FI89923C - Foerfarande foer framstaellning av farmaceutiskt aktiva, vattenloesliga kamptotesinanaloger - Google Patents

Description

89923

Menetelmä farmaseuttisesti aktiivisten, vesiliukoisten kamptotesiinianalogien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää farmaseuttisesti aktiivisten, vesiliukoisten kamptotesiinianalogien valmistamiseksi. Näillä yhdisteillä on kasvainsolun kasvua estävä vaikutus.

DNA-kaksoiskierteen rakenne eukaryoottisissä soluissa asettaa tiettyjä topologisia ongelmia, jotka solun elinkoneiston on ratkaistava, jotta se voisi käyttää geneettistä materiaaliaan templaattina. DNA-juosteiden eroaminen toisistaan on olennaista sellaisille solutapahtumille kuten DNA:n kahdentuminen ja kopioituminen. Koska eukaryoottinen DNA on kromosomaalisten proteiinien välityksellä järjestäytynyt kromatiiniksi, sen päät ovat kahlitut, eivätkä juosteet voi kiertyä auki ilman entsyymien apua, jotka muuttavat topologiaa. On kauan ollut tunnettua, että kopioitumis- tai kahdentumiskompleksin eteneminen pitkin DNA-kaksoiskierrettä olisi helpompaa kääntökohdan avulla, joka vapauttaisi näiden toimintojen luoman vääntörasituksen. To-poisomeraasit ovat entsyymejä, jotka kykenevät muuttamaan DNA:n topologiaa eukaryoottisissa soluissa. Ne ovat ratkaisevia tärkeiden solutoimintojen ja solun uudiskasvun kannalta.

Eukaryoottisissa soluissa on kahdenlaisia topoisomeraaseja, tyyppi I ja tyyppi II. Topoisomeraasi I on monomeerinen entsyymi, jonka molekyylipaino on suunnilleen 100 000. Entsyymi sitoutuu DNA:han ja aiheuttaa lyhytaikaisen, yhtä juostetta koskevan katkoksen, oikaisee kaksoiskierteen (tai sallii sen aukikiertymisen), ja myöhemmin sulkee katkoksen jälleen ennen dissosioitumista DNA-juosteesta.

Topoisomeraasi II käsittää kaksi identtistä alayksikköä, joiden molekyylipaino on 170 000. Topoisomeraasi II katkaisee lyhytai-kaisesti molemmat kaksoiskierteen juosteet, ja siirtää toista kaksijuosteista kappaletta katkoksen välityksellä.

. 3 9923 2

Kamptotesiini on veteen liukenematon, sytotoksinen alkaloidi, jota tuottavat Kiinasta peräisin olevat Camptotheca accumi-nata-puut ja Intiasta peräisin olevat Nothapodytes foetida -puut. Kamptotesiini ja jotkin sen lähisukuiset yhdisteet ovat ainoa yhdistelaji, jonka tiedetään inhiboivan topoisomeraasi I: tä.

Tärkeiden kaupallisten onkolyyttisten aineiden (esim. eto-posidi, doksorubisiini ja mitoksantroni), samoin kuin muiden yhä kehittämisvaiheessa olevien onkolyyttisten aineiden pääasiallisena vaikutuskohteena on topoisomeraasi II:n inhibointi. Kamptotesiini (ja sen kanssa samansukuiset tunnetut yhdisteet) eivät vaikuta lainkaan topoisomeraasi II:een, ja millään tunnetulla topoisomeraasi II:n inhibiittorilla ei ole mitään merkittävää vaikutusta topoisomeraasi I:een.

Kamptotesiini ja sen kanssa samansukuiset tunnetut topoisomeraasi I:tä inhiboivat yhdisteet eivät ole osoittautuneet hou-kutteleviksi kliinisten lääkeaineiden kehittelyyn sytolyytti-sinä aineina johtuen ei-hyväksyttävästä annosrajoitteista toksisuudesta, ennalta arvaamattomasta toksisuudesta, huonosta vesiliukoisuudesta, ja/tai ei-hyväksyttävästä varastoinnin kestävyydestä. Siitä johtuen tarvitaan topoisomeraasi I:tä inhiboivia aineita, jotka eivät sisällä kamptotesiinin ja sitä läheisesti muistuttavien tunnettujen topoisomeraasi I:tä inhiboivien sukulaisyhdisteiden epäedullisia ominaisuuksia. Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet toteuttavat sellaisen tarpeen.

Tämä keksintö koskee menetelmää farmaseuttisesti aktiivisen yhdisteen, jolla on kaava I, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan, hydraatin tai solvaatin valmistamiseksi:

R

/~Λ U> ' ^ E o

II

3 9923 3 jossa kaavassa: X on hydroksi; vety; syaani; -CH2NH2 ; tai formyyli; R on vety silloin, kun X on syaani, CH2NH2 tai formyyli; tai R on formyyli; syaanimetyyli tai -CHjR1 silloin, kun X on vety tai hydroksi; R1 on -0-R2; -S-R2; -N-R2(R3); tai -N+-R2(R3) (R4), sillä ehdolla, että kun R1 on -N+-R2(R3) (R4), yhdiste on liittyneenä farmaseuttisesti hyväksyttävään anio-niin; R2, R3 ja R4 ovat samoja tai erilaisia, ja ne valikoidaan joukosta H; C^.g-alkyyli; C2.6-hydroksialkyyli; C^.g-dialkyy-liamino; C1.6-dialkyyliamino-C2.6-alkyyli; C-L.g-alkyyliamino-C2_6-alkyyli; C2_6-aminoalkyyli tai 3-7 jäsentä sisältävä substi-tuoimaton tai substituoitu karbosyklinen rengas; ja silloin, kun R1 on -N-R2(R3), R2- ja R3-ryhmät voivat olla yhdistyneinä typpiatomiin, johon ne ovat sitoutuneet muodostaen heterosyklisen renkaan, joka lisäksi voi sisältää happi- tai typpiatomin ja joka voi olla substituoitu esimerkiksi alkyyli-tai piperidiiniryhmällä.

Kaavan (I) mukaiset yhdisteet voidaan keksinnön mukaisesti valmistaa menetelmällä, joka käsittää: (a) 10-hydroksikamptotesiinin kondensoinnin formaldehydin ja sopivan primäärisen tai sekundäärisen amiinin kanssa, jolloin saadaan kaikkia kaavan I mukaisia yhdisteitä, paitsi yhdistettä, jossa X on vety, syaani tai formyyli, ja R1 on -N-R2(R3) ja R2 ja R3 ovat samoja ja ovat H; tai (b) 10-hydroksikamptotesiinin formyloinnin, jolloin saadaan 9-formyyli-10-hydroksikamptotesiiniä, joka sen jälkeen saatetaan kondensaatioon sopivien amiinien kanssa, jota seuraa pelkistäminen natriumsyaaniborohydridillä tai katalyyttinen pelkistäminen; tai (c) sopivien kaavan I mukaisten yhdisteiden, jossa kaavassa R1 on -N-R2(R3) , käsittelemisen alkyloivalla aineella, jolloin saadaan vastaavia kaavan I mukaisia yhdisteitä, jossa kaavassa R1 on -N+-R2(R3) (R4) ja R2, R3 ja R4 eivät ole vetyjä, tai (d) 9-dimetyyliaminometyyli-10-hydroksikamptotesiinin tai sen suolan kuumentamisen sopivan alkoholin tai tiolin kanssa iner-tissä liuottimessa, jolloin muodostuu kaavan I mukaisia yhdisteitä, jossa kaavassa R1 on -0-R2 tai -S-R2; tai 4 09923 (e) 10-hydroksikamptotesiinin trifluorimetyylisulfonaatin saattamisen palladiumilla katalysoituun karbonylaatioon; tai (f) kaavan I mukaisen yhdisteen, jossa R on -CH2-N+R2 (R3) (R4), saattamisen reagoimaan syanidin kanssa, jolloin saadaan vastaava kaavan I mukainen yhdiste, jossa R on syaanimetyyli; tai (g) kaavan I mukaisen yhdisteen, jossa R on syaanimetyyli, pelkistämisen, jolloin saadaan vastaava kaavan I mukainen yhdiste, jossa R on aminometyyli.

Tämä keksintö koskee myös yhdistettä, jolla on kaava CF..S0 -0 —v o (ii) U-

Kaavan (II) mukainen yhdiste on käyttökelpoinen valmistettaessa kaavan (I) mukaisia yhdisteitä.

Ilmaisulla "karbosyklinen rengas" tarkoitetaan täysin tyydytettyä, osittain tyydytettyä tai täysin tyydyttämätöntä rengassys-teemiä.

Kaavan (I) mukaisiin edullisiin yhdisteisiin lukeutuvat sellaiset yhdisteet, joissa silloin, kun X on hydroksi, R on dimetyyliaminometyyli, N-morfoliinimetyyli, N-metyylipiperat-sinyylimetyyli, (4'-piperidiini)N-piperidinyylimetyyli, (2·-hydroksietyyli)aminometyyli, trimetyyliammoniummetyyli, syk-loheksyyliaminometyyli, N-metyylianiliinimetyyli, etoksime-tyyli, syklopropyyliaminometyyli, N,N-dimetyyliaminoetyylioksi-metyyli, Ν,Ν-dimetyyliaminoetyylitiometyyli, N,N-dimetyyliami-noetyyliaminometyyli, syaanimetyyli, aminometyyli tai formyyli. Kaavan (I) mukaisiin edullisiin yhdisteisiin kuuluvat myös sellaiset yhdisteet, joissa silloin, kun R on vety, X on syaani, formyyli tai aminometyyli. Kaavan (I) mukaisia

II

5 29923 edullisia yhdisteitä ovat lisäksi sellaiset, joissa X on vety ja R on dimetyyliaminometyyli tai N-morfoliinimetyyli. Erityisen edullisia ovat ne kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa R on dimetyyliaminometyyli, erityisesti sen S-isomeeri.

On tunnettua, että johtuen epäsymmetrisestä hiiliatomista kaavan (I) mukaisten yhdisteiden E-renkaassa (so. hiiliatomi numero 20), optisia isomeerejä esiintyy. S-isomeeri on edullinen isomeeri, joskin R-isomeeri ja raseeminen seos (rase-maatti) sisällytetään myös kaavan (I) mukaisten yhdisteiden piiriin.

Farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat ja niiden valmistaminen ovat hyvin tunnettuja niiden keskuudessa, jotka tuntevat alaa. Edullisiin kaavan (I) mukaisten yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttäviin suoloihin lukeutuvat asetaatti, metaanisulfo-naatti ja hydrokloridi, kuten esimerkiksi mono- tai dihydro-kloridi, kuten myös kaavan (I) mukaisten yhdisteiden aikaiime-tallisuolat, kuten esimerkiksi natriumsuola, joissa E-renkaan sisältämä laktoni on emäshydrolysoitu.

Kvaternääristen suolojen farmaseuttisesti hyväksyttävät anionit ovat hyvin tunnettuja niiden keskuudessa, jotka tuntevat alaa. Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden edullisiin, farmaseuttisesti hyväksyttäviin suoloihin, jossa kaavassa R1 on -N+-R2(R3) (R4) , lukeutuvat metaanisulfonaatti ja kloridi.

Kaavan (I) mukaiset yhdisteet voivat muodostaa hydraatteja tai solvaatteja. Ne, jotka tuntevat alaa, tietävät, että varaukselliset yhdisteet muodostavat hydratoituneitä muotoja lyofilisoi-taessa veden kanssa, tai ne muodostavat solvatoituneita muotoja konsentroitaessa liuoksessa sopivan orgaanisen liuottimen kanssa.

Kaavan (II) mukaista yhdistettä voidaan valmistaa esimerkissä 22 esitetyn menetelmän mukaisesti.

-)9923 6

Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa 10-hydroksi-kamptotesiinistä Mannichin reaktion kautta. 10-hydroksikampto-tesiinin kondensoituminen formaldehydin ja primäärisen tai sekundäärisen amiinin kanssa (Mannich-reaktio) tuottaa kaikkia kaavan (I) mukaisia yhdisteitä, paitsi yhdistettä, jossa X on vety; syaani; tai formyyli, ja R1 on -N-R2(R3), ja R2 ja R3 ovat samoja ja ovat H. 10-hydroksikamptotesiini voidaan vaihtoehtoisesti formyloida (Duff-reaktio), jolloin saadaan 9-formyyli-10-hydroksikamptotesiiniä, joka voi sen jälkeen kondensoitua amiinien kanssa, mitä seuraa kemiallinen pelkistäminen natrium-syaaniborohydridin kanssa tai katalyyttinen pelkistäminen (Pd/C, H2) , jolloin saadaan tuotteita, jotka ovat analogisia niiden tuotteiden kanssa, jotka on saatu Mannichin reaktion kautta, kuten myös kaavan (I) mukaista yhdistettä, jossa kaavassa R1 on -N-R2(R3), ja R2 ja R3 ovat samoja ja ovat H. Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä, joissa R1 on -N+-R2(R3) (R4) ja R2, R3 ja R4 eivät ole H, saadaan käsittelemällä vastaavia kaavan (I) mukaisia yhdisteitä, jossa kaavassa R1 on -N-R2(R3), alkyloivalla aineella. Mannichin reaktion esittävät Magarian et ai., J. Pharm. Sei., 56, 987 (1967). Duffin reaktion esittävät Duff et ai., J. Chem. Soc., 547 (1941).

Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä, jossa kaavassa R1 on O-R2 tai S-R2, voidaan valmistaa 9-dimetyyliaminometyyli-10-hydroksi-kamptotesiinistä tai sen suolasta kuumentamalla sopivan alkoholin tai tiolin kanssa inertissä liuottimessa, kuten esimerkiksi dimetyyliformamidi. Silloin kun käytetään vapaata emästä, lisätään pieni määrä vahvaa happoa, kuten esimerkiksi suolahappoa. Sellaisia johdannaisia voidaan muodostaa myös suoraan Mannichin reaktiossa, kun alkoholi tai tioli sisällytetään reaktioseokseen, ja vahva happo lisätään, tai amiinikom-ponentti on vahvahappoisen suolan muodossa.

Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä, jossa on kaavassa X on vety, syaani, formyyli tai aminometyyli, voidaan valmistaa kaavan (II) mukaisesta yhdisteestä palladiumilla katalysoidun karbo-nylaation avulla.

Il 0 9 923 7

Cacchi et al., Tetrahedron Letters, 27, 3931, 5541, (1986);

Petrakis et ai., J. Amer. Chem. Soc., 109. 2831 (1987) ja Cha-tani et al., J. Org. Chem., Si, 4714 (1986) esittävät aryyli-triflaattien palladiumilla katalysoidun karbonylaation.

Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistukseen käytettävä läh-töyhdiste, so. 10-hydroksikamptotesiini, on luonnon tuote, jota tavataan samasta kasvista kuin kamptotesiiniä [ks. Wani et al., J. Org. Chem., 24, 1364, (1969)]. 10-metoksikamptotesiini on myös eristetty samasta kasvista kuin kamptotesiini, ja se voidaan muuttaa 10-hydroksikamptotesiiniksi keittämällä palauttaen bromivedyn kanssa. Itse kamptotesiini voidaan myös muuttaa 10-hydroksikamptotesiiniksi pyridiinirenkaan pelkistämisen avulla, jota seuraa hapettaminen lyijytetra-asetaatin kanssa [ks. Yakult Honsha K.K., JP-patenttijulkaisu no 9 005 188, 1982]. Raseemista 10-hydroksikamptotesiiniä voidaan myös valmistaa Wanin et al. menetelmällä, J. Med. Chem., 23, 554, (1980) . Kamptotesiinin kokonaissynteesistä on annettu suuri määrä raportteja. Ks. esim., Hutchinson, Tetrahedron, 37, 1047 (1981) , ja Suffness ja Coldel, "The Alkaloids. Chemistry and Pharmacology", Brossi, A., toim., vol. 25, Academic Press, Orlando Florida, 73 (1985). Wani et al., J. Med. Chem., 23., 554 (1980) kuvailevat käytännöllisintä reittiä (jota tämän jälkeen nimitetään Wani-reitiksi) kamptotesiinin tuottamiseksi, joka on raseeminen 20-asemassa olevan hiilen kohdalla.

Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden käyttö a: Sytotoksisuus

Kaavan (I) mukaisen yhdisteen asetaattisuola, jossa kaavassa R on dimetyyliaminometyyli (S-isomeeri) (tämän jälkeen nimitettynä "Yhdiste no. IS"), osoitti voimakasta uudiskasvua vastustavaa aktiivisuutta useassa viljellyssä solulinjassa (taulukko 1). Yhdiste no. IS vastasi täysin sytotoksista potenssiaan kahdeksassa viljellyssä ihmisen kasvainsolulinjasarjassa. Lyhyessä altistuksessa (2 tuntia) lääkeaineelle, 50-%:inen inhi-bitiivinen pitoisuus vaihteli alueella 0,12-2,1 /ug/ml. Jos lääkeaine jätettiin viljelyalustan täydeksi 7 päivää käsittä- 8 39 923 vaksi jaksoksi, jonka alustan päällä solujen annettiin lisääntyä, IC50-arvot vaihtelivat alueella 3,9-75 ng/ml.

Kolmen jyrsijäkasvainsolulinjan ja kahden "normaalin" jyrsijä-solulinjan herkkyydet yhdisteelle no. IS määritettiin myös rotan paksusuolikarsinooman Kl2/Tr ja rotan munuaisen ja suo-liepiteelin solulinjojen herkkyydet määritettiin samassa kokeessa käyttäen loppupistettä, jota käytettiin ihmisen paksunsuolen kasvainsolukokeissa. Näiden jyrsijäsolujen herkkyydet olivat samanlaisia kuin vähiten herkillä ihmisen paksunsuolen kasvainsolulinjoilla, CACO-2 ja WiDR. Hiiren kasvainsolulinjat, L1210-leukemia ja B16-melanooma, eivät olleet herkempiä yhdisteelle no. IS kuin ihmisen paksunsuolen kasvainsolulinjat. Itse asiassa Bl6-melanoomasolulinja näytti olevan huomattavasti vähemmän herkkä kuin muut testatut solulinjat. Varsinkin B16 ja L1210 ovat kumpikin melkoisen herkkiä yhdisteelle no. IS in vivo terapeuttisissa kokeissa syöpähiirillä.

Yhdisteen no. IS sytotoksisuuden määrittämiseksi käytetty menettelyohje, koskien taulukossa 1 lueteltuja solulinjoja, oli yleisesti ottaen seuraavanlainen:

Solulinjoja käytetään ja säilytetään yksikerrosviljelminä Minimal Essential Media (Grand Island Biological Co., Grand Island, N.Y.) -alustoilla, joihin on lisätty 10 % vasikan sikiön seerumia, kosteutetussa viljelykaapissa, jonka C02-pitoisuus oli 5 % 37°C:ssa. Erilaisien pitoisuuksien kaavan (I) mukaista yhdistettä steriileissä olosuhteissa annettiin reagoida 2 tunnin ajan, minkä jälkeen alusta imettiin pois, tai annettiin altistua jatkuvasti. Levyjä inkuboidaan 7 päivän ajan 37°C:ssa C02-viljelykaapissa. Alusta imettiin pois ja solut kiinnitettiin ja värjättiin etanolilla ja Giemsa-värillä. Elossa oleva solupopulaatio määritettiin selaamalla levyjä kuva-analysaattorilla. Uudiskasvun inhibitioprosentti määritettiin suhteessa soluihin, joita inkuboitiin ilman lääkeainetta, ja 50 %:n inhibitiivinen pitoisuus (IC50) määritettiin interpoloimal-la.

:: Q 9 ο τ

9 ' ' y 1- D

Taulukko 1

Yhdisteen no 1 sytotoksisuus kasvainsoluille viljelmässä Solulinja IC50 ( Mg/ml) 2 t Jatkuva _altistus_altistus

Ihmisen paksunsuolen kasvain solulinjat SW-620 0,12 0,0065 SKCO-1 0,23 0,0039 SW-948 0,26 0,016 DLD-1 0,44 0,015 LOVO 0,58 0,0097 HT-29 0,58 0,016 CACO-2 1,7 0,075 WIDR 2,1 0,025

Jyrsijän kasvainsolulinjat L1210-leukemia 1,4 e.h.

K12/Tr-paksunsuolen 3,9 0,084 karsinooma B16-melanooma n.t.1 0,62

Jyrsijän "normaalit" solulinjat NRK52E (rotan munuaisen 1,2 0,052 .. . epiteeli) IEC-6 (rotan suoliston 3,9 0,017 epiteeli) n.t. = ei testattu ' ' r'O ~7 10 ;

Suuresta joukosta kaavan (I) mukaisia yhdisteitä määritettiin sytotoksisuus L1210-leukemiasoluja vastaan, jotka kasvoivat suspensioviljelmässä (taulukko 2). Soluja altistettiin jatkuvasti kasvatettaessa alustassa, joka sisälsi 0,2 prosenttia Noble-agaria. Kolmen päivän inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa C02-inkubaattorissa, pesäkkeet värjättiin eläville soluille spesifisellä formatsaanivärillä ja 24 tuntia myöhemmin, niiden lukumäärä laskettiin pesäkelaskijalla (Biotran II, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ), joka oli säädetty tunnistamaan pesäkkeet, jotka sisälsivät enemmän kuin 50 solua. Pitoisuus, joka alensi kloonaustehokkuutta 50-%:lla (IC50) , määritettiin interpoloimalla. Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden IC50-arvot olivat 12-690 nM, so. sytotoksisuutta osoittavia IC50-arvoja. Samansukuisen luonnontuotteen, 10-hydroksikampto-tesiinin, IC50-arvo oli 18 nM. Kaavan (I) mukaiset sytotoksi-set yhdisteet ovat puhdistetun topoisomeraasi I:n tehokkaita inhibiittoreita. Kuten on osoitettu seuraavassa jaksossa, joka liittyy in vivo -aktiivisuuteen, muutamat kaavan (I) mukaiset yhdisteet, vaikka yleensä ovatkin vähemmän sytotoksisia kuin 10-hydroksikamptotesiini, sisälsivät kasvaimenvastaista aktiivisuutta L1210-leukemiaa vastaan in vivo, joka oli yhtä suuri tai suurempi kuin 10-hydroksikamptotesiinin aktiivisuus. Esimerkiksi yhdiste no. IS oli noin 3-kertaisesti voimattomampi kuin 10-hydroksikamptotesiini mitä tulee sytotoksiseen tehoon L1210-leukemiasoluja vastaan in vitro, mutta sisälsi in vivo kasvainsolun kasvua inhiboivaa aktiivisuutta, joka yleensä oli suurempi kuin 10-hydroksikamptotesiinin aktiivisuus monessa eri jyrsijöiden istutettavassa kasvainmallissa.

Il

Taulukko 2 11 :9 923

Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden aktiivisuus L1210-leukemiaa vastaan in vitro ja in vivo hiirissä, jotka kantavat ip-istutettuja kasvaimia

R

o vX' In 4 CH,*"

Yhdiste R X in vitro aktii- in vivo visuus

kasvain- IC50 MTO ILS

vastaisen (nM) (mg/kg) (%) aktiivisuuden numero 10-hydrok- -H hydroksi 18 9 94 sikamptote- siini IS -CH2N(CH3)2 hydroksi 56 15 >200 (asetaattisuola) 2S -CHO hydroksi 260 42 75 3S -CH2täB(CH3) 3 hydroksi 150 42 >200 4S -CH2NHCH2CH2OH hydroksi 250 42 75 5S -CH2N^^ O hydroksi 370 100 83 6S -CH2N(])NCH3 hydroksi 72 75 >200 7S -CH2nQ—nO hydroksi 270 >42* 44 8S -CH2NH-<J hydroksi 130 25 131 9S -CH2N hydroksi 69 42 112 ^^CH3

Taulukko 2 (jatkoa) •Λ Γ: Ρ r\ -9 12 ; j > / 3

Yhdisteen R χ in vitro In vivo kas- numero aktiivi- vainvastainen aktii- suus aktiivisuus

IC50 MTD ILS

--—__(nM) (mq/kq)_Lii_ 10S -CH2OCH2CH3 hydroksi 48 25 11S -CH2NH—hydroksi 56 25 >200 12S -CH2NHCH2CH2N (CH3) 2 hydroksi 49 >42* 94 13S -CH2OCH2CH2N (CH3) 2 hydroksi ei tes- 42 188 tattu 14S -CH2SCH2CH2N(CH3) 2 hydroksi 12 42 112 15S -CH2N(CH3)2 vety 65 15 88 16S vety syaani 80 3 100 17S -CH2CN hydroksi 400 12 >200 18S -CH2N^0 vety 690 13 144 19S vety -CHO 62 ei testattu 20S vety -CH NH 90 92 112 21S -CH2N(CH3)2 hydroksi ei tes- 54 >200 (natriumsuola) tattu 22S -CH2CH2NH2 hydroksi 360 100 75

In vivo tutkimusten osalta L1210-soluja istutettiin intraperi-toneaalisesti (10 hiirtä kohti), ja lääkeaineita annettiin intraperitoneaalisesti 1. ja 5. päivänä. Eliniän lisääntyminen perustui 6 hiirtä sisältävien ryhmien keskimääräiseen hengissä-pysymisaikaan, joita hiiriä oli käsitelty lääkeaineiden maksi-maalisesti siedetyllä annoksella.

♦Suurin testattu annos (aktiivisuusaste todennäköisesti suurempi korkeammalla annostasolla). In vitro kokeiden osalta L1210-soluja kasvatettiin suspensioviljelmässä, ja ne altistettiin lääkeaineille jatkuvasti kloonattaessa soluja pehmeään agariin. Kloonausteho määritettiin. 50-%:inen inhibitiivinen pitoisuus (IC50) määritettiin interpoloimalla.

13 R 9 9 ? 3

Kaikki edellä luetellut yhdisteet olivat tehokkaita topoisome-raasi I:n inhibiittoreita, ja puhdistettiin ihmisen paksunsuolen syöpäsoluista; entsyymiaktiivisuuden inhibitio havaittiin pitoisuuksissa < 3 /UM.

b: In vivo kasvainsolun kasvun inhibitio

Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden in vivo kasvaimenvastainen aktiivisuus määritettiin aluksi hiiristä, joihin oli istutettu intraperitoneaalisesti (ip) L1210-leukemia (taulukko 2). Yhdisteet no. IS ja no. 4S-13S pidensivät kasvainta kantavien hiirten elinjaksoa >40 %:lla vastaavilla maksimaalisesta siedetyillä annostasoillaan. Kolme yhdisteistä - yhdisteet no. IS, 6S ja 11S - oli erityisen aktiivisia pidentäen elinikää >200 %:lla ja tuottaen pitkäaikaisia kasvaimettomia eloonjääneitä. Joidenkin yhdisteiden aktiivisuus oli korkeampi kuin luonnollisella tuotteella, 10-hydroksikamptotesiinillä, jota kaavan (I) mukaiset yhdisteet rakenteellisesti muistuttavat. Kahden yhdisteen kohdalla - yhdisteet no. 7S ja 13S - korkein testattu annos ei ollut toksinen, joten näillä yhdisteillä saattaa olla suurempi aktiivisuus korkeammilla annostasoilla. Nämä tuotteet olivat kaikesta huolimatta aktiivisia testatuilla annostasoilla.

Johtuen yhdisteen no. IS korkeasta aktiivisuudesta ja tehokkuudesta in vivo (so., matala maksimaalisesti siedetty annos), sen teho arvioitiin muutamassa hiiren istutetussa kasvainmuodossa. Yhdisteen no. IS aktiivisuus on korkealla tasolla sen maksimaalisesti siedetyn annoksen kohdalla useassa eri eläinkasvainmuo-dossa, mukaanlukien leukemiat ja erilaisia kudoslajeja käsittävät kiinteät kasvaimet. Yhdisteen no. IS aktiivisuusspektristä on yhteenveto taulukossa no. 3. Korkea aktiivisuustaso havaittiin suurimmassa osassa kasvainmuotoja, ainoastaan yhden muodoista, paksunsuolen ip-karsinooman 26 osoittautuessa melkein täysin vastustuskykyiseksi lääkeaineelle. Myös kaksi sk-muotoa (subkutaaninen), paksunsuolen ip-karsinooma 26 ja Madisonin keuhkokarsinooma, osoittivat jonkin verran vastustuskykyä lää-keaineelle; so. näissä malleissa aktiivisuus ilmeni kohtuullisesti, so. >70-%:inen kasvain kasvun inhibitio, kun hiiriä, jotka kantoivat subkutaanisia kasvaimia, käsiteltiin yhdisteen 14 9 92 3 no. IS kanssa. Muissa sk-kasvainmuodoissa tuli esille korkea aktiivisuus (yli 90-%:inen inhibitio). Yhdisteen no. IS aktiivisuus osoittautui nimenomaan korkeaksi, annettuna intraperi-toneaalisesti, ei ainoastaan ip-kasvainmuotoja vastaan, vaan myös hiirillä, joihin oli siirretty kasvaimia laskimonsisäisesti (iv) tai ihonalaisesti (sk). Parantavaa aktiivisuutta ilmeni tietyissä kasvainmuodoissa, mukaanlukien ip- ja iv-istutetut P388- ja L1210-leukemiat ja iv- ja sk-istutettu Lewisin keuh-kokarsinooma. Yhdisteen no. IS aktiivisuuden taso ja spektri kestävät eläinkasvainmuodoissa edullisesti vertailun tehokkaimman lääkeaineen kanssa tunnetuista kasvaimia vastustavista lääkeaineista, kuten esimerkiksi syklofosfamidi, cisplatiini ja doksorubisiini.

li :-9923 15

Taulukko 3

Yhdisteen no IS aktiivisuusspektri eläinkasvainmuodoissa

Kasvainmuoto Aktiivisuus maksimaalisesti __siedetyn annoksen kohdalla ip-kasvainmuodot P388-leukemia +++ L1210-leukemia +++ B16-melanooma ++ B16-melanooma/F10-alalinja + + M5076-sarkooma ++

Paksunsuolen karsinooma 26 iv-kasvainmuodot P388-leukemia +++ L1210-leukemia +++

Lewisin keuhko-karsinooma +++ sk-kasvainmuodot

Lewisin keuhko-karsinooma +++ B16-melanooma ++

Bl-melanooma/F10-alalinja ++ ADJ-PC6-plasmasytooma + + M5076-sarkooma ++

Maitorauhasen adenokarsinooma 16/c ++

Paksunsuolen adenokarsinooma 38 ++

Paksunsuolen adenokarsinooma 51 ++

Madisonin keuhkokarsinooma +

Paksunsuolen karsinooma 26 +

Yhdistettä no IS annettiin intraperitoneaalisesti tai intrave-noosisesti joka neljäs tai seitsemäs päivä 2-4 kuurina alkaen 1-3 päivää kasvain istuttamisen jälkeen.

16 a\ o '"n r\ *7 . ly y i3 +++ = parantava (>200-%:inen kasvu eliniässä (ILS)) ++ = >100-%:inen eliniän pidentyminen (ILS) tai >90-%:inen inhibitio kasvaimen kasvussa (TGI)

+ = >50-%:inen ILS tai >70-%:inen TGI

= <50-%:inen ILS tai <70-%:inen TGI

Tulokset näistä hiirikasvainmuotoja koskevista tutkimuksista on esitetty yhteenvetona yksityiskohtaisemmin taulukossa 4, jossa esitetään eliniän (ILS) pidentyminen tai mitattavan (so. sub-kutaanisen) kiinteän kasvaimen kasvun inhibitioprosentti, jotka on saavutettu antamalla yhdistettä no. IS optimaalisin annoksin ja optimaalisin aikavälein. Taulukossa 4 on myös esitetty tulokset, jotka on saatu vertailututkimuksissa näillä kasvain-muodoilla luonnollisten kantatuoteyhdisteiden kanssa, kampto-tesiinin ja 10-hydroksikamptotesiinin kanssa. Nämä tulokset saavutettiin antamalla intraperitoneaalisesti tai intravenoo-sisesti yhdistettä no. IS jaksoittaisesti ajoittaen (so. joka neljäs tai seitsemäs päivä). Joissakin tapauksissa tuloksia saatiin optimaalisella hoitolääkityksellä, jossa yhdistettä no. IS annettiin osa-annoslääkityksenä (joka kolmas tunti 4 kertaa) jokaisena hoitopäivänä, kuten jäljempänä on kuvailtu yksityiskohtaisemmin. Kamptotesiini ja 10-hydroksikamptotesiini annettiin aina ip-suspensioina johtuen niiden liukenemattomuudesta vesivällaineisiin.

Taulukosta 4 käy ilmi, että kaikilla kolmella yhdisteellä on laaja aktiivisuusspektri eläinkasvainmuodoissa. Yhdisteen no.

IS ylivoimainen aktiivisuus käy ilmi useassa kasvainmuodossa mukaan lukien: ip L1210-leukemia, ip B16-melanooma, iv P388-leukemia, iv L1210-leukemia, sk Lewisin keuhkokarsinooma, sk B16-melanooma, sk B16-melanooma/F10-alalinja, sk paksunsuolen karsinooma 51, ja sk Madisonin keuhkokarsinooma. 10-hydroksikamptotesiini on varsin aktiivinen ip-siirretyissä kasvainmuo-doissa, mutta sen aktiivisuus on huonompi kasvainmalleissa, joissa kasvain on siirretty paikkaan, joka sijaitsee kaukana lääkeaineen antamispaikasta. Tämän lääkeaineen aktiivisuus on parhaassa tapauksessa minimaalinen sk-siirretyissä kiinteissä kasvainmuodoissa. Tämä ei todennäköisesti johdu 10-hydroksi- li Λ f' Λ ^ *7 17 kamptotesiinin heikosta liukenevuudesta, koska kamptotesiini on yhtä liukenematon, mutta on varsin aktiivinen tietyissä sk-kas-vainmuodoissa. On mahdollista, että 10-hydroksikamptotesiinin sisältämä aromaattinen hydroksyyliryhmä on altis alkuvaiheen konjugoitumiselle ja sappieritykselle ja näin ollen yhdiste ei saavuta riittäviä pitoisuuksia systeemisessä verenkierrossa. Yhdiste no. IS, joka myös sisältää 10-hydroksyyliryhmän, on hyvin aktiivinen nimenomaan sk- ja iv-kasvainmuodoissa. Tämä voi johtua yhdisteen no. IS 9-asemassa sijaitsevan emäksisen sivuketjun läsnäolosta, joka voi inhiboida 10-hydroksyyliryhmän metaboliaa steerisen estämisen, vetysidosmuodostuksen tai sisäisen suolanmuodostuksen kautta. 10-hydroksikamptotesiini on hyvin aktiivinen paksunsuolen ip-karsinoomassa 26, joka on epä-herkkä yhdisteelle no. IS ja minimaalisen herkkä kamptotesii-nille. Sama kasvain on kuitenkin vastustuskykyinen 10-hydrok-sikamptotesiinille subkutaanisesti siirrettynä ollen kuiten-kin kohtuullisen herkkä yhdisteelle no. IS tässä asetelmassa.

Yhdisteen no. IS aktiivisuudelle ominaisen suuren ilmenemisas-teen ja laajan spektrin lisäksi, kuten on osoitettu taulukossa 4, yhdiste näyttäisi myös säilyttävän täyden kasvainvastaisen aktiivisuuden annettaessa suun kautta. Tämä osoitettiin hiirissä, jotka kantoivat sk-siirrettyä Lewisin keuhkokarsinoomaa, ja sitä kuvaillaan yksityiskohtaisesti jäljempänä. Toinen yhdisteelle no. IS tunnusomainen piirre on sen aktiivisuuden säilyminen P388-leukemian alalinjoissa, jotka osoittautuvat resistenteiksi monivaikutteisille kasvainvastaisille lääkeaineille, kuten jäljempänä kuvaillaan. Koska pääongelmana syövän hoidossa on resistenttien solupopulaatioiden ilmaantuminen, jotka eivät reagoi alunperin tehokkaaseen lääkehoitoon yhtä hyvin kuin toisen linjan hoitolääkitykseen, olisi lääkeaineiden saatavuudella, joille resistentit solut eivät ole ristiresistenttejä, merkittävä vaikutus syövän hoidossa.

Taulukko 4 18 '

Yhdisteen no IS vertaaminen kamptotesiinin ja 10-hydroksikamp-totesiinin kanssa eläinkasvainmuotovalikoimassa

Kasvainmuoto Yhdiste Kamptote- 10-hydroksi- no IS siini kamptotesii- ni

Eliniän pidentyminen (ILS) tai kasvaimen kasvun inhibitio (TI) ip-kasvainmuodot P388 -leukemia parantava parantava parantava

L1210-leukemia parantava 172 % ILS 94 % ILS

B16-melanooma 152 % ILS 36 % ILS 95 % ILS

B16-melanooma/F10- 105 % ILS 68 % ILS 100 % ILS

alalinja

M5076-sarkooma 105 % ILS 81 % ILS 98 % ILS

Paksunsuolen karsi- 25 % ILS 50 % ILS parantava nooma 2 6 iv-kasvainmuodot

P388-leukemia parantava 75 % ILS 40 % ILS

L1210-leukemia parantava 136 % ILS 100 % ILS

Lewisin keuhko- parantava ei testattu ei testattu karsinooma sk-kasvainmuodot

Lewisin keuhko- parantava 92 % TGI 4 % TGI

karsinooma B16-melanooma 100 % TGI 78 % TGI ei testattu 19 :9923

Taulukko 4 (jatkoa)

Kasvainmuoto Yhdiste Kamptote- 10-hydroksi- no IS siini kamptotesii- ni

Eliniän pidentyminen (ILS) tai kasvain-kasvun inhibitio (TI)

Bl-melanooma/F10- 100 % TGI 90 % TGI 58 % TGI

alalinja

ADJ-PC6-plasmasytooma 100 % TGI 100 % TGI 76 % TGI

M5076 -sarkooma 100 % TGI 100 % TGI 66 % TGI

Maitorauhasen adeno- 96 % TGI 99 % TGI 61 % TGI

karsinooma 16/c

Paksunsuolen adeno- 96 % TGI 100 % TGI ei testattu karsinooma 38

Paksunsuolen adeno- 92 % TGI 75 % TGI ei testattu karsinooma 51

Madisonin keuhko- 85 % TGI 63 % TGI 33 % TGI

karsinooma

Paksunsuolen karsi- 72 % TGI 66 % TGI 37 % TGI

nooma 26

Esitetty aktiivisuus oli maksimaalisella siedetyllä annoksella saatu aktiivisuus. Lääkeaineita annettiin intraperitoneaalises-ti tai intravenoosisesti kasvamia kantaville hiirille joka neljäs tai seitsemäs päivä 2-4 kuurina alkaen 1-3 päivää kasvaimen istuttamisen jälkeen. Arvot määritettiin perustuen keskimääräiseen henkiinjäämisaikaan ja kasvaimen keskitilavuuteen 6-8 hiirtä käsittävissä ryhmissä täydellisissä annosvas-tekokeissa.

Yhdisteen no. IS aktiivisuutta kussakin testatussa kasvainniuo-dossa kuvaillaan yksityiskohtaisemmin seuraavissa jaksoissa.

20 09923 ip-kasvainmuodot

Yhdisteen no. IS aktiivisuus, jota yhdistettä on annettu int-raperitoneaalisesti tai subkutaanisesti erilaisilla hoitoajoi-tuksilla hiirille, jotka kantavat ip-siirrettyjä kasvaimia, on esitetty taulukossa 5. Tulokset osoittavat yhdisteen no. IS kasvain vastaisen tehon annosriippuvuuden kuudessa ip-siirre-tyssä kasvain muodossa.

P388-leukemia: Annettaessa intraperitoneaalisesti l. ja 5. päivänä hiirille, jotka kantoivat ip P388-leukemiaa, yhdiste no. IS lisäsi elinikää >200 %:lla, pitkän aikavälin henkiinjääneitä (parantuneita) ollessa 4/6, yhdisteen maksimaalisesti siedetyllä annoksella 15 mg/kg. Pienemmät annokset olivat myös hyvin tehokkaita elinjaksojen lisääntyessä 125 ja 92 %:lla.

Tämä korkea aktiivisuusaste vahvistettiin toisessa myöhemmin (ks. taulukko 8) kuvattavassa kokeessa, jonka yhteydessä maksimaalisesti siedetty annos lisäsi 228 %:lla elinikää (ILS), pitkän aikavälin henkiinjääneitä ollessa 2/6. Yhdiste IS oli siten parantavasti aktiivinen hiirissä, jotka kantoivat ip P3 8 8 -1eukemiaa.

Taulukko 5 21 -, r' ^ r\ 7

Yhdisteen no IS aktiivisuus hiirissä, jotka kantavat ip-istutettuja kasvaimia

Kasvainmuoto Hoitoaikataulu/ Annos ILS Pitkän ai- antamisreitti (mg/kg/ (%) kavalin ruiske henkiinjää- _neitä_ P388-leukemia A/ip 30 toksinen 15 >200 4/6 7,5 125 3,8 92 L1210 A/ip 25 toksinen 15 219 2/6 9 138 5.4 81 3.2 31 B16-melanooma B/ip 25 toksinen 15 152 9 100 5.4 52 3.2 37 B1-melanooma/ B/ip 25 toksinen ..·. F10-alalinja 15 105 9 68 5.4 63 3.2 37

Taulukko 5 (jatkoa) *'« m ^ r'. *>

22 : :>y lI

Kasvainmuoto Hoitoaikataulu/ Annos ILS Pitkän ai- antamisreitti (mg/kg/ (%) välin hen- ruiske) kiinjää neitä M5076-sarkooma C/ip 10 toksinen 5 toksinen 2.5 105 1.2 75 1/8 0,62 70 1/8 M5076-sarkooma C/sk 10 toksinen 5 toksinen 2.5 98 1.2 70 1/8 0,62 36

Paksunsuolen B/ip 40 toksinen karsinooma 26 20 toksinen 10 25 5 5 2.5 7

Hoitoaikataulut ovat: A = päivinä 1 ja 5; B = päivinä 1, 5, 9 ja 13; C = joka kolmas tunti x 4 päivinä 1, 5 ja 9.

Eliniän lisääntyminen (ILS) perustuu keskihenkiinjäämisaikaan 6-8 hiirtä käsittävissä ryhmissä verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. Pitkän aikavälin hengissäpysyjät olivat kasvain-vapaita 45. päivänä leukemioiden osalta ja 60. päivänä kiinteiden kasvaimien osalta.

Il j'9923 23 L1210-leukemia: Annettaessa intraperitoneaalisesti ensimmäisenä ja viidentenä päivänä yhdiste no. IS oli toistettavasti aktiivinen hiirissä, jotka kantoivat ip L1210-leukemiaa. Taulukossa 5 esitettävässä tyypillisessä kokeessa elinikä lisääntyi 219 %:lla, parantuneita oli 2/6, yhdisteen maksimaalisesti siedetyllä annoksella 15 mg/kg. Hyvä aktiivisuus havaittiin myös kahden pienemmän annoksen kohdalla. Yhdisteen no. IS teho arvioitiin tällä aikavälillä vielä kahdeksassa annosvastekokees-sa. Pitkän aikavälin henkiinjääneiden lukumäärä ja ILS-%, jotka saatiin näissä kokeissa maksimaalisesti siedetyillä annoksilla, olivat: 44 % (0/6), >300 % (5/6), 119 % (0/6), 156 % (1/6), 138 % (0/6), 156 % (276), 350 % (2/6) ja 138 % (1/6). Näin ollen, 8/9 kokeessa yhdiste no. IS lisäsi elinikää >100 %:lla, ja 6/9 kokeessa oli pitkän aikavälin henkiinjääneitä.

B16-melanooma: Tässä kasvainmuodossa, jossa yhdiste no. IS oli selvästi parempi kuin kamptotesiini ja 10-hydroksikamptotesiini (katso taulukko 4), lääkeaineen tuottama ILS-% oli 152 yhdisteen maksimaalisesti siedetyllä annoksella 15 mg/kg päivinä 1, 5, 9 ja 13. Tämä tulos varmistettiin toisessa kokeessa, jossa suurin testattu annos, 9,6 mg/kg, tuotti 130-%:n ILS:n.

B16-melanooma/F10-alalinja: B16-melanooman F10-alalinja on tämän kasvain hyvin metastaattinen alalinja, joka seulottiin kloonaamalla. Yhdisteellä no. IS saatiin 105 %:n ILS yhdisteen maksimaalisesti siedetyllä annoksella 15 mg/kg, annettuna intraperitoneaalisesti päivinä 1, 5, 9 ja 13. Aktiivisuutta ilmeni myös kahden pienemmän annoksen kohdalla, minkä osoittivat >40 %:n kasvut eliniässä.

M5076-sarkooma: M5076 on metastaattinen retikulosolusarkooma, joka sai alkunsa C57Bl/6-hiiren munasarjassa ja eristettiin kudossiirrettynä kasvaimena. Tämä kasvain oli ip-siirrettynä herkkä yhdisteelle no. IS, kun lääkeainetta annettiin subku-taanisesti kuin myös annettaessa lääkeaine intraperitoneaalisesti. Aktiivisuusaste oli itse asiassa identtinen, 98-%:inen ILS ja 105-%:inen ILS, kahden mainitun antamisreitinkautta osa-annoksina ajoitettuna joka 3. tunti x 4 päivinä 1, 5 ja 9. Tämä j 9 92 3 24 ajoitus, kuten jäljempänä on kuvailtu, näyttää olevan optimaalinen yhdisteelle no. IS useassa eri kasvainmuodossa. Yhdisteen no. IS teho määritettiin vielä kolmessa annosvastekokeessa hiirissä, jotka kantoivat ip M5076-sarkoomaa; näissä kokeissa lääkeainetta annettiin yksinkertaisena annoksena päivinä l, 5 ja 9 intraperitoneaalisesti (75-%:inen ILS, parantuneita 1/8), yksinkertaisena annoksena päivinä 1, 5, 9 ja 13 intraperitoneaalisesti (71-%:inen ILS, parantuneita 1/8), ja yksinkertaisena annoksena päivinä 1, 5 ja 9 subkutaanisesti (57-%:inen ILS). Kuten iv ja sk kasvainmalleissa (kuvailtuna jäljempänä), yhdiste no. IS näyttää olevan tehokkaimmillaan ip M5076-sarkoo-massa, annettuna osa-annoshoitolääkityksenä. Joka tapauksessa, riippumatta antamisen ajoituksesta, yhdiste no. IS on toistettavasta aktiivinen tässä kasvainmuodossa.

Paksunsuolen karsinooma 26: Paksunsuolen karsinooma 26 on hyvin tunkeutuva ja metastaattinen, erilaistumaton paksunsuolen kas-vainmuoto. Tämä kasvain osoittautui testatulla ajoitussuunni-telmalla vastustuskykyiseksi yhdisteen no. IS maksimaalisesti siedettyä annosta kohtaan.

lv-kasvainmuodot

Yhdisteen no. IS aktiivisuus, annettua intraperitoneaalisesti tai intravenoosisesti hiirille, jotka kantavat systeemisiä (iv-siirrettyjä) leukemioita tai Lewisin keuhkosarkoomaa, on esitettynä taulukossa 6. Yhdisteen no. IS annosvasteisuus ja riippuvuus ajoitussuunnitelmasta on selvästi osoitettu näissä tutkimuksissa. Yhdiste no. IS osoittautui parantavasti aktiiviseksi jokaisessa kolmessa kasvainmuodossa.

II

Taulukko 6 -3.9 9 2 3 25

Yhdisteen no IS aktiivisuus hiirissä, jotka kantavat iv-istutettuja kasvaimia

Kasvainmuoto Hoitoaikataulu/ Annos ILS Pitkän aika- antamisreitti (mg/kg/ (%) välin hen- ruiske) kiinjääneitä P388 -leukemia A/ip 25 279 2/6 15 132 9 100 5.4 58 3.2 42 P388-leukemia A/iv 25 toksinen 19 250 2/6 14 145 10 110 7,9 65 L1210 A/ip 25 toksinen 15 171 1/6 9 136 5.4 93 ... 3,2 57 L1210-leukemia D/iv 40 toksinen 24 >300 4/7 14 157 8,6 129 5.2 71

Taulukko 6 (jatkoa) 26 D9923

Kasvainmuoto Hoitoaikataulu/ Annos ILS Pitkän aika- antamisreitti (mg/kg/(%) välin hen- _ruiske)_kiini ääneitä L1210-leukemia E/iv 6 toksinen 3,6 >300 5/7 2.2 >300 1/7 1.3 243 2/7 0,78 186

Lewisin keuhko- B/ip 25 toksinen karsinooma 15 >200 7/7 9 111 1/7 5.4 37 3,22 16

Hoitoaikataulut ovat: A = päivinä 1 ja 5; B = päivinä 1, 5, 9 ja 13; D = päivinä 2 ja 6; E = joka kolmas tunti x 4 päivinä 2, ja 6.

Eliniän lisääntyminen (ILS) perustuu keskihenkiinjäämisaikaan 6-8 hiirtä käsittävissä ryhmissä verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. Pitkällä aikavälillä hengissä pysyneet olivat kasvainvapaita 45. päivänä leukemioiden osalta ja 60. päivänä kiinteiden kasvainten osalta.

4

II

27 3 9 9 2 3 P388-leukemia: P388-leukemia on yleensä vähemmän herkkä lääkeaineelle istutettuna intravenoosisesti kuin siirrettynä intraperitoneaalisesti. Yhdiste no. IS oli kuitenkin hyvin aktiivinen iv P388-leukemiaa kohtaan joko annettuna maksimaali-sesti siedettynä annoksena päivinä 1 ja 5 intraperitoneaalisesti (279-%:inen ILS, parantuneita 2/6) tai intravenoosisesti (250-%:inen ILS, parantuneita 2/6). Tämän kasvainmuodon kolmannessa kokeessa yhdisteen no. IS tuottama ILS-% oli 125, parantuneita oli 1/6, maksimaalisesti siedetyllä annoksella 15 mg/kg annettuna intraperitoneaalisesti päivien 1 ja 5 kohdalla.

L1210-leukemia: Yhdiste no. IS osoittautui toistettavasti ja tehokkaasti aktiiviseksi iv-istutettua L1210-leukemiaa vastaan. Laajoja ajoitusriippuvuuskokeita suoritettiin tällä kasvainmuo-dolla antaen lääkeaine intravenoosisesti. Kuten taulukossa 6 on osoitettu, osa-annoslääkityksenä antaminen johti korkeampaan aktiivisuusasteeseen laajemmalla annostusalueella. Parantavaa aktiivisuutta havaittiin, kun lääkeainetta annettiin intravenoosisesti päivien 2 ja 6 kohdalla yksittäisannoksena tai neljänä annoksena 3 tunnin välein. Taulukossa 6 esitettyjen tulosten lisäksi on olemassa 10 annosvastekoetta käyttäen iv-annettua yhdistettä no. IS hiirissä, jotka kantoivat iv L1210-leukemiaa. Tulokset ovat seuraavat: Päivien 2 ja 6 kohdalla, 171-%:inen ILS, parantuneita 2/6; 4 käsittelyä 3 tunnin välein päivien 2 ja 6 kohdalla, >300-%:inen ILS, parantuneita 6/6,-kolme käsittelyä 6 tunnin välein päivien 2 ja 6 kohdalla, 200-%:inen ILS, parantuneita 2/7; 2 käsittelyä 12 tunnin välein päivien 2 ja 6 kohdalla, 229-%:inen ILS, 2/7 parantunutta; yksinkertaisia käsittelyjä päivien 2 ja 6 välillä, 143-%:inen ILS ja 129-%:inen ILS; 2 käsittelyä 12 tunnin välein päivien 2 ja 6 .. . välillä, 193-%:inen ILS ja 171-%:inen ILS; yksinkertainen annos ' toisena päivänä, 114-%:inen ILS; ja 4 käsittelyä 3 tunnin vä liajoin toisena päivänä, 244-%:inen ILS, parantuneita 1/6. Yhdiste no. IS näyttäisi olevan tehokkaimmillaan annettaessa ajoituksella joka kolmas tunti. Se on tehottomampi annettaessa päivittäin kuin annettaessa joka neljäs päivä. Näihin tutkimuksiin pohjautuvaa optimaalista ajoitussuunnitelmaa käytettiin tiettyihin kiinteisiin kasvaimiin, kuten edellä on käsitelty ip 3 9 92 3 28 M5076-sarkooman kohdalla ja kuten jäljempänä on kuvailtu. Monessa eri kasvainsysteemissä aktiivisuusaste kohoaa, ja tehokas annostusalue on laajempi, kun yhdistettä no. IS annetaan osa-annosajoituksella (so. joka kolmas tunti 4 kertaa).

Lewisin keuhkokarsinooma: Lewisin keuhkokarsinooma on hyvin me-tastaattinen, erilaistumaton keuhkosyöpä, jota on käytetty laajalti lääkeaineiden tehomäärityksiin. Tämä kasvainmuoto on vastustuskykyinen monelle luodulle kasvainvastaiselle lääkeaineelle, ja käytettäessä seulontasysteeminä, se osoitti hyvin harvan yhdisteen aktiiviseksi. Yhdiste no. IS on parantava tässä kemo-astustuskykyisessä kasvainmuodossa, jolle on tunnusomaista, että kasvain siirrostetaan intravenoosisesti, mikä johtaa kas-vainnystyröitymiseen keuhkoissa. Parantava aktiivisuus on tässä kasvainmuodossa erikoinen havainto.

Kuten ilmenee kaikista kolmesta iv-siirretystä kasvainmuodosta, yhdiste no. IS on varsin tehokas systeemisiä kasvaimia vastaan, annettaessa intraperitoneaalisesti samoin kuin intravenoosisesti .

Sk-kasvainmuodot

Yhdisteen no. IS teho määritettiin kymmenessä kiinteässä kasvainmuodossa, joissa kasvaimet istutettiin subkutaanisesti, ja lääkeaine annettiin intraperitoneaalisesti, intravenoosisesti tai suun kautta (po). Näissä kasvainmuodoissa kasvainvastaista aktiivisuutta arvioidaan kasvaimen kasvun inhibitioasteen avulla kasvaimen istutuskohdassa. Tuumorit mitataan yleensä 2-3 viikkoa kasvaimen istutuksen jälkeen, kun suuria kasvaimia (>500 mm3) ilmenee käsittelemättömissä kontrollieläimissä. Hyvin metastaattisten kiinteiden kasvaimien osalta voidaan myös käyttää hengissäpysymisaikaa lääkeaineen aktiivisuuden mittana. Vähemmän metastaattisten kasvainmuotojen kohdalla hoitamattomien eläinten hengissäpysymisaika on hyvin vaihteleva, ja eläimet voivat pysyä hengissä pitkiä ajanjaksoja kantaen äärimmäisen suuria kasvaimia, jotka usein haavautuvat ja infektoituvat. Yhdiste no. IS oli hyvin tehokas 8:ssa 10:stä kiinteästä sk-kas-vainmuodosta, ehkäisten kasvaimen kasvua yli 90 %:lla maksi- li 39923 29 maalisesti siedetyn annoksen kohdalla (taulukko 7). Eliniän lisääntyminen myötäili kasvaimen kasvun täydellistä inhiboitu-mista hyvin metastaattisissa kasvaimissa mukaan lukien Lewisin keuhkokarsinooma, B16-melanooma, B16-melanooma/Fi0-alalinja ja M5076-sarkooma. Myös vähemmän herkissä kasvainmuodoissa, Madi-sonin keuhkokarsinoomassa ja paksunsuolen karsinoomassa 26, yhdiste no. IS sisälsi jonkin verran kasvaimen kasvua inhiboivaa aktiivisuutta siten, että >70-%:inen inhibitio ilmeni mak-simaalisesti siedetyn annoksen kohdalla.

Taulukko 7 30 · 29923

Yhdisteen no IS aktiivisuus hiirissä, jotka kantavat sk-istutettuja kasvaimia

Kasvainmuoto Hoitoaikataulu/ Annos TGI Hiiret, joil- antamisreitti (mg/kg/ (%) la ei tunnus - ruiske) teltavissa olevia kas- ____________vaimia_

Lewisin keuhko- B/ip 25 toksinen karsinooma 15 100 8/8* 9 99 7/8** 5.4 68 2/8 3,2 31

Lewisin keuhko- F/iv 25 99 5/8 karsinooma 15 95 3/8 9 93 1/8 5.4 87 4/8

Lewisin keuhko- F/po 45 toksinen karsinooma 27 99 4/8 16 90 1/8 9,7 89 2/8 : : 5,8 51 B16-melanooma F/ip 24 99 7/8 ; 14 57 3/8 8,6 63 3/8 ·': 5,2 20 1/8 3,1 63 2/8

II

Taulukko 7 (jatkoa) 31 39923

Kasvainmuoto Hoitoaikataulu/ Annos TGI Hiiret,joil- antamisreitti (mg/kg/ (%) la ei tun- ruiske) nusteltavis- sa olevia ____kasvaimia B16-melanooma F/iv 25 toksinen 15 99 7/8 9 96 6/8 5,4 79 3/8 3.2 54 2/8 B16-melanooma C/ip 6 100 7/7 3,6 100 7/7 2.2 92 2/8 1.3 64 1/8 0,78 46 1/8 B16-melanooma/ B/ip 25 100 7/8 F10-alalinja 15 87 9 57 5.4 62 3.2 52 B16-melanooma/ F/iv 25 97 6/8

FlO-alalinja 15 97 7/8 ... 9 60 2/8 5.4 34 1/8 3.2 22 1/8 32 33923

Taulukko 7 {j atkoa)

Kasvainmuoto Hoitoaikataulu/ Annos TGI Hiiret, joil- antamisreitti (mg/kg/ (%) la ei tunnus- ruiske) teltavissa olevia kas- _vaimia_ ADJ-PC6-plasma- B/ip 25 toksinen sytooma 15 100 7/7*** 9 100 8/8*** 5.4 92 4/8*** 3.2 93 3/8 M5076-sarkooma B/ip 25 toksinen 15 100 8/8 9 98 6/8 5.4 92 3/8 3.2 64 2/8

Maitorauhasen B/ip 20 toksinen adenokarsinooma 10 96 5/8 16/C 5 61 2/8 2.5 59 1/8

Paksunsuolen G/ip 24 89 4/7 adenokarsinooma 14 78 5/7 38 8,6 55 3/7 5.2 0 1/7 3,1 0 2/7

Paksunsuolen H/ip 6 96 5/7 adenokarsinooma 3,6 93 6/7 38 2,2 74 4/7 1.3 68 4/7 0,78 53 2/7 *' I C \ ^ 7 33

Taulukko 7 (jatkoa)

Kasvainmuoto Hoitoaikataulu/ Annos TGI Hiiret, joil- antamisreitti (mg/kg/ (%) la ei tunnus - ruiske) teltavissa olevia kas- ___vaimia_

Paksunsuolen G/ip 24 88 3/8 adenokarsinooma 14 76 1/8 51 8,6 53 1/8 5,2 36 3,1 34

Paksunsuolen H/ip 3,6 92 4/8 adenokarsinooma 2,2 89 4/8 51 1,3 88 3/8 0,78 73 1/8 0,47 37

Madisonin keuhko- F/iv 24 28 1/8 karsinooma 12 0 6 21 3 0 1.5 0

Madisonin keuhko- C/iv 3 toksinen karsinooma 1,5 85 3/8 ·;·; 0,75 63 1/8 0,38 41 0,19 0

Paksunsuolen B/ip 20 toksinen karsinooma 26 10 72 5 39 2.5 38

Hoitoaikataulut ovat: B = päivinä 1, 5, 9 ja 13; C = joka 3. tunti χ 4 päivinä 1, 5 ja 9; F = päivinä 1, 5 ja 9; G = päivinä 3, 10, 17 ja 24; H = joka 3. tunti x 4 päivinä 3, 10, 14 ja 24.

34 89923 * 4/8 pitkän aikavälin, kasvainvapaat henkiinjääneet ** 2/8 pitkän aikavälin, kasvainvapaat henkiinjääneet *** 1/8 pitkän aikavälin, kasvainvapaat henkiinjääneet

Kasvainkasvun inhibitio (TGI) perustuu kasvaimen keskitilavuuteen 7-8 hiirtä käsittävissä ryhmissä, verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. Kasvaimet mitattiin päivien 12 ja 19 välillä (paitsi päivänä 24 paksunsuolen 51 kohdalla ja päivänä 31 paksunsuolen 38 osalta). Kaikissa paitsi kahdessa kokeessa, kaikilla käsittelemättömillä kontrollihiirillä oli mitattavia kasvaimia (21 tai 24 hiirtä/ryhmä). B16/F10:ssä, aikataulu F, 21/24 kontrollihiiristä oli mitattavia kasvaimia. Kokeessa, joka koski paksunsuolen adenokarsinoomaa 38, 19/21 kontrollihiiristä oli mitattavia kasvaimia.

Lewisin keuhkokarsinooma: Tämä hyvin metastaattinen keuhkokas-vain oli testatuista kasvainmuodoista herkin yhdisteelle no.

IS. Tämä on erikoinen havainto, koska Lewisin keuhkokarsinoomaa on laajalti käytetty kasvainvastaisten lääkeaineiden tutkimuksiin, ja se on vastustuskykyinen enimmälle osalle tunnetuista kasvainvastaisista lääkeaineista. Annettaessa intraperitoneaa-lisesti päivien 1, 5, 9 ja 13 kohdalla, yhdiste no. IS inhiboi täysin Lewisin keuhkokarsinooman kasvun käytännöllisesti katsoen kaikissa hiirissä, joita oli käsitelty pitoisuudella 15 tai 9 mg/kg. Maksimaalisesti siedetyn annoksen kohdalla 4 hiirtä kahdeksasta parani. Kasvaimien mittaamishetkellä (14. päivä), kasvaimien tilavuus käsittelemättömissä kontrolleissa oli keskimääräisesti 1685 mm3. Toisessa kokeessa yhdistettä no. IS annettiin intravenoosisesti ja oraalisesti päivien 1, 5 ja 9 kohdalla. Molempien antamisreittien tapauksessa kasvaimen kasvu inhiboitui 99-%:isesti (TGI), samalla kun puolet tai enemmän eläimistä ei ilmentänyt lainkaan kasvainta mittaamishetkellä (13. päivä). Edelleen maksimaalisesti siedetty annos oli molemmilla antamisreiteillä itse asiassa sama viitaten siihen, että yhdisteen no. IS biologinen saatavuus on erinomainen suun kautta annettuna. Tässä kokeessa kasvaimet kasvoivat lopuksi istutuskohdassa osoittaen sen, että joko ip-käsittely on opti- . 39923 35 maalinen tässä kasvainmuodossa, tai että hoitokäsittelyn pitempi kesto on tarpeen parantavan aktiivisuuden kannalta.

B16-melanooma: Tätä metastaattista melanoomamuotoa on laajalti käytetty arvioitaessa ja seulottaessa kasvainvastaisia lääkeaineita. Subkutaanisesti istutettaessa tämä kasvain on vastustuskykyinen useimmille kasvainvastaisille lääkeaineille. Yhdisteen no. IS teho arvioitiin hiirissä, jotka kantoivat sk B16-melanoomaa, kolmessa annosvastekokeessa. Annettaessa yksinkertaisena annoksena päivien 1, 5 ja 9 kohdalla, yhdisteen no. IS maksimaalisesti siedetty annos, annettuna intraperitoneaali-sesti tai intravenoosisesti, inhiboi 99-%risesti kasvaimen kasvua (TGI), eläinten enemmistön ollessa vapaita mitattavista kasvaimista päivien 16 tai 14 kohdalla, kun kontrollihiirten sisältämien kasvainten keskikoko oli 864 ja 758 mm3 ko. kahdessa kokeessa. Annettaessa edellä kuvaillun optimaalisen osa-annoshoitosuunnitelman mukaisesti, yhdiste no. IS inhiboi täydellisesti kasvaimen kasvua laajemmin annosalueen puitteissa. Tämä vastaa tuloksia, jotka on saatu muista kasvainmuodois-ta. Sk B16-melanoomamuodossa kasvaimet kasvoivat lopuksi kaikissa käsitellyissä eläimissä, eikä parantuneita ollut. Tässä metastaattisessa kasvainmuodossa esiintyi kuitenkin eliniän pidentymistä yhdessä kasvaimen kasvun täydellisen inhibition kanssa. Osa-annoslääkityksellä ILS-% oli 52, samalla kun yksinkertainen intraperitoneaalinen annos 24 mg/kg päivien 1, 5 ja 9 kohdalla pidensi elinikää 39 %:lla. Tällä jälkimmäisellä ajoituksella intravenoosinen antaminen lisäsi elinikää 53 %.

Bl6-melanooma/F10-alalinja: Tämä B16-melanooman alalinja, joka on valikoitu korostuneiden metastaattisten ominaisuuksien perusteella, oli herkkyydeltään yhdisteelle no. IS samanlainen kuin B16-perusmelanooma. Intraperitoneaalinen käsittely päivien 1, 5, 9 ja 13 kohdalla johti kasvainkasvun täydelliseen inhi-bitioon maksimaalisesti siedetyllä annoksella. Intravenoosinen hoitokäsittely päivien 1, 5 ja 9 kohdalla inhiboi kasvaimen kasvua 97-%risesti kahdella annostasolla. Kasvaimet mitattiin näissä kokeisa 16. päivänä, ja kontrollihiirten kasvaimet olivat hyvin suurikokoisia ollen keskimäärin 1927 ja 1196 mm3.

3992 3 36

Kasvaimet kasvoivat lopuksi kaikissa ryhmissä, eikä parantuneita ollut. Intraperitoneaalinen käsittely kuitenkin lisäsi tasolla 25 mg/kg elinikää (ILS) 70-%:isesti; intravenoosisessa käsittelyssä samalla annostasolla saatiin ILS-%:ksi 38.

ADJ-PC6-plasmasytooma: Tämä kasvainmuoto, joka eniten muistuttaa ihmisen monipesäkkeistä myeloomasyöpää, oli hyvin herkkä yhdisteelle no. IS annettuna intraperitoneaalisesti päivien 1, 5, 9 ja 13 kohdalla. Kasvaimet mitattiin 19. päivänä, ja niiden tilavuus kontrollihiirissä oli keskimäärin 828 mm3. Yhdiste no. IS inhiboi >90-%:isesti kasvaimen kasvua neljässä annostasossa maksimaalisesti siedetyn annoksen tasolla tai sen alapuolella. Kullakin kolmella ylimmällä annostasolla oli 1 pitkällä aikavälillä kasvaimeton eloonjäänyt 8:sta koeyksilöstä. Koska tämä kasvain ei ole kovin metastaattinen, keskimääräistä henkiinjää-misaikaa ei määritetty.

M5076-sarkooma: Subkutaanisesti istutettu M5076-sarkooma oli varsin herkkä yhdisteelle no. IS TGI:n ollessa >90-%:inen kolmessa annostasossa maksimaalisesti siedetyn tason kohdalla tai sen alapuolella. Kasvaimet mitattiin 17. päivänä, kun kontrollikasvaimet olivat keskimäärin 1045 mm3 tilavuudeltaan. Lääkeaine annettiin intraperitoneaalisesti päivien 1, 5, 9 ja 13 kohdalla. Lääkeaine ei ollut tässä syöpämuodossa parantava, mutta se pidensi elinikää 31 %:lla.

Maitorauhasen adenokarsinooma 16/C: Tämä rintasyöpämuoto on C3H-hiiren spontaanin rintakasvaimen istutettava alalinja. Yhdiste no. 15 inhiboi kasvainkasvua 96-%:isesti maksimaalisesti siedetyllä annoksella 10 mg/kg annettuna intraperitoneaalisesti päivien 1, 5, 9 ja 13 kohdalla. Kasvaimet mitattiin 19. päivänä, kun keskimääräinen kasvaintilavuus kontrollihiirissä oli 630 mm3. Toisessa kokeessa, samalla ajoitussuunnitelmalla, yhdiste no. IS inhiboi kasvaimen kasvua (TGI) 73-%risesti maitorauhasadenokarsinoomassa 16/C Koska tämä kasvain ei ole kovin metastaattinen, eläimiä ei pidetty eloonjäämisen takia.

li 37 89 923

Paksunsuolen adenokarsinooma 38: Tätä ei-metastaattista paksunsuolen kasvainmuotoa on laajalti käytetty lääkeaineen tehon määrittämisessä, ja sen katsotaan olevan yksi lääkeaineille vastustuskykyisimmistä kasvainmuodoista. Yhdistettä no. IS annettiin intraperitoneaalisesti yksittäisenä annoksena tai osa-annoslääkityksenä päivien 3, 10, 17 ja 24 kohdalla. Pitkitetty hoitolääkitys valittiin johtuen tämän kiinteän kasvaimen hitaasta kasvusta. Kasvaimet mitattiin 31. päivänä, ja niiden keskimääräinen koko oli vain 349 mm3 käsittelemättömillä kontrolleilla. Kuten muissakin kasvainmuodoissa yhdiste no. IS oli tehokkaampi osa-annosajoituksella tuottaen > 90-%:isen inhibition kahdessa annostasossa. Hyvä aktiivisuus ilmeni myös yksiannoslääkityksellä (89-%:inen TGI).

Paksunsuolen adenokarsinooma 51: Tämä on toinen hidaskasvuinen paksunsuolen kasvainmuoto, joka on osoittautunut vastustuskykyiseksi useimmille kasvainvastaisille lääkeaineille. Toimintaohje tämän kasvaimen kohdalla käytettynä oli samanlainen kuin paksunsuolen adenokarsinooman 38 kohdalla käytetty ohje. Yhdiste no. IS oli aktiivinen paksunsuolen adenokarsinoomaa 51 vastaan aiheuttaen 88-%:isen TGI:n yksiannoslääkityksellä, ja 92-%:isen TGI:n osa-annoskäsittelyllä. Kuten muissa kasvaimissa, yhdiste no. IS oli tehokas laajemmalla annosalueella annettuna osa-annoslääkityksenä. Paksunsuolen adenokarsinooma 51 mitattiin 24. päivänä, kun kontrollikasvaimet olivat keskimäärin 766 mm3.

Madisonin keuhkokarsinooma: Madisonin keuhkokarsinooma on, kuten Lewisin keuhkokarsinooma, nopeasti kasvava erilaistumaton kasvainmuoto, jonka metastaattinen aktiivisuus on korkea. Päinvastoin kuin Lewisin keuhkokasvain Madisonin keuhkokasvain ei ole varsin herkkä yhdisteelle no. IS. Annettuna yksiannoslää-kityksenä intravenoosisesti päivien 1, 5 ja 9 kohdalla, ei kasvaimen kasvu inhiboidu käytännöllisesti katsoen lainkaan (28-%:inen TGI) maksimaalisesti siedetyllä annoksella. Kahdessa lisäkokeessa käyttäen samaa hoitoajoitusta antaen lääkeaine intraperitoneaalisesti yhdiste no. IS tuotti vain 50 %:n ja 23 %:n TGI:n. Optimaalisella osa-annoslääkityksellä annettuna :-9923 38 intravenoosisesti yhdiste no. IS kuitenkin osoitti aktiivisuutta Madisonin keuhkokarsinoomaa vastaan TGI:n ollessa 85 % maksimaalisesti siedetyllä annoksella. Lääkeaineen teho oli jonkin verran pienempi tällä hoitoajoituksella annettuna intraperitoneaalisesti (74-%:inen TGI maksimaalisesti siedetyllä annoksella). Madisonin keuhkokasvaimet mitattiin 12. tai 13. päivänä kahdessa erillisessä kokeessa, kun kasvainen koko kont-rollihiirissä oli keskimäärin 1571 ja 942 mm3 vastaavasti, mikä kuvasti tämän kasvaimen nopeaa kasvunopeutta. Näin ollen jopa vastustuskykyisen kasvaimen tapauksessa yhdisteen no. IS antaminen optimaalisena hoitolääkityksenä voi johtaa merkittävään kasvaimenkasvun inhibitioon.

Paksunsuolen karsinooma 26: Tässä hyvin tunkeutuvassa ja meta-taattisessa erilaistumattomassa paksunsuolen kasvaimessa, yhdiste no. IS tuotti vain marginaalista kasvaimen kasvun inhi-bitiota (72-%:inen TGI) annettaessa intraperitoneaalisesti yhdisteen maksimaalisesti siedetyllä annoksella päivien 1, 5, 9 ja 13 kohdalla. Kasvaimet mitattiin 19. päivänä, kun kontrolli-kasvaimet olivat keskimäärin 1052 mm3. Ei tiedetä, ilmentäisikö yhdiste no. IS hyvää aktiivisuutta tässä kasvainmuodossa, jos sitä annettaisiin yhdisteen optimaalisella osa-annoslääkityksellä.

Monelle lääkeaineelle resistentit alaliniat

Vaikkakin kaikkein merkittävin ongelma syövän hoidossa onkin tavallisten kasvainten luontainen epäherkkyys kaikille saatavissa oleville aineille tai lääkitysyhdistelmille, toisena pääongelmana on resistenttien kasvainsolujen syntyminen aikaisemmin herkistä kasvaimista. Pääosa potilaista, jotka kantavat "kemosensitiivejä" kasvaimista, kuten esimerkiksi keuhkojen ei-pikkusolusyöpä, munasarjan adenokarsinooma, äkillinen ei-lymfosyyttinen leukemia, rintarauhasen karsinooma ja tietyt lymfoomat, voidaan saattaa taudinlievenemisvaiheeseen yhdistelmälääkityksellä, jotka on tuotu käyttöön etulinjan hoitomuotona näille monimuotoisille taudeille. Useimmissa tapauksissa potilailla esiintyy kuitenkin taudin uusiutumista,

II

39 39 923 ja kyky indusoida myöhempi oireiden lieveneminen edes hyvin voimakkailla yhdistelmälääkkeillä alenee huomattavasti.

Nämä uusiutuvat kasvaimet osoittautuvat tunnusomaisesti vastustuskykyisiksi lääkeaineille, jotka ovat rakenteellisesti ja/tai mekaanisesti yhteenkuulumattomia lääkeaineiden kanssa, joita aluksi käytettiin oireiden lieventämisen indusoimiseksi. Tätä monta lääkeainetta koskevaa resistenssi - ilmiötä tutkitaan tällä hetkellä voimaperäisesti monessa laboratoriossa. Viimeaikaiset tutkimusaineistot viittaavat siihen, että monta lääkeainetta koskevan resistenssigeenin (mdr-geenin) vahvistaminen ja ilmentäminen, ja mdr-geenituotteen, P170-membraaniprote-iinin, läsnäolo liittyvät monta lääkeainetta koskevaan resistenssiin. P170 toimii tarkoituksellisesti ulosvirtauskuljetus-pumppuna substraattispesifisyyden ollessa uskomattoman vaih-televa. Viimeaikaisessa julkaisussa esitetään, että mdr-geenin voimakas ilmeneminen tietyissä aikaisemmin hoitamattomissa kasvaimissa, kuten esimerkiksi pheokromosytooma ja paksunsuolen adenokarsinooma, voisi vastata ainakin osaksi näiden kasvaimien luontaisesta lääkeaineresistenssifenotyypistä.

Näin ollen on tärkeätä identifioida uusia aineita, jotka omaavat suuren aktiivisuusasteen kasvaimia vastaan, joissa ilmentyy monta lääkeainetta koskeva resistenssifenotyyppi. Sellaiset aineet voisivat olla lupaavia edelleenkehittämisen kannalta ke-mosensitiivisten kasvainten hoidossa (so. ilmentämällä tehokkuutta aikaisemmin hoidetuissa potilaissa tai tappamalla mdr-alapopulaatio etulinjan yhdistelmälääkityksen komponenttina), kuin myös tällä hetkellä epäherkkien kasvaimen kannalta, jotka ovat epäherkkiä saatavissa oleville aineille johtuen mdr-gee-nille ominaisesta luontaisesta ilmenemisestä. Kamptotesiini on osoittautunut erikoiseksi siksi, että se on yksi muutamasta sytotoksisesta luonnontuoteaineesta, joka ei ole osoittanut ristiresistenssiä hyvin karakterisoiduissa kasvainalalinjoissa, joissa tulee esille mdr-fenotyyppi, so. P388-alalinjat, jotka ovat resistenttejä doksorubisiinille, vinkristiinille, amsak-riinille, elliptisiinille tai mitoksantronille. Koska useimmat lääkeaineet, joissa ilmenee ristiresistenssiä monelle lääkeai- 40 ι J > 3 neelle resistensseissä solulinjoissa, ovat emäksisiä, oli odotettavissa, että emäksisen sivuketjun lisääminen kamptotesii-nimolekyyliin, kuten yhdisteessä no.IS, johtaisi yhdisteen muodostumiseen, joka tulisi kuljetetuksi soluista ulos P179-glykoproteiinin välityksellä ja osoittautuisi tehottomaksi kasvaimissa, jotka ilmentävät mdr-geeniä.

Yhdisteen no. IS teho määritettiin hiirissä, jotka kantoivat P388:aa ja sen doksorubisiinille ja mitoksantronille resistenttejä alalinjoja (taulukko 8). Doksorubisiini ja mitomysiini c otettiin mukaan vertailun vuoksi. P388/doksorubisiini ja P388/mitoksantroni sisälsivät herkkyyden yhdisteelle no. IS. Nämä monelle lääkeaineelle resistentit solulinjat olivat odotetusti resistenttejä doksorubisiinille. P388/doksorubisiini oli myös resistentti mitomysiini c:lle. Yhdiste no. IS säilyttää näin ollen kasvainvastaisen aktiivisuuden monelle lääkeaineelle resistenteissä solulinjoissa, mikä on tunnusomaista kamptotesiinille.

Il

Taulukko 8 41 jy*23 P388-leukemian monta lääkeainetta koskevien resistenttien ala-linjojen kohdalla esiintyvä ristiresistenssin puute yhdisteelle no IS.

Yhdiste Annos P388 P388/Dok- P388/Mito-

(mg/kg, ip, ILS NCK sorubisiini ksantroni päivinä 1 ja 5)(%) (log) ILS NCK ILS NCK

_(%) (log) (%) (loa)

Yhdiste no IS 25 toksinen toksinen toksinen 15 228 6,5 176 6,0 107 5,7 9 211 6,5 90 2,2 79 3,6 5.4 128 3,5 33 0 57 2,1 3.2 67 1,0 14 0 29 0

Doksorubisiini 9 233 6,5 14 0 70 5.4 156 4,6 19 0 40 3.2 172 5,3 24 0 00 1,9 167 5,1 24 0 00 1.2 117 3,0 19 0 00

Mitomysiini C 7,5 178 5,5 52 0,5 104 5,5 4.5 156 4,6 62 1,0 136 6,5 2,7 128 3,5 52 0,5 54 1,8 1.6 106 2,6 48 0,3 29 0 1,0 83 1,7 29 0 14 0

Eliniän pidentyminen (ILS) perustuu keskihengissäpysymisaikaan 6 hiirtä käsittävissä ryhmissä. Nettokasvainsolukuolema (NCK) lasketaan keskihengissäpysymisajasta, koska hengissäpysymisaika on lineaarinen funktio kasvainsolukuorman logaritmista. Koska mitoksantroniresistentillä alalinjalla on pidempi kahdentumis-aika kuin kahdella toisella solulinjalla, joita käytettiin tässä kokeessa, pienempi ILS on kytkeytynyt suurempaan NCK:hon kuin P388- tai doksorubisiiniresistentissä solulinjassa.

42 3 9 9 2 3

Yhdisteen no. 1 raseeminen muoto

Kaikki tähän mennessä kuvaillut biologiset tutkimukset suoritettiin yhdisteen IS isomeerin kanssa, so. konfiguraatio C-20-asemassa, joka vallitsee luonnollisena esiintyvässä kamptote-siinissä ja 10-hydroksikamptotesiinissä. Yhdisteen no. 1 rasee-mista muotoa valmistettiin kokonaissynteesin avulla, ja sen kasvainvastainen aktiivisuus määritettiin hiirissä, jotka kantoivat ip P388-leukemiaa (taulukko 9). Yhdisteen no. IS raseeminen muoto, jota tämän jälkeen nimitetään yhdisteeksi no. 1RS, on hyvin aktiivinen P388-leukemiassa saaden aikaan 165-%:isen ILS:n, pitkän aikavälin henkiinjääneitä oli 1/6, intraperitone-aalisesti annetulla annoksella 29 mg/kg päivien 1 ja 5 kohdalla. Vaikka ei olekaan aivan yhtä aktiivinen kuin yhdiste no.

IS, yhdiste no. 1RS sisältää erinomaisen aktiivisuuden tässä kasvainmuodossa.

Taulukko 9

Yhdisteen no IS raseemisen seoksen aktiivisuus hiirissä, jotka kantavat ip P388-leukemiaa

Yhdiste no Annos ILS Pitkän aikavälin (mg/kg, ip, (%) henkiinjääneet _päivinä 1 ia 5)_ 1RS 29 165 1/6 14 135 7,2 80 3,6 30

Eläimiin istutettiin intraperitoneaalisesti 106 solua. Eliniän pidentyminen (ILS) perustuu keskihengissäpysymisaikaan 6 hiirtä käsittävissä ryhmissä, verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. Pitkän aikavälin hengissäpysyneet olivat kasvainvapni l a päivän 45 kohdalla.

Il 3 9 9 3 3 43

Yhdisteen no. IS eri suolamuodot

Yhdiste no. IS on vesiliukoinen johtuen emäksisen sivuketjun läsnäolosta asemassa 9, joka muodostaa suoloja happojen kanssa, kuten esimerkiksi etikkahappo, suolahappo ja metaanisulfonihap-po. Taulukoissa 2-9 kuvaillut kokeet suoritettiin yhdisteen no. IS joko asetaatti- tai hydrokloridisuolojen kanssa. Yhdisteen no. IS liukoista muotoa voidaan myös valmistaa yhdisteen no. IS sisältämän E-renkaan laktonin emäksisellä hydrolyysillä, jolloin muodostuu yhdisteen karboksylaattimuodon vesiliukoisia al-kalimetallisuoloja. Yhdisteen no. IS asetaatti-, hydrokloridi-, dihydrokloridi- ja natriumsuolojen suora vertailu suoritettiin hiirissä, jotka kantoivat iv L1210-leukemiaa (taulukko 10). Yhdisteet annettiin intravenoosisesti liuoksina 5-%:isessa dekstroosissa päivien 1 ja 5 kohdalla.

Dihydrokloridisuolaa muodostui lisättäessä ylimäärin suolahappoa, ja se on todennäköisesti tuloksena kinoliinitypen proto-naatiosta renkaassa B kuin myös dimetyyliaminometyyliryhmän typen protonaatiosta. Jokainen suolamuoto oli aktiivinen tässä kasvainmuodossa 100 %:n ILS:n ilmetessä asetaatin kohdalla, 175 %:n ILS:n hydrokloridin kohdalla, 133 %:n ILS:n dihydrokloridin kohdalla, ja 208 %:n ILS:n natriumsuolan kohdalla. Kolme hapanta suolaa olivat yhtä voimakkaat, so. niiden maksimaaliset siedetyt annostasot olivat identtiset 15 mg/kg. Natriumsuola oli kuitenkin noin 3,5 kertaa vähemmän voimakas, maksimaalisen siedetyn annoksen ollessa 54 mg/kg.

\ Γ' r\ ~7 :J >> ll 44

Taulukko 10

Yhdisteen no IS eri suolamuotoja koskeva vertailuaktiivisuus hiirissä, jotka kantavat iv L1210-leukemiaa

Yhdiste no Annos ILS

(mg/kg, ip, päivinä (%) _1 ia 5)_ IS (asetaattisuola) 25 toksinen 15 100 9 83 5.4 67 3.2 50 IS (hydrokloridisuola) 25 toksinen 15 175 9 125 5.4 92 3.2 50 IS (dihydrokloridisuola) 25 toksinen 15 133 9 83 5.4 50 3.2 50 IS (natriumsuola) 90 toksinen 54 208 32 133 19 100 12 67 6.5 33

Eläimiin siirrostettiin intravenoosisesti 106 solua. Eliniän pidentyminen (ILS) perustuu keskihengissäpysymisaikaan 6 hiirtä käsittävissä ryhmissä, verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin.

Il «s 39923

Farmaseuttinen koostumus

Farmaseuttiset koostumukset käsittävät tehokkaan, kasvainsolun kasvua inhiboivan määrän kaavan (I) mukaista yhdistettä ja inertin farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai laimenti-men. Näitä koostumuksia valmistetaan annosyksikkömuodossa, joka sopii parenteraaliseen tai oraaliseen antamiseen.

Kaavan (I) mukaista yhdistettä annetaan tavanomaisessa annos-tusmuodossa, joka on valmistettu yhdistämällä terapeuttisesti tehokas määrä (so., tehokas kasvaimen kasvua inhiboiva määrä) kaavan (I) mukaista yhdistettä ("aktiivinen aineosa") yleisten farmaseuttisten kantajien tai laimentimien kanssa tavanomaisten menettelyjen mukaisesti. Nämä menetelmät voivat käsittää sekoittamista, granulointia ja puristamista tai ainesten liuottamista, siten kuin tavoitellun valmisteen kannalta on tarkoituksenmukaista .

Käytettävä farmaseuttinen kantaja voi esimerkiksi olla kiinteä tai nestemäinen. Esimerkkejä kiinteistä kantajista ovat laktoosi, terra alba (valkea kaoliini), sakkaroosi, talkki, gelatiini, agar, pektiini, akaasia, magnesiumstearaatti, stearii-nihappo ja vastaavat.

Esimerkkejä nestemäisistä kantajista ovat siirappi, maapähkinäöljy, oliiviöljy, vesi ja vastaavat. Kantaja ja laimennin voivat samaan tapaan sisältää viivästyttävää ainetta, joita tunnetaan alalla hyvin, kuten esimerkiksi glyseryylimonostea-raatti tai glyseryylidistearaatti yksin tai vahan kanssa, etyyliselluloosa, hydroksipropyylimetyyliselluloosa, metyylime-takrylaatti ja vastaavat.

Käytettävissä on laaja valikoima farmaseuttisia muotoja. Näin ollen jos käytetään kiinteää kantajaa, valmiste voidaan tab-letoida, sulkea kovaan gelatiinikapseliin jauheen tai pelletin muodossa tai tabletin tai lääketabletin muodossa. Kiinteän kantajan määrä vaihtelee laajalti, mutta se on edullisesti noin 25 mg - noin 1 g. Jos käytetään nestemäistä kantajaa, valmiste-muotona on siirappi, emulsio, pehmeä gelatiinikapseli, steriili 46 89923 injektioliuos tai suspensio ampullissa tai pikkupullossa tai vedetön nestemäinen suspensio.

Pysyvän vesiliukoisen annosmuodon saamiseksi, kaavan (I) mukaisen yhdisteen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola liuotetaan orgaanisen tai epäorgaanisen hapon vesiliuokseen, kuten esimerkiksi 0,3 M meripihkahappo, tai, edullisesti sitruunahappo. Jos ei ole käytettävissä liukoista suolamuotoa, kaavan (I) mukainen yhdiste liuotetaan sopivaan myötäliuottimeen tai niiden yhdistelmiin. Esimerkkejä sellaisista sopivista myötäliuottimista ovat, mutta ei niihin rajoittuen, alkoholi, propyleeniglykoli, polyetyleeniglykoli 300, polysorbaatti 80, glyseriini ja vastaavat, pitoisuuksina, jotka vaihtelevat alueella 0-60 % kokonaistilavuudesta.

Koostumus voi myös olla aktiivisen aineosan suolamuodon liuos-muodossa sopivassa vesiväliaineessa, kuten esimerkiksi vesi tai isotoninen saliini tai dekstroosiliuokset. Niiden kaavan (I) mukaisten yhdisteiden osalta, jotka eivät sisällä emäksistä sivuketjua 9-asemassa, kuten yhdisteet no. 2S ja 10S (ks. rakenne taulukosta 2), E-renkaan laktonin alkalisessa hydrolyysissä muodostuvan karboksylaatin alkalimetallisuola antaisi liukoisen suolan, josta esimerkkinä on yhdisteen no. IS natriumsuola.

Tulee ymmärtää, että tämän keksinnön mukaisissa koostumuksissa käytettävien kaavan (I) mukaisten yhdisteiden varsinaiset edulliset annokset vaihtelevat sen mukaisesti, mikä on kyseinen käytettävä kompleksi, kyseinen formuloitava koostumus, antamistapa ja mikä on kohta, isäntä ja tauti, jota hoidetaan. Optimi-annostukset tiettyä olosuhdeasetelmaa varten voidaan selvittää alaa tuntevien toimesta käyttäen tavanomaisia annosmääritysko-keita, edellä olevien koetulosten valossa. Parenteraalisessa antamisessa on yleisesti käytettävä annos noin 20 - noin 150 mg/m2 kehonpintaa päivää kohti 1-5 päivän ajan, toistamalla edullisesti noin joka neljäs viikko neljänä hoitokuurina. Oraalisessa antamisessa yleisesti käytettävä annos on noin 20 noin 150 mg/m2 kehonpintaa päivää kohti 1-5 päivän ajan, toistaen hoitokuureja sopivin välein.

47 : o c o i

Seuraavat esimerkit valaisevat kaavan (1) mukaisten yhdisteiden kemiallista valnistusta.

Otaksutaan, että ilman lisävalmisteluja alaa tunteva voi käyttäen hyväksi edellistä kuvausta käyttää esillä olevaa keksintöä koko laajuudessaan. Seuraavia esimerkkejä tulee sen vuoksi tulkita ainoastaan valaisevina eikä millään tavalla esillä olevan keksinnön aluetta rajoittavina.

Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden synteesi

Seuraavissa synteesiesimerkeissä lämpötila ilmaistaan Celsiusasteina (°C). Ellei toisin ole osoitettu, kaikki lähtöaineet saatiin kaupallisista lähteistä.

Esimerkki 1 (20 S) 1,2.6.7-tetrahvdrokamptotesiinin valmistaminen

Kamptotesiini (32,0 g, 0,092 moolia), jota oli saatu Tainjain SK&F Ltd;stä, Tainjain, Kiina, yhdistettiin Pt°:n [jota oli valmistettu esipelkistämällä 8,0 g amorfista Pt02:ta 800 mlrssa HOAc:a 1,5 tunnin ajan (h) 1 ilmakehän (atm.) paineessa H2:a] ja HOAcrn (1,6 1) kanssa. Pelkistäminen suoritettiin 1 ilmakehän H2-paineessa 8,5 tunnin aikana, Selmalla kun seosta sekoitettiin voimakkaasti. Tämän ajan kuluttua, teoreettinen määrä H2:ta oli adsorboitunut (hieman enemmän kuin 4,1 h), ja vedynkulutus oli hidastunut huomattavasti. Reaktiosta poistettiin kaasut Ar-virrassa suunnilleen 10 minuutin (min.) aikana, ja seos suodatettiin sen jälkeen seliittikerroksen läpi, joka pestiin H0Ac:n kanssa (200 ml).

Muodostunutta liuosta käytettiin välittömästi seuraavaan reaktioon, jota on kuvailtu esimerkissä 2.

Esimerkki 2 (20 S) 10-hvdroksikamDtotesiinin valmistaminen

Voimakkaasti sekoitettavaan 1,2,6,7-tetrahydrokamptotesiinin liuokseen, jota oli valmistettu kuten edellä esimerkissä 1 on 48 9 9 23 kuvailtu, lisättiin Pb(OAc)4:a (64 g, 0,144 moolia) yhdessä erässä. Reaktiota sekoitettiin Ar-ilmakehässä 30 min. ajan, ja kaikki Pb(0Ac)4 oli liuennut. Konsentroinnissa saatiin kumimai-nen jäännös, jota hierrettiin jääkylmän veden kanssa (1 1), jolloin saatiin vaalean ruskeata kiinteää ainetta, joka suodatettiin, pestiin vielä jääkylmällä vedellä (200 ml), puristettiin kuivaksi kumipainikkeella ja ilmakuivattiin yli yön. Muodostunut osittain märkä tuote sisälsi 44,3 % 10-hydroksi-kamptotesiiniä, 26,9 % 10-asetoksikamptotesiiniä, ja 23,1 % kamptotesiiniä, perustuen korkeapainenestekromatografia-analyysiin (HPLC) (Whatman Partisil 5 ODS3 Rac II 60% CH30H/H20) .

Raaka seos yhdistettiin 1,7 l:n kanssa 50-%:ista vedellistä HOAc:a ja keitettiin palautusjäähdytyksessä yli yön. Reaktio jäähdytettiin ja konsentroitiin suunnilleen 50-100 ml:ksi. Jääkylmää H20:ta lisättiin, ja sakka suodatettiin, pestiin vielä jääkylmällä H20:lla (200 ml), puristettiin kuivaksi kumipainikkeella, ja kuivattiin kovassa alipaineessa 2 päivän ajan, jolloin saatiin, 1,2 % ainetta, joka sisälsi 70,9 % 10-hydroksikamptotesiiniä, 1,2 % 10-asetoksikamptotesiiniä, ja 21,3 % kamptotesiiniä, perustuen HPLC-analyysiin.

Esimerkki 3 (20 S) 9-dimetyyliaminometyyli-10-hydroksikamptotesiinin ase-taattisuolan valmistaminen 10-hydroksikamptotesiini (20 g, jossa määritettynä 62 % 10-hyd-roksikamptotesiiniä ja sisältäen sen vuoksi 12,4 g, 34,1 mmoolia 10-hydroksikamptotesiiniä), jota oli valmistettu kuten esimerkissä 2 on kuvailtu, yhdistettiin HOAcrn (620 ml), 37-%:isen vedellisen CH20:n (12,4 ml, suunnilleen 149 mmoolia) ja 40-%.*sen vedellisen dimetyyliamiinin (12,4 ml, suunnilleen 109 mmoolia) kanssa ja sekoitettiin suunnilleen 18 tuntia, ja ohut-levykromatografia (tie) osoitti, että jonkin verran lähtöaineesta oli jäljellä (tie 9:1 CH2C12, CH30H piihappogeelillä). Tämä systeemi on sopiva 10-hydroksikamptotesiinin häviämiη<·π seuraamiseksi mutta ei tuotteen muodostuksen tarkkailuun. 37-%:ista vedellistä CH20:ta (6 ml, suunnilleen 72 mmoolia), ja 11 49 « Λ n -7 ? J > 2 3 40-%:ista vedellistä dimetyyliamiinia (6 ml, suunnilleen 53 mmoolia) lisättiin vielä, ja sekoittamista jatkettiin vielä 24 tuntia. Reaktioseos konsentroitiin kuivaksi, hierrettiin 0,5-%:isen vedellisen HOAcrn kanssa (1 1), suodatettiin, ja kiinteä aine pestiin vielä 0,5-%:isella vedellisellä HOAc:llä (500 ml). Kuivattu kiinteä aine painoi 6,3 g ja oli HPLC:n mukaan 94-%.isesti talteensaatua kamptotesiiniä (Whatman Partisil 10 ODS 3 50 % CH30H/H20, retentioaika 9 min.). Yhdistetyt vesipitoiset suodokset uutettiin EtOAc:n (3 x 600 ml) ja petrolieetterin (600 ml) kanssa ja sen jälkeen lyofilisoitiin. Raakajäännöksen kromatografointi toteutettiin injisoimalla ainetta liuottimessa A (liuotin A = 99 % H20, 1 % HOAc) (600 ml) ja eluoimalla nopeudella 350 ml/min. 50 mm x 600 mm teräskolonnin läpi, johon oli pakattu 680 g Whatman Partisil 40 ODS 3:a 34 min. lineaarisella gradientilla 100-%:isesta liuottimesta A 40-%:iseen liuottimeen B (liuotin B = 99 % HC30H, 1 % HOAc). Kromatogra-fointia tarkkailtiin aallonpituudessa 410 nm, ja 1 l:n fraktioita otettiin talteen, ja ne, jotka määritettiin >99-%:isesti puhtaiksi analyyttisen HPLC:n avulla (Whatman Partisil 10 ODS 3 50 % CH30H/H20, retentioaika 9 min.) kerättiin yhteen, konsentroitiin ja liuotettiin uudelleen minimimäärään 0,5-%:ista vedellistä H0Ac:a ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 10,58 g (62 %) otsikkoyhdistettä.

IR (KBr) 3400, 2960, 1740, 1650, 1590 cm’1 . 1H NMR (CDC13/CD3 OD) 1,04 (t,3,J=7Hz,C18), 1,96(q,2,J=7Hz,C19), 2,01(s,3,CH3C0 ) 2,50 (s,6, (CH3)2NH) , 4,20(s,2,ArCH2N), 5,28 (d,1,J=19Hz,C17), 5,29(s,2,C5), 5,50(d,1,J=19Hz,C17), 7,42(d,J=9Hz,Cll), 7,67(s,1,C14), 8,05(d,J=19Hz,C12), 8,51(s,C7). Analyysi laskettu kaavalle C23H23N305 1 HOAc 1 H20 (mp. = 515,5) : C,58,24; H,5,67; N,8,15. Todettu: C,58,55; H;5,22; N,8,54. Pb-analyysi < 14,5 ppm.

Otsikkotuotteen mukaista lisämateriaalia, joka oli >90-%:isen puhdasta HPLC:n perusteella (ks. edellä), konsentroitiin kuivaksi ja uudelleenkromatografoitiin myöhemmin samanlaisen materiaalin kanssa, jota oli eristetty muista ajoista.

50 M 9 9 9 ^

Esimerkki 4 (20 S) 9-morfoiiinimetyyli-10-hvdroksikamptotesiinin asetaat-tisuolan valmistaminen 10-hydroksikamptotesiini (100 mg, 0,27 moolia), valmistettuna esimerkissä 2 kuvaillulla tavalla, 37-%:inen vedellinen CH20 (0,5 ml), morfoliini (0,1 ml) ja 2:1 HOAc/EtOH (10 ml) yhdistettiin ja niitä sekoitettiin yli yön. 10-hydroksikamptotesiini oli reagoinut (tie, piihappogeeli, 9:1 CH2C12/CH30H) , ja reak-tioseos konsentroitiin kuivaksi, liuotettiin noin 5 ml:aan H2 0:ta, joka sisälsi useita tippoja HOAc:a, ja liukenematon aines suodatettiin pois. Suodos lyofilisoitiin, ja lyofilisaat-ti kromatografoitiin (15 mm x 250 mm piihappo, keskipaineneste-kromatografia (MPLC), eluoiden CH2Cl2:n kanssa, joka sisälsi 0-2 % CH3OH:a), jolloin saatiin jäännös, joka liuotettiin laimeaan vedelliseen H0Ac:iin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 53 mg (38 %) otsikkoyhdistettä.

IR (KBr) 3400, 3100, 2960, 2920, 2840, 1740, 1650, 1590 cm'1 H NMR (CDCI3/CD3OD) δ 1,12 (t,3,J=7Hz,C18), 1,94 (q,2,J=7Hz,C19), 2,73(m,4,morphilino- CH2N), 3,83 (m,4,morphilino-CH20) 4,19 (s,2,ArCH2N) , 5,26(s,2,C5), 5,25(d,1,J=16Hz,C17), 576(dl,J=l6Hz,C17), 7,27(s,1,C14), 7,40(d,l,J=8Hz,Cll), 8,07(dl,J=8Hz,C12), 8,36(s,1,C7). Analyysi laskettu kaavalle C25H25N3°e CH3C02H (mp. = 525,6) : C,61,71; H,5,95; N,8,00. Todettu: C,61,30; H,5,44; N,8,35.

Esimerkki 5 (20 S) 9-N-metyylipiperatsinyylimetyvli-10-hydroksikampto-tesiinin asetaattisuolan valmistaminen 10-hydroksikamptotesiini (100 mg, 0,27 mmoolia), valmistettuna esimerkissä 2 kuvaillulla tavalla, 2:1 HOAc/EtOH (10 ml), 37-%:inen vedellinen CH20 (0,5 ml) ja N-metyylipiperatsiini (0,1 ml) yhdistettiin ja seosta sekoitettiin 20 tunnin ajan. 10-hydroksikamptotesiini oli reagoinut (tie 9:1 CH2C12/CH30H), ja reaktioseos konsentroitiin, liuotettiin H20:hon (50 ml) ja pestiin EtOAc:n kanssa (5 x 20 ml) ja petrolieetterin kanssa

II

3 9 52 3 51 (20 ml), ja vesifaasi lyofilisoitiin. Jäännös liuotettiin uudelleen laimeaan vedelliseen HOAc:iin ja kromatografoitiin MPLC:lla (Whatman Partisil 40 0DS3, 9 mm x 250 mm kolonni) eluoiden 0-20-%:lla CH30H:lla H20:ssa, joka sisälsi 0,02 % HOAc:a. Tavoiteltu aines koottiin yhteen ja konsentroitiin, ja jäännös lyofilisoitiin, jolloin saatiin 67 mg (46 %) otsikkoyh-distettä.

IR (KBr) 3400, 2960, 2910, 1740, 1650, 1590 cm'1 . 1H NMR (CDCI3/CD3OD) δ 1,03 (t, 3 , J=7Hz, C18) .

1,89(q,2,J=7Hz), 2,02 (s, >3 , CH3C02H) , 2,37 (s, 3 , NCH3) , 2,65(m,8, piperatsiini-CH2) , 4,21(s,2,ArCH2) , 5,26(S,2,C5), 5,30(d,1,J=16Hz,C17), 5,71(d,1,J=16Hz,C17), 7,45(d,1,J=7Hz,Cll), 8,05(d,1,J=7Hz,C12) , 8,47(s,1,C7) , Laskettuna: C26H28N4051 1/2 HOAc 1/4 H20 (mp=528,1); C,61,41; H,6,01, N,10,61. Todettu: C,61,62; H,5,74; N, 10,93.

Esimerkki 6 (20 S) 9- (4'-piperidinopiperidinvyli)metyyli-10-hydroksikamp-totesiinin asetaattisuolan valmistaminen 10-hydroksikamptotesiiniä (100 mg, 0,27 mmoolia), valmistettuna esimerkissä 2 kuvaillulla tavalla, 4-piperidinipiperidiiniä (100 mg, 0,60 mmoolia), 37-%:ista vedellistä CH20:ta (0,5 ml) ja 2:1 HOAc/EtOH:a (10 ml) sekoitettiin 20 tuntia. 10-hydroksi-kamptotesiini oli reagoinut (tie, piihappogeeli, 9:1 CH2C12/ CH3OH), ja reaktioseos konsentroitiin, liuotettiin l-%:iseen vedelliseen etikkahappoon, suodatettiin ja lyofilisoitiin. MPLC-.llä (Whatman Partisil 40 0DS3, 9 x 250 mm kolonni), eluoiden H20:n kanssa (100 ml) ja sen jälkeen 0- 80- %:isella CH30H:lla 0,02-%:isessa vedellisessä HOAc:ssa saatiin 44 mg (30 %) otsikkoyhdistettä lyofilisoinnin jälkeen. IR (KBr) 3400, 2940, 1745, 1660, 1590 cm'1.1H NMR (CDCI3/CD3OD) (t,3,J=7Hz,C18), 1,3 - 3,3 (m,19, piperidiini, C19), 4,11 (s,2,CH2N) , 5,21 (s,2,C5), 5,25 (d,l,J=l6Hz, C17), 5,70 (d,1,J=16Hz,C17), 7,85 (d,1,J=7Hz,Cll), 7,59 (s,1,C14),8,00 (d,1,J=7Hz,C12), 8,35 (s,l,C7). Laskettuna C31H36N405 1 1/2 H20 52 . '59923 (mp.=631,7):C,58,94; H,6,22; N,8,81. Todettu: C,59,02; H,6,44; N, 8,53 .

Esimerkki 7 (20 S) 9-(21-hydroksietvyliamino)metyyli-10-hydroksikamptote-siinin asetaattisuolan valmistaminen 10-hydroksikamptotesiiniä (200 mg, 0,55 mmoolia), valmistettuna esimerkissä 2 kuvaillulla tavalla, paraformaldehydiä (16 mg, O, 55 mmoolia), etanoliamiinia (61 mg, 1,1 mmoolia), ja HOAc:a (6 ml) sekoitettiin 48 tunnin ajan, minkä jälkeen enin 10-hyd-roksikamptotesiinistä oli reagoinut. Reaktioseos konsentroitiin, liuotettiin uudelleen laimeaan HOAc:n (200 ml) ja pestiin EtOAc:n kanssa (4 x 30 ml) ja petrolieetterin kanssa (30 ml), ja muodostunut vesiliuos lyofilisoitiin. Raaka lyofilisaatti liuotettiin H20:hon (50 ml). MPLC:llä (Whatman Partisil 40 0DS3, 15 x 250 mm kolonni), eluoiden H20:lla (100 ml), minkä jälkeen 0-10-%:isella CH30H:lla 0,02-%:isessa H0Ac:ssa H20:ssa, saatiin 88 mg (33 %) otsikkoyhdistettä lyofilisoinnin jälkeen. IR (KBr) 3400, 2980, 2940, 1750, 1570 cm'1 . 1H NMR (CDCI3/CD3OD) δ 1,03(t,3,J= 7Hz,C18) , 1,89(q,2,J=7Hz,C19) , 2,00(s,3,H0Ac), 3,03(m,2,CH2NH), 3,75 (m,2,CH2OH), 4,49 (S,ArCH2NH), 5,24(s,2,C5), 5,30(d,1,J=16Hz,C17), 5,70(d,1,J=16Hz,C17), 7,41 (d,1,J=8Hz,Cll), 7,61(s,1,C14), 8,00 (d,1,J=8Hz,C12), 8,48 (s,l,C7). Laskettuna C23H23N306 HOAc 1 7/8 H20 (mp.=531,3):C,56,52; H,5,83; N,7,91. Todettu: C,56,07; H,5,40; N,8,27.

Esimerkki 8 (20 S) 9-trimetyyliammoniummetyyli-lO-hYdroksikamptotesiinin metaanisulfonaattisuolan valmistaminen 9-dimetyyliaminometyyli-10-hydroksikamptotesiinin asetaattisuo-laa (65 mg, 0,14 mmoolia), valmistettuna esimerkissä 3 kuvaillulla tavalla, liuotettiin CH2Cl2:een (noin 70 ml) ja suodatettiin. Suodos yhdistettiin metyylimetaanisulfonaatin (1 ml) kanssa, jäähdytettiin ja konsentroitiin osittain argon(Ar)-virran alla. Neljän tunnin kuluttua liuotin konsentroitiin 1/2-

II

53 8992 5 tilavuuteen ja jäähdytettiin. Sakka suodatettiin, liuotettiin H20:hon (10 ml), pestiin EtOAcrllä (3 x 10 ml) ja sen jälkeen petrolieetterillä (10 ml) ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 50 mg (60 %) otsikkoyhdistettä. IR (KBr) 3400, 2950, 2900, 1760, 1660, 1600 cm'1 . 1H NMR (CDCI3/CD3OD) δ l,03(d,3,J= 7Hz,C18), 2,01(q,2,J=7Hz,C19), 2,78 (s,>3,CH3SO3) , 2,9 4(S,9,N(CH3)3) , 4,72(s,2,ArCH2N) , 5,20(3,2,05), 5,22(d,1,J=16Hz,C17), 5,67(d,1,J=16Hz,C17), 7,62(d,J=7Hz,Cll), 7,71(s,C14), 8,16(d,1,J=7Hz,C12), 8,89(s,1,C7). Laskettuna 024Η25Ν305·1 1/2 CH3SO3H·2 H20 (mp.=615,7); 0,49,74; H,5,72; N,6,82.

Todettu: 0,49,36; H,5,15; N,7,53.

Esimerkki 9 (20 s) 9-formyyli-10-hvdroksikamptotesiinin valmistaminen 10-hydroksikamptotesiiniä (100 mg, 0,27 mmoolia), valmistettuna esimerkissä 2 kuvaillulla tavalla, heksametyyleenitetra-amiinia (0,80 g, 5,5 mmoolia) ja trifluorietikkahappoa (TFA) (15 ml) keitettiin palauttaen argonin alla 20 tuntia. Reaktio konsentroitiin, yhdistettiin veden kanssa (15 ml) ja sekoitettiin 1 tunnin ajan. H20:ta (75 ml) lisättiin, ja pH säädettiin arvoon 8,4 lisäämällä NaHC03:a. Vesifaasi pestiin EtOAcrlla (3 x 75 ml), tehtiin happameksi pH-arvoon 1,5 3 N HCl:n avulla ja uutettiin sen jälkeen EtOAc:lla (5 x 75 ml). Yhdistettyjä orgaanisia uutteita pestiin 1 N HClrllä (5 x 75 ml), H20:lla (75 ml), ja kyllästetyllä vesipitoisella NaClrlla (25 ml), ja konsentroitiin. Jäännös puhdistettiin sen jälkeen flash-kromato-grafiällä (1 cm x 15 cm piihappo, esiabsorboiden raakamate-riaali 1 cm x 1 cm Na2S04 täytteeseen). Tuote eluoitiin 1-%:isella CH30H:lla CH2Cl2:ssa, jolloin saatiin 50 mg (47 %) otsikkoyhdistettä. Analyyttisesti puhdas näyte saatiin fraktio-saostuksella suunnilleen 25-%:isesta CH3OH:sta CH2Cl2:ssa, jäähdyttämällä hitaasti ja konsentroimalla typpivirran alla. IR (KBr) 3400, 3100, 2950, 1755, 1660, 1600 cm'1 · 1HNMR (CCI3/CD3OD) δ 1,04 (t,3,J=7Hz,C18), 1,96 (d,2,J= 7Hz, C19), 5,32 (d,1,J=14Hz, C17), 5,33 (s,2,C5), 5,68 (d,1,J=14Hz C17), 7,50 (d,1,J=9Hz,Cll), 7,67 (s,l,C14), 8,33 (d,1,J=9Hz,C12), 54 . 39923 9,34 (s,1,C7). 10,85 (s,l,CHO). Laskettuna C21H16N2061H20 (mp.=410,38); C,61,46; H,4,42; N,6,83. Todettu: C,61,09; H,4,17; N,6,52.

Esimerkki 10 (20 S) 9-syklopropYvliaminometyyli-10-hydroksikamptotesiinin hydrokloridisuolan valmistaminen 10-hydroksikamptotesiinin (254 mg, 0,7 mmoolia), valmistettuna esimerkissä 2 kuvaillulla tavalla, 37-%risen vesipitoisen formaldehydin (1,0 ml), syklopropyyliamiinin (400 mg, 0,7 mmoolia) jääetikassa (16 ml) ja etanolin (8 ml) seosta sekoitettiin yli yön ympäristön lämpötilassa ja konsentroitiin alipaineessa kuivaksi. Jäännös hierrettiin veden kanssa, suodatettiin ja kuivattiin, jolloin saatiin 260 mg (75 %:n saanto) otsikkoyhdis-tettä asetaattisuolana, joka muutettiin otsikon mukaiseksi hydrokloridisuolaksi hiertämällä 0,1 N HCl:n kanssa. Anal. (C24H23N3°5 · HC1-3H20). Laskettu: C, 55,01; H, 5,57; N, 8,02. Todettu: C, 54,94; H, 5,18, N, 8,18-½ NMR (D20) δ 0,96 (m, 7), 2.1 (m, 2), 2,8 (m, 1), 4,6 (s, 2), 4,8 (s, 2), 5,2 (s, 2), 7,2 (s, 1), 7,5 (q, 2), 8,6 (s, 1).

Esimerkki 11 (20 S) 9-etoksimetwli-10-hydroksikamptotesiinin valmistaminen 10-hydroksikamptotesiinin (364 mg, 1,0 mmoolia), valmistettu kuten esimerkissä 2 on kuvailtu, dimetyyliamiinihydrokloridin (90 mg, 1,1 mmoolia) ja 37-%risen vedellisen formaldehydin (1,5 ml) seosta keitettiin palautusjäähdyttäen 95-%:isessa etanolissa (25 ml) 51/2 tuntia. Reaktio konsentroitiin pieneen tilavuuteen, ja saostunut tuote otettiin talteen ja kuivattiin. Puhdistettaessa piihappogeelikromatografiällä, eluoiden 3-%risen MeOH.-n kanssa CH2Cl2:ssa, saatiin 85 mg (20 %:n saanto) otsikkoyhdistettä. Anal. (C23H22N206). Laskettu: C, 62,08; H, 5,27; N, 6,29. Todettu: C, 61,80; H, 5,22; N, 6,12. FAB-mas-saspektri: m/e 423 (MH+) 1H NMR (DMSO) ö 0,85 (t, 3). 1,1 (t, 3), 1,9 (m, 2), 3,5 (s, 2), 4,8 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7.2 (s, 1) , 7,7 (m, 2) , 8,6 (s, 1) .

li 55 3 9 9 2 3

Esimerkki 12 (20 S) 9-(N-metyylianiliinimetwli)-10-hvdroksikamptotesiinin valmistaminen 10-hydroksikamptotesiinin (254 mg, 0,7 mmoolia), valmistettuna esimerkissä 2 kuvaillulla tavalla, 37-%:isen vedellisen formaldehydin (1,0 ml), N-metyylianiliinin (0,75 ml, 0,7 mmoolia) jääetikkahapossa (16 ml) ja etanolin (8 ml) seosta sekoitettiin vallitsevassa lämpötilassa 40 tunnin ajan. Öljyksi konsentroin-nin jälkeen saatiin aikaan osittainen puhdistaminen piihappo-geelikromatografiän avulla, eluoiden 1,2- ja 3-%:isella MeOH:lla CH2Cl2:ssa. Tuotefraktiot sisälsivät vielä N-metyy-lianiliinia. Lisäpuhdistumista saatiin aikaan käyttämällä pii-happogeeli-MPLC-kolonnia, ja tuote eluoitiin 2-%:isella MeOHrlla CH2Cl2:ssa. Tuotefraktiot yhdistettiin ja konsentroitiin alipaineessa, jolloin saatiin 77 mg (24 %) otsikkoyhdis-tettä keltaisena kiinteänä aineena. Anal. (C28H25N305 ·1,2 H20) . Laskettu: C, 66,58; H, 5,47; N, 8,32. Todettu: C, 66,97; H, 5,69; N, 7,91. DCI-massaspektri m/e 484 (MH+) . XH NMR (CDC13) Ö 1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 2,8 (s, 3), 5,0 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,5 (q, 2), 6,9 (m, 5), 7,5 (s, 1), 7,9 (q, 2), 8, 4 (s, 1).

Esimerkki 13 (20 S) 9-svkloheksyyliaminometyyli-10-hydroksikamptotesiinin hydrokloridisuolan valmistaminen 10-hydroksikamptotesiinin (364 mg, 1,0 mmoolia), valmistettuna esimerkissä 2 kuvaillulla tavalla, 37-%:isen vedellisen formaldehydin (1,5 ml), sykloheksyyliamiinin (1,3 ml, 10 mmoolia) jääetikkahapossa (25 ml) ja etanolin (12 ml) seosta sekoitettiin yli yön vallitsevassa lämpötilassa ja konsentroitiin alipaineessa kuivaksi. Jäännös puhdistettiin käänteisfaasiko-lonnissa (MPLC) eluoiden 15-%:isella vedellisellä MeOH:lla, joka sisältää 0,02 % jääetikkahappoa. Otsikkoyhdistettä saatiin asetaattisuolana pieneen tilavuuteen konsentroinnin ja lyofi-lisoinnin jälkeen (250 mg, 47 %). Asetaattisuola muuteli iin otsikon mukaiseksi hydrokloridisuolaksi lisäämällä 0,1 N HCl:a, ja suola otettiin talteen suodattamalla. Anal. (C27H29N305·HC1.1 . 0 9 9 2 3 56 1/8 H20). Laskettu: C 60,93, H, 5,98; N, 7,75. 1H NMR (DMSO) δ 0,9 (t, 3), 1,0-2,0 (m, 10), 3,1 (S, 1), 4,5 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,2 (s, 1), 7,9 (q, 2), 8,9 (s, 1).

Esimerkki 14 (20 S) 9-N.N-dimetyvliaminoetyYlioksimetyyli-lO-hvdroksi-kamptotesiinin hvdrokloridisuolan valmistaminen 9 -dimetyyliaminoetyy1i-10 -hydroks ikamptotes i inivapaaemäksen (100 mg, 0,2 mmoolia), valmistettuna esimerkissä 21 kuvaillulla tavalla, seosta 2-dimetyyliaminoetanolissa (4 ml), joka sisältää 3 tippaa 3 N HCl:a, kuumennettiin argonin alla 80°C:ssa 24 tunnin ajan. Puolikiinteätä reaktioseosta käsiteltiin H20:n (5 ml) ja isopropanolin (10 ml) kanssa, sekoitettiin ja suodatettiin, jolloin saatiin 60 mg (59 %) otsikon mukaista yhdistettä. Anal. (C25H27N306 -HCl-0,5 H20) . Laskettu: C, 58,77; H, 5,72; N, 8,25. Todettu: C, 58,94. H, 4,92; N, 7,90. XH NMR (DMSO) δ O, 9 (t,3), 1,85 (m, 2), 2,3 (s, 6), 3,3 (s,2), 4,1 (s,2), 5,2 (S,2), 5,4 (S,2), 7,3 (s,1) , 7,4 (d, 1), 8,0 (d,l), 8,7 (s,l).

Esimerkki 15 (20 S) g-N-N-dimetYyliaminoetyYlitiometyyli-lO-hydroksi-kamptotesiinin hydrokloridisuolan valmistaminen 9-dimetyyliaminometyyli-10-hydroksikamptotesiinin hydroksiklo-ridisuolan (100 mg, 0,2 mmoolia), valmistettuna olennaisesti kuten on kuvattu esimerkissä 18, ja 2-dimetyyliaminoetaanitio-lin (13 ml) seosta kuumennettiin 85°C:ssa argonin alla 5 tuntia. Liukenematon kiinteä aine (ylimäärä tioli) poistettiin suodattamalla, ja suodos konsentroitiin alipaineessa öljymäi-seksi jäännökseksi, joka puhdistettiin käyttäen käänteisfaasi-MPLC:tä. Tuote eluoitiin käyttämällä 5-%:ista ja 10-%:ista MeOH:a H20:ssa, jolloin saatiin 45 mg (41 %) otsikkoyhdistettä keltaisena kiinteänä aineena. Anal. (C25H28N305S.HC1.3H20). Laskettu: C, 49,34; H, 5,79; N, 6,90.

Todettu: C, 48,98; H, 5,82; N, 6,54. XHNMR (D20) δ 1,0 (t,3), 1,9 (m,2), 2,8 (S,6), 4,4 (s,2), 5,3 (S,2), 7,1 (d,l), 7,2 (s,1), 7,6 (d,1), 8,2 (s,l).

. S 9 9 2 3 57

Esimerkki 16 (20 S) 9-N.N-dimetwliaminoetwliaininometvyli-lO-hvdroksi-kamptotesiinin dihvdrokloridisuolan valmistaminen 10-hydroksikamptotesiinin (364 mg, 1,0 mmoolia), valmistettuna esimerkissä 2 kuvaillulla tavalla, N,N-dimetyylietyleenidiamii-nin (100 mg, 1,1 mmoolia), 37-%:isen vedellisen formaldehydin (1,5 ml) jääetikkahapossa (25 ml) ja etanolin (10 ml) seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 64 tuntia. Liuottimet poistettiin alipaineessa, ja kiinteää jäännöstä käsiteltiin veden kanssa (10 ml) ja isopropanolin kanssa (10 ml), joka sisälsi 3 N HCl:a (3 ml). Hienojakoisena saostunut kiinteä aine otettiin talteen, pestiin isopropanolin kanssa ja kuivattiin, jolloin saatiin 218 mg (40 %:n saanto) otsikkoyhdistettä. Anal. (C25H28 N405. Laskettu: C, 55,87; H, 5,63; N, 10,42. Todettu: C, 55,91; H, 5,72; N, 9,86. 1HNMR (CDOD) δ 1,0 (t,3), 1,9 (m,2), 2,9 (s,6), 4,5 (s,2), 5,1 (m,4), 5,4 (q,2), 7,3 (d,l), 7,5 (s,l), 7,8 (d,1), 8,4 (s,l).

Esimerkki 17 (20 R.S)-9-dimetyyliaminometyvli-10-hvdroksikamptotesiinin asetaattisuolan valmistaminen

Otsikkoyhdistettä valmistetaan kuten on kuvailtu esimerkissä 3, paitsi että lähtömateriaalina on raseeminen 10-hydroksikampto-tesiini, jota on valmistettu Wanin et ai. menetelmän mukaan, J. Med. Chem., 23, 554 (1980).

Esimerkki 18 (20 S) 9-dimetwliaminoetwli-lO-hydroksikamptotesiinin monohydrokloridisuolan valmistaminen 9-dimetyyliaminometyyli-10-hydroksikamptotesiinin asetaatti-suolaa, valmistettuna kuten on kuvailtu esimerkissä 3, jont a analysoitiin 2,5 ekvivalenttia etikkahappoa ja 0,75 ekvivalenL tia vettä (8,5 g, 14,5 mmoolia perustuen molekyylipainoon 585), liuotettiin 0,1 N suolahappoon (170 ml, 17 mmoolia), lyofili-soitiin ja pumpattiin korkeassa vakuumissa kolmen päivän ajan, 58 B 9 92 3 jolloin saatiin 8,3 g otsikkoyhdistettä. *H NMR (CDC13/CD30D) 6 1,05 (t, 3, J = 7,5), 1,98 (q, 2, J = 7,5), 2,95 (s, 6), 4,77 (s, 2), 5,33 (s, 2), 5,36 (d, 1, J = 16), 5,62 (d, 1, J = 16), 7,59 (d, 1, J = 9), 7,66 (s, 1), 8,20 (d, 1, J = 9), 8,86 (s, 1). Anal. (CjsH^NjOj .1HC1.3 H20) .

Laskettu: C, 53,96; H, 5,91; N, 8,21; Cl, 6,92.

Todettu: C, 53,68; H, 5,61; N, 8,16; Cl, 6,84.

Esimerkki 19 (20 S) 9-dimetyyliaminoetyyli-10-hydroksikamptotesiinin dihydrokloridisuolan valmistaminen 9-dimetyyliaminometyyli-10-hydrokamptotesiinin asetaattisuolaa (0,389 g 1,07 mmoolia HPLC-analyysillä), valmistettuna kuten on kuvailtu esimerkissä 3, liuotettiin 0,4 N HCl:ään (6 ml, 2,4 mmoolia), lyofilisoitiin ja pumpattiin korkeassa alipaineessa 40 tuntia, jolloin saatiin 0,269 g otsikkoyhdistettä. 'HNMR (CDC13/CD30D) 6 1,05 (t, 3, J = 7,5), 1,92 (q, 2, J = 7,5), 3,01 (S, 6), 4,85 (s, 2), 5,31 (d, 1, J = 16), 5,36 (s, 2), 5,65 (d, 1, J = 16) 7,64 (d, 1, J = 9), 7,73 (s, 1), 8,23 (d, 1, J = 9), 9,07 (s, 1). Anal. (C^H^NjOj^HCl. 3 HjO) .

Laskettu: C, 50,37; H, 5,70; N, 7,66; Cl, 12,93. Todettu: C, 50,76; H, 5,64; N, 7,57; Cl, 12,61.

Esimerkki 20 (20 S) 9-dimetvyliaminoetyyli-10-hydroksikainptotesiinin natriumsuolan valmistaminen

9-dimetyyliaminometyyli-10-hydroksikamptotesiinin asetaattisuolaa, (100 mg, 0,2 mmoolia), valmistettuna kuten on kuvailtu esimerkissä 3, käsiteltiin 0,1 N natriumhydroksidin kanssa (4,5 ml, 0,45 mmoolia), ja liuos ajettiin HP-20-hart-sikolonnin läpi (2 x 22 cm). Hartsi pestiin vedellä (250 ml), ja tuote eluoitiin 1:1-seoksella vettä ja metanolia. Tuotteen sisältävät fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin pieneen tilavuuteen ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 98 mg (98 %) otsikkoyhdistettä. IR (nujoli) 1600cm_1 (karboksylaatti) . *H NMR

II

59 3 9 9 2 3 (D20) δ 0,65 (m,3), 1,8 (m, 2), 2,8 (s, 6), 3,0 (m, 2), 4,21 (s, 2), 4,5 (S, 2), 7,1 (q, 2), 7,2 (s, 1), 7,8 (s, 1). Anal. (c23H24N306Na.1,5 H20). Laskettu: C, 56,55; H, 5,57; N, 8,60. Todettu: C, 56,21; H, 5,65; N, 8,44.

Esimerkki 21 (20 S) 9-dimetyYliaminoetyvli-10-hvdroksikainptotesiinin vapaan suolan valmistaminen 10-hydroksikamptotesiinin (728 mg, 2,0 mmoolia), valmistettuna kuten on kuvailtu esimerkissä 2, jääetikassa (50 ml), etanolin (20 ml), 37-%:isen vedellisen formaldehydin (3 ml) ja 40-%:isen vedellisen dimetyyliamiinin (3 ml) seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 20 tuntia. Liuottimet poistettiin alennetussa paineessa; jäännöstä kuumennettiin 50°C:ssa korkeassa alipaineessa 2 tunnin aikana, ja sitä hierrettiin isopropanolin kanssa (10 ml) otsikkoyhdisteen saostamiseksi (561 mg, 64 %) kiinteänä keltaisena aineena. FAB-massaspektri : m/e 422 (MH+) · 1H NMR (CDCI3/CD3OD) δ 1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 2,5 (s, 6), 4,3 (s, 2), 5,2 (s, 2) 5,4 (q, 2), 7,6 (s, 1), 7,7 (q, 2), 8,5 (s, 1).

Esimerkki 22 (20 S) 10-hydroksikamptotesiinin trifluorimetyvlisulfonaatin (triflaatti) valmistaminen 10-hydroksikamptotesiinin, valmistettuna kuten on kuvailtu esimerkissä 2, (1,44 g, 4,0 mmoolia) seokseen DMF:ssä (40 ml) lisättiin trietyyliamiinia (1,2 g, 12 mmoolia), minkä jälkeen lisättiin N-fenyylitrifluorimetaanisulfonimidiä (2,0 g, 6 mmoolia). Reaktiota kuumennettiin 50°C:ssa 3 tunnin ajan. Liuotin poistettiin alipaineessa, ja jäännöstä hierrettiin veden kanssa, suodatettiin ja kuivattiin. Raakatuotteesta saatiin teoreettinen saanto pääosin yhtenä täplänä ohutlevykromatogra-fialla (TLC), joka osoitti pientä alkuepäpuhtautta. Pieni näyte puhdistettiin flash-kromatografiällä piihappokolonnissa, elu-oiden tuote 2-%:isella MeOH:lla CH2Cl2:ssa.

Anal. (C21H15N207SF3) . Laskettu: C, 50,81; H, 3,05; N, 5,64. Todettu: C,51,38; H,3,42; ,4,99 1HMR (CDC13) δ 1,0 (t,3), u g 99 7 60 -f s y ά o 1,9 (m,2), 5,3 (S,2), 5,4 (q,2), 7,7 (s,l), 7,6-7,9 (m,2), 8,2 (d,2), 8,5 (s,l). FAB-massaspektri m/e 497 (MH+) , 495 (M-H)'.

Esimerkki 23 (20 S) 9-dimetyyliaminometyylikamptotesiinin valmistaminen (20 S) 9-dimetyyliaminometyyli-10-hydroksikamptotesiinin ase-taattisuolan trifluorimetaanisulfonaattia tehtiin in situ seuraavasti . 9-dimetyyliaminometyyli-10-hydroksikamptotesiinin asetaattisuolan, valmistettuna kuten on kuvailtu esimerkissä 3, (482 mg, 1 mmoolia) seosta N,N-dimetyyliformamidissa (DMF) argonin alla (40 ml) käsiteltiin 2,6-lutidiinin (268 mg, 2,5 mmoolia) ja N-fenyylitrifluorimetaanisulfonimidin (0,54 g, 1,5 mmoolia) kanssa. Reaktioseosta sekoitettiin yli yön huoneen lämpötilassa. Edellä muodostettuun triflaattiin lisättiin sen jälkeen trietyyliamiinia (0,4 ml, 3,0 mmoolia), palladiumase-taattia (8 mg, 0,04 mmoolia), trifenyylifosfiinia (20 mg, 0,08 mmoolia) ja väkevää muurahaishappoa (0,08 ml, 2 mmoolia). Reaktiota kuumennettiin 60°C:ssa 8 tunnin ajan. Liuotin poistettiin alipaineessa, ja jäännöstä hierrettiin pienen vesimäärän kanssa ja suodatettiin. Kuivattu raaka liukenematon kiinteä aine painoi 550 mg. Se puhdistettiin flash-kromatografiällä piihappokolonnissa, eluoiden jonkin verran lähtötriflaattia trifenyylifosfaatilla, jolloin saatiin 25 mg (7 %) 9-metyyli-kamptotesiiniä, 88 mg (20 %) otsikkoyhdistettä vapaana emäksenä (4 % MeOH CH2Cl2:ssa) ja jonkin verran 10-hydroksikamptotesiinin trifluorimetyylisulfonaattia 10-%:isella MeOHtlla CH2Cl2:ssa.

Osa otsikkoyhdisteestä muutettiin asetaattisuolaksi käsittelemällä laimean etikkahapon kanssa. Anal. (ε25Η27Ν306 · 2.5H20). Laskettu: C, 58,81; H, 6,12; N, 8,23. Todettu: C, 58,60; H, 5,88; N, 7,88; 1HNMR (CDC1 ) δ 0,9 (t,3), 1,8 (m,2), 2,2 (s,6), 3,7 (s,2), 5,2 (s,2), 5,4 (q,2), 7,3 (d,l), 7,5 (d,l) 7,6 (2,1), 8,0 (d,i), 3,3 (s,l) Massaspektri m/e 406 (MH+ ).

Il n q 9 ? i

61 ~ ' 7 ·- J

Esimerkki 24 10-svaanikamptotesiinin valmistaminen

Tributyylitinasyanidin (444 mg, 1,4 mmoolia) ja tetrakistri-fenyylifosfiinipalladiumin (276 mg, 0,6 mmoolia) liuosta 1,2-dikloorietaanissa (20 ml) kuumennettiin palautusjäähdytyksessä argonin alla 2 tunnin ajan, jolloin muodostui palladiumtina-syanidikompleksi. Sen jälkeen lisättiin 10-hydroksikamptote-siinin trifluorimetyylisulfonaattia, valmistettuna kuten on kuvailtu esimerkissä 22, (266 mg, 0,6 mmoolia) ja kuumennetusta palautusjäähdytyksessä jatkettiin 3,5 tuntia. Reaktio konsentroitiin l/3:aan alkuperäisestä tilavuudestaan ja hierrettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa dietyylieetteriä. Saostunut keltainen kiinteä aine otettiin talteen ja kuivattiin. Otsikkoyh-distettä saatiin 82-%:isena raakasaantona, 183 mg. Puhdistamisen jälkeen flash-kromatografiällä otsikkoyhdiste eluoitui 2-% risen MeOHrn kanssa CH2Cl2:ssa, ja 115 mg (67 %) saatiin.

Anal. (C21H15N304 · 1/2H20). Laskettu: C, 65,96;H, 4,22; N, 10,99. Todettu: C, 65,89; H,4,06; N, 10,66. 1HNMR (CDC13 -MeOD4) δ 1,0 (t,3), 1,9 (m,2), 5,4 (s,2), 5,5 (q,2), 7,7 (S,1), 7,7-8,4 (m,3), 8,6 (s,l).

Massaspektri m/e 374(MH+).

Esimerkki 25 (20 S) 10-formyvlikamptotesiinin valmistaminen

Liekillä kuivattuun pulloon panostettiin 10-hydroksikampto-tesiinin trifluorimetyylisulfonaattia, valmistettuna kuten on kuvailtu esimerkissä 22, (100 mg, 0,22 mmoolia), vastatislattua tetrahydrofuraania (THF) (10 ml) ja tetrakistrifenyylifosfii-nipalladiumia (10 mg, 9 mmoolia). Hiilimonoksidia kuplitettiin (CO) reaktioon 3 min. ajan, ja reaktioseos suljettiin CO-pallosululla ja kastettiin öljyhauteeseen 50°C:ssa. Samalla kun sekoitettiin ja käyttäen käsipumppua lisättiin Bu3SnH-liuosta (0,73 ml) kuivassa THF:ssä (3 ml) tipoittain 4 tunnin ajanjakson aikana. Tämän ajan kuluttua liuotin poistettiin alipaineessa, ja jäännös puhdistettiin flash-kromatografiällä (1-2 % CH

62 39923 OH, CH Cl ), minkä jälkeen seurasi lopullinen puhdistaminen käyttäen Chromatotron-laitetta (Harrison Research, Palo Aito, Kalifornia). Otsikkoyhdistettä eluoitiin 2-%:isen MeOH:n kanssa CH2Cl2:ssa, 20 mg (24 %) . Anal. (C21, H16, N205'l-l/3 H20) . Laskettu: C, 61,84; H, 4,69; N, 6,86. Todettu: C, 61,83; H, 4,53; N, 6,37. 1HNMR (CDC13) δ 0,9 (t, 3), 1,9 (m, 2), 5,3 (split s, 2), 5,4 (q, 2), 7,7 (d, 1), 7,8-8,3 (m, 3), 8,5 (s, 1), 9,9 (s, 1). Massaspektri m/e 377 (MH+) .

Esimerkki 26 (20 S) 10-aminometyylikamptotesiinin asetaattisuolan valmistaminen 10-syaanikamptotesiinin, valmistettuna kuten on kuvailtu esimerkissä 24, (160 mg, 0,4 mmoolia) liuosta jääetikkahapossa (45 ml) käsiteltiin aktivoidun raney-nikkelin kanssa ja hydrattiin paineessa 175,2 kPa (1785,8 g/cm2) 7 tunnin ajan. Katalysaattori poistettiin suodattamalla supercel-massan läpi, ja suodos konsentroitiin alipaineessa. Kiinteä jäännös puhdistettiin keskipainekromatografiällä käänteisfaasikolonnissa eluoimalla tuote 10-%:isen MeOH:n kanssa vedessä. Pakastuskuivauksen jälkeen saatiin 25 mg (15 %) hygroskooppista otsikkoyhdistettä. Anal. (C23H23N306·6 H20). Laskettu: C, 50,63; H, 6,46; N, 7,73. Todettu: C, 50,11; H, 6,57; N, 7,64. 1HNMR (D 0) δ 1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 4,3 (S, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,5 (s, 1), 7,7-8,1 (m, 3) 8,6 (s, 1),

II

63 15923

Esimerkki 27 (20 S) 10-aminometyvlikamptotesiinin asetaattisuolan valmistaminen 10-syaanikamptotesiinin, valmistettuna kuten on kuvailtu esimerkissä 24, (160 mg, 0,42 mmoolia) liuosta jääetikkahapossa (45 ml) käsiteltiin aktivoidulla Raney®-nikkelillä ja hydrat-tiin paineessa 175,2 kPa (1785,8 g/cm2) 7 tuntia. Katalysaattori suodatettiin supercel-täytteen läpi (95 % SiO ), konsentroitiin alipaineessa ja puhdistettiin käänteisfaasikolonnissa. Tuote eluoitui 10-%:isessa MeOHtssa H20:ssa (joka sisälsi 0,02 % etikkahappoa). Fraktioiden yhdistämisen, pieneen tilavuuteen konsentroinnin ja lyofilisoinnin jälkeen saatiin otsikkoyhdis-tettä 26 mg (14 %) . Anal. (C^i^^Og· 6H20) . Laskettu: C, 50,53; H, 6,46; N, 7,73. Todettu: C, 50,11; H, 6,57; N, 7,64. 1HNMR (D20/Me0D4) δ 1,0 (t,3), 2,0 (m,2), 4,3(s,2), 5,2 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,5 (s, 1), 7,7-8,1 (m, 3) 8,6 (s, 1),

Esimerkki 28 (20 S) 9-morfoliinimetyylikamptotesiinin valmistaminen 10-hydroksi-9-morfoliinimetyylikamptotesiinin trifluorimetyyli-sulfonaatin l-mmoolista liuosta, valmistettuna esimerkissä 23 kuvaillulla tavalla, kuivassa DMF:ssä (25 ml) käsiteltiin tri-etyyliamiinin (0,4 ml), Pd(etikkahappo)2:n (8 mg, 0,04 mmoolia), trifenyylifosfiinin (20 mg, 0,08 mmoolia) ja 99-%:isen muurahaishapon kanssa (0,08 ml, 2 mmoolia). Reaktiota kuumennettiin argonin alla 60°C:ssa 6 tunnin ajan, konsentroitiin alipaineessa ja käsiteltiin veden kanssa. Sekä tavoiteltu ot-sikkoyhdiste että pääasiallinen sivutuote, 9-metyylikamptote-siini, saostuivat (300 mg) ja kerättiin talteen suodattamalla piihappogeeli flash-kromatografiapuhdistamisella. 9-metyyli-kamptotesiini eristettiin eluoimalla l-%:isessa MeOH:ssa CH2 Cl2 :ssa (45 mg, 13 %). Eluutiossa 2-%:isella MeOH:lla CH2Cl2:ssa saatiin otsikkoyhdistettä (93 mg, 20 %).

Anal. (C25H25N305 1/2 H20) . Laskettu: C, 65,78; H, 5,74; N, 9,20.

Todettu: C, 65,87; H, 5,96; N, 9,00.

64 39923 (massaspektri m/e 448 (MH+) HNMR (CDCl3/MeOD4) δ 1,0 (t,3), 2,0 (m,2), 2,5 (m,4), 3,7 (m,4), 4,0 (s,2), 5,3 (3,2), 5,6 (q,2), 7,5 (d, 1), 7,6 (S,1), 7,7 (d,1), 8,2 (d,l), 9,0 (S,l).

Sopivat fraktiot kerättiin talteen, konsentroitiin pieneen tilavuuteen ja pakkaskuivattiin yli yön, jolloin saatiin 23 mg (33 %) otsikkoyhdistettä.

Anal. (C24H2JN307· 10 H20) . Laskettu:C, 43,90; H, 6,90; N, 6,38. Todettu: C, 43,82; H, 6,89; N, 5,79. ‘HNMR (DMSO-d6) 0,9 (t,3), 1,9 (m,2), 3,2 (s,2), 5,0 (3,2), 5,1 (s,2), 5,4 (s,2), 7,2 (s,1), 7,5 (q,2), 8,4 (s,l).

Esimerkki 29 (20 S) l0-hydroksi-9-syaanimetyvlikamptotesiinin valmistaminen 9-trimetyyliammoniummetyyli-10-hydroksikamptotesiinin metaa-nisulfonaattisuolan, valmistettuna kuten on kuvailtu esimerkissä 8, (0,42 g, 0,8 mmoolia) 95-%:ssa EtOH:ssa (35 ml) ja natriumsyanidin seosta keitettiin palauttaen argonin alla 3 tunnin ajan. Liuotin poistettiin alipaineessa, vettä lisättiin (20 ml), ja pH säädettiin arvoon 1,5 3 N HCl:llä. Saostunut raaka kiinteä aine otettiin talteen ja kuivattiin. Puhdistaminen suoritettiin flash-piihappogeelikromatografiällä. Tuote eluoitiin 4-%:sen ja 5-%:sen MeOH:n kanssa CH2Cl2:ssa, jolloin saatiin 110 mg (33 %) otsikkoyhdistettä.

Anal. (C22H17N30j.l 3/4 H20) . Laskettu: C, 60,75; H, 4,58; N, 9,66. Todettu:C, 60,63; H, 4,64; N, 9,60. ‘HNMR (CDCl3/MeOD4) δ 0,9 (t, 3) , 1,8 (m,2), 4,2 (s,2), 5,2 (s,2), 5,3 (q,2), 7,5 (d,1) , 7,6 (S,1) , 7,9 (d,1) , 8,4 (s,l).

Esimerkki 30 (20 S) 10-hydroksi-9-aminometyYlikamptotesiinin asetaattisuolan valmistaminen

Liuosta, jossa oli 60 mg (0,15 mmoolia) 10-hydroksi-9-syaanime-tyylikamptotesiiniä, valmistettuna kuten on kuvattu esimerkissä 29, jääetikkahapossa (30 ml), käsiteltiin suunnilleen 1 g:n (märkäpaino) kanssa Raney®-nikkeliä ja hydratoitiin paineessa

II

65 J jy L 3 175,2 kPa (1785,8 g/cm2) 6 tunnin ajan. Katalysaattori poistettiin suodattamalla, ja suodos konsentroitiin alipaineessa kiinteäksi jäännökseksi. Konsentroitu suodos liuotettiin sen jälkeen veteen ja puhdistettiin käänteisfaasikolonnikromatogra-fiällä eluoiden tuote 10-%:11a MeOHrlla vedessä (joka sisälsi 0,02 % jääetikkahappoa). Sopivat fraktiot kerättiin talteen, konsentroitiin pieneen tilavuuteen ja pakkauskuivattiin yli yön, jolloin saatiin 23 mg (33 %) otsikkoyhdistettä.

Anal. (CH24H25N3O7.10 HjO) . Laskettu: C, 43,90; H, 6,90; N, 6,38. Todettu: C, 43,82; H, 6,89; N, 5,79. 'HNMR (DMSO-d^) 0,9 (t,3), 1,9 (m,2, 3,2 (s,2), 5,0 (3,2), 5,1 (s,2), 5,4 (S,2), 7,2 (s, 1) , 7,5 (q, 2) , 8,4 (s, 1) .

Claims (17)

1. Menetelmä farmaseuttisesti aktiivisen yhdisteen, jolla on kaava I, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan, hydraatin tai solvaatin valmistamiseksi: R \i° Is _VO ch3 OH jossa kaavassa: X on hydroksi; vety; syaani; -CH2NH2; tai formyyli; R on vety silloin, kun X on syaani, CH2NH2 tai formyyli; tai R on formyyli; syaanimetyyli tai -CH2R1 silloin, kun X on .vety tai hydroksi; R1 on -0-R2; -S-R2; -N-R2(R3); tai -N+-R2(R3) (R4) , sillä ehdolla, että kun R1 on -N+-R2(R3) (R4) , yhdiste on liittyneenä farmaseuttisesti hyväksyttävään anioniin; R2, R3 ja R4 ovat saunoja tai erilaisia, ja ne valikoidaan joukosta H; C^.g-alkyyli; C2.6-hydrok-sialkyyli; C^.g-dialkyyliamino; C^.g-dialkyyliamino-C^.g-al-kyyli; Cj^.g-alkyyliamino-Cj.g-alkyyli; C2.6-aminoalkyyli tai 3-7 jäsentä sisältävä substituoimaton tai substituoitu kar-bosyklinen rengas; ja silloin, kun R1 on -N-R2(R3), R2- ja R3-ryhmät voivat olla yhdistyneinä typpiatomiin, johon ne ovat sitoutuneet muodostaen heterosyklisen renkaan, joka lisäksi voi sisältää happi- tai typpiatomin ja joka voi olla substituoitu esimerkiksi alkyyli- tai piperidiiniryhmällä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää: (a) 10-hydroksikamptotesiinin kondensoinnin formaldehydin ja sopivan primäärisen tai sekundäärisen amiinin kanssa, jolloin saadaan kaikkia kaavan I mukaisia yhdisteitä, paitsi yhdistettä, jossa X on vety, syaani tai formyyli, ja R1 on -N-R2(R3) ja R2 ja R3 ovat samoja ja ovat H; tai (b) 10-hydroksikamptotesiinin formyloinnin, jolloin saadaan 9-formyyli-10-hydroksikamptotesiiniä, joka sen jälkeen saatetaan kondensaatioon sopivien amiinien kanssa, jota seuraa II 67 55923 pelkistäminen natriumsyaaniborohydridillä tai katalyyttinen pelkistäminen; tai (c) sopivien kaavan I mukaisten yhdisteiden, jossa kaavassa R1 on -N-R2(R1), käsittelemisen alkyloivalla aineella, jolloin saadaan vastaavia kaavan I mukaisia yhdisteitä, jossa kaavassa R1 on -N+-R2(R1) (R2) ja R2, R1 ja R2 eivät ole vetyjä, tai (d) 9-dimetyyliaminometyyli-10-hydroksikamptotesiinin tai sen suolan kuumentamisen sopivan alkoholin tai tiolin kanssa inertissä liuottimessa, jolloin muodostuu kaavan I mukaisia yhdisteitä, jossa kaavassa R1 on -0-R2 tai -S-R2; tai (e) 10-hydroksikamptotesiinin trifluorimetyylisulfonaatin saattamisen palladiumilla katalysoituun karbonylaatioon; tai (f) kaavan I mukaisen yhdisteen, jossa R on -CH2-N+R2(R1) (R2) , saattamisen reagoimaan syanidin kanssa, jolloin saadaan vastaava kaavan I mukainen yhdiste, jossa R on syaanimetyyli; tai (g) kaavan I mukaisen yhdisteen, jossa R on syaanimetyyli, pelkistämisen, jolloin saadaan vastaava kaavan I mukainen yhdiste, jossa R on aminometyyli.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa X on hydroksi ja R on dimetyyliaminometyyli, N-morfoliinimetyyli, N-metyylipiperatsinyylimetyyli, (4'-piperidiini)N-piperidin-yylimetyyli, (2'-hydroksietyyli)aminometyyli, trimetyyliam-moniummetyyli, sykloheksyyliaminometyyli, N-metyylianiliini-metyyli, etoksimetyyli, syklopropyyliaminometyyli, N,N-dime-tyyliaminoetyylioksimetyyli, N,N-dimetyyliaminoetyylitiome-tyyli, Ν,Ν-dimetyyliaminoetyyliaminometyyli, syaanimetyyli, aminometyyli tai formyyli tai, jossa R on vety ja X on syaani, formyyli tai aminometyyli, tai jossa X on vety ja R on dimetyyliaminometyyli tai N-morfolinometyyli. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii 2 tä, että valmistetaan kaavan I mukaisen yhdisteen S-isomee ri. 8 9 923

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukaisen yhdisteen raseeminen seos.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukaisen yhdisteen S-isomeeri, jossa X on hydroksi ja R on dimetyyliaminometyyli.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdisteen asetaattisuola.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdisteen monohydrokloridi-, dihydro-kloridi- tai natriumsuola.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukaisen yhdisteen S-isomeeri, jossa X on hydroksi ja R on trimetyyliammoniummetyyli.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukaisen yhdisteen S-isomeeri, jossa X on hydroksi ja R on N-metyylipiperatsinyylimet-yyli.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukaisen yhdisteen S-isomee-ri, jossa X on hydroksi ja R on N-metyylianiliinimetyyli.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukaisen yhdisteen S-isomeeri, jossa X on hydroksi ja R on sykloheksyyliaminometyyli.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukaisen yhdisteen S-isomeeri, jossa X on hydroksi ja R on N,N-dimetyyliaminoetyyliok-simetyyli. 3 9 9 2 3

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukaisen yhdisteen S-isomeeri, jossa X on hydroksi ja R on syaanimetyyli.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukaisen yhdisteen S-isomeeri, jossa X on hydroksi ja R on morfolinometyyli.

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukaisen yhdisteen S-isomeeri, jossa X on hydroksi ja R on aminometyyli.

16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukaisen yhdisteen S-isomeeri, jossa X on hydroksi ja R on N-syklopropyyliaminometyyli.

17. Yhdiste, jolla on kaava CF3S02-0niq 'ya |j bTc n N \ 11 '—\ E P ch3 oh 13 70 -3 9 923