formes dans les mêmes modes opératoires de purification des extraits primaires (voir, par exemple Balazs et col. Cosmetics and Toiletries, cité ci-dessus). La séparation et la purification des

fractions obtenues se réalisent, par exemple, par filtration moléculaire.

Il est particulièrement important d'utiliser comme véhicule (2) selon la présente invention, deux fractions purifiées que l'on peut obtenir à partir de l'acide hyaluronique, par exemple a partir de crêtes de coqs et qui sont connues sous le nom de hyalastine et hyalectine. La fraction connue sous le nom de hyalastine possède un poids moléculaire moyen entre environ 50.000 et 100.000. La hyalectine possède un poids moléculaire moyen d'environ 500.000 à 730.000. Une fraction combinée de ces deux fractions a également été isolée et elle est caractérisée par son poids moléculaire moyen d'environ 250.000 à environ 350.000. Cette fraction combinée peut s'obtenir avec un rendement de 80% en acide

hyaluronique total disponible à partir de la matière première particu-

liêre, tandis que la fraction hyalectine peut s'obtenir avec un rende-

ment de 30% et la fraction hyaiastine avec un rendement de 50% par rapport au HY de départ. La préparation de ces fractions est décrite

dans les exemples 20 à 22 ci-après.

Ainsi, l'acide hyaluronique que l'on préfère utiliser est une fraction dont le poids moléculaire moyen est en gros compris entre environ 30.000 à environ 13 millions et, de préférence entre environ 30.000 et environ 730.000. Les fractions hyaluroniques que l'on préfère particulièrement ont un poids moléculaire d'environ 50.000 à environ 100.000 ou d'environ 500.000 à environ 730.000, ou consistent en une fraction combinée ayant un poids moléculaire de 250.000 à environ

350.000. Il est important que ces fractions préférées soient sensible-

ment exemptes d'acide hyaluronique de faible poids moléculaire, dont le poids moléculaire soit inférieur à 30.000 et, de ce fait, soit exempt de réactions secondaires inflammatoires lors de leur administration. Les références ultérieures ci-après a l'acide hyaluronique ou HY doivent comprendrent, en cohérence avec le contexte particulier, F la fois

l'acide hyaluronique et ses fractions de divers poids moléculaires.

Selon l'invention, au lieu des acides hyaiuroniques et de ses fractions de divers poids moléculaires, il est possible d'utiliser conmme composant (2) des médicaments leurs sels avec des bases minérales, par

exemple de métal alcalin (sodium, potassium, lithium), de métal alcalino-

terreux (calcium, baryum, strontium), magnésium ou aluminium. Ces sels peuvent être stoéchiométriquement neutres en ce sens que toutes leurs fonctions acides sont salifiées ou peuvent être des sels ou des acides partiels dans lesquels seules un certain nombre de ces fonctions acides

sont salifiées par les métaux mentionnées ci-dessus. Ces sels s'obtien-

nent facilement par exemple en faisant réagir HY ou les fractions mentionnées ci-dessus avec la quantité de base calculée et il est également possible d'utiliser des sels mixtes provenant de différentes bases. Outre les sels ci-dessus, il est également possible d'utiliser des sels de HY avec des composés que l'on peut largement considérer comme de l'ammonium ou de l'ammonium substitué (des amines), par exemple des sels de mono-, di-, tri-, et tétra- alkylammonium ou les groupes alkyles

possèdent, de préférence, entre 1 et 18 atomes de carbone ou des aryl-

alkyles comportant le même nombre d'atomes de carbone dans la portion

aliphatique et o le radical aryle signifie un reste benzénique, éven-

tuellement substitué par un nombre compris entre 1 et 3 groupes méthyle, halogène ou hydroxy. Ces sels d'ammonium ou d'ammonium substitués de HY se forment par réaction chimique entre l'acide hyaluronique et des radicaux d'amines primaire, secondaire ou tertiaire ou des radicaux d'hydroxyde d'ammonium, de composés ou de médicaments présentent une activité pharmaceutique, c'est-a-dire avec ses parties des composés qui

comprennent le composant actif (1). Comme avec les sels décrits ci-

dessus, ces sels peuvent également être stoéchiométriquement neutres, toutes leurs fonctions acides étants salifiées ou ils peuvent être des sels ou des acides partiels et peuvent comprendre des sels mixtes

provenant de différentes bases.

L'acide hyaluronique ou ses fractions moléculaires en tant que composant (2) peuvent donc être remplacés par les sels avec des bases minérales, par exemple de métaux alcalins (sodium, potassium, lithium), de métaux alcalino-terreux (calcium, baryum, strontium), de magnésium,

d'aluminium, d'ammonium ou d'ammonium substitué. Ce principe est égale-

ment valide pour les sels d'acide partiels mentionnés ci-dessus dans lesquels tous les groupes acides présents peuvent être partiellement ou totalement neutralisés par les métaux mentionnés ci-dessus ou avec de l'ammonium ou avec des amines, les sels d'ammonium étant formés par réaction chimique entre l'acide hyaluronique et des radicaux primaire, secondaire ou tertiaire ou des radicaux d'hydroxyde d'ammonium ou de

composés ou médicaments présentant une activité pharmaceutique, c'est-

a-dire le composant (1).

Préparations de médicaments réunissant les composants (1) et (2): Il existe différentes possibilités de fabrication des médicaments selon la présente invention et ces moyens comprennent: a.- l'utilisation d'un dérivé actif, neutre ou acide, du composant (1) mélangé avec de l'acide hyaluronique ou avec une de ses fractions ou leurs sels métalliques; b.l'utilisation de sels partiels de HY avec un dérivé actif basique du composant (1), laissant les groupes acides résiduaires du HY libres ou neutralisés par les métaux ou bases mentionnés ci-dessus; c.l'utilisation de sels de HY stoéchiométriquement neutres avec un dérivé basique du composant (1), éventuellement additionné de HY ou d'un de ses sels de métaux partiel ou total (neutre); d.- l'utilisation de sels stoéchiométriquement neutres de HY avec un dérivé basique du composant (1) , additionné d'autres quantités de composant (1); et e.- l'utilisation à volonté de mélanges de sels ou des mélanges

décrits ci-dessus.

Une forme particulière de médicaments selon la présente invention

est représentée par des mélanges du dérivé ou de la substance pharmaco-

logiquement actif à base du composant (1), avec des acides hyaluroniques ou ses fractions moléculaires lorsque cette substance active (1) est de nature basique, par exemple dans le cas des antibiotiques basiques. Dans ce cas, l'acide hyaluronique, le composant (2) et le dérivé actif (1) forment, ensemble, des sels stoéchiométriquement partiels ou des sels d'acide dans lequel une partie aliquote de tous les acides groupes du composant (2) HY sont salifiés par les groupes basiques du composant actif (1); ou des sels stoéchiométriquement neutres dans lesquels tous les groupes du HY, composant (2), sont salifiés, ou des mélanges de ses sels neutres avec une quantité supplémentaire de substance basique (1).

Donc, aux fins de la présente invention, si l'on utilise une substance active basique (1), il est possible de remplacer les mélanges des composants (1) et (2) avec les sels des acides mentionnés ci-dessus ou ceux qui sont stoechiométriquement neutres, ou naturellement de mélanges de ses sels à la fois avec le composant {1) et avec le

composant (2).

Des mélanges de médicaments entre eux et, éventuellement, avec d'autres principes peuvent également être utilisés comme composant (1)

actif selon l'invention. Si, a la place d'une seule substance acti-

ve (1), on utilise des mélanges de substances actives telles que, par exemple, celles mentionnées ci-dessus, les sels des substances actives basiques et d'acide hyaluronique et de ses fractions moléculaires peuvent être des sels mixtes de une ou plusieurs de ces substances basiques ou, éventuellement, des sels mixtes de ce type avec un certain nombre d'autres groupes acides du HY polysaccharide salifié par les métaux ou bases mentionnés ci-dessus. Il est, par exemple, possible de

préparer des sels d'acide hyaluronique ou d'une de ses fractions molécu-

laires hyalastine ou hyalectine, avec un certain pourcentage de groupes acides salifiés avec l'antibiotique kanamycine, un autre pourcentage

salifié avec le vaso-constricteur phényléphrine, tandis qu'un pourcen-

tage restant des groupes acides sont libres ou salifiés par exemple avec du sodium ou un autre des métaux mentionnés ci-dessus. Il est également possible de mélanger ce type de sels mixtes avec d'autres quantités d'acide hyaluronique ou de ses fractions ou de sels métalliques comme indiqué pour le médicament contenant des sels d'une seule substance

active avec les polysaccharides acides mentionnés ci-dessus.

Il est donc possible, selon un aspect particulier de la présente

invention, d'utiliser les sels mentionnés ci-dessus, isolés et éven-

tuellement purifiés,à l'état anhydre solide sous la forme de poudre amorphe. Lorsque la poudre vient au contact du tissu à traiter, la poudre forme une solution aqueuse concentrée de caractère gélatineux ou de consistance visqueuse présentant des propriétés élastiques. Ces qualités se préservent également pour des dilutions plus fortes et on peut donc utiliser, au lieu des sels anhydres mentionnés ci-dessus, des solutions aqueuses A divers degrés de concentration ou en solution saline, éventuellement avec addition d'autres excipients ou additifs pharmaceutiquement acceptables, par exemple d'autres sels minéraux pour la régulation du pH et de la pression osmotique. Naturellement, il est également possible d'utiliser les sels pour préparer des gels, des inserts, des crèmes ou des onguents dans lesquels on utilise d'autres

excipients ou ingrédients de formulation conventionnelle de ces prépara-

tions pharmaceutiques. Selon un aspect particulier de l'invention, il y a une préférence pour les médicaments contenant de l'acide hyaluronique, ses fractions de divers poids moléculaires ou leurs sels minéraux ou leurs sels partiels ou neutres avec la substance active (1) comme seul

véhicule (à la possible exception d'un solvant aqueux).

Les rapports quantitatifs en poids des deux composants (1) et (2) selon l'invention peuvent varier dans de larges limites et ceci dépend, naturellement, également de la nature des deux composants et dans le premier cas de celui de la substance active. Ces limites sont, par exemple, des rapports de 0,01/1 et 100/1 entre les deux composants (1) et (2). L'intervalle de variation est cependant compris entre les limites de 0,01/1 et 10/1 pour les deux composants et, notaiient, entre

0,1/1 et 2/1.

Les médicaments selon l'invention peuvent se trouver sous forme solide, par exemple, de poudre lyophilisée contenant seulement les deux

composants en mélange ou emballés séparément.

Sous leur forme solide, ces médicaments forment, au contact de l'épithélium à traiter, des solutions plus ou moins concentrées selon la nature de l'épithélium traité et présentent les mêmes caractéristiques que les solutions emplyées jusqu'à présent, in vitro, ce qui représente un autre aspect particulièrement important de la présente invention. Ces solutions se préparent, de préférence, avec de l'eau distillée ou une solution saline stérile et ne contiennent, de préférence, par d'autres véhicules pharmaceutiques en dehors de l'acide hyaluronique ou de l'un de ses sels. Les concentrations de ces solutions peuvent aussi varier dans de larges limites, par exemple, entre 0,01 et 75% pour chacun des deux composants pris séparément et pour leurs mélanges ou leurs sels. Il existe une préférence particulière pour des solutions dont le caractère visco-élastique soit prononce, dont la teneur soit par exemple compris entre 10 et 90% du médicament ou de chacun de ses composants. Les médicaments de ce type sont particulièrement importants, à la fois sous leur forme anhydre (poudres lyophilisées), ou sous la forme de solutions concentrées ou diluées dans l'eau ou une solution saline, éventuellement avec addition d'un additif ou de substances auxiliaires, par exemple de substances désinfectantes particulières ou de sels minéraux agissant

comme tampons ou autres a usage ophtalmique.

Parmi les médicaments selon la présente invention, on doit choi-

sir, en particulier en tant que de besoin, ceux dont le degré d'acidité convient au lieu auquel on doit les appliquer, c'est-a-dire présentant un pH physiologiquement tolérable. L'ajustement du pH, par exemple des sels mentionnés ci-dessus d'acide hyaluronique avec une substance active

basique, peut s'effectuer par régulation de façon convenable des quanti-

tés de polysaccharides ou de ses sels et de la substance basique elle-

même. Ainsi, par exemple, si l'acidité d'un sel d'acide hyaluronique avec une substance basique devait être trop élevée, l'excès de groupe acide libre avec les bases mentionnées ci-dessus est neutralisé, par

exemple, avec de l'hydrate de sodium ou de potassium ou d'ammonium.

Les formulations suivants représentent des exemples de préparation

selon la présente invention et comprennent une association d'un compo-

sant (1) (pharmaceutiquement actif) et du composant véhicule (2) compre-

nant de l'acide hyaluronique.

Formulation 1 - gel contenant EGF dont 100 g contiennent: 20. sel de sodium de HY (fraction hyalastine)....... 55 g sel de sodium de HY (fraction hyalectine)....... 30 g EGF.....................................

...... 0,5 g eau deux fois distillée......................... 23,5 g..DTD: Formulation 2 - insert de 100 mg avec du nitrate de pilocarpine conte-

nant: sel de sodium de HY (fraction hyalastine)....... 100 mg nitrate de pilocarpine.......................... 2 mg

Formulation 3 - forme poudre contenant de la streptomycine pour applica-

tion topique 100 g de poudre contiennent: sel de sodium de HY (fraction hyalastine)....... 70 g sel de sodium de HY (fraction hyalectine)....... 28,5 g streptomycine................................... 1,5 g Formulation 4 - insert de 100 mg en présence de pilocarpine contenant: sel mixte d'acide hyaluronique avec la pilocarpine et avec le sodium (voir préparation dans l'ex. 18) 100 mg Formulation 5 - collyre contenant de la gentamycine et de la naphazoline dont 100 ml contiennent: ò sel mixte d'acide hyaluronique avec la gentamycine,

avec la naphazoline et avec le sodium (voir prépa-

ration dans l'exemple 16)....................... 2,910 g oxybenzoate de propyle.......................... 0,50 g À phosphate de sodium............

............... 1,500 g eau distillée, q.s. pour 100 ml Formulation 6 collyre contenant chloramphénicol, néomycine, phényléphrine, nitrofurazone dont 100 ml contiennent: sel mixte d'acide hyaluronique avec la neomycine,..DTD: avec la phényléphrine et avec le sodium (voir pré-

paration dans l'exemple 17)..................... 2,890 g 15. chloramphénicol................................. 0,500 g nitrofurazone....

............................. 0,02 g eau distillée, q.s. pour 100 ml..DTD: Formulation 7 - collyre contenant phosphate de dexaméthasone, kanamy-

cine E phénylephrine dont 100 ml contiennent: sel mixte d'acide hyaluronique avec la kanamycine et la phényléphrine (voir préparation dans l'exemple 15)................................... 3,060 g sel dexaméthasone phosphate de sodium............ 0,100 g 25. p- hydroxybenzoate de méthyle.................... 0,060 g eau distillée, q.s. pour 100 ml

METHODES DE PREPARATION

Méthode A La préparation des sels selon la présente invention peut se faire de façon connue en soi par mélange de solutions des suspensions dans l'eau ou dans des solvants organiques des deux composants (1) et (2) et, éventuellement de bases ou de sels basiques des métaux alcalins, métaux alcalino-terreux, magnésium, aluminium ou ammonium mentionnés ci- dessus en quantités calculées et en isolant les sels sous une forme anhydre amorphe selon les techniques connues. Il est possible, par exemple, de préparer tout d'abord une solution aqueuse des deux composants (1) et (2), de débarrasser ces composants des solutions aqueuses de leurs sels avec des acides des sels métalliques respectivement, par exemple sulfates dans le cas du composant (1) et ses sels de sodium dans le cas du composant (2) de traiter avec des échangeurs ioniques relatifs et de réunir les deux solutions à basse température, par exemple entre 0 et C. Si le sel ainsi obtenu est facilement soluble dans l'eau, on doit le lyophiliser, tandis que les sels qui ne sont pas facilement solubles peuvent être séparés par centrifugation, filtration ou décantation et, éventuellement être ensuite soumis a une dessication. Les exemples suivants sont donnés simplement à titre d'illustration de la méthode A selon la présente invention et ne doivent pas être considérés comme

limitatifs.

Exemple 1

Préparation du sel de l'acide hyaluronique (HY) avec la streptomycine 2, 43 g de sulfate de streptomycine (10 méq.) sont solubilisés dans

ml d'H20 distillée. La solution est éluée dans une colonne thermos-

tatique à 5 C contenant 15 ml de résine d'ammonium quaternaire (Dowex 1 x 8) sous sa forme OH-. L'éluat exempt de sulfate est recueilli dans un récipient thermostatique à 5 C. 4,0 g du sel de sodium de

l'acide hyaluronique présentant un poids moléculaire de 225.000 (corres-

pondant à 10 méq. d'une unité monomêre) sont solubilisés dans 400 ml

d'H20 distillée. La solution est alors éluée dans une colonne thermos-

tatique à 50 C contenant 15 ml de résine sulfonique (Dowex 50 x 8) sous sa forme H+. L'éluat, exempt de sodium, est recueilli sous agitation dans la solution de streptomycine base. La solution qui en résulte est congelée et instantanément lyophilisée. Dans le sel ainsi obtenu, tous

les groupes acides de l'acide hyaluronique sont salifiés par les fonc-

tions basiques de la streptomycine. Rendement 5,5 g.

Un dosage microbiologique du Bacillus subtilis ATCC 6633 comparé à une streptomycine standard montre une teneur de 33,8% en poids de

streptomycine base, ce qui correspond au poids théorique calculé.

Un dosage colorimétrique de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et col. (Anal. Biochem. 4, 330, 1962), montre une teneur en poids d'acide HY de 66,2% (pourcentage

théorique 66,0%).

Exemple 2

Préparation du sel de l'acide hyaluronique (HY) avec l'érythromycine 4,0 g du sel de sodium de l'acide hyaluronique dont le poids moléculaire est de 77.000 (correspondant à 10 méq. d'une unité monomère) sont solubilisés dans 400 ml d'H20 distillée. La solution est alors éluêe dans une colonne thermostatée a 5 C contenant 15 ml de résine sulfonique (Dowex 50 x 8) sous sa forme H+. L'éluat, exempt de sodium, est maintenu a une température de 5 Co 7,34 g d'érythromycine base (10 méq.) sont ajoutés à la solution de HY, sous agitation a 5 C, jusqu'à ce que l'on obtienne une solubilisation complète. La solution qui en résulte est congelée et lyophilisée. Dans le sel ainsi obtenu, tous les groupes acides de l'acide hyaluronique sont salifiés par

l'érythromycine. Rendement 10,8 g.

Un dosage microbiologique sur staphylococcus aureus ATCC 6538p, par comparaison avec l'érythromycine standard, montre une teneur de 66,0% en poids d'erythromycine base, ce qui correspond a la valeur théorique. Un dosage colorimétrique de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et col., montre une teneur en poids d'acide HY de 34,0%, ce qui correspond au pourcentage théorique calculé.

Exemple 3

Préparation du sel de l'acide hyaluroniue HY) avec la kanamycine 1,46 g de sulfate de dikanamycine (10 meq.) sont solubilisés dans 25 ml d'H20 distillée. La solution est alors élude dans une colonne thermostatique à 5 C contenant 15 ml de résine d'amgonium quaternaire (Dowex 1 x 8) sous sa forme OH-. L'éluat, exempt de sulfates, est recueilli dans un récipient thermostatique a 5 C. 4,0 g du sel de sodium de HY, dont le poids moléculaire moyen est de 165.000, correspondant a

10 méq. d'une unité monomère, sont solubilises dans 400 ml d'H20 distil-

lée. La solution est alors éluée dans une colonne thermostatique à 5 C

contenant 15 ml de résine sulfonique (Dowex 50 x 8), sous sa forme H+.

L'éluat, exempt de sodium, est recueilli sous agitation due a un Vortex dans la solution de kanamycine base. La solution qui en résulte est

instantanément congel e et lyophilisée. Rendement 4,8 g.

Dans le sel obtenu, tous les groupes acides du HY sont salifiés par la kanamycine. Un dosage microbiologique sur B. subtilis ATCC 6633, par comparaison avec la kanamycine standard, montre une teneur de 24,2% en poids de kanamycine base, ce qui correspond au pourcentage théorique

calculé.

Un dosage colorimétrique de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et Colo, montre une teneur en poids d'acide HY de 75,8%, ce qui correspond également à la teneur théorique.

Exemple 4

Préparation du sel de l'acide hyaluronique (HY) avec le néomycine 1,52 g de sulfate de néomycine (10 méq.) sont solubilisés dans ml d'H20 distillée et élués dans une colonne thermostatique a 5 C contenant 15 ml de résine d'ammonium quaternaire (Dowex 1 x 8) sous sa forme OH. L'éluat, exempt de sulfates, est recueilli dans un récipient thermostatique à 5 C, 4,0 g du sel de sodium de HY, dont le poids moléculaire moyen est de 170. 000, correspondant à 10 méq. d'une unité monomère, sont solubilisés dans 400 ml d'H20 distillée et élués dans une colonne thermostatique à 5 C contenant 15 mi de résine sulfonique

(Dowex 50 x 8), sous sa forme H+. L'éluat, exempt de sodium, est re-

cueilli sous agitation dans la solution de néomycine base. Le précipité

visco-élastique qui se forme est séparé par décantation et lyophilisé.

Rendement 4,76 g.

Dans le sel qui en résulte, tous les groupes acides du HY sont

salifiés par la néomycine. Un dosage microbiologique quantitatif effec-

tué sur S. aureus ATCC 6538p, par comparaison avec la néomycine stan-

dard, montre une teneur de 21,2% en poids de néomycine base, ce qui

correspond à la valeur théorique calculée.

Un dosage colorimétriquede l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et col., montre une teneur en

poids d'acide HY de 78,8% en poids.

Exemple 5

Préparation du sel de l'acide hyaluronique (HY) avec la gentamycine 1,45 g de sulfate de gentamycine (10 méq.) sont solubilisés dans

* ml d'H20 distillée. La solution est éluée dans une colonne thermos-

tatique à 5 C contenant 15 ml de résine d'ammonium quaternaire (Dowex 1 x 8) sous sa forme OH-. L'éluat, exempt de sulfates, est recueilli dans un récipient thermostatique a 5 C. 4,0 g du sel de sodium

de HY, dont le poids moléculaire est de 170.000, correspondant à 10 méq.

d'une unité monomère, sont solubilisés dans 400 ml d'H20 distillée. La solution est alors éluée dans une colonne thermostatique à 5 C contenant ml de résine sulfonique (Dowex 50 x 8), sous sa forme H+. L'Éluat, exempt de sodium, est recueilli sous agitation dans un vortex dans la solution de gentamycine base. Le précipité épais et très visqueux qui se

forme est séparé par décantation et lyophilisé. Rendement 4,65 g.

Dans le sel qui en résulte, tous les groupes acides du HY sont salifiés par la gentamycine. Un dosage microbiologique quantitatif

effectué sur S. épidermidus ATCC 12228, par comparaison avec la genta-

mycine standard, montre une teneur en poids de 20,0% de gentamycine

base, ce qui correspond à la teneur théorique.

Un dosage colorimétrique de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et col., montre une teneur en

poids d'acide HY de 80,0% en poids.

Exemple 6

Préparation du sel de l'acide hyaluronique (HY) avec l'amikacine 1,47 g d'amikacine base (10 méq.) sont solubilisés dans 100 ml d'H20 distillée à 5 C. 4,0 g du sel de sodium de HY, dont le poids

moléculaire est de 170.000, correspondant à 10 méq. d'une unité mono-

mère, sont solubilisés dans 400 ml d'H20 distillée. La solution est alors éluée dans une colonne thermostatique a 50C contenant 15 ml de résine sulfonique (Dowex 50 x 8), sous sa forme H+. L'éluat, exempt de sodium, est recueilli sous agitation dans un vortex dans la solution d'amikacine base. Le précipité épais et extrêmement visqueux qui se

forme est séparé par décantation et lyophilisé. Rendement 5,16 g.

Dans le sel qui en résulte, tous les groupes acides du HY sont salifiés par l'amikacine. Un dosage microbiologique quantitatif effectué sur S. aureus ATCC 29737, par comparaison avec l'amikacine standard,

montre une teneur en poids de 27,7% en amikacine base, ce qui corres-

pond à la teneur théorique.

Un dosage colorimétrique de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et col., montre une teneur en

poids d'acide HY de 72,3% en poids.

Exemple 7

Préparation du sel de l'acide hyaluronique (HY) avec la rolitétracycline 4,0 g de sel de sodium de HY, dont le poids moléculaire moyen est

de 170.000, correspondant à 10 méq. d'une unité monomère, sont solubi-

lisés dans 400 ml d'H20 distillée. La solution est alors éluêe dans une colonne thermostatique à 5 C contenant 15 ml de résine sulfonique (Dowex 50 x 8), sous sa forme H+. L'éluat, exempt de sodium est maintenu a une température de 5 C. 5,3 g de rolitétracycline base (10 méq.) sont ajoutés à la solution d'acide HY sous agitation 5 0C à l'écart de la lumière jusqu'à ce que l'on obtienne une solubilisation complète. La

solution ainsi obtenue est instantanément congelée et lyophilisée.

Rendement 8,9 g.

Dans le sel qui en résulte, tous les groupes acides du HY sont salifiés par la rolitétracycline. Un dosage microbiologique quantitatif

effectué sur S. pumilus ATCC 14884, par comparaison avec la rolitétra-

cycline standard, montre une teneur en poids de 52,0% de rolitétracy-

cline base, ce.qui correspond à la teneur théorique. Un dosage colorimétrique de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et col., montre une teneur en

poids d'acide HY de 41,8% en poids.

Exemple 8

Préparation du sel de l'acide hyaluronique (HY) avec la polymyxine B 2,4 g de polymyxine B base (10.méq.) sont mis en suspension dans ml d'H20 distillée à 5 C. 4,0 g du sel de sodium du HY, dont le poids moléculaire moyen est de 170.000, correspondant à 10 méq. d'une

unité monomère, sont solubilisés dans 400 ml d'H20 distillée. La solu-

tion est alors éluée dans une colonne thermostatique à 5 C contenant ml de résine sulfonique (Dowex 50 x 8), sous sa formesH+. L'éluat, exempt de sodium, est recueilli sous agitation vigoureuse dans la solution de polymyxine base à 5 C. Apres une phase initiale pendant laquelle la solution devient claire, il y a formation progressive d'un produit difficilement soluble qui précipite complètement par addition de 5 volumes d'acétone. Le précipité est filtré, lavé à l'acétone et

ensuite séché sous vide. Rendement 6,05 g.

Dans le sel qui en résulte, tous les groupes acides du HY sont salifiés par la polymyxine B. Un dosage microbiologique quantitatif effectué sur S. bronchiseptica ATCC 4617, par comparaison avec la

polymyxine B standard, montre une teneur en poids de 38,7% de poly-

myxine B base, ce qui correspond à la valeur théorique.

Un dosage colorimétrique de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et col., montre une teneur en

poids d'acide HY de 61,3% en poids.

Exemple 9

Préparation du sel d'acide hyaluronique (HY) avec la gramicidine S 6,7 g de chlorhydrate de gramicidine S (10 méq.) sont mis en suspension dans 200 ml d'un mélange éthanol/H20 (80/20). La solution est alors éluée dans une colonne thermostatique à 5 C contenant 15 ml de résine quaternaire (Dowex 50 x 8), sous sa forme H+. 4,0 g de sel de sodium de HY, ayant un poids moléculaire moyen de 165.000, correspondant à 10 méq. d'une unité monomére, sont solubilisés dans 400 ml d'H20 distillée. La solution est alors éluée dans une colonne thermostatique à OC contenant 15 ml de résine sulfonique (Dowex 50 x 8) sous sa forme H. ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) sont ajoutés à l'éluat, exempt de sodium, et on maintient le mélange sous agitation A 5 C. La solution de gramicidine base est alors lentement ajoutée. La solution qui en résulte est précipitée à l'aide de 10 volumes d'acétone. On filtre le

précipité, on lave à l'acétone et on sèche sous vide. Rendement 9,55 g.

Dans le sel qui en rêsulte, tous les groupes acides du HY sont salifiés par la gramicidine S. Un dosage microbiologique quantitatif

effectué sur S. faecium ATCC 10541, par comparaison avec une gramici-

dine S standard, montre une teneur en poids de 60,0% de gramicidine S

base, ce qui correspond à la valeur théorique.

Un dosage colorimétrique de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et col., montre une teneur en

poids d'acide MY de 40,0% en poids.

Exemple 10

Préparation du sel de l'acide hyaluronique (MY) avec la naphazoline De la naphazoline base pure est préparée de la façon suivante: 4,94 g de naphazoline-HC1 (20 mmoles) sont solubilisés dans 100 ml d'H20 distillée à 5 C. 20 ml de NH40H (5 moles) sont ajoutés et on extrait, deux fois, avec 100 ml d'acétate d'éthyle. Les couches organiques sont extraites deux fois avec 50 ml d'H20, on les remélange et on déshydrate avec Na2SO4 anhydre. La solution est concentrée à environ 50 ml et on la place, ensuite, dans un congélateur pour la faire cristalliser. Le produit cristallisé est filtré, lavé à l'acétate d'éthyle et séché sous

vide. Rendement 4,0 g de naphazoline base pure.

4,0 g du sel de sodium de MY, d'un poids moléculaire moyen de 625.000, correspondant à 10 méq. d'une unité monomère, sont solubilisés dans 400 ml d'H20 distillée et élués dans une colonne thermostatique à C contenant 15 ml de résine sulfonique (Dowex 50 x 8) sous sa forme H+. L'éluat, exempt de sodium, est maintenu a une température de 50C. On ajoute 2,1 g de naphazoline base (10 mêq.) à la solution d'acide d'HY et

on agite le mélange à 50C jusqu'à ce que l'on obtienne une solubilisa-

tion complète. Le mélange qui en résulte est instantanément congelé et

lyophilisé. Rendement 5,72 g.

Dans le sel qui en résulte, tous les groupes acides du HY sont salifiés par la naphazoline. Un dosage spectrophotométrique quantitatif effectué par comparaison avec une naphazoline standard (USP) montre une teneur de 35,7% en poids de naphazoline base, ce qui correspond a la

valeur théorique.

Un dosage colorimétrique de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et col., montre une teneur en

poids d'acide HY de 64,3% en poids.

Exemple 11

Préparation du sel de l'acide hyaluronique (HY) avec la phényléphrine 2, 04 g de L-phénylêphrine-HCl (10 meq.) sont solubilisés dans

25 ml d'H20 distillée. La solution est éluée dans une colonne thermo-

statique à 5 C contenant 15 ml de résine d'ammonium quaternaire (Dowex 1 x 8) sous sa forme OH-. L'éluat, exempt de chlorure, est

recueilli dans un récipient thermostatique à 5 C.

4,0 g du sel de sodium de HY, d'un poids moléculaire de 820.000, correspondant à 10 méq. d'une unité monomère, sont solubilisés dans 400 ml d'H20 distillée. La solution est alors éluée dans une colonne thermostatique à 5 C contenant 15 ml de résine sulfonique (Dowex 50 x 8)

sous sa forme H+. L'éluat, exempt de sodium, est recueilli sous agita-

tion dans la solution de phénylêphrine base, le mélange qui en résulte

est instantanément et lyophilisé. Rendement 5,25 g.

Dans le sel qui en résulte, tous les groupes acides du HY sont

salifiés par la phénylephrine. Un dosage spectrophotométrique U.V.

utilisant la méthode d'addition standard (USP) montre une teneur de ,6% en poids de phénylephrine base, ce qui correspond à la valeur

théorique.

Un dosage colorimétrique de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et col., montre une teneur en

poids d'acide HY de 69,4% en poids.

Exemple 12

Préparation du sel de l'acide hyaluronique (HY) avec l'atropine 4,0 g du sel de sodium de HY, d'un poids moléculaire moyen de

1.300.000, correspondant à 10 méq. d'une unité monomère, sont solubi-

lisés dans 400 ml d'H20 distillée. La solution est alors éluee dans une

colonne thermostatique à 5 C contenant 15 ml de résine sulfo-

nique (Dowex 50 x 8) sous sa forme H+. L'éluat, exempt de sodium, est maintenu à une température de 5 C. 2,89 g d'atropine base (10 méq.) sont ajoutés à la solution d'HY et le mélange est agité à 5 C. Le mélange qui

en résulte est congelé et lyophilisé. Rendement 6,5 g.

Dans le sel qui en résulte, tous les groupes de l'acide hyaluro-

nique sont salifiés par l'atropine. Une détermination pendant un dosage par chromatographie en phase gazeuse (USP) effectué par comparaison avec une atropine standard, montre une teneur de 43,3% en poids d'atropine base, ce qui correspond à la valeur théorique. Un dosage colorimétrique de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et col., montre une teneur en

poids d'acide HY de 56,7% en poids.

Exemple 13

Préparation du sel de l'acide hyaluronique (HY) avec la pilocarpine 2,45 g de chlorhydrate de pilocarpine (10 méq.) sont solubilisés dans 50 ml d'H20 distillée. La solution est 1luée dans une colonne thermostatique à 5 C contenant 15 ml de résine d'ammonium quaternaire (Dowex lx 8), dans sa forme OH-. L'éluat, exempt de chlorure, est recueilli dans un récipient thermostatique à 5 C. 4,0 g de sel de sodium de HY d'un poids moléculaire de 170.000, correspondant a 10 méq. d'une

unité monomère, sont solubilisés dans 400 ml d'H20 distillée. La solu-

tion est alors éluée dans une colonne thermostatique à 5 C contenant ml de résine sulfonique (Dowex 50 x 8) sous sa forme H+. L'éluat, exempt desodium, est recueilli, sous agitation, dans la solution de pilocarpine base. La solution ainsi obtenue est instantanément congelée

et lyophilisée. Rendement 5,25 g.

Dans le sel qui en résulte, tous les groupes acides du HY sont salifiés par la pilocarpine. Un dosage spectrométrique selon la méthode USP et effectué en comparaison avec une pilocarpine standard, indique une teneur de 35,1% en poids de pilocarpine base, ce qui correspond à la

valeur théorique.

Un dosage colorimétrique de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et col., montre une teneur en

poids d'acide HY de 64,6% en poids.

Exemple 14

Préparation du sel de l'acide hyaluronique (HY) avec la néomycine et avec la polymyxine 4,0 g de sel de sodium HY, d'un poids moléculaire de 170. 000, correspondant à 10 méq. d'une unité monomère, sont solubilisés dans

400 ml d'H20 distillée. La solution est 1luée dans une colonne thermo-

statique à 5 C contenant 15 ml de résine sulfonique (Dowex 50 x 8) sous sa forme H+. L'éluat, exempt de sodium, est recueilli, dans un récipient thermostatique à 5oC. 0,150 g de polymyxine B base (0,63 meq.) sont ajoutés sous agitation vigoureuse. 1,425 g de sulfate de néomycine (9,37 méq.) sont solubilisés dans 25 ml d'H20 distillée. La solution est éluee dans une colonne thermostatique à 5 C contenant 15 ml de résine d'ammonium quaternaire (Dowex i x 8) sous sa forme OH-. L'éluat, exempt de sulfates, est recueilli sous agitation vigoureuse dans la solution d'acide HY et de polymyxine B. Le précipité qui se forme est séparé par centrifugation et séché sous vide; il n'y a pas de perte du produit dans

la solution résiduaire. Rendement 4,85 g.

17,25 mg de ce produit contiennent: néomycine égale à 5,0 mg de sulfate de neomycine;

polymyxine égale à 0,63 mg (5000 UI) de sulfate de polymyxine.

Ces dosages sont effectués après séparation par HPLC (chromatographie en

phase liquide à haute pression) des deux principes actifs.

Exemple 15

Préparation du sel mixte d'acide hyaluronique (HY) avec la kanamycine et avec la phénylephrine 4,0 g de sel de sodium HY, d'un poids moléculaire de 65.000, correspondant a 10 méq. d'une unité monomère, sont solubilisés dans 400 ml d'H20 distillée. La solution est alors éluée dans une colonne thermostatique a 5 C contenant 15 ml de résine sulfonique (Dowex 50 x 8) sous sa forme H+. L'éluat, exempt de sodium, est recueilli, dans un récipient thermostatique à 5 C. 0,85 g de sulfate de kanamycine (5,82 méq. ) sont solubilises dans 10 ml d'H20 distillée. La solution est éluee dans une colonne thermostatique à 5 C contenant 10 ml de résine

d'ammonium quaternaire (Dowex 1 x 8) sous sa forme OH-.

L'éluat, exempt de sulfates, est recueilli dans un récipient maintenu à une température de 5 C. La base phénylephrine est préparée par dissolution de chlorhydrate de phényléphrine dans H20 distillée à 5 C à 100 mg/ml et l'on ajoute du NH40H (6N) jusqu'à ce que l'on

obtienne une précipitation complète. Le précipité est séparé par filtra-

tion, lavé avec H20 distillée jusqu'à disparition des chlorures de l'eau de lavage et on sèche ensuite sous vide. Les solutions d'acide HY et de

kanamycine base sont mélangées et maintenues à une température de 5 C.

699 mg de phényléphrine base (4,18 méq.) sont ajoutés sous agitation jusqu'à ce que la dissolution soit complète. La solution qui en résulte

est congelée et lyophilisée. Rendement 5,1 g.

Un dosage microbiologique sur B subtilis ATCC 6633, par comparai-

son avec une kanamycine standard, indique une teneur de 13,55% en poids de kanamycine base. Un dosage spectrophotométrique U.V., utilisant la méthode d'addition standard USP, indique une teneur de 13,45% en poids de phényléphrine base. Un dosage colorimêtrique de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et col., montre une teneur en

poids d'acide HY de 73,0% en poids.

Exemple 16

Préparation d'un sel mixte d'acide hyaluronique (HY) avec la gentamy-

cine, avec la naphazoline et avec le sodium 4,0 g de sel de sodium HY, d'un poids moléculaire de 50.000, correspondant a 10 méq. d'une unité monomère, sont solubilisés dans 400 ml d'H20 distillée. La solution est alors élude dans une colonne thermostatique à 5 C contenant 15 ml de résine sulfonique (Dowex 50 x 8) sous sa forme H+. L'éluat, exempt de sodium, est recueilli, dans un récipient thermostatique a 5 C. 1,245 g de sulfate de gentamycine (8,59 méq.) sont solubilisés dans 25 ml d'H20 distillée. La solution est éluée dans une colonne thermostatique a 5 C contenant 12 ml de résine

d'ammonium quaternaire (Dowex 1 x 8) sous sa forme OH.

L'@luat, exempt de sulfates, est recueilli dans un récipient maintenu à une température de 5 C. La naphazoline base pure est préparée en présence chlorhydrate de naphazoline dissout dans H20 distillée a 5 C a une concentration de 50 mg/ml, on ajoute du NH40H (5 moles) jusqu'à ce que l'on arrive a pH 12 et l'on extrait la solution deux fois avec de l'acétate d'éthyle. Les couches organiques sont lavées avec H20 et on déshydrate sur Na2SO4 anhydre. Le produit est placé dans un congélateur pour le faire cristalliser et l'on filtre le précipité, on lave à l'acétate d'éthyle et on le sèche sous vide. 2,5 g de sels de sodium HY et 0,297 g de naphazoline base sont ajoutés à l'acide HY (1,41 méq.) et on agite jusqu'à ce qu'il y ait solubilisation complète. On ajoute alors la solution de gentamycine base, on homogénéise et ensuite on congèle et

on lyophilise. Rendement 7,35 g.

Un dosage microbiologique quantitatif sur B épidermidus ATCC 12228, par comparaison avec une gentamycine standard, indique une teneur de

11,1% en poids de gentamycine base. Une détermination spectrophotomé-

trique quantitative, effectuée par comparaison avec une naphazoline

standard (USP), indique une teneur de 4,0% en poids de naphazoline base.

Une détermination colorimétrique de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et col., montre une

teneur en poids d'acide HY de 83,0% en poids.

Exemple 17

Préparation du sel mixte de l'acide hyaluronique (HY) avec la néomycine, avec la phényléphrine et avec le sodium 4,0 g de sel de sodium HY, d'un poids moléculaire de 65.000, correspondant à 10 méq. d'une unité monomère, sont solubilisés dans 400 ml d'H20 distillée. La solution est alors éluée dans une colonne thermostatique 3 5 C contenant 15 ml de résine sulfonique (Dowex 50 x 8) sous sa forme H+. L'éluat, exempt de sodium, est recueilli, dans un récipient thermostatique à 5 C. 1,28 g de sulfate de néomycine (8,42 méq.) sont solubilisés dans 25 ml d'H20 distillée. La solution est éluée dans une colonne thermostatique à 50C contenant 12 ml de résine d'ammonium

quaternaire (Dowex 1 x 8) sous sa forme OH-.

L'éluat, exempt de sulfates, est recueilli dans un récipient maintenu a une température de 50C. La phényléphrine base est préparée par dissolution de chlorhydrate de phényléphrine dans H20 distillée a mg/ml et addition de NH40H (6N) jusqu'a ce que l'on obtienne une précipitation complète. Le précipité est séparé par filtration, on lave avec H20 distillée jusqu'à ce qu'il y ait disparition des chlorures dans

l'eau de lavage et, ensuite, on sAche sous vide.

2,5 g de sels de sodium de HY et 0,266 g de phényléphrine base (1,58 méq.) sont ajoutés à une solution d'acide HY et on agite jusqu'à ce qu'il y ait solubilisation complète. On ajoute alors la solution de

néomycine base et, après homogénéisation, on congèle et on lyophilise.

Rendement 7,35 g.

Une détermination spectrophotométrique par U.V., utilisant la méthode d'addition standard (USP), indique une teneur de 3,57% en poids de phényléphrine base. Une détermination microbiologique quantitative sur B aureus ATCC 6538p, par comparaison avec une néomycine standard,

indique une teneur de 11,64% en poids de néomycine base.

Une détermination colorimétrique de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et col., montre une

teneur en poids d'acide HY de 82,8% en poids.

Exemple 18

Préparation du sel d'acide hyaluronique (HY) avec la pilocarpine et avec le sodium 98,31 g de sel de sodium HY, d'un poids moléculaire de 170.000, correspondant à 245 méq. d'une unité monomère, sont solubilisés dans

8,5 1 d'H20 distillée.

La solution est alors éluée dans une colonne thermostatique à 5 C

contenant 300 ml de résine sulfonique (Dowex 50 x 8) sous sa forme H+.

L'éluat, exempt de sodium, est recueilli, dans un récipient thermo-

statique à 5 C.

2,34 g de de chlorhydrate de pilocarpine (9,6 mrq.) sont solubi-

lisés dans 50 ml d'HO20 distillée. La solution est éluée dans une colonne thermostatique à 5 C contenant 15 ml de résine d'ammonium quaternaire

(Dowex 1 x 8) sous sa forme OH-.

L'éluat, exempt de chlorures, est recueilli sous agitation dans la solution d'acide HY. On ajoute, lentement, 235,4 ml d'une solution d'hydroxyde de sodium (1M) sous agitation. La solution ainsi obtenue est

instantanément congelée et lyophilisée. Rendement 99,8 g.

mg de produit contiennent 2 mg de pilocarpine sous sa forme de

base.

Exemple 19

Préparation du sel de l'acide hyaluronique (HY) avec la streptomycine et avec le sodium 98,68 g de sel de sodium HY, d'un poids moléculaire de 255. 000, correspondant à 246 méq. d'une unité monomère, sont solubilisés dans 8,5 1 d'H20 distillée. La solution est alors éluée dans une colonne thermostatique à 5 C contenant 300 ml de résine sulfonique (powex 50 x 8) sous sa forme H+. L'éluat, exempt de sodium, est recueilli, dans un

récipient thermostatique à 5 C.

1,88 g de sulfate de streptomycine (7,74 méq.) sont solubilisés dans 20 ml d'H20 distillée. La solution est éluée dans une colonne thermostatique à 5 C contenant 12 ml de résine d'ammonium quaternaire

(Dowex i x 8) sous sa forme OH-.

L'éluat, exempt de sulfates, est recueilli sous agitation dans la solution d'acide HY. 238,3 ml d'une solution de NaOH (1M) sont ajoutés,

lentement, sous agitation et la solution qui en résulte est instantané-

ment congelée et lyophilisée. Rendement 99,8 g.

g du produit contiennent 1,5 g de streptomycine sous sa forme

de base.

Exemple 20

Méthode d'obtention d'un mélange des fractions hyalastine et hyalectine ne présentant pas d'activité inflanmmatoire Des crêtes de coqs, fralches ou congelées (3 000 g) sont émincées dans un hachoir a viande et on les homogénéise ensuite, soigneusement, dans un homogéneiseur mécanique. La pâte ainsi obtenue est alors traitée dans un récipient en acier inoxydable (AISI 316) ou en verre, par volumes d'acétone anhydre. On agite alors l'ensemble pendant six heures à une vitesse de 50 tr/mn. On laisse la séparation s'opérer

pendant douze heures, ce après quoi, on élimine l'acétone par siphon-

nage. On répète l'extraction à l'acétone jusqu'à ce que l'acétone

éliminée atteigne le degré souhaité d'humidité (méthode de Karl-

Fischer). L'ensemble est alors centrifugé et séché sous vide a une température convenable pendant cinq a huit heures. On obtient ainsi 500

à 600 g de poudre sèche de crêtes de coqs.

300 g de poudre sèche sont exposés a une digestion enzymatique par la papaYne (0,2 g) dans des conditions aqueuses et on tamponne, avec un tampon à base de phosphate, en présence d'une quantité convenable de

chlorhydrate de cystéine.

Le mélange qui en résulte est agité pendant vingt-quatre heures a tr/mn, la température étant maintenue à 60 a 65 C. On refroidit alors d 25 C et on ajoute de la Célite (60 g) en maintenant l'agitation pendant encore une heure. Le mélange ainsi obtenu est filtré jusqu'a ce que l'on obtienne un liquide clair. On fait alors subir au liquide clair une ultrafiltration moléculaire en utilisation des membranes dont la limite d'exclusion de poids moléculaire est de 30.000 en vue de retenir, sur la membrane, les molécules dont le poids moléculaire est supérieur à

30.000.

Le produit est ultrafiltré a partir de 5 a 6 volumes initiaux en ajoutant, continuellement, de l'eau distillée au produit pendant le processus d'ultrafiltration. On cesse l'addition d'eau et l'on poursuit l'ultrafiltration jusqu'à ce que le volume soit réduit au tiers du volume initial. Le liquide résiduaire est rendu 0,1M par addition de chlorure de sodium et l'on porte la température à 50 C. Sous agitation à 60 tr/mn, on ajoute 45 g de chlorure de cétylpyridine. La solution est agitée pendant soixante minutes et l'on ajoute, ensuite, 50 g de Célite . Sous agitation, on porte la température de l'ensemble à 25 C et l'on recueille le précipité qui s'est formé par centrifugation. Le précipité obtenu est mis en suspension dans une solution O,01M dans du chlorure de

sodium (5 1) contenant 0,05% de chlorure de cêtylpyridinium. La suspen-

sion qui en résulte est agitée pendant soixante minutes à 50 C. La température est alors portée à 25 C et l'on centrifuge le précipité. On répète l'opération de lavage trois fois, ce après quoi on recueille le précipité dans un récipient o se trouve 3 litres d'une solution O,05M de chlorure de sodium contenant 0,05% de chlorure de cétylpyridine. On

agite à 60 tr/mn pendant soixante minutes et l'on maintient la tempéra-

ture constante à 25 C pendant deux heures. Ce qui surnage est éliminé par centrifugation. On répète le mode opératoire plusieurs fois avec des solutions de chlorure de sodium 0,1M contenant 0,05% de chlorure de

cétylpyridinium. On centrifuge le mélange et on rejette ce qui surnage.

On disperse le précipité dans une solution de chlorure de sodium 0,30M contenant 0,05% de chlorure de cétylpyridinium (3 litres). On agite le

mélange et l'on recueille, a la fois, le précipité et le liquide clair.

On répète l'extraction encore trois fois sur le précipité en utilisant,

chaque fois, 0,5 litre de la même solution aqueuse.

Finalement, le résidu qui s'est précipité est éliminé et les liquides clairs sont tous places ensemble dans un seul récipient. La température du liquide est amenée a 50 C tandis que l'on maintient une agitation constante. On amène le liquide alors à 0,23M avec du chlorure de sodium. On ajoute 1 g de chlorure de cétylpyridinium et le liquide est maintenu sous agitation pendant douze heures. On refroidit le mélange à 25 C et on le filtre ensuite, tout d'abord, sur un garnissage de Célite et, ensuite, a travers un filtre. On lui fait alors subir une ultrafiltration moléculaire sur une membrane dont la limite d'exclusion de poids moléculaire est de 30.000, en ultrafiltrant 3 volumes initiaux avec addition d'une solution de chlorure de sodium 0,33M4. On interrompt l'addition de la solution de chlorure de sodium et le volume est réduit au quart du volume initial. La solution ainsi concentrée est précipitée sous agitation (60 tr/mn) à 25 C avec trois volumes d'éthanol (95%). On

recueille le précipité par centrifugation et on rejette ce qui surnage.

Le précipité est dissous dans un litre d'une solution 0,1M de chlorure de sodium et l'on répète la précipitation avec 3 volumes d'éthanol à

95%. Le précipité est recueilli et on lave tout d'abord avec de l'étha-

nol (75%) trois fois et, ensuite, avec de l'éthanol absolu (trois fois) et finalement avec de l'acétone absolu (trois fois). Le produit ainsi

obtenu (fraction de hyalastine + hyalectine) présente un poids molécu-

laire moyen compris entre 250.000 et 350.000. Le rendement en HY est

égal àa 0,6% en poids du tissu original frais.

Exemple 21

Méthode d'obtention de la fraction hyalastine à partir du mélange obtenu par la méthode décrite dans l'Exemple 20 Le mélange obtenu par la méthode décrite dans l'Exemple 20 est dissous dans de l'eau bidistillée apyrogène au taux de 10 mg de produit

par ml d'eau. La solution obtenue est exposée à une filtration molécu-

laire à travers des membranes filtrantes dont la limite d'exclusion de

poids moléculaire est de 200.000, ce que l'on fait suivre d'une tech-

nique de concentration sur la membrane sans addition d'eau. Pendant le processus d'ultra-filtration a travers les membranes dont la limite d'exclusion de poids moléculaire est de 200.000, les molécules dont le poids moléculaire est supérieur à 200.000 ne passent pas tandis que les

molécules plus petites traversent la membrane en même temps que l'eau.

Pendant le processus de filtration, on n'ajoute pas d'eau, de telle sorte que le volume diminue et qu'il y a donc une augmentation de la concentration des molécules dont le poids moléculaire est supérieur à 200. 000. Le produit est ultrafiltré jusqu'à ce que le volume au-dessus de la membrane soit réduit à 10% du volume initial. Deux volumes d'eau apyrogène bidistillee sont ajoutés et la solution est alors ultrafiltrée à nouveau jusqu'a ce que le volume soit réduit au tiers. On répète l'opération encore deux fois supplémentaires. La solution qui a traversé la membrane est portée à 0,1M avec du chlorure de sodium et on précipite, ensuite, avec 4 volumes d'éthanol à 95%. On lave le précipité trois fois

avec de l'éthanol (75%) et on sèche ensuite sous vide.

Le produit ainsi obtenu (fraction hyalastine) a un poids molécu-

laire entre 50.000 et 100.000. Le rendement en HY est égal à 0,4% en

poids des tissus frais initiaux.

Exemple 22

Méthode d'obtention de la fraction hyalectine La solution concentrée recueillie dans le récipient au-dessus de la membrane d'ultrafiltration dont le poids d'exclusion moléculaire est de 200.000, comme dans l'exemple 21, est diluée avec de l'eau jusqu'à ce que l'on obtienne une solution contenant 5 mg/ml d'acide hyaluronique comme ceci est déterminé par de analyses quantitatives basées sur le dosage de l'acide glucuronique. On amène la solution à O,1M dans une solution de chlorure de sodium aqueux et on précipite ensuite avec 4 volumes d'éthanol à 95%. Le précipité est lavé trois fois -avec de

l'éthanol à 75% et on sèche ensuite sous vide.

Le produit ainsi obtenu (fraction hyalectine) a un poids molécu-

laire entre 500.000 et 730.000. Ceci correspond à une fraction spéci-

fique d'acide hyaluronique ayant une longueur définie de chaîne molécu-

laire d'environ 2.500 à 3.500 motifs saccharides avec un degré de pureté élevé.

Le rendement en HY est égal à 0,2% en poids du tissu frais ini-

tial.

METHODE B

L'invention concerne également un nouveau mode opératoire de préparation des sels d'acide hyaluronique en partant du sel de baryum de l'acide hyaluronique. Ce nouveau mode opératoire concerne les sels qui

sont solubles dans l'eau et, en particulier, les sels d'acide hyaluro-

nique avec des substances actives dans lesquelles tous les groupes carboxyliques de l'acide hyaluronique peuvent être salifiés ou seulement une partie de ces groupes sont salifiés. Dans les sels partiels, les groupes carboxyliques restants de l'acide hyaluronique peuvent être libre ou salifiés avec d'autres substances actives ou avec des métaux alcalins, du magnésium, de l'aluminium, de l'ammonium ou de l'ammonium substitué. Le nouveau mode opératoire consiste à préparer une solution aqueuse du sel de baryum d'un acide hyaluronique eta ajouter une solution aqueuse contenant un certain nombre d'équivalents d'acide sulfurique, totalement ou partiellement salifiés par une ou plusieurs bases organiques ou minérales; dans lequel le nombre d'équivalents sulfuriques correspond au nombre d'équivalents acide hyaluronique présents dans la solution aqueuse de sels de baryum. La solution aqueuse de sels d'acide hyaluronique s'obtient par filtration du sulfate de baryum séparé. C'est-à-dire que, par filtration du sulfate de baryum séparé, il est possible d'obtenir la solution aqueuse du sel d'acide hyaluronique à partir duquel le sel, sous sa forme sèche, peut s'obtenir

par concentration.

Le sel de baryum de l'acide hyaluronique n'est pas décrit dans la littérature et il s'est avéré, de façon surprenante, être soluble dans

l'eau. On peut facilement préparer en traitant le hyaluronate de cétyl-

pyridinium qui n'est pas très soluble avec une solution aqueuse de

32 2579895

chlorure de baryum et en précipitant de la solution, le hyaluronate de

baryum par de l'éthanol ou par un autre solvant convenable. Le hyalu-

ronate de cétylpyridinium est un intermédiaire communément utilisé dans les modes opératoires de préparation d'acide hyaluronique pour séparer et purifier l'acide hyaluronique extrait de divers produits organiques. La solution aqueuse contenant un certain nombre d'équivalents d'acide sulfurique, totalement ou partiellement salifiés par une ou plusieurs bases organiques, est préparée par dissolution dans l'eau des sulfates neutres ou des bases et, éventuellement, par addition d'acide sulfurique. Si l'on a une solution formée de sulfates neutres d'une ou

de plusieurs bases organique sou minérales, contenant un nombre d'équi-

valents sulfuriques correspondant au nombre d'équivalents d'acide hyaluronique présents dans la solution aqueuse de sels de baryum, le

résultat final sera un sel stoéchiométriquement neutre d'acide hyalu-

ronique avec les bases présentes dans la solution aqueuse correspondante (sulfates). Si l'on souhaite un sel stoéchiométriquement partiel ou un sel d'acide d'acide hyaluronique, il faut ajouter de l'acide sulfurique à la solution aqueuse de sulfates ou l'on doit utiliser des sulfates

acides basiques.

La méthode B, selon l'invention, est illustrée par les exemples suivants:

Exemple 23

Méthode d'obtention d'un mélange de fractions de hyalastine et hyalec-

tine sous la forme de sels de baryum et ne présentant aucune activité inflammatoire Des crêtes de coqs, fraîches ou congelées (3 000 g) sont émincées dans un hachoir à viande et on les homogénéise ensuite, soigneusement, dans un homogénéiseur mécanique. La p&te ainsi obtenue est alors traitée dans un récipient en acier inoxydable (AISI 316) ou en verre, par 10 volumes d'acétone anhydre. On agite alors l'ensemble pendant six heures à une vitesse de 50 tr/mn. On laisse la séparation s'opérer pendant douze heures, ce après quoi, on élimine l'acétone par siphonnage. On répète l'extraction à l'acétone jusqu'à ce que l'acétone

éliminée atteigne le degré souhaité d'humidité (méthode de Karl-

Fischer). L'ensemble est alors centrifugé et séché sous vide à une température convenable pendant cinq à huit heures. On obtient ainsi 500

a 600 g de poudre sèche de crêtes de coqs.

300 g de poudre sèche sont exposés à une digestion enzymatique par la papaine (0,2 g) dans des conditions aqueuses et on tamponne, avec un tampon à base de phosphate, en présence d'une quantité convenable de chlorhydrate de cystéine. On agite pendant vingt-quatre heures le produit qui en résulte à une vitesse de 60 tr/mn, la température étant maintenue a 60 à 65 Co On refroidit alors à 25 C et on ajoute de la Célitee (60 g) en maintenant l'agitation pendant encore une heure. Le mélange ainsi obtenu est filtré jusqu'à ce que l'on obtienne un liquide

clair. On fait alors subir au liquide clair une ultrafiltration molëcu-

laire en utilisation des membranes dont la limite d'exclusion de poids moléculaire est de 30.000. Entre 5 et 6 volumes initiaux du produit sont ultrafiltrés en ajoutant, continuellement, de l'eau distillée au produit pendant le processus d'ultra-filtration. On cesse l'addition d'eau et l'on poursuit l'ultra-filtration jusqu'à ce que le volume ait été réduit

au tiers du volume initial.

* Le liquide résiduaire est rendu 0,1M par addition de chlorure de baryum et l'on porte la température a 50 C. Sous agitation à 60 tr/mn, on ajoute 45 g de chlorure de cétylpyridinium. La solution est agitée pendant soixante minutes et l'on ajoute, ensuite, 50 g de Célite . Sous

agitation, on porte la température de l'ensemble à 25 C et l'on recueil-

le le précipité qui s'est formé par centrifugation. Le précipité obtenu est mis en suspension dans une solution,01M dans du chlorure de baryum (5 1) contenant 0,05% de chlorure de cêtylpyridinium. La suspension qui en résulte est agitée pendant soixante minutes à 50 C. La température est alors portée A 25 C et l'on centrifuge le précipité. On répète

l'opération de lavage trois fois, ce après quoi on recueille le préci-

pité dans un récipient o se trouve 3 litres d'une solution 0,05M de chlorure de baryum contenant 0,05% de chlorure de cêtylpyridinium. La suspension qui en résulte est agitée a 60 tr/mn pendant soixante minutes

et l'on maintient la température constante à 25 C pendant deux heures.

Ce qui surnage en clair est éliminé par centrifugation.

On répète le mode opératoire plusieurs fois avec une solution de

chlorure de baryum 0,1M contenant 0,05% de chlorure de cétylpyridinium.

On centrifuge le mélange et on rejette ce qui surnage. On disperse le précipité dans une solution de chlorure de baryum 0,30M contenant 0,05% de chlorure de cétylpyridinium (3 litres). On agite le mélange et l'on recueille, à la fois, le précipité et le liquide clair. On répète l'extraction encore trois fois sur le précipité en utilisant, chaque fois, 0,5 litre de la même solution aqueuse. Finalement, le résidu précipité est éliminé et les liquides clairs sont rassemblés dans un récipient. La température du liquide est portée à 500C tandis que l'on maintient une agitation constante. On porte alors le liquide à 0,23M avec du chlorure de baryum. On ajoute 1 g de chlorure de cêtylpyridinium et le liquide est maintenu sous agitation pendant douze heures. On refroidit le mélange à 25 C et on le filtre, tout d'abord, en présence de Célite et, ensuite, a travers un filtre. On lui fait alors subir une ultrafiltration moléculaire une fois de plus sur les membranes dont la limite d'exclusion de poids moléculaire est de 30.000, en ultrafiltrant 3 volumes initiaux avec addition d'une solution de chlorure de baryum 0,33M. On interrompt l'addition de la solution de chlorure de baryum et le volume est réduit au quart du volume initial. La solution ainsi concentrée est précipitée sous agitation (60 tr/mn) a 25 C avec trois volumes d'éthanol (95%). On recueille le précipité par centrifugation et on rejette ce qui surnage. Le précipité est dissous dans un litre d'une solution O,1M de chlorure de baryum et l'on répète la précipitation avec

3 volumes d'éthanol à 95%.

Le précipité est recueilli et on lave tout d'abord avec de l'étha-

nol (75%) trois fois et, ensuite, avec de l'éthanol absolu (trois fois) et finalement avec de l'acétone absolu (trois fois). Le produit ainsi

obtenu (fraction de hyalastine + hyalectine) présente un poids molécu-

laire moyen compris entre 250.000 et 350.000. Le rendement en HY est

égal à 0,6% en poids du tissu original frais.

Exemple 24

Méthode d'obtention de la fraction hyalastine sous la forme de sel de baryum du mélange obtenu par la méthode décrite dans l'Exemple 30 Le mélange obtenu par la méthode décrite dans l'exemple 23 est dissous dans de l'eau distillee apyrogène, a concurrence de 10 mg de produit pour 1 ml d'eau. La solution ainsi obtenue est soumise à une filtration moléculaireà travers une membrane dont la ligne d'exclusion moléculaire est de 200. 000, et on met ensuite en oeuvre une technique de concentration sans addition d'eau au-dessus de la membrane. Pendant le processus d'ultrafiltration à travers des membranes dont la limite d'exclusion moléculaire est de 200.000, les molécules avec un poids moléculaire de plus de 200.000 sont retenues tandis que les plus petites molécules traversent la membrane en même temps que l'eau. Pendant le processus de filtration, on n'ajoute pas d'eau au-dessus de la membrane de telle sorte que le volume diminue, par conséquent, il y a augmentation de la concentration des molécules dont le poids moléculaire est supérieur a 200. 000. On maintient l'ultrafiltration jusqu'à ce que le volume au-dessus de la membrane soit réduit à 10% du volume initial. On ajoute deux volumes d'eau distillée apyrogéne et l'ensemble est ultrafiltré jusqu'à ce que le volume soit réduit au tiers. On répète l'opération deux fois de plus. La solution qui traverse la membrane est portée à 0,1M avec du chlorure de baryum et on la précipite ensuite avec quatre volumes d'éthanol à 95%. Le précipité est lavé trois fois avec de l'éthanol à 75% et on le sèche ensuite sous vide. Le produit ainsi obtenu (fraction hyalastine) présente un poids moléculaire moyen entre 50.000 et 100.000. Le rendement en HY est égal a 0,4% du tissu de départ frais.

Exemple 25

Méthode d'obtention de la fraction hyalectine sous la forme de sel de baryum La solution concentrée est recueillie dans le réceptacle au-dessus de la membrane de filtration dont la limite d'exclusion est de 200.000 comme dans l'exemple 24 et diluée avec de l'eau jusqu'à ce que l'on obtienne une solution contenant 5 mg/ml d'acide hyaluronique, ceci étant déterminé par une analyse quantitative basée sur le dosage de l'acide glucuronique. La solution est amenée à O,1M dans du chlorure de baryum et on précipite ensuite avec quatre volumes d'éthanol a 95%. On lave le précipité trois fois avec de l'éthanol a 75% et on sèche ensuite sous vide. Le produit ainsi obtenu (fraction hyalastine) présente un poids moléculaire moyen entre 500.000 et 730.000. Le rendement en HY est égal

à 0,2% du tissu de départ frais.

Exemple 26

Préparation du sel d'un acide hyaluronique (HY) avec la streptomycine 4, 47 g du sel de baryum (10 meq.) sont solubilisés dans 300 ml

d'H20 distillée.

2,43 g de sulfate de streptomycine (10 méq.) sont solubilisés dans ml d'H20 distillée et on les ajoute ensuite, goutte a goutte, sous agitation, à la solution du sel de HY. On centrifuge le mélange pendant

trente minutes à 6.000 tr/mn. On sépare la solution, on lave le préci-

pité deux fois avec 25 ml d'H20 distillée. La solution et les eaux de lavage sont rassemblées et ensuite congelées. Dans le sel ainsi obtenu, tous les groupes acides de l'acide hyaluronique sont salifiés par les

fonctions basiques de la streptomycine. Rendement 5,5 g.

Une détermination microbiologique sur B. subtilis ATCC 6633, par comparaison avec une streptomycine standard, indique une teneur de 33,8% en poids de streptomycine basique, ce qui correspond au poids théorique calculé. Une détermination de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide.selon la méthode de Bitter et al. (Anal. Biochem. 4, 330, 1962) indique une teneur de 66,2% en poids d'acide HY (pourcentage

théorique 66,0%).

Exemple 27

Préparation du sel d'un-acide hyaluronique (HY) avec la naphazoline 4,47 g du sel de baryum de HY, dont le poids moléculaire est de 625.000, correspondant à 10 méq. d'une unité monomère, sont solubilisés

dans 400 ml d'H20 distillée.

2,6 g de sulfate neutre de naphazoline (10 méq. de sulfate) sont solubilisés dans 50 ml d'eau distillée et ajoutés à la solution de sel de baryum du HY. On agite le mélange à 5 C jusqu'à ce que le sulfate de baryum soit complètement précipité. Apres centrifugation, la solution qui en résulte est congelée et instantanément lyophilisée. Rendement ,72 g. Dans le sel ainsi obtenu, tous les groupes acides de l'acide

hyaluronique sont salifiés par la naphazoline. Une détermination spec-

trophotométrique comparative, par comparaison avec une naphazoline standard (USP) indique une teneur de 35,7% en poids de naphazollne

basique, ce qui correspond à la valeur théorique calculée.

Une détermination colorimétrique de l'acide glucuronique combiné dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et al. (Anal. Biochem.

4, 330, 1962) indique une teneur de 64,3% en poids d'acide HY.

Exemple 28

Préparation du sel partiel d'un acide hyaluronique (HY) avec la napha-

zoline 4,47 g du sel de baryum de HY, dont le poids moléculaire est de 625.000, correspondant à 10 méq. d'une unité monomère, sont solubilisés

dans 400 ml d'H20 distillée.

1,54 g de sulfate acide de naphazoline (10 méq. de sulfate) sont solubilisés dans 50 ml d'eau bidistillée et ajoutés à la solution de sel de baryum du HY. On agite le mélange à 5 C jusqu'à ce que le sulfate de baryum soit complètement précipité. Après centrifugation, la solution qui en résulte est instantanément congelée et lyophilisee. Rendement

4,5 g.

Dans le sel ainsi obtenu, 50% des groupes acides de l'acide hyaluronique sont saliflis par la naphazoline et 50% sont libres. Une détermination spectrophotométrique quantitative, par comparaison avec

une naphazoline standard (USP), indique une teneur en poids de napha-

zoline basique qui correspond a la valeur théorique calculée. ExeIMle 29 Préparation du sel d'un acide hyaluronique (HY) avec la phnyléphrine

2,16 g de sulfate neutre de L-phénylephrine (10 mêq) sont solubi-

lisés dans 25 ml d'H20 distillée.

4,47 g du sel de baryum de HY, dont le poids moléculaire est de 820.000, correspondant à 10 méq. d'une unité monomère, sont solubilisés dans 400 ml d'H20 distillée et ajoutés a la solution de sulfate de phényléphrine. On agite le mélange jusqu'à précipitation complète du sulfate de baryum. Apres centrifugation, la solution qui en résulte est congelée et lyophilisée. Dans le sel ainsi obtenu, tous les groupes

acides de l'acide hyaluronique sont salifiés par la phényléphrine.

Une détermnnination spectrophotométrique U.V. effectué par la méthode d'addition standard (USP), indique une teneur de 30,6% de

phényléphrine basique, ce qui correspond a la valeur théorique calculée.

Une détermination colorimétrique de l'acide glucuronique combine dans le polysaccharide selon la méthode de Bitter et al. (Anal. Biochem. 4, 330, 1962) indique une teneur de 69,4% en poids d'acide HYo

Exemple 30

Préparation du sel mixte d'un acide hyaluronique (HY) avec la néomyctne avec la phénylôphrine et le sodium 7,15 g de sel de baryum de HY, dont le poids moléculaire est de 65.000, correspondant à 16 meq. d'une unité monomêre, sont solubilises

dans 400 ml d'H20 distillée.

1,28 G de sulfate de néomycine (8,42 meq.) sont solubilisés dans 150 ml d'H20 distillée. 0,34 G de sulfate neutre de phânylêphrine (1,58 meq.) et 0,43 g de Na2SO4 (6 méq.) sont ajoutés a la solution. La solution qui en résulte est ajoutée à la solution de sel de baryum de HY et, après précipitation complète du sulfate de baryum, on centrifuge le mélange. Le sulfate de baryum est séparé et la solution est congelée et

lyophiliséee Rendement 7535 9.

38 -

ETUDES PHARMACOLOGIQUES

L'effet technique des nouveaux médicaments selon la présente invention peut se démontrer, in vivo, par des expériences sur l'oeil de lapin; ces expériences démontrent la supériorité du médicament selon l'invention par rapport à l'utilisation du composant (1) administrée de

façon classique. A titre d'exemple, sont rapportées ci-après les expé-

riences effectuées avec des sels d'acide hyaluronique des antibiotiques

suivants: streptomycine, érythromycine, néomycine, gentamicine.

Il s'agit des sels totaux dans lesquels tous les groupes acides de

l'acide hyaluronique sont salifiés par un groupe basique de l'antibio-

tique et qui sont décrits dans les exemples 1, 2, 4 et 5. On utilise des solutions de ces sels dans l'eau distillée dont les concentrations conviennent a la teneur en antibiotique de la façon suivante: acide hyaluronique + streptomycine (HYA1).... 33,8% 15. acide hyaluronique + érythromycine (HYA2)... 66,0% acide hyaluronique + néomycine (HYA4)....... 21,2% À acide hyaluronique + gentamicine (HYA5)..... 20,0% L'activité de ces antibiotiques est comparée à celles données par les mêmes antibiotiques dissous dans un tampon à base de phosphate et présentant les mêmes concentrations en antibiotiques. L'activité des deux groupes de produits est mesurée sur la base du temps nécessaire pour supprimer une inflammation sèche de l'oeil de lapin induite par un agent bactérien. Plus précisément, l'inflammation sèche est provoquée dans les deux yeux de vingt-quatre lapins par injection intra-oculaire d'une suspension titrée de l'un des groupes bactériens suivants: pseudomonas aeruginosa, staphylococcus aureus, salmonella typhi

(0,1 ml).

Les divers dérivés salins des antibiotiques sont administrés (3 gouttes toutes les six heures) dans l'oeil droit (RE) des lapins,

tandis que dans l'oeil gauche (LE) on instille les quantités correspon-

dantes des antibiotiques dissous dans le tampon à base de phosphate. On commence le traitement immédiatement après injection de la suspension

bactérienne et on la poursuit jusqu'à ce que l'inflammation disparaisse.

On observe les deux yeux de chaque lapins avec une lampe à fente. On examine, en particulier, ce qui suit: l'état de la conjonctive et de l'épithélium cornéen, de la chambre antérieure (présence de l'effet Tyndall) et l'état de l'iris du segment postérieur de l'oeil. L'état de l'arrière de l'oeil est examiné avec une lentille de Goldman. La présence

de signes d'inflammation (hypérémie, exudats, troubles des liqui-

des, etc.) est enregistrée. Le pourcentage des yeux qui ne présentent

aucun signe d'inflammation et alors calculé. Les résultats des expé-

riences sont reportés dans le tableau I grâce auquel on peut observer que l'administration de dérivés salins, selon la présente invention, est suivie d'une guérison plus rapide de l'inflammation par comparaison au cas de l'administration des antibiotiques correspondants non salifiés

par l'acide hyaluronique.

TABLEAU I

Effets de l'administration des dérivés HYA sur la guérison de l'inflammation sèche de l'oeil du lapin TRAITEMENT Nombre de jours à partir de l'inflammation

1 2 3 4 5 6 7 8

streptomycine (6)* 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 16,6 50,0 100,0

HYA1 (6)* 0,0 0,0 16,6 16,6 50,0 100,0 100,0 100,0

érythromycine (6)** 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 16,6 33,3

HYA2 (6)** 0,0 0,0 0,0 0,0 16,6 16,6 33,3 50,0

néomycine (6)*** 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 16,6 33,3

HYA4 (6)*** 0,0 0,0 0,0 0,0 16,6 16,6 33,3 50,0

gentamycine (6)* 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 33,3 50,0 100,0

HYA5 (6)* 0,0 0,0 0,0 16,6 33,3 50,0 100,0 100,0

Les valeurs sont exprimées en pourcentage (nombre d'yeux dont les inflammations ont été soulagées par rapport au nombre total d'yeux traités). Sont indiqués entre parenthèses

le nombre d'yeux traités.

* injection d'aeruginosa pseudomonas ** injection de staphylococcus aureus *** injection de salmonella typhi L'effet technique des médicaments selon la présente invention est encore démontré par les autres expériences suivantes qui concernent

l'action myotique, anti-inflammatoire, cicatrisante et antimicrobienne.

I.- Activité myotique du nitrate de pilocarpine véhicule par l'acide hyaluronique Matériaux On utilise les matériaux suivants comme excipients de la pilocarpine dans les diverses formulations de nitrate de pilocarpine: - sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction hyalastine (poids moléculaire d'environ 100.000), à des concentrations de 10 mg/ml et 20 mg/ml; - sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction hyalectine (poids moléculaire 500.000 a 730.000), à des concentrations de 10 mg/ml et 20 mg/ml;

- alcool polyvinylique à 5% comme excipient ophtalmique témoin.

Diverses formulations à 2% (collyre ou gel) de nitrate de pilocarpine sont préparées et véhiculées par addition des deux différentes fractions de sel de sodium de HY à des concentrations de 10 et 20 mg/ml. On prépare les solutions suivantes: Formulation 1: solution saline avec nitrate de pilocarpine

(PiNO3) (2%) utilisée comme référence.

Formulation 2: solution de (PiNO3) (2%) vehiculee dans de l'al-

cool polyvinylique à 5% et utilisée comme référence.

Formulation 3: solution de (PiNO3) (2%) vehiculée dans des

fractions de sel de sodium de hyalastine (10 mg/ml).

Formulation 4: solution de (PiNO3) (2%) véhiculée dans le sel de

sodium de la fraction hyalastine (20 mg/ml).

Formulation 5: solution de (PiNO3) (2%) véhiculée dans le sel de

sodium de la fraction hyalectine (10 mg/ml).

Formulation 6: solution de (PiNO3) (2%) véhiculée dans le sel de

sodium de la fraction hyalectine (20 mg/ml).

Méthode Des lapins albinos de Nouvelle Zélande sont utilisés (2 à 2,5 kg). La formulation à tester est instillée dans un oeil de chaque lapin avec une microseringue (10 mcl). L'autre oeil est utilisé à titre de référence. On mesure le diamètre de la pupille dans tous les cas à des intervalles de-temps convenables. On teste chaque solution sur au moins huit lapins. Chaque oeil n'est pas traité plus de trois fois et l'on observe une période de repos

d'au moins une semaine entre chaque traitement.

Paramètres On relève les mesures des diamètres des pupilles a divers intervalles de temps pour mesurer la courbe d'activité myotique en fonction du temps. Les paramètres d'activité suivants sont alors calculés par des courbes myosis/temps: * I max = différence maximum de diamètre de la pupille entre l'oeil traité et l'oeil de référence; * temps du pic maximum = temps nécessaire pour atteindre le I max; * durée = temps nécessaire pour revenir aux conditions de base; 10. plateau = période d'activité myotique absolue;

* AUC = surface en-dessous de la courbe myosis/temps.

Résultats Les résultats de l'étude sont reportés sur le tableau 2. Il

est possible de voir, à partir de données des différents paramè-

tres déterminés par la courbe de temps de l'activité myotique pour toutes les solutions étudiées que l'addition d'acide hyaluronique à 2% de solutions de nitrate de pilocarpine, occasionnent une augmentation de l'activité myotilque du médicament. Il est certain que la disponibilité biologique du médicament peut être 2,7 fois plus importante que celle de la solution aqueuse contenant du

nitrate de pilocarpine a 2% (formulation 1).

Il est également important de noter qu'il y a une augmenta-

tion statistique significative de l'activité lorsque la fraction hyalectine de l'acide hyaluronique est utilisée comme véhicule & la fois des formulations a 10 et 20 mg/ml (formulations 5, 6) par comparaison aux solutions de nitrate de pilocarpine véhiculées dans l'alcool polyvinylique (formulation 2). L'utilisation d'acide hyaluronique comme véhicule est particulièrement intéressante parce que l'activité myotique du nitrate de pilocarpine dure plus

longtemps lorsqu'elle est véhiculée avec cette substance. C'est-

à-dire que pour les formulations contenant de l'acide hyaluroni-

que, le temps nécessaire pour que le diamètre de la pupille

revienne aux conditions de base est de plus de 190 minutes (formu-

lation 6) par comparaison avec les 110 minutes nécessaires pour la

pilocarpine en solution saline seule (formulation 1).

TABLERJ 2

Activité biologique des formulations ophtalmiques contenant 2% de nitrate de pilocarpine véhiculées par de l 'acide hyalurcnique Formn- temps de durée plateau AúC, anm AJC

lation véhicule Iax,, mn pic naxi- en mn n nn (+ LF 95%) rela-

no (+ LF 95%) um en in tive 1 solutin saline 1,93 + 0,35 20 110 - 117 + 28 1 2 alcool polyvin. à 5%2,33+ 0,2B 20 140 - 192 + 32 1,64 3 lyalastine (10mg/ml) 2,50+0,42 20 120 - 240+40 2,06 4 hyalastine (20 mgh/l) 2,58 + 0, 3830 150 - 208 + 41 1,78 hyalectine (10nmgAl) 2,50 + 0,38 15 170 - 242 + 48 2,06 6 hyalectine (20 mgnl) 2,70 + 0,38 20 190 45 320 + 46 2,73

* Les valeurs reportées reprsetent la valeur mye-e de huit essais.

II.- Activité myotique de la pilocarpine salifiée par l'acide hyaluro-

nique Matériaux Pour les diverses formulations de pilocarpine salifiées, on utilise les produits suivants: - acide hyaluronique de faible poids moléculaire (hyalastine poids moléculaire 100.000) (HY1); - sel de sodium d'acide hyaluronique de poids moléculaire élevé (hyalectine poids moléculaire entre 500.000 et 730.000) (HY2-Na) à des concentrations de 10 mg/ml et 20 mg/ml; - alcool polyvinylique à 5% comme véhicule ophtalmique pour

obtenir des formulations comparatives.

Les diverses formulations préparées sont les suivantes: 1.- solution saline avec 2% de nitrate de pilocarpine (PiNO3) (utilisée comme référence);

2.- solution à 2% de PINO3 véhiculée par de l'alcool polyvi-

nylique a 5% (utilisée comme référence); 3.- solution pilocarpine base/acide HY1 en solution aqueuse. La teneur en pilocarpine base correspond a 2%; 4.- solution contenant sel de pilocarpine/acide HY1, véhiculée

par HY2-Na, 10 mg/ml. La teneur en pilocarpine base corres-

pond à 2%; 5.- solution contenant sel de pilocarpine/acide HY1, véhiculée par HY2Na, 20 mg/ml. La teneur en pilocarpine base correspond à 2%. 6.inserts de HY2-Na contenant du sel de pilocarpine base avec l'acide hyaluronique (HY1). La pilocarpine base correspondant

à 6,25%.

Méthode Des lapins albinos de Nouvelle Zélande sont utilisés (2 à 2,5 kg). La solution à tester est instillée dans un oeil de chaque lapin avec une microseringue (10 pl). L'autre oeil est utilisé à titre de référence. L'insert est placé dans le sac conjonctif au moyen de pinces convenables. Dans tous les cas, on mesure le diamètre de la pupille à des intervalles de temps convenables. On teste chaque solution sur au moins huit lapins. Chaque oeil n'est pas traité plus de trois fois et l'on observe une période de repos

d'au moins une semaine entre chaque traitement.

Paramètres On relève des mesures des diamètres des pupilles à divers intervalles de temps pour mesurer la courbe d'activité myotique en fonction du temps et l'on effectue les calculs suivants a partir des courbes myosis/temps des paramètres d'activité suivants: I max = différence maximum de diamètre de la pupille entre l'oeil traité et l'oeil de référence; temps de pic = temps nécessaire pour atteindre le I max; 25. durée = temps nécessaire pour revenir aux conditions de base; plateau = période d'activité myotique absolue;

AUC = surface en-dessous de la courbe myosis/temps.

Résultats Comme on peut le voir d'après le tableau 3, sur lequel sont reportées, pour chaque solution testée, les valeurs des divers paramètres enregistrés à partir de l'activité myotique en fonction du temps, il est possible de montrer comment la salification par

l'acide hyaluronique de la pilocarpine a 2% occasionne une augmen-

tation d'activité myotique du médicament dont l'activité peut atteindre environ deux fois celle présentée par une solution

aqueuse à 2% de nitrate de pilocarpine (formule 1).

Une augmentation statistique significative d'activité doit également être notée lorsque l'on utilise de l'acide hyaluronique a poids moléculaire élevé comme véhicule, à la fois pour des

formulations a 10 et à 20 mg/ml (formulations 4 et 5).

La salification avec l'acide hyaluronique est particulière-

ment intéressante également en relation avec la durée plus impor-

tante d!activité myotique de la pilocarpine lorsqu'on la véhicule dans ces formulations: le temps pris pour revenir au diamètre normal de la pupille, dans des conditions de base, atteint des valeurs de 160 minutes (formulation 3) par comparaison avec les

minutes pour la pilocarpine (formulation 1).

TABLEAU 3

Paramètres d'activité biologique des véhicules ophtalmiques l'acide hyaluronique Formulation I m, n temps de durée plateau AUC, cm2 AUC no (+ LF 95%) pic en mn en mn en mn (+ LF 95%) relative

1 1,93 + 0,35 20 110 - 117 + 28 1,00

2 2,33 + 0,28 20 140 - 192 + 32 1,64

3 2,25 + 0,28 20 160 20 212 + 32 1,81

4 2,70 + 0,43 30 180 40.280 + 48 2,39

5 2,80 + 0,20 15 200 45 361 + 40 3,08

6 3,70 + 0,30 40 230 - 442 + 70 3,78

III.- Stabilité des films cornéens de l'acide hyaluronique et des dérivés de pilocarpine Le but des expériences est d'évaluer les propriétés adhésives et filmogènes des dérivés de salification entre la pilocarpine et l'acide hyaluronique à la suite de l'application sur la cornée des animaux. Méthode Le test consiste à évaluer, visuellement, la formation, la stabilité et la durée du film formé par les formulations sur la cornée. A cette fin, on ajoute de la fluorescéine de sodium aux préparations ophtalmiques (0,1%) et on examine l'oeil après

instillation à la lumière U.V. de 366 nm.

On utilise douze lapins albinos dans chacun des deux sexes (Nouvelle Zélande, 2 a 2,5 kg). Une goutte (50 pl) de chaque véhicule est instillée dans un oeil de chaque lapin et on garde

l'autre oeil à titre de contrôle.

Solutions utilisées 1.- solution saline avec 2% de nitrate de pilocarpine (PiN03);

2.- solution à 2% de PiNO3 épaissie avec de l'alcool polyvi-

nylique a 5% (Wacker Chemie, PVA W 48/20); 3.- solution contenant du sel de pilocarpine base/acide HY1. La teneur en pilocarpine base correspond à 2%;

4.- solution contenant sel de pilocarpine base/acide HY1, véhicu-

lée par HY2-Na, 10 mg/ml. La teneur en pilocarpine base correspond a 2%; 5.- solution contenant sel de pilocarpine/acide HY1, véhiculée

par HY2-Na, 20 mg/ml. La teneur en pilocarpine base corres-

pond à 2%.

Toutes ces solutions contiennent 0,1% de fluoresceine de Na.

Dans tous les cas, le pH de ces solutions est voisin de 5,8.

Résultats Les paramètres relatifs a la fluorescence: (a) durée du film cornée intégral; (b) durée de la fluorescence (temps nécessaire à ce que la fluorescence disparaisse totalement de l'oeil;

(c) présence de fluorescence dans le nez (temps pris par la solu-

tion après son application pour apparaître au niveau du nez);

sont indiqués sur le tableau 4.

Les dérivés d'acide hyaluronique avec la pilocarpine produi-

sent un film cornéen stable pendant des périodes de plus de deux heures. La pénétration trans-cornéenne de la pilocarpine semble donc dépendre de la capacité de l'acide hyaluronique a véhiculer

le médicament formant un film stable et homogène sur la cornée.

TABLEAU 4

durée du film durée de la apparition de la solution intégral en fluorescence fluorescence dans mn en mn le nez en mn

1 30 100 2 - 3

2 80 150 10 - 15

3 100 150 5

4 120 180 15 - 20

140 210 50

IV.- Activité anti-inflammatoire de la triamcinolone véhiculée par l'acide hyaluronique Matériaux On utilise ce qui suit: - solution de sel de sodium d'acide hyaluronique/hyalectine (poids moléculaire entre 500. 000 et 730.000, 10 mg/ml dans une solution saline); - solution de phosphate de triamcinolone (10% dans une solution saline). Méthode On effectue les expériences sur des lapins males de Nouvelle Zélande (poids moyen 1,6 kg). Apres une période d'adaptation de cinq jours, on provoque une inflammation intra-oculaire chez les animaux par injection de dextrane (10%, 0,1 ml) dans la chambre antérieure. L'administration est effectuée à la fois dans deux yeux, dans des conditions d'anesthésie locale par de la Novésine & 4%, en insérant l'aiguille de la seringue au bord la cornée dans

la chambre antérieure a une distance de 2 mm.

On effectue le test sur dix animaux.

Traitement Le traitement est effectué sur chaque animal a la fois dans l'oeil droit et dans l'oeil gauche par instillation de trois gouttes, trois fois par jour, pendant un total de six jours de respectivement: une solution de phosphate de triamcinolone (10% dans une solution saline) dans l'oeil gauche (LE); - une solution du sel de sodium d'acide hyaluronique fraction hyalectine (10 mg/ml) + phosphate de triamcinolone (10%) dans

l'oeil droit (RE).

Paramètres L'effet anti-inflammatoire sur la réaction provoquée par le dextrane est évaluée par observation de l'oeil a travers une lampe e fente dans les intervalles suivants: O, 1 h, 3 h, 24 h, 48 h.

3 jours, 4 jours, 5 jours, 6 jours.

A ces intervalles, on observe ce qui suit: - état de la conjonctive et de la cornée, présence possible

d'hypérémie, d'oedéme, et en particulier dans l'iris, nor-

malement sensible à des processus inflammatoires après injection d'agents inflammatoires dans la chambre antérieure;

- effet Tyndall, dans lequel, la présence d'une opacité d'in-

tensité variable ("nubécola") est indicative de la présence d'éléments corpusculaires (inflammatoires) dans la chambre antérieure. Les résultats des observations sont reportées, selon une estimation subjective entre 0 et 3, en relation avec l'effet observé. Résultats Comme on peut le voir d'après le tableau 5, il s'avère que

l'administration de triamcinolone présente un effet anti-inflamma-

toire sur l'iris et occasionne la disparition de l'opacité (effet Tyndall) dans la chambre antérieure. Le processus inflammatoire, évident de la première à la troisième heures, jusque trois à quatre jours, disparaît progressivement et on revient à des valeurs presque normales avec une clarté parfaite de l'oeil vers le sixième jour. D'autre part, l'administration de la fraction hyalectine du sel de sodium d'acide hyaluronique, associée à celle de phosphate de triamcinolone, réduit l'inflammation intra-oculaire observée aux moments mentionnés ci-dessus, par comparaison avec l'administration de phosphate de triamcinolone seule. C'est-à-dire que le processus inflammatoire dans l'iris et l'opacité dans la chambre antérieure s'avère être plus faibles juste vingt-quatre heures après, avec une réduction progressive à 48 h et une absence

totale de réaction inflammatoire à partir du quatrième jour.

Dans la conjonctive et la cornée, on n'observe fondamentale-

ment pas de réaction inflammatoire notable à la suite de l'injec-

tion de dextrane dans la chambre antérieure. Ainsi, l'administra-

tion de phosphate de triamcinolone en même temps que d'une frac-

tion d'acide hyaluronique conduit a une augmentation de l'activité du médicament que démontre la décongestion plus rapide de l'oeil

du lapin.

TABLEAU 5

Effet de l'association de l'acide hyaluronique et du phosphate de triameinolone sur l'inflammation intra-oculaire provoquée par le dextrane M oments d'observation 0 h 1 b 3h 24 h 48h 3 j 4j 5 j 6 j conjonctive:

À LE....... 00 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

10. RE...... 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

cornée:

LE...... 0,0 1,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

RE...... 0,0 0,2 0,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

effet Tyndall:

LE...... 0,0 1,0 3,0 3,0 3,0 3,0 2,2 1,2 0,4.

RE...... 0,0 0,2 3,0 2,1 1,2 0,2 0,0 0,0 0,0

iris:

LE......L 0,0 0,5 2,7 3,0 3,0 3,0 2,4 1,5 0,5

RE...... 0,0 0,7 2,7 2,5 1,2 0,4 0,0 0,0 0,0 LE - oeil gauche traité au phosphate de triamcinolone RE - oeil droit

traité au phosphate de triamcinolone et par la hyalectine (chaque valeur est la moyenne de sept observations sur un total de sept animaux et on l'exprime en teres de notation subjective de 0 à 3, en relation avec la progressivité de l'effet observé) V.- Activité de guérison de 1'EGF véhiculé par l'acide hyaluronique Matériaux On utilise les matériaux suivants: - formulation A - EGF (facteur de croissance épidermique) dissous dans une solution saline (0,5 mg/5 ml); - formulation B - sel de sodium d'acide hyaluronique fraction hyalastine (poids moléculaire 100. 000) dissous dans une

solution saline (10 mg/ml).

Méthode Les expériences sont effectuées sur des lapins Albinos mâles de Nouvelle Zélande (poids moyen 1,8 kg). Les animaux, après une période d'adaptation d'environ cinq jours, subissent une lésion de

l'épithélium de la cornée dans les conditions convenables d'anes-

thésie locale par la Novésine (4%).

La lésion est constituée d'une scarification monoculaire d'une surface circulaire dans la zone optique, effectuée en

utilisant un cylindre de verre concave (0,3 mm) a bord aiguisé.

Traitement

Les animaux sont subdivisés en groupes, chaque groupe conte-

nant cinq animaux et ils subissent, ensuite, un traitement pharma-

cologique par instillation conjonctive tel qu'indiqué ci-dessous: Groupe Traitement groupe 1 (contrôle).... solution saline groupe 2............... solution EGF (formulation A) 25. groupe 3............... solution de sel de sodium fraction

hyalastine + solution de EGF -

combinaison de formulation A + formulation B dans le rapport 1/1 pour préparer la formulation C. Le traitement est effectué dans l'oeil droit par instillation conjonctive de deux gouttes toutes les huit heures pendant un

total de trois administrations.

Paramètres

La guérison de l'épithélium cornéen est évaluée par observa-

tion de l'oeil et documentation photographique avec une lampe à fente, à divers intervalles, après scarification: 0,8 h, 16 h, 24 h. 32 h. 40 h, 48 h. Résultats L'examen ophtalmique 1, indiqué sur le tableau 4, montre que dans les groupes de contrôle (groupe 1), il y a guérison complète (5/5 animaux) quarante huit heures après la lésion. Chez les animaux traités a I'EGF (groupe 2), le processus est apparent déjà vingt-quatre heures après scarification avec une efficacité

notable (4/5 animaux). Chez les animaux traités avec une formula-

tion C composée de sels de sodium d'acide hyaluronique, fraction hyalastine + EGF( groupe 3), le processus de guérison est complet

chez tous les animaux déjà seize heures après scarification.

* Ces résultats montrent que l'utilisation de la fraction hyalastine de l'acide hyaluronique comme véhicule pour l'EGF favorise le processus de guérison, et encourage une guérison plus

rapide et plus efficace des lésions cornéennes.

TABLEAU 6

Guérison des lésions de l'épithélium cornéen temps après scarification (en h) groupe traitement 0 8 16 24 48

1 solution saline + + + + -

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + + -

2 EGF (formulation A) + + + - -

+ + + - -

+ + +

+ + + + -

+ + + - -

3 sel de sodium d'acide + + - - -

hyaluronique + EGF + + - - -

(formulation C) + + - - -

± + -.-

+ + - - -

+ = oeil non guéri - = oeil guéri VI.- Activité antimicrobienne de la gentamycine véhiculée par l'acide hyaluronique Matériaux On utilise les matériaux suivants: - gentamycine dissoute dans une solution saline (50 mg/ml); - sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction hyalectine

(2 mg/ml).

Méthode On provoque une inflammation septique, dans les deux yeux de onze lapins, par injection intra-oculaire d'une suspension titrée de pseudomonas aeruginosa (0,1 ml). A ces lapins présentant une inflammation septique, on administre une fraction hyalectine d'acide hyaluronique en association avec de la gentamycine par

instillation dans l'oeil droit, et, dans l'oeil gauche, on admi-

nistre de la gentamycine dans un véhicule à base de solution saline phosphatée. Le traitement (trois groupes toutes les six

heures) commence immédiatement après injection de l'agent infec-

tieux et on le poursuit jusqu'à disparition de l'infection. On

observe, chaque jour, avec une lampe a fente les yeux des lapins.

Résultats Le traitement avec une association de gentamycine et d'acide hyaluronique conduit à une disparition plus rapide de l'infection septique par comparaison avec l'administration de l'antibiotique

seul. Cette conclusion est claire d'après les données du ta-

bleau 7.

TABLEAU 7

Effet de la gentamycine véhiculée par l'acide hyaluronique fraction hyalectine sur l'inflammation intra-oculaire septique Jours à partir du début de l'inflammation traitement 1 2 3 4 5 6 7 gentamycine + solution saline comme véhicule 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 36,3 100

gentamycine + HY frac-

tion hyalectine 0,0 0,0 9,0+ 72,7+ 72i7+ 100 100 Les valeurs sont exprimées en pourcentage du nombre d'yeux guéris de

leur inflammation par comparaison avec le nombre d'yeux traités.

+ = différence- significative vis-à-vis du véhicule phosphaté (- di 0,05, T test B Fischer) L'invention étant ainsi décrite, il est évident qu'on peut en proposer de nombreuses variantes. Ces variantes ne doivent pas être

considérées comme se départissant de l'esprit de la portée de l'inven-

tion et toutes les modifications qui sont évidentes à l'homme de l'art

doivent être comprises dans la portée des revendications qui vont

suivre.

Claims (30)

REVENDICATIONS

1.- Médicament à usage topique comprenant:

a.- une substance pharmaceutiquement active ou un mélange de subs-

tances pharmaceutiquement actives convenant a l'administration topique; et b.- de l'acide hyaluronique ou l'une de ses fractions moléculaires ou

un sel d'acide hyaluronique ou de ces fractions d'acide hyaluro-

nique avec un métal alcalin ou alcalino-terreux, l'aluminium ou l'ammonium, ou un sel d'acide hyaluronique ou de cette fraction

d'acide hyaluronique avec ses substances actives ou leurs mélan-

ges.

2.- Médicament à usage topique comprenant un sel d'acide hyalu-

ronique ou d'une de ses fractions moléculaires avec, au moins, une substance pharmacologiquement active convenant a une administration

topique.

3.- Médicament selon la revendication 2, dans lequel cet acide

hyaluronique est encore salifié avec un métal alcalin ou alcalino-

terreux l'aluminium ou l'aneonium.

4.- Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 a 3,

dans lequel la substance active présente une activité ophtalmologique ou dermatologique.

5.- Médicament selon l'une-quelconque des revendications 1 à 4,

comprenant au moins un agent antibiotique anti-infectieux, antimicro-

bien, antiviral, cytostatique, antitumoral, anti-inflammatoire, cicatri-

sant, anesthésique, promoteur cholinergique, antagoniste cholinergique,

promoteur adrénergique ou antagoniste adrénergique.

6.- Médicament selon la revendication 5, contenant, au moins, une

substance active choisie dans le groupe constitué par les corps sui-

vants: érythromycine, gentamycine, néomycine, streptomycine, dihydro-

streptomycine, kanamycine, amikacyne, tobramycine, auréomycine, spec-

tinomycine, oléandomycine, carbomycine, spiramycine, oxytétracycline, rolitétracycline, bacitracine, polymyxine B, gramicidine, colistine, chloramphénicol, lincomycine, amphotéricine B, griséofulvine, nystatine,

diéthylcarbamazine, mêbendazole, sulfacétamide, sulfadiazine, sulfisoxa-

zole, iodéoxyuridine, adénine arabinoside, tricarpine, métacholine, carbamylcholine, acéclidine, fisostigmine, néostigmine, démacarium,

stropina, propanolol, timolol, pindolol, bupranolol, aténolol, métopro-

lol, oxprenolol; practolol, butoxamine, sotalol, butadrine, labétalol, dexanméthasone, triamcinolone, prednisolone, fluorométholone, medrison,

fluorocil, méthotrexate et podophylline.

7.- Médicament selon l'une'quelconque des revendications 1 à 6,

contenant, en outre, comme agent anti-inflammatoire la prednisolone, la dexaméthasone, la fluméthasone, la triamcinolone, l'acêtonide, la bétaméthasone, le clobêtasol ou leurs esters, ou contenant comme agent

anesthésique la dibucaîne, la lidocaTne ou la benzocalne.

8.- Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 a 7,

dans lequel la fraction d'acide hyaluronique utilisée présente un poids moléculaire entre 90 a 80% et 0,23% du poids moléculaire de l'acide

hyaluronique intégral présentant un poids moléculaire de 13 millions.

9.- Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 a 8,

dans lequel l'acide hyaluronique comprend une fraction moléculaire purifiée d'acide hyaluronique sensiblement exempte d'acide hyaluronique

dont le poids moléculaire serait inférieur a 30.000.

10.- Médicament selon la revendication 9, dans lequel la fraction moléculaire d'acide hyaluronique présente un poids moléculaire moyen d'environ 50.000 à environ 100.000, d'environ 500.000 à environ 730.000

ou d'environ 250.000 à environ 350.000.

11.- Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 10,

dans lequel le sel d'acide hyaluronique est un sel d'acide partiel de l'acide hyaluronique ou d'une de ses fractions moléculaires avec une

substance pharmaceutiquement active de caractère basique.

12.- Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 10,

dans lequel le sel d'acide hyaluronique est un sel stoéchiométriquement neutre d'acide'hyaluronique ou d'une de ses fractions moléculaires avec

une substance pharmaceutiquement active de caractère basique.

13.- Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 10,

contenant un mélange d'un sel d'acide partiel de l'acide hyaluronique ou d'une de ses fractions moléculaires et un sel stoéchiométriquement

neutre d'acide hyaluronique ou d'une de ses fractions moléculaires.

14.- Médicament à usage topique selon l'une quelconque des revendi-

cations 1 à 13, comprenant un excipient pharmaceutiquement acceptable

supplémentaire classiquement employé pour usages topiques.

15.- Médicament à usage topique pour le traitement thérapeutique ou prophylactique de désordres ophtalmiques ou dermatologiques, de maladies de la muqueuse, des cavités orales et nasales ou de l'oreille externe, le traitement épathologique des organes internes par des substances qui

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peuvent être absorbées par voie intradermique ou par la muqueuse nasale ou rectale, caractérisé en ce qu'il consiste en le médicament selon une

quelconque des revendications 1 à 14.

16.- Procédé de préparation d'un sel d'acide hyaluronique qui consiste:

a.- a combiner une solution aqueuse d'un sel de baryum d'acide hya-

luronique avec un sulfate d'une substance pharmaceutiquement active; et b. - à séparer le sulfate de baryum précipité pour obtenir le sel

d'acide hyaluronique en solution aqueuse.

17.- Procédé selon la revendication 16, dans lequel ce sulfate est ajouté en quantité telle que le nombre d'équivalents de sulfates est égal au nombre d'équivalents d'acide hyaluronique, pour produire ainsi

un sel stoéchiométriquement neutre d'acide hyaluronique.

18.- Procédé selon la revendication 16, dans lequel ce sulfate est ajouté en quantité telle que le nombre de sulfates équivalents est inférieur au nombre d'équivalents d'acide hyaluronique pour produire

ainsi un sel d'acide hyaluronique partiellement salifié.

19.- Procédé selon la revendication 16, dans lequel ce sel de baryum d'acide hyaluronique est, en outre, combiné avec un sulfate d'au moins un élément choisi dans le groupe constitué par un métal alcalin ou

alcalino-terreux, l'aluminium ou l'ammonium.

20.- Procédé selon la revendication 19, dans lequel ces sulfates sont ajoutés en quantité telle que le nombre d'équivalents de sulfates

est égal au nombre d'équivalents d'acide hyaluronique.

21.- Procédé selon la revendication 19, dans lequel ces sulfates sont ajoutés en quantité telle que le nombre d'équivalents de sulfates

est inférieur au nombre d'équivalents d'acide hyaluronique.

22.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 21,

dans lequel cette substance active est au moins un élément choisi parmi:

érythromycine, gentamycine, néomycine, streptomycine, dihydrostrep-

tomycine, kanamycine, amikacyne, tobramycine, auréomycine, spectino-

mycine, érythromycine, oléandomycine, carbomycine, spiramycine, oxy-

tétracycline, rolitetracycline, bacitracine, polymyxine B, gramicidine, colistine, chloramphénicol, lincomycine, amphotéricine B, griséofulvine, nystatine, diéthylcarbamazine, mébendazole, sulfacétamide, sulfadiazine,

sulfisoxazole, iodéoxyuridine, adénine arabinoside, tricarpine, métacho-

line, carbamylcholine, acéclidine, fisostigmine, néostigmine, démacarium,

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stropina, propanolol, timolol, pindolol, bupranolol, aténolol, métoprolol, oxprenolol, practolol, butoxamine, sotalol, butadrine, labétalol,

dexaméthasone, triamcinolone, prednisolone, fluorométholone et medrison.

23.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 22,

dans lequel l'acide hyaluronique est une fraction moléculaire dont le poids moléculaire est compris entre environ 90 à 80% et 0,23% du poids moléculaire de l'acide hyaluronique intégral dont le poids moléculaire

est de 13 millions.

24.- Procédé selon la revendication 23, dans lequel la fraction d'acide hyaluronique est sensiblement exempte d'acide hyaluronique dont

le poids moléculaire serait inférieur à environ 30.000.

25.- Procédé selon la revendication 24, dans lequel la fraction moléculaire présente un poids moléculaire moyen d'environ 50.000 à environ 100.000, environ 500.000 à environ 730.000 ou environ 250.000 à

environ 350.000.

26.- Le sel de baryum d'une fraction hyaluronique non-inflammatoire sensiblement pure, dont le poids moléculaire moyen est compris entre 250. 000 et 350.000, 50.000 et 100.000 ou 500.000 et 730.000 et étant sensiblement exempt d'acide hyaluronique dont le poids moléculaire

serait inférieur à 30.000.

27.- Procédé de préparation d'un sel de baryum d'acide hyaluronique ou d'une de ses fractions moléculaires qui consiste: a.- à traiter un sel de cétylpyridinium d'acide hyaluronique ou d'une de ses fractions moléculaires par une solution aqueuse de chlorure de baryum; et b.- à séparer la solution aqueuse et à y ajouter de l'éthanol pour précipiter, ainsi, le sel de baryum d'acide hyaluronique ou d'une

de ses fractions moléculaires.

28.- Procédé selon la revendication 27, dans lequel la fraction d'acide hyaluronique est sensiblement exempte d'acide hyaluronique dont

le poids moléculaire serait inférieur à environ 30.000.

29.- Procédé selon la revendication 27, dans lequel cette fraction moléculaire présente un poids moléculaire moyen d'environ 50.000 à environ 100.000, d'environ 500.000 a environ 130.000 ou d'environ

250.000 à environ 350.000.