FI104973B - Menetelmä hyaluronihapon puhdistamiseksi - Google Patents

Description

1 104973

Menetelmä hyaluronihapon puhdistamiseksi Tämä keksintö koskee uutta menetelmää hyaluronihapon ja sen suolojen erittäin puhtaiden fraktioiden valmistamiseksi.

5 Etenkin keksintö käsittää menetelmän sellaisen hyaluronihapon erityisen fraktion ja sen suolojen, etenkin sen natriumsuolan valmistamiseksi, jonka keskimääräinen molekyylipaino on tarkoin määrätyllä alueella.

10 Hyaluronihappo (HA) on glykosaminoglykaaneina (mukopolysakka-rideina) tunnettujen biologisten makromolekyylien luokan tyypillinen ja tärkeä edustaja. HA on biologinen polymeeri, joka on läsnä identtisellä molekyylirakenteella kaikissa selkärankaisten elimistön sidekudoksissa, joissa sillä on rakenteel-15 linen ja biologinen merkitys siinä mielessä, että sen paikalliset tasot ovat täysin korreloituja jänteys-, tropismi- ja kudoskorjauksen kanssa vaurion esiintyessä. Katsaus näiden biologisten aineiden fysiologisesta merkityksestä on esitetty julkaisussa Phys. Rev. (Comper W. D., Laurent T. C.: 20 Physiological function of connective tissue polysaccharides. Phys. Rev. 58, (1), 255 - 315, 1978). HA:n kemiallis-fy sikaalinen luonne on sakkaridibiopolymeerin (D-glukuronihapon ja N-asetyyliglykosamiinin) luonne, joka on polymeroitu vuorottelussa, jolloin muodostuu pitkiä haarautumattomia mole-. 25 kyyliketjuja, joiden molekyylipaino vaihtelee 8.000.000 dal- tonin maksimiin (Meyer K.: Chemical Structure of Hyaluronic Acid. Fed. Proceed. 17, 1075, 1958; Laurent T. C.: Chemistry and Molecular Biology of Intracellular Matrix, 703 - 732, Academic Press N.Y., 1970). Tämän biopolymeerin käyttäytymi-30 nen vesiliuoksessa takaa erityisen viskositeetin, jota nimi-·” tetään viskoelastisuudeksi ja joka on tyypillinen joillekin biologisille nesteille, kuten synoviaaliselle (nivelvoide-) nesteelle ja lasiaisnesteelle, jossa HA:ta on läsnä 0,12 -0,24 %:n konsentraatiossa (Balazs E. A. et ai.: Hyaluronic 35 acid and replacement of vitreous and aqueous humor. Mod. v Probl. Ophthal., 10, 3 - 21, 1972). Samoin ihmisestä peräisin olevan kammioveden todettiin sisältävän HA:ta 2 104973 1,14 Mg/:n konsentraatiossa (Laurent U. B. G.: Hyaluronate in human aqueous humor. Arch. Ophthalmol., 101, 129 - 130, 1983) .

5 On saatu runsaasti todistusaineistoa, joka osoittaa, että eksogeenisen HA:n paikallisella jakelulla on selviä terapeuttisia ja suojaavia etuja hyvin useissa patologisissa side- ja epiteelikudosten tiloissa, kuten - vahingoittuneen kudoksen regeneraatiossa parantumattomis- 10 sa ihohaavoissa, - nivelsidekudoksen artroottisessa degeneraatiossa, - silmäkirurgiassa.

Erityisen arvostettu on HA:n viskoelastisen luonteen aikaan-15 saama mahdollisuus peittää kudoksia, jotka ovat vaarassa vahingoittua kirurgisen toimenpiteen aikana. Kaikkien HA:ta käyttäneiden kirurgien mukaaan eksogeenisen HA:n viskoosin kerroksen läsnäolo kudoksien päällä, jotka ovat altteimpia vaurioittaville satunnaisille kosketuksille, kuten komea 20 (sarveiskalvo), saa aikaan tehokkaan suojaavan vaikutuksen, joka heijastuu erittäin positiivisesti operaation onnistuneessa tuloksessa.

Eksogeenisen HA:n kohdistama suojaava ja myönteinen vaikutus . 25 kudoskorjaukseen komealla on osoitettu sekä kokeellisissa eläimissä (Hiller D. et ai.: Use of Na-hyaluronate during intraocular lens implantation in rabbits. Ophthalmic Surgery, 8, (6), 58 - 61, 1977; Miller D. et al.: Use of Na-hyalu ronate in autocorneal transplantation in rabbits. Ophthalmic 30 Surgery, 11, (1), 19 - 21, 1980; Graue E. L. et al.: The : protective effect of Na-hyaluronate to corneal endothelium.

Exp. Eye Res., 31, 119 - 127, 1980; Ozaki L. et al.: Protective effect of Healon-coated intraocular lens on the corneal endothelium. Folia Ophthalmologica Japonica, 32, 1301 - 1305, 35 1981) ja ihmisessä (Norm M.: Preoperative protection of cor nea and conjunctiva. Acta Ophthalmologica, 59, 587 - 594, 1981; Polack F. M. et al.: Sodium hyaluronate (Healon) in 3 104973 keratoplasty and IOL implantation. Ophthalmology, 88, 425 -431, 1981).

Tunnetaan useita menetelmiä puhdistetun hyaluronihapon ja 5 erityisten fraktioiden valmistamiseksi, jotka ovat erittäin puhtaita ja joita käytetään terapiassa, esimerkiksi edellä mainituissa indikaatioissa.

Integraalisten hyaluronihappojen molekyylifraktioiden, jotka 10 saadaan suoraan uuttamalla orgaanisia materiaaleja, esimer kiksi kanan helttoja, molekyylipainot voivat vaihdella laajoissa rajoissa, esimerkiksi n. 90 - 80 %:sta - 0,2 %:iin integraalisen hapon molekyylipainosta, edullisesti 5 % - 0,2 %. Fraktiot voidaan saada integraalisista hapoista hydro-15 lysoimalla tai hapettamalla tai entsymaattisilla kemiallisil la aineilla tai fysikaalisilla toimenpiteillä, esimerkiksi mekaanisesti tai säteilyttämällä ja usein muodostuu siten primordiaalisia (varhais-) uutteita näissä samoissa puhdistusmenetelmissä (ks. esimerkiksi Balazs et ai. julkaisussa 20 "Cosmetics & Toiletries". Italian edition No. 5/84, s. 8 - 17). Saatujen molekyylifraktioiden erotus ja puhdistus tapahtuu tunnetuilla tekniikoilla.

Esimerkiksi US-patenttijulkaisussa 4.141.973 esitetään mene-25 telmä hyaluronihappojen valmistamiseksi, joiden molekyylipai- no on vähintään 750.000 daltonia ja joita voidaan käyttää niiden erityisen ja korkeasteisen puhtauden suhteen ja in-flammotoristen vaikutusten puuttumisen suhteen silmäleikkauk-sissa. Menetelmässä HA-natriumsuola uutetaan lähtöaineesta, 30 eliminoidaan käytettyjen eläinten elinten verijäännökset, deproteinisoidaan näin saatu uute, eliminoidaan inflammatoriset epäpuhtaudet, käsitellään tuote vesiliuoksessa steriloin-tiaineella ja saostetaan hyaluronihapposuola vesiliuoksesta orgaanisella liuottimena. Verijäännökset eliminoidaan etano-35 lilla, natriumsuolansa muodossa oleva HA (joka on muodossa, jossa se havaitaan lähtöaineissa) uutetaan vedellä, depro-teinisointi suoritetaan käsittelemällä laimeilla hapoilla ja 4 104973 uuttamalla samanaikaisesti hydrolysoidut osat kloroformilla, tai proteolyyttisten entsyymien avulla, vahingolliset inflammatoriset aineet eliminoidaan uuttamalla etanolilla pH-arvos-sa 6 - 7 ja sterilointi suoritetaan käsittelemällä setyylipy-5 ridiniumkloridillä. Tämän menetelmän avulla ainoa saatava hyaluronihappofraktio on patentissa erityisesti esitetty fraktio, jonka molekyylipaino on 1.586.000 daltonia. Kemiallisten, fysikaalisten ja biologisten ominaisuuksien mukaisesti tämä hyaluronihapon fraktio näyttää vastaavan kaupallista 10 tuotetta, joka tunnetaan tavaramerkillä "HEALON".

On kehitetty uusia tekniikkoja, kuten molekyyliultrasuodatus. Tämän puhdistusmenetelmän avulla on mahdollista hylätä ne HA-fraktiot, joiden molekyylipaino on lähellä molekyylikokojen 15 korkeampia tai alempia rajoja. Esimerkiksi EPO-patentissa 01238572, joka on myönnetty 25.7.1990, esitetään menetelmä natriumhyaluronaattifraktioiden valmistamiseksi, joiden mole-kyylipainot ovat 250.000 ja 350.000 daltonia, alistamalla tuote, joka saadaan suoraan uuttamalla orgaaninen materiaali 20 ja sitten deproteinisoimalla entsymaattisesti papaiinilla, j kahteen molekyyliultrasuodatukseen kalvojen läpi, joiden molekyylisulkuraja on 30.000, s.o. kalvoilla, jotka sieppaa-vat ainoastaan ne fraktiot, joiden molekyylipainot ovat yli 30.000. Tämä fraktiointi näyttää olevan tärkeä tuotteen saa-25 miseksi, joka on vapaa inflammatorisen luonteen omaavista sekundaarisista vaikutuksista, koska tällaisiin vaikutuksiin reagoivat fraktiot ovat niitä, joilla on alhainen molekyyli-paino, esimerkiksi n. 30.000 daltonia. Toisen molekyylisuodatuksen jälkeen käyttämällä kalvoja, joiden sulkuraja on 30 200.000 (s.o. kalvot, jotka sieppaavat ne fraktiot, joiden : molekyylipainot ovat yli 200.000 daltonia), saatu suodatettu tuote on fraktio (kutsutaan patentissa nimellä HYALASTINE), jonka keskimääräinen molekyylipaino on 50.000 - 100.000 daltonia, kun taas kalvolle jäävä osa on natriumhyaluronaatti-35 fraktio, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 500.000 - 730.000 (fraktio, jota kutsutaan nimellä HYALECTIN).

-:ϊϊ

Tl 5 104973 Tämä keksintö saa aikaan erään toisen menetelmän hyaluroniha-pon fraktion valmistamiseksi, joka on erittäin puhdas ja jolla on tarkoin määritelty molekyylipainoraja. Tällä fraktiolla on mielenkiintoinen sovellutus oftalmisessa kirurgiassa: itse 5 asiassa tuote on erittäin hyvin siedetty, se ei ole inflammatorinen eikä se aiheuta postoperatiivisia komplikaatioita. Edelleen tuote tarjoaa sen huomattavan edun, että se voidaan jättää in situ kirurgian jälkeen aiheuttamatta postoperatiivisia komplikaatioita, kuten etenkin liian korkeaa 10 silmänpainetta, jolloin se vähentää niitä riskejä, joita esiintyy poistettaessa sitä, kuten on ollut tähän asti käytäntönä. Tätä puhtaan hyaluronihapon uutta fraktiota, joka on sen natriumsuolan muodossa, kutsutaan seuraavassa selityksessä nimellä "HA-l".

15 Täsmällisemmin sanottuna mainitulle hyaluronihapon fraktiolle on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 johdanto-osassa.

20 Tämän keksinnön mukaisesti on mahdollista puuttua edullisesti integraalisten hyaluronihappojen tai niiden suolojen, etenkin alkalisuolojen, kuten ensisijaisesti natriumsuolan puhdistus-menetelmiin muuntamalla tällaiset hapot tai suolat määrätyn tyyppisiksi kvaternaarisiksi ammoniumsuoloiksi. Tällainen ” 25 suolanmuodostus voidaan suorittaa missä tahansa puhdistusme netelmän vaiheessa. Koska nämä kvaternaariset ammoniumsuolat ovat helposti liukenevia määrättyihin orgaanisiin liuottimiin, kuten aproottisiin liuottimiin, kuten etenkin N-metyy-lipyrrolidoniin, ne voidaan uuttaa tällaisilla liuottimilla 30 vesifaasista, jolloin saadaan aikaan erityinen ja ylimääräi- • · nen puhdistus aikaisemmin alalla esitettyjen tekniikkojen . suhteen, toiminta, joka ilmeisesti vastaa saatujen tuotteiden puhtausasteesta menetelmän lopussa. Hyaluronikomponentin muunto kvaternaarisiksi ammoniumsuoloiksi voidaan saada ai-35 kaan esimerkiksi käsittelemällä natriumsuolan vesiliuos, joka sisältää muita suoloja, kuten etenkin NaCl:ää, käyttämällä reaktoria tai pylvästä, joka sisältää makromolekyylistä sul- 6 104973 foni-ioninvaihdinta kvaternaarisilla ammoniumemäksillä suolaksi muodostetussa muodossa, esimerkiksi DOWEX M-15-hartsia, joka on valmistettu tetrabutyyliammoniumsuolan muodossa, joka saadaan käsittelemällä sulfonihartsi kvaternaarisilla ammoni-5 umhydroksideilla, esimerkiksi tetrabutyyliammoniumhydroksi-dilla. Ammoniumsuola kulkee eluaattiin ja eluoidaan täysin ioninvaihtimen kautta vedellä. Tämä vesiuute haihdutetaan kuiviin ja jäännös, joka on muodostettu polysakkaridin ammoniumsuola, liuotetaan johonkin edellä mainittuun liuotti-10 meen ja sitten liukenemattomat kiinteät osat suodatetaan pois.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä hyaluronihappo tai sen jokin molekyylifraktio tai jokin niiden suola puhdistetaan 15 muuntamalla ne vastaavaksi kvaternaariseksi ammoniumsuolaksi alemmilla alifaattisillä (C^g) hydrokarbyylisubstituuteilla.

Menetelmän mukaan kerätään hyaluronihapon kvaternaarinen ammoniumsuola tai jokin sen molekyylifraktio orgaaniseen liu-20 ottimeen, joka pystyy liuottamaan tällaiset suolat ja otetaan suodatetusta liuoksesta talteen hyaluronihappo tai sen molekyylifraktio metallisuolan muodossa ja haluttaessa alistetaan näin saadut suolat edelleenpuhdistukseen esimerkiksi tavalla, joka on sinänsä jo tunnettu.

25 Täsmällisemmin sanottuna keksinnölle on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

; Keksintö koskee siten hyaluronihappojen kvaternaaristen ammo- j 30 niumsuolojen käyttöä sekä menetelmissä polysakkaridin uutta- ·' - miseksi eläinten elimistä ja kokonaisuutteista, joissa kek sinnön mukainen uuttaminen voidaan suorittaa menetelmän jossakin sopivassa vaiheessa, mukaanlukien toimenpiteet, joissa suoritetaan molekyylitraktioiden fragmentointi ja erotus, et- 35 tä jossakin tällaisten fraktioiden edelleenkäsittelyssä ja jo eristettyjen fraktioiden edelleenkäsittelyssä, olkoon ne puhtaita tai epäpuhtaita, uusia tai tunnettuja.

i 7 104973

Kuten edellä mainittiin, hyaluronipolysakkaridin muunto voidaan suorittaa puhdistusmenetelmän jossakin sopivassa vaiheessa ja alan ammattihenkilö pystyy valitsemaan sen, milloin tämä tapahtuu kussakin erityisessä tapauksessa, valittujen 5 erilaisten tunnettujen vaiheiden erityisen yhdistelmän sanelemien kriteereiden mukaisesti. Nämä tavanomaiset ja tunnetut vaiheet käsittävät olennaisesti ja yleensä seuraavaa: 1) Polysakkaridin (yleensä ja ensisijaisesti sen natriumsuo-10 lan muodossa) uuttaminen eläinten elimistä, jotka on edellä hienonnettu ja homogenoitu. Tämä suoritetaan tavallisesti orgaanisella liuottimella, joka voidaan sekoittaa veden kanssa, kuten alifaattisella alkoholilla tai alemmalla (C^) alifaat-tisella ketonilla, kuten etanolilla tai asetonilla.

15 2) Proteiiniaineiden eliminointi uuttamalla sopivilla liuottimilla tai hajottamalla vaiheessa 1) saadun uutteen vesiliuos protelyyttisellä entsyymillä, kuten papaiinilla, pepsii-nillä, trypsiinillä tai pronaasilla puskurin, esimerkiksi 20 kysteiinihydrokloridi-fosfaatin läsnäollessa.

3) Vaiheen 1) tai 2) mukaisesti saadun uutteen dialyysi.

4) Jossakin edellä olevassa vaiheessa saadun liuoksen steri- 1 f 25 lointi tunnetulla bakterisidilla, esimerkiksi setyylipyri-diniumkloridilla natriumkloridiliuoksessa. Tämä toimenpide toistetaan tavallisesti useita kertoja.

5) Hyaluronipolysakkaridifraktioiden tai niiden vastaavien 30 suolojen erotus, joilla on erilaiset molekyylipainot, tai • · vastaavasti ei-toivottujen fraktioiden eliminointi, joilla on . esimerkiksi rajamolekyylipainot, s.o. liian kaukana ilmoite tusta molekyylikokoalueesta. Tämä toimenpide suoritetaan edullisesti molekyyliultrasuodatuksen avulla, esimerkiksi 35 tunnetulla tavalla.

β 104973 6) Puhdistetun fraktion tai vastaavan suolan (esimerkiksi natriumsuolan) eristäminen vesiliuoksesta saostamalla sopivalla orgaanisella liuottimena, esimerkiksi alkoholilla.

5 Näiden vaiheiden ja mahdollisesti myös muiden jo alalla käytettyjen tai alan asiantuntijoiden kehittämien vaiheiden järjestystä voidaan vaihdella laajalti. Tämän keksinnön erityistä vaihetta, s.o. kvaternaaristen ammonium-ionien muodostamista suolaksi, voidaan käyttää milloin vain ja edullisesti 10 siellä, missä voidaan odottaa suurinta teknistä vaikutusta.

Polysakkaridikomponentin ammoniumsuola voidaan poistaa suoraan ioninvaihtimen hartsista edellä mainituilla liuottimilla, jotka pystyvät liuottamaan tällaiset suolat, kuten edellä 15 määritellyillä liuottimilla, mutta edullisesti ammoniumsuola uutetaan ensin vedellä ja sitten se haihdutetaan kuiviin.

Näin eristetty ammoniumsuola kootaan edellä mainittuihin liuottimiin ja sitten liuos suodatetaan.

20 Eräs erityinen tapa tämän keksinnön mukaisen menetelmän aikaansaamiseksi muodostuu liittämisestä edellä mainitun toimenpiteen yhdistelmässä edellä mainitussa järjestyksessä vaiheiden 2) ja 3) väliin. Lukuun ottamatta tunnettuja puhdis-tustekniikkoja ja tämän keksinnön mukaista erityistä vai-25 hetta, s.o. hyaluronihapon metallisuolojen muuntamista kva-ternaarisiksi ammoniumsuoloiksi on mahdollista tämän keksinnön erään erityisen suoritusmuodon mukaisesti käyttää rautai-onien kelatoivia aineita, edullisesti edellä mainitussa uut-tamisvaiheessa 1). Itse asiassa on tunnettua, että rautaio-30 nit, joita on aina läsnä alkuperäisissä hyaluronihappouut-·; teissä ja jotka muodostuvat käytettyjen eläinten elinten ve ri jäännöksistä, ovat vastuussa polysakkaridiketjun depolyme-rointiprosesseista. Metalli-ionien eliminointi on osoittautunut erittäin käyttökelpoiseksi hyaluronihappofraktioiden ai-35 kaansaamiseksi, joilla on suhteellisen korkeat molekyylipai-not, ja tämä voidaan saada aikaan kelatoimalla. Käyttämällä tätä toimenpidettä ei ole mahdollista ainoastaan saada hyalu-ronihappoja tai niiden suoloja, joilla on mahdollisesti kor- 9 104973 kea molekyylipaino, vaan myös erityisen puhtaita tuotteita, jotka ovat stabiileja vesiliuoksissa edellä mainittujen rau-taionien totaalisen puuttumisen ansiosta.

5 Keksinnön ensisijaisena tehtävänä on siten saada aikaan menetelmä, joka on tunnettu siitä, että uutetaan eläinten elimiä, jotka sisältävät hyaluronihappoa ja/tai sen suolaa orgaanisella liuottimella, joka voidaan sekoittaa veden kanssa, rau-taionien suhteen kelatoivien aineiden läsnäollessa, toiste-10 taan toimenpide, kunnes ei esiinny enää rautaioneja, kootaan näiden pesuliuosten edellä kuivatettu jäännös vesipitoiseen liuottimeen proteolyyttisen aineen ja sopivan puskurin läsnäollessa ja ohjataan liuos, joka on edellä vapautettu mahdollisista kiinteistä jäännöksistä, ioninvaihtimeen, joka on 15 muodostettu makromolekyylisellä sulfonihartsilla sen kvater-naarisen ammoniumsuolan muodossa, jossa on alempia (C^) ali-faattisia ryhmiä. Ioninvaihtimesta uutettu eluaatti kuivatetaan sitten ja liuotetaan orgaaniseen liuottimeen, joka pystyy liuottamaan hyaluronihappojen kvaternaariset ammoniumsuo-20 lat ja niiden fraktiot. Ammoniumsuola muunnetaan sitten nat-riumsuolaksi lisäämällä natriumhalogenidin, kuten natriumklo-ridin tai natriumbromidin vesiliuosta orgaaniseen liuokseen. Näin saatu natriumsuolan vesiliuos uutetaan sitten orgaanisilla liuottimilla, jotka eivät voi sekoittua veden kanssa, 25 ja alistetaan valinnaisesti toistettuun dialyysiin. Saatu •J liuos käsitellään sitten sterilointiaineella ja haluttassa steriloinnin jälkeen saatu liuos voidaan alistaa ultramole-kyylisuodatukseen. Sitten ei-toivotut hyaluronipolysakkaridi-fraktiot hylätään ja natriumhyaluronaatin halutut fraktiot 30 eristetään sinänsä tunnetulla tavalla.

' :* Tämän keksinnön mukaisesti käytetyt liuottimet kvaternaaris- ten ammoniumsuolojen liuottamiseksi ovat aproottisia liuottimia, kuten N-alkyylipyrrolidonit, etenkin N-metyylipyrrolido-35 ni, dialkyylisulfoksidit, dialkyylikarboksyyliamidit, kuten etenkin alemmat (C1.6) dialkyylisulfoksidit, erityisesti dime-tyylisulfoksidi, ja alempien (C^) alifaattisten happojen alemmat (C^g) dialkyyliamidit, kuten dimetyyli- tai dietyyli-formamidi tai dimetyyli- tai diasetyyliasetamidi.

10 104973

Tetra-alkyyliammoniumemäkset, joita käytetään ioninvaihdin-hartsin ja siten keksinnön luonteenomaisten hyaluroni-ammoniumsuolojen valmistamiseksi, ovat emäksiä, joissa on alempia alifaattisia ryhmiä, edullisesti 1-6 hiiliatomia 5 sisältäviä alkyylejä. Etenkin käytetään suolaksi muodostettua hartsia, jossa on tetrabutyyliammoniumioni.

Edellä mainituissa yhdistelmissä, joita käytetään hyaluroni-happojen, niiden molekyylifraktioiden ja niiden suolojen 10 uuttamis-, puhdistus- ja eristystoimenpiteissä, ja etenkin yhdistelmässä, joka muodostaa tämän keksinnön edullisen menetelmän, on edullista käyttää seuraavia aineita: a) eläinten elimistä muodostuvan lähtöaineen uuttamiseksi: 15 etanoli tai asetoni, b) rautaionien kelatoivana aineena: 1,10-fenantroliini tai dimetyylijohdannainen, 20 c) proteolyyttisinä aineina: yllä jo mainitut, i d) kvaternaaristen ammoniumsuolojen liuottimina: N-metyyli- I pyrrolidoni tai dimetyylisulfoksidi, 25 e) liuottimena ammoniumsuolojen orgaanisesta liuoksesta saa- dun natriumsuolan vesiuutteen puhdistamiseksi: metyleeniklo-ridi, etyyliasetaatti, f) sterilointiaineena: setyylipyridiniumkloridi fosfaattipus- 30 kurin läsnäollessa, g) orgaanisena liuottimena natriumsuolan saostamiseksi puhdistetusta vesiliuoksesta, mahdollisesti ultrasuodatuksen jälkeen: etanoli.

Edellä mainituissa toimenpiteissä on mahdollista käyttää myös muunnelmia, jotka voivat olla edullisia yhä puhtaampien lop- 35 u 104973 putuotteiden saamiseksi. Esimerkiksi edellä mainitun tyyppisten sterilointiaineiden, s.o. heterosyklisiä ytimiä käsittävien ja pitkäketjuisia alkyylejä sisältävien kvaternaaris-ten ammoniumsuolojen (esimerkiksi setyyli), kuten mainitun 5 setyylipyridiniumkloridin käyttö voi toimia samanaikaisesti puhdistusvaiheena, koska näiden lisääminen natriumhyaluronaa-tin liuokseen tuottaa vastaavan ammoniumsuolan hyaluronihapon ionin kanssa. Nämä suolat saostuvat vesiliuokseen ja tämä käsittely mahdollistaa siten sakkojen tämän jälkeen toistet-10 tujen uudelleensaostusten ja pesujen avulla ja sitten liuot tamalla NaCl-liuokseen natriumhyaluronaatin liuoksen saamisen, josta voidaan erottaa ultrapuhdistetut tuotteet. Näitä tuotteita voidaan käyttää etenkin oftalmisessa kirurgiassa.

15 Molekyyliultrasuodatus suoritetaan sinänsä tunnetulla taval la. S.o. käytetään kalvoja, jotka sieppaavat esimerkiksi ne fraktiot, joissa on korkeampia molekyylipainoja, esimerkiksi yli 200.000, ja haluttaessa erotetut fraktiot voidaan ottaa talteen sekä suodatetusta tuotteesta että kalvosta. Erityisen 20 mielenkiintoinen tapa tämän keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi on yhdistää edellä mainitut kemialliset puhdistustoimenpiteet molekyyliultrasuodatuksen kanssa, joka eliminoi hyaluronifraktiot, joissa on alhainen molekyylipai-no. Tällaisten fraktioiden tiedetään olevan vastuussa inflam-25 matoristen vaikutusten käynnistymisestä terapeuttisiin tar koituksiin tarkoitetuissa tuotteissa, kuten on esitetty fraktioiden yhteydessä, joita on selitetty edellä mainitussa EPO-patentissa n:o 0138572, joka on myönnetty 25.7.1990.

30 Tämän keksinnön eräänä edullisena tehtävänä on siten edellä : mainittu menetelmä, joka koskee puhdistusmenetelmien yksi tyiskohtaista yhdistelmää, jossa valinnaisessa osassa suoritetaan molekyyliultrasuodatus alhaisen molekyylipainon omaa-vien molekyylifraktioiden, etenkin fraktioiden eliminoimisek-35 si, joiden molekyylipainot ovat alle 30.000. Tällä menetel mällä tai etenkin noudattamalla esimerkeissä 1 ja 2 esitettyjä yksityiskohtia saadaan natriumhyaluronaatin fraktio, joka 12 104973 on hyvin arvokas terapeuttisesti ja jonka nimi on, kuten aluksi sanottiin, HA-1. Se on erityisen mielenkiintoinen sen käytön suhteen silmäkirurgiassa.

5 Tuotteen käyttö silmäkirurgiassa

Kirjallisuudessa esitetyt ja silmän leikkauksiin suositellut hyaluronihapot eivät täytä täydellisen viimeistelyn kriteereitä, etenkään, koska niitä ei voida jättää paikalleen kilo rurgian jälkeen, esimerkiksi harmaakaihileikkauksen (katarak- ta) jälkeen sekä inflammatoristen aineiden tähteiden tai hyvin pienien määrien läsnäolon että komponenttien johdosta, joiden molekyylipainot ovat liian korkeita ja siten ne ovat liian viskooseja. Lisäksi ne voivat aiheuttaa, kuten edellä 15 mainittiin, ei-toivotun ja vaarallisen silmänpaineen kasvun.

Eksogeenisen HA:n, jota käytetään etukammiossa kirurgian aikana, ei tulisi aiheuttaa negatiivisia vaikutuksia kirurgian jälkeiseen intraokulaariseen paineeseen eikä sen tulisi 20 laukaista inflammatorisia seurauksia intraokulaarisessa ympä ristössä. Ensiksi mainittua haitallista vaikutusta on selitetty toistuvasti kirjallisuduessa erittäin korkean molekyy-lipainon omaavan HA:n käytön jälkeen, jolla on erittäin kohonnut viskositeettiaste (Binkhorst C. D.: Inflammation and 25 intraocular pressure after the use of Healon in intraocular lens surgery. Am. Intra-Ocular Implant. Soc., J., 6, (4), 340 - 341, 1980; Pape L. G.: Intracapsular and extracapsular technique of lens implantation with Healon. Am. Intra-Ocular Implant. Soc. J., 6, (4), 342 - 343, 1980; Passo M. S. et JO al.: Intraocular pressure following cataract surgery using

Healon. ARVO abstracts, 10, 10:45, 1981; Percival P.: Experiences with the Boberg Ans lens and sodium hyaluronate (Hea-lonid). Trans. Ophthal. Soc. UK, 102, (2), 294 - 297, 1982;

McRae S. M. et al.: The effects of sodium hyaluronate, chon-35 droitin sulphate, and methylcellulose on the corneal endothe lium and intraocular pressure. Ann. J. Ophthalmol., 95, 332 -341, 1983).

13 104973 Tämä kokemus on johtanut siihen, että suositellaan aineen poistamista huuhtelemalla fysiologisella suolaliuoksella leikkauksen jälkeen. Berson et ai. (Berson F. G. et ai.: Obstruction of aqueous outflow by sodium hyaluronate in enu-5 cleate human eyes. Am. J. Ophthalmol., 95, 668 - 672, 1983) ovat tutkineet tätä haitallista vaikutusta kuoleman jälkeen poistetussa ihmisen silmässä ja ovat ehdottaneet, että pohjimmaisena syynä on ollut fysiologisten poistokeinojen mekaaninen tukketuminen etukammiossa käytetyn aineen äärimmäi-10 sen viskositeetin johdosta.

Natriumhyaluronaattifraktio, joka on esitetty US-patentissa (Balazs) 4.141.973 ja jonka molekyylipaino on 1.586.000 (ks. saman patentin saraketta 13), on tuote, joka näyttää sen 15 esitettyjen fysikaalis-kemiallisten ja biologisten ominai suuksien kannalta olevan paras okulaarinen tuote markkinoilla. Se tunnetaan nimellä "Healon" eikä se ole immuuni edellä mainituille haitoille. S.o. sen molekyylipaino on olennaisesti liian korkea ja siten sillä on riittämätön viskositeetti 20 silmän määrätyille leikkauksille.

Itse asiassa, vaikkakin tuossa patentissa käytetty testi (antiflogistisen vaikutuksen mittaamiseksi) tuotti hyviä arvoja, Healonia ei voida jättää paikalleen kirurgian jäl-25 keen, esimerkiksi kataraktaleikkausten jälkeen, koska se saattaisi aiheuttaa postoperatiivisia komplikaatioita, kuten silmän paineen nousua.

US-patentissa 4.920.104 (Dale P. De Vore, siirretty yhtiölle 30 Med Chem Products, Inc. Acton, Mass.) esitetään natriumhyalu- ronaatin viskoelastinen liuos fysiologisessa suolaliuoksessa, jonka kinemaattinen viskositeetti on 45.000 - 64.000 cSt ja joka sisältää natriumhyaluronaattia, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 1.000.000 - 2.000.000 daltonia. Tätäkin 35 tuotetta on ehdotettu käytettäväksi silmän kirurgisissa ope raatioissa, joissa sitä voidaan käyttää edullisemmin kuin muita valmisteita sen pienempien postoperatiivisten sivuvai- 14 104973 kutusten ansiosta, etenkin, mitä tulee postoperatiivisen silmänpaineen nousuun.

Kuitenkin myös tämä tuote on eliminoitava kirurgian jälkeen, 5 kuten voidaan nähdä patentin sarakkeen 4 taulukoista 2 ja 3, kun taas taulukko 1 osoittaa, että silmän paine nousee kirurgian jälkeen, jos tuote jätetään paikalleen.

Eurooppalaisessa patentissa n:o 0 138 572 esitetään eräs toi-10 nen natriumhyaluronaatin fraktio, joka on tarkoitettu käytet täväksi oftalmologiassa ja jonka keskimääräinen molekyylipai-no on 500.000 - 730.000 daltonia (HYALECTIN). Sitä voidaan käyttää edullisesti endobulbaaristen nesteiden korvaamiseksi ja sitä käytetään myös silmän operaatioissa, kuten katarak-15 tässä ja okulaarisissa siirrännäisillä. On kuitenkin esiinty nyt tarve tuotteille, joilla on suurempi viskoelastisuus ja jotka pystyvät säilyttämään oikeat tilat etukammiossa kirurgian aikana, tasapainottamaan lasiasvasteen, suojaamaan tehokkaasti endo-okulaarisen rakenteen ilman, että ne on pois-20 tettava kirurgian jälkeen. Kuten olemme todenneet, kirjalli suudessa esitetyt, korkeita molekyylipainoja omaavat ja edellä mainituissa silmän operaatioissa käytettävät tuotteet on aina ollut poistettava kirurgian jälkeen. Tämän keksinnön ansiona on se seikka, että on kehitetty alkuperäinen menetel-25 mä natriumhyaluronaatin fraktioiden saamiseksi, joilla on suhteellisen korkea molekyylipaino ja jotka saadaan lisäämällä rautaionien kelatoivia aineita uuttoliuokseen, jolloin estetään alhaisen molekyylipainon omaavien fraktioiden depo-lymeroituminen, ja jotka ovat vapaita epäpuhtauksista tai 30 fraktioista, jotka ovat tehneet mahdottamaksi tuotteen jättä misen elimistöön. Tämän keksinnön mukainen uusi fraktio HA-l muodostaa siten mielenkiintoisen uutuuden ja suuren edistysaskeleen alalla.

35 Tämän keksinnön mukaisella fraktiolla "HA-l", joka saadaan esimerkeissä 1 ja 2 esitetyillä menetelmillä, on seuraavat ominaisuudet: 15 104973 - Viskositeetti: rajaviskositeettiluku, joka on 14,5 - 21 dl/g määritettynä 25°C:ssa 0,15M NaCl:ssa pH-arvossa 7,0 käyttämällä suspensiotason Ubbelhode-viskosimetriä. Tämä vastaa keskimääräistä molekyylipainoa, joka on 750.000 5 D - 1.230.000 D (edullisesti 925.000 - 1.230.000 D).

- Proteiinipitoisuus; proteiinipitoisuus alle 0,2 % albumiinina ilmaistuna määritettynä Lowry-testillä (Lowry J. et ai.: Protein Measurement with the folin phenol rea- 10 gent. J. Biol. Chem. 193, 265 - 275, 1951).

- U.V.: UV-absorbanssi 257 nm:ssä ja 280 nm:ssä alle 1,0 A.U. mitattuna 1 %:sella (paino/tilavuus) vesiliuoksella.

15 - Dynaaminen viskositeetti: 1 %:sen liuoksen (paino/tila vuus) dynaaminen viskositeetti 0,15 M NaCl:ssa pH-arvossa 7,0 alle seuraavien rajojen määritellyissä leikkausmäärissä käyttämällä rotaatioviskometriä, kuten sellaisia, joita on esitetty julkaisussa U.S. Pharmacopea XXII ed.

20 (911) s. 1619, 20°C:n lämpötilassa:

Leikkausnopeus Dynaaminen viskositeetti (mPa 2000:553ΐ 1 s'1 alle 20.000 mPa 25 10 s'1 alle 2.000 mPa 100 s'1 alle 1.000 mPa 350 s'1 alle 500 mPa - Sulfatoitu mukopolvsakkaridi: pitoisuus alle 0,07 % rik- 30 kiä määritettynä induktiivisesti kytketyllä plasmainstru mentilla (I.C.P.) käyttämällä sopivaa vertailuainetta.

- Rauta: rautapitoisuus alle 10 ppm määritettynä atomiabsorptio- tai I.C.P.-tekniikalla.

35 - Stabiliteetti: fraktion HA-1 puskuroitujen isotonisten, fysiologisen pH-arvon omaavien liuosten stabiliteetti, 16 104973 luonnollisesti vanhentuneina ja lämpösteriloituina, määriteltynä analysoimalla rajaviskositeettiluku ja ilmaistuna keskimääräisen molekyylipainon vastaavalla vähenemisellä, alle seuraavien rajojen: . 5 - 97 % alkuarvosta (varastointi 25 °C:ssa 6 kuukauden ajan), - 75 % alkuarvosta (sterilointi 118 °C:ssa 32 minuutin kuluessa), 10 - 80 % alkuarvosta (sterilointi 121 °C:ssa 16 minuutin kuluessa), - 90 % alkuarvosta (sterilointi 124 °C:ssa 8 minuutin kuluessa) .

15 Tämän keksinnön mukaisen hyaluronifraktion erinomaiset omi naisuudet voidaan osoittaa seuraavilla kokeilla.

HA-l-fraktion intraokulaarinen siedettävyys apinoissa

20 TARKOITUS

Tämä testi suoritettiin oftalmisen siedettävyyden arvioimiseksi apinoissa HA-l-injektion jälkeen, joka annettiin silmän lasiaiseen.

25 MATERIAALIT JA MENETELMÄT 1· Testilan it JO Tähän tutkimukseen käytettiin kuutta nuorta täysikasvuista naaraspuolista makakiapinaa (Macaca fascicularis). Niiden terveys oli hyvä eikä niillä ollut havaittavia silmävammoja.

Tähän tutkimukseen valittiin kädellisiä, koska niiden katso-35 taan olevan paras laji oftalmisessa kirurgiassa käytettyjen viskoelastisten tuotteiden oftalmisen siedettävyyden tutkimiseksi .

17 104973

Makakiapinat valittiin, koska aikaisemmin oftalmisen siedettävyyden tutkimuksiin käytetty Douroucoulis-apina on nyt uhattu laji ja se kuuluu laillisen suojan piiriin.

5 2. Koeryhmät ia vastaavat käsittelyt:

Ryhmänimitys ja annostasot -

Apinoita käsiteltiin kerran seuraavan kaavion mukaisesti: 10 Eläinten Annostaso Injektiopaikka määrä (ml) oikea silmä vasen silmä 1 0,5 suolaliuos HA-1 2 0,5 HA-1 suolaliuos 15 3 0,5 suolaliuos HA-1 4 0,5 HA-1 suolaliuos 5 0,5 suolaliuos HA-1 6 0,5 HA-1 suolaliuos 20 3. Yhdisteen valmistaminen ia antaminen

Kirurgiapäivänä apinat anestesoitiin ketamiinihydrokloridil-la, jota oli täydennetty natriumpentobarbitaalilla. Pupillit dilatoitiin sitten tooppisella 1,0 %:sella tropikamidilla 25 (Mydriacyl, Alcon Laboratories). Komea (sarveiskalvo), kon- ’ junktiiva (sidekalvo), sivuelimet (adnexa) ja etusegmentti tutkittiin rakolamppubiomikroskoopilla ja takasegmentti epäsuoralla oftalmoskoopilla. Peripalpebraalinen iho valmisteltiin kirurgiaa varten käyttämällä kahta pesua ja huuhtelua 30 0,5 %:sella povidonijodilla ja steriilillä suolaliuoksella.

Steriili peite ja silmäluomipeili asetettiin ja silmämuna stabiloitiin pienillä hammaspihdeillä. Käytettiin terävää ja tylppää dissektiota reunukseen pohjautuvan sidekalvokaista-leen tuottamiseksi, joka oli n 10 mm yläreunuksesta ja yhden-35 suuntaisesti sen suhteen ja pituudeltaan n. 10 - 15 mm. Dis- sektio suoritettiin sidekalvon ja Tenon-kapselin läpi kova-kalvon päälliseen. Kaistale preparoitiin leikkaamalla edellä 18 104973 reunukseen paljastamalla alla oleva kovakalvo, joka oli pars planan päällä. N. 5 - 6 mm reunuksesta sijoitettiin kovakal-von sisäinen joustosutuura, joka oli 7-0 Vicyrl (Ethicon), jolloin pistot olivat n. 3 mm:n etäisyydellä.

5 25-numeroista neulaa käytettiin imemään pois 0,5 ml lasiais-nestettä (kahdessa eläimessä oli mahdollista ottaa vain 0,4 ml); lasiaisneste korvattiin samalla määrällä HA-l:tä (12 mg/ml) tai steriiliä suolaliuosta. Joustosutuura varmistet-10 tiin vuodon estämiseksi ja sidekalvokaistale asetettiin ta kaisin. Antibioottista voidetta käytettiin paikallisesti. Lasiaisnesteen solulaskenta suoritettiin poisimetyssä lasi-aisnesteessä kätytämällä hematosytometriä ennen antamista ja n. 48 tuntia antamisen jälkeen.

15 4. Havainnot ia tulokset N. 48 tunnin kuluttua kirurgiasta eläimet anestesoitiin ja suoritettiin oftalmoskooppinen tutkimus. Anestesia, dilatoin-20 ti ja tutkimus suoritettiin edellä esitetyllä tavalla. Tutki mus suoritettiin sokkotavalla sen suhteen, oliko kyseessä oleva silmä injektoitu HA-l:llä vai kontrolliaineella. Silmä-parametrit arvosteltiin, kuten on esitetty alla esitetyissä vakio-ohjeissa silmän arvosteluasteikkojen suhteen.

25

Sidekalvon turvotus, injektio ja märkävuoto; sarveiskalvon turvotus, verisyys, solut ja punotus: 0 = normaali, 30 +1 = lievä, +2 = kohtalainen, +3 = vakava tai liiallinen.

Lasiaisen kirkkaus: 35 0 = kirkas, 1 = hieman samea - pohja näkyvissä, 2 = kohtalaisen samea - pohja tuskin näkyvissä, 19 104973 3 = samea - punainen pohjan heijaste, 4 = samea - harmaa pohjan heijaste, 5 = pohja ei näkyvissä.

5 Silmät preparoitiin imemistä varten käyttämällä povi- donijodiliuosta, kuten edellä esitettiin. Luomipeili sijoitettiin paikalleen ja silmämuna stabiloitiin pienellä ham-masneulapidikkeellä. Lasiaisnestettä (0,1 - 0,2 ml) imettiin suoraan sidekalvon ja kovakalvon läpi 6 mm reunuksesta ylem-10 mässä ohimoneljänneksessä. Huolehdittiin siitä, että vältet tiin alkuperäistä kirurgista paikkaa. Inflammatoriset solut laskettiin käyttämällä hemasytometriä. Samoin käytettiin jälleen tooppista antibioottista voidetta.

15 TULOKSET

Arvot (taulukko 1) osoittavat, että HA-1 on erittäin hyvin siedetty eikä se aiheuta mitään merkittävää silmä-ärsytystä verrattuna kontrollituotteeseen (suolaliuos).

20

Suolaliuosryhmän kahdessa eläimessä esiintyi lievää vesipitoista solukeräytymistä ja punotusta. Kontrollilasiaisnesteen valkosolumäärät olivat 10 - 60 solua/mm3. Yhdessä HA-l:llä injektoidussa silmässä oli lievää vesipitoista solukeräyty-25 mistä ja punoitusta. Lasiaisnesteen valkosolumäärä oli 0-30 solua/mm3 testisilmissä.

20 _ .. 104973 ' - (O -—.

51 tn w \ Ϊ: 'ΞΓΰ — n _

O ö M „ O ID

CD IA m ϋ U

CC S to CC CO *

“ O CC ~> cc K

ra 00 m 5» ro mra'3 E* fo E g Jo

S « ra «" S ro O

3 ~ 3 ^ 3 ίί ‘f5 o

g ® 3 CD = ! U CO

f = En^ E“£ gäggo |§ 53|35 £§g O O o O O , 10 :« rr °Nr II J— m .* .x O *7 :2 co o *2 <0 JUt ^ CO ~ (fl>r E co co X; co a> 3 C ^ ^ Di " N Q m «-< — X r· r- X r- — O i

co O O —· —· O — o »- O

Φ CO

OT « .5 ra JS ^ ^ ^ ^

O O o O

ro _ "c -* Φ :θ 2 Φ * ffl ^ t° «

* D« O ° ° O

2 3 2 ö ^ ^ £ £ o o w ° T O ra 3 ‘3 tn + ♦ « Es cc P ti o >o § ! g ^ ^ t ii S oi ° ♦ £ 2 uj w md

« > t? t? ^ o tn H

> ! £ O oo§S

> > o > •ffl ' ^ Ό Ό Ό Ό 5 x '2 00 ^ ^ \ ^ rt ω '1 o S ° ° ° ° 2 = , Ό C ,> u ~ J_·

® ro m 3 c E

I » WJ<H = “ s c o « 3 > C § Ο Ό O>003 ro ~ ί N N ^^32 «- ro .g o o o o .P ~ ro ® ro j2 O 2 3 ro ,2 3 .3 ti jc — 's' :ro 3 ro J6 rt o _ ** 0 oi .φ .® S ö ä c -|o s» Φ = * <0 > Φ >· ·?. S Ό Ό >0 Ό :CD :<S _ > - < 5 3 s s ssi-i-a»! 1 cö £ « « o !ä = “> ® S — C w

I f o δ S δ ls>: J

Ί K 11 11 o (S X

a ui O co m o co UJ LU CO = .2.

« ro ^ u >r - - KJ^g , <£ 21 104973 Tästä syystä verrattuna suolaliuoskontrolleihin voidaan tehdä se johtopäätös, että HA-1 on erittäin hyvin siedetty silmäku-doksissa intravitreaalisen korvauksen jälkeen.

5 Kliininen tutkimus HA-1:n tehokkuuden analysoimiseksi Healo- nin suhteen kirurgiassa ekstrakapsulaarisen kataraktin poistamiseksi istuttamalla samalla takakammion intraokulaarinen mykiö.

10 TARKOITUS

Tämän jälkeen esitettävät kokeet arvioivat HA-1:n tehokkuutta ja turvallisuutta verrattuna johtavaan markkinoituun visko-elastiseen materiaaliin (Healon) kataraktan poistamisessa ja 15 intraokulaarisen mykiön istuttamisessa kahdessa kliinisessä tutkimuksessa. Ensimmäisessä kliinisessä tutkimuksessa HA-l:tä ja Healonia testattiin samoissa kokeellisissa olosuhteissa (molemmat imetty pois kirurgian jälkeen). Toinen tutkimus kohdistui etenkin HA-l:n turvallisuuteen postoperatii-20 visen intraokulaarisen paineen nousun ja endoteliaalisten solumäärien suhteen: tässä toisessa tutkimuksessa (jossa, päinvastoin kuin ensimmäisessä, molemmat viskoelastiset materiaalit imettiin pois kirurgian jälkeen) HA-l:tä ei poistettu kirurgian päättyessä päinvastoin kuin Healon, joka imettiin ?5 pois silmästä.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

1. Tutkimusmallit: 30

Molempien tutkimusten malli oli satunnainen, rinnakkainen ryhmä, piilotarkkailija (erilliset tutkijat suorittivat seurannat), HA-1:n arviointi Healonin suhteen ekstrakapsulaari-sessa kataraktan poistossa, jossa istutettiin takakammion 35 intraokulaarinen myöiö. Kummassakin tutkimuksessa käytettiin potilaita, joilla oli seniilin kataraktan primaarinen diagnoosi ja joiden ikä oli yli 18 vuotta.

22 104973

Yhteenvetona tutkimuksista voidaan todeta seuraavaa: - Ensimmäisessä tutkimuksessa käytettiin 217 potilasta ja hajauttaminen suoritettiin n. 3:l-suhteen mukaisesti (HA-5 1 161 potilasta ja Healon 56 potilasta).

Molemmat viskoelastiset materiaalit imettiin pois kirurgian jälkeen. Tutkimusjakso käsitti esikirurgisen arvioinnin, operatiivisen toimenpiteen ja välittömän kirur-10 gisen toimenpiteen jälkeisen seurantajakson. Tässä tutki muksessa intraokulaarinen paine mitattiin 3 tunnin kuluttua leikkauksen jälkeen ja seurantatutkimukset 1, 7 ja 30 päivän kuluttua siitä.

15 - Toisessa tutkimuksessa käytettiin 91 potilasta ja HA-1 (45) tai Healon (46) hajautettiin suunnilleen suhteessa 1:1. Tässä tutkimuksessa HA-l:tä ei imetty pois leikkauksen jälkeen päin vastoin, kuin Healon, joka imettiin pois, kuten ensimmäisessä tutkimuksessa. Tutkimusjakso ja 20 HA-1:n vastaava tutkimusmateriaali olivat samat kuin en- I simmäisessä tutkimuksessa. Tässä tutkimuksessa postope- | ratiivinen intraokulaarinen paine mitattiin 1, 3, 6 ja 9 j tunnin kuluttua operaatiosta (useammin kuin ensimmäisessä tutkimuksessa) ja seurantatutkimukset suoritettiin 1, 7, : 25 30 ja myös 90 päivän kuluttua operaatiosta. Tutkimus kä sitti myös peilimikroskopian perusviivalla ja 90 päivän ? kuluttua operaatiosta.

r 2. Arvonen analyysi- ia statistiset menetelmät 30

Tilastolliset analyysit suoritettiin keskus- ja käsittely-ryhmän vertailukelpoisuuden (alfa = 0,10) ja turvallisuuden ja tehokkuuden (alfa = 0,05) arvioimiseksi. Arvojen arviointiin käytettiin Fisherin tarkkoja testejä, t-testejä, de-35 skriptiivisiä tilastoja.

'•M

S

23 104973 3. Tutkimuskanta ia ominaisuudet:

Tutkittiin kaikkiaan 308 potilasta, joista: 5 1· Tutkimus 2. tutkimus HA-1 Healon Kaikkiaan HA-1 Healon Kaikkiaan Perusviiva 158 56 214 41 46 87 Päivä 1 158 56 214 41 46 87 10 Päivä 7 158 56 214 39 45 84 Päivä 30 157 54 211 41 44 85 Päivä 90 - 42 43 85 104973 24 Näiden kahden käsittelyryhmän välillä ei ollut mitään olennaisia eroja kummassakaan tutkimuksessa, mitä tulee useimpiin demografisiin, lääketieteellisiin tai kataraktaominaisuuk-siin.

5 4. Kirurgia

Valmistus ja menetelmät: leikkauksiin käytettiin tutkijan va-kioleikkaustekniikkaa, jolloin katarakta poistettiin yksin-10 kertaisella seniilin/aikuisen ekstrakapsulaarisella poistol la. Samalla siirrettiin takakammion intraokulaarinen mykiö. Käytettiin esioperatiivisia (profylaktisia) lääkityksiä, anestesiaa ja muita intraoperatiivisia lääkityksiä tutkijan vakiotekniikkojen mukaisesti, mutta käyttämättä okulaarisia 15 antihypertensiivisiä aineita. Ennen avaamista intraokulaaris- ta painetta alennettiin mahdollisimman paljon käyttämällä Honan-intraokulaarista paineenalenninta, "Super Pinky":ä tai manuaalista painetta. Viskoelastisia aineita (HA-1 ja Healon) käytettiin tämän jälkeen esitettävällä tavalla.

20

Tuotteet poistettiin kirurgian jälkeen lukuunottamatta Ha-l:tä, joka käytettiin toisessa kliinisessä kokeessa ja joka jätettiin paikalleen.

25 Sekä HA-l ja Healon sijoitettiin etukammioon kirurgisen toi menpiteen helpottamiseksi ja silmäkudosten suojaamiseksi. Seuraavassa on esitetty yhteenveto tutkimuksista: 1. tutkimus: 30 - keskimääräinen HA-1:n käytetty määrä (0,568 ml 12 mg/ml:n konsentraatiossa) oli merkittävästi suurempi kuin käytetty Healonin määrä (0,439 10 mg/ml:n konsentraatiossa), vaikkakin ero oli ainoastaan 0,129 ml.

35 25 104973 2. tutkimus: - ei esiintynyt mitään merkittävää eroa viskoelastisten aineiden käytetyssä keskimääräisessä määrässä: tässä ta- 5 pauksessa keskimääräiset määrät olivat 0,957 (HA-l) ja 0,833 (Healon).

5. Arvioinnit: 10 Seuraavat testit suoritettiin ennen leikkausta, sen aikana ja sen jälkeen: a) esikirurginen arviointi esimerkiksi seuraavien parametrien analysoimiseksi: 15 - visuaalinen tarkkuus (paras manifesti), tonometria, paky- metrimenetelmä (korneaalista paksuutta varten) ja rako-lamppu- ja oftalmoskooppisen tutkimuksen löydökset, - spekulaarinen mikroskopia (ainoastaan 2, tutkimus): endo-teliaalisten solujen laskenta suoritettiin käyttämällä 20 spekulaarista mikroskooppia 10 valitussa keskeisessä kor- neaalisessa paikassa. Jokainen laskenta säädettiin sopivalla tekijällä solumäärän saamiseksi neliömillimetriä kohden ja laskettiin keskiarvo vastaavan solumäärän saamiseksi neliömillimetriä kohden.

25 b) postkirurgiset arvioinnit, kuten: - intraokulaarinen paine (tonometrialla) mitattiin - 3 tunnin kuluttua postoperatiivisesti (1. tutkimus), -1-3-6-9 tunnin kuluttua postoperatiivisesti (2.

30 tutkimus), - oftalmoskooppinen ja rakolamppututkimus, pakymetria, tonometria, spekulaarinen mikroskopia (viimeinen ainoastaan 2. tutkimuksessa endoteliaalista solulaskentaa varten) ja visuaalisen tarkkuuden mittaukset (seurantatutkimuksissa) 35 suoritettiin: - 1 - 7 - 30 päivän kuluttua ensimmäisessä tutkimuksessa, - 1 - 7 - 30 - 90 päivän kuluttua toisessa tutkimuksessa.

104973 26

TULOKSET

1. Operatiivinen arviointi - käytettyjen viskoelastisten materiaalien käsittelyominaisuudet 5

Viskoelastiset materiaalit arvioitiin sen suhteen, miten ne helpottivat mykiöistutusta jokaisen käsittelyryhmän verrattavissa olevissa osuuksissa kummassakin kliinisessä tutkimuksessa.

10 2. Postoperatiiviset komplikaatiot 2a) 1. kliininen tutkimus Kuten voidaan nähdä taulukosta 2: 15 - Komplikaatioiden korkein prosenttimäärä (7,9 % kaikista potilaista) esiintyi kirurgian ja 1. päivän välillä, kun taas pienimmät prosenttimäärät rekisteröitiin 7. ja 30. päivänä.

20 - l. päivänä operaation jälkeen Healon-käsiteltyjen poti- J laiden osuus (14,3 %), joilla esiintyi komplikaatioita, oli 2,5 kertaa suurempi kuin HA-l-käsiteltyjen potilaiden j kohdalla (5,7 %) . Tämä ero oli statistisesti merkitsevä j .25 (p = 0,079 Fisher'in kaksiosaisella tarkkuustestillä).

Erot 7. ja 30. päivänä eivät ole statistisesti merkitseviä (p > 0,6 Fisher'in kaksiosaisella tarkkuustestillä).

Komplikaatioina esiintyi intraokulaarisen paineen nousuja 30 30 mm:iin Hg tai yli (7/158 = 4,4 % HA-l-käsitellyistä potilais ta, 5/56 = 8,9 % Healon-käsitellyistä potilaista) ja korneaa-linen turvotus, iriitti, konjunktiviitti, hyfeema, täplikäs turvotus, haavavuoto, sykliittinen kalvo ja subkonjuktivaali-nen hemorragia.

35 27 104973

Kuten taulukosta 3 voidaan nähdä, johon on merkitty esikirur-gisesti ja postkirurgisesti saadut tonometria-arvot (3 tunnin kuluttua ja 1 - 7 - 30 päivän kuluttua): - Käsittelyryhmien välillä ei esiintynyt mitään merkittäviä 5 eroja keskimääräisessä intraokulaarisessa paineessa; kui tenkin Healon-käsitellyillä potilailla oli suuremmat keskimääräiset intraokulaarisen paineen nousut sekä 3 tunnin kuluttua että 1. päivänä ja heillä oli merkittävästi suurempi intraokulaarisen paineen vakiopoikkeama kuin HA-1- 10 käsitellyillä potilailla 1. päivänä.

Rakolamppu-, pakymetria- (korneaalinen paksuus) ja oftalmo-skooppiset tutkimukset eivät osoittaneet mitään eroja näiden kahden ryhmän välillä.

15 2b) 2. kliininen tutkimus - Hieman suuremmassa osuudessa Healon-käsiteltyjä potilaita (37,0 %) kuin HA-l-käsiteltyjä potilaita (28,6 %) todet- 20 tiin postoperatiivisia komplikaatioita (taulukko 4). Kom plikaatioina esiintyi intraokulaarisen paineen nousuja (5/42 = 11,9 % HA-l-käsitellyistä potilaista, 11/46 = 23,9 % Healon-käsitellyistä potilaista) ja hyfeemaa, haa-vavuotoa, lasiaishemorragiaa, takakotelon sameutumista, 25 silmän suonikalvon irtoamista, iriksen atrofiaa ja täp- likästä turvotusta.

- Nämä kaksi käsittelyryhmää eivät poikenneet statistisesti intraokulaaristen paineiden eikä intraokulaarisen paineen 30 vaihtelevuuden suhteen perusviivalla eikä minään aikana 1. päivästä 90. päivään (taulukko 5). Ensimmäisen 9 tunnin aikana kirurgian jälkeen näyttää, että Healon (poistettu silmästä) ja HA-1 (jätetty paikalleen) tuottivat postoperatiivisen intraokulaarisen painejakautuman, joka 35 poikkesi ensisijaisesti vakiopoikkeamien suhteen. Healon- käsitellyillä potilailla oli suurempia vakiopoikkeamia ja merkittävästi korkeampi keskiarvo 1. tunnin kuluttua ki- 28 104973 rurgian jälkeen ja HA-l-käsitellyillä potilailla oli suurempia, mutta ainoastaan marginaalisesti merkittäviä va-kiopoikkeamia 6 tunnin ja 9 tunnin kuluttua kirurgiasta.

1 tunnin kuluttua kirurgian jälkeen 22,7 %:lla Healon-5 käsitellyistä potilaista ja 10 %:lla HA-l-käsitellyistä potilaista oli vähintään 21 mmHg:n intraokulaarisia paineita. 6 ja 9 tunnin kuluttua kirurgiasta HA-l-käsitelty-jen (73,2 % 6 tunnin kuluttua ja 65,0 % 9 tunnin kuluttua) ja Healon-käsiteltyjen (68,2 % 6 tunnin kuluttua ja 10 71,4 % 9 tunnin kuluttua) potilaiden verrattavissa ole villa osuuksilla oli vähintään 21 mmHg:n painelukemia.

- Mitään muuta eroa ei todettu näiden kahden ryhmän välillä, mitä tulee 1. tutkimuksessa todettuihin havaintoihin.

15 Samoin spekulaarinen mikroskopia (endoteliaalisten solu jen laskenta) ei osoittanut mitään merkittäviä eroja (taulukko 6).

3. Kvantitatiiviset tulokset: 20

Visuaalisen tarkkuuden analyysit osoittivat, että näiden kahden viskoelastisen aineen tehokkuus oli vertailukelpoinen, etenkin: - 1. kliininen tutkimus: 25 Ei esiintynyt mitään merkittävää eroa Healon-käsiteltyjen (77,8 %) ja HA-l-käsiteltyjen (84,7 %) potilaiden osuuksissa, jotka saavuttivat 20/40-näkötarkkuuden 30. päivänä .

- 2. kliininen tutkimus: 30 Ei esiintynyt mitään merkittävää eroa Healon-käsiteltyjen ' (73,9 %) ja HA-l-käsiteltyjen (71,4 %) potilaiden osuuk sien välillä, jotka saavuttivat vähintään 20/40-näkötark-kuuden 30. päivänä. 90. päivänä osuudet olivat lähes identtiset.

29 104973

•H I

Ρ Ή W Φ :(0 -Ρ > ·Η :(0 01 Ρ :(0 Ρ X

•H I X Η Ρ I 0) < ε χ c c Ο ·Η 3 ω - χ 3 (Ο e p — •Η ·Η :(0 X r-, — --- Ο ιΗ Ρ Η σι i—I CT\ l£> -r-1 r-l

3 C (0 - ' - - Ρ -H

P (0 P OJ 00H Γ' (N (OP

io-Η ri« σ> ^ en ^ (Γι'— ιοω C -Η (0 (Ν οΥ> >— ^ ^ X Φ Φ ίί Η -Η Ρ C χ ή ιι r-' r-> co voin πω Η ·Η 4-> S σι Η Ο ο ft 3 C (0 O S Η CN (Ί g 3 •η χ α οχ

•Η XX

rH $Η χ c (ο Ο Ρ Η (0 (0 Η Η

• Η ι—I

Ρ — — — — ·Ηφ

Ο Ρ n (Neo nr- Ο W

Ή I (0 Ο *· - - «- ·Γη·ι-(

ρ C <0 in in ooh von (O

(0 OHo\e CO H CT— (Τ'— -(Λ (0 r-l -Η Ν'- —- w (/)0

X (0 P 3 -H

•η φ Ο Z Z ooco m h cn oo 3 W

η z ft in in ui X

α o co

E X

o c X Φ c -σ -h P -H -

Φ (OP

U) r- —- Η φ

H nr» r-icr Her -HP

> P »N V» V *, p[/)t •h (Ooo in oon co h O-ho) -h h ns in ^ cr — (Τ'— (Τ'— Qib 3 ρ I H H o\o - — - 3 (0 < -H --- C <3\ (Λ Ρ X Ρ II <T(T nn n o n o Φ o Z m in -no

ft ft Z H H rH >H - C

Ο Ρ Ο φ Ρ Η Ό

W Φ II -H

O P (0

. ft -H ft rH

• m '—•h

:(0 P

(N X -H O

:(0 I ft ft

O :(0 :(0 > C E

X > > -Η Ο Φ C

X -Η -H -.(0 Η Ρ φ 3 :(0 :(0 :(0 :(0 ft :(0 (0 3 ·η rH ft rH ft rH rH φ 3

3 rH rH · rH X W P

(0 · -H >, · -H >1 Ο -H >,

Eh HWXr-WXnWX * mono

<H rH (N

30 104973

Taulukko 3: Intraokulaarisen paineen analyysi (tonometria mmHg:nä): l. kliininen tutkimus Käsittely- N Mediaani Vakio- 5 ryhmä poikkeama

Esikiruroia 10 kaikkiaan 213 16.671 3.598 HA-1 157 16.682 3.747

Healon 56 16.643 3.176 15 intraokulaarinen paine 3. tunnin kuluttua kaikkiaan 176 18.077 7.760 HA-1 129 18.027 7.417

Healon 47 18.213 8.718 20 1. päivä kaikkiaan 212 19.146 7.497 HA-1 157 18.580 6.865* 25 Healon 55 20.327 8.453 7. päivä kaikkiaan 200 14.431 3.979 30 HA-1 148 14.468 4.147

Healon 52 14.327 3.491 30. päivä kaikkiaan 207 15.002 3.730 35 HA-1 154 14.932 3.744

Healon 53 15.208 3.718 40 * Näiden kahden käsittelyryhmän 1. päivän vakiopoikkeamat ovat merkitsevästi erilaisia (p = 0,0508 F-testillä).

31 104973

Taulukko 4: Postoperatiiviset komplikaatiot: 2. kliininen tutkimus HA-l-potilaat Healon-potilaat Kaikkiaan 5 N = 42 N = 46 N = 88 N (%) N (%) N (%)

Postoperatiiviset komplikaatiot 10 Ei 30 (71,4) 29 (63,0) 59 (67,0)

Kyllä 12 (28,6) 17 (37,0) 29 (33,0) 32 104973

Taulukko 5: Lyhyt tonometria- (mmHg) tilasto käsittelyryhmän mukaan Käsittely- N Mediaani Vakio- 5 ryhmä poikkeama

Esikirurgia kaikkiaan 8,6 15.256 3.365 10 HA-1 40 15.575 3.296

Healon 46 14.978 3.435 1. tunti kirurgian jälkeen kaikkiaan 84 12.167 9.937 HA-1 40 9.925* 7.430** 15 Healon 44 14.206 11.473 3. tunti kirurgian jälkeen kaikkiaan 84 23.012 14.244 HA-1 41 22.805 15.481

Healon 43 23.209 13.139 20 6, tunti kirurgian jälkeen kaikkiaan 85 27.318 12.200 HA-1 41 28.707 13.757***

Healon 44 26.023 10.542 9. tunti kirurgian jälkeen 25 kaikkiaan 82 26.451 11.863 HA-1 40 27.050 13.449****

Healon 42 25.881 10.261 1. päivä kaikkiaan 87 20.839 8.868 30 HA-1 41 21.805 9.474

Healon 46 19.978 8.301 7. päivä kaikkiaan 84 14.381 5.411 HA-1 39 15.051 5.973 35 Healon 45 13.800 4.865 30. päivä kaikkiaan 83 14.313 3.732 - HA-1 40 14.825 3.761

Healon 43 13.837 3.683 40 90. Päivä kaikkiaan 80 13.138 3.252 HA-1 39 13.128 3.357

Healon 41 13.146 3.190 45 * Nämä kaksi käsittelyryhmää poikkeavat merkitsevästi keski määräisen intraokulaarisen paineen suhteen (p = 0,0442 t-testillä säädettynä epäsymmetristen varianssien suhteen).

** Käsittelyryhmien vakiopoikkeamat olivat merkitsevästi 50 erilaisia (p = 0,0070 F-testillä).

*** Käsittelyryhmien vakiopoikkeamissa oli marginaalisesti merkitsevä ero (p = 0,0886 F-testillä).

55 **** Käsittelyryhmien vakiopoikkeamissa oli marginaalisesti merkitsevä ero (p = 0,0898 F-testillä).

33 104973

Taulukko 6: Yhteenveto spekulaarisen mikroskopian tilastotiedoista käsittelyryhmän mukaan endoteliaalisten solujen laskentaa varten 5 Käsittely- N Mediaani Vakio- ryhmä poikkeama

Esikirurqia 10 kaikkiaan 85 2283,1 451,24 HA-1 40 2234,6 433,72

Healon 45 2326,1 466,86 15 90. päivä kaikkiaan 80 2158,1 505,73 HA-1 39 2068,2 585,52

Healon 41 2243,5 405,08 20 34 104973

JOHTOPÄÄTÖKSET

Yllä esitettyjen kahden kliinisen tutkimuksen tulokset osoittavat HA-l:n arvokkaan tehokkuuden kataraktan poistossa ja 5 intraokulaarisessa mykiöistutuksessa. Etenkin on osoitettu, että HA-1 on hyvin siedetty. Itse asiassa tuote aiheuttaa vähemmän postoperatiivisia komplikaatioita (n. 2,5 kertaa vähemmän) kuin Healon testattaessa niitä samoissa kokeellisissa olosuhteissa, s.o. poistamalla aine kirurgian jälkeen 10 (kuten on esitetty 1. kliinisen tutkimuksen yhteydessä).

Postoperatiivisista komplikaatioista intraokulaarisen paineen lisääntyminen tulisi etenkin ottaa huomioon.

On huomattava, että molemmissa tutkimuksissa HA-l:llä käsi-15 teltyjen potilaiden ja Healonilla käsiteltyjen potilaiden postoperatiiviset kulut poikkesivat intraokulaarisen paineen suhteen. Ensimmäisessä tutkimuksessa, jossa sekä HA-1 että Healon poistettiin kirurgian jälkeen, suuremmalla osuudella Healon-käsitellyistä potilaista esiintyi yli 21 mmHg:n intra-20 okulaarisen paineen kasvuja 1. päivänä verrattuna HA-l-käsi- teltyihin potilaisiin. 2. tutkimuksessa, kun HA-l:tä ei poistettu kirurgian jälkeen kuten Healon, HA-1:n postoperatiiviset intraokulaarisen paineen profiilit olivat vertailukelpoisia .

25

Siten voidaan tehdä se johtopäätös, että näiden kahden vis-koelastisen tuotteen muutamat aspektit ovat vertailukelpoisia, kun taas ne poikkeavat postoperatiivisten komplikaatioiden suhteen: silmästä poistettu Healon näyttää liittyvän 30 intraokulaarisen paineen suurempiin kasvuihin kuin silmästä poistettu HA-1 ja paikalleen jätetty HA-1 muodostaa postoperatiivisen intraokulaarisen profiilin, joka on vertailukelpoinen kirurgian jälkeen poistetun Healonin profiilin kanssa.

35 Näiden tulosten perusteella on tärkeää korostaa sitä mahdol lisuutta, etä HA-1 jätetään paikalleen sen aiheuttamatta 35 104973 postkirurgisia komplikaatioita. Tämä mahdollisuus tarjoaa seuraavat arvokkaat edut: 1. Se yksinkertaistaa kirurgista toimenpidettä, koska tuotet-5 ta ei tarvitse poistaa kirurgian jälkeen.

2. Se vähentää komplikaatioiden riskiä käsittelyn johdosta (s.o. poisimemisen aikana). Esimerkkeinä tällaisista riskeistä mainittakoon traumat kirurgisten toimenpiteiden johdosta 10 ja niiden vastaavat seuraukset.

Keksinnön mukaisella menetelmällä puhdistettua hyaluronihapon uutta molekyylifraktiota sen natriumsuolan, HA-l:n muodossa, etenkin sellaisten suolaliuosten muodossa, joiden pH-arvo on 15 neutraali, voidaan käyttää aktiivisena aineosana farmaseuttisissa valmisteissa. HA-l:n valittu konsentraatio on sellainen, että saadaan aikaan haluttu viskositeettiaste, esimerkiksi viskositeetti, joka on n. 300 mPa x s (350 s_1:ssä) ja n. 10.000 mPa x s (1 syissä).

20

Uutta natriumhyaluronaattifraktiota HA-l:a voidaan käyttää myös silmäkirurgiassa, etenkin kataraktaleikkauksissa tai my-kiösiirroissa.

. 25 Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä:

Esimerkki 1 - Menetelmä HA-l-fraktion valmistamiseksi ia sen vastaava karakterisointi 30 Kanan helttoja, joko tuoreita tai jäädytettyjä (3000 g), jauhetaan lihamyllyssä ja sitten ne homogenoidaan mekaanisessa * »· ' homogenisaattorissa. Saatu tahna sijoitetaan lasisäiliöön, jossa on 10 tilavuusosaa vedetöntä asetonia tai etanolia, joka sisältää 0,1 % p/t raudan kelatointiainetta.

35 l,10-fenantroliini (C.A.R.N. 66-71-7) tai sen dimetyylijoh-· dannaiset ovat esimerkkeinä sopivista kelatoivista aineista.

Lasisäiliöitä ja rautakelatointiaineita käytetään hyalu- 36 1 0 4 9 7 3 ronihapponatriumsuolan depolymerointiprosessin välttämiseksi, jonka terässäiliöiden tai verijäännösten rautaionit muutoin saattaisivat aiheuttaa.

5 Kanan helttoja käsitellään, kunnes rautaionit on täysin uu tettu (instrumentaalinen kontrolli: kompleksin rauta-kela-tointiaineen absorbanssi asetoni- tai etanolifaasissa 1 cm:n kennoissa maksimaalisen absorption aallonpituudessa (510 nm, 1,10-fenantroliinin kohdalla korkeintaan 0,005 A.U.).

10

Suoritetaan toinen pesuprosessi käyttämällä samoja määriä vedetöntä asetonia (tai etanolia) mahdollisen kelatointiai-neen tähteen poistamiseksi. Nämä käsittelyt suoritetaan, kunnes seuraava testi "A" on negatiivinen: 15 - Testi "A": 5 ml asetoni- (tai etanoli-) faasia haihdutetaan kohtuullisen typpivirtauksen avulla. Jäännös liuotetaan 5 ml:aan vettä ja absorbanssi mitataan kelatointiai-neen maksimiabsorption aallonpituudessa.

20

Testin katsotaan olevan negatiivinen, jos absorbanssi on alle 0,1 A.U.

Lopullista reaktiotuotetta sekoitetaan 6 tunnin ajan 50 rpm:n ~ .25 nopeudessa ja sen annetaan erottua 12 tunnin ajan, minkä | jälkeen liuotin poistetaan ja heitetään pois.

Tätä uuttamisprosessia toistetaan, kunnes poisheitetty liuotin on saavuttanut oikean kosteustason (Karl-Fischer-menetel--iO mä) .

Muodostunutta ainetta sentrifugoidaan sitten ja tyhjökui-vatetaan sopivassa lämpötilassa 5-8 tunnin ajan. Tämän prosessin saanto on n. 500 - 600 g kuivaa jauhetta.

J 5 300 g kuivaa jauhetta alistetaan sitten entsymaattiseen hajo-tusprosessiin käyttämällä 0,2 g sopivaa proteolyyttistä ai- 37 104973 netta (papaiini, pepsiini, trypsiini tai pronaasi) puskuroidun vesipitoisen väliaineen avulla, jossa on fosfaattipuskuria, käyttämällä kysteiinihydrokloridin määrää, joka saa aikaan suhteen 20:0,01 - 20:1 kuivan jauheen suhteen. Tätä 5 seosta sekoitetaan sitten 24 tunnin ajan 60 rpm:ssä vakiossa 60 - 65 °C:n lämpötilassa. Koko massa yhdistetään 25 °C:ssa lisäämällä 60 g Celite®:ä ja sekoittamista jatketaan vielä tunnin ajan.

10 Saatua seosta suodatetaan, kunnes saadaan kirkas neste.

Vesiliuos, joka on laimennettu 2 mg/ml:aan tislatulla vedellä, johdetaan pylvääseen, joka on täytetty makromolekyylisel-lä ioninvaihtohartsilla DOWEX M-15, joka saadaan tetrabutyy-15 liammonium- (TBA+) muodossa käsittelemällä tetrabutyyliam- moniumhydroksidillä.

Pylväästä eluoitu liuos haihdutetaan ja kuivatettu jäännös liuotetaan sopivaan N-metyylipyrrolidonin (tai dimetyylisul-20 foksidin) määrään 2 mg/ml:n konsentraation aikaansaamiseksi.

Saatu liuos suodatetaan, jäähdytetään 4 °C:ssa ja lisätään yhtä suuri määrä vettä. Suoritetaan kolme peräkkäistä pesu-prosessia käyttämällä metyleenikloridia ja alempi faasi hei-25 tetään pois joka kerta. Ylempi faasi käsitellään sitten nat- riumbromidilla (NaBr:ää käytetään moolisuhteessa 3:1 hyalu-ronihapon kanssa) 4 °C:ssa, vesiliuos saostetaan lisäämällä 3 tilavuusosaa etanolia ja sakka pestään useita kertoja etanolilla.

30

Sakka liuotetaan veteen ja saatu liuos alistetaan dialyysiin. Liuos tehdään 0,1-molaariseksi lisäämällä natriumkloridia ja lämpötila säädetään 50 °C:seen. 45 g setyylipyridiniumklori-dia lisätään samalla, kun tuotetta sekoitetaan 60 g:ssä/min. 35 Tätä seosta sekoitetaan 60 minuutin ajan, minkä jälkeen lisä tään 50 g Celite®:ä. Sekoittaen tuotteen lämpötilaa lasketaan 25 °C:seen ja muodostunut sakka kerätään sentrifugoimalla.

38 104973 Näin saatu sakka suspendoidaan natriumkloridin 0,01M-liuok-seen (5 litraa), joka sisältää 0,05 % setyylipyridiniumklori-dia. Sekoitetaan edelleen 60 minuutin ajan 50 °C:ssa. Lämpötila lasketaan 25 °C:seen ja sakka sentrifugoidaan.

5

Pesuprosessia toistetaan sitten kolme kertaa ja lopuksi sakka kootaan säiliöihin, joissa on 3 litraa natriumkloridin 0,05M-liuosta, joka sisältää 0,05 % setyylipyridiniumkloridia. Tätä sekoitetaan 60 g/min:ssa 60 minuutin ajan ja pidetään vakios-10 sa, 25 °C:n lämpötilassa 2 tunnin ajan. Supernatantti eli minoidaan sentrifugoimalla.

Toimenpidettä toistetaan useita kertoja 0,1 M natriumkloridi-liuoksella, joka sisältää 0,05 % setyylipyridiniumkloridia.

15 Seos sentrifugoidaan ja supernatantti hylätään. Sakka disper- goidaan 0,30 M natriumkloridiliuokseen, joka sisältää 0,05 % setyylipyridiniumkloridia (3:1).

Seota sekoitetaan ja sekä sakka että kirkas neste kerätään.

~ 20 Uuttaminen toistetaan sakalla vielä 3 kertaa, kulloinkin I käyttämällä 0,5 litraa samaa vesiliuosta.

i ] Jäännössakka poistetaan ja kirkkaat nesteet kerätään yhteen ; ainoaan säiliöön. Nesteen lämpötilaa korotetaan 50 °C:seen 25 sekoittaen. Neste saatetaan 0,23 molaariseksi natriumklori- 1 dilla. Lisätään 1 g setyylipyridiniumkloridia ja sekoittamis ta jatketaan 12 tunnin ajan. Seos jäähdytetään 25 °C:seen, sitten se suodatetaan, ensin Celite®-pakkausten läpi ja sitten suodattimen (1 μ) läpi.

30 ; Saatu liuos käsitellään molekyyliultrasuodatuksella kalvojen läpi, joiden molekyylisulkuraja on 30.000, ultrasuodattamalla 3 alkuperäistilavuusosaa lisäämällä 0,33M-natriumkloridili-uosta. Natriumkloridiliuoksen lisäys keskeytetään ja nesteen 35 tilavuus vähennetään neljännekseen alkuperäisestä tilavuudes taan.

39 104973 Näin konsentroitu liuos saostetaan sekoittamalla (60 g/min.) 25 °C:n lämpötilassa kolmella tilavuudella etanolia (95 %:sta). Sakka kerätään sentrifugoimalla ja supernatantti hylätään. Sakka liuotetaan 1 litraan 0,1 M natriumkloridi-5 liuosta ja saostamistoimenpide toistetaan kolmella tilavuu della 95 %:sta etanolia.

Sakka kerätään ja pestään, ensin 75 %:sella etanolilla (kolme kertaa), sitten absoluuttisella etanolilla (kolme kertaa) ja 10 kolmanneksi absoluuttisella asetonilla (kolme kertaa).

Näiden saadun tuotteen (HA-l-fraktio) keskimääräinen molekyy-lipaino on 750.000 D - 1.230.000 D (edullisesti 925.000 -1.230.000).

15

Hyaluronihapon saanto vastaa 0,6 % alkuperäisestä tuoreesta kudoksesta.

Edellä esitetyllä menetelmällä saadulla lopullisella 20 tuotteella on seuraavat ominaisuudet: - molekvvlipaino l.000.000 D, - raiaviskositeettiluku 14,5 - 21 dl/g määritettynä 25 °C:ssa 0,15 M NaClrssa pH-arvossa 7,0 käyttämällä suspen-siotason Ubbelhode-viskosimetriä. Tämä vastaa keskimää-

25 räistä molekyylipainoa, joka on 750.000 D - 1.230.000 D

(edullisesti 925.000 - 1.230.000).

- proteiinipitoisuus alle 0,2 % albumiinina ilmaistuna määritettynä Lowry-testissä (Lowry J. et ai.: Protein Measurement with the folin phenol reagent. J. Biol., 30 Chem. 193, 265 - 275, 1951).

·. - UV-absorbanssi 257 nm:ssä ja 280 nm:ssä alle 1,0 A.U. mi tattuna 1 %:sella p/t vesiliuoksella.

- 1 %:sen liuoksen p/t dynaaminen viskositeetti 0,15 M NaCl:ssa pH-arvossa 7,0 alle seuraavien rajojen määritel- 35 lyissä leikkausmäärissä käyttämällä rotaatioviskosimet- riä, kuten sellaisia, joita on esitetty julkaisussa U.S. Pharmacopea XXII ed. (911) s. 1619, 20 °C:n lämpötilassa.

40 104973

Leikkausnopeus Dynaaminen viskositeetti fmPa 20 °C:ssal 1 s'1 alle 20.000 mPa 10 s'1 alle 2.000 mPa 5 100 s'1 alle 1.000 mPa 350 s'1 alle 500 mPa - sulfatoidun mukopolvsakkaridin pitoisuus alle 0,07 % rikkinä määritettynä induktiivisesti kytketyllä plasma- 10 instrumentilla (I.C.P.) käyttämällä sopivaa vertailuai netta .

- rautapitoisuus alle 10 ppm määritettynä atomiabsorptiota! I.C.P.-tekniikalla.

15 Vertaileva tutkimus suoritettiin HA-l-fraktion ja muiden kaupallisesti saatavien hyaluronihapponatriumsuolaliuosten välillä niiden rautapitoisuuden määrittämiseksi.

Saadut tulokset (taulukko 7) osoittavat selvästi erilaiset 20 rautapitoisuudet: HA-l-fraktiolla on rautapitoisuus, joka on paljon alhaisempi kuin muiden tuotteiden.

Taulukko 7: HA-l:n rautapitoisuus (ppm) muihin tuotteisiin verrattuna . 25 _

HA-1 Näyte A Näyte B Näyte C

30 rauta < 10 130 120 40 : (ppm) jolloin - näyte A vastaa SODICHMiä (erä 154) 35 - näyte B vastaa BIOCHEMOa (erä 542) - näyte C vastaa BIOTECHNOLOGY GENERALia (erä B-25) 41 104973 - rautapitoisuus määritettiin n. 0,5 g:11a ainetta, joka oli kalsinoitu platinavalupadassa ja jäännös oli liuotettu uudelleen HN03:een 0,1M.

- fraktion HA-1 puskuroitujen isotonisten, fysiologisen pH- 5 arvon omaavien liuosten stabiliteetti. luonnollisesti vanhentuneina ja lämpöstabiloituina, määriteltynä analysoimalla rajaviskositeettiluku ja ilmaistuna keskimääräisen molekyylipainon vastaavalla laskulla, alle seuraa-vien arvojen: 10 - 97 % alkuarvosta (varastointi 25 °C:ssa 6 kuukauden ajan), - 75 % alkuarvosta (sterilointi 118 °C:ssa 32 minuutin kuluessa) , - 80 % alkuarvosta (sterilointi 121 °C:ssa 16 minuutin ku- 15 luessa), - 90 % alkuarvosta (sterilointi 124 °C:ssa 8 minuutin kuluessa).

Vertaileva tutkimus suoritettiin HA-1:n fysiologisen pH-arvon 20 omaavan isotonisen puskuroidun liuoksen ja kaupallisesti saatavien hyaluronihapon vastaavien liuosten välillä stabiliteetin määrittämiseksi seuravissa olosuhteissa: - luonnollinen vanheneminen (varastointi 6 kuukauden ajan huoneen lämpötilassa), 25 - lämpösterilointi erilaisissa olosuhteissa.

Käytettiin farmaseuttiseen käyttöön sopivia materiaaleja ja varusteita, jotnka ovat osoittautuneet luotettaviksi esitettyihin tarkoituksiin.

30 Näitä olivat etenkin: - värittömät lasipienpullot, joilla oli seuraavat ominaisuudet:

- lasi: tyyppi-1 boorisilikaattilasi (julkaisun Ph: Eur. II

35 ed. mukaisesti), - minimiainepaksuus: 0,90 mm, - maksimiainepaksuus: 1,00 mm, 42 104973 - halobutyylikumista valmistetut korkit, joilla oli seuraa-vat ominaisuudet: - elastomeerityyppi: klooributyyli, - inertti kuormitus: kaoliini, 5 - pigmentit: titaanidioksidi ja hiilimusta, - vulkanointiaine: sinkkioksidi, - päästöominaisuudet: julkaisun Ph. Eur. II ed. VI.2.3.1 mukaisesti, - alumiinia olevat repäisysulut, 10 - vettä injektiota varten (julkaisun Ph. Eur. II ed. mukai sesti) .

Käytetyt reagenssit olivat analyyttista laatua.

15 Sterilointiin käytettiin Fedegari-autoklaavia, malli FOF5

Superspectra.

Rajaviskositeettiluku määritettiin suspendointitason Ubbelho-de-viskosimetrillä 25 °C:ssa 0,15 M NaCl:ssa pH-arvossa 7.

20

Vastaava keskimääräinen molekyylipaino laskettiin Mark-Hou-wink-yhtälöllä (H. Mark: Z. Elektrochemie 40, 499, 1934; R. Houwink: J. Prakt. Chem. 157, 15, 1940).

25 Keskimääräiset molekyylipainot ilmaistiin prosenttimäärinä lähtöarvosta depolymerointitaipumusten analysoimiseksi paremmin. Saadut tulokset osoittavat (taulukot 8 ja 9), että HA-l:llä on parempi stabiliteetti (vähintään kaksi kertaa niin hyvä) kuin vertailunäytteillä (ks. taulukko 7), joilla 30 on merkittävästi suuremmat rautapitoisuudet kuin HA-l:llä.

104973 i 43 tn —^ r- 3 <*» o\° u r— <n m σι

I 1 '__ ---' V

3 h n h oo in Αί <0 X ΙΟ Φ CO O <0 H OM1MO >

•h W Αί ---- 0)H

<o in r- ^ r- xr in > Ovocncococ^ 0

c C

C Ή "H

QJ <0 <0 0 CO in rH CM

in a aj »1* cm in co a v»** •η -η Αί v - » ^ -hm n h >

e rH (MO ΠΙΟ W i—l H CO in VO CO

qj >i η σ> σι σι σν 3 >i c >i -P >1 0J Αί 3 a:

jC QJ c Ai QJ

CiHd) -H rH U H CM O) in 10 O C (OO ' ' ' '

> g -H > g Η Γ- O VO CM

:(0 oooo r- in in vo c 3 Jh OOOO C 3

Q) r-H d) rH γΗ H r( *H rH

v) φ a co)· h +j 3 c -p a

rHXJAi Ή si 3 OOOO

I—I Ή rH Ο -H Ai OOOO

O fO i4j iHiOrHrHrHrHr-1 C > -H > <

c P

o a) 3 -p I—( in υ σι cm r> vo · &i x m m co co ·· cp h ui h mn

•H \ Ai ---- ·Η W rH rH

4J rH O (JUO 'f -P rH H

4-1 TJ VO CN rH 4-1 Ό Q) v- (U x-

QJ (U

4-1 3 4J 3 η Αί •ΗΑίΟηνοΓ'ΐη r-H OX CO ri (\) H rH 3 - · - -

•H rH Αί ----- -H (—IH CO VO VO rH

J2*rH Ο Ο σ in J3-HM rH rH

(0 4-10 CM rH H (04-1

4-14-1 4-) 4J

W QJ in Q)

QJ C <D

C4-1QJ G 4-> U CM CM <Ή 01 ai-HG QJ-H ---- intn-rH in in μ r" ό vo o

X O :(0 σιχτο-ιη Αί O rH rH

0 Ai P ---- o Αί 3 in qj οοσιη 3 tn H -rl a (N rH H -H -H · >J > 3 J > a σι χί r- in * · (0 A! ro 3 - ·· -n ι-n · -I—i x o o σ\ m

CO (0 <3 01 (0 rH (M H H

K OS < O o Αί Αί Αί Αί

3 0) 3 QJ

rH 4J rHCCQU rH 4-1 rH < CQ U

3 >1 I 3 >i I

(0 :<0 »S3 (0 :iO

Eh 2 K Eh Z K

m o m o m o H rH (N CM Π 44 104973 jolloin - näytteet A, B ja C ovat samat kuin ne, joita käytettiin rautapitoisuuden määrittämiseksi, - jokaisen tuotteen n. 10 mg/ml:n liuokset 0,9 %:sessa p/t) 5 NaCl-liuoksessa fosfaattipuskurissa 0,002 M pH-arvossa 7,5 läpikävivät: a) luonnollisen vanhenemisen varastoitaessa niitä 6 kuukauden ajan huoneen lämpötilassa (25 °C) pimeässä suo- 10 rittamalla tarkastukset kolmen kuukauden välein (ks.

taulukko 8), b) steriloinnin autoklaavissa seuraavissa olosuhteissa: T = 118 °C 32 minuutin ajan (osoitettu merkillä Ie), - T = 121 °C 16 minuutin ajan (osoitettu merkillä 15 Ile), T = 124 °C 8 minuutin ajan (osoitettu merkillä IIIc), jolloin tarkastukset suoritettiin jokaisen tapahtuman alussa ja lopussa.

20

Esimerkki 2 - Menetelmä HA-l-fraktion valmistamiseksi ia sen vastaava karakterisointi

Kanan helttoja, joko tuoreena tai jäädytettynä (3000 g), 25 jauhetaan lihamyllyssä ja sitten ne homogenoidaan huolelli sesti mekaanisessa homogenisaattorissa. Saatu tahna käsitellään lasisäiliössä 4 tilavuusosalla 95 %:sta etanolia, joka sisältää 0,1 % p/t raudan kelatointiainetta.

30 1,10-fenantroliini (C.A.R.N. 66-71-7) tai sen dimetyylijoh dannaiset ovat esimerkkeinä käyttökelpoisista kelatointi- t aineista.

Käytettiin lasisäiliöitä ja spesifisiä rautakelatointiaineita 35 hyaluronihapponatriumsuolan depolymerointiprosessin välttämi seksi, jonka terässäiliöiden tai verijäännösten rautaionit muutoin saattaisivat aiheuttaa.

45 104973

Kanan helttoja käsitellään, kunnes rautaionien uuttaminen on päättynyt (instrumentaalinen kontrolli: kompleksin rautakela-tointiaineen absorbanssi asetoni- tai etanolifaasissa 1 cm:n kennoissa maksimiabsorption aallonpituudessa (510 nm, 1,10-5 fenantroliinin kohdalla korkeintaan 0,005 A.U.)

Edelleenpesuprosessi suoritetaan käyttämällä samoja tilavuus-määriä vedetöntä asetonia (tai etanolia) mahdollisen kela-tointiaineen jäännöksen poistamiseksi. Näitä käsittelyjä 10 suoritetaan, kunnes seuraavan testin "A" tulos on negatiivi nen.

- Testi "A": 5 ml asetoni- (tai etanoli-) faasia haihdutetaan kohtuullisen typpivirran avulla. Jäännös liuotetaan 15 5 ml:aan vettä ja absorbanssi mitataan kelatointiaineen maksimiabsorption aallonpituudessa.

Testiä pidetään negatiivisena silloin, kun absorbanssi on alle 0,1 A.U.

20

Lopullista reaktiotuotetta sekoitetaan 6 tunnin ajan 50 rpm:n nopeudella ja annetaan erottua 12 tunnin ajan, minkä jälkeen liuotin poistetaan ja heitetään pois.

25 Tätä uuttamisprosessia toistetaan, kunnes poisheitetty liuo tin on saavuttanut oikean kosteustason (Karl-Fischer-menetel- mä) .

Saatu aine sentrifugoidaan sitten ja sitä tyhjökuivatetaan 30 sopivassa lämpötilassa vähintään 8 tunnin ajan. Tämän proses sin saanto on n. 500 - 600 g kuivaa jauhetta.

300 g kuivaa jauhetta alistetaan sitten entsymaattiseen hajo-tusprosessiin käyttämällä 0,2 g sopivaa proteolyyttistä ai-35 netta (papaiini, pepsiini, trypsiini tai pronaasi) puskuroi dun vesipitoisen väliaineen avulla, joka sisältää fosfaatit-puskuria, käyttämällä kysteiinihydrokloridin määrää, joka 46 104973 tuottaa suhteen 20:0,01 - 20:1 kuivan jauheen suhteen. Tätä seosta sekoitetaan sitten 24 tunnin ajan 60 rpm:ssä vakiossa 60 - 65 °C:n lämpötilassa. Reaktion lopussa lisätään 60 g Celite®:ä ja sitten sekoitetaan vielä tunnin ajan. Saatua 5 seosta suodatetaan, kunnes saadaan kirkas neste.

45 g setyylipyridiniumkloridia lisätään sekoittaen 60 rpm:ssä. Seosta sekoitetaan 60 minuutin ajan, minkä jälkeen lisätään 50 g Celite®:ä.

10 Näin muodostunut sakka kootaan sentrifugoimalla ja suspendoi-daan NaCl:n 0,01 M liuokseen (5 litraa), joka sisältää 0,05 % setyylipyridiniumia.

15 Sekoitetaan 60 minuutin ajan 50 °C:ssa ja sitten saatetaan 25 °C:n lämpötilaan ja sakka sentrifugoidaan.

Pesutoimenpide toistetaan kolme kertaa. Sakka kootaan säiliöihin, joissa on 3 litraa natriumkloridin 0,05 M liuosta, 20 joka sisältää 0,5 % setyylipyridiniumkloridia.

Sekoitetaan 60 rpm:ssä 60 minuutin ajan ja sitten pidetään vakiossa 25 °C:n lämpötilassa kahden tunnin ajan. Kirkas ylempi faasi poistetaan sentrifugoimalla.

25

Toimenpide toistetaan kahdesti 0/1 M natriumkloridin liuoksilla, jotka sisältävät 0,05 % setyylipyridiniumkloridia.

Seos sentrifugoidaan ja ylempi faasi heitetään pois. Sakka dispergoidaan natiumkloridin 0,30M liuokseen, joka sisältää 30 0,05 % setyylipyridiniumkloridia (3 litraa).

Seosta sekoitetaan ja sekä sakka että kirkas neste kootaan. Sakka uutetaan toisen· kerran käyttämällä 1,5 litraa samaa vesiliuosta.

35

Kirkkaat nesteet kerätään yhteen ainoaan säiliöön ja alistetaan molekyyliultrasuodatukseen kalvojen läpi, joiden 47 104973 molekyylisulkuraja on 30.000 daltonia, jolloin tapahtuu kon-sentrointi kolmasosaan alkuperäisestä tilavuudesta.

Konsentroitu liuos käsitellään makromolekyylisellä Dowex® M-5 15-ioninvaihtohartsilla, joka saadaan tetrabutyyliammoniumin (TBA+) muodossa, ja sekoitetaan yön ajan.

Suspensioon lisätään sopiva määrä N-metyylipyrrolidonia, niin että saadaan NMP-H20-suhteeksi 70/30 t/t. Seos suodatetaan 10 sitten ja hartsi poistetaan.

Sopiva määrä NaCl:a lisätään sitten liuokseen ja saatetaan pH-arvoon > 7,5 1 M NaOH:lla ja sitten tämä pestään kahdesti metyleenikloridilla (CH2C12) , jolloin alempi faasi heitetään 15 pois joka kerta. Ylempi faasi saostetaan sekoittamalla 60 rpm:ssä 25 °C:n lämpötilassa kolmella tilavuusmäärällä etanolia (95 %:sta).

Sakka kerätään sentrifugoimalla ja ylempi faasi heitetään 20 pois.

Sakka kerätään ja pestään, ensin 75 %:sella etanolilla, sitten absoluuttisella etanolilla ja lopuksi asetonilla.

; 25 Pestyä tuotetta tyhjökuivatetaan vähintään 20 tunnin ajan 25 °C:n lämpötilassa. Kuivatettu tuote liuotetaan veteen kään-teisosmoosilla, jolloin saadaan liuos, joka on > 1 mg/ml. Sopiva määrä natriumkloridia lisätään, jotta saadaan mooli-suudeksi 0,1 - 0,4, ja sitten tehdään alkaliseksi 1 M 30 NaOH:lla. Sitten liuos suodatetaan sterilointisuodattimien läpi.

Liuos saostetaan sekoittaen (60 rpm) 25 °C:n lämpötilassa kolmella tilavuusosalla etanolia (95 %:sta).

35

Sakka kootaan sentrifugoimalla ja ylempi faasi heitetään pois.

48 104973

Sakka kerätään ja pestään, ensin 75 %:sella etanolilla, sitten absoluuttisella etanolilla ja lopuksi asetonilla.

Pestyä tuotetta tyhjökuivatetaan vähintään 50 tunnin ajan 25 5 °C:n lämpötilassa.

Näin valmistetun tuotteen molekyylipaino on 1.180.000. FARMASEUTTISTEN VALMISTEIDEN ESIMERKKEJÄ 10

Seuraavat esimerkit esitetään tässä ainoastaan mahdollisten farmaseuttisten valmisteiden havainnollistamiseksi, joita voidaan soveltaa fraktion HA-1 terapeuttisessa käytössä: 15 Valmiste 1: 2 ml:n ampullit jokainen ampulli sisältää: hyaluronihapponatriumsuolaa (HA-1) mg 24,0 yksiemäksistä natriumfosfaattia 2 H20 mg 0,1 kaksiemäksistä natriumfosfaattia 12 H20 mg 1,2 20 natriumkloridia mg 17,0 vettä injektiota varten ad ml 2,0

Valmiste 2: steriilit, valmiiksi täytetyt 1,1 ml:n ruiskut, jokainen ruisku sisältää: 25 hyaluronihapponatriumsuolaa (HA-1) mg 20,0 natriumkloridia mg 9,350 yksiemäksistä natriumfosfaattia 2 H20 mg 0,055 kaksiemäksistä natriumfosfaattia 12 H20 mg 0,660 vettä injektiota varten ad ml 1,1 30

Valmiste 3: 0,2 ml:n yksittäisannossäiliöt jokainen säiliö sisältää: hyaluronihapponatriumsuolaa (HA-l) mg 400,0 natriumkloridia mg 440,0 35 yksiemäksistä natriumfosfaattia 2 H20 mg 5,0 kaksiemäksistä natriumfosfaattia 12 H20 mg 60,0 vettä injektiota varten ad ml 100,0 49 104973

Valmiste 4: 0,2 ml:n yksittäisannossäiliöt jokainen säiliö sisältää: hyaluronihapponatriimsuolaa (HA-1) mg 200,0 natriumkloridia mg 670,0 5 kaliumkloridia mg 250,0 yksiemäksistä natriumfosfaattia 2 H20 mg 5,0 kaksiemäksistä natriumfosfaattia 12 H30 mg 60,0 vettä injektiota varten ad ml 100,0 10 Valmiste 5: 5 ml:n pullot jokainen pullo sisältää: hyaluronihapponatriumsuolaa (HA-1) mg 200,0 natriumkloridia mg 670,0 kaliumkloridia mg 250,0 15 yksiemäksistä natriumfosfaattia 2 H20 mg 5,0 kaksiemäksistä natriumfosfaattia 12 H20 mg 60,0 natriumetyyli-elohopeatiosalisylaattia mg 5,0 vettä injektiota varten ad ml 100,0 20 Kun keksintöä on nyt selitetty näin, lienee selvää, että sitä vaihdella monin tavoin. Tällaisia vaihteluita ei tule pitää poikkeamana keksinnön hengestä ja puitteista, kuten lienee selvää alan ammattihenkilölle, ja niiden katsotaan kuuluvan seuraavien patenttivaatimuksien piiriin.

Claims (5)

104973

1. Menetelmä sellaisen terapeuttisesti käyttökelpoisen hyalyronihappofraktion tai sen suolan puhdistamiseksi, jonka 5 keskimääräinen molekyylipaino on 750.000 D - 1.230.000 D ja jolla on seuraavat ominaisuudet: a) rajaviskositeettiluku, joka on 14,5 - 21 dl/g määritettynä 25 °C:ssa 0,15 M NaCl:ssa pH-arvossa 7 käyttämällä suspendointitason Ubbelhode-viskosimetriä, 10 b) proteiinipitoisuus alle 0,2 % albumiinina ilmaistuna, c) UV-absorbanssi 257 nm:ssä ja 280 nm:ssä alle 1,0 A.U. mitattuna 1 %:sella p/t vesiliuoksella, d) 1 %:sen p/t liuoksen dynaaminen viskositeetti 0,15 NaCl:-ssa pH-arvossa 7,0 alle seuraavien rajojen määritellyissä 15 leikkausmäärissä käyttämällä rotaatioviskosi-metriä 20 °C:n lämpötilassa: Leikkausnopeus Dynaaminen viskositeetti (mPa 20 °C:ssa) 1 s'1 alle 20.000 mPa 20 10 s'1 alle 2.000 mPa 100 s'1 alle 1.000 mPa 350 s'1 alle 500 mPa e) sulfatoidun mukopolysakkaridin pitoisuus alle 0,07 % rik- 25 kinä, f) rautapitoisuus, joka ei yli 10 ppm, ja g) fraktion fysiologisen pH-arvon omaavien isotonisten puskuroitujen liuosten stabiliteetti, luonnollisesti vanhentuneina ja lämpösteriloituina, määritettynä analysoimalla 30 rajaviskositeettiluku ja ilmaistuna keskimääräisen mole- kyylipainon vastaavalla pienenemisellä, alle seuraavien rajojen: 97. alkuarvosta (varastointi 25 °C:ssa 6 kuukauden ajan) , 35 - 75 % alkuarvosta (sterilointi 118 °C:ssa 32 tunnin kuluessa, - 80 % alkuarvosta (sterilointi 121 °C:ssa 15 minuutin 104973 kuluessa), 90. alkuarvosta (sterilointi 124 °C:ssa 8 minuutin kuluessa). tunnettu siitä, että 5. hyaluronihappo uutetaan eläinten elimistä ensimmäisellä orgaanisella liuottimena rautaa kelatoivan aineen läsnäollessa, - tämä hyaluronihappoa sisältävä uute käsitellään proteo-lyyttisellä aineella, 10. jossain edellä olevassa vaiheessa saatu liuos steriloi daan bakterisidilla ja eri molekyylimassojen omaavat hyaluronifraktiot tai vastaavat suolat erotetaan tai ei-toivutut fraktiot erotetaan molekyyliultrasuodatuk-sella, 15. näin käsitelty hyaluronihappoa sisältävä uute käsitel lään happamalla ioninvaihtimellä, joka on kvaternaari-sen ammoniumsuolan muodossa, - uute liuotetaan ioninvaihtimesta toiseen orgaaniseen liuottimeen, joka pystyy liuottamaan hyaluronihapon 20 kvaternaarisen ammoniumsuolan, - saatu seos käsitellään natriumhalogenidilla hyaluronihapon kvaternaarisen ammoniumsuolan muuntamiseksi vastaavaksi natriumsuolaksi, ja - hyaluronihapon haluttu natriumsuola eristetään. 25

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan hyaluronihappofraktio, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 925.000 - 1.230.000.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valmistetaan fraktio, joka on oleel-. lisesti vapaa hyaluronihappomolekyyleistä, joiden molekyyli- paino on 30.000 D tai tätä pienempi.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hyaluronihapon natriumsuola alistetaan molekyyli-suodatukseen kalvolla, jonka molekyylisulkuraja on 30.000 D. 104973

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että a) uutetaan orgaaninen materiaali kanan heltoista uutta-misliuottimella, joka käsittää asetonia tai etanolia ja 5 sisältää lisäksi fenantroliinia tai sen dimetyylijoh- dannaista uutteen muodostamiseksi, joka on olennaisesti vapaa rautaioneista, b) tämä uute käsitellään proteolyyttisellä aineella, jona on papaiini, pepsiini, trypsiini, pronaasi tai kyse- 10 tiinihydrokloridi, c) näin käsitelty uute saatetaan kosketuksiin pylvään kanssa, joka on täytetty sulfonihappohartsilla tetra-butyyliammoniumsuolan muodossa, d) pylväs eluoidaan, jolloin saadaan liuos, joka sisältää 15 hyaluronihapon tetrabutyyliammoniumsuolaa, e) liuos kuivatetaan, jolloin saadaan jäännös, joka käsit tää hyaluronihapon tetrabutyyliammoniumsuolaa, f) jäännös liuotetaan aproottiseen liuottimeen, g) suodatetaan vaiheen f) liuos, 20 h) pestään vaiheen (g) liuos metyleenikloridilla, i) käsitellään vaiheen (h) liuos natriumhalogenidilla nat-riumhyaluronaatin tuottamiseksi, j) saostetaan natriumhyaluronaatti, k) liuotetaan sakka veteen ja alistetaan liuos dialyysiin, 25 1) käsitellään dialysoitu liuos natriumhyaluronaatin !" saostamiseksi ja m) alistetaan sakka molekyylisuodatukseen kalvolla, jonka molekyylisulkuraja on 30.000 D, liuoksen tuottamiseksi, joka sisältää hyaluronihapon natriumsuolaa, jonka mole-30 kyylipaino on 750.000 - 1.230.000. « > a 53 104973