CZ282248B6 - Způsob čištění kyseliny hyaluronové a frakce čisté kyseliny hyaluronové pro oftalmologické použití - Google Patents
Způsob čištění kyseliny hyaluronové a frakce čisté kyseliny hyaluronové pro oftalmologické použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ282248B6 CZ282248B6 CS923771A CS377192A CZ282248B6 CZ 282248 B6 CZ282248 B6 CZ 282248B6 CS 923771 A CS923771 A CS 923771A CS 377192 A CS377192 A CS 377192A CZ 282248 B6 CZ282248 B6 CZ 282248B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- solution
- fraction
- hyaluronic acid
- sodium
- molecular weight
- Prior art date
Links
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims abstract description 164
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title claims abstract description 158
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 156
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 title claims description 85
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 title claims description 27
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 title claims description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims abstract description 72
- 239000011368 organic material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 72
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 71
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 40
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 29
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 24
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 23
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 23
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- -1 sodium halide Chemical class 0.000 claims description 17
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 16
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 14
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 12
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 12
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 claims description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 10
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 7
- 239000000061 acid fraction Substances 0.000 claims description 7
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 claims description 7
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N tetrabutylammonium Chemical class CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 6
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims description 6
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims description 6
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 6
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N (1-carboxy-2-sulfanylethyl)azanium;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.SCC(N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 claims description 5
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 5
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 claims description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 5
- 229960001305 cysteine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 5
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 5
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 claims description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 4
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 claims description 3
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 abstract description 14
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 abstract description 13
- 229940089982 healon Drugs 0.000 description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 description 51
- 239000000047 product Substances 0.000 description 37
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 32
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 27
- 230000004410 intraocular pressure Effects 0.000 description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 description 19
- 229960001927 cetylpyridinium chloride Drugs 0.000 description 14
- YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M cetylpyridinium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 14
- 208000035965 Postoperative Complications Diseases 0.000 description 12
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 12
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 12
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 10
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 10
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 9
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 8
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 8
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 8
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000000797 iron chelating agent Substances 0.000 description 6
- 229940075525 iron chelating agent Drugs 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000003190 viscoelastic substance Substances 0.000 description 6
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 6
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 5
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 229940014041 hyaluronate Drugs 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 5
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 5
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Inorganic materials [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 5
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001134 F-test Methods 0.000 description 4
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 4
- 210000002159 anterior chamber Anatomy 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 4
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 4
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 4
- 238000009616 inductively coupled plasma Methods 0.000 description 4
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 4
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000003206 sterilizing agent Substances 0.000 description 4
- VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 108700039708 galantide Proteins 0.000 description 3
- 238000001558 permutation test Methods 0.000 description 3
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-3-[(2s,3r,5s,6r)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5,6-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N 0.000 description 2
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 2
- 206010011033 Corneal oedema Diseases 0.000 description 2
- 208000031354 Hyphema Diseases 0.000 description 2
- 208000001344 Macular Edema Diseases 0.000 description 2
- 206010025415 Macular oedema Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000153 Povidone-iodine Polymers 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BGDKAVGWHJFAGW-UHFFFAOYSA-N Tropicamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(CO)C(=O)N(CC)CC1=CC=NC=C1 BGDKAVGWHJFAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N Zinc monoxide Chemical compound [Zn]=O XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 201000004778 corneal edema Diseases 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000010200 folin Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000010230 macular retinal edema Diseases 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BUKHSQBUKZIMLB-UHFFFAOYSA-L potassium;sodium;dichloride Chemical compound [Na+].[Cl-].[Cl-].[K+] BUKHSQBUKZIMLB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960001621 povidone-iodine Drugs 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 2
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical class 0.000 description 2
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 2
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 4-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C1C(C(O)=O)N(C(=O)OC(C)(C)C)CC1NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 241000282709 Aotus trivirgatus Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 206010051625 Conjunctival hyperaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010010726 Conjunctival oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010015946 Eye irritation Diseases 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001613 Gambling Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010022948 Iris atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241001262617 Japonica Species 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- SUAKHGWARZSWIH-UHFFFAOYSA-N N,N‐diethylformamide Chemical compound CCN(CC)C=O SUAKHGWARZSWIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M Pentobarbital sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)[N-]C1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010036346 Posterior capsule opacification Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 208000034698 Vitreous haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 230000003679 aging effect Effects 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940030600 antihypertensive agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002220 antihypertensive agent Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000006229 carbon black Substances 0.000 description 1
- 229960004830 cetylpyridinium Drugs 0.000 description 1
- NEUSVAOJNUQRTM-UHFFFAOYSA-N cetylpyridinium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 NEUSVAOJNUQRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 229920005556 chlorobutyl Polymers 0.000 description 1
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone Chemical compound OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010339 dilation Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 1
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 231100000013 eye irritation Toxicity 0.000 description 1
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036449 good health Effects 0.000 description 1
- 229920005555 halobutyl Polymers 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 201000004614 iritis Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004184 ketamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000013490 limbo Nutrition 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 229940087766 mydriacyl Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 229940071643 prefilled syringe Drugs 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003786 sclera Anatomy 0.000 description 1
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 1
- 201000008525 senile cataract Diseases 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 231100000019 skin ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 125000005207 tetraalkylammonium group Chemical group 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004791 tropicamide Drugs 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000008154 viscoelastic solution Substances 0.000 description 1
- 229940006076 viscoelastic substance Drugs 0.000 description 1
- 210000002395 vitreous cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011787 zinc oxide Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
- C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
- C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Převedením kyseliny hyaluronové, získané z organického materiálu, nebo její sodné soli na kvarterní amonnou sůl lze získat velmi čistou frakci, použitelnou v oční chirurgii.ŕ
Description
Frakce kyseliny hyaluronové, způsob výroby frakce hyaluronátu sodného a farmaceutický prostředek
Oblast techniky
Vynález se týká frakce kyseliny hyaiuronové nebo její soli, způsobu výroby frakce hyaluronátu sodného a farmaceutického prostředku na jejich bázi. Frakce podle vynálezu je použitelná zejména v oční chirurgii.
Dosavadní stav techniky
Kyselina hyaluronová (HA) je typickým a významným představitelem skupiny biologických 15 makromolekul, známých jako glykosaminoglykany (mukopolysacharidy). HA je biologický polymer, přítomný v identické molekulární struktuře ve všech pojivových tkáních organismů obratlovců, kde hraje strukturní a biologickou roli vtom smyslu, že její místní koncentrace jsou v přísné korelaci s tonem, trofismem a obnovou tkáně v případě poranění. Souhrn fyziologického působení těchto biologických látek je uveden v Phys. Rev. (Comper W.D., Laurent T.C.: 20 Physiological function of connective tissue polysaccharides. Phys. Rev., 58, (1), 255-315, 1978).
Fyzikálně-chemicky se u HA jedná o sacharidový biopolymer (kyseliny D-glukuronové a Nacetylglykosaminu). polymerovaný alternujícím způsobem, tvořící dlouhé, nevětvené molekulové řetězce s různou molekulovou hmotnostní, dosahující maxima 8,000.000 Dalton (Meyer K.: Chemical Structure of Hyaluronic Acid. Fed. Proceed. 17, 1075, 1958; Laurent T.C., 25 Chemistry and Molecular Biology of Intracellular Matrix, 703-732, Academie Press N.Y., 1970).
Chování tohoto biopolymeru ve vodném roztoku zaručuje určitou viskozitu, zvanou viskoelasticita, která je typická pro určité biologické tekutiny, jako je kloubní mok a sklivec, kde je HA přítomna v koncentraci 0,12 až 0,24 % (Balasz E.A. a d.: Hyaluronic acid and replacement of vitreous and aqueous humor. Mod. Probl. Ophthal., 10, 3-21, 1972). Bylo zjištěno, že 30 i komorová voda lidského původu obsahuje HA, a to v průměrné koncentraci 1,14 pg/g (Laurent
U.B. G.: Hyaluronate in human aqueous humor. Arch. Ophthalmol., 101, 129-130, 1983).
Bylo publikováno množství důkazů o tom, že místní zásoba exogenní HA má zřetelný terapeutický a ochranný účinek na různé patologické stavy pojivových a epiteliálních tkání, jako 35 je
- snížená regenerace tkáně při nehojících se kožních vředech,
- arthrotická degenerace kloubové pojivové tkáně,
- oční chirurgie.
Zvlášť významná je možnost, poskytovaná viskoelastickým charakterem HA, povlékat tkáně, vystavené nebezpečí poškození při chirurgické manipulaci. Podle údajů všech chirurgů, kteří HA použili, vykonává přítomnost viskózní vrstvy exogenní HA na tkáních, které jsou nejvíce vystaveny traumatizujícímu náhodnému kontaktu, účinný ochranný vliv, který je ve velmi 45 pozitivní míře reflektován v úspěšném provedení operace.
Ochranný účinek a usnadnění oprav tkáně, umožněné exogenní HA na rohovce, bylo prokázáno jak na pokusných zvířatech (Miller D. ad.: Use of Na-hyaluronate during intraocular lens implantation in rabbíts. Ophthaímic Surgery, 8, (6), 58-61, 1977; Miller D. ad.: Use of Na50 hyaluronate in autocomeal transplantation in rabbits. Ophthaímic Surgery, 11, (1), 19-21, 1980;
Graue E.L. a d.: The protective effect of Na-hyaluronate to comeal endothelium. Exp. Eye Res., 31, 119-127, 1980; Ozaki L. ad.: Protective effect of Healon-coated intraocular lens on the
- 1 CZ 282248 B6 comeal endothelium. Folia Ophthalmologica Japonica, 32, 1301-1305, 1981), tak u člověka (Norm M.: Preoperative protection of comea and conjunctiva. Acta Ophthalmologica, 59, 587594, 1981; Polack F.M. a d.: Sodium hyaluronate (Healon) in keratoplasty and IOL implantation. Ophthalmology, 88, 425-431, 1981).
Je známo několik postupů k přípravě čištěné kyseliny hyaluronové a jejích specifických frakcí s vysokou čistotou k terapeutickému použití, například ve výše uvedených indikacích.
Molekulární frakce integrálních hyaluronových kyselin, získávané přímo extrakcí organických materiálů, například slepicích hřebínků, mají molekulovou hmotnost, pohybující se v určitých mezích, například od asi 90 až 80 do 0,2, výhodně mezi 5 a 0,2 % molekulové hmotnosti integrální kyseliny. Tyto frakce je možno získat z integrálních kyselin pomocí hydrolyzačních nebo oxidačních nebo enzymatických chemických činidel nebo fyzikálních postupů, například mechanicky nebo ozařováním, a proto často při těchto postupech čištění současně vznikají primární extrakty (viz například článek Balasz ad. v Cosmetics & Toiletries”, italské vydání č. 5/84, str. 8-17). Dělení a čištění získaných molekulárních frakcí se provádí známými metodami.
Například v patentu US 4,141.973 je popsán postup přípravy hyaluronových kyselin o molekulové hmotnosti alespoň 750.000 Dalton. které je možno použít vzhledem k jejich specifické čistotě vysokého stupně a pro absenci zánětlivých účinků, při operacích oka. Postup spočívá v extrakci sodné soli HA z výchozího materiálu, odstranění zbytků krve z použitých zvířecích orgánů, deproteinizaci takto získaného extraktu, odstranění zánětlivých nečistot, ošetření produktu ve vodném roztoku sterilizačním prostředkem a vysrážení soli kyseliny hyaluronové z vodného roztoku organickým rozpouštědlem. Zbytky krve se odstraňují ethanolem, HA ve formě své sodné soli (což je forma, v níž se nachází ve výchozím materiálu), se extrahuje vodou, deproteinizace se provádí působením zředěných kyselin a současnou extrakcí hydrolyzovaných částí chloroformem nebo pomocí proteolytických enzymů, škodlivé zánětlivé látky se odstraňují extrakcí chloroformem při pH 6 až 7 a sterilizace se provádí působením cetylpyridiniumchloridu. Tímto postupem se získá jediná frakce kyseliny hyaluronové, konkrétně popsaná v uvedeném patentu, o molekulové hmotnosti 1,586.000 Dalton. Na základě chemických, fyzikálních a biologických vlastností lze soudit, že tato molekulární frakce kyseliny hyaluronové odpovídá obchodnímu produktu, známého pod ochrannou známkou HEALON.
Byly vyvinuty nové metody, jako je molekulární ultrafiltrace. Tímto způsobem čištění je možno odstranit frakce HA s molekulovou hmotností v oblasti horního nebo dolního okraje rozmezí velikostí molekul. Například v patentu EPO č. 01238572 uděleném 25.7.1990 je popsán postup získávání frakcí hyaluronátu sodného o střední molekulové hmotnosti mezi 250.000 a 350.000 Dalton tak, že se produkt, přímo získaný extrakcí organického materiálu a následující enzymatickou deproteinizaci pomocí papainu, podrobí dvěma molekulárním ultrafiltracím přes membrány s vylučovací mezí 30.000, tj. membrány, které zachycují pouze frakce s molekulovou hmotností nad 30.000. Zdá se, že tato frakcionace má význam pro získání produktu bez sekundárních účinků zánětlivé povahy, neboť za tyto účinky jsou odpovědné frakce s nízkou molekulovou hmotností, například kolem 30.000 Dalton. Po další molekulární filtraci pomocí membrán s vylučovací mezí 200.000 (tj. membrán, které zachycují frakce s molekulovou hmotností 200.000 Dalton) se jako produkt filtrace získá frakce (v patentu nazývaná HYALASTINE) se střední molekulovou hmotností mezi 50.000 a 100.000 Dalton, zatímco podíl, který zůstává na membráně, je tvořen frakcí hyaluronátu sodného o střední molekulové hmotnosti mezi 500.000 a 730.000 (frakce, nazývaná HYALECTIN).
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je frakce kyseliny hyaluronové nebo její soli, jejíž podstata spočívá v tom, že má střední molekulovou hmotnost v rozmezí 750 000 až 1 230 000 D a tyto charakteristiky:
a) limitní viskozitní číslo v rozmezí 14,5 až 21 dl/g, měřeno při 25 °C v0,15M chloridu sodném při pH 7,0 pomocí Ubbelohdeho viskozimetru se zavěšenou hladinou,
b) obsah bílkovin nepřesahující 0,2 %, vyjádřeno jako albumin,
c) absorbance UV při 257 nm a při 280 nm nepřesahující 1,0 A.U., měřeno v 1% vodném roztoku,
d) dynamická viskozita 1% roztoku vO, 15M chloridu sodném při pH 7,0 pomocí rotačního viskozimetru při teplotě 20 °C nepřesahující tyto hranice při definované smykové rychlosti:
| Smyková rychlost | Dynamická viskozita (mPa.s při 20 °C) |
| 1 s1 10 s'1 100 s'1 350 s'1 | ne více než 20 000 mPa.s ne více než 2 000 mPa.s ne více než 1 000 mPa.s ne více než 500 mPa.s. |
e) obsah sulfatovaného mukopolysacharidu nepřesahující 0,07 %, vyjádřeno jako síra.
f) obsah železa nepřesahující 10 ppm a
g) stabilita isotonických tlumených roztoků s fyziologickým pH frakce, podrobených přirozenému stárnutí a tepelné sterilizaci, zjištěná stanovením limitního viskozitního čísla a vyjádřená odpovídajícím poklesem střední molekulové hmotnosti, nepřesahující tyto hranice:
- 97 % původní hodnoty (skladování při 25 °C, 6 měsíců)
- 75 % původní hodnoty (sterilizace při 118 °C, 32 min)
- 80 % původní hodnoty (sterilizace při 121 °C, 16 min)
- 90 % původní hodnoty (sterilizace při 124 °C, 8 min).
Frakce kyseliny, hyaluronové podle vynálezu má s výhodou střední molekulovou hmotnost mezi 925 000 a 1 230 000 D.
Předmětem vynálezu je dále způsob přípravy výše uvedené frakce hyaluronátu sodného, jehož podstata spočívá v tom, že
a) ze slepičích hřebínků se extrahuje organický materiál rozpouštědlem, tvořeným acetonem nebo ethanolem a dále obsahujícím fenanthrolin nebo jeho dimethylderivát, za vzniku extraktu s obsahem železa do 10 dílů hmotnostních na milion dílů hmotnostních,
b) na tento extrakt se působí proteolytickým činidlem, zvoleným ze skupiny zahrnující papain, pepsin, trypsin, pronasu a cysteinhydrochlorid,
c) takto ošetřený extrakt se uvede do styku s kolonou, plněnou pryskyřicí se skupinami kyseliny sulfonové ve formě tetrabuty lamoniové soli.
d) kolona se eluuje k získání roztoku, obsahujícího tetrabuty lamoniovou sůl kyseliny hyaluronové,
e) roztok se suší k získání zbytku, tvořeného tetrabuty lamoniovou solí kyseliny hyaluronové,
f) tento zbytek se rozpustí v aprotickém rozpouštědle.
g) roztok ze stupně f) se přefiltruje,
h) roztok ze stupně g) se promyje methylenchloridem,
i) na roztok ze stupně h) se působí halogenidem sodným za vzniku hyaluronátu sodného,
j) získaný hyaluronát sodný se vy sráží alkoholem, s výhodou ethanolem,
k) sraženina se rozpustí ve vodě a roztok se podrobí dialýze,
l) na dialyzovaný roztok se působí k vysrážení hyaluronátu sodného alkoholem, s výhodou ethanolem,
m) roztok uvedené sraženiny se podrobí molekulární filtraci přes membránu s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 30 000 D za vzniku roztoku, obsahujícího sodnou sůl kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 750 000 až 1 230 000 D.
Dalším předmětem vynálezu je farmaceutický prostředek, obsahující jako účinnou složku frakci kyseliny hyaluronové podle nároku 1.
Předmětem vynálezu je i výše uvedená frakce kyseliny hyaluronové pro použití v oční chirurgii, obecně v oboru oftalmologie a specificky při operacích zákalu nebo v případě implantátů oční čočky.
Následuje bližší popis tohoto vynálezu
Frakce podle vynálezu umožňuje zajímavé aplikace v oční chirurgii; produkt je výjimečně dobře tolerován, není zánětlivý a nezpůsobuje pooperační komplikace. Dále je značně výhodný v tom, že může být po chirurgickém zákroku ponechán in šitu, aniž by vedl k pooperačním komplikacím, jako je zvláště vysoký nitrooční tlak, atak snižuje dosavadní obvyklá rizika, způsobená manipulací při jeho odstraňování. Tato nová frakce čisté kyseliny hyaluronové ve formě sodné soli je v dalším popisu označována jako HA-1.
Podle objevu, na němž je založen vynález, je možno výhodně zasáhnout do postupu čištění integrálních kyselin hyaluronových nebo jejich solí, zejména alkalických solí, jako je především sodná sůl, převedením těchto kyselin nebo solí na kvartemí amonné soli daného typu. Tuto operaci je možno provést v kterémkoli stupni postupu čištění. Jelikož tyto kvartemí amonné soli jsou snadno rozpustné v určitých organických rozpouštědlech, jako jsou aprotická rozpouštědla, zejména N-methylpyrrolidon, mohou být těmito rozpouštědly extrahovány z vodné fáze, přičemž dochází k dalšímu speciálnímu čištění vzhledem k dosavadním metodám, které má zřejmě za následek stupeň čistoty produktů, získávaných na konci postupu. Převedení hyaluronové složky na kvartemí amonné soli je možno provádět například tak, že se na vodný roztok sodné soli, obsahující další soli, zejména chlorid sodný, působí s použitím reaktoru nebo kolony, obsahující makromolekulámí sulfonový měnič iontů ve formě soli s kvartemími amonnými bázemi, například pryskyřici DOWEX M-15, připravenou ve formě tetrabutylamonné soli, získatelné působením kvartemích hydroxidů amonných, například tetrabutylamoniumhydroxidu, na sulfonovou pryskyřici. Amonná sůl přechází do eluátu a je z ionexu zcela vymyta s vodou. Tento vodný extrakt se odpaří do sucha a zbytek, tvořený amonnou solí polysacharidu, se rozpustí v jednom z výše uvedených rozpouštědel a pak se odfiltrují nerozpustné pevné podíly.
Způsob podle vynálezu tedy obecně spočívá v čištění kyseliny hyaluronové nebo jedné z jejích molekulárních frakcí nebo jedné z jejích solí jejich převedením na odpovídající kvartemí amonnou sůl s nižšími (Ci_6).alifatickými uhlovodíkovými zbytky.
Dále způsob spočívá ve shromáždění kvartemí amonné soli kyseliny hyaluronové nebo jedné z jejích molekulárních frakcí v organickém rozpouštědle, schopném tyto soli rozpouštět, načež se z přefiltrovaného roztoku získá kyselina hyaluronová nebo její molekulární frakce ve formě
-4CZ 282248 B6 kovové soli, a takto získané soli se popřípadě podrobí dalšímu čištění, například již známým způsobem.
Vynález se tedy týká použití kvartemích amonných solí kyselin hyaluronových při extrakci 5 polysacharidu jak ze zvířecích orgánů, tak z totálních extraktů, přičemž čištění podle vynálezu je možno provádět v kterémkoli vhodném stupni postupu včetně operací, při nichž se provádí fragmentace a děleni molekulárních frakcí, i během veškerého dalšího zpracování těchto frakcí i dalšího čištění již izolovaných frakcí, buď čistých, nebo znečištěných, jak novým, tak známým způsobem.
Jak výše uvedeno, je možno převedení hyaluronového polysacharidu provádět v kterémkoli vhodném stupni procesu čištění, přičemž vhodný okamžik v každém konkrétním případě může určit odborník v oboru podle kriterií, určovaných konkrétní kombinací různých známých kroků, které byly zvoleny. Tyto obvyklé a známé stupně v podstatě obecně zahrnují:
1) extrakci polysacharidu (obvykle a převážně ve formě sodné soli) ze zvířecích orgánů, předem rozemletých a homogenizovaných. Provádí se obvykle organickým rozpouštědlem, mísitelným s vodou, jako je alifatický alkohol nebo nižší (Ci_ó) alifatický keton, například ethanol nebo aceton.
2) odstranění bílkovinných látek extrakcí vhodnými rozpouštědly nebo zpracováním vodného roztoku extraktu, získaného ve stupni 1), proteolytickým enzymem, jako je papain, pepsin. trypsin nebo pronasa. v přítomnosti tlumivého roztoku, například cysteinhydrochlorid-fosfátu.
3) dialýzu extraktu, získaného ve stupni 1) nebo 2).
4) sterilizaci roztoku, získaného v některém z předchozích stupňů, známým baktericidem. 25 například cetylpyridiniumchloridem v roztoku chloridu sodného. Tato operace se obvykle několikrát opakuje.
5) dělení frakcí hyaluronového polysacharidu nebo jejich příslušných solí s různou molekulovou hmotností nebo popřípadě odstraňování nežádoucích frakcí, například s okrajovými molekulovými hmotnostmi, tzn. s hodnotami příliš vzdálenými od deklarovaného rozmezí velikosti molekul. Tato operace se výhodně provádí formou molekulární ultrafiltrace, například známým způsobem.
6) izolaci vyčištěné frakce nebo příslušné soli (například sodné soli) z vodného roztoku srážením vhodným organickým rozpouštědlem, například alkoholem.
Pořadí těchto stupňů, popřípadě i dalších, již používaných v dosavadním stavu techniky nebo vypracovaných odborníky v oboru, je možno značně obměňovat. Specifický stupeň vynálezu, tj. vytvoření soli s kvartemími amonnými ionty, je možno zařadit libovolně, výhodně v té fázi, kdy je možno očekávat největší technologický efekt.
Amonná sůl polysacharidové komponenty může být z ionexové pryskyřice odstraněna přímo výše uvedenými rozpouštědly, která jsou schopna tuto sůl rozpouštět a jejichž příklady jsou výše vyjmenovány, ale výhodně se amonná sůl extrahuje nejprve vodou a pak se odpaří do sucha. Takto izolovaná amonná sůl se vyjme do výše uvedených rozpouštědel a roztok se pak přefiltruje.
Jeden z konkrétních způsobů provedení postupu podle vynálezu vyplývá z jeho zařazení do kombinace výše uvedených operací v uvedeném pořadí mezi stupně 2) a 3). Kromě známých metod čištění a specifického stupně podle vynálezu, tj. převedení kovových solí kyseliny hyaluronové na kvartemí amonné soli, je podle dalšího výhodného znaku vynálezu možno použít 50 chelatačních činidel pro ionty železa, výhodně ve výše uvedeném stupni 1). Je totiž známo, že ionty železa, vždy přítomné v originálních extraktech kyseliny hyaluronové a pocházející ze
- 5 CZ 282248 B6 zbytků krve z použitých zvířecích orgánů, způsobují depolymeraci polysacharidového řetězce. Odstranění kovových iontů se ukazuje jako velmi významné pro získání frakcí kyseliny hyaluronové s relativně vysokou molekulovou hmotností, a toho je možno dosáhnout chelatací. Tímto způsobem je možno nejen získat kyseliny hyaluronové nebo jejich soli s vysokou molekulovou hmotností, ale také zvlášť čisté produkty, které jsou stabilní ve vodných roztocích díky úplné absenci zmíněných iontů železa.
Výhodným předmětem vynálezu je tedy způsob, spočívající vtom, že se zvířecí orgány, obsahující kyselinu hyaluronovou a/nebo některou její sůl, extrahují organickým rozpouštědlem, mísitelným s vodou, v přítomnosti chelatačního činidla pro ionty železa, operace se opakuje do vymizení iontů železa, vysušený zbytek se vyjme do vodného rozpouštědla v přítomnosti proteolytického činidla a vhodného tlumivého roztoku a roztok, předem zbavený veškerých pevných zbytků, se nechá projít měničem iontů, tvořeným makromolekulámí sulfonovou pryskyřicí ve formě kvartemí amonné soli s nižším (Ci_6) alifatickým zbytkem. Eluát, odtahovaný z měniče iontů, se pak vysuší a rozpustí v organickém rozpouštědle, schopném rozpouštět kvartemí amonné soli kyselin hyaluronových ajejich frakce. Amonná sůl se pak převede na sodnou sůl přídavkem vodného roztoku halogenidů sodného, jako je chlorid nebo bromid sodný, k organickému roztoku. Takto získaný vodný roztok sodné soli se pak extrahuje organickými rozpouštědly, nemísitelnými s vodou, a popřípadě se podrobí opakované dialýze. Na získaný roztok se pak působí sterilizačním prostředkem a roztok získaný po sterilizaci je pak možno podrobit ultramolekulámí filtraci. Veškeré nežádoucí frakce hyaluronového polysacharidu se pak kanalizují a požadované frakce hyaluronátu sodného se izolují známým způsobem.
Rozpouštědly, vhodnými k rozpouštění kvarterních amonných solí podle vy nálezu, jsou aprotická rozpouštědla, mezi něž patří N-alkylpyrrolidony. zejména N-methylpyrrolidon, dialkylsulfoxidy, dialkylkarboxylamidy, jako jsou zejména nižší (Ci_6) dialkylsulfoxidy, zejména dimethylsulfoxid, a nižší (Ci_6) dialkylamidy nižších (Ci_6) alifatických kyselin, jako je dimethylnebo diethylformamid nebo dimethyl- nebo diacetylacetamid.
Tetraalkylamonnými bázemi, používanými k přípravě ionexové pryskyřice,· a tedy charakteristických amonných solí kyseliny hyaluronové, podle vynálezu, jsou báze s nižšími alifatickými zbytky', výhodně alkyly s 1 až 6 uhlíkovými atomy. Přednostně se používá pryskyřice ve formě soli s tetrabutylamonným iontem.
V uvedených kombinacích, používaných při postupech extrakce, čištění a izolace kyselin hyaluronových, jejich molekulárních frakcí a solí, a zejména v kombinaci, popsané výše jako výhodný postup podle vynálezu, je výhodné používat tato činidla:
a) k extrakci výchozího materiálu, tvořeného zvířecími orgány: ethanol nebo aceton,
b) jako chelatační činidlo pro ionty železa: 1,10-fenanthrolin nebo dimethylderivát,
c) jako ochranné prostředky: prostředky již uvedené,
d) jako rozpouštědla pro kvartemí amonné soli: N-methylpyrrolidon nebo dimethylsulfoxid,
e) jako rozpouštědlo k čištění vodného extraktu sodné soli, získaného z organického roztoku amonných solí: methylenchlorid, ethylacetát,
f) jako sterilizační činidlo: cetylpyridiniumchlorid v přítomnosti fosfátového pufru,
g) jako organické rozpouštědlo k vysrážení sodné soli z vyčištěného vodného roztoku, popřípadě .po ultrafiltraci: ethanol.
V uvedených postupech je možno dále používat obměny, které mohou v dalším zpracování přispívat k získání ještě čistších finálních produktů. Například použití sterilizačních činidel uvedeného typu, tj. kvarterních amonných solí s heterocyklickými jádry, obsahujících alkyly
-6CZ 282248 B6 s dlouhým řetězcem (například cetyl), jako je uvedený cetylpyridiniumchlorid, může současně sloužit jako čisticí stupeň, poněvadž přídavkem těchto látek k roztoku hyaluronátu sodného vzniká odpovídající amonná sůl s iontem kyseliny hyaluronové. Tyto soli se ve vodném roztoku srážejí, a tudíž je tímto zpracováním možno získat pomocí opakovaného srážení a promývání sraženin s následujícím rozpuštěním v roztoku chloridu sodného roztok hyaluronátu sodného, z něhož se izolují ultračištěné produkty. Tyto produkty jsou velmi vhodné k použití v oční chirurgii.
Molekulární ultrafiltrace se provádí známým způsobem. To znamená, že se používají membrány, které zachycují například frakce s vyšší molekulovou hmotností, například nad 200.000, aje-li to žádoucí, je možno oddělené frakce získávat jak z filtrovaného produktu, tak z membrány. Zvlášť zajímavý způsob provádění postupu podle vynálezu spočívá v kombinaci uvedených chemických čisticích operací s molekulární ultrafiltrací, která odstraňuje hyaluronové frakce s nízkou molekulovou hmotností. Tyto frakce jsou uznávanou příčinou výskytu zánětlivých účinků u produktů k terapeutickým účelům, jak je uvedeno v případě frakcí, popsaných v patentu EPO č. 0138572, uděleném 25.7.1990.
Dalším výhodným předmětem vynálezu tedy je výše uvedený postup, spočívající v detailní kombinaci čisticích operací, kde je popřípadě zařazena molekulární ultrafiltrace k odstranění frakcí o nízké molekulové hmotnosti, zejména frakcí s molekulovou hmotností nižší než 30.000. Tímto postupem, přesněji podrobným postupem podle příkladů 1 a 2, se získá frakce hyaluronátu sodného, velmi cenná z terapeutického hlediska, která, jak výše uvedeno, má označení HA-1. Je velmi zajímavá z hlediska použití v oční chirurgii.
Použití produktu v oční chirurgii
Kyseliny hyaluronové, popsané v literatuře a doporučované pro použití při operacích oka, nesplňují kriteria absolutní dokonalosti, zejména vzhledem ktomu. že nemohou být po chirurgickém zákroku, například po operaci šedého zákalu, ponechány na místě v důsledku přítomnosti zbytků nebo stop zánětlivých látek a složek s příliš vysokou molekulovou hmotností, a tedy s příliš velkou viskozitou. Kromě toho mohou způsobit, jak výše uvedeno, nežádoucí a nebezpečný vzrůst očního tlaku.
Exogenní HA, zaváděná během chirurgického zákroku do přední komory, by neměla mít negativní účinky na pooperační nitrooční tlak ani by neměla spouštět zánětlivé pochody v nitroočním prostředí. První uvedený negativní účinek byl opakovaně popsán v literatuře po použití HA s velmi vysokou molekulovou hmotností s velmi vysokým stupněm viskozity (Binkhorst C. D.: Inflammation and intraocular pressure after the use of Healon in intraocular lens surgery. Am. Intra-Ocular Implant. Soc., J., 6, (4), 340-341, 1980; Pape L.G.: Intracapsular and extracapsular technique of lens implantation with Healon. Am. Intra-Ocular Implant. Soc. J., 6, (4), 342-343, 1980; Passo M. S. ad.: Intraocular pressure following cataract surgery using Healon. ARVO abstracts, 10, 10:45, 1981; Percival P.: Experiences with the Boberg Ans lens and sodium hyaluronate (Healonid). Trans. Ophthal. Soc. UK, 102, (2). 294-297, 1982; McRae
S.M. a d.: The effects of sodium hyaluronate, chondroitin sulphate, and methylcellulose on the comeal endothelium and intraocular pressure. Ann. J. Ophthalmol., 95, 332-341, 1983).
Tyto poznatky vedly k doporučení odstraňovat tuto látku promytím fyziologickým roztokem po operaci. Berson a d. (Berson F.G. a d.: Obstruction of aqueous outflow by sodium hyaluronate in enucleate human eyes. Am. J. Ophthalmol., 95, 668-672, 1983) studovali mechanismus tohoto nepříznivého jevu na posmrtném enukleovaném lidském oku a vyslovili domněnku, že základní příčinou je mechanická obstrukce fyziologického odtokového systému v přední komoře v důsledku extrémní viskozity zavedené látky.
-7 CZ 282248 B6
Frakce hyaluronátu sodného, popsaná v Balazsově patentu US 4,141.973, o molekulové hmotnosti 1,586.000 (viz sloupec 13 citovaného patentu) je produkt, který se vzhledem ke svým uvedeným fyzikálně-chemickým a biologickým vlastnostem jeví jako nejlepší oftalmologický produkt na trhu. Je znám pod označením Healon; není však prost výše uvedených nevýhod. To znamená, že má v podstatě příliš vysokou molekulovou hmotnost, a tudíž nevhodnou viskozitu pro některé operace oka.
Potvrzuje to skutečnost, že přestože test, uvedený v citovaném patentu (k měření antiflogistického účinku) poskytuje příznivé údaje, nelze Healon po chirurgickém výkonu, například po operacích šedého zákalu, ponechat na místě, neboť by mohl způsobit pooperační komplikace, jako je vzrůst očního tlaku.
V patentu US 4,920.104 Dále P. de Vore (převedeném na Med Chem Products, lne. Acton, Mass.) je popsán a nárokován viskoelastický roztok hyaluronátu sodného ve fyziologickém roztoku, který má kinematickou viskozitu 45.000 až 64.000 cSt a obsahuje hyaluronát sodný o střední molekulové hmotnosti v rozmezí 1,000.000 až 2,000.000 Dalton. Tento produkt je také deklarován pro použití při chirurgických operacích oka, kde je jeho aplikace výhodnější než v případě jiných přípravků vzhledem k menším pooperačním vedlejším účinkům, zejména pokud jde o vzrůst pooperačního očního tlaku.
Tento produkt je však rovněž nutno po chirurgickém výkonu odstraňovat, jak je patrné z tabulek 2 a 3 ve sloupci 4 citovaného patentu, zatímco tabulka 1 ukazuje, že při ponechání produktu na místě po chirurgickém zákroku dojde k vzrůstu očního tlaku.
Jiná frakce hyaluronátu sodného pro použití v ofitalmologii je popsána v evropském patentu č. 0138572 a má střední molekulovou hmotnost v rozmezí 500.000 až 730.000 Dalton (HYALECTIN). Lze ji obvykle použít k náhradě endobulválních tekutin a používá se rovněž při operacích oka, například v případě šedého zákalu a očních implantů. Existovala však potřeba produktů s větší viskoelasticitou, schopných udržovat během chirurgického výkonu v přední komoře správné intervaly, a tak vyrovnávat sklivcovou odezvu a dosáhnout účinného ochranného účinku na endookulámí strukturu bez nutnosti odstraňování po chirurgickém výkonu. Jak je patrné z uvedených skutečností, produkty s vyšší molekulovou hmotností, popsané v literatuře a použité při uvedených operacích oka, musely být vždy po chirurgickém výkonu odstraňovány. Podstata tohoto vynálezu spočívá ve vypracování originálního postupu k získání frakcí hyaluronátu sodného s relativně vysokou molekulovou hmotností, zahrnujícího přídavek chelatačního činidla pro ionty železa kextrakčnímu roztoku, zabraňující depolymeraci na nízkomolekulámí frakce, přičemž získané frakce jsou prosty nečistot nebo frakcí, které by znemožňovaly ponechání produktu v organismu. Nová frakce HA-1 podle vynálezu tedy představuje zajímavou novinku a velký krok kupředu v dosavadním stavu techniky.
Frakce HA-1 podle vynálezu, připravitelná postupem, popsaným v příkladech 1 a 2, má tyto charakteristiky:
Viskozita: limitní viskozitní číslo v rozmezí 14,5 až 21 dl/g, měřeno při 25 °C v 0,15M NaCI při pH 7,0 Ubbelohdeho viskozimetrem se zavěšenou hladinou. To odpovídá průměrné molekulové hmotnosti v rozmezí 750.000 až 1,230.000 Dalton (výhodně mezi 925.000 až 1,230.000 Dalton).
Obsah bílkovin: obsah bílkovin nepřesahuje 0,2 %, vyjádřeno jako albumin, stanoveno Lowryho testem (Lowry J. a d.: Protein Measurement with the folin phenol reagent. J. Biol., Chem. 193, 265-275,1951).
UV spektrum: UV absorbance při 257 nm a při 280 nm nepřesahuje 1,0 A.U., měřeno v 1% vodném roztoku.
-8CZ 282248 B6
Dynamická viskozita: dynamická viskozita 1% roztoku v 0,15M NaCI při pH = 7,0 nepřesahuje při definovaných smykových rychlostech s použitím rotačního viskozimetru, například popsaného v U.S. Pharmacopea XXII ed. (911), str. 1619, při teplotě 20 °C tyto hranice:
Smyková rychlost______Dynamická viskozita (mPa.s. při 20 °C) s'1 s1
100 s350 s'1 ne více než 20.000 mPa.s ne více než 2.000 mPa.s ne více než 1.000 mPa.s ne více než 500 mPa.s
Sulfátovanv mukopolvsacharid: obsah nepřevyšující 0,07 %, počítáno jako síra, stanoveno na zařízení s indukčně vázaným plasmatem (ICP) s použitím vhodné referenční látky.
Železo: obsah železa nepřesahuje 10 ppm, stanoveno atomovou absorpcí nebo metodou ICP.
Stabilita: stabilita tlumených isotonických roztoků s fyziologickým pH frakce HA-1. podrobených přirozenému stárnutí a tepelné sterilizaci, stanovená určením limitního viskozitního čísla a vyjádřená jako odpovídající pokles střední molekulové hmotnosti, nepřesahuje tyto hranice:
- 97 % počáteční hodnoty (skladování při 25 °C, 6 měsíců)
- 75 % počáteční hodnoty (sterilizace při 118 °C. 32 min)
- 80 % počáteční hodnoty (sterilizace při 121 °C, 16 min)
- 90 % počáteční hodnoty (sterilizace při 124 °C, 8 min)
Výhodné vlastnosti hyaluronové frakce HA-1 podle vynálezu je možno prokázat těmito experimenty:
Nitrooční tolerance frakce HA-1 u opic
CÍL
Tento test byl proveden za účelem zjištění oftalmologické tolerance u opic po injekci HA-1 do očního sklivce.
MATERIÁLY A METODY
1. Pokusný druh
Ke studiu bylo použito šest mladých dospělých samic druhu Macaca fascicularis. Byly v dobrém zdravotním stavu a neměly detekovatelné oční lese.
Primáti byli zvoleni ke studiu proto, že jsou považováni za optimální druhy pro studium oftalmologické tolerance viskoelastických produktů, používaných v oční chirurgii.
Makakové byli zvoleni proto, že druh Douroucoulis, který byl pro studia oftalmologické tolerance používán dříve, je nyní ohrožen a podléhá zákonné ochraně.
-9CZ 282248 B6
2. Pokusné skupiny a příslušné ošetření
Označení skupin a velikost dávek:
Opice byly ošetřeny podle tohoto schématu:
| číslo | velikost | místo injekce | |
| zvířete | dávky (ml) | pravé oko | levé oko |
| 1 | 0,5 | fyziol. roztok | HA-1 |
| 2 | 0,5 | HA-1 | fyziol. roztok |
| 3 | 0,5 | fyziol. roztok | HA-1 |
| 4 | 0,5 | HA-1 | fyziol. roztok |
| 5 | 0.5 | fyziol. roztok | HA-1 |
| 6 | 0,5 | HA-1 | fyziol. roztok |
3. Příprava a podávání prostředku
V den chirurgického výkonu byly opice anestetizovány ketaminhydrochloridem s přídavkem pentobarbitalu sodného. Zornice pak byly dilatovány místní aplikací 1,0% tropikamidu (Mydriacyl, Alcon Laboratories). Rohovka, spojivka, adnexa a přední segment byly vyšetřeny biomikroskopem se štěrbinovou lampou a zadní segment nepřímým oftalmoskopem. Peripalpebrální kůže byla připravena k chirurgickému výkonu dvojnásobným oplachem 0,5% povidonovým jodem a sterilním fyziologickým roztokem. Byla umístěna sterilní rouška a víčkové spekulum a bulva byla stabilizována malými zubními kleštěmi. Byly použity ostré a tupé řezy k vytvoření spojivkového laloku limbálního tvaru o délce přibližně 10 až 15 mm ve vzdálenosti přibližně 10 mm od vyššího limbu a rovnoběžně sním. Řezy byly vedeny skrze spojivku aTenonův váček do episklery. Lalok byl připraven předním řezem do limbu a přetažením spodní bělimy přes pars plana. Přibližně 5 až 6 mm od limbu byla umístěna síťová sutura Vicyrl 7-0 (Ethicon) se záběry v rozestupech přibližně 3 mm.
Jehla, kalibrovaná na 25 ml, byla použita k odsátí 0,5 ml sklivce (u dvou zvířat bylo možno odsát pouze 0,4 ml); sklivec byl nahrazen stejným objemem HA-1 (12 mg/ml) nebo sterilního fyziologického roztoku. Síťová sutura byla zajištěna proti úniku a spojivkový lalok byl vrácen na původní místo. Topickv byla nanesena antibiotická mast. V odsátém sklivci bylo provedeno před podáním a přibližně 48 h po podání počítání sklivcových buněk pomocí hemacytometru.
4. Zjištěné údaje
Přibližně po 48 h po chirurgickém výkonu byla zvířata anestetizována a provedeno ofitalmologické vyšetření. Anestesie, dilatace a vyšetření bylo provedeno výše popsaným způsobem. Vyšetření bylo s ohledem na to, zda bylo příslušné oko injikováno HA-1 nebo kontrolní látkou, prováděno naslepo. Parametry oka byly podle standardní stupnice označeny tímto způsobem:
Spojivkový edem, injekce a vyloučení, rohovkový edem, herny, buňky a rozšíření:
= normální +1 = lehký +2 = mírný +3 = těžký nebo intenzivní
- 10CZ 282248 B6
Čirost sklivce:
= čirý = lehký zákal - pozadí viditelné = mírný zákal - pozadí sotva viditelné = zákal - červený reflex pozadí = zákal - šedý reflex pozadí = pozadí neviditelné
Oči byly připraveny pro odsátí pomocí výše uvedeného povidonového jodového roztoku. Bylo umístěno víčkové spekulum a bulva byla stabilizována malým zubním držákem. Sklivec (0,1 až 0,2 ml) byl odsát přímo skrze spojivku abělimu 6 mm od limbu ve vyšším temporálním kvadrantu. Bylo dbáno, aby nebylo dotčeno místo původního zákroku. Byly spočítány zánětlivé buňky pomocí hemacytometru. Opět byla topicky aplikována antibiotická mast.
VÝSLEDKY
Získané údaje (tabulka 1) demonstrují, že HA-1 byla velmi dobře tolerována a nevyvolala významné podráždění oka ve srovnání s kontrolní látkou (fyziologickým roztokem).
Dvě zvířata ve skupině fyziologického roztoku vykázala slabou infiltraci vody do buňky a rozšíření. Počet bílých krvinek kontrolního sklivce se pohyboval mezi 10 a 60 buňkami na mm3. Jedno oko po injekci HA-1 vykázalo slabou infiltraci vody do buňky a rozšíření. Počet bílých krvinek sklivce se u pokusných očí pohyboval od 0 do 30 buněk na mm3.
Tabulka 1. Oční tolerance HA-1 (oproti fyziologickému roztoku)
| pravé oko | levé oko | |||
| doba (h) | 0 | 48 | 0 | 48 |
| spoj ivka - edem | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 |
| injekce | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 |
| vyprázdnění | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 |
| rohovka - edem | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 |
| přední komora - herny | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 |
| rozšíření | 0/6 | + 1/6 | 0/6 | +2/6 |
| buňky | 0/6 | + 1/6 | 0/6 | +2/6 |
| čočka - zákal | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 |
| sklivec - čirost | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 |
| počet buněk | 0(1/6); | 0(2/6); | 0(2/6); | 0-5-10 |
| 10 b, | 20 b | 0 b, | 15-30-60 | |
| málo č | (2/6); | málo č | bílých’ | |
| (1/6); | 10 b | (2/6); | ||
| 10 b. | (1/6): | 10 b, | ||
| mnoho č | 10 b, | mnoho č | ||
| (1/6); | málo č | (2/6) | ||
| 0 b, | (1/6) |
málo č (3/6) pravé oko injikováno 0,5 ml fyziologického roztoku, levé oko injikováno 0,5 ml HYALOFIL * - jedna hodnota pro každou opici
-11CZ 282248 B6
Ze srovnání s kontrolními pokusy s fyziologickým roztokem tedy vyplývá, že v případě intravitreální náhrady je HA-1 velmi dobře tolerována očními tkáněmi.
Klinické zkoušky účinnosti HA-1 oproti HEALONu při chirurgické extrakci extrakapsulámí 5 katarakty s implantací intraokulámí čočky do zadní komory.
CÍL
Dále popsané experimenty měly za úkol zjistit účinnost a bezpečnost HA-1 ve srovnání 10 s předním obchodně dostupným viskoelastickým materiálem (Healon) při odstranění zákalu a implantaci intraokulámí čočky při dvou klinických zkouškách. Při první klinické zkoušce byly HA-1 i Healon testovány za stejných experimentálních podmínek (odsátí po chirurgickém zákroku). Druhá zkouška byla zaměřena zejména na bezpečnost HA-1 s ohledem na vzestup nitroočního tlaku a počtu endotheliálních buněk; při této zkoušce (na rozdíl od první, kde byly 15 oba viskoelastické materiály po chirurgickém zákroku odsáty) nebyla HA-1 po skončení chirurgického zákroku odstraňována, zatímco Healon byl z oka odsát.
MATERIÁLY A METODY
1. Projekt experimentu
Při obou zkouškách byly použity namátkově vybrané paralelní skupiny, skrytý pozorovatel (vyšetření prováděli různí pracovníci) a byla zkoumána HA-1 oproti Healonu při extrakci extrakapsulámí katarakty s implantací intraokulámí čočky do zadní komory. Pro obě zkoušky 25 přicházeli v úvahu pacienti s primární diagnózou senilní katarakty a starší 18 let.
Pro první zkoušku bylo získáno 217 pacientů a namátkové rozdělení bylo provedeno zhruba v poměru 3 : 1 (161 pacient HA-1, 56 pacientů Healon). Po chirurgickém zákroku byly oba viskoelastické materiály odsáty. Doba experimentu zahrnovala předoperační vyšetření, operační 30 proceduru a okamžité pooperační sledování. Nitrooční tlak byl měřen 3 h po operaci a vyšetření bylo provedeno 1, 7 a 30 dní po operaci.
Pro druhou zkoušku bylo použito 91 pacientů a namátkově ošetřeno HA-1 (45) nebo Healonem (46) v poměru zhruba 1 : 1. Při této zkoušce nebyla HA-1 po operaci odsáta, zatímco Healon byl 35 odsát stejně jako při první zkoušce. Průběh experimentu (a relativní studijní materiál pro HA-1) byl stejný jako při první zkoušce. Pooperační nitrooční tlak byl při této zkoušce měřen 1, 3, 6 a 9 h po operaci (častěji než při první zkoušce) a vyšetření bylo prováděno 1, 7, 30 a 90 dní po operaci. Zkouška zahrnovala vyšetření spekulámím mikroskopem v základním stavu a 90 dní po operaci.
2. Analýza dat a statistické metody
Statistická analýza byla použita ke stanovení středu a komparability ošetřovaných skupin (a=0,10) a bezpečnosti a účinnosti (α=0,05). K vyhodnocení dat byly použity Fisherovy exaktní 45 testy, t-testy, deskriptivní statistika.
3. Testovaný soubor a jeho charakteristika
Bylo studováno celkem 308 pacientů, rozdělených takto:
- 12 CZ 282248 B6
1.zkouška
| HA-l | Healon | celkem | |
| počáteční stav | 158 | 56 | 214 |
| 1. den | 158 | 56 | 214 |
| 7. den | 158 | 56 | 214 |
| 30. den | 157 | 54 | 211 |
| 90. den | - | - | - |
2. zkouška
| HA-1 | Healon | celkem | |
| počáteční stav | 41 | 46 | 87 |
| 1. den | 41 | 46 | 87 |
| 7. den | 39 | 45 | 84 |
| 30. den | 41 | 44 | 85 |
| 90. den | 42 | 43 | 85 |
Mezi jednotlivými ošetřovanými skupinami při obou zkouškách nebyly významné rozdíly z hlediska demografického, lékařského nebo charakteristiky zákalu.
4. Chirurgický zákrok
Příprava a metody: Zákrok byl proveden standardním chirurgickým postupem, používaným na. daném pracovišti pro nekomplikovanou extrakci senilní a zralé extrakapsulámí katarakty s transplantací intraokulární čočky do zadní komory. Preoperativní (profy faktická) medikace, anestesie a další intraoperativní medikace byly prováděny standardním postupem daného pracoviště, avšak bez použití očních antihypertensiv. Preincisní nitrooční tlak byl co nejvíce snížen pomocí Honanova zařízení, zařízení Super Pinky nebo manuálně. Viskoelastické látky (HA-1 a Healon) byly aplikovány dále popsaným způsobem.
Produkty byly po zákroku odstraněny s výjimkou HA-1, použité při druhé klinické zkoušce, která byla ponechána na místě.
HA-1 i Healon byly vpraveny do přední komory za účelem usnadnění chirurgického postupu a ochrany očních tkání.
První zkouška: průměrné množství použité HA-1 (0,568 ml o koncentraci 12 mg/ml) bylo významně vyšší než množství použitého Healonu (0,439 o koncentraci 10 mg/ml), přestože rozdíl činil pouze 0,129 ml.
Druhá zkouška: V průměrném množství použité viskoelastické látky nebyl významný rozdíl; v tomto případě bylo průměrné množství 0,957 (HA-1) a 0,833 (Healon).
5. Hodnocení
Před chirurgickým zákrokem, během něho a po něm byly provedeny tyto zkoušky:
a) předoperační vyšetření, například ke zjištění
- ostrosti vidění (optimální manifestace), tonometrie, metoda pachymetrie (pro tloušťku rohovky) a vyšetření štěrbinovou lampou a oftalmoskopem
- spekulámí mikroskopie (pouze druhá zkouška): pomocí spekulámího mikroskopu byly počítány endotheliální buňky na 10 zvolených místech v centru rohovky. Každý počet byl upraven příslušným faktorem k získání počtu buněk na čtverečný milimetr a zprůměrován k získání reprezentativního počtu buněk na čtverečný milimetr..
b) pooperační vy šetření, jako je
- nitrooční tlak (tonometrií), měřen:
- 3 h po operaci (první zkouška)
- 1-3-6-9 h po operaci (druhá zkouška)
- vyšetření oftalmoskopem a štěrbinovou lampou, pachymetrie, tonometrie, spekulámí mikroskopie (posledně uvedená pouze při druhé zkoušce pro počítání endotheliálních buněk) a měření ostrosti vidění (při kontrolních vyšetřeních) bylo prováděno:
- při první zkoušce po 1-7-30 dnech
- při druhé zkoušce po 1-7-30-90 dnech.
VÝSLEDKY
1. Operační hodnocení - manipulační vlastnosti použitých viskoelastických materiálů
Viskoelastické materiály byly hodnoceny jako usnadňující implantaci čočky ve srovnatelných poměrech u každé ošetřované skupiny při obou klinických zkouškách.
2. Pooperační komplikace
2. a) První klinická zkouška
Jak je patrné z tabulky 2:
- největší procento komplikací (u 7,9 % všech pacientů) se vyskytovalo mezi operací a 1. dnem, menší procento bylo zaznamenáno v 7. a 30. dnu,
- 1. den po operaci byl podíl pacientů, ošetřených Healonem (14,3 %) a trpících komplikacemi, 2,5krát vyšší než u pacientů, ošetřených HA-1 (5,7 %). Tento rozdíl byl statisticky významný (podle Fisherova dvoupolohového exaktního testu p=0,079y). Rozdíly v 7. a 30. dnu nebyly statisticky významné (podle Fisherova dvoupolohového exaktního testu p>0,6). Komplikace zahrnovaly vzrůst nitroočního tlaku na 30 mm Hg i více (7/158 = 4,4 % pacientů ošetřených HA-
1, 5/56 = 8,9 % pacientů ošetřených Healonem) a korneální edem, iritis, konjunktivitis, hyphému, makuíámí edem, únik z rány, krvácení řasinkové blány a podspojivky.
Jak je patrné z tabulky 3, kde jsou zaznamenány tonometrické hodnoty, získané před a po operaci (po době 3 h a 1-7-30 dní):
- mezi ošetřenými skupinami nebyly významné rozdíly nitroočního tlaku, avšak pacienti ošetření Healonem měli vy šší vzestup středního nitroočního tlaku po 3 h i 1 dnu a významně větší standardní odchylku nitroočního tlaku po 1 dnu než pacienti ošetření HA-1.
Vyšetření štěrbinovou lampou, pachymetrie (na tloušťku rohovky) a otfalmoskopem neukázalo rozdíly mezi oběma skupinami..
2. b) Druhá klinická zkouška
- u mírně vyššího podílu pacientů ošetřených Healonem (37,0 %) než v případě HA-1 (28,6 %) byly zaznamenány pooperační komplikace (tabulka 4). Komplikace zahrnovaly vzestup nitroočního tlaku (5/42 = 11,9 % pacientů ošetřených HA-1, 11/46 = 23,9 % pacientů ošetřených Healonem) a případy hyphémy, úniku z rány, krvácení sklivce, zakalení zadního pouzdra,
- 14 CZ 282248 B6 oddálení cévnatky, atrofie duhovky a makulámího edemu.
- obě ošetřené skupiny se statisticky nelišily s ohledem na střední nitrooční tlak ani jeho variabilitu v základním stavu nebo v době od 1. do 90. dne (tabulka 5). Během prvních 9 h po operaci se zdá, že Healon (odstraněný z oka) a HA-1 (ponechaná na místě) vyvolávají distribuci pooperačního nitroočního tlaku, která je primárně odlišná s ohledem na standardní odchylku.
Pacienti ošetření Healonem měli větší standardní odchylku a významně vy šší střední hodnotu 1 h po operaci, zatímco pacienti ošetření HA-1 měli větší, avšak pouze okrajově významné standardní odchylky 6 a 9 h po operaci. 1 h po operaci mělo 22,7 % pacientů ošetřených Healonem a 10 % pacientů ošetřených HA-1 nitrooční tlak 21 mm Hg nebo více. 6 a 9 h po ío operaci měly hodnotu tlaku 21 mm Hg nebo vyšší srovnatelné podíly pacientů ošetřených HA-1 (73,2 % po 6 h a 65,0 % po 9h) a Healonem (68,2 % po 6 h a 71,4 % po 9 h).
- mezi oběma skupinami nebyl zjištěn žádný další rozdíl ohledně pozorování, zaznamenaných při první zkoušce. Významný rozdíl nebyl zjištěn ani spekulámí mikroskopií (počet endotheliálních buněk, tabulka 6).
3. Kvantitativní závěry
Měření ostrosti vidění ukázalo, že účinnost obou viskoelastických látek je srovnatelná:
- při první klinické zkoušce nebyl zjištěn významný rozdíl mezi podílem pacientů ošetřených 20 Healonem (77,8 %) a HA-1 (84,7 %), kteří dosáhli 30. den ostrosti vidění 20/40.
- při druhé klinické zkoušce nebyl zjištěn významný rozdíl mezi podílem pacientů ošetřených Healonem (73,9 %) a HA-1 (71,4 %), kteří dosáhli 30. den ostrosti vidění 20/40 nebo lepší. 90. den byly jejich podíly téměř shodné.
Tabulka 2. Pooperační komplikace: první klinická zkouška
| pacienti | pacienti | pacienti | |
| sHA-l | s Healonem | celkem | |
| N= 158 | N = 56 | N = 214 | |
| N (%) | N (%) | N (%) | |
| 1. den | |||
| ne | 149 (94,3) | 48 (85,7) | 197 (92,1) |
| ano | 9 (5,7) | 8(14,3) | 17(7,9) |
| 7. den | |||
| ne | 153 (98,1) | 55 (98,2) | 208 (98,1) |
| ano | 3 (1,9) | 1(1,8) | 4(1,9) |
| 30. den | |||
| ne | 154(98,1) | 52 (96.3) | 206 (97,6) |
| ano | 3(1,9) | 2 (3,7) | 5 (2,4) |
podíl pacientů ošetřených Healonem s komplikacemi je významně vyšší (podle Fisherova dvoupolohového exaktního testu p=0,079) než u pacientů ošetřených HA-1
Tabulka 3. Stanovení nitroočního tlaku (tonometrie, mm Hg): první klinická zkouška
Prechirurgie
| skupina | N | střed | stand. odchylka |
| celkem | 213 | 16,671 | 3,598 ' |
| HA-1 | 157 | 16,682 | 3.Ί4Ί |
| Healon | 56 | 16,643 | 3,176 |
- 15 CZ 282248 B6
| ošetřená skupina Nitrooční tlak po 3 h | N | střed | st. odchylka |
| celkem | 176 | 18,077 | 7,760 |
| HA-1 | 129 | 18,027 | 7.417 |
| Healon | 47 | 18,213 | 8,718 |
| 1. den | |||
| celkem | 212 | 19,146 | 7,497 |
| HA-1 | 157 | 18,580 | 6,865* |
| Healon | 55 | 20,327 | 6,453 |
| 7. den | |||
| celkem | 200 | 14,431 | 3,979 |
| HA-1 | 148 | 14,468 | 4,147 |
| Healon | 52 | 14,327 | 3,491 |
| 30.den | |||
| celkem | 207 | 15,002 | 3,730 |
| HA-l | 154 | 14,932 | 3,744 |
| Healon | 53 | 15,208 | 3,718 |
Standardní odchylky obou ošetřených skupin v 1. dni jsou významně odlišné (podle F-testu p=0.0508)
Tabulka 4. Pooperační komplikace: druhá klinická zkouška
| pacienti sHA-1 N = 42 N (%) | pacienti s Healonem N = 46 N (%) | pacienti celkem N = 88 N (%) | |
| pooperační komplikace | |||
| ne | 30(71,4) | 29 (63,0) | 59 (67,0) |
| ano | 12 (28,6) | 17(37,0) | 29 (33,0) |
Tabulka 5. Celková tonometrická statistika podle ošetřených skupin
| ošetřená skupina | N | střed | st. Odchylka | |
| Prechirurgie | celkem | 86 | 15,256 | 3,365 |
| HA-1 | 40 | 15,575 | 3,296 | |
| Healon | 46 | 14,978 | 3,435 | |
| 1 h po operaci | celkem | 84 | 12,167 | 9,937 |
| HA-1 | 40 | 9,925* | 7,430’* | |
| Healon | 44 | 14.206 | 11,473 | |
| 3 h po operaci | celkem | 84 | 23,012 | 14,244 |
| HA-1 | 41 | 22,805 | 15,481 | |
| Healon | 43 | 23,209 | 13,139 |
- 16CZ 282248 B6
Tabulka 5. Celková tonometrická statistika podle ošetřených skupin - pokračování
| 6 h po operaci | ||||
| celkem | 85 | 27,318 | 12,200 | |
| HA-1 | 41 | 28,707 | 13,757 | |
| Healon | 44 | 26,023 | 10,542 | |
| 9 h po operaci | ||||
| celkem | 82 | 26,451 | 11,863 | |
| HA-1 | 40 | 27,050 | 13,449' | |
| Healon | 42 | 25,881 | 10,261 | |
| 1. den | ||||
| celkem | 87 | 20,839 | 8,868 | |
| HA-1 | 41 | 21,805 | 9,474 | |
| Healon | 46 | 19.978 | 8,301 | |
| 7. den | ||||
| celkem | 84 | 14,381 | 5,411 | |
| HA-1 | 39 | 15,051 | 5,973 | |
| Healon | 45 | 13,800 | 4,865 | |
| 30. den | ||||
| celkem | 83 | 14,313 | 3,732 | |
| HA-1 | 40 | 14,825 | 3,761 | |
| Healon | 43 | 13.837 | 3,683 | |
| 90. den | ||||
| celkem | 80 | 13,138 | 3,252 | |
| HA-1 | 39 | 13,128 | 3,357 | |
| Healon | 41 | 13,146 | 3,190 |
Obě ošetřené skupiny se významně liší s ohledem na nitrooční tlak (podle t-testu p=0,0442, upraveno na nerovné odchylky).
Standardní odchylky ošetřených skupin se významně liší (podle F-testu p=0,0070).
Standardní odchylky ošetřených skupin mají okrajově významnou odlišnost (podle F-testu p=0,0886).
Standardní odchylky ošetřených skupin mají okrajově významnou odlišnost (podle F-testu p=0,0898).
Tabulka 6. Souhrnná statistika spekulámí mikroskopie pro počítání endotheliálních buněk
| ošetřená skupina | N | střed | st. odchylka |
| Prechirurgie | |||
| celkem | 85 | 2283,1 | 451,24 |
| HA-1 | 40 | 2234,6 | 433,72 |
| Healon | 45 | 2326,1 | 466,86 |
| 90. den | |||
| celkem | 80 | 2158,1 | 505,73 |
| HA-1 | 39 | 2068,2 | 585,52 |
| Healon | 41 | 2243,5 | 405,08 |
- 17CZ 282248 B6
ZÁVĚRY
Výsledky dvou popsaných klinických zkoušek ukazují vysokou účinnost použití HA-1 při extrakci katarakty a implantaci nitrooční čočky. Bylo zejména prokázáno, že HA-1 je velmi dobře tolerována. Tento produkt totiž vyvolává méně (asi 2,5krát) pooperačních komplikací než Healon, testovaný za stejných podmínek, tzn. s odstraněním látky po chirurgickém zákroku (jak je popsáno v první klinické zkoušce). Mezi pooperačními komplikacemi je nutno brát v úvahu především vzestup nitroočního tlaku.
Je třeba upozornit, že se při jednotlivých zkouškách pooperační stav pacientů, ošetřených jednak HA-1 ajednak Healonem, lišil, pokud jde o nitrooční tlak. Při první zkoušce, při níž byla po chirurgickém zákroku odstraněna jak HA-1, tak Healon, se v porovnání s pacienty ošetřenými HA-1 projevil 1 den po operaci u většího podílu pacientů ošetřených Healonem vzestup nitroočního tlaku nad 21 mm Hg. Při druhé zkoušce, kde HA-1 nebyla po zákroku odstraněna, zatímco Healon ano, byly pooperační profily nitroočního tlaku u HA-1 srovnatelné.
Z uvedených skutečností vyplývá, že některé aspekty obou viskoelastických produktů jsou srovnatelné, ale s ohledem na pooperační komplikace se oba liší; Healon odstraňovaný z oka se zdá být spojen s větším vzestupem nitroočního tlaku než HA-1 odstraňovaná z oka a HA-1 ponechaná na místě vykazuje pooperační nitrooční profil srovnatelný s Healonem, odstraněným po zákroku.
Na základě těchto výsledků je nutno zdůraznit možnost ponechání HA-1 na místě bez vyvolání pooperačních komplikací. Tato možnost nabízí tyto významné výhody:
1. Zjednodušuje chirurgický postup vynecháním extrakce produktu po zákroku.
2. Snižuje riziko komplikací v důsledku manipulace (tj. během odsávání). Příklady takového rizika jsou traumata vlivem chirurgických postupů a jejich příslušných následků.
Vynález se rovněž týká farmaceutických prostředků, obsahujících jako účinnou složku novou molekulární frakci kyseliny hyaluronové ve formě sodné soli, HA-1, zejména ve formě fyziologických roztoků s neutrálním pH. Zvolená koncentrace HA-1 je taková, aby se dosáhlo požadovaného stupně viskozity, například asi 300 mPa.s (při 350 s'1) a asi 10.000 mPa.s (při 1 s’‘)·
Vynález se také týká použití nové frakce hyaluronátu sodného HA-1 v oční chirurgii, zejména při operacích zákalu nebo v případě implantů čoček.
Příklady provedení wnálezu
Příklad 1
Postup získání frakce HA-1 a její relativní charakterizace
Slepičí hřebínky, buď čerstvé, nebo zmrazené (3.000 g), se umelou v mlýnku na maso a pak se důkladně homogenizují v mechanickém homogenizátoru. Získaná pasta se umístí do skleněné nádoby s 1.0 objemy bezvodého acetonu nebo ethanolu, obsahujícího .0,1 % (hmotnost/objem) specifického chelatačního činidla pro železo.
Příkladem vhodného chelatačního činidla je 1,10-fenanthrolin (C.A.R.N. 66-71-7) nebo jeho dimethylderiváty. Skleněná nádoba a chelatační činidlo se používá k vyloučení depolymerace
- 18CZ 282248 B6 sodné soli kyseliny hyaluronové, která by jinak mohla být způsobena ionty železa z ocelových nádob nebo zbytků krve.
Slepičí hřebínky se zpracovávají do úplného odstranění iontů železa (instrumentální kontrola: absorbance komplexu železo-chelatační činidlo v acetonové nebo ethanolické fázi v 1 cm kyvetách při vlnové délce maximální absorpce - 510 nm v případě 1,10-fenanthrolinu, ne více než 0,005 A.U.).
Provede se další promytí stejným objemem bezvodého acetonu (nebo ethanolu) k odstranění veškerých zbytků chelatačního činidla. Toto zpracování se provádí až do negativního výsledku testu A:
Test A: 5 ml acetonové (nebo ethanolické) fáze se odpaří pomocí mírného proudu dusíku. Zbytek se rozpustí v 5 ml vody a změří se absorbance při vlnové délce maximální absorpce chelatačního činidla.
Výsledek testu se považuje za negativní, je-li absorbance nižší než 0,1 A.U.
Konečný reakční produkt se 6 h míchá s rychlostí otáčení 50 min'1 a nechá se 12 h separovat, načež se rozpouštědlo přečerpá sifonem a vypustí.
Tento extrakční postup se opakuje do dosažení správné hodnoty vlhkosti rozpouštědla (KarlFischerova metoda).
Získaná látka se pak odstředí a suší 5 až 8 h ve vakuu při vhodné teplotě. Výtěžek tohoto postupu činí asi 500 až 600 g suchého prášku.
300 g suchého prášku se pak podrobí enzymatickému digerování s 0,2 g vhodného proteolytického činidla (papain, pepsin, trypsin nebo pronasa) v tlumeném vodném prostředí s fosfátovým pufrem s použitím množství cysteinhydrochloridu, poskytujícího poměr k suchému prášku 20 : 0,01 až 20 : 1. Tato směs se pak míchá 24 h s rychlostí otáčení 60 min'1 při konstantní teplotě 60 až 65 °C. Celá hmota se přídavkem 60 g CelituR ochladí na 25 °C a v míchání se pokračuje ještě hodinu.
Získaná směs se filtruje do obdržení čiré kapaliny.
Vodný roztok, zředěný destilovanou vodou na 2 mg/ml, se vede do kolony, plněné makromolekulámí ionexovou pryskyřicí DOWEX M-15, získanou v tetrabutylamonné (TBA+) formě reakcí s hydroxidem tetrabutylamonným.
Roztok, eluovaný z kolony, se odpaří a vysušený zbytek se rozpustí ve vhodném objemu Nmethylpyrrolidonu (nebo dimethylsulfoxidu) do koncentrace 2 mg/ml.
Získaný roztok se přefiltruje, ochladí na 4 °C a přidá se stejný objem vody. Provede se třikrát po sobě promytí methylenchloridem a pokaždé se vypustí spodní fáze. Na vrchní fázi se pak působí bromidem sodným (NaBr v molámím poměru ke kyselině hyaluronové 3 : 1) při 4 °C, vodný roztok se vysráží přídavkem 3 objemů ethanolu a sraženina se několikrát promyje ethanolem.
Sraženina se pak rozpustí ve vodě a získaný roztok se podrobí dialýze. Přídavkem chloridu sodného se koncentrace roztoku upraví na 0,1 M a teplota se upraví na 50 °C. Za míchání produktu rychlostí 60 min'1 se přidá 45 g cetylpyridiniumchloridu. Tato směs se míchá 60 min, načež se přidá 50 g CelituR. Za míchání se teplota produktu sníží na 25 °C a vzniklá sraženina se oddělí odstředěním. Takto získaná sraženina se suspenduje v 0,01M roztoku chloridu sodného (5 1), obsahujícího 0,05 % cetylpyridiniumchloridu. Směs se míchá dalších 60 min při 50 °C.
- 19CZ 282248 B6
Teplota se sníží na 25 °C a sraženina se odstředí.
Postup promývání se pak třikrát opakuje a sraženina se nakonec shromáždí do nádob, obsahujících 3 1 0,05M roztoku chloridu sodného, obsahujícího 0.05 % cetylpyridiniumchloridu. Tato směs se míchá 60 min s rychlostí otáčení 60 min'1 a udržuje se 2 h na konstantní teplotě 25 °C. Supematant se odstraní odstředěním.
Postup se několikrát opakuje s0,lM roztokem chloridu sodného, obsahujícího 0,05 % cetylpyridiniumchloridu. Směs se odstředí a supematant se vypustí. Sraženina se disperguje v 0,30M roztoku chloridu sodného, obsahujícím 0,05 % cetylpyridiniumchloridu (3 : 1).
Směs se míchá a shromáždí se jak sraženina, tak čirá kapalina. Na sraženinu se ještě třikrát opakovaně aplikuje extrakce, pokaždé s 0,5 1 stejného vodného roztoku.
Zbylá sraženina se odstraní a čirá kapalina se shromáždí v jediné nádobě. Teplota kapaliny se za míchání zvýší na 50 °C. Kapalina se pak chloridem sodným upraví na koncentraci 0,23 M. Přidá se 1 g cetylpyridiniumchloridu a pokračuje se v míchání 12 h. Směs se ochladí na 25 °C a pak přefiltruje, nejprve přes náplň CelituR a pak přes filtr (1 u).
Získaný roztok se pak podrobí molekulární ultrafiltraci přes membrány s vy lučovací mezí 30.000, přičemž se ultrafiltrují 3 původní objemy s přídavkem 0.33M roztoku chloridu sodného. Přídavek roztoku chloridu sodného se suspenduje a objem kapaliny se sníží na čtvrtinu původního objemu.
Takto zahuštěný roztok se za míchání (60 min'1) při teplotě 25 °C vysráží třemi objemy ethanolu (95%). Sraženina se oddělí odstředěním a supematant se vypustí. Sraženina se rozpustí v 1 l 0,lM roztoku chloridu sodného a postup srážení se opakuje se třemi objemy 95% ethanolu.
Sraženina se shromáždí a promyje, nejprve 75% ethanolem (třikrát), pak absolutním ethanolem (třikrát) a potřetí absolutním acetonem (třikrát).
Takto získaný produkt (frakce HA-1) má průměrnou molekulovou hmotnost v rozmezí 750.000 až 1,230.000 D (výhodně mezi 925.000 a 1,230.000).
Výtěžek kyseliny hyaluronové je roven 0,6 % původní čerstvé tkáně.
Konečný produkt, získaný popsaným postupem, má tyto charakteristiky:
- molekulová hmotnost 1.000.000 D
- limitní viskozitní číslo v rozmezí 14,5 až 21 dl/g, měřeno při 25 °C v 0,15M NaCl při pH 7,0 s použitím Ubbelohdeho viskozimetru se zavěšenou hladinou. Odpovídá průměrné molekulové hmotnosti v rozmezí 750.000 až 1,230.000 D (výhodně mezi 925.000 a 1,230.000).
- obsah proteinu nepřesahující 0,2 %, vyjádřeno jako albumin, stanoveno Lowryho testem (Lowry J. a d.: Protein Measurement with the folin phenol reagent, J. Biol. Chem. 193, 265-275, 1951).
- UV absorbance při 257 nm · a při 280 nm nepřesahující 1,0 A.U., měřeno na 1% (hmotnost/objem) vodném roztoku.
- dynamická viskozita 1% roztoku (hmotnost/objem) v 0,15M NaCl při pH=7,0. měřeno rotačním viskozimetrem, například popsaným v LT.S. Pharmacopea XXII ed. (911), str. 1619, při teplotě 20 °C, nepřesahující při definovaných smykových rychlostech tyto hranice:
-20CZ 282248 B6
Smyková rychlost____________Dynamická viskozita (mPa.s při 20 QC) s'1 ne více než 20.000 mPa.s s'1 ne více než 2.000 mPa.s
100 s'1 ne více než 1.000 mPa.s
350 s'1 ne více než 500 mPa.s
- obsah sulfatovaného mukopolysacharidu nepřesahující 0,07 %, vyjádřeno jako síra, stanoveno na zařízení s indukčně vázaným plasmatem (ICP) s použitím vhodné referenční látky.
- obsah železa nepřesahující 10 ppm, stanoveno atomovou absorpcí nebo metodou ICP.
Byla provedena srovnávací studie, pokud jde o obsah železa, mezi frakcí HA-1 a jinými roztoky sodné soli kyseliny hyaluronové, dostupnými obchodně. Získané výsledky (tabulka 7) jasně demonstrují rozdílný obsah železa: frakce HA-1 má mnohem nižší obsah železa než ostatní produkty.
Tabulka 7. Obsah železa (ppm) v HA-1 proti jiným produktům
HA-1 vzorek A vzorek B vzorek C železo (ppm) <10 130 120 40 kde:
- vzorek A odpovídá SODICHIMu (šarže 154)
- vzorek B odpovídá BIOCHEMO (šarže 542)
- vzorek C odpovídá BIOTECHNOLOGY GENERÁL (šarže B-25)
- obsah železa byl stanoven na asi 0,5 g látky, která byla žíhána v platinovém kelímku a zbytek se rozpustí v 0,lM kyselině dusičné.
- stabilita isotonických tlumených roztoků s fyziologickým pH frakce HA-1, podrobených přirozenému stárnutí a tepelné sterilizaci, zjištěná stanovením limitního viskozitního čísla a vyjádřená odpovídajícím poklesem střední molekulové hmotnosti, nepřesahující tyto hranice:
- 97 % původní hodnoty (skladování při 25 °C, 6 měsíců)
- 75 % původní hodnoty (sterilizace při 118 °C, 32 min)
- 80 % původní hodnoty (sterilizace při 121 °C, 16 min)
- 90 % původní hodnoty (sterilizace při 124 °C, 8 min)
Byla provedena srovnávací studie mezi isotonickým tlumeným roztokem HA-1 s fyziologickým pH a analogickými roztoky kyseliny hyaluronové, obchodně dostupnými, ke zjištění stability za podmínek:
- přirozeného stárnutí (skladování při teplotě místnosti, 6 měsíců)
- tepelné sterilizace za různých podmínek.
Bylo použito takových materiálů pro farmaceutické použití a zařízení, které prokázaly spolehlivost pro daný účel.
Jednalo se zejména o:
- ampulky z bezbarvého skla s těmito charakteristikami:
-21 CZ 282248 B6
- sklo: borosilikátové typ 1 (podle Ph. Eur. II ed.)
- minimální tloušťka těla: 0,90 mm
- maximální tloušťka těla: 1,00 mm
- zátky z halobutylového kaučuku s těmito charakteristikami:
- typ elastomeru: chlorbutyl
- inertní plnivo: kaolin
- pigmenty: oxid titaničitý a saze
- vulkanizační činidlo: oxid zinečnatý
- charakteristiky uvolňování: podle Ph. Eur. II ed. VI.2.3.1.
- hliníkové oklepávací uzávěry
- voda pro injekce (podle Ph. Eur. II ed.)
Reagencie byly použity v analytické čistotě.
Ke sterilizaci byl použit Fedegariho autokláv model FOF5 Superspectra.
Limitní viskozitní číslo bylo stanoveno Ubbelohdeho viskozimetrem se zavěšenou hladinou při 25 °C v 0,15M NaCl při pH 7,0.
Odpovídající střední molekulová hmotnost byla vypočtena z Mark-Houwinkovy rovnice (H. Mark: Z. Elektrochemie 40, 499, 1934; R. Houwink: J. Prakt. Chem. 157, 15, 1940).
K lepšímu stanovení depolymeračních trendů byly hodnoty střední molekulové hmotnosti vyjádřeny jako procentický podíl původní hodnoty. Získané výsledky (tabulky 8 a 9) demonstrují, že HA-1 má větší stabilitu (alespoň dvakrát větší) než referenční vzorky (viz tabulka 7), které mají významně vyšší obsah železa než HA-1.
Tabulka 8. Stabilita roztoku - účinek přirozeného stárnutí limitní visk. č. (dl/g) variace mol. hm. (%)
| vzorek | pův. | 3 měs. | 6 měs. | pův. | 3 měs. | 6 měs. |
| HA-1 | 20,9 | 20,8 | 20,5 | 100 | 99,4 | 97,5 |
| A | 10,4 | 10,1 | 9,6 | 100 | 96,2 | 89,9 |
| B | 9,7 | 9,2 | 8,8 | 100 | 93,2 | 87,8 |
| C | 15,5 | 15,1 | 14,8 | 100 | 96,6 | 94,0 |
Tabulka 9. Stabilita roztoku - účinek sterilizace limitní visk. č. (dl/g) variace mol. hm. (%)
| vzorek | pův. | Ic | líc | IIIc | pův. | Ic | líc | IIIc |
| HA-1 | 20,9 | 17,2 | 18,3 | 19,9 | 100 | 77,1 | 83,8 | 93,7 |
| A | 10,4 | 6,2 | 6,6 | 7,2 | 100 | 50,2 | 54,5 | 61,2 |
| B | 9,7 | 6,3 | 6,7 | 7.3 | 100 | 56.2 | 61,1 | 68,5 |
| C | 15,5 | 10,9 | 11,5 | 12,6 | 100 | 62,5 | 67,2 | 75,9 |
kde:
- 22 CZ 282248 B6
- vzorky A, B a C jsou stejné jako při stanovení obsahu železa
- roztoky přibližně 10 mg/ml každého produktu v 0,9 % (hmotnóst/objem) roztoku chloridu sodného v 0,002M fosfátovém pufru o pH 7,5 byly podrobeny:
a) přirozenému stárnutí skladováním po dobu 6 měsíců při teplotě místnosti (25 °C) v temnu s kontrolami po třech měsících (viz tabulka 8)
b) sterilizaci v autoklávu za těchto podmínek:
T = 118 °C po dobu 32 min (označeno Ic)
T = 121 °C po dobu 16 min (označeno líc)
T = 124 °C po dobu 8 min (označeno IIIc) s kontrolami na začátku a na konci každého teplotního intervalu.
Příklad 2
Postup získání frakce HA-1 a její relativní charakterizace
Slepičí hřebínky, buď čerstvé, nebo zmrazené (3.000 g), se umelou v mlýnku na maso a pak se důkladně homogenizují v mechanickém homogenizátoru. K získané pastě se ve skleněné nádobě přidají 4 objemy 95% ethanolu, obsahujícího 0,1 % (hmotnost/objem) specifického chelatačního činidla pro železo.
Vhodným chelatačním činidlem je 1,10-fenanthrolin (C.A.R.N. 66-71-7) nebo jeho dimethylderiváty.
Skleněná nádoba a chelatační činidlo se používá k vyloučení depolymerace sodné soli kyseliny hyaluronové, která by jinak mohla být způsobena ionty železa z ocelových nádob nebo zbxtků krve.
Slepičí hřebínky se zpracovávají do úplného odstranění iontů železa (instrumentální kontrola: absorbance komplexu železo-chelatační činidlo v acetonové nebo ethanolické fázi v 1 cm kyvetách při vlnové délce maximální absorpce - 510 nm v případě 1,10-fenanthrolinu, ne více než 0,005 A.U.).
Provede se další promytí stejným objemem bezvodého acetonu (nebo ethanolu) k odstranění veškerých zbytků chelatačního činidla. Toto zpracování se provádí až do negativního výsledku testu A:
Test A: 5 ml acetonové (nebo ethanolické) fáze se odpaří pomocí mírného proudu dusíku. Zbytek se rozpustí v 5 ml vody a změří se absorbance při vlnové délce maximální absorpce chelatačního činidla.
Výsledek testu se považuje za negativní, je-li absorbance nižší než 0,1 A.U.
Konečný reakční produkt se 6 h míchá s rychlostí otáčení 50 min'1 a nechá se 12 h separovat, načež se rozpouštědlo přečerpá sifonem a vypustí.
Tento extrakční postup sé opakuje do dosažení správné hodnoty vlhkosti rozpouštědla (KarlFischerova metoda).
-23 CZ 282248 B6
Získaná látka se pak odstředí a suší ve vakuu při vhodné teplotě po dobu alespoň 8 h. Výtěžek tohoto procesu činí asi 500 až 600 g suchého prášku.
300 g suchého prášku se pak podrobí enzymatickému digerování s 0,2 g vhodného proteo5 lytického činidla (papain, pepsin, trypsin nebo pronasa) v tlumeném vodném prostředí s fosfátovým pufrem s použitím množství cysteinhydrochloridu, poskytujícího poměr k suchému prášku 20 : 0,01 až’20 : 1. Tato směs se pak míchá 24 h s rychlostí otáčení 60 min’1 při konstantní teplotě 60 až 65 °C. Po skončení reakce se přidá 60 g CelituR a celek se míchá ještě hodinu. Získaná směs se filtruje do získání čiré kapaliny.
Za míchání rychlostí 60 min’1 se přidá 45 g cetylpyridiniumchloridu. Směs se míchá 60 min, načež se přidá 50 g CelituR.
Takto získaná sraženina se shromáždí odstředěním a suspenduje v0,01M roztoku chloridu 15 sodného (5 1), obsahujícím 0,05 % cetylpyridinia.
Směs se míchá 60 min při 50 °C a pak se přivede na teplotu 25 °C a sraženina se odstředí.
Postup promývání se opakuje třikrát. Sraženina se shromáždí v nádobách, obsahujících 3 I 0.05M 20 roztoku chloridu sodného, obsahujícího 0,5 % cetylpyridiniumchloridu.
Směs se míchá 60 min rychlostí 60 min’1 a pak se udržuje 2 h na konstantní teplotě 25 °C. Čirá vrchní fáze se odstraní odstředěním.
Postup se opakuje dvakrát s 0,01M roztoky, obsahujícími 0,05 % cetylpyridiniumchloridu. Směs se odstředí a vrchní fáze se vypustí. Sraženina se disperguje v 0,30M roztoku chloridu sodného, obsahujícím 0,05 % cetylpyridiniumchloridu (3 I).
Směs se míchá a shromáždí se sraženina i čirá kapalina. Sraženina se extrahuje podruhé 30 s použitím 1,5 1 stejného vodného roztoku.
Čiré , kapaliny se spojí do jedné nádoby a podrobí molekulární ultrafiltraci přes membrány s molekulární vylučovací hodnotou 30.000 D se zahuštěním na třetinu jejich původního objemu.
Na zahuštěný roztok se působí makromolekulámí ionexovou pryskyřicí DowexR M-15, získané v tetrabutylamonné formě (TBA), a míchá se přes noc.
K. suspenzi se přidá vhodný objem N-methylpyrrolidonu do dosažení objemového poměru NMPH2O 70 : 30. Směs se pak podrobí filtraci a pryskyřice se odstraní.
Pak se k roztoku přidá vhodné množství chloridu sodného a pH se pomocí 1M hydroxidu sodného upraví na >7,5; roztok se pak dvakrát promyje methylenchloridem (CH2CI2) a pokaždé se vypustí spodní fáze. Vrchní fáze se za míchání rychlostí 60 min’1 a při teplotě 25 °C vysráží třemi objemy ethanolu (95%).
Sraženina se shromáždí odstředěním a vrchní fáze se vypustí.
Sraženina se shromáždí a promyje, nejprve 75% ethanolem. pak absolutním ethanolem a nakonec acetonem.
Promytý produkt se pak alespoň 20 h suší ve vakuu při teplotě 25 °C. Vysušený produkt se rozpustí ve vodě pomocí inverzní osmózy tak, aby se získal roztok o koncentraci > 1 mg/ml. Přidá se chlorid sodný v množství, odpovídajícím dosažení molarity 0,1 až 0,4, a provede se alkalizace 1M hydroxidem sodným. Roztok se pak přefiltruje přes sterilizační filtry.
-24CZ 282248 B6
Roztok se za míchání rychlostí 60 min'1 vysráží při teplotě 25 °C třemi objemy ethanolu (95%).
Sraženina se shromáždí odstředěním a vrchní fáze se vypustí.
Sraženina se spojí a promyje, nejprve 75% ethanolem, pak absolutním ethanolem a nakonec acetonem.
Promytý produkt se suší alespoň 50 h ve vakuu při teplotě 25 °C.
Takto získaný produkt má molekulovou hmotnost 1.180.000.
Příklady farmaceutických prostředků
K bližšímu osvětlení a pouze pro ilustrační účely jsou uvedeny příklady možných farmaceutických prostředků pro terapeutické použití frakce HA-1.
Formulace 1: 2 ml ampule každá ampule obsahuje:
| sodná sůl kyseliny hyaluronové (HA-1) jednosytný fosforečnan sodný. 2 H;O dvojsytný fosforečnan sodný, 12 H2O chlorid sodný voda pro injekce do objemu | 24.0 mg 0.1 mg 1-2 mg 17.0 mg 2.0 mf |
Formulace 2: sterilní plněné injekční stříkačky 1.1 ml k přímému použití každá stříkačka obsahuje:
| sodná sůl kyseliny hyaluronové (HA-1) chlorid sodný jednosytný fosforečnan sodný, 2 H2O dvojsytný fosforečnan sodný, 12 H2O voda pro injekce do objemu | 20,0 mg 9.350 mg 0,055 mg 0,660 mg 1,1 ml |
Formulace 3: nádobky na jednorázové dávky 0,2 ml každá nádobka obsahuje:
| sodná sůl kyseliny hyaluronové (HA-1) chlorid sodný jednosytný fosforečnan sodný, 2 H2O dvojsytný fosforečnan sodný, 12 H2O voda pro injekce do objemu | 400.0 mg 440,0 mg 5,0 mg 60,0 mg 100,0 ml |
-25 CZ 282248 B6
| Formulace 4: | nádobky na jednorázové dávky 0,2 ml |
každá nádoba obsahuje:
sodná sůl kyseliny hyaluronové (HA-1) chlorid sodný chlorid draselný jednosytný fosforečnan sodný, 2 H2O dvojsytný fosforečnan sodný, 12 H2O voda pro injekce do objemu
Formulace 5: flakony 5 ml každý flakon obsahuje:
sodná sůl kyseliny hyaluronové (HA-1) chlorid sodný chlorid draselný jednosytný fosforečnan sodný, 2 H2O dvojsytný fosforečnan sodný, 12 H?O ethyl-merkurithiosalicylát sodný voda pro injekce do objemu
200,0 mg
670,0 mg
250,0 mg
5,0 mg
60,0 mg 100,0 ml
200,0 mg
670,0 mg
250,0 mg
5,0 mg
60,0 mg
5,0 mg
100,0 ml
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Frakce kyseliny hyaluronové nebo její soli, vyznačující se tím, že má střední molekulovou hmotnost v rozmezí 750 000 až 1 230 000 D a tyto charakteristiky:a) limitní viskozitní číslo v rozmezí 14,5 až 21 dl/g, měřeno při 25 °C v0,15M chloridu sodném při pH 7,0 pomocí Ubbelohdeho viskozimetru se zavěšenou hladinou,b) obsah bílkovin nepřesahující 0,2 %, vyjádřeno jako albumin,c) absorbance UV při 257 nm a při 280 nm nepřesahující 1,0 A.U., měřeno v 1% vodném roztoku,d) dynamická viskozita 1% roztoku v0,15M chloridu sodném při pH 7,0 pomocí rotačního viskozimetru při teplotě 20 °C nepřesahující tyto hranice při definované smykové ry chlosti:
Smyková rychlost Dynamická viskozita (mPa.s při 20 °C) 1 s-1 10 s'1 100 s-’ 350 s'1 ne více než 20 000 mPa.s ne více než 2 000 mPa.s ne více než 1 000 mPa.s ne více než 500 mPa.s, e) obsah sulfatovaného mukopolysacharidu nepřesahující 0,07 %, vyjádřeno jako síra,f) obsah železa nepřesahující 10 ppm ag) stabilita isotonických tlumených roztoků s fyziologickým pH frakce, podrobených přirozenému stárnutí a tepelné sterilizaci, zjištěná stanovením limitního viskozitního čísla a vyjádřená odpovídajícím poklesem střední molekulové hmotnosti, nepřesahující tyto hranice:- 97 % původní hodnoty (skladování při 25 °C, 6 měsíců)- 75 % původní hodnoty (sterilizace při 118 °C, 32 min)- 80 % původní hodnoty (sterilizace při 121 °C, 16 min)- 90 % původní hodnoty (sterilizace při 124 °C, 8 min). - 2. Frakce kyseliny hyaluronové podle nároku 1, vyznačující se tím, žerná střední molekulovou hmotnost mezi 925 000 a 1 230 000 D.
- 3. Způsob přípravy frakce hyaluronátu sodného, podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tí m , žea) ze slepičích hřebínků se extrahuje organický materiál rozpouštědlem, tvořeným acetonem nebo ethanolem a dále obsahujícím fenanthrolin nebo jeho dimethylderivát, za vzniku extraktu s obsahem železa do 10 dílů hmotnostních na milion dílů hmotnostních,b) na tento extrakt se působí proteolytickým činidlem, zvoleným ze skupiny zahrnující papain, pepsin, trypsin, pronasu a cysteinhydrochlorid,c) takto ošetřený extrakt se uvede do styku s kolonou, plněnou pryskyřicí se skupinami kyseliny sulfonové ve formě tetrabutylamoniové soli,d) kolona se eluuje k získání roztoku, obsahujícího tetrabutylamoniovou sůl kyseliny hyaluronové,-27CZ 282248 B6e) roztok se suší k získání zbytku, tvořeného tetrabutylamoniovou solí kyseliny hyaluronové,f) tento zbytek se rozpustí v aprotickém rozpouštědle,g) roztok ze stupně f) se přefiltruje,h) roztok ze stupně g) se promyje methylenchloridem,i) na roztok ze stupně h) se působí halogenidem sodným za vzniku hyaluronátu sodného,j) získaný hyaluronát sodný se vysráží alkoholem, s výhodou ethanolem,k) sraženina se rozpustí ve vodě a roztok se podrobí dialýze,l) na dialyzovaný roztok se působí k vysrážení hyaluronátu sodného alkoholem, s výhodou ethanolem,m) roztok uvedené sraženiny se podrobí molekulární filtraci přes membránu s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 30 000 D za vzniku roztoku, obsahujícího sodnou sůl kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 750 000 až 1 230 000 D.
- 4. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou složku frakci kyseliny hyaluronové podle nároku 1.
- 5. Frakce kyseliny hyaluronové podle nároku 1 pro použití v oční chirurgii.
- 6. Frakce kyseliny hyaluronové podle nároku 1 pro použití v oboru ofitalmologie.
- 7. Frakce kyseliny hyaluronové podle nároku 1 pro použití při operacích zákalu nebo v případě implantátů oční čočky.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITPD910077A IT1247175B (it) | 1991-04-19 | 1991-04-19 | Procedimento per la purificazione di acido ialuronico e frazione di acido ialuronico puro per uso oftalmico. |
| PCT/EP1992/000861 WO1992018543A1 (en) | 1991-04-19 | 1992-04-16 | Procedure for the purification of hyaluronic acid and fraction of pure hyaluronic acid for ophthalmic use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ377192A3 CZ377192A3 (en) | 1993-05-12 |
| CZ282248B6 true CZ282248B6 (cs) | 1997-06-11 |
Family
ID=11389548
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS923771A CZ282248B6 (cs) | 1991-04-19 | 1992-04-16 | Způsob čištění kyseliny hyaluronové a frakce čisté kyseliny hyaluronové pro oftalmologické použití |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5559104A (cs) |
| EP (1) | EP0535200B1 (cs) |
| JP (1) | JP2580458B2 (cs) |
| KR (1) | KR0178544B1 (cs) |
| AT (1) | ATE186307T1 (cs) |
| AU (1) | AU653022B2 (cs) |
| BR (1) | BR9205240A (cs) |
| CA (1) | CA2084875C (cs) |
| CZ (1) | CZ282248B6 (cs) |
| DE (1) | DE69230242T2 (cs) |
| DK (1) | DK0535200T3 (cs) |
| ES (1) | ES2092971T3 (cs) |
| FI (1) | FI104973B (cs) |
| GR (1) | GR3032434T3 (cs) |
| HU (1) | HU215193B (cs) |
| IL (2) | IL101611A (cs) |
| IT (1) | IT1247175B (cs) |
| NO (1) | NO305520B1 (cs) |
| PL (1) | PL168477B1 (cs) |
| RU (1) | RU2128666C1 (cs) |
| SG (1) | SG46515A1 (cs) |
| SK (1) | SK280191B6 (cs) |
| UA (1) | UA27229C2 (cs) |
| WO (1) | WO1992018543A1 (cs) |
Families Citing this family (57)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1274984B (it) * | 1994-12-09 | 1997-07-29 | Technopharma Sa | Soluzioni viscosizzate con ialuronato di sodio per l'uso come fluido maschera nella fotocheratectomia terapeutica mediante laser a accimeri |
| IT1282219B1 (it) * | 1995-12-20 | 1998-03-16 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | Processo chimico fisico combinato per la preparazione di frazioni di acido ialuronico a basso peso molecolare caratterizzate da bassa |
| IT1287967B1 (it) | 1996-10-17 | 1998-09-10 | Fidia Spa In Amministrazione S | Preparazioni farmaceutiche per uso anestetico locale |
| IT1291452B1 (it) | 1997-04-14 | 1999-01-11 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | Rivestimento a base di acido ialuronico e suoi derivati per la protezione di parti elettroniche da agenti esterni |
| US6919076B1 (en) | 1998-01-20 | 2005-07-19 | Pericor Science, Inc. | Conjugates of agents and transglutaminase substrate linking molecules |
| US6958148B1 (en) | 1998-01-20 | 2005-10-25 | Pericor Science, Inc. | Linkage of agents to body tissue using microparticles and transglutaminase |
| IL139354A (en) | 1998-05-29 | 2005-08-31 | Bone Care Internat Inc | Method for making hydroxy-25 ene-vitamin d compounds |
| DK172900B1 (da) | 1998-12-18 | 1999-09-27 | Per Julius Nielsen | Præparat samt kit til brug ved intraoculære operationer |
| IT1306644B1 (it) | 1999-04-08 | 2001-10-02 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | Strutture tridimensionali comprendenti derivati dell'acido ialuronicoottenibili mediante la tecnica antisolvente supercritico. |
| RU2163123C2 (ru) * | 1999-05-26 | 2001-02-20 | Уфимский научно-исследовательский институт глазных болезней | Глазные капли |
| RU2147876C1 (ru) * | 1999-07-08 | 2000-04-27 | Государственное учреждение Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" | Фармацевтическая композиция для обезболивания в офтальмологии |
| RU2148404C1 (ru) * | 1999-07-08 | 2000-05-10 | Государственное учреждение Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" | Фармацевтическая композиция для медикаментозного расширения зрачка в офтальмологии |
| RU2186786C1 (ru) * | 2001-03-26 | 2002-08-10 | Воронежская государственная технологическая академия | Способ получения гиалуроновой кислоты |
| KR100836733B1 (ko) * | 2002-11-15 | 2008-06-10 | 코오롱생명과학 주식회사 | 히알우론산 나트륨의 회수방법 및 그를 위한 장치 |
| RU2234310C1 (ru) * | 2003-01-21 | 2004-08-20 | Гусева Ольга Юрьевна | Способ приготовления вискоэластичного протектора эндотелия роговицы |
| US20040167480A1 (en) * | 2003-02-21 | 2004-08-26 | Advanced Medical Optics, Inc. | Administration of multiple viscoelastic solutions with a multi-compartment syringe |
| US20080063677A1 (en) * | 2004-03-10 | 2008-03-13 | New Life Resources, Llc | Therapeutic, nutraceutical and cosmetic applications for eggshell membrane and processed eggshell membrane preparations |
| US20040180025A1 (en) * | 2003-03-12 | 2004-09-16 | New Life Resources, Llc | Therapeutic, nutraceutical and cosmetic applications for eggshell membrane and processed eggshell membrane preparations |
| US6946551B2 (en) * | 2003-03-12 | 2005-09-20 | New Life Resources, Llc | Preparation of hyaluronic acid from eggshell membrane |
| RU2325902C2 (ru) * | 2003-10-27 | 2008-06-10 | Федеральное государственное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А.Илизарова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" (ФГУ "РНЦ "ВТО" им.акад. Г.А. Илизарова Росмедтехнологий") | Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани |
| US8580315B2 (en) * | 2004-03-10 | 2013-11-12 | Esm Technologies, Llc | Anti-inflammatory activity of eggshell membrane and processed eggshell membrane preparations |
| US20050266390A1 (en) * | 2004-06-01 | 2005-12-01 | Yuichiro Ueda | Processes for removing cells and cell debris from tissue and tissue constructs used in transplantation and tissue reconstruction |
| KR100577075B1 (ko) * | 2004-06-16 | 2006-05-08 | 주식회사 티앤라이프시스템 | 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염을 이용한 히아루론산정제방법 |
| US7094775B2 (en) | 2004-06-30 | 2006-08-22 | Bone Care International, Llc | Method of treating breast cancer using a combination of vitamin D analogues and other agents |
| RU2369408C2 (ru) * | 2004-07-09 | 2009-10-10 | Ферросан А/С | Гемостатическая композиция, включающая гиалуроновую кислоту |
| RU2280041C1 (ru) * | 2005-04-21 | 2006-07-20 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное предприятие "Тульская индустрия ЛТД" | Способ получения водорастворимых солевых комплексов гиалуроновой кислоты (варианты) |
| DE102005030011A1 (de) * | 2005-06-17 | 2006-12-21 | Aesculap Ag & Co. Kg | Verfahren zur Herstellung von sterilen Polysaccharidlösungen |
| ITPD20050242A1 (it) | 2005-08-03 | 2007-02-04 | Fidia Farmaceutici | Bioconiugati antitumorali dell'acido ialuronico o dei suoi derivati, ottenibili per coniugazione chimica diretta o indiretta, e loro impiego in campo farmaceutico |
| ITMI20061668A1 (it) * | 2006-09-01 | 2008-03-02 | Schiena Michele Giuseppe Di | Composizione a base di acido ialuronico e suoi sali per il trattamento di lesioni epiteliali |
| KR101509139B1 (ko) * | 2006-11-23 | 2015-04-08 | 주식회사 엘지생명과학 | 히알루론산의 정제방법 |
| KR100894042B1 (ko) * | 2007-04-13 | 2009-04-20 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 설파살라진-히알루론산 혼합물의 제조방법 및 이로부터얻어진 혼합물을 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물 |
| US9089592B2 (en) | 2007-04-26 | 2015-07-28 | Seikagaku Corporation | Method for micro-incision cataract surgery, a method of evaluation of a viscoelastic material, a composition for evaluation of a viscoelastic material and a method for evaluation using the composition |
| US8759321B2 (en) * | 2007-06-13 | 2014-06-24 | Bausch & Lomb Incorporated | Ophthalmic composition with hyaluronic acid and polymeric biguanide |
| CA2705850C (en) * | 2007-11-13 | 2016-07-19 | Bio-Technology General (Israel) Ltd. | Dilute filtration sterilization process for viscoelastic biopolymers |
| US8119112B2 (en) * | 2008-01-31 | 2012-02-21 | Bausch & Lomb Incorporated | Ophthalmic compositions with an amphoteric surfactant and hyaluronic acid |
| US9096819B2 (en) | 2008-01-31 | 2015-08-04 | Bausch & Lomb Incorporated | Ophthalmic compositions with an amphoteric surfactant and an anionic biopolymer |
| JP5758797B2 (ja) | 2008-04-04 | 2015-08-05 | ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデイション | アルキル化半合成グリコサミノグリカンエーテルならびにその製造および使用方法 |
| US20100286010A1 (en) * | 2008-09-03 | 2010-11-11 | Erning Xia | Ophthalmic Compositions with Hyaluronic Acid |
| US20100086512A1 (en) | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Rolf Schaefer | Mucomimetic compositions and uses therefore |
| US20100178317A1 (en) * | 2009-01-09 | 2010-07-15 | Burke Susan E | Lens Care Solutions with Hyaluronic Acid |
| CN103442718A (zh) * | 2011-03-02 | 2013-12-11 | 电气化学工业株式会社 | 含透明质酸或透明质酸盐的水溶液 |
| WO2012118191A1 (ja) * | 2011-03-02 | 2012-09-07 | 電気化学工業株式会社 | ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液 |
| CN103442721A (zh) * | 2011-03-02 | 2013-12-11 | 电气化学工业株式会社 | 含透明质酸或透明质酸盐的水溶液 |
| JP5957442B2 (ja) * | 2011-03-02 | 2016-07-27 | デンカ株式会社 | 樹脂製バレルを有するシリンジ内にヒアルロン酸又はその塩を含む水溶液を充填してなるプレフィルドシリンジ |
| WO2012118193A1 (ja) * | 2011-03-02 | 2012-09-07 | 電気化学工業株式会社 | ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液 |
| US9522162B2 (en) | 2011-03-23 | 2016-12-20 | University Of Utah Research Foundation | Methods for treating or preventing urological inflammation |
| RU2477138C1 (ru) * | 2011-11-02 | 2013-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное предприятие "Тульская индустрия ЛТД" | Способ получения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии, заполняющий материал и способ введения заполняющего материала в проблемную зону |
| ITMI20120664A1 (it) | 2012-04-20 | 2013-10-21 | Anika Therapeutics Srl | Biomateriali a base di gellano per l'uso come filler in chirurgia |
| WO2015120223A1 (en) * | 2014-02-06 | 2015-08-13 | New York University | Method for separating hyaluronan and quantifying its molecular mass distribution in biological samples |
| IT201600079633A1 (it) * | 2016-07-28 | 2018-01-28 | Fidia Farm Spa | Procedimento di preparazione e purificazione del sale sodico dell’acido ialuronico |
| US11337994B2 (en) | 2016-09-15 | 2022-05-24 | University Of Utah Research Foundation | In situ gelling compositions for the treatment or prevention of inflammation and tissue damage |
| CN111228653A (zh) | 2018-11-13 | 2020-06-05 | 格莱科米拉治疗公司 | 用电离辐射加强癌症治疗的方法 |
| IT201900019724A1 (it) * | 2019-10-24 | 2021-04-24 | Bmg Pharma S P A | “procedimento in solvente organico per la purificazione dell’acido ialuronico sale sodico” |
| WO2021110975A1 (en) | 2019-12-05 | 2021-06-10 | Cis Pharma Ag | High hyaluronate multi-purpose disinfection solutions for ophthalmic applications |
| RU2765951C1 (ru) * | 2021-05-14 | 2022-02-07 | Общество с ограниченной ответственностью "АВЕО" | Способ очистки гиалуроната от эндотоксинов |
| EP4395796A4 (en) | 2021-09-01 | 2024-12-25 | Shanghai Qisheng Biological Preparation Co., Ltd. | Cartilage regeneration using injectable, in situ polymerizable collagen compositions containing chondrocytes or stem cells |
| WO2023125689A1 (en) | 2021-12-28 | 2023-07-06 | Shanghai Qisheng Biological Preparation Co., Ltd. | Hyaluronic acid-collagen copolymer compositions and medical applications thereof |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT252264B (de) * | 1965-03-17 | 1967-02-10 | Etapharm Chem Pharm Lab Ges M | Verfahren zur Herstellung eines reinen hochviskosen Hyaluronsäurepräparates |
| US4141973A (en) * | 1975-10-17 | 1979-02-27 | Biotrics, Inc. | Ultrapure hyaluronic acid and the use thereof |
| US4766348A (en) * | 1983-06-09 | 1988-08-23 | Gte Products Corporation | Single-ended metal halogen lamp and fabrication process employing ionization potential selection of additive gases |
| FR2553099B1 (fr) * | 1983-10-11 | 1989-09-08 | Fidia Spa | Fractions d'acide hyaluronique ayant une activite pharmaceutique, procedes pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant |
| US5093487A (en) * | 1986-01-06 | 1992-03-03 | Mobay Corporation | Low viscosity high molecular weight filter sterilizable hyaluronic acid |
| NO161573C (no) * | 1983-11-25 | 1989-08-30 | Miles Inc | Fremgangsmaate til fremstilling av hyaluronsyre. |
| JPS6121241A (ja) * | 1984-07-10 | 1986-01-29 | オリエンタル建設株式会社 | プレストレストコンクリ−ト部材組立式ラ−メン構造体における多スパン梁の構築方法 |
| US4784990A (en) * | 1985-01-18 | 1988-11-15 | Bio-Technology General Corporation | High molecular weight sodium hyaluronate |
| AU600257B2 (en) * | 1986-03-21 | 1990-08-09 | International Pharmaceutical Products, Inc. | Non-inflammatory hyaluronic acid fraction and process for preparing it |
| IT1198449B (it) * | 1986-10-13 | 1988-12-21 | F I D I Farmaceutici Italiani | Esteri di alcoli polivalenti di acido ialuronico |
| JPH0813847B2 (ja) * | 1987-08-11 | 1996-02-14 | 日本化薬株式会社 | ヒアルロン酸の分画法 |
| JPH01210401A (ja) * | 1988-02-17 | 1989-08-24 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 酸性多糖類の分離法 |
| JPH0723317B2 (ja) * | 1988-03-17 | 1995-03-15 | 生化学工業株式会社 | 角膜上皮層障害症治療剤 |
| US4920104A (en) * | 1988-05-16 | 1990-04-24 | Medchem Products, Inc. | Sodium hyaluronate composition |
| JP2731545B2 (ja) * | 1988-10-12 | 1998-03-25 | 電気化学工業株式会社 | ヒアルロン酸の精製方法 |
-
1991
- 1991-04-19 IT ITPD910077A patent/IT1247175B/it active IP Right Grant
-
1992
- 1992-04-16 DK DK92908628T patent/DK0535200T3/da active
- 1992-04-16 AT AT92908628T patent/ATE186307T1/de active
- 1992-04-16 EP EP92908628A patent/EP0535200B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-16 SK SK3771-92A patent/SK280191B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-04-16 PL PL92297297A patent/PL168477B1/pl unknown
- 1992-04-16 DE DE69230242T patent/DE69230242T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-16 WO PCT/EP1992/000861 patent/WO1992018543A1/en not_active Ceased
- 1992-04-16 HU HU9204012A patent/HU215193B/hu unknown
- 1992-04-16 RU RU92016520A patent/RU2128666C1/ru active
- 1992-04-16 JP JP4507997A patent/JP2580458B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-16 ES ES92908628T patent/ES2092971T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-16 AU AU15766/92A patent/AU653022B2/en not_active Expired
- 1992-04-16 CA CA002084875A patent/CA2084875C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-16 SG SG1996005472A patent/SG46515A1/en unknown
- 1992-04-16 CZ CS923771A patent/CZ282248B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-04-16 IL IL10161192A patent/IL101611A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-04-16 KR KR1019920703262A patent/KR0178544B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-16 BR BR9205240A patent/BR9205240A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-12-16 NO NO924873A patent/NO305520B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-12-18 FI FI925756A patent/FI104973B/fi not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-06-16 UA UA93002144A patent/UA27229C2/uk unknown
-
1995
- 1995-04-20 IL IL11345395A patent/IL113453A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-05-11 US US08/439,437 patent/US5559104A/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-01-19 GR GR20000400131T patent/GR3032434T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ282248B6 (cs) | Způsob čištění kyseliny hyaluronové a frakce čisté kyseliny hyaluronové pro oftalmologické použití | |
| US4141973A (en) | Ultrapure hyaluronic acid and the use thereof | |
| US5681825A (en) | Surgical method | |
| JP4146910B2 (ja) | 眼外科用のヒアルロン酸ナトリウム主薬の眼製剤 | |
| US4819617A (en) | Viscoelastic material for ophthalmic surgery | |
| EP0399156B1 (en) | Sodium hyaluronate composition | |
| US20090170809A1 (en) | Pectic Polysaccharides Isolated from Fruit Pods of Okra | |
| AU715620B3 (en) | Therapeutic methods and uses | |
| JPS62500720A (ja) | 眼科用組成物 | |
| RU2165749C1 (ru) | Способ восстановления эндотелия роговицы | |
| RU2114587C1 (ru) | Раствор для защиты роговицы от повреждений "визитон-1" | |
| KR101341647B1 (ko) | 베타-글루칸을 포함하는 각결막염 치료용 점안제 조성물 | |
| RU2197923C1 (ru) | Фармацевтическая композиция для лечения отеков роговицы "осмогель" | |
| KR20060131938A (ko) | 점탄성 조성물을 포함하는 신규한 유리-라디칼 제거제,사용 방법 및 패키지 | |
| RU2191012C1 (ru) | Глазные капли для лечения эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговицы | |
| JPH0613453B2 (ja) | 前眼部手術用の前房注入剤 | |
| RU2135127C1 (ru) | Раствор для защиты и лечения заболеваний и повреждений роговицы "визитин" | |
| Fechner et al. | Comparison of hydroxypropyl methylcellulose 2%(Adatocel®) and hyaluronic acid 1%(Healon®) | |
| WO2011146863A1 (en) | Surgical compositions containing sigma-receptor agonists | |
| WO2025114947A1 (en) | Ophthalmic pharmaceutical compositions and relative use | |
| RU2238738C2 (ru) | Протектор роговицы | |
| Nashi | To Study the Causes of Subnormal Vision After Manual Small Incision Cataract Surgery in Department of Ophthalmology, Kims Hubli |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20120416 |