JP3025633B2 - グルタチオン結合活性を有するポリペプチド及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、グルタチオンと特
異的に結合することができるポリペプチド又はその活性
なフラグメント、それをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを
含有する発現ベクター、該発現ベクターで形質転換され
た宿主細胞、並びにこれらを利用して該ポリペプチドを
製造する方法、及びこのようにして製造されたポリペプ
チドに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】生体は外界からの異物に対して自己を守
る防御機構をそなえている。その代表的なものが自己と
異物とを厳密に識別する免疫である。この異物を認識す
るのは免疫グロブリンあるいは抗体と呼ばれる蛋白質で
あり、異物を抗原（非自己抗原）という。利根川らによ
って免疫グロブリンの遺伝子が解明された[(Maki, R. e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 77, 2138 - 2142
(1980)]ことによって、その構造遺伝子や抗原に対する
多様性獲得の機構が遺伝子レベルで明らかにされた。図
１に示すように、抗体蛋白質は２本の重鎖（H鎖）と２
本の軽鎖（L鎖）からなる４量体によって形成されてい
る。Ｌ鎖の約半分とＨ鎖の約３／４は、抗原の種類が変
わってもそのアミノ酸配列はほとんど変わらないために
定常（Ｃ）領域と呼ばれ、Ｌ鎖、Ｈ鎖をそれぞれCL, CH
と呼ぶ。また残りの部分は抗原の種類によってアミノ酸
配列が変わるために可変（Ｖ）領域と呼ばれ、Ｌ鎖、Ｈ
鎖をそれぞれVL, VHと呼ぶ。さらにV領域の中には、抗
原によってアミノ酸配列が極めて変わり易い超可変領域
（CDR, complementarity determining region）が３箇
所あり、それぞれCDR1, CDR2, CDR3と呼ばれている。抗
体の遺伝子はDNAの再配列によって抗体の多様性、すな
わちそれぞれの異物を特異的に認識して結合する活性を
産み出している。再配列後のＢ細胞から得られた抗体遺
伝子では、L鎖遺伝子はV、J、Cの三つの遺伝子断片が、
またH鎖遺伝子は、V、D、J、Cの四つの別々の遺伝子断
片が寄せ集まって形成されている。すなわち、これらの
遺伝子断片の連結のされ方が変化することによって、遺
伝子がコードするアミノ酸配列に多様性が生じる。な
お、Jは接合(joining)を、Dは多様性(diversity)を意味
する。例えば、マウスのH鎖の遺伝子は約１００個のV断
片、約２０個のD断片、及び４個のJ断片と１個のC断片
の組み合わせから形成されているが、その再配列、すな
わち各断片からの遺伝子の選択とそれらの結合とによっ
て多くの多様性を生じる。またCDR1とCDR2はV断片によ
ってコードされ、CDR3はV断片の３’末端領域、D断片及
びJ断片の５’末端領域によってコードされている。従
って、CDRの中にあってCDR3のアミノ酸配列が一番変化
に富んでいる。

【０００３】通常、１種類の抗原によって複数のリンパ
球クローンが刺激されるので、ほとんどの抗原に対する
応答はポリクローナルである。その結果得られる免疫血
清（ポリクローナル抗体という）は、抗原分子の詳細な
機能解析や抗原分子の抗原決定基地図の作成などには利
用できない。ところが、細胞融合技術が確立された[Koh
ler, G. & Milstein, C., Nature,256, 495 - 497 (197
5)]ことによって、抗原に対して特異性を持った単一の
抗体（モノクローナル抗体という）を作出するハイブリ
ドーマ技術が確立された。この技術はモノクローナル抗
体を基礎研究や診断剤として使用する多くの実際面での
応用例を生みだしてきた。その反面、抗原でマウスを免
疫するという繁雑な操作が必要であると同時に、自己の
持つ成分や低分子量の化合物に対しては、通常免疫応答
が引き起こされないために、それらに対する抗体を得る
ことができないという問題点を有している。

【０００４】

【発明が解決すべき課題】最近、自己成分の認識の機構
に破綻をきたした自己免疫疾患の存在が数多く明らかに
されてきた。このような自己成分の１つにグルタチオン
がある。グルタチオンは低分子量であって、その血中や
尿中の濃度が上昇するとグルタチオン血症（glutathion
emia）などの疾患を引き起こす。また、癌細胞の耐性獲
得にも関与していることが示唆されている。グルタチオ
ンは主として小胞体に存在して小胞体の酸化還元状態を
コントロールしており、蛋白質が正しい構造を形成する
上で必須の成分である。さらには蛋白質のジスルフィド
と反応して、そのジスルフィド基を維持する機能や過酸
化水素遊離反応基と反応して解毒する機能をも有する。
従って、このようなグルタチオンあるいはグルタチオン
で修飾された蛋白質を迅速に検出しかつ定量する手法が
望まれている。そのためには抗体の利用が望ましいが、
グルタチオンは自己成分であると同時に分子量が小さい
ため、これまでの技術では抗体を取得することは不可能
であった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、グルタチ
オンに対して特異的な結合活性を有する抗体を提供する
ことを目的として鋭意、研究を重ね、ある種のファージ
ディスプレイライブラリー(phage display library)か
ら、グルタチオンと特異的に結合し得るポリペプチドを
コードするＤＮＡを得、該ＤＮＡを用いて目的のグルタ
チオン結合活性を有するポリペプチドを製造することに
成功した。即ち、本発明は、グルタチオン及びグルタチ
オンで修飾された蛋白質と結合することを特徴とするポ
リペプチドを提供するものである。本発明のポリペプチ
ドは、グルタチオンに特異的に結合するものであればい
かなるものであってもよいが、好ましくは、ＣＤＲ３領
域に、少なくとも配列番号１、２、３又は４に記載のア
ミノ酸配列を含有する、免疫学的に活性なポリペプチド
又は１個以上のアミノ酸の欠失、挿入又は置換によるそ
の誘導体又はその活性フラグメントであり、さらに好ま
しくは配列番号５、６、７又は８に記載のアミノ酸配列
を含む免疫学的に活性なポリペプチド又は１個以上のア
ミノ酸の欠失、挿入又は置換によるその誘導体又はその
活性フラグメントである。本発明はまた、グルタチオン
結合活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提
供するものである。本発明のＤＮＡは、少なくとも、配
列番号１、２、３又は４に記載のアミノ酸配列をコード
する塩基配列を含有することが好ましい。本発明はま
た、該ＤＮＡを含有する発現ベクターを提供するもので
ある。さらに、本発明は該発現ベクターで形質転換され
た宿主細胞を提供するものである。本発明はまた、該宿
主細胞を培養し、培養物から免疫学的に活性な生成物を
分離することを含む、グルタチオン結合活性を有するポ
リペプチドの製造方法を提供するものである。

【０００６】本明細書中、本発明のグルタチオン結合活
性を有するポリペプチドを表すために、「蛋白質」及び
「ポリペプチド」を相互変換可能に用いる。本発明によ
り、グルタチオン結合活性を有するポリペプチドをコー
ドするＤＮＡが開示されたので、それを用いて該ＤＮＡ
の合成ができ、また既知のアミノ酸の欠失、挿入及び置
換の手法に従い、グルタチオン結合活性を有するポリペ
プチドの誘導体を得ることができる。従って、本発明は
そのようにして得られる誘導体をも包含するものであ
る。さらに、本発明のポリペプチドは、抗原（グルタチ
オン）を認識し、結合活性を保持している限り、適当な
長さの断片であってもよい。従って、本発明は、そのよ
うな活性フラグメントをも包含するものである。断片化
は、当業者既知の方法で行うことができる。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下に本発明のグルタチオン結合
活性を有するポリペプチドの製造について説明する。本
発明のポリペプチドはファージディスプレイライブラリ
ー(phage display library)[Winter, G. and Milstein,
C., Nature, 349, 293 - 299 (1991)]の１種であり、N
issimらによって作成された公知のライブラリー[Nissi
m, A., et al., EMBO J., 13, 692 - 698 (1994)]から
選択された。このライブラリーは以下に記載の方法や文
献に従って当業者が作製できる。ファージディスプレイ
ライブラリーは、特に、自己及び／又は低分子量抗原に
対する抗体の選択に好都合である。例えば、環状一重鎖
DNAを持った大腸菌のファージ、例えばファージfdを利
用した場合、その表面に発現しているコート蛋白質、例
えばg3p（gene 3 protein）のN末端にペプチドや蛋白質
をつないで、目的とするペプチドや蛋白質をファージの
表面に発現させ、その機能を調べることができる。従っ
て、大腸菌を用いてファージ表面に一重鎖のFvフラグメ
ント（VHの下流にリンカーを介してVLをつないだもの，
ｓｃＦｖともいう）、あるいはFabフラグメント（抗体
のVL,CL1とVH,CH1からなるヘテロ二量体）（図２参照）
を、表現させることができる[Hoogenboom, H. R.et a
l., Nucleic Acids Res., 19,4133 - 4137 (1991)]。後
者のように、重鎖部分をファージ表面に発現させた場合
は、軽鎖部分を同時に分泌発現させ、大腸菌のペリプラ
ズム内で両者を再構築してFabとすることができる。一
方、抗体フラグメントとファージコート蛋白質との間に
アンバー変異を入れておき、かつ宿主を使い分けること
によって、フラグメントを可溶性蛋白質として回収する
こともできる。従って、in vivo [Marks, J. D.et al.,
J. Mol. Biol., 222, 581 - 597 (1991)]あるいはin v
itro[Hoogenboom, H. R. & Winter, G., J. Mol. Bio
l., 227, 381 -388 (1992)]で再配列させたＶ遺伝子を
使ってより多彩な組合せを作れば、動物を免疫する方法
によらず、同一ライブラリーから異なる結合能をもった
一重鎖のFvフラグメント又はFabフラグメントを単離で
きる。

【０００８】このように、これらのライブラリーから外
来抗原、自己抗原を含めていろいろな抗原を認識する一
重鎖Fvフラグメント又はFabフラグメントを選択するこ
とが可能である。なお、図２はg3pを介して抗体ペプチ
ドをファージ表面で発現させた状態を示している。図
中、（ａ）はFabフラグメント（抗体のVκ,CκとVH,CH1
からなるヘテロ二量体）を、（ｃ）は一重鎖のFvフラグ
メント（VHの下流にリンカーを介してVκをつないだも
の）を、g3pを介してそれぞれファージ上で発現させた
状態を示している。様々なVH 及びVL遺伝子の組合せは
ポリメラーゼ鎖反応(PCR)によって増幅されたリンパ球
の数に由来しており、様々なフラグメントがランダムに
対をなすことによって形成される。このようにして作成
したライブラリーから、数回の選択を繰り返して目的と
する物質に対する結合能を有するファージが選び出され
る。即ち、既に公知の方法でヒトの末梢血リンパ球から
mRNAを抽出して相補DNAを調製し、PCR法によって人工的
に再配列させた抗体のV遺伝子を増幅してそのレパート
リーを調製する。このＨ鎖及びＬ鎖のV領域を線状ファ―シ
゛の表面に表現させたライブラリーを構築し、この多様
な組み合わせから目的とする一重鎖Fvフラグメント又は
Fabフラグメントを取得できる。

【０００９】既述のごとく、本発明のグルタチオン結合
活性を有するポリペプチドは、公知のライブラリー[Nis
sim, A., et al., EMBO J., 13, 692 - 698 (1994)]か
ら選択された。このライブラリーは、４から１２残基か
らなるランダムなアミノ酸配列を導入できるようにデザ
インされたPCRプライマーを使って人工的なCDR3を造成
し、その結果得られたCDR3領域をもつVH遺伝子[Hoogenb
oom, H. R. & Winter,G., Nucleic Acids Res., 227,38
1 - 388 (1992)]を含んでいる。このライブラリーは、i
n vitroで再配列された５０のヒト生殖細胞ＶＨ遺伝子
からなる種々の組合せのヒトVH遺伝子とＬ鎖としてヒト
Vλ3遺伝子とを組合せ、これらを前述した単鎖Fvフラグ
メント（sc Fv)としてファージ上に発現させたものであ
る。５０の生殖細胞VH断片の一つ一つはVHファミリーに
基づくプライマーであるVHBACKSfiとHSLP4- HSLP12[Mar
ks, J. D., et al., J. Mol. Biol., 222, 581 - 597
(1991)]を使って増幅することができる[Hoogenboom, H.
R. & Winter, G., NucleicAcids Res., 227, 381 - 38
8 (1992)]。

【００１０】ヒトのVH断片のCDR1、CDR2の配列多様性
は、生殖細胞由来のおよそ５０のVH断片の種類によって
決められている[Tomlinson, I. M., et al., J. Mol. B
iol.,227, 776-798(1992)]。またCDR3の配列は生殖細胞
由来のVH断片の配列、及びおよそ３０個のD及び６個のJ
断片の組み合わせで生成するので[Ichihara, Y., eta
l., EMBO J., 7, 4141-4150 (1988)]、極めて変化に富
んでおり、かつアミノ酸残基の数も４−２５残基と異な
っている。従って、HSLPプライマーはJ断片と４から１
２個のアミノ酸からなるランダムな配列［(A/C, N, N)
n，（nは4 - 12，Nは塩基A,T,G,Cを示す）］を持つDNA
断片を導入できるようにデザインされる。さらにプライ
マーの３’末端部分は、VH断片のFR3（CDR2とCDR3をコ
ードする領域にはさまれた遺伝子上の領域）にアニール
できるようデザインする。しかるに、HSLPの配列は5'-G
AC CAG GGT ACC TTG GCC CCA[(A/C)nNN]TCT TGC ACA GT
A ATACAC GGC CGT GTCである。鋳型はそれぞれのVHセグ
メントをコードしている組換えM13ファージを感染させ
た１０⁶の大腸菌として供給されている。

【００１１】最初のPCRは、例えば94℃で1分間処理して
一本鎖にしたDNAに、VHBACKSfiとHSLPのプライマーを共
存させて55℃で1分間アニーリングする。続いて４種類
のデオキシリボヌクレオチド３リン酸(dNTP)の共存下で
72℃で1.5分、DNAポリメラーゼと反応させる。この反応
を２５回繰り返してDNAを増幅する。２回目のPCRでは、
JH断片の３'末端側にクローニングのために制限酵素切
断部位、例えばSalIサイトを導入する。この場合には、
プライマーとしてVHBACKSfi（既出）とJHSAL［Nissim,
A., et al., EMBO J., 13, 692 - 698 (1994)]とを使っ
て、さらに１５回PCR反応を繰り返し、DNAを増幅する。
ここで、JHSALの配列は、5'-GCC TGA ACC GCC TCC ACC
AGT CGA CAC GGT GAC CAG GGT ACC TTG GCC CCA (配列
番号９）であり、下線で示した部分がSalIサイトであ
る。

【００１２】４５０（５０の生殖細胞由来のVH断片と４
から１２の９種の異なる長さを持つCDR3のPCR生成物の
合計）の試料のバンドの大きさをアガロース電気泳動で
チェックした後、制限酵素NcoIとSalIで処理して得た断
片をpHEN1-Vλ3[(Hoogenboom, , H. R. & Winter, G.,
J. Mol. Biol., 227, 381 - 388 (1992)]のNcoI - XhoI
切断部分と連結する。このベクターにはすでにVλ3 を
コードする遺伝子が組み込まれている（図３）。なお、
図３のtagとして示される部分にc-mycペプチドの配列が
入っている。得られるポリペプチドは図２（ｃ）で示さ
れるｓｃＦｖの型でファージ上に発現される。その結
果、それぞれ少なくとも１０⁷の異なるクローンを含む
９種のファージミドライブラリーを構築できる。それぞ
れのライブラリーはヘルパーファージVCS-M13(Stratage
ne社）を使ってファージとして取り出すことができる。
これらのライブラリーはファージミドを大腸菌に感染さ
せて保存する。

【００１３】ライブラリーの増殖には、およそ１０⁸個
の上述した組換え大腸菌を３７℃で、例えばアンピシリ
ンを含む50mlの培地中で600nmにおける濁度(OD)が0.5に
なるまで振とう培養する。次にその10mlに例えばVCS-M1
3あるいはM13-KO7(Stratagene社)などのヘルパーファー
ジを、数として大腸菌の約20倍になるように加え、静置
したまま37℃で30分間培養する。次に、4000rpmで10分
間遠心して菌体を集め、それをアンピシリンとカナマイ
シンとを含む30mlの培地に懸濁した後、さらに培地を加
えて300mlとし、30℃で一夜振とう培養する。

【００１４】pHEN1ファージミド粒子の調製にあたって
は、上述した培養液を例えば８０００ｒｐｍで１０分間
遠心した後、常法に従ってファージを集めればよい。す
なわち得られた上清にその１/５量のポリエチレングリ
コール溶液（20％ポリエチレングリコール6000、2.5M N
aCl）を加えてよく混合した後、4℃で1時間放置する。4
000rpmで30分間遠心して得られたペレットを40mlの水に
懸濁後、8mlの上記のポリエチレングリコール溶液を加
え、4℃で20分放置する。この溶液を4000rpmで30分遠心
して上清を除く。このようにして得られたペレットを2.
5mlの水に懸濁し、さらに4000rpmで10分遠心して残った
細胞破片を取り除いて4℃で保存する。この方法で1−5
×１０¹³PFUのファージが得られる。

【００１５】グルタチオン結合活性を有するポリペプチ
ドの選択のために、まずグルタチオンを、例えば牛血清
アルブミン（BSA）に結合させる。方法はPierce社の手
順書に従えばよい。すなわちスペーサーとしてSulfo-SM
CC[スルホスクシニミジル 4-(N-マレイミドメチル)シク
ロヘキサン-1-カルボキシレート]を用いてグルタチオン
とBSAとを結合させる。まずpH7.0の緩衝液にBSAとその1
/4量のSulfo-SMCCを溶解し、30℃で1.5時間振とうしな
がら反応させた後、例えばPD-10のようなゲル濾過カラ
ムを通して結合物を得る。このようにして得られたマレ
イミド化されたBSA溶液にグルタチオンを加え、撹拌し
ながら室温で2時間反応させる。得られた溶液を例えばP
D-10のようなゲル濾過カラムを通してグルタチオンとBS
Aとが結合したものを選り分ける。

【００１６】次にこのようにして得られたグルタチオン
と結合したBSAをチューブ（Nunc-immunotube，Nunc社）
に加え、室温で一夜放置する。次の日にチューブをPBS
（食塩を含むリン酸バッファー）で3回洗浄した後、例
えばスキムミルクを含むPBSを用いてブロッキングし、
さらにPBSで3回洗浄する。上記のチューブにスキムミル
ク入りPBSに１０¹²から１０¹³PFUの上記ファージを加
え、室温で反応させる。チューブは0.1％のTween-20を
含むPBSで20回、さらにはPBSで20回洗浄して界面活性剤
を除去する。結合したファージは例えば100mMのトリエ
チルアミンを加えて10分間上下に回転して溶出する、溶
出されたファージは即座に中和しなければならない。得
られたファージは4℃で保存する、このようにして得ら
れたファージは例えば大腸菌TG1に感染させて、上記ラ
イブラリーの増殖と同様の方法で増殖させることができ
る。

【００１７】次に、増殖した大腸菌のコロニーをアンピ
シリンを含む100μlの培地を分注した96穴のプレートに
移植し、振とうしながら37℃で一夜増殖させる。次は20
0μlの同じ培地を含む96穴のプレートに各穴から少量移
植して37℃で1時間振とうして培養する。各穴に１０⁹PF
UのVCS-M13を加えて37℃で30分放置した後、37℃で1時
間振とうし、4000rpmで10分又は同様の条件下で遠心し
て上清を除く。ペレットをアンピシリンとカナマイシン
とを含む200μlの培地に懸濁して30℃で一夜振とう培養
する。培養液を同様に遠心分離してその上清をファージ
ELISAに使用する。

【００１８】このようにして選んだファージを可溶性の
蛋白質として発現させる。まず１０⁵PFUのファージを大
腸菌HB2151に37℃で30分感染させる。これを希釈してア
ンピシリンを含む培地にまき37℃で一夜培養する。生じ
たコロニーをアンピシリンを含む100μlの培地を分注し
た96穴のプレートに移植して37℃で一夜振とう培養す
る。もう一度同じ培地を含む96穴のプレートに移植し
て、さらに37℃で600nmにおけるODがおよそ0.9になるま
で振とう培養して増殖させる。ODが目的値に到達した
ら、IPTGを加えてさらに16から24時間振とうして遺伝子
を誘発発現させる。4000rpmで10分遠心分離して、その1
00μlをELISAにかける。

【００１９】単鎖FvのＬ鎖の後ろにはc-mycのペプチド
が連結されているので、それを認識する抗体9E10[Clack
son, T., et al., Nature, 352, 624-628(1991)]を使っ
て発現した単鎖Fvを検出することができる。まず常法に
従ってBSAに結合させたグルタチオンをプレートの穴に
コーティングする。その96穴のプレートに上述した単鎖
Fvを含む培養上清を加え吸着させた後、常法通り精製し
た9E10（9E10を生産するハイブリドーマはEuropean Col
lections of Animal Cell Culture, Centre for Applie
d Microbiology and Research（ＥＣＡＣＣ）, Porton
Down, Salsbury, SP4 OJK UKから受託番号８５１０２２
０２として入手できる）を加えて反応させる。次にパー
オキシダーゼを結合させた抗マウス抗体(Dakopatsある
いはICN Biomedicals Inc. UKから入手できる）を加え
て9E10に結合させて、次に洗浄する。これにABTS[2,2'-
azino bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)
diammonium salt]と過酸化水素水を加えて20ー30分放置
した後、フッ化ナトリウムを加えて405nmでの吸収を読
み、単鎖Fvの量を定量する[Nissin, A., et al., EMBO
J., 13, 692-698(1994)]。大量の蛋白質を必要とする時
は、通常の組み換え体の培養方法に従えばよい。また培
養液から単鎖Fvを精製するには、例えば上清を限外濾過
などの方法で濃縮する。次にグルタチオン−Sートラン
スフェラーゼを精製するのに用いるグルタチオン−セフ
ァロース4Bカラムを用いてグルタチオン結合活性を有す
る単鎖Fvを精製できる。またモノクローナル抗体9E10を
用いても精製が可能である。その他単鎖Fvの精製に利用
できる技術はいずれもグルタチオン結合活性を有するポ
リペプチドの精製に有効である。また遺伝子を取り出し
て目的とするベクターにつなげば、大腸菌に限らず酵
母、枯草菌、糸状菌、昆虫細胞、動物細胞や植物細胞な
ど、好みに従って単鎖Fvの発現に利用できる。このよう
にして得られたグルタチオン結合活性を有するポリペプ
チドは、目的通りグルタチオンの検出や定量に有用なこ
とが判った。

【００２０】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明する。なお以下の実施例は単なる例示に過ぎず、い
かなる意味においても、本発明を制限するものではな
い。実施例１ ライブラリーの培養 本発明のグルタチオン結合活性を有するポリペプチドの
製造には、公知のNissimらのライブラリー[Nissim, A.,
et al., EMBO J., 13, 692 - 698 (1994)]を用いた。
ライブラリー50μl（約１０⁸cells）を100μg/ml のア
ンピシリン（ 明治製菓）及び 1％ のグルコースを含む
50ml の２ｘTY（１l中に16gのトリプトン、10gの酵母エ
キス、5gのNaClを含む）を入れた300mlのはね付きマイ
ヤーに加え、攪拌しながら、37℃で培養した。波長600n
mの吸光度が0.5に達したとき、培養液10mlを取り、ヘル
パーファージVCS―M13（Stratagene）を大腸菌TG1株と
ヘルパーファージの数比が1:20になるように加えた。

【００２１】一方、残りの40mlは遠心して、沈殿を約0.
5mlの２ｘTYに懸濁した後、100mg/ml のアンピシリン
及び 1％ のグルコースを含むTYE（1l中に10gのトリプ
トン、5gの酵母エキス、8gのNaCl、15gのバクトアガー
を含む）プレートにまき、37℃で一晩培養して、そのす
べてを適量の２ｘTY（2〜5ml）に懸濁し、最終濃度が20
％になるようにグリセロールを加えて―80℃凍結保存用
とした。ヘルパーファージを加えた培養液は37℃の水浴
中で30分間培養した後、2500rpmで15分間遠心分離して
上清を除いた。沈殿を100μg/ml のアンピシリンと25μ
g/ml のカナマイシン（和光純薬）を含む30mlの２ｘTY
に懸濁し、あらかじめ30℃に保温した100μg/ml のアン
ピシリンと25μg/ml のカナマイシンを含む270mlの２ｘ
TYに加えた後、攪拌しながら30℃で一晩培養した。

【００２２】実施例２ ファージの調製 実施例１に従って、一晩培養した液を8000rpmで10分間
遠心分離して沈殿を除去した後、培養上清にPEG/NaCl溶
液（20％のポリエチレングリコール6000と2.5MのNaClを
含む）を1/5容量加え、よく攪拌した後４℃で１時間放
置した。その後、8000rpmで30分間４℃で遠心分離し
て、上清を取り除き、沈殿を40mlの滅菌水に懸濁して、
8mlの上記のPEG/NaCl溶液を加えた後、攪拌し４℃で20
分間静置した。4000rpmで30分間遠心分離して、上清を
デカンテーションで取り除いた後、PEG/NaCl溶液を完全
に取り除くために、再度、4000rpmで10分間遠心分離し
て、上清をアスピレーターで取り除いた。その後、沈殿
を2.5mlの滅菌水に懸濁して、4000rpmで10分間遠心分離
した後、上清を新しいチューブに移し、ファージ溶液を
得た。このファージ溶液は大腸菌TG1株を宿主としてフ
ァージのtiterを測ったところ、1ｘ10¹³PFUであった。

【００２３】実施例３ グルタチオンとキャリアータン
パク質との連結 [スルホスクシニミジル 4-(N-マレイミドメチル)シクロ
ヘキサン-1-カルボキシレート（sulfo-succinimidyl 4-
(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate）；
以下、sulfo―SMCCと略す］1.5mg を 1ml の100mM リン
酸ナトリウム緩衝液、0.9M NaCl、0.1M EDTAを含むpH7.
0のコンジュゲート用緩衝液（以下conjugation buffer
という） に溶解させ、キャリアータンパク質として牛
血清アルブミン（以下BSAと略す）（Sigma） もしくは
Keyhole limpet ヘモシアニン（以下KLHと略す）（CALB
IOCHEM）4mgを加え30℃で2時間攪拌した後、conjugatio
n buffer で平衡化したPD―10カラム（Pharmacia）にか
け、１mlずつ分取した。波長 280nmで各フラクションの
吸光度を測定し、一番初めに現われたピークの前後4本
を集めた。次に、グルタチオン 4mg をconjugation buf
fer 0.5ml に加え、その中から、50μlを取っておき、
残りをsulfo―SMCCとキャリアータンパク質をコンジュ
ゲートした溶液に加えた。4℃で一晩もしくは室温で2時
間反応させた後、100mM リン酸ナトリウム、0.9M NaCl
を含むpH7.0の精製用緩衝液（以下purification buffer
という） で平衡化したPD―10ゲル濾過カラムにかけ、
0.5ml ずつ分取し、波長 280nmにおける吸光度を測定し
て、一番大きいピークを集めた。なお、コンジュゲート
した蛋白質中のグルタチオン濃度は、Elleman's反応に
て測定した（Ellman, G. L. Arch. Biochem. Biophys.
94, 75-81(1958)）。BSA−グルタチオン溶液は、グル
タチオンの濃度が約50μg/mlになるように1l中に5.84g
のNaCl、4.72gのNa₂HPO₄、2.64gのNaH₂PO₄.2H₂Oを含むp
H7.2に調製した緩衝液（以下PBSと略す）で希釈してパ
ニングのコーティング用として、また10μg/mlもしくは
1μg/ml になるように同様にPBSで希釈してELISAのコ
ーティングに用いた。

【００２４】実施例４ グルタチオン結合活性を有する
ポリペプチドをディスプレイするファージの選択 約50μg/mlのＢＳＡ−グルタチオンを含むPBS溶液を 高
蛋白結合能を持つチューブ（Nunc）もしくはマイクロタ
イタープレート（Coastar）に2mlもしくは200μlずつ加
え、室温で一晩放置した。次の日、グルタチオン溶液を
除いた後、PBSを噴射びんで注ぎ、デカンテーションで
洗液を除く方法で3回洗浄した。次に、2％のスキムミル
クを含むPBS（以下2％MPBSと略す）をふちまでいっぱい
に満たし、ふたをして37℃で2時間放置した後、PBSで3
回洗浄した。これに実施例２で調製した10¹²PFUのファ
ージを含む2％MPBS溶液を加え、室温で２時間放置し
た。その後、0.1％Tween―20を含むPBSで15回洗浄し、
次に、PBSで15回洗浄した。ファージ溶液を溶出するた
めに100mMのトリエチルアミンを、チューブの場合には1
ml、プレートの場合には100μlずつ加え10分間放置し
た。10分間経過した後、溶出されたファージ溶液を先に
用意したトリエチルアミンの半分量の1M Tris-HCl、pH
7.4の入ったチューブに加え、直ちに中和した。

【００２５】次に、あらかじめ波長600nmの吸光度が0.5
になる迄培養した大腸菌TG1株9mlにファージ液1mlを加
え、37℃で30分間培養した。その後、１０¹から１０⁷ま
での希釈系列をそれぞれ200μlずつ調製し、そのうちの
100μlずつを100μg/ml のアンピシリン 及び 1％ のグ
ルコースを含むTYEプレートにプレーティングした。ま
た、残りの培養液は、2500rpmで20分間遠心分離した
後、沈殿を1mlの２ｘTＹに懸濁し、100μg/ml のアンピ
シリン 及び 1％ のグルコースを含むTYEのプレートに
プレーティングした。得られた大腸菌はグルタチオン結
合活性を有するポリペプチドをディスプレイするファー
ジを含むものとして、すべてのプレートを37℃で一晩培
養した。

【００２６】実施例５ アフィニティークロマトグラフ
ィーによるグルタチオン結合活性を有するポリペプチド
をディスプレイするファージの選択 まず、Glutathione―Sepharose 4B （Pharmacia） をPB
Sで膨潤し、1mlの担体としカラムにつめPBSで洗浄し
た。10mlの2％MPBSでブロッキングした後、実施例２で
得た10¹²PFUのファージを含む2％MPBS溶液をこのカラム
にかけた。その後、10ml のPBS、10ml の2％MPBS、10ml
の0.5MNaCl―50mMTris―HCl、pH7.5、 10mlの0.5MNaCl
―50mMTris―HCl、pH8.5、 10ml の0.5MNaCl―50mMTris
―HCl、pH9.5で順にカラムを洗浄した後、5ml の100mM
トリエチルアミン を用いてファージを溶出した。その
際、溶出されたファージをすぐに中和するために、実施
例４と同様にして溶出液を採取するチューブに前もっ
て、2.5ml の1.0M Tris―HCl、pH7.4を加えておいた。こ
のファージ溶液を2ml取って前もって600nmに於ける吸光
度が0.5になるように培養しておいた大腸菌宿主ＴＧ１
の培養液10mlに加えた。37℃で30分間培養した後、100
μlを取って100μg/ml のアンピシリン 及び 1％ のグ
ルコースを含むTYEプレートにまき、次の日、プレート
に出てきたコロニー数を数えた。また、残りの培養液
は、遠心して菌体を沈殿させた後、200μlの２ｘTYで懸
濁し100μg/ml のアンピシリン 及び 1％ のグルコース
を含むTYEプレートにまいた。選択されたコロニーは、
実施例６のELISAに供した。

【００２７】実施例６ ELISAによるグルタチオン結合
活性を有するポリペプチドをディスプレイするファージ
の検出 実施例４または５で選択したグルタチオン結合活性を有
するポリペプチドをディスプレイするファージによって
生じたコロニー570個を、100μg/mlのアンピシリン及び
1％のグルコースを含む100μlの２ｘTYの入った96穴の
マイクロタイタープレート（Corning）に接種し、攪拌
しながら37℃で一晩培養した。次の日、培養液の30μl
を取って100μg/ml のアンピシリン 及び 1％ のグルコ
ースを含む200μlの２ｘTYの入った96穴のマイクロタイ
タープレートに移し、攪拌しながら37℃で１時間培養し
た。その後、各穴に10⁹PFUのVCS―M13ヘルパーファージ
と100μg/mlのアンピシリン及び1％ のグルコースを含
む25μlの２ｘTYを加えて、37℃で30分間静置し、さら
に1時間攪拌した後、2000rpmで30分間遠心分離して、上
清を除去した。沈殿を100μg/ml のアンピシリン 及び5
0μg/mlのカナマイシン を含む200μlの２ｘTYに懸濁
し、攪拌しながら30℃で一晩培養した後、2000rpmで30
分間遠心分離して、この上清をファージ液として以下の
ELISAに用いた。

【００２８】96穴のマイクロタイタープレート（Coasta
r）に10μg／mlのBSA―グルタチオンを50μlずつ加え、
室温で一晩静置した後、PBSで１回プレートを洗ってか
ら、200μlの2％MPBSを各穴に加え、室温で2時間放置
し、ブロッキングした。その後、各穴にすでに調製した
ファージ溶液を50μlずつ加え、2時間室温で放置した
後、0.05％Tween20を含むPBSで1回、PBSで2回洗浄し
た。この穴にホースラディッシュパーオキシダーゼ（以
下HRPと略す）コンジュゲート抗M13ファージ抗体(Pharm
acia)を50μlずつ加え、室温で1時間放置した。その間
に、2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン)-6 ス
ルホン酸 ジアンモニウム塩（2,2'-Azino bis (3-ethyl
benzothiazoline)-6 sulfonic acid diammonium salt；
以下ABTSと略す）10mgを20mlの50mMのクエン酸、pH4.5
に加え、発色液とした。プレートを0.05％Tween20を含
むPBSで2回、PBSで2回洗った後、上記の発色液に36μl
のH₂O₂を加え、よく混ぜた後、各穴に50μlずつ加え
た。20〜60分室温で放置した後、マイクロプレートイム
ノリーダーを用いて、波長405nmの吸光度の値を測定
し、グルタチオン−キャリアー蛋白質に対する結合能を
調べた。その結果、570コロニー中、波長405nmの吸光度
の値が0.5以上のものが24コロニー、0.1〜0.5までのも
のが57コロニー得られた。これらのコロニーをKLHーグ
ルタチオンを抗原としたELISAを行なったところ、すべ
てのコロニーで結合活性が認められた。また、BSAを抗
原としてELISAを行なったところ、42個のクローンで結
合活性が認められなかった。この結果に基づいて、グル
タチオン−キャリアー蛋白質に特異的に結合するポリペ
プチドをディスプレイするファージとしてこれらの42個
のクローンを選択した。

【００２９】実施例７ グルタチオン結合活性を有する
単鎖Fv (scFv)フラグメントの検出 １） sc Fvフラグメントの調製 これまで述べた過程で、グルタチオンとの結合能を持つ
ことが確認されたクローンが、グルタチオン結合活性を
有するｓcFvフラグメントとして働くことができるかど
うかを調べた。調製されたファージを一部とって、大腸
菌宿主HB2151に接種した。37℃で30分間水浴中で培養し
た後、100μg/ml のアンピシリン 及び1％ のグルコー
スを含むTYEプレートにまいて、一晩37℃で培養して生
じたコロニーをプレートからとって100μg/ml のアンピ
シリン 及び 1％ のグルコースを含む2.5ml の２ｘTYに
移し、攪拌しながら一晩37℃で培養した。次の日、培養
液50μlをとって100μg/ml のアンピシリン 及び 0.1％
のグルコースを含む30mlの２ｘTY を入れた200mlのマ
イヤーに加え、37℃で培養し、波長600nmの吸光度の値
が0.9になったら、最終濃度が1mMになるようにイソプロ
ピルチオ-β-D-ガラクトシド（Isopropylthio-β-D-gal
actoside；以下IPTGと略す）を加え、攪拌しながら30℃
で16〜24時間培養した。その後、遠心分離して菌体を除
去し、上清を濾過して別の容器に移し、10倍程度に濃縮
してscFvフラグメント溶液とした。残りの培養液の一部
は、等量の80％グリセロールを加えて、―80℃で保存し
た。

【００３０】２）抗 c-myc 抗体 の調製 本発明のポリペプチドは、図３にｔａｇとして示すよう
に、c-mycペプチドが単鎖FvフラグメントのＣ末端に結
合した形で発現されるので、該ペプチドに対する抗体を
用いて検出することができる。そこで、該scFvフラグメ
ントの検出に必要である抗 c-myc モノクローナル抗体
をハイブリドーマを用いて調製した。まず、抗 c-myc
抗体を産生するハイブリドーマMycl 9E10 (ECACCより８
５１０２２０２として入手可能)を10％ のウシ胎児血清
（以下FCSという）を含むRPMI 1640培地(Gibco)10mlで
一晩37℃、5％CO₂で培養した。次の日、細胞数を数え、
10⁵/mlになるように希釈した後、一晩37℃、5％CO₂で培
養した。5日間、細胞数のカウントと希釈を繰り返した
後、細胞を十分に増やすため1週間37℃、5％CO₂で培養
した。次に、培養液を濾過し、上清をFPLCシステム（Ph
armacia製）を用いて50mM クエン酸が12.8％、100mMリ
ン酸水素二ナトリウムが87.2％の緩衝液で平衡化したsu
per protein Gカラム（Pharmacia製）にかけた。同じ緩
衝液で洗浄した後、50mM クエン酸が89.2％、100mM リ
ン酸水素二ナトリウムが10.8％の緩衝液で溶出し、溶出
液を中和するために、1mlあたり150μlの1.0M Tris−HC
l緩衝液を加えた。その後、この溶出液を50mM クエン酸
が12.8％、100mM リン酸水素二ナトリウムが87.2％の緩
衝液で平衡化したprotein Gカラム(Pharmacia製）にか
け、洗浄後、50mM クエン酸が89.2％、100mM リン酸水
素二ナトリウムが10.8％の緩衝液で溶出した。1mlあた
り150μlの1.0M Tris−HCl緩衝液を加えて中和した後、
PBSにバッファー交換して2mg/mlに調製して抗体溶液と
した。

【００３１】３） sc Fv フラグメントのELISAによる
検出 実施例６のファージ溶液を用いたELISAによる検出の場
合と同様に、BSAーグルタチオンを用いたコーティング
及びブロッキングを行なった。その後、各穴に2％のス
キムミルクを含む50μlのscFvフラグメント溶液を加え
た。2時間室温で放置した後、穴を0.05％Tween20を含む
PBSで1回、PBSで2回洗い、上記２）で調製した4μg/ml
の9E10 抗体 (抗マウス c-myc 抗体)を50μlずつ加え、
90分間室温で放置した。穴を0.05％ Tween20を含むPBS
で2回、PBSで2回洗い、次にHRP コンジュゲート抗マウ
ス抗体（Sigma）を 50μlずつ加え、90分間室温で放置
した。その間に、10mgのABTSを20mlの50mM クエン酸、pH
4.5に溶解し、ABTS溶液を調製した。0.05％ Tween20を
含むPBSで2回、PBSで2回穴を洗った後、上記のABTS溶液
に36μlのH₂O₂を加えた溶液を各穴に50μlずつ加えた。
20〜60分間室温で放置した後、波長405nmの吸光度の値
を測定し、scFvフラグメントのBSA−グルタチオンとの
結合能を測定して以下の結果を得た。

【００３２】95個のクローンについて測定を行なったと
ころ、波長405nmの吸光度の値が0.5以上のものが10コロ
ニー、0.2から0.5までのものが19コロニー得られた。ま
た、これらの29個のコロニーについてBSAを抗原としてE
LISAを行なったところ、BSAに対する結合活性がほとん
ど認められなかったものが14コロニー、少し活性があっ
たものが11コロニー、波長405nmの吸光度の値が0.1以上
あったものが、4コロニー得られた。そこで、BSAに対す
る結合活性がほとんど認められなかったものと少し活性
が認められたものをBSA−グルタチオンに特異的に結合
するscFvフラグメントとして選択した。

【００３３】実施例８ イムノブロッティングによるグ
ルタチオン結合活性を有するポリペプチドの検出 １）ドットブロッティングによる検出 実施例６のELISAによって結合活性が認められたクロー
ンについて、結合特異性を調べるためにドットブロッテ
ィングを行った。適当な大きさのPVDF膜（Millipore）
をメタノールとPBSで洗った後、BSAーグルタチオン、KL
Hーグルタチオン、BSAを１ドットにつき、約2μgずつPV
DF膜に結合させて、10％MPBSで室温で1時間ブロッキン
グを行なった。0.2％Tween20を含むPBSでメンブレンを5
分間, 2回洗浄し、0.2％Tween20と2％スキムミルクを含
む、実施例６で得たファージ溶液（１０¹¹PFU/ml）１ml
を、メンブレンを入れたハイブリバッグに加えた。４℃
で一晩振盪した後、0.2％Tween20を含むPBSで5分,2回洗
い、0.2％Tween20を含む2％MPBSで5000倍に希釈したHRP
とコンジュゲートしたヒツジ抗M13抗体（Pharmacia）を
1ml加え，室温で2時間振盪した。その後、0.2％Tween20
を含むPBSで5分, 2回、PBSで5分, 2回洗い、ジアミノベ
ンチジン溶液（0.5mg/ml）30mlを染色用容器に移し、使
用直前にH₂O₂を10ml加え、メンブレンを入れた。室温で
約15分 から30分程度（染色の度合いによって変える）
振盪した後、メンブレンを蒸留水に移し反応を止めた。
蒸留水でよく洗った後、風乾してドットを観察したとこ
ろ、6D5、11C12、11D10、11F12、17B8、17H8、18B10及
び18C2のクローンに、BSAに対する結合活性は見られな
かったが、BSAーグルタチオン及びKLHーグルタチオンへ
の結合活性が認められた。従って、これらのクローンが
グルタチオンを認識すること、及びグルタチオンで修飾
された蛋白質の検出に有効であることが明らかになっ
た。

【００３４】２） ウェスタンブロッティングによる検
出 上記１）のELISAによって結合活性が見られた18B10、18
C2のクローンについて、さらに結合活性について調べる
ためにウェスタンブロッティングを行った。BSAーグル
タチオンを１穴につき約5μgのせ、Laemmliらの方法(La
emmli, U., Nature, 227, 680−685(1970)) に従い、10
％のSDSポリアクリルアミドゲルでSDS―PAGEを行なっ
た。その後、HyBond-ECL膜(Amersham) にセミドライ法
によって電圧7V、90分のエレクトロブロッティングを行
ない、10％MPBSで室温で2時間ブロッキングを行ない、
0.2％Tween20を含むPBSでメンブレンを5分, 2回洗い、
0.2％Tween20及び2％スキムミルクを含む実施例６で得
たファージ溶液（10¹¹PFU/ml）１mlをメンブレンを入れ
たハイブリバッグに加えた。4℃で一晩振盪した後、メ
ンブレンを0.2％Tween20を含むPBSで5分, 2回洗った
後、HRPとコンジュゲートしたヒツジ抗M13抗体を0.2％T
ween20を含む2％MPBSで5000倍希釈して加え、室温で2時
間振盪した。その後、0.2％Tween20を含むPBSで15分, 2
回、PBSで5分, 2回洗い、余分な水分を除去した後、化
学発光によりハイブリダイズした抗体の検出が可能であ
るECL kit (Amersham)の１液と２液を等量加え、1分間
緩く振盪した。その後サランラップで覆い、オートラジ
オグラフィーしたところ、18B10及び18C2においてBSA−
グルタチオンへの結合活性が認められた。

【００３５】実施例９ グルタチオン結合活性を有する
ポリペプチドをディスプレィしたファージのグルタチオ
ンによる競合阻害 実施例６でグルタチオン結合活性を有するポリペプチド
をディスプレィすることが確認されたクローンについ
て、キャリヤータンパク質とコンジュゲートしたグルタ
チオンのみでなく、グルタチオンそのものに対する結合
活性があるかどうかを調べるために還元型グルタチオン
を用いたELISA法による競合阻害実験を行った。実施例
６及び８で確認されたグルタチオン結合活性を有するポ
リペプチドをディスプレィする11F12、18B10、18C2及び
6D5の各クローンについて競合阻害実験を行った。還元
型グルタチオンをPBSに溶解し、1〜10^-5mg/mlまでの希
釈系列を100μlずつ調製した。96穴のマイクロタイター
プレートに必要な穴の分だけ10μg/mlのBSA―グルタチ
オンを50μlずつ加え、室温で一晩静置した後、PBSで１
回プレートを洗ってから、200μlの2％MPBSを各穴に加
え、室温で2時間放置し、ブロッキングした。その後、
各穴に4％MPBSを25μlずつ加えた。続いて、各穴当たり
1０¹⁰PFU/50μlを含むように調製したファージ溶液20μ
lと、調製した還元型グルタチオン5μlを含むように調
製したPBS溶液を25μlずつ加えた。また、ポジティブコ
ントロールとして、グルタチオンを加えない穴にはPBS
を5μlずつ加えた。

【００３６】3時間室温で放置した後、0.05％Tween20を
含むPBSで1回、PBSで2回洗浄した。この穴にHRPコンジ
ュゲート抗M13ファージ抗体(Pharmacia)を50μlずつ加
え、室温で1時間放置した。その間に、ABTS 10mgを20ml
の50mMのクエン酸、pH4.5に加え、発色液とした。プレ
ートを0.05％Tween20を含むPBSで2回、PBSで2回洗った
後、上記の発色液に36μlのH₂O₂を加え、よく混ぜた
後、各穴に50μlずつ加えた。20〜60分室温で放置した
後、マイクロプレートイムノリーダーを用いて、波長40
5nmの吸光度の値を測定し、グルタチオンーキャリアー
蛋白質に対する結合能を調べた。クローン11F12、18B1
0、18C2及び6D5による競合阻害実験の結果を、それぞ
れ、図４〜７に示す。図中、縦軸は波長405nmの吸光
度、横軸は還元型グルタチオンの量を表す。これらの図
から明らかなように、11F12、18B10、18C2及び6D5のそ
れぞれのクローンのグルタチオンとの結合活性は、還元
型グルタチオンを加えると、グルタチオンの量に依存し
て減少しており、これは、本発明のクローンがグルタチ
オン結合活性を有するポリペプチドをディスプレイして
いることを示すものである。

【００３７】実施例１０ グルタチオン結合活性を有す
るポリペプチドの塩基配列の決定 ELISAで活性が認められたクローンの内、11F12、18B10、
18C2及び6D5について塩基配列を決定し、CDR3領域と生
殖系列（germ line）を調べた。塩基配列決定は、Sange
rらの方法(Sanger,F., Nicklen,S. and Coulson, A. R.
(1977) Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 74巻, 5463頁-54
67頁)に従い、ABIの373A DNA シークェンサーを使用し
て蛍光色素が結合したダイデオキシNTPによるターミネ
ーター法で塩基配列を決定できるPRISM ready terminat
or kit を用いて行なった。ウェスタンブロッティング
などのために、大量に調製したファージの中から、一部
をとって、単鎖(ss)のファージDNAを調製し、テンプレ
ートとした。プライマーには、CDR3領域の直後の18mer
の配列(CAGGTACCTTGGCCCCA：配列番号１０)と軽鎖の可
変領域のなかの18merの配列(GGCCACAGACACAGCAGG：配列
番号１１)を用いた。テンプレートがssDNAなので、0.8p
molのプライマー（二重鎖(ds)DNAの場合には、3.2pmo
l）を用いた。プライマーとテンプレート及びプレミッ
クス（ＡＢＩ社）をSangerらの方法に従って、混合し、
96℃で30sec., 50℃で15sec., 60℃で4min.、サイクル
シークェンス反応を行なった。サイクルシークェンス反
応が終了した後、プロトコールに従って、CTAB沈殿法を
用いて、DNAの精製を行なった。

【００３８】まず2.5mlの5％ CTAB-0.5M NaCl を加え、
軽く攪拌した後、10,000rpmで5分間遠心分離して得た沈
殿を1.2M NaCl 50mlに懸濁した後、125mlの100％ エタ
ノールを加え、激しく攪拌し、10,000rpmで5分間遠心し
た。上清を取り除き、沈殿に500mlの70％エタノールを
加え、30秒間激しく攪拌した後、10,000rpmで5分間遠心
して上清を取り除いた。その後、沈殿を風乾してサンプ
ルバッファー（脱イオン化ホルムアミド＋EDTA＋ブルー
デキストラン）4mlを加え、サンプル溶液とした。サン
プル溶液をDNAシークェンサーにかけ、塩基配列を決定
した。これらクローンの特徴は以下の表に示す通りであ
る。

【００３９】

【表１】 クローン VH family CDR3(アミノ酸配列) 6D5 VH1; DP-25 CREDL（配列番号４） 11F12 VH1; DP-25 LTRNKFKSRGH（配列番号１） 18B10 VH3; DP-47 TQYHHVRYRHYL（配列番号２） 18C2 VH3; DP-45 AWDVRTER（配列番号３） クローン11F12をコードする塩基配列及びそれから推定
されるアミノ酸配列を配列番号５に示す。配列番号５に
おいて、アミノ酸番号３１−３５はCDR1領域、アミノ酸
番号５０−６６はCDR2領域、アミノ酸番号９９−１０９
はCDR3領域に相当する。また、クローン18B10をコード
する塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸配列を配
列番号６に示す。配列番号６において、アミノ酸番号３
１−３５はCDR1領域、アミノ酸番号５０−６６はCDR2領
域、アミノ酸番号９９−１１０はCDR3領域に相当する。
クローン18C2をコードする塩基配列及びそれから推定さ
れるアミノ酸配列を配列番号７に示す。配列番号７にお
いて、アミノ酸番号３１−３５はCDR1領域、アミノ酸番
号５０−６５はCDR2領域、アミノ酸番号９８−１０５は
CDR3領域に相当する。但し、18C2のCDR3領域のアミノ酸
のうち、Ｎo.１０４グルタミン酸は、アンバーコドンで
ある。クローン６Ｄ５をコードする塩基配列及びそれか
ら推定されるアミノ酸配列を配列番号８に示す。配列番
号８において、アミノ酸番号３１−３５はＣＤＲ１領
域、アミノ酸番号５０−６６はＣＤＲ２領域、アミノ酸
番号９９−１０３はＣＤＲ３領域に相当する。また、EL
ISAで活性のあった他のクローン（11C12、11D10、17B
8、17H8、18B10）についてもシークェンスを行なった
が、上記の４つのクローンのいずれかと同じ塩基配列を
持つことがわかった。

【００４０】配列番号：１ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 直接の起源 ライブラリー名：Ｎｉｓｓｉｍライブラリー クローン名：11F12

【００４１】配列番号：２ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 直接の起源 ライブラリー名：Nissimライブラリー クローン名：18B10

【００４２】配列番号：３ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 直接の起源 ライブラリー名：Nissimライブラリー クローン名：18C2

【００４３】配列番号：４ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 直接の起源 ライブラリー名：Nissimライブラリー クローン名：6D5 配列： Cys Arg Glu Asp Leu 5

【００４４】配列番号：５ 配列の長さ：１０９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 直接の起源 ライブラリー名：Nissimライブラリー クローン名：11F12 配列： CAG GTG CAG CTG TTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG CCC 48 Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Pro 5 10 15 TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC ACT AGC TAT 96 Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 GCT ATG CAT TGG GTG CGC CAG GCC CCC GGA CAA AGG CTT GAG TGG ATG 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 GGA TGG ATC AAC GCT GGC AAT GGT AAC ACA AAA TAT TCA CAG AAG TTC 192 Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 CAG GGC AGA GTC ACC ATT ACC AGG GAC ACA TCC GCG AGC ACA GCC TAC 240 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAA GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCA AGG TTG ACG CGT AAT AAG TTT AAG TCG CGT GGT CAT 327 Ala Arg Leu Thr Arg Asn Lys Phe Lys Ser Arg Gly His 100 105 109

【００４５】配列番号：６ 配列の長さ：１１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 直接の起源：Nissimライブラリー クローン名：18B10 配列： ＧＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＧＡ
ＧＧＣ ＴＴＧ ＧＴＡ ＣＡＡ ＣＣＴ ＧＧＧ ＧＧＧ ４８ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ５
１０ １５ ＴＣＣ ＣＴＧ ＡＧＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＴＧＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＴＣＴ
ＧＧＡ ＴＴＣ ＡＣＣ ＴＴＴ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＡＴ ９６ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ ２０ ２５
３０ ＧＣＣ ＡＴＧ ＡＧＣ ＴＧＧ ＧＴＣ ＣＧＣ ＣＡＧ ＡＣＴ ＣＣＡ
ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＣ １４４ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｖａｌ ３５ ４０
４５ ＴＣＡ ＧＣＴ ＡＴＴ ＡＧＴ ＧＧＴ ＡＧＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＡＧＣ
ＡＣＡ ＴＡＣ ＴＡＣ ＧＣＡ ＧＡＣ ＴＣＣ ＧＴＧ １９２ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ ５０ ５５
６０ ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＧＧ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＴＣＣ ＡＧＡ ＧＡＣ
ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＡＧ ＡＡＣ ＡＣＧ ＣＴＧ ＴＡＴ ２４０ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓｐ
Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ ６５ ７０
７５ ８０ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＴＧ ＡＡＣ ＡＧＣ ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＣＣ ＧＡＧ
ＧＡＣ ＡＣＧ ＡＣＣ ＧＴＧ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ２８８ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ ８５
９０ ９５ ＧＣＡ ＡＧＡ ＡＣＧ ＣＡＧ ＴＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＧＴＧ ＡＧＧ
ＴＡＴ ＣＧＴ ＣＡＴ ＴＡＴ ＴＴＧ ３３０ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｌｅｕ １００ １０５
１１０

【００４６】配列番号：７ 配列の長さ：１０５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 直接の起源：Ｎｉｓｓｉｍライブラリー クローン名：18C2 配列： GAG GTT CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GGC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 GCT ATG CAC TGG GTT CGC CAG GCT CCA GGA AAA GGT CTG GAG TGG GTA 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 TCA GCT ATT GGT ACT GGT GGT GGC ACA TAC TAT GCA GAC TCC GTG AAG 192 Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC TCC TTG TAT CTT 240 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT GCA 288 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 AGA GCT TGG GAT GTT CGT ACG TAG AGG 315 Arg Ala Trp Asp Val Arg Thr Glu Arg 100 105

【００４７】配列番号：８ 配列の長さ：１０２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 直接の起源：Nissimライブラリー クローン名：6D5 配列： CAG GTC CAG CTT GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Arg Glu Val Lys Lys Pro Gly Ara 5 10 15 TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC ACT AGC TAT 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 GCT ATG CAT TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGA CTT GAG TGG ATG 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 GGA TGG ATC AAT GCT GGC AAT GGT AAC ACA GCA TAT GCA CAG AAG TTC 192 Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Ala Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 CAG GGC AGA GTC ACC ATA ACC AGG GAC ACG TCC ATG AGC ACA GCC TAC 240 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Met Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ACG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT 288 Thr Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCA AGA TGT AGG GAG GAT TTG 309 Ala Arg Cys Arg Glu Asp Leu 100 103

【００４８】配列番号：９ 配列の長さ：５１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GCCTGAACCG CCTCCACCAG TCGACACGGT GACCAGGGTA CCTTGGCCCC A 51

【００４９】配列番号：１０ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： CAGGTACCTT GGCCCCA 17

【００５０】配列番号：１１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： ＧＧＣＣＡＣＡＧＡＣ ＡＣＡＧＣＡＧＧ
１８

【図面の簡単な説明】

【図１】 抗体を示す模式図である。

【図２】 抗体ペプチドのｇ３ｐを介するファージ表面
での発現の状態を示す模式図であり、図中、（ａ）はFa
bフラグメント（抗体のVκ,CκとVH,CH1からなるヘテロ
二量体）、（ｂ）はファージの模式図、（ｃ）は一重鎖
のFvフラグメント（VHの下流にリンカーを介してVκを
つないだもの）の、g3pを介するファージ上での発現の
状態を示している。

【図３】 プラスミドpＨＥＮ１-Ｖλ３の模式図。

【図４】 クローン11F12を用いた競合阻害実験の結果
を示すグラフ。

【図５】 クローン18B10を用いた競合阻害実験の結果
を示すグラフ。

【図６】 クローン18C2を用いた競合阻害実験の結果を
示すグラフ。

【図７】 クローン6D5を用いた競合阻害実験の結果を
示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/531 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＶＨ領域が配列番号５、６、７又は８に
   記載のアミノ酸配列であり、グルタチオンとの特異的な
   結合活性を有することを特徴とする単鎖Ｆｖポリペプチ
   ド。
2. 【請求項２】 ＶＬ領域がヒトＶλ３遺伝子がコードす
   るアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１記載の
   単鎖Ｆｖポリペプチド。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のポリペプチドを
   コードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のＤＮＡを含有する発現
   ベクター。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の発現ベクターで形質転
   換された宿主細胞。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の宿主細胞を培養し、培
   養物から請求項１又は２に記載のポリペプチドを分離す
   ることを含む、グルタチオンとの特異的な結合活性を有
   するポリペプチドの製造方法。
7. 【請求項７】 請求項１又は２に記載のポリペプチドを
   含有する、グルタチオン又はグルタチオンで修飾された
   蛋白質を検出するための診断薬。