SK397391A3 - 9,10-Substituované kamptotecíny, farmaceutický prípravok s ich obsahom a medziprodukt - Google Patents

Abstract

Sú opísané 9,10-substituované kamptotecíny všeobecného vzorca (I), kde X je hydroxyskupina, vodík, -CH2NH2 alebo formylová skupina, R je vodík, keď X je -CH2NH2 alebo formylová skupina, alebo Rje -CHO alebo -CH2RI, keď X je vodík alebo hydroxyskupina, R1 je -O-R2, -S-R2, -CH2NH2 v prípade, že X je hydroxyskupina, kyanoskupina, -N-R2(R3) alebo -N+-R2(R3)(R4) za predpokladu, že keď R1 je -N+-R2(R3)(R4), zlúčenina je spojená s farmaceutický prijateľným aniónom, R2, R3 a R4 sú rovnaké alebo rôzne a ich význam je uvedený v opisnej časti, alebo farmaceutický prijateľné soli, hydráty alebo solváty. Dalej je opísaný farmaceutický prostriedok s ich obsahom na inhibiciu rastu nádorových buniek a medziprodukt vhodný na výrobu účinných látok.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa vzťahuje na vo vode rozpustené 9,10-substituované kamptotecíny, na farmaceutický prípravok inhibujúci rast nádorových buniek s obsahom týchto látok a na medziprodukty na výrobu týchto zlúčenín.

Doterajší stav techniky štruktúra helixu DNA vyvoláva v eukaryotických bunkách určité topologické problémy, ktoré musí bunkový aparát vyriešiť, keď má použiť genetický materiál ako matricu. Oddelenie jednotlivých reťazcov DNA je základom pre niektoré bunkové pochody, ako je replikácia a transkripcia DNA.

Vzhľadom na to, že DNA je v eukaryotických bunkách organizovaná v chromatíne chromozómovými bielkovinami, zakončenia sú zovreté a reťazce sa nemôžu rozvinúť bez zásahu enzýmov, meniacich topológiu. Už dlho bolo uznávané, že by postup transkripcie a replikácie pozdĺž helixu DNA bol uľahčený otočným bodom, ktorý by znížil torzné napätie, vznikajúce pri týchto pochodoch. Topoizomerázy sú enzýmy, ktoré sú schopné vyvolávať zmeny v topológii DNA eukaryotických buniek. Sú rozhodujúce pre dôležité bunkové funkcie a bunkovú proliferáciu.

V eukaryotických bunkách sú dve triedy topoizomeráz, typ I a typ II. Topoizomeráza I je monomerný enzým s molekulovou hmotnosťou približne 100 000. Enzým sa viaže na DNA a spôsobuje prechodné jednotlivé prerušenie reťazca, rozvinutie dvojitého helixu, alebo možnosť jeho rozvinutia, a následovné znovuuzavretie tohto prerušenia pred disociovaním od reťazca DNA.

Topoizomeráza II je tvorená dvoma identickými podjednotkami molekulovej hmotnosti 170 000. Topoizomeráza II prechodne prerušuje obidva reťazce helixu, čo umožní prechod druhého dvojitého segmentu reťazca cez toto prerušenie.

-2Kamptotecín je vo vode nerozpustný, cytotoxický alkaloid vytváraný stromami

Camptoteca accuminata, nachádzajúcimi sa v Číne a Nothapodytes foedita, nachádzajúcimi sa v Indii. Kamptotecín a niekoľko jeho blízko príbuzných kongenérov sú jedinou známou triedou zlúčenín inhibujúcich topoizomerázu I.

Inhibícia topoizomerázy II je hlavným cieľom dôležitých komerčných onkolytických látok, ako je napríklad etopozid, doxorubicín a mitoxantrón, rovnako ako aj ďalších onkolytických látok, ktoré sú ešte vo vývoji. Kamptotecín (a jeho známe kongenéry) nemajú žiadny účinok na topoizomerázu II a žiadne známe inhibítory topoizomerázy II nemajú signifikantný účinok na topoizomerázu I.

Kamptotecín a jeho známe topoizomerázu I inhibujúce kongenéry sa neosvedčili ako zaujímavé pri vývoji klinicky použiteľných liečiv používaných ako cytolytické činidlá, pre nedostatok klinickej účinnosti, neprijateľnú toxicitu obmedzujúcu dávky, nepredvídateľnú toxicitu, slabú rozpustnosť vo vode a/alebo neprijateľnú stabilitu pri skladovaní. Preto existuje potreba nájsť inhibičné činidlá topoizomerázy I, ktoré sú bez nežiadúcich vlastností kamptotecínu a jeho známych k topoizomeráze I vzťahujúcich sa inihibičných kongenérov. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu spĺňajú tieto požiadavky.

Miyasaka ďalší, US patent č. 4 604 463 zverejnený 5. augusta 1986 a pridelený Yakult Honsha K. K., opisuje kamptotecínové deriváty všeobecného vzorca

C

II o

v ktorom

R¹ je atóm vodíka, atóm halogénu alebo alkylová skupina s 1 až 4 atómmi uhlíka, a

-3X je atóm chlóru alebo -NR²R³, kde R² a R³ sú rovnaké alebo rôzne a každý znamená atóm vodíka, substituovanú alebo nesubstituovanú skupinu vybranú zo skupiny tvorenej cyklopentylom, cyklohexylom, A/-metylpyridylom-(4), 2-pyrolidylom, fenylom, tolylom, xylylom, pyridylom-2 a 2-metylpyridylom-(4) s výnimkou, že keď obidva R² a R³ sú substituované alebo nesubstituovaná alkylové skupiny, môžu byť spojené navzájom atómom dusíka, ku ktorému sú naviazané, na vytvorenie heterocyklického kruhu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z pyrolidínu, piperidínu, 2-oxopyrolidínu, morfolínu, tiomorfolínu a 4-R⁴-piperidínových kruhov, v ktorých R⁴ je atóm vodíka, substituovaná alebo nesubstituovaná alkylová skupina s 1 až 4 atómmi uhlíka alebo substituovaná alebo nesubstituovaná fenylová skupina a v ktorom zoskupenie -O-CO-X je viazané atómom umiestneným v akejkoľvek 9-, 10a 11- polohe v kruhu A, a ich amónne soli alebo ich soli alkalických kovov.

Miyasaka a ďalší tiež konštatujú, že takéto kamptotecínové deriváty sú užitočné protinádorové lieky, majúce silný protinádorový účinok so zníženou toxicitou.

Miyasaka a ďalší, US patent č. 4 473 692 zverejnený 25. septembra 1984 a pridelený Yakult Honsha K. K., opisuje kamptotecínové deriváty všeobecného vzorca v ktorom

o

-4R¹ je atóm vodíka, priama alebo rozvetvená alkylová skupina s 1 až 30 atómami uhlíka, alkoxyskupina s 1 až 30 atómami uhlíka alebo aryloxyskupina a 1 až 17 atómami uhlíka,

R² je atóm vodíka, priama alebo rozvetvená alkylová skupina s 1 až 30 atómami uhlíka, cykloalkylová skupina s 5 až 8 atómami uhlíka alebo fenylalkylová skupina, naftylalkylová skupina, hydroxy mety lová skupina, karboxymetylová skupina alebo aryloxymetylová skupina a 1 až 17 atómami uhlíka a

R³ je XR', kde R* je atóm vodíka, priama alebo rozvetvená alkylová skupina s 1 až 30 atómami uhlíka, acylová skupina s 1 až 17 atómami uhlíka a X je atóm kyslíka alebo síry, alebo kde R* je nitroskupina, aminoskupina, alkylaminoskupina s 1 až 8 atómami uhlíka, acylaminoskupina s 1 až 17 atómami uhlíka alebo atóm halogénu s výnimkou, že keď obidva R¹ a R² sú atómy uhlíka, R³ nie je hydroxy-, metoxyalebo acetoxyskupina.

Miyasaka tiež uvádza, že hore uvedené kamptotecínové deriváty majú značný protinádorový účinok s malou toxicitou.

Miyasaka a ďalší, US patent č. 4 545 880 zverejnený 8. októbra 1985 opisuje spôsob výroby kamptotecínových derivátov všeobecného vzorca

v ktorom

R¹ znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu, hydroxylovú skupinu, alkoxyskupinu alebo acyloxyskupinu,

-5R² znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu, aralkylovú skupinu, hydroxymetylovú skupinu, karboxymetylovú skupinu aiebo acyloxymetylovú skupinu,

R' znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu alebo acylovú skupinu, a

X znamená atóm kyslíka alebo síry.

Yakult Honsha K. K., európska patentová prihláška číslo zverejnenia 0,088 642, A2, zverejnená 4. septembra 1983 opisuje kamptotecinové deriváty

v ktorom

R¹ a R² každý znamená atóm vodíka, susbtituovanú alebo nesubstituovanú skupinu, substituovanú alebo nesubstituovanú aralkylovú skupinu alebo substituovanú alebo nesubstituovanú arylovú skupinu a R¹ a R² spolu s atómom dusíka, ku ktorému sú pripojené, môžu tvoriť cyklickú skupinu.

Yakult Honsha K. K. uvádza, že takéto zlúčeniny sú užitočné ako farmaceutické medziprodukty pre protinádorové látky.

Wani a ďalší, J. Med. Chem., 29, 2358 - 2363 (1986) opisujú L-1210 myšie leukémické skúšky protinádorovej aktivity rôznych kamptotecínových analógov vrátane 9-nitro-20(S)-kamptotecínu, 9-amino-20(S)-kamptotecínu, 9-nitro-10metoxy-20(S)-kamptotecínu, 9-nitro-10-hydroxy-20(S)-kamptotecínu a 9-acetamido10-hydroxy-20(S)-kamptotecínu.

Nitta a ďalší, Proc. 14”¹ International Congr. Chemotherapy, Kyoto, 1985, Tokyo Univ. Tokyo Press, Anticancer Section 1, str. 28 až 30, opisuje, že zlúčenina

-6označená CPT-11 má profilovú účinnosť v predklinických modeloch tumorov. CPT11 je vo vode rozpustný kamptotecínový analóg so 4-(piperidino)piperídínovým bočným reťazcom spojeným cez karbamátovú väzbu na C-10 10-hydroxy-7etylkamptotecínu.

Hoci kamptotecín je toxický pre močový mechúr a má nepredvídateľnú toxicitu na proliferujúce tkanivá, čo vopred vylučuje jeho použitie, zdá sa, že 10hydroxykamptotecín podľa čínskej literatúry má schopnosť zadržovať aktivitu ľudských tuhých tumorov s oveľa viac zníženou toxicitou. Pozri Xu Bin a Yang Jin Long Advances in Chinese Medicinal Materials Research, H. M. Chang a ďalší, Eds., World Scientific Publ. Co., Singapore, 1985, str. 377, ktorí opisujú výsledky fázy I a fázy II klinických skúšok 10-hydroxykamptotecínu na 253 pacientoch s niekoľkými typmi ľudských tuhých nádorov.

Department of Maxillo Facial Surgery, 9*¹ People's Hospital, Shanghai, Clin. J. Stomatology, 13, 75 (1978) opisuje fázu II klinických skúšok kamptotecínu a 10hydroxykamptotecínu u niekoľkých typov ľudských tuhých nádorov.

Wani a ďalší, J. Med. Chem., 23, 554 (1980) opisuje syntézu rôznych syntetických analógov kamptotecínu a 10-hydroxykamptotecínu vrátane analógu, ktorým je dietylaminoetyléter na C-10.

Wani a ďalší, J. Med. Chem., 30, 1774 (1987) opisuje syntézu rôznych 11substituovaných kamptotecínových analógov vrátane kyano-, nitro-, amino-, dimetylamino, formylových, aminometylových a hydrometylových. Wani a ďalší opisujú, že medzi týmito analógmi len 11-kyano, 11-nitro a 11-aminokamptotecínové analógy sú účinné v skúškach protinádorovej aktivity. Zreteľne 11-aminometylový analóg a jeho hydrochloridová soľ sú opisované ako neúčinné.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu sú 9,10-substituované kamptotecíny všeobecného vzorca I

-Ί -

kde

X je hydroxyskupina, vodík, -CH2NH2 alebo formylová skupina,

R je vodík, keď X je CH2NH2 alebo formylová skupina, alebo R je -CHO alebo -CH₂R¹, keď X je vodík alebo hydroxyskupina,

R¹ je -O-R², -S-R², -CH2NH2, v prípade, že X je hydroxyskupina, kyanoskupina, -N-R²(R³), alebo N⁺-R²(R³)(R⁴) za predpokladu, že keď R¹ je -N⁺-R²(R³)(R⁴), zlúčenina je spojená s farmaceutický prijateľným aniónom,

R², R³, R⁴ sú rovnaké alebo rôzne a sú vybrané z H, alkylovej skupiny s 1 až 6 atómami uhlíka, hydroxyalkylovej skupiny s 2 až 6 atómami uhlíka, C1-6 dialkylamino-C₂-6-alkylovej skupiny, aminoalkylovej skupiny s 2 až 6 atómami uhlíka alebo 3 až 7-členného nesubstituovaného karbocyklického kruhu, a v prípade, že R¹ je -N-R²(R³), skupiny R² a R³ sa môžu navzájom spojiť atómom dusíka, ku ktorému sú viazané za vzniku heterocyklického kruhu za predpokladu, že takýto kruh je vybraný z morfolínového, /V-metylpiperazinylového alebo 4‘-p-piperidino-piperidínového kruhu, alebo ich farmaceutický prijateľné soli, hydráty alebo solváty.

Vynález sa tiež týka kamptotecínového derivátu vzorca II

ako medziproduktu na výrobu zlúčenín podľa vynálezu.

Pojem karbocyklický kruh sa chápe ako úplne nasýtený alebo úplne nenasýtený kruhový systém.

Výhodné zlúčeniny všeobecného vzorca I zahrnujú také zlúčeniny, v ktorých, ak X je hydroxyskupina, R je dimetylaminometylová skupina, /V-morfolinometylová, /V-metylpiperazinylmetylová, (4'-piperidín)-/V-piperidinylmetylová, (2-hydroxyetyl)aminometylová, trimetylamóniummetylová, cyklohexylaminometylová, /V-metylanilinometylová, etoxymetylová, cyklopropylaminometylová, /V,/V-dimetylaminoetoxymetylová, Λ/,/V-dimetylaminoetylaminometylová, kyanometylová, aminoetylová alebo formylová skupina. Výhodné zlúčeniny všeobecného vzorca I tiež zahrnujú také zlúčeniny, v ktorých R je vodík, X je kyanoskupina, formylová alebo aminometylová skupina. Ďalšími výhodnými zlúčeninami všeobecného vzorca I sú také zlúčeniny, v ktorých X je vodík a R je dimetylaminometylová alebo Nmorfolinometylová skupina. Výhodné sú najmä zlúčeniny všeobecného vzorca I, kde R je dimetylaminometylová skupina, najmä jej S-izomérna forma.

Vynález sa tiež týka farmaceutických prostriedkov tvorených účinným množstvom inhibujúcim rast nádorových buniek zlúčeniny všeobecného vzorca I a inertným farmaceutický prijateľným nosičom alebo riedidlom.

Vynález sa tiež vzťahuje na spôsob inhibície rastu nádorových buniek citlivých na zlúčeninu všeobecného vzorca I, ktorá pozostáva z aplikovania zvieratám, vrátane ľudí, ovplyvnených uvedenými nádorovými bunkami, účinného, rast nádorových buniek inhibujúceho množstva takejto zlúčeniny.

-9Je známe, že v dôsledku prítomnosti asymetrického atómu uhlíka v kruhu E zlúčeniny všeobecného vzorca I, t.j. k uhlíkovému atómu číslo 20, budú existovať optické izoméry. Výhodným izomérom je S-izomér, avšak R-izomér a racemická zmes (racemát) sú tiež zahrnuté v rozsahu zlúčenín všeobecného vzorca I.

Odborníkom v danej oblasti techniky sú dobre známe farmaceutický prijateľné soli a ich výroba. Výhodné farmaceutický prijateľné soli zlúčenín všeobecného vzorca I zahrnujú acetát, metánsulfonát a hydrochlorid, napríklad ako je mono- a di-hydrochlorid, rovnako ako aj soli alkalických kovov zlúčenín všeobecného vzorca I, napríklad sodné soli, v ktorých E-kruh laktónu bol podrobený hydrolýze zásadou.

Odborníkom v danej oblasti techniky sú dobre známe farmaceutický prijateľné anióny kvartérnych solí. Výhodné farmaceutický prijateľné soli zlúčenín všeobecného vzorca I, v ktorých R¹ je -N⁺-R²(R³)(R⁴) zahrnujú metánsulfonát a chlorid.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I môžu vytvárať hydráty alebo solváty. Odborníkom v danej oblasti techniky je známe, že nabité zlúčeniny tvoria hydratované druhy, keď sú lyofilizované vodou, alebo tvoria solvatované druhy, keď sú koncentrované v roztoku s vhodným organickým rozpúšťadlom.

Zlúčenina vzorca II sa môže vyrobiť spôsobom opísaným v príklade 22.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sa môžu vyrobiť z 10-hydroxykamptotecínu Mannichovou reakciou. Kondenzácia 10-hydroxykamptotecínu s formaldehydom a primárnym alebo sekundárnym amínom (Mannichova reakcia) poskytne všetky zlúčeniny všeobecného vzorca I okrem zlúčenín, v ktorých X je vodík, kyanoskupina alebo formylová skupina a R¹ je -N-R²(R³) a R² a R³ sú rovnaké a sú vodíky. Alternatívne sa 10-hydroxykamptotecín môže formylovať (Duffova reakcia), čím vznikne 9-formyl-10-hydroxykamptotecín, ktorý sa môže podrobiť kondenzácii s aminmi, následne chemickej redukcii s kyanoborohydridom sodným alebo katalytickej redukcii (Pd/C, H₂), čím vzniknú produkty analogické tým, ktoré sú získané Mannichovou reakciou, rovnaké ako zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorých R¹ je -N⁺-R²(R³)(R⁴) a R² a R³ sú rovnaké a sú vodíky. Zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorých R¹ je -N⁺-R²(R³)(R⁴) a R², R³ a R⁴ nie sú vodíky, sa získajú pôsobením zodpovedajúcich zlúčenín všeobecného vzorca I, v ktorých R¹ je

-10-N-R²(R³) s alkylačným činidlom. Mannichova reakcia bola nájdená Magarianom a ďalšími, J. Pharm. Sci., 56, 987 (1967). Duffova reakcia bola opísaná Duffom a ďalšími, J. Chem. Soc., 547,1941.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I, kde R¹ je O-R² alebo S-R² sa môžu vyrobiť z 9-dimetylaminometyl-10-hydroxykamptotecínu alebo jeho solí zahrievaním s vhodným alkoholom alebo tiolom v inertnom rozpúšťadle, napríklad vdimetylformamide. Keď sa použije voľná báza, pridá sa malé množstvo silnej kyseliny, napríklad kyseliny chlorovodíkovej. Takéto deriváty sa tiež môžu vytvoriť priamo Mannichovou reakciou, keď alkohol alebo tiol sa zahrnie do reakčnej zmesi a pridá sa silná kyselina, alebo aminová zložka je soľou silnej kyseliny.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I, kde X je vodík, kyanoskupina, formylová skupina alebo aminometylová skupina sa môžu vyrobiť zo zlúčeniny vzorca II paládiom katalyzovanou karbonyláciou. Paládiom katalyzovaná karbonylácia aryltriflátov je opísaná Cacchim a ďalším, Tetrahedron Letters, 27, 3931, 5541 (1986), Petrakisom a ďalšími, J. Amer. Chem. Soc., 109,2831, (1981) a Chatanim a ďalšími, J. Org. Chem., 51,4714 (1986).

Východzí materiál na výrobu zlúčenín všeobecného vzorca I, t.j. 10-hydroxykamptotecín je prirodzeným produktom nachádzajúcim sa v rovnakej rastline ako kamptotecín (pozri Wani a ďalší, J. Org. Chem., 34, 1364, 1969). 10-Metoxykamptotecín bol tiež izolovaný z rovnakej rastliny ako kamptotecín a môže sa premeniť na 10-hydroxykamptotecín zahrievaním pod spätným chladičom s bromovodíkom. Samotný kamptotecín sa môže tiež premeniť na 10-hydroxykamptotecín redukciou pyridínového kruhu, nasledovanou oxidáciou s octanom olovičitým ((CH3COO)4Pb) (pozri Yakult Honsha K. K., japonská patentová prihláška č. 9 005 188, podaná 30. júna 1982). Racemický 10-hydroxykamptotecín sa tiež môže vyrobiť spôsobom podľa Waniho a ďalších, J. Med. Chem., 23, 554 (1980). Bolo opísané veľké množstvo metód úplnej syntézy kamptotecínu. Pozri príklad Hutchinson, Tetrahedron, 37, 1047, 1981 a Suffness a Coldel, The Alkalois Chemistry and Pharmacology, Brossi A. a ďalší, zv. 25, Academic Press, Orlandoo, F la., 73, (1985) pre prehľad literatúry. Najpraktickejšia cesta (ďalej označovaná ako Waniho cesta) na výrobu kamptotecínu, ktorý je racemický viazaný na uhlíku v 20. polohe, je opísaná Wanim a ďalšími, J. Med. Chem., 23, 554 (1980).

-11 Užitočnosť zlúčenín všeobecného vzorca I

a) Cytotoxicita

Acetátová soľ zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorej R je dimetylaminometyl (S-izomér) (v ďalšom označovaná ako zlúčenina č. 1S‘j vykazuje silnú antiproliferatívnu účinnosť v celom rade kultivovaných bunkových línií (tabuľka 1). V sérii ôsmich kultivovaných bunkových línií z nádorových buniek ľudského hrubého čreva, bola zlúčenina č. 1S dosť konzistentná vo svojej cytotoxickej účinnosti. Po krátkej expozícii (2 hodiny) liečiva, 50%-ná inhibičná koncentrácia sa pohybovala od 0,12 až do 2,1 mikrogramov/ml. Keď bolo liečivo ponechané v kultivačnom médiu počas celého sedemdenného obdobia, v priebehu ktorého bunky proliferovali, hodnoty IC50 boli v rozsahu od 3,9 do 75 ng/ml.

Tiež boli vyhodnotené na citlivosť na zlúčeninu č. 1S tri hlodavčie nádorové línie a dve normálne hlodavčie bunkové línie.

Boli hodnotené bunkové línie K12/Tr potkanieho karcinómu hrubého čreva a potkanej obličky a intestinálnych epitelov v rovnakom pokuse s použitím koncového bodu používaného v pokusoch s ľudskými nádorovými bunkami hrubého čreva, CACO-2 a WiDR. Myšie tumorové bunkové línie, L1210 leukémia a B16 melanóm, neboli viac citlivé na zlúčeninu č. 1S ako nádorové bunkové línie ľudského hrubého čreva. V skutočnosti B16 melanómová bunková línia sa zdala byť značne menej citlivá ako druhá testovaná línia. Zbytočne B16 a L1210 sú obidva dosť citlivé na zlúčeninu č. 1S v in vivo terapeutických skúškach u myší s týmito nádormi.

Protokol použitý na hodnotenie cytotoxicity zlúčeniny č. 1S v bunkových líniách uvedených v tabuľke 1 bol zvyčajne nasledujúci:

Bunkové línie sa používajú a prechovávajú ako jednovrstvové kultúry v minimálnom esenciálnom médiu (Grand Island Biological Co., Grand Island, N. Y.) doplnením 10%-ným fetálnym teľacím sérom v 5% CO₂ zvlhčovaním inkubátora pri 37 °C. Rôzne koncentrácie zlúčeniny všeobecného vzorca I sa nechajú za sterilných podmienok reagovať po 2 hodiny, nasleduje ašpirácia média alebo sa exponujú kontinuálne. Dosky sa inkubujú počas 7 dní pri 37 °C v CO₂ inkubátore. Médium sa ašpiruje a bunky sa fixujú a napustia etanolom a Geismovým farbivom. Populácia

-12prežívajúcich buniek sa určí snímaním platní pomocou obrazového analyzátora. Percento inhibície proliferácie sa určí relatívne k bunkám inkubovaným v neprítomnosti liečiva a interpoláciou sa určí 50%-ná inhibičná koncentrácia (IC₅o).

Tabuľka 1

Cytotoxicita zlúčeniny č. 1S na nádorové bunky v kultúre

Označenie línie	IC50 (pg/ml)
	2 hodiny expozície	kontinuálna expozícia
Bunkové línie nádorov ľudského hrubého čreva
SW-620	0,12	0,0065
SKCO-1	0,23	0,0039
SW-948	0,26	0,016
DLD-1	0,44	0,015
LOVO	0,58	0,0097
HT-29	0,58	0,016
CACO-2	1,7	0,075
WIDR	2,1	0,025
Bunkové línie nádorov hlodavcov
L1210 leukémia	1,4	n.t.*
K12/Tr karcinóm hrubého čreva	3,9	0,084
B16 melanóm	n. t.x	0,62
Normálne bunkové línie hlodavcov
NRK52E (epitel potkanej obličky)	1,2	0,052
IEC-6 (intestinálny epitel potkana)	3,9	0,017

^x n. t. = netestované

-13Veľa zlúčenín všeobecného vzorca I bolo hodnotených na cytotoxicitu proti L1210 bunkám leukémie rastúcich v suspenznej kultúre (tabuľka 2). Bunky boli exponované kontinuálne po klonovaní do média obsahujúceho 0,2 % Nobleho agaru. Po inkubácii pri 37 °C v CO₂ inkubátore po dobu troch dní, kolónie boli napustené špecifickým formazanovým farbivom pre životaschopné bunky a 24 hodín neskôr boli spočítané počítačom kolónií (Biotran II, New Brunswick Scientific Co., Edison, N. J.) upravenom na identifikáciu kolónií s viac ako 50-timi bunkami. Koncentrácie, ktoré znižujú účinnosť klonovania o 50% (ICso), boli určené interpoláciou. Zlúčeniny všeobecného vzorca I majú hodnoty IC50 od 12 do 690 nM, t.j. hodnoty IC₅o, ktoré preukazujú cytotoxický účinok. Príbuzný prirodzený produkt, 10-hydroxykamptotecín má IC5018 nM. Cytotoxické zlúčeniny všeobecného vzorca I sú silnými inhibítormi purifikovanej topoizomerázy I. Ako je stanovené v nasledujúcom odstavci, ktorý sa vzťahuje k aktivite in vivo, veľa zlúčenín všeobecného vzorca I aj keď sú všeobecne menej toxické ako 10-hydroxykamptotecín, má protinádorový účinok proti L1210 leukémii in vivo, ktorý je ekvivalentný alebo lepší ako účinok 10-hydroxykamptotecínu. Napríklad zlúčenina č. 1S bola asi trikrát menej účinná ako 10-hydroxykamptotecín s ohľadom na cytotoxickú účinnosť proti L1210 leukemickým bunkám in vitro, ale vykazovala inhibičnú aktivitu rastu nádorových buniek in vivo, ktorá bola všeobecne lepšia ako 10-hydroxykamptotecínu u celej rady transplantovateľných hlodavčích nádorových modelov.

Tabuľka 2

-14Aktivita zlúčenín všeobecného vzorca I proti L1210 leukémii in vitro a in vivo u myší, ktoré majú i. p. implantované nádory

Zlúčenina	R	x	Aktivita IC50 (nM)	Protinádorová aktivita in vitro
MTD (mg/kg)	ILS (%)
10-hydroxy- kamptotecín	-H	hydroxy	18	9	94
1S	-CH2N(CH3)2 (acetát)	hydroxy	56	15	<200
2S	-CHO	hydroxy	260	42	75
3S	-CH2N+(CH3)3	hydroxy	150	42	>200
4S	-ch2nhch2ch2oh	hydroxy	250	42	75
5S	/—\ CH2N ň	hydroxy	570	100	83
6S	tCH-N nch, \ /	hydroxy	72	75	>200
7S	“•OO	hydroxy	270	>42x	44
8S	-CH2NH —	hydroxy	130	25	131
9S	© -CH2N	hydroxy	69	42	112
10S	-ch2och2ch3	hydroxy	48	25	131

Zlúčenina	R	X	Aktivita IC50 (nM)	Protinádorová aktivita in vitro
MTD (mg/kg)	ILS (%)
11S	-CK^riH-ς λ	hydroxy	56	25	>200
12S	-CH2NHCH2CH2N(CH3)2	hydroxy	49	42x	94
13S	-CH2OCH2CH2N(CH3)2	hydroxy	n. t.*	42	188
14S	-CH2SCH2CH2N(CH3)2	hydroxy	12	42	112
15S	-CH2N(CH3)2	vodík	65	15	88
16S	vodík	kyano	80	3	100
17S	-ch2cn	hydroxy	400	12	>200
18S	-CH N λ	vodík	690	13	144
19S	vodík	-CHO	62	n. t.*	n. t.*
20S	vodík	-CH2NH2	90	92	112
21S	-CH2N(CH3)2 sodná soľ	hydroxy	n. t.	54	>200
22S	-CH2CH2NH2	hydroxy	360	100	75

n. t. = netestované

Pre štúdie in vivo L1210 bunky sa implantujú intraperitoneálne (i. p.) (10⁶ buniek na myš) a liečiva sa aplikujú i. p. v 1. a 5. dni. Vzostup dĺžky života (ILS) bol založený na priemernej dobe prežitia skupiny 6 myší liečených maximálne tolerovaternou dávkou liečiva (MTD).

^x Najvyššia testovaná dávka (stupeň aktivity je pravdepodobne väčší pri vyššej dávkovej hladine).

-16Pre in vitro štúdie bunky L1210 sa nechajú rásť v suspenznej kultúre a exponujú sa liečivami kontinuálne po klonovaní buniek do niektorého agaru. Stanoví sa klonovacia účinnosť. Interpoláciou sa stanoví 50%-ná inhibičná koncentrácia (IC₅o).

Všetky hore uvedené zlúčeniny boli účinnými inhibítormi topoizomerázy I purifikovanej z rakovinových buniek ľudského hrubého čreva, 50%-ná inhibičná aktivita enzýmu bola pozorovaná v koncentráciách <3 μΜ.

b) Inhibícia rastu nádorových buniek in vivo

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sa na začiatku ohodnotia na in vivo protinádorovú aktivitu u myší, ktoré majú intraperitoneálne (i. p.) implantovanú L1210 leukémiu (zlúčeniny č. 1S a 4S až 13S v tabuľke predĺžia dĺžku života o >40 % pri ich maximálne tolerovateľných dávkových hladinách). Tri zlúčeniny č. 1S, 6S a 11S sú obzvlášť účinné, predlžujú dĺžku života o >200% a vyvolávajú dlhodobé, beznádorové prežitie. Veľa zlúčenín má aktivitu lepšiu ako prirodzený produkt, 10hydroxykamptotecín, ktorému sú zlúčeniny všeobecného vzorca I štruktúrne príbuzné. Pre dve zo zlúčenín č. 7S a 13S, najvyššie testovaná dávka nebola toxická, tak tieto zlúčeniny môžu mať väčšiu aktivitu pri vyšších dávkových hladinách. Napriek tomu, tieto zlúčeniny boli aktívne pri testovaných dávkových hladinách.

Založené na jej vysokom stupni aktivity a potencie in vivo (t.j. nízkej maximálne tolerovanej dávke) zlúčenina č. 1S bola ohodnotená v celom rade transplantovaných myších nádorových modelov. Zlúčenina č. 1S má vysoký stupeň aktivity vo svojej maximálnej dávke v celom rade zvieracích nádorových modelov, vrátane leukémií a tuhých nádorov rôznych histiotypov. Spektrum aktivity zlúčeniny č.1S je zhrnuté v tabuľke 3. Vysoká hladina aktivity bola pozorovaná u väčšiny tumorových modelov, s tým, že len u jedného z modelov i. p. karcinómu 26 holou bola pozorovaná takmer úplná refraktérnosť na liečivo. Tiež dva zo subkutánnych (s. c.) modelov karcinómu 26 holou a Madisonovho pľúcneho karcinómu sa preukázali ako refraktérne na liečivo, t.j. v týchto modeloch, skromná aktivita t.j. >70%-ná inhibícia rastu tumoru bola zrejmá, keď boli liečené myši, ktoré mali subkutánne nádory, zlúčeninou č. 1S. U druhých s. c. nádorových modelov bola

-17preukázaná vysoká aktivita (väčšia ako 90%-ná inhibícia). Zreteľne zlúčenina č. 1S aplikovaná i. p. vykazovala vysokú aktivitu nielen proti i. p. nádorovým modelom, ale aj u myší inokulovaných nádormi intravenózne (i. v.) alebo subkutánne (s. c.). Liečivý účinok bol zrejmý u určitých nádorových modelov vrátane i. p. a i. v. implantovaných P388 a L1210 leukémii a i. v . a s. c. implantovaného Lewisovho karcinómu pľúc. Úroveň a spektrum aktivity zlúčeniny č. 1S u zvieracích nádorových modelov je výhodne porovnateľná s najviac účinnými zo známych protinádorových liečiv, ako je napríklad cyklofosfamid, cispiatín a doxorubicín.

Výsledky týchto štúdii na transplantovaných myších nádorových modeloch sú zhrnuté podrobnejšie v tabuľke 4, ktorá ukazuje predĺženie dĺžky života (ILS) alebo percentuálnu inhibíciu merateľného (t.j. subkutánneho) rastu tuhých nádorov pri optimálnych dávkach a optimálnych rozvrhoch aplikácie zlúčeniny č. 1S. V tabuľke 4 sú ukázané aj výsledky získané v porovnávacích štúdiách na týchto nádorových modeloch s pôvodnými zlúčeninami prirodzeného produktu, kamptotecínu a 10hydroxykamptotecínu. Tieto výsledky boli dosiahnuté pri i. p. alebo i. v. aplikácii zlúčeniny č. 1S pri intermitentnom rozvrhu, t.j. každý štvrtý alebo ôsmy deň. V niektorých prípadoch boli výsledky získané s optimálnym dávkovým rozvrhom liečenia, v ktorom zlúčenina č. 1S bola aplikovaná v rozdelenom dávkovom režime (každé 3 hodiny x 4) v každom dni liečenia, ako je podrobnejšie opísané nižšie. Kamptotecín a 10-hydroxykamptotecín sa vždy aplikujú ako suspenzie i. p. v dôsledku ich nerozpustnosti vo vodných vehikulách.

Z tabuľky 4 je zrejmé, že všetky tri zlúčeniny majú široké spektrum aktivity u zvieracích nádorových modelov. Lepšia aktivita zlúčeniny č. 1S je zrejmá z niektorých nádorových modelov vrátane: i. p. L1210 leukémie, i. p. B16 melanómu,

i. v. P388 leukémie, i. v. L1210 leukémie, s. c. Lewisového pľúcneho karcinómu, s. c. B16 melanolu/podlínia F10, s. c. karcinómu 51 hrubého čreva, a s. c. Madisonového pľúcneho karcinómu. 10-Hydroxykamptotecín je dosť účinný u i. p. implantovaných nádorových modelov, ale má nedostatočnú aktivitu u nádorových modelov, u ktorých je nádor imlantovaný v mieste vzdialenom od miesta aplikácie liečiva, toto liečivo má prinajlepšom maximálnu účinnosť u s. c. implantovaných tuhých nádorových modelov. To pravdepodobne nie je spôsobené slabou rozpustnosťou 10-hydroxykamptotecínu, pretože kamptotecín je rovnako

-18nerozpustný, ale je značne účinný u určitých s. c. tumorových modelov. Je možné, že aromatická hydroxylová skupina 10-hydroxykamptotecínu je vnímavá na prvý prechod a biliárnu exkréciu a tak zlúčenina nedosahuje primeranú koncentráciu v systémovej cirkulácii. Pozoruhodné je, že zlúčenina č. 1S, ktorá má tiež 10hydroxykamptotecínovú skupinu, je vysoko aktívna u s. c. a i. v. nádorových modelov. To môže byť spôsobené prítomnosťou bázického bočného reťazca v 9. polohe zlúčeniny č. 1S, ktorý môže inhibovať metabolizmus 10-hydroxylovej skupiny stérickou zábranou, viazaním vodíka alebo vytvorením inertnej soli. 10Hydroxykamptotecín je vysoko aktívny u i. p. karcinómu 26 hrubého čreva, ktorý je necitlivý na zlúčeninu č. 1S a minimálne citlivý na kamptotecín. Avšak rovnaký tumor je refraktérny na 10-hydroxy-kamptotecín, keď je implantovaný s. c. a má ešte skromnú citlivosť na zlúčeninu č. 1S v tomto usporiadaní.

Ďalej okrem vysokého stupňa a širokého spektra aktivity zlúčeniny č. 1 S, ako je demonštrované v tabuľke 4, zlúčenina by mala tiež zachovávať úplný protinádorový účinok pri orálnej aplikácii. To bolo demonštrované u myší, ktoré majú

s. c. implantovaný Lewisov karcinóm pľúc a je to nižšie podrobnejšie opísané.

Inou vlastnosťou zlúčeniny č. 1S je jej retencia aktivity v sublíniách P388 leukémie, ktoré vykazujú rezistenciu na mnohé protinádorové látky ako je opísané nižšie. Ako hlavný problém v chemoterapii rakoviny je nájdenie rezistentných populácií nádorových buniek, ktoré zlyhávajú v odpovedi, na pôvodne účinné režimy podania liečiv, rovnako ako režimy liečenia sekundárnych línií, dostupnosť liečiv, na ktoré rezistentné bunky nie sú rezistentné, by mali mať signifikantný dopad na ovládanie rakoviny.

Aktivita zlúčeniny č. 1S v každom z nádorových modelov, ktoré boli testované je opísaná vo väčších detailoch v nasledujúcich odstavcoch.

i. p. nádorové modely

Aktivita zlúčeniny 1S aplikovanej i. p. alebo s. c. v rôznych programoch liečenia myší, ktoré majú i. p. implantované tumory je ukázaná v tabuľke 5. Údaje ukazujú závislosť protinádorového účinku na dávke zlúčeniny č. 1S u šiestich i. p. implantovaných nádorových modelov.

-19Ρ388 leukémia: Keď je podaná i. p. v dňoch 1 a 5 myšiam, ktoré majú i. p. P388 leukémiu, zlúčenina č. 1S vyvoláva 200% ILS so 4/6 dlhodobo prežívajúcimi zvieratami (v koži) a jej maximálne tolerovateľná dávka je 15 mg/kg. Nižšie dávky sú tiež vysoko účinné s vzostupmi v dĺžke života na 125 % z 32 %. Tento vysoký stupeň aktivity bol potvrdený v inom pokuse opísanom nižšie (pozri tabuľku 8), v ktorom maximálna tolerovateľná dávka vyvolávala 228% ILS s 2/6 dlhodobo prežívajúcimi zvieratami. Zlúčenina č. 1S takto mala liečebný účinok u myší, ktoré majú i. p. P388 leukémiu.

L1210 leukémia: Keď bola podaná i. p. v dňoch 1 a 5 zlúčenina č. 1S, bola reprodukovateľné aktívna u myší, ktoré majú i. p. L1210 leukémiu. V reprezentatívnom pokuse ukázanom v tabuľke 5, bolo 219 % ILS s 2/6 vyliečeniami pri maximálnej tolerovanej dávke 15 mg/kg. Rovnako sa našla dobrá aktivita pri dvoch nižších dávkach. Zlúčenina č. 1S bola v tomto usporiadaní hodnotená v ôsmich pridaných štádiách dávky a odpovede. Percento ILS a dlhodobé prežívanie získané pri maximálne tolerovaných dávkach v týchto experimentoch boli: 44 % (0/6), >300 % (5/6), 119 % (0/6), 156 % (1/6), 138 % (0/6), 156 % (2/6), 350 % (2/6) a 138 % (1/6). Z toho vyplýva, že v 8/9 pokusov zlúčenina č. 1S vyvolávala >100% ILS a v 6/9 pokusoch boli prítomní dlhodobo prežívajúci jedinci.

B16 melanóm: V tomto nádorovom modeli, v ktorom zlúčenina č. 1SS bola zreteľne lepšia ako kamptotecín a 10-hydroxykamptotecín (pozri tabuľku 4), liečivo vyvolávalo 52% ILS pri svojej maximálne tolerovanej dávke 15 mg/kg podanej i. p. v dňoch 1, 5, 9 a 13. Tento výsledok sa potvrdil v druhom pokuse, v ktorom najvyššia testovaná dávka 9,6 mg/kg vyvolala 130% ILS.

B16 melanóm/podlínia F10: F10 podlínia B16 melanómu je vysoko metastázujúcou podlíniou tohto nádoru, ktorý bol vybraný klonovaním. Zlúčenina č. 1S vyvoláva 105% ILS pri svojej maximálne tolerovanej dávke 15 mg/kg podanej i. p. v dňoch 1, 5, 9 a 13. Ako je indikované, aktivita zvyšuje dĺžku života o >40%, a bola rovnako zrejmá aj u dvoch nižších dávok.

M5076 sarkóm: M5076 sarkóm je metastázujúci sarkóm retikulámych buniek, ktorý vzniká vo vaječníkoch C5781/6 myší a bolo nájdené, že je transplantovateľným nádorom. Tento nádor implantovaný i. p. bol citlivý na zlúčeninu č. 1S, keď látka bola podaná s. c. rovnako ako i. p. aplikáciou. Stupeň aktivity bol virtuálne

-20identický 98% ILS a 105% ILS, týmito dvoma aplikačnými cestami v delenej dávkovej schéme každé tri hodiny x 4 v dňoch 1, 5 a 9. Táto schéma, ako je nižšie opísané, zdá sa byť optimálna pre zlúčeninu č. 1S v celom rade nádorových modelov. Zlúčenina č. 1S bola hodnotená v troch prídavných štúdiách dávky a účinku u myší, ktoré majú i. p. M5076 sarkóm. V týchto štúdiách látka bola podaná ako jediná dávka v dňoch 1, 5 a 9 i. p. (75% ILS s 1/3 vyliečeniami), ako jednotlivá dávka v dňoch 1, 5, 9 a 13 i. p. (71 ILS a 1/8 vyliečeniami) a ako jedna dávka v dňoch 1, 5 a 9 s. c. (57% ILS). Ako pri i. v. a s. c. nádorových modeloch (ako je nižšie opísané), zlúčenina č. 1S sa zdá byť najúčinnejšia u i. p. M5076 sarkómu, keď je podaná v dennom dávkovom režime. Napriek tomu bez ohľadu na schému aplikácie je zlúčenina č. 1S reprodukovateľné aktívna u tohto nádorového modelu.

Karcinóm 26 hrubého čreva: Karcinóm 26 hrubého čreav je vysoko invazívny a metastázujúci nediferencovaný tumorový model na hrubom čreve. Tento nádor, v testovanej schéme sa ukázal ako refraktérny k maximálne tolerovanej dávke zlúčeniny č. 1S.

i. v. nádorové modely

Aktivita zlúčeniny č. 1S aplikovanej i. p. alebo i. v. myšiam, ktoré majú systémové (i. v. inokulované) leukémie alebo Lewisov pľúcny karcinóm je ukázaná v tabuľke 6. Závislosť odpovede na dávke a závislosť na schéme podania zlúčeniny č. 1S je jasne v týchto štúdiách demonštrovaná. V každom z troch nádorových modelov vykazovala zlúčenina č. 1S liečebný účinok.

P388 leukémia: P388 leukémia je všeobecne oveľa viac citlivá na liečiva, keď je implantovaná i. v. ako keď je inokulovaná i. p. Avšak zlúčenina č. 1S bola vysoko účinná proti i. v. P388 leukémii, keď bola podaná vo svojej maximálne tolerovanej dávke v dňoch 1 a 5 i. p. (279% ILS s 2/6 vyliečeniami) alebo i. v. (250% ILS s 2/6 vyliečeniami). V treťom pokuse tohto nádorového modelu zlúčenina č. 1S vyvoláva 125% ILS s 1/6 vyliečeniami v maximálne tolerovanej dávke 15 mg/kg podanej i. p. v dňoch 1 a 5.

L1210 leukémia: Zlúčenina č. 1S sa ukázala byť reprodukovateľné a vysoko aktívna proti i. v. implantovanej L1210 leukémii. Boli uskutočnené extenzívne štúdie

-21 závislosti na schéme podania u tohto nádorového modelu s liečivom aplikovaným i. v. Ako je demonštrované v tabuľke 6, aplikácia v rozdelenom dávkovom režime viedla k vyššiemu stupňu aktivity v širšom dávkovom rozsahu. Liečebný účinok bol pozorovaný, keď bolo liečivo podané i. v. v dňoch 2 a 6 ako jediná dávka alebo ako štyri dávky v trojhodinových intervaloch. V tabuľke 6 je uvedených desať štúdií vzťahu dávky a účinku pri i. v. aplikácii zlúčeniny č. 1S u myší, ktoré majú i. v. L1210 leukémiu. Výsledky sú nasledujúce: dni 2 a 6,171% ILS s 2/6 vyliečeniami, 4 pôsobenia v trojhodinových intervaloch v dňoch 2 a 6, >300% ILS so 6/6 vyliečeniami, tri liečenia v šesťhodinových intervaloch v dňoch 2 a 6 200% ILS s 2/7 vyliečeniami, dve liečenia v dvanásťhodinových intervaloch v dňoch 2 a 6, 229% ILS s 2/7 vyliečeniami, jediné liečenie v dňoch 2 a 6,143% ILS a 129% ILS, dve liečenia v dvanásťhodinových intervaloch v dňoch 2 a 6, 193% ILS a 171% ILS, jediná dávka v dni 2, 114% ILS, a štyri liečenia v trojhodinových intervaloch v dni 2, 244% ILS s 1/6 vyliečeniami. Zlúčenina č. 1S by sa mala javiť neúčinne, keď je aplikovaná v schéme každé tri hodiny. Je menej účinná keď je podávaná denne ako keď je podávaná každý štvrtý deň. Optimálna schéma z týchto štúdií bola použitá pre určité tuhé nádory, ako je spomenuté vyššie pre i. p. M5076 sarkóm a ako je opísané nižšie. U celého radu tumorových systémov stupeň aktivity je zvýšený a účinný dávkový rozsah je širší, keď zlúčenina č. 1S je podaná v delenej dávkovacej schéme, t. j. každé tri hodiny štyrikrát denne.

Lewisov karcinóm pľúc: Lewisov karcinóm pľúc je vysoko metastázujúca, nediferencovaná pľúcna rakovina, ktoré sa široko používa na hodnotenie liečiv. Tento nádorový model je refraktémy na celý rad zavedených protinádorových liečiv, a keď je použitý ako skríningový systém identifikuje len veľmi málo zlúčenín ako účinných. Zlúčenina č. 1S má liečivé pôsobenie u tohto chemorefraktérneho nádorového modelu, v ktorom je nádor inokulovaný i. v., čo vedie k nádorovým jadrám v pľúcach. Liečivé pôsobenie u tohto nádoru je neobvyklým zistením.

Ako je zrejmé zo všetkých troch i. v. inokulovaných nádorových modelov, zlúčenina č. 1S je dosť účinná proti systémovým tumorom, keď je aplikovaná i. p., rovnako ako i. v.

-22s. c. nádorové modely

Zlúčenina č. 1S bola hodnotená u desiatich tuhých nádorových modeloch, v ktorých nádory boli implantované s. c. a liečivo bola aplikované i. p., i. v. alebo orálne (p. o.). V týchto modeloch je protinádorová aktivita hodnotená stupňom inhibície rastu nádorov v mieste implantácie nádoru. Nádory sa všeobecne merajú 2 až 3 nasledujúce týždne po implantácii nádoru, keď sú zrejmé veľké tumory (>500 mm³) u neliečených kontrolných zvierat. Pre vysoko metastázujúce tuhé tumory sa tiež môže použiť čas prežitia ako miera aktivity. Pre menej metastázujúce nádorové modely čas prežitia neliečených zvierat je značne variabilný a zvieratá môžu prežívať dlhé obdobie s extrémne veľkými nádormi, ktoré často zvredovatejú a infikujú sa. Zlúčenina č. 1S bola vysoko účinná v 8 z 10 s. c. tuhých tumorových modeloch, inhibovala vzrast nádorov o viac ako 90% pri svojej maximálne tolerovanej dávke (tabuľka 7). Úplná inhibícia rastu nádorov u vysoko metastázujúcich nádorov vrátane Lewisovho karcinómu pľúc, B16 melanómu, B15 melanómu podlínie F10 a M5076 sarkómu bola sprevádzaná predĺžením dĺžky života. Dokonca aj u menej respresibilných nádorových modelov, Madisonovmu karcinómu pľúc a karcinómu 26 hrubého čreva, mala zlúčenina č. 1S nejaký účinok na rast nádorov s >70% inhibíciou preukázateľnou pri maximálne tolerovanej dávke.

Lewisov karcinóm pľúc: Tento vysoko metastázujúci pľúcny nádor bol najcitlivejší na zlúčeninu č. 1S zo všetkých testovaných nádorových modelov. To je neobvyklý nález, keďže Lewisov karcinóm pľúc bol široko používaný v štúdiách protinádorových liečiv a je refraktérny na väčšinu známych protinádorových liečiv. Keď je podaná i. p. v dňoch 1, 5, 9 a 13, zlúčenina č. 1S úplne inhibuje rast Lewisovho karcinómu pľúc u skoro všetkých myší liečených 15 alebo 9 mg/kg. V maximálne tolerovanej dávke 4 g bolo vyliečených 8 myší. V dobe merania nádoru, tumory u neliečených kontrol mali v priemere objem 1685 mm³. V druhom pokuse zlúčenina č. 1S bola aplikovaná i. v. a p. o. v dňoch 1, 5, a 9. U obidvoch aplikačných ciest bola 99% inhibícia rastu nádorov (TGI) s viac než polovicou zvierat, ktoré nevykazovali žiadnu prítomnosť nádorov v dobe merania (13. deň). Okrem toho maximálne tolerovaná dávka oboma cestami aplikácie bola v podstate rovnaká, čo vedie k domnienke, že zlúčenina č. 1S má výbornú biologickú

-23dostupnosť po orálnej aplikácii. V tomto pokuse, tumory buď rastú v mieste implantácie, čo indikuje buď, že i. p. liečenie je optimálne u tohto nádorového modelu, alebo, že ďalšie liečenie je potrebné pre liečebný účinok.

B16 melanóm: Tento metastázujúci melanómový model bol široko používaný na hodnotenie a vyhľadávanie protinádorových liečiv. Keď je implantovaný s. c., tento nádor je refraktérny na väčšinu protinádorových liečiv, zlúčenina č. 1S bola hodnotená u myší, ktoré majú B16 melanóm v štúdiách závislosti na dávke. Keď je podaná v jednotlivej dávke v dňoch 1, 5 a 9, maximálne tolerovaná dávka zlúčeniny č. 1S aplikovaná i. v. alebo i. p., vyvoláva 99% inhibíciu rastu nádoru (TGI) s väčšinou zvierat, ktoré nemajú žiadne merateľné nádory v 16. alebo 14. dni. keď väčšina kontrolných myší má nádory veľkosti 864 a 758 mm³ v dvoch pokusoch. Keď je podaná v optimálnom delenom dávkovom liečebnej schéme, zlúčenina č. 1S vyvolá úplnú inhibíciu rastu tumorov v širšom rozsahu dávok. To je zhodné s výsledkami získanými u iných nádorových modeloch. U s. c. B16 melanómového modelu, nádory prípadne rastú u všetkých liečených zvierat a nie sú žiadne vyliečenia. V tomto metastázujúcom nádorovom modeli dochádza k predĺženiu dĺžky prežitia, ktoré sa objavuje s úplnou inhibíciou rastu nádoru. V delenom dávkovom režime bolo 52% ILS, zatiaľ čo pri jednotlivých dávkach 24 mg/kg v dňoch 1, 5 a 9 sa predlžoval dĺžku života o 39%. V poslednej schéme i. v. aplikácia viedla k 53% ILS.

B16 melanóm/podlínia F10: Táto podlínia B16 melanómu vybraná na zvýšenie metastatickej vlastnosti bola vo svojich odpovediach na liečenie zlúčeninou č. 1S podobná pôvodnému B16 melanómu. i. p. liečenie v dňoch 1, 5, 9 a 13 viedlo k úplnej inhibícii rastu nádorov v maximálne tolerovaných dávkových hladinách. V týchto pokusoch, tumory boli merané 16. deň a tumory kontrolných myší boli veľmi veľké, priemerne 1927 a 1196 mm³. Tumory vo všetkých liečených skupinách buď rástli a neboli tu žiadne vyliečenia. Avšak i. p. pri 25 mg/kg viedlo k 70% vzostupu dĺžky života (ILS), i. v. liečenie v rovnakej dávke poskytlo 38% ILS.

ADJ PCe-plazmacytóm: Tento nádorový model, ktorý je najviac príbuzný ľudskej rakovine typu viacnásobného myelómu, bol vysoko citlivý na zlúčeninu č. 1S aplikovanú i. p. v dňoch 1, 5, 9 a 13. Tumory boli merané 19. deň a mali v priemere 828 mm³ u kontrolných myší. Zlúčenina č. 1S vyvoláva >90% inhibíciu rastu

-24nádorov v štyroch dávkových úrovniach pri alebo pod maximálne tolerovanou dávkou. Bol tu 1 z 8 dlhodobo prežívajúcich beznádorových zvierat v každej z horných troch dávkových hladín. Keďže tento tumor nie je vysoko metastazujúci, nebol určovaný stredný čas prežitia.

M5076 sarkóm: M5076 sarkóm implantovaný s. c. bol dosť citlivý na zlúčeninu č. 1S s >90% inhibíciou TGI v troch dávkových hladinách pri alebo pod maximálne tolerovanou dávkou. Nádory boli merané 17. deň, keď kontrolné nádory merali priemerne 1045 mm³. Liečivo bolo aplikované i. p. v dňoch 1, 5, 9 a 13. Liečivo nebolo účinné u tohto modelu, ale predlžovalo dĺžku života o 30%.

Mammarný adenokarcinóm 16/C: Tento nádorový model tumoru prsníka je transplantovateľnou podlíniou spontánneho tumoru mammary, C₃H myší. Zlúčenina č. 1S inhibovala rast nádorov o 96% pri maximálne tolerovanej dávke 10 mg/kg, podanej v dňoch 1, 5, 9 a 13. Tumory boli merané 19. deň, keď priemerná veľkosť nádoru u kontrolných myší bola 630 mm³. V druhom pokuse v rovnakej liečebnej schéme, zlúčenina č. 1S vyvolávala 73% inhibíciu rastu nádoru (TGI) u mammarného adenokarcinómu 16/C. Keďže nádor nie je vysoko metastazujúci, prežívanie zvierat nebolo merané.

Adenokarcinóm 38 hrubého čreva; Tento nemetastazujúci nádorový model bol široko používaný v hodnotení liečiv a je považovaný za jeden z najviac refraktérnych nádorových modelov na liečivá. Zlúčenina č. 11S bola aplikovaná i. p. ako jednotlivá dávka alebo v delenom dávkovom režime v dňoch 3, 10, 17 a 24. Bolo zvolené oveľa dlhšie liečebné použitie, kvôli pomalému rastu tohto tuhého nádoru. Tumory boli merané 31. deň a mali v priemere len 349 mm³ a neliečených kontrol. Ako v iných nádorových modeloch zlúčenina č. 1S bola oveľa viac účinnejšia v delenej dávkovej schéme vyvolávajúcej >90% inhibíciu v dvoch dávkových hladinách. Rovnako tak bola preukázateľná dobrá aktivita (89% TGI) v jednotlivom dávkovom režime.

Adenokarcinóm 51 hrubého čreva: To je iný pomaly rastúci nádorový model hrubého čreva, ktorý bol vyskúšaný ako refraktérny u väčšiny protinádorových liečiv. Použitý protokol pre tento nádor bol podobný ako pre adenokarcinóm 38 hrubého čreva. Zlúčenina č. 1S bola účinná proti adenokarcinómu 51 hrubého čreva, vyvolávajúc 88% TGI s jednotlivým dávkovým režimom a 92% TGI v delenom

-25dávkovom pôsobení. Ako u iných nádoroch, zlúčenina č. 1S bola účinná v širšom rozsahu dávok, keď bola podaná v delenom dávkovom režime. Adenokarcinóm 51 hrubého čreva bol meraný 24. deň, keď kontrolné nádory mali v priemere 766 mm³.

Madisonov pľúcny karcinóm: Madisonov pľúcny karcinóm ako Lewisov pľúcny karcinóm je rýchlo rastúci nediferencovaný nádorový model s vysokou metastatickou aktivitou. Na rozdiel od Lewisovho pľúcneho nádoru, Madisonov pľúcny nádor nie je vysoko citlivý na zlúčeninu č. 1S. V jednotlivom dávkovom režime podávanom i. v. v dňoch 1, 5 a 9, tu nie je prakticky žiadna, tumorový rast inhibujúca aktivita (28% TGI) pri maximálne tolerovanej dávke. V dvoch pridaných pokusoch s rovnakej liečebnej schéme s liečivom podaným i. p., zlúčenina č. 1S vyvolala len 55% a 23% TGI. Avšak v optimálnom delenom dávkovom režime, zlúčenina č. 1S aplikovaná i. v. vykazovala účinok proti Madisonovmu pľúcnemu karcinómu s 85% TGI pri maximálne tolerovanej dávke. Liečivo bolo menej účinné v tejto liečebnej schéme pri podaní i. p. (74% TGI pri maximálne tolerovanej dávke). Madisonove pľúcne nádory boli merané 12. alebo 13. deň vo dvoch oddelených pokusoch, keď nádory u kontrolných myší merali v priemere 1571 a 942 mm³, čo odráža veľkú rýchlosť rastu tohto nádoru. Dokonca u refraktérneho nádoru, zlúčenina č. 1S, vo svojom liečebnom režime, môže viesť k signifikantnej inhibícii rastu tumorov.

Karcinóm 26 hrubého čreva: U tohto vysoko invazívneho a metastázujúceho nediferencovaného nádoru hrubého čreva, zlúčenina č. 1S, vyvoláva len hraničnú inhibíciu rastu tumorov (72% TGI) pri i. p. aplikácii vo svojej maximálne tolerovanej dávke v dňoch 1, 5, 9 a 13. Tumory boli merané 19. deň, keď kontrolné tumory merali priemerne 1052 mm³. Nie je známe, či by zlúčenina č. 1S vykazovala dobrú aktivitu u tohto modelu, keby bola podávaná vo svojom optimálnom delenom režime.

Podlínie rezistentné na viac liečiv

Napriek tomu, že najdôležitejším problémom v terapii rakoviny je necitlivosť bežných neoplaziem na všetky dostupné činidla alebo kombinačné režimy, iným veľkým problémom je vznik rezistentných nádorových buniek z predtým odpovedá-26júcich nádorov. Väčšina pacientov s chemosenzitívnymi tumormi ako je veľkobunkový karcinóm pľúc, ovariálny adenokarcinóm, akútna nonlymfocytická leukémia, karcinóm prsníka a určité lymfómy môžu byť uvedené do remisie kombinačnými režimami, ktoré boli stanovené ako terapia prvej línie pre tieto rôzne ochorenia. Avšak vo väčšine prípadov je značne redukovaná u pacientov s rekurentným ochorením schopnosť vyvolať významné remisie aj napriek uplatneniu značne intenzívnych kombinačných režimov. Charakteristikami sa tieto rekurentné tumory preukážu byť refraktérne na liečiva, ktoré nie sú príbuzné štruktúrne a/alebo mechanisticky látkam, ktoré boli pôvodne použité na vyvolanie remisie. Tento fenomén rezistencie na viacej liečiv je v súčasnosti intenzívne skúmaný v celom rade laboratórií. Súčasná evidencia vedie k domnienke, že zosilenie a vyjadrenie génu rezistencie na viacej liečiv (mdr = multidrug resistence) a prítomnosť mdr génového produktu P170 membránového glykoproteínu, je spojená s rezistenciou na viacej liečiv. P170 účelne slúži ako refluxná transportná pumpa s neuveriteľnou rôznosťou substrátovej špecificity. Súčasná práca vedie k domnienke, že silná expresia mdr génu u istých skôr neliečených nádorov, napríklad ako je feochromocytom a adenokarcinóm by mohla byť zodpovedná aspoň čiastočne za vrodený na liečiva refraktérny fenotyp týchto nádorov.

Preto je dôležité identifikovať nové činidlá, ktoré si podržia vysoký stupeň účinnosti proti nádorom, ktoré vykazujú fenotyp rezistencie na viacej liečiv. Takéto činidlá môžu byť sľubné pre ďalšie pokroky v liečení chemosenzitívnych nádorov (t.j. preukázaním účinnosti u predtým liečených pacientov alebo vybitím mdr subpopulácie ako zložky kombinovaných režimov prvej línie), rovnako tak, ako pre v súčasnej dobe neodpovedajúce nádory, ktoré sú necitlivé k dostupným liečivám pre vrodené vyjadrenie mdr génu. Kamptotecín sa preukázal byť neobvyklý v tom, že je jedným z malého množstva prirodzených produktov cytotoxických činidiel, ktoré nevykazujú skríženú rezistenciu u dobre charakterizovaných nádorových podlínií, ktoré vykazuje mdr-fenotyp, t. j. P388 podlínia rezistentná na doxorubicín, vinkristín, amsakrín, ellipticín alebo mitoxantrón. Keďže väčšina z liečiv, ktoré majú skríženú rezistenciu u bunkových podlínií rezistentných na viacej liečiv je zásaditá, očakávalo sa, že pridanie zásaditého bočného reťazca k molekule kamptotecínuu ako u zlúčeniny č. 1S, by malo viesť k zlúčenine, ktorá by bola transportovaná z buniek

-27pomocou P170 glykoproteínu a tak sa preukázať neúčinnou u tumorov vyjadrujúcich mdr gén. Zlúčenina č. 1S bola hodnotená u myší, ktoré majú P388 a doxorubicín a mitoxantrón rezistentné podiínie (tabuľka 8). Na porovnanie bol zahrnutý doxorubicín a mitomycín. P388/mitoxantrón si ponechávali citlivosť na zlúčeninu č.

1S. Tieto bunkové línie rezistentné na viacej liečiv vykazovali očakávanú rezistenciu na doxorubicín. P388/doxorubicín bol tiež rezistentný na mitomycín c. Z toho vyplýva, že zlúčenina č. 1S si zachováva protinádorový účinok u bunkových línií rezistentných na viacej liečiv, čo je charakteristická vlastnosť kamptotecínu.

Racemické formy zlúčeniny č. 1

Všetky predtým opísané biologické štúdie boli uskutočnené s S izomérom zlúčeniny č. 1, t.j. s konfiguráciou na C-20, ktorá existuje v prirodzene sa vyskytujúcom kamptotecíne a 10-hydroxykamptotecíne. Racemická forma zlúčeniny č. 1 bola pripravená celkovou syntézou a bola hodnotená na protinádorový účinok u myší, ktoré majú i. p. P388 leukémiu (tabuľka 9). Racemická forma zlúčeniny č. 1S, v ďalšom označovaná ako zlúčenina č. 1RS, je vysoko aktívna u P388 leukémie a vyvoláva 165% ILS s 1/6 dlhodobo prežívajúcich v dávke 29 mg/kg aplikovanej i. p. v dňoch 1 a 5. Hoci nie je tak aktívna ako zlúčenina č. 1S (porovnaj tabuľku 5 a 8), zlúčenina č. 1RS má výborné účinky u tohto nádorového modelu.

Rôzne soľné formy zlúčeniny č. 1S

Zlúčenina č. 1S je vo vode rozpustná účinkom prítomnosti zásaditého bočného reťazca v polohe 9, ktorý tvorí soli s kyselinami, napríklad s kyselinou octovou, chlorovodíkovou a metánsulfónovou. Experimenty opísané v tabuľkách 2 až 9 boli uskutočnené buď s acetátovými alebo hydrochloridovými soľami zlúčeniny č. 1S. Rozpustná forma zlúčeniny č. 1S sa tiež môže pripraviť zásaditou hydrolýzou E-kruhu laktónu zlúčeniny č. 1S vytvorením vo vode rozpustných solí alkalických kovov karboxylátovej formy zlúčeniny. Priame porovnanie acetátových, hydrochiorídových, dihydrochloridových a sodných solí zlúčeniny č. 1S bolo uskutočnené u myší, ktoré majú i. v. L1210 leukémiu (tabuľka 10). Zlúčeniny boli aplikované ako

-28roztoky v 5% dextróze i. v. v dňoch 1 a 5. Dihydrochloridová soľ sa vytvára po pridaní prebytku kyseliny chlorovodíkovej a pravdepodobne vedie k protonácii chinolínového dusíka v kruhu B, rovnako ako dusíka dimetylamino-metylovej skupiny. Každá soľná forma bola aktívna u tohto nádorového modelu so 100% ILS zrejmými pre acetát, 175% ILS pre hydrochlorid, 133% ILS pre dihydrochlorid a 208% ILS pre sodnú soľ. Tri soli kyselín boli ekvipotentné, t. j, že mali identickú maximálnu tolerovanú dávkovú úroveň 15 mg/kg. Avšak sodná soľ bola asi 3,5-krát menej účinná s maximálne tolerovanou dávkou 54 mg/kg.

Tabuľka 3

Spektrum aktivity zlúčeniny č. 1S u zvieracích nádorových modeloch

Tu morový model	Aktivita pri maximálne tolerovanej dávke
i.p. tumorové modely
P388 leukémia	+++
L1210 leukémia	+++
B16 melanóm	++
B16 melanóm/podlinia F10	++
M5076 sarkóm	++
karcinóm 26 hrubého čreva	-
i.v. tumorové modely
P388 leukémia	+++
L1210 leukémia	+++
Lewisov pľúcny karcinóm	+++
s.c. tumorové modely
Lewisov pľúcny karcinóm	+++
B16 melanóm	++
B16 melanóm/podlinia F10	++
ADJ-PC6 plazmacytóm	++
M5076 sarkóm	++

Tu morový model	Aktivita pri maximálne tolerovanej dávke
Mammarov adenokarcinóm 16/C	++
adenokarcinóm 38 hrubého čreva	++
adenokarcinóm 51 hrubého čreva	++
Madisonov pľúcny karcinóm	+
karcinóm 26 hrubého čreva	+

Vysvetlivky k tabuľke 3

Zlúčenina č. 1S bola aplikovaná i. p. alebo i. v. každý štvrtý alebo siedmy deň počas 2 až 4 cyklov začínajúc 1 až 3 dni po implantácii nádoru.

+++ = liečivý (>200% vzostup v dĺžke života ILS) ++ = >100% vzostup v dĺžke života (ILS) alebo >90% inhibícia rastu nádorov (TGI) + = >50% ILS alebo >70% TGI - = <50% ILS alebo < 70% TGI.

Tabuľka 4

Porovnávanie zlúčeniny č. 1S s kamptotecínom a 10-hydroxykamptotecínom v celom rade zvieracích nádorových modelov

Tu morový model	Zlúčenina č. 1S predĺženie doby prežitia	Kamptotecín	10-Hydroxy- kamptotecín
		ILS inhibícia rastu tumorov (TGI)
i.p. tumorové modely
P388 leukémia	liečivý	liečivý	liečivý
L1210 leukémia	liečivý	172% ILS	94% ILS
B16 melanóm	152% ILS	36% ILS	95% ILS
B16 melanóm/podlínia F10	105% ILS	68% ILS	100% ILS
M5076 sarkóm	105% ILS	81% ILS	98% ILS

Tumorový model	Zlúčenina č. 1S predĺženie doby prežitia	Kamptotecín	10-Hydroxy- kamptotecín
		ILS inhibícia rastu tumorov (TGI)
karcínóm 26 hrubého čreva	25% ILS	50% ILS	liečivý
i.v. tumorové modely
P388 leukémia	liečivý	75% ILS	40% ILS
L1210 leukémia	liečivý	136% ILS	100% ILS
Lewisov pľúcny karcínóm	liečivý	netestované	netestované
s.c. tumorové modely
Lewisov pľúcny karcínóm	liečivý	92% TGI	4% TGI
B16 melanóm	100% TGI	78% TGI	netestované
B16 melanóm/podlínia F10	100% TGI	90% TGI	58% TGI
ADJ-PC6 plazmacytóm	100% TGI	100% TGI	76% TGI
M5076 sarkóm	100% TGI	100% TGI	66% TGI
Mammarov adenokarcinóm 16/C	96% TGI	99% TGI	61% TGI
adenokarcinóm 38 hrubého čreva	96% TTGI	100% TGI	netestované
adenokarcinóm 51 hrubého čreva	92% TGI	75% TGI	netestované
Madisonov pľúcny karcinóm	85% TGI	63% TGI	33% TGI
karcinóm 26 hrubého čreva	72% TGI	66% TGI	37% TGI

-31 Tabuľka 5

Aktivita zlúčeniny č. 1S u myší, ktoré majú i.p. implantované nádory

Tu morový model	Schéma liečenia/ spôsob podania	Dávka (mg/kg/injekciu)	ILS (%)	Dlhodobé prežitie
P388 leukémia	A/ip	30	toxický
		15	>200	4/6
		7,5	125
		3,8	92
L1210 leukémia	A/ip	25	toxický
		15	219	2/6
		9	138
		5,5	81
		3,2	31
B16 melanóm	B/ip	25	toxický
		15	152
		9	100
		5,4	52
		3,2	43
B16 melanóm/F10 podlínia	B/ip	25	toxický
		15	105
		9	68
		5,4	63
		3,2	37
M5076 sarkóm	C/ip	10	toxický
		5	toxický
		2,5	105
		1.2	75	1/8
		0,62	70	1/8

Tumorový model	Schéma liečenia/ spôsob podania	Dávka (mg/kg/injekciu)	ILS (%)	Dlhodobé prežitie
M5076 sarkóm	C/sc	10	toxický
		5	toxický
		2,5	98
		1.2	70	1/8
		0,62	36
karcinóm 26 hrubého čreva	B/ip	40	toxický
		20	toxický
		10	25
		5	5
		2,5	7

Tabuľka 6

Aktivita zlúčeniny č. 1S u myší, ktoré majú i.v. implantované nádory

Tumorový model	Schéma liečenia/ spôsob podania	Dávka (mg/kg/injekciu)	ILS (%)	Dlhodobé prežitie
P388	A/ip	25	279	2/6
		15	132
		9	100
		5,4	58
		3,2	42
P388 leukémia	A/iv	25	toxický
		19	250	2/6
		14	145
		10	110
		7,9	65

Tumorový model	Schéma liečenia/ spôsob podania	Dávka (mg/kg/injekciu)	ILS (%)	Dlhodobé prežitie
L1210 leukémia	A/ip	25	toxický
		15	171	1/6
		9	136
		5,4	93
		3,2	57
L1210 leukémia	D/iv	40	toxický
		24	>300	4/7
		14	157
		8,6	129
		5,2	71
L1210 leukémia	E/iv	6	toxický
		3,6	>300	5/7
		2,2	>300	1/7
		1,3	243	2/7
		0,78	186
Lewisov pľúcny karcinóm	B/ip	25	toxický
		15	>200	7/7
		9	111	1/7
		5,4	37
		3,2	16

-34Tabuľka 7

Aktivita zlúčeniny č. 1S u myší, ktoré majú s.c. implantované nádory

Tumorový model	Schéma liečenia/ spôsob podania	Dávka (mg/kg/injekciu)	TGI (%)	Myši bez hmatateľných nádorov
Lewisov pľúcny karcinóm	B/ip	25	toxický
		15	100	CO 00 x
		9	99	7/8xx
		5,4	68	2/8
		3,2	31
Lewisov pľúcny karcinóm	F/iv	25	99	5/8
		15	95	3/8
		9	93	1/8
		5,4	87	4/8
Lewisov pľúcny karcinóm	F/po	45	toxický
		27	99	4/8
		16	90	1/8
		9,7	89	2/8
		5,8	51
B16 melanóm	F/ip	24	99	7/8
		14	57	3/8
		8,6	63	3/8
		1,2	20	1/8
		3,1	63	2/8

Tumorový model	Schéma liečenia/ spôsob podania	Dávka (mg/kg/injekciu)	TGI (%)	Myši bez hmatateľných nádorov
B16 melanóm	F/iv	25	toxický
		15	99	7/8
		9	96	6/8
		5.4	79	3/8
		3,2	54	2/8
B16 melanóm	C/ip	6	100	7/7
		3,6	100	7/7
		2,2	92	2/8
		1,3	64	1/8
		0,78	46	1/8
B16 melanóm/F10 podlínia	B/ip	25	100	7/8
		15	87
		9	57
		5,4	62
		3,2	52
B16 melanóm/F10 podlínia	F/iv	25	97	6/8
		15	97	7/8
		9	60	2/8
		5,4	34	18
		3,2	22	1/8
ADJ-PC6 plazmacytóm	B/ip	25	toxický
		15	100	Ťľf^
		9	100	8/8xxx
		5,4	92	4/8χχχ
		3,2	93	3/8

Tumorový model	Schéma liečenia/ spôsob podania	Dávka (mg/kg/injekciu)	TGI (%)	Myši bez hmatateľných nádorov
M5076 sarkóm	B/ip	25	toxický
		15	100	8/8
		9	98	6/8
		5,4	92	3/8
		3,2	64	2/8
Mammarný adenokarcinóm 16/C	B/ip	20	toxický
		10	96	5/8
		5	61	2/8
		2,5	59	1/8
adenokarcinóm 38 hrubého čreva	G/ip	24	89	4/7
		14	78	5/8
		8,6	55	3/7
		5,2	0	1/7
		3,1	0	2/7
adenokarcinóm 38 hrubého čreva	H/ip	6	96	5/7
		3,6	93	6/7
		2,2	74	4/7
		1,3	68	4/7
		0,78	53	2/7
adenokarcinóm 51 hrubého čreva	G/ip	24	88	3/8
		14	76	1/8
		8,6	53	1/8
		5,2	36	1/8
		3,1	34

Tumorový model	Schéma liečenia/ spôsob podania	Dávka (mg/kg/injekciu)	TGI (%)	Myši bez hmatateľných nádorov
adenokarcinom 51 hrubého čreva	H/ip	3,6	92	4/8
		2,2	89	4/8
		1,3	88	3/8
		0,78	73	1/8
Madisonov pľúcny karcinóm	F/iv	24	28	1/8
		12	0
		6	21
		3	0
		1,5	0
Madisonov pľúcny karcinóm	C/iv	3	toxický
		1.5	85	3/8
		0,75	63	1/8
		0,38	41
		0,19	0
karcinóm 26 hrubého čreva	B/ip	20	toxický
		10	72
		5	39
		2,5	38

Vysvetlivky k tabuľke 7 ^x4/8 dlhodobé prežitie bez nádorov ^xx2/8 dlhodobé prežitie bez nádorov ^xxx1/8 dlhodobé prežitie bez nádorov

-38Liečebné schémy sú: B = dni 1, 5, 9 a 13,

C = každé 3 hodiny x 4 v dňoch 1,5 a 9,

F = dni 1, 5 a 9, G = dni 3,10,17 a 24,

H = každé 3 hodiny x 4 v dňoch 3,10,14 a 24.

Inhibícia rastu nádoru (TGI) ja založená na strednom objeme nádorov skupín alebo 8 myší relatívne k neliečeným kontrolám. Nádory boli merané medzi 12. a 19. dňom, s výnimkou 24. dňa pre adenokarcinóm 51 hrubého čreva a 31. dňa pre adenokarcinóm 38 hrubého čreva.

Vo všetkých, okrem dvoch pokusoch, všetky neliečené kontrolné myši (21 alebo 24 myši/skupinu) mali merateľné nádory. V B16/F10, schéme F, 21/24 kontrolných myší malo merateľné nádory. V pokuse s adenokarcinómom 38 hrubého čreva, 19/21 kontrolných myší malo merateľné nádory.

Vzostup v dĺžke života (ILS) je založený na strednej hodnote prežívajúcej doby skupiny 6 myší. Čisté zabitie tumorových buniek (NCK = net celí kill) je vypočítané zo strednej prežívajúcej doby štandardnými metódami, keďže doba prežívania je lineárnou funkciou logaritmu zaťaženia nádorových buniek. Keďže mitoxantrónová rezistentná podlínia má dlhší zdvojovací čas ako ostatné dve bunkové línie použité v tomto pokuse, menší ILS je spojený s väčším NCK ako u P388 alebo doxorubicínovej rezistentnej bunkovej línie.

-39Tabuľka 8

Nedostatok skríženia rezistencie na zlúčeninu č. 1S na viacej liečiv, P388 leukémie rezistentných podlínií

Zlúčenina	Dávka (mg/kg, ip, dni 1 a 5)	P388	P388doxorubicín	P388/mitoxantrón
ILS (%)	NCK (log)	ILS (%)	NCK (log)	ILS (%)	NCK (log)
zlúčenina 1S	25	toxická	toxická	toxická
	15	228	6,5	176	6,0	107	5,7
	9	211	6,5	90	2,2	79	3,6
	5,4	128	3,5	33	0	57	2,1
	3,2	67	1.0	14	0	29	0
doxorubicín	9	233	6,5	14	0	7	0
	5,4	156	4,6	19	0	4	0
	3,2	172	5,3	24	0	0	0
	1,9	167	5,1	24	0	0	0
	1,2	117	3,0	19	0	0	0
mitomycín C	7,5	178	5,5	52	0,5	104	5,5
	4,5	156	4,6	62	1,0	136	6,5
	2,7	128	3,5	52	0,5	54	1,8
	1,6	106	2,6	48	0,3	29	0
	1,0	83	1,7	29	0	14	0

-40Tabuľka 9

Aktivita racemickej zmesi zlúčeniny č. 1S u myší, ktoré majú i. p. P388 leukémiu

Zlúčenina	Dávka (mg/kg, ip, dni 1a 5)	ILS (%)	Dlhodobé prežívanie
IRS	29	165	1/6
	14	135
	7,2	80
	3,6	30

Zvieratá boli implantované i. p. s 10⁶ bunkami. Vzostup v dĺžke života (ILS) je založený na strednej dobe prežívania skupiny 6 myší relatívne k neliečeným kontrolám. Dlhodobé prežitie bolo bez tumorov v 45. dni.

Tabuľka 10

Porovnávacia aktivita rôznych soľných foriem zlúčeniny č. 1S u myší, ktoré majú i. v. L1210 leukémiu

Zlúčenina	Dávka (mg/kg, ip, dni 1 a 5)	ILS (%)
1S (acetátová soľ)	25	toxický
	15	100
	9	83
	5,4	67
	3,2	50
1S (hydrochloridová soľ)	25	toxický
	15	175
	9	125
	5,4	92
	3,2	50

Zlúčenina	Dávka (mg/kg, ip, dni 1 a 5)	ILS (%)
1S (dihydrochloridová soľ)	25	toxický
	15	133
	9	83
	5,4	50
	3,2	50
1S (sodná soľ)	90	toxický
	54	208
	32	133
	19	100
	12	67
	6,5	33

Zvieratá boli inokulované i. v. s 10⁶ bunkami. Vzostup v dĺžke života (ILS) je založený na strednej hodnote času prežívania skupín 6 myší relatívne k neliečeným kontrolám.

Farmaceutické prípravky a spôsob liečenia

Farmaceutické prípravky podľa tohto vynálezu tvorí účinné nárast nádorových buniek inhibujúce množstvo zlúčeniny všeobecného vzorca I a inertný farmaceutický prijateľný nosič alebo riedidlo. Tieto prípravky sú pripravené v dávkovej jednotkovej forme vhodnej na parenterálnu alebo orálnu aplikáciu.

Zlúčenina všeobecného vzorca I sa aplikuje v bežnej dávkovej forme pripravenej kombináciou terapeuticky účinného množstva, t.j. účinného rast tumorov inhibujúceho množstva, zlúčeniny všeobecného vzorca I (aktívna zložka) so štandardnými farmaceutickými nosičmi alebo riedidlami podľa bežných postupov. Tieto postupy môžu zahrňovať miesenie, granulovanie a stláčanie alebo riedenie zložiek, ako je vhodné pre žiadaný prípravok.

-42Farmaceutické nosiče môžu byť tuhé alebo kvapalné. Príkladmi tuhých nosičov sú laktóza, biela hlinka, mastenec, sacharóza, želatína, agar, pektín, akácia, stearan horečnatý, kyselina steárová a podobne. Príkladmi kvapalných nosičov sú sirup, podzemnicový olej, olivový olej, voda a podobne. Nosiče alebo riedidla môžu tiež obsahovať oneskorovacie látky v danej oblasti techniky dobre známe, napríklad glycerylmonostearát alebo glyceryldistearát samotné alebo s voskom, etylcelulózou, hydroxypropylmetylcelulózou, metylmetakrylátom a podobne.

Môže sa použiť celý rad farmaceutických foriem, prípravky sa môžu tabletovať, naplniť do tvrdých želatínových kapsúl v práškovej alebo peletovej forme alebo môžu tvoriť pastilky. Množstvo tuhého nosiča sa bude meniť v širokom rozsahu, ale výhodné bude medzi 25 mikrogramami až približne 1,0 g. Keď je použitý kvapalný nosič, prípravok bude vo forme sirupu, emulzie, mäkkej želatínovej kapsuly, sterilného injekčného roztoku alebo suspenzie v ampulách alebo fľaštičkách alebo vo forme nevodnej kvapalnej suspenzie.

Na získanie stabilnej vo vode rozpustné dávkovej formy, farmaceutický prijateľná soľ zlúčeniny všeobecného vzorca I sa rozpustí vo vodnom roztoku organickej alebo anorganickej kyseliny, ako je napríklad 0,3M roztok kyseliny jantárovej alebo výhodne kyseliny jantárovej alebo výhodne kysliny citrónovej. Keď nie je dostupná rozpustná soľná forma, zlúčenina všeobecného vzorca I sa rozpustí vo vhodných spolurozpúšťadlách alebo v ich kombináciách. Príklady takýchto vhodných spolurozpúšťadiel zahrnujú, ale neobmedzujú sa len na alkohol, propylénglykol, polyetylénglykol 300, polysolvát 80, glycerín a podobne, v koncentráciách v rozmedzí od 0 do 60 % celkového objemu.

Prípravky môžu tiež byť vo forme roztoku alebo soľnej formy aktívnej zložky vo vhodnom vodnom vehikule ako je voda, alebo izotonické soľné alebo dextrózové roztoky. Pre tie zlúčeniny všeobecného vzorca I, ktoré nemajú zásaditý bočný reťazec v 9. polohe ako sú zlúčeniny č. 2S a 10S (pozri tabuľku 2 pre štruktúry), soľ alkalického kovu karboxylátu vytvoreného alkalickou hydrolýzou E-kruhu laktónu, by mala viesť k rozpustným soliam, ako je uvedené pre sodnú soľ zlúčeniny č. 1S.

Bude treba ohodnotiť, že aktuálne výhodné dávkovanie zlúčenín všeobecného vzorca I použité vo farmaceutických prostriedkoch podľa vynálezu sa

-43bude meniť podľa použitého komplexu, podľa druhu prípravku, spôsobu aplikácie a miesta aplikácie, hostiteľa a choroby, ktorá má byť liečená. Optimálne dávkovanie pre danú sadu podmienok môže byť odborníkmi v danej oblasti techniky určené za použitia bežných dávok určujúcich testov s ohľadom na vyššie uvedené pokusné údaje. Na parenterálnu aplikáciu je dávka zvyčajne používané od približne 20 do približne 150 mg/m² telesného povrchu, na deň pre jeden až päť dní výhodne opakované každý štvrtý týždeň pre štyri cykly liečenia. Na orálnu aplikácie je dávka zvyčajne používaná od približne 20 do približne 150 mg/m² telesného povrchu na deň pre jeden až päť dní, s cyklami liečenia opakovanými vo vhodných intervaloch.

Nasledujúce príklady ilustrujú a) protokol použitia na vymedzenie aktivity rôznych zlúčenín všeobecného vzorca I u transplantovaných myších nádorových modelov, b) chemickú výrobu zlúčenín všeobecného vzorca I použitých vo farmaceutických prostriedkoch a spôsoboch podľa vynálezu a c) orálne a parenterálne farmaceutické prostriedky podľa vynálezu.

Predpokladá sa, že bez ďalšieho vypracovania odborník v danej oblasti techniky použitím predchádzajúceho opisu môže využiť vynález v jeho najširšom rozsahu. Nasledujúce príklady sú preto konštruované len na ilustráciu a žiadnym spôsobom neobmedzujú vynález.

Príklady uskutočnenia vynálezu

I. Protokoly použité na transplantované myšie nádorové modely

Protokoly použité na hodnotenie protinádorovej aktivity zlúčenín všeobecného vzorca I sú dobre známe a využívané odborníkmi na hodnotenie účinkov liečiv v predklinických nádorových modeloch. Tieto štúdie všeobecne sledujú protokoly stanovené National Cancer Inštitúte, ako je opísané v publikácii Geran a ďalší, Cancer Chemotherapy Reports, časť 3, zv. 3,1 až 103,1972).

A) i. p. nádorové modely

Tumory použité v týchto štúdiách - P388 leukémia a jej doxorubicínové a mitoxantrónové rezistentné podlínie, L1210 leukémia, B16 melanóm, B16

-44melanón/F10 podlínia, M5076 sarkóm a karcinóm 26 hrubého čreva sa udržujú sériovovu transplantáciou u syngeneických kmeňov myší. Pre leukémie sú tieto tumory prechovávané na DBA/2 myšiach. M5076 sarkóm, B16 melanóm a jeho F10 podlínie sú prechovávané na C5781/6 myšiach a karcinóm 26 hrubého čreva je udržiavaný na BALB/c myšiach. Leukémia a M5076 sarkóm sa sériovo transplantujú

i. p. ako ascitová bunková suspenzia, zatiaľ čo B16 melanómové línie sa karcinóm 26 hrubého čreva sa sériovo transplantujú ako s. c. tuhé tumory.

Na terapeutické skúšky sa tumory aseptický odstránia z myších darcov a pripravia sa ako suspenzia na i. p. aplikáciu testovaným zvieratám. Testovanými zvieratami pre karcinóm 26 hrubého čreva sú samice BALB/c myší (20 až 25 g). Testovanými zvieratami pre ostatné nádorové modely sú syngeneické samičie Fi hybridy B6D2Fi myší (C57B1/6xDBA/2). Inokulačné hladiny sú rôzne podľa typu nádoru: P388 leukémia sa inokuluje pri 10⁶ bunkách na myš, L1210 leukémia pri 10⁵ alebo 10⁶ bunkách na myš, M5076 sarkóm pri 5x10⁶ bunkách na myš. Na implantáciu B16 melanómových línií a karcinómu hrubého čreva, s. c., tumory z myších darcov sa rozsekajú a homogenizujú na voľne uloženom teflónovom sklenenom homogenizátore na poskytnutie nádorovej suspenzie. Inokulačné hladiny sú 0,5 ml 10% (hmotnosť/-objem) suspenzie karcinómu 26 hrubého čreva, B16 melanómových línií a 0,5 ml 5% (hmotnosť/objem) suspenzie karcinómu 26 hrubého čreva. Po inokulácii tumoru, myši sa náhodne rozdelia na liečené skupiny tvorené každá 6 až 8 zvieratami. V každom pokuse sú tri skupiny neliečených kontrolných myší. Liečiva sa rozpustia alebo suspendujú v primeranom vodnom vehikulu a podávajú rôznymi spôsobmi a aplikačnými schémami v širokom rozsahu dávkových hladín. Zvieratá sú chované v škatuľových klietkach a denne monitorované na mortalitu počas 30 (L210), 45 (P388) alebo 60 (B16, M5076, karcinóm 26 hrubého čreva) dní. Konečným bodom pre aktivitu je stredná hodnota prežívacieho času a vzostup dĺžky života relatívne k neliečeným kontrolám. Liečivo je považované za účinné v týchto tumorových modeloch, ak predlžuje dĺžku života o 0 až 40 %.

B) i. v. nádorové modely

Tumory používané v tejto štúdii - P388 leukémia, L1210 leukémia a Lewisov pľúcny karcinóm sa prechovávajú sériovou transplantáciou u syngeneických

-45kmeňov myší DBA/2 pre leukémie a C5781/6 pre Lewisov pľúcny karcinóm. Leukémie sa sériovo transplantujú i. p. ako ascitová bunková suspenzia, zatiaľ čo Lewisov pľúcny karcinóm sa sériovo transplantuje ako s. c. tuhý nádor.

Na terapeutické skúšky sa tumory aseptický odoberú u myších darcov a pripravia sa ako suspenzie na implantáciu testovaným zvieratám, ktoré sú pre každý tumor syngeneické samičie Fi hybridy B6D2F-I myší (C57B1/6 x DBA/2). Hladina inokula sa mení s typom nádoru. P388 leukémia pri 10⁶ bunkách na myš, L1210 leukémia pri 10⁵ alebo 10⁶ bunkách na myš a Lewisov pľúcny karcinóm 0,25 ml 10% (hmotnosť/objem) suspenzie. Suspenzia Lewisovho pľúcneho karcinómu sa pripraví ako je opísané vyššie pre B16 melanóm.. Po inokulácii tumoru sa myši náhodne rozdelia na liečené skupiny každá so 6 až 8 myšami. V každom pokuse sú tri skupiny neliečených kontrolných myší.

C) s. c. nádorové modely

Tumory použité v týchto štúdiách sa udržujú sériovovu transplantáciou u syngeneických myší C5781/6 pre Lewisov pľúcny karcinóm, B216 melanóm a jeho F10 podlíniu, M5076 sarkóm a adenokarcinóm 38 hrubého čreva; BALB/c pre karcinóm 26 hrubého čreva, ADJ-PC6 plazmacytóm, Madisonov pľúcny karcinóm a adenokarcinóm 51 hrubého čreva; C3H pre mammamý adenokarcinóm 16/C. S výnimkou M5076 sarkóm u, ktorý je prechovávaný ako i. p. ascitová bunková suspenzia, všetky ostatné tumory sa sériovo transplantujú ako s. c. tuhé tumory.

Na terapeutické skúšky sa tumory aseptický odstránia z myších darcov a pripravia sa na implantáciu s. c. testovaným zvieratám. Testovanými zvieratami pre Lewisov pľúcny karcinóm, B16 malanóm a jeho F10 podlíniu, M5076 sarkóm a adenokarcinóm 38 hrubého čreva sú syngeneické samičie Fí hybridy B6D2F myší (C57B1/6 x DBA/2) ADJ-PC6 plazmacytóm a karcinóm 26 hrubého čreva sú hodnotené u samíc BALB/c myší: Madisonov pľúcny karcinóm a adenokarcinóm 51 hrubého čreva sú hodnotené u syngeneických samíc Fi hybridov CD2Fi myší (BALB/c x DBA/2). Mammarný adenokarcinóm 16/C je hodnotený na samiciach C3H myší. Inokulum sa mení podľa druhu nádorov. Adenokarcinóm 38 hrubého čreva sa implantuje trochárom ako 2 mm fragmenty. M5076 sarkóm a ADJ-PC6 plazmacytóm sa implantujú ako bunkové suspenzie pri 5x10⁶ a 2x10⁶ bunkách na

-46myš. Karcinóm 26 hrubého čreva, adenokarcinóm 51 hrubého čreva, Lewisov pľúcny karcinóm, MAdisonov pľúcny karcinóm a B16 melanóm a jeho F10 podlínie sa implantujú ako tumorové suspenzie pripravené ako je opísané vyššie v objeme 0,5 ml. Koncentrácia suspenzie bola 10% (hmotnosť/objem) s výnimkou karcinómu 26 hrubého čreva, pre ktorý koncentrácia suspenzie bola 5%-ná. Po inokulácii nádoru sa myši náhodne rozdelili do liečených skupín po 7 alebo 8 myší. V každom pokuse sú tri skupiny neliečených kontrolných myší.

Liečivá sa rozpustia alebo suspendujú vo vhodných vodných vehikulách a podávajú sa rôznymi aplikačnými cestami a v rôznych liečebných schémach v rozsahu dávkových hladín. Zvieratá sú chované v škatuľových klietkach a denne sú monitorované na mortalitu. V období, keď neliečené kontrolné zvieratá majú veľké merateľné tumory (zvyčajne >500 mm³), sa u všetkých zvierat merajú tumory v kolmých priemeroch s nóniovým posuvným meradlom a objem nádoru sa vypočíta zo vzorca: dĺžka x (šírka)² x 0,5. Doba merania nádorov závisí na rozličných rýchlostiach nárastu rôznych nádorov: najrýchlejšie rastúce nádory, ako je napríklad Lewisov a Madisonov pľúcny karcinóm, B16 melanóm a jeho P10 podlínie sa merajú medzi 12. a 16 dňom. Pomalšie rastúce nádory sa merajú v neskorších časových bodoch: 17. deň pre M5076 sarkóm, 16. alebo 19. deň pre ADJ-PC6 plazmacytóm a karcinóm 26 hrubého čreva, 24. deň pre adenokarcinóm 51 hrubého čreva a 31. deň pre adenokarcinóm 38 hrubého čreva. Koncovými bodmi pre aktivitu je stredný nádorový objem, percento inhibície nádorového rastu relatívne k neliečeným kontrolám a počet zvierat bez hmatateľných nádorov v dni merania. Liečivo je považované za účinné u tých nádorových modelov, kde vyvoláva >70% inhibíciu nádorového rastu pri alebo pod maximálne tolerovanou dávkou.

Pre vysoko metastazujúce nádory vrátane Lewisových a Madisonových pľúcnych nádorov, karcinómu 26 hrubého čreva a B16 melanómu a jeho F10 podlínií, sú myši, ktoré majú nádory, taktiež monitorované na dobu prežitia. Pre menej metastazujúce nádorové modely, myši, ktoré majú nádory sú zabité po meraní nádoru. V tejto zostave vzostup v dĺžke života väčší alebo rovný 30 % je považovaný sa dôkaz účinnosti liečiva.

-47II. Syntéza zlúčenín všeobecného vzorca I

V nasledujúcich syntetizačných príkladoch je teplota uvádzaná v stupňoch

Celzia (°C). Pokiaľ nie je vyznačené inak, sú všetky východiskové materiály získané z komerčných zdrojov.

Príklad 1

Výroba (20S)-1,2,6,7-tetrahydrokamptotecínu g, 0,092 mol kamptotecínu získaného od Tainjain SkaF L t d., Tainjain, Čína, bolo zmiešaných s Pt°, pripravenou redukciou 8,0 g amorfného PtO2 v 800 ml HOAc po dobu 1,5 hodiny pod tlakom 0,1 MPa (1 atmosféra) H₂ a v 1,6 I HOAc. Redukcia sa uskutočnila pri tlaku 0,1 MPa (1 atmosféra) H₂ po dobu 8,5 hodiny pri silnom miešaní zmesi. Na konci tejto doby, teoretické množstvo H₂ sa absorbuje (o niečo viac ako 4,1 I) a vychytávanie H₂ sa značne spomalí. Reakčná zmes sa zbaví plynu prúdom Ar asi 10 minút a potom sa filtruje cez vrstvu celitu, ktorá sa premyje 200 ml HOAc.

Výsledný roztok sa bezprostredne použije v nasledujúcej reakcii opísanej v príklade 2.

Príklad 2

Výroba (20S)-10-hydroxykamptotecínu

K silne miešanému roztoku 1,2,6,7-tetrahydrokamptotecínu pripravenom ako je opísané v príklade 1, sa pridá 64 g, 0,144 mol Pb(OAc)4 v jednej porcii. Reakčná zmes sa mieša pod prúdom Ar 30 minút, pričom všetok Pb(OAc)₄ sa rozpustí. Koncentráciou sa získa gumovitý zvyšok, ktorý sa trituruje s 1 litrom ľadovo studenej vody, čím vznikne svetlohnedá tuhá látka, ktorá sa odfiltruje, premyje sa ďalšími 200 ml ľadovo studenej vody a tlakovo sa suší gumovou priehradou a vzduchom cez noc. Výsledný, čiastočne vlhký produkt obsahuje 44,3 % 10-hydroxykamptotecínu,

26,9 % 10-acetoxykamptotecínu a 23,1 % kamptotecínu podľa vysokotlakovej

-48kvapalinovej chromarografickej (HPLC) analýze (Whatman Partisil 5 ODS3 Rac II 60 % CH3OH/H2O).

Surová zmes sa zmieša s 1,7 litrom vodného HOAc a zahrieva sa cez noc pod spätným chladičom. Reakčná zmes sa chladí a koncentruje približne na 50 až 100 ml. Pridá sa 1 liter ľadovo studenej vody a precipitát sa odfiltruje, premyje sa ďalšími 200 ml ľadovo studenej vody, suší sa pod tlakom gumovou priehradkou a suší sa vo vysokom vákuu po dobu dvoch dní, čím vznikne 21,16 g materiálu obsahujúceho 70,9 % 10-hydroxykamptotecínu, 1,2 % 10-acetoxykamptotecínu a 21,3 % kamptotecínu podľa HPLC analýzy.

Príklad 3

Výroba acetátovej soli (20S)-9-dimetylaminometyl-10-hydroxykamptotecínu g 10-hydroxykamptotecinu (ktorý bol skúšaný pri 62% 10-hydroxykamptotecíne a preto obsahoval 12,4 g, 34,1 mmol 10-hydroxykamptotecínu), pripraveného ako je opísané v príklade 2, sa zmieša s 620 ml HOAc, 12,4 ml (približne 149 mmol) 37% vodného CH₂O a 12,4 ml (približne 109 mmol) 40% vodného dimetylamínu a mieša sa približne 18 hodín a chromatografia na tenkej vrstve indikuje malé množstvo zostávajúceho východiskového materiálu (tlc v 9:1 CH₂CI₂, CH3OH na silikagéli). Tento systém je vhodný na sledovanie vymiznutia 10hydroxykamptotecínu, ale nie na monitorovanie vytvárania sa produktu. 6 ml (približne 72 mmol) ďalšieho 37% vodného CH₆O a 6 ml (približne 53 mmol) vodného dimetylamínu sa pridá, miešanie pokračuje ďalších 24 hodín. Reakčná zmes sa koncentruje do sucha, trituruje sa 1 litrom 0,5 % vodnej HOAc. Sušená tuhá látka mala hmotnosť 6,3 g a izoluje sa 94 % kamptotecínu podľa HPLC (Whatman Partisil 10 0DS 3 50% CH₃OH/H₂O, retenčný čas 9 minút). Zmiešané vodné filtráty sa extrahujú 3 x 600 ml EtOAc a 600 ml petroléteru a potom sa lyofilizujú.

Chromatografia surového zvyšku sa dosiahne injekciu materiálu v 600 ml rozpúšťadla A (rozpúšťadlo A = 99 % H₂O, 1 % HOAc) a elúciou pri 350 ml/min cez 50 mm x 600 mm oceľový stĺpec naplnený 680 g Whatman Partisil 40 0DS 3 s 34 minútovým lineárnym gradientom zo 100% rozpúšťadla A do 40% rozpúšťadla B

-49(rozpúšťadlo B = 99 % CH3OH, 1 % HOAc). Chromatografia sa monitoruje pri 410 nm a zhromaždí sa 1 liter filtrácií a tie, ktoré sa analyzujú pri = 99% čistote analytickou HPLC (Whatman Partisil 10 ODS 3 50% CH3OH/H2O, retenčný čas 9 minút) sa zhromaždia, koncentrujú a znova sa rozpustia v minimálnom množstve 0,5% vodnej HOAc a lyofilizujú sa, čím vznikne 10,58 g (62 %) vyššie spomenutého produktu.

IR (KBr) 3400, 2960,1740,1650,1590 cm'^{1 1}H-NMR (CDCI3/CD3OD): 1,04 (t, 3, J = 7 Hz, C18), 1,96 (q, 2, J = 7 Hz, C19), 2,01 (s, 3, CH3CO2), 2,5 (s, 6, (CH₃)₂NH), 4,2 (s, 2, ArCH₂N), 5,28 (d, 1, J = 19 Hz, C17), 5,29 (s, 2, C5), 5,5 (d, 1, J = 19 Hz, C17), 7,42 (d, J = 9 Hz, C11), 7,67 (s, 1, C14), 8,05 (d, J = 9 Hz, C12), 8,51 (s, C7).

Vypočítané pre C23H23N3O5.IHOAc.IH2O (molekulová hmotnosť = 515,5) Vypočítané: C 58,24, H 5,67, N 8,15 %

Nájdené: C 58,55, H 5,22, N 8,54 %.

Pb analýza s <14,5 ppm.

Ďalšie uvedené produkové materiály, ktoré boli >90% čistejšie podľa HPLC (pozri vyššie), sa koncentrujú do sucha a ďalej rechromatografujú s podobnými materiálmi izolovanými z druhých cyklov.

Príklad 4

Výroba acetátovej soli (20S)-9-morfolinometyl-10-hydroxykamptotecínu

100 mg, 0,27 mmol 10-hydroxykamptotecínu pripraveného, ako je opísané v príklade 2, 0,5 ml 37% vodného CH₂O, 0,1 ml morfolínu a 10 ml 2:1 HOAc/EtOH sa zmieša a mieša sa cez noc. Hydroxykamptotecín reagoval (tlc, silikagél, 9:1 CH₂CI₂/CH₃OH) a reakčná zmes sa koncentruje do sucha, rozpustí sa asi v 5 ml vody obsahujúcej niekoľko kvapiek HOAc a nerozpustný materiál sa odfiltruje. Filtrát sa lyofilizuje a lyofilizát sa chromatografuje (15 mm x 250 mm oxidu kremičitého strednotlakovou kvapalinovou chromatografiou (MPLC) elúciou s CH₂Ci₂, ktorý obsahuje 0 až 2% CH₃OH), čím vznikne zvyšok, ktorý sa rozpustí v zriedenom HOAc a lyofilizuje sa, čím vznikne 53 mg (38%) výslednej zlúčeniny.

IR (KBr) 3400, 3100, 2960, 2920, 2840, 1740, 1650,1590 cm¹

-50¹H-NMR (CDCI3/CD3OD): 1,12 (t, 3, J = 7 Hz, C18), 1,94 (q, 2, J = 7 Hz, C19), 2,73 (m, 4, morfolino-CH₂N), 3,83 (m, 4, morfolino-CH₂O), 4,19 (s, 2, ArCH₂N), 5,26 (s, 2,

C5), 5,25 (d, 1, J = 16 Hz, C17), 5,76 (d, 1, J = 16 Hz, C17), 7,27 (s, 1, C14), 7,40 (d, 1, J = 8 Hz, CH), 8,07 (d, 1, J = 8 Hz, C12), 8,36 (s, 1, C7).

Analýza pre CH₂5H₂₅N₃O₆ CH₃CO₂H (molekulová hmotnosť = 525,6)

Vypočítané: C 31,71, H 5,95, N 8,0 %

Nájdené: C 61,3, H 5,44, N 8,35 %.

Príklad 5

Výroba acetátovej soli (20S)-9-/V-metylpiperazinylmetyl-10-hydroxykamptotecínu

100 mg, 0,27 mmol 10-hydroxykamptotecínu pripraveného ako je opísané v príklade 2, 10 ml 2:1 HOAc/EtOH, 0,5 ml 37% vodného CH₂O a 0,1 ml N-metylpiperazínu sa zmieša a mieša sa 20 hodín. 10-Hydroxykamptotecín reaguje (tie 9:1 CH₂Cl₂/CH₃OH) a reakčná zmes sa koncentruje, rozpustí sa v 50 ml vody a premyje sa 5 x 20 ml EtOAc a 20 ml petroléteru a vodná fáza sa Iyofilizuje. Zvyšok sa znovu rozpustí v zriedenom vodnom HOAc a chromatografuje sa na MPLC (Whatman Partisil 40 0DS 3, 9 mm x 250 mm stĺpci) elúciou s 0 až 20 % CH₃OH v H₂O, ktorý obsahuje 0,02% HOAc. Žiadaný lyofilizát poskytne 67 mg (46 %) výslednej zlúčeniny.

IR (KBr) 3400, 2960, 2910,1740,1650, 1590 cm’^{1 1}H-NMR (CDCIs/CDaOD): 1,03 (t, 3, J = 7 Hz, C18), 1,89 (q, 2, J = 7 Hz), 2,02 (s, >3, CH₃CO₂H), 2,37 (s, 3, NCH₃), 2,65 (m, 8, piperazín-CH₂), 4,21 (s, 2, ArCH₂),

5,26 (s, 2, C5), 5,30 (d, 1, J = 16 Hz, C17), 5,71 (d, 1, J = 16 Hz, C17), 7,45 (d, 1, J = 7 Hz, C11), 8,05 (d, 1, J = 7 Hz, C12), 8,47 (s, 1,C7).

Analýza pre (WWUOs 1,5HOAc.1/2H₂O (molekulová hmotnosť = 528,1) Vypočítané: C 61,41, H 6,01, N 10,61 %

Nájdené: C 61,62, H 5,74, N 10,93 %.

Príklad 6

Výroba acetátovej soli (20S)-9-(4'-piperidinopiperidinyl)-metyl-10-hydroxykamptotecínu

-51 100 mg, 0,27 mmol 10-hydroxykamptotecínu pripraveného ako je opísané v príklade 2, 100 mg, 0,6 mmol 4-piperidinopiperidínu, 0,5 ml 37% vodného CH₂O a 10 ml 2:1 HOAc/EtOH sa mieša 20 hodín. 10-hydroxykamptotecín reaguje (tlc, silikagél, 9:1 CH₂CI₂/CH₃OH) a reakčná zmes sa koncentruje, rozpustí sa v 1% vodnej kyseliny octovej, filtruje sa a lyofilizuje. MPLC (Whatman Partisil 40 0DS 3, 9 mm x 250 mm stĺpec) elúciou so 100 ml vody a potom 0 až 8% CH₃OH v 0,02% vodnej HOAc poskytne 44 mg (30 %) výslednej zlúčeniny po lyofilizácii.

IR (KBr) 3400, 2940,1745,1660,1590 cm’^{1 1}H-NMR (CDCIs/CDsOD): 0,99 (t, 3, J = 7 Hz, C18), 1,3 - 3,3 (m, 19, piperidín, C19), 4,11 (s, 2, CH₂N), 5,21 (s, 2, C5), 5,25 (d, 1, J = 16 Hz, C17), 5,7 (d, 1, J = 16 Hz, C17), 7,85 (d, 1, J = 7 Hz, C11), 7,59 (s, 1, C14), 8,0 (d, 1, J = 7 Hz, C12), 8,35 (s, 1,C7).

Analýza pre C₃iH₃6N₄O5.1,5 H₂O (molekulová hmotnosť = 631,7)

Vypočítané: C 58,94, H 6,22, N 8,81 %

Nájdené: C 59,02, H 6,44, N 8,53 %.

Príklad 7

Výroba acetátovej soli (20S)-9-(2^,-hydroxyetylamino)-metyl-10-hydroxykamptotecínu

200 mg, 0,55 mmol 10-hydroxykamptotecínu pripraveného ako je opísané v príklade 2,16 mg, 0,55 mmol paraformaldehydu, 61 mg, 1,1 mmol etanolamínu a 6 ml HOAc sa mieša 48 hodín, po ktorých väčšina 10-hydroxykamptotecínu zreagovala. Reakčná zmes sa koncentruje, znovu rozpustí v 200 ml zriedenej HOAc a premyje sa 4 x 30 ml EtOAc a 30 ml petroléteru a výsledný vodný roztok sa lyofilizuje. Surový lyofilizát sa rozpustí v 50 ml vody. MPLC (Whatman Partisil 40 0DS 3, 15 mm x 250 mm stĺpec) elúciou so 100 ml vody a potom 0 až 10% CH₃OH v 0,02% vodnej HOAc poskytne 88 mg (33 %) výslednej zlúčeniny po lyofilizácii.

IR (KBr) 3400, 2980, 2940,1750,1570 cm'^{1 1}H-NMR (CDCIs/CDsOD): 1,03 (t, 3, J = 7 Hz, C18), 1,89 (q, 2, J = 7 Hz, C19), 2,0 (s, 3, HOAc), 3,03 (m, 2, CH₂NH), 3,75 (m, 2, CH₂OH), 4,49 (s, ArCH₂NH), 5,24 (s, 2, C5), 5,3 (d, 1, J = 16 Hz, C17), 5,7 (d, 1, J = 16 Hz, C17), 7,41 (d, 1, J = 8 Hz, C11), 7,6 (s, 1, C14), 8,0 (d, 1, J = 8 Hz, C12), 8,48 (s, 1, C7).

-52Analýza pre C23H23N3O6.HOAC.11/8 H₂0 (molekulová hmotnosť = 531,3) Vypočítané: C 56,52, H 5,83, N 7,91 %

Nájdené: C 56,07, H 5,40, N 8,27 %.

Príklad 8

Výroba metánsulfonátovej soli (20S)-9-trimetylamóniummetyl-10-hydroxykamptotecínu mg, 0,14 mmol acetátovej soli 9-dimetylaminometyl-10-hydroxykamptotecínu, pripraveného ako je opísané v príklade 3, sa rozpustí v asi 70 ml CH₂CI₂ a filtruje sa. Filtrát sa zmieša s 1 ml metylmetánsulfonátu, ochladí sa a čiastočne sa koncentruje pod prúdom argónu (Ar). Po 4 hodinách sa rozpúšťadlo koncentruje na polovičný objem a chladí sa. Precipitát sa filtruje, rozpustí v 10 ml vody, premyje 3 x 10 ml EtOAc a potom 10 ml petroléteru a lyofílizuje sa, čím vznikne 50 mg (60 %) výslednej zlúčeniny.

IR (KBr) 3400, 2950, 2900,1760,1660,1600 cm'^{1 1}H-NMR (CDCI3/CD3OD): 1,03 (d, 3, J = 7 Hz, C18), 2,01 (q, 2, J = 7 Hz, C19), 2,78 (s, >3, CH3SO3), 2,94 (s, 9, N(CH₃)₃), 4,72 (s, 2, ArCH₂N), 5,2 (s, 2, C5), 5,22 (d, 1, J = 16 Hz, C17), 5,67 (d, 1, J = 16 Hz, C17), 7,62 (d, J = 7 Hz, C11), 7,71 (s, C14),

8,16 (d, 1, J = 7 Hz, C12), 8,89 (s, 1, C7).

Analýza pre C₂4H₂₅N₃O5.1,5 CH3H₂O (molekulová hmotnosť = 615,7)

Vypočítané: C 49,74, H 5,72, N 6,82 %

Nájdené: C 49,36, H 5,15, N 7,53 %.

Príklad 9

Výroba (20S)-9-formyl-10-hydroxykamptotecínu

100 mg, 0,27 mmol 10-hydroxykamptotecínu pripraveného ako je opísané v príklade 2, 0,8 mg 5,5 mmol hexametyltetraamínu a 15 ml kyseliny trifluóroctovej (TEA) sa 20 hodín zahrieva pod spätným chladičom pod argónom. Reakčná zmes sa koncentruje, zmieša sa s 15 mi vody a mieša sa 1 hodinu, pridá sa 75 ml vody a pH sa upraví na 8,4 pridaním NaHCO₃. Vodná fáza sa premyje 3 x 75 ml EtOAc,

-53okyslí sa na pH 1,5 3N HCI a potom sa extrahuje 5 x 75 ml EtOAc. Zmiešané organické extrakty sa premyjú 5 x 75 ml 1N HCI, 75 ml vody a 25 ml nasýteného vodného roztoku NaCl a koncentrujú sa. Zvyšok sa potom prečistí rýchlou chromatografiou (1 cm x 15 cm oxid kremičitý so surovým materiálom predabsorbovaným na vložke 11 cm x 1 cm Na₂SO4). Produkt sa eluuje 1% CH3OH v CH₂CI₂, čím vznikne 50 mg (47 %) výslednej zlúčeniny. Analyticky čistá vzorka sa získa frakcionovanou precipitáciou z približne 25% CH3OH v CH₂CI₂ pomalým chladením a koncentráciou pod prúdom dusíka.

IR (KBr) 3400, 3100, 2950,1755,1660,1600 cm·^{1 1}H-NMR (CCI3D/CD3OD): 1,04 (t, 3, J = 7 Hz, C18), 1,96 (d, 2, J = 7 Hz, C19), 5,32 (d, 1, J = 14 Hz, C17), 5,33 (s, 2, C5), 5,68 (d, 1, J = 14 Hz, C17), 7,5 (d, 1, J = 9 Hz, C11), 7,67 (s, 1, C14), 8,33 (d, 1, J = 9 Hz, C12), 9,34 (s, 1, C7).

Analýza pre C₂iHieN₂O6.1H₂O (molekulová hmotnosť = 410,38)

Vypočítané: C 61,46, H 4,42, N 6,83 %

Nájdené: C 61,09, H 4,17, N 6,52 %.

Príklad 10

Výroba soli (20S)-9-cyklopropylaminometyl-10-hydroxykamptotecínu

Zmes 254 mg, 0,7 mmol 10-hydroxykamptotecínu pripraveného ako je opísané v príklade 2, 1,0 ml, 37% vodného formaldehydu, 400 mg, 0,7 mmol cyklopropylamínu v 16 ml ľadovej kyseliny octovej a 8 ml etanolu sa cez noc mieša pri teplote miestnosti a koncentruje sa vo vákuu do sucha. Zvyšok sa trituruje s vodou, filtruje sa a suší, čím vznikne 360 mg (75 % výťažok) hore uvedenej zlúčeniny ako jej acetátová soľ, ktorá sa premení v zmienenú hydrochloridovú soľ tri t u ráči o u s 0,1 N HCI.

Analýza pre C^H^NeOs. HCI. 3H₂O

Vypočítané: C 55,01, H 5,57, N 8,02 %

Nájdené: C 54,94, H 5,18, N 8,18 %.

¹H-NMR (D₂O): 0,96 (m, 7), 2,1 (m, 2), 2,8 (m, 1), 4,6 (s, 2), 4,8 (s, 2), 5,2 (s, 2), 7,2 (s,1), 7,5 (q, 2), 8,6 (s,1).

-54Príklad 11

Výroba (20S)-9-etoxymetyl-10-hydroxykamptotecínu

Zmes 364 mg, 1,0 mmol 10-hydroxykamptotecínu pripraveného ako je opísané v príklade 2, 90 mg, 1,1 mmol dimetylaminohydrochloridu a 1,5 ml 37% vodného formaldehydu sa zahrieva pod spätným chladičom v 25 ml 95% etanolu

5,5 hodiny. Reakčná zmes sa koncentruje na malý objem a precipitovaný produkt sa zhromaždí a suší. Prečistenie silikagélovou chromatografiou elúciou s 3% MeOH v CH2CI2 poskytne 85 mg (20% výťažok) výslednej zlúčeniny.

FAB spektrum: m/e 423 (Mhľ).

’H-NMR (DMSO): 0,85 (t, 3), 1,1 (t, 3), 1,9 (m, 2), 3,5 (s, 2), 4,8 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,2 (s, 1),7,7 (m, 2), 8,6 (s, 1).

Analýza pre C23H22N2O6 Vypočítané: C 62,08, H 5,27, N 6,29 %

Nájdené: C 61,80, H 5,22, N 6,12 %.

Príklad 12

Výroba (20S)-9-(A/-metylanilinometyl)-10-hydroxykamptotecínu

Zmes 254 mg, 0,7 mmol 10-hydroxykamptotecínu vyrobeného ako je opísané v príklade 2,1,0 ml 37% vodného formaldehydu, 0,75 ml, 0,7 mmol /V-metylanilínu v 16 ml ľadovej kyseliny octovej a 8 ml etanolu sa mieša 40 hodín pri teplote miestnosti. Po koncentrácii na olej, čiastočné prečistenie sa získa silikagélovou chromatografiou elúciou 1,2 a 3% MeOH v CH2CI2. Výsledné frakcie ešte stále obsahujú metylanilín. Ďalšie prečistenie sa dosiahne použitím silikagélového MPLC stĺpca a produkt sa eluuje 2% MeOH v CH₂CI₂. Frakcie produktu sa zmiešajú a koncentrujú vo vákuu, čím vznikne 77 mg (24 %) výslednej zlúčeniny ako žltej tuhej látky.

DCI-spektrum: m/e 484 (MH⁺).

¹H-NMR (CDCb): 1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 2,8 (s, 3), 5,0 (s. 2), 5,2 (s, 2), 5,5 (q, 2), 6,9 (m, 5), 7,5 (s, 1), 7,9 (q, 2), 8,4 (s, 1).

Analýza pre C28H25N3O5.1,2 H₂O

-55Vypočítané: C 66,58, H 5,74, N 8,32 %

Nájdené: C 66,97, H 5,69, N 7,91 %.

Príklad 13

Výroba hydrochloridovej soli (20S)-9-cyklohexylaminometyl-10-hydroxy-kamptotecínu

Zmes 364 mg, 1,0 mmol 10-hydroxykamptotecínu pripraveného ako je opísané v príklade 2, 1,5 ml, 37% vodného formaldehydu, 1,3 ml, 10 mmol cyklohexylamínu v 25 ml ľadovo studenej kyseliny octovej a 12 ml etanolu sa cez noc mieša pri teplote miestnosti a koncentruje sa vo vákuu do sucha. Zvyšok sa prečistí na MPLC stĺpci v reverznej fázy elúciou s 15% vodným MeOH, ktorý obsahuje 0,02 % ľadovo studenej kyseliny octovej. Po koncentrácii na malý objem a lyofilizácii sa získa výsledná zlúčenina ako acetátová soľ (250 mg, 47 %). Acetátová soľ sa premení na výslednú hydrochloridovú soľ pridaním 0,1 N HCI a soľ sa zhromaždí filtráciou.

¹H-NMR (DMSO): 0,9 (t, 3), 1,0 - 2,0 (m, 10), 3,1 (s, 1), 4,5 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,2 (s, 1), 7,9 (q, 2), 8,9 (s, 1).

Analýza pre C27H29N3O₅.HCI.1,5H₂O Vypočítané: C 60,93, H 6,11, N 7,89 %

Nájdené: C 60,83, H 5,98, N 7,75 %.

Príklad 14

Výroba hydrochloridovej soli (20S)-9-/V,/V-dimetylaminoetyloxymetyl-10-hydroxykamptotecínu

Zmes 100 mg, 0,2 mmol vodnej bázy 9-dimetylaminometyl-10-hydroxykamptotecínu pripravenej ako je opísané v príklade 21, v 4 ml 2-dimetylaminoetanolu, ktorá obsahuje tri kvapky 3N HCI sa zahrieva pod argónom pri 80 °C po 24 hodinách. Na polotuhú reakčnú zmes sa pôsobí 5 ml vody a 10 ml izopropanolu, mieša sa a filtruje, čím vznikne 60 mg (59 %)výslednej zlúčeniny.

-56¹H-NMR (DMSO): 0,9 (t, 3), 1,35 (m, 2), 2,3 (s, 6), 3,3 (s, 2), 4,1 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,3 (s, 1), 7,4 (d, 1), 8,0 (d, 1), 8,7 (s, 1).

Analýza pre C25H27N3O6. HCI. 0,5 H₂O

Vypočítané: C 58,77, H 5,72, N 8,25 %

Nájdené: C 58,94, H 4,92, N 7,90 %.

Príklad 15

Výroba hydrochloridovej soli (20S)-9-N,/V-dimetylaminoetyltiometyl-10-hydroxykamptotecínu

Zmes 100 mg, 0,2 mmol hydrochloridovej soli 9-dimetyl-10-hydroxykamptotecínu pripraveného ako je opísané v príklade 18, a 560 mg, 4 mmol 2-dimetylaminoetántiolu.HCI v 13 ml DMF sa zahrieva pod argónom pri 85 °C po dobu 5 hodín. Nerozpustná tuhá látka (prebytok tiolu) sa odstráni filtráciou a filtrát sa vo vákuu koncentruje na olejovitý zvyšok, ktorý sa prečistí s použitím MPLC v reverznej fáze. Produkt sa eluuje s použitím 5% a 10% MeOH vo vode, čím vznikne 45 mg (41 %) výslednej zlúčeniny ako žltej tuhej látky.

¹H-NMR (D₂0): 1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 2,8 (s, 6), 4,4 (s, 2), 5,3 (s, 2), 7,1 (d, 1), 7,2 (s, 1), 7,6 (d, 1), 8,2 (s, 1).

Analýza pre C₂5H₂8N₃O₅S.HCI.3H₂O Vypočítané: C 49,34, H 5,79, N 6,9 %

Nájdené: C 48,98, H 5,82, N 6,54 %.

Príklad 16

Výroba dihydrochloridovej soli (20S)-9-W,/V-dimetylaminoetylaminometyl-10hyd roxy kamptotecí n u

Zmes 364 mg, 1,0 mmol 10-hydroxykamptotecínu pripraveného ako je opísané v príklade 2, 100 mg, 1,1 mmol A/,/V-dimetyletyléndiamínu, 1,5 ml 37% vodného formaldehydu v 25 ml fadovo studenej kyseliny octovej a 10 ml etanolu sa mieša pri teplote miestnosti 64 hodín. Rozpúšťadlo sa vo vákuu odstráni a na tuhý zvyšok sa pôsobí 10 ml vody a 10 ml izopropanolu, ktorý obsahuje 3 ml 3N HCI.

-57Precipitovaná tuhá látka sa zhromaždí, premyje sa izopropanolom a suší sa, čím vznikne 218 mg (40% výťažok) výslednej zlúčeniny.

¹H-NMR (CD3OD): 1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 2,9 (s, 6), 4,5 (s, 2), 5,1 (m, 4), 5,4 (q, 2),

7,3 (d, 1), 7,5 (s, 1), 7,8 (d, 1), 8,4 (s, 1).

Analýza pre C25H28N4O5.2HCI Vypočítané: C 55,87, H 5,63, N 10,42 %

Nájdené: C 55,91, H 5,72, N 9,86 %.

Príklad 17

Výroba acetátovej soli (20R,S)-9-dimetylaminometyl-10-hydroxykamptotecínu

Výsledná zlúčenina sa vyrobí ako je opísané v príklade 3 a výnimkou, že východiskový materiál je racemický 10-hydroxykamptotecín pripravený podľa metódy Wäni a ďalší, J. Med. Chem., 23, 554 (1980).

Príklad 18

Výroba monohydrochloridovej soli (20S)-9-dimetylaminoetyl-10-hydroxykamptotecínu

Acetátová soľ 9-dimetylaminometyl-10-hydroxykamptotecín, pripravená ako je opisané v príklade 3, ktorá bola analyzovaná na 2,5 ekvivalentov kyseliny octovej a 0,75 ekvivalentov vody (8,5 g, 14,5 mmol založené na molekulovej hmotnosti 585) sa rozpustí v 170 ml, 17 mmol 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej, lyofilizuje sa a pumpuje sa pod vysokým vákuom po dobu 3 dní, čím vznikne 8,3 g výslednej zlúčeniny.

¹H-NMR (CDCI3/CD3OD): 0,5 (t, 3, J = 7,5 Hz), 1,98 (q, 2, J = 7,5 Hz), 2,95 (s, 6), 4,77 (s, 2), 5,33 (s, 2), 5,36 (d, 1, J = 16 Hz), 5,62 (d, 1, J = 16 Hz), 7,59 (d, 1, J = 9 Hz), 7,66 (s, 1), 8,2 (d, 1, J = 9 Hz), 8,86 (s, 1).

Analýza pre C23H23N3O5.IHCI.3H2O

Vypočítané: C 53,96, H 5,91, N 8,21, Cl 6,92 %

Nájdené: C 53,68, H 5,61, N 8,16, Cl 6,84 %.

-58Príklad 19

Výroba dihydrochloridovej soli (20S)-9-dimetylaminometyl-10-hydroxykamptotecínu

0,389 g, 1,07 mmol podľa HPLC analógov acetátovej soli 8-dimetylaminometyl-10-hydroxykamptotecínu, pripravenej ako je opísané v príklade 3 sa rozpustí v 6 ml, 2,4 mmol 0,4N HCI, lyofilizuje sa a pumpuje sa pod vysokým vákuom po dobu 40 hodín, čím vznikne 0,269 g výslednej zlúčeniny.

¹H-NMR (CCI3D/CD3OD): 1,05 (t, 3, J = 7,5 Hz), 1,92 (q, 2, J = 7,5 Hz), 3,01 (s, 6),

4,85 (s, 2), 5,31 (d, 1, J = 16 Hz), 5,36 (s, 2), 5,65 (d, 1, J = 16 Hz), 7,64 (d, 1, J = 9 Hz), 7,73 (s, 1), 8,23 (d, 1, J = 9 Hz), 9,07 (s, 1).

Analýza pre C23H23N3O2.2HCI. 3H₂O

Vypočítané: C 50,37, H 5,70, N 7,66, Cl 12,93 %

Nájdené: C 50,76, H 5,64, N 7,57, Cl 12,61 %.

Príklad 20

Výroba sodnej soli (20S)-9-dimetylaminometyl-10-hydroxykamptotecínu

Na 100 mg, 0,2 mmol acetátovej soli 9-dimetylaminometyl-10-hydroxykamptotecínu, pripravenej ako je opísané v príklade 3 sa pôsobí 4,5 ml, 0,45 mmol 0,1 N hydroxidu sodného a roztok na nechá prejsť cez H-20 živicový stĺpec (2 x 22 cm). Iskerník sa premyje 250 ml vody a produkt sa eluuje 1:1 zmesou vody a metanolu. Frakcie obsahujúce produkt sa zmiešajú, koncentrujú na malý objem a lyofilizujú sa, čím vznikne 98 mg (98 %) výslednej zlúčeniny.

IR (nujol) 1600 cm¹, (karboxylát).

¹H-NMR (D₂O): 0,65 (m, 3), 1,8 (m, 2), 2,8 (s, 6), 3,0 (m, 2), 4,21 (s, 2), 4,5 (s, 2),

7,1 (q, 2), 7,2 (s, 1), 7,8 (s, 1).

Analýza pre C23H₂4N3O6Na.1,5H2O Vypočítané: C 56,55, H 5,57, N 8,6 %

Nájdené: C 56,21, H 5,65, N 8,44 %.

Príklad 21

Výroba voľnej bázy (20S)-9-dimetylaminometyl-10-hydroxykamptotecínu

-59Zmes 729 mg, 2,0 mmol 10-hydroxykamptotecínu pripraveného ako je opísané v príklade 2, v 50 ml ľadovo studenej kyseliny octovej, 20 ml etanolu, 3 ml 37% vodného formaldehydu a 3 ml 40% vodného dimetylamínu sa mieša pri teplote miestnosti 20 hodín. Rozpúšťadlo sa odstráni za zníženého tlaku, zvyšok sa zahrieva na teplotu 50 °C pod vysokým vákuom 2 hodiny a trituruje 10 ml izopropanolu, aby precipitovalo 561 mg (64 %) výslednej zlúčeniny ako žltej tuhej látky.

FAB hmotnostné spektrum: m/e 422 (MH⁺).

¹H-NMR (CDCI3/CD3OD): 1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 2,5 (s, 6), 4,3 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (q, 2), 7,6 (s, 1), 7,7 (q, 2), 8,5 (s, 1).

Príklad 22

Výroba trifluórmetylsulfonátu(triflát) (20S)-10-hydroxykamptotecínu

K zmesi 1,44 g, 4,0 mmol 10-hydroxykamptotecínu pripraveného ako je opísané v príklade 2, v 40 ml DMF sa pridá 1,2 g, 12 mmol trietylamínu a potom sa pridá 2,0 g, 6 mmol /V-fenyltrifluórmetánsulfonimidu. Reakčná zmes sa zahrieva pri teplote 50 °C po dobu 3 dní. Rozpúšťadlo sa vo vákuu odstráni a zvyšok sa trituruje vodou, filtruje sa a suší. Teoretický výťažok surového produktu sa získa ako jediná škvrna chromatografiou na tenkej vrstve (TLC) vykazujúcej malé množstvá pôvodných nečistôt. Malá vzorka sa prečistí rýchlou chromatografiou na silikagélovom stĺpci elúciou produktu 2% MeOH v CH2CI2.

¹H-NMR (CDCb): 1.0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 5,3 (s, 2), 5,4 (q, 2), 7,7 (s, 1), 7,6 - 7,9 (m, 2), 8,2 (d, 2), 8,5 (s, 1).

FAB hmotnostné spektrum: m/e 497 (MH⁺), 495 (M-H)'.

Analýza pre C21H15N2SF3

Vypočítané: C 50,81, H 3,05, N 5,64 %

Nájdené: C 51,38, H 3,42, N 4,99 %.

Príklad 23

Výroba (20S)-9-dimetylaminometylkamptotecínu

-60Acetátová soľ trifluórmetánsulfonátu (20S)-9-dimetylaminometyl-10-hydroxykamptotecínu sa pripraví in situ ako je opísané nižšie. Na zmes 482 mg, 1 mmol acetátovej soli 9-dimetylaminometyl-10-hydroxykamptotecínu, pripravenej ako je opísané v príklade 3 v 40 ml A/,/V-dimetylformamide (DMF) pod argónom sa pôsobí 268 mg, 2,5 mmol 2,6-lutidínu a 0,54 g, 1,5 mmol N-fenyltrifluórmetánsulfonamidu.

t

Reakčná zmes mieša cez noc pri teplote miestnosti. Potom sa k hore vytvorenému . filtrátu pridá 0,4 ml, 3 mmol trietylamínu, 8 mg, 0,04 mmol octanu paladnatého, 20 mg, 0,08 mmol trifenylfosfínu a 0,08 ml koncentrovanej kyseliny mravčej. Reakčná zmes sa 8 hodín zahrieva pri teplote 60 °C. Rozpúšťadlo sa vo vákuu odstráni a zvyšok sa trituruje malým množstvom vody a filtruje sa. Sušená, surová nerozpustná tuhá látka mala hmotnosť 550 mg. Prečistí sa rýchlou chromatografiou na silikagélovom stĺpci elúciou malým množstvom východiskového triflátu s trifenylfosfátom za získania 25 mg (7 %) 9-metylkamptotecínu, 88 mg (20 %) výslednej zlúčeniny ako voľnej bázy (4% MeOH v CH₂CI) a malé množstvo trifluórmetylsulfonátu 10-hydroxykamptotecínu s 10% MeOH v CH₂CI₂. Malé množstvo výslednej zlúčeniny sa premení na acetátovú soľ pôsobením zriedenej kyseliny octovej.

¹H-NMR (CDCI₃): 0,9 (t, 3), 1,8 (m, 2), 2,2 (s, 6), 3,7 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (q, 2), 7,3 (d, 1), 7,5 (d, 1), 7,6 (s, 1), 8,0 (d, 1), 3,3 (s, 1).

Hmotnostné spektrum: m/e 406 (MH³⁰).

Analýza pre 0₂5Η₂₇Ν3θβ.2,5Η₂0

Vypočítané: C 58,81, H 6,12, N 8,23 %

Nájdené: C 58,60, H 5,88, N 7,88 %.

Príklad 24 ' Výroba 10-kyanokamptotecínu

Roztok 444 mg, 1,4 mmol tributylcínkyanidu a 276 mg, 0,6 mmol tetrakistrifenylfosfínpaládia v 20 ml, 1,2-dichlóretánu za zahrieva pod spätným chladičom pod argónom 2 hodiny za vytvorenia paládiumcín-kyanidového komplexu. Potom sa pridá 266 mg, 0,6 mmol trifluórmetylsulfonátu 10-hydroxikamptotecínu, pripraveného ako je opísané v príklade 22 a zahrieva sa pod spätným chladičom a zahrievanie

-61 pod spätným chladičom pokračuje po dobu 3,5 hodiny. Reakčná zmes sa koncentruje na tretinu svojho pôvodného objemu a t rítu ruje sa s rovnakým objemom dietyléteru. Precipitovaná žltá tuhá látka sa zhromaždí a suší sa. Výsledná zlúčenina sa získa v 82% výťažku 183 mg. Po prečistení rýchlou chromatografiou, výsledná zlúčenina eluovala s 2% MeOH v CH₂CI₂ a získa sa 115 mg.

¹H-NMR (CDCb): 0,9 (t, 3), 1,8 (m, 2), 2,2 (s, 6), 3,7 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (q, 2), 7,3 (d, 1), 7,5 (d, 1), 7,6 (2,1), 8,0 (d, 1), 3,3 (s, 1).

Hmotnostné spektrum: m/e 406 (MH³⁰).

Analýza pre C₂5H₂7N₃O6.2,5H₂O

Vypočítané: C 58,81, H 6,12, N 8,23 %

Nájdené: C 58,60, H 5,88, N 7,88 %.

Príklad 25

Výroba (20S)-10-formylkamptotecínu

Plameňom vysušená banka sa naplní 100 mg, 0,22 mmol trifluórmetylsulfonátu 10-hydroxykamptotecínu, pripraveného ako je opísané v príklade 22, 10 ml čerstvo destilovaného tetrahydrofuránu (THF) a 10 mg, 9 mmol tetrakistrifenylfosfín-paládia. Oxid uhoľnatý (CO) bublá v reakčnej zmesi 3 minúty a potom sa reakčná zmes uzavrie CO balónom a ponorí sa do olejového kúpeľa pri 50 °C. Za miešania a použitia ručnej pumpy sa po kvapkách pridá roztok 0,73 ml Br₃SnH v 3 ml bezvodného THF v priebehu štyroch hodín. Po tejto dobe sa vo vákuu odstráni rozpúšťadlo a zvyšok sa prečistí rýchlou chromatografiou (1 až 2% CH3OH, CH2CI2), nasleduje konečná purifikácia s použitím chromatotrónu (Harisson Research, Palo Alto, Californie). Výsledná zlúčenina eluovaná s 2% MeOH v CH₂CI₂ mala 20 mg (24 %).

¹H-NMR (CDCb): 0,9 (t, 3), 1,9 (m, 2), 5,3 (split s, 2), 5,4 (q, 2), 7,7 (d, 1), 7,8 - 8,3 (m, 3), 8,5 (s, 1), 9,9 (s, 1).

Analýza pre C21H16N2O5.I 1/3 H₂O Vypočítané: C 61,84, H 4,69, N 6,86 %

Nájdené: C 61,83, H 4,53, N 6,37 %.

-62Príkiad 26

Výroba acetátovej soli (20S)-10-aminometylkamptotecínu

Na roztok 160 mg, 0,4 mmol 10-kyanokamptotecínu, pripraveného ako je opísané v príklade 24, v 45 ml ľadovo studenej kyseliny octovej sa pôsobí aktivovaným Raney niklom a hydrogenuje sa pri 0,07 MPa (1785,8 g/cm) po dobu 7 hodín. Katalyzátor sa odstráni filtráciou cez supercel a filtrát sa vo vákuu koncentruje. Tuhý zvyšok sa prečistí chromatografiou pri strednom tlaku na stĺpci v reverznej fáze elúciou produktu 10% MeOH vo vode. Po sušení vymrazovaním sa získa 25 mg (15 %) hygroskopickej výslednej zlúčeniny.

’H-NMR (D₂O): 1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 4,3 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,5 (s, 1), 7,7 8,1 (m, 3), 8,6 (s, 1).

Analýza pre C23H23N3O6.6 H₂O Vypočítané: C 50,63, H 6,46, N 7,73 %

Nájdené: C 50,11, H 6,57, N 7,64 %.

Príklad 27

Výroba acetátovej soli (20S)-10-aminometylkamptotecínu

Na roztok 160 mg, 0,42 mmol 10-kyanokampotecínu, pripraveného ako je opísané v príklade 24, v 45 ml ľadovo studenej kyseliny octovej sa pôsobí aktivovaným Raney niklom a hydrogenuje sa pri 0,07 MPa (1785,8 g/cm) po dobu 7 hodín. Katalyzátor sa filtruje cez supercel (95% SiO₂), koncentruje sa vo vákuu a purifikuje sa na stĺpci v reverznej fáze. Produkt eluoval v 10% MeOH H₂O, ktorý obsahuje 0,02 % kyseliny sírovej. Po zhromaždení frakcií sa koncentruje na malý objem a lyofilizáciou sa získa 26 mg (14 %) výslednej zlúčeniny.

’H-NMR (D₂O/MeOD„): 1,0 (t, 3), 2,0 (m, 2), 4,3 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,5 (s, 2), 7,5 (s, 1),8,0 (m, 3), 8,6(8,1).

Analýza pre C23H23N3O6 Vypočítané: C 50,53, H 6,46, N 7,73 %

Nájdené: C 50,11, H 6,57, N 7,64 %.

-63Príklad 28

Výroba (20S)-9-morfolinometylkamptotecínu

Na 1 mmol roztoku trifluórmetylsulfonátu 10-hydroxy-9-morfolinometylkamptotecínu, pripraveného ako je opísané v príklade 23, v 25 ml bezvodého DMF sa pôsobí 0,4 ml trietylamínu, 8 mg, 0,08 mmol Pd(kyselina octová)₂, 20 mg, 0,08 mmol I3P a 0,08 ml, 2 mmol 99% kyseliny mravčej. Reakcia sa zahrieva pod argónom na 60 °C po dobu 6 hodín, koncentruje sa vo vákuu a pôsobí sa na ňu vodou. Ako žiadaná výhodná zlúčenina, tak aj hlavný vedľajší produkt 9-metylkamptotecín sa vyzráža (300 mg) a zhromaždí sa filtráciou, purifikáciou silikagélovou rýchlou chromatografiou. 9-metylkamptotecín sa izoluje elúciou 1% MeOH v CH2CI2 (45 mg, 13 %). Elúcia s 2% MeOH v CH2CI2 poskytne 93 mg (20 %) výslednej zlúčeniny.

¹H-NMR (CDCl3/MeOD₄): 1,0 (t, 3), 2,0 (m, 2), 2,5 (m, 4), 3,7 (m, 4), 4,0 (s, 2), 5,3 (s, 2), 5,6 (q, 2), 7,5 (d, 1), 7,6 (s, 1), 7,7 (d, 1), 8,2 (d, 1), 9,0 (s, 1).

Hmotnostné spektrum: m/e 448 (MH⁺).

Analýza pre C25H25N3O5.0,5 H₂O

Vypočítané: C 65,78, H 5,74, N 9,2 %

Nájdené: C 65,87, H 5,96, N 9,00 %.

Príklad 29

Výroba (20S)-10-hydroxy-9-kyanometylkamptotecínu

Zmes 0,42 g, 0,8 mmol metánsulfonátovej soli 9-trimetylamóniummetyl-10hydroxykamptotecínu, pripravenej ako je opísané v príklade 8 v 35 ml 95% EtOH a

1,26 g, 25 mmol kyanidu sodného sa zahrieva pod spätným chladičom pod argónom po dobu 3 hodín. Rozpúšťadlo sa odstráni vo vákuu, pridá sa 20 ml vody a pH sa upraví na pH 1,5 3N HCI. Precipitovaná surová tuhá látka sa zhromaždí a suší. Prečistenie sa uskutoční rýchlou silikagélovou chromatografiou na stĺpci, produkt sa eluoval so 4% a 5% MeOH v CH₂CI₂, čím poskytol 110 mg (33 %) výslednej zlúčeniny.

-64¹H-NMR (CDCl3/MeOD₄): 0,9 (t, 3), 1,8 (m, 2), 4,2 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,3 (q, 2), 7,5 (d,

1), 7,6 (s,1), 7,9 (d,1), 8,4 (s, 1).

Analýza pre C22H17N3O5.1 3/4 H₂O

Vypočítané: C 60,75, H 4,58, N 9,66 %

Nájdené: C 60,63, H 4,64, N 9,60 %.

Príklad 30

Výroba acetátovej soli (20S)-10-hydroxy-9-aminoetylkamptotecínu

Na roztok 60 mg, 0,15 mmol 10-hydroxy-9-kyanometylkamptotecínu, pripraveného ako je opísané v príklade 29, v 30 ml ľadovo studenej kyseliny octovej sa pôsobí približne 1 g (vlhká hmotnosť) Raney niklom a hydrogenuje sa pri 0,07 MPa (1785,8 g/cm) po dobu 6 hodín. Katalyzátor sa odstráni filtráciou a filtrát sa potom rozpustí vo vode a čistí sa chromatografiou na stĺpci v reverznej fáze eluovaním produktu 10% MeOH vo vode (obsahuje 0,02 % ľadovo studenej kyseliny octovej). Vhodné frakcia sa zhromaždí, koncentruje sa na malý objem a suší sa vymrazovaním cez noc s výnosom 23 mg (33 %) výslednej zlúčeniny.

¹H-NMR (DMSO-de): 0,9 (t, 3), 1,9 (m, 2), 3,2 (s, 2), 5,0 (3, 2), 5,1 (s, 2), 5,4 (s, 2),

7,2 (s,1), 7,5 (q, 2), 8,4 (s, 1).

III. Príklady farmaceutických prípravkov

Príklad A

Parenterálny prípravok

Na prípravu parenterálneho farmaceutického prípravku podľa vynálezu vhodného na aplikáciu injekciou sa 100 mg vo vode rozpustnej soli zlúčeniny všeobecného vzorca I zmieša s 10 ml 0,9% sterilného roztoku NaCl a zmes sa naplní do vhodnej dávkovej jednotkovej formy vhodnej na injekčnú aplikáciu.

Príklad B Orálny prípravok

-65Na prípravu farmaceutického prípravku na orálne podanie podl’a vynálezu, 10 mg zlúčeniny všeobecného vzorca I sa zmieša so 750 mg laktózy a zmes s naplní do orálnej dávkovej formy, ako je napríklad tvrdá želatínová kapsula, ktorá je vhodná na perorálnu aplikáciu.

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1, 9,10-Substituované kamptotecíny všeobecného vzorca I kde

   X je hydroxyskupina, vodík, -CH₂NH₂ alebo formylová skupina,

   R je vodík, keď X je CH₂NH₂ alebo formylová skupina, alebo R je -CHO alebo -CH₂R¹, keď X je vodík alebo hydroxyskupina,

   R¹ je -O-R², -S-R², -CH₂NH₂, v prípade, že X je hydroxyskupina, kyanoskupina, -N-R²(R³), alebo N⁺-R²(R³)(R⁴) za predpokladu, že keď R¹ je -N⁺-R²(R³)(R⁴), zlúčenina je spojená s farmaceutický prijateľným aniónom,

   R², R³, R⁴ sú rovnaké alebo rôzne a sú vybrané z H, alkylovej skupiny s 1 až 6 atómami uhlíka, hydroxyalkylovej skupiny s
2. 2 až 6 atómami uhlíka, Cve dialkylamino-C₂.6-alkylovej skupiny, aminoalkylovej skupiny s 2 až 6 atómami uhlíka alebo 3 až 7-členného nesubstituovaného karbocyklického kruhu, a v prípade, že R¹ je -N-R²(R³), skupiny R² a R³ sa môžu navzájom spojiť atómom dusíka, ku ktorému sú viazané za vzniku heterocyklického kruhu za predpokladu, že takýto kruh je vybraný z morfolínového, /V-metylpiperazinylového alebo 4‘-p-piperidino-piperidínového kruhu, alebo ich farmaceutický prijateľné soli, hydráty alebo solváty.

   -672. 9,10-Substituované kamptotecíny všeobecného vzorca I podľa nároku 1, v ktorých X je hydroxyskupina a R je dimetylaminometylová skupina, A/-morfolinometylová, /V-metylpiperazinylmetylová, (4'-piperidín)-/V-piperidinylmetylová, (2hydroxyetyl)aminometylová, trimetylamóniummetylová, cyklohexylaminometylová, /V-metylanilinometylová, etoxymetylová, cyklopropylaminometylová, Λ/,/V-dimetylaminoetyloxymetylová, Λ/,/V-dimetylaminoetyltiometylová, /V,/V-dimetylaminoetylaminometylová, kyanometylová, aminoetylová alebo formylová skupina, alebo kde R je vodík a X je formylová alebo aminometylová skupina, alebo kde X je vodík a R je dimetylaminometylová alebo /V-morfolinometylová skupina.
3. 3. 9,10-Substituované kamptotecíny všeobecného vzorca I podľa nároku 1, ktoré sú vo forme S-izoméru.
4. 4. 9,10-Substituované kamptotecíny všeobecného vzorca I podľa nároku 1, ktoré sú vo forme racemickej zmesi.
5. 5. 9,10-Substituovaný kamptotecín všeobecného vzorca I podľa nároku 3, v ktorom X je hydroxyskupina a R je dimetylaminometylová skupina.
6. 6. 9,10-Substituovaný kamptotecín všeobecného vzorca I podľa nároku 5, ktorý je vo forme acetátu.
7. 7. 9,10-Substituovaný kamptotecín všeobecného vzorca I podľa nároku 5, ktorý je vo forme monohydrochloridu, dihydrochloridu alebo sodnej soli.
8. 8. 9,10-Substituovaný kamptotecín všeobecného vzorca I podľa nároku 3, v ktorom X je hydroxyskupina a R je trimetylamóniummetylová skupina.
9. 9. 9,
10. 10-Substituovaný kamptotecín všeobecného vzorca I podľa nároku 3, v ktorom X je hydroxyskupina a R je /V-metylpiperazinylmetylová skupina.

    -6810. 9,10-Substituovaný kamptotecín všeobecného vzorca I podľa nároku 3, v ktorom X je hydroxyskupina a R je /V-metylanilinometylová skupina.
11. 11. 9,10-Substituovaný kamptotecín všeobecného vzorca I podľa nároku 3, v ktorom X je hydroxyskupina a R je cyklohexylaminometylová skupina.
12. 12. 9,10-Substituovaný kamptotecín všeobecného vzorca I podľa nároku 3, v ktorom X je hydroxyskupina a R je A/,/V-dimetylaminoetyloxymetylová skupina.
13. 13. 9,10-Substituovaný kamptotecín všeobecného vzorca I podľa nároku 3, v ktorom X je hydroxyskupina a R je kyanometylová skupina.
14. 14. 9,10-Substituovaný kamptotecín všeobecného vzorca I podľa nároku 3, v ktorom X je hydroxyskupina a R je morfolinometylová skupina.
15. 15. 9,10-Substituovaný kamptotecín všeobecného vzorca I podľa nároku 3, v ktorom X je hydroxyskupina a R je aminometylová skupina.
16. 16. 9,10-Substituovaný kamptotecín všeobecného vzorca I podľa nároku 3, v ktorom X je hydroxyskupina a R je cyklopropylaminometylová skupina.
17. 17. Farmaceutický prostriedok na inhibíciu rastu nádorových buniek, vyznačujúci sa tým, že ako svoju účinnú zložku obsahuje účinné množstvo

    9,10-substituovaného kamptotecínu všeobecného vzorca I kde

    X je hydroxyskupina, vodík, -CH2NH2 alebo formylová skupina,

    R je vodík, keď X je CH₂NH₂ alebo formylová skupina, alebo R je -CHO alebo -CH₂R¹, keď X je vodík alebo hydroxyskupina,

    R¹ je -O-R², -S-R², -CH2NH2, v prípade, že X je hydroxyskupina, kyanoskupina, -N-R²(R³), alebo N⁺-R²(R³)(R⁴) za predpokladu, že keď R¹ je -N⁺-R²(R³)(R⁴), zlúčenina je spojená s farmaceutický prijateľným aniónom,

    R², R³, R⁴ sú rovnaké alebo rôzne a sú vybrané z H, alkylovej skupiny s 1 až 6 atómami uhlíka, hydroxyalkylovej skupiny s 2 až 6 atómami uhlíka, Ci_₆ dialkylamino-C₂-6-alkylovej skupiny, aminoalkylovej skupiny s 2 až 6 atómami uhlíka alebo 3 až 7-členného nesubstituovaného karbocyklického kruhu, alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ, hydrát alebo solvát.
18. 18. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 17, vyznačujúci sa t ý m, že v účinnej zložke všeobecného vzorca I je X je hydroxyskupina a R je dimetylaminometylová skupina, /V-morfolinometylová, /V-metylpiperazinylmetylová, (4^,-piperidín)-/V-piperidinylmetylová, (2'-hydroxyetyl)aminometylová, trimetylamóniummetylová, cyklohexylaminometylová, /V-metylanilinometylová, etoxymetylová, cyklopropylaminometylová, /V,/V-dimetyl-aminoetyloxymetylová, /V,/V-dimetylaminoetyltiometylová, /V,/V-dimetylaminoetylaminometylová, kyanometylová, aminoetylová

    -70alebo formylová skupina, alebo kde X je vodík a R je dimetylaminometylová alebo /V-morfolinometylová skupina.
19. 19. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 17, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje S-izomér účinnej látky.
20. 20. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 17, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje racemickú zmes účinnej zložky.
21. 21. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 17, vyznačujúci sa t ý m, že v účinnej zložke X je hydroxyskupina a R je dimetylaminometylová skupina.
22. 22. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 17, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje účinnú zložku vo forme acetátu.
23. 23. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 17, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje monohydrochlorid, dihydrochlorid alebo sodnú soľ účinnej zložky.
24. 24. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 17, vyznačujúci sa t ý m, že je v orálnej dávkovej forme.
25. 25. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 17, vyznačujúci sa t ý m, že je v parenteráinej dávkovej forme.
26. 26. Kamptotecinový derivát vzorca II