CZ397391A3 - Ve vodě rozpustné campothecinové sloučeniny užité čně v inhibici růstu živočišných nádorových buněk - Google Patents

Abstract

Ve vodě rozpustné camotothecinové sloučeniny, farmaceutické prostředky s jejich obsahem a způsob inhibice růstu nádorových buněk citlivých na tyto látky u zvířat, která to potřebují. Popisuje se jejich struktura, jejich cytotoxicita, ' farmaceutické prostředky je obsahující a příkladech se uvádí výroba těchto látek.

Description

Ve vodě rozpustná camptothecinové slW5errřny~tržiteé-né^! v inhibici růstu živočišných nádorových buněk

Oblast vynálezu

Vynález se vztahuje na ve vodě rozpustné camptothecinové sloučeniny, farmaceutické prostředky obsahující růst nádorových buněk inhibující množství takového analogu a způsob inhibice růstu nádorových buněk citlivých na takové analogy u zvířat, která to potřebují.

Dosavadní stav techniky

Struktura helixu ONA vyvolává v eukaryotických buňkách určité topologická problémy, které musí buněčný aparát vyřešit, má-li užít genetický materiál jako templát. Oddělení jednotlivých řetězců DAN je základem pro některé buněčné pochody, jako jsou replikace a transkripce ONA.

Vzhledem k tomu, že DNA je v eukaryotických buňkách organizována ve chromatinu chromosomálními bílkovinami, zakončení jsou sevřena a řetězce se nemohou rozvinout bez zásahu enzymů, měnících topologii. Již dlouho bylo uznávána, že by postup transkripce a replikace podél helixu DNA byl usnadněn otočným bodem, který by snížil torsní napětí, vznikající při těchto pochodech. Topoisomerázy jsou enzymy, které jsou schopné vyvolat změny v topologii DNA eukaryotických buněk. Jsou rozhodující pro důležité buněčné funkce a buněčnou proliferaci.

V eukaryotických buňkách jsou dvě ^řídy topoisomeráz, typ I a typ II. Topoisomeráza I je monomerní enzym, molekulární hmotnosti přibližně 100 000. Enzym se váže na DNA a působí přechodné jednotlivé přerušení řetězce, rozvinutí dvojitého helixu, nebo možnosťjeho rozvinutí, a následně znovuuzavření tohoto přerušení před disociováňím od řetězce DNA.

I

Topoisomeráza II je tvořena dvěma identickými podjednotkami molekulární hmotnosti 170 000. Topoisomeráza II přechodně přerušuje oba řetězce helixu, což umožní průchod druhého dvojiténo segmentu řetězce přes toto přerušení.

Camptothecin je ve vodě nerozpustný, cytotoxický alkaloid vytvářený stromy Camptotheca accuminata, domácí v Číně a Notnapodytes foedita, domácí v Indii. Camphothecin a několik jeho úzce příbuzných kongenerů jsou jedinou známou třídou sloučenin innibujících topoisomerázu I.

Inhibice topoisomerázy II je hlavním cílem důležitých komerčních onkolytických látek, například etoposid, doxorubinin a mitoxantron, stšjně jako dalších onkolytických činidel, která jsou ještě ve vývoji. Camptothecin (a jeho známé kongenery) nemají žádný účinek na topoisomerázu II a žádné známé inhibitory topoisomerázy II nemají signifikantní účinek na topoisomerázu I.

Camptothecin ajeho známé topoisomerázu I inhibující kopgonery se neosvědčily jako atraktivní pro vývoj klinicky použitelných farmak užívaných jako cytolytická činidla pro nedostatek klinické účinnosti, nepřijatelnou toxicitu omezující dávky, napředvídatelnou toxicitu, slabou rozpustnost ve vodě a/nebo nepřijatelnou stabilitu při skladování. Proto existuje potřeba pro inhibiční činidla topoisomerázy I, která jsou prosta nežádoucích vlastností camptothecinu a jeho známých k topoisomeráze I vztažených inhibičních kongonerů. Sloučeniny tohoto vynálezu splňují tyto požadavky.

Miyasaka a další, U.S. patent č. 4 6^04 463 uveřejněný 5. srpna 1986 a přidělený Yakult Honsha K: K., popisuje camptothecinové deriváty obecného vzorce *

ve kterém ίΛ je atom vodíku, atom halogenu nebo alkylové skupina s 1 až 4 atomy uhlíku a

3 9 3

X je atom chloru nebo kde -NR R , ve která R a R jsou stejné nebo různá a každý znamená atom vodíku, substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu vybranou ze skupiny tvořené cyklopentylem, cyklohexylem, M-methylpyridylem-(4), 2-pyrrolodylem, fenylem, tolylem, xylylem, pyridylem-2 a 2-methylpyridylem-(4) s výjimkou, že když 2 3 oba R a R jsou substituované nebo nesubstituované alkylové skupiny, mohou být spolu spojeny s atomem dusíku, ke kterému jsou vázány, k vytvoření heterocyklického kruhu vybraného ze skupiny sestávající z pyrrolidinu, piperidinu, 2-oxopyrrolidinu, morfolinu, thiomorfolinu

4 a 4-R -piperidinových kruhů, ve kterých R je atom vodíku, substituovaná nebo nesubstituované alkylové skupina s 1 až 4 atomy uhlíku nebo substituovaná nebo nesubstituovfcá fenylová skupina a ve kterém seskupení -0-C0-X je vázáno atomem umístěným v jakékoli 9-, 10- a 11-poloze v kruhu Λ, a jejich amonné soli nebo jejich soli alkalických kovů.

Miyasaka a další také konstatují, že takové camptothecinová deriváty jsou užitečné protinádorové léky, mající silný protinádorový účinek se sníženou toxicitou.

Miyasaka a další, US patent č. 4 473 692 uveřejněný

25. září 1934 a přidělený Yakult Honsha K. K., popisuje camptothecinove deriváty obecného vzorce

» ve kterém r! je atom vodíku, přímá nebo větvená alkylová skupina s 1 až 30 atomy uhlíku, alkoxyskupina s 1 až 30 atomy uhlíku nebo aryloxyskupina s 1 až 17 atomy uhlíku,

R je atom vodíku, přímá nebo větvená alkylová skupina s 1 až 30 atomy uhlíku, cykloalkylová skupina s 5 až 3 atomy uhlíku, fenylalkylová skupina, naftylalkylová skupina, hydroxymethylová skupina, karboxymethylová skupina nebo aryloxymethylová skupina s 1 až 17 atomy uhlíku a * R je XR , kde R je atom vodíku, přímá nebo větvená alkylová skupina s 1 až 30 atomy uhlíku nebo acylová skupina s 1 až 17 atomy uhlíku a *

X je atom kyslíku nebo síry, nebo ve které R' je nitroskupina, aminoskupina, alkylaminoskupina s 1 až 3 atomy uhlíku, acylaminoskupina s 1 až 17 atomy uhlíku nebo

2 atom halogenu s výjimkou, že když oba R a R jsou atomy uhlíku, r3 není hydroxy-, methoxy- nebo acetoxy-skupina.

Miyasaka rovněž uvádí, že svrchu uvedené camptothecinové deriváty mají značný protinádorový účinek s malou toxicitou.

Miyasaka a další, US patent č. 4 545 330 uveřejněný

3. října 1935 popisuje metodu 'výroby camptothecinových derivátů obecného vzorce

ve kterém

R^ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu, hydroxylovou skupinu, alkoxyskupinu nebo acyloxyskupinu,

L

R znamená atom vodíku, alkylovou skupinu, aralkylovou sku pinu, hydroxymethylovou skupinu, karboxymethylovou skupinu nebo acyloxymethylovou skupinu,

R znamená atom vodíku, alkylovou skupinu nebo acylovou skupinu a

X znamená atom kyslíku nebo síry.

Yakult Honska K. K., evropská patentová přihláška publikační č. 0,033 642, A2, publikovaná 4. září 1933 popisuje camptothecinové deriváty obecného vzorce

ve kterém 12

R a R každý znamená atom vodíku, substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu, substituovanou nebo nesubstituovanou aralkylovou skupinu nebo substituovanou nebo nesub1 2 stituovanou arylovou skupinu a R a /i vzato dohromady s atomem dusíku, ke kterému jsou připojeny, mohou tvořit cyklickou skupinu.

Yakult Honsha K. K. uvádí, že takové sloučeniny jsou užitečné jako farmaceutické meziprodukty pro protinádorové činidla.

Wani a další, 3. Med. Chem., 29, 2353 - 2363 (1936) popisují L-1210 myší leukemiové zkoušky protinádorové aktivity různých camptothecinových analogů včetně 9-nitro-20(S)-camptothecinu, 9-amino-2Q(S)-camptothecinu, 9-nitro-13-methoxy-2CI(S)i

-camptothecinu, 9-nitro-10-hydroxy-20(S)-camptothecinu s

9-acetamido-lQ-hydroxy-23(S)-camptothecinu.

Nitta a další, Proč. 14th International Congr. Chemotherapy, Xyoto, 1935, Tokyo Univ. Tokyo Press, Anticancer . Section 1, str. 23 až 30, popisuje, že sloučenina označená CPT-11 má profilovou účinnost v preklinických modelech tumorů. CPT-11 je ve vodě rozpustný camptothecinový analog s

4-(piperidino)-piperidinovýra postranním řetězcem spojeným přes karbamátovou vazbu na C-10 lQ-hydroxy-7-ethylcamptothecinu.

Ačkoliv camptothecin je toxický pro močový měchýř a má nepředvídatelnou toxicitu na proliferující tkáně předem vylučující jako užití, 19-hydroxycamptothecin se zdá mít podle čínské literatury schopnost zadržovat aktivitu lidských solidních tumorů s mnohem více sníženou toxicitou. Viz Xu 3in a Yang 3in Long Advances in Chinese Medicinal Materials Research”, Η. M. Chang a další, Eds., World Scientific Publ. Co., Singapore, 1935, str. 377, kteří diskutují výsledky fáze I a fáze II klinických zkoušek 10-hydroxycamptothecinu u r

253 pacientů s několika typy lidských solidních nádorů.

Department of Maxillo facial surgery, 9th People's Hospital, Shanghai, Clin. 3. Stomatology, 13, 75 (1973), dis kutuje fázi XI klinických zkoušek camptothecinu a 10-hydroxy camptothecinu u několika typů lidských solidních nádorů.

Wani a další, 3. Med. Chem.,.23, 554 (1930) popisuje syntesu různých syntetických analogů camptothecinu a 10-hydroxycamptothecinu včetně analogu, kterým je diethylamino ethylther na C-10.

Wani a další, 3. Med. Chem. 30, 1774 (1937) popisuje syntesu různých 11-substituovaných camptothecinových analogů včetně kyano-, nitro-, amino-, dimethylamino, formylových aminomethylových a hydromethylových. Wani a další referují, že mezi těmito analogy pouze 11-kyano, 11-nitro a 11-aminocamptothecinové analogy jsou účinná ve zkoušce protinádorová aktivity. Zřetelně 11-aminomethylový analog a jeho hydrochloridová sůl jsou popisovány jako neúčinné.

Podstata vynálezu

Vynález se týká sloučeniny obecného vzorce I

X je hydroxyskupina, atom vodíku, -CH₂Í1H₂, nebo formylová skupina,

R znamená atom vodíku v případě, že X znamená CH_OMH„ nebo 1 z z formyl, nebo znamená R skupinu -CHQ nebo CH₂R v případě, že X znamená atom vodíku nebo hydroxyskupinu,

R¹ znamená -Q-R², -S-R², CH9NH9, -N-R²(R³) nebo -H⁺-R²(R³)(R⁴) Z Z τ t za předpokladu, že v případě, že R 'znamená skupinu -N⁺-R²(R³)(R⁴), je sloučenina spojena s farmaceuticky přijatelným aniontem,

3 4

R , R a R ., stejné nebo různé, se volí ze skupiny atom vodíku, alkyl o 1 až 6 atomech uhlíku, hydroxyalkyl o 2 až 6 atomech uhlíku, dialkylaminoskupina o 1 až 6 atomech uhlíku v každé alkylové části, diálkylaminoalkyl o 1 až 6 atomech uhlíku v každé alkylové části a o 2 až 6 atomech uhlíku v alkylové skupině, alkylaminoalky1 o 1 až 6 atomech uhlíku v jedné alkylové části a o 2 až 6 atomech uhlíku ve druhé alkylové části, aminoalkyl o 2 až 6 atomech uhlíku nebo nesubstituovaný nebo substituovaný uhlíkový kruh a 3 až 7 atomech v kruhu a v případě, že ίΛ znamená skupinu -H-R²(R^)(R⁴), mohou skupiny

3

R a R společně s atomem dusíku, na nějž jsou vázány, tvořit heterocyklický kruh za předpokladu, že se tento kruh volí ze skupiny morfolinový, M-methylpiperazinylový nebo 4*-piperidinpiperidinylový kruh, přičemž tyto kruhy mohou obsahovat ještě další heteroatomy, jakož i farmaceuticky přijatelných solí, hydrátů nebo solvátů těchto sloučenin.

Vynález se rovněž vztahuje na sloučeninu vzorce II

Sloučenina vzorce II je užitečná ve výrobě sloučenin vzorce I.

Pojmem karbocyklický kruh” je míněn plně nasycený nebo plně nenasycený kruhový systém.

I

Výhodné sloučeniny vzorce I zahrnují takové, ve kterých, když X je hydroxyskupina, R je dimethylaminomethylová, N-morfolinomethylová, N-methylpiperazinylmethylová, (4 *-piperidin)-N-piperidinylmethylová, (2 ’-hydroxyethyl)aminomethylová, trimethylamoniummethylová, cyklohexylaminomethylová, M-methylanilinomethylová, ethoxymethylová, cyklopropylaminomethylová, il,U-dimethylaminoethoxymethylová, N,ll-dimethylaminoethylaminomethylová, kyanoraethylová, aminoethylová nebo formylová skupina. Výhodné sloučeniny vzorce I rovněž zahrnují taková sloučeniny, ve kterých R je vodík, X je kyanoskupina, formylová nebo aminometnylová skupina. Nadto výhodnými sloučeninami vzorce I jsou takové, ve kterých X je vodík a R je' dimethylaminomethylová nebo N-morfolinomethylová skupina. Zejména výhodné jsou sloučeniny vzorce I, kde R je dimethylaminomethylová skupina, zejména její S-isoraerová forma.

Vynález se rovněž vztahuje na farmaceutická prostředky tvořené účinným množstvím, inhibujícím růst nádorových buněk, sloučeniny vzorce I a inertní farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.

Vynález se rovněž vztahuje na způsob inhibice růstu nádorových buněk citlivých na sloučeninu vzorce I, která pozůstává z aplikování zvířatům včetně lidí, ovlivněných zmíněnými nádorovými buňkami, účinného, růst nádorových buněk inhibujícího množství takové sloučeniny.

Je známo, že v důsledku přítomnosti asymetrického atomu uhlíku v kruhu E sloučenin vzorce’I, tj. uhlíkovému atomu číslo 20, budou existovat optické isomery. Výhodným isomerem je S-isomer, avšak R-isomer a racemická sjměs (racemát) jsou rovněž zahrnuty v rozsahu sloučenin vzorce I.

Odborníkům jsou dobře známé farmaceuticky přijatelné soli a jejich výroba. Výhodné farmaceuticky přijatelné soli sloučenin vzorce I zahrnují acetát, methansulfonát a hydrochlo rid, takový jako mono- a di-hydrochlorid, stejně jako soli alkalických kovů sloučenin vzorce I, takové jako sodíkové, ve kterých E-kruh laktonu byl podroben hydrolýze zásadou.

Odborníkům jsou dobře známá farmaceuticky přijatelné aniony kvarterních solí. Výhodné farmaceuticky přijatelné soli sloučenin vzorce I, ve kterých R^ je -N+^:*R²(R^)(R⁴) zahrnují methansulfonát a chlorid.

Sloučeniny vzorce I mohouvytvářet hydráty nebo solváty. Odborníkům je známo, že nabité sloučeniny tvoří hydratované druhy, když jsou lyofilizovány s vodou, nebo tvoří solvatoI vane druhy, když jsou koncentrovány v roztoku s vhodným organickým rozpouštědlem.

Sloučenina vzorce II se může vyrobit způsobem vyloženým v příkladu 22.

Sloučeniny vzorce I se mohou vyrobit z 10-hydroxycamptoth^.cinem cestou Mannichovy reakce. Kondenzace 10-hydroxycamptothecinu s formaldehydem a primárním nebo sekundárním aminem (Mannichova reakce) poskytne všechny sloučeniny vzorce I vyjma sloučenin, ve kterých X je vodík, kyanoskupina ne1 2 3 2 3 bo formylová skupina a R je -N-R (R ) a R a R jsou stejné a jsou vodíky. Alternativně se 10-hydroxycamptothecin může formylovat (Duffova reakce), čímž vznikne 9-formyl-lO-hydroxycamptothecin, který se může podrobit kondenzaci s aminy, následovanou chemickou redukcí s kyanoborohydridem sodným nebo katalytické redukci (Pd/C, h^), čímž vzniknou produkty analogické těm, jež jsou získány Mannichovou reakcí, stejně jako sloučeniny vzorce I, ve kterých R^ je -N⁺-R²(R^)(R⁴) a R² a R^ jsou stejné a jsou vodíky. Sloučeniny vzorce I, ve kterých ^r1 je -H⁺-r2(_R3)(_R4) _a r2, _r3 θ _R4 _nej_{gou vo}díky se získají působením odpovídajících sloučenin vzorce I, ve kterých R¹ je

-H-R²(R⁵) s alkylačním činidlem. Mannichova reakce byla objevena Magarianem a dalšími, 3. Pharm. Sci., 56, 987 (1967).

z

Duffova reakce byla popsána Ouffem a dalšími, 3. Chem. Soc.,

547, 1941.

? 7

Sloučeniny vzorce I, kde R je Q - R nebo S - R se mohou vyrobit z 9-dimethylaminometny1-10-hydroxycamptothecin nebo jeho soli zahříváním s vhodným alkoholem nebo tniolem v inertním rozpouštědle, takovém jako dimethylformamid. Když se užije volné baze, přidá se malé množství silné kyseliny, takové jako kyselina chlorovodíková. Takové deriváty se také mohou vytvořit přímo v Mannicnově reakci, když alkohol nebo tniol se zahrne v reakční směsi a přidá se silná kyselina, nebo aminová složka je solí silná kyseliny.

Sloučeniny vzorce I, kde X je vodík, kyanoskupina, formylová nebo aminomethylová skupina se mohou vyrobit ze sloučeniny vzorce II paladiem katalyzovanou karbonylací. Paladium. -katalyzovaná karbonylace aryltriflátů je popsána Cacchim a dalšími, Tetrahedron Letters, 27, 3931, 5541 (1936), Petrakisem a dalšími, 3. Amer. Chem. Soc., 109, 2331 (1931) a Chatanim a dalšími, 3. Org. Chem., 51, 4714 (1936).

Výchozí materiál pro výrobu sloučenin vzorce I, to je

10-hydroxycamptothecin je přirozeným produktem nalézajícím se ve stejné rostlině jako camptothecin (viz Wani a další, 3. Org. Chem., 34, 1364, 1969). 10-methoxycamptothecin byl také izolován ze stejné rostliny jako camptothecin a může se přeměnit na 10-hydroxycamptothecin zahříváním pod zpětným chladičem s bromovodíkem. Sám camptothecin se může také přeměnit na 10-hydroxycymptothecin redukcí pyridinového kruhu následovanou oxidací s octanem olovičitýra /(CH^COOj^Pb/ (viz Yakult Honsha

K. K., japonská patentová přihláška Č.90CH5183, vyplněná 30.

* * cerna 1982). Racemický 10-hydroxycamptothecin se rovněž může vyrobit metodou Waniho a dalších, 3. Med. Chem., 23, 554 (1930). Bylo referováno o velkém počtu metod totální synthesy camptothecinu. Viz například Hutchinson, Tetrahedron, 37, 1047, 1931 a Suffness a Coldel, The Alkaloids Cheraistry and Pharmacology, Brossi A. a další, sv. 25, Academie Press, Orlando, Fla., 73, (1935) pro přehled literatury. Nejpraktičtější cestou (dále označovaná jako Wanino cesta) pro výrobu camptothecinu, který je racemický na uhlíku v 20. poloze, je popsána Wanim a dalšími, 3. Med. Chem., 23, 554 (1930).

Užitečnost sloučenin vzorce I:

a) cytotoxicita

Acetátová sůl sloučeniny vzorce I, ve které R je dimethylaminomethyl (S-isomer) (v dalším označená jako sloučenina č. IS) vykazuje silnou antiproliferativní účinnost v řadě kultivovaných buněčných liniích (tabulka 1). V sérii osmi kultivovaných buněčných linií z nádorových buněk lidského kolon, byla sloučenina č. IS dosti konsistentní ve své cYtotoxické účinnosti. Za krátkou exposici (2 hodiny) farmaku, 50¾ inhibiční koncentrace se pohybovaly od 0,12 - 2,1 mikrogramů/ml. Jestliže farmakou bylo ponecháno v kultivačním mediu po plné sedmidenní období v průběhu, kterého buňky byly ponechány proliferovat, hodnoty IC^g byly v rozsahu od 3,9 do 75 ng/ml.

·' Rovněž byly vyhodnoceny na citlivost ke sloučenině č. IS tři hlodavší nádorové buněčné-linie a dvě normální hlodavčí buněčná linie.

Byly hodnoceny buněčné linie K12/Tr potkaního karcinomu kolon a potkaní ledviny a intestinálních epithelií ve stejném experimentu s použitím koncového bodu užívaného v pokusech s lidskými kolonovými nádorovými buňkami, CACO-2 a WiOR. Myší tumorové buněčné lin ie, L121Q leukemie a 316 melanom, nebyly více citlivé na sloučeninu č. IS než nádorové buněčné linie lidského tlustého střeva. Ve skutečnosti Í316 melanomová buněčná linie se zdála být značně méně citlivá než druhá testovaná linie. Zbytečně B16 a L1210 jsou obě dosti citlivé na sloučeninu č. IS v in vivo terapeutických zkouškách u myší s těmito nádory.

Protokol užitý k hodnocení cytotoxicity sloučeniny č.

1S v buněčných liniích uvedených v tabulce 1 byl obecně následující:

Buněčné linie se užívají a přechovávají jako jednovrstevné kultury v minimálním esenciálním mediu (Grand Island Siological Co., Grand Island, 11.Y.) doplněním 10¾ fetálním telecím sérem v 5¾ C0₂ zvlhčovaním inkubátoru při 37 °C. Různé koncentrace sloučeniny vzorce I za sterilních podmínek se nechají reagovat po 2 hodiny, následované aspirací media nebo se exponují kontinuálně. Desky se inkubují po 7 dnů při 37 °C v C0₂ inkubátoru. Medium se aspiruje a buňky se fixují a napustí ethanolem a Geismovým barvivém. Populace přežívajících buněk se určí snímáním ploten pomocí obrazového analyzátoru. Procento inhibice proliferace se určí relativně k buňkám inkubovaným v nepřítomnosti farmaka a interpolací se určí 50% inhibiční koncentrace (Ιϋ^θ).

Tabulkal

Cytotoxicita sloučeniny č. 1S na nádorové buňky v kultuře

IC_5g (/ug/ml) označení linie 2 hfc-d-f kontinuální exposice exposice buněčné linie nádorů lidského kolon

SW-620	0,12	0,0065
SKCQ-1	0,23	0,0039
SW-943	0,26	{ 0,016
DLD-1	0,44	0,015
LQVO	0,53	0,0097
HT-29	0,53	0,016
CACQ-2	1,7	0,075
WIOR	2,1	0,025

í

Tabulka 1 - pokračování označení linie

IC₅₀ (/Ug/ml) hfe<J-( kontinuální exposice exposice buněčné linie nádorů hlodavců

L1210 leukemie	1,4	n.t.
K12/Tr karcinom kolon	* 3,9	0,084
316 melanom	„ + x Π » to ·	0,62

normální buněčné linie ' hlodavců

NRK52E (potkaní ledviny epithe) 1,2 0,052

IEC-6 (intestinální epithe ^_ potkana) 3,9 0,017

n.t. = netestováno

Rada sloučenin vzorce I byla hodnocena pro cytotoxicitu proti L1210 buněk leukemie rostoucích v suspensní kultuře (tabulka 2). 8uňky byly exponovány kontinuálně po klonování do media obsahujícího 0,2 % Mobleho agaru. Po inkubaci při 37 °C c CO2 inkubátoru po tři dny, kolonie byly napuštěny specifickým formazanovým barvivém,pro životaschopné buňky a 24 hodin později byly spočteny počítačem kolonií (Siotran II, New Brunswick Scientific Co., Edison, N.J.) upraveném k identifikaci kolonií o více než 50 buňkíách. Koncentrace, které snižují účinnost klonování o 50 % (IC_5Q), byly určeny interpolací. Sloučeniny vzorce I mají hodnoty IC^g od 12 do 690 nM, to je hodnoty IC₅g, které judikují cytotoxický účinek. Příbuzný přirozený produkt, 10-hydroxy-comptothexin má IC_5Q z

í ·* nM. Cytotoxická sloučeniny vzorce I jsou silnými inhibitory purifikovaná topoisomerázy I. Jak je stanoveno v následujícím oddílu vztaženém k aktivitě in vivo, řada sloučenin vzorce I ačkoliv je obecně méně cytotoxická než 13-hydroxycaptothecin, má protinádorový účinek proti L1213 leukémii in vivo, který je ekvivalentní nebo lepší než účinek 13-hydroxycamptothecinu. Například sloučenina č. 13 byla asi třikrát méně účinná než 13-hydroxycaptothexin s ohledem na cytotoxickou účinnost proti L1213 leukemických buněk in vitro, ale vykazovala in vivo růst nádorových buněk inhibiční aktivitu, která byla obecně lepší než 13-hydroxycamptothecin a řady transplantovatelných hlodavcích nádorových modelů.

Taffulka 2

Aktivita sloučenin vzorce I proti L1213 leukémii in vitro a in vivo u myší nesoucích i.p.-implantované nádory

sloučenina R X _ aktivita protinádorová aktivita

IC_5Q (nM) in vitro_

MTD ILS (¾) (mg/kg) α

c\ o CM

CV

ΙΛ ιλ α in i· o rCM

Λ

CM CM CM co

cq	\o	o	O	o	O
	tZ\	VO	u>	ΙΛ	Ι
		CM	rH	CM	l*V

o

O «ř

CM

-Λ.

lf\ X

Γ

CM

Γ

X

X o

X	X	X	x	X	X	P
X	X	X	X	X	X	Ό
o	O	o	o	a	o	X
Cm	Cm	P	-p	Cm	P	JZ
Ό	Ό	-a	Ό	T3	a
X	X	x	X	X	X
JC	JZ	r	•C	JZ	JZ

H

'CO			X
Μ-»			a
O			CM
CM O			Τ-
z-. CO			Ο
ťV			CM
		u	—*
u			O
v-		+	Τ'
«Cm		-^7
CM	a	CM	CM
—		·**	—-
C_3	a	a	tj

II III

i i·

I c X-H X o o ω ρ JZ

Ό 4-> tn >. o —« sz +> ι ε α ro —i o tn tn tn cm rv -e tn

ΙΛ tn \o

-CH₉N ) hydroxy 270 3. 42 cn r*

A sloučenina R X aktivita protinádorová aktivita

IC,_n (nM) MID ILS (¾) (mg/kg)

Ϊ >ω

X ro

JC /-s ro o\«

X•ro > cn o _J

Ul I—I o TO 'CO c

C Jí •η a •HH C a x s u CL ro >

•-4 O 4-» US Jí CJ ro u-i ra c

SO a

I

OS

O a

CM

A

CM a a ca a •e

ΓΛ a

Os

SO

CM

SO

CM a

a

CM x\

US rCM

OS

US co a

a

Os a

so i*s

		c
	X	ro		CM	X	X
	X	co		—	X	X
co	co	o		ra	o	o
c	Ul	Ui	σ	CM	Ul	Ul
ro	tj	Ό	—	T~	to	•a
>s	Ss	X	ω	CJ	X	X
Jí	JJ	JZ	ι	1	JZ	JZ

c ro

JIM

O

-Μ ro

N

X

JJ

CJO ro cl +» • o •f4 >

>N

TH ro

Σ ro <UI

O >

'CO

TJ

O c

F-l ro +j ro >

o

Ul ro >ro c

r4 'CO ro c

o

Ul ro

a.

ro

CM o

4->

JZ ro cn xu n c o f-ι ui xo ε > *-4 x ro ε

Q.

+->

tn ro

N >

•ra +»

C ro r*4

a.

ε

LfS ro

JZ □

'Ss c

ro

XJ '« ro ro x

jí xz n

Ή • ΧΠ r-4 X ε

JZ

CJ so ro c O ro >

X c

•r4

CL c

'ro >

o >CJ ro ui

O

□.

CM ro r-4

JO ro ro c

•fJ c

ro >u □

a i—4 cn c

ro o

o

Ui u

X

JZ cn

SO

CJ

CM

Č3

I

CM

CJ

I cn

Γ cn co

		cn		a	co	•	S-4
				c	ι-4	•rd	4-»
		'CO		ro	CS|		*-4
		c		xn	fM	'-4	>N
		•a		3	_J	•<-3	ro
		o		O		3	>Ui
		cn		Jí	O	Jí	CL
		s_z		IM	>	•f4
		CM			•f4	f-4	XD
		z*x	CM	O	>	CL	JJ
		rs	ra	rM		ro	O
c	C	—		X	c		TJ
ro	ro	CJ	CM	JJ	•-4	ro
ra	ra	X^·	T*	ro		cn	'03
o	o	zz	CJ	. cz	ro		(Z
Ui	u	CM	CM	{	•-4	ra	Ul
Ό	a	—	—	·, ii	a	Jí	>a
X	X	CJ	CJ		3	ro	ε
JZ	JZ	1	1	•	4->	ε	•3
				4->	cn	Ui	Ui
				«		ro	a.
				c	o	«Μ
					Ui		ra
				X	a.	. ro	z
cn	cn	cn	cn
Os	o	F—1	CM
»—1	CM	CM	CM

1.

Hejvyšší testovaná dávka (stupeň aktivity je pravděpodobně větší při vyšší dávkové hladině).

Pro in vitro studie buňky L1110 se nechají růst v suspensní kultuře a exponují se farmaky kontinuálně po klonování buněk do některého agaru. Stanoví se klonovací účinnost. Interpolací se stanoví 50¾ inhibiční koncentrace (IC^).

Všechny svrchu uvedené sloučeniny byly^účinnými inhibitory topoisomerázy I a purifikovány z rakovinných buněk lidského koton, 50¾ inhibiční aktivita enzymu byla pozorována v koncentracích 3/uM.

b) Inhibice růstu nádorových buněk in vivo

Sloučeniny vzorce I se z počátku ohodnotí na in vivo protinádorovou aktivitu u myší nesoucích intraperitoneálně (i.p.) implantovanou L121Q leukémii (sloučeniny č. IS a 4S - 13S v tabulce prodlouží rozsah života o >40 % při jejich maximálně tolerovatelných dávkových hladinách). Tři sloučeniny č. IS, 6S a 11S jsou zejména účinná, prodlužují rozsah života o >200 ¾ a vyvolávají dlouhodobá, beznádorová přežití. Řada sloučenin má aktivitu lepší než přirozený produkt, 10-hydroxycamptothecin, kterému jsou sloučeniny vzorce I strukturně příbuzné. Pro dvě ze sloučenin č. 7S a 13S, nejvyšěí testovaná dávka nebyla toxická, tak tyto sloučeniny mohou mít vetší aktivitu při vyšších dávkových hladinách. Přesto tyto sloučeniny byly aktivní při testovaných dávkových hladinách.

Založeno na jejím vysokém stupni aktivity a potence in vivo (tj. nízké maximálně tolerované dávce) sloučenina č. IS byla ohodnocena v řadě transplantovaných myších nádorových modelech. Sloučenina č. IS má vysoký stupeň aktivity ve své, maximální dávce v řadě zvířecích nádorových modelů, včetně leukémií a solidních nádorů různých histiotypů.

*

Spektrum aktivity sloučeniny č. 1S je shrnuto v tabulce 3. Vysoká hladina aktivity byla pozorována u většiny tumorových modelu, s tím, že pouze u jednoho z modelů i.p. karcinomu 26 holou byla pozorována téměř úplná refrakternost na farmakon. Taká dva ze subkutánních s.c.) modelů karcinomu 26 holou a Madisonova plicníno karcinomu se prokázaly jako poněkud refrakterní na farmakon, tj. v těchto modelech, skromná aktivita to je >70% inhibice růstu tumoru byla zřejmá, když byly léčeny myši nesoucí subkutánní nádory, sloučeninou č. 1S.

D druhých s.c. nádorových modelů, byla prokázána vysoká aktivita (větší než 90% inhibice). Zřetelně sloučenina č. 1S aplikovaná i.p. vykazovala vysokou aktivitu nejen proti i.p. nádorovým modelům, ale u myší inokulovanýcn nádory intravenosně (i.v.) nebo subkutánně (^s.c.). Léčivý účinek byl zřejmý u určitých nádorových modelů včetně i.p. a i.v. implantovaných P338 a L1210 leukémií a i.v. a s.c. implantovaného Lewisova karcinomu plic. Úroveň a spektrum aktivity sloučeniny *»- č. 1S u zvířecích nádorových modelů je vhodně srovnatelná s nejvíce účinnými ze známých protinádorových farmak, takových jako cyklofosfamid, cisplatin a doxorubicin.

i·

Výsledky těchto studií na transplantovaných myších nádorových modelech jsou shrnuty podrobněji v tabulce 4, která ukazuje prodloužení rozsahu života (ILS) nebo procentní inhibici měřitelného (tj. subkutánního) růstu pevných nádorů při optimálních dávkách a optimálních rozvrzích aplikace sloučeniny 1S. Také jsou v tabulce 4 ukázány výsledky získané ve srovnávacích studiích na těchto nádorových modelech s původními sloučeninami přirozeného produktu, camptothecinu a 10-hydroxycamptothecinu. Tyto výsledky byly dosaženy při i.p. nebo i. v. aplikaci sloučeniny č. 1S při iVitermitentním rozvrhu , tj. každý čtvrtý nebo sedmý den. V některých případech byly výsledky získány s optimálním dávkovým rozvrhem léčení, ve kterém sloučenina č. 1S byla aplikována v rozděleném dávkovém režimu (každé 3 hodiny krát 4) v každém dni léčení, jak je podrobněji popsáno níže. Camptothecin a 10-hydroxycamptothecin se vždy aplikují jako suspenze i.p. v důsledku je* jich nerozpustnosti ve vodných vehikulech.

Z tabulky 4 je zřejmé, že všechny tři sloučeniny mají široké spektrum aktivity u zvířecích nádorových modelů.

Lepší aktivita sloučeniny č. 1S je zřejmá v některých nádorových modelech včetně: i.p. 11210 leukémii, i.p. 316 melanomu, i.v. P333 leukémii, i.v. L121Q leukémii, s.c. Lsuisově plicním karcinomu, s.c. 316 melanolu/podlinie F1Q, s.c. karcinom 51 kolon, a s.c. Madisonovš plicním karcinomu. . 10-hydroxycamptothecin je dosti účinný u i.p. implantovaných nádorových modelů, ale má nedostatečnou aktivitu u nádorových modelů, u kterých je nádor implantován v místě vzdáleném od nísta aplikace farmaka, .toto farmaka má při nejlepším maximální účinnost u s.c. implantovaných solidních nádorových modelů. To pravděpodobně není způsobeno slabou rozpustností 10-hydroxycamotothecinu, protože camptothecin je stejně nerozpustný, ale je značně účinný u určitých s.c. tumorových modelů. 3e možné, že aromatická hydroxylová skupina 10-hydroxycamptotnecinu je vnímavá na první průchod a biliární exkreci a tak sloučenina nedosahuje přiměřenou koncentraci v systémová cirkulaci. Pozoruhodně sloučeninač. 1S, která má také 10-hydroxylovou skupinu a je však vysoce aktivní u s.c. a i.v. nádorových modelů. To může být způsobeno přítomností basického postranního řetězce v 9. poloze sloučeniny č. 1S, který může inhibovat metabolismus 10-hydroxylové skupiny sterickou zábranou, vázáním vodíku nebo vytvořením interní soli. 10-hydroxycamptothecin je vysoce aktivní u i.p. karcinomu 26 kolon, který je necitlivý na sloučeninu č. 1S a minimálně citlivý na camptothecin. Avšak stejný tumor je refrakterní na 10-hydroxycamptothecin, když je implantován s.c. má ještě skromnou citlivost na sloučeninu č. 1S v tomto uspořádání.

Nadto k vysokému stupni a širokému spektru aktivity sloučeniny č. 1S, jak je demonstrována v tabulce 4, sloučenina by měla také zachovávat plný protinádorový účinek při orální aplikaci. To bylo demonstrováno u myší nesoucích s.c. implantovaný Lewisův karcinom plic a js níže podrobněji popsáno.

Jinou vlastností sloučeniny č. IS je její retence aktivity v subliniích P333 leukemie, které vykazují resistenci na mnohotné protinádorové látky jak je níže popsáno. Jako hlavní problém v chemotherapii rakoviny je objevení resistentních populací nádorových buněk, které selhávají v odpovědi na původně účinné režimy podání farmak, stejně jako režimy léčení sekundárních linií, dostupno'st farmak, na která resistentní buňky nejsou zkříženě resistentní, by měly mít signifikantní dopad na ovládání rakoviny.

i

Aktivita sloučeniny č. IS v každém z nádorových modelů, které byla testovány je popsána ve větších detailech v následujících oddílech.

i.p. nádorové modely

Aktivita sloučeniny IS aplikované i.p. nebo s.c. v různých programech léčení myší nesoucích i.p.-implantované tumory je ukázána v tabulce 5. Údaje ukazují závislost protinádorového účinku na dávce sloučeniny č. IS u šesti i.p.-implantovaných nádorových modelů.

P333 leukemie: Když je podána i.p. ve dni 1 a 5 myším nesoucím i.p. P333 leukémii, sloučenina č. IS vyvolává 200¾

ILS se 4/6 dlouhodobě přežívajících zvířat (v kůře) a její maximálně tolerovatelná dávka je 15 mg/kg. Nižší dávky jsou také vysoce účinné se vzestupy v rozsahu života 125 a 92 Tento vysoký stupeň aktivity byl potvrzen v jiném pokusu dále popsaném (viz tabulka 3), ve kterém maximálně tolerovaná dávka vyvolávala 228¾ ILS s 2/6 dlouhodobě přežívajících zvířat.

Tak sloučenina č. IS měla léčebný účinek u myší nesoucích

i.p. P333 leukémii.

- 24 L1210 leukemie: Když byla padána i.p. ve dnech 1 a 5, sloučenina č. 1S, byla reprodukovatelně aktivní u myší nesoucích i.p. L 1210 leukémii. V representativním pokuse ukázaném v tabulce 5, bylo 219 % ILS s 2/6 vyléčeními při maximální tolerované dávce 15 mg/kg. Rovněž se nalezla dobrá aktivita při dvou nižších dávkách. Sloučenina č. 1S byla v tomto uspořádání hodnocena v osmi přidaných stadiích dávky a odpovědi. Procento ILS a dlouhodobě přežívající získané při maximálně tolerovaných dávkách v těchto experimentech byly: 44 % (0/6), > 300 % (5/6), 119 % (0/6), 156 (1/6), 133 % (0/6), 156 % (2/6), 350 % (2/6) a 133 % (1/6). Tak v 3/9 pokusů sloučenina č. 1S vyvolávala >100% ILS a v 6/9 pokusů byli přítomni dlouhodobě přežívající jedinci.

316 melanom: V tomto nádorovém modelu, ve kterém sloučenina č. 1S byla zřetelně lepší než camptothecin a 10-hydroxycaptothecin (viz tabulka 4), farmakou vyvolávalo 52% ILS při své maximální tolerované dávce 15 mg/kg podané i.p. ve dnech 1, 5, 9 a 13. Tento výsledek se potvrdil v druhém pokuse, ve kterém nejvyšší testovaná dávka 9,6 mg/kg vyvolala 130% ILS.

316 melanom/podlinie F10: F10 podlinie 316 melanorau je vysoce metastasující podlinií tohoto nádoru, který byl vybrán klonováním. Sloučenina č. 1S vyvolává 105% ILS při své maximálně tolerované dávce 15 mg/kg podané i.p. ve dnech 1, 5, 9 a 13. Jak je indikováno, aktivita zvyšuje rozsah života 0 >40 %, a byla stejně zřejmá i u dvou nižších dávek.

M5076 sarcom: M5076 sarcom je metastasující sarkom retikulárních buněk, který vzniká v ovariu I C5731/6 myší a bylo nalezeno, že je transplantovatelným nádorem. Tento nádor implantovaný i.p. byl citlivý na sloučeninu č. 1S, když látka byla podána s.c. stejně jako i.p. aplikací. Stupeň aktivity byl virtuelně identický 93% ILS a 105% ILS, těmito dvěma aplikačními cestami v děleném dávkovém schématu každé tři hodiny krát 4 ť

ve dni 1, 5 a 9. Toto schéma jak níže popsáno, se jeví být optimální pro sloučeninu č. 1S v řade nádorových modelů. Sloučenina č. 1S byla hodnocena ve třech přídavných studiích dávky a účinku u myší nesoucích i.p. M5376 sarkom. V těchto studiích látka byla podána jako jedinná dávka ve dnech 1, 5 a 9 i.p. (75% ILS s 1/3 vyléčeními), jako jednotlivá dávka ve dnech 1, 5, 9 a 13 i.p. (71% ILS s 1/3 vyléčeními) a jako jedna dávka ve dnech 1, 5 a 9 s.c. (57% ILS).Jako při i.v. a s.c. nádorových modelech (jak níže popsáno), sloučenina č.

lS.se zdá být nejúčinnější u i_;p. M5376 sarkomu, když je podána v děleném dávkovém režimu. Přesto bez ohledu na schéma aplikace je sloučenina č. 1S reprodukovatelně aktivní u tohoto nádorového modelu._Λ

Karcinom 26 kolon:

Karcinom 26 kolon je vysoce invasivní ametastasující nediferenciovaný tumorový model na kolon. Tento nádor, v testovaném schématu se ukázal jako refrakterní k maximálně tolerované dávce sloučeniny č. 1S.

i.v. nádorové modely

Aktivita sloučeniny č. 1S aplikované i.p. nebo i.v. myším nesoucím systémové (i.v. inokulované) leukemie nebo Lewisův plicní karcinom je ukázána v tabulce 6. Závislost odpovědi na dávce a závislost na schématu podání sloučeniny č. 1S je jasně v těchto studiích demonstrována. V každém ze tří nádorových modelů, sloučenina č. 1S vykazovala léčebný účinek.

f

P333 leukemie:

P338 leukemie je obecně mnohem méně citlivá na farmaka je-li implantována i.v. než když je inokulována i.p. Avšak sloučenina č. 1S byla vysoce účinná proti i.v. P338 leukémii, byla-li dána ve své maximálně tolerovaná dávce ve dnech 1 a 5 i.p. (279% ILS s 2/6 vyléčeními) nebo i.v. (250% ILS se 2/6 vyléčeními). V třetím pokuse tohoto nádorového modelu sloučenina č. 1S vyvolává 125% ILS se 1/6 vyléčeními v maximálně tolerovaná dávce 15 mg/kg podané i.p. ve dnech a 5.

L1210 leukemie:

Sloučenina č. 1S se ukázala být reprodukovatelně a vysoce aktivní proti i.v. implantovaná L1210 leukemie. Byly uskutečněny extensivní studie závislosti na schématu podání u tohoto nádorového modelu s farmakou aplikovaným i.v. Jak je demonstrováno v tabulce 6, aplikace v rozděleném dávkovém režimu vedla k vyššímu stupni aktivity v širším dávkovém rozsahu. Léčebný účinek byl pozorován, když farmakou bylo podáno i.v. ve dnech 2 a 6 jako jediná dávka nebo jako čtyři dávky v'tříhodinových intervalech. Nadto k údajům ukazujícím v tabulce 6, je zde deset studií vztahu dávky a účinku při i.v. aplikaci sloučeniny č. 1S u myší nesoucích i.v. LlglO leukémii. Výsledky jsou následující: dny 2 a 6, 171%

ILS s 2/6 vyléčeními, 4 působení v tříhodinových intervalech ve dnech 2 a 6, > 300% ILS se 6/6 vyléčeními, tři léčení v šestihodinových intervalech ve dnech 2 a 6 200% ILS s 2/7 vyléčeními, dvě léčení ve 12hodinových intervalech ve dnech 2 a 6, 229% ILS se 2/7 vyléčeními, jediné léčení ve dnech 2 až 6, 143% ILS a 129% ILS, dvě léčení ve dvanáctihodinových intervalech ve dnech 2 až 6, 193% ILS a 171% ILS, jediná dávka ve dni 2, 114% ILS, a 4 léčení v tříhodinových intervalech ve dni 2, 244% ILS se 1/6 vyléčeními. Sloučenina č. 1S by se měla jevit nejúčinnšjší, když je splikovápa ve schématu každé hodiny. Je méně účinné, když je podávané denně, než když je podána každý čtvrtý den. Optimální schéma z těchto studií bylo užito pro určité pevné nádory, jak svrchu diskutováno pro i.p. M5076 sarkom a jak je popsáno níže. U řady tumorových systémů stupeň aktivity je zvýšen a účinný dávkový rozsah je širší, když sloučenina č. 1S je podána v děleném dávkovacím, tj. každé 3 hodiny čtyřikrát denně, schématu.

z * ».»

Lewisův karcinom plic:

Lewisův karcinom plic je vysoce metastasující, nediferencovaná plicní rakovina, která se široce užívá pro hodnocení farmak. Tento nádorový model je refrakterní na řadu zavedených protinádorových farmak , když je užit jako skríningový systém identifikuje jen velmi málo sloučenin jako účinná. Sloučenina č. IS má léčivé působení u tohoto chemorefrktorního nádorového modelu, ve kterém je nádor inokulován

i.v., což vede k nádorovým jádrům v plicích. Léčivé působení u tohoto nádoru je neobvyklým zjištěním.

Jak je zřejmé ze všech tří i.v. inokulovaných nádorových <

modelů, sloučenina č. IS je dosti účinná proti systémovým tumorům, když je aplikována i.p. stejně jako i.v.

s.c. nádorové modely

Sloučenina č. IS byla hodnocena u deseti pevných nádorových modelů, ve kterých nádory byly implantovány s.c. a farmakou bylo aplikováno i.p., i.v. nebo orálně (ρ.ο.). V těchto modelech je protinádorová aktivita hodnocena stupněm inhibice růstu nádoru v místě implantace nádoru. Nádory se obecně měří 2 až 3 týdny následující po implantaci nádoru, když jsou zřejmé velké tumory ( 50Q mm^) u neléčených kontrolních zvířat. Pro vysoce metastasující solidní tumory se rovněž může použít čas přežití jako měřítko aktivity. Pro méně metastasující nádorové modely čas přežití neléčených zvířat je značně variabilní a zvířata mohou přežívat po dlouhá období s extrémně velkými nádory, které často zvředovatí a infikují se. Sloučenina č. IS byla vysoce účinná v 8 z 10 p.c. solidních tumorových modelů, inhibujíc vzrůst nádorů o více než 90 % při své maximální tolerované dávce (tabulka 7). Úplná inhibice růstu nádoru u vysoce metastasujících nádorů včetně Lewisova karcinomu plic, B16 melanolu, 815 melanomu podlinie F10 a M5076 sarkomu byla provázena prodloužením rozsahu života. Dokonce i u méně respresibilních nádorových modelů, Madisonově karcinomu plic a karcinomu 26 kodon, sloučenina č. IS měla nějaký účinek na růst nádorů s > 70¾ inhibici prokazatelnou při maximálně tolerované dávce.

Lewisův karcinom plic: Tento vysoce metastasující plicní nádor byl nejcitiivější na sloučeninu č. 15 ze všech testovaných nádorových modelů. To je neobvyklý nález, jelikož Lewisův karcinom plic byl široce užíván ve studii protinádorových farmak a je refrakterní na většinu známých protinádorových farmak. Když je podána i.p. ve dnech 1,5,9a 13, sloučenina č. IS úplně inhibuje růst Lewisova plicního karcinomu u téměř všech myší léčených 15 nebo 9 mg/kg. V maximálně tolerované dávce 4 g 8 myší byly vyléčeny. V době měření nádoru, tumory u neléčených kontrol měly v průměru objem ' -1635 mnP. V druhém pokuse sloučenina č. IS byla aplikována

i.v. a p.o. ve dnech 1, 5 a 9. U obou aplikačních cest byla 99¾ inhibice růstu nádorů (TGI) s více než polovinou zvířat, které nevykazovaly žádnou přítomnost nádoru v době měření (13. den). Mimoto maximálně tolerovaná dávka oběma cestami aplikace byla v podstatě stejná, což vede k domněnce, že sloučenina č. IS má výtečnou biologickou dostupnost po orální aplikaci. V tomto pokuse, tumory popřípadě rostou v místě implantace, což indikuje bu3, že i.p. léčení je optimální u tohoto nádorového modelu nebo, že delší léčení je potřebné po léčebný účinek.

B16 melanom: Tento metastasující melanomový model byl široce používán k hodnocení a vyhledávání protinádorových farmak.

Když je implantován s.c., tento nádor je refrakterní na většinu protinádorových farmak, sloučenina $. 15 byla hodnocena ¹ r u myší nesoucích B16 melanom ve studiích závislosti na dávce. Když je podána v jednotlivé dávce ve dnech 1, 5 a 9, maximální tolerovaná dávka sloučenina č. 15 aplikovaná i.v. nebo i.p., vyvolává 99¾ inhibici růstu nádoru (TGI) s většinou zvířat, které nemají žádné měřitelné nádory v 16. nebo 14. dni, kdy většina kontrolních myší má nádory velikosti 364 a 753 mm⁵ ve dvou pokusech. Když je podána v optimálním děleném dávkovém léčebném schématu, sloučenina č. IS vyvolá úplnou inhibici růstu tumoru v širším rozsahu dávek. To je shodné s výsledky získanými u jiných nádorových modelů. U s.c. 916 melanomového modelu, nádory případně rostou u všech léčených zvířat a nejsou zde žádná vyléčení. V tomto metastasujícím nádorovém modelu dochází k prodloužení rozsahu přežití, které se objevuje s úplnou inhibici růstu nádoru. V děleném dávkovém režimu bylo 52 ⁵» ILS, zatímto při jednotlivých dávkách 24 mg/kg ve dnech 1, 5 a 9 se prodlužoval rozsah života o 39 %. V posledním schématu i.v. aplikace vedla k 53 % ILS.

B16 melanom/podlinie F10: Tato podlinie B16 melanomu vybraná pro zvýšení metastatické vlastnosti byla ve svých odpovědech na léčení sloučeninou č. IS, podobná původnímu B16 melanomu.

I.p. léčení ve dnech 1, 5, 9 a 13 vedlo k úplné inhibici růstu nádorů v maximálně tolerovaných dávkových hladinách. V těchto pokusech, tumory byly měřeny 16. den a tumory kontrolních myší byly velmi velké, průměrně 1927 a 1196 mm³. Tumory ve'všech léčených skupinách případně rostly a nebyla zde žádná vyléčení. Avšak léčení i.p. při 25 mg/kg vedlo k 70 % vzestupu v rozsahu přežití'(ILS), i.v. léčení ve stejné dávce poskytlo 38 % ILS.

ADJ PCg-plasmacytom: Tento nádorový model, který je nejvíce příbuzný lidské rakovině typu ronohotného myelomu, byl vysoce citlivý na sloučeninu č. IS aplikovanou i.p. ve dnech 1, 5, 9 a 13. Tumory byly měřeny 19. den a měly v průměru B28 mm³ u kontrolních myší. Sloučenina č. IS vyvolávala > 90¾ inhibici růstu nádoru ve čtyřech dávkových úrovních při nebo pod maximálně tolerovanou dávkou. Byl zde 1 z 8 dlouhodobě přežívajících beznádorových zvířat v každé z vrchních tří dávkových hladin. Jelikož tento tumor není vysoce metastasující, nebyl určován mediánový čas přežití.

ϊ

M5076 sarkom: M5G76 sarkom implantovaný s.c. byl dosti citlivý na sloučeninu č. IS s >90% inhibici TGI ve třech dávkových hladinách při nebo pod maximálně tolerovanou dávkou. Nádory byly měřeny 17. den, když kontrolní nádory měřily průměrně 1045 mm\ Farmakou bylo aplikováno i.p. ve dnech 1, 5, 9 a

13. Farmakou nebylo léčivé u tohoto modelu, ale prodlužovalo rozsah života o 31 %.

Mammární adenokarcinom 16/C: Tento nádorový model tumoru prsů je transplantovatelnou podlinií spontánního tumoru mammary, C^H myší. Sloučenina č. 15 inhibovala růst nádoru o 96 % při maximální tolerované dávce 10 mg/kg, podané ve dnech 1, 5, 9 a 13. Tumory byly měřeny 19. den, když průměrná velikost nádoru u kontrolních myší byla 630 mm\ v druhém pokuse ve stejném léčebném schématu, sloučenina č. IS vyvolávala 73% inhibici růstu nádorů (TGI) u mammarního adenokarcinomu 16/C. Jelikož nádor není vysoce metastasující, přežívání zvířat nebylo měřeno.

Adenokarcinom 38 hodin: Tento nemetastasující nádorový model byl široce používán v hodnocení farmak a je považován za jeden z nejvíce na farmaka refrakterních nádorových modelů. Sloučenina č. IS byla aplikována i.p. jako jednotlivá dávka nebo v děleném dávkovém režimu ve dnech 3, 10, 17 a 24. Bylo zvoleno mnohem delší léčebné použití, pro pomalý růst tohoto solidního nádoru. Tumory byly měřeny 31. den a měly v průměru pouze 349 πκτΡ u neléčených kontrol. Jako v jiných nádorových modelech sloučenina č. IS byla mnohem účinnější v děleném dávkovém schématu vyvolávající > 90% inhibici ve dvou dávkových hladinách. Stejně tak byla prokazatelná dobrá aktivita (89 % TGI) v jednotli vém dávkovém režimu. |

Adenokarcinom 51 kolon: To je jiný pomalu rostoucí kolonový nádorový model, který byl vyzkoušen jako refrakterní u většiny protinádorových farmak. Užitý protokol pro tento nádor byl podobný jako po adenokarcinomu 38 kolon. Sloučenina č. IS byla účinná proti adenokarcinomu 51 kolon vyvolávajíc 83¾

TGI s jednotlivým dávkovým režimem a 92¾ TGI v děleném dávkovém působení. Jako u jiných nádorů, sloučenina č. IS byla účinná v širším rozsahu dávek, když byla padána v děleném dávkovém režimu. Adenokarcinom 51 kolon byl mařen 24. den, když kontrolní nádory měly v průměru 766 mm³.

Madisonův plicní karcinom: Madisonův plicní karcinom jako Lewisův plicní karcinom je rychle rostoucí nediferencovaný nádorový model s vysokou metastatickou aktivitou. Na rozdíl od Lewisova plicního nádoru, Madisonův plicní nádor není vysoce citlivý na sloučeninu č. IS. V jednotlivém dávkovém režimu podávaném i.v. ve dnech 1, 5 a 9, zde není prakticky žádná, tumorový růst inhibující aktivita (23 ¾ TGI) při maximální tolerované dávce. Ve dvou přídatných pokusech se stejným léčebným schématem s farmakem podaným i.p., sloučenina č.

IS vyvolala jenom 55¾ a 23¾ TGI. Avšak v optimálním děleném dávkovém režimu, sloučenina č. IS aplikovaná i.v. vykazovala účinek proti Madisonově plicnímu karcinomu s 85¾ TGI při maximální tolerované dávce. Farmakon bylo poněkud méně účinné v tomto léčebném schématu při podání i.p. (74 % TGI při maximální tolerované dávce). Madisonovy plicní nádory byly měřeny

12. nebo 13. den ve dvou oddělených pokusech, když nádory u kontrolních myší měřily v průměru 1571 a 942 mm³, což odráží velkou rychlost vzrůstu tohoto nádoru. Tak dokonce u refrakterního nádoru, sloučenina č. IS, ve svém optimálním léčebném režimu, může vést k signifikantní inhibici růstu tumoru.

Karconom 26 kolon: U tohoto vysoce invasivního a metastasujícího nediferenciovaného nádoru kolon, sloučenina č. IS, vyvolávala pouze hraniční inhibici růstu tumoru (72 ¾ TGI) při

i.p. aplikaci ve své maximální tolerované dávce ve dnech 1, 5, a 13. Tumory byly měřeny 19. den, když kontrolní tumory měřily průměrně 1052 mm³. Není známo zda by sloučenina č. IS vykazovala dobrou aktivitu u tohoto modelu, kdyby byla podávána ve svém optimálním děleném dávkovém režimu.

Podlinie resistentní na více farmak

Přestože nejdůležitšjšíra problémem v therapii rakoviny je necitlivost běžných neoplasmat na všechna dostupná činidla nebo kombinační režimy, jiným velkým problémem je vznik resistentních nádorových buněk z předtím odpovídajících nádorů. Většina pacientů s chemosensitivními tumory jako velkobuněčný karcinom plic, ovariální'adenokarcinom, akutní nonlymfocytická leukemie, karcinom prsu a jisté lymfomy mohou být uvedeny do remise kombinačními režimy, které byly stanoveny jako therapie prvé linie pro tato různá onemocnění. Avšak ve většině případů je značně redukována u pacientů s rekurentním onemocněním schopnost vyvolat významné remise i přes uplatnění značně intensivních kombinačních režimů. Charakterstiky se tyto rekurentní tumory prokáží být refrakterní na íarmaka, která nejsou příbuzná strukturně a/nebo mechanisticky látkám, které byly původně užity k vyvolání remise. Tento fenomen resiptence na více farmak je v současné době intensivně zkoumán v řadě larboratoří. Současná evidence vede k domněnce, že zesílení a vyjádření genu resistence na více farmak (mdr = multidrug resistence) a přítomnost mdr genového produktu P17Q membránového glykoproteinu, je spojena s resistencí na více farmak. P17Q účelně slouží jako effluxní transportní pumpa s neuvěřitelnou růzností substrátové specificity. Současné práce vedou k domněnce, že silná exprese mdr genu u jistých dříve neléčených nádorů takových,.jako .feochromocytom a-adenokarcinom by mohlo být odpovědná při nejmenším částečně za vro-r zený na farmaka refrakterní fenotyp těchtp nádorů.

Tak je důležité identifikovat nová činidla, která si podrží vysoký stupeň účinnosti proti nádorům, které vykazují fenotyp resistence na více farmak. Taková činidla mohou být slib ná pro další pokroky v léčení chemosensitivníchtaádorů (to je ť

prokázáním účinnosti u předtím léčených pacientů nebo vybitím mdr subpopulace jako složky kombinačních režimů první linie) stejně tak jako pro v současné době neodpovídající nádory, které jsou necitlivé k dostupným farmakům pro vrozené vyjádření mdr genu. Camptothecin prokázal být neobvyklým v tom, že je jedním z mála přirozených produktů cytotoxických činidel, která nevykazují zkříženou resistenci u dobře charakerizovaných nádorových podlinií, které vykazují mdr-fenotyp, to je P383 podlinie resistentní na doxorubicin, vinkristin, amsakrin, ellipticin nebo mitoxantron. jelikož většina z farmak, která mají zkříženou resistenci u buněčných linií resistentních na více farmak je zásaditá, bylo očekáváno, že přidání zásaditého postranního řetězce k molekule camptothecinu jako u sloučeniny č. 1S, by mělo vést ke sloučenině, která by byla transportována z buněk pomocí P170 glykoproteinu a tak se prokázat neúčinnou u tumorů Vyjadřujících mdr gen. Sloučenina č. 1S byla hodnocena u myší nesoucích P333 a jako doxorubicin a mitoxantron resistentní podlinie (tabulka 8). Pro srovnání byl zahrnut doxorubicin a motomycin. P388/mitoxantron si ponechávaly citlivost na sloučeninu č. 1S. Tyto buněčné linie resistentní na více farmak vykazovaly očekávanou resistenci na doxorubicin. P388/doxorubicin byl rovněž resistentní na mitomycin c. Tak sloučenina č. 1S si zachovává protinádorový účinek u buněčných linií resistentních na více farmak, což je charakteristická vlastnost camptothecinu.

Racemické formy sloučeniny č. 1

Všechny předtím popsané biologické studie byly uskutečněny s S isomerem sloučeniny δ. 1, to je, konfigurací na C-20, která existuje v přirozeně se vyskytujícím camptothecinu a 10-hydroxycamptothecinu. Racemická forma sloučeniny č. 1 byla připravena celkovou synthesou a byla hodnocena na protinádorový účinek u myší nesoucích i.p. P388 leukémii (tabulka 9). Racemická forma sloučeniny č. 1S, v dalším ozna34 čována jako sloučenina č. 1RS, je vysoce aktivní u P333 leukemie vyvolávajíc 165% ILS s 1/6 dlouhodobě přežívajících v dávce 29 mg/kg aplikované i.p. ve dnech 1 a 5. Ačkoliv není tak aktivní jako sloučenina č. 13 (srovnej tabulky 5 a 8), sloučenina č. 1RS má výtečné účinky v tohoto nádorového modelu.

Různá solná formy sloučeniny č. 1S

Sloučenina č. 1S je ve vodě rozpustná účinkem přítomnosti zásaditého postranního řetězce v poloze 9, který tvoří soli s kyselinami, takovými jako'kyselina octová, chlorovodíková methansulfonová. Experimenty popsané v tabulkách 2 až 9 byly uskutečněny buď s acetátovými nebo chlorovodíkovými solemi sloučeniny č. 1S. Rozpustná forma sloučeniny č. 1S se rovněž může připravit zásaditou hydrolýzou E-kruhu laktonu sloučeniny č. 1S s vYtvořením ve vodě rozpustných solí alkalických kovů karboxylátové formy sloučeniny. Přímé srovnání acetátových, hydrochloridových, dihydrochloridových a sodných solí sloučeniny č. 1S bylo uskutečněno u myší nesoucích i.v. L1210 leukémii (tabulka 10). Sloučeniny byly aplikovány jako roztoky v £% dextrose i.v. ve dnech 1 a 5. Dihydrochloridová sůl se vytvoří po přidání přebytku kyseliny chlorovodíkové a pravděpodobně vede k protonaci chinolinového dusíku v kruhu B, stejně jako dusíku dimethylaminomethylové skupiny. Každá solná forma byla aktivní u tohoto nádorového modelu se 100% ILS zřejmými pro acetát, 175 % ILS pro hydrochlorid, 133 % ILS pro dihydrochlorid a 203 % ILS pro sodnou sůl. Tři soli kyselin byly ekvipotentní, to je měly identickou maximální tolerovanou dávkovou úroveň 15 mg/kg. Avšak sodíková sůl byla asi 3, 5-krát méně účinná s maximálně tolerovanou dávkou 54 mg/kg.

I í

Tabulka 3

Spektrum aktivity sloučeniny č. 1S u zvířecích nádorových modelů tumorový model aktivita při maximálně tolerovaná dávce

ip tumorové modely
P333 leukemie	+++
L1210 leukemie	+++
B16 melanom	++
B16 melanom/FlO podlinťB	++
M5076 sarkom	++
karcinom 26 kolon	-
iv tumorové modely
P333 leukemie	+++
L1210 leukemie	+++
Lewisův plicní karcinom	+++
sc tumorové modely
Lewisův plicní karcinom	+++
316 melanom	++
B16 melanom/FlO podlinie	++
ADJ-PC6 plasmacytom	++
M5Q76 sarkom	1 ++
Mammarův adenokarcinom 16/c	++
adenokarcinom 33 kolon	++
adenokarcinom 51 kolon	++
Madisonův plicní karcinom	+
karcinom 26 kolon	+

* '.9

- 36 Vysvětlivky k tabulce 3

Sloučenina č. 1S byla aplikována i.o. nebo i.v. v každý čtvrtý nebo sedmý den po 2 až 4 běhy začínající 1 až 3 dny po implantaci nádoru.

+++ = léčivý (>200% vzestup v rozsahu života ILS) ++ = >100% vzestup v rozsahu života (ILS) nebo ~7 90% inhibice růstu nádoru (TGI) + = > 50% ILS nebo 70% TGI = /50% ILS nebo < 70% TGI.

Lewisův plicní karcinom léčivý 92¾ TGI 4¾ TGI

016 melanom 100¾ TGI 70¾ TGI netestováno

016 melanom/FlO podlinie 100¾ TGI 90¾ JGI 50¾ TGI

A00-PC6 plasmacytom 100¾ TGI 100¾ TGI 76¾ TGI

Ol	i—	r~	o	N·	x·	«74»	CD	CD	Γ-	43	n-
o	CD	H-	VI	<	01	vi	N-	N*	Η-	SzJ	0
	Z	NO	CD		»4	α	CS	Cs	Ν!	α
«4	N·	I—1	a	(4·	O				Ν-	CD	e4*
c	01	C3		C	W	Os	3	3	α		C
3	c·		N-	3	3		CD	CD		N-	2
O	<	N-	CD	O	O	03	Ν-	t—>	Η-	CD	O
»4		CD	C	14	3	01	αι	01	CD	C	•4
□	XJ	C	Λ	O		14	3	3	C	x·	a
<	Π-	ŽC	CD	<	N3	z.	O	O	x\	CD	<
co.	Ι-	CD	3	CD.	CS	C	3	3	CD	3	CD.
	Ο	3	H·			Sv			3	N·
3	3	l—	CD	3	X		~n		N·	CD	3
O	i—.	CD		O	o		Ν-		CD		α
CL				CL	N-		α				CL
CD	X			CD	o						CD
N—	03				3		X3				N-
<	14			<			O				<
	O						α

□

H·

CO

O

Π o

<

X.

O

CL

CO

N-	N-	Ν-			Ν-	Ν-	Η-	Η-	Η—	ΧΟ 03
CD.	CD.	Ο»		NO	α	α	VI	CD.	(D.	•4 Ν-
CK	O<	O«		ví	vrt	νπ	ΝΟ	ο*	Ο<	Ο Ο
H·	N··	H·		A®	A®	·\·	Α®	Η·	Η*	α. c
<	<	<	t					<	<	Ν— Ο<
X.	X.	X.	*	N4	N4	Ν4	Ν4	X.	X.	Χ3 Ο CD
				Γ-	Γ-	Γ-	Γ”			•4« C 3
				όη	ΟΟ	όη	cn			CD Ν< 1—
										Ν< CD 3
										Η· 3 01

c4- NS n*. n<

Q. · o ncr cn x

3	VI		VI	C3	Cs	VI	Ν—	Η—	Ν4 ΓΟ
CD	os	νι	ο	Ν-	C3	OS	«J	CD.	Γ 01
<4·	α.®	A“	Α®	Α·	Α®	Α®	ΝΟ	Ο«	cn 3
CD							Α®	Ν·	Ό
03	Ν4	1-4	Ν4	ΗΗ	Ν4	Ν4		<	Η- <4>
«4·	Γ~	ί-	ι-	ι-	Γ-	ι—	1-4	X.	3 Ο
Ο	cn	α	αη	αη	όη	W	ι—		3 <4-
<							cn		Η· 3
03.									Ο* CD
3									Η· Ο
Ο									in ce

3	α	p.	N-	sa	0	so	SO
CD	α	α	CD.	ca	α	VI	O	CD,
rh	A·	A®	O<					O<
CD			H·					H·
03	*—4	H-4	<			Η-»		<
rt*	Γ”	r-	X.	Γ-	Γ”	Γ“	Γ-	X,
0	cn	cn		cn	cn	cn	cn
<
QX						*
3
0

•4 c·

Hf+ α C I cr «4-Χ C C. 3 /5 O O H X C X o z—\ 01 ~4 3 CDXJ I—I «4O <4· cr

CD

O

Srovnání sloučeniny č. 1S s captothecinem a 10-hydroxycamptothecinem u rady zvířecích nádorových modelů

77	*g·	03	03			ΞΖ
OJ	ω	Q.	cl		03	VI
»1	cl	(S	ro		=3	O
n	H·	3	3		=3
M·	0!	O	O		03	Os
□	O	A	77		II
O	□	03	03		C·	ro
3	c·	H	>1		<	03
	<	o	o			1-3
řs3		w	W		03	77
Cs	TO	3	3		a.	O
	1—‘	O	O		ro	3
7Γ	f“	3	3		3
O	O				O
t—‘	3	ví	Vd		77
O	Hs	Η-	CO	CS	03
3				1-3
	77	Χ-	77	O	O
	ω	Ο	O		tr-
	π	Ι-	h—		3
	o	Ο	O		O
	H·	3	3		3
	3
	O
	3					1—'		Ό
-J	C3	sO	sO	SO		o		I3
(s3	VI	hO	OS	Os		(3		O
•\e		<A°		o\e		e\“	Ό	C.
							*3<	(—
Ή	—d	—(	—I	—d		—d	Q	O
(3	<3	CT	<3	¢3		CT	N<	c
t-1	h-Ί	1—1	l-d	l-d		1—1	►-·	(sic
							<-b	ra
							HS	3
								i±.
								CL
								O
								CT
								s<
			K-			H-		t—1
cs	Os		O	Ό		o		r~
Os	VJ	ví	a	SO		O		cn
o\°	•’.e	o\·	•\e	<M>		«!.θ		h·
-d	—d	-d	—i	—1		-d		3
<3	<3	CT	(3	CT		CT		3·
1—1	t—1	1—I	t—1	t—1		t—1		»—
								α-
								π-
								ό
								ro
								n
								c·
		3	3					ro
V3	V4	ro	ro	Os		Os		cd·
-J	VJ	«+	cd·	1—		Os		C
o\°	•\a	ro	ro	o\e		o\e
		ro	ro					cd·
—1	—1	cd·	cd·	—»		—1		C
C3	o	O	O	<3		CT		3
(—1	h-i	<	<	Η-1		l-d		a
		03.	03.					-3
		3	3					c
		O	O					f\
								—d
								<3
								l-d
			1					s^

tumorový model sloučenina č. 1S Camtothecin 10-hydroxycamptothecin ϊ

Tabulka 5

Aktivita sloučeniny č. 1S u myší nesoucich,'implantované nádory tumorový model schéma léčení/ dávka ILS způsob podání (mg/kg/ (%) inj.) dlouhodobé přežití

P383 leukemie	A/ip	30	toxický
		15	>200
		7,5	125
		3,3	92
L1210 leukemie	A/ip	25	toxický
		15	219
		9	138
		5,5	81
		3,2	31
B16 melanom	B/ip	25	toxický
		15	152
		9	100
		5,4	52
i· B16 nelanom/		3,2	43
- B/ip	25	toxický
F10 podlinie		15	105
		9	68
		5,4	63
		3,2	37
M5076 sarkom	C/ip	10	toxický
		5	toxický
		2,5	105
		1,2	75
		0,62	{ 70
M5076 sarkom	C/sc	10	toxický
		5	toxický
		2,5	98
		1,2	70
		0,62	36

4/6

2/6

1/8

1/3

1/8

Tabulka 5 - pokračování tumorový model schéma léčení/ dávka ILS způsob podání (mg/kg/ (%) inj.) dlouhodobé přežití

karcinom 26 kolon 9/ip	40	toxický
	20	toxický
	10	25
	5	5
	2,5	7

1’

Ta bulka 6

Aktivita sloučeniny č. IS u myší nesoucích iv-implantované nádory tumorový model schéma léčení/ dávka ILS dlouhodobé způsob podání (mg/kg/ (¾) přežití inj.)

P383	A/ip	25	279	2/6
		15	132
		9	100
		5,4	58
		3,2	42
P383 leukemie	A/iv	25	toxický
		19	250	2/6
		14	145
		10	110
		7,9	65
L1210 leukemie	A/ip	25	toxický
		15	171	1/6
		9	136
1*		5,4	93
		3,2	57
L1210 leukemie	D/iv	40	toxický
		24	>300	4/7
		14	157
		8,6	129
		5,2	71
L1210 leukemie	E/iv	6	toxický
		3,6	>300	5/7
		2,2	>300	1/7
		1,3	'243	2/7
		0,78	136
Lewisův plicní	B/ip - '	25	toxický
karcinom		15	> 200	7/7
		9	111	1/7
		5,4	37
	Z	3,2	16
	l * *.»

- 42 Tabulka 7

Aktivita sloučeniny č. IS u myší nesoucích sc-implantované nádory

tumorový model	schéma léčení/ způsob podání	dávka (mg/kg/ inj.)	TGI myši bez hmat (¾) telných nádori
Lewisův plicní	3/ip		25	toxický
karcinom			15	100	8/8X
			9	99	7/3XX
			5,4	63	2/3
			3,2	31
Lewisův plicní	F/iv		25	99	5/8
karcinom			15	95	3/3
			9	93	1/3
			' 5,4	87	4/3
Lewisův plicní	F/po		45	toxický
karcinom	-		27	99	4/3
			16	90	1/3
			9,7	39	2/3
1'			5,3	51
316 melanom	F/ip		24	99	7/3
			14	57	3/3
			3,6	63	3/3
			1,2	20	1/3
			3,1	63	2/3
316 melanom	F/iv		25	toxický
			15	99	7/3
			9	96	6/8
			5,4	179	3/3
			3,2	54	2/3
316 melanom	C/ip		6	100	7/7
			3,6	100	7/7
			2,2	92	2/3
			1,3	64	1/8
			0,73	46	1/3

Tabulka 7 - pokračování

tumorový model schéma léčení/ dávka	TGI (¾)	myši bez hmatatelných nádorů
	způsob	podání	(mg/kg/ inj.)
316 melanom/	B/ip		25	100	7/8
F10 podlinie			15	37 ·
			9	57
			5,4	62
			3,2	52
816 melanom/	F/iv		25	97	6/8
F1Q podlinie			15	97	7/8
			9	60	2/3
	i		5,4	34	1/8
			3,2	22	1/8
A0J-PC6 plasmacytom B/ip		25	toxický
			15	100	7/7xxx
			9	100	g/gXXX
			5,4	92	4/8XXX
			3,2	93	3/8
M5Q.76 sarkom	B/ip		25	toxický
			15	100	8/8
			9	98	6/8
			5,4	92	3/8
			3,2	64	2/8
Mammarní	B/ip		20	toxický
adenokarcinom	16/C		10	96	5/8
			5	61	2/8
			2,5	59	1/3
adenokarcinom	33 G/ip		24	89 >	4/7
kolon			14	’’ 78	5/8
			8,6	55	3/7
			5,2	0	1/7
			3,1	0	2/7

- 44 Tabulka 7 - pokračování

tumorový model	schéma způsob	léčení/ podání	dávka (mg/kg/ inj.)	TGI (%)	myši telný
adenokarcinom 33	H/ip		6	96	5/7
kolon			3,6	93	6/7
			2,2	74	4/7
			1,3	63	4/7
			0,78	53	2/7
adenokarcinom 51	G/ip	...	24	33	3/3
kolon			14	76	1/3
			8,6	53	1/3
			5,2	36	1/3
			3,1	34
adenokarcinom 51	H/ip		3,ž	92	4/3
kolon			2,2	89	4/3
			1,3	83	3/8
			0,73	73	1/8
Madisonův plicní	F/iv		24	23	1/3
kaťcinom			12	0
			6	21
			3	0
			1,5	0
Madisonův plicní	C/iv		3	toxický
karcinom			1,5	35	3/8
			o,75	63	1/8
			0,33	41
			0,19	0
karcinom 26	3/ip		20	[toxický
kolon			10	'r 72
			5	39
			2,5	33

í

Vysvětlivky k tabulce 7 ^x4/3 dlouhodobé přežití bez nádorů ^xx2/3 dlouhodobá přežití bez nádorů ^xxxl/3 dlouhodobé přežití bez nádorů léčebné schémata jsou: B = dny 1, 5, 9 a 13,

C ;= každé 3 hodiny x 4 ve dnech 1, 5 a 9,

F = dny 1, 5 a 9, G = dny 3, 10, 17 a 24,

H = každé 3 hodiny x 4 ve dnech 3, 10, 14 a 24.

Inhibice růstu nádoru (TGI) je založena .na středním, objemu nádorů skupin 7 nebo 8 myší relativně k neléčeným kontrolám., Nádory bylý měřeny mezi 12. a 19. dnem, vyjma 24. den pro adenokarcinom 51 kolon a 31. den pro adenokarcinom 33 kolon).

Ve všech, vyjma dva pokusy, všechny neléčené kontrolní myši (21 nebo 24 myší/skupinu) měly měřitelné nádory. V B16/F10, schématu F, 21/24 kontrolních myší mělo měřitelné nádory. V pokuse s adenokarcinomem 38 kolon, 19/21 kontrolních myší mělo měřitelné nádoDy.

Vzestup v rozsahu života (ILS) je založen na mediánu přežívací doby skupin 6 myší. Čistá zabití tumorových buněk (NCK = net cell kill) je vypočteno z mediánu přežívací doby standardními metodami, jelikož přežívacíidoba je lineární funkcí logaritmu zatížení nádorových buněk. Jelikož mitoxantronová resistentní podlinie má delší zdvojovači čas než ostatní dvě buněčné linie užití v tomto pokuse, menší ILS je spojena s větší NCK než u P383 nebo dixiriubicinově resistentní buněčné linie.

	a	cn
w	o	k—·
«+	X	o
o	o	c
3	1-3	n<
s<	c	CD
O	α-	3
H·	π-	H·
3	ό	3
	Η·	03
π	3	k—4 σι

t—¹ IsO t—¹ k—¹ -řs* —u »—· (— <n vo π π

OOs-JSOlSnisOSOIsO^a· |s3 4>

cn

I—¹ ο

c ο<

cs □

π· ω

r*\

0.3 O. ca a. *< -^<

7Γ 7Γ (—'ca m <nn

co

t—

1-1

i—1

I-1

kr1

H-1

ISO

I-1

ISO

IsO

*r% hh

SX

a

rs>

ví

«4

1—J

OS

<4

vt

Vi

OS

ISO

ISO

o\° Γ

Os

CO

os

CO

'U

-4

ISO

OS

SX

CO

i—*

a

H-

s^> cn

o

“O

X

SX

H·

x-\

co

N3

SX

4>

VI

SX

S/l

VI

•P·

OS

l-u

SX

OS

G\

o

i-1 x:

C3

X

o <n

-4

OS

s/i

OS

SZI

a

t-1

SX

OS

sji

a

S/l

S/l

S/l

03%

ca 7š

s-z

-o

SX

N5

v

OS

SOI

IsO

r*o

1—

I—

Hu

SX

SO

«4

®\® l~

C3

so

CO

ISO

ISO

ISO

so

-P-

SO

-p·

SX

13

CS

<+

s_, cn

co

o

\

X

a.

H·

o

o

X

X

o

<3

a

O

h-

o

C3

O

a

o

o

O

a

IS3

Os

03%

k—4 S

1-3

«·

%»

«·

w

a o

c

SX

Ul

a

vi

ISO

C3

ca π

σ

o

Π· □

I— ISO S/l SX O IS3 VI *4 O c-k·

P-sOPsOs^aOO-P-^JSO^sO-^a

X

H· o

X

03» caoH-oss/iaoaoaoisosxsn

C3 VI SJI

Os ~4 /~s |—I “O ώ® r~ sx s^> cn co co

Nedostatek zkřížení resistence na sloučeninu č. IS na více farmak Γ3Β0 leukemie resistentních podlinií (— S Γ+ O O O ca z: x s_, 03 a

c+ n

a a

Tabulka 9

Aktivita racemická směsi sloučeniny č. 1S u myší nesoucích i.p. P333 leukémii sloučenina dávka ILS ('mg/kg, ip, _m dny 1 a 5) dlouhodobé přežívání

IRS .165 1/6

135

7,2 30

3,6 -30 z

Zvířata byla implantována i.p. s 10 buňkami. Vzestup v rozsahu života (ILS) je založen na mediánu přežívací doby skupin 6 myší relativně k neléčeným kontrolám. Dlouhodobé přežití bylo bez tumorů ve 45. dni.

Tabulka 10

Srovnávací aktivita různých solných forem sloučeniny č. IS u myší nesoucích i.v. L1210 leukémii sloučenina dávka ILS (%) (mg/kg, ip, dny 1 a 5)

IS (acetátová	25	toxický
sůl)	15	100
	9	33
	5,4	67
	3,2	50
IS (hydrochlori-	25 χ	toxický
dová sůl)	15	175
	9	125
	5,4	92
	3,2	50
IS (dihydrochlori·	- 25	toxický
dová sůl)	15	133
i·	9	33
	5,4	50
	3,2	50
IS (sodná sůl)	90	toxický
	54	203
	32	133
	19	100
	12	67
	6,5	33

Zvířata byla inokulována i.v. s 10^Ď buňkami. Vzestup v rozsahu života (ILS) je založen na mediánu přežívacího času skupin 6 myší relativně k neléčeným kontrolám.

Farmaceutické přípravky a způsob léčení

Farmaceutická přípravky podle tohoto vynálezu tvoří účinné vzrůst nádorových buněk inhibující množství sloučeniny vzorce I a inertní farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo. Tyto přípravky jsou připraveny v dávkové jednotkové formě vhodné pro parenterální nebo orální aplikaci.

Sloučenina vzorce I se aplikuje v běžné dávkové formě připravené kombinací terapeuticky účinného množství, tj. účinného růstu tumorů inhibujíčího množství, sloučeniny vzorce I (aktivní složka) se standardními farmaceutickými nosiči nebo ředidly podle běžných postupů. Tyto postupy mohou zahrnovat míšení, granulování a stlačení nebo ředění složek, jak je vhodné pro žádaný přípravek.

Užití farmaceutického nosiče mohou být například buď pevné nebo kapalné. Příkladnými pevnými nosiči jsou laktosa, bílá hlinka, mastek, sacharosa, želatina, agar, pektin, akacie, stearan hořečnatý, kyselina stearová a podobně. Příkladnýrmirkapalnými nosiči jsou sirup, podzemnicový olej,olivový olej, voda a podobně. Podobně nosiče nebo ředidla mohou obsahovat zpožďovací materiály dobře v oboru známé, takové jako glycerylmonostearát nebo glyceryldistearát samotné nebo s voskem, ethylcelulosou, hydroxypropylmethylcelulosou, methylmethakrylátem a podobně.

Může se užít široká řada farmaceutických forem, přípravky se mohou tabletovat, naplnit dó tvrdých;želatinových kapslí v práškové nebo peletové formě nebo mohou tvořit pastilky. Množství pevného nosiče se bude široce mě;nit, ale výhodně bude mezi 25 mikrogramy do asi 1,0 g. Když je užit kapalný nosič, přípravek bude ve formě sirupu, emulze, měkké želatinové kapsle, sterilního injekčního roztoku nebo suspenze v ampulích nebo lahvičkách nebo v nevodné kapalné suspenzi.

K získání stabilní ve vodě rozpustné dávková formy, farmacaůticky přijatelná sůl sloučeniny vzorce I se rozpustí ve vodném roztoku organické nebo anorganické kyseliny, takové jako Q,3M roztok kyseliny jantarové nebo výhodně kyseliny jantarové nebo výhodně kyseliny citrónové. Jestliže není dostupná rozpustná solná forma, sloučenina vzorce I se rozpustí ve vhodném spolurozpouštedle nebo jejich kombinacích. Příklady takových vhodných spolurozpouštědel zahrnují, ale nejsou omezeny na alkohol, propylenglykol, polyethylenglykol 300, polysolvát 30, glycerin a podobně v koncentracích v rozsahu od 0 až 60 % celkového objemu.

Přípravky mohou také být ve formě roztoku nebo solné formy aktivní složky va vhodném vodném vehikulu jako je voda, nebo isotonické solní nebo dextrosové roztoky. Pro tx sloučeniny vzorce I, které, nemají zásaditý postranní řetězec v 9. poloze jako jsou sloučeniny č. 25 a 10S (viz tabulka 2 pro: struktury), sůl alkalického kovu karboxylátu vytvořeného alkalicku hydrolýzou E-kruhu laktonu by měla nést k rozpustným solím, jak příkladně uvedeno pro sodnou sůl sloučeniny 1S.

1'

Bude třeba ohodnotit, že aktuelní výhodné dávkování sloučenin vzorce I užití v prostředcích podle vynálezu se bude měnit podle užitého určitého komplexu, určitého vytvořeného přípravku, způsobu aplikace a určitého místa, hostitele a nemoci, jež má být léčena. Optimální dávkování pro danou sadu podmínek může být odborníky určeno s užitím běžných dávek určujících testů s ohledem na svrchu uvedené pokusné údaje. Pro parenterální aplikaci, dávka obecně užívaná je od asi 20 do asi o

150 mg/m tělesného povrchu, na den pro jeden až pět dní, výhodně opakované každý čtvrtý týden pro čtyři běhy léčení. Pro orální aplikaci, dávka obecně užívaná je od asi 20 do asi 150 mg/m tělesného povrchu na den pro jeden až pět dní, s běhy léčení opakovanými ve vhodných intervalech.

Následující příklady ilustrují a) protokol užití pro vyměření aktivity různých sloučenin vzorce I u transplantovaných myších nádorových modelů, b) chemickou výrobu sloučenin vzorce I užitých v přípravcích a metodách podle vynálezu a

c) orální a parenterální farmaceutické přípravky podle vynálezu.

Má se za to, že bez dalšího vypracování odborník s použitím předchozího popisu může využít vynález v jeho nejplnějším rozsahu. Následující příklady jsou proto konstruovány pouze jako ilustrativní a žádným způsobem neomezují rozsah vynáleau.'

Příklady provedeni vynálezu

I. Protokoly, užité pro transplantovaná myší nádorové modely

Protokoly užití pro hodnocení protinádorové aktivity sloučenin vzorce I jsou dobře známé a využívané odborníky v hodnocení účinků farmak v preklinických nádorových modelech. Tyto studie obecně sledují protokoly/stanovené National Cancer Institute, jak popsáno Geranem a dalšími, Cancer Chemotherapy Reports, část 3, sv. 3, 1 - 103, 1972.

A. i.p. nádorové modely

Tumory užité v těchto studiích-P383 leukemie a její dexorbicinové a mitoxanronová resistentní podlinie, L1210 leukemie, 316 melanom, B16 melanom/FlQ podlinie, M5Q76 sarkom a karcinom 26 kolon se udržují sériovou transplantací u syngeneických kmenů myší. Pro leukemie jsou tyto tumory přechovávány na D8A/2 myších. M5076 sarkom, S16 melanom a jeho F10 podlinie jsou přechovány na C5781/6 myších a sarcinom 26 kolon je udržován na 8AL8/c myších. Leukemie a M5076 sarkom se sériově transplantují i.p. jako ascitová buněčná suspenze, zatímco B16 melanomové linie a karcinom 26 kolon se sériově transplantují jako s.c. solidní tumory.

Pro terapeutické zkoušky, se tumory asepticky odstraní z myších dárců a připraví se jako suspenze k i.p. aplikaci testovním zvířatům. Testovními zvířaty pro karcinom 26 kolon jsou samice 3AL3/c myši (20 až 25 g). Testovními zvířaty pro ostatní nádorové modely jsou syngeneické samice hybridu 36D2F-. myší (C57Bl/6xO3A/2). InokulaČní hladiny jsou různé z

podle typu nádoru: P338 leukemie se inokulujs při 10 buňkách na myš, L121Q leukemie při 10⁵ nebo 10⁶ buněk na myš, M5076 sarkom při 5 x 10^ na myš. Pro implantaci 316 melanomových linií a karcinomu kolon, s.c., tumory z myších dárců se rozsekají a homogenizují na volně uloženém teflonovém skleněném homogenisátoru k poskytnutí nádorové suspenze. InokulaČní i hladiny jsou 0,5 ml 10%,(hmotnost:objem) suspenze karcinomu kolon, 816 melanomových linií a 0,5 ml 5% (hmotnostiobjem) saspenze karcinomu 26 kolon. Po inokulaci tumoru, myši se náhodně .'rozdělí na léčené skupiny tvořené každá 6 až 8 zvířaty.

V každém pokuse jsou tři skupiny neléčených kontrolních myší.

Farmaka se rozpustí nebo suspendují v přiměřeném vodném vehikulu a podávají řadou cest a schémat: aplikace v širokém rozsahu dávkových hladin. Zvířata jsou pěstována v krabicových klecích a denně monitorována na mortalitu po 30 (L1210), 45 (P333) nebo 60 (B16, M5Q76, karcinom 26 koion)dní. Konečným bodem pro aktivitu je medián prežívacího času a vzestup v rozsahu života relativně k neléčeným kontrolám. Farmakou je považováno za účinné v těchto tumorových modelech, jestliže prodlužují rozsah života 0 * 40 %.

B. i.v. nádorové modely

Tumory užívané v této studii P338 leukemie, L1210 leukemie a Lewisův plicní karcinom se přechováivají seriální transplantací u syngeneických kmenů myší DBA/2 pro leukemie a C57B1/6 pro Lewisův plicní karcinom. Leukemie se sériově transplantuje i.p. jako ascitová buněčná suspenze, zatímco Lewisův plicní karcinom se sériově transplantuje jako s.c. solidní nádor. ’ ϊ

í

Pro terapeutické zkoušky tumory se asepticky odeberou u myších dárců a připraví se jako suspenze k implantaci testovním zvířatům, které jsou pro každý tumor syngeneické samčí F^ hybridy 36D2F·^ myší (C5731/6 x DBA/2). Hladina inokula se mění s typem nádoru. P333 leukemie při 10^ buněk na myš,

L1210 leukemie při 10^ nebo 10^ buněk na myš a Lewisův plicní karcinom 0,25 ml 10 % (hmotnost:objem) suspenze. Suspenze Lewisova plicního karcinomu se připraví jak svrchu popsáno pro B16 melanom. Po inokulaci tumoru se myší náhodně rozdělí na léčené skupiny každá o 6 až 3 myších. V každém pokuse jsou tři skupiny neléčených kontrolních 'myší.

C. s.c. nádorové modely

Tumory užití v těchto studiích se udržují sériovou¹ transplantací u syngeneickýchjkmenů myší C57BL/6 prórLewisův plicní karcinom, B16 melanom a jeho F10 podlinii, M5076 sarkom, a adenokarcinom 33 kolon; SALB/c pro karcinom 26 kolon, ADJ-PC6 plasmacytom, Madisonův plicní karcinom a adenokarcinom 51 kolon; C3H pro mammarní adenokarcinom 16/c. S výjimkou M5076 sar- <; komu, který je přechován jako i.p. ascitová buněčná suspenze, všechny ostatní tumory se sériově transplantují jako s.c. so- ,.í lidní tumory.

Pro terapeutické zkoušky, tumory se asepticky odstraní z myších dárců a připraví se pro implantaci s.c. testovním zvířatům. Testovními zvířaty pro Lewisův plicní karcinom, B16 ;

melanom a jeho F10 podlinii, M5076 sarkom a adenokarcinom 38 -í kolon jsou syngeneické samičí F^ hybridy B602F myší (C5731/6 x DBA/2). AD3-PC6 plasmacytom a karcinom 26 kolon jsou hodnoceny u samic BALB/c myší. Madisonův plicní karcinom a adenokarcinom 51 kolon jsou hodnoceny u synergeneických samic F^ hybridů CD2Fj myší (BALB/c x DBA/2). Mammární adenokarcinom 16/c je hodnocen na samicích C3H myší. Inokulum se mění podle druhu nádorů. Adenokarcinom 38 kolon se implantuje trocharem í jako 2 mm fragmenty. M5Q76 sarkom a ADJ-PC6 plasmacytom se 1

Z Z I implantují jako buněčné suspenze při 5 x 10 a 2 x 10 buněk I

I na myš. Karcinom 26 kolon, adenokarcinom 51 kodon, Lewisův plicní karcinom, Madisonův plicní karcinom a 816 melanom a jeho F10 podlinie se implantují jako tumorové suspenze připravené jak popsáno svrchu v objemu 0,5 ml. Koncentrace suspenze byla 10 % (hmotnost:objem) vyjma karcinomu 26 kolon, pro který koncentrace suspenze byla 5 Po inokuláci nádoru se myši náhodně rozdělí do léčených skupin 7 nebo 3 myší. V každém pokuse jsou tři skupiny neléčených kontrolních myší.

Farmaka se rozpustí nebo suspendují ve vhodných vodných vehikulech a podávají se různými aplikačními cestami a v různých léčebných schématech v rozsahu dávkových hladin. Zvířata jsou chována v krabicovitých klecích a denně monitorována na mortalitu. V období, když neláčená kontrolní zvířata mají velkéí měřitelné tumory (obvykle500 mm³), se u všech zvířat měří nádory v kolmých průměrech s noniovým posuvným měřidlem 2 a objem nádoru se vypočte ze vzorce: délka x (šířka) x o,5.

Doba měření nádorů závisí na rozličných rychlostech vzrůstu růz-·/ ných nádorů: nejrychleji rostoucí nádory, takové jako Lewisovy .....

a Madisonovy plicní karcinomy, 816 melanom a jeho F10 podlinie seiměří mezi 12. a 16. dnem. Pomaleji rostoucí nádory se měří v pozdějších časových bodech: 17. den pro 145076 sarkom, 16. nebo 19. den pro A0J-PC6 plasmacytom a karcinom 26 kolon, 24. den pro adenokarcinom 51 kolon a 31. den pro adenokarcinom 38kolon. Koncovými body pro aktivitu jsou střední nádorový objem, procento inhibice nádorového růstu relativně k neléčeným kontrolám a počet zvířat bez hmatatelných nádorů ve dni měření. Farmakou je považováno za účinné u těchto nádorových modelů, když vyvolává * 70¾ inhibici nádorového růstu při nebo pod maximálně tolerovanou dávkou.

f

Pro vysoce metastasující nádory včetně: Lewisových a Madisonových plicních nádorů), karcinomu 26 kolon a B16 melanomu a jeho F10 podlinií, myši nesoucí nádory jsou rovněž monitorovány na dobu přežití. Pro méně metastasující nádorové modely, myši nesoucí nádory jsou zabity po měření ná55 daru. V této sestavě vzestup v rozsahu života větší nebo rovný 30 procentům je považován za průkaz účinnosti farmaka.

II. Synthesa sloučenin vzorce I

V následujících syntetisačních příkladech, teplota je uváděna ve stupních Celsia (°C). Pokud není vyznačeno jinak, jsou všechny výchozí materiály získány z komerčních zdrojů.

Příklad 1

Výroba (20S)1,2,6,7-tetrahydrocamptothecinu

A g, 0,092 mol camptothecinu získaného od Tainjain SKaF Ltd., Tainjain, Čína, byl smísen s Pt°/připravené redukcí 3,0 g amorfního Pt02 v 300 ml HOAc po 1,5 hodiny pod 0,1 MPa (1 aimoy sféra( H2/ a 1,6 1 HOAc. Redukce se uskutečnila při 0,1 MPa (1 atm.i) H₂ po 8,5 hodiny při silném míchání směsi. Na konci této doby, teoretické množství se absorbuje (o něco více než

4,1 1) a vychytávání H₂ se značně·, zpomalí. Reakční směs se zbaví plynu proudem Ar po přibližně 10 minut a pak se filtruje přes vrstvu celitu, která se promyje 200 ml HOAc.

Výsledný roztok se bezprostředně užije v následující reakci popsané v příkladu 2.

Příklad 2

Výroba (20S) 10-hydroxycamptothecinu t

’ *

K silně míchanému roztoku 1,2,6,7-tetrahydracamptothecinu připraveném jak svrchu popsáno v příkladu 1, se přidá 64 g,

0,144 mol Pb(0Ac)₄ v jedné porci. Reakční směs?set míchá pod Ar 30 minut a všechen Pb(0Ac)₄ se rozpustí. Koncentrací se získá gumovitý zbytek, který se trituruje s 1 litrem ledově chladné vody, čímž vznikne světle hnědá pevná látka, která se odfiltruje, promyje se dalšími 200 ml ledově chladné vody, tlakově se suší s pryžovou přehradou a vzduchem přes noc. Výsledný částečně vlhký produkt obsahuje 44,3 % 10-hydroxycamptothecinu, 26,9 % 10-acetoxycamptothecinu a 23,1 % camptothecinu podle vysokotlaká kapalinové chromatografické (HPLC) analyse (Whatman Partisil 5 QDS3 Rac II 60¾ CH-jOH/^O).

Surová směs se smísí s 1,7 litrem vodného HOAc a zahřívá se přes noc pod zpětným chladičem. Reakční směs se chladí a koncentruje se přibližně na 50 - 100 ml. Přidá se 1 litr ledově chladné vody a precipitát se odfiltruje, promyje se dalšími 200 ml ledově chladné vody, tlakově suší s pryžovou

A přehradou a suší se ve vysokém vakuu po dva dny, čímž vznikne 21,16 g materiálu obsahujícího 70,9 % 10-hydroxycamptothecinu, 1,2 ¾ 10-acetoxycamptothecinu a 21,3 ¾ camtothecinu podle HPLC analýzy.

Příklad 3

Výroba acetátové soli (2QS) 9.dimethylaminomethyl-10-hydroxycamtothecinu g 10-hydroxycamptothecinu (který byl zkoušen při 62V 10-hydroxYcamptothecinu*a proto obsahoval 12,4 g, 34,1 mmol 10-hydroxycamptothecinu) připravený jak popsáno v příkladu 2, se smísí s 620 ml HOAc, 12,4 ml (přibližně 149 mmol) 37¾ vodného CH₂0 a 12,4 ml (přibližně 109.mmol) 40¾ vodného dimethylaminu a míchá se přibližně IQ hodin a chromatografuje na tenké vrstvě indikuje něco zbývajícího výchozího materiálu (tle v 9 : 1 CH₂C1₂, CHjOH na silikagelu). Tento systém je vhodný pro sledování vymizení 10-hydroxycamptottheoinu/ale ne pro monitorování vytváření produktu. 6 ml (přibližně 72 mmol) dalšího 37¾ vodného CK₂0 a 6 ml (přibližně 53 mmol) 40¾ vodného dimethylaminu se přidá, míchání pokračuje dalších 24 hodin. Reakční směs se koncentruje do sucha, trituruje se s 1 litrem 0,5% vodné HOAc, filtruje a pevná látka se promyje dalšími 500 ml 0,5% vodné HOAc. Sušená pevná látka měla hmotnost 6,3 g a rekoveruje se 94 % camptothecinuzpodle HPLC (Uhatman Partisil 10 00S 3 50% CH₃QH/H₂0,' retenční čas 9 minut). Smíšené vodné filtráty se extrahují 3 x 600 iml EtQAc a 600 ml petroletheru a potom se lyofilizují.

Chromatografie surového zbytku se dosáhne injekcí materiálu v 600 ml rozpouštědla A (rozpouštědlo A = 99% H₂0,

1% HOAc) a elucí při 350 ml/min přes 50 mm x 600 mm ocelový sloupec naplněný 680,g Whatman Partisil 40 ODS 3 ss 34

A minutovým lineárním gradientem ze 100% rozpouštědla A do 40% rozpouštědla B (rozpouštědlo 8 * 99% CH^OH, 1% HOAc). Chromatografie se monitoruje při 410 nm a shromáždí se 1 litr filtrací a ty, které se analyzují při = 99% čistotě analytickou HPLC (Uhatman Partisil 10 ODS 3 50% CH₃0H/H₂0, retenční čas 9 minut) se shromáždí, koncentrují, a znovu rozpustí v minimálním množství 0,5% vodné HOAc a lyofylizují se, čímž vznikne 10·,58 g (62 %) jmenovaného produktu.

IR (KBr) 3400, 2960, 1740, 1650, 1590 cm’¹.

¹H-HMR (CDCl₃/CD₃00) 1,04 (t, 3, 3 = 7 Hz, CIS),1,96 (q, 2, 0 = 7 Hz, C19), 2,01 (s, 3, CHjCOg), 2,50 (s, 6, (CH₃)₂MH), 4,20 (s, 2, ArCH₂N), 5,23 (d, 1, 3 = 19 Hz, C17),

5,29 (s, 2, C5), 5,50 (d, 1, J = 19 Hz, C17), 7,42 (d, 0 = 9 Hz, Cil), 7,67 (s, 1, V14), 8,05 (d, 3 = 9 Hz, C12), 8,51 (s, C7).

Vypočteno pro ^C23^H23^M3°5 ^{1 HQAc 1 H}2° 515,5):

(molekulová hmotnost = vypočteno nalezeno

C 58,24, H 5,67, N 8,15 %

C 58,55, H 5,22, M 8,54 %.

Pb analýza s £ 14,5 ppm.

Další uvedené produktové materiály, které byly >90% čistší podle HPLC (viz svrchu), se koncentrují do sucha a dále rechromatografují s podobnými materiály izolovanými z druhých běhů.

Příklad 4

Výroba acetátové soli (20S) 9-morfolinomethyl-10-hydroxycamptothecinu

100 mg, 0,27 mmol 10-hydroxycamptothecinu připraveného jak popsáno v příkladu 2, 0,5 ml 37% vodného CH₂Q,' 0,1 ml morfolinu a 10 ml 2 : l^HOAc/EtOH se smísí a míchá se přes noc. Hydroxycamptothecin reagoval (tle, silikagel, 9:1 CH₂Cl₂/CHjOH) a reakční směs se koncentruje do sucha, roeř pustí se asi v 5 ml vody obsahující několik kapek HOAc a nerozpustný materiál se odfiltruje. Filtrát se lyofilizuje a lyofilizát se chromatografuje (15 mm x 250 mm oxidu křemičitého střední tlakovou kapalinovou chromatografii (MPLC) elucí s CH₂Cl₂obsahujícím 0-2% CH^OH), čímž vznikne zbytek, který se rozpustí v zředěném vodném HOAc a lyofilizuje se a tím vznikne 53 mg (33 %) výsledné sloučeniny. ^ť ' ''

IR (KBr) 3400, 3100, 2960, 2920, 2340, 1740, 1650, 1590 cm¹.

(CDC1 j/CDjOD) : 1,12 (t, 3, 3 = 7 Hz, CI8), 1,94 (q, 2, 3=7 Hz, C19), 2,73 (m, 4, morfolino-CH₂N), 3,83 (m, 4, morfolino^CH₂0), 4,19 (s, 2, ArCH₂N), 5,26 (s, 2, C5), 5,25 (d, 1, 3 = 16 Hz, C17), 5,76 (d, 1, 3 = 16 Hz, C17), 7,27 (s, 1, C14), 7,40 (d, 1, 3 = 8 Hz, CH), 3,07 (d, 1, 3 = 8 Hz, C12),

3,36 (s, 1,

Analýza pro vypočteno nalezeno

C7).

^25^25^3^6 ^^H3 ^^2^ (molekulová hmotnost = 525,6)

C 61,71, H 5,95, H 3,00 %

C 61,30, H 5,44, N 3,35 %.

í

Příklad 5

Výroba acetátové soli (20S) 9-IJ-methylpiperazinylmethyl-lO-hydroxycamptothecinu

100 mg, 0,27 mmol 10-hydroxycamptothecinu připraveného jak popsáno v příkladu 2, 10 ml 2 : 1 HOAc/EtOH, 0,5 ml:.37% vodného CH₂0 a 0,1 ml H-methylpiperazinu se smísí a míchá se 20 hodin. 10-hydroxycamptothecin reaguje (tle 9 : 1 CH₂C1₂/ /CH-jQH) a reakční směs se koncentruje, rozpustí se v 50 ml < r· vody a promyje se 5 x 20 ml EtOAc a 20 ml petroletheru a vodná fáze se lyofilizuje. Zbytek se znovu rozpustí ve zředěném vodném HOAc a chromatografuje se na MPLC (Whatman Partisil 40 ODS 3, 9 mm x 250 mm sloupci) elucí s 0 až 20¾ CH,0H/v H_o0 obsahující 0,02¾ HOAc. iádaný lyofilisát poskytne 67 mg (46 %) výsledné sloučeniny.

IR (KBí) 3400, 2960, 2910, 1740, 1650, 1590 cm¹.

¹H-HMR (CDClj/CDjOD): 1,03 (t, 3, 0 = 7 Hz, C13), 1,89 (q,

2, 3 = 7 Hz), 2,02 (s,> 3, CH₃CO₂H), 2,37 (s, 3, NCH^), 2,65 m,_r8, piperazin-CH₂), 4,21 (s, 2, ArCHg), 5,26 (s, 2, C5),

5,30 (d, 1, 3 = 16 Hz, C17), 5,71 (d, 1, 3 = 16 Hz, C17),

7,45 (d, 1, 3 = 7 Hz, Cil), 8,05 (d, 1, 3 = 7 Hz, C12), 8,47 (s, 1, C7).

Analýza pro ^C26^H28^fl4⁸5 ^1,3 1/2 H₂0 (molekulární hmotnost * 528,1) vypočteno C 61,41, H 6,01, N 10,61 ¾ nalezeno C 61,62, H 5,74, H 10,.93

Příklad 6 t

Výroba acetátové soli (20S) 9-(i4^,-piperidinopiperidinyl)methy1-10-hydroxycamptothecinu í

100 mg, 0,27 mmol 10-hydroxycamptothecinu připraveného jak popsáno v příkladu 2, 100 mg, 0,60 mmol 4-piperidinopiperidinu, 0,5 ml 37% vodného CH_?0 a 10 ml 2 : 1 HOAc/EtOH se míchají 20 hodin. 10-hydroxycamptothecin reaguje (tle, silikagel, 9 ϊ 1 CI^C^/CH^OH) a reakční směs se koncentruje, rozpustí se v 1% vodná kyselině octové, filtruje se a lyofilizuje se. MPLC (Whatman Partisil 40 ODS 3 9 x 250 mm sloupec) elucí se 100 ml vody a pak 0 až 3 % CH^OH v 0,02% vodné HQAc poskytne 44 mg (30 %) výsledné sloučeniny po lyofilizaci.

IR (KBx?) 3400, 2940, 1745, 1660, 1590 cm“¹.

¹H-HMR (C0C1OD): 0,99 (t, 3, 3 = 7 Hz, 018),.1,3 - 3,3 (m,

19, piperidin, 019), 4,11 (s, 2, CH₂N), 5,21 (s, 2, 05), 5,25 (d, 1, 3 = 16 Hz, 017),-5,70 (d, 1, 3 =16 Hz, 017), 7,85 (d, 1, 3 = 7 Hz, Cil), 7,59 (s, 1, 014), 8,00 (d, 1, 3 = 7 Hz, 012), 3,35 (s, 1, 07).

Analýza pro Cj^Hj^H^Oj 1,5 1^0 (molekulární hmotnost = 631,7) vypočteno C 53,94, H 6,22, N 8,81 % nalezeno C 59,02, H 6,44, N 8,53 %.

»·

Příklad 7

Výroba acetátové soli (20S)-9-(2’-hydrocyethylamiino)methyl-10-hydroxycamptothecinu

200 mg, 0,55 mmol 10-hydroxycamptothecinu vyrobeného jak popsáno v příkladu 2, 16 mg, 0,55 mmol paraformaldehydu, mg, 1,1 mmol ethanolaminu a 6 ml HOAc se 48 hodin míchá, po kterých většina 10-hydroxycaptothesinu reagovala. Reakční směs se koncentruje, znovu rozpustí ve 2Q0 ml zředěné HOAc a promyje se 4 x 30 ml EtQAc a 30 ml petroletheru a výsledný vodný roztok se lyofilizuje. Surový lyofilizát se rozpustí v 50 ml vody. MPLC (Whatman Partisil 40 ODS 3, 15 mm x 250 mm sloupec) elucí se 100 ml vody a potom o až 10 % CH^OH v 0,02% HOAc ve vodě poskytne 88 mg (33 %) výsledné sloučeniny po lyofilizaci .

IR (KBr) 3400, 2930, 2940, 1750, 1570 cm¹.

¹H-NMR (C0Cl₃/C0₃00): 1,03 (t, 3,3=7 Hz, C13), 1,39 ' (q, 2, 3 = 7 Hz, C19), 2,00 (s, 3, HOAc), 3,03 (m, 2, CH₂NH), 3,75 (m, 2, CH₂0H), 4,49 (s, ArCH^JH), 5,24 (s, 2, C5), 5,30 (d, 1, O = 16 Hz, C17), 5,70 (d, 1, 3 = 16 Hz, G17), 7,41 (d,l, 3=8 Hz, Cil), 7,6 (s, 1, C14), 3,00 (d, 1, 3 = Q Hz, C12), 3,43 (s, 1, C7).

Analýza pro ^C23^H23^fl3°6 ^l’^{,8Ac 1} l/θ Í^mole!<ulární hmotnost = 531,3) vypočteno C 56,52, H 5,33, N 7,91 % nalezeno C 56,07, H 5,40, H 3,27 %.

Příklad 8

Výroba methansulfonátové soli (20S)-9-trimethylammoniummethy1-10-hydroxycamptothecin mg, 0,14 mmol acetátové soli 9-dimethylaminomethyl-ip-hydroxycamptothecinu, připraveného jak popsáno v příkladu 3, se rozpustí v asi 70 ml CH₂C1₂ a filtruje se. Filtrát se smísí s 1 ml methylmethansulfonátu, chladí se a částečně se koncentruje pod proudem argonu (Ar). Po 4 hodinách se rozpouštědlo koncentruje na poloviční objem a chladí se. Precipitát se filtruje, rozpustí se v 10 ml vody, promyje 3 x 10 ml EtOAc a potom 10 ml petroletherem a lyofilizuje se, čímž vznikne 50 mg (60 %) výsledné sloučniny.

IR (KBr) 3400, 2950, 2900, 1760, 1660, 1600 cm’¹.

¹H-NMR .(C0Cl₃/C0₃00): 1,03 (d, 3, 3 = 7 Hz, C13), 2,01 (q,

2, 3 = 7 Hz, C19), 2,73 (s,>3, CHjSOj), !2,94 (s, 9, N(CH₃)₃),

4,72 (s, 2, ArCH₂n), 5,20 (s, 2, C5), 5,22 (d, 1 3 = 16 Hz,

C17), 5,67 (d, 1, 3 = 16 Hz, C17), 7,62 (d, 3 = 7 Hz, Cil),

7,71 (s, C14), 3,16 (d, 1, 3 = 7 Hz, C12), 8,39 (s, 1, C7),

Analýza pro ^₂^^5'¹5°5 ’ ^{1,5 CÍ,}3^H2³ (mol.hmotnost = 615,7) vypočteno C 49,74, H 5,72, H 6,32 % nalezeno C 49,36, H 5,15, N 7,53

Příklad 9

Výroba (29S)-9-formyl-19-hydroxycaptothecinu

100 mg, 0,27 mmol 10-hydroxycamptothecinu připraveného jak popsáno v příkladu 2, 0,3Q-mg, 5,5 mmol hexamethyltetraaminu a 15 ml kyseliny trifluoroctová (TEA) se 20 hodin zahřívá pod zpětným chladičem pod argonem. Reakční směs se koncentruje, smísí se s 15 ml-vody a míchá se 1 hodinu, přidá se 75 ml vody a pH se upraví na 3,4 přidáním NatlCO^. Vodná fáze se promyje 3 x 75 ml EtOAc, okyselí se na pH 1,5 3N HC1 a potom sa extrahuje 5 x 75 ml EtOAc. Smíšené organické extrakty se promyjí 5 x 75 ml>IN HC1, 75 ml vody a 25 ml nasyceného vodného roztoku MaCl a koncentrují se. Zbytek se pak přečistí rychlou chromatografií (1 cm x 15 cm oxid křemičitý se surovým materiálem preabsorbovaným na vložce 1 cm χ 1 cm Ma₂S0^·). Produkt se eluuje s 1¾ CH^OH v CH₂C1₂, čímž vznikne 50 mg (47 %) výsledné sloučeniny. Analyticky čistý vzorek se získá frakcionovanou precipitací z přibližně 25¾ CH-jOH v CH₂C1₂ Domalým chlazením a koncentrací pod proudem dusíku.

IR (KBr) 3400, 3100, 2950, 1755, 1660, 1600 cm^-1.

¹H-MMR (CCljD/CDjOO): 1,04 (t, 3, 0 = 7 Hz, C18), 1,96 (d,

2, 0 = 7 Hz, C19), 5,32 (d, 1, 0 = 14 Hz, C17), 5,33 (s, 2, C5), 5,63 (d, 1, 0 = 14 Hz, C17), 7,50 (d, 1, 0 = 9 Hz, Cil),

7,67 (s, 1, C14), 3,33 (d, 1, 0 = 9 Hz, C12), 9,34 (s, 1, C7).

I

Analýza pro H₂0 (mol.hmotnost'= 410,33) vypočteno C 61,46, H 4,42, N 6,83 ¾ nalezeno C 61,09, H 4,17, II 6,52

T 63

Příklad 10

Výroba soli (2QS)-9-cyklopropylaminomethyl-10-hydroxycamtothecinu

Směs 254 mg, 0,7 mmol 10-hydroxycamptothecinu připraveného jak popsáno v příkladu 2, 1,0 ml, 37% vodného formaldehydu, 400 mg, 0,7 mmol cyklopropylaminu v 16 ml ledové kyseliny octové a 8 ml ethanolu se přes noc míchá při teplotě místnosti a koncentruje se ve vakuu do sucha. Zbytek se trituruje s vodou, filtruje se a suší, čímž vznikne 260 mg (75% výtěžek) zmíněné sloučeniny jako její acetátová sůl, která se přemění ve zmíněnou hydrochloridovou sůl triturací s 0,1 H HC1. *

Analýza pro C24H23N3Q5.HCl.3H2O vypočteno C 55,01, H 5,57, N 8,02 % nalezeno C 54,94, H 5,18, N 8,18 %.

¹H-NMR (0₂0); 0,96 (m, 7), 2,1 (m, 2), 2,8 (m, 1), 4,6 (s, 2),

4,3 (s, 2), 5,2 (s, 2), 7,2 (s, 1), 7,5 (q, 2), 3,6 (s, 1).

r

Příklad 11

Výroba (2OS)-9-ethoxymethyl-10-hydroxycamptothecinu

Směs 364 mg, 1,0 mmol 10-hydroxycamtothecinu připraveného jak posáno v příkladu 2, 90 mg, 1,1 mmol dimethylaminohydrochloridu a 1,5 ml 37% vodného fprmaldehydu se zahřívá pod zpětným chladičem ve 25 ml 95% ethanolu 5,5 hodiny. Reakční směs se koncentruje na malý objem a precipitovaný produkt se >

shromáždí a suší. Přečištění silikagelovoň chromatografií elucí s 3% MeOH v CH₂Cl2 poskytne 35 mg (20% výtěžek) výsledné sloučeniny.

FA3 spektrum: m/e 423 (MH⁺).

¹H-MMR (DM50): 0,35 (t, 3), 1,1 (t, 3), 1,9 (m, 2), 3,5 (s, 2), 4,3 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,2 (s, 1),

7,7 (ni, 2), 3,6 (s, 1).

Abalýza pro ^C23^H22^fl2°6 vypočteno nlezeno

C 62,03, H 5,27, 0 61,80, H 5,22, fl 6,29 % N 6,12 %.

Příklad 12

Výroba (20S)-9-(H-methylanilinorcethyl)-10-hydroxycamtotnecinu

Směs 254 mg, 0,7 mřnol 10-hydroxycamtothecinu vyrobeného jak popsáno v příkladu 2, 1,0 ml 37% vodného formaldehydu, 0,75 ml, 0,7 mmol fl-methylanilinu v 16 ml ledová kyseliny octové a 8 ml ethanolu se míchá 40 hodin při teplotě místnosti. Po koncentraci na olej, částečné přečištění se získá silikagelovou chromatografií elucí 1,2 a 3% MeOH v CH₂C1₂. Frakce produkce stále ještě obsahují v methylanilin. Oalšího přečištění se dosáhne užitím silikagelového MPLC sloupce a produkt se eluuje s 2% MeOH v CH₂C1₂· Frakce produktu se smí sí a koncentrují se ve vakuu, čímž vznikne 77 mg (24 %) výsledné sloučeniny jako žluté pevné látky.

DCI-spektrum: m/e 434 (MH⁺).

¹H-HMR (CDC1₃): 1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 2,3 (s, 3), 5,0 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,5 (q, 2), 6,9 (m, 5-), 7,5 (s, 1),

7,9 (q, 2), 3,4 (s, 1).

Analýza pro ^C23^H25^W3°5*¹’² H₂0 vypočteno C 66,53, H 5,74, N 3,32 % { nalezeno C 66,97, Η 5;69, M 7,91 %.

&

Příklad 13

Výroba hydrochloridové soli (20S)-9-cyklohexylaminomethy1-10-hydroxycamptothecinu

Směs 364 mg, 1,0 mmol 10-hydroxycamptothecinu připraveného podle popisu v příkladu 2, 1,5 ml, 37¾ vodného formaldehydu, 1,3 ml, 10 mmol cyklohexylaminu ve 25 ml ledová kyseliny octové a 12 ml ethanolu se přes noc míchá při teplotě místnosti a koncentruje se ve vakuu do sucha. Zbytek se přečistí na MPLC sloupci v reversní fázi elucí s 15¾ vodným MeOH obsahujícím 0,02 % ledové kyseliny octové. Po koncentraci na malý objem a lyofilizaci se získá výsledná sloučenina jako acetátová sůl (250 mg, 47 %).- Acetátová sůl se přemění na výslednou hydrochlorídovou sůl přidáním 0,lN HC1 a sj/ůl se shromáždí filtrací..

1_h-NMR (OMSO): 0,9 (t, 3), 1,0 - 2,0 (m, 10), 3,1 (s, 1),

4,5 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,2 (s, 1), 7,9 (q, 2),

8,9 (s, 1).

Analýza pro C₂₇H_2gN₃0₅.HCl. 1,5 H₂Q vypočteno C 60,93, H 6,11, N 7,39 % nalezeno C 60,83, H 5,93, N 7,75

Příklad 14

Výroba hydrochloridové soli (23S)-9-N,[l-dimethylaminoethyloxymethyl-10-hydroxycamptothecinu

Směs 100 mg, 0,2 mmol vodné baze 9-dimethylaminomethyl-10-hydroxycamptothecinu připravené jak po.psáno v příkladu 21, í

ve 4 ml 2-dimethylaminoethanolu obsahu jícícho, tři kapky 3N HC1 se zahřívá pod argonem při 30 °C po 24 hodin. Ha polopevnou reakční směs se působí 5 m vody a 10 ml isopropanolu, míchá se a filtruje, čímž vznikne 60 mg (59 %) výsledné sloučeniny.

¹H-NMR (DMSO): 0,9 (t, 3), 1,35 (m, 2), 2,3 (s, 6), 3,3 (s,

2), 4,1 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,3 (s, 1), 7,4 (d, 1), t

3,0 (d, 1), 8,7 (s, 1).

Analýza pro ^C25^(I27^N3°6'^HCÍ·'⁰ ’ ⁵ 1^0 vypočteno' C 53,77, H 5,72, II 3,25 % nalezeno C 53,94, H 4,92, N 7,90 %.

Příklad 15

Výroba hydrochloridové soli (20S)-9-N,N-dimetnylaminoethylthiomethy1-10-hydroxycamptothecinu

Směs 100 mg, 0,2 mmol hydrochloridové soli 9-dimethyl-10-hydroxycamptothecinu připraveného v podstatě jako v příkladu 18, a 560 mg, 4 mmol 2-dimethylaminoethanthiol-HCl ve 13 ml OMF se zahříváina 35 °C pod argonem 5 hodin.Nerozpustná pevná látka (přebytek thiolu) se odstraní filrací a filtrát se ve vakuu koncentruje na olejovitý zbytek, který se přečistí s užitím MPLC v reversní fázi. Produkt se sluuje s užitím 5% a 10% MeOH ve vodě, čímž vznikne 45 mg (41 %) výsledná sloučeniny jako žluté pevné látky.

¹H-flMR (020): 1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 2,3 (s, 6), 4,4 (s, 2),

5,3 (s, 2), 7,1 (d, 1), 7,2 (s, 1), 7,6 (d, 1), 8,2 (s, 1).

Analýza pro ^C25^H23^I'^,3°5^S*’⁵ H₂0 vypočteno C 49,34, H 5,79, lí 6,90 % nalezeno C 48,93, H 5,32, N 6,54 %.

Příklad 16

Výroba dihydrochloridové soli (20S)-9-N,ií-dimethylaminoethylaminomethyl-10-hydroxycamptothecinu

I i *

Směs 364 mg, 1,0 mmol 10-hydroxycamptothecinu připraveného jak popsáno v příkladu 2, 100 mg, 1,1 mmol N,N-dimethylethylendiaminu, 1,5 ml 37% vodného formaldehydu ve 25 ml ledové kyseliny octové a 10 ml ethanolu se míchá při teplotě místnosti.64 hodin. Rozpouštědlo se ve vakuu odstraní a na pevný zbytek se působí 10 ml vody a 10 ml isopropanolu obsa-« hujícíno 3 ml 3M HC1. Konečně precipitovaná pevná látka se shromáždí, promyje se isopropanolem a suší se, čímž vznikne 213 mg (40%-výtěžek) výsledná sloučeniny.

1_h-ÍJMR (C0₃00): 1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 2,9 (s, 6), 4,5 (s, 2), 5,1 (m, 4), 5,4 (q, 2), 7,3 (d, 1), 7,5 (s, 1),

7,3 (d, 1), 8,4 (s, 1).

Analýza pro ^C25^H28^N4°5’ vypočteno C 55,37, H 5,63, U-10,42 % nalezeno C 55,91, H 5,72, M 9,36 %.

Příklad 17

Výroba acetátové soli (20R,S)-9-dimethylaminomethyl-10-hydroxycamptothecinu

Výsledná sloučenina se vyrobí jak popsáno v příkladu 3 s výjimkou, že výchozí materiál je racemický 10-hydroxycamtoth^cin připravený podle metody Wani a další, J. Med. Chem., 23, 554 (1980).

Příklad 13

Výroba monohydrochloridové soli (20S)-9-dimethylaminoethyl-lO-hydroxycamptothecinu

Acetátová sůl 9-dimethylaminomethyl-10-hydroxycamtothecinu připraveného jak popsáno v příkladu 3, která byla analyzována na 2,5 ekvivalentů kyseliny octována 0,75 ekvivalentů vody (8,5 g, 14,5 mmol založeno na molekulární hmotnosti 585) se rozpustí ve 170 ml, 17 mmol 0,lN kyselině chlorovodíkové, lyofilizuje se a pumpuje se pod vysokým vakuem po 3 dny, čímž vznikne 3,3 g výsledné sloučeniny.

¹H-NMR (CDC1₃/CD₃00): 0,5 (t, 3, 0 = 7,5), 1,93 (q, 2, 3 =

7,5 Hz), 2,95 (s, 6), 4,77 (s,2), 5,33 (s, 2), 5,36 (d, 1, 3 = 16 Hz), 5,62 (d, 1, 3 = 16 Hz), 7,59 (d, 1, 3 = 9 Hz), 7,66 (s, 1), 3,20 (d, 1, 3 = 9 Hz), 3,36 (s, 1).

Analýza pro 0₂₃Η₂₃Ν₃0₅.1HC1.3H₂0 vypočteno C 53,96, H: 5,91, N 3,21, Cl 6,92 % nalezeno:. C 53,63, H 5,61, N 3,16, Cl 6,34 %.

Příklad 19

Výroba dihydrochloridové soli (20S)-9-dimethylaminomethyl-10-hydroxyoamtothecinu

0,339 g, 1,07 mmol podle HPLC analogy, acetátové soli 3-dimethylaminomethyl-10-hydroxycamptothecinu připravené jak popsáno v příkladu 3 se rozpustí v 6 ml, 2,4 mmol 0,4N HC1, lyofilizuje se a pumpuje pod vysokým vakuem 40 hodin, čímž vznikne 0,269 g výsledné sloučeniny.

¹H-NMR (CDC1₃/CD₃OO): 1,05 (t, 3, 7 = 7,5 Hz), 1,92 (q, 2, = 7,5 Hz), 3,01 (s, 6), 4,85 (s, 2), 5,31 (d, 1, 3 = 16 Hz),

5,36 (s, 2), 5,65 (d, 1, J = 16 Hz), 7,64 (d, 1, 3 = 9 Hz),

7,73 (s, 1), 8,23 (d, 1, 3 = 9 Hz), 9,07 (s, 1).

Analýza pro vypočteno nalezeno ^C23^H23^H3°2*^2HC1·^{3 H}2°

C 50,37, H 5,70, N 7,66, Cl 12,93 % C 50,76, H 5,64, N 7,57, Cl 12,61 %.

Příklad 20

Výroba sodné soli (20S)-9-dimethylaminomethyl-10-hydrodxycaraptothecinu

Na 100 mg, 0,2 mmol acetátové soli 9-dimethylaminomethyl-10-hydroxycamptothecinu připraveného jak popsáno v příkladu se působí 4,5 ml, 0,45 mmol 0,lN hydroxido.tsodného a roztok

- 69 se nechá projít přes H-20 pryskyřicový sloupec (2 x 22 cm). Pryskyřice se promyje 253 ml vody a produkt se eluuje .1 :íl směsí vody a methanolu. Frakce obsahující produkt se smísí, koncentrují se na malý objem a lyofilizují se, čímž vznikne 93 mg (93 %) výsledné sloučeniny.

IR (nujol) 1630 cm’^, (karboxylát).

¹H-I1!'IR (D₂Q): 0,65 (m, 3), 1,0 (m, 2), 2,3 (s, 6), 3,0 (m,

2), 4,21 (s, 2), 4,5 (s, 2), 7,1 (q, 2), 7,2 (s, 1), 7,3 (s, 1).

Analýza pro C₂jH₂₄N₃0₆Ua.l,5 H₂0 vypočteno C:56;55, H 5,57, N 3,60 % nalezeno C 56,21, H 5,65, N 8,44 %.

Příklad 21

Výroba volné baze (20S)-9-dimethylaminomethyl-10-hydrox5í·* camptothecinu

Směs 723 mg, 2,0 mmol 10-hydroxycamptothecinu připraveného jak popsáno v příkladu 2, v 50 ml.ledové kyseliny octová, 20 ml ethanolu, 3 ml 37% vodného formaldehydu a 3 ml 40% - ----·vodného dimethylaminu se míchá za teploty místnosti 20 hodin. Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku, zbytek se zahřívá na 50 °C pod vysokým vakuem 2 hodiny a trituruje 10 ml isopropanolu, aby precipitovalo 561 mg (64 %) výsledné sloučeniny jako žlutá pevná látka. FA3 hmotové spektrum: m/e 422 (MH⁺).

¹H-Hi4R (COClj/COjOQ): 1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 2,5 (s, 6),

4,3 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (q, 2), 7,6 (β, 1), 7,7 (q, 2),

3,5 (s, 1). >

i

Příklad 22

Výroba trifluormethylsulfonátu(triflát) (20S)-10-hydroxycamptothecinu

Ke směsi 1,44 g, 4,0 mmol 10-hydroxycamptothecinu připraveného jak popsáno v příkladu 2, ve 40 ml DMF se přidá

1,2 g, 12 mmol trietnylaminu a potom se přidá 2,0 g, 6 mmol N-fenyltrifluormethansulfonimidu. Reakční smšs se zahřívá při 50 °C 3 dny. Rozpouštědlo se ve vakuu odstraní a zbytek se trituruje vodou, filtruje se a suší. Teoretický výtěžek surového produktu se získá jako jediná skvrna chromatografii na tenké vrstvě (TLC) vykazující něco původních nečistot.

Malý vzorek sepřečistí fychlou chromatografii na silikagelavém sloupci elucí produktu 2% MeOH v CII₂C1₂.

¹H-riMŘ (CDClj): 1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 5,3 (s, 2), 5,4 (q, 2), 7,7 (s, 1), 7,6 - 7,9 (m, 2), 8,2 (d, 2), 3,5 (s, 1). \

FA3 hmotové spektrum m/e 497 (MH⁺), 495 (M-H)“ . · '

Analýza pro ^C21⁹15^M2^9F3 vypočteno C-’50,81, H 3,05, N 5,64 % nalezeno C 51,33, H 3,42/ N 4,99 %.

Příklad 23

Výroba (205)-9-dimethylaminomethylcamptothecinu

Acetátová sůl trifluormethansulfonát (20S)-9-dimethylaminomethyl-10-hydroxycamptothecinu se připraví in šitu jak následuje. Na směs 482 mg, 1 mmol acetátové soli 9-dimethylaminomethyl-10-hydroxycamtothecino připravené jakrpopsáno v příkladu 3 ve 40 ml N,N-dimethylformamidu (OMF) pod argonem se působí 263 mg, 2,5 mmol 2,6-lutidinu a 0,54 g, 1,5 mmol

N-fenyltrifluormethansulfonamidu. Reakční smšs se přes noc míchá při teplotě místnosti. Pak se ke svrchu vytvořenému ;

i

Se i

filtrátu přidá 0,4 ml, 3,0 mmol triethylaminu, 3 mg, 0,04 mmol paladiumacetátu, 20 mg, 0,03 mmol trifenylfosfinu a 0,03 ml koncentrované kyseliny mravenčí. Reakční směs se 3 hodin zahřívá při 60 °C. Rozpouštědlo se ve vakuu odstraní a zbytek se trituruje malým množstvím vody a filtruje se. Sušená, surová nerozpustná pevná látka měla hmotnost 550 mg. Přečistí se rychlou chromatografií na silikagelovém sloupci elucí malým množstvím výchozího triflátu s trifenylfosfátem k získání 25 mg (7¾) 9-methylcamptothecinu, 33 mg (20¾) výsledné sloučeniny jako volné baze (4¾ MeOH 9 CH₂C1₂) a nějaký trifluormethylsulfonát 10-hydroxycamptothecinu s 10¾ MeOH v CH₂C1₂· Malé množství výsledné sloučeniny se přemění na acetátovbu sůl působením zředěné kyseliny octové.

* ¹H-HMR (COC1₃): 0,9 (t, 3), 1,3 (m, 2), 2,2 (s, 6), 3,7 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (q, 2), 7,3 (d, 1), 7,5 (d, 1),

7,6 (2,1), 8,0 (d, 1), 3,3 (s, 1).

Hmotové spektrum m/e 406 (MH³⁰)·

Analýza pro ^25^Η27^ί!3³6’²’^^H2° vypočteno C53,81, H 6,12, N 8,23 h nlezeno C 53,60, H 5,88, N 7,83 %.

Příklad 24

Výroba 10-kyanocamptothecinu

Roztok 444 mg, 1,4 mmol tributylcínkyanidu a 276 mg,

0,6 mmol tetrakistrifenylfosfinpaladia ve 20 ml 1,2-dichlorethanu se zahřívá pod zpětným chladičem pod argonem 2 hodiny k vytvoření paladiumcín-kyanidového komplexu. Pak se 266 mg, 0,6 mmol trifluormethylsulfonátu 10-hydroxycamptothecinu, připraveného jak popsáno v příkladu 22. Přidá a zahřívá pod zpětným chladičem a zahřívání pod zpětným chladičem pokračuje po 3,5 hodiny. Reakční směs se koncentruje na třetinu svého původního objemu a trituruje se se stejným objemem diethyl72 etheru. Precipitovaná žlutá pevná látka se shromáždí a suší se. Výsledná sloučenina se získá v 82¾ surovém výtěžku 133 mg.

Po přečištění rychlou chromatografii, výsledná sloučenina eluovala s 2¾ MeOH v 3 získá se 115 mg.

¹H-NMR (CDClj): 0,9 (t, 3), 1,3 (m, 2), 2,2 (s, 6), 3,7 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (q, 2), 7,3 (d, 1), 7,5 (d, 1),

7_?6 (2, 1), 3,0 (d, 1), 3,3 (s, 1).·

Hmotové spektrum m/e 406 (MH³³).

Analýza pro ^C25^H27^N3°6* ²*^5H2° vypočteno C 53,31, H 6,12, M 3,23 ¾ nalezeno C 53,60, H 5,33, N 7,33 %.

Příklad 25

Výroba (20S)-10-formylcamptothecinu

Plamenem vysušená baňka se naplní 100 mg, 0,22 mmol trifluormethylsulfonátu lQ-hydroxycaraptothecinu, připraveného jalj:. popsáno v příkladu 22, 10 ml čerstvě destilovaného tetrahydrofuranu (THF) a 10 mg , 9 mmol tetrakistrifenylfosfinpaladia. Oxid uhelnatý (CO) se bublá do reakční směsi 3 minuty a pak se reakční směs uzavře CO balonem a ponoří se v olejové lázni při 50 °C. Za míchání a použití ruční pumpy se po kapkách přidá roztok 0,73 ml Br^SnH ve 3 ml bezvodého THF v průběhu čtyřhodinového období. Po této době se ve vakuu odstraní rozpouštědlo a zbytek se přečistí rychlou chromatografii (1 až 2¾ CH^QH, CH2CI2), následovanou konečnou purfiltrací s užitím chromatotronu (Harrison Research, Palo Alto,Californie). Výsledná sloučenina eluovaná s 2¾ MeOH v CH2CI2 měla 20 mg (24 Hmotové spektrum m/e 377 (MH⁺).

l_}rMMR (CDC1₃): 9P.9 (t, 3), 1,9 (m, 2), 5,3 (split s, 2),

5,'4 (q, 2), 7,7 (d, 1), 7,3 - 3,3 (m, 3), 8,5 (s, 1), 9,9 (s, 1).

Analýza pro ^1^16 ^2°5* ¹ vypočteno C61,34, H 4,69, N 6,86 % nalezeno C 61,33, H 4,53, N 6,37 %.

Příklad 26

Výroba acstátové soli (20S)-10-aminomethylcamptothecinu »

Na roztok 160 mg, 0,4 mmol 10-kyanocamptothecinu, připraveného jak popsáno v příkladu 24, ve 45 ml ledové kyseliny octové se působí aktivovaným Raneylovým niklem a hydrogenuje se při 0,07 mPa (1735,8 g/cm) po:7 hodin. Katalyzátor se odstraní filtrací přes supercel a filtrát se ve vakuu koncentruje. Pevný zbytek se přečistí chromatografií při středním tlaku na sloupci v reversní fázi elucí produktu 10 % MeQH ve vodě. Po sušení mrazením se získá 25 mg (15 %) hygroskopické výsledné sloučeniny.

¹H-NMR (D₂0): 1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 4,3 (s, 2), 5,2 (s, 2),

5,4 (s, 2), 7,5 (s, 1), 7,7 - 8,1 (m, 3), 8,6 (s, 1).

1'

Analýza pro C₂-jH₂jN₃0₆.6H₂0 vypočteno C 50,63, H 6,46, N 7,73 % nalezeno C 50,11, H 6,57, N 7,64 %.

*

Příklad 27

Výroba acetátové soli (20S)-10-aminomethylcamptothecinu

Na roztok 160 mg, 0,42 mmol 10-kyanocamptothecinu, přir í

praveného jak popsáno v příkladu 24, ve 45 ml ledové kyseliny octové se působí aktivovaným Raneyovým niklem a hydrogenuje se při 0,07 MPa (1735,8.g/cm) po 7 hodin. Katalyzátor se filtruje přes supercel (95% Si0₂), koncentruje se ve vakuu a ř

purifikuje ss na sloupci v reverzní fázi. Produkt eluoval v

10% MeOH H₂0, obsahující 0,02^:% kyseliny sírové. Po shromáždění frakcí, koncentruje na malý objem a lyofilizacl se získá 26 mg (14 %) výsledné sloučeniny.

¹H-;I;IR (0_?0/Me00₄): 1,0 (t,

5,2 (s, 2), 5,5 (s, 2), 7,5

3), 2,0 (m, 2), 4,3 (s, 2), (s, 1), 3,0 (m, 3), 3,6 (s, 1).

Analýza pro vypočteno nalezeno ^C23^fl23^f,3°6 0 50,53, H 6,46, C 50,11, H 6,57,

N 7,73 %

N 7,64 %.

Příklad 23

3,7 (m, 7,6 (s, Hmotové

Analýza

Výroba (20S)-9-morfolinomethylcamptothecinu

Na 1 mmol roztoku trifluormethylsulfonátu 10-hYdroxy-9-morfolinomethylcamptothecinu, připravený jak popsáno v příkladu 23, ve 25 ml bezvodého DMF se působí 0,4 ml triethylaminu, 3 mg, 0,03 mmol Pd (kyselina octová)₂, 20 mg, 0,03 mmol Φ^Ρ a 0,03 ml, 2 mmol 99% kyseliny mravenčí. Reakce se zahřívá poči argonem na 60 °C i 6 hodin; koncentruje se ve vakuu a působí se na ní vodou. Jak žádaná výhodná sloučenina, tak hlavní vedlejší produkt 9-methyleamptothecin vyprepicituje (300 mg) a shromáždí se filtrací, purifikací silikagelovou rychlou chromatografii. 9-methylcamptotnecin se isoluje elucí 1% MeOH v CH₂C1₂ (45 mg, 13 %). Eluce s 2% MeOH v CH₂C1₂ poskytne 93 mg (20 %) výsledné sloučeniny.

^XH-NMR (C0Cl₃/Me00₄): 1,0 (t, 3), 2,0 (m, 2), 2,5 (m, 4),

4), 4,0 (s, 2), 5,3 (š,2), 5',6 (q, 2), 7,5 (d, 1),

1), 7,7 (d, 1), 3,2 (d, 1), 9,0 (3, 1).

spektrum m/a 443 (MH⁺).

pro ^C25^H25^r,3°5.0,5 H₂Q vypočteno C 65,73, H 5,74, N 9,20 % nalezeno C 65,37, H 5,96, N 9,00 %.

i

Příklad 29

Výroba (20S) 10-hydroxy-9-kyanomethylcamptothecinu a

Směs 0,42 g, 0,3 mmol methansulfonátové soli 9-trimethylammoniummethy1-10-hydraxycamptothecinu, přípravná jak popsáno v příkladu 8 ve 35 ml 95% EtOH a 1,26 g, 25 mmol kyanidu sodného se zahřívá pod zpětným chladičem pod argonem- _k po 3 hodiny. Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu, přidá se 20ml vody a pH se upraví na pH 1,5 3H HC1. Precipitovaná surová pevná látka se shromáždí a suší. Přečištění se uskuteční rychlou silikagelovou chromatografií na sloupci. Produkt byl eluován se 4% a 5% MePH v CHgCl^» čímž poskytl 110 mg (33 %) výsledné sloučeniny.

¹H-NMR (CDC1₃/Me00₄): 0,9 (t, 3, 1,3 (m, 2), 4,2 (s, 2),.

5,2 (s, 2), 5,3 (q, 2), 7,5 (d, 1), 7,6 (s, 1), 7,9 (d, 1),

8,4 (s, 1).

Analýza pro ^C22^H17^M3⁰5’³’ ^H2° vypočteno C 60,75, H 4,53, N 9,66 % nalezeno C 60,63, H 4,64, N 9,60 %. ;

Příklad 30

Výroba acetátové soli (20S)-10-hydroxy-9-aminoethylcamptothecinu ;

t í

Ma roztok 60 mg, 0,15 mmol 10-hydroxy-9-kyanomethylcampto- * ‘ thecinu, připraveného jak popsáno v příkladu 29, ve 30 ml ledové kyseliny octová^se působí přibližně 1 g (vlhká hmotnost)

Raneyova niklu a hydrogenuje se při 0,07 MPa -(-1705,3 g7^,čm)~ ' hodin. Katalyzátor se odstraní filtrací a filtrát se koncentruje ve vakuu na pevný zbytek. Koncentrovaný filtrát se pak rozpustí ve vodě a čistí se chromatografií na sloupci v reversní fázi eluováním produktu 10% MeOH ve vodě (obsahující 0,02 % ledové kyseliny octové). Vhodná frakce se shromáž dí, koncentruje se na malý objem a mrazově suší pres noc s vý nosem 23 mg (33 %) výsledné sloučeniny.

¹H-NMR (DMS0-d₆): 0,9 (t, 3), 1,9 (m, 2), 3,2 (s, 2), 5,0 (3,2), 5,1 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,2 (s, 1), 7,5 (q, 2),

3,4 (s, 1).

III. Příklady farmaceutických přípravků

Příklad A

Parenterální přípravek

K přípravě parenterálního farmaceutického přípravku podle vynálezu vhodného pro aplikaci injekcí se 100 mg vs vodě rozpustné soli sloučeniny vzorce I smísí s 10 ml 0,9 %' sterilního roztoku NaCl a směs se naplní do vhodné dávkové jednotkové formy vhodné pro injekční aplikaci.

··

Příklad 3

Orální přípravek

K přípravě orálního farmaceutického přípravku podle vynálezu, 100 mg sloučeniny vzorce I se smísí se 750 mg laktosy a směs se naplní do orální dávkové formy, jako je tvrdá želatinová kapsle, která je vhodná pro perorální aplikaci.

Zastupuje:

Claims (17)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Camptothecinová sloučenina vzorce λΛ3Γ3° λ::3Η^;··'^λ αν^η jas kde

   X je hydroxyskupina, vodík, -CH₂NH₂ nebo formylová skupina, r

   R je vodík, když X je CH₂MH₂ nebo formylová skupina, nebo

   R je -CHO nebo -CH₂r\ když X je vodík nebo hydroxyskupina, r! j_e -o-R², -S-E², -CH₂NH₂, kyanoskupina, -N-R²(R^), nebo

   N⁺-R²(R³)(R⁴) za předpokladu, že když R¹ je -N⁺-R²(R⁵)(R^), sloučenina je spojena s farmaceuticky přijatelným anionem,

   R², R^ a R* jsou stejné nebo různé a jsou vybrány z H, alkylu s 1 až 6 atomy uhlíku, hydroxyalkylu se 2 až 6 atomy uhlíku, dialkylamino s 1 až 6 atomy uhlíku-alkylu se 2 až 6 atomy uhlíku, aminoalkylu se 2 až 6 atomy uhlíku nebo 3 až 7členný nesubstituovaný kařbocysklický kruh, a

   1 2 3 2 3 když R je -N-R (R ), R a R skupiny se mohou spolu spojit s atomem dusíku, ke kterému jsou vázány k vytvoření heterocyklickáho kruhu za předpokladu, že takový kruh je vybrán z morfolinového, N-methylpiperazinylového nebo 4 '-p-piperidinopiperidinového, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, hydrát nebo solvát.
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, ve kterém X je hydroxyskupina a R je dimethylaminomethylová, Π-morfolinomethylová, M-methylpiperazinylmethylová, (4 '-_pip_Sridin)-i'l-piperidinylmethylová, (2 -hydroxyethyl)aminometnylová, trimethylamoniummethylová, cyklohexylaminomethylová, Fl-metbylanilinomethylová, ethoxymethylová, cyklopropylaminomethylová, N,fl-dimethylaminoethyloxymethylová, fl,N-dimethylaminoethylthiomethylová, fl,il-dimethylaminoethylaminomethylová, kyanomethylová, aminoethylová nebo formylová skupina, nebo kde R je vodík a X je formylová nebo aminomethylová skupina, nebo kde X je vodík a R je dimethylaminomethylová nebo N-morfolinomethylová skupina.
3. 3. Sloučenina podle nároku 1, která je S-isomerem.
4. 4. Sloučenina podle nároku 1, která je racemátovou směsí.
5. 5. Sloučenina podle nároku 3, ve která X je hydroxyskupina a R je dimethylaminomethylová skupina.

   ιό. Sloučenina podle nároku 5, která je acetátovou solí.
6. 7. Sloučenina podle nároku 5, která je monohydrochlorid, dihydrochlorid nebo sodná sůl.

   3. Sloučenina podle nároku 3, ve které X je hydroxyskupina, a R je trimethylammoniummethylová skupina
7. 9. Sloučenina podle nároku 3, ve které X je hydroxyskupina a R je M-methylpiperazinylmethylová. skupina.
8. 10. Sloučenina podle nároku 3, ve které X je hydroxyskupina a R je N-methylanilinomethylová skupina.
9. 11. Sloučenina podle nároku 3, ve které C je hydroxyskupina a R je cyklohexylaminomethylová skupina.
10. 12. Sloučenina podle nároku 3, ve které X je hydroxysku- ‘ pina a R je Ν,ΙΙ-dimethylaminoethyloxymethylová skupina.
11. 13. Sloučenina podle nároku 3, ve které X je hydroxyskupina a R je kyanomethylová skupina. *
12. 14. Sloučenina podle nároku 3, v které X je hydroxyskupina a R je morfolinomethylová-skupina.
13. 15. Sloučenina podle nároku 3, ve které X je hydroxyskupina a R je aminomethylúvá skupina.

    »
14. 16. Sloučenina podle nároku 3, ve které X je hydroxyskupina a R je cyklopropylaminomethylová skupina.

    -· · i
15. 17. Farmaceutický přípravek, vyznačujícíse tím, že jako svou účinnou složku obsahuje účinný růst ná- ⁴ dobových buněk inhibující množství aktivní složky a inertního farmaceuticky přijatelného nosiče nebo ředidla, přičemž zrnině- í ný přípravek je užitečný k inhibici růstu zvířecích nádorových » buněk citlivých na aktivní složku a ve kterém aktivní složka je sloučenina vzorce kde

    X je hydroxyskupina, vodík, -CH₂NH₂, nebo formylová skupina ,

    R je vodík, když X je CH₂NH₂ nebo formylová skupina, nebo

    R je -CHO nebo -CH₂R^, když X je vodík nebo hydroxyskupina , r! je -0-r2, -S-R⁷, -CK₂?IH₂, kyanoskupina, -N-R^(R^) nebo

    -N⁺-r2(r3)(R⁴) za předpokladu, že když R^ je

    N⁺-r2(r3)(R⁴), sloučenina je spojena s farmaceuticky 2 3 4 přijatelným anionem, R ,R a R jsou stejné nebo různé a jsou vybrány z H, alkylu s 1 až 6 atomy uhlíku, hydroxyalkylu se 2 až 6 atomy uhlíku, dialkylamino s 1 až 6 atomy uhlíku alkylu se 2 až 6 atomy uhlíku, alkylamino s 1 až 6 atomy uhlíku alkylu se 2 až 6 atomy uhlíku, aminoalkylu se 2 až 6 atomy uhlíku nebo 3 až 7členného nesubstituovaného karbocyklického kruhu, a

    1 2 3 2 3 když R je -N-R (R ), R a R skupiny se mohou spolu spojit s atomem dusíku, ke kterému jsou vázány k vytvoření heterocyklického kruhu za předpokladu, že takový heterocyklický krUh je vybrán z morfolinového, N-methylpiperazinylového nebo 4'-piperidinopiperidinylového kruhu, nebo její farmatherapeuticky přijatelná sůl, hydrát nebo solvát.
16. 18. Príprav^podle nároku 17, vyznačující se tím, že X je hydroxyskupina a R je dimethylaminomethylová, N-morf olinome thy lová, N-methylpirazinylmethylová, (4*-piperidin)-M-piperidinylmethylová, (2'-hydroxyethyl)aminomethylová, trimethylammoniummethylová, cyklohexylaminomethylová, N-methy1 anilinomethylová, ethoxymethylová, cyklopropylaminomethylová,

    N, N-dimethylaminoethoxymethylová, N,N-dimethylaminoethylthiomethylová, N,N-dimethylaminoethylaminomethylová, kyanomethylová, aminoethylová nebo formylová skupina, nebo ve které X je vodík a R je dimethylaminomethylová nebo N-morfolinomethylová skupina.

    t

    81 yznačující

    19. Přípravek s e t í m, že je 20. Přípravek s e t í m, že je 21. Přípravek s e tí m, že X j methylová skupina.

    podle nároku 17, v

    S-isomerem.

    podle nároku 17, v racemickou směsí.

    podle nároku 17, v hydroxyskupina a yznačující yznačující je dimethylamino22. Přípravek podle nároku 21, vyznačující se tím, že je acetátovou solí.

    23. Přípravek podlé nároku 21, vyznačující se tím, že je monohydrochloridovou, dihydrochloridovou nebo sodnou solí.

    24. Přípravek podle nároku 17, vyznačující tím, že he v orální dávkové formě.

    25. přípravek podle nároku 17, v yznačující tím, že je v parenterální dávkové formě.

    26. Způsob inhibice růstu zvířecích nádorových buněk, vyznačující se tím, že jsou citlivé na sloučeninu vzorce kde

    X je hydroxyskupina, vodík, nebo formylová skupina,

    R je vodík, když X je Cř^íIH^ nebo formylová skupina, nebo R je -CHO nebo -Cí^R , když X je vodík nebo hydroxyskupina,

    R¹ je -Q-R~, -S-R*, -CH₉tlH₉, kyanoskupina, -U-R^(R^) nebo + 234 »

    -ii -R (R )(R ) za předpokladu, že když R je +2x3\/4\

    -N -R (R )(R ), sloučenina je spojena s farmaceuticky přijatelným anionem,

    2 3 4

    R , R a R jsou stejné nebo různé a jsou vybrány z H, alkylu s 1 až 6 atomy uhlíku, hydroxyalkylu se 2 až 6 atomy <

    uhlíku, dialkylamiňo s 1 až 6 atomy uhlíku alkylu se 2 až 6 atomy uhlíku, aminoalkylu se 2 až 6 atomy uhlíku nebo 3 až 7členného nesubstituovaného karboxyklického kruhu, a

    1 2 3 2 3 když R je -N-R (R ), R a R skupiny mohou být spojeny spolu s atomem dusíku, ke kterému jsou vázány k vytvoření heterocyklického kruhu za předpokladu, že takový heterocyklický kruh je'vybrán z morfolinového, N-methylpiperazinylového nebo 4*-piperidinopiperidinového kruhu, nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, hydrát nebo solvát, přičemž takový způsob tvoří aplikace zvířatům ovlivněným zmíněnými nádorovými buňkami, účinného, růst tumorových buněk inhibujícího množství takové sloučeniny.

    27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že X je hydroxyskupina a R je dimethylaminomethylová, fl-morfolinomethylová, N-methylpiperazinylmethylová, (4*-piperidinylmethylová, (2 -hydroxyethyDaminomethylová, trimethylammoniummethylová, cyklohexylaminomethylová, M-methylanilinomethylová, ethoxymethylová, cyklopropylaminomethylová, N,N-dimethylaminoethoxymethylová, M,M-dimethylaminoethylthlome thy 1 o vá , íi, M-dime thy laminoe thy lamí nome thy 1 o vá, kyanomathylová, kde

    X je hydroxyskupina, vodík, nebo formylová skupina,

    R je vodík, když X je CH,:1H₂ nebo formylová skupina, . * nebo R je -CHO nebo -CH₉R , když X je vodík nebo hydroi. « xyskuoina,
17. 19 9 9 3

    R je -0-R, -3-R, kyanoskupina, -!I-R’(R ) nebo

    -il+-R~(R)(R⁴) za předpokladu, že když R^3, je *

    -řl⁺-R²(R^)(R⁴), sloučenina je spojena s farmaceuticky přijatelným anionsm,

    2 3 4

    R , R a R jsou stejná nebo různé a jsou vybrány z H, alkylu s 1 až 6 atomy uhlíku, hydroxyalkylu se 2 až á atomy uhlíku, dialkylamiňo s 1 až 6 atomy uhlíku alkylu se 2 až 6 atomy uhlíku, aminoalkylu se 2 až 6 atomy, uhlíku nebo 3 až 7člannéno nesubstituovaného karboeyklickáho kruhu, a

    1 2 3 2 3 když R je -H-R (R ), R a R skupiny mohou být spojeny spolu s atomem dusíku, ka kterému jsou vázány k vytvoření heterocyklického kruhu za předpokladu, že takový heterocyklický kruh . je'vybrán z morfolinového, fl-methylpiperazinylováho nebo 4*-piperidinopiperidinového kruhu, nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, hydrát nebo solvát, * přičemž takový způsob tvoří aplikace zvířatům ovlivněným zmínčnými nádorovými buňkami, účinného, růst tumorových buněk inhibujíčího množství taková sloučeniny.