CN103113381B

CN103113381B - 系列水溶性羟基喜树碱环烷胺醇衍生物及其制法与用途

Info

Publication number: CN103113381B
Application number: CN201310062966.3A
Authority: CN
Inventors: 张世轩; 耿涛; 姜波; 孙晨光; 哈莉莎; 覃华栋; 宋歌; 钱媛; 范庆宇
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2013-02-26
Filing date: 2013-02-26
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2033-02-26
Also published as: CN103113381A

Abstract

本发明首次将环烷胺醇亚甲基引入到羟基喜树碱结构中，合成了系列水溶性羟基喜树碱环烷胺醇衍生物，将强细胞毒性的羟基喜树碱修饰成中等细胞毒性的羟基喜树碱环烷胺醇衍生物，提高了诱导肿瘤细胞凋亡的选择性。并首次发现羟基喜树碱脯氨醇在体内具有特殊的氢化还原代谢途径，是已有喜树碱衍生物所不具有的，可通过对细胞内活性氧调控，从而抑制细胞增殖，选择性诱导肿瘤细胞的凋亡，抑制细胞发炎坏死，不影响正常细胞功能。

Description

系列水溶性羟基喜树碱环烷胺醇衍生物及其制法与用途

技术领域

本发明涉及新型喜树碱衍生物类抗肿瘤药物,以及制备方法和应用。更具体地说涉及9-环烷胺醇亚甲基-10-羟基取代的喜树碱衍生物,以及制备方法和这些化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

1966年Wall等从首先在中国特有植物喜树中发现喜树碱(CPT)。1985年发现10-羟基喜树碱(HCPT)，在中国一直用于临床。由于溶解度不理想，对骨髓抑制和腹泻以及肾毒性等严重不良反应限制了临床使用。1985年Redinob和Stewart发现喜树碱抗肿瘤的机理为抑制DNA拓扑异构酶I，引起医药界开展了大规化学结构修饰与构效关系研究。1998年他们又在《Science》上报道了Topo I为调节DNA空间构型动态变化的关键性酶，并证实喜树碱与DNA拓扑异构酶I分子对接机制。喜树碱衍生物具有作用机制明确，抗癌活性强，广谱，安全可靠，与其他抗肿瘤药物无交叉耐药性等优点，但是仍有呕吐，腹泻和骨髓抑制等严重不良反应。因此，激发了医药界对此化学结构修饰的热情，迄今喜树碱衍生物专利有150多种。[Serena Basili and Stefano Moro,Novel camptothecin derivatives as topoisomerase I inhibitors,Expert Opin.Ther.Patents,2009,19:555-575]已上市的喜树碱衍生物类抗癌药物有3种。1994年伊立替康(CPT-11)在日本上市（US4604463），为10-羟基喜树碱树碱衍生物前药，在体内需要酯酶水解成活性代谢物7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)，其毒性强于HCPT。CPT-11的生物利用度很低，大多仍以原型药物排除体外（约为55%）。1996年拓扑替康(TPT)在美国上市（US5004758），为9-二甲氨基亚甲基10-羟基喜树碱，与HCPT比较对DNA拓扑异构酶I抑制活性和细胞毒性均有所降低，但仍属于强细胞毒类药物。2004年贝洛替康(CKD602)在韩国上市（US6265413131），为7-异丙氨乙基喜树碱，2011年进入美国III期临床研究，与TPT比较对DNA拓扑异构酶I抑制活性增强，细胞毒性类似,仍属于强细胞毒类药物。

此外还有9-硝基喜树碱及其代谢物9-氨基喜树碱，以及GG-221等，虽然已进入临床研究，但是均以骨髓抑制和腹泻等严重不良反应而退出临床研究。

先导化合物CPT或HCPT本身细胞毒性就太强,在杀伤肿瘤细胞同时对正常细胞也构成严重伤害。已有的喜树碱衍生物存在的主要问题仍然以追求增加细胞毒性为目的，而忽视了对肿瘤细胞的选择性，从而造成对正常细胞的伤害，引起严重不良反应。因此，仍然需要发明以提高对肿瘤细胞杀伤的选择性，减少对正常细胞伤害为目的的高效低毒的喜树碱衍生物类抗癌药物。

发明内容

本发明的目的：以羟基喜树碱为先导化合物，通过环烷胺醇衍生物的结构修饰，适当降低细胞毒性，提高对诱导肿瘤细胞凋亡的选择性，而减少对正常细胞的伤害的一系列水溶性羟基喜树碱环烷胺醇衍生物类抗癌药物。

本发明一系列水溶性羟基喜树碱环烷胺醇衍生物及其盐类,具有通式Ⅰ的结构：

其中：X为4`-羟基哌啶基，N-4`-羟乙基哌嗪基，L-脯氨醇基或D-脯氨醇基中的一种。

在本发明的实施例1～3中，分别合成了当X为不同取代基的化合物，即：10-羟基-9-L-脯氨醇亚甲基喜树碱（PRPT）、10-羟基-9-（4`-羟基）-哌啶醇亚甲基喜树碱（PPPT）、10-羟基-9-（4`-羟乙基）-哌嗪亚甲基喜树碱（QPPT），并且分别进行了效果验证试验，包括血浆中内酯型/羧酸型比例与溶解度、对DNA Topo I酶的靶向选择性、体外抗癌活性等，试验结果证明：本发明制备的化合物PRTP，其内酯型/羧酸型比例较为适宜，在PBS中的溶解度比先导化合物HCPT和对照药TPT分别提高约300倍和5倍；在辛醇中的溶解度比先导化合物HCPT和对照药TPT分别提高约15倍和16倍。并且PRPT对DNA Topo I抑制活性（CC₅₀0.3μM）约相当于先导化合物HCPT的3倍，TPT的10倍。体外抗癌活性的试验结果证明PRPT为中等细胞毒（IC₅₀21.3μM），比先导化合物HCPT（IC₅₀3.26μM）降低5倍，比TPT（IC₅₀8.95μM）降低1倍。从而证明本发明所述的系列水溶性羟基喜树碱环烷胺醇衍生物，能够将强细胞毒性的羟基喜树碱修饰成中等细胞毒性的羟基喜树碱环烷胺醇衍生物，提高了诱导增殖期肿瘤细胞凋亡的选择性。并且本发明首次发现羟基喜树碱脯氨醇在体内具有特殊的氢化还原代谢途径，是已有喜树碱衍生物所不具有的，可通过对细胞内活性氧（ROS）调控，从而抑制细胞增殖，选择性诱导增殖期肿瘤细胞的凋亡，抑制细胞发炎和坏死，保护正常细胞，因此，其在制备抗肿瘤药物中具有广阔的应用前景。

本发明上文所述羟基喜树碱环烷胺醇衍生物，其制备方法是以10-羟基喜树碱为先导化合物，与甲醛溶液和环烷胺醇类化合物在冰醋酸中缩合而成；其原料摩尔配比为：10-羟基喜树碱-甲醛-环烷胺醇类化合物（1：1-5：1-5）；工艺步骤为：将10-羟基喜树碱加入到10-100倍量（W/V）的冰醋酸中，再按比例加入甲醛溶液和环烷胺醇类化合物于反应容器中，在40-90℃下搅拌至溶液澄清,倾入适量有机溶剂中,将析出的絮状沉淀滤出，用丙酮重结晶，得羟基喜树碱环烷胺醇衍生物醋酸盐。

所述的环烷胺醇类化合物选自4-哌啶醇，N-羟乙基哌嗪，L-脯氨醇或D-脯氨醇中的一种。

所述的有机溶剂选自乙醚，四氢呋喃，异丙醚或乙酸乙酯中的一种。

羟基喜树碱环烷胺醇衍生物及其盐类，加入药学上可以接受的敷料，在制备抗肿瘤药物中的应用。

上述半合成路线为经典的酸催化Mannich反应。

有益效果

本发明首次将环烷胺醇亚甲基引入到羟基喜树碱结构中，合成了系列水溶性羟基喜树碱环烷胺醇衍生物，将强细胞毒性的羟基喜树碱修饰成中等细胞毒性的羟基喜树碱环烷胺醇衍生物，提高了诱导增殖期肿瘤细胞凋亡的选择性。并首次发现羟基喜树碱脯氨醇在体内具有特殊的氢化还原代谢途径，是已有喜树碱衍生物所不具有的，可通过对细胞内活性氧（ROS）调控，从而抑制细胞增殖，选择性诱导增殖期肿瘤细胞的凋亡，抑制细胞发炎和坏死，保护正常细胞。

附图说明

图1.琼脂糖凝胶电泳M（标准蛋白）。1道pUC19DNA。2道DNA Topo I。3-5道0.1，0.5，2.5μM PRPT。6道2.5μM HCPT。

图2.人乳腺癌MCF-7细胞加PRPT（6.25μM）37℃培养2h，加PF1（10μM）培养0.5h，MCF-7细胞内H₂O₂PF1荧光染色照片（a为MCF-7+PF1,b为MCF-7+PRPT6.25μM+PF1）

图3.羟基喜树碱环烷胺醇衍生物提高MCF-7细胞内H₂O₂浓度，其中，横坐标为羟基喜树碱环烷胺醇衍生物浓度，纵坐标为产生的H₂O₂浓度。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

10-羟基-9-L-脯氨醇亚甲基喜树碱（PRPT）：在反应容器中加入HCPT1.0g，冰醋酸60ml，甲醛溶液0.90g，L-脯氨醇1.12g，在78-82℃下搅拌至溶液澄清，10分钟后，立即倾入200ml乙醚中，将析出的絮状沉淀滤出，用少量1%冰醋酸乙醚溶液洗涤，凉干，得到浅黄色固体1.40g，产率92.1%，纯度88.5%（HPLC-UV），丙酮重结晶纯度99.2%（HPLC-UV）。

MS：478[M+H]⁺。¹H-NMR（DMSO-d6）：0.86（3H，t，18-CH₃），1.70（2H，4’-CH₂），1.83（5H，m，19-CH₂，3’-CH₂），1.91（3H，s，CH₃COOH），3.36（H₂O），5.43（2H，s，17-CH₂），6.53（20-OH），7.26（1H，s，14-CH），7.52（1H，d，11-CH），8.07（1H，d，12-CH），8.84（1H，s，7-CH）。¹H-NMR（D₂O）：0.90（3H，t，18-CH₃），1.88（2H，m，19-CH₂），2.50（3H，s，CH₃COOH），2.07（2H，m，4’-CH₂），2.31（2H，m，3’-CH₂）,3.14、3.27（2H，m，6’-CH₂），3.82（2H，s，5-CH₂）,3.84（2H，s，17-CH₂），3.97（2H，m，2’-CH₂），4.49（2H，m，5’-CH₂）,5.28（2H，s，ArCH₂N），7.22（1H，s，14-CH），7.27（1H，d，11-CH），7.72（1H，d，12-CH），8.31（1H，s，7-CH）。IR（KBr,cm^-1）：3384,2974,2876,1744,1655(ν _C=O),1591,1505。UV(甲醇)：λmax268，333，384nm。为10-羟基-9-L-脯氨醇亚甲基喜树碱醋酸盐(C₂₆H₂₇N₃O₆.CH₃COOH)。

实施例2

10-羟基-9-（4`-羟基）-哌啶醇亚甲基喜树碱（PPPT）：在反应容器中加入HCPT100mg，冰醋酸10ml，甲醛溶液220mg，4-哌啶醇280mg，在65℃下搅拌至溶液澄清，10分钟后,倾入50ml乙醚中，将析出的絮状沉淀滤出，用少量1%冰醋酸乙醚溶液洗涤，凉干，得到浅黄色固体102mg，纯度88.8%（HPLC-UV），丙酮重结晶，纯度98.4%（HPLC-UV）。

MS：478[M+H]⁺。¹H-NMR（DMSO-d6）：0.88（3H，t，18-CH₃），1.44，1.76（2H，t，t，3’，5’-CH₂），1.84（2H，m，19-CH₂），1.88（3H，s，CH₃COOH），2.37（2H，t，t，2’，6’-CH₂），3.58（1H，m，4’-CH₂），4.13（2H，s，ArCH₂N），5.24（2H，s，5-CH₂），5.42（2H，s，17-CH₂），6.51（20-OH），7.52（1H，s，14-CH），7.40（1H，d，11-CH），7.98（1H，d，12-CH），8.72（1H，s，7-CH）。IR(KBr,cm^-1):3423，2938，1749，1655(ν_C=O)，1594，1506，1469，1384。UV(甲醇)：λmax268，333，384nm。为10-羟基-9-（4`-羟基）-哌啶醇亚甲基喜树碱醋酸盐(C₂₆H₂₇N₃O₆.CH₃COOH)。

实施例3

10-羟基-9-（4`-羟乙基）-哌嗪亚甲基喜树碱（QPPT）：在反应容器中加入HCPT100mg，冰醋酸10ml，甲醛溶液90mg，4-羟乙基哌嗪144mg，在45℃下搅拌至溶液澄清，倾入70ml乙醚中，将析出的絮状沉淀滤出，用少量1%冰醋酸乙醚溶液洗涤，凉干，得到浅黄色固体111mg，纯度91.7%（HPLC-UV），丙酮重结晶，纯度98.5%（HPLC-UV）。

MS：507[M+H]⁺。¹H-NMR（DMSO-d6）：0.86（3H，t，18-CH₃），1.84（2H，m，19-CH₂），2.50（3H，s，CH₃COOH），2.61（10H，m，2’，3’，5’，6’，7’-CH₂），3.50（2H，t，8’-CH₂），4.09（2H，s，ArCH2N），5.24（2H，s，5-CH₂），5.42（2H，s，17-CH₂），6.52（20-OH），7.26（1H，s，14-CH），7.41、7.43（1H，d，11-CH），7.98（1H，d，12-CH），8.73（1H，s，7-CH）。IR(KBr,cm^-1)：3423，1746，1655(ν_C=O)，1589，1504，1463，1384，1338。UV(甲醇)：λmax270，332，384nm。为10-羟基-9-（4`-羟乙基）-哌嗪亚甲基喜树碱醋酸盐(C₂₇H₃₀N₄O₆.1.5CH₃COOH)。

实施例4

9-亚甲基10-羰基-喜树碱：在反应容器中加入10-羟基-9-L-脯氨醇亚甲基喜树碱100mg，甲醇10ml，滴加次氯酸钠溶液1ml，60°C减压干燥，用二氯甲烷溶解，用硅胶色谱法分离得到氧化产物。纯度97.2%（HPLC-UV）。

MS：377[M+H]⁺。IR(KBr,cm^-1):3384，2974,2876,1744,1655(ν_C=O),1591,1505，1413。 ¹H-NMR（DMSO-d6）：H-NMR（DMSO-d6）：0.86（3H，t，18-CH3），1.83（2H，m，19-CH2），4.19、4.23（1H，d，9-CH2），4.46、4.49（1H，d，9-CH2），5.24（2H，s，5-CH2），5.42（2H，s，17-CH2），6.52（20-OH），7.26（1H，s，14-CH），7.40、7.42（1H，d，11-CH），7.95、7.97（1H，d，12-CH），8.80（1H，s，7-CH）。示δ5.36的CH₂特征峰消失，取而代之的是δ4.30的端烯=CH₂双氢耦合特征峰。为9-亚甲基10-羰基-喜树碱。

实施例5效果验证试验

（1）血浆中内酯型/羧酸型比例与溶解度

在血浆中喜树碱衍生物内酯型比例越大，细胞内浓度越高，细胞毒性越强,但是与细胞内DNA Topo I结合力减弱,因此，对增殖期细胞的选择性差。在血浆中喜树碱衍生物内酯型比例越小，细胞内浓度越低，细胞毒性越弱,但是与细胞内DNA Topo I结合力增强,因此，对增殖期细胞的选择性强。为了使喜树碱衍生物能在细胞内外的正常转运，设计衍生物应有一个适宜内酯型与羧酸型比例，不但可使其容易进入细胞内，而且要考虑到与细胞内与DNA Topo I有适度的结合力，这样才能达到具有选择性诱导增殖细胞活性，减少对正常细胞的伤害的目的。

上述反应过程为喜树碱衍生物与DNA Topo I72 3位酪氨酸活性酚羟基结合方式。

血浆中内酯型/羧酸型比例测定方法：将0.2ml药物PBS溶液（1mg/1ml）与0.2ml血浆混合，涡旋1分钟，37℃培养箱内培养2小时。加入3.6ml1%甲酸甲醇溶液，涡旋1分钟，1500转/min离心10分钟，分取上清液按高效液相色谱测定方法测定。

高效液相色谱测定方法：以C₁₈为色谱柱，在268nm波长检测，以水-甲酸(45:55:0.2)为流动相测定。结果见表1。本发明中PRPT内酯型/羧酸型比例较为适宜。其中，PRTP在PBS中的溶解度比先导化合物HCPT对照药TPT分别提高约300倍和5倍；在辛醇中的溶解度比先导化合物HCPT对照药TPT分别提高约15倍和16倍。

表1.羟基喜树碱衍生物血浆中内酯型/羧酸型与溶解度

（3）对DNA Topo I酶的靶向选择性

正常细胞一般处于非增殖期，DNA Topo I酶活性较弱。肿瘤细胞大多处于增殖期细胞，具有较强的DNA Topo I酶活性。对DNA Topo I酶抑制活性强弱直接反映了对增殖期肿瘤细胞的选择性。因此，提高对DNA Topo I抑制活性可选择性诱导肿瘤细胞凋亡，而减少对正常细胞的伤害。按文献[William D.Kingsbury,et al，J.Med.Chem.1991,34,98-107]对DNA Topo I抑制活性测定结果CC₅₀见表2。其中，PRPT对DNA Topo I抑制活性（CC₅₀0.3μM）约相当于先导化合物HCPT（CC₅₀1.0μM）3倍，TPT（CC₅₀3.2μM）10倍,见表2和图1。

表2.羟基喜树碱及其衍生物对DNA Topol抑制活性

药物	CC₅₀μM
		HCPT	1.0
TPT	3.2
		PRPT	0.3
PPPT	0.4
		QPPT	0.5

（3）体外抗癌活性

《国家新药（西药）临床前研究指导原则》抗肿瘤药效学指导原则体外抗癌活性（MTT法）规定IC₅₀合成药小于10μg/1ml，植物提取物30μg/1ml]示为有抗癌活性。强细胞毒类药物在杀伤肿瘤细胞同时也杀伤正常细胞，毒副作用较大。只有中等细胞毒药物对肿瘤细胞活杀伤同时对正常细胞毒性可以忍受。

MTT法对5种人肿瘤细胞：胃腺癌BGC-823，小细胞肺癌MCI-H1688，小细胞肺癌NCI-H446，肝癌SMMC-7721，乳腺癌MCF-7体外抗增殖活性测定结果IC₅₀见表2。其中，PRPT为中等细胞毒（IC₅₀21.3μM），比先导化合物HCPT（IC₅₀3.26μM）降低5倍，比TPT（IC₅₀8.95μM）降低1倍,见表3。

表3.羟基喜树碱衍生物体外抗增殖活性（IC₅₀μM）

IC₅₀μM	HCPT	TPT	PRPT	PPPT	QPPT
						BGC-823	4.00	8.20	17.1	33.8	36.3
MCI-H1688	2.07	2.49	4.31	6.50	17.0
						NCI-H446	8.40	6.28	11.0	57.0	30.0
SMMC-7721	0.82	16.4	54.0	22.00	49.0
						MCF-7	1.00	11.4	19.9	49.0	35.3
平均值	3.26	8.95	21.3	33.7	33.5

（4）PRPT的主要代谢途径

大鼠灌胃给药（20mg/kg），收集尿液加4倍量0.1%甲酸甲醇溶液，离心分取上清液，进行LC-MS-MS测定。结果表明：PRPT尿液中排泄的主要为硫酸酯化，氢化还原和甲基化代谢物，原形药物小于30%，未发现氧化代谢物9-亚甲基-10-羰基喜树碱。PPPT主要为原形药物和少量氧化代谢物9-亚甲基-10-羰基喜树碱（实施例4）。QPPT主要为氧化代谢物9-亚甲基-10-羰基喜树碱，几乎无原形药物排泄。TPT尿液中排泄的主要为原形药物大于85%，少量还原代谢物和氧化代谢物。CPT-11主要以原形药物(55%)排除，部分被体内羧酸酯酶水解成活性代谢物SN-38，其毒性均强于10-羟基喜树碱，其余部分为氧化谢物。

上述反应过程为PRPT大鼠灌胃给药的主要代谢途径。

本发明首次发现PRPT这种特有的氢化还原代谢途径是其他已有的喜树碱衍生物所不具有的。这种氢化还原代谢途径，与选择性提高肿瘤细胞内H₂O₂浓度有关，从而可抑制细胞增殖，选择性诱导肿瘤细胞凋亡。

（5）选择性提高肿瘤细胞内H₂O₂浓度

PF1荧光探针选择性测定细胞内H₂O₂浓度方法：2005年美国加洲大学波克利分校Chang教授课题组设计合成一种细胞内过氧化氢（H₂O₂）选择性荧光探针戊烷基硼二氢荧光素（PF1:495，528nm）。具有良好的渗透性，能透过细胞膜，稳定性良好，操作简单,特异性强。PF1本身无荧光，进入细胞内选择性被H₂O₂氧化成成黄绿色荧光素FITC。能测量活细胞内μM水平的H₂O₂的变化，是目前唯一能真实评定细胞内H₂O₂的有效工具。[JACS，2005，127，16652-16659]

测定方法：将肿瘤细胞接种于96黑孔板，每孔90μl（5000个/孔）,5%CO₂饱和湿度的培养箱内，37℃培养24h。加入含有不同梯度药物PBS溶液（用DMSO配成每1ml含1mg 的储备液，临用前分别用PBS稀释成500，250，125，62.5，31.25,0μM）10μl，每个浓度设4个复孔，孵育2h（PRPT2h，BAj4h）。加入PF1荧光探针溶液（用DMSO配成每1ml含1mg的储备液，临用前将用PBS稀释100μM）10μl，37℃振荡0.5h。用荧光酶标仪（激发波长488nm，发射波长525nm）测定荧光强度。

标准曲线：每孔加入含血浆培养基90μl，加入含有不同梯度H₂O₂的PBS溶液（临用前取H₂O₂溶液，用PBS稀释成500，250，125，62.5，31.25,0μM溶液）10μl，加入100μM的PF1荧光探针溶液10μl，37℃振荡0.5h。依法测定荧光强度，并绘制标准曲线。血浆培养基中H₂O₂在3.1-50μM（X）范围内与荧光强度（Y）线性关系良好，回归方程为：Y=101X+481（R²=0.998，n=5）。图3为羟基喜树碱环烷胺醇衍生物提高MCF-7细胞内H₂O₂浓度。

荧光显微镜成象：对于贴壁细胞，用黑透孔板实验，吸出含PF1荧光探针溶液的培养基,用PBS洗2次。用荧光显微镜成象。对于悬浮的正常单核细胞可离心后，用PBS洗2次，再用荧光显微镜成象。

结果显示，其中PRPT提高MCF-7细胞内H₂O₂浓度约相当于先导化合物HCPT3倍，TPT（CC₅₀3.2μM）2倍。荧光显微镜成象见附图2。

（6）体外抗氧化试验

羟基喜树碱环烷胺醇衍生物不能被H₂O₂溶液氧化，但是可被NaOCl溶液氧化。用硅胶色谱法分离得到氧化产物经波谱学确证均为9-亚甲基10-羰基喜树碱（实施例4）。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是生物体内一类活性含氧化合物的总称，产生于机体的代谢过程中，能够调节细胞的分化，增殖，转化，凋亡和死亡。ROS对细胞的作用程度取决于ROS种类和暴露的持续时间。大量氧自由基能促进有丝分裂和细胞增殖，微摩尔级的H₂O₂能引起短暂性或永久性细胞周期停滞，也能诱导分化。NaOCl是有害的，能引起细胞发炎坏死。[Nature,2000,418:239-247；J Cell Physiol,2002,192:1-15]

超氧化物歧化酶（SOD）分为生物体内重要的抗氧化酶，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD是以氧自由基连锁反应前体物^.O₂ ^-为唯一底物，将其歧化为H₂O₂，构成机体抗ROS的第一道天然防线。谷胱苷肽酶（GPX）催化H₂O₂将还原型谷胱苷肽（GSH）氧化为氧化型谷胱苷肽（GSSG）。过氧化氢酶（CAT）催化H₂O₂分解为水和氧。在线粒体内CAT催化高浓度H₂O₂将NaCl氧化成氧化性更强的NaOCl，NaOCl的形成是导致细胞发炎坏死的主要原因。

正常细胞内SOD和CAT活性较强，产生的ROS可被随时清除，维持在一个相对较低的ROS水平，而不影响正常细胞功能。研究表明，抗氧化应激系统缺陷是肿瘤细胞的共性，加之肿瘤细胞的旺盛代谢活动，具有致癌刺激、线粒体功能失调等特性。另外，肿瘤细胞内初始氧自由基浓度高于正常细胞，所有的肿瘤细胞SOD和CAT活性都明显低于正常细胞，清除ROS能力低下,对ROS更敏感。原因是由于正常细胞内的H₂O₂浓度主要由GPX控制，H₂O₂ 维持在一个很低的水平，而在肿瘤细胞H₂O₂主要由CAT控制，肿瘤细胞高浓度的H₂O₂更接近其细胞毒性。[Biomed Pharmacother,2005,59:169-174]

肿瘤细胞内SOD和CAT活性均低于正常细胞，使肿瘤细胞内^.O₂ ^-.浓度高于正常细胞，是促进细胞增殖的主要原因。相对于正常细胞，相同浓度的H₂O₂作用下，肿瘤细胞更容易发生凋亡。微摩尔级H₂O₂使线粒体跨膜电位下降，细胞膜完整性被破坏，细胞核浓缩，DNA片段化等，从而活化caspases通路，抑癌基因p53，抑制NF-Кb，释放线粒体细胞色素C、凋亡诱导因子（AIF）进一步诱导细胞凋亡。[Life Sci,2005,76:1439-1453]因此，促进肿瘤细胞内H₂O₂形成的药物具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡作用。[Biomedicine&Pharmacotherapy,2005,59:169–174]

在细胞内ROS中H₂O₂的寿命比其他活性氧自由基更稳定。因此H₂O₂成为细胞信号传导的重要信使。微摩尔级H₂O₂靶向氧化以半胱氨酸为活性中心的特定酶。如氧化CDC25激酶巯基，从而抑制对CDK1/Cyclin B的激活，使增殖期细胞被阻止在G2/M，抑制细胞增殖。如氧化Caspases激酶巯基，激活线细胞凋亡通路，引起细胞凋亡。更高浓度H₂O₂在CAT的作用下，可将NaCl氧化为活性更强的次氯酸钠，则可引起细胞发炎和坏死。（Pharmacology&Therapeutics2007,115:1-12；现代细胞分子生物学，2010,P226-238,P433-458）

上述为H₂O₂对细胞增殖与凋亡的调控机制。

PRPT通过捕获细胞内氧自由基，特异性提高肿瘤细胞内H₂O₂浓度，与抑制细胞增殖和选择性诱导肿瘤细胞凋亡有关。PRPT在体内可被发炎细胞产生的NaOCl氧化成9-亚甲基-10-羰基喜树碱，从而抑制细胞发炎坏死，减小对正常细胞的影响。

PRPT选择性诱导肿瘤细胞凋亡的分子生物学机制

（1）抑制增殖期细胞：PRPT细胞毒性明显降低，但对DNA Topo I抑制活性明显提高，可直接选择性抑制增殖期细胞S期。

（2）选择性诱导肿瘤细胞凋亡；PRPT主要被氢化还原代谢，可使增殖期细胞内产生微摩尔级H₂O₂，导致CDC25酪氨酸激酶巯基被氧化,使CDK1/Cyclin B1不能被激活，细胞被阻滞在G2/M期。Caspases半胱天冬氨酸Caspases激酶家族巯基也可被微摩尔级H₂O₂氧化，导致细胞凋亡通路被激活，从而可选择性诱导肿瘤细胞凋亡。

（3）保护正常细胞和消除变态反应：PRPT既可促进H₂O₂的生成，又可被强ROS次氯酸所氧化，从而促进增殖细胞凋亡，抑制细胞发炎和坏死，减小对正常细胞的影响。

Claims

1.一系列水溶性羟基喜树碱环烷胺醇衍生物及其盐类, 其特征在于，具有通式Ⅰ的结构：

Ⅰ

其中：X为 4`-羟基哌啶基，N-4`-羟乙基哌嗪基，L-脯氨醇基或D-脯氨醇基中的一种。

2.如权利要求1 所述羟基喜树碱环烷胺醇衍生物的制备方法，其特征在于，其原料摩尔配比为：10-羟基喜树碱-甲醛溶液-环烷胺醇类化合物1：1-5：1-5；工艺步骤为：将10-羟基喜树碱加入到10-100倍W/V冰醋酸中，再按比例加入甲醛溶液和环烷胺醇类化合物于反应容器中，在40~90℃下搅拌至溶液澄清，倾入有机溶剂中, 将析出的絮状沉淀滤出，洗涤，用丙酮重结晶，得羟基喜树碱环烷胺醇衍生物醋酸盐。

3.如权利要求2所述羟基喜树碱环烷胺醇衍生物的制备方法，其特征在于所述的环烷胺醇类化合物选自4-哌啶醇，N-羟乙基哌嗪，L-脯氨醇或D-脯氨醇中的一种。

4．如权利要求2所述羟基喜树碱环烷胺醇衍生物的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂选自乙醚，四氢呋喃，异丙醚或乙酸乙酯中的一种。

5.　权利要求1所述羟基喜树碱环烷胺醇衍生物及其盐类在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：加入药学上可以接受的辅料。