HU215193B - Eljárás szemészeti célra alkalmazható nagy tisztaságú hialuronsav-frakció és az ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására - Google Patents
Eljárás szemészeti célra alkalmazható nagy tisztaságú hialuronsav-frakció és az ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU215193B HU215193B HU9204012A HU9204012A HU215193B HU 215193 B HU215193 B HU 215193B HU 9204012 A HU9204012 A HU 9204012A HU 9204012 A HU9204012 A HU 9204012A HU 215193 B HU215193 B HU 215193B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- hyaluronic acid
- salt
- solution
- sodium salt
- molecular weight
- Prior art date
Links
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims abstract description 91
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 85
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title claims abstract description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 239000000061 acid fraction Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 title description 4
- -1 hyaluronic acid quaternary ammonium salt Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 18
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 8
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract 2
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 claims description 171
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 87
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 75
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 63
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 46
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 29
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 27
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 20
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 claims description 19
- KIUKXJAPPMFGSW-YXBJCWEESA-N (2s,4s,5r,6s)-6-[(2s,3r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(3s,4r,5r,6r)-6-[(3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H](C(O[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)C(O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)C(C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-YXBJCWEESA-N 0.000 claims description 16
- 229960001927 cetylpyridinium chloride Drugs 0.000 claims description 16
- YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M cetylpyridinium chloride Chemical group [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 14
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical group C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000000797 iron chelating agent Substances 0.000 claims description 11
- 229940075525 iron chelating agent Drugs 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N tetrabutylammonium Chemical group CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 7
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 239000003206 sterilizing agent Substances 0.000 claims description 6
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 claims description 5
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 claims description 5
- QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N (1-carboxy-2-sulfanylethyl)azanium;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.SCC(N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 4
- 229960001305 cysteine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 4
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 4
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 4
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims description 3
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 claims description 2
- OEUUFNIKLCFNLN-LLVKDONJSA-N chembl432481 Chemical compound OC(=O)[C@@]1(C)CSC(C=2C(=CC(O)=CC=2)O)=N1 OEUUFNIKLCFNLN-LLVKDONJSA-N 0.000 claims description 2
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 claims description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 3
- 150000005621 tetraalkylammonium salts Chemical class 0.000 claims 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 61
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 58
- 229940089982 healon Drugs 0.000 description 54
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 28
- 230000004410 intraocular pressure Effects 0.000 description 28
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 14
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 12
- 208000035965 Postoperative Complications Diseases 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 10
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 9
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 8
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 6
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 6
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 6
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000003190 viscoelastic substance Substances 0.000 description 6
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 6
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OOSZCNKVJAVHJI-UHFFFAOYSA-N 1-[(4-fluorophenyl)methyl]piperazine Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1CN1CCNCC1 OOSZCNKVJAVHJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 5
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 5
- DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dodecahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 5
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 229940074545 sodium dihydrogen phosphate dihydrate Drugs 0.000 description 5
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001134 F-test Methods 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 3
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 210000000871 endothelium corneal Anatomy 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 229940014041 hyaluronate Drugs 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-3-[(2s,3r,5s,6r)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5,6-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N 0.000 description 2
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 2
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 241001674044 Blattodea Species 0.000 description 2
- 206010011033 Corneal oedema Diseases 0.000 description 2
- 206010015946 Eye irritation Diseases 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000012274 Preoperative evaluation Methods 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BGDKAVGWHJFAGW-UHFFFAOYSA-N Tropicamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(CO)C(=O)N(CC)CC1=CC=NC=C1 BGDKAVGWHJFAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N Zinc monoxide Chemical compound [Zn]=O XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 210000002159 anterior chamber Anatomy 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 2
- 210000001217 buttock Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 201000004778 corneal edema Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 2
- 231100000013 eye irritation Toxicity 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 108700039708 galantide Proteins 0.000 description 2
- 238000009616 inductively coupled plasma Methods 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 2
- 238000001558 permutation test Methods 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 2
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 2
- RTVRBWMZXZDOAZ-UHFFFAOYSA-M (2-carboxyphenyl)sulfanyl-ethylmercury;sodium Chemical compound [Na].CC[Hg+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1S RTVRBWMZXZDOAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GQEZCXVZFLOKMC-UHFFFAOYSA-N 1-hexadecene Chemical group CCCCCCCCCCCCCCC=C GQEZCXVZFLOKMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMUDPLZKKRQECS-UHFFFAOYSA-K 3-[18-(2-carboxyethyl)-8,13-bis(ethenyl)-3,7,12,17-tetramethylporphyrin-21,24-diid-2-yl]propanoic acid iron(3+) hydroxide Chemical compound [OH-].[Fe+3].[N-]1C2=C(C)C(CCC(O)=O)=C1C=C([N-]1)C(CCC(O)=O)=C(C)C1=CC(C(C)=C1C=C)=NC1=CC(C(C)=C1C=C)=NC1=C2 BMUDPLZKKRQECS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 4-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C1C(C(O)=O)N(C(=O)OC(C)(C)C)CC1NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012260 Accidental injury Diseases 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 241000282709 Aotus trivirgatus Species 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000272161 Charadriiformes Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 206010051625 Conjunctival hyperaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010010726 Conjunctival oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000031354 Hyphema Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- SUAKHGWARZSWIH-UHFFFAOYSA-N N,N‐diethylformamide Chemical compound CCN(CC)C=O SUAKHGWARZSWIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010034203 Pectus Carinatum Diseases 0.000 description 1
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M Pentobarbital sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)[N-]C1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920000153 Povidone-iodine Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 244000184734 Pyrus japonica Species 0.000 description 1
- 206010037867 Rash macular Diseases 0.000 description 1
- 101710205840 Ribonuclease P protein component 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100028671 Ribonuclease P/MRP protein subunit POP5 Human genes 0.000 description 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 208000034698 Vitreous haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940030600 antihypertensive agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002220 antihypertensive agent Substances 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 238000009530 blood pressure measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000006229 carbon black Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 229920005556 chlorobutyl Polymers 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- BQYJATMQXGBDHF-UHFFFAOYSA-N difenoconazole Chemical compound O1C(C)COC1(C=1C(=CC(OC=2C=CC(Cl)=CC=2)=CC=1)Cl)CN1N=CN=C1 BQYJATMQXGBDHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone Chemical compound OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002899 effect on cataract Effects 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 1
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100000040 eye damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 230000036449 good health Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 229920005555 halobutyl Polymers 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 229940109738 hematin Drugs 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000004614 iritis Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004184 ketamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229960002900 methylcellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229940087766 mydriacyl Drugs 0.000 description 1
- AJFDBNQQDYLMJN-UHFFFAOYSA-N n,n-diethylacetamide Chemical compound CCN(CC)C(C)=O AJFDBNQQDYLMJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940023490 ophthalmic product Drugs 0.000 description 1
- 238000002577 ophthalmoscopy Methods 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229960002275 pentobarbital sodium Drugs 0.000 description 1
- 210000002640 perineum Anatomy 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229960001621 povidone-iodine Drugs 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011241 protective layer Substances 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 description 1
- 230000010344 pupil dilation Effects 0.000 description 1
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 231100000019 skin ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 210000001760 tenon capsule Anatomy 0.000 description 1
- 125000005207 tetraalkylammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000732 tissue residue Toxicity 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 229960004791 tropicamide Drugs 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000008154 viscoelastic solution Substances 0.000 description 1
- 210000002395 vitreous cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011787 zinc oxide Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
- C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
- C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás szemsebészeti célőkra alkalmas, nagytisztaságú, 750 000 és 1 230 000 közötti átlagős mőlekűlatömegűhialűrőnsav-frakció és/vagy egyé , gyógyászatilag alkalmas sójaelőállítására, őly módőn, hőgya hialűrőnsavat állati szövetből, főkénttyúktaréjból szerves őldószerrel, vassal kelátőt képező szer(vaskelátképző szer) jelenlétében extrahálják,a kapőtt vasmenteshialűrőnsavat tartalmazó kivőnatőt prőteőlitikűs szerrel kezelik,ahialűrőnsavat tartalmazó kivőnatőt kvaterner ammóniűmsó alakjában lévősavas iőncserélővel hőzz k érintkezésbe,az iőncserélőről származókivőnatőt a hialűrőnsav kvaterner ammóniűmsójának őldására alkalmasszerves őldószerben őldják,a hialűrőnsav kvaterner ammóniűmsójátnátriűmsóvá alakítj kés elkülönítik, és adőtt esetben azthialűrőnsavvá vagy gyógyászatilag alkalmas más sókká átalakítják. ŕ
Description
A találmány tárgya új eljárás egy eddig le nem írt tisztaságú, vasmentes, 750000 és 1 230000 közötti átlagos molekulatömegű hialuronsav-frakció és ennek sói, különösen a nátriumsója előállítására.
A hialuronsav (a továbbiakban esetenként rövidítve: HA) a glikózamino-glikánok (mukopoliszacharidok) néven ismert biológiai makromolekulák egyik jellegzetes és fontos képviselője. A hialuronsav - mely biológiai eredetű polimer - azonos molekulaszerkezettel megtalálható a gerincesek szervezetének valamennyi kötőszövetében, s ott szerkezeti és biológiai szerepet tölt be, mivel helyi koncentrációi szoros összefüggésben állnak a tónussal, a trofizmussal és - sérülés esetén - a szövetek regenerálódásával. E biológiai anyagok fiziológiai szerepéről áttekintést ad W. D. Comper és T. C. Laurent [,,A kötőszöveti poliszacharidok fiziológiai szerepe”, Phys. Rév. 58, 255-315 (1978)]. A hialuronsav fizikai-kémiai sajátságai abból erednek, hogy ez az anyag egy szacharid-biopolimer (amely D-glükuronsavból és N-acetil-glükózaminból áll), amelyek egymással váltakozva polimerizált, el nem ágazó láncokat alkotnak; molekulatömegük legfeljebb 8 000000 dalton [K. Meyer: „A hialuronsav kémiai szerkezete”, Fed. Proceed. 17, 1075 (1958); T. C. Laurent: „A sejten belüli mátrix kémiája és molekuláris biológiája”, Academic Press Ν. Y., 703-732 old. (1970)]. E biopolimer viselkedése vizes oldatban különleges viszkozitást - úgynevezett viszkoelaszticitást - biztosít, amely egyes biológiai folyadékokra, így az ízületi (szinoviális) nedvre és az üvegtestre jellemző, ahol a hialuronsav koncentrációja 0,12-0,24 t% [E. A. Balazs és munkatársai: „A hialuronsav és a csamokvíz, valamint üvegtest helyettesítése”, Med. Probl. Ophthal. 10, 3-21 (1972)]. Úgy találták, hogy az emberi eredetű csamokvíz is tartalmaz hialuronsavat 1,14 pg/g átlagos koncentrációban [U. B. G. Laurent: „Hialuronát az emberi eredetű csarnokvízben”, Arch. Ophthalmol. 101, 129-130(1983)].
Számos bizonyítékot közöltek, melyek azt mutatják, hogy az exogén (kívülről bevitt) hialuronsav helyi alkalmazása kötőszöveti és hámszöveti kóros állapotok nagyszámú típusában jól meghatározott, terápiás és védő hatású előnyökkel jár. Ilyen kóros állapotok például:
- a szöveti regenerálódás romlása nem gyógyuló bőrfekélyek esetében;
- izületi kötőszövetek artrózisos degenerálódása; valamint
- szemsebészeti beavatkozások.
Különösen értékelhető az a lehetőség - amelyet a hialuronsav viszkoelasztikus jellege biztosít -, hogy a károsodás veszélyének kitett szövetek sebészi beavatkozások során hialuronsawal bevonhatók. Valamennyi sebész szerint, akik hialuronsavat alkalmaztak, az exogén hialuronsavból álló viszkózus réteg jelenléte olyan szöveteken, amelyeket véletlenszerű sérülés leginkább veszélyeztet (ilyen például a szaruhártya), hatásos védelmet nyújt: azt alátámasztja, hogy e védőréteg nagymértékben hozzájárul a műtét sikeres kimeneteléhez.
Az exogén hialuronsavnak szaruhártyára kifejtett védő és a szöveti regenerálódást előmozdító hatását mind kísérleti állatokon [D. Miller és munkatársai: „Nátrium-hialuronát alkalmazása nyulakon végzett intraokuláris lencsebeültetések során”, Ophthalmic Surgery 8, 58-61 (1977); D. Miller és munkatársai: „Nátrium-hialuronát alkalmazása nyulakon végzett autokomeális átültetés során”, Ophthalmic Surgery 11, 19-21 (1980); E. L. Graue és munkatársai: „Nátriumhialuronát védőhatása a szaruhártya-endotéliumra”, Exp. Eye Rés. 31, 119-127 (1980); L. Ozaki és munkatársai: „Szemen belüli (intraokuláris), Healonnal bevont lencse védőhatása a szaruhártya-endotéliumra”, Fólia Ophthalmologica Japonica 32, 1301-1305 (1981)], mind embereken igazolták [M. Norm: „A szaruhártya és kötőhártya műtét előtti védelme”, Acta Ophthalmologica 59, 587-594 (1981); F. M. Polack és munkatársai: „Nátrium-hialuronát (Healon) használata szaruhártya-plasztikában és intraokuláris lencsebeültetésben (IOL)”, Ophthalmology 88, 425-431 (1981)].
Több eljárás ismert a terápiásán - különösen a fenti célokra - alkalmazható tisztított hialuronsav, valamint egyes nagy tisztaságú frakcióinak az előállítására.
A közvetlenül szerves anyagokból, például tyúktaréjból közvetlen extrakcióval kapott összes hialuronsav-frakciók molekulatömege széles határok között így például az összes hialuronsav molekulatömegének körülbelül 90%-80%-ától annak 0,2%-áig, előnyösen annak 5%-ától 0,2%-áig terjedő tartományban - váltakozhat. Az összes hialuronsavból a frakciókat hidrolízissel vagy enzimatikus úton kémiai anyagokkal, vagy oxidációval vagy fizikai eljárásokkal, például mechanikai úton vagy besugárzással állítják elő, ezért az elsődleges kivonatok kinyerését gyakran az említett tisztítási eljárások alkalmazásával végzik [lásd például: Balazs és munkatársai: „Kozmetikai és higiéniai készítmények” (könyveim angolul), olasz nyelvű kiadás 5/84 sz., 8-17 old.)]. A különböző molekulatömegű frakciók elválasztását és tisztítását ismert eljárásokkal érik el.
A 4 141 973 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban például olyan, legalább 750000 dalton molekulatömegű hialuronsavak előállítási eljárását közlik, amelyek, tekintettel különösen nagy tisztaságukra és gyulladást okozó hatástól való mentességükre, szemműtétek során alkalmazhatók. Ez az eljárás abban áll, hogy a kiindulóanyagból kivonják a hialuronsav-nátriumsót, az így kapott kivonatból az alkalmazott állati szervezetből származó vérmaradékot eltávolítják, az így kapott kivonatot fehérjementesítik, a gyulladást okozó szennyezéseket kiküszöbölik, az így kapott terméket vizes oldatban sterilizálószerrel kezelik, majd a vizes oldatból a hialuronsavsót szerves oldószerrel kicsapják. A vérmaradékokat etanollal távolítják el; a hialuronsavat nátriumsója alakjában (mivel a kiindulóanyagokban ebben a formában van jelen) vízzel kivonják, a fehérjementesítést híg savas kezeléssel érik el, és egyidejűleg a hidrolizált alkotórészeket (komponenseket) kloroformmal extrahálják, vagy proteolitikus enzimeket alkalmaznak; a káros, gyulladást előidéző anyagokat 6-7 pH-η kloroformmal extrahálják; végül a sterilizálást cetil-piridinium-klori2
HU 215 193 Β dós kezeléssel végzik. Ezen eljárás alkalmazásával egyedül a szabadalmi leírásban konkrétan közölt, a leírás szerint 1 586000 dalton molekulatömegű hialuronsav-frakciót kapják. Kémiai, fizikai és biológiai sajátságok alapján úgy látszik, hogy a hialuronsavnak ilyen molekulatömegű frakciója megfelel a „HEALON” védett néven ismert, kereskedelmi forgalomban lévő terméknek.
Új technológiai eljárásokat fejlesztettek ki, ilyen például a molekuláris ultraszűrés. E tisztítási módszerrel lehetővé válik azoknak a hialuronsav-frakcióknak a kiküszöbölése, amelyek molekulatömege a hialuronsav molekulaméretei felső vagy alsó határának megfelelő értéket megközelíti. így például az 1 238 572 számú, 1990. július 25-én engedélyezett európai szabadalmi leírásban olyan eljárást ismertetnek, amelyek segítségével kapott nátrium-hialuronát-frakciók molekulatömege 250000 és 350000 dalton közötti érték. Ezen eljárás szerint a szerves anyagból extrakcióval közvetlenül kapott, és ezt követően papainnal enzimes úton fehérjementesített szerves terméket két molekuláris ultraszűrésnek vetik alá; az egyik szűrőmembrán kizárási határa 30 000 dalton, s ez annyit jelent, hogy csak azokat a frakciókat tartja vissza, amelyek molekulatömege 30000-nél nagyobb. Úgy látszik, hogy ez a frakcionálás lényeges olyan termék előállítása céljából, amelyek gyulladást előidéző szekundér hatásoktól mentesek, mivel az ilyen hatásokért felelős frakciók molekulatömege kisebb, például 30000 dalton körüli érték. További molekulaszűréssel - 200000 kizárási határral rendelkező membránok alkalmazásával (tehát olyan membránok alkalmazásával, amelyek csak 200000 daltonnál nagyobb molekulatömegű frakciókat tartanak vissza) olyan frakciót (szűrőn áthaladó frakciót) kapnak (e frakciót a szabadalmi leírásban HYALASTINE-nak nevezik), amelynek átlagos molekulatömege 50 000 és 100000 dalton között van, míg a szűrőn maradó nátrium-hialuronát-frakció átlagos molekulatömege 500000-730000 (ezt a frakciót HYALECTINE-nak jelölik).
A fentiekben ismertetett újabb eljárásokat is figyelembe véve, az ismert és a gyógyászati minőségű hialuronsav előállítása során alkalmazott tisztítási eljárás általában a következő lépéseket foglalja magában:
1) A poliszacharid kivonása (általában és főként nátriumsója formájában) az előzőleg feldarabolt és homogenizált állati szervekből. Ezt általában vízzel elegyedő szerves oldószerrel, például rövid szénláncú (1-6 szénatomos) alifás alkohollal vagy alifás ketonnal, így például etanollal vagy acetonnal végezzük.
2) Fehérjeanyagok eltávolítása megfelelő oldószerekkel végzett extrakcióval vagy az 1) lépésben kapott extraktum vizes oldatának proteolitikus enzim, például papain, pepszin, tripszin vagy pronáz és pufferanyag, például ciszteinhidroklorid-foszfát jelenlétében végzett emésztése útján.
3) Az 1) vagy 2) lépésben kapott extraktum dialízise.
4) Az előző lépések bármelyikében kapott oldat sterilizálása ismert baktericid hatású szerrel, például cetil-piridinium-kloriddal konyhasóoldatban. E műveletet általában többször megismételjük.
5) A különböző molekulatömegű hialuronsavpoliszacharid-frakciók, illetve sóik elkülönítése, illetve a nem kívánt frakciók kiküszöbölése például a határértékekhez közel álló molekulafrakciók eltávolítása, azaz a deklarált molekulamérettartománytól távol eső frakciók eltávolítása. E műveletet előnyösen molekuláris ultraszűrővel, például annak ismert módja szerint hajtjuk végre.
6) A tisztított frakció, illetve annak sója (például nátriumsója) elkülönítése a vizes oldatból alkalmas szerves oldószerrel, például valamilyen alkohollal végzett kicsapás útján.
Az eddig ismert és alkalmazott tisztítási eljárások során azonban mindig nehézséget képez a fémionok és különösen a vasionok, valamint az érzékeny szövetekben, különösen a szemben gyulladást és egyéb műtéti szövődményeket okozó szennyezések egyszerű és hatásos módon történő eltávolítása. A fémion-szennyezések eltávolításának szükségessége különösen azóta merült fel, amióta ismertté vált, hogy a hialuronsav kinyerésére alkalmazott állati szervekből származó, eddig általában figyelembe nem vett vasion-szennyezések a hialuronsav és származékai bomlását katalizálják a hialuronsav tartalmú készítmények tárolása során is (B. Halliwell, Febs Letters 96 (2), 238-242,1978).
A jelen találmány célkitűzése olyan új és könnyen kivitelezhető eljárás kidolgozása volt, amellyel különösen nagy tisztaságú, a szemészeti és szemsebészeti követelményeket kielégítő, a szokásos szerves és szervetlen szennyezésektől, így a fém-, különösen a vasionoktól mentes, viszonylag nagy, 750000 és 1230 000 közötti átlagos molekulatömegű hialuronsav-frakció állítható elő. Az e követelményeket kielégítő frakció különösen alkalmas szemsebészeti célokra is, a szövetek által jól tűrhető, gyulladást okozó hatása nincsen, és műtét utáni szövődményeket nem okoz. E termék jelentős további előnye, hogy műtét után helyben hagyható, anélkül, hogy műtét utáni komplikációk - különösen például túlzottan magas szemnyomás - lépnének fel; s ezáltal csökken az a veszély, amely a műtét utáni eltávolítással jár, s amelyet mindmáig a gyakorlatban alkalmaznak. E leírásban a továbbiakban ezt az új, tiszta, nátriumsója alakjában lévő hialuronsav-frakciót „HA-1 ” rövidítéssel jelöljük.
A találmány egyik alapját az a felismerésünk képezi, hogy a nyers vagy akár már részlegesen tisztított hialuronsavak vagy sóik, különösen a nátriumsók tisztítása és elkülönítése igen előnyösen végezhető úgy, hogy a tisztítandó hialuronsavat vagy sóit kvatemer ammóniumsóvá alakítjuk. A kvatemer ammóniumsók egyes szerves oldószerekben, így például aprotikus oldószerekben, különösen például N-metil-pirrolidonban könnyen oldódnak, a vizes fázisból ilyen oldószerekkel extrahálhatók, s így a technika jelenlegi állása szerint
HU 215 193 Β leírt eljárásokhoz képest különleges további tisztítás érhető el abban a műveletben, amely nyilvánvalóan felelős az eljárás befejeztével kapott tennék tisztasági fokáért. A hialuronsav-komponens például úgy alakítható kvatemer ammóniumsókká, hogy a nátriumsó vizes oldatát, amely más sókat, különösen konyhasót is tartalmaz, egy reaktorban vagy oszlopon, amely nagymolekulájú szulfonsav-ioncserélőt tartalmaz kvatemer ammóniumbázisokkal sóvá alakított formában - például tetrabutil-ammóniumsója alakjában - lévő DOWEX ΜΙ 5 gyantával kezeljük. Ez a gyanta úgy kapható, hogy a szulfonsav-gyantát kvatemer ammónium-hidroxidokkal, például tetrabutil-ammónium-hidroxiddal kezeljük. Az ammóniumsó az eluátumba kerül, és az ioncserélő gyantáról vízzel teljes mértékben eluálható. Ezt a vizes kivonatot szárazra pároljuk; a lepárlási maradék a poliszacharid ammóniumsója, amelyet egy fentebb említett oldószerben oldunk, és az oldhatatlan, szilárd termékeket szűréssel eltávolítjuk.
Általános vonatkozásában tehát a jelen találmány jellemző vonása, hogy egy hialuronsavat vagy annak valamelyik molekulafrakcióját vagy ezek valamely sóját úgy tisztítjuk, hogy 1-6 szénatomos alifás szénhidrogéncsoportokat (szubsztituenseket) tartalmazó kvatemer ammóniumsóvá alakítjuk.
A találmány szerinti eljárásnak egy másik jellemző vonása, hogy a hialuronsav vagy valamely molekulafrakciójának a kvatemer ammóniumsóját olyan szerves oldószerben gyűjtjük össze, amely e sókat oldja, utána a szűrt oldatból a hialuronsavat vagy annak molekulafrakcióját valamely fémsó alakjában elkülönítjük, és kívánt esetben az így kapott sókat - például önmagában ismert módon - további tisztításnak vetjük alá.
A jelen találmány további lényeges vonása a hialuronsavban mindig jelen levő és a gyógyászati felhasználás szempontjából káros vasionok eltávolítási módja, amely szerint a tisztítás során, előnyösen a nyers hialuronsavnak a kiindulási állati szövetekből való extrahálásakor az extraháló szerves oldószerhez a vasionokat keláttá alakító (vaskelátképző) szert, előnyösen 1,10-fenantrolint vagy annak dimetilszármazékát adjuk. Ismert, hogy a hialuronsav kinyerésére alkalmazott állati szövetek mint a tyúktaréj, köldökzsinór, kötőszövetek vagy bőrszövet vérmaradékából származó vasionok mindig jelen vannak az eredeti hialuronsav-kivonatokban, és ezek felelősek a poliszacharidlánc depolimerizációs folyamataiért. A fémionok kiküszöbölése nagyon hasznosnak bizonyult viszonylag nagy molekuletömegű hialuronsav-frakciók kinyerésében; ez kelátképzéssel érhető el. Ezzel a művelettel nem csupán nagy molekulatömegű hialuronsavak vagy sóik kaphatók, hanem különlegesen tiszta termékek is, amelyek a fentebb említett vasionok teljes hiánya következtében - vizes oldatokban stabilak.
A fentiek alapján tehát a találmány új eljárás olyan, 750000 és 1230000 közötti átlagos molekulatömegű, nagy tisztaságú hialuronsav-frakció vagy annak gyógyászatilag elfogadható sója előállítására, amelynek során
1) a hialuronsav valamilyen állati szervből, mint tyúkvagy kakastaréjból, köldökzsinórból, kötő- vagy bőrszövetből, előnyösen azonban a nagy mennyiségben rendelkezésre álló tyúktaréjból egy első, célszerűen vízzel elegyedő szerves oldószerrel, vassal kelátot képező szer (vaskelátképző szer) jelenlétében extrahálva vasionoktól lényegében mentes, hialuronsavat tartalmazó kivonatot kapunk;
2) az így kapott, hialuronsavat tartalmazó kivonatot proteolitikus szerrel kezeljük; előnyösen puffer jelenlétében;
3) az így kezelt hialuronsavat tartalmazó kivonatot kvatemer ammóniumsó alakjában lévő savas ioncserélővel hozzuk érintkezésbe;
4) az ioncserélőről kapott oldószeres kivonatot egy második, a hialuronsav kvatemer ammóniumsójának oldására alkalmas szerves oldószerben oldjuk;
5) a 4) lépésből származó elegyet nátrium-halogeniddel kezelve a hialuronsav kvatemer ammóniumsóját a megfelelő nátriumsóvá alakítjuk; és
6) a kapott hialuronsav-nátriumsóból - önmagában ismert műveletekkel a kívánt molekulatömeg-tartományú hialuronsav-nátriumsót elkülönítjük, és adott esetben azt hialuronsawá vagy gyógyászatilag alkalmas más sókká átalakítjuk.
A találmány szerinti eljárás gyakorlati kivitele során előnyösen oly módon járunk el, hogy a hialuronsavat és/vagy annak valamely sóját tartalmazó állati szövetet, például tyúk- vagy kakastaréjt, állati kötő- vagy bőrszövetet vízzel elegyedő szerves, a vasionokkal kelátot képező szert is tartalmazó oldószerrel, előnyösen 1,10fenantrolint tartalmazó acetonnal extrahálunk, ezt a műveletet a vasionok teljes eltávolításáig ismételjük, utána e mosóoldatok előzőleg megszárított maradékát proteolitikus enzim és megfelelő puffer jelenlétében vizes oldószerben összegyűjtjük, és az így kapott, előzőleg valamennyi szilárd maradéktól megszabadított oldatot rövid szénláncú (1-6 szénatomos) alifás csoportokat tartalmazó kvatemer ammóniumsó alakjában lévő, nagymolekulájú szulfonsav-ioncserélőn vezetjük át. Az ioncserélő gyantáról eluált oldatot szárítjuk, és a maradékot olyan szerves oldószerben oldjuk, amely a hialuronsavak és azok frakcióinak kvatemer ammóniumsóit oldja. Ezt követően az ammóniumsót valamilyen nátrium-halogenid, például nátrium-klorid vagy nátrium-bromid vizes oldatának a szerves oldathoz való hozzáadásával nátriumsóvá alakítjuk. A nátriumsó így kapott vizes oldatát vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel extraháljuk, és adott esetben ismételt dialízisnek vetjük alá. Az így kapott oldatot sterilezőszerrel kezeljük, és kívánt esetben a sterilizálás után kapott oldatot molekuláris ultraszűrésnek vethetjük alá. így bármely nemkívánt hialuronsav-poliszacharid-frakció eltávolítható. A nátrium-hialuronát kívánt frakcióit önmagában ismert módon izoláljuk.
A jelen találmány értelmében a kvatemer ammóniumsók oldásához előnyösen aprotikus oldószereket alkalmazhatunk, ilyenek: az N-alkil-pirrolidonok, különösen az N-metil-pirrolidon; dialkil-szulfoxidok, dialkil-karbonsavamidok, így különösen a rövid szénláncú (1-6 szénatomos) dialkil-szulfoxidok, különösen a dimetil-szulfoxid, valamint rövid szénláncú (1-6 szén4
HU 215 193 Β atomos) alkilcsoporttal helyettesített amidjai, például a dimetil- vagy dietil-formamid, valamint a dimetil- és a dietil-acetamid.
Az ioncserélő gyanta előállításához, s így a találmány szerinti, jellemző hialuronsav-ammóniumsók előállításához olyan tetraalkil-ammónium-bázisokat alkalmazunk, amelyek rövid szénláncú alifás csoportokat, előnyösen 1-6 szénatomos alkilcsoportokat tartalmaznak. Legelőnyösebb a tetrabutil-ammónium-ionnal sóvá alakított gyanta használata.
A hialuronsavak, valamint azok molekulafrakciói és sóik kivonására, tisztítására és elkülönítésére alkalmazott eljárási kombinációk, és különösen a fentebb leírt kombináció során, amely a találmány szerinti eljárás előnyös kiviteli módja, az alább felsorolt szerek (vegyszerek) alkalmazása előnyös:
(a) a kiindulóanyagként felhasznált állati szervek extrakciójához: etanol vagy aceton;
(b) vasionokkal kelátot alkotó szer: 1,10-fenantrolin vagy annak dimetilszármazéka;
(c) proteolitikus szerek: a fentebb már említettek;
(d) a kvatemer ammónimumsók oldásához: N-metil-pirrolidon vagy dimetil-szulfoxid;
(e) az ammóniumsók szerves oldatából kapott nátriumsó vizes oldatának tisztításához oldószerként: diklór-metán, etil-acetát;
(f) sterilizálószerként: cetil-piridinium-klorid foszfátpuffer jelenlétében; és (g) a tisztított vizes oldatból a nátriumsó lecsapására alkalmazható oldószerként, esetleg ultraszűrés után: etanol.
A fentebb kifejtett műveletek során olyan variációk vezethetők be, amelyek még tisztább végtermékek sikeres előállítását eredményezheti. így például, ha a fentiekben említett típusú sterilezőszerek heterociklusos gyűrűt és hosszú szénláncú alkilcsoportokat (például cetilcsoportot) tartalmazó kvatemer ammóniumsók, így például az említett cetil-piridinium-klorid, akkor ez egyszersmind tisztítási lépést is jelent, mivel ezeknek az anyagoknak a nátrium-hialuronát-oldathoz adása a hialuronsaviont tartalmazó megfelelő ammóniumsóhoz vezet. E sók vizes oldatból kiválnak, ez a kezelés tehátismételt kicsapás és a csapadék mosása útján - majd konyhasóban a csapadékot feloldva olyan nátriumhialuronát oldatot eredményez, amelyből ultratiszta termékek izolálhatok. Ezek a termékek a szemsebészeti alkalmazásra különösen megfelelőek.
A molekuláris ultraszűrést önmagában ismert módon hajtjuk végre: például olyan membránokat alkalmazunk, amelyek a nagyobb molekulatömegű, például 200000 daltonnál nagyobb molekulatömegű frakciókat visszatartják (kiszűrik), és kívánt esetben mind a kiszűrt terméket, mind a szűrletben lévő terméket kinyerhetjük. A jelen találmány szerinti eljárás különösen érdekes kiviteli módja abban áll, hogy a fentebb említett kémiai tisztítási műveleteket molekuláris ultraszűréssel kombináljuk, s így az utóbbi útján a kis molekulatömegű hialuronsav-frakciókat eltávolítjuk. Ismert, hogy ezek a frakciók felelősek a terápiás célokra alkalmazott termékek gyulladást okozó mellékhatásaiért, amint ezt a fentebb idézett 138,572 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett frakciók esetében közölték.
A termék alkalmazása a szemsebészetben:
Az irodalomban leírt és szemsebészetben ajánlott hialuronsavak nem teljesen elégítik ki az abszolút követelményeket, különösen azért, mert a műtét után - például hályogműtét után - nem hagyhatók helyben, mivel egyrészt gyulladást előidéző anyagokat, másrészt olyan komponensek nyomait tartalmazzák, amelyek molekulatömege és viszkozitása is túlságosan nagy. Ezek a termékek, mint fentebb említettük, a szemnyomást nem kívánt és veszélyes módon növelhetik. A műtét során az elülső szemcsarnokba bevezetett exogén hialuronsavnak nem szabad negatív hatást gyakorolnia a műtét utáni intraokuláris nyomásra, sem gyulladásos folyamatokat előidézni a szemen belüli környezetben. Az előbbi káros mellékhatást ismételten közölték az irodalomban; e hatás nagy molekulatömegű, rendkívül viszkózus hialuronsav alkalmazása után lép fel [C. D. Binkhorst: „Gyulladás és intraokuláris nyomás Healon intraokuláris szemlencsesebészeti alkalmazása után”, Am. IntraOcular Implant. Soc. J. 6, 340-341 (1980); L. G. Papé: „Tokon belüli és tokon kívüli szemlencseátültető eljárás Healon használatával”, Am. Intra-Ocular Implant. Soc. J. 6,342-343 (1980); M. S. Passo és munkatársai: „Hályogműtétet követő intraokuláris nyomás Healon alkalmazása során”, ARVO Abstracts 10, 10:45 (1981); P. Percival: „Tapasztalatok Boberg Ans lencse és nátriumhialuronát (Healonid) alkalmazásával”, Trans. Ophthal. Soc. UK, 102, 294-297 (1982); S. M. McRae és munkatársai: „Nátrium-hialuronát, kondroitin-szulfát és metil-cellulóz hatásai a szaruhártya-endotéliumra és az intraokuláris nyomásra”, Ann. J. Ophthalmol. 95, 332-341 (1983)].
Ez a tapasztalat vezetett ahhoz a javaslathoz, hogy a műtét után az anyagot fiziológiás konyhasóoldattal végzett öblítéssel távolítsák el. Berson és munkatársai [„A csamokvíz-kiáramlás gátlása kihámozott emberi szemben nátrium-hialuronáttal”, Am. J. Ophthalmol. 95, 668-672 (1983)g ennek a káros folyamatnak a mechanizmusát vizsgálták halál után kihámozott emberi szemen, és valószínűsítették, hogy ennek oka a fiziológiai elvezetóutak mechanikai elzáródása az elülső szemcsarnokban a bevezetett anyag túlságosan nagy viszkozitása következtében.
A 4141 973 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (szerzője Balazs) ismertetett nátrium-hialuronát-frakció, amelynek molekulatömege 1 586000 (lásd az idézett szabadalmi leírás 13. oszlopát) megadott fizikai-kémiai és biológiai sajátságai alapján a forgalomban lévő legjobb szemészeti terméknek látszik. „Healon” néven ismert, azonban a fentebb említett hátránytól nem mentes; azaz molekulatömege lényegében túlságosan nagy, ezért viszkozitása egyes szemműtétek során nem megfelelő.
Valójában, bár az idézett szabadalmi leírásban alkalmazott, a gyulladásgátló hatás mérésére alkalmazott teszt jó eredményeket adott, a Na-hialuronát a műtét után - például hályogműtétek után - nem hagyható a
HU 215 193 Β műtét helyén, mivel műtét utáni szövődményeket, például a szemnyomás növekedését idézheti elő.
A 4920104 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (feltaláló P. de Vore: tulajdonosa a Med Chem Products, Inc. Acton Mass.) közük és igényelik nátrium-hialuronát fiziológiás konyhasóoldattal készült viszkoelasztikus olyan oldatát, amelynek kinematikus viszkozitása 45 000 és 64 000 est között van, s olyan nátrium-hialuronátot tartalmaz, amelynek átlagos molekulatömege 1 000 000 és 2 000 000 dalton közötti érték. E terméket alkalmasnak nyilvánítják szemműtétek során történő alkalmazásra, ahol egyéb készítményeknél kedvezőbben használható, mivel műtét utáni mellékhatásai, különösen a műtét utáni szemnyomásnövekvés csekély.
E terméket azonban szintén el kell távolítani a műtét után - amint ez a szabadalmi leírás 2. és 3. táblázataiból (a leírás 4. oszlopában) látható -, míg az 1. táblázat azt mutatja, hogyha a terméket a műtét után helyben hagyják, akkor a szemnyomás növekszik.
Egy másik, szemészeti alkalmazásra használható nátrium-hialuronát-frakciót írnak le a 138572 számú európai szabadalmi leírásban, amelynek átlagos molekulatömege 500 000 és 7 300000 dalton között váltakozik (HYALECTIN). Ez a termék célszerűen alkalmazható endobulbáris folyadékok helyettesítésére, és szemműtéteknél, például hályogműtétek és szembeültetések során alkalmazzák. Szükség volt azonban olyan, nagyobb viszkoelaszticitással rendelkező termékekre, amelyek képesek a megfelelő térközök fenntartására az elülső szemcsamokban a műtét során, az üvegtest válaszának ellensúlyozására, valamint hatásos védelem céljára a szem belső szerkezetében enélkül, hogy a terméket a műtét után el kellene távolítani.
A fentiekből látható, hogy az irodalomban közölt nagy molekulatömegű, és a fentebb említett szemműtétek során alkalmazott termékeket a műtét után minden esetben el kell távolítani. A jelen találmány különleges előnye abban a tényben rejlik, hogy eredeti eljárást dolgoztunk ki viszonylag nagy molekulatömegű nátriumhialuronát-frakciók előállítására, s ezt úgy végezzük, hogy vasionokat kelátozó szereket adunk az extrakciós oldathoz, így megakadályozzuk a termék depolimerizációját kisebb molekulatömegű frakciókká, s így mentessé tesszük azoktól a szennyezésektől vagy frakcióktól, amelyek következtében a termék (műtét után) nem hagyható a szervezetben. Mindezek alapján a jelen találmány szerinti új HA-1 frakció figyelemre méltó újdonságot és nagy előrehaladást jelent a technika jelenlegi állásához képest.
A jelen találmány szerinti, az 1. és 2. példákban leírt eljárással kapható „HA-1” frakció jellemzői az alábbiak:
Viszkozitás: ezt az értéket a polimer oldatok esetében célszerűen alkalmazott határviszkozitási számban adjuk meg, amelynek definíciója „az (n-no)/n0C viszonyszámnak - ahol n a polimer-oldat kinematikus viszkozitása, n0 az oldószer kinematikus viszkozitása (mindkettőnek az SI egysége m2/s) és C a polimer koncentrációja — a 0 koncentrációt közelítő határértéke.” A koncentrációt gramm/deciliter, vagyis g/l00 cm3 egységekben megadva, a határviszkozitási szám egysége a fenti képlet alapján ennek a reciproka, vagyis 100 cm3/g. így a frakció 25 °C-on 0,15 mólos nátriumklorid oldatban 7,0 pH-értékben, az Ubbelohde „tartott szintű” viszkoziméterben meghatározott határviszkozitási száma 14,5 és 21 100 cm3/g értékek között van.
- Fehérjetartalom: a Lowry-teszttel meghatározva [J. Lowry és munkatársai: „Fehérje meghatározása a folin-fenol-reagenssel” J. Bioi. Chem. 193, 265-275 (1951)] és albuminban kifejezve legfeljebb 0,2 t%.
- U.V.: 257 nm hullámhosszon és 280 nm hullámhosszon az U.V. abszorbanciája 1 tömeg/térf.%os vizes oldatban mérve legfeljebb 1,0 A.U. (Az oldat U.V. adszorbanciájának mértéke az oldatba beeső sugárnyaláb intenzitását és az oldat által áteresztett sugárnyaláb intenzitása viszonyának logaritmusa; mértékének egységét A. U. (adsorbance unit) rövidítéssel jelölik.)
- Dinamikus viszkozitása: tömeg/térf.%-os 0,15 mólos nátrium-klorid-oldatban 7,0 pH-értéken, a meghatározott nyírási sebességeken, rotációs viszkoziméterben mérve (ehhez például az Egyesült Államok XXII. Gyógyszerkönyvének 1619. oldalán leírt eszköz használható) 20 °C-on legfeljebb az alábbi érték:
| Nyírási sebesség | Dinamikus viszkozitás (mPa.s 20 °C-on) |
| 1 s-l | legfeljebb 20 000 mPa.s |
| 10 s-l | legfeljebb 2000 mPa.s |
| 100 s-l | legfeljebb 1000 mPa.s |
| 350 s-l | legfeljebb 500 mPa.s |
- Szulfatált mukopoliszacharid-tartalma: induktívan kapcsolt plazmaeszközzel („coupled plasma instrument, rövidítve I. C. P.”) mérve megfelelő összehasonlító anyag alkalmazásával, kénben kifejezve legfeljebb 0,071%.
- Vastartalma: atomabszorpciós méréssel vagy
I. C. P. eszközzel meghatározva legfeljebb 10 ppm.
- Stabilitása: a pufferolt izotóniás, a HA-1 frakció fiziológiai pH-értékével rendelkező, természetes úton öregített, hővel sterilizált oldat stabilitása a viszkozitási szám határértékeinek meghatározása alapján, az átlagos molekulatömeg megfelelő csökkenésében kifejezve nem haladja meg az alábbi határértékeket:
- 25 °C-on 6 hónapig tárolva a kezdeti érték 97%-a;
- 118 °C hőmérsékleten 32 percig sterilizálva a kezdeti érték 75%-a;
- 121 °C hőmérsékleten 16 percig sterilizálva a kezdeti érték 80%-a; és
- 124 °C hőmérsékleten 8 percig sterilizálva a kezdeti érték 90%-a.
A jelen találmány szerinti HA-1 hialuronát-frakció kiváló sajátságait mutatják az alábbi kísérletek.
A HA-1 FRAKCIÓ SZEMEN BELÜLI ELVISELHETŐSÉGE (INTRAOKULÁRIS TOLERABILITÁSA) VIZSGÁLATA MAJMOKON
HU 215 193 Β
A vizsgálat célja
E tesztet azon céllal végeztük, hogy kiértékeljük majmokon a HA-1 szemészeti tolerabilitását a szem üvegtestébe adott injekció után.
Anyagok és módszerek
1. A vizsgált állatfajok
E vizsgálatainkhoz hat fiatal, érett nőstény Macaca fascicularis majmot alkalmaztunk. Az állatok egészségi állapota jó volt, kimutatható szemkárosodásban nem szenvedtek.
E vizsgálatainkhoz főemlősöket választottunk, mert ezeket tekintik a legmegfelelőbb állatfajnak a szemsebészetben alkalmazott viszkoelasztikus termékek szemészeti tolerabilitásának a vizsgálatára. A Macaca fascicularis majmot azért választottuk, mert a szemészeti tolerabilitás vizsgálatára előzőleg alkalmazott Douroucoulis majom jelenleg veszélyeztetett állatfaj, s így törvényes védelem alatt áll.
2. Vizsgálati csoportok és a csoportokban alkalmazott megfelelő kezelések
A csoportok megtervezése, dózisszintek:
A majmokat egyszer kezeltük az alábbi ütemezés szerint:
| Az állat sorszáma | Dózis- szint (ml) | A befecskendezés helye | |
| ajobb szem | a bal szem | ||
| 1. | 0,5 | konyhasóoldat | HA-1 |
| 2. | 0,5 | HA-1 | konyhasóoldat |
| 3. | 0,5 | konyhasóoldat | HA-1 |
| 4. | 0,5 | HA-1 | konyhasóoldat |
| 5. | 0,5 | konyhasóoldat | HA-1 |
| 6. | 0,5 | HA-1 | konyhasóoldat |
3. az állatok előkészítése és adagolás
A műtét napján a majmokat pentobarbitál-nátriummal kiegészített ketamin hidrokloriddal elaltattuk, majd pupillájukat helyileg alkalmazott 1,0 t%-os tropikamid-dal (Mydriacyl, az Alcon Laboratories cég készítménye) tágítottuk. A szaruhártyát, kötőhártyát, függelékeket és az elülső szegmentumot réslámpás biomikroszkóppal, a hátsó szegmentumot közvetett szemtükrözéssel vizsgáltuk meg. A szemhéj körüli bőrt úgy készítettük elő a műtéthez, hogy kétszer mostuk és öblítettük 0,5 t%-os poli(vinil-pirrolidon)-jód-, valamint steril konyhasóoldattal. Steril szem- és szemhéjtükröt helyeztünk el, és a szemgolyót egy kis fogascsipesszel stabilizáltuk. Éles és tompa metszést alkalmaztunk a szaruhártyaszéli kötőhártyalebeny feltárására megközelítőleg 10 mm-re a felső szaruhártyaszéltől, azzal párhuzamosan, körülbelül 10-15 mm hosszúságban. A metszést a kötőhártyán és a Tenon-tokon át az ínhártyáig végeztük. A lebenyt úgy preparáltuk, hogy a szaruhártya széle előtt előzetesen metszést végeztünk, s így feltártuk az alatta lévő ínhártyát és a felette elhelyezkedő pars plana-t. A szaruhártya szélétől körülbelül 5-6 mm-re ínhártyán belül 7-0 Vicyrl (Ethicon) betétvarratot helyeztünk el, mintegy 3 mmes varratközökkel.
25-mércés (méretű) tűt alkalmaztunk 0,5 ml üvegtest leszívására (2 állaton csak 0,5 ml folyadékot tudtunk leszívni); az üvegtestet azonos térfogatú HA-1-val (koncentrációja 12 mg/ml) vagy steril konyhasóoldattal helyettesítettük. A betétvarratot megerősítettük a szivárgás kiküszöbölése céljából, és a kötőhártyalebenyt visszahelyeztük. Helyileg antibiotikum-kenőcsöt alkalmaztunk. A leszívott üvegtestfolyadékban az üvegtestsejtszámot hemacitométer (vérsejtszámláló) alkalmazásával határoztuk meg az adagolás előtt és körülbelül 48 órával adagolás után.
Megfigyelések és feljegyzések (jegyzőkönyv)
A műtét után körülbelül 48 órával az állatokat elaltattuk, és szemtükrözést végeztünk. Az altatást, a pupillatágítást és a vizsgálatot a fentebb leírt módon hajtottuk végre. A vizsgálatot vakpróbában is elvégeztük olyan értelemben, hogy a vizsgáló nem tudta, hogy a kérdéses szemet HA-1 termékkel vagy kontrollanyaggal kezelték-e.
A szem paramétereit az alábbi megadott pontozóskála (standard mérték) szerint osztályoztuk.
Kötőhártya-ödéma, befecskendezés és váladék; szaruhártya-ödéma, hematin, sejtek és pirosodás:
= normális +1= enyhe +2 = mérsékelt +3 = súlyos vagy kiterjedt; az üvegtest tisztasága:
= tiszta = enyhe homályosodás, a szemfenék látható = mérsékelt homályosodás, a szemfenék alig látható = homályosság, vörös szemfenéki reflex = homályosság, szürke szemfenéki reflex = a szemfenék nem látható.
A szemeket a leszíváshoz a fentebb leírtak szerint, povidon-jód-oldat alkalmazásával készítettük elő. Szemhéjtükröt helyeztünk el, és a szemgolyót egy kis fogastűvel stabilizáltuk. Közvetlenül a kötőhártyán és az ínhártyán át, a szem felső halántéki negyedében, a szaruhártya szélétől 6 ml-re 0,1-0,2 ml üvegtestet szívtunk le. Ügyeltünk arra, hogy az eredeti műtéti helyet elkerüljük. A gyulladásos sejteket hemacitométerrel megszámoltuk. Helyileg ismét antibiotikum-kenőcsöt alkalmaztunk.
EREDMÉNYEK
Az 1. táblázat adatai alátámasztják, hogy a HA-1 tolerabilitása nagyon jó, és a kontrollanyaggal (konyhasóoldattal) összehasonlítva jelentős szemingerlést (szemirritációt) nem idézett elő.
A konyhasóval kezelt csoportban két állaton enyhe csarnokvizes sejtbeszűrődést és pirosodást figyeltünk meg. A kontroll üvegtestében a fehérvérsejtek száma 10-60 sejt/mm3 között változott. Egy HA-1 termékkel kezelt állaton a csamokvízben enyhe sejtes beszűrődést és pirosodást tapasztaltunk. A kezelt szemek üvegtestében a fehérvérsejtszám 0—30 sejt/mm3-nek adódott.
HU 215 193 Β
1. táblázat
A HA-1 tolerabilitása a szemben (konyhasóoldattal összehasonlítva)
| Idő (óra) | Kötőhártya | Szaru- hártya | Elülső csarnok | Szem- lencse | Üvegtest | |||||
| Ödéma | Injekció | Váladék | Ödéma | Hem | Piro- sodás | Sejt | Hályog | Tiszta- ság | Sejtszám | |
| Jobb szem | ||||||||||
| 0 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0(1/6); 10 FVS - néhány VVS (1/6); 10 FVS-sok VVS (1/6); 0 FVS - néhány VVS (3/6) |
| 48 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | +1/6 | +1/6 | 0/6 | 0/6 | 0(2/6); 20 FVS (2/6); 10 FVS (1/6); 10 FVS - néhány VVS (1/6) |
| Bal szem | ||||||||||
| 0 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0(2/6); 0 FVS - néhány VVS (2/6); 10 FVS-sok VVS (2/6) |
| 48 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | +2/6 | +2/6 | 0/6 | 0/6 | 0-5-10-15-30-60 FVS* |
* Egyedi értékek minden egyes majom esetére külön-külön. Magyarázat a táblázathoz:
A jobb szembe 0,5 ml konyhasóoldatot fecskendeztünk;
A bal szembe 0,5 ml hyaloftil-t fecskendeztünk;
FVS: fehérvérsejt (szám);
VVS: vörösvérsejt (szám);
Mindezek alapján a konyhasóval mint kontrollal végzett összehasonlításból következtethető, hogy a HA-1 terméket az üvegtesten belüli helyettesítés után a szemszövetek kitűnően tűrik.
Klinikai vizsgálatot végeztünk HA-1 és Healon hatékonyságának a kiértékelésére extrakapszuláris hályogeltávolítási műtét során a hátsó csarnokban végzett szemen belüli lencsebeültetéssel.
A vizsgálat célja
E vizsgálataink során kiértékeltük a HA-1 hatékonyságát és biztonságát a forgalomban lévő legjobb viszkoelasztikus termékkel (Healonnal) összehasonlítva hályogeltávolítás és intraokuláris lencsebeültetés során két klinikai kísérletben. Az első klinikai kísérletben a HA-1 és a Healton terméket azonos kísérleti körülmények között vizsgáltuk (a műtét után mindkettőt leszívtuk). A második kísérletben elsősorban a HA-1 gyógyszerbiztonságát figyeltük meg egyrészt a műtét utáni szemnyomás, másrészt az endoteliális sejtszám vonatkozásában; e második vizsgálatunkban (eltérően az elsőtől, ahol mindkét viszkoelasztikus anyagot leszívtuk a műtét után) a HA-1 terméket a műtét befejezése után nem távolítottuk el; a Healtont viszont leszívtuk a szemről.
Anyagok és módszerek 1. A vizsgálat megtervezése
Mindkét vizsgálatot randomizáltan végeztük, párhuzamos csoportban, ismeretlen megfigyelőkkel (a műtét utáni megfigyelést más személyek végezték), és kiértékeltük a HA-1 hatását Healtonnal összehasonlítva extrakapszuláris hályogeltávolítás és hátsó csarnoki intraokuláris lencsebeültetés során. Minden egyes vizsgálatban aggkori hályoggal elsődlegesen diag30 nosztizált, illetve 18 évnél idősebb betegeket választottunk.
Részletesebben:
- Az első vizsgálatban 217 betegünk vett részt; ezeket körülbelül 3:1 arányban, randomizáltan kezel35 tűk (161 beteget HA-1 termékkel, 56 beteget Healonnal).
A műtét után mindkét viszkoelasztikus anyagot leszívtuk.
A vizsgálati periódus műtét előtti kiértékelésből, a 40 műtéti eljárásból és a műtétet közvetlenül követő időszakban végzett megfigyelésből állt. E vizsgálat során a szemen belüli nyomást a műtét után 3 óránként mértük, majd az ezt követő megfigyelési periódusban a műtét utáni 1., 7. és 30. napokon vizsgáltuk.
- A második klinikai vizsgálatban 91 betegünk vett részt, ezeket körülbelül 1:1 arányban kezeltük HA-1 termékkel (45 beteget), illetve Healtonnal (46 beteget).
E vizsgálat során a HA-1 g terméket a műtét után 50 nem szívtuk le, ezzel szemben a Healtont - ugyanúgy, mint az első vizsgálatban - leszívtuk. A vizsgálati periódus (és a megfelelő vizsgálati anyag a HA-1 esetében) azonos volt az első vizsgálattal.
Ebben a vizsgálatunkban a műtét utáni, szemen be55 lüli nyomást a műtét után 1,3, 6 és 9 órával (tehát gyakrabban, mint az első vizsgálatunkban) mértük, majd a megfigyelési időszakban a műtét után 1, 7, 30 és 90 nappal vizsgáltuk. E vizsgálat során a kísérlet kezdetén, majd a műtét után 90 nappal tükörmikroszkópos vizsgálatot is végrehajtottunk.
HU 215 193 Β
2. Az adatok elemzése, statisztikai módszerek
Statisztikai elemzést végeztünk azzal a céllal, hogy kiértékeljük a kezelt csoportok összehasonlíthatóságát (alfa = 0,10), valamint biztonságát és hatásosságát (alfa = 0,05). Az adatok kiértékelésére a Fisherféle egzakt tesztet, t-próbát és leíró statisztikát alkalmaztunk.
3. A vizsgált populáció és jellemzői
Összesen 308 beteget vizsgáltunk a következő meg5 oszlással:
| 1. vizsgálat | 2. vizsgálat | |||||
| HA-1 | Healon | Összesen | HA-1 | Healon | Összesen | |
| Kezdetben | 158 | 56 | 214 | 41 | 46 | 87 |
| az 1. napon | 158 | 56 | 214 | 41 | 46 | 87 |
| a 7. napon | 158 | 56 | 214 | 39 | 45 | 84 |
| a 30. napon | 157 | 54 | 211 | 41 | 44 | 85 |
| a 90. napon | - | - | - | 42 | 43 | 85 |
A legtöbb demográfiai, orvosi és hályogbetegségi jellemzők szempontjából a két kezelési csoport között egyik vizsgálatban sem voltak jelentős különbségek.
4. A műtét 25
Előkészítés és módszerek:
A műtétet a vizsgáló azzal a standard sebészi eljárásával végezte, amely komplikáció nélküli aggkori, illetve felnőttkori extrakapszuláris hályogeltávolításra alkalmazható a hátsó kamrában végzett intraokuláris len- 30 cseátültetéssel. A műtét előtti (profilaktikus) gyógyszerelést, altatást és a műtét alatti gyógyszerelést a vizsgáló orvos standard eljárásával, azonban szemben alkalmazott vérnyomáscsökkentők alkalmazása nélkül végezte, a bemetszés előtt a szemen belüli nyomást Honan-féle 35 szemnyomáscsökkentővel vagy „Super Pinky” vagy manuális nyomás alkalmazásával a lehető legalacsonyabb értékre csökkentettük. A HA-1 és Healon viszkoelasztikus anyagokat a fentebb leírtak szerint alkalmaztuk. 40
A termékeket a műtét után eltávolítottuk, kivéve a második klinikai vizsgálat során alkalmazott HA-1 terméket, amelyet a helyén hagytunk.
Mind a HA-1, mind a Healon terméket az elülső csatornákba vezettük be a műtéti eljárás megkönnyítése 45 és a szemszövetek védelme céljából, közelebbről:
Az első vizsgálatban:
-Az alkalmazott HA-1 átlagos mennyisége (0,568 ml térfogatú, 12 mg/ml koncentrációjú oldat) jelentősen nagyobb volt, mint az alkalmazott 50 Healon térfogata (0,439 ml térfogatú, 10 mg/ml koncentrációjú oldat), bár ez a különbség csupán 0,129 ml volt.
A második vizsgálatban:
- a viszkoelasztikus anyagok alkalmazott átlagos 55 mennyiségében nem állt fenn jelentős különbség; ebben az esetben a HA-1 termékből 0,957 ml és a Healon termékből 0,833 ml átlagos mennyiséget használtunk.
5. Ellenőrző vizsgálatok:
A műtét előtt, alatt és után az alábbi vizsgálatokat végeztük:
a) műtét előtti kiértékelés, például az alábbi jellemzők megállapítására:
- látásélesség (a legjobb érték), nyomásmérés (tonometria), vastagságmérő módszer (a szaruhártya vastagságának megállapítására), valamint réslámpás és oftalmoszkópiás vizsgálatok;
- szemtükrös mikroszkópia (csak a második vizsgálatban): az endoteliális sejtszámot szemtükrös mikroszkóppal állapítottuk meg a szaruhártya közepének 10 kiválasztott helyén. Minden egyes sejtszámot a megfelelő faktorral korrigáltunk, hogy a négyzetmilliméterre eső sejtszámot és az átlagot megkapjuk, és a négyzetmilliméterre eső reprezentatív sejtszámot megadjuk.
b) műtét utáni kiértékelések, így:
- a szemen belüli nyomást (tonometriával) mértük;
- a műtét után 3 órával (az 1. vizsgálatban);
- a műtét után 1, 3, 6 és 9 órával (a 2. vizsgálatban);
- oftalmoszkópiás és réslámpás vizsgálatok, vastagságmérés (pachimetria), tonometria, szemtükrös mikroszkópi vizsgálat (az utóbbit csak a 2. vizsgálatban végeztük az endoteliás sejtszám megállapítására), valamint a látásélesség mérése (a műtét utáni megfigyelő vizsgálatok során) a következő időpontokban:
- a műtét után 1, 7 és 30 nappal az 1. vizsgálatban;
- a műtét után 1, 7, 30 és 90 nappal a 2. vizsgálat során.
EREDMÉNYEK
1. az alkalmazott viszkoelasztikus anyagok jellemzőinek műtéti kiértékelése
A viszkoelasztikus termékeket valamennyi kezelt csoportban, mindkét klinikai kísérlet során összehasonlítható arányokban végzett lencseátültetések megkönnyítése alapján értékeltük.
2. Műtét utáni szövődmények
2a) az 1. klinikai kísérletben:
- amint a 2. táblázatból látható:
HU 215 193 Β
- A szövődmények legmagasabb százalékban (az összes betegek 7,9%-ánál) a műtét és az 1. nap vége között léptek fel; a 7. és 30. napon ez a százalékos érték kisebb volt.
- A műtét utáni 1. napon a Healonnal kezelt betegeken 2,5-ször magasabb számban (14,3%) léptek fel szövődmények, mint a HA-1 termékkel kezelt betegeken (5,7%). Ez a különbség statisztikailag jelentős (p = 0,079y) a Fisher-féle kétrekeszes egzakt próba alapján). A 7. és 30. napokon a különbségek statisztikailag nem voltak jelentősek (p>0,6 a Fisher-féle próba alapján).
A szövődmények például a szemen belüli nyomás 30 Hgmm-val vagy még nagyobb értékkel megfigyelt növekvésében jelentkeztek =7/158 = 4,4% a HA-1 termékkel kezelt betegeken, míg 5/56 = 8,9% a Healonnal kezelt betegeken); további szövődményként lépett fel szaruhártyaödéma, szivárványhártya-gyulladás, kötőhártya-gyulladás, hyphaema (vérzés az elülső szemcsarnokban), foltos ödéma, sebszivárgás, bevérzés a sugártestmembránban és a kötőhártya alatt.
A 3. táblázatból - amelyben közöljük a műtét előtt és a műtét után (a 3. órában, valamint 1., 7. és 30. napokon) kapott tonometriás adatokat - látható, hogy:
- a kezelt csoportok között a szemen belüli átlagos nyomás vonatkozásában nem adódtak jelentős különbségek; azonban a Healonnal kezelt betegek esetében mind a műtét után 3 órával, mind 1 nappal nagyobb volt a szemen belüli nyomás növekvése, és jelentősen nagyobb volt a szemen belüli nyomás standard deviációja, mint a HA-1 termékkel kezelt betegeken az 1. napon.
A réslámpás, pachimetriás (a szaruhártya vastagságát mérő) és oftalmoszkópiás vizsgálatok a két csoport között nem mutattak jelentős különbséget.
2b) A 2. klinikai kísérletben:
- a Healonnal kezelt betegeken kissé nagyobb arányban (37,0%-ban) jelentkeztek műtét utáni szövődmények, mint a HA-1 termékkel kezelt betegeken (28,6%-ban) (lásd a 4. táblázatot). Szövődményként jelentkezett a szemen belüli nyomás növekedése (5/42 = 11,9% a HA-1 termékkel kezelt betegeken, míg 11/46 = 23,9% a Healonnal kezelt betegeken); további szövődményként jelentkezett a hyphaemia, sebszivárgás, vérzés az üvegtestben, a hátsó tok homályosodása, az érhártya leválása, a szivárványhártya atrófiája és foltszerű (foltos) ödéma.
- A két kezelt csoport a szemen belüli átlagos nyomás (a továbbiakban röviden szemnyomás), valamint a szemnyomásnak a kezdeti értéke és az 1. nap és 90. nap között mért értékeinek váltakozása vonatkozásában statisztikailag nem különbözött egymástól (lásd az 5. táblázatot). A műtét utáni első 9 órában - úgy látszik - hogy a (szemből eltávolított) Healon és a (helyben hagyott) HA-1 által előidézett szemnyomáseloszlás főként a standard szórás szempontjából különbözött egymástól. A Healonnal kezelt betegek esetében a standard szórás nagyobb, a műtét után 1 órával átlagos értéke jelentősen nagyobb, míg a HA-1 termékkel kezelt betegek esetén a műtét utáni 6. és 9. órában a standard szórás értéke magasabb volt, de alig szignifikáns. A műtét után 1 órával a Healonnal kezelt betegek 22,7%-ában, míg a HA-1-val kezelt betegek 10%-ában érte el vagy haladta meg a szemnyomás a 21 Hgmm vagy ennél nagyobb értéket. A műtét után 6 órával a HA-1 termékkel kezelt betegek 73,2%-ában, műtét után 9 órával 65%-ában érte el vagy haladta meg a betegek szemnyomása a 21 Hgmm értéket; a Healonnal kezelt betegek 68,2%-ában, illetve 71,4%-ában érte el vagy haladta meg a 21 Hgmm értéket a műtét után 6, illetve 9 órával.
- Az első vizsgálat során tett megfigyelések szempontjából a két csoport között más különbség nem jelentkezett. A mikroszkópos szemtükrözés (endoteliális sejtszám) nem utalt jelentős különbségekre (lásd a 6. táblázatot).
3. Kvantitatív eredmények
A látásélesség mérése azt mutatta, hogy mindkét viszkoelasztikus anyag hatékonysága összehasonlítható, közelebbről:
- az 1. klinikai kísérletben:
Nem mutatkozott szignifikáns különbség azon Healonnal kezelt, illetve HA-1 termékkel kezelt betegek arányában, akik a műtét utáni 30. napon 20/40 értékű látásélességet értek el (a Healonnal kezelt betegek 77,8%-a, míg a HA-1 termékkel kezelt betegek 84,7%-a).
- A 2. klinikai kísérletben:
Nem mutatkozott szignifikáns különbség azon Healonnal kezelt, illetve HA-1 termékkel kezelt betegek arányában, akik a műtét utáni 30. napon 20/40 vagy magasabb értékű látásélességet értek el (a Healonnal kezelt betegek 73,9%-a, míg a HA-1 termékkel kezelt betegek 71,4%-a). A 90. napon ezek az arányok közel azonosak voltak.
2. táblázat
Az 1. klinikai vizsgálat során megfigyelt, műtét utáni szövődmények
| HA-1-val kezelt betegek N = 158 N (%) | Healonnal kezelt betegek N = 56 N (%) | Összes betegek száma N = 214 N (%) | |
| Az 1. napon Nincsen Van* | 149 (94,3) 9(5,7) | 48 (85,7) 8(14,3) | 197 (92,1) 17(7,9) |
| A 7. napon Nincsen Van | 153 (98,1) 3(1,9) | 55 (98,2) 1 d,8) | 208 (98,1) 4(1,9) |
| A 30. napon Nincsen Van | 154 (98,1) 3(1,9) | 52 (96,3) 2 (3,7) | 206 (97,6) 5 (2,4) |
* A Healonnal kezelt szövődményes betegek aránya szignifikánsan magasabb (a Fisher-féle kétrekeszes egzakt teszt alapján), mint a HA-1 termékekkel kezelt betegek esetén.
HU 215 193 Β
3. táblázat
A szemnyomás értéke (tonometria, Hgmm-ben) az 1. klinikai vizsgálatban
| Kezelt csoport | N | Átlag | Standard szórás | |
| Műtét előtt | ||||
| Összesen | 213 | 16,671 | 3,598 | |
| HA-1 | 157 | 16,682 | 3,747 | |
| Healon | 56 | 16,643 | 3,176 | |
| Szemnyomás a műtét után 3 órával | ||||
| Összesen | 176 | 18,077 | 7,760 | |
| HA-1 | 129 | 18,027 | 7,417 | |
| Healon | 47 | 18,213 | 8,718 | |
| Szemnyomás a műtét után 1 nappal | ||||
| Összesen | 212 | 19,146 | 7,497 | |
| HA-1 | 157 | 18,580 | 6,865* | |
| Healon | 55 | 20,327 | 8,453 | |
| Szemnyomás a műtét után 7 nappal | ||||
| Összesen | 200 | 14,431 | 3,979 | |
| HA-1 | 148 | 14,468 | 4,147 | |
| Healon | 52 | 14,327 | 3,491 | |
| Szemnyomás a műtét után 30 nappal | ||||
| Összesen | 207 | 15,002 | 3,730 | |
| HA-1 | 154 | 14,932 | 3,744 | |
| Healon | 53 | 15,208 | 3,718 |
* A műtét utáni 1. napon a két kezelt csoport standard szórása szignifikánsan különbözik (az F-teszt alapján p - 0,0508).
4. táblázat
A 2. klinikai vizsgálat során megfigyelt, műtét utáni szövődmények
| HA-1-val kezelt betegek N = 42 N (%) | Healonnal kezelt betegek N = 46 N (%) | Összes betegek száma N = 88 N (%) | |
| Műtét utáni szövődmények | |||
| Nincsen | 30(71,4) | 29 (63,0) | 59 (67,0) |
| Van | 12(28,6) | 17(37,0) | 29 (33,0) |
5. táblázat
A kezelt csoportban megfigyelt tonomteriás értékek (Hgmm) statisztikai összefoglalása
| Kezelt csoport | N | Átlag | Standard szórás | |
| Műtét előtt | ||||
| Összesen | 86 | 15,256 | 3,365 | |
| HA-1 | 40 | 15,575 | 3,296 | |
| Healon | 46 | 14,978 | 3,435 | |
| A műtét után 1 órával | ||||
| Összesen | 84 | 12,167 | 9,937 | |
| HA-1 | 40 | 9,925* | 7,430** | |
| Healon | 44 | 14,206 | 11,473 |
HU 215 193 Β
5. táblázat (folytatás)
| Kezelt csoport | N | Átlag | Standard szórás | |
| A műtét után 3 órával | ||||
| Összesen | 84 | 23,012 | 14,244 | |
| HA-1 | 41 | 22,805 | 15,481 | |
| Healon | 43 | 23,209 | 13,139 | |
| A műtét után 6 órával | ||||
| Összesen | 85 | 27,318 | 12,200 | |
| HA-1 | 41 | 28,707 | 13,757*** | |
| Healon | 44 | 26,023 | 10,542 | |
| A műtét után 9 órával | ||||
| Összesen | 82 | 26,451 | 11,863 | |
| HA-1 | 40 | 27,050 | 13,449**** | |
| Healon | 42 | 25,881 | 10,261 | |
| A műtét után 1 nappal | ||||
| Összesen | 87 | 20,839 | 8,868 | |
| HA-1 | 41 | 21,805 | 9,474 | |
| Healon | 46 | 19,978 | 8,301 | |
| A műtét után 7 nappal | ||||
| Összesen | 84 | 14,381 | 5,411 | |
| HA-1 | 39 | 15,051 | 5,973 | |
| Healon | 45 | 13,800 | 4,865 | |
| A műtét után 30 nappal | ||||
| Összesen | 83 | 14,313 | 3,732 | |
| HA-1 | 40 | 14,825 | 3,761 | |
| Healon | 43 | 13,837 | 3,683 | |
| A műtét után 90 nappal | ||||
| Összesen | 80 | 13,138 | 3,252 | |
| HA-1 | 39 | 13,128 | 3,357 | |
| Healon | 41 | 13,146 | 3,190 |
* A két kezelt csoport az átlagos szemnyomás vonatkozásában szignifikánsan különbözik (p = 0,0442 a nem egyenlő varianciákra korrigált t-próba alapján).
** A kezelési csoportok standard szórása szignifikánsan különbözik (p = 0,0070 az F-próba alapján).
*** A kezelt csoportok standard szórása alig éri el a szignifikáns különbséget (p = 0,0886 az F-próba alapján).
**** A kezelt csoportok standard szórása alig éri el a szignifikáns különbséget (p = 0,0898 az F-próba alapján).
6. táblázat
A kezelt csoportban végzett mikroszkópos szemtükrözés statisztikai értékeinek (endoteliális sejtszám) összefoglalása
| Kezelt csoport | N | Átlag | Standard szórás | |
| Műtét előtt | ||||
| Összesen | 85 | 2283,1 | 451,24 | |
| HA-1 | 40 | 2234,6 | 433,72 | |
| Healon | 45 | 2326,1 | 466,86 | |
| A műtét után 90 nappal | ||||
| Összesen | 80 | 2158,1 | 505,73 | |
| HA-1 | 39 | 2068,2 | 585,52 | |
| Healon | 41 | 2243,5 | 405,08 |
HU 215 193 Β
KÖVETKEZTETÉSEK
Mindkét fentebb ismertetett klinikai kísérlet eredményei azt mutatják, hogy a HA-1 hályogeltávolítás és intraokuláris lencsebeültetés során értékes hatású. Közelebbről: igazolódott a HA-1 kedvező tűrhetősége. Valóban, a termék (körülbelül 2,5-szer) kevesebb műtét utáni szövődményt okoz, mint a Healon azonos kísérleti körülmények között, azaz ha a műtét után az anyagot eltávolítottuk (amint ezt az 1. klinikai vizsgálat esetére leírtuk). A műtét utáni szövődmények között különösen a szemnyomás növekedését kell figyelembe venni.
Megjegyezzük, hogy a szemnyomás vonatkozásában a HA-1 termékkel, illetve Healonnal kezelt betegek műtét utáni periódusa különbözött. Az 1. kísérletben - ahol a műtét után mind a HA-1 terméket, mind a Healont eltávolítottuk - az 1. napon a Healonnal kezelt betegek magasabb aránya mutatott 21 Hgmm-nél nagyobb szemnyomás-növekedést a HA-1 termékkel kezelt betegekhez képest. A 2. klinikai kísérletben - ahol a HA-1 terméket a Healontól eltérően a műtét után nem távolítottuk el - a HA-1 műtét utáni szemnyomásprofiija hasonló volt.
A fentiekből az a következtetés vonható, hogy a két viszkoelasztikus termék bizonyos vonatkozásokban hasonló, a műtét utáni szövődmények szempontjából azonban különböznek: úgy látszik, hogy a Healon műtét utáni eltávolítása a szemnyomásban nagyobb növekedést idéz elő, mint a HA-1 eltávolítása műtét után; míg a helyben hagyott HA-1 műtét utáni szemnyomásprofilja a műtét után eltávolított Healon szemnyomásprofíljához hasonló.
Ezeknek az eredményeknek az alapján lényeges hangsúlyoznunk annak a lehetőségét, hogy a HA-1 helyben hagyható műtét utáni szövődmények kiváltása nélkül. Ez a lehetőség az alábbi, értékes előnyökkel jár:
1. A műtéti eljárás egyszerűsödik, mivel a termék műtét utáni eltávolítása mellőzhető.
2. Az eljárásnak (leszívás) tulajdonítható veszély csökken. Ilyen veszélyek például a sebészi eljárásnak tulajdonítható sérülések, s ezek megfelelő következményei.
A jelen találmány azokra a gyógyászati készítményekre is vonatkozik, amelyek hatóanyagként a hialuronsav új molekula-frakcióját nátriumsója alakjában, azaz a HA-1 terméket tartalmazzák, különösen közömbös pH-értékű konyhasóoldatok alakjában. A HA-1 termék koncentrációját úgy választjuk, hogy annak viszkozitása a kívánt értéket elérje, például körülbelül 300 mPa.s (350 s-l-nél) és körülbelül 10000 mPa.s (1 s-l-nél) között legyen.
A találmány révén lehetővé válik az új HA-1 nátrium-hialuronát-frakció alkalmazása a szemsebészetben, különösen hályogműtétek és lencsebeültetések során.
A találmányt az alábbi, nem korlátozó példákban részletesen ismertetjük.
1. példa
Eljárás a HA-1 frakció előállítására, és a frakció jellemzése
3000 g friss vagy fagyasztott tyúktaréjt húsdarálóban megdarálunk, majd mechanikus homogenizáló berendezésben gondosan homogenizáljuk. Az így kapott pasztát 10-szeres térfogatú vízmentes acetonnal vagy etanollal - amely 0,1 tömeg/térf.% specifikus, vassal kelátot képző szert tartalmaz - összekeverve üvegedénybe helyezzük.
Vassal kelátot képző szerként például 1,10fenantrolint (C. A. R. N. 66-71-7) vagy annak dimetilszármazékait alkalmazhatjuk. Az üvegedényt és a specifikus vaskelátképző szereket abból a célból alkalmazzuk, hogy elkerüljük a hialuronsav-nátriumsó depolimerizációját, amely az acéltartályokból vagy vérmaradékokból származó vasionok hatására felléphet.
A tyúktaréjt addig kezeljük, amíg a vasionok eltávolítása teljessé válik (ezt műszerrel ellenőrizzük úgy, hogy mérjük a vaskelátképző szerrel kialakult komplex abszorbanciáját az etanolos fázisban, 1 cm méretű cellában, a maximális abszorbció hullámhosszán (1,10-fenantrolin esetén 510 nm); ez a 0,005 A. U. értéket nem haladhatja meg).
A mosási eljárást ismételjük azonos térfogatú vízmentes acetonnal (vagy etanollal) a kelátképző szer nyomainak az eltávolítására. E kezeléseket mindaddig végezzük, amíg az alábbi „A” próba negatív eredményt ad.
Az próba: 5 ml acetonos (vagy etanolos) fázist mérsékelt nitrogénáramban bepárlunk. A maradékot 5 ml vízben oldjuk, és abszorbanciáját a kelátképző szer abszorpciós maximumának hullámhosszán meghatározzuk.
A próba eredményét negatívnak tekintjük, ha ez az abszorbanciaO,l A. U. értéknél alacsonyabb.
A reakció végtermékét 6 órán át 50 percenkénti fordulatsebességgel keverjük, utána 12 órán át elkülönülni hagyjuk, majd az oldószert leszifonozzuk (leszívatjuk), és elvetjük.
Az extrakciós folyamatot addig ismételjük, amíg az elvezetésre szánt oldószer a megfelelő nedvességtartalmaz eléri (Karl-Fischer-módszerrel végzett meghatározás alapján).
Ekkor a kapott terméket centrifúgáljuk, majd megfelelő hőmérsékleten 5-8 órán át vákuumban szárítjuk. Ennek eredményeként körülbelül 500-600 g száraz port kapunk.
300 g száraz port 0,2 g megfelelő proteolitikus szerrel (papain, pepszin, tripszin vagy pronáz) pufferolt vizes közegben enzimes emésztésnek vetünk alá. Pufferolt vizes közegként foszfátpuffert alkalmazunk, amely a száraz porhoz viszonyítva 20:0,01-20:1 arányban cisztein hidrokloridot tartalmaz. Az így kapott keveréket 24 órán át 60-65 °C állandó hőmérsékleten 60 rpm sebességgel keveijük, utána az egész terméket 25 °C-ra hűtjük, 60 g celitet adunk hozzá, és a keverést még 1 órán át folytatjuk. Az így kapott keveréket élesre szüljük.
A vizes oldatot 2 mg/ml koncentrációra hígítjuk desztillált vízzel, és olyan oszlopra töltjük, amely tetrabutil-ammónium-hidroxidos kezelés útján kapott tetrabutil-ammónium (TBA+) alakban makromolekuláris DOWEX M-15 ioncserélő gyantát tartalmaz.
Az oszlopról eluált oldatot bepároljuk, és a szárított maradékot megfelelő térfogatú N-metil-pirrolidonnal (vagy dimetil-szulfoxiddal) 2 mg/ml koncentrációra hígítjuk.
HU 215 193 Β
Az így kapott oldatot szűrjük, 4 °C-ra hűtjük, és egyenlő térfogatú vizet adunk hozzá, majd egymás után háromszor mossuk diklór-metánnal, és az alsó fázist mindig elvetjük. Ezután a felső fázist nátrium-bromiddal kezeljük (a nátrium-bromidot a hialuronsavhoz viszonyítva 3:1 mólarányban alkalmazzuk) 4 °C hőmérsékleten, majd a vizes oldathoz háromszoros térfogatú etanolt adunk, és a kivált csapadékot etanollal többször mossuk.
A csapadékot vízben oldjuk, és az így kapott oldatot dializáljuk. Az oldatot nátrium-klorid-oldat hozzáadásával 0,1 mólosra állítjuk be, és hőmérsékletét 50 °C-ra emeljük, és 45 g cetil-piridinium-kloridot adunk hozzá, 60 rpm sebességű keverés közben. Az elegyet 60 percig keverjük, majd 50 g celitet adunk hozzá. A termék hőmérsékletét keverés közben 25 °C-ra csökkentjük, és a kiváló csapadékot centrifugálással elkülönítjük. Az így kapott csapadékot 5 liter 0,01 molos, 0,05% cetilpiridinium-kloridot tartalmazó nátrium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, és 50 °C hőmérsékleten további 60 percig keverjük, majd 25 °C-ra hűtjük, és a csapadékot centrifugálással elkülönítjük.
A mosási eljárást ezután háromszor ismételjük, végül az összegyűjtött csapadékot egyenként 3 liter, 0,05% cetil-piridinium-kloridot tartalmazó 0,05 mólos nátrium-klorid-oldattal töltött edényekbe visszük. Az így kapott keveréket 60 percig 60 fordulat/perc sebességgel keverjük, majd 2 órán át 25 °C hőmérsékleten tartjuk, s utána a felülúszót centrifugálással eltávolítjuk.
Ezt az eljárást 0,05 t% cetil-piridinium-kloridot tartalmazó, 0,1 mólos nátrium-klorid-oldattal többször ismételjük, utána a keveréket centrifugáljuk, és felülúszóját elvetjük. A csapadékot 0,05 t% cetil-piridinium-kloridot tartalmazó 0,30 molos nátrium-kloriddal 3:1 arányban diszpergáljuk.
Az elegyet keveijük, és mind a csapadékot, mind tiszta folyadékot felhasználjuk. A csapadék extrakcióját még háromszor ismételjük, minden alkalommal 0,5 liter azonos vizes oldatot használunk.
A megmaradt csapadékot eltávolítjuk, és a tiszta folyadékmennyiséget egyetlen tartályba gyűjtjük, a folyadékot 50 °C-ra melegítjük keverés közben, és az oldat nátrium-klorid-tartalmát 0,23 M koncentrációra állítjuk, majd 1 g cetil-piridinium-kloridot adunk hozzá, és 12 órán át tovább keverjük. Ekkor az elegyet 25 °Cra hűtjük, cetilen átszűrjük, és 1 μ szűrőnyílású szűrőn vezetjük át.
Az így kapott oldatot molekuláris ultraszűrésnek vetjük alá olyan membrán szűrők alkalmazásával, amelyek kizárási határa 30 000, úgy, hogy 0,33 molos nátrium-klorid-oldat hozzáadásával az eredeti térfogat háromszorosát szűrjük. Ekkor a nátrium-klorid-oldat hozzáadását megszüntetjük, és a folyadék térfogatát eredeti térfogatának negyedére csökkentjük.
Az így kapott koncentrált oldatot 25 °C hőmérsékleten 60 fordulat/perc sebességgel keverjük, és háromszoros térfogatú 95%-os etanol hozzáadásával kicsapjuk a terméket. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, a felülúszót elvetjük, a csapadékot 1 liter 0,1 mólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk. A kicsapási eljárást háromszoros térfogatú, 95%-os etanollal megismételjük.
A csapadékot összegyűjtjük, és előbb 75 t%-os etanollal háromszor, majd abszolút etanolban háromszor, végül abszolút acetonnal ismét háromszor mossuk.
Az így kapott termék a HA-1 frakció, amelynek átlagos molekulatömege 750000 és 1230 000 dalton (előnyösen 925 000 és 1 230 000 dalton) között van.
A hialuronsav hozama az eredeti, friss szövet 0,6 t%-a.
A fentebb leírt eljárással kapott végtermék jellemzői a következők:
- molekulatömege 1 000 000 dalton
- viszkozitási számának határértékei 14,5, illetve 21100cm3/g (25 °C hőmérsékleten 0,15 mólos nátrium-klorid oldatban 7,0 pH-érték mellett Ubbelohde viszkoziméterben meghatározva), ez 750000 dalton és 1230000 dalton (előnyösen 925 000 és 1 230 000 dalton) közötti átlagos molekulatömegnek felel meg;
- fehérjetartalma albuminban kifejezve legfeljebb 1,2 t% a Lowry-teszttel végzett meghatározás alapján [J. Lowry és munkatársai: „Fehéije meghatározása a folin-fenol-reagenssel”, J. Bioi. Chem. 193,265-275,(1951)];
- U. V. abszorbanciája 257 nm és 280 nm hullámhosszon 1 tömeg/térf.%-os koncentrációjú vizes oldatban mérve legfeljebb 1,0 A. U.;
- dinamikus viszkozitása 1 tömeg/térf.%-os koncentrációban 0,15 mólos nátrium-klorid-oldatban 7,0 pH-η, a meghatározott nyírási sebesség alkalmazásával, rotációs viszkoziméterben (lásd például a XXII. kiadású U.S. Gyógyszerkönyv 1619. oldalán) 20 °C hőmérsékleten meghatározva az alábbi határok közötti érték:
| Nyírási sebesség | Dinamikus viszkozitás (mPa.s 20 °C-on) |
| 1 s-1 | legfeljebb 20000 mPa.s |
| 10 s-1 | legfeljebb 2000 mPa.s |
| 100 s-1 | legfeljebb 1000 mPa.s |
| 350 s-1 | legfeljebb 500 mPa.s |
- szulfatált mukopoliszacharid-tartalma kénben kifejezve legfeljebb 0,07 t% az induktívan kapcsolt plazma-mérőműszer (I. C. P.) és megfelelő összehasonlító anyag alkalmazásával végzett meghatározás alapján;
- vastartalma I. C. P. méréssel végzett atomabszorpciós meghatározás alapján legfeljebb 10 ppm.
Elvégeztük a HA-1 frakció és más, kereskedelmi forgalomban lévő hialuronsav-nátriumsó-oldatok vastartalmának összehasonlító vizsgálatát.
Amint a 7. táblázatból látható, a kapott eredmények világosan mutatják, hogy a vastartalom különböző: a HA-1 frakció vastartalma sokkal csekélyebb, mint egyéb termékeké.
HU 215 193 Β
7. táblázat
A HA-1 és más termékek vastartalmának (ppm) az összehasonlítása
| HA-1 | „A” minta | „B” minta | „C” minta | |
| Vas tartalom (ppm) | 10 | 130 | 120 | 40 |
A táblázatban:
- az „A” minta a SODICHIM-terméknek (154. gyártási tétel) felel meg;
- a „B” minta a BIOCHEMO-terméknek (542. gyártási tétel) felel meg;
-a „C” minta megfelel a BIOTECHNOLOGY 15 GENERAL-terméknek (B-25. gyártási tétel);
- a vasiontartalmat körülbelül 0,5 g anyaggal határoztukmeg,amelyetplatinatégelyben kiizzítottunk, és a maradékot 0,1 mólos salétromsavban oldottuk.
- A természetes úton öregített, hővel sterilizált, 20 fiziológiás pH-értékű, izotóniásan pufferolt HA-1 frakció stabilitása a viszkozitási szám határértékei alapján, a molekulatömeg csökkenésében kifejezve legfeljebb a következő változásokra mutat:
- 25 °C hőmérsékleten 6 hónapon át tárolva a kezdeti érték 97%-a;
- 118 °C hőmérsékleten 32 percig sterilizálva a kezdeti érték 75%-a;
- 121 °C hőmérsékleten 16 percig sterilizálva a 30 kezdeti érték 80%-a;
- 124 °C hőmérsékleten 8 percig sterilizálva a kezdeti érték 90%-a.
Összehasonlító vizsgálatot végeztünk a HA-1 és a kereskedelmi forgalomban lévő, hasonló hialuronsavol- 35 datok stabilitási körülményeinek megállapítására; a termékeket fiziológiás pH-értékű, izotóniásan pufferolt oldatban alkalmaztuk. A stabilitást az alábbi körülmények között vizsgáltuk:
- természetes öregedés (tárolás 6 hónapig, szobahő- 40 mérsékleten);
- hősterilizálás különböző körülmények között.
A fentebb leírt célokra gyógyszerészeti célra alkalmas anyagokat és a gyakorlatban megbízhatónak bizonyult berendezéseket alkalmaztunk. Közelebbről az alábbiakat használtuk:
- színtelen üvegampullák, amelyek jellemzői;
- üveg: 1-típusú boroszilikát üveg (a II. kiadású Európai Gyógyszerkönyvnek megfelelő minőség);
- legkisebb vastagsága 0,90 mm;
- legnagyobb vastagsága 1,0 mm;
- halogénezett butilgumiból készült dugók, amelyek jellemzői:
- az elasztomer típusa: klór-butil-gumi;
- közömbös töltőanyaga: kaolin;
- pigment: titán-dioxid és szénfekete;
- vulkanizálószer: cink-oxid;
- felszabadulási jellemzői a II, kiadású Európai Gyógyszerkönyv VI.2.3.1. cikkelyének megfelelők;
- alumíniumból készült lepattintható zár;
- injekciós célra alkalmas víz (a II. kiadású Európai Gyógyszerkönyvnek megfelelő minőség).
Analitikai tisztaságú reagenseket használtunk.
A sterilizálást Fedegari autoklávban (modell 25 POP5 Superspectra) végeztük.
A viszkozitási szám határértékét Ubbelohde típusú viszkoziméterben 25 °C hőmérsékleten, 0,15 molos nátrium-klorid-oldatban 7,0 pH-η határoztuk meg.
A megfelelő, átlagos molekulatömeget a Mark-Houwink egyenlettel számítottuk ki [H. Mark: Z. Elektrochemie 40, 499 (1934); R. Houwink: J. Prakt. Chem. 157, 15 (1940)].
A depolimerizációs hajlam pontosabb kiértékelése céljából az átlagos molekulatömegértékeket a molekulatömeg kezdeti értékének százalékában fejeztük ki. Az így kapott eredmények (lásd a 8. és 9. táblázatokat) mutatják, hogy a HA-1 termék stabilitása nagyobb (legalább kétszer olyan nagy), mint az összehasonlításra használt mintáké (lásd a 7. táblázatot), amelyek vastartalma jelentősen nagyobb, mint a HA1 vastartalma.
8. táblázat
Az oldat stabilitása a természetes öregedés körülmények között
| A minta | A viszkozitási szám határértékei (100 cm3/g) | A molekulatömeg változása (%) | ||||
| Kezdetben | 3 hónap után | 6 hónap után | Kezdetben | 3 hónap után | 6 hónap után | |
| HA-1 | 20,9 | 20,8 | 20,5 | 100 | 99,4 | 97,5 |
| A | 10,4 | 10,1 | 9,6 | 100 | 96,2 | 89,9 |
| B | 9,7 | 9,2 | 8,8 | 100 | 93,2 | 87,8 |
| C | 15,5 | 15,1 | 14,8 | 100 | 96,6 | 94,0 |
HU 215 193 Β
9. táblázat
A sterilizálás hatása az oldat stabilitására
| A viszkozitási szám határértékei (100 cm2 3/g) | A molekulatömeg változása (%) | |||||||
| A minta | Kezdetben | I c. | II c. | III c. | Kezdetben | I c. | IIc. | lile. |
| HA-1 | 20,9 | 17,2 | 18,3 | 19,9 | 100 | 77,1 | 83,8 | 93,7 |
| A | 10,4 | 6,2 | 6,6 | 7,2 | 100 | 50,2 | 54,5 | 61,2 |
| B | 9,7 | 6,3 | 6,7 | 7,3 | 100 | 56,2 | 61,1 | 68,5 |
| C | 15,5 | 10,9 | 11,5 | 12,6 | 100 | 62,5 | 67,2 | 75,9 |
A fenti táblázatokban:
- az A, B és C minták azonosak voltak a vastartalom meghatározásához használt mintákkal;
- megközelítőleg 10 mg/ml koncentrációjú oldatokat alkalmaztunk minden termék esetében; a termékeket 0,9 tömeg/térf.%-ban nátrium-kloridot tartalmazó, 7,5 pH-értékű 0,002 molos foszfátpufferban oldottuk, és az alábbi körülmények között vizsgáltuk;
a) természetes úton öregítettük úgy, hogy 6 hónapon át 25 °C szobahőmérsékleten, sötétben tároltuk, és 3 havonként ellenőriztük (lásd a 8. táblázatot);
b) autoklávban sterilizáltuk az alábbi körülmények között:
az Ic mintát 118 °C-on 32 percig sterilizáltuk; a IIc. mintát 121 °C-on 16 percig sterilizáltuk; a lile. mintát 124 °C-on 8 percig sterilizáltuk, és mindegyik mintát a kezdő időpontban és a művelet végén ellenőriztük.
2. példa
Eljárás HA-1 frakció előállítására és a frakció jellemzése
3000 g friss vagy fagyasztott csirketaréjt húsdarálóban megdarálunk, majd mechanikus homogenizáló berendezésben gondosan homogenizáljuk. Az így kapott pasztát üvegedényben négyszeres térfogatú, 0,1 tömeg/térf.% mennyiségben specifikus vaskelátképző szert tartalmazó 95 t%-os etanollal keverjük.
Kelátképző szerként például 1,10-fenantrolint (C. A. R. N. 66-71-7) vagy annak dimetilszármazékát alkalmazzuk.
Az üvegedényt és a specifikus vaskelátképző szereket abból a célból használjuk, hogy elkerüljük a hialuronsav-nátriumsó depolimerizációját, amely az acéltartályokból vagy vérmaradékokból származó vasionok hatására felléphet.
A csirketaréjt a vasionok teljes eltávolításáig kezeljük [ezt műszerrel ellenőrizzük úgy, hogy megmérjük a vaskelátképző szerrel képzett komplex abszorbanciáját az etanolos fázisban 1 cm méretű cellában a maximális abszorpció hullámhosszán (az 1,10-fenantrolin esetében 510 nm); ez legfeljebb 0,05 A.U. lehet].
A következő mosást azonos térfogatú vízmentes acetonnal (vagy etanollal) végezzük a kelátképző szer nyomainak eltávolítása céljából. E kezeléseket addig folytatjuk, amíg az alábbi „A” próba negatív eredményt ad:
Az „A” próba: 5 ml acetonos (vagy etanolos) fázist mérsékelt sebességű nitrogénáram átvezetésével bepárlunk, a maradékot 5 ml vízben oldjuk, és az így kapott oldat abszorbanciáját a kelátképző szer abszorpciós maximumának hullámhosszán mérjük. A próbát akkor tekintjük negatívnak, ha az abszorbancia 0,1 A. U. értéknél kisebb.
A végső reakcióterméket 6 órán át 50 rpm sebességgel keverjük, majd 12 órán át elkülönülni hagyjuk, utána az oldószert leszifonozzuk, és elvetjük.
Ezt az extrakciós folyamatot addig ismételjük, amíg az elvetésre szánt oldószer nedvességtartalma Karl-Fischer módszerrel végzett meghatározás alapján a megfelelő szintet el nem éri.
Az így kapott terméket centrifugáljuk, és legalább 8 órán át megfelelő hőmérsékleten vákuumban szárítjuk. Ennek az eljárásnak eredményeként körülbelül 500-600 g száraz port kapunk.
Ezt követően 300 g száraz, porszerű terméket 0,2 g megfelelő proteolitikus szerrel (papin, pepszin, tripszin vagy pronáz) enzimes emésztésnek vetünk alá, amelyet (foszfátpuffert tartalmazó vizes közegben, pufferanyagként cisztein hidroklorid alkalmazásával végzünk. A cisztein hidrokloridot a száraz porhoz viszonyítva 20:0,1-20:1 arányban alkalmazzuk. Az elegyet 24 órán át 60-65 °C állandó hőmérsékleten, 60 rpm sebességgel keverjük. A reakció végén 60 g celitet adunk hozzá, és további 1 órán át keverjük, majd az így kapott keveréket élesre szüljük.
A szűrlethez 60 rpm sebességű keverés közben 45 g cetil-piridinium-kloridot adunk, 60 percig keverjük, majd 50 g celitet adunk hozzá, és centrifúgáljuk. A csapadékot 5 liter, 0,05 t% cetil-piridinium-kloridot tartalmazó, 0,01 mólos nátrium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, 60 percig 50 °C hőmérsékleten keverjük, és 25 °C-ra hűtve a csapadékot centrifúgáljuk.
A mosási eljárást háromszor ismételjük, utána a csapadékot 3 literes tartályokba gyűjtjük, amelyek 3 liter, 0,5 t% cetil-piridinium-kloridot tartalmazó, 0,05 molos nátrium-klorid-oldatot tartalmaznak.
Az így kapott elegyet 60 percig 60 rpm sebességgel keverjük, és 2 órán át 25 °C állandó hőmérsékleten tartjuk. Ekkor a felső, tiszta fázist centrifugálással eltávolítjuk. E folyamatot 0,05 t%-os cetil-piridinium-kloridot tartalmazó, 0,1 mólos nátrium-klorid oldattal kétszer ismételjük, majd a keveréket centrifúgáljuk, és a felső fázist elvetjük. A csapadékot 0,05 t%-os cetilpiridinium-kloridot tartalmazó, 3 liter 0,30 mólos nátri16
HU 215 193 Β um-klorid-oldatban diszpergáljuk, és keverés után mind a csapadékot, mind a tiszta folyadékfázist megtartjuk. A csapadékot másodszor extraháljuk 1,5 liter azonos vizes oldattal.
A tiszta folyadékfázisokat egyetlen edénybe gyűjtjük, és molekuláris ultraszűrésnek vetjük alá 30000 dalton kizárási határral rendelkező membránon át, és eredeti térfogatának harmadára koncentráljuk.
A koncentrált oldatot tetrabutil-ammónium- (TBA) alakban lévő, makromolekuláris ioncserélő DOWEX M-15 gyantával kezeljük, és másnapig keverjük.
A szuszpenzióhoz addig adunk N-metil-pirrolidont, amíg annak a vízhez viszonyított térfogataránya a 70:30 értéket el nem éri, majd a keveréket szűrjük, a gyantát eltávolítjuk.
Ekkor az oldathoz megfelelő mennyiségű nátriumkloridot adunk, pH-értékét 1 mólos nátrium-hidroxidoldattal 7,5 feletti pH-ra állítjuk, kétszer mossuk diklórmetánnal, és az alsó fázist mindkét esetben elvetjük. A felső fázishoz háromszoros térfogatú, 95 t%-os etanolt adunk, és 25 °C hőmérsékleten 60 rpm sebességgel keverve végrehajtjuk a kicsapást. A csapadékot centrifugáljuk, a felső fázist elvetjük, a csapadékot összegyűjtjük, és előbb 25 t%-os etanollal, majd absz. etanollal, végül acetonnal mossuk.
A kimosott terméket legalább 20 órán át 25 °C hőmérsékleten vákuumban szárítjuk. A szárított terméket fordított ozmózis útján vízben oldjuk, s így 1 mg/ml-nél nagyobb koncentrációjú oldatot kapunk. Ehhez megfelelő mennyiségű nátrium-kloridot adunk, hogy molaritása 0,1 és 0,4 között legyen, majd az oldatot 1 mólos nátrium-hidroxid-oldattal lúgosítjuk, és sterilizálószűrőkön vezetjük át.
Az oldathoz háromszoros térfogatú 95%-os etanolt adunk, miközben 60 rpm sebességgel 25 °C hőmérsékleten keverjük. Az így kivált csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, és a felső fázist elvetjük. A csapadékot szűrjük, és előbb 75 t%-os etanollal, majd absz. etanollal, végül acetonnal mossuk. A kimosott terméket 25 °C hőmérsékleten legalább 50 órán át vákuumban szárítjuk. Az így kapott termék molekulatömege 1 180000.
Az alábbi példákat csupán a HA-1 frakció terápiás alkalmazására használható gyógyászati készítmények illusztrálására céljából közöljük.
1. készítmény: 2 ml oldatot tartalmazó ampullák előállítása
Egy ampulla tartalmának komponensei:
Hialuronsav-nátriumsó (HA-1) 24,0 mg
Nátrium-dihidrogén-foszfát-dihidrát 0,1 mg
Dinátrium-hidrogén-foszfát-dodekahidrát 1,2 mg Nátrium-klorid 17,0 mg
Injekciós célra alkalmas víz, amennyi szükséges 2,0 ml-hez
2. készítmény: steril, alkalmazásra kész, 1,1 ml oldatot tartalmazó fecskendők előállítására
Egy fecskendő tartalmának komponensei: Hialuronsav-nátriumsó (HA-1) 20,0 mg
Nátrium-klorid 9,350 mg
Nátrium-dihidrogén-foszfát-dihidrát 0,055 mg
Dinátrium-hidrogén-foszfát-dodekahidrát 0,660 mg
Injekciós célra alkalmas víz, amennyi szükséges 1,1 ml-hez
3. készítmény: 0,2 ml térfogatú egyszeri dózisokat tartalmazó tartóedény
Egy tartóedény össztartalmának komponensei: Hialuronsav-nátriumsó (HA-1) 400,0 mg
Nátrium-klorid 440,0 mg
Nátrium-dihidrogén-foszfát-dihidrát 5,0 mg
Dinátrium-hidrogén-foszfát-dodekahidrát 60,0 mg
Injekciós célra alkalmas víz, amennyi szükséges 100,0 ml-hez
4. készítmény: 0,2 ml térfogatú, egyszeri dózisokat tartalmazó tartóedények
Egy tartóedény tartalmának komponensei:
Hialuronsav-nátriumsó (HA-1) 200,0 mg
Nátrium-klorid 670,0 mg
Kálium-klorid 250,0 mg
Nátrium-dihidrogén-foszfát-dihidrát 5,0 mg
Dinátrium-hidrogén-foszfát-dodekahidrát 60,0 mg
Injekciós célra alkalmas víz, amennyi szükséges 100,0 ml-hez
5. készítmény: 5 ml-es flakonok előállítása Egy flakon tartalmának komponensei:
Hialuronsav-nátriumsó (HA-1) 200,0 mg
Nátrium-klorid 670,0 mg
Kálium-klorid 250,0 mg
Nátrium-dihidrogén-foszfát-dihidrát 5,0 mg
Dinátrium-hidrogén-foszfát-dodekahidrát 60,0 mg Nátrium-etil-higany(II)-tio-szalicilát 5,0 mg
Injekciós célra alkalmas víz, amennyi szükséges 100,0 ml-hez
A találmány fenti leírása alapján nyilvánvaló, hogy sokféle módon változtatható. Ezek a változatok azonban nem tekinthetők a találmány szellemétől és oltalmi körétől való eltérésnek, és így valamennyi ilyen módosítás amint ez a területen jártas szakember számára nyilvánvaló - az alábbi igénypontok oltalmi körébe esik.
Claims (6)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás egy 750000 és 1230000 dalton közötti molekulatömegű hialuronsav-frakció vagy annak gyógyászatilag elfogadható sója előállítására, amelynél a hialuronsav-nátriumsó az alábbi jellemzőket mutatja:a) Viszkozitási számának határértékei 14,5 100 cm3/g és 21 100 cm3/g, ha a meghatározást 25 °C hőmérsékleten 7,0 pH-értékű, 0,15 mólos nátrium-klorid-oldatban Ubbelohdeviszkoziméterben végezzük;b) fehérjetartalma albuminban kifejezve legfeljebb 0,2 t%;c) U. V.-abszorbanciája 257 nm és 280 nm hullámhosszon mérve legfeljebb 1,0 A. U., ha a meghatározást 1 tömeg/térf.%-os vizes oldatban végezzük;d) 1 tömeg/térf.%-os, 0,15 mólos nátrium-kloridoldattal készült, 7,0 pH-értékű oldatának dina17HU 215 193 Β mikus viszkozitása meghatározott nyírási sebességek mellett rotációs viszkoziméterben mérve 20 °C hőmérsékleten legfeljebb az alábbi határértékeket éri el:
Nyírási sebesség Dinamikus viszkozitás (mPa.s 20 °C-on) 1 s-1 legfeljebb 20000 mPa.s 10s-l legfeljebb 2000 mPa.s 100 s-1 legfeljebb 1000 mPa.s 350 s-1 legfeljebb 500 mPa.s e) szulfatált mukopoliszacharid-tartalma kénben kifejezve legfeljebb 0,07t%;f) vastartalma legfeljebb 10 ppm; ésg) a frakció fiziológiás pH-értékű, izotóniás, pufferolt oldatainak stabilitási értékei természetes öregítés és hősterilizálás után, a viszkozitási szám határértékeinek meghatározása alapján, és az átlagos molekulatömeg megfelelő csökkenésében kifejezve - 25 °C hőmérsékleten 6 havi tárolás után a kezdeti érték 97%-a;- 118 °C hőmérsékleten 32 percig végzett sterilizálás után a kezdeti érték 75%-a;- 121 °C hőmérsékleten 16 percig végzett sterilizálás után a kezdeti érték 80%-a; és- 124 °C hőmérsékleten 8 percig végzett sterilizálás után a kezdeti érték 90%-a azzal jellemezve, hogy1) a hialuronsavat valamilyen állati szervből egy első, célszerűen vízzel elegyedő szerves oldószerrel, vassal kelátot képező szer (vaskelátképző szer) jelenlétében extrahálva vasionoktól lényegében mentes, hialuronsavat tartalmazó kivonatot kapunk; - 2) az így kapott, hialuronsavat tartalmazó kivonatot proteolitikus enzimmel kezeljük;
- 3) az így kezelt, hialuronsavat tartalmazó kivonatot kvatemer ammóniumsó alakjában lévő savas ioncserélővel hozzuk érintkezésbe, és ezzel a hialuronsavat kvaterner-ammóniumsóvá alakítjuk;
- 4) az ioncserélőről származó kivonatot egy második, a hialuronsav kvatemer ammóniumsójának oldására alkalmas szerves - előnyösen aprotikus - oldószerben oldjuk;
- 5) a 4) lépésből származó elegyben kapott hialuronsav-kvatemer sót - kívánt esetben tisztítási műveletek után - nátriumkloriddal kezeljük, és ezzel a hialuronsav-kvatemer ammóniumsóját a megfelelő nátriumsóvá alakítjuk;
- 6) a kapott hialuronsav-nátriumsóból - önmagában ismert műveletekkel a kívánt molekulatömeg-tartományú hialuronsav-nátriumsót elkülönítjük és adott esetben azt hialuronsavvá vagy gyógyászatilag alkalmas más sókká átalakítjuk.2. az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 6) lépésben a hialuronsav-nátriumsó kívánt molekulatömegű frakcióját a hialuronsav-nátriumsó vizes oldatának molekuláris szűrésével állítjuk elő.3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 6) lépésben a kívánt molekulatömegű hialuronsav-frakciót a hialuronsavat tartalmazó kivonat molekuláris szűrésével állítjuk elő.4. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a 3) lépésben savas ioncserélőként valamilyen szulfonsavgyantát alkalmazunk kvatemer ammóniumsója alakjában.5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 3) lépésben kvatemer ammóniumsóként olyan tetraalkil-ammóniumsót alkalmazunk, amelyben egyegy alkilcsoport legfeljebb 6 szénatomos.6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tetraalkil-ammóniumsóként valamely tetrabutilammóniumsót alkalmazunk.7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1) lépésben szerves oldószerként etanolt vagy acetont, vassal kelátot alkotó szerként 1,10-fenantrolint alkalmazunk.8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 6) lépésben a nátriumsót sterilizálószerrel kezeljük.9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sterilizálószerként cetil-piridinium-kloridot alkalmazunk.10. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hialuronsav-nátriumsót olyan membránszűrőn vetjük alá molekuláris szűrésnek, amelynek molekuláris kizárási határa 30 000 dalton.11. Az 1. igénypont szerinti eljárás nátrium-hialuronát-frakció előállítására, azzal jellemezve, hogy1) tyúktaréjból a szerves anyagot vaskelátképzőként fenantrolint vagy annak dimetil-származékát tartalmazó acetonnal vagy etanollal, mint szerves oldószerrel extraháljuk, s így lényegében vasionoktól mentes kivonatot kapunk;2) a kapott kivonatot proteolitikus szerrel, előnyösen papainnal, tripszinnel vagy pronázzal kezeljük, előnyösen pufferanyag mint cisztein-hidroklorid jelenlétében;3) az így kapott kivonatot tetrabutil-ammóniumsója alakjában lévő szulfonsavgyantával töltött oszloppal hozzuk érintkezésbe;4) az oszlop eluálásával a hialuronsav tetrabutilammóniumsóját tartalmazó oldatot állítunk elő;5,) az így kapott oldatot beszárítva a hialuronsav tetrabutil-ammóniumsójából álló maradékot kapunk;52) az így kapott maradékot aprotikus oldószerben oldjuk;53) az 52) lépésből származó oldatot szüljük;54) az 53) lépésből kapott oldatot diklór-metánnal mossuk;55) az 54) lépésből kapott oldatot nátrium-halogeniddel kezelve hialuronsav-nátriumsót állítunk elő:6]) az így kapott hialuronsav-nátriumsót kicsapjuk;HU 215 193 Β62) az így kapott csapadékot vízben oldva dialízisnek vetjük alá;63) a dializált oldat kezelésével a hialuronsav-nátriumsót kicsapjuk;64) az így kapott csapadékot molekuláris szűrésnek vetjük alá 30000 dalton kizárási határral rendelkező membránszűrőn, s így olyan hialuronsav-nátriumsót tartalmazó oldatot kapunk, amelynek átlagos molekulatömege 750000 és 1230 000 dalton között van.12. Eljárás szemészeti, főként szemsebészeti célra alkalmazható gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1. vagy 11. igénypont szerint előállított hialuronsav-frakciót vagy annak sóját gyógyászati szempontból elfogadható hígító-, vivőés/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.13. A 12. igénypont szerinti eljárás szemészeti, főként szemsebészeti célra alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy1. igénypont szerint előállított hialuronsav-frakciót5 vagy annak nátriumsóját gyógyászati szempontból elfogadható hígító-, vivő- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve szemészeti, főként szemsebészeti célra alkalmas gyógyászati készítménnyé alakítjuk.10 14. A 12. igénypont szerinti eljárás intraartikuláris kezelésre alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1. vagy 11. igénypont szerint előállított hialuronsav-frakciót vagy annak nátriumsóját gyógyászati szempontból elfogadható hígító-,15 vivő- és/vagy segédanyagokkal összekeverve intraartikuláris gyógykezelésre alkalmas gyógyászati készítménnyé alakítjuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITPD910077A IT1247175B (it) | 1991-04-19 | 1991-04-19 | Procedimento per la purificazione di acido ialuronico e frazione di acido ialuronico puro per uso oftalmico. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9204012D0 HU9204012D0 (en) | 1993-03-29 |
| HUT63186A HUT63186A (en) | 1993-07-28 |
| HU215193B true HU215193B (hu) | 1998-10-28 |
Family
ID=11389548
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9204012A HU215193B (hu) | 1991-04-19 | 1992-04-16 | Eljárás szemészeti célra alkalmazható nagy tisztaságú hialuronsav-frakció és az ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5559104A (hu) |
| EP (1) | EP0535200B1 (hu) |
| JP (1) | JP2580458B2 (hu) |
| KR (1) | KR0178544B1 (hu) |
| AT (1) | ATE186307T1 (hu) |
| AU (1) | AU653022B2 (hu) |
| BR (1) | BR9205240A (hu) |
| CA (1) | CA2084875C (hu) |
| CZ (1) | CZ282248B6 (hu) |
| DE (1) | DE69230242T2 (hu) |
| DK (1) | DK0535200T3 (hu) |
| ES (1) | ES2092971T3 (hu) |
| FI (1) | FI104973B (hu) |
| GR (1) | GR3032434T3 (hu) |
| HU (1) | HU215193B (hu) |
| IL (2) | IL101611A (hu) |
| IT (1) | IT1247175B (hu) |
| NO (1) | NO305520B1 (hu) |
| PL (1) | PL168477B1 (hu) |
| RU (1) | RU2128666C1 (hu) |
| SG (1) | SG46515A1 (hu) |
| SK (1) | SK280191B6 (hu) |
| UA (1) | UA27229C2 (hu) |
| WO (1) | WO1992018543A1 (hu) |
Families Citing this family (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1274984B (it) * | 1994-12-09 | 1997-07-29 | Technopharma Sa | Soluzioni viscosizzate con ialuronato di sodio per l'uso come fluido maschera nella fotocheratectomia terapeutica mediante laser a accimeri |
| IT1282219B1 (it) * | 1995-12-20 | 1998-03-16 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | Processo chimico fisico combinato per la preparazione di frazioni di acido ialuronico a basso peso molecolare caratterizzate da bassa |
| IT1287967B1 (it) | 1996-10-17 | 1998-09-10 | Fidia Spa In Amministrazione S | Preparazioni farmaceutiche per uso anestetico locale |
| IT1291452B1 (it) | 1997-04-14 | 1999-01-11 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | Rivestimento a base di acido ialuronico e suoi derivati per la protezione di parti elettroniche da agenti esterni |
| US6919076B1 (en) | 1998-01-20 | 2005-07-19 | Pericor Science, Inc. | Conjugates of agents and transglutaminase substrate linking molecules |
| US6958148B1 (en) | 1998-01-20 | 2005-10-25 | Pericor Science, Inc. | Linkage of agents to body tissue using microparticles and transglutaminase |
| CN1148347C (zh) | 1998-05-29 | 2004-05-05 | 骨疗国际公司 | 羟基-25-烯-维生素d类化合物的制备方法 |
| DK172900B1 (da) | 1998-12-18 | 1999-09-27 | Per Julius Nielsen | Præparat samt kit til brug ved intraoculære operationer |
| IT1306644B1 (it) | 1999-04-08 | 2001-10-02 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | Strutture tridimensionali comprendenti derivati dell'acido ialuronicoottenibili mediante la tecnica antisolvente supercritico. |
| KR100836733B1 (ko) * | 2002-11-15 | 2008-06-10 | 코오롱생명과학 주식회사 | 히알우론산 나트륨의 회수방법 및 그를 위한 장치 |
| US20040167480A1 (en) * | 2003-02-21 | 2004-08-26 | Advanced Medical Optics, Inc. | Administration of multiple viscoelastic solutions with a multi-compartment syringe |
| US6946551B2 (en) * | 2003-03-12 | 2005-09-20 | New Life Resources, Llc | Preparation of hyaluronic acid from eggshell membrane |
| US20080063677A1 (en) * | 2004-03-10 | 2008-03-13 | New Life Resources, Llc | Therapeutic, nutraceutical and cosmetic applications for eggshell membrane and processed eggshell membrane preparations |
| US20040180025A1 (en) * | 2003-03-12 | 2004-09-16 | New Life Resources, Llc | Therapeutic, nutraceutical and cosmetic applications for eggshell membrane and processed eggshell membrane preparations |
| US8580315B2 (en) * | 2004-03-10 | 2013-11-12 | Esm Technologies, Llc | Anti-inflammatory activity of eggshell membrane and processed eggshell membrane preparations |
| US20050266390A1 (en) * | 2004-06-01 | 2005-12-01 | Yuichiro Ueda | Processes for removing cells and cell debris from tissue and tissue constructs used in transplantation and tissue reconstruction |
| KR100577075B1 (ko) * | 2004-06-16 | 2006-05-08 | 주식회사 티앤라이프시스템 | 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염을 이용한 히아루론산정제방법 |
| US7094775B2 (en) | 2004-06-30 | 2006-08-22 | Bone Care International, Llc | Method of treating breast cancer using a combination of vitamin D analogues and other agents |
| CN101001649B (zh) * | 2004-07-09 | 2011-08-31 | 弗罗桑医疗设备公司 | 包括透明质酸的止血组合物及其制备方法 |
| DE102005030011A1 (de) * | 2005-06-17 | 2006-12-21 | Aesculap Ag & Co. Kg | Verfahren zur Herstellung von sterilen Polysaccharidlösungen |
| ITPD20050242A1 (it) | 2005-08-03 | 2007-02-04 | Fidia Farmaceutici | Bioconiugati antitumorali dell'acido ialuronico o dei suoi derivati, ottenibili per coniugazione chimica diretta o indiretta, e loro impiego in campo farmaceutico |
| ITMI20061668A1 (it) * | 2006-09-01 | 2008-03-02 | Schiena Michele Giuseppe Di | Composizione a base di acido ialuronico e suoi sali per il trattamento di lesioni epiteliali |
| KR101509139B1 (ko) * | 2006-11-23 | 2015-04-08 | 주식회사 엘지생명과학 | 히알루론산의 정제방법 |
| KR100894042B1 (ko) * | 2007-04-13 | 2009-04-20 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 설파살라진-히알루론산 혼합물의 제조방법 및 이로부터얻어진 혼합물을 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물 |
| US9089592B2 (en) | 2007-04-26 | 2015-07-28 | Seikagaku Corporation | Method for micro-incision cataract surgery, a method of evaluation of a viscoelastic material, a composition for evaluation of a viscoelastic material and a method for evaluation using the composition |
| US8759321B2 (en) * | 2007-06-13 | 2014-06-24 | Bausch & Lomb Incorporated | Ophthalmic composition with hyaluronic acid and polymeric biguanide |
| WO2009063291A1 (en) * | 2007-11-13 | 2009-05-22 | Bio-Technology General (Israel) Ltd. | Dilute filtration sterilization process for viscoelastic biopolymers |
| US9096819B2 (en) | 2008-01-31 | 2015-08-04 | Bausch & Lomb Incorporated | Ophthalmic compositions with an amphoteric surfactant and an anionic biopolymer |
| US8119112B2 (en) * | 2008-01-31 | 2012-02-21 | Bausch & Lomb Incorporated | Ophthalmic compositions with an amphoteric surfactant and hyaluronic acid |
| CN102177180A (zh) | 2008-04-04 | 2011-09-07 | 犹他州大学研究基金会 | 烷基化半合成的糖胺聚糖醚及其制备和使用方法 |
| US20100286010A1 (en) * | 2008-09-03 | 2010-11-11 | Erning Xia | Ophthalmic Compositions with Hyaluronic Acid |
| US20100086512A1 (en) | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Rolf Schaefer | Mucomimetic compositions and uses therefore |
| US20100178317A1 (en) * | 2009-01-09 | 2010-07-15 | Burke Susan E | Lens Care Solutions with Hyaluronic Acid |
| JP5957438B2 (ja) * | 2011-03-02 | 2016-07-27 | デンカ株式会社 | ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液 |
| CN103442719A (zh) * | 2011-03-02 | 2013-12-11 | 电气化学工业株式会社 | 含透明质酸或透明质酸盐的水溶液 |
| KR20140145940A (ko) * | 2011-03-02 | 2014-12-24 | 덴키 가가쿠 고교 가부시기가이샤 | 수지제 배럴을 갖는 시린지 내에 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 충전하여 형성되는 프리필드시린지 |
| JP5957441B2 (ja) * | 2011-03-02 | 2016-07-27 | デンカ株式会社 | ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液 |
| KR20140025369A (ko) * | 2011-03-02 | 2014-03-04 | 덴키 가가쿠 고교 가부시기가이샤 | 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액 |
| JP6062917B2 (ja) | 2011-03-23 | 2017-01-18 | ザ ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデイション | 泌尿器科の炎症の治療及び予防の方法 |
| RU2477138C1 (ru) * | 2011-11-02 | 2013-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное предприятие "Тульская индустрия ЛТД" | Способ получения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии, заполняющий материал и способ введения заполняющего материала в проблемную зону |
| ITMI20120664A1 (it) | 2012-04-20 | 2013-10-21 | Anika Therapeutics Srl | Biomateriali a base di gellano per l'uso come filler in chirurgia |
| US10723812B2 (en) | 2014-02-06 | 2020-07-28 | New York University | Method for separating hyaluronan and quantifying its molecular mass distribution in biological samples |
| IT201600079633A1 (it) * | 2016-07-28 | 2018-01-28 | Fidia Farm Spa | Procedimento di preparazione e purificazione del sale sodico dell’acido ialuronico |
| WO2018053111A1 (en) | 2016-09-15 | 2018-03-22 | University Of Utah Research Foundation | In situ gelling compositions for the treatment or prevention of inflammation and tissue damage |
| CN111228653A (zh) | 2018-11-13 | 2020-06-05 | 格莱科米拉治疗公司 | 用电离辐射加强癌症治疗的方法 |
| KR20220113937A (ko) | 2019-12-05 | 2022-08-17 | 씨아이에스 파르마 에이쥐 | 안과용 고 히알루로네이트 다목적 소독액 |
| RU2765951C1 (ru) * | 2021-05-14 | 2022-02-07 | Общество с ограниченной ответственностью "АВЕО" | Способ очистки гиалуроната от эндотоксинов |
| EP4395796A1 (en) | 2021-09-01 | 2024-07-10 | Shanghai Qisheng Biological Preparation Co., Ltd. | Cartilage regeneration using injectable, in situ polymerizable collagen compositions containing chondrocytes or stem cells |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT252264B (de) * | 1965-03-17 | 1967-02-10 | Etapharm Chem Pharm Lab Ges M | Verfahren zur Herstellung eines reinen hochviskosen Hyaluronsäurepräparates |
| US4141973A (en) * | 1975-10-17 | 1979-02-27 | Biotrics, Inc. | Ultrapure hyaluronic acid and the use thereof |
| US4766348A (en) * | 1983-06-09 | 1988-08-23 | Gte Products Corporation | Single-ended metal halogen lamp and fabrication process employing ionization potential selection of additive gases |
| IN163192B (hu) * | 1983-10-11 | 1988-08-20 | Fidia Spa | |
| US5093487A (en) * | 1986-01-06 | 1992-03-03 | Mobay Corporation | Low viscosity high molecular weight filter sterilizable hyaluronic acid |
| NO161573C (no) * | 1983-11-25 | 1989-08-30 | Miles Inc | Fremgangsmaate til fremstilling av hyaluronsyre. |
| JPS6121241A (ja) * | 1984-07-10 | 1986-01-29 | オリエンタル建設株式会社 | プレストレストコンクリ−ト部材組立式ラ−メン構造体における多スパン梁の構築方法 |
| US4784990A (en) * | 1985-01-18 | 1988-11-15 | Bio-Technology General Corporation | High molecular weight sodium hyaluronate |
| AU600257B2 (en) * | 1986-03-21 | 1990-08-09 | International Pharmaceutical Products, Inc. | Non-inflammatory hyaluronic acid fraction and process for preparing it |
| IT1198449B (it) * | 1986-10-13 | 1988-12-21 | F I D I Farmaceutici Italiani | Esteri di alcoli polivalenti di acido ialuronico |
| JPH0813847B2 (ja) * | 1987-08-11 | 1996-02-14 | 日本化薬株式会社 | ヒアルロン酸の分画法 |
| JPH01210401A (ja) * | 1988-02-17 | 1989-08-24 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 酸性多糖類の分離法 |
| JPH0723317B2 (ja) * | 1988-03-17 | 1995-03-15 | 生化学工業株式会社 | 角膜上皮層障害症治療剤 |
| US4920104A (en) * | 1988-05-16 | 1990-04-24 | Medchem Products, Inc. | Sodium hyaluronate composition |
| JP2731545B2 (ja) * | 1988-10-12 | 1998-03-25 | 電気化学工業株式会社 | ヒアルロン酸の精製方法 |
-
1991
- 1991-04-19 IT ITPD910077A patent/IT1247175B/it active IP Right Grant
-
1992
- 1992-04-16 DE DE69230242T patent/DE69230242T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-16 JP JP4507997A patent/JP2580458B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-16 WO PCT/EP1992/000861 patent/WO1992018543A1/en active IP Right Grant
- 1992-04-16 HU HU9204012A patent/HU215193B/hu unknown
- 1992-04-16 AT AT92908628T patent/ATE186307T1/de active
- 1992-04-16 KR KR1019920703262A patent/KR0178544B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-04-16 SK SK3771-92A patent/SK280191B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-04-16 EP EP92908628A patent/EP0535200B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-16 BR BR9205240A patent/BR9205240A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-04-16 DK DK92908628T patent/DK0535200T3/da active
- 1992-04-16 IL IL10161192A patent/IL101611A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-04-16 SG SG1996005472A patent/SG46515A1/en unknown
- 1992-04-16 CZ CS923771A patent/CZ282248B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-04-16 ES ES92908628T patent/ES2092971T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-16 PL PL92297297A patent/PL168477B1/pl unknown
- 1992-04-16 RU RU92016520A patent/RU2128666C1/ru active
- 1992-04-16 CA CA002084875A patent/CA2084875C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-16 AU AU15766/92A patent/AU653022B2/en not_active Expired
- 1992-12-16 NO NO924873A patent/NO305520B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-12-18 FI FI925756A patent/FI104973B/fi not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-06-16 UA UA93002144A patent/UA27229C2/uk unknown
-
1995
- 1995-04-20 IL IL11345395A patent/IL113453A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-05-11 US US08/439,437 patent/US5559104A/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-01-19 GR GR20000400131T patent/GR3032434T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU215193B (hu) | Eljárás szemészeti célra alkalmazható nagy tisztaságú hialuronsav-frakció és az ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására | |
| US4141973A (en) | Ultrapure hyaluronic acid and the use thereof | |
| US5681825A (en) | Surgical method | |
| EP1854812B1 (en) | Pectic polysaccharides isolated from fruit pods of okra | |
| RU2145882C1 (ru) | Синтетический вязкоэластичный материал для применения в офтальмологии | |
| FR2553099A1 (fr) | Fractions d'acide hyaluronique ayant une activite pharmaceutique, procedes pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant | |
| NO174277B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et hyaluronsyresalt | |
| US20100036387A1 (en) | Viscoelastic Composition for Surgical Procedures | |
| CN1111403C (zh) | 继发性白内障抑制剂 | |
| KR101341647B1 (ko) | 베타-글루칸을 포함하는 각결막염 치료용 점안제 조성물 | |
| JPS6281319A (ja) | 前眼部手術用の前房注入剤 | |
| CN115209926B (zh) | 用于眼内膜剥离术的制剂 | |
| WO2011146863A1 (en) | Surgical compositions containing sigma-receptor agonists | |
| RU2098079C1 (ru) | Глазной гель | |
| RU2135127C1 (ru) | Раствор для защиты и лечения заболеваний и повреждений роговицы "визитин" | |
| RU2197923C1 (ru) | Фармацевтическая композиция для лечения отеков роговицы "осмогель" | |
| NZ209850A (en) | Preparing pure hyaluronic acid fractions and pharmaceutical compositions |