SK280191B6 - Frakcia kyseliny hyalurónovej, spôsob výroby frakc - Google Patents

Description

Vynález sa týka frakcie kyseliny hyalurónovej alebo jej soli, spôsobu výroby frakcie hyaluronátu sodného a farmaceutického prostriedku na ich báze. Frakcia podľa vynálezu je použiteľná predovšetkým v očnej chirurgii.

Doterajší stav techniky

Kyselina hyalurónová (HA) jc typickým a významným predstaviteľom skupiny biologických makromolekúl, známych ako glykozaminoglykány (mukopolysacharidy). HA je biologický polymér, prítomný v identickej molekulárnej štruktúre vo všetkých spojivových tkanivách organizmov stavovcov, kde hrá štruktúrnu a biologickú úlohu vtom zmysle, že jej miestne koncentrácie sú v prísnej korelácii s tónom, trofizmom a obnovou tkaniva v prípade poranenia. Súhrn fyziologického pôsobenia týchto biologických látok je uvedený v Phys. Rev. (Comer W.D., Laurent T.C.: Physiological funetion of connective tissue polysaccharides. Phys. Rev., 58, (1), 255-315, 1978). Fyzikálne-chemicky ide pri HA o sacharidový biopolymér (kyseliny D-glukurónovej a N-acetylglykozamínu), polymerizovaný alternujúcim spôsobom, tvoriaci dlhé, ne vetvené molekulové reťazce s rôznou molekulovou hmotnosťou, dosahujúcou maximum 8,000,000 Dalton (Meyer K.: Chemical Structure of Hyaluronic Acid. Fed. Proceed. 17, 1075, 1958; Laurent T.C.. Chemistry and Molecular Biology of Intracellular Matrix. 703-732, Aacademic Press N.Y., 1970). Správanie tohto biopolyméru vo vodnom roztoku zaručuje určitú viskozitu, nazývanú viskoelasticita, ktorá je typická pre určité biologické tekutiny, ako je kĺbový mok a sklovec, kde je HA prítomná v koncentrácii 0,12 až 0,24 % (Balasz E.A. a ď.: Hyaluronic acid and replacement of citreous and aqueous humor. Mod. Probl. Ophtal., 10, 3-21, 1972). Zistilo sa, že aj komorová voda ľudského pôvodu obsahuje HA a to v priemernej koncentrácii 1,14 pg/g (Laurent U.B.G.: Haluronate in human aqueous humor. Árch. Ophthalmol., 101, 129-130, 1983).

Bolo publikované množstvo dôkazov o tom, že miestna zásoba exogénnej HA má zreteľný terapeutický a ochranný účinok na rôzne patologické stavy spojivových a epiteliálnych tkanív, ako je

- znížená regenerácia tkaniva pri nehojacich sa kožných vredoch,

- artritická degenerácia kĺbového spojivového tkaniva,

- stavy vyplývajúce z očnej chirurgie.

Veľmi významná je možnosť, poskytovaná viskoelastickým charakterom HA, poťahovať tkanivá vystavené nebezpečenstvu poškodenia pri chirurgickej manipulácii. Podľa údajov všetkých chirurgov, ktorí HA použili, vykonáva prítomnosť viskóznej vrstvy exogénnej HA na tkanivách, ktoré sú najviac vystavené traumatizujúcemu náhodnému kontaktu, účinný ochranný vplyv, ktorý je vo veľmi pozitívnej miere reflektovaný v úspešnej realizácii operácie.

Ochranný účinok a uľahčenie opráv tkaniva, umožnené exogénnou HA na rohovke, boli dokázané tak na pokusných zvieratách (Miller D. a d’.: Use of Na-hyaluronate during intraocular lens implantation in rabbits. Ophthalmic Surgery, 8, (6), 58-61, 1977; Miller D. a d’.: Use of Nahyaluronate in autocorneal transplantation in rabbits. Ophthalmic Surgery, 11, (1), 19-21, 1980; Graue E.L. a d’.:

The protective effect of Na-hyaluronate to corneal endothelium. Exp. Eye Res., 31, 119-127, 1980; Ozaki L. a d’.: Protective effect of Healon-coated intraocular len on the corneal endothelium. Fólia Ophthalmologica Japonica, 32, 1301-1305, 1981), ako aj u človeka (Norm M.: Preoperative protection of cornea and conjunctiva. Acta Opthalmologica, 59, 587-594, 1981; Polack F.M. a d’.: Sodium hyaluronate (Healon) in keratoplasty and IOL implantation. Ophthalmology, 88,45-431, 1981).

Je známych niekoľko postupov prípravy čistenej kyseliny hyalurónovej a jej špecifických frakcií s vysokou čistotou na terapeutické použite, napríklad pri uvedených indikáciách.

Molekulárne frakcie integrálnych hyalurónových kyselín, získavané priamo extrakciou organických materiálov, napríklad slepačích hrebienkov, majú molekulovú hmotnosť, pohybujúcu sa v určitých medziach, napríklad od asi 90 až 80 do 0,2, výhodne medzi 5 a 0,2 % molekulovej hmotnosti integrálnej kyseliny. Tieto frakcie je možné získať z integrálnych kyselín pomocou hydrolyzačných alebo oxidačných alebo enzymatických chemických činidiel alebo fyzikálnych postupov, napríklad mechanicky alebo ožarovaním, a preto často pri týchto postupoch čistenia súčasne vznikajú primárne extrakty (pozri napríklad článok Balasz a ď. v „Cosmetics & Toiletries“, talianske vydanie č. 5/84. Str- 8-17). Delenie a čistenie získaných molekulárnych frakcií sa uskutočňuje známymi metódami.

Napríklad v patente US 4,141,973 je opísaný postup prípravy hyalurónových kyselín s molekulovou hmotnosťou aspoň 750.000 Dalton, ktoré je možné použiť, vzhľadom na ich špecifickú čistotu vysokého stupňa a absenciu zápalových účinkov, pri operácii oka. Postup spočíva v extrakcii sodnej soli HA z východiskového materiálu, odstránení zvyškov krvi z použitých zvieracích orgánov, deproteinizácii takto získaného extraktu, odstránení zápalových nečistôt, ošetrení produktu vo vodnom roztoku sterilizačným prostriedkom a vyzrážaní soli kyseliny hyalurónovej z vodného roztoku organickým rozpúšťadlom. Zvyšky krvi sa odstraňujú etanolom, HA, vo forme svojej sodnej soli (čo je forma, v ktorej sa nachádza vo východiskovom materiáli), sa extrahuje vodou, deproteinizácia sa uskutočňuje pôsobením zriedených kyselín a súčasnou extrakciou hydrolyzovaných častí chloroformu alebo pomocou proteolytických enzýmov, škodlivé zápalové látky sa odstraňujú extrakciou chloroformom pri pH 6 až 7 a sterilizácia sa uskutočňuje pôsobením cetylpyridíniumchloridu. Týmto postupom sa získa jediná frakcia kyseliny hyalurónovej, konkrétne opísaná v uvedenom patente, s molekulovou hmotnosťou 1,586,000 Dalton. Na základe chemických, fyzikálnych a biologických vlastností je možné usúdiť, že táto molekulárna frakcia kyseliny hyalurónovej zodpovedá obchodnému produktu, známeho pod ochrannou známkou „HEALON“.

Boli vyvinuté nové metódy, ako molekulová ultrafíltrácia. Týmto spôsobom čistenia je možné odstrániť frakcie HA s molekulovou hmotnosťou v oblasti horného alebo dolného okraja rozmedzia veľkosti molekúl. Napríklad v patente EPO č. 01238572 udelenom 25.7.1990 je opísaný postup získavania frakcii hyaluronátu sodného so strednou molekulovou hmotnosťou medzi 250.000 a 350.000 Dalton tak, že sa produkt priamo získaný extrakciou organického materiálu a nasledujúcou enzymatickou deproteinizáciou pomocou papínu podrobí dvom molekulárnym ultrafiltráciám cez membrány s vylučovacou medzou 30.000, to o

znamená membrány, ktoré zachytávajú len frakcie s molekulovou hmotnosťou nad 30.000. Zdá sa, že táto frakcionácia má význam na získanie produktu bez sekundárnych účinkov zápalovej povahy, keďže za tieto účinky sú zodpovedné frakcie s nízkou molekulovou hmotnosťou, napríklad okolo 30.000 Dalton. Po ďalšej molekulovej filtrácii pomocou membrán s vylučovacou medzou 200.000 (to znamená membrán, ktoré zachytávajú frakcie s molekulovou hmotnosťou 200.000 Dalton) sa ako produkt filtrácie získa frakcia (v patente nazývaná HYALASTINE) so strednou molekulovou hmotnosťou medzi 50.000 a 100.000 Dalton, zatiaľ čo podiel, ktorý zostáva na membráne, je tvorený frakciou hyaluronátu sodného so strednou molekulovou hmotnosťou medzi 500.000 a 730.000 (frakcia nazývaná HYALECTIN).

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je frakcia kyseliny hyalurónovej alebo jej soli, ktorej podstata spočíva v tom, že má strednú molekulovú hmotnosť ležiacu v rozmedzí 750 000 až 1 230 000 D a tieto charakteristiky:

a) limitné viskozitné číslo ležiace v rozmedzí 14,5 až 21 dl/g, merané pri 25 °C v 0,15 M chloride sodnom pri pH 7,0 pomocou Ubbelohdovho viskozimetra so zavesenou hladinou,

b) obsah bielkovín nepresahujúci 0,2 % vyjadrené ako albumín,

c) absorbancia UV pri 257 nm a pri 280 nepresahujúca 1,0 A.U., merané v 1 % vodnom roztoku,

d) dynamická viskozita 1 % roztoku v 0,15 M chloride sodnom pri pH 7,0 pomocou rotačného viskozimetra pri teplote 20 °C nepresahujúca tieto hranice pri definovanej šmykovej rýchlosti:

Šmyková rýchlosť Dynamická viskozita (mPa.s pri 20 °C) s'l nie viac ako 20 000 mPa.s lOs'l nie viac ako 2 000 mPa.s

100 s’l nie viac ako 1 000 mPa.s

350 s'l nie viac ako 500 mPa.s

e) obsah sulfátovaného mukopolysacharidu nepresahujúci 0,07 %, vyjadrené ako síra,

f) obsah železa nepresahujúci 10 ppm a

g) stabilita izotonických tlmených roztokov s fyziologickým pH frakcie, podrobených prirodzenému starnutiu a tepelnej sterilizácii, zistená stanovením limitného viskozitného čísla a vyjadrená zodpovedajúcim poklesom strednej molekulovej hmotnosti, ktorá nepresahuje tieto hranice:

- 97 % pôvodnej hodnoty (skladovanie pri 25 °C, 6 mesiacov)

- 75 % pôvodnej hodnoty (sterilizácia pri 118 °C, 32 min.)

- 80 % pôvodnej hodnoty (sterilizácia pri 121 °C, 16 min.)

- 90 % pôvodnej hodnoty (sterilizácia pri 124 °C, 8 min.).

Frakcia kyseliny hyalurónovej podľa vynálezu má výhodne strednú molekulovú hmotnosť medzi 925 000 a 1 230 000 D.

Predmetom vynálezu je ďalej spôsob prípravy uvedenej frakcie hyaluronátu sodného, ktorého podstata spočíva v tom, že

a) zo slepačích hrebienkov sa extrahuje organický materiál rozpúšťadlom, tvoreným acetónom alebo etanolom a ďalej obsahujúcim fenantrolín alebo jeho dimetylderivát, za vzniku extraktu s obsahom železa do 10 dielov hmotnostných na milión dielov hmotnostných,

b) na tento extrakt sa pôsobí proteolytickým činidlom, zvoleným zo skupiny zahrnujúcej papaín, pepsín, trypsin, pronázu a cysteínhydrochlorid,

c) takto ošetrený extrakt sa uvedie do styku s kolónou, plnenou živicou so skupinami kyseliny sulfónovej vo forme tetrabutylamóniovej soli,

d) kolóna sa eluuje s cieľom získať roztok, obsahujúci tetrabutylamóniovú soľ kyseliny hyalurónovej,

e) roztok sa eluuje s cieľom získať zvyšok, tvorený tetrabutylamóniovou soľou kyseliny hyalurónovej,

f) tento zvyšok sa rozpustí v aprotickom rozpúšťadle,

g) roztok zo stupňa f) sa prefiltruje,

h) roztok zo stupňa g) sa premyje metylénchloridom,

i) na roztok zo stupňa h) sa pôsobí halogenidom sodným za vzniku hyaluronátu sodného,

j) získaný hyaluronát sodný sa vyzráža alkoholom, výhodne etanolom,

k) zrazenina sa rozpustí vo vode a roztok sa podrobí dialýze,

l) na dialyzovaný roztok sa pôsobí s cieľom vy zrážať hyaluronát sodný alkoholom, výhodne etanolom,

m) roztok uvedenej zrazeniny sa podrobí molekulovej filtrácii cez membránu s vylučovacou medzou s molekulovou hmotnosťou 30 000 D za vzniku roztoku, obsahujúceho sodnú soľ kyseliny hyalurónovej s molekulovou hmotnosťou 750 000 až 1 230 000 D.

Ďalším predmetom vynálezu je farmaceutický prostriedok, obsahujúci ako účinnú zložku frakciu kyseliny hyalurónovej podľa nároku 1.

Predmetom vynálezu je aj uvedená frakcia kyseliny hyalurónovej na použitie v očnej chirurgii, všeobecne v odbore oftalmológie a špecificky pri operáciách zákalu alebo v prípade implantátov očnej šošovky.

Nasleduje bližší opis tohto vynálezu.

Frakcia podľa vynálezu umožňuje zaujímavé aplikácie v očnej chirurgii; produkt je výnimočne dobre tolerovaný, nie je zápalový a nespôsobuje pooperačné komplikácie. Ďalej je značne výhodný v tom, že môže byť po chirurgickom zákroku ponechaný in situ bez toho, aby viedol k pooperačným komplikáciám, ako je veľmi vysoký vnútroočný tlak a tak znižuje doterajšie obvyklé riziká, spôsobené manipuláciou pri jeho odstraňovaní. Táto nová frakcia čistej kyseliny hyalurónovej vo forme sodnej soli je v ďalšom opise označovaná ako „HA-1“.

Podľa objavu, na ktorom je založený vynález, je možné výhodne zasiahnuť do postupu čistenia integrálnych kyselín hyalurónových alebo ich solí, predovšetkým alkalických solí, ako je predovšetkým sodná soľ, prevedením týchto kyselín alebo solí na kvartéme amónne soli daného typu. Túto operáciu je možné uskutočniť v ktoromkoľvek stupni postupu čistenia. Keďže tieto kvartéme amónne soli sú ľahko rozpustné v určitých organických rozpúšťadlách, ako sú aprotické rozpúšťadlá, predovšetkým N-metylpyrolidón, môžu byť týmito rozpúšťadlami extrahované z vodnej fázy, pričom dochádza k ďalšiemu špeciálnemu čisteniu vzhľadom na doterajšie metódy, ktoré má zrejme za následok stupeň čistoty produktov, získavaných na konci postupu. Prevedenie hyalurónovej zložky na kvartéme amónne soli je možné uskutočňovať napríklad tak, že sa na vodný roztok sodnej soli, obsahujúcej ďalšie soli, predovšetkým chlorid sodný, pôsobí pri použití reaktora alebo kolóny, s obsahom makromolekulámeho sulfónového me niča iónov vo forme soli s kvartérnymi amónnymi bázami, čo môže byť napríklad živica DOWEX M-15, pripravená vo forme tetrabutylamónnej soli, získateľnej pôsobením kvartémych hydroxidov amónnych, napríklad tetrabutylamóniumhydroxidu, na sulfónovú živicu. Amónna soľ prechádza do eluátu a je z ionexu úplne vybraná s vodou. Tento vodný extrakt sa odparí do sucha a zvyšok, tvorený amónnou soľou polysacharidu, sa rozpusti vjednom z uvedených rozpúšťadiel a potom sa odfiltrujú nerozpustné pevné podiely.

Spôsob podľa vynálezu teda všeobecne spočíva v čistení kyseliny hyalurónovej alebo jednej z jej molekulových frakcií alebo jednej z jej solí prevedením na príslušnú kvartérnu amónnu soľ s nižšími (Ci_6)-alifatickými uhľovodíkovými zvyškami.

Ďalej spôsob spočíva v zhromaždení kvartérnej amónnej soli kyseliny hyalurónovej alebo jednej z jej molekulových frakcií v organickom rozpúšťadle, schopnom tieto soli rozpúšťať a potom sa z prefiltrovancho roztoku získa kyselina hyalurónová alebo jej molekulová frakcia vo forme kovovej soli a takto získané soli sa prípadne podrobia ďalšiemu čisteniu, napríklad už známym spôsobom.

Vynález sa teda týka použitia kvartérnych amónnych solí kyselín hyalurónových pri extrakcii polysacharidov tak zo zvieracích organizmov, ako aj z totálnych extraktov, pričom čistenie podľa vynálezu je možné uskutočňovať v ktoromkoľvek vhodnom stupni postupu vrátane operácií, pri ktorých sa uskutočňuje fragmentácia a delenie molekulových frakcií, aj počas celého ďalšieho spracovania týchto frakcií aj ďalšieho čistenia už izolovaných frakcii, buď čistých, alebo znečistených, tak novým, ako aj známym spôsobom.

Ako je uvedené, je možné prevedenie hyalurónového polysacharidu uskutočňovať v ktoromkoľvek vhodnom stupni procesu čistenia, pričom vhodný okamih v každom konkrétnom prípade môže určiť odborník v odbore podľa kritérií určovaných konkrétnou kombináciou rôznych známych krokov, ktoré boli zvolené. Tieto obvykle a známe stupne v podstate všeobecne zahrnujú:

1) extrakciu polysacharidu (obvykle a prevažne vo forme sodnej soli) zo zvieracích orgánov, dopredu rozomletých a homogenizovaných. Uskutočňuje sa obvykle organickým rozpúšťadlom, miešateľným s vodou, ako je alifatický alkohol alebo nižší (C].(i)-alifatický ketón, napríklad etanol alebo acetón.

2) odstránenie bielkovinových látok extrakciou vhodnými rozpúšťadlami alebo spracovaním vodného roztoku extraktu, získaného v stupni 1), proteolytickým enzýmom, ako je papín, pepsín, trypsín alebo pronáza, v prítomnosti tlmivého roztoku, napríklad cysteínhydrochlorid-fosfátu.

3) dialýzu extraktu, získaného v stupni 1) alebo 2).

4) sterilizáciu roztoku, získaného v niektorom z predchádzajúcich stupňov, známym baktericidom, napríklad cetylpyridíniumchloridom v roztoku chloridu sodného. Táto operácia sa obvykle niekoľkokrát opakuje.

5) delenie frakcií hyalurónového polysacharidu alebo ich príslušných solí s rôznou molekulovou hmotnosťou alebo pripadne odstraňovanie nežiaducich frakcií, napríklad s okrajovými molekulovými hmotnosťami, tzn. s hodnotami príliš vzdialenými od deklarovaného rozmedzia veľkosti molekúl. Táto operácia sa výhodne uskutočňuje formou molekulovej ultrafiltrácie, napríklad známym spôsobom.

6) izoláciu vyčistenej frakcie alebo príslušnej soli (napríklad sodnej soli) z vodného roztoku zrážaním vhodným organickým rozpúšťadlom, napríklad alkoholom.

Poradie týchto stupňov, prípadne aj ďalších, už používaných v doterajšom stave techniky alebo vypracovaných odborníkmi v odbore, je možné značne obmeňovať. Špecifický stupeň vynálezu, to znamená vytvorenie soli s kvartérnymi amónnymi iónmi, je možné zaradiť ľubovoľne, výhodne v tej fáze, keď je možné očakávať najväčší technologický efekt.

Amónna soľ polysacharidového komponentu môže byť z ionexovej živice odstránená priamo uvedenými rozpúšťadlami, ktoré sú schopné túto soľ rozpúšťať a ich príklady sú uvedené, ale výhodne sa amónna soľ extrahuje najprv vodou a potom sa odparí do sucha. Takto izolovaná amónna soľ sa vyberie do uvedených rozpúšťadiel a roztok sa potom prefiltruje.

Jeden z konkrétnych spôsobov realizácie postupu podľa vynálezu vyplýva zjeho zaradenia do kombinácie uvedených operácií v uvedenom poradí medzi stupne 2) a 3). Okrem známych metód čistenia a špecifického stupňa podľa vynálezu, to znamená prevedenia kovových solí kyseliny hyalurónovej na kvartérne amónne soli, je podľa ďalšieho výhodného znaku vynálezu možné použiť chelatačné činidlá pre ióny železa, výhodne v uvedenom stupni 1). Vie sa totiž, žc ióny železa, vždy prítomné v originálnych extraktoch kyseliny hyalurónovej pochádzajúce zo zvyškov krvi z použitých zvieracích orgánov, spôsobuje depolymerizáciu polysacharidového reťazca. Odstránenie kovových iónov sa ukazuje ako veľmi významné na získanie frakcií kyseliny hyalurónovej s relatívne vysokou molekulovou hmotnosťou, a to je možné dosiahnuť chelatáciou. Týmto spôsobom je možné nielen získať kyseliny hyalurónové alebo ich soli s vysokou molekulovou hmotnosťou, ale tiež veľmi čisté produkty, ktoré sú stabilné vo vodných roztokoch vďaka úplnej absencii uvedených iónov železa.

Výhodným predmetom vynálezu je teda spôsob spočívajúci v tom, že sa zvieracie orgány, obsahujúce kyselinu hyalurónovú a/alebo niektorú jej soľ, extrahujú organickým rozpúšťadlom, miešateľným s vodou, v prítomnosti chelatačného činidla pre ióny železa, operácia sa opakuje do vymiznutia iónov železa, vysušený zvyšok sa vyberie do vodného tlmivého roztoku a roztok, dopredu zbavený všetkých pevných zvyškov, sa nechá prejsť cez menič iónov, tvorený makromolekulovou sulfónovou živicou vo forme kvartérnej amónnej soli s nižším (C].(j(-alifatickým zvyškom. Eluát, odťahovaný z meniča iónov, sa potom vysuší a rozpustí v organickom rozpúšťadle, schopnom rozpúšťať kvartérne amónne soli kyselín hyalurónových a ich frakcie. Amónna soľ sa potom prevedie na sodnú soľ prídavkom vodného roztoku halogenidu sodného, ako je chlorid alebo bromid sodný, k organickému roztoku. Takto získaný vodný roztok sodnej soli sa potom extrahuje organickými rozpúšťadlami, nemiešateľnými s vodou a prípadne sa podrobí opakovanej dialýze. Na získaný roztok sa potom pôsobí sterilizačným prostriedkom a roztok získaný po sterilizácii je potom možné podrobiť ultramolekulovej filtrácii. Všetky nežiaduce frakcie hyalurónového polysacharidu sa potom kanalizujú a požadované frakcie hyaluronátu sodného sa izolujú známym spôsobom.

Rozpúšťadlami, vhodnými na rozpúšťanie kvartémych amónnych soli podľa vynálezu, sú aprotické rozpúšťadlá, medzi ktoré patria N-alkylpyrolidóny, predovšetkým N-metylpyrolidón, dialkylsulfoxidy, dialkylkarboxylamidy, ako sú predovšetkým nižšie (C]_g) dialkylsulfoxidy, predovšetkým dimetylsulfoxid a nižšie (Cj.g) dialkylamidy nižších (C ]_g) alifatických kyselín, ako je dimetyl alebo dietylformamid alebo dimetyl- alebo diacetylacetamid.

Tetraalkylamónnymi bázami, používanými na prípravu ionexovej živice a teda charakteristických amónnych solí kyseliny hyalurónovej, podľa vynálezu, sú bázy s nižšími alifatickými zvyškami, výhodne alkyly s 1 až 6 atómami uhlíka. Prednostne sa používa živica vo forme soli s tetrabutylamónnym iónom.

V uvedených kombináciách, používaných pri postupoch extrakcie, čistenia a izolácie kyselín hyalurónových, ich molekulárnych frakcií a solí a predovšetkým v kombinácii opísanej ako výhodný postup podľa vynálezu, je výhodné používať tieto činidlá:

a) na extrakciu východiskového materiálu, tvoreného zvieracími orgánmi: etanol alebo acetón,

b) ako chelatačné činidlo pre ióny železa: 1,10-fenantrolín alebo dimetylderivát,

c) ako ochranné prostriedky: prostriedky už uvedené,

d) ako rozpúšťadlo pre kvartérne amónne soli: N-metylpyrolidón alebo dimetylsulfoxid,

e) ako rozpúšťadlo na čistenie vodného extraktu sodnej soli, získaného z organického roztoku amónnych solí: metylénchlorid, etylacetát,

t) ako sterilizačné činidlo: cetylpyridíniumchlorid v prítomnosti fosfátového pufra,

g) ako organické rozpúšťadlo na vyzrážanie sodnej soli z vyčisteného vodného roztoku, prípadne po ultrafiltrácii: etanol.

V uvedených prípadoch je možné ďalej používať obmeny, ktoré môžu v ďalšom spracovaní prispievať k získaniu ešte čistejších finálnych produktov. Napríklad použitie sterilizačných činidiel uvedeného typu, to znamená kvartérnych amónnych solí s heterocyklickými jadrami, obsahujúcich alkyly s dlhým reťazcom (napríklad cetyl), ako je uvedený cetylpyridíniumchlorid, môže súčasne slúžiť ako čistiaci stupeň, keďže prídavkom týchto látok k roztoku hyaluronátu sodného vzniká zodpovedajúca amónna soľ s iónom kyseliny hyalurónovej. Tieto soli sa vo vodnom roztoku zrážajú a teda je týmto spracovaním možné získať pomocou opakovaného zrážania a premývania zrazenín s nasledujúcim rozpustením v roztoku chloridu sodného roztok hyaluronátu sodného, z ktorého sa izolujú ultračisteného produkty. Tieto produkty sú veľmi vhodné na použitie v očnej chirurgii.

Molekulová ultrafiltrácia sa uskutočňuje známym spôsobom. To znamená, že sa používajú membrány, ktoré zachytávajú napríklad frakcie s vyššou molekulovou hmotnosťou, napríklad na 200,000 a ak je to žiaduce, je možné oddelené frakcie získavať tak z filtrovaného produktu, ako aj z membrány. Veľmi zaujímavý spôsob uskutočňovania postupu podľa vynálezu spočíva v kombinácii uvedených chemických čistiacich operácií s molekulárnou ultrafíltráciou, ktorá odstraňuje hyalurónové frakcie s nízkou molekulovou hmotnosťou. Tieto frakcie sú uznávanou príčinou výskytu zápalových účinkov produktov na terapeutické ciele, ako jc uvedené v prípade frakcií opísaných v patente EPO č. 0,138572, udelenom 25.7.1990.

Ďalším výhodným predmetom vynálezu teda je uvedený postup, spočívajúci v detailnej kombinácii čistých operácii, kde je prípadne zaradená molekulová ultrafiltrácia s cieľom odstrániť frakcie s nízkou molekulovou hmotnosťou, predovšetkým frakcie s molekulovou hmotnosťou niž šou ako 30.000. Týmto postupom, presnejšie podrobným postupom podľa príkladu 1 a 2, sa získa frakcia hyaluronátu sodného, veľmi cenná z terapeutického hľadiska, ktorá, ako je uvedené, má označenie HA-1. Je veľmi zaujímavá z hľadiska použitia v očnej chirurgii.

Použitie produktu v očnej chirurgii

Kyseliny hyalurónové, opísané v literatúre a odporúčané na použitie pri operáciách oka, nespĺňajú kritériá absolútnej dokonalosti, predovšetkým vzhľadom na to, že nemôžu byť po chirurgickom zákroku, napríklad po operácii sivého zákalu, ponechané na mieste v dôsledku prítomnosti zvyškov alebo stôp zápalových látok a zložiek s príliš vysokou molekulovou hmotnosťou a teda s príliš veľkou viskozitou. Okrem toho môžu spôsobiť, ako je uvedené, nežiaduci a nebezpečný nárastočného tlaku.

Exogénna HA, zavádzaná počas chirurgického zákroku do prednej komory, by nemala mať negatívne účinky na pooperačný vnútroočný tlak, ani by nemala spúšťať zápalové pochody vo vnútroočnom prostredí. Prvý uvedený negatívny účinok bol opakovane opísaný v literatúre po použití HA s veľmi vysokou molekulovou hmotnosťou s veľmi vysokým stupňom viskozity (Binkhorst C.D.: Inflammation and intraocular pressure after the use of Healon in intraocular lens surgery. Am. Intra-Ocular Implant. Soc., J., 6, (4), 340-341, 1980: Pape L.G.: Intracapsular and extracapsular technique of lens implantation with Healon. Am. Intra-Ocular Implatn. Soc. J., 6, (4), 342-343, 1980; Passo M.S. a ď.: Intraocular pressure following cataract surgery using Healon. ARVO abstracts, 10, 10:45, 1981; Percival P.: Experiences with the Boberg Ans lens and sodium hyaluronate (Healonid). Trans. Ophtal. Soc. UK, 102, (2), 294-297, 1982; McRae S.M. a ď.: The effects of sodium hyaluronate, chondroitin sulphate, and methylcellulose on the comeal endothelium an intraocular pressure. Ann. J. Ophthalmol., 95, 332-241, 1983).

Tieto poznatky viedli k odporučeniu odstraňovať túto látku premytím fyziologickým roztokom po operácii. Berson a ď. (Berson F.G. a ď.: Obstruction of aqueous outflow by sodium hyaluronate in enucleate human eyes. Am. J. Ophthalmol., 95, 668-573, 1983) študovali mechanizmus tohto nepriaznivého javu na posmrtnom enukleovanom ľudskom oku a vyslovili domnienku, že základnou príčinou je mechanická obštrukcia fyziologického odtokového systému v prednej komore v dôsledku extrémnej viskozity zavedenej látky.

Frakcia hyaluronátu sodného, opísaná v Balazsovom patente US 4,141,973, s molekulovou hmotnosťou 1,586,000 (pozri stĺpec 13 citovaného patentu) je produkt, ktorý sa vzhľadom na svoje uvedené fyzikálne-chemické a biologické vlastnosti javí ako najlepší oftalmologický produkt na trhu. Je známy pod označením „Healon“; nie je však bez obsahu uvedených nevýhod. To znamená, že má v podstate príliš vysokú molekulovú hmotnosť a teda nevhodnú viskozitu na niektoré operácie oka.

Potvrdzuje to skutočnosť, že napriek tomu, že test, uvedený v citovanom patente (na meranie antiflogistického účinku) poskytuje priaznivé údaje, nie je možné Healon po chirurgickom výkone, napríklad po operácii sivého zákalu, ponechať na mieste, keďže by mohol spôsobiť pooperačné komplikácie, akou je nárast očného tlaku.

V patente US 4,920,104 Dale P. de Vore (uskutočnenom na Med Chem Products, Inc. Acton, Mass.) je opísaný a nárokovaný viskoelastický roztok hyaluronátu sodného vo fyziologickom roztoku, ktorý má kinematickú viskozitu 45.000 až 64.000 cSt a obsahuje hyaluronát sodný so strednou molekulovou hmotnosťou v rozmedzí 1,000.000 až 2,000.000 Dalton. Tento produkt je tiež deklarovaný na použitie pri chirurgických operáciách oka, kde je jeho aplikácia výhodnejšia ako v prípade iných prípravkov vzhľadom na menšie pooperačné vedľajšie účinky, predovšetkým pokiaľ ide o nárast pooperačného očného tlaku.

Tento produkt je však nutné po chirurgickom výkone odstraňovať, ako je zrejmé z tabuliek 2 a 3 v stĺpci 4 citovaného patentu, zatiaľ čo tabuľka 1 ukazuje, že pri ponechaní produktu na mieste po chirurgickom zákroku dôjde k nárastu očného tlaku.

Iná frakcia hyaluronátu sodného na použitie v oftalmológii je opísaná v európskom patente č. 0138572 a má strednú molekulovú hmotnosť v rozmedzí 500.000 až 730.000 Dalton (HYA-LECTIN). Je možné ju obvykle použiť na náhradu endobulválnych tekutín a používa sa takisto pri operáciách oka, napríklad v prípade sivého zákalu a očných implantátov. Existovala však potreba produktov s väčšou viskoelasticitou, schopných udržiavať počas chirurgického výkonu v prednej komore správne intervaly a tak vyrovnávať sklovcovú odpoveď a dosiahnuť účinný ochranný účinok na endookulárnu štruktúru bez nutnosti odstraňovania po chirurgickom výkone. Ako je zrejmé z uvedených skutočností, produkty s vyššou molekulovou hmotnosťou, opísané v literatúre a použité pri uvedených operáciách oka, museli byť vždy po chirurgickom výkone odstraňované. Podstata tohto vynálezu spočíva vo vypracovaní originálneho postupu na získanie frakcií hyaluronátu sodného s relatívne vysokou molekulovou hmotnosťou, zahrnujúceho prídavok chelatačného činidla pre ióny železa k extrakčnému roztoku, zabraňujúci depolymerizácii na nízkomolekulové frakcie, pričom získané frakcie neobsahujú nečistoty alebo frakcie, ktoré by znemožňovali ponechanie produktu v organizme. Nová frakcia HA-1 podľa vynálezu teda predstavuje zaujímavú novinku a veľký krok dopredu v doterajšom stave techniky.

Frakcia „HA-l“ podľa vynálezu, pripraviteľná postupom opísaným v príkladoch 1 a 2, má tieto charakteristiky: Viskozita: limitné viskozitné číslo ležiace v rozmedzí 14,5 až 21 dl/g, merané pri 25 °C v 0,15 M NaCl pri pH 7,0 Ubbelohdovým viskozimetrom so zavesenou hladinou. To zodpovedá priemernej molekulovej hmotnosti ležiacej v rozmedzí 750.000 až 1,230.000 Dalton (výhodne medzi 925.000 až 1,230.000 Dalton).

Obsah bielkovín: obsah bielkovín nepresahuje 0,2 % vyjadrené ako albumín, stanovené Lowryho testom (Lowry J. a ď.: Proteín Measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193,265-275, 1951).

UV spektrum: UV absorbancia pri 257 nm a pri 280 nm nepresahuje 1,0 A.U., merané v 1 % vodnom roztoku.

Dynamická viskozita: dynamická viskozita 1 % roztoku v 0,15 M NaCl pri pH = 7,0 nepresahuje pri definovaných šmykových rýchlostiach pri použití rotačného viskozimetra, napríklad opísaného v U.S. Pharmacopea XXII ed. (911), str. 1619, pri teplote 20 °C teito hranice.

Šmyková rýchlosť Dynamická viskozita (mPa.s pri 20 °C) 1 s'l nie viac ako 20 000 mPa.s s* I nie viac ako 2 000 mPa.s

100 s'l nie viac ako 1 000 mPa.s

350 s^-1 nie viac ako 500 mPa.s

Sulfátovaný mukopolysacharid: obsah neprevyšujúci 0,07 %, počítané ako síra, stanovené na zariadení s indukč né viazanou plazmou (ICP) pri použití vhodnej referenčnej látky.

Železo: obsah železa nepresahuje 10 ppm, stanovené atómovou absorbciou alebo metódou ICP.

Stabilita: stabilita izotonických tlmených roztokov s fyziologickým pH frakcie HA-1, podrobených prirodzenému starnutiu a tepelnej sterilizácii, stanovená určením limitného viskozitného čísla a vyjadrená ako zodpovedajúci pokles strednej molekulovej hmotnosti, nepresahuje tieto hranice:

- 97 % začiatočnej hodnoty (skladovanie pri 25 °C, 6 mesiacov)

- 75 % začiatočnej hodnoty (sterilizácia pri 118 °C, 32 min.)

- 80 % začiatočnej hodnoty (sterilizácia pri 121 °C, 16 min.)

- 90 % začiatočnej hodnoty (sterilizácia pri 124 °C, 8 min.).

Výhodné vlastnosti hyalurónovej frakcie HA-1 podľa vynálezu je dokázať týmito experimentmi:

Vnútroočná tolerancia frakcie HA-1 u opíc

CIEĽ

Tento test bol uskutočnený s cieľom zistiť oftalmologickú toleranciu u opíc po injekcii HA-1 do očného sklovca.

MATERIÁLY A METÓDY

1. Pokusný druh

Na štúdiu sa použilo šesť mladých dospelých opíc druhu Macaca fascicularis. Boli v dobrom zdravotnom stave a nemali detegované očné lézie.

Primáty boli zvolené na štúdiu preto, lebo sú považované za optimálne druhy na štúdium oftalmologickej tolerancie viskoelastických produktov, používaných v očnej chirurgii.

Makaky boli zvolené preto, že druh Douroucoulis, ktorý bol na štúdium oftalmologickej tolerancie používaný predtým, je teraz ohrozený a podlieha zákonnej ochrane.

2. Pokusné skupiny a príslušné ošetrenia Označenie skupín a veľkosti dávok

Opice boli ošetrené podľa tejto schémy:

číslo	veľkosť	miesto injekcie
zvieraťa	dávky (ml)	pravé oko	ľavé oko
1	0,5	fyziol. roztok	HA-1
2	0,5	HA-1	fyziol. roztok
3	0,5	fyziol. roztok	HA-1
4	0,5	HA-l	fyziol. roztok
5	0,5	fyziol. roztok	HA-1
6	0,5	HA-I	fyziol. roztok

3. Príprava a podávanie prostriedku

Ten deň, keď bol uskutočnený chirurgický výkon, boli opice anestetizované ketamínhydrochloridom s prídavkom pentobarbitalu sodného. Zrenice potom boli dilatované miestnou aplikáciou 1,0 % tropikamidu (Mydriacyl, Alcon Laboratories). Rohovka, spojivka, adnex a predný segment boli vyšetrené biomikroskopom so štrbinovou lampou a zadný segment nepriamym oftalmoskopom. Peripalpebrálne koža bola pripravená na chirurgický výkon dvojnásobným oplachom 0,5 % povidónovým jódom a sterilným fyziologickým roztokom. Bolo umiestené sterilné rúško a

SK 280191 Β6 viečkové spekulum a bulva boli stabilizované malými zubnými kliešťami. Boli použité ostré a tupé rezy cieľom vytvoriť spojovkový lalok s limálnym tvarom s dĺžkou približne 10 až 15 mm vo vzdialenosti približne 10 mm od vyššieho limbu a rovnobežne s ním. Rezy boli vedené cez spojivku a Tenonov vačok do episkléry. Lalok bol pripravený predným rezom do limbu a pretiahnutím spodného beľma cez pars piana. Približne 5 až 6 m od limbu bola umiestená sieťová sutura Vicyrl 7-0 (Ethicon) so zábermi v rozostupoch približne 3 mm.

Ihla, kalibrovaná na 25 ml, bola použitá na odsatie 0,5 ml sklovca (u dvoch zvierat bolo možné odsať len 0,4 ml): sklovec bol nahradený rovnakým objemom HA-1 (12 mg/ml) alebo sterilného fyziologického roztoku. Sieťová štruktúra bola zaistená proti úniku a spojovkový lalok bol vrátený na pôvodné miesto. Topicky bola nanesená antibiotická masť. V odsatom sklovci bolo uskutočnené pred podaním a približne 48 h po podaní počítanie sklovcových buniek pomocou hemacytometra.

4. Zistené údaje

Približne po 48 h po chirurgickom výkone boli zvieratá anestetizované a uskutočnené oftalmologické vyšetrenie. Anestézia, dilatácia a vyšetrenie boli uskutočnené opísaným spôsobom. Vyšetrenie bolo, s ohľadom na to, či bolo príslušné oko injikované HA-1 alebo kontrolnou látkou, uskutočňované naslepo. Parametre oka boli podľa štandardnej stupnice označené týmto spôsobom:

Spojovkový edém, injekcia a vylúčenie, rohovkový edém, hémy, bunky a rozšírenie:

= normálny +1 = ľahký +2 = mierny +3 = ťažký alebo intenzívny

Čírosť sklovca:

= číry = ľahký zákal - pozadie viditeľné = mierny zákal - pozadie sotva viditeľné = zákal - červený reflex pozadia = zákal - sivý reflex pozadia = pozadie neviditeľné

Oči boli pripravené po odsatí pomocou uvedeného povidónového jódového roztoku. Bolo umiestené viečkové spekulum a bulva bola stabilizovaná malým zubným držiakom. Sklovec (0,1 až 0,2 ml) bol odsatý priamo cez spojovku a bielko 6 mm od limbu vo vyššom temporálnom kvadrante. Dbalo sa na to, aby nebolo dotknuté miesto pôvodného zákroku. Spočítali sa zápalové bunky pomocou hemacytometra. Opäť bola topicky aplikovaná antibiotická masť.

VÝSLEDKY

Získané údaje (tabuľka 1) demonštrujú, že HA-1 bola veľmi dobre tolerovaná a nevyvolala významné podráždenie oka v porovnaní s kontrolnou látkou (fyziologickým roztokom).

Dve zvieratá v skupine fyziologického roztoku prejavili slabú infiltráciu vody do bunky a rozšírenie. Počet bielych krviniek kontrolného sklovca sa pohyboval medzi 10 a 60 bunkami na mm². Jedno oko po injekcii HA-1 prejavilo slabú infiltráciu vody do bunky a rozšírenie. Počet bielych krviniek sklovca sa u pokusných očí pohyboval od 0 do 30 buniek na mm².

Tabuľka 1. Očná tolerancia HA-1 (oproti fyziologickému roztoku)

	pravé oko	ľavé oko
čas (h)	0	48	0	48
spojivka -
edém	0/6	0/6	0/6	0/6
injekcia	0/6	0/6	0/6	0/6
vyprázdnenie	0/6	0/6	0/6	0/6
rohovka - edém	0/6	0/6	0/6	0/6
predná komora -
hémy	0/6	0/6	0/6	0/6
rozšírenie bunky	0/6	+ 1/6	0/6	+2/6
šošovka - zákal	0/6	0/6	0/6	0/6
sklovec -čírosť	0/6	0/6	0/6	0/6
počet buniek	0(1/6);	0(2/6);	0(2/6);	0-5-10
	10b,20	0 b,		15-30-60
	málo č.	(2/6)	málo č.	bielych* *
	(1/6);	10b	(2/6);
	10b,	(1/6);	10 b,
	mnoho	10 b	mnoho
	Č.	málo č.	č.
	(1/6);	(1/6)	(2/6)

0b málo č.

(3/6) pravé oko injikované 0,5 ml fyziologického roztoku ľavé oko injikované 0,5 ml HYALOFIL * - jedna hodnota pre každú opicu

Z porovnania s kontrolnými pokusmi s fyziologickým roztokom teda vyplýva, že v prípade intravitreálnej náhrady je HA-1 veľmi dobre tolerovaná očnými tkanivami.

Klinické skúšky účinnosti HA-1 oproti HEALONu pri chirurgickej extrakcii cxtrakapsulámej katarakty s implantáciou intraokulámej šošovky do zadnej komory.

CIEĽ

Ďalej opísané experimenty mali úlohu zistiť účinnosť a bezpečnosť HA-1 v porovnaní s popredným obchodne dostupným viskoelastickým materiálom (Healon) pri odstránení zákalu a implantácii intraokulámej šošovky pri dvoch klinických skúškach. Pri prvej klinickej skúške boli HA-1 aj Healon testované pri rovnakých experimentálnych podmienkach (odsatie po chirurgickom zákroku). Druhá skúška bola zameraná predovšetkým na bezpečnosť HA-1 s ohľadom na vzostup vnútroočného tlaku a počtu endoteliálnych buniek; pri tejto skúške (na rozdiel od prvej, kde boli obidva viskoelastické materiály po chirurgickom zákroku odsaté) nebola HA-1 po skončení chirurgického zákroku odstraňovaná, zatiaľ čo Healon bol z oka odsatý.

MATERIÁLY A METÓDY

1. Projekt vynálezu

Pri obidvoch skúškach boli použité náhodne vybrané paralelné skupiny, skrytý pozorovateľ (vyšetrenie uskutočňujú traja rôzni pracovníci) a bola skúmaná HA-1 oproti Healonu pri extrakcii extrakapsulámej katarakty s implantáciou intraokulámej šošovky do zadnej komory. Pre obidve skúšky prichádzali do úvahy pacienti s primárnou diagnózou senilnej katarakty a starší ako 18 rokov.

Pre prvú skúšku bolo získaných 217 pacientov a náhodné rozdelenie bolo uskutočnené približne v pomere 3 : : 1 (161 pacientov HA-1, 56 pacientov Healon). Po chirurgickom zákroku boli obidva viskoelastické materiály od7 saté. Čas experimentu zahŕňal predoperačné vyšetrenie, operačnú procedúru a okamžité pooperačné sledovanie. Vnútroočný tlak bol meraný 3 h po operácii a vyšetrenia bolo uskutočnené 1, 7 a 30 dní po operácii.

Pre druhú skúšku bolo použitých 91 pacientov a náhodne ošetrených HA-1 (45) alebo Healonom (46) v pomere približne 1:1. Pri tejto skúške nebola ΗΛ-1 po operácii odsatá, zatiaľ čo Healon bol odsatý rovnako, ako aj pri prvej skúške. Priebeh experimentu (a relatívny študijný materiál pre HA-1) bol rovnaký ako pri prvej skúške. Pooperačný vnútroočný tlak bol pri tejto skúške meraný 1, 3, 6 a 9 h po operácii (častejšie ako pri prvej skúške) a vyšetrenie bolo uskutočňované 1, 7, 30 a 90 dní po operácii. Skúška zahŕňala vyšetrenie spekulámym mikroskopom v základnom stave a 90 dní po operácii.

2. Analýza dát a štatistické metódy

Štatistická analýza bola použitá na stanovenie stredu a komparability ošetrovaných skupín (a = 0,10) a bezpečnosti a účinnosti (a = 0,05). Na vyhodnotenie dát boli použité Fisherove exaktné testy, t-testy, deskriptívna štatistika.

3. Testovaný súbor a jeho charakteristika

Bolo študovaných celkovo 308 pacientov, rozdelených takto:

1. skúška

	HA-1	Healon	celkovo
začiatočný stav	158	56	214
L deň	158	56	214
7. deň	158	56	214
30. deň	157	54	211
90. deň	-	-	-
2. skúška
	HA-1	Healon	celkovo
začiatočný stav	41	46	87
L deň	41	46	87
7. deň	39	45	84
30. deň	41	44	85
90. deň	42	43	85

Medzi jednotlivými ošetrovanými skupinami pri obdivoch skúškach neboli významné rozdiely z hľadiska demografického, lekárskeho alebo charakteristiky zákalu.

4. Chirurgický zákrok

Príprava a metódy: Zákrok bol uskutočnený štandardným chirurgickým postupom, používaným na danom pracovisku na nekomplikovanú extrakciu senilnej a zrelej extrakapsulárnej katarakty s transplantáciou intraokulámej šošovky do zadnej komory. Preoperatívna (profylaktická) medikácia, anestézia a ďalšie intraoperatívne medikácie boli uskutočňované štandardným postupom daného pracoviska, ale bez použitia očných antihypertenziv. Preincízny vnútroočný tlak bol čo najviac znížený pomocou Honanovho zariadenia, zariadenia „Super Pinky“ alebo manuálne. Viskoelastické látky (HA-1 a Healon) boli aplikované ďalej opísaným spôsobom.

Produkty boli po zákroku odstránené s výnimkou HA1, použitej pri druhej klinickej skúške, ktorá bola ponechaná na mieste.

HA-1 aj Healon boli dopravené do prednej komory s cieľom uľahčiť chirurgický postup a ochranu očných tkanív.

Prvá skúška: priemerné množstvo použitej HA-1 (0,568 ml s koncentráciou 12 mg/ml) bolo významne vyššie ako množstvo použitého Healonu (0,439 s koncentráciou 10 mg/ml), napriek tomu, že rozdiel bol 0,129 ml.

Druhá skúška: V priemernom množstve použitej viskoelastickej látky nebol významný rozdiel; v tomto prípade bolo priemerné množstvo 0,957 (HA-1) a 0,833 (Healon).

5. Hodnotenie

Pred chirurgickým zákrokom, počas neho a po ňom boli uskutočnené tieto skúšky:

a) predoperačné vyšetrenie, napríklad s cieľom zistenia

- ostrosti videnia (optimálna manifestácia), tonometria, metóda pachymetrie (pre hrúbku rohovky) a vyšetrenie štrbinovou lampou a oftalmoskopom,

- spekuláma mikroskopia (len druhá skúška): pomocou spekulámeho mikroskopu boli počítané endoteliálne bunky na 10 zvolených miestach v centre rohovky. Každý počet bol upravený príslušným faktorom s cieľom získať počet buniek na štvorcový milimeter a spriememený s cieľom získať reprezentatívny počet buniek na štvorcový milimeter.

b) pooperačné vyšetrenie, ako je

- vnútroočný tlak (tonometria), meraný:

- 3 h po operácii (prvá skúška)

- 1-3-6-9 h po operácii (druhá skúška)

-vyšetrenie oftalmoskopom a štrbinovou lampou, pachymetria, tonometria, spekuláma mikroskopia (posledná uvedená len pri druhej skúške na spočítanie endoteliálnych buniek) a meranie ostrosti videnia (pri kontrolných vyšetreniach) bolo uskutočňované:

- pri prvej skúške po 1-7-30 dňoch

- pri druhej skúške po 1-7-30-90 dňoch.

VÝSLEDKY

L Operačné hodnotenie - manipulačné vlastnosti použitých viskoelastických materiálov

Viskoelastické materiály boli hodnotené ako uľahčujúce implantáciu šošovky v porovnateľných pomeroch pre každú ošetrovanú skupinu pri obdivoch klinických skúškach.

2. Pooperačné komplikácie

2. a) Prvá klinická skúška

Ako je zrejmé z tabuľky 2:

- najväčšie percento komplikácií (u 7,9 % všetkých pacientov) sa vyskytovalo medzi operáciou a 1. dňom, menšie percento bolo zaznamenané 7. a 30. deň.

- 1. deň po operácii bol podiel pacientov ošetrených Healonom (14,3 %) a trpiacich komplikáciami 2,5-krát vyšší ako u pacientov ošetrených HA-1 (5,7 %). Tento rozdiel bol štatisticky významný (podľa Fisherovho dvojpolohového exaktného testu p = 0,079 y), rozdiely medzi 7. a 30. dňom neboli štatisticky významné (podľa Fisherovho dvojpolohového exaktného testu p>0,6). Komplikácie zahŕňali nárast vnútroočného tlaku na 30 mm Hg aj viac (7/158 = = 4,4 % pacientov ošetrených HA-1, 5/56 = 8,9 % pacientov ošetrených Healonom) a komeálny edém, iritídu, konjuktivitídu, hyfému, makulámy edém, únik z rany, krvácanie riasinkovej blany a podspojovky.

Ako je zrejmé z tabuľky 3, kde sú zaznamenané tonometrické hodnoty, získané pred a po operácii (po 3 h a 1 -7-30 dňoch):

- medzi ošetrenými skupinami neboli významné rozdiely vnútroočného tlaku, ale pacienti ošetrení Healonom mali vyšší vzostup stredného vnútrooíného tlaku po 3 h aj 1 dni a významne väčšiu štandardnú odchýlku vnútroočného tlaku po 1 dni ako pacienti ošetrení HA-1.

Vyšetrenie štrbinovou lampou, pachymetria (na hrúbku rohovky) a oftalmoskopom neukázalo rozdiely medzi obidvoma skupinami.

2. b) Druhá klinická skúška

- u mierne vyššieho podielu pacientov ošetrených Healonom (37,0 %) ako v prípade HA-1 (28,6 %) boli zaznamenané pooperačné komplikácie (tabuľka 4). Komplikácie zahŕňali vzostup vnútroočného tlaku (5/42 = 11,9 % pacientov ošetrených HA-1, 11/46 = 23,9 % pacientov ošetrených Healonom) a prípady hyfémy, úniku z rany, krvácanie sklovca, zakalenie zadného puzdra, oddialenie cievnatky, atrofie dúhovky a makulámeho edému.

- obidve ošetrené skupiny sa štatisticky nelíšili s ohľadom na stredný vnútroočný tlak, ani jeho variabilitu v základnom stave alebo v čase od 1. do 90. dňa (tabuľka 5). Počas prvých 9 h po operácii sa zdá, že Healon (odstránený z oka) a HA-1 (ponechaná na mieste) vyvolávajú distribúciu pooperačného vnútroočného tlaku, ktorá je primáme odlišná s ohľadom na štandardnú odchýlku. Pacienti ošetrení Healonom mali väčšiu štandardnú odchýlku a významne vyššiu strednú hodnotu 1 h po operácii, zatiaľ čo pacienti ošetrení HA-1 mali väčšie, ale len okrajovo významné štandardné odchýlky 6 a 8 h po operácii. 1 h po operácii malo 22,7 % pacientov ošetrených Healonom a 10 % pacientov ošetrených HA-1 vnútroočný tlak 21 mm Hg alebo viac. 6 a 9 h po operácii bola hodnota tlaku 21 mm Hg alebo vyššie porovnateľné podiely pacientov ošetrených HA-1 (73,2 % po 6 h a 65,0 % po 9 h) a Healonom (68,2 % po 6 h a 71,4 po 9 h).

- medzi obidvoma skupinami nebol zistený žiadny ďalší rozdiel pokiaľ ide o pozorovania zaznamenané pri prvej skúške. Významný rozdiel nebol zistený ani spekulámou mikroskopiou (počet endoteliálnych buniek, tabuľka 6).

3. Kvantitatívne závery

Meranie ostrosti videnia ukázalo, že účinnosť obidvoch viskoelastických látok je porovnateľná:

- pri prvej klinickej skúške nebol zistený významný rozdiel medzi podielom pacientov ošetrených Healonom (7,8 %) a HA-1 (84,7 %), ktorí dosiahli 30. deň ostrosť videnia 20/40.

- pri druhej klinickej skúške nebol zistený významný rozdiel medzi podielom pacientov ošetrených Healonom (73,9 %) a HA-1 (71,4 %), ktorí dosiahli 30. deň ostrosť videnia 20/40 alebo lepšiu. 90. deň boli ich podiely takmer zhodné.

Tabuľka 2. Pooperačné komplikácie: prvá klinická skúška

Pacienti	Pacienti	Pacienti
	s HA-1	s Healonom	celkovo
	N= 158	N=56	N = 2I4
	N (%)	N (%)	N (%)
1. deň
nie	149(94,3)	48(85,7)	197(82,1)
áno*	9(5,7)	8(14,3)	17(7,9)
7. deň
nie	153(98,1)	55(98,2)	208(98,1)
áno	3(1,9)	1(1,8ň	4(1,9)
30. deň
nie	154(98,1	52(96,3)	206(97,6)
áno	3(1,9)	2(3,7)	5(2,4)

* podiel pacientov ošetrených Healonom s komplikáciami je významne vyšší (podľa Fisherovho dvojpolohového exaktného testu p = 0,079 ako u pacientov ošetrených HA-1

Tabuľka 3. Stanovenie vnútroočného tlaku (tonometria, nim Hg): prvá klinická skúška Prechirurgia

skupina	N	stred	štand. odchýlka
celkovo	213	16,671	3,598
HA-1	157	16,682	3,747
Healon	56	16,643	3,176
ošetrená	N	stred	štand. odchýlka

skupina Vnútroočný tlak

po 3h
celkovo	176	18,077	7,760
HA-1	129	18,027	7,417
Healon	47	18,213	8,718
1. deň
celkovo	212	19,146	7,497
HA-1	157	18,580	6,865*
Healon	55	20,327	6,453
7. deň
celkovo	200	14,431	3,979
HA-1	148	14,468	4,147
Healon	52	14,327	3,491
30. deň
celkovo	207	15,002	3,730
HA-1	154	14,932	3,744
Healon	53	15,208	3,718

* štandardné odchýlky obidvoch ošetrených skupín 1. deň sú významne odlišné (podľa F-testu p = 0,0508)

Tabuľka 4. Pooperačné komplikácie: druhá klinická skúška

	Pacienti	Pacienti	Pacienti
	s HA-1	s Healonom	celkovo
	N = 42	N = 46	N =88
	N (%)	N (%)	N (%)
pooperačné
komplikácie
nie	30 (71,4)	29 (63,0)	59 (67,0)
áno	12(28,6)	17(37,0)	29 (33,0)

Tabuľka 5. Celková tonometrická štatistika podľa ošetrenia skupín

ošetrená	N	stred	štand. odchýlka
skupina
Prechirurgia
celkovo	86	15,256	3,365
HA-1	40	15,575	3,296
Healon	46	14,978	3,435

h po operácii

celkovo	84	12,167	9,937
HA-1	40	9,925*	7,430**
Healon	44	14,206	11,473
3 h po ope	:rácii
celkovo	84	23,012	14,244
HA-1	41	22,805	15,481
Healon	43	23,209	13,139

h po operácii

celkovo	85	27,318	12,200
HA-1	41	28,707	13,757***
Healon	44	26,023	10,542

h po operácii

celkovo	82	26,451	11,863
HA-1	40	27,050	13 449****
Healon	42	25,881	10,261
1. deň
celkovo	87	20,839	8,868
HA-1	41	21,805	9,474
Healon	46	19,978	8,301
7. deň
celkovo	84	14,381	5,411
HA-1	39	15,051	5,973
Healon	45	13,800	4,865
30. deň
celkovo	83	14,313	3,732
HA-1	40	14,825	3,761
Healon	43	13,837	3,683
90. deň
celkovo	80	13,138	3,252
HA-1	39	13,128	3,357
Healon	41	13,146	3,190
* Obidve	ošetrené	skupiny	sa významne odlišujú

s ohľadom na vnútroočný tlak (podľa t-testu p = 0,0442, upravené na nerovné odchýlky) ** Štandardné odchýlky ošetrených skupín sa významne odlišujú (podľa F-testu p = 0,0070) ***Štandardné odchýlky ošetrených skupín majú okrajovo významnú odlišnosť (podľa F-testu p = 0,0886) **** Štandardné odchýlky ošetrených skupín majú okrajovo významnú odlišnosť (podľa F-testu p = 0,0898)

Tabuľka 6. Súhrnná štatistika spekulárnej mikroskopie pre počítanie endoteliálnych buniek

ošetrená	N	stred	štand. odchýlka
skupina
Prechirurgia
celkovo	85	2283,1	451,24
HA-1	40	2234,6	433,72
Healon	45	2326,1	466,86
90. deň
celkovo	80	2158,1	505,73
HA-1	39	2068,2	585,52
Healon	41	2243,5	405,08

ZÁVERY

Výsledky dvoch opísaných klinických skúšok ukazujú vysokú účinnosť použitia HA-1 pri extrakcii a implantácii vnútroočnej šošovky. Predovšetkým sa ukázalo, že HA-1 je veľmi dobre tolerovaná. Tento produkt totiž vyvoláva menej (asi 2,5 krát) pooperačných komplikácii ako Healon, testovaný pri rovnakých podmienkach, to znamená, s odstránením látky po chirurgickom zákroku (ako je opísané v prvej klinickej skúške). Medzi pooperačnými komplikáciami je nutné brať do úvahy predovšetkým vzostup vnútroočného tlaku.

Je nutné upozorniť, že sa pri jednotlivých skúškach pooperačný stav pacientov, ošetrených jednak HA-1 a jednak Healonom, líšil, pokiaľ ide o vnútroočný tlak. Pri prvej skúške, pri ktorej bola po chirurgickom zákroku odstránená tak HA-1, ako aj Healon, sa v porovnaní s pacientmi ošetrenými HA-1 prejavil 1 deň po operácii u väčšieho počtu pacientov ošetrených Healonom vzostup vnútroočného tlaku nad 21 Hg. Pri druhej skúške, kde HA-I nebola po zákroku odstránená, zatiaľ čo Healon áno, boli pooperačné profdy vnútroočného tlaku u HA-1 porovnateľné.

Z uvedených skutočností vyplýva, že niektoré aspekty obidvoch viskoelastických produktov sú porovnateľné, ale s ohľadom na pooperačné komplikácie sa obidva líšia. Healon odstraňovaný z oka sa zdá byť spojený s väčším vzostupom vnútroočného tlaku ako HA-1-1 odstraňovaná z oka a HA-1 ponechaná na mieste prejavuje pooperačný vnútroočný profil porovnateľný s Healonom, odstráneným po zákroku.

Na základe týchto výsledkov je nutné zdôrazniť možnosť ponechania HA-1 na mieste bez vyvolania pooperačných komplikácii. Táto možnosť ponúka tieto významné výhody:

1. Zjednodušuje chirurgický postup vynechaním extrakcie produktu po zákroku.

2. Znižuje riziko komplikácií v dôsledku manipulácie (to znamená počas odsávania). Príkladmi takéhoto rizika sú traumy vplyvom chirurgických postupov a ich príslušných následkov.

Vynález sa takisto týka farmaceutických prostriedkov, obsahujúcich ako účinnú zložku novú molekulárnu fázu kyseliny hyalurónovej vo forme sodnej soli, HA-1, predovšetkým vo forme fyziologických roztokov s neutrálnych pH. Zvolená koncentrácia HA-1 je taká, aby sa dosiahol požadovaný stupeň viskozity, napríklad asi 300 mPa.s (pri 350 sl) aasi 10.000 mPa.s (pri 350 s^-').

Vynález sa tiež týka použitia novej frakcie hyaluronátu sodného HA-1 v očnej chirurgii, predovšetkým pri operáciách zákalu alebo v prípade implantátov šošoviek.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Postup získania frakcie HA-1 a jej relatívna charakterizácia

Slepačie hrebienky, buď čerstvé alebo zmrazené (3000

g), sa zomelú v mlynčeku na mäso a potom sa dôkladne homogenizujú v mechanickom homogenizátore. Získaná pasta sa umiestni do sklenenej nádoby s 1,0 objemami bezvodého acetónu alebo etanolu, obsahujúceho 0,1 % (hmotnosť/objem) špecifického chelatačného činidla pre železa.

Príkladom vhodného chelatačného činidla je 1,10-fenantrolín (C.A.R.N. 66-71-7) alebo jeho dimetylderiváty. Sklenená nádoba a chelatačné činidlo sa používajú na vylúčenie depolymerizácie sodnej soli kyseliny hyalurónovej, ktorá by inak mohla byť spôsobená iónmi železa z oceľových nádob alebo zvyškov krvi.

Slepačie hrebienky sa spracúvajú až do úplného odstránenia iónov železa (inštrumentálna kontrola: absorbancia komplexu železo-chelatačné činidlo v acetónovcj alebo etanolickej fáze v 1 cm kyvetách pri vlnovej dĺžke maximálnej absorpcie - 510 nm v prípade 1,10-fenantrolínu, nie viac ako 0,005 A:U).

Uskutoční sa ďalšie premytie rovnakým objemom bezvodého acetónu (alebo etanolu) s cieľom odstrániť všetky zvyšky chelatačného činidla. Toto spracovanie sa uskutoční až do negatívneho výsledku testu „A“.

Test „A“: 5 ml acetónovcj (alebo etanolickej) fázy sa odparí pomocou mierneho prúdu dusíka. Zvyšok sa rozpustí v 5 ml vody a zmeria sa absorbancia pri vlnovej dĺžke maximálnej absorpcie chelatačného činidla.

Výsledok testu sa považuje za negatívny, ak je absorbancia nižšia ako 0,1 A.U.

Konečný reakčný produkt sa 6 h mieša s rýchlosťou otáčania 50 min.‘l a nechá sa 12 h separovať a potom sa rozpúšťadlo prečerpá sifónom a vypustí.

Tento extrakčný postup sa opakuje až do dosiahnutia správnej hodnoty vlhkosti rozpúšťadla (Karl-Fischerova metóda).

Získaná látka sa potom odstredí a suší 5 až 8 H vo vákuu pri vhodnej teplote. Výťažok tohto postupu je asi 500 až 600 g suchého prášku.

300 g suchého prášku sa potom podrobí enzymatickému digerovanu s 0,2 vhodného proteolytického činidla (papaín, pepsin, trypsín alebo pronáza) v tlmenom vodnom prostredí s fosfátovým pufrom pri použití množstva cysteínhydrochloridu, poskytujúceho pomer k suchému prášku 20 : 0,01 až 20 :1. Táto zmes sa potom mieša 24 H s rýchlosťou otáčania 60 min.'l pri konštantnej teplote 60 až 65 °C. Celá hmota sa prídavkom 60 g Celí tu R ochladí na 25 °C a v miešaní sa pokračuje ešte hodinu.

Získaná zmes sa filtruje až do získania čírej kvapaliny.

Vodný roztok zriedený destilovanou vodou na 2 mg/ml sa vedie do kolóny, plnenej makromolekulovou ionexovou živicou DOWEX M-15, získanou v tetrabutylamónnej (TBA+) forme reakciou s hydroxidom tetrabutylamónnym.

Roztok, eluovaný z kolóny, sa odparí a vysušený zvyšok sa rozpustí vo vhodnom objeme N-metylpyrolidónu (alebo dimetylsulfoxidu) do koncentrácie 2 mg/ml.

Získaný roztok sa prefiltruje, ochladí na 4 °C a pridá sa rovnaký objem vody. Uskutoční sa trikrát po sebe premytie metylénchloridom a vždy sa vypusti spodná fáza. Na vrchnú fázu sa potom pôsobí bromidom sodným (NaBr v molárnom pomere ku kyseline hyalurónovej 3:1) pri 4 °C, vodný roztok sa vyzráža prídavkom 3 objemov etanolu a zrazenina sa niekoľkokrát premyje etanolom.

Zrazenina sa potom rozpustí vo vode a získaný roztok sa podrobí dialýze. Prídavkom chloridu sodného sa koncentrácia roztoku upraví na 0,1 Ma teplota sa upraví na 50 °C. Pri miešaní produktu rýchlosťou 60 min.'l sa pridá 45 g cetylpyridíniumchloridu. Táto zmes sa mieša 60 min. a potom sa pridá 50 g Celitu^R. Pri miešaní sa teplota produktu zníži na 25 °C a vzniknutá zrazenina sa oddelí odstredenim. Takto získaná zrazenina sa suspenduje v 0,01 M roztoku chloridu sodného (5 1), obsahujúceho 0,05 % cetylpyridíniumchloridu. Zmes sa mieša ďalších 60 min. pri 50 °C. Teplota sa zníži na 25 °C a zrazenina sa odstredí.

Postup premývania sa potom trikrát opakuje a zrazenina sa nakoniec zhromaždí do nádob, obsahujúcich 3 1 0,05 M roztoku chloridu sodného, obsahujúceho 0,05 % cetylpyridíniumchloridu. Táto zmes sa mieša 60 min. s rýchlosťou otáčania 60 min.'· a udržiava sa 2 H na konštantnej teplote 25 °C. Supernatant sa odstráni odstredením.

Postup sa niekoľkokrát opakuje s 0,1 M roztokom chloridu sodného, obsahujúceho 0,05 % cetylpyridíniumchloridu. Zmes sa odstredí a supernatant sa vypustí. Zrazenina sa disperguje v 0,30 M roztoku chloridu sodného, obsahujúcom 0,05 % cetylpyridíniumchloridu (3 : 1).

Zmes sa mieša a zhromaždí sa tak zrazenina, ako aj kvapalina. Na zrazeninu sa ešte trikrát opakovane aplikuje extrakcia, vždy s 0,5 1 rovnakého vodného roztoku.

Zvyšná zrazenina sa odstráni a číra kvapalina sa zhromaždí v jedinej nádobe. Teplota kvapaliny sa pri miešaní zvýši na 50 °C. Kvapalina sa potom chloridom sodným upraví na koncentráciu 0,23 M. Pridá sa 1 g cetylpyridiniumchloridu a pokračuje sa vmiešaní 12 h. Zmes sa ochladí na 25 °C a potom prefiltruje, najprv cez náplň CeIitu^R a potom cez filter (1 u).

Získaný roztok sa potom podrobí molekulovej ultrafiltrácii cez membrány s vylučovacou medzou 30.000, pričom sa ultrafiltrujú 3 pôvodné objemy s prídavkom 0,33 M roztoku chloridu sodného. Prídavok roztoku chloridu sodného sa suspenduje a objem kvapaliny sa zníži na štvrtinu pôvodného objemu.

Takto zahustený roztok sa pri miešaní (60 min.l) pri teplote 25 °C vyzráža troma objemami etanolu (95 %). Zrazenina sa oddelí odstredením a supernatant sa vypustí. Zrazenina sa rozpustí v 1 1 0,1 M roztoku chloridu sodného a postup zrážania sa opakuje s troma objemami 95 % etanolu.

Zrazenina sa zhromaždí a premyje sa, najprv 75 % etanolom (trikrát), potom absolútnym etanolom (trikrát) a tretí raz absolútnym acetónom (trikrát).

Takto získaný produkt (frakcia HA-1) má priemernú molekulovú hmotnosť ležiacu v rozmedzí 750.000 až 1,230.000 D (výhodne medzi 925.000 a 1,230.000).

Výťažok kyseliny hyalurónovej sa rovná 0,6 % pôvodného čerstvého tkaniva.

Konečný produkt, získaný opísaným postupom, má tieto charakteristiky:

-molekulová hmotnosť 1,00,000 D -limitné viskozitné číslo v rozmedzí 14,5 až 21 dl/g, merané pri 25 °C v 0,15 M NaCI pri pH 7,0 pri použití Ubbelohdovho viskozimetra so zavesenou hladinou. Zodpovedá priemernej molekulovej hmotnosti v rozmedzí 750.000 až 1,230.000 D (výhodne medzi 925.000 a 1,230.000).

-obsah proteínu nepresahujúci 0,2 % vyjadrené ako albumín, stanovené Lowryho testom (Lowry J. a d.: Proteín Measurement with the folin phenol reagen, J. Biol. Chem. 193,265-275,1951).

-UV absorbancia pri 257 nm a pri 280 nm nepresahujúca 1,0 A.U., merané na 1 % (hmotnosť/objem) vodnom roztoku.

-dynamická viskozita 1 % roztoku (hmotnosť/objem) v 0,15 M NaCI pri pH = 7,0, merané rotačným viskozimetrom, napríklad opísaným v U.S. Pharmacopea XXII ed. (911), str. 1619, pri teplote 20 °C, ktorá nepresahuje pri definovaný šmykových rýchlostiach tieto hranice:

Šmyková rýchlosť Dynamická viskozita (mPa.s pri 20 °C) 1 s 1 nie viac ako 20 000 mPa.s s‘l nie viac ako 2 000 mPa.s

100 s-1 nie viac ako 1 000 mPa.s

350 s'l nie viac ako 500 mPa.s

-Obsah sulfátovaného mukopolysacharidu: nepresahujúci 0,07 %, vyjadrené ako síra, stanovené na zariadení s indukčné viazanou plazmou (ICP) pri použití vhodnej referenčnej látky.

-Obsah železa: nepresahujúci 10 ppm, stanovené atómovou absorbciou alebo metódou ICP.

Bola uskutočnená porovnávacia štúdia, pokiaľ ide o obsah železa, medzi frakciou HA-1 a inými roztokmi sodnej soli kyseliny hyalurónová, dostupnými obchodne. Získané výsledky (tabuľka 7) jasne demonštrujú rozdielny obsah železa: frakcia HA-1 má oveľa nižší obsah železa ako ostatné produkty.

Tabuľka 7. Obsah železa (ppm) vHA-1 oproti iným produktom

HA-1 vzorka A vzorka B vzorka C železo (ppm) <10 130 120 40 kde:

-vzorka A zodpovedá SODICHIMu (šarža 154) -vzorka B zodpovedá BIOCHEMO (šarža 542)

-vzorka C zodpovedá BIOTECHNOLOGY GENERÁL (šarža B-25)

-obsah železa bol stanovený na asi 0,5 g látky, ktorá bola žíhaná v platinovom poháriku a zvyšok sa rozpustí v 0,1 M kyseline dusičnej

-stabilita izotonických tlmených roztokov s fyziologickým pH frakcie HA-1, podrobených prirodzenému starnutiu a tepelnej sterilizácii, zistená stanovením limitného viskozitného čísla a vyjadrená zodpovedajúcim poklesom strednej molekulovej hmotnosti, ktorá nepresahuje tieto hranice:

- 97 % pôvodnej hodnoty (skladovanie pri 25 °C, 6 mesiacov)

- 75 % pôvodnej hodnoty (sterilizácia pri 118 °C, 32 min.)

- 80 % pôvodnej hodnoty (sterilizácia pri 121 °C, 16 min.)

- 90 % pôvodnej hodnoty (sterilizácia pri 124 °C, 8 min.).

Bola uskutočnená porovnávacia štúdia medzi izotonickým tlmeným roztokom HA-1 s fyziologickým pH a analogickými roztokmi kyseliny hyalurónovej, obchodne dostupnými, s cieľom zistiť stabilitu pri podmienkach: -prirodzeného starnutia (skladovanie pri teplote miestnosti, 6 mesiacov)

-tepelná sterilizácia pri rôznych podmienkach.

Boli použité také materiály na farmaceutické použitie a zariadenia, ktoré ukázali spoľahlivosť pre daný cieľ.

Ide predovšetkým o:

-ampulky z farebného skla s týmito charakteristikami: -sklo: borosilikátové typ 1 (podľa Ph. Eur. II ed.) -minimálna hrúbka tela: 0,90 mm -maximálna hrúbka tela: 1,00 mm

-zátky z halobutylového kaučuku s týmito charakteristikami:

-typ elastoméru: chlórbutyl

-inertné plnivo: kaolín

-pigmenty: oxid titaničitý a sadze

-vulkanizačné činidlo: oxid zinočnatý

-charakteristiky uvoľňovania: podľa pH. Eur. II ed. VI.2.3.1.

-hliníkové oklepávacie uzávery

-voda pre injekcie (podľa Prehľad obrázkov na výkrese. Eur. II ed).

Reagencie boli použité v analytickej čistote.

Na sterilizáciu bol použitý Fedegariho autokláv model FOF5 Superspectra.

Limitné viskozitné číslo bolo stanovené Ubbelohdovým viskozimetrom so zavesenou hladinou pri 25 °C v 0,15 M NaCl pri pH 7,0.

Zodpovedajúca stredná molekulová hmotnosť bola vypočítaná z Mark-Houwinkovej rovnice (H. Mark: Z. Elektrochemie 40, 499, 1934; R. Houwink: J. Prakt. Chem. 157, 15, 1940).

S cieľom lepšie stanoviť depolymerizačné trendy boli hodnoty strednej molekulovej hmotnosti vyjadrené ako percentný pdoiel pôvodnej hodnoty. Získané výsledky (tabuľky 8 a 9) demonštujú, že HA-1 má väčšiu stabilitu (aspoň dvakrát väčšiu) ako referenčné vzorky (pozri tabuľka 7), ktoré majú významne vyšší obsah železa ako HA-1.

Tabuľka 8. Stabilita roztoku - účinok prirodzeného starnutia limitný visk. č. (dl/g) variácia mol. hm. (%)

vzorka	pôv.	3 mes.	6 mes.	Pôv.	3 mes.	6 mes.
HA-1	20,9	20,8	20,5	100	99,4	97,5
A	10,4	10,1	9,6	100	96,2	89,9
B	9,7	9,2	8,8	100	93,2	87,8
C	15,5	15,1	14,8	100	96,6	94,0

Tabuľka 9. Stabilita roztoku - účinok sterilizácie limitný visk. č. (dl/g) variácia mol. hm. (%)

vzorka	pôv.	Ic	líc	IIIc	Pôv.	Ic	Ilc	IIIc
HA-1	20,9	17,2	18,3	19,9	100	77,1	83,8	93,7
A	10,4	6,2	6,6	7,2	100	50,2	54,5	61,2
B	9,7	6,3	6,7	7,3	100	56,2	61,1	68,5
C	15,5	10,9	11,5	12,6	100	62,5	67,2	75,9

kde:

-vzorky A, B a C sú rovnaké ako pri stanovení obsahu železa

-roztoky približne 10 mg/ml každého produktu v 0,9 % (hmotnosť/objem) roztoku chloridu sodného v 0,002 M fosfátovom pufri s pH 7,5 boli podrobené:

a) prirodzenému starnutiu skladovaním počas 6 mesiacov pri teplote miestnosti (25 °C) v temne s kontrolami po troch mesiacoch (pozri tabuľka 8)

b) sterilizácii v autokláve pri týchto podmienkach: T = 118 °C počas 32 min. (označené Ic)

T = 121 °C počas 16 min. (označené líc)

T = 124 °C počas 8 min. (označené IIIc) s kontrolami na začiatku a na konci každého teplotného intervalu

Príklad 2

Postup získania frakcie HA-1 a jej charakterizácia

Slepačie hrebienky, buď čerstvé alebo zmrazené (3.000 g), sa zomelú v mlynčeku na mäso a potom sa dôkladne homogenizujú v mechanickom homgenizátore. S cieľom získať pastu sa v sklenenej nádobe pridajú 4 objemy 95 % etanolu, obsahujúceho 0,1 % (hmotnosť/objem) špecifického chelatačného činidla pre železo.

Vhodným chelatačným činidlom je 1,10-fenantrolín (C.A.R.N. 66-71-7) alebo jeho dimetylderiváty.

Sklenená nádoba a chelatačné činidlo sa používajú na vylúčenie depolymerizácie sodnej soli kyseliny hyalurónovej, ktorá by inak mohla byť spôsobená iónmi železa z oceľových nádob alebo zvyškov krvi.

Slepačie hrebienky sa spracúvajú do úplného odstránenia iónov železa (inštrumentálna kontrola: absorbancia komplexu železo-chelatačné činidlo v acetónovej alebo etanolickcj fáze v 1 cm kyvetách pri vlnovej dĺžke maximálnej absorbancie - 510 nm v prípade 1,10-fenantrolínu, nie viac ako 0,005 A.U.).

Uskutoční sa ďalšie premytie rovnakým objemom bezvodého acetónu (alebo etanolu) s cieľom odstrániť všetky zvyšky chelatačného činidla. Toto spracovanie sa uskutočňuje až do negatívneho výsledku testu „A“:

Test „A“: 5 ml acetónovej (alebo etanolickej) fázy sa odparí pomocou mierneho prúdu dusíka. Zvyšok sa rozpustí v 5 ml vody a zmeria sa absorbancia pri vlnovej dĺžke maximálnej absorpcie chelatačného činidla.

Výsledok testu sa považuje za negatívny, ak je absorbancia nižšia ako 0,1 A.U.

Konečný reakčný produkt sa 6 H mieša s rýchlosťou otáčania 50 min.^-' a nechá sa 12 H separovať a potom sa rozpúšťadlo prečerpá sifónom a vypustí.

Tento extrakčný postup sa opakuje až do dosiahnutia správnej hodnoty vlhkosti rozpúšťadla (Karl-Fisherova metóda).

Získaná metóda sa potom odstredí a suší vo vákuu pri vhodnej teplote počas aspoň 8 h. Výťažok tohto procesu je asi 500 až 600 g suchého prášku.

300 g suchého prášku sa potom podrobí enzymatickému digerovaniu s 0,2 g vhodného proteolytického činidla (papín, pepsín, trypsín alebo pronáza) v tlmenom vodnom prostredí s fosfátovým pufrom pri použití množstva cystemhydrochloridu, poskytujúceho pomer k suchému prášku 20:0,01 až 20:1. Táto zmes sa potom mieša 24 h s rýchlosťou otáčania 60 min.' pri konštantnej teplote 60 až 65 °C. Po skončení reakcie sa pridá 60 g Celitu^ a celkom sa mieša ešte hodinu. Získaná zmes sa filtruje až do získania číre kvapaliny.

Pri miešaní rýchlosťou 60 min.·' sa pridá 45 g cetylpyridíniumchloridu. Zmes sa mieša 60 min. a potom sa pridá 50 g CelituR.

Takto získaná zrazenina sa zhromaždí a suspenduje v 0,01 M roztoku chloridu sodného (5 1), obsahujúcom 0,05 % cetylpyridínia.

Zmes sa mieša 60 min. pri 50 °C a potom sa privedie na teplotu 25 °C a zrazenina sa odstredí.

Postup premývania sa opakuje trikrát. Zrazenina sa zhromaždí v nádobách obsahujúcich 3 1 0,05 M roztoku chloridu sodného, obsahujúceho 0,5 % cetylpyridíniumchloridu.

Zmes sa mieša 60 min. rýchlosťou 60 min.·' a potom sa udržiava 2 h na konštantnej teplote 25 °C. Číra vrchná fáza sa odstráni odstredením.

Postup sa opakuje dvakrát s 0,01 M roztokmi, obsahujúcimi 0,05 % cetylpyridiniumchloridu. Zmes sa odstredí a vrchná fáza sa vypustí. Zrazenina sa disperguje v 0,30 M roztoku chloridu sodného, obsahujúcom 0,05 % cetylpyridiniumchloridu (3 1).

Zmes sa mieša a zhromaždí sa zrazenina aj číra kvapalina. Zrazenina sa extrahuje druhý raz pri použití 1,5 1 vodného roztoku.

Číre kvapaliny sa spoja do jednej nádoby a podrobia sa molekulovej ultrafiltrácii cez membrány s molekulovou vylučovacou hodnotou 30.000 D so zahustením na tretinu ich pôvodného objemu.

Na zahustený roztok sa pôsobí makromolekulovou ionexovou živicou Dowex^ M-15, získanou v tetrabutylamónnej soli (TBA-) a mieša sa cez noc.

K suspenzii sa pridá vhodným objem N-metylpyrolidónu až do dosiahnutia objemového pomeru NMP-H2O 70 : 30. Zmes sa potom podrobí filtrácii a živica sa odstráni.

Potom sa k roztoku pridá vhodné množstvo chloridu sodného a pH sa pomocou 1 M hydroxidu sodného upraví na > 7,5; roztok sa potom dvakrát premyje metylénchloridom (CH2CI2) a vždy sa vypustí spodná fáza. Vrchná fáza sa pri miešaní rýchlosťou 60 min.·' a pri teplote 25 °C vyzráža troma objemami etanolu (95 %).

Zrazenina sa zhromaždí odstredením a vrchná fáza sa vypusti.

Zrazenina sa zhromaždi a premyje, najprv 75 % etanolom, potom absolútnym etanolom a nakoniec acetónom.

Premytý produkt sa potom aspoň 20 h suší vo vákuu pri teplote 25 °C. Vysušený produkt sa rozpustí vo vode pomocou inverznej osmózy tak, aby sa získal roztok s koncentráciou > 1 mg/ml. Pridá sa chlorid sodný v množstvo zodpovedajúcom dosiahnutiu molarity 0,1 až 0,4 a uskutoční sa alkalizácia 1 M hydroxidom sodným. Roztok sa potom prefiltruje cez sterilizačné filtre.

Roztok sa pri miešaní rýchlosťou 60 min.·' vyzráža pri teplote 25 °C troma objemami etanolu (95 %).

Zrazenina sa zhromaždí odstredením a vrchná fáza sa vypustí.

Zrazenina sa spojí a premyje, najprv 75 % etanolom, potom absolútnym etanolom a nakoniec acetónom.

Premytý produkt sa suší aspoň 50 h vo vákuu pri teplote 25 °C.

Takto získaný produkt má molekulovú hmotnosť 1,180.000.

Príklady farmaceutických prostriedkov

Na bližšie osvetlenie a len na ilustračné ciele sú uvedené príklady možných farmaceutických prostriedkov na terapeutické použitie frakcie HA-1. Formulácia 1: 2 ml ampulka každá ampulka obsahuje tieto zložky: sodná soľ kyseliny hyalurónovej (HA-1) 24,0 mg jednosýtny fosforečnan sodný, 2 H2O 0,1 mg dvojsýtny fosforečnan sodný, I2H2O ',2 mg chlorid sodný 17,0 mg voda pre injekcie do objemu 2,0 ml

Formulácia 2: sterilné plnené injekčné striekačky 1,1 ml na priame použitie každá striekačka obsahuje tieto zložky:

sodná soľ kyseliny hyalurónovej (HA-1) 20,0 mg chlorid sodný 9,350 mg jednosýtny fosforečnan sodný, 2 H2O 0,055 mg dvojsýtny fosforečnan sodný, 12 H2O 0,660 mg voda pre injekcie do objemu 1,1 ml

Formulácia 3: nádobky na jednorázové dávky 0,2 ml každá nádobka obsahuje tieto zložky :

sodná soľ kyseliny hyalurónovej (HA-1) 400,0 mg chlorid sodný 440,0 mg jednosýtny fosforečnan sodný, 2 H2O 5,0 mg dvojsýtny fosforečnan sodný, I2II2O 60,0 mg voda pre injekcie do objemu 100,0 mi

Formulácia 4: nádobky na jednorazové dávky 0,2 ml každá nádobka obsahuje tieto zložky:

sodná soľ kyseliny hyalurónovej (HA-1) 200,0 mg chlorid sodný 670,0mg chlorid draselný 250,0mg jednosýtny fosforečnan sodný, 2 H2O 5,0 mg dvojsýtny fosforečnan sodný, 12 H2O 60,0 mg voda pre injekcie do objemu 100,0 ml

Formulácia 5: flakóny 5 ml každý flakón obsahuje tieto zložky:

sodná soľ kyseliny hyalurónovej (HA-1) 100,0 mg chlorid sodný 670,0mg chlorid draselný 250,0mg jednosýtny fosforečnan sodný, 2 H2O 5,0mg dvojsýtny fosforečnan sodný, 12 H2O 60,0mg etyl-merkuritiosalicylát sodný 5,0mg voda pre injekcie do objemu 100,0ml

Claims (7)

1. Frakcia kyseliny hyalurónovej alebo jej soli, vyznačujúca sa tým, že má strednú molekulovú hmotnosť v rozmedzí 750 000 až 1 230 000 D a tieto charakteristiky:

a) limitné viskozitné číslo v rozmedzí 14,5 až 21 dl/g, merané pri 254 °C v 0,15 M chloride sodnom pri pH 7,0 pomocou Ubbelohdovho viskozimetra so zavesenou hladinou,

b) obsah bielkovín nepresahujúci 0,2 %, vyjadrené ako albumín,

c) absorbanciu UV pri 257 nm a pri 280 nm nepresahujúcu

1,0 A.U., merané v 1 % vodnom roztoku,

d) dynamickú viskozitu 1 % roztoku v 0,15 M chloride sodnom pri pH 7,0 pomocou rotačného viskozimetra pri teplote 20 °C nepresahujúcu tieto hranice pri definovanej šmykovej rýchlosti:

Šmyková rýchlosť Dynamická viskozita (mPa.s pri 20 °C)

1 s^-' nie viac ako 20 000 mPa.s

10 s^-1 nie viac ako 2 000 mPa. s

100 s* 1 nie viac ako I 000 mPa.s

350 s^-' nie viac ako 500 mPa.s

e) obsah sulfátovaného mukopolysacharidu nepresahujúci

0,07 %, vyjadrené ako síra,

f) obsah železa nepresahujúci 10 ppm a

g) stabilita izotonických tlmených roztokov s fyziologickým pH frakcie, podrobených prirodzenému starnutiu a tepelnej sterilizácii, zistená stanovením limitného viskozitného čísla a vyjadrená zodpovedajúcim poklesom strednej molekulovej hmotnosti, ktorá nepresahuje tieto hranice:

- 97 % pôvodnej hodnoty (skladovanie pri 25 °C, 6 mesiacov)

- 75 % pôvodnej hodnoty (sterilizácia pri 118 °C, 32 min.)

- 80 % pôvodnej hodnoty (sterilizácia pri 121 °C, 16 min.)

- 90 % pôvodnej hodnoty (sterilizácia pri 124 °C, 8 min.).

2. Frakcia kyseliny hyalurónovej podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že má strednú molekulovú hmotnosť ležiacu medzi 925 000 a 1 230 000 D.

3. Spôsob prípravy frakcie kyseliny hyaluronátu sodného, podľa nárokov 1 alebo 2, vyznačujúci sa t ý m , že

a) zo slepačích hrebienkov sa extrahuje organický materiál rozpúšťadlom, tvoreným acetónom alebo etanolom a ďalej obsahujúcim fenantrolín alebo jeho dimetylderivát, za vzniku extraktu s obsahom železa do 10 dielov hmotnostných na milión dielov hmotnostných,

b) na tento extrakt sa pôsobí proteolytickým činidlom, zvoleným zo skupiny zahrnujúcej papaín, pepsín, trypsín, pronázu a cysteínhydrochiorid,

c) takto ošetrený extrakt sa uvedie do styku s kolónou, plnenou živicou so skupinami kyseliny sulfónovej vo forme tetrabutylamóniovej soli,

d) kolóna sa eluuje s cieľom získať roztok, obsahujúci tetrabutylamóniovú soľ kyseliny hyalurónovej,

e) roztok sa eluuje s cieľom získať zvyšok, tvorený tetrabutylamóniovou soľou kyseliny hyalurónovej,

í) tento zvyšok sa rozpustí v aprotickom rozpúšťadle,

g) roztok zo stupňa f) sa prefiltruje,

h) roztok zo stupňa g) sa premyje metylénchloridom,

i) na roztok zo stupňa h) sa pôsobí halogenidom sodným za vzniku hyaluronátu sodného,

j) získaný hyaluronát sodný sa vyzráža alkoholom, výhodne etanolom,

k) zrazenina sa rozpustí vo vode a roztok sa podrobí dialýze,

l) na dialyzovaný roztok sa pôsobí s cieľom vyzrážať hyaluronát sodný alkoholom, výhodne etanolom,

m) roztok uvedenej zrazeniny sa podrobí molekulovej filtrácii cez membránu s vylučovacou medzou s molekulovou hmotnosťou 30 000 D za vzniku roztoku, obsahujúceho sodnú soľ kyseliny hyalurónovej s molekulovou hmotnosťou 750 000 až 1 230 000 D.

4. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje ako účinnú zložku frakciu kyseliny hyalurónovej podľa nároku 1.

5. Frakcia kyseliny hyalurónovej podľa nároku 1 na použitie v očnej chirurgii.

6. Frakcia kyseliny hyalurónovej podľa nároku 1 na použitie v odbore oftalmológie.

7. Frakcia kyseliny hyalurónovej podľa nároku 1 na použitie pri operáciách zákalu alebo v prípade implantátov očnej šošovky.