WO2013089307A1 - 후발성 백내장 억제용 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

후발성 백내장 억제용 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDF

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WO2013089307A1
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cataract
hyaluronic acid
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주천기
이성희
최준섭
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Definitions

  • composition for inhibiting late cataract and preparation method thereof Composition for inhibiting late cataract and preparation method thereof
  • the present invention relates to a composition for inhibiting late cataract and a method for producing the same. More specifically, by reducing the incidence of late cataracts can prevent the loss of vision and secondary surgery due to late cataracts, as well as compositions for inhibiting late cataracts that can provide more effective drug and homogeneous preparations And to a method for producing the same.
  • the capsular epithelial cells continue to proliferate when exposed to the external environment after cataract surgery.
  • the epithelial cells of the lens are moved to the posterior capsula, which is a relatively empty space.
  • the cell transformation and proliferation occur, light transmission and visual acuity are reduced. Cataracts develop.
  • Nd-Yg laser surgery has been known as the only method for treating late cataracts.
  • these lasers have narrowed the field of vision. Accordingly, prophylactic treatment of late cataracts is more effective.
  • a method of inhibiting late cataracts may be performed by applying a physical change to the intraocular lens support used during cataract surgery or using a capsular expansion ring. Only methods are suggested.
  • Korean Patent No. 0490286 discloses an ophthalmic composition for treating retinal injury that can treat retinal ischemia due to glaucoma, retinal injury due to diabetic retinopathy, retinal nerve degeneration due to uveitis, and the like as sulfasalazine or a water-soluble salt thereof. Is disclosed.
  • Korean Patent No. 0417623 discloses a pharmaceutical composition capable of preventing and treating cerebral neurological diseases such as Parkinson's disease, Huntington's disease or Alzheimer's disease using sulfasalazine as an active ingredient.
  • the present invention can lower the incidence of late cataracts and effectively prevent loss of vision and secondary surgery due to late cataracts, as well as compositions for inhibiting late cataracts that can provide more effective pharmacological and homogeneous preparations. It is to provide a method for producing the same.
  • the present invention is hydrophilic sulfasalazine; 1.4 to 2.0% (w / v) hyaluronic acid; And it provides a composition for inhibiting late cataract comprising a carrier comprising an aqueous solution.
  • the present invention comprises the steps of hydrophilizing sulfasalazine; Adding hyaluronic acid powder to the hydrophilized sulfasalazine; And the hydrophilized sulfasalazine and hyaluronic acid powder provides a method for producing a composition for inhibiting late cataract comprising the step of mixing for 5 to 24 hours at 33 to 42 ° C.
  • hydrophilic sulfasalazine 1.4 to 2.0% (w / v) hyaluronic acid; And it may be provided with a composition for inhibiting late cataract comprising a carrier comprising an aqueous solution.
  • the present inventors in Korea, No. Patent No. 0,894,042, sulfasalazine - hyaluronic acid common compound, and by using a composition for cataract inhibition after including the same, and then to suppress the growth and movement of the cause LECs the cataract lens, posterior capsule It has been shown that the transparency can be maintained and the occurrence of late cataract can be suppressed.
  • hyaluronic acid is a poorly soluble compound, so that the maximum solubility in aqueous solvents and the like is only 2% (w / v), so that the aqueous solution containing sulfasalazine and the aqueous solution containing 2% (w / v) of hyaluronic acid are the same. Even if proportioned, the concentration of hyaluronic acid in the composition to be produced does not reach the concentration required during ophthalmic surgery, for example, 1.4 to 1.53 ⁇ 4> (w / v), and the homogeneity of such a mixture is also sufficient. I could't.
  • the present inventors continue to study, and applying the specific manufacturing method described below can not only include hyaluronic acid in the content of more than the level required during ophthalmic surgery, but also significantly superior homogeneity, but inhibits more than equivalent level of late cataract
  • the composition for inhibiting late cataract having an effect was confirmed and completed the invention. Accordingly, the composition for inhibiting late cataract significantly lowers the incidence of late cataracts, thereby effectively preventing loss of vision and secondary surgery due to late cataracts, as well as having more effective drug efficacy and homogeneous dispersion.
  • Formulations may be provided.
  • the composition for inhibiting late cataract effectively inhibits the migration of lens epithelial cells, thereby significantly lowering the incidence of late cataract. More specifically, it was confirmed that application of the composition for inhibiting late cataract can inhibit the expression of NF-k B in the nucleus of the cell which is the main active site.
  • Sulfasalazine (Sulfasalazine, 2-Hydroxy-5- [[4-[(2-pyr idinylamino) sul fonyl] azo) benzoic acid or 6_oxo-3 (2— [4—GV to pyr idi ⁇ -2-y lsulf amoy 1) pheny 1] hydrazono) eye 1 ohexa- 1, 4-dienecarboxy 1 ic acid] is sulfazypyridine and 5-aminosalicylic acid (5-aminosalicylic acid, 5-ASA) azo bond It is known to inhibit the activity of NF-kB (Nuclear factor kappa B). Accordingly, the composition for inhibiting late cataract including the sulfasalazine can inhibit the development of late cataract by inhibiting the activity of NF-k B expressed when the lens epithelial cells proliferate and migrate.
  • NF-kB Nuclear factor kappa B
  • hydrophilic sulfasalazine may be obtained in the form of an acid addition salt or an alkali addition salt by adding hydrochloric acid, sodium chloride, potassium chloride, or the like to sulfasalazine, and more preferably, may be obtained by PEGylating sulfasalazine.
  • the hydrophilic sulfasalazine may comprise pegylated sulfasalazine.
  • the PEGylated sulfasalizine can be obtained by adding sulfasalizine to a salt balance solution comprising polyethylene glycol.
  • Such salt balance solutions may comprise polyethylene glycols of various molecular weights and concentrations, comprising 1%, preferably 5% (v / v) polyethylene glycol having a weight average molecular weight of 300 to 500, preferably 380 to 420. It is preferable to contain in the above concentration.
  • the concentration of the hydrophilic sulfasalazine may be 0.1 to 1.5 mM, preferably 0.2 to 1.2 mM, more preferably 0.3 to l.OmM. If the concentration is less than 0.1 mM may be difficult to implement effective drug, it is toxic to the eye for a long time operation when lens epithelial cells could "be excessive if it exceeds 1.5mM.
  • the hyaluronic acid 0 ⁇ 31 ⁇ 011 acid maintains the shape of the capsular bag during cataract surgery and acts as a lubricant during intraocular lens implantation.
  • the transparency and viscosity of the composition are increased to enable stable procedures when the composition for inhibiting late cataract is applied to the eye.
  • the content of hyaluronic acid in the composition for inhibiting late cataract is 1.4 to 2.0% (w / v), more preferably 1.5 to 1.8% (w / v) Can be.
  • w / v the content of hyaluronic acid in the composition for inhibiting late cataract
  • a composition for inhibiting late cataract having a high homogeneity while having a hyaluronic acid content of 1.4 to 2.0 3 ⁇ 4 (w / v) is provided.
  • hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 1.0X10 6 to 4.0xi0 6 g / mol can be used in the composition for inhibiting late recurrent cataract.
  • the relative standard deviation of sulfasalazine content measured using high performance liquid chromatography may be 2 or less.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • sulfasalazine when the composition for inhibiting the late cataract is applied to an ophthalmic procedure or the like, sulfasalazine may be uniformly contacted over the entire area of the lens epithelial cell. It can be solved the problem of excessive contact with a certain part to show toxicity to the lens epithelial cells, or contact with a low concentration, the effective drug is not expressed, and can provide a very stable ophthalmic preparation.
  • sulfasalazine when the latex cataract suppression composition is applied to an ophthalmic procedure and the like, sulfasalazine is used together with hyaluronic acid, thereby minimizing the risk of secondary drug administration and additional toxicity during surgery.
  • the carrier containing the aqueous solution may include distilled water, phosphate buffered saline (Phosphate Buffered Saline), balanced salt solution (Balanced Salt Solution), saline (Saline) or a combination thereof.
  • Phosphate Buffered Saline phosphate Buffered Saline
  • Balanced Salt Solution balanced salt solution
  • Saline saline
  • the composition for inhibiting late cataract may further comprise a pharmaceutically acceptable salt.
  • the pharmaceutically acceptable salts include hydrochloric acid, sodium chloride, potassium chloride or a combination thereof.
  • the present inventors continue to study the composition for inhibiting late cataract, by adding hyaluronic acid powder to hydrophilized sulfasalazine and mixing under specific reaction conditions, it is possible to increase the content of hyaluronic acid as well as homogeneity of the composition. It was also confirmed through experiments that the present invention can provide a composition for inhibiting late cataract with excellent drug efficacy and stability, and completed the invention.
  • the hydrophilized sulfasalazine and hyaluronic acid powder is preferably mixed at 33 to 42 ° C, preferably at 35 to 40 ° C, for 5 to 24 hours, preferably 10 to 15 hours.
  • the mixing temperature is less than 33 ° C, the components of the composition for inhibiting late cataract may not be homogeneously mixed, and when the temperature is more than 42t, stable preparation of the preparation may not be easy. Because it is not desirable.
  • the mixing time is less than 5 hours, components of the composition for inhibiting late cataract may not be homogeneously mixed, and when the mixing time exceeds 24 hours, a change in the viscosity of hyaluronic acid may occur.
  • the hydrophilized sulfasalazine and hyaluronic acid powder was common at temperatures of 35 ° C (Example 4), 37 ° C (Example 1) and 40 ° C (Example 3).
  • the combined composition for inhibiting late cataract has a relative standard deviation of sulfasalazine content of 2 or less, and it is confirmed that the components of the late cataract suppressing composition are very homogeneously dispersed. On the contrary, when the mixing temperature is 25 ° C. (Comparative Example 1), a high relative standard deviation of 20% or more appears, and it is confirmed that the components of the composition for inhibiting late cataract are very unevenly dispersed.
  • the step of hydrophilizing sulfasalazine a method commonly known as a method for solubilizing a poorly soluble compound may be used without particular limitation, and preferably, the step of PEGylating sulfasalazine may be applied.
  • the step of PEGylating the sulfasalazine may include adding sulfasalazine to a salt balance solution containing polyethylene glycol. Polyethylene glycol contained in the salt balance solution may be hydrophilized by PEGylating sulfasalizine (PEGylation).
  • the sulfasalazine When the sulfasalazine is pegylated and hydrophilized, it can be used as a water-soluble liquid without changing the chemical structure, and can be easily prepared as an injection and an ophthalmic preparation. Specific details of the sulfasalazine and polyethylene glycol are the same as described above.
  • Hydrophilizing the sulfasalazine may include adjusting the concentration of sulfasalazine to 0.1 to 1.5 mM. More specifically, the sulfasalazine solution is added to the salt balance solution containing polyethylene glycol in an appropriate amount so that the concentration of sulfasalizine is 0.1 to 1.5 mM, preferably 0.2 to 1.2 mM, more preferably 0.3 to l.OmM. Can be adjusted with.
  • the concentration of the hyaluronic acid in the total composition is adjusted to 1.4 to 2.0% (w / v), preferably 1.5 to 1.8% (w / v). It may include. More specifically, the concentration may be adjusted by adding an appropriate amount of hyaluronic acid powder to the hydrophilized sulfasalazine or the salt balance solution to which the sulfasalazine is added. There is no other limitation on the physical properties, shape, size, etc. of the hyaluronic acid powder, it is preferable that the aseptic treatment.
  • the method for producing a composition for inhibiting late cataract may further comprise the step of adding a pharmaceutically acceptable additive, carrier or salt.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or salt may be added without any limitation in the process of preparing the composition for inhibiting late cataract, but it is preferable to add the hydrophilized sulfasalazine and hyaluronic acid powder after mixing completely. Do.
  • the present invention by reducing the incidence of late cataracts can prevent the loss of vision and secondary surgery due to late cataracts, as well as compositions for inhibiting late cataracts that can provide more effective drug and stable formulation Can be provided.
  • Figure 1 schematically shows the process of developing late cataract.
  • Figure 2 schematically shows the relationship between the invention of late cataract and lens epithelial cells.
  • Figure 3 shows the results of confirming whether the composition for inhibiting the late cataract according to the embodiment inhibited the movement of the lens epithelial cells and shows the statistical data for this.
  • Figure 4 shows the results of confirming the toxicity of the cells by concentration of sulfasalazine through ⁇ assay.
  • FIG. 5 shows the results of confirming whether NF-k B is activated in the cytoplasm and the nucleus, and shows statistical data thereof.
  • Figure 6 shows the homogeneity evaluation results of the composition for inhibiting late cataract of Example 1, Example 3, Example 4 and Comparative Example 1.
  • Figure 7 shows the homogeneity evaluation results of the composition for inhibiting late cataracts of Example 2 and Comparative Example 2.
  • the salt balance solution containing sulfasalazine was mixed with hyaluronic acid powder (Sodium Hyaluronate, NOVA Biotech) for 15 hours at 37 ° C. for 12 hours, and a composition for inhibiting late cataract of sulfasalazine-hyaluronic acid mixture was prepared. Got it.
  • hyaluronic acid powder sodium Hyaluronate, NOVA Biotech
  • a composition for inhibiting late cataract was obtained in the same manner as in Example 1, except that sulfasalazine was brought to a concentration of 1.0 mM.
  • a composition for inhibiting late cataract was obtained in the same manner as in Example 1 except that the mixing temperature of the salt balance solution including the sulfasalazine and the hyaluronic acid powder was 40 ° C.
  • Example 4 the mixing temperature of the salt balance solution including the sulfasalazine and the hyaluronic acid powder was 40 ° C.
  • a composition for inhibiting late cataract was obtained in the same manner as in Example 1 except that the mixing temperature of the salt balance solution containing sulfasalazine and hyaluronic acid powder was set to 351C.
  • Example 5 the mixing temperature of the salt balance solution containing sulfasalazine and hyaluronic acid powder was set to 351C.
  • a composition for inhibiting late cataract was obtained in the same manner as in Example 1, except that sulfasalazine was adjusted to a concentration of 0.3 raM. Comparative Example 1
  • a composition for inhibiting late cataract cataract was obtained in the same manner as in Example 1 except that the mixing temperature of the salt balance solution containing sulfasalazine and hyaluronic acid powder was set to 25 "C. Comparative Example 2
  • a composition for inhibiting late cataract was obtained in the same manner as in Comparative Example 2 except that sulfasalazine was added so as to have a concentration of 0.5 mM.
  • the mixing temperatures of the sulfasalazine concentration, the amount (concentration) of the hyaluronic acid and the salt balance solution containing the sulfasalazine and the hyaluronic acid powder in Examples 1 to 5 and Comparative Examples 1 to 3 are shown in Table 1 below.
  • 'HLE B3 cell' Human lens epithelial B3 cell line
  • crystalline epithelial cells culture medium containing 20% fetal bovine serum in Eagle's minimum essential medium (MEM, Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, USA) And cultured at 371: using a 5% C0 2 cell incubator.
  • MEM Eagle's minimum essential medium
  • the anterior of the capsular bag was cut to about 5 mm in diameter, and the capsular bag extension ring (Tension ring, CTR98-A, Lucid Korea, Korea) was inserted and the contents of the lens were removed.
  • These lenses were placed in Dulbeccos Modified essential medium (DMEM) culture without serum and cultured at 37 ° C. using a 5% CO 2 cell incubator.
  • DMEM Dulbeccos Modified essential medium
  • the composition for inhibiting late cataract prepared in Example and Comparative Example and the human lens epithelial cell culture medium obtained in Preparation Example 1 were mixed in a 1: 1 amount, and then administered to the capsular bag of Preparation Example 2 to observe the effect. .
  • the effect analysis method is as follows.
  • composition for inhibiting late cataract prepared in Examples 1 and 2 and the control group not treated with sulfasalazineol were mixed in a 1: 1 equivalent amount to human lens epithelial cell culture obtained in Preparation Example 1 and administered to the capsular bag of Preparation Example 2, respectively.
  • the migration of lens epithelial cells was inhibited by using a microscope (AE-21, Pel co) and a microscope camera (Digital 352 CCD, Motic) and the results are shown in FIG.
  • the migration of the lens epithelial cells was inhibited by the composition for inhibiting late cataract of Example 1 and 2, compared with the control group not treated with sulfasalazine.
  • the composition for inhibiting late cataracts of Examples 1 and 2 was added to the compositions of Comparative Examples 2 and 3 (mixture of 2 »hyaluronic acid solution in a salt balance solution containing sulfasalazine in a 50:50 weight ratio).
  • the migration of lens epithelial cells can be more effectively inhibited.
  • the composition for inhibiting late cataract of Example 1 and 2 shows the effect of inhibiting migration and proliferation of 51.5%, 40.5% of the capsular epithelial cells, respectively, Comparative Example 2 and It is confirmed that the composition of 3 exhibits 68.5% and 48.5% of inhibiting migration and proliferation of lens epithelial cells.
  • composition for inhibiting late cataract of Example inhibits the expression and activity of NF-k B during migration of lens epithelial cells.
  • electrophoresis experiments confirmed that NF-k B was activated in the cytoplasm and the nucleus, and the results are shown in FIGS. 5-A. At this time,
  • Beta-tubulin was used as a cytoplasmic marker and Laminin A was used as a nuclear protein marker.
  • Fig. 5-A it is confirmed that NF-k B is expressed in the cytoplasm and nucleus during epithelial cell migration of the lens, and the main active site is the nucleus of the cell (control).
  • the compositions for inhibiting late cataracts of Examples 1,2 and 5 were applied, it was confirmed that the expression of NF-k B was suppressed in the nucleus of the cell which is the main active site.
  • Example 1 (37 ° C)
  • Example 3 (40 ° C)
  • Example 4 (35 ° C)
  • Comparative Example 1 25 ° C) 3
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Example 1 As shown in Figure 6-B, in Example 1 (37 ° C), Example 3 (40 t) and Example 4 (35 ° C), the relative standard deviations of 0.87%, 1.30% and 1.34% are shown, respectively. , The composition for inhibiting late cataract was confirmed to be very homogeneously dispersed. In contrast, Comparative Example K25 ° C) showed a high relative standard deviation of 28.35%, it was confirmed that the composition for inhibiting late cataract is very non-uniformly dispersed.
  • Example 2 After taking three samples for each of the upper, middle, and lower positions of the compositions of Example 2 and Comparative Example 2, the content of sulfasalazine was analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC). Then, this content analysis was repeated three times, from which the relative standard deviation (RDS) of the content was calculated.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Example 2 shows a relative standard deviation of 0.59%, the composition for inhibiting late cataract is very homogeneously dispersed On the contrary, in Comparative Example 2, a relative standard deviation of 6.84% was shown, indicating that the dispersion was very nonuniform.

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Abstract

본 발명은 친수성 설파살라진; 높은 함량의 히알루론산; 및 수용액을 포함하는 담체를 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물; 및 친수화 된 설파살라진에 히알루론산 가루를 첨가하고 특정의 반응 조건으로 혼합하여 상기 후발성 백내장 억제용 조성물을 얻을 수 있는 제조 방법에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
후발성 백내장 억제용 조성물 및 이의 제조 방법
【기술분야】
본 발명은 후발성 백내장 억제용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는， 후발성 백내장의 발병률을 낮추어 후발성 백내장으로 인한 시력의 상실 및 2차적 수술을 방지할 수 있을 뿐만 아니라， 보다 효과적인 약효 및 균질한 제제를 제공할 수 있는 후발성 백내장 억제용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
전체 백내장 수술 환자의 약 30%가 후발성 백내장 (After-cataract, Posterior capsular opacity), 즉 남아있는 수정체 상피세포가 불규칙한 배열로 수정체 후낭 (posterior capsule)으로 자라 들어가서 수정체가 다시 흔탁해지는 질환을 겪고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 후발성 백내장은 전 연령대에서 발생되는데 , 특히 노령 환자층에 비하여 젊은 환자층에서 발명를이 2배 이상 높게 나타나는 것으로 보고되고 있다.
보다 구체적으로， 도 1 및 도 2 에 나타낸 바와 같이， 백내장 수술 후에 외부환경에 노출되면 수정체 상피세포는 계속적인 증식을 하게 된다. 이에 따라 수정체 상피세포가 상대적으로 빈 공간인 수정체 후낭으로 이동하게 되고, 계속적인 세포 변형과 증식이 일어나면서 빛의 투과력 및 시력이 저하되게 되는데， 이러한 후낭에 모인 수정체 상피세포가 완전히 변형되면서 후발성 백내장이 발생하게 된다.
아직까지 후발성 백내장의 치료는 레이저 (Nd-Yg Laser) 수술이 유일한 방법으로 알려져 있으나, 이러한 레이져 시술 후에는 시야가 좁아지는 문제가 나타나고 있다. 이에 따라, 후발성 백내장을 예방적으로 치료하는 방법이 보다 더 효과적인데, 현재까지는 후발성 백내장을 억제하는 방법으로 백내장 수술시 사용되는 인공수정체 지지부에 물리적인 변화를 가하거나 수정체낭 확장 고리를 이용하는 방법 등이 제시되고 있을 뿐이다. 한국등록특허 제 0490286 호에는 설파살라진 또는 그 수용성 염을 활성성분으로 하여 녹내장에 의한 망막의 허혈， 당뇨병성 망막증에 의한 망막 손상， 포도막염에 의한 망막 신경의 퇴화 등을 치료할 수 있는 망막손상 치료용 안약 조성물에 관하여 개시되어 있다.
또한， 한국등록특허 제 0417623 호에는 설파살라진을 유효성분으로 하여 파킨슨병， 헌팅톤병 또는 알츠하이머병 등의 뇌신경 질환을 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물이 개시되어 있다.
그러나, 이러한 방법들에 의해서도 효과적으로 후발성 백내장을 예방 및 치료할 수 없었고， 백내장 수정체 상피 세포의 증식 및 이동을 억제하여 후발성 백내장을 예방 또는 치료하는 방법에 대해서는 전혀 알려진 바가 없었다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명은 후발성 백내장의 발병률을 낮추어 후발성 백내장으로 인한 시력의 상실 및 2 차적 수술을 효과적으로 방지할 수 있을 뿐만 아니라， 보다 효과적인 약효 및 균질한 제제를 제공할 수 있는 후발성 백내장 억제용 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하기 위한 것이다.
【과제의 해결 수단】
본 발명은 친수성 설파살라진; 1.4 내지 2.0 %(w/v)의 히알루론산; 및 수용액을 포함하는 담체를 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 설파살라진을 친수화 시키는 단계; 상기 친수화 된 설파살라진에 히알루론산 가루를 첨가하는 단계; 및 상기 친수화 된 설파살라진 및 히알루론산 가루를 33 내지 42°C에서 5 내지 24 시간 흔합하는 단계를 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
이하 발명의 구체적인 구현 예에 따른 후발성 백내장 억제용 조성물 및 이의 제조 방법에 관하여 상세히 설명하기로 한다. 발명의 일 구현 예에 따르면， 친수성 설파살라진; 1.4 내지 2.0 %(w/v)의ᅳ히알루론산; 및 수용액을 포함하는 담체를 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물이 이 제공될 수 있다.
본 발명자들은， 한국등록특허 제 0894042 호에서， 설파살라진- 히알루론산 흔합물 및 이를 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물을 이용하면， 후발성 백내장의 원인 수정체 상피 세포의 증식 및 이동을 억제하여 수정체' 후낭의 투명성을 유지시킬 수 있고, 후발성 백내장의 발생을 억제할 수 있음을 밝힌 바 있다.
그런데， 히알루론산은 난용성 화합물로서 수용매 등에 대한 최대 용해도가 2% (w/v)에 불과하기 때문에， 설파살라진이 포함된 수용액과 2% (w/v)의 히알루론산의 포함된 수용액을 동일한 비율로 흔합한다고 하여도， 제조되는 조성물 상에 히알루론산의 농도가 안과 수술시 요청되는 농도， 예를 들어， 1.4~1.5¾> (w/v)에 미치지 못할 뿐만 아니라， 이러한 흔합물의 균질성 또한 충분하지 못하였다.
이에 본 발명자들은 연구를 계속 진행하여， 후술하는 특정의 제조 방법을 적용하면 히알루론산을 안과 수술시 요청되는 수준 이상의 함량으로 포함시킬 수 있을 뿐만 아니라， 균질성이 현저히 우수하면서도 동등 수준 이상의 후발성 백내장 억제 효과를 갖는 후발성 백내장 억제용 조성물을 제조할 수 있음을 실험을 통하여 확인하고 발명을 완성하였다. 이에 따라， 이러한 후발성 백내장 억제용 조성물은 후발성 백내장의 발병률을 현저히 낮추어 후발성 백내장으로 인한 시력의 상실 및 2 차적 수술을 효과적으로 방지할 수 있을 뿐만 아니라， 보다 효과적인 약효 및 균질한 분산 상태를 갖는 제제를 제공할 수 있다.
또한， 후술하는 실험예 A 및 C 에 나타난 바와 같이， 상기 후발성 백내장 억제용 조성물은 수정체 상피 세포의 이동을 효과적으로 억제하여 후발성 백내장의 발병률을 현저히 낮출 수 있는 점이 확인 된다. 보다 구체적으로， 상기 후발성 백내장 억제용 조성물을 적용하면 NF-k B 가 주 활성부위인 세포의 핵에서 발현되는 것을 억제할 수 있음이 확인되었다. 상기 설파살라진 (Sulfasalazine, 2-Hydroxy-5-[ [4-[(2- pyr idinylamino)sul fonyl ]azo] benzoic acid 또는 6_oxo—3— (2—[4—GV~ pyr i d i η-2-y lsulf amoy 1 ) pheny 1 ] hydrazono ) eye 1 ohexa- 1， 4-d i enecarboxy 1 i c acid]은 설파피리딘 (Sulfapyridine)과 5-아미노살리실산 (5-aminosalicylic acid, 5-ASA)이 아조 결합 (azo bond)하여 형성된 화합물로서， NF- kB(Nuclear factor kappa B)의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이에 따라， 이러한 설파살라진을 포함한 상기 후발성 백내장 억제용 조성물은 수정체 상피세포가 증식 및 이동을 할 때 발현되는 NF-k B 의 활성을 억제하여 후발성 백내장의 발병을 억제할 수 있다.
상기 설파살라진은 수용액에 대하여 난용성이여서， 약제로 사용되기 위해서는 친수성 설파살라진으로 가용화하여야 한다. 이러한 친수성 설파살라진은 설파살라진에 염산， 염화나트륨， 염화칼륨 등을 첨가하여 산 부가염 또는 알칼리 부가염의 형태로 얻어 질 수 있고， 보다 바람직하게는 설파살라진을 페그화 (PEGylation) 하여 얻어질 수도 있다.
상기 친수성 설파살라진은 페그화된 설파살리진을 포함할 수 있다. 상기 페그화 (PEGylation) 된 설파살리진은 설파살리진을 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 염 균형 용액에 첨가하여 얻어 질 수 있다. 이러한 염 균형 용액은 다양한 분자량 및 농도의 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있는데， 300 내지 500， 바람직하게는 380 내지 420 의 중량평균분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 1%, 바람직하게는 5% (v/v) 이상의 농도로 포함하는 것이 바람직하다.
상기 친수성 설파살라진의 농도는 0.1 내지 1.5 mM, 바람직하게는 0.2 내지 1.2mM, 보다 바람직하게는 0.3 내지 l.OmM 일 수 있다. 상기 농도가 0.1 mM 미만이면 유효한 약효를 구현하기 어려울 수 있으며， 1.5mM 를 초과하면 장시간 안과 수술 시 수정체 상피 세포에 대한 독성이 과다해질 '수 있다.
한편， 상기 히알루론산0^31^011 acid)은 백내장 수술시 수정체낭의 모양을 유지시켜주고， 인공수정체 삽입시 윤활제 역할을 하며, 조성물의 투명도 및 점도를 증가시켜서 상기 후발성 백내장 억제용 조성물을 안구에 적용할 때 안정적 시술을 가능하게 해준다 .
발명의 일 구현예의 후발성 백내장 억제용 조성물에서는， 상기 후발성 백내장 억제용 조성물에서 히알루론산의 함량이 1.4 내지 2.0 %(w/v) , 보다 바람직하게는 1.5 내지 1.8 %(w/v)일 수 있다. 종래에는 1.0%(w/v)를 초과하여 히알루론산을 포함하는 조성물을 제조하기가 어려웠을 뿐 만 아니라, 히알루론산의 함량을 높인다고 하여도 조성물의 균질성이 현저히 저하되었다. 그러나， 후술하는 특정의 제조 방법에 의하면， 히알루론산의 함량이 1.4 내지 2.0 ¾(w/v)이면서도 우수한 균질성을 갖는 후발성 백내장 억제용 조성물이 제공된다.
상기 후발성 백내장 억제용 조성물에서 히알루론산의 함량이 1.4%(w/v) 미만인 경우， 수정체낭의 모양올 유지시키기 어렵고， 인공수정체 삽입시 윤활제 역할이 감소될 수 있으며， 설파살라진의 약효를 유효성 있게 전달하지 못할 뿐만 아니라， 상기 조성물의 점도가 저하되어 설파살라진이 수정체 상피세포에 접촉할 수 있는 시간이 짧아질 수 있고， 이에 따라 안구용 제제로서 적절한 역할을 하기 어려워질 수 있어 바람직하지 못하다. 한편, 상기 후발성 백내장 억제용 조성물에서는， 1.0X106 내지 4.0xi06g/몰의 중량평균분자량을 갖는 히알루론산을 사용할 수 있다.
상기 후발성 백내장 억제용 조성물에서는， 고성능 액체 크로마토그래프 (HPLC)를 이용하여 측정한 설파살라진 함량의 상대표준편차가 2 이하 일 수 있다. 종래의 기술에 의하면 설파살라진 및 히알루론산의 흔합물이 포함된 조성물에서 히알루론산의 함량을 높이면 균질성이 현저히 낮아지고 설파살라진의 분산이 매우 불균질하게 되는 현상 (예를 들어， 설파살라진 함량의 상대표준편차가 매우 커지는 현상)이 관찰되었으나， 후술하는 실험예 D에 나타난 바와 같이， 발명의 일 구현예의 상기 후발성 백내장 억제용 조성물에서는 설파살라진 및 히알루론산이 매우 균질하게 분산되어 있음이 확인된다. 이에 따라, 상기 후발성 백내장 억제용 조성물을 안과 시술 등에 적용하는 경우， 수정체 상피 세포 전 영역에 걸쳐 설파살리진이 균질하게 접촉할 수 있기 때문에， 설파살리진이 특정 부분에 과농도로 접촉하여 수정체 상피 세포에 독성을 나타내거나， 저농도로 접촉하여 유효한 약효가 발현되지 않는 문제점 등을 해결할 수 있으며， 매우 안정적인 안과 시술용 제제를 제공할 수 있다. 또한， 상기 후발성 백내장 억제용 조성물을 안과 시술 등에 적용하는 경우 설파살라진을 히알루론산과 같이 사용하기 때문에 수술시 2 차적인 약물 투여의 번거로움 및 추가적인 독성에 대한 위험 부담을 최소화할 수 있다. 한편, 상기 수용액을 포함하는 담체는 증류수， 인산완층액 (Phosphate Buffered Saline), 균형염용액 (Balanced Salt Solution), 생리식염수 (Saline) 또는 이들의 흔합물 등을 포함할 수 있다.
상기 후발성 백내장 억제용 조성물은 약제학적으로 허용되는 염을 더 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 염의 구체적인 예로는 염산， 염화나트륨， 염화칼륨 또는 이들의 흔합물이 있다. 한편， 발명의 다른 구현예에 따라， 설파살라진을 친수화 시키는 단계; 상기 친수화 된 설파살라진에 히알루론산 가루를 첨가하는 단계; 및 상기 친수화 된 설파살라진 및 히알루론산 가루를 33 내지 42°C에서 5 내지 24 시간 흔합하는 단계를 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물의 제조 방법이 제공될 수 있다.
본 발명자들은， 후발성 백내장 억제용 조성물에 관한 연구를 계속 진행하여， 친수화 된 설파살라진에 히알루론산 가루를 첨가하고 특정의 반웅 조건으로 흔합하면， 히알루론산의 함량을 높일 수 있을 뿐만 아니라 조성물의 균질성도 향상시킬 수 있어서， 우수한 약효 및 안정성을 갖는 후발성 백내장 억제용 조성물을 제공할 수 있는 점을 실험을 통하여 확인하고 발명을 완성하였다.
상기 친수화 된 설파살라진 및 히알루론산 가루는 33 내지 42°C에서， 바람직하게는 35 내지 40°C에서， 5 내지 24 시간， 바람직하게는 10 내지 15시간 동안흔합하는 것이 바람직하다. 상기 흔합시의 온도가 33°C 미만인 경우에는， 후발성 백내장 억제용 조성물의 성분들이 균질하게 흔합되지 않을 수 있고， 42t 초과인 경에는 제제의 안정적인 조제가 쉽지 않기 때문에 바람직하지 않다. 또한， 상기 흔합의 시간이 5시간 미만인 경우에는， 후발성 백내장 억제용 조성물의 성분들이 균질하게 흔합되지 않을 수 있고， 24시간을 초과하는 경우에는 히알루론산의 점도에 변화가 생길 수 있다. 후술하는 실험예 D 에서 나타난 바와 같이， 상기 친수화 된 설파살라진 및 히알루론산 가루를 35 °C (실시예 4)， 37 °C (실시예 1) 및 40 °C (실시예 3)의 온도에서 흔합하여 제조된 후발성 백내장 억제용 조성물은， 설파살라진 함량의 상대표준편차가 2 이하로 나타나， 후발성 백내장 억제용 조성물의 성분들이 매우 균질하게 분산되어 있음이 확인된다. 이에 반하여， 상기 흔합 온도가 25 °C (비교예 1)인 경우에는 20 % 이상의 높은 상대표준편차가 나타나서， 후발성 백내장 억제용 조성물의 성분들이 매우 불균일하게 분산된다는 점이 확인된다.
상기 설파살라진을 친수화 시키는 단계에서는 난용성 화합물을 가용화 시키기 위한 방법으로 통상적으로 알려진 방법을 별 다른 제한 없이 사용할 수 있으나， 바람직하게는 설파살라진을 페그화 (PEGylation)시키는 단계를 적용할 수 있다. 구체적으로， 이러한 설파살라진을 페그화 (PEGylation)시키는 단계는 설파살라진을 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 염 균형 용액에 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 염 균형 용액에 포함되는 폴리에틸렌 글리콜은 설파살리진을 페그화 (PEGylation)하여 친수화 시킬 수 있다. 설파살라진을 페그화하여 친수화 시키면， 화학적 구조의 변경 없이 수용성의 액체로 사용할 수 있고， 주사제 및 안과용 제제로 용이하게 제작할 수 있다. 상기 설파살라진 및 폴리에틸렌 글리콜에 관한 구체적인 내용은 상술한 내용과 같다.
상기 설파살라진을 친수화 시키는 단계에서는 설파살라진의 농도를 0.1 내지 1.5 mM 로 조절하는 단계를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로， 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 염 균형 용액에 적절한 양으로 설파살라진 용액을 첨가하여， 상기 설파살리진의 농도를 0.1 내지 1.5 mM, 바람직하게는 0.2 내지 1.2mM, 보다 바람직하게는 0.3 내지 l.OmM 로 조절할 수 있다. 상기 친수화 된 설파살라진에 히알루론산 가루를 첨가하는 단계에서는 전체 조성물 상에서 상기 히알루론산의 농도가 1.4 내지 2.0 %(w/v), 바람직하게는 1.5 내지 1.8%(w/v)가 되도록 조절하는 단계를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로， 상기 친수화 된 설파살라진 또는 상기 설파살라진이 첨가된 염 균형 용액에 적절한 양의 히알루론산 가루를 첨가하여 농도를 조절할 수 있다. 상기 히알루론산 가루의 물성， 형태， 크기 등 에는 다른 제한이 없으며， 무균 처리된 것이 바람직하다.
한편， 상기 후발성 백내장 억제용 조성물의 제조 방법에서는， 약제학적으로 허용되는 첨가제， 담체 또는 염을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 염은 상기 후발성 백내장 억제용 조성물의 제조하는 과정에서 별 다른 제한 없이 첨가될 수 있으나， 상기 친수화 된 설파살라진 및 히알루론산 가루가 완전히 흔합된 이후에 첨가하는 것이 바람직하다.
【발명의 효과】
본 발명에 따르면， 후발성 백내장의 발병률을 낮추어 후발성 백내장으로 인한 시력의 상실 및 2 차적 수술을 방지할 수 있을 뿐만 아니라， 보다 효과적인 약효 및 안정적인 제제를 제공할 수 있는 후발성 백내장 억제용 조성물이 제공될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 후발성 백내장 발생 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2 는 후발성 백내장 발명과 수정체 상피세포의 관계를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3 는 실시예에 의한 후발성 백내장 억제용 조성물이 수정체 상피세포의 이동을 억제하였는지 확인한 결과 및 이에 대한 통계데이타를 나타낸 것이다.
도 4 는 설파살라진의 농도별 세포에 대한 독성을 ΜΊΤ assay 를 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5 는 NF-k B 가 세포질 및 핵에서 활성화 되는지 여부를 확인한 결과 및 이에 대한 통계데이타를 나타낸 것이다ᅳ 도 6은 실시예 1， 실시예 3， 실시예 4 및 비교예 1의 후발성 백내장 억제용 조성물의 균질성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 7 은 실시예 2 및 비교예 2 의 후발성 백내장 억제용 조성물의 균질성 평가 결과를 나타낸 것이다.
【발명의 실시를 위한 구체적인 내용】
발명을 하기의 실시예에서 보다 상세하게 설명한다. 단， 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. <실시예 및 비교예: 후발성 백내장 억제용조성물의 제조 > 실시예 1
10%(v/v)의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG, Mw.400, 상품명: P3265, Sigma 사)이 포함된 염 균형용액 (Balanced salt solution) 500mL 에 설파살라진을 0.5 mM 의 농도가 되도톡 첨가하고，실온에서 2 시간 정도 흔합하였다.
그리고， 상기 설파살라진이 포함된 염 균형용액에 히알루론산 가루 (Sodium Hyaluronate, NOVA Biotech) 15 g/L 가 되게 37°C에서 12 시간 동안 흔합하여， 설파살라진 -히알루론산 흔합물의 후발성 백내장 억제용 조성물을 얻었다. 실시예 2
설파살라진을 1.0 mM 의 농도가 되도록 한 점을 제외하고는， 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 후발성 백내장 억제용 조성물을 얻었다. 실시예 3
상기 설파살라진이 포함된 염 균형용액 및 히알루론산 가루의 흔합 온도를 40°C로 한 점을 제외하고는 실시예 1 과 동일한 방법으로 후발성 백내장 억제용 조성물을 얻었다. 실시예 4
상기 설파살라진이 포함된 염 균형용액 및 히알루론산 가루의 흔합 온도를 351C로 한 점을 제외하고는 실시예 1 과 동일한 방법으로 후발성 백내장 억제용 조성물을 얻었다. 실시예 5
설파살라진을 0.3 raM 의 농도가 되도록 한 점을 제외하고는， 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 후발성 백내장 억제용 조성물을 얻었다. 비교예 1
상기 설파살라진이 포함된 염 균형용액 및 히알루론산 가루의 흔합 온도를 25"C로 한 점을 제외하고는 실시예 1 과 동일한 방법으로 후발성 백내장 억제용 조성물을 얻었다. 비교예 2
10%(v/v)의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG, Mw.400, 상품명: P3265, Sigma 사)이 포함된 염 균형용액 (Balanced salt solution) 500mL 에 설파살라진을 1.0 mM 의 농도가 되도록 첨가하고， 실온에서 1 시간 정도 흔합하였다.
그리고， 상기 설파살라진이 포함된 염 균형용액에 2%의 히알루론산 용액을 50:50 중량비로 배합하고， 25°C에서 2 시간 동안 흔합하여， 설파살라진 -히알루론산흔합물의 후발성 백내장 억제용 조성물을 얻었다. 비교예 3
설파살라진을 0.5mM 의 농도가 되도록 첨가한 점 외에는 상기 비교예 2와 동일한 방법으로 후발성 백내장 억제용 조성물은 얻었다. 상기 실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 3 에서의 설파살라진 농도， 히알루론산의 사용량 (농도) 및 설파살라진이 포함된 염 균형용액 및 히알루론산 가루의 흔합온도를 하기 표 1에 기재하였다. [표 1]
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* 비교예 1 의 경우, 후술하는 바와 같이 설파살라진과 히알루론산의 흔합물이 매우 불균질하게 형성되고， 히알루론산의 상당 부분이 용해되지 않아 히알루론산의 정확한 농도를 측정할 수 없었다. <실험예 >
제조예 1. 사람수정체의 상피세포 배양
Human lens epithelial B3 cell line (이하， 'HLE B3 세포'라 한다) 수정체 상피세포를， Eagle's minimum essential medium (MEM, Invitrogen- Gibco, Grand Island, NY, USA)에 20% fetal bovine serum 이 포함된 배양액에 넣고 5% C02세포 배양기를 이용하여 371：에서 배양하였다. 제조예 2. 수정체낭배양
돼지 눈올 이용하며， 수정체를 분리후 수정체 낭의 전방을 직경 약 5mm 정도로 잘라내고， 수정체낭 확장고리 (Tension ring, CTR98-A, Lucid Korea, Korea)를 삽입한 후, 수정체의 내용물을 제거하였다. 이러한 수정체 낭올 혈청 (serum)이 없는 Dulbeccos Modified essential medium(DMEM) 배양액에 넣고， 5% C02세포 배양기를 이용하여 37°C에서 배양하였다. 상기 실시예 및 비교예에서 제조된 후발성 백내장 억제용 조성물과 상기 제조예 1 에서 얻어진 사람의 수정체 상피 세포 배양액을 1:1 동량으로 섞은 후， 제조예 2의 수정체 낭에 투여하여 효과를 관찰하였다.
효과 분석방법은 다음과 같다.
1) 세포독성: ΜΊΤ assay를 통하여 분석하였다.
2) 단백질 활성: Western blot 분석법을 이용하여 수행하였다.
얻어진 모든 결과에 대한 통계학적 분석은 one-way ANOVA test 를 이용하여 실시하였다.
A. 수정체 상피 세포의 이동 억제 여부 확인
실시예 1，2 에서 제조된 후발성 백내장 억제용 조성물 및 설파살라진올 처리 하지 않은 대조군을 각각 상기 제조예 1 에서 얻어진 사람의 수정체 상피 세포 배양액을 1:1 동량으로 섞고 제조예 2 의 수정체 낭에 투여한 후， 수정체 상피 세포의 이동이 억제되는지를 현미경 (AE-21, Pel co 사) 및 현미경카메라 (Digital 352 CCD, Motic 사)이용하여 관찰하고 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3-A 에 나타난 바와 같이， 설파살라진을 처리 하지 않은 대조군과 비교하였을 때， 실시예 1,2 의 후발성 백내장 억제용 조성물에 의하여 수정체 상피 세포의 이동이 억제된 것이 확인되었다. 또한， 실시예 1，2 의 후발성 백내장 억제용 조성물이 비교예 2 및 3 의 조성물 (설파살라진이 포함된 염 균형용액에 2 »의 히알루론산 용액을 50:50 중량비로 배합)에 비하여 수정체 상피 세포의 이동을 더 효과적으로 억제할 수 있는 점도 확인되었다.
구체적으로， 도 3-B 에 나타난 바와 같이， 실시예 1,2 의 후발성 백내장 억제용 조성물이 각각 51.5%, 40.5% 의 수정체 상피세포의 이동 억제 및 증식 억제 효과를 나타내는데 반하여， 비교예 2 및 3 의 조성물은 68.5%, 48.5% 에 불과한 수정체 상피세포의 이동 억제 및 증식 억제 효과를 나타내는 점이 확인된다.
B. 설파살라진의 농도별 세포독성 확인 실험
도 4에 나타난 바와 같이， MTT assay를 통하여 분석한 결과, 실시예 1,2 및 5 의 조성물이 60.0 % 이상의 수치를 나타내어， 유의할 만한 세포 독성이 없는 것이 확인되었다.
C NF-k B의 발현 및 활성 억제 확인 실험
실시예의 후발성 백내장 억제용 조성물이 수정체 상피세포의 이동 중 NF-k B의 발현과 활성을 억제하는지를 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 우선， 전기 영동 (electrophoresis) 실험을 통하여, NF-k B가 세포질 및 핵에서 활성화되는지 확인하고， 그 결과를 도 5-A 에 나타내었다. 이때，
Beta-tubulin은 세포질 마커로， Laminin A는 핵단백질 마커로 사용하였다. 도 5-A 에 나타난 바와 같이， 수정체의 상피 세포 이동 중 NF-k B가 세포질과 핵에서 발현되고, 주 활성 부위가 세포의 핵인 것이 확인된다 (대조군). 이에 반하여， 실시예 1,2 및 5 의 후발성 백내장 억제용 조성물을 적용한 경우에는， 주 활성부위인 세포의 핵에서 NF-k B 의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있다.
또한， 도 5-B에서 추가적으로 확인되는 바와 같이， 실시예의 후발성 백내장 억제용 조성물을 적용하면, NF-k B 의 핵으로의 이동을 30%이상 억제할 수 있는 것으로 나타났다.
D. 설파살라진 -히알루론산흔합물의 균질성 평가 (1) 설파살라진을 10% 폴리에틸렌글리콜이 포함된 염 균형용액에 농도별로 녹여 고성능 액체크로마토 그래프로 설파살라진 함량을 측정하여 직선의 검량선을 준비하였다 (도 6-A).
(2) 그리고， 실시예 1(37 °C), 실시예 3(40 °C) 실시예 4(35 °C) 및 비교예 1(25 °C)의 조성물의 상， 중， 하 위치 별로 3 개의 샘플을 취한 후， 고성능 액체 크로마토그래프 (HPLC)를 이용하여 설파살라진의 함량을 분석하였다. 그리고， 이러한 함량 분석을 3 회 반복하여， 이로부터 함량의 상대표준편차 (RDS)를 계산하였다.
도 6-B 에 나타난 바와 같이， 실시예 1(37 °C), 실시예 3(40 t) 및 실시예 4(35 °C)에서는 각각 0.87%， 1.30% 및 1.34%의 상대표준편차가 나타나， 후발성 백내장 억제용 조성물이 매우 균질하게 분산되어 있음을 확인할 수 있었다. 이에 반하여， 비교예 K25 °C)은 28.35 %의 높은 상대표준편차를 나타내어， 후발성 백내장 억제용 조성물이 매우 불균일하게 분산되어 있음을 확인할 수 있었다.
또한， 비교예 1 의 조성물에서는 히알루론산과 설파살라진이 매우 불균일하게 분산되어 있을 뿐 아니라 사용된 히알루론산의 상당 부분이 용해되지 않아， 실질적으로 1.4(w/v)% 이상의 고농도의 히알루론산을 포함한 조성물로 될 수 없음을 확인할 수 있었다. (3) 설파살라진을 10% 폴리에틸렌글리콜이 포함된 염 균형용액에 농도별로 녹여 고성능 액체크로마토 그래프로 설파살라진 함량을 측정하여 직선의 검량선을 준비하였다 (도 7-A).
실시예 2 및 비교예 2 의 조성물의 상， 중， 하 위치 별로 3 개의 샘플을 취한 후， 고성능 액체 크로마토그래프 (HPLC)를 이용하여 설파살라진의 함량을 분석하였다. 그리고， 이러한 함량 분석을 3 회 반복하여， 이로부터 함량의 상대표준편차 (RDS)를 계산하였다.
도 7-B 에서 나타난 바와 같이 실시예 2은 0.59 %의 상대표준편차가 나타나， 후발성 백내장 억제용 조성물이 매우 균질하게 분산되어 있는데 반하여， 비교예 2 는 6.84 % 의 상대표준편차가 나타내어 매우 불균일하게 분산되어 있음을 확인할 수 있었다 .

Claims

【특허청구범위】 【청구항 11 친수성 설파살라진;
1.4 내지 2.0 %(w/v)의 히알루론산; 및
수용액을 포함하는 담체를 포함하는 후발성 백내장 억제용조성물.
【청구항 2]
제 1항에 있어서，
상기 친수성 설파살라진은 페그화 (PEGylation)된 설파살라진을 포함하는 후발성 백내장 억제용조성물.
【청구항 3]
제 1항에 있어서，
상기 친수성 설파살라진의 농도가 0.1 내지 1.5mM 인 후발성 백내장 억제용조성물.
【청구항 4]
제 1항에 있어서，
상기 수용액을 포함하는 담체는 증류수， 인산완층액， 균형염용액 및 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 후발성 백내장 억제용조성물.
【청구항 5】
제 1항에 있어서，
염산， 염화나트륨 및 염화칼륨으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 염을 더 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물.
【청구항 6】 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 후발성 백내장 억제용 조성물을 포함하는 안구 투여용 제제.
【청구항 7]
설파살라진을 친수화 시키는 단계;
상기 친수화 된 설파살라진에 히알루론산 가루를 첨가하는 단계 ; 및 상기 친수화 된 설파살라진 및 히알루론산 가루를 33 내지 42°C에서 5 내지 24 시간 흔합하는 단계를 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물의 제조 방법 .
【청구항 8】
제 7항에 있어서，
상기 설파살라진을 친수화 시키는 단계는 설파살라진을 페그화 (PEGylation)시키는 단계를 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물의 제조 방법 .
【청구항 9]
제 8항에 있어서，
상기 설파살라진을 페그화 (PEGylation)시키는 단계는 설파살라진을 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 염 균형 용액에 첨가하는 단계를 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물의 제조 방법.
【청구항 10】
제 7항에 있어서，
상기 설파살라진을 친수화 시키는 단계는 설파살라진의 농도를 0.1 내지 1.5 mM 로 조절하는 단계를 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물의 제조 방법 .
【청구항 11】 제 7항에 있어서，
상기 친수화 된 설파살라진에 히알루론산 가루를 첨가하는 단계는 상기 히알루론산의 농도가 1.4 내지 2.0 %(w/v)가 되도록 조절하는 단계를 포함하는 후발성 백내장 억제용 조성물의 제조 방법.
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