KR0178544B1 - 안과용 순수 히알우론산 분류물 및 그의 정제방법 - Google Patents
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- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
- C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
- C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
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Abstract
히알우론산의 고순도 분류물은 안과 수술시 염증을 일으키지 않고 수술후 합병증을 일으키지 않는 것으로 나타났다. 또한, 해당 사급 암모늄염 내로 히알우론산을 전환시키는 것과 다음의 정제과정, 히알우론산의 나트륨염 내로 사급 암모늄염을 재전환시키는 것을 특징으로 하는 히알우론산의 제조방법을 나타냈다.
Description
[발명의 명칭]
안과용 순수 히알우론산 분류물 및 그의 정제방법
[발명의 상세한 설명]
[본 발명의 배경 및 분야]
본 발명은 히알우론산 및 그의 염의 고순도 분류물의 신규한 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 일정한 범위에서 평균 분자량을 갖는 상기 방법으로 얻을 수 있는 히알우론산 및 그의 염 특히 나트륨염의 특별한 분류로 이루어진다.
히알우론산(HA)은 글리코스아미노글리칸(무코다당류)으로 공지된 생물학적인 거대분자의 강(綱)의 전형적이며 중요한 상징물이다. HA는 척추 동생물의 결합조직 모두에서, 동일한 분자구조로 존재하는 생물학적인 폴리머이며, 손상시에, 긴장도, 향성(向性) 및 조직 회복과 엄밀하게 관련되는 이 국소 수준 감지에서, 구조적이고 생물학적인 역할을 행한다. 생물학적인 물질의 생리학적인 관찰은 Phys. Rev.(Comper W.D., Laurent T.C.:Physiological function of connective tissue polysaccharides. Phys. Rev., 58, (1), 255-315, 1978)에 기재되어 있다. HA의 화학적-물리적 성질은 교체 중 중합되고, 오랜 기간 형성되고, 8,000,000달톤의 최대 분자량에서 변하는 비측쇄 분자 등의 다당 생 중합체(D-글루크론산과 N-아세틸글루코스아민)이다(Meyer K.; Chemical Structure of Hyaluronic Acid. Fed. Proceed. 17, 1075, 1958; Laurent T.C.; Chemistry and Molecular Biology of Intracellula Matrix, 703-732, Academic Press N.Y., 1970). 수용액에서 이 생 중합체의 행동은 소위 점-탄성도로 불리우는 특별한 점도를 보증하며, 이것은 어떤 생물학적인 유체, 특히 활액 및 초자체액의 전형적인 것이고, HA는 0.12 내지 0.24%의 농도로 존재한다(Balazs E.A. et al.:Hyaluronic acid and replacement of vitreous and aqueous humor. Mod. Probl. Ophthal., 10, 3-21, 1972). 또한, 인간의 수성체액은 1.14mcg/g의 평균 농도에서 HA를 함유하는 것으로 나타났다(Laurent U.B.G.:Hyaluronate in human aqueous humor. Arch. Ophthalmol., 101, 129-130, 1983).
공증의 신체는 결합 및 상피조직, 특히 다음과 같은, 병리학적인 조건의 중요한 종류에서 치료학적 및 보호적인 명백한 효과를 갖는 외인성(外因性) HA의 국소 공급을 보여주는 축적을 가졌다.
-비-치유 피부 궤양에서 손상된 조직 재생
-관절 결합조직의 관절 변질
-안과 수술
특히 평가된 가능성은 HA의 점-탄성에 의해 외과 수술 처치동안 손상의 위험에 노출된 조직을 피복시키기 위해 제공된다. 각막과 같은 뜻밖의 접촉 외상에 대부분 노출되는 조직에 외인성 HA의 점성층의 존재로 보호적인 효과 능률을 발휘하는데 HA를 사용하였던 모든 외과 의사들에 있어서, HA는 수술의 성공적인 성취에 매우 양호한 등급으로 나타났다.
각막에 외인성의 HA로 실행되는 보호적인 효과 및 조직 회복의 촉진 효과는 실험 동물 및 사람에서 모두 나타났었다.(Miller D. et al.;Use of Na-hyaluronate during intraocular lens implantation in rabbits. Ophthalmic surgery, 8, (6), 58-61, 1977; Miller K. et al.:Use of Na-hyaluronate in autocorneal transplantation in rabbits. Ophthalmic surgery, 11, (1), 19-21, 1980; Graue E.L. et al.:The protective effect of Na-hyaluronate to corneal endothelium. Exp. Eye Res., 31, 119-127, 1980; Ozaki L. et al:Protective effect of Healon-coated intraocular lens on the corneal endothelium. Folia Ophtalmologica Japonica, 32, 1301-1305, 1981), (Norm M.:Preoperative protection of cornea and conjunctiva. Acta Ophthalmologica, 59, 587-594, 1981; Polack F.M. et al.: Sodium hyaluronate(Healon) in keratoplasty and IOL implantation. Ophthalmology, 88, 425-431, 1981).
상기한 바와 같이 치료에 사용되는 고순도의 정제된 히알우론산의 정제방법과 특히, 여러 가지 고순도의 히알우론산 분류물이 공지되었다.
유기 물질의 추출에 의해서 예를 들면, 암탉 볏에서 직접 얻은 내재 히알우론산의 분자 분류물은 넓은 범위에서 다양하게 분자량을 가질 수 있고, 예를 들면 내재산의 분자량의 약 90%∼80% 내지 0.2%, 바람직하기로는 5% 내지 0.2%를 가질 수 있다. 분류물은 가수분해화 또는 산화 또는 화학적인 효소제 또는 물리적인 과정, 예를 들면 기계적 또는 방사선 등에 의해서 내재 산으로부터 얻을 수 있고, 그 결과 최초의 추출은 이들과 동일한 정제 과정으로 형성된다(예를 들면, Balazs et al. in Cosmetics Toiletries, Italian edition No. 5/84, pp 8-17).
얻어진 분자 분류물의 분리와 정제는 공지 기술로 실행된다.
예를 들면, 미국 특허 제4,141,973호에 안과 수술시 특별하고 고순도이며 염증 효과가 없는 측면에서 사용될 수 있는 적어도 750,000달톤의 분자량의 히알우론산의 제조 방법이 기재되어 있다. 출발 물질에서 HA 나트륨염을 추출하는 방법은 사용된 동물 기관에서 남아있는 혈액을 제거하고, 이렇게 얻은 추출물을 탈 단백화하고, 염증성 불순물을 제거하고, 살균된 수용액에서 처리하고, 유기 용매와 수용액에서 히알우론산 염을 침전시켰다. 혈액 잔류물은 에탄올로 제거시키고, 이 나트륨 염 형태의 HA(이것의 출발 물질에서 나타난 형태)는 물로 추출하고, 탈 단백화는 희석산과 동시에 클로로포름으로 가수 분해된 부분을 추출로 처리하고, 또는 단백질 효소의 수단으로 실행하고, 해로운 염증성 물질은 pH 6 내지 pH 7에서 클로로포름의 추출로 제거시키고, 살균은 염화세틸피리디늄으로 처리하였다. 이 과정에 의해서, 얻은 히알우론산 분류물은 단지 1,586,000달톤의 분자량을 갖는 것으로 특허에 명백하게 기재되어 있다. 이것의 화학적, 물리적 및 생물학적 특성의 기초로, 히알우론산의 분자 분류물은 힐론(HEALON) 상표로 알려진 시판 제품에 해당하는 것으로 나타났다.
신규한 기술은 분자 한외여과법으로 개발되어 왔다. 이 정제 방법에 의해서 분자 크기 범위보다 높거나 낮은 한계 내에 들어오는 분자량으로 이들 HA 분류물을 버리는 것이 가능하다. 예를 들면, 1990년 7월 25일 등록된 유럽 특허 제01238572호에는 30,000이상의 분자량을 잡는 막에 의한 30,000의 분자차단 막을 통해 두분자 한외 여과에 대해, 파파인에 의한 유기성 물질과 연속한 효모탈단백화의 추출로 직접 얻은 생성물 접촉으로 250,000 내지 350,000달톤의 평균분자중량으로 히알우론산 나트륨의 분류물을 얻기 위한 방법이 기재되어 있다. 이 분류는 염증성의 이차 작용에서 자유로운 생성물을 달성하는데 중요하게 나타났고, 이런 효과를 위한 확실한 분류물은 예를 들면 약 30,000달톤의 저 분자량이었다.
분자여과 이후, 200,000의 배출을 제한하는 막(200,000달톤 이상의 분자량을 잡는 막)을 사용하여 얻은 여과된 생성물은 50,000 내지 100,000달톤 평균 분자량으로 분류되고(특허 HYALASTINE으로 명칭된), 한편 막에 남은 부분은 500,000 내지 730,000의 평균 분자량을 갖는 히알우론산 나트륨 분류물이다(HYALECTIN이라 칭하는 분류물).
[본 발명의 개시]
본 발명은 고순도이며 일정한 분자량 범위를 갖는 히알우론산 분류물을 제조하는 또다른 방법을 제공한다. 이 분류물은 안과 수술시 유익한 적용을 갖는다; 실지로 생성물은 매우 양호한 내성을 갖으며, 이것은 염증을 일으키지 않고, 수술 후 합병증을 일으키지 않는다. 더욱이, 생성물은 수술 후 합병증, 특히 지나치게 높은 안압을 발생시킴없이 수술 후 바로 퇴원 가능한 커다란 이점을 제공하고, 따라서 지금까지 실행되어 왔던 것과 같이 이것의 제거시 조치에 포함되는 위험을 감소시킨다. 이 나트륨염의 형태의, 순수 히알우론산의 신규한 분류물은 다음의 설명에서 HA-1로 칭한다.
[본 발명의 상세한 설명]
본 발명으로 나타난 바에 의하면, 이것은 주어진 타입의 사급 암모늄염내로 산 또는 염을 전입 시킴으로써, 내재 히알우론산 또는 그들의 염 특히, 알카리성염 주로 나트륨염의 정제 방법의 이점에 대해 조정이 가능해진다.
이러한 염화는 정제 방법 중의 어느 하나의 단계로 실행할 수 있다. 따라서, 이러한 사급 암모늄염은 일정한 유기 용매, 특히 비양자성 용매, 특히 N-메틸피롤리돈에서 쉽게 용해되며, 이들은 수상으로부터 용매로 추출할 수 있고, 따라서 종래에 나타난 기술에 관해 특별하고 추가적인 정제로 실행되며, 이 조작은 과정의 끝에서 얻어진 생성물의 순도를 위해 분명한 가지치가 있다. 사급암모늄염내로 히알우론 성분의 전환은 나트륨염, 다른 염을 함유하는, 특히 NaCl과 같은 염의 수용액에서 처리하는, 거대분자를 함유하는 반응기 또는 컬럼을 사용하는, 사급 암모늄염기에 의한 염화형태에 술폰 이온 교환기, 예를 들면 DOWEX M-14수지, 테트라 부틸암모늄염의 형태로 제조된, 수산화사급암모늄에 의한 술폰수지의 처리에 의해 얻는, 예를 들면 수산화테트라부틸암모늄으로 얻어지는 실시예로 실행할 수 있다. 암모늄염은 용출액 내로 인가되고 물에 의한 이온 교환기에 의해 완전하게 용출된다. 이 수성 추출은 건조로 증발되고, 다당류의 암모늄염에 의해서 이루어진 잔류물은 상기 용매의 하나로 용해되고, 이어서 불용성 고체 부분은 여과시킨다.
본 발명의 방법은 저지방족(C1-6) 하이드로카르빌 치환체에 의한 해당 사급 암모늄염 내로 이들은 전환시킴에 의해서, 히알우론산 또는 이들 분자 분류물의 하나 또는 이들 염의 하나를 정제함으로써, 이들의 더욱 일반적인 개념에서 그들을 특성화한다.
두번째 방법은 유기 용매에서 히알우론산의 사급 암모늄염 또는 이것의 분자 분류물의 하나를 수집함으로써 특성화하고, 이것은 히알우론산 또는 금속염의 형태로 이들 분자 분류물을 여과한 용액으로부터 회수함으로써 염으로 용해할 수 있고, 원한다면 추가적인 정제로 예를 들면, 그 자체로 이미 공지된 방법으로 얻어지는 염을 제공함에 의해서 용해할 수 있다.
따라서, 본 발명은 동물기관 및 전체 추출물로부터 다당류의 추출 방법 2가지에서 히알우론산의 사급 암모늄염의 사용에 관계되며, 본 발명에 따른 정제는 방법의 어떤 적합한 단계에서 실행될 수 있으며, 분자 분류물의 토막내기 및 분리를 실행하는 조작을 포함하고, 이런 분류물을 공정화에 추가하고, 신규하거나 공지된 순수 또는 순수하지 않은 이미 분리된 분류물의 정제를 추가한다.
상기한 것처럼, 히알우론성 다당류의 전환은 정제 방법의 어느 적합한 단계에서 실행될 수 있으며, 이것이 각 특별한 경우에 실행되어야만 할 때를 이 기술에 숙련가는 선택할 수가 있을 것이고, 판정 기준에 따라 선택하여진 여러 가지 공지 단계의 일정한 조합으로 지시한다. 이들 통상적으로 공지된 단계는 본질적이고 일반적인 다음을 포함한다.
1) 동물 기관에서 다당류의 추출은(이것의 나트륨염 상태로 일반적이고 널리 보급된) 우선적으로 잘게 썰어 균질화된다. 이것은 물과 혼합될 수 있는 유기용매 특히, 지방족 알콜 또는 저지방족(C1-6) 케톤, 에탄올 또는 아세톤과 같은 것의 수단으로 통상 실행된다.
2) 단계 1)에서 얻은 추출물은 적합한 용매 추출에 의해 단백질 물질의 제거 또는 완충 용액, 예를 들면, 시스테인 하이드로클로라이드-포스페이트 존재하에서, 단백질 분해 효소, 특히 파파인, 펩신 트립신 또는 프로나제로 수성 용액의 침지에 의해 제거한다.
3) 단계 1) 또는 단계 2)에 따라 얻은 추출물을 투석한다.
4) 용액의 살균은 공지된 살균제 예를 들면, 염화나트륨 용액에서 염화 세틸피리디늄에 의해 앞선 단계의 어느 하나로 얻는다. 이 조작은 통상 여러번 반복한다.
5) 분자량 차이에 의한 히알우론 다당류 분류물의 분리 또는 각각의 원하지 않는 예를 들면, 한계치의 분자량의 제거는 공공연한 분자 크기 범위로부터 더욱 제거된다. 이 조작은 예를 들면, 공지된 방법의 분자 한외 여과에 의해 바람직하게 실행한다.
6) 정제된 분류물과 또는 적합한 유기용매 예를 들면, 알콜로 침전시켜서 수용액에서 각각의 염(예를 들면 나트륨염)을 분리한다.
이 단계의 결과와 가능하게는 혹은 종래 기술에 사용된 또는 이 분야의 숙련자들에 의해 미리 실행된 다른 것의 결과는 크게 변화시킬 수 있다. 특별한 사급 암모늄염의 염화 단계인 본 발명의 특별한 단계는 최대의 기술적인 효과를 유리하게 기대할 수 있는 곳에서 삽입시킬 수 있다.
다당류 성분의 암모늄염은 상기 용매에 의한 이온 교환수지에서 직접 제거할 수 있고, 이 용매는 염, 특히 다음에 설명된 것과 같은 것을 용해할 수 있으며, 그러나 바람직하게는 암모늄염은 물로 1차 추출하고, 건조도로 증발시킨다. 이렇게 분리된 암모늄염은 상기 용매로 수집하고, 이어서 용액은 여과한다.
본 발명의 방법 실행의 한 특별한 방법은 상기 조작의 조합에서, 상기 순서에서, 단계 2)와 단계 3) 사이에 삽입으로부터 유도한다. 공지 기술과 본 발명의 특별한 단계는 별개로 하고, 사급 암모늄염 내로 히알우론산의 금속염의 전환은 본 발명의 또다른 특이한 개념에 따라, 철 이온을 위한 킬레이팅제의 사용을 만들기 위해, 바람직하게는 상기 추출 단계 1)에서 가능해진다. 실제로, 사용된 동물 기관에 남아있는 혈액으로부터 유도한 본래의 히알우론산 추출물에 항상 존재하는 철 이온은 다당류 사슬의 해중합 공정을 위한 능력이 있는 것으로 공지되어 있다. 금속 이온의 제거는 비교적 고분자량으로 히알우론 분류물의 획득에 많이 이용되는 것으로 확인되었고, 이것은 킬레이트화에 의해 성취할 수 있다. 이 처리를 실시함으로써, 이것은 가능한 한 고분자량으로 히알우론산 또는 그들의 염을 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 또한 특히 순수한 생성물을 상기 철 이온의 전혀없는 것으로 하여 수용액에서 적합하도록 한다.
따라서, 본 발명의 우선의 목적은 히알우론산을 함유하는 동물 기관의 추출 및/또는 유기용매에 의한 이것의 염의 하나를 추출함에 의해서 특성화된 공정으로 이루어지고, 이것은 단백질 제거제와 적당한 완충용액의 존재시 수성용매에서 세척하여 이들의 건조된 잔류물을 우선적으로 수집하고, 저지방족(C1-6) 라디칼로 사급 암모늄염이 하나의 형태로 거대분자 술폰수지로 이루어진 이온 교환기에 어떤 고체 잔류물에서 이미 자유롭게 된, 용액을 통과시킴으로써, 철 이온이 더 이상 존재하지 않을 때까지 조작을 반복한다. 이어서, 이온 교환기로부터 추출된 용출액은 건조시키고, 히알우론산 및 그들의 분류물의 사급 암모늄염을 용해할 수 있는 유기용매에 용해시킨다. 이어서, 암모늄염은 유기용매에 대해 할로겐화나트륨 특히 염화나트륨 또는 브롬화나트륨과 같은 수용액의 첨가로 나트륨염 내로 인가시킨다. 이렇게 얻은 나트륨염의 수용액은 이어서, 물과 혼합될 수 없는 유기용매로 추출하고 선택적으로 반복된 투석으로 처리한다. 이어서, 얻은 용액은 살균제로 처리하고, 살균화 후 얻은 용액은 원한다면 한외 분자여과로 처리할 수 있다. 이어서, 원하지 않는 다소의 히알우론성 다당류 분류물은 버리고, 원하는 히알우론산 나트륨의 분류물은 공지 방법에 의해 분리시킨다.
본 발명에 따라 사급 암모늄염을 용해시키기 위해 사용하는 용매는 비양자성 용매, N-알킬피롤리돈과 같은, 특히 N-메틸피롤리돈, 디알킬술폭시드, 디알킬 카르복실아미드, 특히 저급(C1-6) 디알킬술폭시드, 특히 디메틸술폭시드와 저급(C1-6) 지방족 산의 저급 디알킬아미드, 특히 디메틸 또는 디에틸포름아미드-또는 디메틸-또는 디아세틸아세트아미드이다.
테트라-알킬암모늄염 기를 이온 교환수지 제조에 사용하고 그것으로 본 발명 특성의 히알우론 암모늄염은 저지방족 라디칼의 염기이고, 바람직하게는 탄소 원자 수 1 내지 6의 알킬기이다. 가장 바람직하기로는 테트라부틸 아모늄 이온의 염화수지를 사용한다.
이들 분자 분류물 및 이들 염의 추출, 정제 및 히알우론산의 분리의 공정을 위해 사용하는 상기한 조합에서와 특히, 본 발명에 따른 선행 공정 형태인 상기한 조합에서, 다음의 시약을 사용하는 것이 바람직하다.
(a) 동물 기관으로 이루어진 출발물질의 추출을 위한 시약:에탄올 또는 아세톤.
(b) 철이온을 위한 킬레이트제:1,10-페난트롤린 또는 디메틸유도체.
(c) 단백질 분해제:이미 언급했음.
(d) 사급 암모늄염을 위한 용매:N-메틸피롤리돈 또는 디메틸-술폭시드.
(e) 암모늄염의 유기용액으로부터 얻은 나트륨염의 수성 추출물 정제를 위한 용매:염화메틸렌, 에틸아세테이트.
(f) 살균제:인산염 완충용액의 존재하 염화세틸피리디늄.
(g) 가능하게는 한외 여과 후 정제된 수용액으로부터 나트륨염을 침전시키기 위한 유기용매:에탄올.
상기한 과정에서 또한 더욱 순수한 최종 생성물의 성공적인 획득에 추가적으로 사용할 수 있는 변형체를 인가시키는 것이 가능하다. 예를 들면, 헤테로시클릭핵과 긴-사슬알킬(예를 들면 세틸), 특히 염화세틸피리디늄으로 언급된 것으로, 사급 암모늄염인 상기한 타입의 살균제의 사용은 정제 단계와 같은 쓸모 있는 같은 시간에서 사용할 수 있고, 이것으로 히알우론산 나트륨의 용액에 대한 이들의 첨가는 히알우론산 이온에 의한 해당 암모늄염을 생성한다. 이들 염은 수용액에서 침전됨으로써, 연속적인 재침전화 처리를 반복하고 침전물을 세척함으로써, 한외 정제된 생성물을 분리하는 것으로부터 히알우론산 나트륨의 용액, NaCl용액에 용해시켜서 얻는 것이 가능해진다. 이 생성물은 안과의 수술시에 사용하기에 특히 적합하다.
분자 한외 여과는 공지된 방법으로 실행된다. 이것은 채집, 예를 들면 고분자량 20,000 이상을 분류하는 막을 사용하고, 원한다면 분리된 분류물은 여과된 생성물과 막 둘 모두로부터 회수할 수 있다. 특히 본 발명의 과정을 실행하는 흥미로운 방법은 저분자량의 히알우론 분류물을 제거하는 분자 한외여과에 의한 정제의 상기한 화학적인 조작을 조합한다. 이런 분류물은 치료 목적을 위한 생성물로 실행하는 염증의 초기에 효과가 있는 것으로 인지되어 있다. 이것은 1990년 7월 25일에 유럽특허청에 등록된 유럽 특허 제0138572에 기재된 분류물의 경우에 나타났다.
본 발명의 또다른 바람직한 목적은 저분자량 분자 분류물 특히 30,000 이하의 분자량 분류물을 제거하기에 효과가 있는 선택적인 조합에 관한 상기 공정이다. 이 공정에서, 더욱 엄밀하게, 다음의 실시예 1과 2에 상세하게 나타난 기재에 의해서, 히알우론산 나트륨의 분류는 치료학 관점에서 매우 유용하고 이것은 상기에서 HA-1로 처음 칭하였다. 이것은 특히 안과 수술시에 이것을 사용하는 것이 특히 유리하다.
[안과 수술에서 생성물의 사용]
문헌에 기재된 것처럼 눈에 대한 수술에 사용하기 위해 소개된 히알우론산은 순수 완제품의 기준이 안전하지 않고, 특히 너무 큰 분자량과 과도한 점도의 염증성 물질과 성분의 잔류물 또는 흔적 모두의 존재 때문에 수술 후(예를 들면, 백내장 수술 후) 바로 퇴원할 수 없게 된다. 더욱이, 이들은 상기 이전처럼 바람직하지 않고 위험한 안구의 내부압 증가가 일어날 수 있다.
수술시 전실에 인가된 외인성 HA는 외과 수술 후 안구 내부의 압력에 나쁜 영향을 미치지 않아야 하고, 안구 내부 주위에 일어나는 염증을 더 이상 발생시키지 말아야 한다. 전자에 불리한 효과는 점성의 매우 향상된 등급을 갖는 매우 큰 분자량 HA의 사용 후, 다음 문헌에 반복해서 기재되어 있다.(Binkhorst C.D.:Inflammation and intraocular pressure after the use of Healon in intraocular lens surgery. Am. Intra-Ocular Implant. Soc., J., 6, (4), 340-341, 1980; Pape L.G.:Intracapsular and extracapsular technique of lens implantation with Healon. Am. Intra-Ocular Implant. Soc. J., 6, (4), 342-343, 1980; Passo M.S. et al.:Intraocular pressure following cataract surgery using Healon. ARVO abstracts, 10, 10:45, 1981: Percival P.:Experiences with the Boberg Ans lens and sodium hyaluronate(Healonid). Trans. Ophthal. Soc. UK, 102, (2) 294-297, 1982; McRae S.M. et al.:The effects of sodium hyaluronate, chondroitin sulphate, and methylcellulose on the corneal endothelium and intraocular pressure. Ann. J. Ophthalmol., 95, 332-342, 1983).
이 실험은 수술후 생리적인 식염수로 린스함으로써 물질을 제거하는 장점을 이끌었다. 버슨 등이(Berson F.G. et al.:Obstruction of aqueous outflow by sodium hyaluronate in enucleate human eyes. Am. J. Ophthalmol., 95, 668-672, 1983) 사후에 떼어낸 인가의 눈에서 이 불리한 사건의 메카니즘을 연구하였고, 인가된 물질의 극한 점도로 발생한 전실에서 생리학적인 배농(排膿) 기관이 기계적인 차단을 일으키는 기초가 되는 것으로 제안하였다.
1,586,000의 분자량을 갖는(동일 특허의 컬럼 13참조) 발자즈에 의한 미국 특허 제4,141,973호에 기재된 히알우론산 나트륨 분류물은 물리-화학적 및 생물학적인 특성을 나타낸 관점에서 시판용 최상 안과 제품으로 나타난 생성물이다. 이것은 힐론(Healon)의 명칭으로 공지되었고 상기 불리한 것으로부터 면역되지 않았다. 즉 이것의 분자량은 본질적으로 너무 크게 되고, 따라서 이것은 눈에 균일한 수술을 위해 부적합한 점도를 갖는다.
실제로, 특허에 사용된 시험이 좋은 데이타를 얻을지라도, 힐론(Healon)은 수술 후 예를 들면, 백내장 수술 후, 안구내부압 증가와 같은 수술 후 합병증이 일어날 수 있으므로 바로 퇴원할 수가 없다.
데일 피, 드 보레에 의한 미국 특허 제4,920,104호(메사츄세스 액톤의 Med Chem Product Inc.에 양도된)에 생리 식염수에서 히알우론산 나트륨의 점탄성 용액은 45,000 내지 64,000cSt의 동적점도와 1,000,000 내지 2,000,000달톤의 평균 분자량 범위의 히알우론산 나트륨을 함유하는 것으로 기재되어 있다. 이 생성물은 눈에 대한 외관적인 수술용으로 너무나 잘 알려졌다. 이것은 수술 후, 특히 수술 후 안압이 상승되는 것을 최소화로 일으키는 부가 효과로, 다른 조제품보다 더욱 유리하게 사용될 수 있다.
그러나, 생성물은 특허의 컬럼 4에서 표 2와 표 3에서 나타날 수 있는 것처럼, 수술 후 틀림없이 제거되야만 하고, 생성물은 수술 후 바로 퇴원하게 되면 안압을 상승시키는 것으로 표 1에 나타난다.
안과에 사용하기 위한 히알우론산 나트륨의 또다른 분류물은 유럽특허 제0138572호에 500,000 내지 730,000의 다양한 평균 분자량을 갖는 것으로 기재되어 있다. 이것은 안구내 유체를 위한 치환체로 통상 사용될 수 있고, 또한 안과 수술시, 특히 백내장 및 안구 이식에 사용된다. 그러나, 이것은 수술 후 제거시킬 필요없이 안구 내부 구조에 효율적인 보호 효과를 가지기 위한, 초자체 감응 평형 유지를 위한, 수술시 전실내의 조절 공간을 유지할 수 있는 매우 큰 점탄성의 생성물을 필요로 한다.
우리가 참고한, 문헌에 기재된, 눈에서 상기 수술에 사용된 고분자량의 생성물은 수술 후 항상 제거시켜야만 한다. 본 발명의 장점은 추출용액에 철이온을 위한 킬레이팅제 첨가로 얻은 비교적 고분자량의 히알우론산 나트륨의 분류물의 성취를 위해 만들었던 본래 실제 과정에 있고, 유기체에서 생성물을 배출하는 것이 불가능하게 된 불순물 및 분류물을 이들로부터 제거하여 저분자량 분류물에 대한 해중합을 방해한다. 따라서, 본 발명의 신규한 분류물 HA-1은 흥미롭게 신규하고 기술상 매우 진보된 단계로 나타났다.
실시예 1과 2에 기재된 과정으로 얻을 수 있는 본 발명의 분류물 HA-1는 다음의 특성을 갖는다.
-점도:우벨호드(Ubbelhod) 현탁 수준점도계를 사용하여 pH 7.0의 25℃의 0.15 M NaCl에서 측정할 때, 14.5 내지 21dl/g 범위의 점도수가 제한된다. 이것은 750,000D 내지 1.230,000D(바람직하게는 925,000 내지 1.230,000D)의 평균 분자량 범위에 해당한다.
-단백질 함량:단백질 함량은 로리(Lowry) 측정(Lowry J. et al.:Protein Measurement with the folin phenol reagent. J. Biol., Chem. 193, 265∼275, 1951)에 의해서 측정할 때, 알부민으로 나타낸 0.2%를 초과하지 않는다.
-U.V.:257nm와 280nm에서 U.V.흡수는 1% w/v수용액에서 측정할 때 1.0 A.U.를 초과하지 않는다.
-동적점도:pH=7.0에서 0.15 M NaCl중 1% w/v용액의 동적점도는 20℃의 온도에서 U.S. pharmacopea XXII ed.(911) 페이지 1619에 기재된 것과 같이 회전 점도계를 사용하여 한정된 전단 속도에서 다음 한계를 초과하지 않았다.
-황산염 무코다당류:적합한 기준 물질을 사용하여, 유도성으로 결합된 플라스마 장치(I.C.P.)에서 측정할 때, 황이 0.07%를 초과하지 않았다.
-철:철 이온 함량은 원자흡수 도는 I.C.P. 기술로 측정하였을 때, 10ppm을 초과하지 않았다.
-안전도:자연적으로 숙성시키고, 가열-살균시킨 분류물의 생리학적 안전도를 제한점도 수로 평가하여 측정하고, 대응하는 평균 분자량의 평균 분자량의 감소로 표현했을 때에 다음과 같은 한계치를 초과하지 않았다.
-초기치의 97%(25℃에서 6개월 동안 저장 후)
-초기치의 75%(118℃에서 32개월 동안 멸균저장 후)
-초기치의 80%(121℃에서 16개월 동안 멸균저장 후)
-초기치의 90%(124℃에서 8개월 동안 멸균저장 후)
본 발명의 히알우론산 분류물 HA-1의 양질은 다음의 실험으로 나타낼 수 있다:원숭이에서 HA-1 분류물의 안구내부 내성
[목적]
이 시험은 눈의 초자체 안으로 HA-1을 다음과 같이 주입한 원숭이에서 안과학의 내성을 평가하기 위해 실행하였다.
[물질 및 방법]
1. 시험 종(種)
이 연구에는 적령기의 암컷 시노몰거스(원숭이 속) 원숭이 6마리를 사용하였다. 이들 원숭이는 건강하고 눈에 손상이 없는 것들이다.
영장류는 안과 수술을 위해 사용하는 점탄성의 안과 내성을 연구하기에 최선의 종으로 고려되기 때문에 이 연구에서 선택하였다.
안과 내성 연구에 미리 사용되었던 도우로쿨리스 원숭이 때문에 선택된 시노몰거스 원숭이는 이제 위험하게 되면 합법적인 보호를 하게 된다.
2. 실험적인 군과 비교적인 처리:군 명칭 및 투여량 수준 다음 계획에 따라 원숭이들을 처리하였다.:
3. 화합물 제조 및 투여
수술날에 원숭이를 펜토바르비탈 나트륨으로 보충한 염산 케탄민으로 마취시켰다. 이어서, 동공을 1.0% 트로픽아미드(리드리아실, 알콘라보라토리) 국소법으로 희석히켰다.
각막, 결막, 안구부속기와 전실부를 스릿-램프 생현미경과 간접 검안경으로 후실부를 측정하였다. 안검(眼瞼) 주위 피부를 두번 세척하고 0.5% 포비돈요드와 살균 식염수로 관류시켜 수술을 준비하였다. 살균 드레이프와 안검경을 작은 치구겸자로 안구를 안정하게 고정시켰다. 날카롭고 무딘절단은 가장자리를 기부로 결막 피부판, 대략 10mm 내지 수퍼리어 림버스(limbus)에 평행하게, 약 10 내지 15mm 길이로 전개하기 위해 사용하였다. 절단부는 결막과 상공막(上鞏膜)에 대한 테농낭을 통해 실행되었다. 피부판을 평면 부위와 공막 사이에 노출된 림버스에 대한 전방향으로 절단시켜서 제조하였다. 림버스에서 약 5 내지 6mm, 7-0비실(에티콘)의 내공막 매트리스 봉합선을 약 3mm 부분 교합에 위치시켰다. 25-게이지 바늘을 초자체액의 0.5ml 흡입에 사용하였다(두 동물에서만 단지 0.4ml 흡수로 가능하였다); 초자체 HA-1의 등부피(12mg/ml) 또는 살균 식염수로 복구시켰다. 매트리스 봉합선은 누출을 방지하기 위해 안정하게 하였고, 결막피부판을 복구하였다. 초자체의 세포수는 투여 이전과 투여 후 약 48시간에서 혈구계산반을 사용하여 흡인된 초자체에서 실행하였다.
4. 관측치와 기록
수술 약 48시간 후, 동물을 마취시키고 검안 시험을 실시하였다. 마취법, 확장법과 시험은 앞에서 기재된 것처럼 실행하였다. 시험은 문제의 눈이 HA-1로 주입되었는지 조절 물질로 주입되었는지에 대해 맹실험으로 처리하였다. 눈의 변수를 이하에 나타난 눈의 점수 규모에 따라 표준화된 인자로 나타낸 것처럼 등급화 하였다.
결막부종, 충혈 및 유출; 각막부종, 헴(heme), 세포 및 발적확장:
0=보통
+1=온화
+2=적당
+3=양호 및 넓은
초자체 명도:
0=맑음
1=약간흐름-기저보임
2=보통흐름-기저가 약간보임
3=흐름-붉은 기저 반사
4=흐름-회색 기저 반사
5=기저가 보이지 않음
눈을 상기한 것처럼 포비돈 요드용액을 사용하여 흡인을 위해 실시하였다. 안검경을 작은 치구 바늘 집게로 안구를 일정하게 고정하였다. 초자체(0.1 내지 0.2ml)를 결막과 공막을 통해, 상두의 1/4에서 림버스로부터 6mm에 직접 흡인시켰다. 치료는 본래 수술 위치를 피하여 실시하였다. 염증성 세포를 혈구계산반을 사용하여 헤아렸다. 국소 항생연고를 다시 적용시켰다.
[결과]
데이타(표 1)에 나타난 HA-1은 조절제(식염수)와 비교할 때 내성이 매우 양호하고 눈의 자극이 작게 발생되었다.
식염수군에서 두 동물은 수성세포침윤 및 발적확장이 가벼운 것으로 나타났다.
조절 초자체의 백색 세포는 mm3당 10 내지 60세포 범위로 측정되었다. HA-1 주입된 눈은 수성세포침윤 및 발적확장이 가벼운 것으로 나타났다.
초자체의 백색 세포는 시험눈에서 mm3당 0 내지 30세포수 범위로 측정되었다.
RE=우안(식염수 0.5ml로 주입)
LE=좌안(HYALOFTIL 0.5ml로 주입)
WBC=백혈구 세포
RBC=적혈구 세포
* 각 원숭이의 단일치
따라서, 식염수 조절제와 비교하여 HA-1은 다음 초자체내의 재배치 눈의 조직에 의해 매우 내성이 양호한 것으로 결론지을 수 있다.
임상적인 연구는 후실 안구내이 수정체 이식을 위해 낭외의 백내장 추출을 위한 수술에서 HA-1대 Healon의 효능을 위한 것이다.
[목적]
다음에 기재된 실험은 백내장 추출에서 시판된 점탄성 물질(Healon)에 유도되어 비교하여 HA-1의 효능과 안정성을 평가하였고, 두 임상 연구에서 안구 내부의 수정체 이식을 평가하였다. 첫번째 임상 연구에서, HA-1 및 힐론을 동일한 실험조건에서 측정하였다(둘다 수술 후 흡인). 두번째 연구는 특히 수술 후 안구내부압과 내피세포수의 증가에 관해 HA-1의 안전도에 초점을 두었다:이 두번째 연구에서(즉 첫번째 연구와 다르게, 점탄성 물질 모두를 수술 후 흡인하였다), HA-1은 수술의 결과에서 힐론과 다르게 눈으로부터 흡인하여 제거시키지 않았다.
[물질 및 방법]
두 연구를 위한 계획은 평행군, 은폐성-관측자(연구자의 추적을 막기 위해), 후실 안구내부의 수정체 이식에 의한 낭외의 백내장 추출에서 HA-1대 힐론의 평가를 무작위로 하였다. 각 연구에서 노인성 백내장의 우선 진단에 의한 환자와 18세 이상의 환자를 선택하였다.
특히:-첫번째 연구에서, 217명의 환자를 채용하여 무작위로 약 3:1의 비율(HA-1 161명, 힐론 56명)로 실시하였다. 두가지 점탄성 물질을 수술 수에 흡인하였다. 본 연구 기간은 수술 전 평가, 수술과정 및 수술 후 즉시 추적된 기간으로 이루어졌다. 이 연구에서 안구내부압을 수술 3시간 후에 측정하였고, 수술 후 1, 7 및 30일에 추적 시험하여 측정하였다.
-두번째 임상 연구에서 91명의 환자를 약 1:1의 비율, HA-1(45명) 또는 힐론(46명)으로 무작위 채용하였다. 이 연구에서, HA-1은 수술 후, 첫번째 연구에서 처럼 힐론을 흡인한 것과 다르게 흡인시키지 않았다. 이 연구기간(HA-1용 비교연구 물질)은 첫번째 연구에서 앞서 기재된 것처럼 실시하였다. 이 연구에서, 수술 후 안구내부압을 수술 후 1, 3, 6 및 9시간에서 측정하였고(첫번째 연구보다 빈번하게), 수술 후 1, 7, 30과 90일에서 추적 시험 측정하였다. 연구는 또한 수술 후 기준선과 수술 후 90일에서 검경 현미경 측정을 포함하였다.
2. 데이타 분석 및 통계학적인 방법:통계학적인 분석은 중간치와 처리군 비교치(알파=0.10)와 안전도 및 효능도(알파=0.05)를 평가하기 위해 실행하였다.
피셔(Fisher's)의 정확한 시험, t-시험, 서술적인 통계학을 데이타 평가로 사용하였다.
3. 연구 개체수와 특성:총 308명 환자를 연구하였다.
최대 인구통계학적, 의학적인 연구나 백내장 특성에 의한 연구에서 두 처리군과 실질적으로 다른 점은 없었다.
4. 수술:제조 및 방법:수술은 후실 안구내의 수정체 이식에 의한 합병증이 없는 노인/성인 낭외의 백내장 추출을 위한 연구자들의 표준 수술 기술에 의해서 실행하였다. 수술 전 약물처리(예방제), 마취와 수술시 다른 약물 처리는 연구자들의 표준 기술에 의해 사용하였지만, 눈의 항고혈압제 사용없이 하였다. 절개전 안구내부압을 호난 안구내부압감소제, 수퍼핑키 또는 매뉴얼의 압력을 사용하여 가능한 한 낮추었다. 점탄성 물질(HA-1 및 힐론)을 다음과 같이 사용하였다.
생성물은 위치를 떠난 두번째 임상 시험에 사용된 HA-1의 이론에 의해 수술 후 제거시켰다.
HA-1과 힐론 둘은 특히 수술 과정을 돕기 위해서와 눈의 조직을 보호하기 위해서 전실내로 삽입시켰다.
첫번째 연구:
-사용된 HA-1의 평균량(12mg/ml의 농도에서 0.568ml)은 0.129ml와 다를지라도, 사용된 힐론의 총량(10mg/ml의 농도에서 0.439ml)보다도 매우 많았다.
두번째 연구:
-사용된 점탄성의 평균량에서 별차이가 없었다.:이 경우 평균량은 0.975(HA-1)과 0.833(힐론)이었다.
5. 평가:
다음의 시험은 수술 전, 수술시, 후에 시행하였다.
a) 예를 들면, 다음과 같은 평가와 같은 수술 전 평가
-시력(최상현상), 안압측정법, 후도계(厚度計)법 (각막두께) 및 슬릿램프와 검안경 시험부속품.
-검안 현미경(두번째 연구):내피 세포수는 중앙각막위치에서 취한 10에서 검안 현미경을 사용해 측정하였다. 각 측정수는 m2당 세포수 수율로 적당한 인자와 m2당 표본 세포수로 얻은 평균에 의해서 조절되었다.
b) 다음과 같은 수술 후 평가:
-안구내부암을(안압측정법으로) 다음 조건에서 측정한다.:
-수술 후 3시간(첫번째 연구).
-수술 후 1, 3, 6, 9시간(두번째 연구).
-검안경과 슬릿램프시험, 후도계, 안압측정법, 검안현미경(내피세포수 측정을 위한 두번째 측정 마지막)과 시력 측정(추적 시험에서) 다음과 같이 실행하였다.
-첫번째 연구에서 1, 7, 30일.
-두번째 연구에서 1, 7, 30, 90일.
[결과]
1. 수술평가-사용한 점탄성물질의 조작특성:
점탄성은 임상연구 모두에서 각 처리군의 비교 비율에서 수정체 이식을 촉진하는 것으로 평가된다.
2. 수술 후 합병증:
2a) 첫번째 임상연구
표 2에서 나타난 것처럼 할 수 있다:
-합병증은 높은 퍼센트(전체 환자의 7.9%)로 수술 후 1일까지 발생하였고, 7일 내지 30일에서는 작은 %로 나타났다.
-합병증으로 고생하는 힐론 처리된 환자(14.3%)의 수술 후 1일의 비율은 HA-1로 처리된 환자보다 2.5배가 많았다. 이 차이는 통계학적으로 매우 큰 것이다(피셔 2-테일드 정밀 시험에 의해서 p=0.079). 7일과 30일의 차이는 통계학적으로 중요하지 않았다(피셔의 2-테일드 정밀 시험에 의해서 p0.6). 합병증은 30mmHg 또는 그 이상으로 상승한 안구내부압(HA-1로 처리된 환자의 7/158=4.4%, 힐론으로 처리된 환자의 5/56=8.9%)과 각막부종, 홍채염, 결막염, 헤페마(hyphema), 반점부종, 상처누출, 모양체막과 결막염하 출혈 등을 포함한다. 수술 전과 수술 후(3시간 및 1,7,30일에서) 얻어진 안구내부압 측정 데이타를 기록한 표 3에 나타난 것처럼 할 수 있다.
-처리된 군에서 일어나 평균 안구내부압의 차이는 중요하지 않았다.:그러나, 힐론-처리된 환자들은 3시간과 1일 모두에서 평균 안구내부압이 증가되었고, HA-1로 처리된 환자들보다 1일에서 안구내부압의 표준 편차가 매우 큰 것으로 나타났다. 슬릿램프, 후도계(각막 두께 측정을 위한)와 검안경의 시험은 두군 사이에 차이가 없는 것으로 나타났다.
2b) 두번째 임상염구
-수술 후 합병증 환자(표 4)는 HA-1로 처리된 환자(28.6%)보다 힐론-처리된 환자(37.0%)의 약간 많아진 비율을 나타냈다. 합병증은 안구내부압 상승(HA-1로 처리된 환자 5/42=11.9%, 힐론-처리된 환자 11/46=23.9%)과 헤페마, 상처누출, 초자체의 출혈, 후실낭의 혼탁화, 융모막의 박리, 홍채 위축과 반점 부종을 포함한다.
-두 처리군은 평균 안구내부압 또는 기준선이나 1일 내지 90일의 어떤 시간(표 5)에서 안구내부압의 변화성에 대해 통계적으로 별차이가 없었다. 수술 후 처음 9시간 동안, 힐론(눈에서 제거된)과 HA-1(잔류된)는 표준편차가 우선적으로 다른 수술 후 안구내부압 분포를 일으키는 것으로 나타났다. 힐론-처리된 환자는 표준편차가 크고 수술 후 1시간에서 평균치가 매우 커졌고 HA-1로 처리된 환자들은 더욱 커졌지만, 수술 후 6시간과 9시간에서는 표준편차가 크지 않았다. 수술 1시간 후에서, 힐론-처리된 환자의 22.7%와 HA-1로 처리된 환자의 10%는 21mmHg 또는 그 이상의 안구내부압을 가졌다. 수술 후 6시간과 9시간에서 HA-1로 처리된 환자(6시간에서 73.2%와 9시간에서 65.0%)와 힐론-처리된 환자(6시간에서 68.2%와 9시간에서 71.4%)의 비교비율은 21mmHg 또는 그 이상의 안구내부압을 가졌다.
-첫번째 연구에서 기록된 관찰에 관한 두군은 다른 차이점이 없는 것으로 나타났다. 마찬가지로, 검안 현미경 측정(내피 세포수 측정)은 차이점이 별로 없는 것으로 나타났다(표 6).
3. 정량분석 결과
시력 평가는 다음과 같은 비교적인 두점탄성 물질의 효능을 나타났다:
-첫번째 임상연구:힐론-처리된 환자(77.8%)와 HA-1처리된 환자(84.7%)의 30일에서 20/40시력 성취는 별차이점이 없었다.
-두번째 연구:힐론-처리된 환자(73.9%)와 HA-1 처리된 환자(71.4%)의 30일에서 20/40 또는 좀더 나은 시력의 성취는 별차이가 없었다. 90일에서 비율은 거의 동일하게 되었다.
* 힐론-처리된 환자의 합병증 비율은 HA-1로 처리된 환자의 합병증 비율보다 매우 큰 것으로 나타났다(피셔어 2-테일드 정밀 시험에 의해서 p=0.079).
* 두 처리군의 1일 표준편차는 차이가 매우 크다(F-시험으로 p=0.0508)
* 두 처리군은 평군 안구내부압이 크게 차이가 있다.(상이 변화를 위해 조절된 t-시험에 의해 p=0.0442)
** 처리된 군의 표준편차는 큰 차이가 있다.(F-시험, p=0.0070)
*** 처리군의 표준편차는 별로 크지 않았다.(F-시험, p=0.0886)
**** 처리군의 표준편차는 별로 크지 않았다.(F-시험, p=0.0898)
[결론]
여기에 기재한 두가지의 임상실험의 결과는, 백내장추출과 안구내수정체 이식에 HA-1를 사용하는 것이 평가할 만한 효능을 보이고 있다. 특히, HA-1가 적당한 내성을 갖고 있음을 보여주고 있다. 사실, 이 생성물은 수술 후 물질이 제거(제1임상실험에 대해 기재한 바와 같이)됨으로써 동일한 실험 조건하에서 시험한 힐론((HEALON))에 비해 수술 후 합병증을 보다 적게(약 2.5배 이하) 일으킨다. 수술 후이 합병증에서, 안구내부압이 증가하는 것을 특히 고려해야 한다.
상기의 두 실험에서, HA-1로 치료한 환자의 수술 후 경과와 힐론으로 치료한 환자의 경과는 눈내부압과 관련해서는 서로 다름을 알 수 있다. 제1실험에서, HA-1과 힐론 모두를 수술 후에 제거할 때, 힐론으로 치료한 환자 대부분이 하루에 21mmHg 이상의 안구내부압 증가를 보였다. 제2실험에서, 수술 후에 HA-1을 제거하지 않은 경우, 힐론과는 달리 HA-1의 수술 후 안구내부압 프로필에 필적하였다.
상기 두 점탄성 생성물들의 일부 양상에서는 비교될 수 있지만, 수술 후의 합병증에 관해서는 서로 상이하다. 즉, 눈에서 제거된 힐론은 눈으로부터 제거된 HA-1 보다 안구내부압에서 상당한 증가를 보이게 되며, 그 위치에 남아있는 HA-1은 수술 후에 제거된 힐론의 안구내부압과 비교될 만한 수술 후 안구내 프로필을 이룬다.
이러한 결과를 기초로하여, 수술 후 합병증을 일으킴이 없이 제위치에 HA-1이 잔존할 수 있음을 강조하는 것이 중요하다. 이 가능성은 다음과 같은 평가할 만한 이점을 제공하게 된다.
1. 수술 후에 생성물의 추출 단계를 생략할 수 있으므로 수술 과정이 간단하게 된다.
2. 취급성(즉, 흡출시)의 이유로 합병증의 위험성을 줄일 수 있다. 이러한 위험성의 예로는, 수술 과정과 이와 관련된 결과로 인한 외상이 있다.
또한, 본발명은 활성 성분으로서 새로운 몰 분류물의 히알우론산을 그의 염형태인 HA-1, 특히 중성 pH의 염류용액 형태로 함유하는 약제학적 제제에 관한 것이다. HA-1에서의 농도선택은 원하는 점도, 예를들면, 약 300mPaxs(350s-1에서)과 약 10,000mPaxs(1s-에서)가 얻어지면 된다.
또한, 본 발명은 신규한 히알우론산 나트륨 분류물인 HA-1을 안구 수술 특히, 백내장 수술과 수정체 이식에 사용하는 용도에 관한 것이다.
다음의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것이다.
[실시예 1]
[HA-1 분류물을 얻기 위한 과정과 그와 관련한 특성]
신선하거나 냉동(3000g)된 암탉 뼈를 고기 다짐기로 잘게 저미고, 기계식 균질기로 주의 깊게 균질화시킨다. 그 결과로 얻어진 페이스트를 특정한 철킬레이트제 0.1%w/v를 함유하는 10부피의 무수 아세톤이나 에탄올이 있는 유리 용기에 넣는다.
여기서, 킬레이트제의 일례로는 1,10-페난트롤린(C.A.R.N 66-71-7)이나 그의 디메틸-유도체가 유용하다. 유리 용기와 특정한 철 킬레이트제는 철 용기나 혈액잔류물로부터 나온 철 이온에 의해 일어나게 되는 히알우론산나 트륨염의 탈중합반응을 방지하는데 사용된다.
암탉 뼈를 철 이온이 완전히 추출될 때까지 처리한다(기계적인 조절:1,10-페난트롤린인 경우, 1-cm 세포당 최대흡수파장(510nm)에서 아세톤이나 에탄올속에 있는 철-킬레이트제 복합물의 흡수도가 0.005A.U. 이하). 동일 부피의 무수 아세톤(에탄올)을 사용하여 추가적인 세척 공정을 실시하여 일부 잔류하는 킬레이트제를 제거시킨다. 이러한 처리는 다음 시험 A의 결과가 네거티브가 될 때까지 계속한다.
-시험 A:아세톤(또는 에탄올) 5ml를 적당한 질소 흐름을 이용하여 증발시킨다. 그 잔류물을 5ml의 물에 용해시키고, 흡수도를 킬레이트제 최대 흡수 파장에서 측정하였다.
이 시험은 흡수도가 0.1A.U. 이하일 때, 네거티브로 간주된다.
최종 반응생성물을 6시간 동안 50rpm이 속도로 교반하고, 12시간 동안 방치하여 분리시킨다. 그후에 용매를 흡수해서 버린다.
버려진 용매가 적정 습도 수준에 도달될 때까지 이 추출 공정을 반복한다(칼-피셔법).
이로부터 얻어진 물질을 원심 분리하고, 적당한 온도에서 5 내지 8시간 동안 진공건조시킨다. 이 공정의 수율은 건조 분말 약 500 내지 600g이다.
건조 분말 300g을 적당한 단백질 분해제(파파인, 펩신, 트립신 또는 프로나아제) 0.2g으로 상기 건조 분말에 대해 20:0.01 내지 20:1의 비율로 다량의 시스테인 염산염을 사용하는 인산염 완충제의 완충수성매체를 통해서 효소적 소화 처리를 실시한다. 이 혼합물을 60 내지 65℃의 일정한 온도에서 24시간 동안 60rpm으로 교반시킨다. 전체 덩어리는 셀라이트(Celite )를 첨가하여 25℃로 냉각시키고, 계속해서 몇시간 동안 교반을 유지한다.
이로부터 얻어진 혼합물을 맑은 액체가 얻어질 때까지 여과시킨다.
희석수 2mg/ml로 희석시킨 수성 용액을 테트라부틸암모늄 히드록시드로 처리하여서 형성된 테트라부틸암모늄(TBA+)에서 얻어진 고분자 이온 교환수지 도웩스 엠-15(DOWEX M-15)가 충진되어 있는 컬럼으로 인가시킨다.
컬럼에서 용출된 용액을 증발시키고, 건조된 잔류물을 적당한 부피의 N-메틸피롤리돈(또는, 디메틸설폭사이드)에 용해시켜서 농도 2mg/ml를 달성한다.
얻어진 용액을 여과하고, 4℃로 냉각시키고, 동일한 부피의 물을 첨가한다. 여기서, 염화메틸렌을 사용하여 3번의 연속된 세척 공정을 수행하고, 하층상을 여러번 버린다. 그리고, 상층상은 4℃에서 염화나트륨(NaBr은 히알우론산과 3:1의 비율로 사용된다)으로 처리한다. 수성 용액을 3부피의 에탄올을 첨가시켜서 침전시키고, 이 침전물을 여러번 에탄올로 세척한다.
이 침전물을 물에 용해시키고, 이로 부터 얻어진 용액을 투석시킨다. 이 용액에 염화나트륨을 첨가시켜서 0.1M로 만들고, 온도를 50℃에 이르게 한다. 이 생성물을 60g/분으로 교반시키면서 염화세틸피리디늄 45g을 첨가한다. 이 혼합물을 60분 동안 교반한 후에 셀라이트 50g을 첨가한다.교반하면서 생성물의 온도를 25℃로 감소시키고, 형성된 침전물을 원심 분리로 모은다. 이로 부터 얻어진 침전물을 염화세틸피리디늄 0.05%를 함유하는 염화나트륨 0.01M 용액에서 현탁시킨다. 그리고, 추가로 60분 동안 50℃에서 교반한다. 이 온도를 25℃로 낮추고, 침전물을 원심 분리시킨다.
세번에 걸쳐 세척 공정을 반복하고, 침전물을 최종적으로 염화세틸피리디늄 0.05%를 함유하는 염화나트륨 0.05M의 3리터 용기에 모은다. 이것을 60분 동안 60g/분에서 교반시키고, 2시간 동안 25℃의 온도로 유지시킨다. 상청액을 원심 분리로 제거시킨다.
이 공정을 염화세틸피리디늄 0.05%를 함유하는 염화나트륨 0.1M의 용액으로 여러번 반복한다. 이 혼합물을 원심 분리하고, 상청액을 버린다. 침전물을 염화세틸피리디늄 0.05%를 함유하는 염화나트륨 0.30M(3:1)에 분산시킨다.
이 혼합물을 교반시키고, 침전물과 투명한 액체를 모은다. 이 침전물에 대한 추출을 3번에 걸쳐 반복하되 각각 0.5ℓ의 동일한 수성 용액을 사용한다.
나머지 침전물은 제거하고, 하나의 용기에다 투명 액체를 모은다. 이 액체의 온도를 교반시키면서 50℃로 승온시킨다. 이 액체를 염화나트륨을 이용하여 0.02M로 한다. 그리고, 세틸피리디늄 1g을 첨가하고, 12시간 동안 계속 교반을 한다. 이 혼합물을 25℃로 냉각시키고, 먼저, 셀라이트 팩을 통해서 여과시키고, 이어서 여과기(1μ)를 통해서 여과시킨다.
얻어진 용액을 0.33M의 염화나트륨 용액의 첨가로 원래 부피의 3배를 한외 여과하는 분자제외한계가 30,000인 막을 통해서 분자 한외 여과시킨다. 염화나트륨의 첨가는 현탁되게 하고, 액체의 부피를 원래 부피의 1/4로 감소시키게 된다.
이렇게 농축된 용액을 25℃의 온도에서 교반(60g/분)시키면서 3부피의 에탄올(95%)로 침전시킨다. 침전물을 원심 분리로 모으고, 상층액은 버린다. 침전물을 0.1M의 염화나트륨 용액 1ℓ에 용해시키고, 3부피의 95% 에탄올로 침전 과정을 반복적으로 실시한다.
침전물을 모으고, 먼저 75%의 에탄올로 3번, 절대 에탄올로 3번, 무수 아세톤으로 3번 세척을 한다.
이로 부터 얻어진 생성물(HA-1 분류물)은 750,000D와 1,230,000D사이(바람직하게는 925,000과 1,230,000사이) 범위의 평균 분자량을 갖는다.
히알우론산 수율은 원래의 신선한 조직의 0.6%와 같다.
앞서 언급한 방법에 따란 얻어진 최종 생성물은 다음과 같은 특성을 갖는다.
-분자량이 1,000,000D이다.
-한계 점도수가 14.5와 21dl/g 사이의 범위를 갖는다. 이것은 pH 7.0, 0.51M의 NaCl, 25℃의 온도에서 우벨호드(Ubbelhode) 현탁 레벨 점도계로 측정한 값이다. 이 값은 750,000D와 1,230,000D 사이(바람직하기로는 925,000과 1,230,000사이) 범위의 평균 분자량에 상응하는 값이다.
-단백질 함량은 알부민과 같이 0.2%를 초과하지 않는다. 이것은 로우리 시험(Lowry J. et al.:Protein Measurement with the folin phenol reagent. J.Biol., Chem. 193, 265-275, 1951)에 의해 측정한 것이다.
-U.V. 흡수도는 257nm와 280nm에서 1.0A.U.를 초과하지 않는다. 이것은 1%w/v 수성 용액에서 측정한 것이다.
-pH=7.0, 0.15M NaCl에서 1% 용액w/v의 동적점도는 회전 점도계를 사용하여 측정한 결과 정의된 전단 속도에서 다음의 한계를 초과하지 않는다. 상기의 점도계는 20℃에서 미합중국 파마코피아(Pharmacopea) XXII ed.(911) page 1619에 기재되어 있다.
-황산화된 무코폴리사카라이드 함량은 황과 같이 0.07%를 초과하지 않는다. 이것은 적당한 참고물질을 사용하여 I.C.P 기계(inductively coupled plasma instrument)로 측정한다.
-철함량은 10p.p.m을 초과하지 않는다. 이것은 원자흡수 또는 I.C.P 기술로 의해 측정한다.
HA-1 분류물과 통상의 방법으로 얻어진 다른 히알우론산 나트륨염 용액간에 철함량에 대해서 비교실험을 실시한다.
이로 부터 얻어진 결과(표 7)에서 철 함량이 뚜렷이 차이가 있다. 즉, HA-1 분류물은 철 함량에서 다른 생성물에 비해 상당히 낮다.
-시료 A는 소디침(SODICHIM:lot 154)에 해당한다.
-시료 B는 바이오케모(BIOCHEMO:lot 542)에 해당한다.
-시료 C는 바이오테크놀로지 제너랄(BIOTECHNOLOGY GENERAL:lot B-25)에 해당한다.
-철의 함량은 팔라티늄 도가니에서 소성시키고 잔류물을 HNO30.1M에 용해시킨 약 0.5g의 물질에서 결정하였다.
-분류물 HA-1의 생리적 pH, 자연적인 시효 및 열살균된 등장 완충 용액의 안정성은 한계 점성수의 평가에 의해 측정하며, 평균 분자량에서 그에 상응하는 감소로 표현된다. 그리고, 다음의 한계를 초과하지 않는다.
-초기값의 97%(25℃에서 6개월간 저장).
-초기값의 75%(118℃에서 32분간 살균).
-초기값의 80%(121℃에서 16분간 살균).
-초기값의 90%(124℃에서 8분간 살균).
HA-1의 생리적 pH를 갖는 등장완충용액과 상업적으로 얻어진 유사한 히알우론산 용액간의 비교 실험을 실시하여 다음 조건에서의 안정성을 결정한다.
-자연적인 시효(실온에서 6개월간 저장)
-여러 조건에서의 열살균
상기에 기재한 목적에 부합되게 이미 입증된 약제학적 용도를 위한 재료나 장치가 사용되었다.
이들은 특히:
-다음 특성을 갖는 무색 유리바이알:
-유리:타입-1 보로실리케이트 유리(ph. Eur. II ed.에 따름)
-최소 몸체두께:-.90mm
-최대 몸체두께:1.00mm
-다음 특성을 갖는 할로부틸 고무로 만든 스토퍼(stoppers):
-엘라스토머 타입:클로로부틸
-비활성 충전물:카올린
-안료:이산화티탄과 카본 블랙
-가황제:산화아연
-릴리이스 특성:ph. Eur. Ⅱ ed. Ⅵ.2.3.1에 의함
-알루미늄 플립-오프 폐쇄함.
-주입수(ph. Eur. Ⅱ ed.에 따름)
사용된 시약은 분석용 품위이었다.
살균에는 모델 FoF5 슈퍼스펙트라인 페디가리 오토클레이브(Fedegari autoclave)가 사용되었다.
한계 점도수는 pH7.0, 0.15M NaCl, 25℃에서 현탁레벨, 우벨호드형 점도계로 결정하였다.
이에 상응하는 평균 분자량은 마크-호우윈크식으로 계산하였다(H. Mark:Z. Elektrochemie 40, 499, 1934; R. Houwink:J. Prakt, Chem. 157, 15, 1940).
평균 분자량 값은 해중합 경향을 더 좋게 평가하기 위해 출발물질의 백분율로 표현하였다. 이로 부터 얻어진 결과(표 8과 9)에서, HA-1보다 철함량이 상당히 많은 참조 시료(표 7에서 볼 수 있음)보다 HA-1이 훨씬 안정성이 있음을 보여주고 있다.
여기서:
-샘플 A, B 및 C는 철함량 분석에 사용된 것과 동일하다.
-pH0.5 0.002M 인산 완충 용액에서 NaCl의 0.9%w/v 용액에 각 생성물의 약 10mg/ml의 용액은 다음을 사용하였다.:
a) 6개월간 실온의 암실에서 저장한 노화제를 3개월씩 측정하였다.(표 8참조)
b) 다음의 조건으로 소독조에서 살균하였다.
-T=32분간 118℃(Ⅰ로 표기)
-T=16분간 121℃(Ⅱ로 표기)
-T=8분간 124℃(Ⅲ로 표기)
각 조건의 시작과 끝에서 측정.
[실시예 2]
[HA-1 분류물로 얻기 위한 과정 및 그의 비교특성]
신선하거나 냉동한 암탉 볏(3000g)을 고기 절단기에서 잘게 썰고 이어서 기계식 파쇄기에서 파쇄시켰다. 얻은 페이스트를 일정한 철 킬레이트제의 0.1w/v를 함유하는 95% 에탄올의 4배 부피의 유리 용기에 처리시켰다.
1,10-펜난트롤린 (C.A.R.N. 66-71-1) 또는 그의 디메틸 유도체를 킬레이트제로 사용하였다.
유리 용기와 일정한 철 킬레이트제를 히알우론산 나트륨염의 해중합과정을 피하고 위해 사용하였고, 그렇지 않으면 강철 용기 또는 혈액 잔류물에서 철이온에 의해 해중합이 일어날 수 있다.
암탉 볏는 철이온을 완전히 추출할 때까지 처리시켰다(0.05A.U. 이하, 1-cm 세포에서 아세톤 또는 에탄을 상에서 이온-킬레이트제 착물의 흡수).
추가의 세척 공정은 어떤 잔류 킬레이트제를 제거하기 위하여 무수아세톤(또는 에탄올)의 동일 부피를 사용하여 실행하였다.
이온도는 다음의 시험 A가 네가티브의 결과로 될 때까지 실행시켰다.
-시험 A:아세톤(또는 에탄올)상의 5ml는 질소 흐름 조절의 수단으로 증발시켰다. 잔류물은 5ml 물에 용해시키고 흡광도는 킬레이트제 최대 흡수 파장에서 측정하였다.
시험은 흡광도가 0.1A.U. 이하일 때 네가티브로 고려된다.
최종 반응 생성물 50rpm의 속도에서 6시간 동안 교반시키고 12시간 동안 분리하기 위해 방치하고, 그후 용매는 싸이폰하여 제거하였다.
이 주출과정은 제거시키는 용매가 정확하게 습기 수준에 도달하였을 때까지 반복하였다(칼-피셔 방법).
얻은 물질을 이어서 원심 분리시키고 적어도 8시간 동안 적당한 온도에서 진공건조시켰다. 이 과정의 수율은 건조 분말 약 500g 내지 600g이었다. 이어서, 건조분말 300g을 건조분말에 대해 20:0.01 내지 20:1의 비율로 제공되는 시스테인 염산염의 양을 사용하는 인산 완충 용액에 의해 완충된 수성 매체를 통해 적합한 단백질 분해제(파파인, 펩신, 트립신 또는 프로나아제)의 0.2g을 효소 소화로 제공하였다. 이어서 이 혼합은 60℃ 내지 65℃의 일정한 온도에서 60rpm으로 24시간 동안 진탕시켰다. 반응의 끝에서, 셀라이트 (Celite ) 60g을 첨가하였고 전체를 1시간 더 진탕시켰다. 얻은 혼합물을 맑은 액체를 얻을 때까지 여과하였다.
염화 세틸피리디늄 45g을 60rpm 진탕하에서 첨가시켰다. 혼합물을 60분간 진탕시킨 후, 셀라이트 50g을 첨가시켰다.
이렇게 형성된 침전물은 원심 분리기로 수집하고, 0.05% 세틸피리디늄이 함유된 0.01M NaCl(5리터) 용액에 현탁시켰다.
이것을 50℃에서 60분간 진탕시키고 이어서, 25℃의 온도로 낮추고 침전물을 원심 분리하였다. 세척과정은 3번 반복하였다.
침전물은 0.5% 염화세틸피리디늄이 함유된 0.05M NaCl 용액을 3리터를 담은 용기에서 수집하였다.
이것을 60분간 60rpm으로 교반시키고, 이어서 2시간 동안 25℃의 일정한 온도에서 유지하였다. 맑은 상층액은 원심 분리로 제거하였다.
과정은 0.05% 염화세틸피리디늄을 함유한 0.1M NaCl 용액으로 두번 반복하였다. 혼합물은 원심 분리하여 상층액은 버렸다. 침전물을 0.05% 염화세틸피리디늄을 함유한 0.3M NaCl용액(3리터)에 분산시켰다.
혼합물을 교반시키고 침전물과 맑은 액체를 수집하였다. 침전물을 동일한 수용액 1.5리터를 사용하여 두번 추출하였다.
맑은 액체를 단일 용기로 수집하고, 30,000달톤의 분자를 배출시켜 버리는 막을 통해 분자 한외 여과로 노출시켜 초기 부피의 1/3로 농축하였다.
농축된 용액은 테트라부틸암모늄(TAB+)의 형태로 얻어지는 DowexR M-15 이온 교환 거대분자 수지로 처리하여, 하룻밤 동안 진탕시켰다.
적당한 부피 또는 N-메틸피롤리돈을 NMP-HO 70/30 V/V의 비율에 도달할 때까지 현탁액에 첨가시켰다. 이어서, 이 혼합물을 여과시키고 수지를 제거하였다.
이어서, NaCl의 적당량을 용액에 첨가시키고, 1M NaOH로 pH7.5로 만들고, 이어서 이것을 염화메틸렌으로 두번 세척하고, 각 세척시 하층액을 버렸다. 상층액은 에탄올(95%)의 3배 부피로 25℃ 온도에서 60rpm으로 진탕시키는 동안 침전시켰다.
침전물을 원심 분리로 수집하였고, 상층액은 버렸다.
침전물을 수집하여 75% 에탄올로 1차 세척하고, 이어서 무수 에탄올로 세척하고 마지막으로 아세톤으로 세척하였다.
이어서, 세척된 생성물은 25℃ 온도에서 적어도 20시간 동안 진공건조시켰다. 건조된 생성물은 역삼투에 의해 물에서 안정화됨으로써 1mg/ml의 용액을 얻었다.
NaCl의 적당량을 0.1 내지 0.4의 몰농도를 얻기 위해 첨가하고 이어서, 이것은 1M NaOH로 알카리성으로 만들었다. 이어서, 용액을 살균 필터를 통해 여과시켰다.
용액은 에탄올(95%) 3배 부피로 25℃의 온도에서 60rpm으로 교반시키는 동안 침전되었다.
침전은 원심 분리로 수집하고 상층액은 버렸다.
침전은 수집하고 75% 에탄올로 1차 세척하고 이어서, 무수 에탄올로 세척하고 마지막으로 아세톤으로 세척하였다.
세척된 생성물은 25℃ 온도에서 적어도 50시간 동안 진공 건조하였다.
이렇게 얻은 생성물은 1,180,000의 분자량을 갖는다.
[약제학적인 제조의 실시예]
다음의 실시예들은 단지 HA-1 분류물의 치료학적인 응용을 위해 가능한 약제학적인 제조를 나타내기 위한 목적으로 여기에 기재하였다:
형식 1: 2-ml 앰플
각 앰플 함량:
히알우론산나트륨(HA-1) 24.0mg
인산이수소나트륨 2HO 0.2mg
인산일수소나트륨 12HO 1.2mg
염화나트륨 17.0mg
주사용 물의 부피 2.0mg
형식 2:살균, 예비-충전, 1.1ml 주사제
각 주사 함량:
히알우론산나트륨(HA-1) 20.0mg
염화나트륨 9.350mg
인산이수소나트륨 2HO 0.055mg
인산일수소나트륨 12HO 0.660mg
주사용 물의 부피 1.1mg
형식 3:0.2ml, 단일-투여 용기
각 용기 함량:
히알우론산나트륨(HA-1) 400.0mg
염화나트륨 440.0mg
인산일수소나트륨 12HO 5.0mg
인산이수소나트륨 2HO 60.0mg
주사용 물의 부피 100.0mg
형식 4: 0.2ml, 단일-투여 용기
각 용기 함량:
히알우론산나트륨(HA-1) 200.0mg
염화나트륨 670.0mg
염화칼슘 250.0mg
인산이수소나트륨 2HO 5.0mg
인산일수소나트륨 12HO 60.0mg
주사용 물의 부피 100.0mg
형식 5: 5ml 작은병
각 작은병 함량:
히알우론산나트륨(HA-1) 200.0mg
염화나트륨 670.0mg
염화칼슘 250.0mg
인산이수소나트륨 2HO 5.0mg
인산일수소나트륨 12HO 60.0mg
에틸-메르큐리치오살리실레이트 5.0mg
주사용 물의 부피 100.0ml
상기한 본 발명은 여러 가지 방법으로 변형시킬 수 있는 것이 명백하다. 이러한 변형은 본 발명의 개념과 범위에서 이탈시키지 않는 모든 이러한 변형은 다음 청구항의 범위내에서 포함시킬 수 있는 것을 이 기술의 숙련자들에게는 명백하게 될 것이다.
Claims (27)
- 평균 분자량 750,000∼1,230,000D과 다음과 같은 특성들을 갖는 히알우론산 화합물 또는 그의 염: (a) 우벨로드 현탁 수준 점도계를 사용하여, pH=7.0의 0.15M NaCl 중에서 25℃에서 측정했을 때 제한점도수:14.5∼21dl/g, (b) 단백질 함유량:알부민 0.2% 이하, (c) 1%w/v 수용액에 대하여 측정했을 때, 257nm 및 280nm에서 U.V. 흡수층:1.0A.U. 이하, (d) 20℃에서 회전점도계를 사용하여, 한정된 전단율에서 측정했을 때, pH=0.7의 0.15M NaCl중 1%w/v 용액의 동적점도가 다음과 같은 한계값을 초과하지 않음.(e) 황산처리한 무코다당류 함유량:황 0.07% 이하, (f) 철분 함유량:10p.p.m. 이하, (g) 자연적으로 숙성시키고, 가열·멸균시킨 화합물의 생리학적 pH를 갖는 등장완충액의 안정도을 제한점도수를 평가하여 측정하고, 대응하는 평균분자량의 감소로 표현했을 때에 다음과 같은 한계값을 초과하지 않음.-초기값의 97%(25℃에서 6개월 동안 저장 후)-초기값의 75%(118℃에서 32개월 동안 멸균시킨 후)-초기값의 80%(121℃에서 16개월 동안 멸균시킨 후)-초기값의 90%(124℃에서 8개월 동안 멸균시킨 후)
- 제1항에 있어서, 상기 평균 분자량이 925,000∼1,230,000인 히알우론산 화합물.
- (a) 히알우론산 또는 그의 염을 대응하는 사급 암모늄염으로 전환시키고, (b) 상기 대응하는 사급 암모늄염을 이러한 암모늄염을 용해시킬 수 있는 유기용매 중에 용해시키고, (c) 이 용액을 여과한 후, 할로겐화 나트륨으로 처리시켜서 나트륨 형태로 히알우론산을 회수하는 것을 특징으로 하는 히알우론산 또는 그의 염의 정제방법.
- 제3항에 있어서, 히알우론산의 상기 염의 수용액을 사급 암모늄여기로 염화시킨 산 이온 교환체에 흡수시켜서 상기 사급 암모늄염을 형성시키는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 이온 교환체가 사급 암모늄형의 DOWEX 15 이온 교환체인 방법.
- 제3항 내지 제5항중 어느 하나의 항에 있어서, 히알우론산의 사급 암모늄염을 용해시키기 위하여 사용한 상기 유기용매가 비양자성 유기용매인 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 비양자성 용매가 저급 디알킬설폭사이드 또는 디알킬카복실아미드인 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 비양자성 용매가 디메틸설폭사이드 또는 N-메틸-피롤리돈인 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 히알우론산의 염이 나트륨염인 방법.
- 제9항에 있어서, 히알우론산의 암모늄염의 대응하는 나트륨염으로의 전환을 상기 유기용매 중에서 히알우론산의 암모늄염 용액에 브롬화 나트륨을 첨가하여 행하는 방법.
- (a) 철-킬레이트제 존재하에 제1유기용매를 사용하여 동물 기관으로부터 히알우론산을 추출하여 철 이온이 실질적으로 없는 히알우론산 함유 추출물을 얻고, (b) 상기 히알우론산 함유 추출물을 단백질 분해제로 처리하고, (c) 이와 같이 처리한 히알우론산 함유 추출물을 사급 암모늄염형의 산 이온 교환체와 접속시키고, (d) 상기 이온 교환체에서 얻은 추출물을 히알우론산의 사급 암모늄염을 용해시킬 수 있는 제2유기용매 중에 용해시키고, (e) 단계(d)의 혼합물을 할로겐화 나트륨으로 처리하여 히알우론산의 사급 암모늄염을 대응하는 나트륨염으로 전환시키고, (f) 히알우론산의 목적하는 나트륨염을 단리시킴을 특징으로 하는 히알우론산 화합물의 제조방법.
- 제11항에 있어서, 상기 히알우론산의 나트륨염의 수용액을 분자 여과시켜서 히알우론산의 나트륨염의 목적하는 분자량의 화합물을 얻는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 히알우론산 함유 추출물을 분자 여과시켜서 히알우론산의 목적하는 분자량의 화합물을 얻는 방법.
- 제12 또는 제13항에 있어서, 상기 산 이온 교환체가 사급 암모늄염형의 설폰산 수지인 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 사급 암모늄염이 최대로 6개의 탄소원자를 갖는 알킬기를 갖는 테트라알킬암모늄염인 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 테트라알킬암모늄염이 테트라부틸암모늄염인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 제1유기용매가 에탄올 또는 아세톤이고, 상기 철-킬레이트제가 1,10-페난트롤린인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 나트륨염을 살균제로 처리하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 살균제가 염화 세틸피리디늄인 방법.
- 제12 또는 제13항에 있어서, 상기 히알우론산의 나트륨염을 분자 축출 한계치 30,000D를 갖는 막으로 분자 여과시키는 방법.
- (a) 암탉 볏에서 채취한 유기물질을, 아세톤 또는 에탄올과 부차적으로 페난트롤린 또는 그이 디메틸 유도체를 함유하는 추출 용매로 추출하여 철 이온이 실질적으로 없는 추출물을 얻고, (b) 상기 추출물을 피파인, 펩신, 트립신, 푸로나제 및 시스테인 염산염으로 되는 군중에서 선택된 단백질 분해제로 처리하고, (c) 이와 같이 처리한 추출물을 테트라부틸암모늄염형의 설폰산 수지로 충전한 컬럼과 접촉시키고, (d) 이 컬럼을 용출시켜서 히알우론산의 테트라부틸암모늄염을 함유하는 용액을 얻고, (e) 이 용액을 건조시켜서 히알우론산의 테트라부틸암모늄염으로 되는 잔류물을 얻고, (f) 상기 잔류물을 비양자성 용매에 용해시키고, (g) 단계(f)의 용액을 여과시키고, (h) 단계(g)의 용액을 염화 메틸렌으로 세척하고, (i) 단계(h)의 용액을 할로겐화 나트륨으로 처리하여 히알우론산 나트륨을 제조하고, (j) 상기 히알우론산 나트륨을 침전시키고, (k) 상기 침전물을 물 중에 용해시킨 후, 이 용액을 투석하고, (l) 투석된 용액을 처리하여 히알우론산 나트륨을 침전시키고, (m) 상기 침전물을 분류 축출 한계치 30,000D를 갖는 막으로 분자 여과시켜서 분자량 750,000∼1,230,000을 갖는 히알우론산의 나트륨염을 함유하는 용액을 제조하는 것을 특징으로 하는 히알우론산 나트륨 화합물의 제조방법.
- 제21항의 방법에 의해서 제조된 히알우론산 나트륨 화합물.
- 유효성분으로서 제1항에 의한 히알우론산 화합물과 약제학적 담체을 함유하는 안과 수술시 손상의 위험에 노출된 조직을 보호하기 위한 제약학적 조성물.
- 제1항의 히알우론산 화합물로 되는 안과 수술용 약제.
- 제1항의 히알우론산 화합물로 되는 안과학 분야용 약제.
- 제1항의 히알우론산 화합물로 되는 백내장 수술용 약제.
- 제1항의 히알우론산 화합물로 되는 수정체 이식용 약제.
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