KR20140024863A

KR20140024863A - 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액

Info

Publication number: KR20140024863A
Application number: KR1020137026032A
Authority: KR
Inventors: 켄지 노오미; 켄타로 시마다; 타다시 모리카와
Original assignee: 덴키 가가쿠 고교 가부시기가이샤
Priority date: 2011-03-02
Filing date: 2012-03-02
Publication date: 2014-03-03
Also published as: JP5957439B2; CN103442719A; JPWO2012118191A1; WO2012118191A1

Abstract

안정성이 높은 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액에 관한 것이다.
2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하이며, 요오드가 함유된 환원제를 함유하는, 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 제공한다. 또는, 상기 환원제가 금속 요오드화 화합물류인 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 제공한다. 또는, 상기 히알루론산 또는 히알루론산염의 농도가, 5~15mg/mL인, 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 제공한다.

Description

히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액{Aqueous solution containing hyaluronic acid or salt thereof}

본 발명은, 2가 용해성 철의 함유율이 낮고, 요오드가 함유된 환원제를 함유하는, 히알루론산(hyaluronic acid) 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액에 관한 것이다.

히알루론산은, N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산(glucuronic acid)의 이당단위(二糖單位)가 연결되어 구성된 다당으로 알려져 있다. 히알루론산은 일반적으로 의약품·화장품·식품 등의 원재료로 사용되고 있다. 히알루론산의 생산 방법으로는, 닭의 계관(鷄冠) 등으로부터의 추출물에 의해 제조되는 방법이나 미생물을 이용한 발효법에 의해 생산되는 방법이 있다.

예를 들면, 특허문헌 1에는 스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus)를 이용하여, 발효법에 의해 히알루론산을 생산하는 방법이 기재되어 있다. 상기 특허문헌 1에는, 배양 중에 황산제1철을 3배 농도가 되게끔 첨가했을 경우(실시예 3)에는, 첨가하지 않은 경우(실시예 1)보다도 히알루론산의 수율 및 분자량이 증가된다는 것이 기재되어 있다.

또한, 특허문헌 2에는 스트렙토코쿠스 에퀴(Streptococcus equi)(ATCC9527)를 이용하여, 발효법에 의해 히알루론산 분말을 생산하는 것이 기재되어 있다. 특허문헌 3에 있어서, 특허문헌 2의 방법에 기초하여 생산된 히알루론산 나트륨 결정에는 칼슘, 마그네슘, 및 철이 많이 함유되어 있다는 것을 나타내는 실험 데이터가 기재되어 있다. 또한 특허문헌 3에는, 특허문헌 2의 방법에 기초하여 얻은 히알루론산 함유액에 킬레이트 수지를 더 접촉시킴으로써, 칼슘, 마그네슘, 및 철의 함유율이 10ppm 미만으로 감소된 히알루론산 나트륨 결정을 얻을 수 있다는 것이 기재되어 있다.

(0001)[특허문헌1] 일본공개특허공보 특개평9-56394호 공보 (0002)[특허문헌2] 일본공고특허공보 특공평7-2117호 공보 (0003)[특허문헌3] 일본공개특허공보 특개2008-280430호 공보

그러나, 상기 문헌에 기재된 종래 기술은 아래와 같은 점에서 개선의 여지가 있다.

첫째, 특허문헌 1에 기재된 생산 방법에서는, 황산제1철(황산철(II), FeSO₄)을 대량으로 배양지에 첨가하기 때문에, 정제된 후의 히알루론산 함유 용액에 철이 혼입되기 쉬울 수 있다. 또한, 황산제1철을 대량으로 포함하는 배양지로부터 철을 제거하기 위해서는, 통상보다도 많은 코스트가 필요하게 된다.

둘째, 특허문헌 2에 기재된 생산 방법에서는, 히알루론산 분말에 칼슘, 마그네슘, 및 철이 많이 포함되어 있으며, 히알루론산 나트륨의 순도가 낮다.

셋째, 특허문헌 3에 기재된 생산 방법에서는, 히알루론산 나트륨 결정중의 칼슘, 마그네슘, 및 철의 함유율을 10ppm 미만으로 감소시킨 것이 기재되어 있지만, 구체적으로 함유율이 얼마인지는 명확하지 않다. 또한 그 분석 결과는 ppm 레벨(ppm-order)이며, 정밀성이 결핍되어 있다. 더욱이, 칼슘, 마그네슘, 및 철의 함유율을 감소시킴으로써, 구체적으로 어떤 효과를 얻을 수 있는 가는 기재되어 있지 않다.

본 발명은 상기 문제점에 비추어 행해진 것이며, 2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하이며, 요오드가 함유된 환원제를 포함하기 때문에, 안정성이 높은 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액에 포함되는 불순물에 관한 연구를 행한 결과, 히알루론산염 수용액 중에 혼입되어 있는 2가 용해성 철의 함유율이 높을수록 히알루론산 분자의 안정성이 감소된다는 것을 처음으로 알아냈다. 또한, 본 발명자들은, 놀랍게도 3가의 용해성 철의 함유율이 커져도 히알루론산 분자의 안정성은 감소되지 않고, 2가 용해성 철의 함유율이 클 경우에 한하여 히알루론산 분자의 안정성이 감소된다는 것을 알아냈다.

여기에서, 본 발명자들은, 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액 중에 혼입되어 있는 2가 용해성 철의 함유율을 저감시키는 동시에, 2가 용해성 철에 의한 히알루론산 분자의 안정성이 감소되는 것을 억제하는 첨가물을 찾아본 결과, 요오드가 함유된 환원제를 첨가함으로써, 2가 용해성 철로 인한 히알루론산 분자의 안정성의 감소를 억제할 수 있다는 것을 처음으로 알아냈다. 또한, 본 발명자들은, 놀랍게도 환원성의 화합물일지라도, 브롬화Na, 아황산수소Na, 황화Na, 티오글리콜산Na, 포도당, 및 아스코르빈산(Ascorbic acid)을 첨가하였을 경우에는, 2가 용해성 철로 인한 히알루론산 분자의 안정성의 감소가 억제되지 않고, 도리어 첨가함으로써 안정성이 많이 감소된다는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.

다시 말해, 본 발명에 의하면, 2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하이며, 요오드가 함유된 환원제를 함유하는, 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액이 제공된다. 상기 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액은 보존 후의 고유점도 잔존율이 양호하다는 것이, 후술되는 실시예에서 실증된다. 때문에, 의약품·화장품·식품 등의 원재료로 적절하다.

또한, 본 발명에 의하면, 상기 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 포함하는 의약조성물이 제공된다. 상기 의약조성물은, 보존 후의 고유점도 잔존율이 우수한 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 포함한다. 때문에, 시간이 경과됨에 따라 생기는 점도의 저하, 또는 품질의 저하가 생기기 어렵다.

또한, 본 발명에 의하면, 상기 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 포함하는, 관절증(關節症) 치료용 주사제가 제공된다. 상기 관절증 치료용 주사제는 보존 후의 고유점도 잔존율이 양호한 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 포함한다. 때문에, 관절 내 또는 그 주변에 투여했을 경우에, 양호한 체류성(滯留性)을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 상기 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 포함하는, 화장료(化粧料) 조성물이 제공된다. 상기 화장료 조성물은, 보존 후의 고유점도 잔존율이 양호한 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 포함한다. 때문에, 시간이 경과함에 따라 생기는 점도의 저하, 또는 품질의 저하가 생기기 어렵다.

또한, 본 발명에 의하면, 히알루론산 또는 히알루론산염, 및 2가 용해성 철을 함유하는 조성물과, 요오드가 함유된 환원제를 수용액에 용해시키는 공정을 포함하고, 상기 조성물은, 히알루론산 또는 히알루론산염의 농도가 10mg/mL로 되게끔 수용액에 용해되었을 때의, 수용액 중의 2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하인, 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액의 생산 방법이 제공된다. 상기 생산 방법에 의하면, 보존 후의 고유점도 잔존율이 양호한 히알루론산 또는 히알루론산염을 생산할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 히알루론산 또는 히알루론산염, 및 2가 용해성 철을 함유하는 조성물과, 요오드가 함유된 환원제를 수용액에 용해시키는 공정을 포함하고, 상기 조성물은, 히알루론산 또는 히알루론산염의 농도가 10mg/mL로 되게 수용액에 용해되었을 때의, 수용액 중의 2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하인, 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액의 안정화 촉진 방법이 제공된다. 상기 환원제를, 2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하인 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액에 함유시키면, 보존 후의 고유점도 잔존율이 현저하게 향상된다는 것이, 후술되는 실시예에서 실증된다. 때문에, 상기 안정화 촉진 방법에 의하면, 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액의 안정화를 현저하게 촉진할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 요오드가 함유된 환원제를 포함하는, 2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하인 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 안정화하기 위한, 안정화제가 제공된다. 상기 환원제를, 2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하인 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액에 첨가하면, 보존 후의 고유점도 잔존율이 현저하게 향상된다는 것이, 후술하는 실시예에서 실증된다. 때문에, 상기 안정화제를, 2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하인 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액에 함유시키면, 현저하게 안정화시킬 수 있다.

본 발명에 의하면, 2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하이며, 요오드가 함유된 환원제를 포함하기 때문에, 안정성이 높은 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 얻을 수 있다.

도 1은, 2가 용해성 철 및 요오드화Na을 함유하는 수용액에, 히알루론산 나트륨 분말을 첨가했을 때의, 고유점도 잔존율의 변화를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명의 실시 형태에 대하여 상세하게 설명한다. 한편, 같은 내용에 대해서는 반복되는 번잡한 설명을 피하기 위하여, 설명을 적절히 생략한다.

<히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액>

본 발명의 일 실시 형태는, 2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하이며, 요오드가 함유된 환원제를 포함하는, 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액이다. 이러한 조성으로 이루어지는 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액은, 후술하는 실시예에서 실증되는 바와 같이, 보존 후의 고유점도 잔존율이 높고, 물리적인 안정성이 뛰어나다. 또한, 장기 보존 후 또는 긴 시간이 경과한 후에도 점도나 품질의 저하가 생기기 어렵고, 예를 들면 의약품·화장품·식품 등의 원재료로 적합하다.

상기 요오드가 함유된 환원제는, 예를 들면 금속 요오드화 화합물류이어도 좋다. 금속 요오드화 화합물류로서는, 예를 들면 요오드화 나트륨, 요오드화 칼륨, 요오드화 칼슘, 또는 요오드화 마그네슘을 들 수 있다.

상기 5ppb 이하는, 예를 들면 0.001, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, 또는 5ppb여도 좋다. 또한 상기 함유율은, 여기에서 예시된 값 이하, 또는 임의의 2개 값의 범위 내여도 좋다. 상기 함유율은, 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액의 안정성을 향상시키는 관점에서 보면, 적을수록 좋다.

본 실시 형태의 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액에 포함되는, 상기 환원제의 함유율은, 예를 들면 5, 10, 30, 50, 100, 150, 300, 500, 800, 1000, 1500, 2000, 5000 또는 10000㎍/mL여도 좋다. 또한 상기 함유율은, 여기에서 예시된 임의의 2개 값의 범위 내여도 좋다. 또한 상기 함유율은, 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액의 안정성을 더 향상시키는 관점에서 보면, 10㎍/mL 이상이 바람직하고, 100㎍/mL 이상이 더 바람직하다. 또한 상기 함유율은, 생산 코스트 저감, 또는 조작성 향상의 관점에서 보면 2000㎍/mL 이하가 바람직하고, 1500㎍/mL 이하가 더 바람직하다.

본 실시 형태의 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액에 포함되는 히알루론산 나트륨 또는 히알루론산염의 평균 분자량은, 예를 들면 50만, 80만, 100만, 150만, 180만, 200만, 250만, 300만, 500만, 또는 800만이어도 좋다. 상기 평균 분자량은, 여기에서 예시된 임의의 2개 값의 범위 내여도 좋다. 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액의 점성을 더 향상시키는 관점에서 보면, 100만 이상이 바람직하고, 150만 이상이 더 바람직하다. 점성이 높은 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액은, 관절증(關節症) 치료용 주사제로 사용했을 경우, 환부에서의 체류성이 좋다. 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액에 포함되는 히알루론산 또는 히알루론산염의 평균 분자량은, 고유점도를 측정한 후, 로렌트(Laurent) 식(LAURENT et al., Biochim Biophys Acta.1960 Aug 26;42:476-485.)을 이용하여 산출할 수 있다.

본 실시 형태의 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액에 포함되는 히알루론산 또는 히알루론산염의 함유량은, 예를 들면, 0.1, 1, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 또는 20mg/mL여도 좋다. 상기 함유율은, 여기에서 예시된 임의의 2개 값의 범위 내여도 좋다. 치료 효과, 또는 주사제 등에 사용될 때의 조작성의 관점에서 보면, 5와 15mg/mL의 값의 범위 내가 바람직하고, 8과 12mg/mL의 값의 범위 내가 더 바람직하다.

본 실시 형태의 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액의 pH는, 예를 들면 5.5, 6, 6.5, 6.8, 7, 7.8, 8, 8.5, 또는 9여도 좋다. 상기 pH는, 여기에서 예시된 임의의 2개 값의 범위 내여도 좋다. 상기 pH는, 안정성의 관점에서 보면, 6.5과 8의 값의 범위 내가 바람직하고, 6.8과 7.8의 값의 범위 내가 더 바람직하다.

본 실시 형태의 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액은, 예를 들면, 히알루론산 또는 히알루론산염, 및 2가 용해성 철을 함유하는 조성물과, 요오드가 함유된 환원제를 수용액에 용해시키는 공정을 포함하고, 상기 조성물은, 히알루론산 또는 히알루론산염의 농도가 10mg/mL로 되게끔 수용액에 용해되었을 때의, 수용액 중의 2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하인, 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액의 생산 방법에 의해 얻을 수 있다. 상기 생산 방법은 복잡한 공정이 반드시 필요한 것이 아니고, 생산성 또는 코스트면에서 우수하다.

본 명세서에 있어서 「히알루론산염」이란, 예를 들면 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 아연, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 또는 히알루론산 암모늄이어도 좋다. 그 중에서, 원하는 점성, 또는 관절증에 대한 치료 효과가 기대될 수 있는 관점에서 보면, 히알루론산 나트륨이 바람직하다. 히알루론산 나트륨의 화학명은, 예를 들면 [→3)-2-아세트아미노-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-소듐글루코피라노실우로네이트-(1→]n([→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-sodium glucopyranosyluronate-(1→]n)(IUPAC)로 나타낼 수 있다.

본 명세서에 있어서 「2가 용해성 철」이란, 용해성 상태로 되어 있는 철로서 2가 철이다. Fe² ⁺나 2가철로 표기할 수도 있다.

<의약조성물 등>

본 실시 형태의 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액은 의약조성물의 원재료로 사용될 수 있다. 이 경우, 상기 의약조성물은 안정성이 뛰어난 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 포함하기 때문에, 장기적으로 보존한 후에도 점도나 품질의 저하가 생기기 어렵다. 또한, 예를 들면 관절 내 또는 그 주변에 투여하였을 경우에, 환부에 긴 시간 또는 원하는 시간 동안 체류할 수 있다. 상기 의약조성물의 제형(劑形)은 특히 한정되지 않지만, 관절 등 환부에 직접 투여할 수 있다는 관점에서 보면 주사제가 바람직하다. 주사제 용기로서는, 예를 들면 시린지(syringe), 바이알, 또는 앰플을 사용할 수 있다. 투여할 때에는, 단독으로 투여할 수도 있고, 약리학적으로 허용되는 1개 또는 그 이상의 담체 혹은 부형제(賦形劑)와 함께 혼합하여, 제제학(製劑學)의 기술분야에서 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조된 의약제제로 제공하는 것이 바람직하다. 상기 의약조성물은 투여 형태에 맞추어, 완충제(緩衝劑)(예를 들면, 인산염 완충액, 초산 나트륨 완충액), 무통화제 (예를 들면, 염산 리도카인, 염산 프로카인(procaine) 등), 안정제 (예를 들면, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예를 들면, 벤질 알코올(benzyl alcohol), 페놀 등), 산화 방지제 등과 배합하여도 좋다. 또한 상기 의약조성물은, 첨가제로서 인산수소나트륨, 결정 인산 2수소나트륨, 염화나트륨을 포함하여도 좋다. 조정된 의약조성물은, 예를 들면 인간이나 포유 동물 (예를 들면 래트(rat), 마우스, 토끼, 개, 원숭이, 양, 돼지, 소, 고양이 등)에 대하여 투여할 수 있다. 또한 의약조성물은, 예방을 목적으로 사용되는 조성물을 포함한다.

상기 의약조성물의 투여 방법은 피험자의 연령, 증상, 환부 등에 의해 적절히 선택할 수 있다. 변형성 무릎 관절증의 치료에 사용할 경우에는, 예를 들면, 성인은 1회당 2.5mL를 매주 연속 5회 무릎 관절강(關節腔) 내에 투여할 수 있다. 또는, 증상을 유지하는 것을 목적으로 할 경우, 2~4주일 간격으로 투여할 수 있다. 또한 견관절주위염(肩關節周圍炎)의 치료에 사용할 경우에는, 예를 들면, 성인은 1회당 2.5mL를 매주 연속 5회 어깨 관절(어깨 관절강, 견봉하활액포(肩峰下滑液包), 또는 상완이두근장두건건초(

) 내에 투여할 수 있다. 또한 관절 류머티즘에 있어서, 무릎 관절통(關節痛)의 치료에 사용될 경우에는, 예를 들면, 성인은 1회당 2.5mL을 매주 연속 5회 무릎 관절강 안에 투여할 수 있다. 또한, 적절한 화학요법약과 병용하여 투여해도 좋다.

상기 의약조성물의 약리작용으로서는, 예를 들면, a)히알루론산염이 연골조직에 결합하여 표면을 피복함으로써 점탄성(粘彈性) 혹은 윤활작용, b)연골기질의 안정화에 의한 관절연골보호 작용(변성억제 작용, 수복 작용 등), c)염증성 세포 및 활막세포(滑膜細胞)의 표면을 피복함으로써, 혹은 통증유발 증강물질(增强物質)의 생산 억제 등에 의한 진통작용, d)활막세포 및 연골변성에 따르는 관절염과 밀접한 관계를 가지는 활막세포, 연골세포, 혹은 호중구(好中球)나 매크로파지(Macrophage)와 같은 염증성세포에 영향을 주어 발견되는 염증작용을 들 수 있다. 이들의 작용에 의해, 예를 들면 동통의 경감, 또는 일상생활 활동이나 관절가동 영역의 개선이 기대된다.

본 실시 형태의 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액은 화장료 조성물의 원재료로서 사용될 수 있다. 이 경우, 상기 화장료 조성물은 안정성이 뛰어난 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 포함하기 때문에, 장기간 보존한 후에도 점도나 품질의 저하가 생기기 어렵다. 또한, 보습(保濕)용 화장료 조성물로서 사용할 경우, 보습효과가 지속되기 쉬워진다.

<안정화 방법 등>

다른 실시 형태는, 히알루론산 또는 히알루론산염, 및 2가 용해성 철을 함유하는 조성물과, 요오드가 함유된 환원제를 수용액에 용해시키는 공정을 포함하고, 상기 조성물은 히알루론산 또는 히알루론산염의 농도가 10mg/mL로 되게 수용액에 용해되었을 때의, 수용액 중의 2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하인, 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액의 안정화 촉진 방법이다. 상기 방법에 의하면, 물리적 안정성이 높고, 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 얻을 수 있다. 또한 상기 방법은, 복잡한 공정을 반드시 필요로 하는 것은 아니기 때문에, 편리성이 뛰어나다.

또한, 상기 환원제는 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액의 안정화제 원재료로서 사용될 수 있다. 상기 안정화제를 이용하면, 2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하인 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액의, 물리적 안정성을 향상시킬 수 있다. 상기 안정화제는, 분말 상태 또는 액체 상태여도 좋다. 또한 액체 상태일 경우에는 완충제(緩衝劑)를 포함하여도 좋다.

이상, 본 발명의 실시 형태에 대하여 설명하였지만, 이것들은 본 발명에 대한 예시이며, 상기 이외의 각종 구성을 채용할 수도 있다. 또한, 상기 실시 형태에 기재된 구성을 조합시켜 채용할 수도 있다.

[ 실시예 ]

이하, 본 발명에 대하여 실시예를 이용하여 더 설명하지만, 본 발명은 이것들에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

이하의 순서로, 히알루론산Na 수용액을 조정하였다. 우선, 글루코오스(glucose) 5%, 인산제1칼륨 0.2%, 폴리 펩톤(Peptone) 1.0%, 효모(酵母) 진액 0.5% 로 이루어지는 배양지 1리터를 가열 살균한 후, 스트렙토코쿠스 에퀴FM-100(微工硏條寄 제9027호)을 접종하였다. 1vvm로 공기를 통과시키면서, 200회전/분으로 교반하며, 온도 33℃, pH 8.5 (20% 수산화 나트륨의 자동 적하(滴下)에 의한 컨트롤)에서 20시간 배양하였다. 상기 액체를 균체(菌體) 여과장치로 여과하고, 물에 12시간 투석하여 투석막 내의 히알루론산 용액을 회수하였다. 회수 용기는, 철이 혼입되는 것을 방지하기 위하여, 내표면이 유리로 제조된 것을 이용하였다. 여기에 염화나트륨을 2.5%로 되게 첨가하고, 히알루론산용액의 2배량의 에탄올을 첨가하여 히알루론산Na을 침전시켰다. 침전을 에탄올로 5회 세정하고, 불순물을 충분히 씻어 버린 후 40℃에서 10시간 바람 건조하여, 히알루론산Na의 분말을 얻었다.

다음에, 얻어진 히알루론산Na 분말을, 2mM 인산 버퍼(buffer) 및 0.9% 염화나트륨을 포함하는 수용액에 용해시키고, 히알루론산Na을 각각 5, 8, 10, 12, 15mg/mL 포함하는 히알루론산Na 수용액을 얻었다. 더하여, 고유점도를 측정하고, 로렌트(Laurent) 식을 이용하여 히알루론산Na의 분자량을 계산한 결과, 253만이었다.

<비교예 1>

실시예 1에 기재된 순서로 스트렙토코쿠스 에퀴FM-100을 배양하고, 특허문헌 3(특개2008-280430호 공보)의 실시예 1에 기재된 순서와 같은 순서로, 히알루론산Na 수용액을 정제하였다. 구체적으로는, 우선, 글루코오스(glucose) 5%, 인산제1칼륨 0.2%, 폴리 펩톤(Peptone) 1.0%, 효모 진액 0.5% 로 이루어지는 배양지 1리터를 가열 살균한 후, 스트렙토코쿠스 에퀴FM-100을 접종하였다. 공기를 1vvm로 통과시키면서, 200회전/분으로 교반하며, 온도 33℃, pH 8.5 (20% 수산화 나트륨의 자동 적하에 의한 컨트롤)에서 20시간 배양하였다. 배양액을, 이온교환수를 이용하여 10배로 희석하고, 그 수용액 2.5L에 활성탄(다케다 약품사(武田藥品社)제의 백로(白鷺) RW50-T)을 5g, 펄라이트(perlite)(미쓰이금속광업(三井金屬鑛業) 주식회사의 로카헬프(ROKAHELP) #409)를 30g 첨가하여 1시간 처리하고, 누체(Nutsche)를 이용하여 여과하였다. 상기 조작을 2회 반복하여 배양지 중의 유기성분을 제거하고, 히알루론산Na 함유액을 조정하였다. 다음에, 내경 15mm, 높이 300mm인 크로마토컬럼에 미쓰비시 화학사(三菱化學社)제 다이아이온(diaion) CR11을 68ml 충전(充塡)하여, 수지를 재생하였다. 상기 크로마토컬럼에 상기 히알루론산Na 함유액 2.5L를, SV=18(1200ml/hr)로 액체 통과시켰다. 크로마토컬럼 통과액 1L에 식염 2g을 용해하고, pH7로 되게 조정한 후, 2-프로파놀로 석출하여, 40℃에서 진공건조하여, 히알루론산Na의 분말을 얻었다.

다음에, 얻어진 히알루론산Na 분말을, 2mM인산 버퍼 및 0.9% 염화나트륨을 포함하는 수용액에 용해시키고, 히알루론산Na을 각각 5, 8, 10, 12, 15mg/mL 포함하는 히알루론산Na 수용액을 얻었다. 또한, 고유점도를 측정하고, 로렌트(Laurent) 식을 이용하여 히알루론산Na의 분자량을 계산한 결과, 240만이었다.

<평가예 1>

(1)용해성 철의 분석

실시예 1 및 비교예 1에서 조제된 히알루론산Na 분말을, 2mM 인산 버퍼 및 0.9% 염화나트륨을 포함하는 수용액에 용해시키고, 히알루론산Na을 5, 8, 10, 12, 또는 15mg/mL 함유하는 히알루론산Na 수용액을 각각 조제하였다(No.1~10). 다음에, 각각의 수용액에 대하여, 철량이 2가인 용해성 철량, 2가 및 3가인 용해성 철량, 및 전체 철량을 아래 (1-1)~(1-3)의 순서로 측정하였다. 전체 철량에는 용해성 및 불용해성 철량을 포함한다. 철량이 2가인 용해성 철량, 2가 및 3가인 용해성 철량, 및 전체 철량의 검출 한계는, 5ppb이었다.

(1-1) 2가 용해성 철의 분석 방법

a) 히알루론산Na 수용액 2.75g을 샘플병에 분취(分取)한다.

b) 티오시안산 칼륨 용액 0.1mL, 1, 10-페난트롤린 용액 0.05mL을 첨가하여 혼합한다.

c) 약 10mL로 희석한 후, 약 10분간 방치(放置)한다.

d) 클로로포름 5mL을 첨가한 후, 밀전(密栓)한다. 5분간 흔들어 혼합하여, 추출(抽出)한다.

e) 정치(靜置)한 후, 클로로포름 상(相)을 4mL 분배하여, 다른 샘플병에 옮긴다.

f) 핫플레이트(hot plate)에서 증발건고(蒸發乾固)시킨 후, 농질산(濃硝酸) 0.5mL을 첨가하여 산분해(酸分解)시킨다.

g) 희질산(1+100) 2mL을 첨가하여, 나머지를 용해시킨다.

h) ICP발광 분석에 의하여 Fe를 정량(定量) 한다.

(1-2) 2가 및 3가 용해성 철의 분석 방법

a) 히알루론산Na 수용액 2.75g을 샘플병에 분취한다.

b) 염산 히드록실아민 용액 0.2mL을 첨가한다.

c) 1, 10-페난트롤린 용액 0.2mL, 티오시안산 칼륨 용액 0.5mL을 첨가한다.

d) 약 10mL로 희석한 후, 약 10분간 방치한다.

e) 4-메틸-2-펜탄온 5mL을 첨가한 후, 밀전한다. 1분간 흔들어 혼합하여, 추출한다.

f) 정치한 후, 4-메틸-2-펜탄온 상(相)을 4mL 분취하여, 다른 샘플병에 옮긴다.

g) 핫플레이트에서 증발건고한 후, 농질산 0.5mL을 첨가하여 산분해시킨다.

h) 희질산(1+100) 2mL을 첨가하여, 나머지를 용해시킨다.

i) ICP발광 분석에 의하여 Fe를 정량 한다.

(1-3) 전체 철의 분석 방법

a) 히알루론산Na 수용액 2.75g을 샘플병에 분취한다.

b) HCl(1+1) 0.1mL을 첨가하여 핫플레이트로 가열한다.

c) 상기 (1-2) 2가 및 3가 용해성 철의 분석 방법 용해성 철의 분석의 b) 이후의 조작으로 행한다.

(1-4) 철량의 분석 결과

상기 (1-1)~(1-3)의 분석 결과를 표1에 나타낸다.

(2)고유점도 측정

2mM 인산 버퍼 및 0.9% 염화나트륨을 포함하는 수용액에 대하여, 실시예 1 또는 비교예 1에서 조제된 히알루론산Na 분말을, 히알루론산Na 농도가 10mg/mL로 되게 각각 용해시켰다(No.11~12). 더하여, 80℃에서 24시간 보존한 후, 고유점도 및 고유점도 잔존율(%)을 측정한 결과를 표2에 나타낸다. 한편, 고유점도는 제15개정 일본약국방제2추보(第十五改正日本藥局方第二追補) 「정제 히알루론산 나트륨」의 점도 항목에 기재된 내용에 따라 측정하였다. 그 결과를 표2에 나타낸다.

2mM 인산 버퍼 및 0.9% 염화나트륨을 포함하는 수용액에 대하여, 표3에 나타내는 염화철(II)(FeCl₂)을 용해시켰다(No.13~19). 다음에, 각각의 수용액에 실시예 1에서 조제된 히알루론산Na 분말을, 히알루론산Na 농도가 10mg/mL로 되게 용해하였다. 더하여, 80℃에서 24시간 보존한 후, 고유점도 및 고유점도 잔존율(%)을 측정하였다. 그 결과를 표3에 나타낸다.

2mM 인산 버퍼 및 0.9% 염화나트륨을 포함하는 수용액에 대하여, 표4에 나타내는 염화철(III)(FeCl₃)을 용해시켰다(No.20~22). 다음에, 각각의 수용액에 실시예 1에서 조제된 히알루론산Na 분말을, 히알루론산Na 농도가 10mg/mL로 되게 용해하였다. 더하여, 80℃에서 24시간 보존한 후, 고유점도 및 고유점도 잔존율(%)을 측정하였다. 그 결과를 표4에 나타낸다.

이상의 결과로부터, 1)실시예 1에 기재된 방법을 채용하면, 2가 용해성 철의 혼입량이 5ppb 이하인 히알루론산Na 수용액을 조정할 수 있으며, 2) 2가 용해성 철에 의해, 히알루론산Na 수용액이 보존된 후의 고유점도가 저하되며, 3) 3가 용해성 철은, 히알루론산Na 수용액의 보존 후의 고유점도에 영향을 주지 않는다는 것을 알아내었다.

<평가예 2>

2mM 인산 버퍼 및 0.9% 염화나트륨을 포함하는 수용액에 대하여, 표5에 나타낸 각종 첨가물을 용해하였다(No.23~34). 다음에, 각각의 수용액에 실시예 1에서 조제된 히알루론산Na 분말을, 농도가 10mg/mL로 되게 용해하였다. 더하여, 80℃에서 24시간 보존한 후, 고유점도 및 고유점도 잔존율(%)을 측정하였다. 첨가물 중에, 글리신(glycine), L-아스파라긴산Na, 정제 백설탕은 비환원성의 화합물이다. 요오드화Na, 요오드화K, 브롬화Na, 아황산수소Na, 황화Na, 티오글리콜산Na, 포도당, 및 아스코르빈산(Ascorbic acid)은 환원성 화합물이다.

* 첨가제

요오드화Na: 와코준약사(和光純藥社), 194-02272

요오드화K: 와코준약사, 168-03975

글리신(glycine): 와코준약사, 036435

L-아스파라긴산Na: 와코준약사, 193-01262

브롬화Na: 와코준약사, 193-01505

아황산수소Na: 와코준약사, 190-01375

황화Na: 와코준약사, 197-03362

티오글리콜산Na: 와코준약사, 590-11762

포도당: 와코준약사, 076-05705

정제 백설탕(자당): 와코준약사, 196-13705

아스코르빈산(Ascorbic acid)Na: 와코준약사, 196-01252

이상의 결과에 의하여, 실시예 1에서 조제된 히알루론산Na 분말을 용해시킨 수용액은, 요오드화Na 또는 요오드화K을 함유시킬 경우, 히알루론산Na 수용액의 안정성이 향상된다는 것을 알았다. 또한, 요오드화Na, 또는 요오드화K과 같이 환원성 성질을 가지는 화합물이어도, 아황산수소Na, 황화Na, 티오글리콜산Na, 포도당, 및 아스코르빈산(Ascorbic acid)을 첨가하였을 경우에는, 오히려 안정성이 저하되었다.

<평가예 3>

2mM 인산 버퍼 및 0.9% 염화나트륨을 포함하는 수용액에 대하여, 표 6에 나타낸 각종 첨가물을 용해하였다(No.35~41). 더하여, 각각의 수용액에 염화철(II)을 11.3ppb (2가 용해성 철로서 5ppb) 첨가하였다. 다음에, 각각의 수용액에 실시예 1에서 조제된 히알루론산Na의 분말을, 농도가 10mg/mL로 되게 용해하였다. 그 후, 80℃에서 24시간 보존한 후, 고유점도 및 고유점도 잔존율(%)을 측정하였다.

이상의 결과에 의하여, 실시예 1에서 조제된 히알루론산Na의 분말을 용해시킨 수용액은, 2가 용해성 철을 5ppb 함유시킬 경우, 히알루론산Na 수용액의 안정성이 저하되는 것이 나타났다. 또한, 그 안정성의 저하는, 요오드화Na 또는 요오드화K에 의해 현저하게 억제된다는 것을 알았다.

<평가예 4>

2mM 인산 버퍼 및 0.9% 염화나트륨을 포함하는 수용액에 대하여, 표7에 나타내는 농도로 요오드화Na을 용해하였다(No.42~48). 다음에, 각각의 수용액에 실시예 1에서 조제된 히알루론산Na 분말을, 농도가 10mg/mL로 되게 용해하였다. 더하여, 80℃에서 24시간 보존한 후, 고유점도 및 고유점도 잔존율(%)을 측정하였다.

이상의 결과에 의하여, 실시예 1에서 조제된 히알루론산Na 분말을 용해시킨 수용액은, 요오드화Na을 10㎍/mL 이상 함유시킬 경우, 히알루론산Na 수용액의 안정성이 향상된다는 것을 알았다. 또한, 그 안정성의 향상은, 요오드화Na을 100㎍/mL 함유한 부근에서 완만해졌다.

<평가예 5>

2mM 인산 버퍼 및 0.9% 염화나트륨을 포함하는 수용액에 대하여, 요오드화Na을, 농도가 1000㎍/mL로 되게 용해하였다. 더하여, 각각의 수용액에 표8에 나타낸 농도의 염화철(II)을 첨가하였다(No.49~54). 다음에, 각각의 수용액에 실시예 1에서 조제된 히알루론산Na 분말을, 농도가 10mg/mL로 되게 용해하였다. 그 후, 80℃에서 24시간 보존한 후, 고유점도 및 고유점도 잔존율(%)을 측정하였다.

표 8의 결과와, 표 3의 결과를 그래프로 나타내면, 도 1에 나타낸 바와 같다. 상기 도 1로부터, 2가 용해성 철 농도가 낮은 농도로 포함되어 있는 히알루론 용액에, 요오드화Na을 1000㎍/mL 함유시키면, 히알루론산Na 수용액의 안정성이 향상된다는 것을 알았다. 상기 안정화 효과는, 특히 2가 용해성 철 농도가 5ppb 이하일 때에 현저하였다.

이상과 같이, 2가 용해성 철의 함유율이 낮은 히알루론산Na 수용액은, 보존된 후의 고유점도 잔존율이 향상되었다. 또한, 상기 히알루론산Na 수용액에 요오드화Na을 함유시키면, 고유점도 잔존율이 더 향상되었다. 상기 히알루론산Na 수용액은 안정성이 높고, 장기적으로 보존된 후에도 점도나 품질의 저하가 생기기 어렵기 때문에, 예를 들면 의약조성물 등의 원재료로서 뛰어나다. 또한, 장기적 보존에 적합하기 때문에 코스트를 억제할 수 있다.

이상은, 본 발명을 실시예에 기초하여 설명하였다. 상기 실시예는 어디까지나 예시에 불과하며, 각종 변형예가 가능할 수 있으며, 또한 이러한 변형예도 본 발명의 범위에 속한다는 것을 당업자가 이해하여야 한다.

Claims

2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하이며, 요오드가 함유된 환원제를 함유하는 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액.
제1항에 있어서,
상기 히알루론산 또는 히알루론산염의 농도가 5~15mg/mL인 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 요오드가 함유된 환원제가 금속 요오드화 화합물류인 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 환원제의 함유량이 10~10000㎍/mL인 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 히알루론산 또는 히알루론산염의 평균 분자량이 100만 이상인 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 히알루론산염이 히알루론산 나트륨인 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 포함하는 의약조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 포함하는 관절증 치료용 주사제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 포함하는 화장료 조성물.
히알루론산 또는 히알루론산염, 및 2가 용해성 철을 함유하는 조성물과 요오드가 함유된 환원제를 수용액에 용해시키는 공정을 포함하고,
상기 조성물은, 히알루론산 또는 히알루론산염의 농도가 10mg/mL가 되게 수용액에 용해하였을 때의, 수용액 중의 2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하인, 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액의 생산 방법.
히알루론산 또는 히알루론산염, 및 2가 용해성 철을 함유하는 조성물과 요오드가 함유된 환원제를 수용액에 용해시키는 공정을 포함하고,
상기 조성물은, 히알루론산 또는 히알루론산염의 농도가 10mg/mL가 되게 수용액에 용해하였을 때의, 수용액 중의 2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하인, 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액의 안정화 촉진 방법.
요오드가 함유된 환원제를 포함하고,
2가 용해성 철의 함유율이 5ppb 이하인 히알루론산 또는 히알루론산염을 포함하는 수용액을 안정화시키기 위한, 안정화제.