具体实施方式
以下将通过具体实施例进一步阐述本发明,但并不用于限制本发明的保护范围。在不脱离本发明构思的前提下,本领域技术人员可对权利要求的各参数或条件做出的改进或组合,这些改进或组合也应视为本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。本发明中使用的溶剂及试剂来自国药集团上海试剂公司。除特别说明外,所用试剂均为化学纯。
现有技术、文献制备合成化合物II的合成通法
参照文献,呋喃与顺丁烯二酸酐在四氢呋喃中反应得到5-烯-去甲斑蝥素1,2)、化合物1在四氢呋喃中通过催化氢化(例如Pd/C)得到去甲斑蝥素2,3)、化合物2在醇试剂ROH中进行酸酐水解开环反应得到去甲斑蝥酸单酯II。
(1)、制备5-烯-去甲斑蝥素1
顺丁烯二酸酐12.02g,置于干燥研体中研细溶解于乙醚90mL,缓慢滴加呋喃13mL。反应液在38℃反应1h后,溶液出现白色固体,随反应时间增长白色固体增多。反应至24h后抽滤,得5-烯-去甲斑蝥素1(17.459g,85.75%),为白色固体。熔点122~123℃,Rf 0.52(展开剂为石油醚∶乙酸乙酯=3∶1);1HNMR(400MHz,CDCl3):δ3.18(s,2H),5.47(s,2H),6.58(s,2H)。
(2)、制备去甲斑蝥素2
取5-烯去甲斑蝥素1(1.09g)于施兰克瓶中,加入20ml四氢呋喃使其溶解,加入110mg钯碳Pd/C,真空除去烧瓶中空气后通入氢气,25℃下搅拌使其反应,反应结束后抽滤除去钯碳,将所得滤液旋蒸,干燥,即得去甲斑蝥素(72.2%),去甲斑蝥素2 794.3mg,为白色固体。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ:4.85(s,2H),3.34(d,J=20Hz,2H),1.65(d,J=8Hz,4H)。13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ:173.35,80.08,51.14,40.35,40.14,39.93,39.72,27.90.
(3)、制备去甲斑蝥素单酸酯II
去甲斑蝥素单酸甲酯IIa(R=Me):称取去甲斑蝥素2 503.6mg(3mmol),溶于5ml甲醇中,加热到80℃~85℃,冷却回流,反应3.5h后放置冰箱中冷却12h,析出无色固体,抽滤,得到去甲斑蝥素单酸甲酯IIa 433mg(0.725mmol),产率72.2%.1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ:12.22(s,1H),4.66(s,2H),3.49(s,3H),2.98(s,2H),1.50(m,4H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ:172.72,172.04,78.26,77.93,52.38,51.63,51.30,28.96,28.89.
去甲斑蝥素单酸乙酯IIb(R=Et):称取去甲斑蝥素2 672mg于烧瓶中,加入30ml无水乙醇使其溶解,80℃加热回流,4.5小时后反应完全,旋蒸,以乙酸乙酯为洗脱液过硅胶柱,点板,收集显色的样品旋蒸,干燥,即得去甲斑蝥素单酸乙酯IIb 747.2mg(收率87%),白色固体。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ:4.91(d,J=24Hz,2H),4.11(d,J=8Hz,2H),2.99(q,J=12Hz,3H),1.81(t,J=4Hz,2H),1.52(d,J=8Hz,2H),1.21(t,J=8Hz,3H).13CNMR(100MHz,CDCl3):δ:176.45,170.87,78.59,78.29,77.03,76.71,61.16,52.27,28.97,13.94.
去甲斑蝥素单酸苄酯IIc(R=Bn):取去甲斑蝥素2 200mg(1.19mmol),置于圆底烧瓶中,加入4ml二氯甲烷溶解,后加入0.17ml三乙胺和0.13ml苄醇(1.2mmol),反应1h后,在160℃加热回流5h,冷却后,减压除去溶剂,将剩余物经柱层析得到去甲斑蝥素单酸苄酯IIc234mg,产率71.2%,为白色固体。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ:12.29(s,1H),7.29-7.34(m,5H),5.01(d,J=16Hz,1H),4.99(d,J=12Hz,1H),4.69(t,J=4Hz,2H),3.03(d,J=4Hz,2H),1.49-1.53(m,4H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ:172.76,171.49,136.17,128.79,128.37,128.35,127.46,127.31,78.35,78.01,66.06,52.41,51.34,28.95,28.93.
本发明、区域选择性合成高喜树碱去甲斑蝥素酸酯衍生物I的制备通法
高喜树碱与去甲斑蝥素单酸甲酯(II)在偶联剂、有机碱催化剂存在下,反应得到高喜树碱去甲斑蝥素酸酯衍生物I;其中所述偶联剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(缩写EDCI)、二环己基碳二亚胺(缩写DCC)等;所述有机碱选自三乙胺、二异丙基胺、4-二甲氨基吡啶(缩写DMAP)等、DABCO;反应溶剂可依据反应对温度、溶剂极性的需求,二氯甲烷(缩写DCM)、氯仿;反应温度可依据反应类型适当选取;反应时间可通过TLC、HPLC或LC-MS液相质谱联用等监控手段追踪反应情况得出。
高喜树碱去甲斑蝥素酸酯衍生物Ia(R=Me):将高喜树碱(100mg,0.27mmol)、去甲斑蝥素甲酯(109.0mg,0.54mmol)、EDCI(126.1mg,0.66mmol)、DMAP(27.48mg,0.17mmol)、二氯甲烷(20ml)于圆底烧瓶中,室温条件下反应36h。TLC点板追踪,展开剂(CH2Cl2:CH3OH=10:1),在紫外灯254nm下观察。反应停止后,取(CH2Cl2:H2O=3:2)于60ml的分液漏斗中对反应液进行萃取,收集下层有机层,加入适量的无水硫酸镁对其进行干燥30分钟,取滤液,溶剂旋干后,剩余物柱层析,洗脱剂(CH2Cl2:CH3OH=97:3),收集样品,旋干,50℃真空干燥箱烘干,得到黄色固体101mg,产率:67.3%。Rf=0.6(CH2Cl2:CH3OH=10:1),mp:154.3-155.7℃.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=8.24(s,1H),8.15(d,J=12Hz,1H),7.66(d,J=16Hz,2H),7.53(d,J=8Hz,1H),5.69(d,J=16Hz,1H),5.14-5.28(m,4H),4.96(s,1H),4.38(s,1H),3.72(d,J=4Hz,3H),3.25(s,2H),1.83-1.90(m,4H),1.64(d,J=8Hz,2H),0.97(t,J=8Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ=173.75,171.47,169.59,157.51,152.23,150.04,149.48,146.57,146.94,131.00,130.83,129.03,128.30,125.66,118.83,118.67,118.65,98.27,79.07,78.40,72.85,66.19,52.74,52.48,51.78,49.98,31.59,29.06,7.84.IR(KBr):ν(cm-1)=3443,3130,2988,1746,1660,1606,1503,1435,1399,1231,1191,1142,1054,999,817,555.
高喜树碱去甲斑蝥素酸酯衍生物Ib(R=Et):将高喜树碱(100mg,0.27mmol)、去甲斑蝥素乙酯(117.5mg,0.55mmol)、EDCI(124.4mg,0.65mmol)、DMAP(20.92mg,0.17mmol)、二氯甲烷(20ml)于圆底烧瓶中,室温反应36h。TLC点板跟踪,展开剂(CH2Cl2:CH3OH=20:1),在紫外灯254nm下观察。反应停止后,取(CH2Cl2:H2O=3:2)于60ml的分液漏斗中对反应液进行萃取,收集下层有机层,加入适量的无水硫酸镁对其进行干燥30分钟,取滤液,溶剂旋干,剩余物柱层析,洗脱剂(CH2Cl2:CH3OH=40:1),收集,旋干,50℃真空干燥箱烘干,得到白色固体102mg,产率:66.3%。Rf=0.33(CH2Cl2:CH3OH=20:1);mp:157.1-159.7℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=8.65(s,1H),8.18(d,J=14Hz,1H),7.78(s,1H),7.58(d,J=8Hz,1H),7.31(s,1H),6.52(s,1H),5.40(s,2H),5.24(s,2H),4.95(s,1H),4.79(s,1H),4.07(d,J=8Hz,2H),3.41(d,J=8Hz,2H),1.85(s,2H),1.64(s,4H),1.13(s,3H),0.87(s,3H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ=172.89,171.36,170.17,157.19,152.93,150.42,149.35,146.26,145.74,131.65,130.85,130.79,128.67,126.12,119.54,119.32,97.20,78.74,78.23,72.82,65.68,60.93,52.29,51.31,50.63,30.74,28.92,14.47,8.22.IR(KBr):ν(cm-1)=3474,3414,3130,2984,1745,1659,1615,1502,1399,1231,1191,1144,1051,998.
高喜树碱去甲斑蝥素酸酯衍生物Ic(R=Bn):将高喜树碱(100mg,0.27mmol)、去甲斑蝥苄酯(152.0mg,0.54mmol)、EDCI(105.0mg,0.54mmol)、DMAP(21.0mg,0.17mmol)、CH2Cl2(15ml)于圆底烧瓶中,室温条件下让其反应48h。TLC点板追踪,展开剂(CH2Cl2:CH3OH=20:1),在紫外灯254nm下观察。反应停止后,取(CH2Cl2:H2O=3:2)于60ml的分液漏斗中对反应液进行萃取,收集下层有机层,加入适量无水硫酸镁对其进行干燥30min,抽滤,取滤液,溶剂旋干,剩余物柱层析,洗脱剂(CH2Cl2:CH3OH=97:3),收集样品,溶剂旋干,50℃真空干燥箱烘干残余溶剂,得到黄色固体产物108mg,产率44.6%,Rf=0.58(CH2Cl2:CH3OH=20:1);mp:245.2-248.1℃;1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=8.62(s,1H),8.15(d,J=8Hz,1H),7.71(s,1H),7.48(d,J=12Hz,1H),7.31(d,J=12Hz,6H),6.55(s,1H),5.41(s,2H),5.26(s,2H),5.11(q,J=12Hz,2H),4.97(s,1H),4.83(s,1H),3.44(d,J=4Hz,2H),1.86(t,J=16Hz,2H),1.65(s,4H),0.87(s,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ=172.93,171.28,170.18,160.50,152.97,152.93,150.42,149.29,146.25,136.31,131.65,130.80,128.86,128.51,128.45,126.15,122.43,119.53,119.39,97.14,88.06,86.28,78.83,78.81,78.27,72.82,66.54,65.69,55.00,52.24,51.29,50.67,30.68,28.92,8.23.IR(KBr):ν(cm-1)=3419,3130,2975,1757,1739,1660,1558,1504,1456,1400,1360,1298,1233,1181,1145,1062,1001,839,741.
为了确定反应底物HCPT中的哪些OH基团参与了去甲斑蝥素单酸甲酯II的偶联反应,我们使用DMSO-d6作为溶剂测量了HCPT的1HNMR谱。不难发现酚羟基位于δ=10.22ppm和醇羟基位于δ=6.4ppm。因此,在由HCPT和去甲斑蝥素单酸甲酯IIa的偶联制备的产物Ia的1HNMR谱中,10-酚羟基的峰完全消失,明显表明酚羟基参与偶联反应。
生物活性测试实验
细胞株和溶剂
肿瘤细胞株:
人肝癌细胞HEPG2,人胃癌细胞BGC803,人结肠癌细胞SW480,人胰腺癌细胞PANC-1,
细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640中培养基,
溶剂:二甲亚砜(简称为DMSO)。
CCK-8染色法检测细胞抗肿瘤活性实施方案
本试验按照SRB方法,以斑蟊素为阳性对照,DMSO溶剂为空白对照,进行了浓度为50nnmol/mL的去甲斑蝥素单酸单酯衍生物3对肝癌细胞HEPG2、人胃癌细胞BGC803、结肠癌细胞SW480和胰腺癌PANC-1四种肿瘤细胞的抑制活性测试。
具体测试方案为:选用待测肿瘤活细胞比例达90%以上的细胞进行实验。细胞增殖抑制试验采用EnoGeneCellTMCounting Kit-8(简称为CCK-8)细胞活力检测试剂盒。细胞消化、计数、制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液,96孔板中每孔加入100μL细胞悬液(每孔1×104个细胞);96孔板置于37℃,5%CO2培养箱中培养24小时;每孔加入100μL相应的含药物的培养基,作用浓度为50μMol/L,同时设立阴性对照组,溶媒对照组,阳性对照组(阳性对照分别选用斑蝥素和喜树碱),每组5复孔;96孔板置于37℃,5%CO2培养箱中培养72小时后;每孔加入10μL CCK-8溶液,将培养板在培养箱内孵育4小时,用酶标仪测定在450nm处的吸光值(简称OD值),计算各个化合物对人肝癌细胞HEPG2、人胃癌细胞BGC803和结肠癌细胞SW480的抑制率。实验结果详见表1。
表1、高喜树碱去甲斑蝥素酸酯衍生物I对于4种肿瘤细胞的抑制活性
aprelimary testing concentartion c=50μMol/L
btest solvent DMSO
高喜树碱和去甲斑蝥素衍生物是针对不同肿瘤生长调节酶的化学结构,我们先前的研究发现喜树碱与去甲斑蝥素衍生物可容易地以中等至高产率制备得到喜树碱母体结构中20-OH连接的酯。按照这一发现,预计高喜树碱与去甲斑蝥素酸酯衍生物的偶联也会形成相应的母体结构20-OH连接的酯。然而令我们惊讶的是,上述偶联剂以及有机碱存在下的偶联反应高区域选择性地将高喜树碱母体结构的10位-酚羟基和去甲斑蝥素酸酯衍生物以酚酯衍生物形式获得。
活性实验表明这一高喜树碱去甲斑蝥素酸酯衍生物系列化合物对人肝癌细胞HEPG2、胃癌细胞BGC803、结肠癌细胞SW480和胰腺癌PANC-1四种癌细胞系有较强的抑制活性;可将其用于制备相应抗肿瘤候选药物。