RU2325902C2 - Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани - Google Patents
Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани Download PDFInfo
- Publication number
- RU2325902C2 RU2325902C2 RU2003131580/15A RU2003131580A RU2325902C2 RU 2325902 C2 RU2325902 C2 RU 2325902C2 RU 2003131580/15 A RU2003131580/15 A RU 2003131580/15A RU 2003131580 A RU2003131580 A RU 2003131580A RU 2325902 C2 RU2325902 C2 RU 2325902C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- glycosaminoglycans
- ethanol
- connective tissue
- carried out
- mineralised
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
иИзобретение относится к медицине и описывает способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани, включающий ферментативный гидролиз, депротеинизацию, осаждение, отличающийся тем, что деминерализацию проводят в течение 20 ч, используя 0,5 н. HCl, ферментативный гидролиз проводят в течение 18 ч, используя фермент пепсин, депротеинизацию осуществляют добавлением сульфата аммония до 75%-го насыщения, осаждение гликозаминогликанов проводят 4%-ным ацетатом калия в 96% этаноле, переосаждают этанолом, проводят лиофильную сушку, разделяют гликозаминогликаны хроматографически с использованием ДЕАЕ-сефадекса А-25, проводят лиофильную сушку. Данный способ прост в использовании, позволяет воспроизводить его в условиях лаборатории лечебного учреждения, экономичен во времени. 2 ил.
Description
Изобретение относиться к области химической технологии и косметологии, возможно его использование в области медицины и здравоохранения для производства биологически активных и пищевых добавок, действие которых направлено на улучшение состояния соединительной ткани.
В настоящее время известно, что гликозаминогликаны (ГАГ) из разных видов соединительной ткани применяются с целью хондропротективного действия в артрологии, а также используют естественные и синтетические гликозаминогликаны, которые входят в ряд препаратов для регенерации покровных тканей. [Остеоартроз: современное состояние проблемы (аналитический обзор) / Миронов С.П. С.96-99].
В литературе описаны способы выделения гликозаминогликанов из хрящевой ткани (Карякина Е.В., Косягин Д.В. Определение гликозаминогликанов сыворотки крови // Лаб. дело. - 1982. - №10. - С.15-17).
Для проведения ферментативного гидролиза в этих способах используются протеолитические ферменты (проназа Е), а для осаждения гликозаминогликанов - специфические осадители ГАГ - четвертичные аммониевые основания (цетилпиридиний хлорид либо цетилпиридиний бромид) (Косягин Д.В., Василенко Ж.Б. Осаждение ГАГ мочи солями алифатических аммониевых оснований и их очистка // Лаб. дело. - 1988. - №2, - С.57).
Известнен способ выделения агрегатов протеогликанов, в котором проводят диализ до полного удаления солей, освобождаются от растворимого коллагена и неагрегированных протеогликанов путем их осаждения лимонной кислотой, далее проводят диализ до полного удаления кислоты, полученный раствор обрабатывают H+ формой катионита для получения кислой формы агрегатов протеогликанов, далее солевой формой катионита для получения кислой солевой формы агрегатов протеогликанов, которую затем обрабатывают не менее чем двойным объемом 96,6° этанола, насыщенного ацетатом металла, для осаждения основной формы агрегатов протеогликанов, с последующей промывкой и сушкой осадка этиловым спиртом и эфиром, при этом кислотно-солевая и основно-солевая формы агрегатов протеогликанеов могут быть лиофилизированы. (Патент РФ №2096038, опубл. 20.11.1997).
Однако данный метод подразумевает длительную процедуру диализа и использование большого количества дистиллированной воды. Кроме того, конечным продуктом являются углеводобелковые соединения, т.е. недостаточно освобожденные от белка гликозаминогликаны. Использование катионитов требует их регенерации, а промывка и сушка этанол-эфирной смесью является токсичной процедурой на конечном этапе очистки ГАГ из-за процессов сорбции эфира на целевом продукте.
Известно также косметическое средство, предотвращающее старение кожи, в основе которого в качестве активных ингридиентов используются ферментный препарат панкреатин и гиалуроновая кислота, введенные в состав жировой основы гидрогенизированного хлопкового масла, гидролина и глицерина с использованием консервантов, антисептиков и антиоксидантов (Патент РФ №2078561, опубл. 10.04.1996).
Однако известное средство является дорогим по себестоимости, энергоемким, трудоемким.
Известен способ выделения гликозаминогликанов (ГАГ) из фиброзного хряща, в котором хрящ подвергают протеолизу папаином депротеинизации гидролизата трихлоруксусной кислотой и осаждение гликозаминогликанов этанолом, содержащим уксуснокислые соли калия или натрия (Патент РФ №2089201 опубл. 10.09.1997 г.).
Однако в известном способе предлагается выделение ГАГ из неминерализованной соединительно-костной ткани - фиброзного хряща и он не предназначен для выделения ГАГ из костей сельскохозяйственных животных.
Задачей настоящего изобретения является разработка экономичного по расходу времени и реактивов способа выделения гликозаминогликанов из различных видов минерализованной соединительной ткани, в первую очередь, из костей сельхозживотных.
Поставленная задача решается тем, что в способе выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани, включающем ферментативный гидролиз, депротеинизацию, осаждение, деминерализацию проводят в течение 20 ч, используя 0,5 н. HCl, ферментативный гидролиз проводят в течение 18 ч, используя фермент пепсин, депротеинизацию осуществляют добавлением сульфата аммония до 75%-го насыщения, осаждение гликозаминогликанов проводят 4%-ным ацетатом калия в 96% этаноле, переосаждают этанолом, проводят лиофильную сушку, разделяют гликозаминогликаны хроматографически с использованием ДЕАЕ-сефадекса А-25, проводят лиофильную сушку.
Настоящее изобретение поясняют подробным описанием, примером лабораторного выполнения и иллюстрациями, на которых:
фиг.1 - иллюстрирует схему выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани;
фиг.2 - иллюстрирует хроматографический профиль гликозаминогликанов костной ткани на анионообменнике.
Способ осуществляют следующим образом.
После предварительной обработки, заключающейся в удалении мягких тканей, минерализованную соединительную ткань (например, кости крупного рогатого скота) измельчали до кусочков около 5×5 мм. Затем ткань подвергали деминерализации 0,5 н. HCl в течение 20 ч, после этой процедуры деминерализованную ткань освобождали от раствора костного минерала, неколлагеновых белков и проводили пепсиновый протеолиз в присутствии фермента в 0,1 М HCl с рН=2. Пепсин брался из расчета 1 мг на 100 мг ткани. За 18 ч инкубации при температуре 37°С на магнитной мешалке ткань разрушалась полностью с образованием коллоидного раствора, который подвергали центрифугированию при 40.000gx. Белки, РНК, гликопротеины осаждали из супернатанта добавлением сульфата аммония до 75%-го насыщения. Осадок формировался в течение 1 ч, после чего его отделяли центрифугированием (10 мин, 40.000gx). Из полученного супернатанта проводили осаждение ГАГ 4%-ным ацетатом калия в 96% этаноле. Осадок ГАГ, собранный центрифугированием, переосаждали этанолом, снова собирали и лиофильно высушивали. Для получения высокоочищеных фракций ГАГ их разделяли хроматографически с использованием ДЕАЕ-сефадекса А-25, после этого лиофильно высушивали и для изготовления косметического средства гомогенизировали с мазевой основой в массовом соотношении 1:10 соответственно.
Пример лабораторного выполнения
Кости крупного рогатого скота очищают от мягких тканей, обезжиренные спирт-эфирной смесью 1:1 измельчают до кусочков размерами 5×5 мм.
100 г измельченной обезжиренной костной ткани помещают в круглодонную колбу, в которую заливают 200 мл 0,5 н. HCl и оставляют на 20 ч при комнатной температуре. Полученный после удаления надосадка нерастворившийся костный матрикс заливают 0,1 М HCl и вносят 1 мг пепсина. Реакционную массу помещают на магнитную мешалку и проводят ферментативный гидролиз костной ткани в течение 18 ч до полного растворения костей и образования коллоидного раствора.
После этого из раствора протеолизата центрифугированием при 40.000gx 10 мин отделяют осадок, в котором содержаться белки, РНК, гликопротеины. Отбирают в стаканы для центрифугирования супернатант и проводят депротеинизацию, добавляя в него сульфат аммония до 75% насыщения. После повторного центрифугирования в том же режиме осаждают ГАГ 4%-ным ацетатом калия в 96% этаноле в расчете объемов 1:4. Осадок формируется в течение 30 мин на холоде при 4°С. После центрифугирования при 1.300gx 15 мин удаляют супернатант, собирая отработанный 4%-ный ацетат калия в 96% этаноле в отдельную емкость для последующей перегонки этанола. Осадок ГАГ, собранный центрифугированием, переосаждают этанолом, снова центрифугируют при 1.300gx 15 мин, собирают и лиофильно высушивают. Для получения высокоочищеных фракций ГАГ их разделяли хроматографически с использованием ДЕАЕ-сефадекса А-25 (ионообменная емкость 3,5+0,5 meg/g, размер гранул 40-120 мкм). Линейный градиент концентрации элюирующего раствора создают использованием 0,00-2,5 М хлористого натрия в 0,02 М трис-HCl буфере (рН 7,0). Фракции денситометрируют при 226 нм и отбирают по 3 мл, идентифицируя их по определению ГУК, гексоз, общего азота и сульфатов. После этого полученные растворы различных фракций ГАГ лиофильно высушивают.
Выделенные высокоочищенные ГАГ вводят в мазевую основу в соотношении 1:10 соответственно.
Предлагаемый способ прост в использовании, позволяет воспроизводить его в условиях лаборатории лечебного учреждения, для его осуществления не требуется применения дорогостоящих реактивов - специфических осадителей ГАГ и большого количества протеолитических ферментов.
Кроме того, этот способ экономичен по времени, дает возможность повторного использования этанола при собирании его использованным, после последующей перегонки, и позволяет получить высокоочищенный целевой продукт.
Предлагаемый способ используется в биохимической лаборатории РНЦ "ВТО" им. академика Г.А.Илизарова, там же разработано и косметическое средство.
Claims (1)
- Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани, включающий ферментативный гидролиз, депротеинизацию, осаждение, отличающийся тем, что деминерализацию проводят в течение 20 ч используя 0,5 н. HCl, ферментативный гидролиз проводят в течение 18 ч используя фермент пепсин, депротеинизацию осуществляют добавлением сульфата аммония до 75%-ного насыщения, осаждение гликозаминогликанов проводят 4%-ным ацетатом калия в 96%-ном этаноле, переосаждают этанолом, проводят лиофильную сушку, разделяют гликозаминогликаны хроматографически с использованием ДЕАЕ-сефадекса А-25, проводят лиофильную сушку.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003131580/15A RU2325902C2 (ru) | 2003-10-27 | 2003-10-27 | Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003131580/15A RU2325902C2 (ru) | 2003-10-27 | 2003-10-27 | Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2003131580A RU2003131580A (ru) | 2005-04-10 |
RU2325902C2 true RU2325902C2 (ru) | 2008-06-10 |
Family
ID=35611564
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2003131580/15A RU2325902C2 (ru) | 2003-10-27 | 2003-10-27 | Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2325902C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2658918C1 (ru) * | 2017-12-01 | 2018-06-26 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский государственный университет" (КемГУ) | Способ выделения гликозаминогликанов из вторичных коллагенсодержащих отходов |
-
2003
- 2003-10-27 RU RU2003131580/15A patent/RU2325902C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
"Осаждение белков сульфатом аммония". Clive Dennison "A guide to protein isolation" [он-лайн], 02.10.2002 [найдено 09.04.2007] найденно из Интернет:<URL: http://subscribe.ru/archive/science.health.molbiol/200210/15150851.text, известен протокол http://molbiol.ru/protocol/17_15.html. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2658918C1 (ru) * | 2017-12-01 | 2018-06-26 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский государственный университет" (КемГУ) | Способ выделения гликозаминогликанов из вторичных коллагенсодержащих отходов |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2003131580A (ru) | 2005-04-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11884953B2 (en) | Method for preparing protein peptide based on connective tissue and prepared protein peptide and use thereof | |
Miller | Isolation and characterization of the cyanogen bromide peptides from the. alpha. 1 (II) chain of chick cartilage collagen | |
Bartold et al. | The effect of chronic inflammation on gingival connective tissue proteoglycans and hyaluronic acid | |
Morse et al. | A new approach to the study of urinary macromolecules as a participant in calcium oxalate crystallization | |
CN109349419B (zh) | 一种修复人体细胞的复合牦牛骨胶原蛋白肽粉 | |
JP4063877B2 (ja) | 真珠層からの活性物質の製造法、特に医薬品用途としての生成物 | |
CN110538312A (zh) | 一种皮肤创伤修复软膏及其制备方法 | |
Reynolds et al. | The renal lesion in Wilson's disease | |
Ryall | The possible roles of inhibitors, promoters, and macromolecules in the formation of calcium kidney stones | |
CN102952837A (zh) | 一种医用鱼胶原蛋白多肽原料及其制备工艺 | |
EP2589389B1 (en) | Method for producing a biologically active complex. biologically active protein/polypeptide complex | |
Anderson | Some studies on the occurrence of sialic acid in human cartilage | |
RU2325902C2 (ru) | Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани | |
JPS62236499A (ja) | 生物学的に活性なポリペプチド、それらの製造方法ならびにそれらを含有する組成物 | |
Ugel | Bovine keratohyalin: anatomical, histochemical, ultrastructural, immunologic, and biochemical studies | |
CN104448038B (zh) | 一种硫酸软骨素钙盐的制备工艺 | |
CN1807612A (zh) | 一种糜胰蛋白酶的制备方法 | |
WO2012166005A1 (ru) | Белково-полипептидный комплекс специфического действия на кожную ткань, способ его получения и фармкомпозиция на его основе | |
Asboe-Hansen et al. | Mastocytosis (urticaria pigmentosa) with urinary excretion of hyaluronic acid and chondroitin sulfuric acid: changes induced by polymyxin B | |
Shulman et al. | Protein–polysaccharide of chicken cartilage and chondrocyte cell cultures | |
CN114573682A (zh) | 一种弹性蛋白肽及其制备方法 | |
RU2304441C1 (ru) | Способ получения сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей | |
RU2288729C2 (ru) | Способ выделения коллагена из костной ткани сельскохозяйственных животных | |
PT1206488E (pt) | Processo para o isolamento e para a purificacao de alergenios de polens das gramineas | |
JP7357189B1 (ja) | 魚類軟骨由来のコラーゲン含有組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |