CN102349901A - 吡非尼酮在制备防治眼科手术后增殖性疾病的药物中的应用及其滴眼液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了吡非尼酮在制备防治眼科手术后增殖性疾病的药物中的应用及其滴眼液。本发明将吡非尼酮配制成滴眼液，经过实验发现，其稳定性好，并且具有较好的眼内组织穿透性，能抑制HLECs的迁移和增殖，在作用范围(0～1mg/ml)内对HLECs无细胞毒性，吡非尼酮在0～1％范围内，在眼部连续用药，一个月内用药安全，无明显毒副作用。吡非尼酮可延缓兔眼Phaco术后PCO的发生，减少HLECs的增殖，减少PCO对光学区的遮挡，且PFD应用于兔眼Phaco术后未见明显眼表损伤或术后炎症加重，未见严重不良反应发生。因此本发明的吡非尼酮可以用于防治眼科手术后增殖性疾病，特别是白内障术后发生的后囊膜混浊。

Description

吡非尼酮在制备防治眼科手术后增殖性疾病的药物中的应用及其滴眼液

技术领域：

本发明属于防治眼科疾病的药物领域，具体涉及吡非尼酮在制备防治眼科手术后增殖性疾病，特别是白内障手术后晶状体后囊膜混浊的药物中的应用及其滴眼液。

背景技术：

白内障是全球排名第一位的致盲眼病。白内障的防治研究是防盲治盲及公共卫生工作的重点项目，具有显著的现实意义。目前白内障的防治以手术治疗-白内障囊外摘除或超声乳化白内障吸出联合人工晶体植入术为主。随着手术技术日臻完善及手术器械的不断发展，白内障手术的成功率和复明质量已大幅提高，绝大部分白内障患者可以通过手术治疗复明，但是白内障术后发生的后囊膜混浊(posterior capsule opacification，PCO，也即后发性白内障)却不同程度的对患者造成视物遮挡，成为最大的影响白内障患者术后视功能恢复的因素。因此如何预防或减少晶状体后囊膜或囊袋的纤维化，减少PCO的发生，是目前白内障防治的重点之一。

PCO是白内障术后残留的晶状体上皮细胞增殖及胶原产生以及囊袋纤维化皱缩所引起。PCO目前的防治方法主要是针对晶状体上皮细胞的增殖、分化、迁移，以及晶状体囊袋纤维化的抗细胞代谢药和对细胞因子进行适当调控的制剂等(细胞因子受体抑制剂)。近几年来随着对预防后发性白内障多途径的研究，人们发现多肽生长因子在PCO的形成和发展中起着重要的作用，其中TGF-β家族是伤口修复纤维化的系列反应(包括细胞增殖、分化、迁移等)的启动点之一，TGF-β因子在诱导、调节细胞外基质降解等方面起正性调控作用。如能减少或阻断TGF-β的表达，将能从该途径阻断或干扰晶状体囊创伤愈合过程的纤维化进程，达到减少PCO的目的。

吡非尼酮(pirfenidone，PFD)是一种新型广谱的抗炎抗纤维化药物，为吡啶酮衍生物，化学名为5-甲基-1-苯基-2[1H]-吡啶酮，分子量为185.23，常温下为白色或淡黄色粉末。目前PFD的口服制剂已经在欧美、日本和印度上市，被广泛应用于全身多种组织纤维化疾病治疗中，能下调多种细胞因子的产生，抑制胶原合成，以及阻止成纤维细胞增殖，抗纤维化作用显著，且细胞毒性小，安全、高效。目前吡非尼酮口服制剂已用于特发性肺纤维化、多发性硬化、原发性硬化性胆管炎、慢性丙型肝炎、骨髓纤维变性、神经纤维瘤病、硬化性腹膜炎和纤维变性肾功能障碍的抗纤维化临床治疗中。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供吡非尼酮在制备防治眼科手术后增殖性疾病的药物中的应用。

所述的吡非尼酮在制备防治眼科手术后增殖性疾病的药物中的应用，尤其是指吡非尼酮在制备防治白内障术后后囊膜混浊的药物中的应用。

所述的药物优选为滴眼液。

本发明的第二个目的是提供一种新型、可局部应用、安全高效的用于防治眼科手术后增殖性疾病的滴眼液，其特征在于，包括有效剂量的吡非尼酮和辅料。

优选，按总质量分数100％计，所述的吡非尼酮在滴眼液中的含量为0.5～1％，进一步优选为0.5％。

优选，所述的滴眼液，按总质量分数100％计，含有吡非尼酮0.5～1％、NaCl 0.7～0.75％、枸橼酸钠0.2％、硫柳汞0.002％、余量为水。

药理学实验：

一、吡非尼酮滴眼液眼内药代动力学研究

取实施例2配制好的质量分数为0.5％的吡非尼酮滴眼液分别放置于常温及冰箱冷藏保存6个月，观察其色泽，颜色、溶解度、pH值及含量的稳定性。

取常温保存6个月、冷藏保存6个月的0.5％的吡非尼酮滴眼液各1ml，置100ml容量瓶中，加入甲醇溶液至稀释至100ml，摇匀，备用。检测时再分别取上述溶液0.2ml，加入1.8ml甲醇溶液，摇匀，12000rpm离心5min，取上清20μl进样行HPLC检测，以吡非尼酮的标准品作为参照。

以外标法吡啡尼酮峰面积比计算含量回收率。

结果表明0.5％的吡非尼酮滴眼液常温保存6月、冷藏保存6月均无色透明，未见有变色、混浊、沉淀物及结晶等改变，HPLC检测无杂峰。

表1表示的是常温保存6月及冷藏保存6个月后含量回收率测定RSD及RE均小于±1％的规定值。PH值稳定，常温保存与冷藏保存无差异。说明该滴眼液稳定好，可以常温或冷藏保存。

表1 0.5％吡非尼酮滴眼液含量回收率测定结果

＊P＞0.05

将新西兰大白兔(雌雄不拘，体重2～2.5kg，购自广东省医学实验动物中心)60只，随机分为10组，用微量移液器准确量取50μl 0.5％的吡非尼酮滴眼液滴入结膜囊，轻拉下睑确保液体不溢出。分别于滴眼后2、5、8、10、15、20、30、60、90、120min分钟处死一组兔子，迅速摘取眼球，抽取房水、玻璃体，剪除结膜、角膜、巩膜等组织，生理盐水冲洗，滤纸吸干，置于EP管内称重，-20℃冷藏备用。组织剪碎匀浆后用500μl甲醇萃取，离心取上清40℃温浴氮气吹干，100μl甲醇重新定容，离心取上清进样行HPLC检测药物浓度。浓度计算采用加权最小二乘法进行回归分析。均数间的比较采用SPSS 16.0统计软件分析。药代动力学参数采用winnonlin 5.0软件进行非房室模型数据处理。

研究结果表明：吡非尼酮具有较好的眼内穿透性，角膜、结膜、巩膜、房水中消除半衰期分别为18.26、34.2、39.48、15.71min，峰浓度分别达9.64mg/g、9.62mg/g、2.13mg/g、34.88mg/L。药物在这4种组织的半衰期均较短，代谢快。玻璃体内药物浓度较低为0.52mg/L，半衰期相对较长达为70.91min。本实验发现吡非尼酮在兔眼具有良好的组织穿透性，可在房水中达到较高浓度，能够从眼内外同时发挥抗瘢痕化的作用。由于它在眼组织中的消除半衰期短，需要频繁滴眼才能维持有效浓度。为了减少滴眼的次数，可采用在滴眼液中加入赋形剂的方法，增加泪液黏度，使药物分布更均匀，减少药物经泪道排出的速率。目前常用的有生物黏附性凝胶，其中包括羟丙纤维素(HPC)、聚丙烯酸类(PAA)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、聚半乳糖醛酸(PLA)、木质葡聚糖(xyloglucan)、葡聚糖(Dextrans)等；在位形成凝胶，如温度敏感型有Poloxamer(泊洛沙姆)等，pH值敏感型有卡波姆(carbopol)，离子敏感型凝胶有海藻酸盐等。这些赋形剂都可以增加药物在眼表的停留时间，提高药物的生物利用度。另外还有脂质体、纳米颗粒、眼植入物等多种缓释或提高眼内通透性的辅助措施可以增强眼内药物的浓度。因此，吡非尼酮作为滴眼剂在眼部具有广阔的应用前景。

二、吡非尼酮滴眼液眼内毒性研究

1、实验动物：

新西兰大白兔，雌雄不拘，体重2-2.5Kg，随机分入空白对照、0.1％、0.5％、1％的吡非尼酮滴眼液(即分别是实施例1、2和3的滴眼液)，MMC(0.25mg/ml)(批号：505AGB，Kyowa Hakko Kogyo公司)组各3只。均采用小梁切除术处理。取材时摘除眼球后，迅速用双面刀片将眼球剖成两半，取手术对侧半眼球分别固定于FFA眼球固定液与2.5％戊二醛缓冲液中。

眼表耐受性试验采用未经处理的新西兰白兔，每组3只，共12只。

2、实验方法：

2.1给药方式

空白对照组不做任何处理；滴眼液组每日6次，每次1滴，持续28天；MMC组眼球于术中0.25mg/ml的MMC棉片放置于巩膜及结膜瓣下5分钟后大量生理盐水冲洗净残余MMC。

2.2眼表毒性评价

眼表毒性采用改良的Draize Test评价方法，眼刺激反应评分和眼刺激评价标准如表2和表3所示。

表2：眼刺激反应评分

表3：眼刺激评价标准

3结果：

3.1吡非尼酮在免眼的毒性作用

3.1.1单次吡非尼酮滴眼液点眼对眼局部耐受性影响

如图1、图2和图3所示，正常兔眼(空白对照)、0.1％、0.5％、1％的吡非尼酮滴眼液单次点眼后均无结膜充血、水肿，角膜混浊及红膜充血，分泌物增多等现象。Draize评分为0。

3.1.2长期吡非尼酮点眼对眼局部耐受性影响

如图4所示，0.1％的吡非尼酮滴眼液组，其眼球角膜透明，前方清亮，虹膜无充血及皱褶加深，Draize评分为0；

如图5所示，0.5％的吡非尼酮滴眼液组，其眼球角膜透明，前方清亮，虹膜无充血及皱褶加深，Draize评分为0；

如图6所示，1％的吡非尼酮滴眼液组，其眼球角膜透明，前方清亮，虹膜无充血及皱褶加深，Draize评分为0；

由此可见0.1％、0.5％、1％的吡非尼酮滴眼液每日6次，连续28天点眼，Draize评分为0。

3.1.3各组不同组织HE染色对比

3.1.3.1角膜上皮

如图7所示，空白对照组，0.1％、0.5％、1％的吡非尼酮滴眼液处理组，点眼后的1周、2周和4周后，其角膜上皮细胞结构清晰，无坏死，无异常上皮脱落，基底细胞与基质层间连接紧密。而MMC组角膜上皮层厚度较其他组略薄，结构清晰，表面光滑。

3.1.3.2结膜上皮

如图8所示，空白对照组，0.1％和0.5％的吡非尼酮滴眼液处理组，点眼后的1周、2周和4周，结膜上皮完整，细胞结构清楚。1％的吡非尼酮滴眼液处理组，点眼后的4周时结膜上皮空泡化，细胞层次减少。MMC组1周时上皮结构欠清晰，4周时厚度略薄。

3.1.3.3睫状体上皮

如图9所示，空白对照组，0.1％、0.5％、1％的吡非尼酮滴眼液处理组和MMC组，点眼后的1周、2周和4周后，其睫状体色素上皮及无色素上皮均排列整齐，无出血坏死。

3.1.3.4视网膜

如图10所示，空白对照组，0.1％、0.5％、1％的吡非尼酮滴眼液处理组和MMC组，点眼后的1周、2周和4周后，其视网膜各层结构清晰，无水肿变性。

3.1.4扫描电镜观察

扫描电镜观察不同浓度的吡非尼酮滴眼液点眼后4周兔眼角膜内皮形态改变。如图11、12和13所示，图11可以看出随吡非尼酮浓度增高，内皮细胞水肿加重，部分内皮细胞融合。MMC组细胞肿胀较明显，面积变大，部分细胞融合。图12可以看出空白对照组细胞形态规则，相邻细胞间有胞突呈齿状镶嵌连接，细胞表面有许多微绒毛，吡非尼酮组随细胞浓度增加，微绒毛密度降低，细胞连接处变不规则。MMC组微绒毛减少，细胞连接处胞突变形，成毛刷样外观，失去原有形态。图13可见内皮细胞之间齿突样镶嵌连接，空白对照组均匀整齐，1％的PFD组突起变不规则，缩短；MMC组失去典型的齿突镶嵌样结构，突起变细，细胞连接处边界不清，模糊。

由此可见0.1％的吡非尼酮滴眼液组角膜内皮细胞形态呈清晰的六边形，相邻细胞间有齿状胞突镶嵌连接。细胞表面微绒毛较多。0.5％的吡非尼酮滴眼液组角膜内皮部分形态不规则，部分细胞相连接处胞突减少、边界不清晰。1％的吡非尼酮滴眼液组角膜内皮细胞形态部分失去六边形形态，细胞变大，细胞表面微绒毛减少，细胞肿胀。MMC组角膜内皮细胞水肿，细胞间连接处胞突减少，变细，不规则，细胞表面微绒毛显著减少。

3.1.5角膜内皮计数

每组取3个不同部位计数SEM 1000倍视野下的细胞个数，统计上缘与左侧缘细胞，不统计下缘及右侧缘细胞，其结果如表4所示。

表4：角膜内皮细胞计数

方差分析统计结果组内方差为150.73，组间方差为66.47，F值为2.27，P＞0.05。因此认为整体方差齐，不同组处理4周后各组间比较没有差异。

3.1.6透射电镜观察

由图14可以看出，线粒体形态基本正常，个别轻度扩张，少数内质网扩张，细胞无显著肿胀，细胞间连接紧密，部分扩张。核膜连续完整。

示紧密连接。

示NPE细胞基底膜皱褶。

示PE细胞基底膜内褶。

示睫状体基质层。示空泡。PE：睫状体色素上皮。NPE：睫状体非色素上皮。M：线粒体。由图15可以看出，RPE微绒毛包绕着光感受器膜盘末端，视杆细胞膜盘(ROD)层次清楚，无水肿，线粒体(M)无肿胀，视网膜各层结构未见水肿，变性，坏死。

因此透射电镜见睫状体无色素上皮细胞核圆较大，基底面胞膜呈高度皱褶样改变，相邻细胞的侧面呈折叠排列规则成条纹状，膜间隙小，基底膜较薄，平铺于表面并不随细胞膜凹陷而进入内褶，基底面胞浆内线粒体丰富。色素上皮位于靠近睫状体基质侧，所含线粒体数量较无色素上皮少，靠近无色素上皮侧胞浆内可见圆形空泡，内有均质低密度颗粒。上皮之间以紧密连接、缝隙连接和桥粒相连接。上皮细胞线粒体形态基本正常，个别轻度扩张，少数内质网扩张，细胞无肿胀，细胞间连接紧密，部分色素上皮层与无色素上皮层之间细胞间隙扩张。核膜连续完整。MMC组睫状体色素上皮细胞内可见少许空泡，无色素上皮皱褶间隙增宽，细胞核完整，线粒体无水肿。视网膜各层层次清晰，无水肿、变性、坏死。

综上所述，吡非尼酮在眼部未见明显毒性反应，扫描电镜观察到1％的吡非尼酮滴眼液可以引起角膜内皮水肿，细胞间连接处突起减少，不规则，尚都在可逆损伤范围内。吡非尼酮组与MMC组均可引起睫状体色素上皮内部分空泡样变，细胞膜和细胞核及线粒体未见异常。吡非尼酮组及MMC组视网膜未见异常改变。表明吡非尼酮滴眼液在眼部1月内用药安全，无明显毒副作用。

三、吡非尼酮抑制体外人晶状体上皮细胞增殖作用和机制研究

永生化人晶状体上皮细胞HLECs(SRA01/04)购自中国医学科学院肿瘤研究所，用含10％澳洲源优质胎牛血清(FBS)、1％非必需氨基酸的改良型α-MEM培养基，培养于37℃、5％CO2培养箱中。其传代培养为：HLECs生长至80％以上融合时，可考虑予以传代，加入0.25％胰蛋白酶溶液，覆盖细胞表面，静置约3min，倒置显微镜下见细胞变为圆形，吸出胰酶溶液，加入含胎牛血清的完全培养基终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液，按1∶2或1∶3分瓶接种，传代后置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养，隔日换液。

每25ml的2mg/ml的吡非尼酮贮存液是先用稍许灭菌去离子水溶解50mg的吡非尼酮，再补灭菌去离子水至25ml，60℃恒温震荡30min充分溶解，0.22μm滤器过滤，分装，-20℃保存。其他浓度可用贮存液稀释，如稀释成0.2、0.3、0.4、0.5、1mg/ml。

1.吡非尼酮对人晶状体上皮细胞增殖和迁移能力的抑制作用

1.1 PFD作用后HLECs的生长状况

通过倒置相差显微镜观察不同浓度(0、0.2、0.3、0.4、0.5、1mg/ml)PFD分别作用12、24hr后HLECs的生长状况。PFD作用12hr后，HLECs的细胞形态和密度与对照组比较没有明显差异。PFD作用24hr后，不同浓度组的HLECs细胞形态没有明显变化，PFD 0.5mg/ml、1mg/ml浓度组HLECs细胞密度低，排列欠规则，未融合，其余各个浓度组(0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml)，细胞密度、排列与对照组相比无明显差异，也即形态学上，0.5mg/ml、1mg/mlPFD对体外培养HLECs生长和增殖有抑制作用(图16)。

1.2MTT法检测吡非尼酮对HLECs增殖的影响

应用MTT法测定不同浓度的(0、0.01、0.1、0.2、0.3、0.5、1mg/ml)PFD分别作用4、12、24、48、72h后HLECs的A值，结果如表5所示。与对照组比较，0.01、0.1、0.2mg/ml的吡非尼酮浓度组HLECs的A值均无统计学差异(P＞0.05)，0.3mg/ml可能是PFD抑制HLECs增殖的起始作用浓度，而PFD作用24hr时IC50最小，为0.5253mg/ml，则0.5mg/ml可能是最适作用浓度，24hr可能是PFD抑制HLECs增殖的最适作用时间。由于0.5mg/ml PFD抑制HLECs增殖的起始作用时间是12hr，为进一步确定最适作用浓度和最适作用时间，再次应用MTT法进一步细分PFD作用浓度，测定0、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5和0.6mg/ml的PFD作用12hr和24hr后HLECs的A值(表6)。PFD作用12hr后，不同浓度组的抑制率依次为-0.0163、0.0031、-0.0134、0.2318、0.2594、0.4405，IC50为0.5793mg/ml，0.4mg/ml浓度组、0.5mg/ml浓度组和0.6mg/ml浓度组与对照组比较差异有显著性(P＝0.000)，其余各浓度组HLECs的A值与对照组相比无统计学差异(P＞0.05)。PFD作用24hr后，不同浓度组的抑制率依次为0.0955、0.2439、0.2726、0.2781、0.2878、0.5016，IC50为0.4755mg/ml，除0.2mg/ml浓度组外，其余各个浓度组HLECs的A值与空白对照组比较均有统计学差异(P＜0.05)。两次MTT法检测的结果均经过重复测量资料的方差分析，结果显示PFD的作用浓度和作用时间对A值均有影响(P＜0.001)，且作用浓度与作用时间之间有交互作用(P＜0.001)。因此，通过MTT法检测PFD抑制HLECs增殖的起始作用浓度为0.25mg/ml，最适作用浓度为0.5mg/ml，最适作用时间为24hr。

表5：MTT法检测不同浓度PFD作用0、4、12、24、48、72hr后HLECS的A值及抑制率

续表5

注：0.3mg/ml PFD组作用24hr、48hr、72hr后和对照组比较有统计学显著性差异(P＜0.05)；0.5mg/ml PFD组作用12hr、24hr、48hr、72hr后和对照组比较有统计学显著性差异(P＜0.05)；1mg/ml PFD组作用4hr、12hr、24hr、48hr、72hr后和对照组比较均有统计学显著性差异(P≤0.001)。

表6：不同浓度PFD作用24hr后HLECs A值

注：0.25、0.3mg/ml PFD组作用24hr后，和对照组比较均有统计学显著性差异(P＜0.001)；0.4、0.5、0.6mg/ml PFD组作用12hr、24hr后和对照组比较有统计学显著性差异(P＜0.001)。

1.3 PFD作用后HLECs迁移能力的变化

通过划痕法检测0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml PFD作用12hr和24hr后对HLECs迁移能力的影响，结果如图17所示，PFD作用组24h后细胞仍未长满划痕，HTFs的迁移能力下降，空白对照组的细胞基本长满划痕。

1.4台盼蓝染色检测吡非尼酮的细胞毒性

台盼蓝染色检测PFD的细胞毒性，从表7可得出不同浓度(0、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0mg/ml)PFD作用24hr后HLECs的活细胞率。经卡方检验，各个PFD浓度组的活细胞率分别与对照组比较，差异无统计学意义(表7)，说明本文所采用的各个PFD作用浓度均未对HLECs产生细胞毒性作用，HLECs的增殖能力下降并不是由于PFD的细胞毒性引起。

表7：台盼蓝染色法检测不同浓度PFD作用24hr后HLECs的活细胞率

注：经卡方检验，不同浓度PFD作用下HLECs的活细胞率分别与对照组比较，差异均无统计学意义，P＞0.05。

1.5免疫荧光法检测吡非尼酮作用后TGFβs及信号通路蛋白表达PFD

不同浓度的吡非尼酮作用于HLECs 24hr后，以免疫荧光法标记HLECs中的TGFβ1、2、3蛋白和SMAD3、4蛋白、FN蛋白，并通过激光共聚焦显微镜观察和记录其表达变化。通过图18-23中可见待测蛋白TGFβ1、2、3、SMAD3、4、FN主要在HLECs的细胞质中表达，TGFβ2在细胞中含量最高，其次为TGFβ3，SMAD3、SMAD4含量最较少，TGFβ1和FN在HLECs中含量最少；与对照组比较，在浓度为0.25mg/ml(B)和0.5mg/ml(C)的PFD作用24hr后HLECs中的红色荧光均有不同程度的减弱，细胞密度有所下降，且C组红色荧光降低和细胞密度减少较B组明显，但PFD对待测蛋白表达的影响无法仅从激光共聚焦显微镜下观察得出量化的结论。

1.6免疫印迹法检测吡非尼酮抑制TGFβs及其信号通路蛋白表达

如图24和25所示，免疫印迹法(Western-blot)发现不同浓度(0.25、0.5mg/ml)PFD作用于HLECs 12hr后，HLECs中TGFβ3、SMAD3、4、FN等蛋白表达量较对照组减少(p＜0.05)，TGFβ2表达量无明显变化(p＞0.05)；作用24hr后，HLECs中TGFβ2、3、SMAD3、4、FN等蛋白表达量减少，且PFD对待测蛋白表达量的抑制作用有浓度依赖关系。

1.7Realtime RT-PCR检测吡非尼酮抑制TGFβ1、2、3、SMAD3、4、I型胶原、MMP2的mRNA表达

经Realtime RT-PCR法检测，对各个待测基因校正Quantity值进行ANOVA统计检验，0.25mg/ml和0.5mg/mlPFD分别作用于HLECs 12hr后，可见细胞中除TGFβ2外，TGFβ1、3、SMAD3、4、I型胶原、MMP2mRNA的表达较对照组减少且呈浓度依赖关系，TGFβ2mRNA的表达在PFD作用12hr后没有明显变化(表8)；作用24hr后，各个待测基因(TGFβ1、2、3、SMAD3、4、I型胶原、MMP2mRNA)mRNA表达量与对照组相比均减少，且呈浓度依赖关系(表8)。

表8：不同浓度PFD作用12hr和24hr后HLECs中

TGF β1、2、3、SMAD3、4、MMP2、COL1A1mRNA表达量的变化

1.8明胶酶谱法测吡非尼酮作用后人晶状体上皮细胞分泌MMP2和MMP9的变化

无血清条件下，不同浓度(0、0.25、0.5mg/ml)PFD作用于HLECs 24hr后，取细胞培养上清液做明胶酶谱分析(图26)，PFD干预过的HLECs分泌的MMP2和MMP9明显较对照组减少(ANOVA检验，p＜0.05)，这种抑制作用具有浓度依赖关系。说明PFD通过影响一系列细胞因子的合成或分泌，最终影响MMPs等分泌蛋白的分泌，而后者对HLECs的趋化和活化起着重要作用。

综上所述，PFD对体外培养HLECs的迁移和增殖有明显抑制作用且呈浓度依赖关系；PFD抑制HLECs增殖的起始作用浓度和最适作用浓度分别为0.25mg/ml和0.5mg/ml，最适作用时间为24hr；在作用浓度范围(0～1mg/ml)内，PFD对体外培养HLECs增殖的抑制作用和PFD的细胞毒性无关；PFD抑制体外培养HLECs增殖的机制可能是：通过抑制HLECs中TGFβs基因和蛋白的表达，从而抑制TGFβs下游通路(SMADs通路)，影响I型胶原等的合成，减少MMPs的分泌；这些生长因子、胶原表达的减少可能是体外HLECs增殖和迁移能力受抑制的原因。

四、吡非尼酮防治白内障术后晶状体后囊膜混浊的研究

健康纯种的新西兰白兔10只，雌性，体重1.5-2.0kg，经裂隙灯显微镜及前置镜检查双眼前后段未见异常，随机分两组。第一组：PFD组，6只兔，右眼为实验眼。第二组：对照组，4只兔，右眼为实验眼。所有手术均由同一熟练的白内障医生操作，采用同一术式。

本实验中的0.5％的吡非尼酮滴眼液每50ml是将250mg吡非尼酮溶于50ml的0.5％(质量体积分数)羧甲基纤维素钠溶液中。

1、术前准备：手术前30分钟复方托品卡胺滴眼液点术眼q10min×3。

2、麻醉：用盐酸氯胺酮和盐酸氯丙嗪1∶1混合液(V/V)1.5-2.0ml/Kg体重肌肉注射予以麻醉，可维持时间约60min，必要时追加1ml上述麻醉剂。术眼结膜囊滴加1％丙美卡因眼液3次。

3、术眼结膜囊冲洗：运用0.025％碘伏溶液滴术眼，3min后生理盐水冲洗手术野及术眼。

4、术眼消毒：用复方碘伏溶液消毒术野3次，铺无菌孔巾，暴露术眼。

5、做以上穹窿为基底的结膜瓣约90°，电灼止血后做角膜缘隧道切口，12点方向3.2隧道刀穿刺进入前房，隧道长约2.5mm，3点方向用15°穿刺刀穿刺入前房，粘弹剂充填前房后连续环形撕囊，直径约6mm，前囊下注入BSS液进行水分离。将超声乳化头自隧道切口进入眼内，开启灌注，低能量模式及I/A模式吸出晶状体软核及皮质，切口自行闭合。

6、术后处理：术后每天定时定量喂养标准饲料，定时观察兔的体重、毛色等全身情况及眼局部情况。术后4周内两组术眼均予局部结膜囊滴妥布霉素地塞米松磷酸钠滴眼液，4次/日。PFD组术眼结膜囊内滴0.5％的吡非尼酮滴眼液，每2～4hr一次，对照组术眼结膜囊内滴滴眼液(成份与上述的0.5％的吡非尼酮滴眼液的成分相同，只是缺少吡非尼酮)，每2～4hr一次，持续8w。观察方法：术后1、3、7、10、14、21、28、35、42、50、56天用肉眼及裂隙灯显微镜观察眼前段，直接检眼镜观察眼底。详细记录结膜、角膜、前房、后囊膜、眼底情况。术前和术后8w进行角膜内皮照相和计数。术后1、2、4、8w作裂隙灯后照法后囊膜照相，并予图像分析计算PCO面积。

6.1结膜充血分级

0级-无充血

1级+轻度充血，范围较局限

2级++中度充血，范围较大，色泽较红

3级+++重度充血，范围广泛，色泽较深

6.2角膜水肿分级

0级-清晰透明

1级+线状混浊，无或少后弹力层皱褶

2级++斑片状，后弹力层明显皱褶，厚度增加

3级+++弥漫性混浊，大泡性角膜病变，厚度增加明显

6.3房水混浊分级

0级-房水清晰透明，Tyndall现象(-)

1级+房水轻度混浊，Tyndall现象(+)，较少/无纤维素渗出

2级++房水中度混浊，Tyndall现象(++)，明显纤维素性渗出

3级+++房水重度混浊，Tyndall现象(+++)，大量的纤维素性渗出

7结果：

7.1术前兔眼裂隙灯检查

裂隙灯检查见10只兔子双眼结膜无充血，角膜透明，横径平均12.8±1.08mm，前房深度约4～5CT，瞳孔3×3mm，对光反射灵敏，散瞳下见晶状体透明，玻璃体腔透明，眼底视网膜平伏，血管走行正常，视乳头边界清晰，淡红色，未见出血渗出。

7.2术后兔眼裂隙灯检查

术后2组兔一般情况好，体重无明显变化，毛色正常，2组兔眼均未发现化脓性眼内炎等严重并发症，未见视网膜脱离或黄斑囊样水肿，术后角膜水肿、前房渗出等手术所致炎症表现均在7天内恢复，2组差异无统计学意义(p＞0.05)。

7.2.1术后结膜充血分级情况

术后1、3、7、10天两组兔眼结膜充血情况如表9，结膜充血逐渐减轻，至术后10天术眼结膜基本无充血，经秩和检验，两组兔眼结膜充血情况在各个观察时间点均无统计学差异(p＞0.05)(表9)。

表9：两组兔眼术后结膜充血情况比较

注：经秩和检验，两组兔眼结膜充血情况无统计学差异(p＞0.05)

7.2.2术后角膜水肿分级情况

术后1、3、7、10天两组兔眼角膜水肿情况如表10，角膜水肿逐渐减轻，至术后7天两组术眼角膜水肿基本消退，经秩和检验，两组兔眼角膜水肿情况在各个观察时间点均无统计学差异(p＞0.05)(表10)。

表10：两组兔眼术后角膜水肿情况比较

注：经秩和检验，两组兔眼角膜水肿情况无统计学差异(p＞0.05)

7.2.3术后房水混浊分级情况

术后1、3、7、10天两组兔眼角膜水肿情况如表11，房水混浊逐渐减轻，至术后7天两组术眼房水清，前房渗出基本吸收，经秩和检验，两组兔眼房水混浊情况在各个观察时间点均无统计学差异(p＞0.05)(表11)。

表11两组兔眼术后房水混浊情况比较

注：经秩和检验，两组兔眼房水混浊情况无统计学差异(p＞0.05)

8兔眼干预前和干预后的角膜内皮计数

PFD组兔眼术前角膜内皮计数平均为2236.50±108.46/mm²，术后8w术眼角膜内皮计数平均为2382.58±229.77/mm²，PFD组药物干预结束时术眼角膜内皮计数与干预前相比，经独立样本T检验(下同)，无统计学差异(p＝0.109)；对照组兔眼术前角膜内皮计数平均为2364.08±226.58/mm²，术后8w术眼角膜内皮计数平均为2299.68±183.28/mm²，术前术后角膜内皮计数无统计学差异(p＝0.566)；术前两组角膜内皮计数无统计学差异(p＝0.218)，术后两组角膜内皮亦无差异(p＝0.410)，说明本试验的晶状体手术和PFD眼部应用对兔眼角膜内皮无不良影响。

9兔眼术后后囊膜混浊情况及图像分析

术后1周，两组均有2只兔眼可观察到后囊下晶状体上皮细胞团，术后2周左右可观察到术眼晶状体囊袋内周边部出现再生晶状体皮质，经裂隙灯眼前段照相，以角膜中心为圆心画一组直径分别为3、5、6、7、9mm的同心圆，PFD组术后出现中央6mm范围内PCO时间平均为20.8±5.1天，比对照组(14.7±2.6天)明显延迟(p＜0.05)(图27)。术后2-8wPCO面积，不论是中央3mm光学区还是周边数个同心圆区，PFD组均较对照组小(p＜0.05)(图28)。术后52天和56天时，对照组2只兔眼先后出现增殖的晶状体皮质脱出瞳孔，虹膜充血膨隆，前房变浅(图27)。

综上所述，PFD可延缓兔眼晶状体术后PCO的发生，减少HLECs的增殖，减少PCO对光学区的遮挡，减少PCO的发生；PFD在兔眼Phaco手术的术中术后局部应用未见明显眼表损伤、角膜内皮损伤，未见术后炎症加重。

由以上药理学实验可见，本发明的吡非尼酮滴眼液，稳定性好，常温保存六个月不变质，并且吡非尼酮具有较好的眼内组织穿透性，角膜、结膜、巩膜、房水和玻璃体均能穿透。本发明还通过实验发现吡非尼酮滴能够抑制HLECs的迁移和增殖，0.25mg/ml是PFD抑制HLECs的起始作用浓度，0.5mg/ml是PFD抑制HLECs的最适作用浓度，24hr是最适作用时间，并经实验发现，PFD抑制体外HLECs增殖的机制可能是：PFD抑制TGFβs增殖，通过影响TGFβ下游通路(SMAD通路)，进而影响了I型胶原、MMPs等的表达；这些生长因子、胶原等的减少可能导致HLECs的增殖和迁移受到抑制。本发明还发现吡非尼酮在作用范围(0～1mg/ml)内对HLECs无细胞毒性，吡非尼酮在0～1％范围内，在眼部连续用药，一个月内用药安全，无明显毒副作用。本发明还通过建立晶状体手术动物模型并应用PFD抑制PCO发生，初步发现PFD(0.5mg/ml)可延缓兔眼Phaco术后PCO的发生，减少HLECs的增殖，减少PCO对光学区的遮挡，且PFD应用于兔眼Phaco术后未见明显眼表损伤或术后炎症加重，未见严重不良反应发生。

由于血眼屏障、血房水屏障的存在，吡非尼酮常规剂型，如口服片剂，不能在眼部起到抗增殖抗瘢痕化的药理作用，而且能否应用还需考虑其对眼球是否有毒性等因素。本发明将吡非尼酮配制成滴眼液，经过实验发现，其稳定性好，并且具有较好的眼内组织穿透性，能抑制HLECs的迁移和增殖，在作用范围(0～1mg/ml)内对HLECs无细胞毒性，吡非尼酮在0～1％范围内，在眼部连续用药，一个月内用药安全，无明显毒副作用。吡非尼酮可延缓兔眼Phaco术后PCO的发生，减少HLECs的增殖，减少PCO对光学区的遮挡，且PFD应用于兔眼Phaco术后未见明显眼表损伤或术后炎症加重，未见严重不良反应发生。因此本发明的吡非尼酮可以用于防治眼科手术后增殖性疾病，特别是白内障术后发生的后囊膜混浊。

附图说明：

图1是0.1％的吡非尼酮滴眼液单次点眼对眼局部耐受性的影响，其中A点眼前，B点眼后5min，C点眼后10min，D点眼后30min；

图2是0.5％的吡非尼酮滴眼液单次点眼对眼局部耐受性的影响，其中A点眼前，B点眼后5min，C点眼后10min，D点眼后30min；

图3是1％的吡非尼酮滴眼液单次点眼对眼局部耐受性的影响，其中A点眼前，B点眼后5min，C点眼后10min，D点眼后30min；

图4是0.1％的吡非尼酮滴眼液长期点眼对眼局部耐受性的影响；

图5是0.5％的吡非尼酮滴眼液长期点眼对眼局部耐受性的影响；

图6是1％的吡非尼酮滴眼液长期点眼对眼局部耐受性的影响；

图7是各处理组和对照组的角膜上皮HE染色对比(400×)；

图8是各处理组和对照组的结膜上皮HE染色对比(400×)；

图9是各处理组和对照组的睫状体上皮HE染色对比(400×)；

图10是各处理组和对照组的视网膜上皮HE染色对比(400×)；

图11是角膜内皮细胞在扫描电镜的视图(1000×)，其中A、空白对照组，B、0.1％的吡非尼酮滴眼液，C、0.5％的吡非尼酮滴眼液，D、1％的吡非尼酮滴眼液，E、MMC组；

图12是角膜内皮细胞在扫描电镜的视图(5000×)，其中A、空白对照组，B、0.1％的吡非尼酮滴眼液，C、0.5％的吡非尼酮滴眼液，D、1％的吡非尼酮滴眼液，E、MMC组；

图13是角膜内皮细胞在高倍扫描电镜图；

图14是睫状体上皮细胞的透射电镜图；

图15是视网膜细胞的透射电镜图；

图16是不同浓度的PFD作用0、12、24后HLECs的形态变化；

图17是不同浓度PFD作用12、24hr后HLECs迁移能力的变化；

图18是不同浓度PFD作用24hr后HLECs中TGF β1的表达变化，其中Cy3标记TGFβ1(红色荧光)，DAPI标记细胞核(蓝色荧光)；A为对照组，B为0.25mg/ml PFD作用组，C为0.5mg/mlPFD作用组；

图19是不同浓度PFD作用24hr后HLECs中TGF β2的表达变化，其中Cy3标记TGFβ2(红色荧光)，DAPI标记细胞核(蓝色荧光)；A为对照组，B为0.25mg/ml PFD作用组，C为0.5mg/mlPFD作用组；

图20是不同浓度PFD作用24hr后HLECs中TGF β3的表达变化，其中Cy3标记TGFβ3(红色荧光)，DAPI标记细胞核(蓝色荧光)；A为对照组，B为0.25mg/ml PFD作用组，C为0.5mg/mlPFD作用组；

图21是不同浓度PFD作用24hr后HLECs中SAMD3的表达变化，其中Cy3标记SAMD3(红色荧光)，DAPI标记细胞核(蓝色荧光)；A为对照组，B为0.25mg/ml PFD作用组，C为0.5mg/mlPFD作用组；

图22是不同浓度PFD作用24hr后HLECs中SAMD4的表达变化，其中Cy3标记SAMD4(红色荧光)，DAPI标记细胞核(蓝色荧光)；A为对照组，B为0.25mg/ml PFD作用组，C为0.5mg/mlPFD作用组；

图23是不同浓度PFD作用24hr后HLECs中FN的表达变化，其中Cy3标记FN(红色荧光)，DAPI标记细胞核(蓝色荧光)；A为对照组，B为0.25mg/ml PFD作用组，C为0.5mg/mlPFD作用组；

图24是免疫印迹法检测不同浓度PFD作用12hr和24hr后HLECs中TGFβ1、2、3蛋白、SMAD3、4蛋白、FN蛋白的表达变化；

图25是不同浓度PFD分别作用12hr、24hr后TGFβ2、3蛋白、SMAD3、4蛋白、FN蛋白的表达变化的半定量分析图，其中A：TGFβ2；B：TGFβ3；C：SMAD3；D：SMAD4；E：FN。

图26是PFD作用24hr后HLECs分泌MMP2、9的变化，其中上图为明胶酶谱图，1～3为对照组，4～6和7～9分别为0.25mg/ml和0.5mg/mlPFD作用下细胞培养上清液中MMP2和MMP9的明胶降解条带。下图为各PFD浓度组MMP2(72KD)和MMP9(92KD)条带灰度分析比较图，A：MMP2，B：MMP9；

图27是各个观察时间点两组兔眼的裂隙灯眼前段照相，其中A和F分别为PFD组和对照组术前兔眼裂隙灯眼前段照相；B～E和G～J分别依次为PFD组和对照组术后1w、2w、4w、8w的裂隙灯眼前段照相；

图28是PFD组和对照组术后1w、2w、4w、8w时裂隙灯眼前段照相示术眼中央3mm光学区，3～5mm区域、5～6mm区域和6～7mm区域PCO面积比较；

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

本实施例的每100ml吡非尼酮滴眼液是这样配制的：将0.1g的吡非尼酮用少量的注射用水湿润，然后再用3ml 10％(体积分数)醋酸水溶液溶解，加注射用水至约80ml，用1NNaOH调pH 6左右，再加0.8g的氯化钠、0.2g的枸橼酸钠、0.002g的硫柳汞，调至pH＝7，加灭菌注射用水至100ml，0.22μm过滤，无菌分装。

实施例2：

本实施例的每100ml吡非尼酮滴眼液是这样配制的：将0.5g的吡非尼酮用少量的注射用水湿润，然后再用4ml 10％(体积分数)醋酸水溶液溶解，加注射用水至约80ml，用1NNaOH调pH 6左右，再加0.75g的氯化钠、0.2g的枸橼酸钠、0.002g的硫柳汞，调至pH＝7，加灭菌注射用水至100ml，0.22μm过滤，无菌分装。

实施例3：

本实施例的每100ml吡非尼酮滴眼液是这样配制的：将1g的吡非尼酮用少量的注射用水湿润，然后再用5ml 10％(体积分数)醋酸水溶液溶解，加注射用水至约80ml，用1NNaOH调pH 6左右，再加0.7g的氯化钠、0.2g的枸橼酸钠、0.002g的硫柳汞，调至pH＝7，加灭菌注射用水至100ml，0.22μm过滤，无菌分装。

Claims (7)

1.吡非尼酮在制备防治眼科手术后增殖性疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的眼科手术后增殖性疾病为白内障术后后囊膜混浊。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为滴眼液。

4.一种用于防治眼科手术后增殖性疾病的滴眼液，其特征在于，包括有效剂量的吡非尼酮和辅料。

5.根据权利要求4所述的用于防治眼科手术后增殖性疾病的滴眼液，其特征在于，按总质量分数100％计，所述的吡非尼酮在滴眼液中的含量为0.5～1％。

6.根据权利要求5所述的用于防治眼科手术后增殖性疾病的滴眼液，其特征在于，按总质量分数100％计，所述的吡非尼酮在滴眼液中的含量为0.5％。

7.根据权利要求5所述的用于防治眼科手术后增殖性疾病的滴眼液，其特征在于，所述的滴眼液，按总质量分数100％计，含有吡非尼酮0.5～1％、NaCl 0.7～0.75％、枸橼酸钠0.2％、硫柳汞0.002％、余量为水。

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