KR100894042B1 - 설파살라진-히알루론산 혼합물의 제조방법 및 이로부터얻어진 혼합물을 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 설파살라진-히알루론산 혼합물의 제조방법 및 이로부터 얻어진 혼합물을 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물에 관한 것으로,

본 발명에서 제시된 설파살라진-히알루론산 혼합물은 난용성인 설파살라진을 폴리에틸렌 글리콜과 첨가물을 사용하여 친수성으로 바꾸어 준 다음, 다시 수정체낭에 안전하게 주입되고 투명성을 유지할 수 있도록 히알루론산와 반응시킨 것이다.

본 발명에 의한 설파살라진-히알루론산 혼합물 및 조성물은 수정체낭에서 천천히 분해되어 수정체 상피세포가 증식 및 이동할 때 발현되는 NF-k B의 활성을 억제하여 후발성 백내장의 발병을 억제하는 효과를 낳는다.

후발성 백내장, 수정체 상피세포, 설파살라진, 히알루론산

Description

설파살라진-히알루론산 혼합물의 제조방법 및 이로부터 얻어진 혼합물을 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물{A METHOD FOR PREPARING SULFASALAZINE HYALURONIC ACID COMPOUND AND COMPOSITION FOR AFTER-CATARACT SUPPRESSION CONTAINING COMPOUND PREPARED FROM THE METHOD}

도 1은 후발성 백내장 발생 모식도,

도 2는 후발성 백내장과 수정체 상피세포의 증식과 변형관계 모식도,

도 3은 설파살라진, 히알루론산 복합체의 제조 흐름도,

도 4a 및 4b는 배양된 사람 수정체 상피세포에서 본 발명의 일 실시예에 의해 얻어진 설파살라진-히알루론산 혼합물의 수정체 상피세포에 대한 이동 및 증식의 억제효과를 각각 입증하는 사진,

도 5는 설파살라진-히알루론산 혼합물의 사람 수정체 상피세포에 대한 독성을 조사한 그래프이고,

도 6은 본 발명의 일 실시예에 의해 얻어진 설파살라진-히알루론산 혼합물이 돼지의 수정체에서 후발성 백내장을 억제하는 효과를 입증하는 사진 및 그래프로서, 약물이 처리되지 않은 대조군(A), 설파살라진-히알루론산 혼합물(B), SN50(C)를 각각 도시하고,

도 7은 수정체 상피세포 이동 도중 NF-k B가 발현되는 것을 입증하는 사 진(A)과, 본 발명의 일 실시예에 의해 얻어진 설파살라진-히알루론산 혼합물을 적용하였을 때 NF-k B의 활성 억제를 입증하는 그래프(B)이다.

본 발명은 설파살라진-히알루론산 혼합물의 제조방법 및 이로부터 얻어진 혼합물을 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 백내장 수술 후 20-50%의 환자에서 발생하는 후발성 백내장을 치료하기 위한 약물개발과 적용에 관한 것이다.

후발성 백내장(After-cataract, Posterior capsular opacity)은 백내장 발병 후 수술로 치료된 후에 다시 수정체가 혼탁해 지는 질환으로 이것은 수술 후 남아있는 수정체 상피세포가 발병의 원인이다. 이같은 후발성 백내장은 백내장 수술 후 발생하는 질환으로 노인에서보다 젊은 환자에서 발병률은 배 이상 높다. 후발성 백내장의 치료는 레이저(Nd-Yg Laser) 수술이 유일한 방법이고 시야는 좁아든다. 그러므로 후발성 백내장은 예방적 치료가 가장 효과적인 치료방법이다.

이같은 후발성 백내장의 발생 모식도를 도 1에 정리하였다. 도 1에서 보듯이, 후발성 백내장은 백내장 수술 후 수정체 상피세포가 외부환경에 노출됨으로서 수정체 상피세포가 증식을 계속하게 되고, 빈 공간인 수정체낭의 후면으로 이동하 여 세포 변형과 증식이 계속 일어나 빛의 투과력을 저하시키고 시력을 저하시키게 되며, 이같은 수정체 후낭에 모인 수정체 상피세포가 완전히 변형되면 후발성 백내장이 된다.

구체적으로, 후발성 백내장 발병과 수정체 상피세포간 관계는 도 2에 모식도로서 나타낸 바와 같다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, 백내장 수술 후 외부환경에 노출되면 수정체 상피세포가 증식하게 되고, 이들이 이동되어 수정체 후낭에 모인 수정체 상피세포가 완전히 변형되면 결과적으로 빛 투과력과 투명도가 감소되는 것이다.

현재까지 후발성 백내장을 억제하는 방법으로는 백내장 수술시 사용되는 인공수정체 지지부에 물리적인 변화를 가하거나 수정체낭 확장 고리를 이용하는 방법 등이 제시되고 있다.

또한, 관련 선행기술로는 한국 특허출원 공개 제2003-0023098호 (설파살라진 또는 그 수용성 염을 활성성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 망막손상 치료용 안약 조성물과 그 제조방법)에서 녹내장에 의한 망막의 허혈, 당뇨병성 망막증에 의한 망막 손상, 포도막염에 의한 망막 신경의 퇴화 등의 치료에 대하여 기술하고 있다.

또한, 한국 특허출원 공개 제2001-0092980호 (후발성 백내장의 발병 억제를 위한 기술 후발성 백내장 억제와 치료를 위한 뇌질환 예방 및 치료용 조성물)로서, 2-하이드록시-5-[[4-(2-피리디닐아미노)설포닐]아조]벤조산 ("설파살라진")을 유효성분으로 함유하는 파킨슨병, 헌팅톤병 및 알츠하이머병으로 이루어진 그룹에서 선택되는 뇌신경 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 대하여 기술하고 있다.

그러나, 후발성 백내장의 원인을 수정체 상피세포의 증식 및 이동에 기반을 두고 억제제를 개발하는 기술은 아직까지 시도된 바 없다.

이에 본 발명자들은 후발성 백내장의 원인이 수정체 상피세포의 증식 및 이동의 메카니즘에 의한 것이라는 점에 착안하여, 이같은 수정체 상피세포의 증식 및 이동 메카니즘을 억제하고 수정체 후낭의 투명성을 유지시킬 수 있는 억제제에 관한 연구를 계속한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 제 1 목적은 백내장 수술시 혹은 수술 이후 후발성 백내장의 발병을 낮추거나 억제를 위한 것으로, 후발성 백내장의 발병 기전에 기초를 둔 치료기술을 제공하는 데 있다.

본 발명의 제 2 목적은 백내장 수술 후 남아 있는 수정체 상피세포의 증식 및 이동 메카니즘을 억제하고 수정체 후낭의 투명성을 유지시키기 위한 치료기술을 제공하는 데 있다.

본 발명의 제 3 목적은 후발성 백내장은 효과적으로 억제하면서 동시에 백내장 수술에 영향을 주지 않고, 다른 눈 조직에도 영향을 미치지 않는 치료기술을 제공하는 데 있다.

상술한 목적들을 달성하기 위하여, 본 발명은 백내장 수술시 혹은 수술 이후 약물을 투여하여 후발성 백내장을 억제함에 있어, 초기 수정체 상피세포의 증식과 이동을 억제하는 발병 기전에 바탕을 둔 억제제 제공기술을 제시하는 특징을 갖는다.

즉, 본 발명의 제1 견지에 의하면,

설파살라진을 페그화(pegylation)하는 단계; 및

얻어진 설파살라진에 히알루론산을 첨가하는 단계; 를 포함하여 이루어지는 설파살라진-히알루론산 혼합물의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 제2 견지에 의하면,

상기 제1 견지에 의해 제조된 설파살라진-히알루론산 혼합물이 제공된다.

본 발명의 제3 견지에 의하면,

(i) 약제학적 담체 및 (ii) 후발성 백내장을 억제하기에 충분한 양의 청구항 4항의 혼합물 또는 약제학적으로 허용되는 염을 함유하는 후발성 백내장 억제용 조성물이 제공된다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명에서 후발성 백내장 억제용 혼합물 및 조성물의 기본 성분으로 사용하는 설파살라진은 수정체 상피세포가 증식 및 이동을 할 때 발현되는 NF-k B의 활성을 억제하여 후발성 백내장의 발병을 억제하는 역할을 수행하게 된다.

이같은 설파살라진은 물에 난용성이어서, 약제로 사용하기 위해서는 그 가용화가 필요하다. 즉, 설파살라진에 염화수소, 혹은 염화나트륨, 염화칼륨 등을 첨가하여 염의 형태로도 사용할 수 있다.

이에 설파살라진을 페그화 반응시켜 친수성으로 변환시키며, 이를 위해 용매로는 염 균형 용액(Balanced Salt Solution)이 사용되는 것으로, 상기 BSS 용액으로는 통상 입수 가능한 것을 사용하면 충분하며, 일례로는 10%(v/v) 폴리글리콜(MW 400)을 함유하는 용액을 사용할 수 있다.

첨가 함량비는 10%(v/v) 폴리글리콜(MW 400)을 함유하는 염 균형 용액 500ml에 설파살라진을 0.5mM 이하의 농도 범위로 첨가하면 세포 독성 및 후발성 백내장 예방 효과 측면에서 볼 때 바람직하다.

그런 다음 완전히 혼합시키는 것이 좋으며, 필요에 따라서는 실온에서 1시간 정도 통상의 혼합 공정을 수행할 수도 있다.

나아가, 페그화된 설파살라진과 반응되는 히알루론산은 수정체낭에 안전하게 주입시키고 나아가 적용처인 눈의 특성상 투명성을 유지시키기 위하여 사용되는 것으로, 그 함량비는 설파살라진 혼합용액과 동량의 중량비(예를 들어, 1:1)로 첨가하면 충분하다.

그런 다음 완전히 혼합시킨다. 필요에 따라서는 실온에서 2시간 정도 통상의 혼합 공정을 수행할 수도 있다.

이같이 혼합된 설파살라진-히알루론산 혼합물은 수정체낭에서 수정체 상피세포와 결합하고 설파살라진은 세포내로 천천히 침투되어 수정체 상피세포가 증식 및 이동할 때 발현되는 NF-k B의 활성을 억제하여 결과적으로 후발성 백내장 발병을 억제하는 효과를 낳는다.

얻어진 혼합액은 사용시까지 냉장 보관하는 것이 바람직하다.

즉, 본 발명에 의한 설파살라진-히알루론산 혼합물은 난용성인 설파살라진을 폴리에틸렌 글리콜과 첨가물을 사용하여 친수성으로 바꾸어 준 다음, 다시 수정체낭에 안전하게 주입될 뿐 아니라 눈의 투명성을 유지시킬 수 있도록 히알루론산와 반응시킨 것이다.

이같은 본 발명에 의한 설파살라진과 히알루론산 혼합물의 조제 흐름도를 도 3에 정리하였다.

또한, 이같은 설파살라진-히알루론산 혼합물을 증류수로 희석시켜 후발성 백내장 억제용 조성물을 제조할 수 있다. 얻어진 조성물을 증류수에 0.1 ~ 0.5 mM 의 농도로 용해하여 본 발명의 조성물을 활성성분으로 하는 후발성 백내장 억제용 조성물을 제조한다.

상기 증류수 대신 약학적으로 허용가능한 담체 혹은 부형제를 혼합하여 사용할 수도 있다.

이같은 조성물을 백내장 수술시 혹은 수술이후 필요시 주사제 혹은 안약 등의 형태로 투여가능하다.

본 발명에 의해 얻어진 후발성 백내장 억제용 조성물은 다음과 같은 기능 및 작용을 하는 것으로 규명된다:

첫째, 백내장 수술시 혹은 수술이후 투여하여 수정체에 남아있는 수정체 상피세포의 증식 및 이동을 억제하고 수정체 후낭의 투명성을 유지시킨다.

둘째, 수정체 상피세포의 증식과 이동에만 관여하고 일정기간이 지나면 생체 분해됨으로 주변 조직에는 영향을 미치지 않는다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명의 후발성 백내장 억제용 혼합물 및 조성물을 구체적으로 설명한다. 이는 본 발명의 실시 예일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 사람 수정체의 상피세포 배양

수정체 상피세포로서 Human lens epithelial B3 cell line(이하, 'HLE B3세포'라 한다)를 사용하여 Eagle's minimum essential medium (MEM, Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, USA)에 20% fetal bovine serum이 포함된 배양액에서 배양시켰다. 이때 사용되는 세포배양기는 37℃, 5% CO₂세포 배양기를 이용하였다.

제조예 2: 수정체낭 배양

돼지 눈을 이용하며, 수정체를 분리 후 수정체 낭의 전방을 직경 약 5mm정도로 잘라내고, 수정체낭 확장 고리 (Tension ring, CTR98-A, Lucid Korea, Seoul, Korea)를 삽입한 후, 수정체의 내용물을 제거하였다.

이렇게 수정체낭만 남아있는 것을 혈청(serum)이 없는 Dulbeccos Modified essential medium (DMEM)배양액에 넣어 5% CO₂세포 배양기를 이용하여 37℃에서 배 양하였다.

약물의 적용효과는 배양 후 14일에 관찰하였다.

제조예 3: 히알루론산 - 설파살라진 혼합물의 제조

설파살라진을 10%(v/v) 폴리에틸렌 글리콜 (PEG, MW400, 상품명:P3265, Sigma사)이 포함된 염 균형용액 (Balanced salt solution, 상품명:BSS PLUS PART I, Alcon사) 500ml에 0.1mM, 0.3mM, 0.5mM씩 넣은 다음 실온에서 1시간정도 섞어 주었다.

설파살라진 혼합용액에 2% 히알산 (히알루론산)을 50:50 중량비로 배합하여 2시간 동안 혼합하였다.

이렇게 혼합된 설파살라진-히알루론산 혼합액을 사용할 때까지 냉장 보관하였다.

제조예 4: 투여 방법

제조예 2의 수정체낭에 대하여 제조예 3에서 얻어진 설파살라진-히알루론산 혼합물과 제조예 1에서 얻어진 세포배양액을 1:1 동량으로 섞은 다음 투여하였으며, 1회 투여 후 효과를 관찰하였다.

효과 분석방법은 다음과 같다.

1) 세포독성: MTT assay를 통하여 분석하였다.

2) 단백질 활성: Western blot 분석법을 이용하여 수행하였다.

얻어진 모든 결과에 대한 통계학적 분석은 one-way ANOVA test를 이용하여 실시하였다.

실시예 1:

본 실시예는 설파살라진-히알루론산 혼합물이 수정체 상피세포의 이동을 억제하는지 여부와 함께 농도별 세포 독성을 갖는지 여부를 함께 확인하기 위한 것이다.

수정체 배양된 사람의 수정체 상피세포에서 제조예 3의 설파살라진-히알루론산 혼합물의 효과를 관찰하였다. 즉, 설파살라진-히알루론산 혼합물에 대한 사람의 수정체 상피세포의 이동 억제 효과를 0(대조군), 0.3mM, 0.5mM의 농도별로 확인하고 그 결과를 도 4에 도시하였다.

도 4a에서 보듯이, 설파살라진을 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때, 설파살라진-히알루론산 혼합물 0.3mM과 0.5mM 각각에서 세포의 이동이 억제된 것을 확인할 수 있었다.

구체적으로는 도 4b에서 보듯이, 배양된 사람수정체 상피세포에서 설파살라진-히알루론산 혼합물의 수정체 상피세포에 대한 이동 및 증식의 억제효과는 0.3mM에서 38±7%, 0.5mM에서 83±5%의 억제효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 5에서 보듯이, 0.5mM 이하 농도에서 MTT assay 실험결과 세포의 독성은 없는 것을 확인하였다.

실시예 2:

본 실시예는 설파살라진-히알루론산 혼합물이 수정체 상피세포의 이동을 억제하는지를 입증하기 위한 것이다.

제조예 4의 돼지 수정체낭을 이용한 후발성 백내장 모델에서 설파살라진-히알루론산 혼합물이 수정체 상피세의 이동을 억제하여 수정체 후면의 혼탁을 예방하는지를 관찰하고 얻어진 결과를 도 6에 도시하였다.

도 6에서 보듯이, 본 발명에 의한 설파살라진-히알루론산 혼합물과 NF-k B활성 억제제로 알려진 SN50 (Calbiochem, 481480)를 사용하여 실험결과, 수정체 상피세포가 수정체 후낭(Posterior capsule, 도 6내에서 PC로 표시함)로 이동이 현저하게 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 구체적인 억제효과는 SN50(C)의 경우 43%이었고, 설파살라진-히알루론산 혼합물(B)의 경우 56%까지 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 참고로, 도 6내 Asterisks(*)는 수정체 상피세포 군집을 나타내고, A는 약물이 처리되지 않은 대조군을 의미한다.

실시예 3:

본 실시예는 수정체 상피세포의 증식과 이동에 관련하여 NF-k B가 활성화되는 것을 관찰하고 본 발명에 의한 설파살라진-히알루론산 혼합물이 수정체 상피세포의 이동 중 NF-k B의 발현과 활성을 억제하는지를 함께 관찰하기 위한 것이다.

우선, 수정체 상피세포의 증식 및 이동과 관련하여 NF-k B 가 세포질 및 핵 모두에서 활성화되는지를 관찰하였으며 그 결과를 도 7A에 나타내었다. 참고로, 도 7A에서 Alpha-tubulin은 세포질 마커로, Laminin A는 핵단백질 마커로 사용하였고, 대조군으로는 SN50 NF-k B억제제를 이용하였다. 그 결과, 수정체 상피세포 이동중 NF-k B가 세포질과 핵 모두에서 발현하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, NF-k B의 핵으로의 이동이 SN50과 본 발명에 의한 설파살라진-히알루론산 혼합물(Sulfa)에 의하여 억제되는지를 확인하고 그 결과를 도 7B에 정리하였다. 도 7B에서 보듯이, 세포질과 핵 모두에서 SN50과 설파살라진-히알루론산 혼합물 모두 NF-k B의 핵으로의 이동을 억제하였으며, 특히 설파살라진-히알루론산 혼합물이 50% 이상 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에 의한 후발성 백내장 억제용 조성물에 따르면, 후발성 백내장의 발병률을 낮출 수 있고, 후발성 백내장으로 인한 시력의 상실을 예방하고, 2차적 수술을 피할 수 있을 뿐 아니라 안전성이 확보된 설파살라진을 새롭게 이용할 수 있다.

현재 후발성 백내장 억제제는 개발되지 않아 선도적인 발명일 뿐 아니라 발병기전이 비슷한 세포 증식성 질환에도 적용가능한 잇점을 갖는다.

Claims (7)

1. (a) 설파살라진을 10%(v/v) 폴리에틸렌 글리콜(PEG, MW400)이 포함된 염 균형 용액(Balanced Salt Solution) 500ml에 0.5mM 이하 농도로 가한 다음 실온에서 섞어서 난용성 설파살라진을 친수성으로 변환시키는 단계; 및

   (b) 상기 친수성 설파살라진에 히알루론산을 첨가하는 단계; 를 포함하여 이루어지는 설파살라진-히알루론산 혼합물의 제조방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 친수성 설파살라진과 히알루론산의 함량비는 중량 기준으로 동량 범위내인 것을 특징으로 하는 설파살리진-히알루론산 혼합물의 제조방법.
4. 제1항 또는 제3항의 방법에 의해 제조된 설파살라진-히알루론산 혼합물.
5. (i) 약제학적 담체 및 (ii) 후발성 백내장을 억제하기에 충분한 양의 청구항 4항의 혼합물 또는 약제학적으로 허용되는 염을 함유하는 후발성 백내장 억제용 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 담체로는 증류수를 사용하는 것을 특징으로 하는 후발성 백내장 억제용 조성물.
7. 제5항에 있어서, 상기 혼합물 또는 약제학적으로 허용되는 염의 함량은 0.5mM 이하 범위내인 것을 특징으로 하는 후발성 백내장 억제용 조성물.

Images