ES2312914T3 - Procedimiento para explorar librerias de presentacion en fagos con ligandos diferentes. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para seleccionar, de un repertorio de polipéptidos, una población de polipéptidos funcionales que se unen a un ligando diana en un primer sitio de unión y a un ligando genérico en un segundo sitio de unión, ligando genérico que puede unirse a miembros funcionales del repertorio independientemente de la especificidad del ligando diana, que comprende las etapas de: a) poner en contacto el repertorio con el ligando genérico y seleccionar los polipéptidos funcionales unidos al mismo; y b) poner en contacto los polipéptidos funcionales seleccionados con el ligando diana y seleccionar una población de polipéptidos que se unen al ligando diana; en el que los polipéptidos del repertorio son de la superfamilia de inmunoglobulinas.

Description

Procedimiento para explorar librerías de presentación en fagos con ligandos diferentes.

La presente invención se refiere a procedimientos para seleccionar repertorios de polipéptidos usando ligandos genéricos y diana. En particular, la invención describe un procedimiento para seleccionar repertorios de polipéptidos de anticuerpo con ligando genérico para aislar subconjuntos funcionales de los mismos.

Introducción

El dominio de unión a antígenos de un anticuerpo comprende dos regiones separadas: un dominio variable de las cadenas pesadas (V_{H}) y un dominio variable de las cadenas ligeras (V_{L}: que puede ser V_{\kappa} o bien V_{\lambda}). El propio sitio de unión a antígenos está formado por seis bucles polipeptídicos: tres del dominio V_{H} (H1, H2 y H3) y tres del dominio V_{L} (L1, L2 y L3). Se produce un repertorio primario diverso de genes de V que codifican los dominios V_{H} y V_{L} mediante el reordenamiento combinatorio de los segmentos de genes. El gen de V_{H} se produce mediante la recombinación de tres segmentos de genes, V_{H}, D y J_{H}. En los seres humanos, hay aproximadamente 51 segmentos funcionales de V_{H} (Cook y Tomlinson (1995) Immunol Today, 16: 237), 25 segmentos funcionales de D (Corbett et al. (1997) J. Mol. Biol., 268: 69) y 6 segmentos funcionales de J_{H} (Ravetch et al. (1981) Cell, 27: 583), dependiendo del haplotipo. El segmento de V_{H} codifica la región de la cadena polipeptídica que forma los bucles de unión a antígenos primero y segundo del dominio V_{H} (H1 y H2), mientras que los segmentos de V_{H}, D y J_{H} se combinan para formar el tercer bucle de unión a antígenos del dominio V_{H} (H3). El gen de V_{L} se produce mediante la recombinación de sólo dos segmentos de genes, V_{L} y J_{L}. En los seres humanos, hay aproximadamente 40 segmentos funcionales de V_{\kappa} (Schäble y Zachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 1001), 31 segmentos funcionales de V_{\lambda} (Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220; Kawasaki et al. (1997) Genome Res., 7: 250), 5 segmentos funcionales de J_{\kappa} (Hieter et al. (1982) J. Biol. Chem., 257: 1516) y 4 segmentos funcionales de J_{\lambda} (Vasicek y Leder (1990) J. Exp. Med., 172: 609), dependiendo del haplotipo. El segmento de V_{L} codifica la región de la cadena polipeptídica que forma los bucles de unión a antígenos primero y segundo del dominio V_{L} (L1 y L2), mientras que los segmentos de V_{L} y J_{L} se combinan para formar el tercer bucle de unión a antígenos del dominio V_{L} (L3). Se cree que los anticuerpos seleccionados de este repertorio primario son suficientemente diversos como para unirse a casi todos los antígenos con al menos afinidad moderada. Los anticuerpos de alta afinidad se producen mediante "maduración de la afinidad" de los genes reordenados, en los que se generan mutaciones puntuales y se seleccionan por el sistema inmunitario partiendo de la base de la unión mejorada.

El análisis de las estructuras y las secuencias de los anticuerpos ha demostrado que cinco de los seis bucles de unión a antígenos (H1, H2, L1, L2, L3) poseen un número limitado de conformaciones de cadena principal o estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877). Las conformaciones de cadena principal se determinan mediante (i) la longitud del bucle de unión a antígenos, y (ii) residuos particulares, o tipos de residuos, en ciertas posiciones clave en el bucle de unión a antígenos y en la región de entramado de los anticuerpos. El análisis de las longitudes de los bucles y de los residuos clave ha permitido predecir las conformaciones de cadena principal de H1, H2, L1, L2 y L3 codificadas por la mayor parte de las secuencias de anticuerpos humanos (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220). Aunque la región H3 es mucho más diversa en lo que se refiere a la secuencia, la longitud y la estructura (debido al uso de los segmentos de D), también forma un número limitado de conformaciones de cadena principal para longitudes de bucle cortas que dependen de la longitud y de la presencia de residuos particulares, o de los tipos de residuo, en posiciones clave en el bucle y en la región de entramado de los anticuerpos (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1).

Un análisis similar de la diversidad de las cadenas laterales en las secuencias de anticuerpos humanos ha permitido la separación del patrón de diversidad de secuencias en el repertorio primario a partir del creado mediante hipermutación somática. Se encontró que los dos patrones son complementarios: la diversidad en el repertorio primario se centra en el centro de la unión a antígenos mientras que la hipermutación somática extiende la diversidad a regiones en la periferia que están altamente conservadas en el repertorio primario (Tomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol., 256: 813; Ignatovich et al. (1997) J. Mol. Biol, 268: 69). Esta complementariedad parece haber evolucionado como una estrategia eficaz para la búsqueda de espacio de las secuencias, dado el número limitado de células B disponibles para la selección en cualquier momento dado. Así, los anticuerpos se seleccionan en primer lugar del repertorio primario basándose en la diversidad en el centro del sitio de unión. Entonces se permite que la hipermutación somática optimice los residuos en la periferia sin romper las interacciones favorables establecidas durante la respuesta primaria.

La reciente llegada de la tecnología de presentación en fagos (Smith (1985) Science, 228: 1315; Scott y Smith (1990) Science, 249: 386; McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552) ha permitido la selección in vitro de anticuerpos humanos frente a una amplia variedad de antígenos diana de librerías de una "única etapa". Estas librerías de fagos-anticuerpos pueden agruparse en dos categorías: librerías naturales que usan genes de V reordenados recogidos de células B humanas (Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581; Vaughan et al. (1996) Nature Biotech., 14: 309) o librerías sintéticas mediante las cuales se "reordenan" in vitro segmentos de genes de V de la línea germinal (Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97) o en las que se incorporan CDR sintéticas en un único gen de V reordenado (Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457). Aunque las librerías sintéticas ayudan a superar las desviaciones inherentes del repertorio natural que pueden limitar el tamaño eficaz de las librerías de fagos construidas a partir de genes de V reordenados, requieren el uso de cebadores de PCR degenerados largos que introducen frecuentemente deleciones de pares de bases en los genes de V unidos. Este alto grado de aleatorización también puede conducir a la creación de anticuerpos que no pueden plegarse correctamente y que, por tanto, tampoco son funcionales. Además, los anticuerpos seleccionados de estas librerías pueden expresarse muy escasamente y, en muchos casos, contendrán mutaciones de la región de entramado que pueden afectar a la inmunogenicidad de los anticuerpos cuando se usan en la terapia de seres humanos.

Recientemente, en una ampliación del enfoque de las librerías sintéticas (documento WO97/08320, Morphosys) se ha sugerido que las regiones de entramado de los anticuerpos humanos pueden optimizarse previamente sintetizando un conjunto de "genes maestros" que tienen secuencias de la región de entramado consenso e incorporan sustituciones de aminoácidos mostradas para mejorar el plegamiento y la expresión. Entonces se incorpora la diversidad en las CDR usando oligonucleótidos. Dado que es deseable producir anticuerpos humanos artificiales que no se reconozcan como extraños por el sistema inmunitario humano, el uso de regiones de entramado consenso que, en la mayoría de los casos, no corresponden a ninguna región de entramado natural, constituye una desventaja de este enfoque. Además, dado que es probable que la diversidad de CDR también tendrá un efecto en el plegamiento y/o en la expresión, es preferible optimizar el plegamiento y/o expresión (y eliminar cualquier desplazamiento del marco de lectura o codones de terminación) una vez que el gen de V se ha unido completamente. Para este fin, sería deseable tener un sistema de selección que pudiera eliminar los miembros de la librería no funcionales o escasamente plegados/expresados antes de que se lleve a cabo la selección con el antígeno diana.

Un problema con las librerías de la técnica anterior es que, dado que la conformación de cadena principal es heterogénea, la obtención de modelos estructurales tridimensionales es difícil debido a que puede que no se disponga de los datos cristalográficos de alta resolución adecuados. Esto constituye un problema particular para la región H3, en la que la inmensa mayoría de los anticuerpos derivados de las librerías de anticuerpos naturales o sintéticas tienen una longitud media o bucles largos y, por tanto, no pueden obtenerse modelos.

Además, Chemical Abstracts 128(20), 1998, nº 242750 y Eur. J. Immunol, 27(5), páginas 1221-1228 (1997) describen polidactilo (auto) y procedimientos para su uso en exploración.

Sumario de la invención

Según el primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para seleccionar, de un repertorio de polipéptidos, una población de polipéptidos funcionales que se unen a un ligando diana en un primer sitio de unión y a un ligando genérico en un segundo sitio de unión, ligando genérico que puede unirse a miembros funcionales del repertorio independientemente de la especificidad del ligando diana, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto el repertorio con el ligando genérico y seleccionar los polipéptidos funcionales unidos al mismo; y

b) poner en contacto los polipéptidos funcionales seleccionados con el ligando diana y seleccionar una población de polipéptidos que se unen al ligando diana, en el que los polipéptidos del repertorio son de la superfamilia de inmunoglobulinas.

La invención proporciona en consecuencia un procedimiento mediante el cual se preselecciona un repertorio de polipéptidos, según la funcionalidad tal como se determina mediante la capacidad para unirse al ligando genérico, y el subconjunto de polipéptidos obtenido como resultado de la preselección se emplea entonces para otras rondas de selección según la capacidad para unirse al ligando diana. Aunque, en una realización preferida, el repertorio se selecciona en primer lugar con el ligando genérico, resultará evidente para un experto en la técnica que el repertorio puede ponerse en contacto con los ligandos en el orden opuesto, es decir, con el ligando diana antes que con el ligando genérico.

La invención permite que la persona experta en la técnica elimine, de un repertorio de polipéptidos elegido, aquellos polipéptidos que no son funcionales, por ejemplo como resultado de la introducción de mutaciones por desplazamiento del marco de lectura, codones de terminación, mutantes de plegamiento o mutantes de expresión que no podrían o no pueden unirse sustancialmente a ningún ligando diana. Tales mutantes no funcionales se generan mediante la aleatorización normal y diversos procedimientos empleados en la construcción de los repertorios de polipéptidos. Al mismo tiempo, la invención permite que la persona experta en la técnica enriquezca un repertorio de polipéptidos elegido para aquellos polipéptidos que son funcionales, se pliegan bien y se expresan altamente.

Preferiblemente, se obtienen dos o más subconjuntos de polipéptidos de un repertorio mediante el procedimiento de la invención, por ejemplo, explorando previamente el repertorio con dos o más ligandos genéricos, o poniendo en contacto el repertorio con el/los ligando(s) genérico(s) en diferentes condiciones. Ventajosamente, los subconjuntos de polipéptidos así obtenidos se combinan para formar otro repertorio de polipéptidos, que puede explorarse además poniéndolo en contacto con ligandos diana y/o genéricos.

Preferiblemente, la librería según la invención comprende polipéptidos de anticuerpo o polipéptidos de receptores de células T. Ventajosamente, la librería puede comprender dominios de inmunoglobulinas individuales, tales como los dominios V_{H} o V_{L} de anticuerpos, o los dominios V_{\beta} o V_{\alpha} de receptores de células T. En una realización preferida, por tanto, pueden explorarse previamente de manera individual repertorios de, por ejemplo, polipéptidos de V_{H} y V_{L} usando un ligando genérico y luego combinándolos para producir un repertorio funcional que comprende ambos polipéptidos V_{H} y V_{L}. Un repertorio de este tipo puede explorarse luego con un ligando diana con el fin de aislar polipéptidos que comprenden ambos dominios V_{H} y V_{L} y que tienen la especificidad de unión
deseada.

En una realización ventajosa, el ligando genérico seleccionado para su uso con repertorios de inmunoglobulinas es un superantígeno. Los superantígenos pueden unirse a moléculas de inmunoglobulina funcionales, o subconjuntos de los mismos que comprenden conformaciones de cadena principal particulares, independientemente de la especificidad del ligando diana. Como alternativa, los ligandos genéricos pueden seleccionarse de cualquier ligando que pueda unirse a la estructura general de los polipéptidos que constituyen cualquier repertorio dado, tales como los propios anticuerpos, matrices de iones metálicos, compuestos orgánicos incluyendo proteínas o péptidos, y
similares.

En un segundo aspecto, se usa una librería en la que los miembros funcionales tienen sitios de unión para ambos ligandos genéricos y dianas. Las librerías pueden diseñarse específicamente para este fin, por ejemplo, mediante la construcción de librerías de anticuerpos que tienen una conformación de cadena principal que se reconoce por un superantígeno dado, o mediante la construcción de una librería en la que sustancialmente todos los miembros potencialmente funcionales poseen una estructura reconocible por un ligando de anticuerpo.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para detectar, inmovilizar, purificar o inmunoprecipitar uno o más miembros de un repertorio de polipéptidos seleccionado previamente según la invención, que comprende unir los miembros al ligando genérico.

En un aspecto adicional, se usa una librería que comprende un repertorio de polipéptidos de la superfamilia de inmunoglobulinas, en la que los miembros del repertorio tienen una conformación de cadena principal conocida.

Los repertorios de polipéptidos se generan y se mantienen ventajosamente en la forma de una librería de ácidos nucleicos.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar, inmovilizar, purificar o inmunoprecipitar uno o más miembros de un repertorio de polipéptidos seleccionado previamente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende unir los miembros al ligando genérico y separar luego aquellos miembros de la librería que se unen al ligando genérico.

En todavía otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para detectar, inmovilizar, purificar o inmunoprecipitar uno o más miembros de un repertorio de polipéptidos seleccionado previamente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende unir los miembros al ligando diana.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Gráfico de barras que indica las posiciones en las regiones V_{H} y V_{\kappa} del repertorio de anticuerpos humanos que muestran una amplia diversidad natural y establecen contactos con el antígeno (véase Tomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol., 256: 813). En esta representación no se muestra H3 y el extremo de L3 aunque también son altamente diversos y establecen contactos con el antígeno. Aunque se ha caracterizado perfectamente la diversidad de secuencia en los genes lambda humanos (véase Ignatovich et al. (1997) J. Mol. Biol, 268: 69) actualmente existen muy pocos datos sobre contactos con antígenos para las estructuras tridimensionales de lambda.

Figura 2: Secuencia de scFv que constituye la base de una librería según la invención. Actualmente hay dos versiones de la librería: una librería "primaria" en la que se varían 18 posiciones y una librería "somática" en la que se varían 12 posiciones. Están indicadas las seis regiones de bucle H1, H2, H3, L1, L2 y L3. Están subrayadas las regiones CDR tal como se definen mediante Kabat (Kabat et al. (1991). Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services).

Figura 3: Análisis de la funcionalidad en una librería según la invención antes y después de seleccionar con los ligandos genéricos Proteína A y Proteína L. Aquí, la Proteína L se reviste sobre una placa de ELISA, los sobrenadantes de scFv se unen a ella y la detección de la unión de scFv se realiza con Proteína A-HRP. Por tanto, sólo aquellos scFv que pueden unirse a ambas Proteína A y Proteína L producen una señal en el ELISA.

Figura 4: Secuencias de clones seleccionados de las librerías según la invención, tras el cribado con ubiquitina bovina, BIP de rata, histona bovina, NIP-BSA, FITC-BSA, leptina humana, tiroglobulina humana, BSA, lisozima de huevo de gallina, IgG de ratón e IgG humana. Lo subrayado en las secuencias indica las posiciones en las que variaron en las librerías respectivas.

Figura 5: 5a: Comparación de la concentración de scFv producida mediante las librerías "primarias" de DVT no seleccionadas y preseleccionadas en células huésped. 5b: Curva patrón de ELISA tal como se determina a partir de patrones conocidos.

Figura 6: Inmunotransferencia de tipo Western de fagos de librerías "primarias" de DVT preseleccionadas y no seleccionadas, sondadas con el anticuerpo anti-pIII de fago con el fin de determinar el porcentaje de fagos que portan scFv.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Repertorio: Un repertorio es una población de diversas variantes, por ejemplo variantes de ácido nucleico que difieren en la secuencia de nucleótidos o variantes de polipéptido que difieren en la secuencia de aminoácidos. Una librería según la invención englobará un repertorio de polipéptidos o ácidos nucleicos. Según la presente invención, un repertorio de polipéptidos se diseña para que posea un sitio de unión para un ligando genérico y un sitio de unión para un ligando diana. Los sitios de unión pueden solaparse o pueden estar situados en la misma región de la molécula, pero sus especificidades diferirán.

Organismo: Tal como se usa en el presente documento, el término "organismo" se refiere a todas las formas de vida celulares, tales como procariotas y eucariotas, así como a entidades no celulares que contienen ácidos nucleicos, tales como bacteriófagos y virus.

Funcional: Tal como se usa en el presente documento, el término "funcional" se refiere a un polipéptido que posee la actividad biológica nativa de las proteínas producidas en la naturaleza de este tipo, o bien cualquier actividad deseada específica, por ejemplo según se considere por su capacidad para unirse a moléculas de ligando, definidas más adelante. Ejemplos de polipéptidos "funcionales" incluyen un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno a través de su sitio de unión a antígenos, una molécula de receptor (por ejemplo, un receptor de células T) que se une a su ligando característico y una enzima que se une a su sustrato. Con el fin de clasificar un polipéptido como funcional según la invención, se entiende que en primer lugar debe procesarse y plegarse apropiadamente para conservar su integridad estructural global, según se considere por su capacidad para unirse al ligando genérico, también definido más adelante.

Para evitar dudas, la funcionalidad no es equivalente a la capacidad para unirse al ligando diana. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-CEA funcional no podrá unirse específicamente a ligandos diana tales como LPS bacterianos. Sin embargo, dado que puede unirse a un ligando diana (es decir, podría unirse a CEA si CEA fuese el ligando diana) se clasifica como una molécula de anticuerpo "funcional" y puede seleccionarse mediante la unión a un ligando genérico, tal como se define más adelante. Normalmente, las moléculas de anticuerpo no funcionales no podrán unirse a ningún ligando diana.

Ligando genérico: Un ligando genérico es un ligando que se une a una proporción sustancial de miembros funcionales en un repertorio dado. Así, el mismo ligando genérico puede unirse a cualquier miembro del repertorio independientemente de sus especificidades de ligando diana (véase más adelante). En general, la presencia de un sitio de unión al ligando genérico funcional indica que el miembro del repertorio se expresa y se pliega correctamente. Así, la unión del ligando genérico a su sitio de unión proporciona un procedimiento para preseleccionar polipéptidos funcionales de un repertorio de polipéptidos.

Ligando diana: El ligando diana es un ligando para el que va a identificarse un miembro o miembros de unión específica. Cuando los miembros del repertorio son moléculas de anticuerpo, el ligando diana puede ser un antígeno y cuando los miembros del repertorio son enzimas, el ligando diana puede ser un sustrato. La unión al ligando diana depende de ambos el miembro del repertorio que es funcional, tal como se describió anteriormente con el ligando genérico, y con la especificidad precisa del sitio de unión para el ligando diana.

Subconjunto: El subconjunto es una parte del repertorio. En los términos de la presente invención, a menudo se da el caso de que sólo un subconjunto del repertorio es funcional y por tanto posee un sitio de unión al ligando genérico funcional. Además, también es posible que sólo una fracción de los miembros funcionales de un repertorio (todavía significativamente más de lo que se uniría a un ligando diana dado) se una al ligando genérico. Estos subconjuntos pueden seleccionarse según la invención.

Los subconjuntos de una librería pueden combinarse o reunirse para producir repertorios novedosos que se han preseleccionado según criterios deseados. Los repertorios combinados o reunidos pueden ser simples mezclas de los miembros de polipéptido preseleccionados mediante la unión al ligando genérico, o pueden manipularse para combinar dos subconjuntos de polipéptidos. Por ejemplo, pueden explorarse previamente de manera individual polipéptidos de V_{H} y V_{L} y combinarse posteriormente a nivel genético con vectores individuales de manera que se expresan como dímeros de V_{H}-V_{L} combinados, tales como scFv.

Librería: El término librería se refiere a una mezcla de polipéptidos o ácidos nucleicos heterogéneos. La librería está compuesta de miembros, que tienen una única secuencia de ácido nucleico o polipéptido. En este sentido, librería es sinónimo de repertorio. Las diferencias de secuencia entre los miembros de la librería son responsables de la diversidad presente en la librería. La librería puede adoptar la forma de una simple mezcla de polipéptidos o ácidos nucleicos, o puede estar en la forma de microorganismos o células, por ejemplo bacterias, virus, células de animal o plantas y similares, transformada con una librería de ácidos nucleicos. Preferiblemente, cada microorganismo o célula individual contiene sólo un miembro de la librería. Ventajosamente, los ácidos nucleicos se incorporan en vectores de expresión, con el fin de permitir la expresión de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos. En un aspecto preferido, por tanto, una librería puede adoptar la forma de una población de microorganismos huéspedes, conteniendo cada microorganismo una o más copias de un vector de expresión que contiene un único miembro de la librería en forma de ácido nucleico que puede expresarse para producir su miembro de polipéptido correspondiente. Así, la población de microorganismos huésped tiene el potencial para codificar un gran repertorio de variantes de polipéptido genéticamente diversas.

Superfamilia de inmunoglobulinas: Esto se refiere a una familia de polipéptidos que conserva la característica de plegado de inmunoglobulina de las moléculas de inmunoglobulina (anticuerpos), que contienen dos láminas \beta y, habitualmente, un puente disulfuro conservado. Los miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas están implicados en muchos aspectos de interacciones celulares y no celulares in vivo, incluyendo papeles generalizados en el sistema inmunitario (por ejemplo, anticuerpos, moléculas de receptor de células T y similares), implicación en la adhesión celular (por ejemplo, las moléculas ICAM) y señalización intracelular (por ejemplo, moléculas de receptor, tales como el receptor de PDGF). La presente invención puede aplicarse a todas las moléculas de la superfamilia de inmunoglobulinas, dado que se logra la variación en ellas de formas similares. Preferiblemente, la presente invención se refiere a inmunoglobulinas (anticuerpos).

Conformación de cadena principal: La conformación de cadena principal se refiere al rastro de la estructura principal de Ca de una estructura en tres dimensiones. Cuando se consideran los bucles hipervariables individuales de los anticuerpos o las moléculas de TCR la conformación de cadena principal es sinónimo de la estructura canónica. Tal como se explica en Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901 y Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877, los anticuerpos presentan un número limitado de estructuras canónicas para cinco o sus seis bucles hipervariables (H1, H2, L1, L2 y L3), pese a la considerable diversidad de cadenas laterales en los propios bucles. La estructura canónica precisa mostrada depende de la longitud del bucle y de la identidad de ciertos residuos clave implicados en su empaquetamiento. El sexto bucle (H3) es mucho más diverso en ambos longitud y secuencia y, por tanto, sólo muestra estructuras canónicas para ciertas longitudes de bucle cortas (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol. 263: 800; Shirai et al (1996) FEBS Letters, 399: 1). En la presente invención, los seis bucles tendrán preferiblemente estructuras canónicas y por tanto, se conocerá la conformación de cadena principal para toda la molécula de anticuerpo.

Polipéptido de anticuerpo: Los anticuerpos son inmunoglobulinas que se producen por las células B y forman una parte central del sistema de defensa inmunitario del huésped en vertebrados. Un polipéptido de anticuerpo, tal como se usa en el presente documento, es un polipéptido que es un anticuerpo o bien es una parte de un anticuerpo, modificado o no modificado. Así, el término polipéptido de anticuerpo incluye una cadena pesada, una cadena ligera, un dímero de cadena pesada-cadena ligera, un fragmento de Fab, un fragmento de F(ab')_{2}, un fragmento de Dab o un fragmento de Fv, incluyendo Fv de cadena sencilla (scFv). Los procedimientos para la construcción de tales moléculas de anticuerpo se conocen bien en la técnica.

Superantígeno: Los superantígenos son antígenos, principalmente en la forma de toxinas expresadas en bacterias, que interaccionan con miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas fuera de los sitios de unión a ligandos convencionales de estas moléculas. Las enterotoxinas de Staphylococcus interaccionan con los receptores de células T y tienen el efecto de estimular a las células T CD4+. Los superantígenos para anticuerpos incluyen las moléculas Proteína G que se unen a la región constante de las IgG (Bjorck y Kronvall (1984) J. Immunol, 133: 969; Reis et al. (1984) J. Immunol., 132: 3091), Proteína A que se une a la región constante y al dominio V_{H} de las IgG (Forsgren y Sjoquist (1966) J. Immunol., 97: 822) y Proteína L que se une al dominio V_{L} (Bjorck (1988) J. Immunol., 140: 1994).

Realizaciones preferidas de la invención

La presente invención proporciona un sistema de selección que elimina (o reduce significativamente la proporción de) miembros no funcionales o escasamente plegados/expresados de una librería de polipéptidos mientras obtiene el enriquecimiento de miembros funcionales, plegados y bien expresados antes de que se lleve a cabo una selección de la especificidad frente a un "ligando diana". Un repertorio de moléculas de polipéptido se pone en contacto con un "ligando genérico", una proteína que tiene afinidad por una característica estructural común a todas las proteínas funcionales, por ejemplo plegadas completa y/o correctamente, de la clase relevante. Debe observarse que el término "ligando" se usa ampliamente en referencia a moléculas de uso en la presente invención. Tal como se usa en el presente documento, el término "ligando" se refiere a cualquier entidad que se une a o que va a unirse mediante un miembro de la librería de polipéptidos.

Un número significativo de proteínas defectuosas presentes en el repertorio inicial no se une al ligando genérico y por tanto, se eliminan. Esta eliminación selectiva de los polipéptidos no funcionales de una librería da como resultado una marcada reducción en su tamaño real, mientras que se mantiene su tamaño funcional, con un aumento correspondiente en su calidad. Los polipéptidos que se conservan en virtud de la unión al ligando genérico constituyen un "primer conjunto seleccionado" o "subconjunto" del repertorio original. En consecuencia, este "subconjunto" se enriquece con elementos funcionales, bien plegados y bien expresados del repertorio inicial.

Los polipéptidos del primer conjunto seleccionado o subconjunto se ponen en contacto posteriormente con al menos un "ligando diana", que se une a los polipéptidos con una especificidad funcional dada. Tales ligandos diana incluyen, pero no se limitan a, la mitad de un par receptor/ligando (por ejemplo, una hormona u otra molécula de señalización celular, tal como un neurotransmisor, y su receptor análogo), de un par de unión de moléculas de adhesión celular, un sustrato de proteína que se une mediante el sitio activo de una enzima, una proteína, péptido o bien compuesto orgánico pequeño frente al que se dirige un anticuerpo particular o incluso el propio anticuerpo. En consecuencia, el uso de una librería de este tipo requiere menos trabajo y es más económico, en lo que se refiere a ambos tiempo y materiales, que el de una librería convencional. Además, dado que comparado con un repertorio que no se ha seleccionado con un ligando genérico, el primer conjunto seleccionado contendrá una proporción mucho mayor de moléculas que pueden unirse al ligando diana que las que no pueden unirse al ligando diana, habrá una reducción significativa del ruido durante la selección con el "ligando diana".

También se contemplan esquemas de selección combinatoria según la invención. Pueden realizarse múltiples selecciones del mismo repertorio de polipéptidos inicial en paralelo o en serie usando diferentes ligandos genéricos y/o diana. Así, el repertorio puede seleccionarse en primer lugar con un único ligando genérico y luego seleccionarse posteriormente en paralelo usando diferentes ligandos diana. Los subconjuntos resultantes pueden usarse entonces por separado o combinados, en cuyo caso el subconjunto combinado tendrá una variedad de especificidades del ligando diana pero una única especificidad del ligando genérico. Como alternativa, el repertorio puede seleccionarse en primer lugar con un único ligando diana y luego seleccionarse posteriormente en paralelo usando diferentes ligandos genéricos. Los subconjuntos resultantes pueden usarse entonces por separado o combinados, en cuyo caso el subconjunto combinado tendrá una variedad de especificidades de ligando genérico pero una única especificidad del ligando diana. También se concibe el uso de esquemas más elaborados. Por ejemplo, el repertorio inicial puede someterse a dos rondas de selección usando dos ligandos genéricos diferentes, seguido por la selección con el ligando diana. Esto produce un subconjunto en el que todos los miembros se unen a ambos los ligandos genéricos y el ligando diana. Como alternativa, si se realiza la selección del repertorio inicial con los dos ligandos genéricos en paralelo y los subconjuntos resultantes combinados y luego se selecciona con el ligando diana, el subconjunto resultante se une al menos a uno de los dos ligandos genéricos y al ligando diana. Los repertorios combinados o reunidos pueden ser simples mezclas de los subconjuntos o pueden manipularse para unir físicamente los subconjuntos. Por ejemplo, los polipéptidos de V_{H} y V_{L} pueden seleccionarse individualmente en paralelo mediante la unión de dos ligandos genéricos diferentes, y combinarse posteriormente a nivel genético en vectores individuales de manera que se expresen como V_{H}-V_{L} combinados. Este repertorio puede seleccionarse entonces frente al ligando diana de manera que los miembros seleccionados pueden unirse a ambos los ligandos genéricos y el ligando diana.

La invención engloba librerías de polipéptidos funcionales seleccionados o que pueden seleccionarse mediante los procedimientos ampliamente descritos anteriormente, así como librerías de ácidos nucleicos que codifican moléculas de polipéptido que pueden usarse en una selección realizada según estos procedimientos (preferiblemente, moléculas que comprenden un primer sitio de unión para un ligando diana y un segundo sitio de unión para un ligando genérico). Además, la invención proporciona procedimientos para detectar, inmovilizar, purificar o inmunoprecipitar uno o más miembros de un repertorio de polipéptidos funcionales seleccionado usando ligandos genéricos o diana según la invención.

La invención puede aplicarse al enriquecimiento de librerías de moléculas de la superfamilia de inmunoglobulinas. Esto es particularmente cierto en lo que se refiere a la generación de poblaciones de anticuerpos y receptores de células T que son funcionales y tienen una especificidad deseada, tal como se requiere para su uso en procedimientos diagnósticos, terapéuticos o profilácticos. Para este fin, la invención proporciona librerías de anticuerpos y receptores de células T en las que todos los miembros tienen ambos bucles y regiones de entramado naturales de conformación de cadena principal conocida, así como estrategias para la mutagénesis útil de la secuencia de partida y la selección posterior de las variantes funcionales así generadas. Tales librerías de polipéptidos pueden comprender dominios V_{H} o V_{\beta} o, como alternativa, pueden comprender dominios V_{L} o V_{\alpha}, o incluso ambos dominios V_{H} o V_{\beta} y V_{L}
o V_{\alpha}.

Existe una necesidad significativa en la técnica de librerías de anticuerpos o moléculas de receptor de células T mejoradas. Por ejemplo, pese al progreso en la creación de librerías de fagos-anticuerpos de "única etapa", todavía quedan algunos problemas. Las librerías naturales (Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581; Vaughan et al. (1996) Nature Biotech., 14: 309) que usan genes de V reordenados recogidos de células B humanas se desvían enormemente debido a la selección positiva y negativa de las células B in vivo. Esto puede limitar el tamaño eficaz de las librerías de fagos construidas a partir de genes de V reordenados. Además, los clones derivados de librerías naturales contienen invariablemente mutaciones de la región de entramado que pueden afectar a la inmunogenicidad de los anticuerpos cuando se usan en la terapia de seres humanos. Las librerías sintéticas (Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97) pueden superar el problema de desviación pero requieren el uso de cebadores de PCR degenerados que frecuentemente introducen deleciones de pares de bases en los genes de V unidos. Este alto grado de aleatorización también puede conducir a la creación de anticuerpos que no pueden plegarse correctamente y que, por tanto, tampoco son funcionales. En muchos casos es probable que estos miembros no funcionales superarán en número a los miembros funcionales en una librería. Aunque las regiones de entramado pueden optimizarse previamente para el plegamiento y/o la expresión (documento WO97/08320, Morphosys) mediante la síntesis de un conjunto de "genes maestros" con secuencias de regiones de entramado consenso y mediante la incorporación de sustituciones de aminoácidos que se ha demostrado que mejoran el plegamiento y la expresión, sigue existiendo el problema de la inmunogenicidad puesto que, en la mayoría de los casos, las secuencias consenso no se corresponden con ninguna región de entramado natural. Además, dado que es probable que la diversidad de CDR también tenga un efecto en el plegamiento y/o la expresión, es preferible optimizar el plegamiento y/o la expresión (y eliminar cualquier desplazamiento del marco de lectura o codones de terminación) una vez que se ha unido completamente el gen de V.

Otro problema con las librerías existentes es que dado que la conformación de cadena principal es heterogénea, es difícil la obtención de modelos estructurales tridimensionales debido a que puede que no se disponga de datos cristalográficos de alta resolución adecuados. Esto constituye un problema particular para la región H3, en la que la inmensa mayoría de los anticuerpos derivados de las librerías de anticuerpos naturales o sintéticas tienen una longitud media o bucles largos y, por tanto, no pueden obtenerse modelos.

Otro problema con las librerías es la dependencia de marcadores de epítopo (tales como los marcadores myc, FLAG o HIS) para la detección de fragmentos de anticuerpo expresados. Dado que éstos se sitúan habitualmente en los extremos N o C terminales del fragmento de anticuerpo, tienden a ser propensos a rotura proteolítica. Pueden usarse superantígenos, tales como la Proteína A y la Proteína L para detectar fragmentos de anticuerpos expresados mediante la unión de los propios dominios plegados, pero puesto que son específicos de la familia de V_{H} y V_{L}, sólo se unirá una proporción relativamente pequeña de miembros de cualquier librería de anticuerpos existente a uno de estos reactivos y se unirá a ambos una proporción incluso más pequeña.

Para este fin, sería deseable tener un sistema de selección que pudiera eliminar (o al menos reducir la proporción de) miembros no funcionales o escasamente plegados/expresados de la librería antes de que se lleve a cabo la selección frente al antígeno diana mientras se obtiene el enriquecimiento de miembros no funcionales, plegados y bien expresados, pudiendo todos ellos unirse a ligandos genéricos tales como los superantígenos Proteína A y Proteína L. Además, sería ventajoso construir una librería de anticuerpos en la que todos los miembros tengan regiones de entramado naturales y tengan bucles con conformaciones de cadena principal conocidas.

La invención, en consecuencia, proporciona un procedimiento por el cual puede seleccionarse un repertorio de polipéptidos para eliminar miembros no funcionales. Esto da como resultado una marcada reducción en el tamaño real de la librería (y un aumento correspondiente en la calidad de la librería) sin reducir el tamaño de la librería funcional. La invención también proporciona un procedimiento para crear un nuevo repertorio de polipéptidos en el que todos los miembros funcionales pueden unirse a un ligando genérico dado. El mismo ligando genérico puede usarse para la posterior detección, inmovilización, purificación o inmunoprecipitación de cualquiera de uno o más miembros del repertorio.

Puede usarse cualquier repertorio de anticuerpos "sin exposición previa" o "inmunitarios" con la presente invención para obtener el enriquecimiento de miembros funcionales y/o para obtener el enriquecimiento de miembros que se unen a un ligando o ligandos genérico(s) dado(s). De hecho, dado que sólo un pequeño porcentaje de todos los segmentos de V_{H} de la línea germinal humana se une a la Proteína A con alta afinidad y sólo un pequeño porcentaje de todos los segmentos de V_{L} de la línea germinal humana se une a la Proteína L con alta afinidad, la preselección con estos superantígenos es sumamente ventajosa. Como alternativa, la preselección a través del marcador de epítopo permite que se eliminen las variantes no funcionales de las librerías sintéticas. Las librerías que son susceptibles de preselección incluyen, pero no se limitan a, librerías que comprenden genes de V reordenados in vivo del tipo descrito por Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 11 1 581 y Vaughan et al. (1996) Nature Biotech., 14: 309, librerías sintéticas por las que los segmentos de genes de V de la línea germinal se "reordenan" in vitro (Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97) o en las que se incorporan CDR sintéticas en un único gen de V reordenado (Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457) o en múltiples regiones de entramado maestras (documento WO97/08320, Morphosys).

Selección de polipéptidos según la invención

Una vez que se genera un conjunto diverso de polipéptidos, se aplica la selección según la invención. Dos amplios procedimientos de selección se basan en el orden en el que se aplican los ligandos genéricos y diana; las variaciones combinatorias en estos esquemas implican el uso de múltiples ligandos genéricos y/o diana en una etapa dada de una selección. Cuando se usa un esquema combinatorio, el conjunto de moléculas de polipéptido puede ponerse en contacto con, por ejemplo, varios ligandos diana de una vez, o mediante cada uno individualmente, en serie; en este último caso, los conjuntos seleccionados resultantes de polipéptidos pueden mantenerse separados o pueden reunirse por sí mismos. Estos esquemas de selección pueden resumirse tal como sigue:

a. Procedimiento de selección 1 Selección de polipéptidos inicial usando el ligando genérico

Con el fin de eliminar los miembros no funcionales de la librería, se selecciona un ligando genérico, de manera que el ligando genérico sólo se une mediante moléculas funcionales. Por ejemplo, el ligando genérico puede ser un ión metálico, un anticuerpo (en la forma de un anticuerpo monoclonal o una mezcla de anticuerpos policlonales), la mitad de un complejo enzima/ligando o material orgánico; debe observarse que los ligandos de cualquiera de estos tipos son, adicionalmente o como alternativa, de uso como ligandos diana según la invención. La producción de anticuerpos y la cromatografía de afinidad con metales se tratan en detalle más adelante. Idealmente, estos ligando se unen a un sitio (por ejemplo, un marcador de péptido o el sitio de unión a un superantígeno) en los miembros de la librería que son de estructura o secuencia constante, estructura que puede que esté ausente o alterada en los miembros no funcionales. En el caso de las librerías de anticuerpos, este procedimiento puede usarse para seleccionar de una librería sólo aquellos miembros funcionales que tienen un sitio de unión para un superantígeno o anticuerpo monoclonal dados; un enfoque de este tipo es útil en la selección de polipéptidos de anticuerpo funcionales a partir de conjuntos naturales y sintéticos de los mismos.

Los superantígenos Proteína A y/o Proteína L pueden usarse en la invención como ligandos genéricos para seleccionar repertorios de anticuerpos, dado que se unen a dominios V_{H} y V_{L} plegados correctamente (que pertenecen a ciertas familias de V_{H} y V_{L}), respectivamente, independientemente de la secuencia y la estructura del sitio de unión para el ligando diana. Además, puede usarse la Proteína A u otro superantígeno la Proteína G como ligandos genéricos para seleccionar el plegamiento y/o la expresión mediante la unión de los dominios constantes de las cadenas pesadas de los anticuerpos. Los anticuerpos anti-\kappa y anti-\lambda también pueden usarse en la selección de los dominios constantes de las cadenas ligeras. También pueden usarse pequeños compuestos orgánicos miméticos de anticuerpos o de otras proteínas de unión, tales como la Proteína A (Li et al. (1998) Nature Biotech., 16: 190).

Cuando se usa este procedimiento de selección, el ligando genérico, mediante su propia naturaleza, puede unirse a todos los miembros funcionales del repertorio preseleccionado; por tanto, este ligando genérico (o algún conjugado del mismo) puede usarse para detectar, inmovilizar, purificar o inmunoprecipitar cualquier miembro o población de miembros del repertorio (ya esté seleccionado mediante la unión a un ligando diana dado o no, tal como se trata más adelante). La detección de proteínas mediante técnicas de inmunoensayo, así como la inmunoprecipitación de polipéptidos miembros de un repertorio de la invención puede llevarse a cabo mediante las técnicas tratadas más adelante con respecto a las pruebas de los ligandos de selección de anticuerpos que pueden usarse en la invención (véase "Antibodies for use as ligands in polypeptide selection"). La inmovilización puede llevarse a cabo a través de la unión específica de un miembro de polipéptido de un repertorio a un ligando genérico o bien a uno diana según la invención que se une, por sí mismo, a un soporte sólido o semisólido, tal como un filtro (por ejemplo, de nitrocelulosa o nailon) o un soporte cromatográfico (incluyendo, pero sin limitarse a, un soporte de celulosa, polímero, resina o sílice); la unión covalente del polipéptido miembro al ligando genérico o diana puede llevarse a cabo utilizando cualquiera de varios agentes químicos de reticulación conocidos por un experto en la técnica. La inmovilización en un soporte de cromatografía de afinidad con metales se describe más adelante (véase "Metallic ligands as use for the selection of polypeptides"). La purificación puede comprender cualquiera o una combinación de estas técnicas, en particular inmunoprecipitación y cromatografía mediante procedimientos bien conocidos en la técnica.

Usando este enfoque, puede llevarse a cabo la selección con múltiples ligandos genéricos uno tras otro para crear un repertorio en el que todos los miembros se unen a dos o más ligandos genéricos, por separado en paralelo, de manera que los subconjuntos pueden combinarse entonces (en este caso, los miembros del repertorio preseleccionado se unirán al menos a uno de los ligandos genéricos) o bien por separado seguido por la incorporación en la misma cadena polipeptídica por lo que se usa una gran librería funcional en la que todos los miembros pueden unirse a todos los ligandos genéricos durante la preselección. Por ejemplo, los subconjuntos pueden seleccionarse de una o más librerías usando diferentes ligandos genéricos que se unen a cadenas pesadas y ligeras de moléculas de anticuerpo (véase más adelante) y luego combinarse para formar una librería de cadenas pesadas/ligeras, en la que las cadenas pesadas y ligeras se asocian de manera no covalente o bien se unen covalentemente, por ejemplo, mediante el uso de dominios V_{H} y V_{L} en un contexto de Fv de cadena sencilla.

Selección de polipéptidos secundaria usando el ligando diana

Tras la etapa de selección con el ligando genérico, se explora la librería con el fin de identificar los miembros que se unen al ligando diana. Dado que se obtiene el enriquecimiento de polipéptidos funcionales tras la selección con el ligando genérico, habrá una reducción ventajosa en la unión no específica ("ruido") durante la selección con el ligando diana. Además, dado que la selección con el ligando genérico produce una marcada reducción en el tamaño real de la librería (y un aumento correspondiente en la calidad de la librería) sin reducir el tamaño de la librería funcional, un repertorio más pequeño debe provocar la misma diversidad de especificidades y afinidades del ligando diana que el repertorio de partida más grande (que contenía muchos miembros no funcionales y escasamente plegados/expresados).

Pueden usarse uno o más ligandos diana para seleccionar polipéptidos del primer conjunto de polipéptidos seleccionado generado usando el ligando genérico. En el caso de que se usen dos o más ligandos diana para generar varios subconjuntos diferentes, pueden combinarse dos o más de esos subconjuntos para formar un único subconjunto más complejo. Un único ligando genérico puede unirse a cada miembro de subconjunto combinado resultante; sin embargo, un ligando diana dado se une sólo a un subconjunto de miembros de la librería.

b. Procedimiento de selección 2 Selección de miembros del repertorio inicial con el ligando diana

Aquí, la selección usando el ligando diana se lleva a cabo antes de la selección usando el ligando genérico. Obviamente, puede resultar el mismo juego de polipéptidos de cualquiera de los esquemas, si se desea tal resultado. Usando este enfoque, puede llevarse a cabo la selección con múltiples ligandos diana en paralelo o mezclando los ligandos diana para la selección. Si se lleva a cabo en paralelo, los subconjuntos resultantes pueden combinarse, si se requiere.

Selección de polipéptidos secundaria usando el ligando genérico

La selección posterior del subconjunto de unión al ligando diana puede llevarse a cabo entonces usando uno o más ligandos genéricos. Aunque no se trata de una selección de la función, dado que los miembros del repertorio que pueden unirse al ligando diana son funcionales por definición, no permite que se aíslen subconjuntos que se unen a diferentes ligandos genéricos. Así, puede seleccionarse la población seleccionada por el ligando diana mediante un ligando genérico o mediante dos o más ligandos genéricos. En este caso, los ligandos genéricos pueden usarse uno tras otro para crear un repertorio en el que todos los miembros se unen al ligando diana y dos o más ligandos genéricos o por separado en paralelo, de manera que se crean diferentes subconjuntos (pero posiblemente solapantes) uniendo el ligando diana y diferentes ligandos genéricos. Éstos pueden combinarse entonces (en este caso, los miembros se unirán al menos a uno de los ligandos genéricos).

Selección de miembros de librerías de polipéptidos de la familia de inmunoglobulinas

Los miembros de los repertorios o librerías seleccionados en la presente invención pertenecen ventajosamente a la superfamilia de moléculas de inmunoglobulinas, en particular, polipéptidos de anticuerpo o polipéptidos de receptores de células T. Para los anticuerpos, se concibe que el procedimiento según esta invención puede aplicarse a cualquiera de las librerías de anticuerpos existentes conocidas en la técnica (ya sean naturales o sintéticas) o a librerías de anticuerpos diseñadas específicamente para preseleccionarse con ligandos genéricos (véase más adelante).

Construcción de librerías de la invención a. Selección de la conformación de cadena principal

Los miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas comparten todos un plegamiento similar para su cadena polipeptídica. Por ejemplo, aunque los anticuerpos son sumamente diversos en lo que se refiere a su secuencia primaria, la comparación de las secuencias y las estructuras cristalográficas ha revelado que, al contrario de lo que se espera, cinco de los seis bucles de unión a antígenos de los anticuerpos (H1, H2, L1, L2, L3) adoptan un número limitado de conformaciones de cadena principal, o estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) citados anteriormente; Chothia et al (1989) citado anteriormente). El análisis de las longitudes de bucle y los residuos clave ha permitido por tanto la predicción de las conformaciones de cadena principal de H1, H2, L1, L2 y L3 encontradas en la mayoría de los anticuerpos humanos (Chothia et al. (1992) citado anteriormente; Tomlinson et al. (1995) citado anteriormente; Williams et al. (1996) citado anteriormente). Aunque la región H3 es mucho más diversa en lo que se refiere a la secuencia, la longitud y la estructura (debido al uso de segmentos de D), también forma un número limitado de conformaciones de cadena principal para longitudes de bucle cortas que dependen de la longitud y de la presencia de residuos particulares, o de los tipos de residuo, en posiciones clave en el bucle y en la región de entramado de los anticuerpos (Martin et al. (1996) citado anteriormente; Shirai et al. (1996) citados anteriormente).

Según la presente invención, se diseñan librerías de polipéptidos de anticuerpo en las que se han elegido ciertas longitudes de bucle y residuos clave para garantizar que se conoce la conformación de cadena principal de los miembros. Ventajosamente, éstas son conformaciones reales de las moléculas de la superfamilia de inmunoglobulinas encontradas en la naturaleza, para minimizar la posibilidad de que no sean funcionales, tal como se trató anteriormente. Los segmentos de genes de V de la línea germinal sirven como una región de entramado básica adecuada para construir librerías de anticuerpos o receptores de células T; también pueden usarse otras secuencias. Pueden producirse variaciones a una frecuencia baja, de manera que un pequeño número de miembros funcionales puede poseer una conformación de cadena principal alterada, que no afecta a su función.

También puede usarse en la invención la teoría de la estructura canónica para evaluar el número de conformaciones de cadena principal diferentes codificadas por los anticuerpos, para predecir la conformación de cadena principal basada en las secuencias de los anticuerpos y para elegir los residuos para su diversificación que no afecte a la estructura canónica. Se sabe que, en el dominio V_{\kappa} humano, el bucle L1 puede adoptar una de cuatro estructuras canónicas, el bucle L2 tiene una única estructura canónica y que el 90% de los dominios V_{\kappa} humanos adoptan una de cuatro o cinco estructuras canónicas para el bucle L3 (Tomlinson et al. (1995) citado anteriormente); así, en el dominio V_{\kappa} solo, pueden combinarse diferentes estructuras canónicas para crear una variedad de conformaciones de cadena principal diferentes. Dado que el dominio V_{\lambda} codifica una variedad diferente de estructuras canónicas para los bucles L1, L2 y L3 y que los dominios L_{\kappa} y V_{\lambda} pueden aparearse con cualquier dominio V_{H} que puede codificar varias estructuras canónicas para los bucles H1 y H2, el número de combinaciones de estructuras canónicas para estos cinco bucles es muy grande. Esto implica que la generación de diversidad en la conformación de cadena principal puede ser esencial para la producción de una amplia variedad de especificidades de unión. Sin embargo, mediante la construcción de una librería de anticuerpos basada en una conformación de cadena principal única conocida se encontró, a diferencia de lo que se esperaba, que no se requiere la diversidad en la conformación de cadena principal para generar suficiente diversidad para dirigir sustancialmente a todos los antígenos. Incluso más sorprendentemente, no es necesario que la conformación de cadena principal única sea una estructura consenso (puede usarse una única conformación que se produce en la naturaleza como base para toda la librería).

Ha de entenderse, sin embargo, que pueden producirse variaciones ocasionales de manera que un pequeño número de miembros funcionales pueda poseer una conformación de cadena principal alternativa, que puede ser desconocida.

La conformación de cadena principal única que se elige es preferiblemente común entre las moléculas del tipo de la superfamilia de inmunoglobulinas en cuestión. Una conformación es común cuando se observa que la adopta un número significativo de moléculas que se producen en la naturaleza. En consecuencia, en un aspecto preferido de la invención, se considera por separado la aparición natural de las conformaciones de cadena principal diferentes para cada bucle de unión de una molécula de la superfamilia de inmunoglobulinas y entonces se elige una molécula de la superfamilia de inmunoglobulinas que se produce en la naturaleza que posee la combinación deseada de conformaciones de cadena principal para los diferentes bucles. Si ninguna está disponible, puede elegirse la equivalente más próxima. Dado que es una desventaja de las librerías de polipéptidos de la familia de inmunoglobulinas de la técnica anterior que muchos miembros tienen regiones de entramado no naturales o contienen mutaciones en la región de entramado (véase anteriormente), en el caso de los anticuerpos o receptores de células T, es preferible que se cree la combinación deseada de conformaciones de cadena principal para los diferentes bucles mediante la selección de segmentos de genes de la línea germinal que codifican las conformaciones de cadena principal deseadas. Es más preferible, que los segmentos de genes de la línea germinal seleccionados se expresen frecuentemente y lo más preferible es que sean los que más frecuentemente se expresan.

En el diseño de las librerías de anticuerpos, por tanto, puede considerarse por separado la incidencia de las conformaciones de cadena principal diferentes para cada uno de los seis bucles de unión a antígenos. Para H1, H2, L1, L2 y L3, se elige una conformación dada que se adopta por entre el 20% y el 100% de los bucles de unión a antígenos de las moléculas que se producen en la naturaleza. Normalmente, se observa que la incidencia es superior al 35% (es decir, entre el 35% y el 100%) e, idealmente, superior al 50% o incluso superior al 65%. Dado que la inmensa mayoría de bucles H3 no tienen estructuras canónicas, es preferible seleccionar una conformación de cadena principal que sea común entre aquellos bucles que no presenten estructuras canónicas. Para cada uno de los bucles, se selecciona por tanto la conformación que se observa con mayor frecuencia en el repertorio natural. En los anticuerpos humanos, las estructuras canónicas (CS) más populares para cada bucle son las siguientes: H1 - CS 1 (79% del repertorio expresado), H2 - CS 3 (46%), L1 - CS 2 de V_{\kappa} (39%), L2 - CS 1 (100%), L3 - CS 1 de V_{\kappa} (36%) (el cálculo supone una proporción \kappa:\lambda de 70:30, Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48: 133). Para los bucles H3 que tienen estructuras canónicas, lo más común parece ser una longitud de CDR3 (Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services) de varios residuos con un puente salino del residuo 94 al residuo 101. Al menos hay 16 secuencias de anticuerpos humanos en la librería de datos EMBL con los residuos clave y la longitud de H3 requerida para formar esta conformación y al menos dos estructuras cristalográficas en el banco de datos de proteínas que pueden usarse como base para la obtención de modelos de anticuerpos (2cgr y 1tet). Los segmentos de genes de la línea germinal expresados más frecuentemente de esta combinación de estructuras canónicas son el segmento 3-23 de V_{H} (DP-47), el segmento JH4b de J_{H}, el segmento O2/O12 de V_{\kappa} (DPK9) y el segmento J_{\kappa}1 de J_{\kappa}. Estos segmentos pueden usarse por tanto en combinación como base para construir una librería con la conformación de cadena principal única deseada.

Como alternativa, en lugar de elegir la conformación de cadena principal única basándose en la aparición natural de las conformaciones de cadena principal diferentes para cada uno de los bucles de unión de manera aislada, se usa la aparición natural de combinaciones de conformaciones de cadena principal como base para elegir la conformación de cadena principal única. En el caso de los anticuerpos, por ejemplo, puede determinarse la aparición natural de combinaciones de estructuras canónicas para cualquiera de dos, tres, cuatro, cinco o para los seis bucles de unión a antígenos. Aquí, es preferible que la conformación elegida sea común en los anticuerpos que se producen en la naturaleza y lo más preferible que se observe lo más frecuentemente en el repertorio natural. Así, en los anticuerpos humanos, por ejemplo, cuando se consideran las combinaciones naturales de los cinco bucles de unión a antígenos, H1, H2, L1, L2 y L3, se determina la combinación más frecuente de estructuras canónicas y después se combina con la conformación más popular para el bucle H3, como base para elegir la conformación de cadena principal única.

b. Diversificación de la secuencia canónica

Habiendo seleccionado varias conformaciones de cadena principal conocidas o, preferiblemente una única conformación de cadena principal conocida, se construye la librería variando el sitio de unión de la molécula con el fin de generar un repertorio con diversidad estructural y/o funcional. Esto significa que las variantes se generan de manera que poseen suficiente diversidad en su estructura y/o en su función de modo que pueden proporcionar una variedad de actividades. Por ejemplo, cuando los polipéptidos en cuestión son receptores de la superficie celular, pueden poseer una diversidad de especificidades de unión al ligando diana.

La diversidad deseada se genera normalmente variando la molécula seleccionada en una o más posiciones. Las posiciones que van a cambiarse pueden elegirse al azar o se seleccionan preferiblemente. La variación puede lograrse entonces mediante aleatorización, durante la cual el aminoácido residente se reemplaza por cualquier aminoácido a análogo del mismo, natural o sintético, produciendo un número muy grande de variantes o bien reemplazando el aminoácido residente con uno o más de un subconjunto definido de aminoácidos, produciendo un número más limitado de variantes.

Se han notificado diversos procedimientos para introducir tal diversidad. Pueden usarse la PCR propensa a errores (Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226: 889), la mutagénesis química (Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533) o cepas mutadoras bacterianas (Low et al. (1996) J. Mol. Biol., 260: 359) para introducir mutaciones al azar en los genes que codifican la molécula. Los procedimientos para mutar las posiciones seleccionadas también se conocen bien en la técnica e incluyen el uso de oligonucleótidos con apareamiento erróneo u oligonucleótidos degenerados, con o sin el uso de PCR. Por ejemplo, se han creado varias librerías de anticuerpos sintéticas dirigiendo mutaciones a los bucles de unión a antígenos. Se ha aleatorizado la región H3 de una región Fab de unión al toxoide tetánico en seres humanos para crear una variedad de nuevas especificidades de unión (Barbas et al. (1992) citado anteriormente). Se han agregado regiones H3 y L3 aleatorias o semialeatorias a segmentos de genes de V de la línea germinal para producir grandes librerías con regiones de entramado no mutadas (Hoogenboom y Winter (1992) citado anteriormente; Nissim et al. (1994) citado anteriormente; Griffiths et al. (1994) citado anteriormente; De Kruif et al. (1995) citado anteriormente). Tal diversificación se ha extendido para incluir algunos o todos de otros bucles de unión a antígenos (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, documento WO97/08320, citado anteriormente).

Dado que la aleatorización de bucles tiene el potencial para crear aproximadamente más de 10^{15} estructuras para H3 solo y un número similarmente grande de variantes para los otros cinco bucles, no es factible usar la tecnología de transformación actual o ni siquiera mediante el uso de sistemas libres de células para producir una librería que represente todas las combinaciones posibles. Por ejemplo, en una de las librerías más grandes construidas hasta la fecha, se generaron 6 x 10^{10} anticuerpos diferentes, que es sólo una fracción de la posible diversidad para una librería de este diseño (Griffiths et al. (1994) citado anteriormente).

Además de la eliminación de los miembros no funcionales y del uso de una única conformación de cadena principal conocida, la presente invención trata estas limitaciones diversificando sólo aquellos residuos que están implicados directamente en la creación o modificación de la función deseada de la molécula. Para muchas moléculas, la función será unirse a un ligando diana y por tanto, la diversidad debe concentrarse en el sitio de unión al ligando diana, mientras se evita cambiar los residuos que son cruciales para el empaquetamiento global de la molécula o para el mantenimiento de la conformación de cadena principal elegida; por lo que las posiciones seleccionadas que van a variarse en la librería pueden ser aquellas que constituyen el sitio de unión para el ligando diana.

Diversificación de la secuencia canónica tal como se aplica a los anticuerpos

En el caso de una librería de anticuerpos, el sitio de unión para el ligando diana es lo más frecuentemente el sitio de unión a antígenos. Así, preferiblemente, la librería de anticuerpos sólo tiene variados los residuos en el sitio de unión a antígenos. Estos residuos son extremadamente diversos en el repertorio de anticuerpos humanos y se sabe que establecen contactos en los complejos anticuerpo/antígeno de alta resolución. Por ejemplo, se sabe que en L2 las posiciones 50 y 53 son diversas en los anticuerpos que se producen en la naturaleza y se observa que establecen contactos con el antígeno. Por el contrario, el enfoque convencional habría sido diversificar todos los residuos en la región determinante de la complementariedad (CDR1) correspondiente tal como se define por Kabat et al. (1991, citado anteriormente), unos siete residuos en comparación los dos diversificados en la librería. Esto representa una mejora significativa en lo que se refiere a la diversidad funcional requerida para crear una variedad de especificidades de unión a antígenos.

En la naturaleza, la diversidad de los anticuerpos es el resultado de dos procesos: la recombinación somática de los segmentos de genes de V, D y J de la línea germinal para crear un repertorio primario sin exposición previa (denominada por tanto diversidad de unión o de la línea germinal) y la hipermutación somática de los genes de V reordenados resultantes. El análisis de las secuencias de los anticuerpos humanos ha demostrado que la diversidad en el repertorio primario se centra en el centro del sitio de unión a antígenos mientras que la hipermutación somática extiende la diversidad a regiones en la periferia del sitio de unión a antígenos que están altamente conservadas en el repertorio primario (véase Tomlinson et al. (1996) citado anteriormente). Esta complementariedad ha evolucionado probablemente como una estrategia eficaz para la búsqueda de espacio de las secuencias, y aunque es aparentemente única para los anticuerpos, puede aplicarse fácilmente a otros repertorios de polipéptidos según la invención. Según la invención, los residuos que se varían son un subconjunto de los que forman el sitio de unión para el ligando diana. Los diferentes (incluyendo el solapamiento) subconjuntos de residuos en el sitio de unión al ligando diana se diversifican en diferentes fases durante la selección, si se desea.

En el caso de un repertorio de anticuerpos, el procedimiento de dos etapas de la invención es análogo a la maduración de los anticuerpos en el sistema inmunitario humano. Se crea un repertorio "sin exposición previa" inicial en el que se diversifican algunos, pero no todos, los residuos en el sitio de unión a antígenos. Tal como se usa en el presente documento en este contexto, la expresión "sin exposición previa" se refiere a moléculas de anticuerpo que tienen un ligando diana no predeterminado. Estas moléculas se asemejan a las que se codifican por los genes de inmunoglobulinas de un individuo que no se ha sometido a diversificación inmunitaria, como es el caso con los individuos fetales y recién nacidos, cuyos sistemas inmunitarios todavía no se han expuesto mediante una amplia variedad de estímulos antigénicos. Este repertorio se selecciona entonces frente a una variedad de antígenos. Si se requiere, puede introducirse entonces diversidad adicional fuera de la región diversificada en el repertorio inicial. Este repertorio madurado puede seleccionarse para obtener una función especificidad o afinidad modificadas.

La invención proporciona dos repertorios de anticuerpos sin exposición previa diferentes en los que se varían algunos o todos los residuos en el sitio de unión a antígenos. La librería "primaria" imita el repertorio natural primario, con diversidad limitada a los residuos en el centro del sitio de unión a antígenos que son diversos en los segmentos de genes de V de la línea germinal (diversidad de la línea germinal) o diversificados durante el proceso de recombinación (diversidad de unión). Los residuos que se diversifican incluyen, pero no se limitan a, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 y L96. En la librería "somática" la diversidad se limita a los residuos que se diversifican durante el proceso de recombinación (diversidad de unión) o que están altamente mutados de manera somática). Estos residuos que se diversifican incluyen, pero no se limitan a: H31, H33, H35, H95, H96, H97, H98, L30, L31, L32, L34 y L96. Se sabe que todos los residuos enumerados anteriormente como adecuados para la diversificación en estas librerías establecen contactos en uno o más complejos anticuerpo-antígeno. Dado que en ambas librerías, no se varían todos los residuos en el sitio de unión a antígenos, se incorpora diversidad adicional durante la selección variando los residuos restantes, si se desea hacerlo así. Resultará evidente para un experto en la técnica que puede usarse cualquier subconjunto de cualquiera de estos residuos (o residuos adicionales que comprenden el sitio de unión a antígenos) para la diversificación inicial y/o posterior del sitio de unión a antígenos.

En la construcción de librerías, la diversificación de las posiciones elegidas se logra normalmente a nivel del ácido nucleico alterando la secuencia codificante que especifica la secuencia del polipéptido de manera que puedan incorporarse en esa posición varios de los posibles aminoácidos (los 20 o un subconjunto de los mismos). Usando la nomenclatura de la IUPAC, el codón más versátil es NNK, que codifica todos los aminoácidos así como el codón de terminación TAG. El codón NNK se usa preferiblemente con el fin de introducir la diversidad requerida. También pueden usarse otros codones que logran los mismos fines, incluyendo el codón NNN, que conduce a la producción de otros codones de terminación TGA y TAA.

Una característica de la diversidad de la cadena lateral en el sitio de unión a antígenos de los anticuerpos humanos es una desviación pronunciada que favorece a ciertos residuos de aminoácidos. Si se suma la composición de aminoácidos de las diez posiciones más diversas en cada una de las regiones de V_{H}, V_{\kappa} y L_{\kappa}, más del 76% de la diversidad de la cadena lateral procede de sólo siete residuos diferentes, siendo éstos, serina (24%), tirosina (14%), asparagina (11%), glicina (9%), alanina (7%), aspartato (6%) y treonina (6%). Esta desviación hacia los residuos hidrófilos y los residuos pequeños que pueden proporcionar flexibilidad de la cadena principal probablemente se refleja en la evolución de las superficies que están predispuestas a unirse a una amplia variedad de antígenos y puede ayudar a explicar la variedad requerida de anticuerpos en el repertorio primario.

Dado que es preferible imitar esta distribución de aminoácidos, la distribución de los aminoácidos en las posiciones que van a variarse en las librerías imita preferiblemente a la observada en el sitio de unión a antígenos de los anticuerpos. Tal desviación en la sustitución de los aminoácidos que permite la selección de ciertos polipéptidos (no sólo de los polipéptidos de anticuerpo) frente a una variedad de ligandos diana se aplica fácilmente a cualquier repertorio de polipéptidos según la invención. Hay diversos procedimientos para desviar la distribución de aminoácidos en la posición que va a variarse (incluyendo el uso de mutagénesis de trinucleótidos, documento WO97/08320, Morphosys, citado anteriormente), de los que el procedimiento preferido, debido a la facilidad de síntesis, es el uso de codones degenerados convencionales. Comparando el perfil de aminoácidos codificados por todas las combinaciones de codones degenerados (con degeneración única, doble, triple y cuádruple en proporciones iguales en cada posición) con el uso de aminoácidos naturales, es posible calcular el codón más representativo. Los codones (AGT)(AGC) T, (AGT)(AGC)C y (AGT)(AGC)(CT) (es decir, DVT, DVC y DVY, respectivamente usando la nomenclatura de la IUPAC) son los más próximos al perfil de aminoácidos deseado: codifican el 22% de serina y el 11% de tirosina, asparagina, glicina, alanina, aspartato, treonina y cisteína. Preferiblemente, por tanto, las librerías se construyen usando cualquiera de los codones DVT, DVC o DVY en cada una de las posiciones diversificadas.

Tal como se estableció anteriormente, los polipéptidos que constituyen las librerías de anticuerpos pueden ser anticuerpos completos o fragmentos de los mismos, tales como los segmentos Fab, F(ab')_{2}, Fv o scFv, o dominios V_{H} o V_{L} separados, cualquiera de los cuales está modificado o bien no modificado. De éstos, se usan particularmente los fragmentos Fv, o scFv, de la cadena lateral. Los fragmentos scFV, así como otros polipéptidos de anticuerpo, se generan de manera fiable mediante procedimientos de ingeniería de anticuerpos bien conocidos en la técnica. El scFv se forma conectando los genes de V_{H} y V_{L} usando un oligonucleótido que codifica un péptido conector diseñado apropiadamente, tal como (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_{3} o péptido(s) conector(es) equivalente(s). Los puentes conectores del extremo C-terminal de la primera región V y el extremo N-terminal de la segunda región V, ordenados como V_{H}-conector-V_{L} o bien V_{L}-conector-V_{H}. En principio, el sitio de unión de scFv puede reproducir fielmente la especificidad del anticuerpo completo correspondiente y viceversa.

En la técnica se conocen bien técnicas similares para la construcción de fragmentos Fv, Fab y F(ab')_{2}, así como moléculas quiméricas de anticuerpo. Cuando se expresan los fragmentos Fv, debe tenerse precaución para garantizar el plegamiento y la asociación correctos de la cadena. Para los fragmentos Fab y F(ab')_{2}, se combinan los polipéptidos de V_{H} y V_{L} con los segmentos de la región constante, que pueden aislarse de genes reordenados, genes de C de la línea germinal o pueden sintetizarse a partir de datos de secuencias de anticuerpos como para los segmentos de la región V. Una librería según la invención puede ser una librería de V_{H} o V_{L}. Así, pueden construirse librerías separadas que comprenden dominios V_{H} y V_{L} individuales y, opcionalmente incluyen dominios C_{H} o C_{L}, respectivamente, creando moléculas de Dab.

c. Sistemas de vectores de librería según la invención

Las librerías pueden usarse para dirigir la exploración usando los ligandos genéricos y/o diana o pueden usarse en un protocolo de selección que implica un empaquetamiento de presentación genética.

Los sistemas de expresión en el bacteriófago lambda pueden explorarse directamente como placas de bacteriófago o como colonias de lisogenes, descritas ambas anteriormente (Huse et al. (1989) Science, 246: 1275; Caton y Koprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87; Mullinax et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 8095; Persson et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 2432) y pueden usarse en la invención. Aunque tales sistemas de expresión pueden usarse para explorar hasta 10^{6} miembros diferentes de una librería, realmente no son adecuados para explorar grandes números (más de 10^{6} miembros). Otros sistemas de exploración se basan en, por ejemplo, la síntesis química directa de los miembros de la librería. Un procedimiento inicial implica la síntesis de péptidos en un conjunto de vástagos o varillas, tal como se describe en el documento WO84/03564. Un procedimiento similar que implica la síntesis de péptidos en perlas, que forma una librería de péptidos en la que cada perla es un miembro individual de la librería, se describe en la patente estadounidense número 4.631.211 y un procedimiento relacionado se describe en el documento WO92/00091. Una mejora significativa de los procedimientos basados en perlas implica marcar cada perla con un marcador identificativo único, tal como un oligonucleótido, para facilitar la identificación de la secuencia de aminoácidos de cada miembro de la librería. Estos procedimientos basados en perlas mejorados se describen en el documento WO93/06121.

Otro procedimiento de síntesis química implica la síntesis de series de péptidos (o peptidomiméticos) sobre una superficie de una manera que coloca cada miembro distinto de la librería (por ejemplo, secuencia peptídica única) en una ubicación diferenciada, predefinida en la serie. Se determina la identidad de cada miembro de la librería mediante la ubicación espacial en la serie. Se determinan las ubicaciones en la serie en las que se producen las interacciones de unión entre una molécula predeterminada (por ejemplo, un receptor) y los miembros reactivos de la librería, identificando así las secuencias de los miembros reactivos de la librería basándose en la ubicación espacial. Estos procedimientos se describen en la patente estadounidense número 5.143.854; en los documentos WO90/15070 y WO92/10092; Fodor et al. (1991) Science, 251: 767; Dower y Fodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem., 26: 271.

De uso particular en la construcción de librerías son los sistemas de presentación de selección, que permiten que un ácido nucleico se una al polipéptido que expresa. Tal como se usa en el presente documento, un sistema de presentación de selección es un sistema que permite la selección, mediante medios de presentación adecuados, de los miembros individuales de la librería mediante la unión a ligandos genéricos y/o diana.

Puede usarse cualquier sistema de presentación de selección en conjunción con una librería. Se conocen en la técnica protocolos de selección para aislar los miembros deseados de las librerías grandes, tipificados mediante técnicas de presentación en fabos. Tales sistemas, en los que se presentan diversas secuencias peptídicas sobre la superficie de bacteriófagos filamentosos (Scott y Smith (1990) citado anteriormente), han demostrado ser útiles para crear librerías de fragmentos de anticuerpos (y las secuencias de nucleótidos que los codifican) para la selección y amplificación in vitro de fragmentos de anticuerpos específicos que se unen a un antígeno diana. Las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones V_{H} y V_{L} se unen a fragmentos de genes que codifican señales líder que los dirigen hacia el espacio periplásmico de E. coli y como resultado, los fragmentos de anticuerpos resultantes se presentan sobre la superficie del bacteriófago, normalmente como fusiones con proteínas de la envuelta del bacteriófago (por ejemplo, pIII o pVIII). Como alternativa, los fragmentos de anticuerpos se presentan externamente sobre las cápsides de fagos lambda (cuerpos del fago). Una ventaja de los sistemas de presentación basados en fagos es que, dado que son sistemas biológicos, pueden amplificarse los miembros seleccionados de la librería simplemente mediante el crecimiento del fago que contiene el miembro seleccionado de la librería en células bacterianas. Además, dado que la secuencia de nucleótidos que codifica el miembro de la librería de polipéptidos está contenida en un fago o vector fagémido, la secuenciación, la expresión y la posterior manipulación genética son relativamente sencillas.

Los procedimientos para la construcción de librerías de presentación de anticuerpos en bacteriófagos y las librerías de expresión en fagos lambda se conocen bien en la técnica (McCafferty et al. (1990) citado anteriormente; Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Burton et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 88: 10134; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133; Chang et al. (1991) J. Immunol., 147: 3610; Breitling et al. (1991) Gene, 104: 147; Marks et al. (1991) citado anteriormente; Barbas et al. (1992) citado anteriormente; Hawkins y Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313, incorporados al presente documento por referencia).

Un enfoque particularmente ventajoso ha sido el uso de librerías de fagos con scFv (Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883; Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070; McCafferty et al. (1990) citado anteriormente; Clackson et al. (1991) citado anteriormente; Marks et al. (1991) citado anteriormente; Chiswell et al. (1992) Trends Biotech., 10: 80; Marks et al. (1992) citado anteriormente). Se han descrito diversas realizaciones de librerías de scFv presentadas en proteínas de la envuelta de bacteriófagos. También se conoce el refinamiento de los enfoques de presentación en fagos, por ejemplo tal como se describe en los documentos WO96/06213 y WO92/01047 (Medical Research Council et al.) y en el documento WO97/08320 (Morphosys, citado anteriormente), que se incorporan al presente documento por referencia.

Otros sistemas para la generación de librerías de polipéptidos o nucleótidos implican el uso de maquinaria enzimática libre de células para la síntesis in vitro de los miembros de la librería. En un procedimiento, se seleccionan moléculas de ARN mediante rondas alternas de selección frente a un ligando diana y amplificación mediante PCR (Tuerk y Gold (1990) Science, 249: 505; Ellington y Szostak (1990) Nature, 346: 818). Puede usarse una técnica similar para identificar secuencias de ADN que se unen a un factor de transcripción humano predeterminado (Thiesen y Bach (1990) Nucleic Acids Res., 18: 3203; Beaudry y Joyce (1992) Science, 257: 635; documentos WO92/05258 y WO92/14843). De una manera similar, puede usarse la traducción in vitro para sintetizar polipéptidos como un procedimiento para generar librerías grandes. Estos procedimientos que comprenden generalmente complejos de polisomas establecidos, se describen adicionalmente en los documentos WO88/08453, WO90/05785, WO90/07003, WO91/02076, WO91/05058 y WO92/02536. Sistemas de presentación alternativos que no se basan en fagos, tales como los dados a conocer en los documentos WO95/22625 y WO95/11922 (Affymax) usan los polisomas para presentar polipéptidos para su selección. Éstos y todos los documentos anteriores también se incorporan al presente documento por referencia.

Dado que la invención proporciona una librería de polipéptidos que tiene sitios de unión para ambos ligandos genéricos y diana, el procedimiento de selección anterior puede aplicarse para una selección usando el ligando genérico o bien el ligando diana. Así, la librería inicial puede seleccionarse usando el ligando genérico y después el ligando diana o usando el ligando diana y después el ligando genérico. La invención también proporciona múltiples selecciones usando diferentes ligandos genéricos en paralelo o bien en serie antes o después de la selección con el ligando diana.

Preferiblemente, el procedimiento según la invención comprende además las etapas de someter el/los polipépti-
do(s) seleccionado(s) a una variación adicional (tal como se describe en el presente documento) y repetir las etapas a) a d).

Dado que el ligando genérico, por su misma naturaleza, puede unirse a todos los miembros de la librería seleccionados usando el ligando genérico, el procedimiento según la invención comprende además el uso del ligando genérico (o algún conjugado del mismo) para detectar, inmovilizar, purificar o inmunoprecipitar cualquier miembro funcional o población de miembros de la librería (se haya seleccionado mediante la unión al ligando diana o no).

Dado que la invención proporciona una librería en la que los miembros tienen una conformación de cadena principal conocida, el procedimiento según la invención comprende además la producción de un modelo estructural tridimensional de cualquier miembro funcional de la librería (se haya seleccionado mediante la unión al ligando diana o no). Preferiblemente, la construcción de un modelo de este tipo implica la obtención de modelos por homología y/o la sustitución molecular. Puede crearse un modelo preliminar de la conformación de cadena principal mediante la comparación de la secuencia del polipéptido con la secuencia de una estructura tridimensional conocida, mediante la predicción de la estructura secundaria o mediante la exploración de librerías estructurales. También puede usarse software informático para predecir la estructura secundaria del polipéptido. Con el fin de predecir las conformaciones de las cadenas laterales en las posiciones variadas, puede emplearse una librería de rotámeros de cadenas laterales.

En general, los constructos de vectores y moléculas de ácido nucleico requeridos para la realización de la presente invención están disponibles en la técnica y pueden construirse y manipularse tal como se explica en los manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA.

La manipulación de ácidos nucleicos en la presente invención se lleva a cabo normalmente en vectores recombinantes. Tal como se usa en el presente documento, vector se refiere a un elemento diferenciado que se usa para introducir ADN heterólogo dentro de las células para la expresión y/o la replicación del mismo. Los procedimientos mediante los cuales se seleccionan o construyen y, posteriormente, se usan tales vectores, los conoce bien un experto medio en la técnica. Se dispone públicamente de numerosos vectores, incluyendo plásmidos bacterianos, bacteriófagos, cromosomas artificiales y vectores episomales. Tales vectores pueden usarse para la simple clonación y mutagénesis; como alternativa, como es típico de los vectores en los que se portan los miembros del repertorio (o prerepertorio) de la invención, se emplea un vector de expresión de genes. Puede seleccionarse un vector que puede usarse según la invención para alojar una secuencia codificante polipeptídica de un tamaño deseado, normalmente desde 0,25 kilobases (kb) hasta 40 kb de longitud. Se transforma una célula huésped adecuada con el vector tras las manipulaciones de clonación in vitro. Cada vector contiene diversos componentes funcionales, que generalmente incluyen un sitio de clonación (o "policonector"), un origen de replicación y al menos un gen marcador seleccionable. Si el vector dado es un vector de expresión, adicionalmente posee uno o más de lo siguiente: secuencias de elemento potenciador, promotor, terminación de la transcripción y señal, cada una colocada en las proximidades del sitio de clonación, de manera que están operativamente unidas al gen que codifica un miembro del repertorio de polipéptidos según la invención.

Ambos vectores de clonación y de expresión contienen generalmente secuencias de ácidos nucleicos que permiten que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Normalmente en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican de manera autónoma. Tales secuencias se conocen bien para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram negativas, el origen del plásmido de 2 micras es adecuado para levaduras y diversos orígenes virales (por ejemplo, SV 40, adenovirus) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Generalmente, el origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamíferos, a menos que se usen en células de mamífero que puedan replicar altos niveles de ADN, tales como las células COS.

Ventajosamente, un vector de clonación o de expresión puede contener un gen de selección denominado también marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de las células huésped transformadas crecidas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contienen el gen de selección no sobrevivirán por tanto en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos y otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, deficiencias auxótrofas del complemento, o suministran nutrientes críticos no disponibles en los medios de crecimiento.

Dado que la replicación de vectores según la presente invención se realiza lo más convenientemente en E. coli, puede usarse un marcador seleccionable en E. coli, por ejemplo, el gen de la \beta-lactamasa que confiere resistencia al antibiótico ampicilina. Éstos pueden obtenerse de plásmidos de E. coli, tales como pBR322 o un plásmido pUC tal como pUC 18 o pUC 19.

Vectores de expresión contienen habitualmente un promotor que se reconoce por el organismo huésped y que está operativamente unido a la secuencia codificante de interés. Un promotor de este tipo puede ser inducible o constitutivo. La expresión "operativamente unido" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera deseada. Una secuencia control "operativamente unida" a una secuencia codificante se acopla de una manera tal que se logra la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con las secuencias control.

Los promotores adecuados para su uso con los huéspedes procariotas incluyen, por ejemplo, los sistemas promotores de \beta-lactamasa y lactosa, la fosfatasa alcalina, el sistema de promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán generalmente una secuencia de Shine-Dalgarno operativamente unida a la secuencia codificante.

En la librería, los vectores preferidos son vectores de expresión que permiten la expresión de una secuencia de nucleótidos correspondiente a un miembro de la librería de polipéptidos. Así, la selección con los ligandos genéricos y/o diana puede llevarse a cabo mediante la propagación y la expresión separadas de un único clon que expresa el miembro de la librería de polipéptidos o mediante el uso de cualquier sistema de presentación de selección. Tal como se describió anteriormente, el sistema de presentación de selección preferido es la presentación en bacteriófagos. Así, pueden usarse vectores de fagos o fagémidos. Los vectores preferidos son los vectores fagémidos que tienen un origen de replicación de E. coli (para la replicación bicatenaria) y también un origen de replicación de fagos (para la producción del ADN monocatenario). La manipulación y la expresión de tales vectores se conoce bien en la técnica (Hoogenboom y Winter (1992) citados anteriormente; Nissim et al. (1994) citado anteriormente). Brevemente, el vector contiene un gen de \beta-lactamasa para conferir selectividad en el fagémido y un promotor lac en el sentido de 5' del casete de expresión que está constituido por (en el extremo N a C terminal) una secuencia líder pelB (que dirige el péptido expresado al espacio periplásmico), un sitio de clonación múltiple (para clonar la versión de nucleótido del miembro de la librería), opcionalmente uno o más marcadores de péptido (para la detección), opcionalmente uno o más condones de terminación TAG y la proteína de fago pIII. Así, usando diversas cepas supresoras y no supresoras de E. coli y con la adición de glucosa, isopropil-tio-\beta-D-galactósido (IPTG) o un fago coadyuvante, tal como VCS M13, el vector puede replicarse como un plásmido sin expresión, producir grandes cantidades del miembro de la librería de polipéptidos únicamente o producir el fago, algunos de los cuales contiene al menos una copia de la fusión polipéptido-pIII en su superficie.

La construcción de vectores emplea técnicas de acoplamiento convencionales. Los vectores aislados o fragmentos de ADN se rompen, adaptan y se vuelven a acoplar en la forma deseada para generar el vector requerido. Si se desea, puede llevarse a cabo un análisis para confirmar que están presentes las secuencias correctas en el vector construido de una forma conocida. Los expertos en la técnica conocen procedimientos adecuados para construir vectores de expresión, preparar los transcritos in vitro, introducir el ADN en las células huésped y realizar análisis para evaluar la expresión y la función. Se detecta la presencia de una secuencia de genes en una muestra o se cuantifica su amplificación y/o expresión mediante procedimientos convencionales, tales como el análisis de tipo Southern o Northern, la inmunotransferencia de tipo Western, transferencia puntual de ADN, ARN o proteínas, hibridación in situ, inmunocitoquímica o análisis de la secuencia de moléculas de ácidos nucleicos o proteínas. Los expertos en la técnica concebirán fácilmente cómo pueden modificarse estos procedimientos, si se desea.

Mutagénesis usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Una vez se elige el sistema de vector y se clonan una o más secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos de interés en el vector de librería, se puede generar diversidad dentro de las moléculas clonadas emprendiendo la mutagénesis antes de la expresión; como alternativa, las proteínas codificadas pueden expresarse y seleccionarse, tal como se describió anteriormente, antes de la mutagénesis y se realizan rondas de selección adicionales. Tal como se estableció anteriormente, la mutagénesis de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos estructuralmente optimizados, se lleva a cabo mediante procedimientos moleculares convencionales. Puede usarse particularmente la reacción en cadena de la polimerasa o PCR, (Mullis y Faloona (1987) Methods Enzymol., 155: 335, incorporado al presente documento por referencia). La PCR, que usa múltiples ciclos de replicación de ADN catalizada mediante una ADN polimerasa termoestable dependiente de ADN para amplificar la secuencia diana de interés, se conoce bien en la técnica.

Cebadores de oligonucleótidos útiles según la invención son moléculas de ADN o ARN monocatenarias que hibridan con un molde de ácido nucleico para cebar la síntesis enzimática de una segunda cadena de ácido nucleico. El cebador es complementario para una parte de una molécula diana presente en un conjunto de moléculas de ácido nucleico usadas en la preparación de los conjuntos de series de la invención. Se contempla que una molécula de este tipo se prepara mediante procedimientos sintéticos, químicos o bien enzimáticos. Como alternativa, una molécula de este tipo o un fragmento de la misma se produce en la naturaleza y se aísla a partir de su fuente natural o se compra de un proveedor comercial. Los cebadores de oligonucleótidos mutagénicos tienen de 15 a 100 nucleótidos de longitud, idealmente desde 20 hasta 40 nucleótidos, aunque pueden usarse oligonucleótidos de longitud diferente.

Normalmente, se produce hibridación selectiva cuando dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente complementarias (al menos complementarias aproximadamente en un 65% a lo largo de un tramo de al menos de 14 a 25 nucleótidos, preferiblemente al menos complementarias aproximadamente en un 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente en un 90%). Véase Kanehisa (1984) Nucleic Acid Res. 12: 203, incorporado al presente documento por referencia. Como resultado, se espera que se tolere un cierto grado de apareamiento erróneo en el sitio de cebado. Tal apareamiento erróneo puede ser pequeño, tal como un mono-, di- o trinucleótido. Como alternativa, puede comprender bucles de nucleótido, que se definen como regiones en las que el apareamiento erróneo abarca una serie ininterrumpida de cuatro o más nucleótidos.

En general, cinco factores influyen en la eficacia y la selectividad de hibridación del cebador con una segunda molécula de ácido nucleico. Estos factores, que son (i) la longitud del cebador, (ii) la secuencia y/o composición del nucleótido, (iii) la temperatura de hibridación, (iv) la composición química del tampón y (v) el potencial para el impedimento estérico en la región en la que se necesita que el cebador hibride, son consideraciones importantes cuando se diseñan secuencias de cebado no aleatorias.

Existe una correlación positiva entre la longitud del cebador y ambas la eficacia y la precisión con las que un cebador se reasociará a una secuencia diana; las secuencias más largas tienen una temperatura de fusión (T_{M}) superior a la de las más cortas, y es menos probable que se repitan dentro de una secuencia diana dada, minimizando por tanto la hibridación variable. Las secuencias de cebadores con un alto contenido en G-C o que comprenden secuencias palindrómicas tienden a autohibridarse, tal como lo hacen sus sitios diana buscados, ya que la cinética de hibridación unimolecular, más que la bimolecular, está favorecida generalmente en disolución; al mismo tiempo, es importante diseñar un cebador que contenga números suficientes de apareamientos de nucleótidos G-C para unir fuertemente la secuencia diana, ya que cada par de este tipo se une mediante tres enlaces de hidrógeno, en lugar de los dos que se encuentran cuando se aparean las bases A y T. La temperatura de hibridación varía inversamente con la eficacia de reasociación del cebador, tal como lo hace la concentración de disolventes orgánicos, por ejemplo, formamida, que podría incluirse en una mezcla de hibridación, mientras que los aumentos en la concentración de sal facilitan la unión. En condiciones de hibridación rigurosas, las sondas más largas hibridan más eficazmente que las más cortas, las cuales son suficientes en condiciones más permisivas. Las condiciones de hibridación rigurosas incluyen normalmente concentraciones de sal inferiores a aproximadamente 1 M, más habitualmente inferiores a aproximadamente 500 mM y preferiblemente inferiores a aproximadamente 200 mM. Las temperaturas de hibridación oscilan desde tan solo 0ºC hasta más de 22ºC, más de aproximadamente 30ºC, y (lo más frecuente) por encima de aproximadamente 37ºC. Los fragmentos más largos pueden requerir temperaturas de hibridación superiores para la hibridación específica. Puesto que varios factores afectan a la rigurosidad de la hibridación, la combinación de parámetros es más importante que la medida absoluta de uno cualquiera solo.

Los cebadores se diseñan teniendo en cuenta estas consideraciones. Aunque un experto en la técnica puede realizar mentalmente cálculos estimados de los méritos relativos de numerosas secuencias, se han diseñado programas informáticos para ayudar en la evaluación de estos diversos parámetros y en la optimización de las secuencias de cebador. Ejemplos de tales programas son "PrimerSelect" del paquete de software DNAStar^{TM} (DNAStar, Inc.; Madison, WI) y OLIGO 4.0 (National Biosciences, Inc.). Una vez diseñados, se preparan oligonucleótidos adecuados mediante un procedimiento adecuado, por ejemplo, el procedimiento de fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981) Tetrahedron Lett., 22: 1859) o el procedimiento de triéster según Matteucci y Caruthers (1981) J. Am. Chem. Soc., 103: 3185, ambos incorporados al presente documento por referencia, o mediante otros procedimientos químicos usando un sintetizador de oligonucleótidos automático comercial o bien la tecnología VLSIPS^{TM}.

Se lleva a cabo la PCR usando ADN de molde (al menos lfg; de manera más útil, 1-1000 ng) y al menos 25 pmol de cebadores oligonucleótidos; puede ser ventajoso usar una cantidad mayor de cebador cuando el conjunto de cebadores es fuertemente heterogéneo, ya que cada secuencia se representa mediante sólo una pequeña fracción del conjunto de moléculas, y las cantidades se vuelven limitantes en los últimos ciclos de amplificación. Una mezcla de reacción típica incluye: 2 \mul de ADN, 25 pmol de cebador de oligonucleótido, 2,5 \mul de 10X tampón 1 de PCR (Perkin-Elmer, Foster City, CA), 0,4 \mul de dNTP 1,25 \muM, 0,15 \mul (o 2,5 unidades) de Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer, Foster City, CA) y agua desionizada hasta un volumen total de 25 \mul. Se recubre con aceite mineral y se realiza la PCR usando un ciclador térmico programable.

La longitud y temperatura de cada etapa de un ciclo de PCR, así como el número de ciclos, se ajustan de acuerdo con los requisitos de rigurosidad vigentes. La temperatura y el tiempo de reasociación se determinan ambos mediante la eficacia con la que se espera que un cebador se reasocie con un molde y el grado de apareamiento erróneo que se va a tolerar; obviamente, si las moléculas de ácido nucleico se amplifican y se mutagenizan simultáneamente, se requiere apareamiento erróneo, al menos en la primera ronda de síntesis. Atendiendo a la amplificación de una población de moléculas usando un conjunto mixto de cebadores mutagénicos, se pondera la pérdida, en condiciones de reasociación rigurosas (alta temperatura), de posibles productos mutantes que sólo resultarían de temperaturas de fusión bajas frente a la reasociación variable de cebadores con secuencias distintas al sitio diana. La capacidad de optimizar la rigurosidad de las condiciones de reasociación de cebadores está completamente dentro del conocimiento de un experto medio en la técnica. Se usa una temperatura de reasociación entre 30ºC y 72ºC. La desnaturalización inicial de las moléculas de molde se produce normalmente entre 92ºC y 99ºC durante 4 minutos, seguido de 20-40 ciclos constituidos por desnaturalización (94-99ºC durante 15 segundos a 1 minuto), reasociación (temperatura determinada tal como se trató anteriormente; 1-2 minutos) y extensión (72ºC durante 1-5 minutos, dependiendo de la longitud del producto amplificado). La extensión final generalmente es de 4 minutos a 72ºC, y puede ir seguida por una etapa indefinida (0-24 hora) a 4ºC.

Análisis estructural de los miembros del repertorio

Dado que la invención proporciona un repertorio de polipéptidos de conformación de cadena principal conocida, se genera fácilmente un modelo estructural tridimensional de cualquier miembro del repertorio. Normalmente, la construcción de un modelo de este tipo implica la obtención de modelos por homología y/o sustitución molecular. Se crea un modelo preliminar de la conformación de cadena principal mediante la comparación de la secuencia de polipéptidos con una secuencia similar de estructura tridimensional conocida, mediante la predicción de la estructura secundaria o mediante la exploración de librerías estructurales. Los paquetes de software informático de obtención de modelos moleculares están comercialmente disponibles y son útiles para predecir estructuras laterales de polipéptidos. Con el fin de predecir las conformaciones de las cadenas laterales en las posiciones variadas, puede emplearse una librería de rotámeros de cadenas laterales.

Anticuerpos para su uso como ligandos en la selección de polipéptidos

Un ligando diana o genérico que va a usarse en la selección de polipéptidos según la presente invención puede ser, por sí mismo, un anticuerpo. Esto es particularmente cierto en el caso de los ligandos genéricos, que se unen a características estructurales que se conservan sustancialmente en polipéptidos funcionales para seleccionarse para su inclusión en los repertorios de la invención. Si se dispone públicamente de un anticuerpo apropiado, puede producirse mediante metodología de presentación en fagos (véase anteriormente) o tal como sigue:

Pueden usarse proteínas recombinantes o bien las derivadas de fuentes naturales para generar anticuerpos usando técnicas convencionales, bien conocidas por los expertos en el campo. Por ejemplo, la proteína (o "inmunógeno") se administra para exponer a un mamífero tal como un mono, cabra, conejo o ratón. Pueden recogerse los anticuerpos resultantes como sueros policlonales, o pueden inmortalizarse las células que producen anticuerpos procedentes del animal expuesto (por ejemplo, mediante la fusión con un elemento de fusión de inmortalización para producir un hibridoma), células que producen entonces anticuerpos monoclonales.

a. Anticuerpos policlonales

La proteína antigénica se usa sola o bien conjugada con un portador convencional con el fin de aumentar su inmunogenicidad, y se genera un antisuero frente al conjugado péptido-portador en un animal, tal como se describió anteriormente. Pueden realizarse el acoplamiento de un péptido a una proteína portadora e inmunizaciones tal como se ha descrito (Dymecki et al. (1992) J. Biol. Chem., 267: 4815). El suero se titula frente a antígeno proteico mediante ELISA o como alternativa mediante transferencia puntual o de tipo mancha (Boersma y Van Leeuwen (1994) J. Neurosci. Methods, 51: 317). Se muestra que el suero reacciona fuertemente con los péptidos apropiados mediante ELISA, por ejemplo, siguiendo los procedimientos de Green et al. (1982) Cell, 28: 477.

b. Anticuerpos monoclonales

Se conocen bien las técnicas para preparar anticuerpos monoclonales, y los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando cualquier antígeno candidato, preferiblemente unido a un portador, tal como se describe por Arnheiter et al. (1981) Nature, 294, 278. Normalmente se obtienen anticuerpos monoclonales a partir de cultivos de tejido de hibridoma o a partir de líquido ascítico obtenido de animales en los que se introdujo el tejido de hibridoma. No obstante, pueden describirse los anticuerpos monoclonales como que "se generan frente a" o "se inducen por" una proteína.

Tras generarse, los anticuerpos monoclonales se someten a ensayo para determinar la función y la especificidad mediante cualquiera de varios medios. También pueden usarse procedimientos similares para someter a prueba anticuerpos recombinantes producidos mediante presentación en fagos u otras tecnologías de selección in vitro. También pueden explorarse hibridomas que producen anticuerpos monoclonales (o sueros policlonales) para determinar la unión del anticuerpo al inmunógeno. La pruebas inmunológicas particularmente preferidas incluyen inmunoensayos unidos a enzima (ELISA), inmunotransferencia e inmunoprecipitación (véase Voller, (1978) Diagnostic Horizons, 2: 1, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD; Voller et al. (1978) J. Clin. Pathol., 31: 507; patente de nueva publicación estadounidense número 31.006; patente del Reino Unido 2.019.408; Butler (1981) Methods Enzymol., 73: 482; Maggio, E. (ed.), (1980) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL) o radioinmunoensayos (RIA) (Weintraub, B., Principles of radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, marzo de 1986, págs. 1-5, 46-49 y 68-78), todos ellos para detectar la unión del anticuerpo al inmunógeno frente al que se generó. Resultará evidente para un experto en la técnica que la molécula de anticuerpo o bien el inmunógeno debe marcarse para facilitar tal detección. Las técnicas para marcar moléculas de anticuerpo son bien conocidas por los expertos en la técnica (véase Harlour y Lane (1989) Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, págs. 1-726).

Como alternativa, pueden usarse otras técnicas para detectar la unión al inmunógeno, confirmando de este modo la integridad del anticuerpo que va a servir como un antígeno genérico o bien un antígeno diana según la invención. Éstas incluyen procedimientos cromatográficos tales como SDS PAGE, isoelectroenfoque, inmunotransferencia de tipo Western, HPLC y electroforesis capilar.

Los "anticuerpos" se definen en el presente documento como construcciones que usan la región de unión (variable) de tales anticuerpos, y otras modificaciones de anticuerpos. Así, un anticuerpo útil en la invención puede comprender anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpo, agregados de anticuerpos polifuncionales o en general cualquier sustancia que comprende uno o más sitios de unión específicos de un anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo pueden ser fragmentos tales como fragmentos de Fv, Fab y F(ab')_{2} o cualquier derivado de los mismos, tales como fragmentos de Fv de cadena sencilla. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden ser no recombinantes, recombinantes o humanizados. El anticuerpo puede ser de cualquier isotipo de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgM, etcétera. Además, pueden usarse agregados, polímeros, derivados y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos si resulta apropiado.

La invención se describe adicionalmente, solamente para los fines de ilustración, en los siguientes ejemplos.

Iones metálicos como ligandos para la selección de polipéptidos

Tal como se expuso anteriormente, pueden usarse ligandos distintos a los anticuerpos en la selección de polipéptidos según la invención. Una categoría de este tipo de ligando es la de iones metálicos. Por ejemplo, se puede querer preseleccionar un repertorio para determinar la presencia de una cola de histidina (HIS) funcional usando una matriz Ni-NTA. La cromatografía de afinidad con metales inmovilizados (IMAC; Hubert y Porath (1980) J. Chromatography, 98: 247) se aprovecha de las propiedades de unión a metales de los residuos de aminoácidos histidina y cisteína, así como de otros que pueden unirse a metales, en las superficies expuestas de numerosas proteínas. Emplea una resina, normalmente agarosa, que comprende un quelante metálico bidentado (por ejemplo, ácido iminodiacético, IDA, un grupo de ácido dicarboxílico) al que se complejan iones metálicos; con el fin de generar una resina que porta un ión metálico según la invención, se mezcla agarosa/IDA con una sal metálica (por ejemplo, CuCl_{2} 2H_{2}O), a partir de la que se quela el IDA a los cationes divalentes. Una preparación de agarosa/IDA comercialmente disponible es "CHELATING SEPHAROSE 6B" (Pharmacy Fine Chemicals; Piscataway, NJ). Los iones metálicos que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, los cationes divalentes Ni^{2+}, Cu^{2+}, Zn^{2+} y Co^{2+}. Se prepara un conjunto de moléculas de polipéptido en un tampón de unión constituido esencialmente por sal (normalmente, NaCl o KCl) a una concentración de 0,1 a 1,0 M y un ligando débil (tal como Tris o amoníaco), teniendo este último afinidad por los iones metálicos de la resina, pero a un grado inferior al de un polipéptido que va a seleccionarse según la invención. Concentraciones útiles del ligando débil oscilan desde 0,01 hasta 0,1 M en el tampón de unión.

El conjunto de polipéptidos se pone en contacto con la resina en condiciones que permiten que los polipéptidos tengan dominios de unión a metal (véase más adelante) para unirse; tras eliminar las impurezas, se eluyen los polipéptidos seleccionados con un tampón en el que el ligando débil está presente en una concentración más alta que en el tampón de unión, específicamente, a una concentración suficiente para que el ligando débil desplace los polipéptidos seleccionados, a pesar de su afinidad de unión inferior para los iones metálicos. Concentraciones útiles del ligando débil en el tampón de elución son de 10 a 50 veces superiores a las del tampón de unión, normalmente desde 0,1 hasta 0,3 M; obsérvese que la concentración de sal en el tampón de elución es igual en el tampón de unión. Según los procedimientos de la presente invención, los iones metálicos de la resina normalmente sirven como el ligando genérico; sin embargo, se contempla que también pueden usarse como el ligando diana.

Se lleva a cabo la IMAC usando un aparato de cromatografía convencional (columnas, a lo largo de las que el tampón se retira mediante gravedad, se extrae mediante un vacío o se conduce mediante presión); como alternativa, se emplea un procedimiento en grandes lotes, en el que la resina que porta metal se mezcla, en forma de suspensión, con el conjunto de polipéptidos a partir del que se van a seleccionar los miembros de un repertorio de la invención.

Se ha descrito la purificación parcial de una proteína T4 de suero mediante IMAC (Staples et al., patente estadounidense número 5.169.936); sin embargo, el amplio espectro de proteínas que comprende los dominios de unión a metal expuestos en la superficies también abarca otras proteínas T4 solubles, proteínas de suero humano (por ejemplo, IgG, haptoglobina, hemopexina, Gc-globulina, Clq, C3, C4), desmoplasmina humana, lectina de Dolichos biflorus, Tyr(P) fosfatasas inhibida por zinc, fenolasa, isoenzimas de carboxipeptidasa, Cu,Zn-superóxido dismutasas (incluyendo las de seres humanos y todos los demás eucariotas), nucleósido difosfatasa, interferón de leucocitos, lactoferrina, \alpha_{2}-SH glicoproteína de plasma humano, \beta_{2}-macroglobulina, \alpha_{1}-antitripsina, activador de plasminógeno, polipéptidos gastrointestinales, pepsina, albúmina sérica humana y bovina, proteínas granulares de granulocitos, lisozimas, proteínas no histonas, fibrinógeno humano, transferrina de suero humano, linfotoxina humana, calmodulina, proteína A, avidina, mioglobinas, somatomedinas, hormona del crecimiento humano, factores de crecimiento transformantes, factor de crecimiento derivado de plaquetas, polipéptido natriurético auricular \alpha humano, cardiodilatina y otras. Además, pueden purificarse las secuencias del dominio extracelular de las proteínas unidas a membrana usando IMAC. Obsérvese que los repertorios que comprenden cualquiera de las proteínas anteriores o variantes de unión a metales de las mismas pueden producirse según los procedimientos de la invención.

Tras la elución, los polipéptidos seleccionados se eliminan del tampón de unión a metales y se colocan en un tampón apropiado hasta su próximo uso. Si el ión metálico se ha usado para generar un primer conjunto de polipéptidos seleccionados según la invención, las moléculas de ese conjunto se colocan en un tampón que está optimizado para la unión con el segundo ligando que va a usarse en la selección de los miembros del repertorio funcional de polipéptidos. Si el metal se usa, en cambio, en la segunda etapa de selección, los polipéptidos del repertorio se transfieren a un tampón adecuado para almacenamiento (por ejemplo, un tampón de glicina al 0,5%) o bien para el uso al que está destinado. Tales tampones incluyen, pero no se limitan a: agua, disolventes orgánicos, mezclas de agua y disolventes orgánicos miscibles en agua, tampones salinos fisiológicos y tampones de unión proteína/ácido nucleico o proteína/proteína. Como alternativa, las moléculas de polipéptido pueden deshidratarse (es decir, mediante liofilización) o inmovilizarse sobre un soporte sólido o semi-sólido, tal como una membrana de filtración de nitrocelulosa o nailon o una matriz de gel (es decir, de agarosa o poliacrilamida) o reticularse a una resina de cromatografía.

Las moléculas de polipéptido pueden eliminarse del tampón de elución mediante cualquiera de varios procedimientos conocidos en la técnica. El eluato de polipéptido puede dializarse frente a agua u otra disolución de elección; si los polipéptidos van a liofilizarse, se usa agua a la que se han añadido inhibidores de proteasa (por ejemplo, pepstatina, aprotinina, leupeptina, u otros). Como alternativa, puede someterse la muestra a precipitación con sulfato de amonio, que se conoce bien en la técnica, antes de la resuspensión en el medio de elección.

Uso de los polipéptidos seleccionados según la invención

Los polipéptidos seleccionados según el procedimiento de la presente invención pueden emplearse sustancialmente en cualquier procedimiento que implique la unión ligando-polipéptido, incluyendo aplicaciones terapéuticas y profilácticas in vivo, aplicaciones diagnósticas in vitro e in vivo, aplicaciones de reactivos y ensayo in vitro y similares. Por ejemplo, en el caso de los anticuerpos, pueden usarse moléculas de anticuerpo en técnicas de ensayo basadas en anticuerpos, tales como técnicas ELISA, según procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

Tal como se refirió anteriormente, las moléculas seleccionadas según la invención son de utilidad en procedimientos diagnósticos, profilácticos y terapéuticos. Por ejemplo, variantes de enzima generadas y seleccionadas mediante estos procedimientos pueden someterse a ensayo para determinar su actividad, in vitro o bien in vivo usando técnicas bien conocidas en la técnica, mediante las que se incuban con moléculas de sustrato candidatas y se analiza la conversión de sustrato a producto. Podrían expresarse receptores de la superficie celular o moléculas de adhesión seleccionados en células cultivadas que entonces se someten a prueba para determinar su capacidad para responder a estímulos bioquímicos o para determinar su afinidad con otros tipos de células que expresan moléculas de la superficie celular a las que se espera que se una la molécula de adhesión no diversificada, respectivamente. Los polipéptidos de anticuerpo seleccionados según la invención pueden usarse de manera diagnóstica en el análisis de tipo Western y en la detección de proteína in situ mediante procedimientos inmunohistoquímicos convencionales; para su uso en estas aplicaciones, los anticuerpos de un repertorio seleccionado pueden marcarse de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica. Además, tales polipéptidos de anticuerpo pueden usarse de manera preparativa en procedimientos de cromatografía de afinidad, si se complejan a un soporte cromatográfico, tal como una resina. Un experto en la técnica conoce bien todas las técnicas de este tipo.

Los usos terapéuticos y profilácticos de las proteínas preparadas según la invención implican la administración de polipéptidos seleccionados según la invención a un mamífero destinatario, tal como un ser humano. De uso particular con respecto a esto son los anticuerpos, otros receptores (incluyendo, pero sin limitarse a receptores de células T) y en el caso en el que se usó un anticuerpo o receptor como un ligando genérico o bien diana, las proteínas que se unen a ellos.

Se prefieren los anticuerpos sustancialmente puros o las proteínas de unión a los mismos con al menos del 90 al 95% de homogeneidad para la administración a un mamífero, y del 98 al 99% o más de homogeneidad es lo más preferido para usos farmacéuticos, especialmente si el mamífero es un ser humano. Una vez purificados, parcialmente o hasta la homogeneidad según se desee, los polipéptidos seleccionados pueden usarse diagnóstica o terapéuticamente (incluyendo extracorpóreamente) o en el desarrollo y la realización de procedimientos de ensayo, tinciones inmunofluorescentes y similares (Lefkovite y Pernis, (1979 y 1981) Inmunological Methods, Volúmenes I y II, Academic Press, NY).

Normalmente, los anticuerpos o proteínas de unión a los mismos seleccionados de la presente invención encontrarán su uso en la prevención, supresión o tratamiento de estados inflamatorios, hipersensibilidad alérgica, cáncer, infección bacteriana o vírica y trastornos autoinmunitarios (que incluyen, pero no se limitan a, diabetes tipo I, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn y miastenia grave).

En la presente solicitud, el término "prevención" implica la administración de la composición protectora antes de la inducción de la enfermedad. "Supresión" se refiere a la administración de la composición tras un acontecimiento inductivo, pero antes de la aparición clínica de la enfermedad. "Tratamiento" implica la administración de la composición protectora después de que se manifiesten los síntomas de la enfermedad.

Están disponibles sistemas de modelo animal que pueden usarse para explorar la eficacia de los anticuerpos o proteínas de unión a los mismos en la protección frente a o el tratamiento de la enfermedad. Se conocen en la técnica procedimientos para las pruebas del lupus eritematoso sistémico (SLE) en ratones propensos (Knight et al. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J. Med., 299: 515). Se somete a prueba la miastenia grave (MG) en ratones hembra SJL/J induciendo la enfermedad con la proteína AchR soluble de otras especies (Lindstrom et al. (1988) Adv. Inmunol., 42: 233). Se induce artritis en una cepa susceptible de ratones mediante inyección de colágeno tipo II (Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Inmunol., 42: 233). Se ha descrito un modelo mediante el que se induce artritis adyuvante en ratas propensas mediante inyección de la proteína de choque térmico micobacteriana (Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171). Se induce tiroiditis en ratones mediante la administración de tiroglobulina tal como se describió (Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). La diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM) se produce de manera natural o puede inducirse en diversas cepas de ratones tales como las descritas por Kanasawa et al. (1984) Diabetology, 27: 113. EAE en ratón y rata sirve como modelo para EM en seres humanos. En este modelo, se induce la enfermedad desmielinizante mediante la administración de proteína básica de mielina (véase Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al., eds., Grune y Stratton, Nueva York, págs. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478: y Satoh et al. (1987) J. Inmunol., 138: 179).

Los anticuerpos, receptores (incluyendo, pero sin limitarse a receptores de células T) o proteínas de unión a los mismos seleccionados de la presente invención también pueden usarse en combinación con otros anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales (MAb) reactivos con otros marcadores en células humanas responsables de las enfermedades. Por ejemplo, los marcadores de células T adecuados pueden incluir los agrupados en los así denominados "grupos de diferenciación," tal como se nombraron por el First International Leukocyte Differentiation Workshop (Bernhard et al. (1984) Leukocyte Typing, Springer Verlag, NY).

Generalmente, los presentes anticuerpos, receptores o proteínas de unión seleccionados se utilizarán en forma purificada junto con portadores farmacológicamente apropiados. Normalmente, estos portadores incluyen disoluciones acuosas o alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo cualquiera medio salino y/o tamponado. Vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro de sodio, dextrosa en Ringer, dextrosa y cloruro de sodio y Ringer lactato. Los adyuvantes fisiológicamente aceptables adecuados, si son necesarios para mantener un complejo de polipéptidos en suspensión, pueden escogerse de espesativos tales como carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, gelatina y alginatos.

Los vehículos intravenosos incluyen agentes de reposición de fluido y nutrientes y agentes de reposición de electrolitos, tales como los basados en dextrosa en Ringer. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes y gases inertes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición).

Los polipéptidos seleccionados de la presente invención pueden usarse como composiciones administradas por separado o junto con otros agentes. Estos pueden incluir diversos fármacos inmunoterápicos, tales como ciclosporina, metotrexato, adriamicina o cisplatino, e inmunotoxinas. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir "cócteles" de diversos agentes citotóxicos u otros agentes junto con los anticuerpos, receptores o proteínas de unión a los mismos seleccionados de la presente invención, o incluso combinaciones de polipéptidos seleccionados según la presente invención que tienen especificidades diferentes, tales como polipéptidos seleccionados usando ligandos diana diferentes, tanto si están reunidos o no antes de la administración.

La vía de administración de las composiciones farmacéuticas según la invención puede ser cualquiera de las comúnmente conocidas por los expertos en la técnica. Para terapia, incluyendo sin limitación inmunoterapia, los anticuerpos, receptores o proteínas de unión a los mismos seleccionados de la invención pueden administrarse a cualquier paciente según técnicas convencionales. La administración puede realizarse de cualquier modo apropiado, incluyendo por vía parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, mediante la vía pulmonar, o también, de manera apropiada, mediante infusión directa con un catéter. La dosificación y la frecuencia de administración dependerá de la edad, el sexo y la afección del paciente, la administración simultánea de otros fármacos, las contraindicaciones y otros parámetros han de tenerse en cuenta por el médico.

Los polipéptidos seleccionados de esta invención pueden liofilizarse para el almacenamiento y reconstituirse en un portador adecuado antes de su uso. Esta técnica ha demostrado ser eficaz con inmunoglobulinas convencionales y liofilización conocida en la técnica y pueden emplearse técnicas de reconstitución. Los expertos en la técnica apreciarán que la liofilización y la reconstitución pueden conducir a diversos grados de pérdida de actividad de los anticuerpos (por ejemplo, con las inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos IgM tienden a presentar pérdida de actividad superior a la de los anticuerpos IgG) y que esos niveles de uso pueden tener que ajustarse al alza para compensar.

Las composiciones que contienen los presentes polipéptidos seleccionados o un cóctel de los mismos pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En ciertas aplicaciones terapéuticas, una cantidad adecuada para llevar a cabo al menos inhibición, supresión, modulación, destrucción parciales, o algún otro parámetro medible, de una población de células seleccionadas se define como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades necesarias para lograr esta dosificación dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general del propio sistema inmunitario del paciente, pero generalmente oscilan desde 0,005 hasta 5,0 mg de anticuerpo, receptor (por ejemplo, un receptor de células T) o proteína de unión a los mismos seleccionados por kilogramo de peso corporal, usándose más comúnmente dosis de 0,05 a 2,0 mg/kg/dosis. Para aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los presentes polipéptidos seleccionados o cócteles de los mismos también pueden administrarse en dosificaciones similares o ligeramente inferiores.

Una composición que contiene un polipéptido seleccionado según la presente invención puede utilizarse en la práctica profiláctica y terapéutica para ayudar en la alteración, inactivación, destrucción o eliminación de una población de células diana seleccionadas en un mamífero. Además, los repertorios de polipéptidos seleccionados descritos en el presente documento pueden usarse de manera extracorpórea o in vitro selectivamente para destruir, reducir o de otro modo eliminar eficazmente una población de células diana de una colección heterogénea de células. Puede combinarse la sangre de un mamífero de manera extracorpórea con los anticuerpos, receptores de la superficie celular o proteínas de unión a los mismos seleccionados, por lo cual se destruyen las células no deseadas o de otro modo se eliminan de la sangre para volver al mamífero de acuerdo con técnicas convencionales.

La invención se describe adicionalmente, sólo para fines de ilustración, en los ejemplos siguientes.

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Ejemplo 1

Diseño de librería de anticuerpos A. Conformación de cadena principal

Para cinco de los seis bucles de unión a antígenos de los anticuerpos humanos (L1, L2, L3, H1 y H2) existe un número limitado de conformaciones de cadena principal o estructuras canónicas ((Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220). La conformación más popular de la cadena principal para cada uno de estos bucles se usa para proporcionar una única conformación de cadena principal conocida según la invención. Estos son: H1 - CS 1 (79% del repertorio expresado), H2 - CS 3 (46%), L1 - CS 2 de V_{\kappa} (39%), L2 - CS 1 (100%), L3 - CS 1 de V_{\kappa} (36%). El bucle H3 forma un número limitado de conformaciones de cadena principal para longitudes de bucle cortas (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1). Por tanto, donde el H3 tiene una longitud CDR3 (tal como se define por Kabat et al. (1991). Sequences of proteins of inmunological interest, U.S. Department of Health and Human Services) de siete residuos y tiene un residuo de lisina o arginina en la posición H94 y un residuo de aspartato en la posición H101 se forma un puente salino entre estos residuos y en la mayoría de los casos es probable que se produzca una única conformación de cadena principal. Al menos hay 16 secuencias de anticuerpos humanos en la librería de datos EMBL con los residuos clave y la longitud de H3 requeridos para formar esta conformación y al menos dos estructuras cristalográficas en el banco de datos de proteínas que puede usarse como base para la obtención de modelos de anticuerpos (2cgr y 1tet).

En este caso, los segmentos de genes de la línea germinal expresados más frecuentemente que codifican los residuos clave y las longitudes de bucle deseados y para producir las combinaciones necesarias de estructuras canónicas son el segmento 3-23 de V_{H} (DP-47), el segmento JH4b de J_{H}, el segmento O2/O12 de V_{\kappa} (DPK9) y el segmento 1 de J_{\kappa}. Estos segmentos pueden usarse por tanto en combinación como base para construir una librería con la conformación de cadena principal única deseada. El segmento O2/O12 de V_{\kappa} (DPK9) es miembro de la familia V_{\kappa}1 y por tanto se unirá al superantígeno Proteína L. El segmento 3-23 de V_{H} (DP-47) es un miembro de la familia V_{H}3 y por tanto debería unirse al superantígeno Proteína A, que entonces puede usarse como un ligando genérico.

B. Selección de posiciones para variación

El análisis de secuencias V_{H} y V_{\kappa} humanas indica que las posiciones más diversas en el repertorio maduro son las que efectúan la mayoría de los contactos con antígenos (véase Tomlinson et al., (1996) J. Mol. Biol., 256: 813; figura 1). Estas posiciones forman el sitio de unión a antígenos funcional y por tanto se seleccionan para la diversificación de la cadena lateral (figura 2). H54 es un residuo clave y señala el lado opuesto del sitio de unión a antígenos en la estructura canónica 3 de H2 escogida (la diversidad observada en esta posición se debe a las estructuras canónicas 1, 2 y 4 en las que H54 señala al sitio de unión). Sin embargo, en este caso H55 (que señala al sitio de unión) está diversificado. La diversidad en estas posiciones se crea o mediante la diversidad de la línea germinal o de unión en el repertorio primario o bien mediante hipermutación somática (Tomlinson et al., (1996) J. Mol. Biol., 256: 813; figura 1). Por tanto, se variaron dos subconjuntos de residuos diferentes en el sitio de unión a antígenos para crear dos formatos de librería diferentes. En la librería "primaria" los residuos seleccionados para variación son a partir de H2, H3, L2 y L3 (la diversidad en estos bucles es principalmente el resultado de la diversidad de la línea germinal o de unión). Las posiciones variadas en esta librería son: H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 y L96 (18 residuos en total, figura 2). En la librería "somática" los residuos seleccionados para variación son a partir de H1, H3, L1 y el final de L3 (aquí la diversidad es principalmente el resultado de la hipermutación somática o diversidad de unión). Las posiciones variadas en esta librería son: H31, H33, H35, H95, H96, H97, H98, L30, L31, L32, L34 y L96 (12 residuos en total, figura 2).

C. Selección del uso de aminoácidos en las posiciones que van a variarse

Se introduce una diversidad de cadena lateral en las librerías "primarias" y "somáticas" incorporando o el codón NNK (que codifica los 20 aminoácidos, incluyendo el codón de terminación TAG, pero no los codones de terminación TGA y TAA) o bien el codón DVT (que codifica el 22% de serina y el 11% de tirosina, asparagina, glicina, alanina, aspartato, treonina y cisteína y usando degeneración única, doble, triple y cuádruple en proporciones iguales en cada posición, imita lo más estrechamente la distribución de residuos de aminoácido en los sitios de unión antígeno de los anticuerpos humanos naturales).

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Ejemplo 2

Construcción y selección de librerías con los ligandos genéricos

Se ensamblaron las librerías "primarias" y "somáticas" mediante PCR usando los oligonucleótidos enumerados en la tabla 1 y segmentos de gen V de línea germinal DPK9 (Cox et al. (1994) Eur. J. Inmunol., 24: 827) y DP-47 (Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 7768). En resumen, se realizó una primera ronda de amplificación usando pares de cebadores en 5' (hacia atrás) conjuntamente con cebadores en 3' (hacia delante) NNK o DVT junto con el segmento de gen V de línea germinal correspondiente como molde (véase la tabla 1). Esto produce ocho fragmentos de ADN separados para cada una de las librerías de NNK y DVT. Entonces se realizó una segunda ronda de amplificación usando los cebadores en 5' (hacia atrás) y los cebadores en 3' (hacia delante) mostrados en la tabla 1 junto con dos de los fragmentos purificados a partir de la primera ronda de de amplificación. Esto produce cuatro fragmentos separados para cada una de las librerías de NNK y DVT (un fragmento V_{H} "primaria", 5A; un fragmento V_{\kappa} "primaria", 6A; un fragmento V_{H} "somática", 5B; y un fragmento V_{\kappa} "somática", 6B).

Se cortó cada uno de estos fragmentos y entonces se ligó en pCLEANVH (para los fragmentos V_{H}) o pCLEANVK (para los fragmentos V_{\kappa}) que contenían dominios V_{H} y V_{\kappa} simulados, respectivamente en una versión de pHEN1 que no contiene ningún codón TAG ni marcador de péptido (Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381). Entonces se sometieron los ligamientos en la cepa de E. Coli no supresora HB2151. Se produjo un fago de cada una de estas librerías y se seleccionó por separado usando inmunotubos revestidos con 10 \mug/ml de los ligandos genéricos Proteína A y Proteína L para las librerías V_{H} y V_{\kappa}, respectivamente. Entonces se preparó ADN a partir de E. coli infectado con el fago seleccionado y se cortó de modo que se sustituyeron los insertos de V_{\kappa} simulados por las librerías de V_{\kappa} correspondientes. La electroporación de estas librerías da como resultado los siguientes tamaños de librería de insertos: 9,21 x 10^{8} (NNK "primaria"), 5,57 x 10^{8} (DVT "primaria"), 1,00 x 10^{9} (NNK "somática") y 2,38 x 10^{8} (DVT "somática"). Como control para la preselección se crearon cuatro librerías adicionales pero sin selección con los ligandos genéricos Proteína A y Proteína L: los tamaños de librería de insertos para estas librerías eran de 1,29 x 10^{9} (NNK "primaria"), 2,40 x 10^{8} (DVT "primaria"), 1,16 x 10^{9} (NNK "somática") y 2,17 x 10^{8} (DVT "somática").

Para verificar el éxito de la etapa de preselección, se clonó ADN a partir de las librerías "primarias" de NNK seleccionadas y no seleccionadas en un vector de expresión basado en pUC y se sometió a electroporación en HB2151. Se escogieron 96 clones al azar de cada librería clonada nuevamente y se indujo la expresión de fragmentos scFv solubles. Se sometió a ensayo la producción de scFv funcional mediante ELISA usando Proteína L para capturar los scFv y después el conjugado Proteína A-HRP para detectar la unión. Sólo scFv que expresa los dominios V_{H} y V_{\kappa} funcionales (sin desplazamientos del marco de lectura, codones de terminación, plegamiento o mutaciones de expresión) proporcionará una señal usando este ensayo. El número de anticuerpos funcionales en cada librería (señales de ELISA por encima del valor de ruido) era del 5% con la librería "primaria" de NNK no seleccionada y del 75% con la versión seleccionada de la misma (figura 3). La secuenciación de clones que eran negativos en el ensayo confirmó la presencia de desplazamientos del marco de lectura, codones de terminación, mutaciones por PCR en residuos críticos de la región de entramado y aminoácidos en el sitio de unión a antígenos que deben evitar el plegamiento y/o la expresión.

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Ejemplo 3

Selección de librerías frente a ligandos diana

Se seleccionaron por separado las librerías de NNK "primaria" y "somática" (sin preselección) usando cinco antígenos (ubiquitina bovina, BIP de rata, histona bovina, NIP-BSA y lisozima de huevo de gallina) revestidos en inmunotubos a diversas concentraciones. Tras 2-4 rondas de selección, se obtuvieron anticuerpos altamente específicos de todos los antígenos excepto de lisozima de huevo de gallina. Se seleccionaron clones al azar para la secuenciación demostrando un intervalo de anticuerpos para cada antígeno (figura 4).

En la segunda fase, se mezclaron fagos a partir de las librerías de NNK y DVT preseleccionadas 1:1 para crear una única librería "primaria" y una única librería "somática". Entonces se seleccionaron por separado estas librerías usando siete antígenos (FITC-BSA, leptina humana, tiroglobulina humana, BSA, lisozima de huevo de gallina, IgG de ratón e IgG humana) revestidos en inmunotubos a diversas concentraciones. Tras 2-4 rondas de selección, se obtuvieron anticuerpos altamente específicos para todos los antígenos, incluyendo lisozima de huevo de gallina que no produjo resultados positivos en la fase previa de selección usando las librerías que no se habían preseleccionado usando los ligandos genéricos. Se seleccionaron clones al azar para la secuenciación, demostrando un intervalo de anticuerpos diferentes para cada antígeno (figura 4).

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Ejemplo 4

Efecto de la preselección en la expresión de scFv y la producción de fagos que portan scFv

Para verificar adicionalmente el resultado de la preselección, se clona ADN a partir de las librerías "primarias" de DVT no seleccionadas y preseleccionadas en un vector de expresión basado en pUC y se somete a electroporación en HB2151, proporcionando 10^{5} clones en ambos caso. Se recogieron 96 clones de al azar de cada librería clonada nuevamente y se indujo la expresión de fragmentos de scFv solubles. Se somete a ensayo de nuevo la producción de scFv funcional usando Proteína L para capturar el scFv seguido del uso de Proteína A-HRP para detectar scFv unido. El porcentaje de anticuerpos funcionales en cada librería es del 35,4% (no seleccionada) y del 84,4% (preseleccionada) indicando un aumento de 2,4 veces en el número de elementos funcionales como resultado de la preselección con Proteína A y Proteína L (el aumento es menos pronunciado que con la librería de NNK equivalente ya que el codón DVT no codifica el codón de terminación TAG. En la librería de NNK no seleccionada, la presencia de un codón de terminación TAG en una cepa no supresora tal como HB2151 conducirá a terminación y por tanto evita la expresión de scFv funcional. La preselección de la librería de NNK elimina los clones que contienen codones de terminación TAG para producir una librería en la que una alta proporción de miembros expresan scFv soluble.)

Con el fin de evaluar el efecto de la preselección de la librería "primaria" de DVT sobre la expresión de scFv total, se inducen las librerías no seleccionadas y preseleccionadas clonadas nuevamente (conteniendo cada una 10^{5} clones en un vector de expresión basado en pUC) para determinar la expresión policlonal de fragmentos scFv. Entonces se determina la concentración de scFv expresado en el sobrenadante incubando diluciones de dos veces (columnas 1-12 en figura 5a) de los sobrenadantes en la placa de ELISA revestida de Proteína L, seguido de detección con Proteína A-HRP, se someten a ensayo scFvs de concentración conocida en paralelo para cuantificar los niveles de expresión de scFv en las librerías de DVT no seleccionadas y preseleccionadas. Estas se usan para representar una curva patrón (figura 5b) y a partir de esto se calculan los niveles de expresión de las librerías "primarias" de DVT no seleccionadas y preseleccionadas como 12,9 \mug/ml y 67,1 \mug/ml respectivamente, es decir un aumento de 5,2 veces en la expresión debido a la preselección con Proteína A y Proteína L.

Para evaluar la cantidad de fago que porta scFv, se hacen crecer las librerías "primarias" de DVT no seleccionadas y preseleccionadas y se produce fago policlonal. Se llevan volúmenes iguales de fago a partir de las dos librerías en condiciones de desnaturalización a un gel de Bis-Tris NuPAGE al 4-12% con tampón de desplazamiento MES. El gel resultante se somete a inmunotransferencia de tipo Western, se sonda usando un anticuerpo anti-pIII y se expone a una película de rayos X (figura 6). La banda inferior en cada caso corresponde a la proteína pIII sola, mientras que la banda superior contiene la proteína de fusión pIII-scFv. La cuantificación de las intensidades de banda usando el paquete de software NIH image indica que la preselección da como resultado un aumento de 11,8 veces en la cantidad de proteína de fusión presente en el fago. En efecto, el 43% de pIII total en el fago preseleccionado está como fusión pIII-scFv, lo que sugiere que la mayoría de las partículas de fago tendrán al menos un scFv presentado en la superficie.

Por tanto, no sólo la preselección usando ligandos genéricos permite el enriquecimiento de los miembros funcionales de un repertorio sino que además conduce a una selección preferente de los miembros que están bien expresados y (si es necesario) puede provocar un alto nivel de presentación en la superficie del fago sin romperse por las proteasas bacterianas.

Claims (14)

1. Un procedimiento para seleccionar, de un repertorio de polipéptidos, una población de polipéptidos funcionales que se unen a un ligando diana en un primer sitio de unión y a un ligando genérico en un segundo sitio de unión, ligando genérico que puede unirse a miembros funcionales del repertorio independientemente de la especificidad del ligando diana, que comprende las etapas de:

a)

poner en contacto el repertorio con el ligando genérico y seleccionar los polipéptidos funcionales unidos al mismo; y

b)

poner en contacto los polipéptidos funcionales seleccionados con el ligando diana y seleccionar una población de polipéptidos que se unen al ligando diana;

en el que los polipéptidos del repertorio son de la superfamilia de inmunoglobulinas.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que los polipéptidos del repertorio son polipéptidos de anticuerpo o fragmentos de los mismos; o polipéptidos de receptores de células T.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el repertorio de polipéptidos es un repertorio de células B.

4. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que los polipéptidos son dominios variables de cadenas pesadas.

5. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que los polipéptidos son dominios V_{\kappa} o V_{\lambda}.

6. Un procedimiento en el que un repertorio de polipéptidos según la reivindicación 2 y un repertorio de polipéptidos según la reivindicación 4 se ponen en contacto con ligandos genéricos y se combinan entonces los subconjuntos así obtenidos.

7. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior en el que el ligando genérico se selecciona del grupo constituido por una matriz de iones metálicos, un compuesto orgánico, una proteína, un péptido, un anticuerpo y un superantígeno.

8. Un procedimiento para detectar, inmovilizar, purificar o inmunoprecipitar uno o más miembros de un repertorio de polipéptidos seleccionado previamente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende unir los miembros al ligando genérico.

9. Un procedimiento para detectar, inmovilizar, purificar o inmunoprecipitar uno o más miembros de un repertorio de polipéptidos seleccionado previamente según una cualquiera de las reivindicaciones a 7, que comprende unir los miembros al ligando genérico y separar luego aquellos miembros de la librería que se unen al ligando genérico.

10. Un procedimiento para detectar, inmovilizar, purificar o inmunoprecipitar uno o más miembros de un repertorio de polipéptidos seleccionado previamente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende unir los miembros al ligando diana.

11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende someter los polipéptidos seleccionados a variación adicional mediante diversificación, y se repiten las etapas (a) a (d).

12. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que los polipéptidos se diversifican en posiciones aleatorias.

13. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que los polipéptidos se diversifican en posiciones seleccionadas.

14. El procedimiento según la reivindicación 13, en el que las posiciones seleccionadas son H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 y L96.