KR20030069917A - 안질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 2-하이드록시-5-[[4-(2-피리디닐아미노)설포닐]아조]벤조산 ("설파살라진")을 유효성분으로 함유하는 안질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

안질환 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing and treating ophthalmic diseases}

본 발명은 안질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 설파살라진(sulfasalazine)을 유효성분으로 함유하는 안질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

뇌졸중 및 퇴행성뇌질환(예, 알츠하이머성 치매, 파킨슨병등)은 재생능력이 없는 뇌신경세포의 사멸을 수반하기 때문에 뇌기능의 장애를 일으키며 생명을 앗아갈 수 있는 치명적인 노인성 질환이다. 따라서 뇌신경세포의 사멸을 억제하는 약물은 뇌질환의 치료제로 사용이 가능하다.

뇌신경세포 사멸의 주 경로로 흥분성 독성, 산화적 독성, 아연독성, 아폽토시스(apoptosis) 등이 제시되고 있으며, 각각은 특이한 신호전달과정을 통하여 세포사를 유발하게 된다. 특히, 뇌졸중은 흥분성 독성과 산화적 독성에 의해 급격한 신경세포의 사멸로 이어지므로, 이를 효과적으로 제어하는 약물의 개발이 시급하다.

한편, 녹내장(glaucoma) 또는 당뇨병성 망막증(retinopathy) 등과 같은 안질환 환자의 초자체 내에는 흥분성 신경전달물질의 하나인 글루타메이트(glutamate)의 농도가 대조군에 비해 2배 정도 증가되어 있다는 것이 보고되어 있다 (Lieth et al., Diabetes, Vol.47, May 1998; Dreyer et al., Arch Ophthalmol, Vol.114, Mar 1996; Ambati et al., Arch Ophthalmol., Vol.115, Sep 1997). 따라서, 상기 글루타메이트의 농도를 낮출 수 있는 약물은 안질환의 치료제로 사용이 가능하다.

살리실산(Salicylic acid) 구조를 분자중에 갖고 있는 설파살라진(sulfasalazine)은 화학명이 2-하이드록시-5-[[4-[2-피리디닐아미노)설포닐]아조]벤조산(2-Hydroxy-5-[[4-[(2-pyridinylamino)sulfonyl]azo]benzoic acid)이며, 다음의 화학식으로 표시된다.

설파살라진은 전사인자인 핵인자 카파 B(nuclear factor kappa B)의 작용을 억제하는 기전에 의해 염증성 장질환(inflammatory bowel disease)의 치료제로 사용되고 있다.

한편, 아스피린이나 비스테로이드성 항염증제가 알츠하이머병 및 퇴행성 질환의 예방에 효과가 있는 것으로 보고되고 있고, 아스피린과 살리실산이 신경세포에 직접 작용하여 NMDA에 의한 신경독성을 억제하는 것이 보고되어 있다. 그러나아스피린과 살리실산이 신경독성 억제작용을 나타내는 농도는 3-10mM로서 임상학적으로 실제 이용하기에는 한계가 있다.

따라서, 보다 낮은 농도에서도 NMDA에 의한 신경독성을 유효하게 억제할 수 있는 화합물을 찾아내는 것이 요망되어 왔다.

이에 본 발명자들은 NMDA의 독성을 낮은 독성에서도 효과적으로 억제할 수 있는 화합물을 제공하고자 광범위하게 연구를 하였고, 그 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 신경세포의 사멸을 효과적으로 감소시키는 작용을 갖는 약제를 제공한다.

본 발명은 또한 신경세포의 사멸을 유발하는 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 특징과 장점은 하기 발명의 상세한 설명으로부터 당업자에게 드러날 것이다.

도 1은 설파살라진이 NMDA에 의한 세포사멸을 억제하는 것을 보여주는 그래프이며, 설파살라진의 농도를 변화시킨 것이다.

도 2는 설파살라진이 NMDA에 의한 세포사멸을 억제하는 것을 보여주는 그래프이며, NMDA의 농도를 변화시킨 것이다.

도 3은 NMDA 독성억제에 미치는 설파살라진의 작용에 Ca²⁺의 조절이 관여하는 지의 여부를 결정한 그래프이다.

도 4는 설파살라진이 AMPA에 의한 신경독성을 감소하는 것을 보여주는 그래프이다.

도 5는 설파살라진이 카이네이트에 의한 신경독성을 감소하는 것을 보여주는 그래프이다.

도 6은 설파살라진이 Fe²⁺에 의한 산화적 독성을 농도 의존적으로 억제하는 것을 보여주는 그래프이다.

도 7은 설파살라진이 부티오닌 설폭시민(BSO)에 의한 산화적 독성을 억제하는 것을 보여주는 그래프이다.

도 8 및 도 9는 설파살라진이 Zn²⁺에 의한 신경세포 사멸을 억제하는 것을 보여주는 그래프이다.

도 10은 설파살라진이 산소-포도당 결핍에 의한 신경세포 사멸을 억제하는 것을 보여주는 그래프이다.

본 발명에 따라 제공되는 신경세포의 사멸을 효과적으로 감소시키는 약물은 설파살라진이다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 설파살라진을 유효성분으로 함유하는 신경세포의 사멸을 유발하는 뇌질환을 예방 및 치료하기 위한 조성물이 제공된다.

본 발명에 따른 뇌질환의 예방·치료제의 유효성분인 설파살라진은 NMDA에 의한 신경독성을 억제하므로 뇌졸중, 뇌손상 혹은 척추손상의 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 또한 설파살라진은 구조적으로 항산화작용을 보유하고 있어서 활성산소에 의한 신경독성을 억제하므로, 본 발명에 따른 조성물은 활성산소에 의한 신경세포 독성이 원인이 되는 질병, 예를 들어 뇌졸중, 뇌손상, 척추손상, 퇴행성 신경계 질환의 예방 및 치료에 이용될 수 있다.

나아가, 본 발명에 따른 조성물은, 아연의 세포내 유입을 억제하여 아연에 의한 신경독성을 억제하므로, 뇌졸중의 치료에 이용될 수 있다.

그러므로, 본 발명에 따라 제공되는 설파살라진을 유효성분으로 함유하는 조성물은, 신경세포의 사멸을 유발하는 각종 원인에 의한 뇌질환의 예방 및 치료를 위해 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 설파살라진을 유효성분으로 함유하는 안질환을 예방 및 치료하기 위한 조성물이 제공된다. 본 발명에 따른 안질환의 예방·치료제의 유효성분인 설파살라진은 글루타메이트 수용체, 특히 NMDA 수용체의 길항제(NMDA receptor antagonist)로서 작용하여 글루타메이트의 농도를 감소시키므로, 글루타메이트의 축적으로 인해 야기되는 녹내장 및 당뇨병성 망막증 등과 같은 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

이하에서, 본 발명의 조성물이 억제활성을 나타내는 각종 신경세포 사멸 원인에 대하여 설명한다.

흥분성 신경독성(Excitotoxicity; glutamate neurotoxicity)

흥분성 신경전달물질인 글루타메이트의 수용체인 NMDA, AMPA, 카이네이트 수용체(kainate receptors)의 과도활성은 뇌졸중 및 뇌손상에 의한 뇌세포사멸의 주원인이 된다 (Choi 1988). 따라서, 흥분성 신경독성 억제약물의 개발은 뇌졸중 및 외상성 뇌손상 등의 뇌질환 치료약물의 개발에 필수적이다. 특히, NMDA 수용체를 통한 신경독성은 뇌손상후 급격히 발생하기 때문에, 일차적으로 차단되어야 한다. 하지만, 현재까지 개발된 NMDA 수용체 길항제는 임상실험에서 효능이 입증되지 않고 있으며, 길항제 자체의 독성작용과 다양한 부작용으로 인하여 답보상태에 있다 (Olney et al., 1991). 따라서, 안전하게 NMDA 독성을 억제할 수 있는 약물의 개발은 뇌졸중 및 뇌손상의 치료를 위하여 필수적인 과제이다.

산화적 독성

뇌졸중, 뇌손상, 알츠하이머성 치매, 파킨슨병 환자에서 뇌세포사멸의 주 원인으로 활성산소의 축적후 단백질, 핵산, 지질의 산화적 손상이 제시되고 있다. 흥분성 독성은 물론 산화적 뇌세포독성을 효과적으로 제어하는 약물은 뇌졸중 및 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방에 사용되고 있다 (Beal 1996).

아연독성

뇌졸중 및 간질발작후 아연은 신경세포의 말단에서 유리되어 주변의 표적세포로 전압-게이트 칼슘 채널(voltage-gated calcium channel)이나 NMDA 수용체를 통하여 들어간다 (Choi & Koh, 1998; Kohet al, 1996). 순간적으로 과량의 아연이 세포내에 쌓이면, 활성산소가 생기면서 세포는 사멸하게 된다 (Kimet al., 1999). 따라서, 아연독성을 억제하는 약물이 개발되면 뇌졸중의 치료에 이용될 것으로 기대되고 있다.

아폽토시스(Apoptosis(고사), programmed cell death)

신경 세포의 퇴화과정에서 세포질의 수축과 핵염색체의 응축, 그리고 시클로헥시미드(cycloheximide; 단백질 합성 억제제)에 의한 세포사멸이 억제되며, 흥분성독성과 산화적 독성과는 다른 특징을 보이는 아폽토시스가 보고되고 있는데, 아폽토시스는 허혈 (ischemia), 뇌손상 (brain trauma), 척추손상 (spinal cord trauma), 알츠하이머성 치매, 파킨슨병에서 나타나는 세포사멸의 주 형태로 알려져 있다 (Smaleet al., 1995; Croweet al., 1996; Mochizukiet al., 1996; Bredesenet al., 1996). 신경성장인자, caspases의 활성 억제제, bcl-2등이 아폽토시스 억제효과가 있다고 밝혀지면서, 뇌질환 치료에 이용하기 위한 연구가 활발히 진행중이다. 하지만, 신경성장인자의 예기치 않은 독성작용, caspases-비의존적 아폽토시스, bcl-2을 표적조직에 운반하는 벡터의 개발 등이 문제점으로 제기되고 있다 (Kohet al; Ryuet al, Koet al., 2000).

본 발명은 뇌질환에서 나타나는 신경세포사멸의 주 유형인 흥분독성, 산화적독성, 아연독성, 또는 apoptosis의 모델을 이용하여, 설파살라진의 신경세포보호작용을 규명하여 뇌졸중, 뇌손상, 알츠하이머성 치매, 파킨슨병등의 새로운 치료제로 개발하는 것을 포함한다.

한편, 글루타메이트 수용체에는 NMDA형(N-methyl-D-aspartate), AMPA형(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate), KA형(kinate) 등의 서브타입(subtype)이 존재한다는 것이 알려져 있다 (實驗醫學, 第9券 第6號, 1991年5月1日 發行, 羊土社). 또한, 이러한 각각의 서브타입에 작용하는 효현제(agonist) 및 길항제(antagonist)에 해당하는 약물들도 여러 가지가 알려져 있는데, 예를 들어, NMDA형 수용체의 길항제로서 MK-801(dibenzocycloheptene-5,10-imine) (實驗醫學, supra; Pang et al., IOVS, Vol.40, No.6, May 1999), memantine (Lagreze et al., IOVS, Vol.39, No.6, May 1998), 그리고 eliprodil (Kapin et al., IOVS, Vol.40, No.6, May 1999) 등의 약물들이 알려져 있다.

본 발명에서는 설파살라진이 글루타메이트 수용체(NMDA, AMPA/카이네이트 수용체), 특히 NMDA 수용체를 통한 흥분독성을 억제한다는 것을 실험적으로 입증하였다 (하기 실시예 참조). 따라서, 녹내장 및 당뇨병성 망막증과 같은 안질환 환자의 초자체 내에서의 글루타메이트 농도가 대조군에 비하여 2배 가량 높은 것으로 보고되어 있는 상황에서, 설파살라진을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 투여하여 초자체 내에서의 글루타메이트의 농도를 낮춘다면 녹내장 및 당뇨병성 망막증과 같은 안질환도 치료할 수 있다.

본 발명은 본 발명자들이 설파살라진이 직접 뇌세포에 작용하여 NMDA에 의한 흥분독성을 억제하는 작용이 있다는 것을 발견한 것에 기초를 두고 있으며, 설파살라진이 직접 뇌세포에 작용하여 새로운 뇌질환 치료약물로서 이용될 수 있음을 다음과 같이 규명하고 발명을 완성하였다.

1. 일차적으로 설파살라진이 뇌세포를 보호하는 작용의 특이성을 결정하였다. 특히, NMDA, AMPA, 카이네이트에 의해 유도되는 흥분독성에 대한 설파살라진의 보호작용, Fe²⁺나 부티오닌 설폭시미드 등에 의한 산화적 독성에 대한 설파살라진의 보호작용, 아연독성에 대한 설파살라진의 보호작용, 스타우로스포린(staurosporine)이나 사이클로스포린(cyclosporine)에 의해 유도되는 apoptosis에 대한 설파살라진의 보호작용을 결정하였다.

2. 본 발명자들은 설파살라진이 NMDA, 아연독성 및 산화적독성을 억제하여 뇌세포를 보호한다는 것을 발견하였는데, 이러한 설파살라진의 작용은 NMDA 수용체의 억제, 아연의 유입억제, 항산화 효과를 통하여 나타났다.

3. 설파살라진은 산소-포도당 결핍(뇌졸중의 세포배양모델)에 의한 뇌신경세포의 사멸을 억제하였는데, 이는 설파살라진의 뇌세포보호작용이 뇌졸중에 의한 세포사멸을 억제하는 치료제로 사용될 수 있다는 것을 입증한다.

본 발명의 바람직한 구현예를 하기 실험예를 통하여 설명하지만, 본 발명이 이들 예에만 국한되는 것은 아니다.

[실험방법]

실험 1. 대뇌피질세포 배양 (Cortical Cell Cultures)

신경세포(neuron)의 순수배양을 위해서 임신 14 - 16일 (E14 - E16)된 마우스 태아에서 대뇌피질(neocortex)을 분리, 수거하여 유리(파스테르) 파이펫을 이용하여 조직을 단일세포로 나눈 후(trituration), 폴리-D-리신과 라미닌으로 입힌 24 웰 플레이트(Felcon, Primaria)에 3.5 - 4 hemispheres/plate (약 2 X 10⁵/ 웰)의 밀도로 세포를 분주해서 5% CO_2, 37℃로 유지되는 배양기에 넣었다. 분주 배양액은 MEM (minimum essential medium, Gibco)에 2 mM 글루타민, 21 mM 글루코스, 26.5 mM 중탄산염, 5% 태아송아지 혈청 (FBS), 5% 말 혈청으로 보충하였다.

분주한 후 3일째 (3 days in vitro; DIV3) 에 신경아세포 (glia)의 번식을 억제하기 위해 2.5 μM Ara-C (cytosine-arabinoside)를 처리하여, 분주 후 7일에혈청결핍에 의한 신경세포사를 실험하였다. 이러한 조건에서는 뉴론-특이적 에놀라제(neuron-specific enolase(NSE); 신경세포에 특이한 단백질)나 신경아세포 섬유성 산성 단백질(glia fibrillar acidic protein(GFAP); 신경아 세포에 특이한 단백질) 항체를 사용하였을 때 배양세포중 95% 이상이 뉴론이었다.

뉴론과 신경아세포의 혼합배양은 뉴론 순수배양과 동일한 방법을 사용하고 신경아세포가 단일층으로 완전히 자라는 때인 7 - 8 일에 10 μM Ara-C를 배양액에 첨가하였다. 이틀후, 5% FBS를 포함하는 배양액으로 갈아주었다.

실험 2. 글루타메이트 신경독성 (흥분독성)

흥분성 신경전달물질 (excitatory amino acids; glutamate 와 aspartate)의 아고니스트 등으로 뉴론-신경아세포의 혼합배양에서 신경세포사를 유도할 때, DIV12-14된 배양세포를 사용하며, 1) HCSS (in mM: 120 NaCl, 5 KCl, 1.6 MgCl₂, 2.3 CaCl₂, 15 Glucose, 20 HEPES, 10 NaOH)용액에 300 μM NMDA를 넣어 짧은 시간 (1시간 이하) 처리하거나; 또는 2) 21 mM 글루코스와 26.5 mM 중탄산염을 첨가한 MEM에 20 μM AMPA, 50 μM 카이네이트를 넣어 5% CO₂ 37℃ 배양기내에서 24시간 처리하였다. 수시간에 걸쳐 세포손상을 현미경을 이용하여 관찰하고 세포사의 정도를 24시간후에 LDH를 측정하여 정량하였다.

실험 3. 산화적 독성에 의한 신경세포 손상 유도

뉴론과 신경아세포가 섞여있는 대뇌피질세포(DIV 12 - 14)에서 산화적 독성에 의한 신경세포의 사멸을 유도하기 위하여 50 μM FeCl₂(Fenton 반응에의해 OH· 의 생성을 촉진한다), 10 mM 부티오닌-설폭시민 (BSO; glutathione의 생성을 억제한다), 또는 H₂O₂를 첨가하였다. 수시간에 걸쳐 세포손상을 현미경을 이용하여 관찰하고 세포사의 정도를 24시간후에 LDH를 측정하여 정량하였다.

실험 4. 아연 신경독성

뉴론과 신경아세포가 섞여있는 배양한지 12 - 14일된 대뇌피질세포에서, HCSS (in mM: 120 NaCl, 5 KCl, 1.6 MgCl₂, 2.3 CaCl₂, 15 Glucose, 20 HEPES, 10 NaOH)용액에 300 μM 아연을 넣어 30분간 처리한 후, 수 시간에 걸쳐 세포손상을 현미경을 이용하여 관찰하고 세포사의 정도를 24 시간 후에 LDH를 측정하여 정량하였다.

실험 5. 산소-포도당 결핍 (Deprivation of Oxygen and glucose)

DIV 14일된 혼합배양세포의 배양액을 포도당이 없는 염기용액 (mM: NaCl 116, MgSO₄0.8, NaH₂PO₄1, CaCl₂0.9, 그리고 페놀 레드 10mg/ml)으로 바꾼후, 95%N₂와 5% CO₂로 유지되는 저산소실(hypoxic chamber)에 40 - 100분간 처리하였다. 산소-포도당결핍을 종결하기 위하여, 배양세포들을 저산소실에서 뺀 후 최종농도가 5.5 mM이 되도록 포도당을 넣어 주었다.

실험 6. 신경 세포사 분석 (Analysis of neuronal death)

독성 물질에 노출시켰던 세포들은 위상차 현미경으로 세포사멸의 양상을 (특히, 세포질 팽창정도, 뉴라이트(neurites)의 손상) 관찰하며, 세포가 죽는 정도는 노출 이후 24 - 48 시간 후 죽은 세포로부터 배지로 분비되는 락테이트 디하이드로게나제(LDH) 활성을 측정하여 분석하였다. 세포배양 상등액 25 ㎕를 96-웰 플레이트에 옮기고 100 ㎕의 β-NADH 용액(0.3 ng/ml)과 25㎕의 22.7 mM 피루베이트 용액을 넣고 1분간 반응시킨후 플레이트 판독기로 340 nm에서 흡광도 변화양상을 2 분간 측정하였다. 측정값은 거의 모든 신경세포가 죽는 조건인 500μM NMDA를 24시간 동안 계속하여 노출시킨후 그 배지로 부터 얻은 LDH 활성 값(=100%)으로 보정하였다. 트립판 블루로 염색되는 세포수를 세어 LDH 분석법에 의한 세포사의 정도와 비교분석하여 세포사의 정도를 비교하였다.

실험 7. 칼슘 이미지화(Calcium imaging)

형광물질인 Fluo-3(Ex λ= 488nm, Em λ= 526nm )은 칼슘과 결합하면 488nm에서 최대흡광을 나타내어 490nm에서 흥분시켰을 때 526nm에서 방출하는 형광강도를 측정하였다(Minta et al., 1989). 2% 플루로닉(Pluronic) F-127을 포함하는 HCSS 용액(120mM NaCl, 5mM KCl, 1.6 mM MgCl₂, 2.3 mM CaCl₂, 15mM Glucose, 20mM HEPES, 10mM NaOH)에 fluo-3을 최종농도가 5μM이 되도록 녹이고, 이 용액을 HCSS 용액으로 씻어준 일차 배양세포에 첨가하여 37℃에서 20분간 배양한 후 다시 HCSS용액으로 씻어준다. 100W 제논 램프와 Nikon 20X, 0.4 N.A. 대물렌즈를 장착한 Nikon Diaphot inverted microscope 위에서 fluo-3을 490nm에서 흥분시키고, 530nm에서 방출시켜 그 상을 CCD 카메라를 통하여 얻은 뒤 Quanticell 700 system(APPLIED IMAGING)을 이용하여 정량하였다.

실험 8. TSQ 염색(TSQ staining)

세포안으로의 Zn²⁺유입은 TSQ (N-(6-메톡시-8-퀴놀릴)-p-톨루엔 설폰아미드), Zn²⁺-킬레이트화 염료 (Weiss et al., 1993)을 사용하여 확인하였다. 배양한 신경세포는 2% Pluronic F-127을 포함하는 HCSS 용액(120mM NaCl, , 5mM KCl, 1.6 mM MgCl₂, 2.3 mM CaCl₂, 15mM Glucose, 20mM HEPES, 10mM NaOH)에 TSQ를 최종농도가 0.01 % 가 되도록 녹이고 이 용액을 HCSS 용액으로 씻어준 일차 배양액에 첨가하여 37 ℃에서 20분간 배양한 후 다시 HCSS용액으로 씻어준다. 세포내 Zn²⁺에 결합한 TSQ의 형광강도는 365nm에서 흥분시키고, 460nm에서 방출된 형광을 형광 플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다.

[실험결과]

위 실험 1 - 8의 결과는 다음과 같이 요약될 수 있다.

첫째, 설파살라진은 흥분독성의 요소 중 NMDA에 의한 신경독성을 억제하였는데, 그 신경세포 보호작용의 기전은 NMDA 수용체의 활성후 세포내 Ca²⁺의 축적을 억제하는 것으로 나타났다.

둘째, 설파살라진은 강력한 항산화제로서 활성산소에 의한 신경독성을 억제하였다.

셋째, 설파살라진은 아연에 의한 신경독성을 억제하였는데, 그 보호작용의 원리는 세포내로의 아연의 유입 억제 및 아연에 의한 산화적 독성의 억제이다.

넷째, 설파살라진은 산소-포도당 결핍(허혈성 신경세포사의 모델)에 의한 신경세포의 사멸을 억제하였다.

이러한 결과를 통하여, 설파살라진은 단일 화합물로서 NMDA 수용, 활성산소, 아연의 유입을 동시에 억제하는 최초의 화합물로서, 흥분독성, 산화적독성, 아연독성이 일어나는 것으로 알려진 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 간질 및 퇴행성뇌질환의 효과적인 치료제로 응용이 될 수 있는 것으로 기대된다.

이하 구체적인 실험결과를 설명한다.

1. 흥분독성

도 1에, 배양한지 13 - 15일 (DIV 13 - 15)된 대뇌피질세포에 300 μM NMDA를 단독 또는 표지된 농도의 설파살라진을 첨가하여 10 분간 처리하고, 24시간 후 배양액으로 유리되는 LDH의 양을 측정하여 신경세포의 사멸을 정량한 결과를 나타내었다 (mean ± SEM, n = 8 - 16 배양 웰/조건).

그 결과, 신경세포와 신경교세포로 구성된 혼합배양 대뇌피질세포에 300 μM NMDA를 10분간 처리하였을 때, 24시간 후 75 - 85%의 신경세포가 사멸하였다. 10 - 1,000 μM 설파살라진을 NMDA와 동시에 10분간 첨가하였을 때, 100 μM 설파살라진부터 농도에 비례해서 NMDA에 의한 세포사멸을 억제하였다.

대뇌피질세포(DIV 13 - 15)에 30 - 1,000 μM NMDA를 단독 또는 300 μM, 1 mM 설파살라진의 존재하에 10 분간 처리하고, 24시간 후 배양액으로 유리되는 LDH의 양을 측정하여 신경세포의 사멸을 정량한 결과를 도 2에 나타내었다(mean ± SEM, n = 8 - 16 배양 웰/조건). 도 2에서, *는 ANOVA 테스트 및 Student-Neuman-Keuls 테스트를 이용했을 때, P<0.05에서의 상대적 대조군(NMDA 단독)과의 유의적인 차이를 보여준다. 도 2는 설파살라진의 농도를 고정한 후 NMDA의 농도에 따른 신경세포사멸에 대한 효과를 동정한 것이다. 30 - 1000 μM NMDA를 10분간 처리하였을 때 24시간 후 약 15 - 90%의 신경세포가 사멸하였는데, 300 μM의 설파살라진의 보호효과가 유의적으로 나타났다. 설파살라진의 농도가 1 mM로 늘어나면 NMDA의 독성이 완전히 방지되는 것이 관찰되었다.

NMDA에 의한 신경세포의 사멸에 세포내 Ca²⁺의 유입과 축적이 필연적으로 작용한다. 설파살라진의 NMDA 독성억제작용에 Ca²⁺의 조절이 관여하는 지를 결정하기 위하여 Ca²⁺을 인지하는 fluo-3 형광물질을 사용하여 실험하였다. 대뇌피질세포(DIV 13)에 100 μM NMDA를 단독 또는 300 μM 설파살라진을 30분전에 넣은 후 100 μM NMDA를 처리한 후 세포내 축적되는 Ca²⁺을 fluo-3과의 결합후 나타나는 형광강도를 측정하여 정량하고 결과를 도 3에 나타내었다 (mean ± SEM, n은 매 조건당 4-6 유리바닥 디시에서 무작위로 선정된 55-94개의 세포). 도 3에서, *은 Student-Neuman-Keuls 테스트를 이용했을 때 P<0.05에서의 NMDA 단독 처리군과의 유의적 차이를 나타낸다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, NMDA를 처리한 후 세포내 Ca²⁺이 증가하는 것이 관찰되었는데, 설파살라진을 투여하면 세포내 Ca²⁺의 축적이 상당히감소하였다. 따라서, 설파살라진은 NMDA 수용체를 통한 Ca²⁺축적을 억제하여 NMDA의 신경독성을 줄이는 것으로 추정된다.

한편, NMDA외에 AMPA/카이네이트 수용체를 통한 흥분독성에 대한 설파살라진의 효과를 탐색하였다. 대뇌피질세포(DIV 13 - 15)에 20 μM AMPA를 단독 (alone) 또는 표지된 농도의 설파살라진을 첨가하여 24시간 처리한 후 배양액으로 유리되는 LDH의 양을 측정하여 신경세포의 사멸을 정량하고 결과를 도 4에 나타내었다 (mean ± SEM, n = 10 - 12 배양 웰/조건). 도 4에서, *는 ANOVA 테스트 및 Student-Neuman-Keuls 테스트를 이용했을 때, P<0.05에서의 NMDA 단독 처리군과의 유의적인 차이를 보여준다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 20 μM AMPA를 24시간 동안 처리하였을 때, 약 50 - 60 % 의 신경세포가 사멸하였다. 10 - 300 μM 설파살라진을 동시에 첨가하면 신경세포사멸이 약 30%까지 감소하였다.

대뇌피질세포(DIV 13 - 15)에 50 μM 카이네이트를 단독 또는 표지된 농도의 설파살라진을 첨가하여 24시간 처리한 후 배양액으로 유리되는 LDH의 양을 측정하여 신경세포의 사멸을 정량하고 결과를 도 5에 나타내었다(mean ± SEM, n = 8 - 16 배양 웰/조건). 도 5에서, *는 ANOVA 테스트 및 Student-Neuman-Keuls 테스트를 이용했을 때, P<0.05에서의 카이네이트 단독 처리군과의 유의적인 차이를 보여준다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 50 μM 카이네이트를 24시간 처리하면 약 55%정도 세포사멸이 일어나는데 100 μM 설파살라진을 처리하면 세포사멸이 40%까지 감소하였다. 따라서, 설파살라진은 AMPA/카이네이트에 의한 신경독성을 어느 정도 줄이는 것을 알 수 있다.

2. 유리 라디칼 신경독성

대뇌피질세포(DIV 13 - 15)에 50 μM Fe²⁺단독 또는 표지된 농도의 설파살라진을 첨가하여 24시간 처리한 후 배양액으로 유리되는 LDH의 양을 측정하여 신경세포의 사멸을 정량하고 결과를 도 6에 나타내었다 (mean ± SEM, n = 4 - 12 배양 웰/조건). 도 6에서, *는 ANOVA 테스트 및 Student-Neuman-Keuls 테스트를 이용했을 때, P<0.05에서의 Fe²⁺단독 처리군과의 유의적인 차이를 보여준다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 신경세포와 신경교세포로 구성된 혼합배양 대뇌피질세포에 50 μM Fe²⁺를 24시간동안 지속적으로 처리하였을 때, 50 - 60 %의 신경세포가 사멸하였다. Fe²⁺에 의한 산화적독성은 설파살라진에 의해 농도 의존적으로 줄어들었다.

Fe²⁺외에도, 부티오닌 설폭시민(BSO)를 처리하면 세포내 글루타치온을 고갈시켜 활성산소의 생성에 의한 신경세포의 사멸이 나타나는데, 설파살라진을 동시에 처리하면 BSO에 의한 산화적독성이 상당히 억제된다(도 7). 도 7은 배양한지 13 -15일 (DIV 13 - 15)된 대뇌피질세포에 10 mM BSO를 단독 또는 표지된 농도의 설파살라진을 첨가하여 24시간 처리한 후 배양액으로 유리되는 LDH의 양을 측정하여 신경세포의 사멸을 정량한 결과를 보여준다(mean ± SEM, n = 8 배양 웰/조건). 도 7에서, *는 ANOVA 테스트 및 Student-Neuman-Keuls 테스트를 이용했을 때, P<0.05에서의 BSO 단독 처리군과의 유의적인 차이를 보여준다.

3. Zn²⁺신경독성

대뇌피질세포(DIV 13 - 15)에 30 - 500 μM Zn²⁺를 단독 또는 100 μM 설파살라진의 존재하에 30분간 처리하고, 24시간 후 배양액으로 유리되는 LDH의 양을 측정하여 신경세포의 사멸을 정량하고 결과를 표 8에 나타내었다 (mean ± SEM, n = 8 배양 웰/조건). 도 8에서, *는 ANOVA 테스트 및 Student-Neuman-Keuls 테스트를 이용했을 때, P<0.05에서의 Zn²⁺단독 처리군과의 유의적인 차이를 보여준다.

도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 신경세포와 신경교세포로 구성된 혼합배양 대뇌피질세포에 Zn²⁺를 30분처리하면 24시간후 농도의존적으로 신경세포가 사멸하였다. Zn²⁺를 처리하는 동안 100 μM 설파살라진을 첨가하면 신경세포의 사멸이 상당히 줄어들었다. 300 μM Zn²⁺에 의한 신경세포의 사멸을 억제하는 설파살라진의 유효농도는 10 - 100 μM 이었다.

Zn²⁺는 신경세포로 침투하여 산화적독성을 유도하는 것으로 보고되어있다 (Kim et al, 1999). 설파살라진의 Zn²⁺독성억제효과가 Zn²⁺의 침투를 억제하는지를 동정하기 위하여 형광탐지물질인 TSQ를 사용하였다. 즉, 대뇌피질세포(DIV 13)에 300 μM Zn²⁺를 단독 또는 100 μM 설파살라진의 존재하에 30분간 처리하였다. 20분후, 세포내로 유입되는 Zn²⁺의 양을 TSQ와의 결합에 의한 형광강도를 측정하여 비교하고 결과를 도 9에 나타내었다 (mean ± SEM, n = 8 배양 웰/조건). 도 9에서, *는 Student's 테스트를 이용했을 때, P<0.05에서의 Zn²⁺단독 처리군과의 유의적인 차이를 보여준다. 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, Zn²⁺의 처리후 세포내에 TSQ의 형광이 검출되었는데, 설파살라진의 존재하에 상당히 줄어들었다. 결론적으로, 설파살라진은 항산화작용은 물론 Zn²⁺의 세포내 유입을 억제하여 Zn²⁺의 독성을 억제하였다.

4. 산소 포도당 결핍 (Oxygen Glucose Deprivation )

산소-포도당 결핍에 의한 신경세포의 사멸은 뇌졸중후 발생하는 신경세포의사멸과 유사한 경로를 통하여 일어나기 때문에, 뇌졸중에 의한 신경세포 사멸의 기전과 방지약물을 개발하는데 사용되어 왔다 (Albers et al., 1989; Choi, 1990). 설파살라진의 신경세포보호효과가 뇌졸중에 의한 신경세포의 사멸을 방지하는지를 동정하기 위하여, 신경세포와 신경교세포로 구성된 혼합배양 대뇌피질세포에 45분, 60분, 90분간 산소와 포도당 결핍을 유도하였다. 24시간 후 40 - 100%의 신경세포가 사멸하였는데, 산소-포도당 결핍동안 300μM 설파살라진을 첨가하였을 때 신경세포의 사멸은 상당히 감소하였다(도 10).

도 10은 대뇌피질세포(DIV 13 - 15)에 산소와 포도당을 단독 또는 300 μM 설파살라진의 존재하에 45, 60, 90분간 제거하여 산소-포도당 결핍(Oxygen-glucose deprivation(OGD)) 상태를 만들고, 24시간 후 배양액으로 유리되는 LDH의 양을 측정하여 신경세포의 사멸을 정량한 결과를 보여준다. (mean ± SEM, n = 4 배양 웰/조건). 도 10에서, *는 ANOVA 테스트 및 Student-Neuman-Keuls 테스트를 이용했을 때, P<0.05에서의 OGD 단독 처리군과의 유의적인 차이를 보여준다.

이상의 실험을 토대로 하여 다음과 같은 결론을 내릴 수 있다.

· 설파살라진은 흥분성 신경독성을 억제한다.

- 100 - 1,000μM 설파살라진은 NMDA에 의한 신경독성을 대부분 억제한다.

- 설파살라진은 Ca²⁺의 축적을 억제하여 NMDA 신경독성을 방지한다.

- 10 - 300μM 설파살라진은 AMPA나 kainate에 의한 신경독성을 부분적으로 감소시킨다.

- 따라서, 흥분성 신경독성이 뇌세포 사멸의 원인이 되는 뇌졸중, 뇌손상, 척추손상의 치료제로 사용이 가능하다. 또한, 녹내장 및 당뇨병성 망막증과 같은 안질환의 치료제로 사용이 가능하다.

· 설파살라진은 산화적독성을 억제한다.

- 설파살라진은 항산화제이다.

- 30 - 100μM 설파살라진은 활성산소에 의한 신경세포의 사멸을 억제한다.

- 따라서, 산화적 독성이 뇌세포 사멸의 원인이 되는 뇌질환 (특히, 알츠하이머병, 루게릭병, 뇌졸중, 뇌손상)의 치료제로 사용이 가능하다.

· 설파살라진은 Zn ²⁺ 독성을 억제한다.

- 10 - 100μM 설파살라진은 Zn²⁺에 의한 신경세포의 사멸을 억제한다.

- 설파살라진의 항산화효과가 Zn²⁺의 독성을 억제한다.

- 설파살라진은 Zn²⁺의 세포내 유입을 억제하여 Zn²⁺의 독성을 억제한다.

- 따라서, 설파살라진은 Zn²⁺독성이 뇌세포사멸의 원인이 되는 뇌졸중 및 뇌손상의 치료제로 사용이 가능하다.

· 설파살라진은 산소-포도당 결핍에 의한 신경세포의 사멸을 억제한다.

설파살라진은 산소-포도당 결핍후 일어나는 신경세포의 사멸을 억제한다. 따라서, 설파살라진은 허혈성 뇌졸중 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 상기에서 설명한 바 있는, 각종 원인에 의한 신경세포의 사멸을 유발하는 뇌질환의 효과적인 예방 뿐만 아니라 치료에 유효하게 적용될 수 있다. 치료용 조성물로 사용되는 경우에, 유효성분인 설파살라진의 함유량은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 0.1 - 10,000 μM, 바람직하게는 0.1 - 10,000μM, 보다 바람직하게는 1 - 1,000 μM의 범위내에서 선정될 수 있다. 정확한 투여량과 투여방법은 투여대상의 나이, 증세, 질병원인, 질병의 진행정도, 체중 등에 따라 당업자에 의해 적의 선정될 수 있으며, 이런 것들에 의해 본 발명이 제한을 받는 것은 아니다. 설파살라진은 초기 3 - 5 g, 이후 1 일 500mg을 4회 복용하여 장염 및 류마티즈성 관절염의 치료에 사용하는데, 경구투여후 장박테리아에 의하여 5-아미노살리실레이트로 분해되어 염증억제 효과를 나타낸다(Goodman & Gilmans The Pharmacological Basis of Therapeutics, Joel G. Hardman et al., eds., 9th edition, 1996, The McGraw-Hill Companies, pps 617-631 & 1959-1062.;H. Schroder, D. E. S. Campbell : absorption, metabolism, and excretion of salicylazosulfapyridine in man : Clin. Pharmacol. Ther.13 : 539-551 (1972) ). 투여후, 혈중농도는 수 시간이내에 500 μM에 이르며 지용성이기 때문에 뇌내에서 신경세포를 보호하는 효과가 어느 정도 예측이 되는데, 비경구 투여방법인 정맥주사, 근육주사, 피하주사로 투여하면 뇌세포 보호효과가 더욱 효과적일 것으로 예상된다. 본 발명의 조성물은 당업자에게 주지된 각종 제형의 형태로 제제화 될 수 있으며, 각 제형에 적합한 통상의 첨가제 혹은 부형제를 포함할 수 있다.

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Claims (2)

1. 2-하이드록시-5-[[4-(2-피리디닐아미노)설포닐]아조]벤조산 ("설파살라진")을 유효성분으로 함유하는 녹내장(glaucoma) 및 당뇨병성 망막증(retinopathy)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 안질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 설파살라진은 0.1 - 10,000 μM의 양으로 함유되는 것을 특징으로 하는 조성물.