TWI636060B - 一種由噬菌體表現之單鏈變異片段抗體庫 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容是關於一種由噬菌體表現之單鏈變異片段抗體庫，其係包含複數個由噬菌體表現的單鏈變異片段，各單鏈變異片段的特徵在於：(1) 具有特定的正則結構組合；(2) 各互補性決定區域具有特定分佈的芳香族殘基；以及(3) 各互補性決定區域具有特定序列。本揭示內容之單鏈變異片段抗體庫可用以有效製備能結合至不同抗原之不同抗體。據此，本揭示內容提供了一種方法，可針對不同抗原製備不同抗體，以即時因應實驗研究及/或臨床應用的需求。

Description

一種由噬菌體表現之單鏈變異片段抗體庫
本揭示內容是關於包含不同抗體片段之抗體庫。更具體來說，本揭示內容是關於一種由噬菌體表現的單鏈變異片段(phage-displayed single-chain variable fragment, scFv)抗體庫及其用途。
抗體亦稱為免疫球蛋白，其係由免疫系統中負責辨識及中和外來物質(例如細菌及病毒)的漿細胞(plasma cell)所製造的一種大分子量之Y型蛋白。抗體可辨識一般稱作抗原之外來標的物中的特定部位。抗體Y型結構的端點分別包含一抗原結合位置(paratope)，可專一性地結合至抗原上特定的抗原決定位置(epitope)，藉以使抗原與抗體二結構可準確地結合在一起。利用此種結合機制，一抗體可標定一微生物或一受感染的細胞，進而協助免疫系統其他成份進行後續的攻擊，或是直接中和該標的物(舉例來說，阻斷一微生物用以侵入個體或存活的部分)。人體體液免疫系統(humoral immune system)最主要的功能即是產生抗體。
抗體通常是由基本結構單元所組成；一般來說，抗體具有二條分子量較大的重鏈及二條分子量較小之輕鏈。已知有五種重鏈，分別命名為α (alpha)、δ (delta)、ε (epsilon)、γ (gamma)及μ (mu)。依據重鏈種類的不同會產生各種同型抗體(isotype)，分別為免疫球蛋白A (immunoglobulin A, IgA)、免疫球蛋白D (immunoglobulin D, IgD)、免疫球蛋白E (immunoglobulin E, IgE)、免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)及免疫球蛋白M (immunoglobulin M, IgM)抗體。各重鏈具有二個區域：恒定區域(constant region, CH)及變異區域(variable region, VH)。相同的同型抗體具有相同的恒定區域，而不同的同型抗體則具有不同的恒定區域。由不同B細胞產生的抗體具有不同的重鏈變異區域；反之，經一特定抗原刺激及活化的單一B細胞或B細胞群，會產生具有相同重鏈變異區域的抗體。至於輕鏈，目前已知有二種形式，分別命名為λ (lambda)及κ (kappa)。與重鏈的結構相似，各輕鏈皆具有二個區域：恒定區域(constant region, CH)及變異區域(variable region, VH)，相同的同型抗體會具有相同的恒定區域，而變異區域則會隨者刺激抗原的不同而不同。
縱使所有的抗體皆具有相似的蛋白結構，位於抗體端點之小區域卻完全不同，因此，每一個體體內可同時存在著數以百萬的抗體(其端點結構僅具微小差異；即不同的抗原結合位置)。該小區域一般稱為高變異區域(hypervariable region)或互補性決定區域(complementarity determining region, CDR)。不同的變異區域可與不同抗原結合，此一抗體多樣性可確保免疫系統能辨識相當數量之不同抗原。這些大量且具多樣性的抗體是先由一組可用以編碼不同抗原結合位置之基因片段(即變異片段(variable segment)、多樣片段(diversity segment)及連接片段(joining segment))進行隨機重組，再於該些基因片段進行隨機突變(亦稱為體細胞超突變(somatic hypermutation, SHM)所產生，其中隨機突變可進一步增加抗體的多樣性。
在製備抗體的過程中，通常會將天然或重組蛋白或其片段免疫注射至動物體內，使其產生免疫反應(immunize)；產生的抗體可專一性地辨識及結合該蛋白/片段。接著，因應不同需要可使用不同方法自動物體內製備抗體(例如單株抗體或多株抗體)。一般來說，習知技藝人士是利用融合瘤技術(hybridoma technique)來製備單株抗體。該項技術是在使動物產生免疫反應後，由動物體內取出細胞並進行融合，以製備可產生抗體的融合瘤；接著，再將該融合瘤建構為用以製備抗體的細胞株，進而純化及分析所得抗體。雖然該些技術已為製備抗體的慣用技術，但仍有以下缺點：牽涉複雜技術致使製備時間過長、抗原決定位置識別不全及製備成本過高等。此外，並不是每一種蛋白/蛋白片段皆可利用該些技術來製備相對應的抗體，例如低溶解度抗原、低免疫性(immunogenicity)抗原或具有毒性的抗原。
有鑑於此，相關領域極需一種系統及/或方法，以更具成本效益的方式製備一種對特定抗原具有結合親和性及專一性的抗體。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本揭示內容的第一態樣是關於一種由噬菌體表現的單鏈變異片段(phage-displayed single-chain variable fragment, scFv)抗體庫，其係包含複數個由噬菌體表現之scFv。在本發明抗體庫中，各個由噬菌體表現之scFv皆包含一第一重鏈互補性決定區域(complementarity determining region, CDR-H1)、一第二重鏈CDR (CDR-H2)、一第三重鏈CDR (CDR-H3)、一第一輕鏈CDR (CDR-L1)、一第二輕鏈CDR (CDR-L2)及一第三輕鏈CDR (CDR-L3)；其中， 各CDR-H1、CDR-L2及CDR-L3具有第一型之正則結構(canonical structure, CS)，且各CDR-H2及CDR-L1具有第二型之CS；以及 各CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中芳香族殘基的分佈與一天然抗體之對應CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中芳香族殘基的分佈相似。
依據本揭示內容實施方式，CDR-L1是由一包含序列編號：2-10中任一核酸序列之第一編碼序列編碼而成，CDR-L2是由一包含序列編號：11-14中任一核酸序列之第二編碼序列編碼而成， CDR-L3是由一包含序列編號：15-22中任一核酸序列之第三編碼序列編碼而成，CDR-H1是由一包含序列編號：23-26中任一核酸序列之第四編碼序列編碼而成，CDR-H2是由一包含序列編號：27-28中任一核酸序列之第五編碼序列編碼而成，且CDR-H3是由一包含序列編號：29-106中任一核酸序列之第六編碼序列編碼而成。
依據本揭示內容一實施方式，該噬菌體是M13噬菌體或T7噬菌體。較佳的情況是，該噬菌體是M13噬菌體。
在本揭示內容實施方式中，至少一由噬菌體表現之scFv對蛋白抗原具有專一性，其中該蛋白抗原係選自由第二型之人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)、麥芽糖結合蛋白質(maltose-binding protein, MBP)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、人類血清白蛋白(human serum albumin, HSA)、溶菌酶(lysozyme)、介白素-1β (interleukin-1 beta, IL-1β)、流感病毒之血球凝集素(hemagglutinin of influenza virus, HA)、流感病毒之核蛋白(nucleoprotein of influenza virus, NP)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、第一型之表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor 1, EGFR1)、第三型表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor 3, EGFR3)、高血糖素受體(glucagon receptor)、人類去氧核糖核酸水解酶(human DNase I)、第一型之程序性死亡配體(programmed death-ligand 1, PD-L1)、第三型唾液酸結合免疫球蛋白相似凝集素(sialic acid binding Ig-like lectin 3, SIGLEC 3)、免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)的結晶片段區域(fragment crystallizable region, Fc region)及利妥昔(rituximab)所組成的群組。
本揭示內容的第二態樣是關於一種用以製備本發明由噬菌體表現之scFv抗體庫的方法。該方法包含以下步驟： (1)合成一第一核酸序列，其係包含分別用以編碼一免疫球白基因之CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的一第一、一第二、一第三、一第四、一第五及一第六編碼序列； (2)將該第一核酸序列插入一第一噬質體(phagemid)載體中； (3)以定位點突變方法(site-directed mutagenesis)分別修飾該第一、第二及第三編碼序列以製備一變異輕鏈(VL)抗體庫，其係包含一第一組由噬菌體表現之scFv，其中各scFv分別具有經修飾的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；以及以定位點突變方法分別修飾該第四、第五及第六編碼序列以製備一變異重鏈 (VH) 抗體庫，其係包含一第二組由噬菌體表現之scFv，其中各scFv分別具有經修飾的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3； (4)利用蛋白L來篩選該VL抗體庫，由該VL抗體庫挑選一第三組由噬菌體表現之scFv；且利用蛋白A來篩選該VH抗體庫，由該VH抗體庫挑選一第四組由噬菌體表現之scFv； (5)由對應的噬菌體中擴增複數個第二核酸序列，其係用以編碼經修飾之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，且由對應的噬菌體中擴增複數個第三核酸序列，其係用以編碼經修飾之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；以及 (6)將該些第二及第三核酸序列插入一第二噬質體載體以製備本發明之由噬菌體表現的scFv抗體庫。
依據本揭示內容實施方式，在步驟(3)中，該第一、第二及第三編碼序列是分別以序列編號：107-115、116-119及120-127的核酸序列進行修飾，且該第四、第五及第六編碼序列是分別以序列編號：128-131、132-133及134-211的核酸序列進行修飾。
依據本揭示內容某些實施方式，在步驟(3)前更包含一步驟，其係將該免疫球蛋白基因之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中芳香族殘基的分佈及一天然抗體之對應CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中芳香族殘基的分佈進行比對。
依據本揭示內容某些實施方式，步驟(1)之免疫球蛋白基因係源自一哺乳動物；例如小鼠、大鼠、倉鼠、兔、猴、山羊及綿羊。在一實施例中，該免疫球蛋白基因係源自小鼠。依據本揭示內容一較佳實施方式，該免疫球蛋白基因可用以編碼一對VEGF具有專一性的抗體。
依據本揭示內容實施方式，該第一及第二 噬質體載體可以是相同或不同的噬質體載體。具選擇性地，該第一及第二噬質體載體皆是源自M13噬菌體。
本揭示內容之第三態樣是關於一種利用本發明由噬菌體表現之scFv抗體庫來製備一重組抗體的方法，其中該重組抗體對一蛋白抗原具有結合親和性及專一性。該方法包含以下步驟： (a)以該蛋白抗原篩選本發明之由噬菌體表現之scFv抗體庫； (b)挑選複數個噬菌體，其中該些噬菌體會分別表現對該蛋白抗原具有結合親和性及專一性的scFv； (c)使步驟(b)挑選之該些噬菌體分別表現可溶形式之scFv； (d)由步驟(c)之scFv挑選一對該蛋白抗原具有高結合親和性及專一性的可溶形式scFv； (e)由會表現步驟(d)之可溶形式scFv的噬菌體中萃取一噬質體DNA； (f)以步驟(e)之噬質體DNA作為模版，利用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)分別擴增一用以編碼CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的第一核酸序列，及一用以編碼CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的第二核酸序列； (g)將該第一及第二核酸序列插入一表現載體中，其係包含一第三及一第四核酸序列，其中該第三核酸序列係用以編碼一免疫球蛋白之重鏈恒定區域，且該第四核酸序列係用以編碼該免疫球蛋白之輕鏈恒定區域；以及 (h) 將步驟(g)之包含該第一、第二、第三及第四核酸序列的表現載體轉染至一宿主細胞，以製備該重組抗體。
在本揭示內容實施方式中，該第一核酸序列是位於該第三核酸序列的上游，且該第二核酸序列是位於該第四核酸序列的上游。
依據本揭示內容一實施方式，步驟(g)之免疫球蛋白係選自由免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)、免疫球蛋白A (immunoglobulin A, IgA)、免疫球蛋白D (immunoglobulin D, IgD)、免疫球蛋白E (immunoglobulin E, IgE)及免疫球蛋白M (immunoglobulin M, IgM)所組成的群組；較佳的情況是，該免疫球蛋白是IgG。
在本揭示內容一實施方式中，步驟(h)的宿主細胞是一哺乳動物細胞。
依據本揭示內容另一實施方式，該蛋白抗原可以是HER2、MBP、BSA、HSA、溶菌酶、IL-1β、人類DNase I、HA、NP、VEGF、EGFR1、EGFR3、PD-L1、SIGLEC 3、IgG之Fc區域、高血糖素受體或利妥昔。
本揭示內容的第四態樣是關於利用本發明由噬菌體表現之scFv抗體庫製備的重組抗體。依據本揭示內容實施方式，該重組抗體包含：(1) 一CDR-L1，其係具有第二型之CS，且係由一包含序列編號：2-10中任一核酸序列之第一編碼序列編碼而成；(2) 一CDR-L2，其係具有第一型之CS，且係由一包含序列編號：11-14中任一核酸序列之第二編碼序列編碼而成；(3) 一CDR-L3，其係具有第一型之CS，且係由一包含序列編號：15-22中任一核酸序列之第三編碼序列編碼而成；(4) 一CDR-H1，其係具有第一型之CS，且係由一包含序列編號：23-26中任一核酸序列之第四編碼序列編碼而成；(5) 一CDR-H2，其係具有第二型之CS，且係由一包含序列編號：27或28之第五編碼序列編碼而成；以及(6) 一CDR-H3，其係由一包含序列編號：29-106中任一核酸序列之第六編碼序列編碼而成。依據本揭示內容某些實施方式，各CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中芳香族殘基的分佈與一天然抗體之對應CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中芳香族殘基的分佈相似。
依據本揭示內容某些實施方式，重組抗體的離解常數(dissociation constant, KD)約為10-7 至10-11 M。
依據本揭示內容某些實施方式，製備的重組抗體包含一與序列編號：241-330中任一序列至少有90%相似度的胺基酸序列。
或者是，本揭示內容亦提供一種由HER2免疫之小鼠製備及純化的重組抗體。依據一實施方式，該重組抗體包含一與序列編號：233、237及331-334中任一序列至少有90%相似度的胺基酸序列。此外，由小鼠製備之重組抗體可經人源化(humanized)處理，處理後的抗體包含一與序列編號：235至少有90%相似度的胺基酸序列。
依據本揭示內容實施方式，本發明重組抗體(即由噬菌體表現之scFv抗體庫製備的重組抗體、由經HER2免疫之小鼠製備的重組抗體及人源化之重組抗體)可具專一性地結合至HER2的抗原決定位置。依據一實施方式，本發明重組抗體會引發HER2受體被內化(internalization)。依據另一實施方式，本發明重組抗體會抑制HER2受體的功能。
據此，本發明亦提供一種重組抗體之用途，其係用以製備一藥物以治療一罹患或疑似罹患一種與HER2相關之疾病的個體。依據本揭示內容一實施方式，該種與HER2相關之疾病是腫瘤，且投予本發明重組抗體可有效抑制腫瘤生長。較佳的情況是，該個體是人類。
依據本揭示內容較佳的實施方式，該可用以治療與HER2相關之疾病的抗體包含一與序列編號：233、235、237及241-330中任一序列至少有90%相似度的胺基酸序列。
本揭示內容的另一態樣是關於一種用以治療一與HER2相關之疾病的組合物。依據本揭示內容某些實施方式，該組合物包含包含一第一重組抗體及一第二重組抗體，其中該第一重組抗體及第二重組抗體皆是由本發明由噬菌體表現之scFv抗體庫所製備。較佳的情況是，該第一重組抗體會結合至HER2之第一抗原決定位置，且該第二重組抗體會結合至HER2之第二抗原決定位置。依據本揭示內容一特定實施方式，該第一重組抗體包含序列編號：253的胺基酸序列，且該第二重組抗體包含序列編號：274或301的胺基酸序列。
本揭示內容更提供一種本發明組合物之用途，其係用以製備一藥物以治療一罹患或疑似罹患一種與HER2相關之疾病的個體。依據本揭示內容一實施方式，該種與HER2相關之疾病是腫瘤，且投予本發明組合物可有效抑制腫瘤生長。較佳的情況是，該個體是人類。
依據本揭示內容較佳的實施方式，該第一重組抗體包含序列編號：253的胺基酸序列，且該第二重組抗體包含序列編號：274或301的胺基酸序列。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
在本說明書中，「抗原」(antigen或Ag)一詞是指可引發免疫反應的分子。該免疫反應可以是產生抗體、活化特定之免疫勝任細胞，或二者。習知技藝人士當可了解包含幾乎所有蛋白及胜肽等大分子皆可作為抗原。此外，抗原亦可源自重組或基因體DNA。習知技藝人士當可了解可用以編碼一「抗原」(antigen或Ag)之DNA包含一用以編碼可引發免疫反應之蛋白的核酸序列或部分核酸序列。此外，本所屬領域具有通常知識者亦可了解抗原不必然是由基因中單一全長核酸序列編碼而成，而是有可能由源自多個基因、經不同重組方式排列之部分核酸序列編碼而成，藉以引發特定的免疫反應。此外，習知技藝人士當可了解抗原不必然是由一「基因」(gene)編碼而成；日漸增多的數據顯示抗原可以為合成或源自生物檢體的物質。所述生物檢體包含，但不限於，組織檢體、腫瘤檢體、細胞或生物體液。
在本說明書中，「免疫」(immunization)一詞是指所屬領域習知技藝人士所熟知、藉由對動物體投予(例如注射、黏膜刺激(mucosal challenge)等)一抗原劑或物質來引發免疫反應產生的過程，其中產生的免疫反應對該抗原劑或物質具有專一性。該抗原劑或物質可以單獨投予或與佐劑(adjuvant)共同投予至動物體內。
「抗體」(antibody)一詞在本說明書泛指單株抗體(monoclonal antibody；包含全長單株抗體)、多株抗體(polyclonal antibody)、多效抗體(multi-specific antibody；例如雙效抗體)及能產生特定生物活性的抗體片段。「抗體片段」(antibody fragment)一詞在本說明書中包含全長抗體的一部分，該部分通常為抗體中與抗原結合的位置或變異區域。例示性的抗體片段包含Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、雙鏈抗體(diabody)、線性抗體(linear antibody)、單鏈抗體分子(single-chain antibody molecule)及由抗體片段形成的多效抗體。
「抗體庫」(antibody library)一詞在本說明書是指一群經表現的抗體及/或抗體片段，用以篩選及/或組合成完整抗體。抗體及/或抗體片段可以表現於核醣體(ribosome)、噬菌體或細胞表面(特別是酵母菌細胞表面)。
在本說明書中，「單鏈變異片段」(single-chain variable fragment或scFv)是指包含一免疫球蛋白之重鏈變異區域(variable regions of the heavy chain, VH)及輕鏈變異區域(variable regions of the light chain, VL)的融合蛋白，其中該VH及VL是共價鍵結以形成一VH::VL異二聚體(heterodimer)。該VH及VL可直接連結或透過一由胜肽編碼之連接子連結，其中該連接子可連接VH的N端及VL的C端，或是連接VH的C端及VL的N端。連接子通常為包含多個能增加可撓性之甘胺酸(glycine)及多個能增加溶解性之絲胺酸(serine)或蘇胺酸(threonine)的片段。即使移除抗體之恒定區域且插入連接子，scFv蛋白仍保有原免疫球蛋白的專一性。可由包含用以編碼VH及VL序列的核酸來表現單鏈Fv多肽抗體。
「互補性決定區域」(complementarity determining region, CDR)在本說明書是指一抗體分子的高變異區域，其可與結合抗原之三維立體表面形成互補表面。由N端到C端，各抗體重鏈及輕鏈皆包含三個CDR (CDR 1、CDR 2及CDR3)。因此，一個HLA-DR抗原結合位置共包含6個CDR (3個重鏈變異區域的CDR及3個輕鏈變異區域的CDR)。各CDR的胺基酸殘基會與結合抗原緊密接觸，其中與抗原接觸最緊密的位置通常為重鏈CDR3。
本所屬領域具有通常知識者皆知，「正則結構」 (canonical structure, CS)一詞是指由抗原結合(即CDR)環狀區域形成的主鏈構形(main chain conformation)。比對結構可發現，在6個抗原結合環狀區域中，其中5個是選自由有限之既有構形結構所組成的群組。可由多肽骨架之扭轉角(torsion angle)來辨別各正則結構。
在本說明書中，「EC50 」一詞是指一抗體或其抗原結合區域的濃度，該濃度在活體外或活體試驗中可引發一反應，其為最大反應的一半量(即最大反應及基準質的中間量)。
在本說明書中，「結合速率常數」(association rate constant, kon )是指一數值，用以表示抗體與抗體標的抗原間之結合強度，通常是以抗原-抗體的反應動力學來測定該數值。「解離速率常數」(dissociation rate constant, koff )在本說明書是指一數值，用以表示抗體與抗體標的抗原間之解離強度，通常是以抗原-抗體的反應動力學來測定該數值。將「解離速率常數」(dissociation rate constant, koff )除以「結合速率常數」(association rate constant, kon )可得到「離解常數」(dissociation constant, Kd )。該些常數可作為表示抗體對其抗原之親和力及中和該抗原之活性的指數。
「噬質體」(phagemid)一詞在本說明書是指一結合細菌噬菌體及質體特性的載體。細菌噬菌體是指任何一種可感染細菌的病毒。
「核酸序列」（nucleic acid sequence）、「多核苷酸」（polynucleotide）或「核酸」（nucleic acid）在本說明書中可交替使用，可指一雙股去氧核糖核酸（deoxyribonuclic acid, DNA）、一單股DNA或所述DNA之轉錄產物（例如核糖核酸分子，ribonucleic acid，RNA）。需知本揭示內容無關乎自然界或自然狀態下的基因多核苷酸序列。能用以分離或純化（或部份純化）本發明之核酸、多核苷酸或核苷酸序列的方法包含，但不限於離子交換色層分析（ion-exchange chromatography）、分子篩選色層分析（molecular size exclusion chromatography）或是可用於基因工程技術諸如擴增（amplification）、扣除雜交法（subtractive hybridization）、選殖（cloning）、次選殖（sub-cloning）、化學合成（chemical synthesis）或其組合等基因工程技術。
本發明亦包含所有簡併核苷酸序列(degenerate nucleotide sequence)，其係用以編碼於生物體中具有特定活性或功能的胜肽/多肽/蛋白(例如本發明CDR)。「簡併核苷酸序列」(degenerate nucleotide sequence)是指包含一或多個簡併密碼子(degenerate codon；與可編碼一多肽之參考多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。簡併密碼子可包含不同的核苷酸三聯體(triplet)，卻可編碼出相同的胺基酸殘基(例如GAU及GAC三聯體皆係用以編碼天門冬胺酸(aspartic acid, Asp))。
「編碼序列」(coding sequence)及「編碼區域」(coding region)在本說明書中可交替使用，係是包含RNA及DNA的核苷酸序列及及核酸序列，其係可用以編碼合成RNA、蛋白、部分RNA或部分蛋白時需要的基因訊息。「外來核苷酸序列」(foreign nucleotide sequence)、「異源性核苷酸序列」(heterologous nucleotide sequences)或「外源性核苷酸序列」(exogenous nucleotide sequences)是指特定生物體基因組之自然產物以外的核苷酸序列。「異源性蛋白」(Heterologous proteins)是指由外來、異源性或外源性核苷酸編碼之蛋白，該些蛋白通常不會表現於細胞中。分離後重新導入相同種類之生物體的核苷酸序列不會被視為特定生物體基因組自然產生的產物，而會視為異性或外源性核苷酸序列。
「相似」(similar或similarity)在本說明書是指不同核酸或胺基酸序列間的關聯性，其中該些序列之部分序列相同，或是序列中一或多個區域具有相似性。相似的胺基酸殘基可以是不同胺基酸序列間相同的胺基酸殘基，或是不同序列間保留性置換的胺基酸取代。
本揭示內容的主旨為提供一種由噬菌體表現之scFv抗體庫，其係可辨識及結合至不同的抗原蛋白，例如HER2。該抗體庫包含複數個由噬菌體表現之scFvs，該些scFv的特徵在於：(1)具有特定的CS組合；(2)各CDR具有特定分佈的芳香族殘基；以及(3)各CDR具有特定的序列。因此，在不需要重複常規步驟(例如使宿主動物免疫及/或製備融合瘤)的情況下，利用抗原篩選本發明抗體庫可簡單製備出對特定抗原具有結合親和性及專一性的抗體，因而能大幅縮減製備抗體所需之時間和勞力。據此，因應各種實驗研究及/或臨床應用需求，本揭示內容提供了一種用以製備對抗原具有專一性之抗體的方法。
為建立本發明由噬菌體表現之scFv抗體庫，先從小鼠的抗體群組(antibody repertoire)決定各scFv的CS組合。在本揭示內容一實施方式中，用以建立小鼠抗體群組的方法包含： (A)利用一蛋白抗原使一宿主動物免疫； (B)由該免疫之小鼠體中分離脾臟細胞，並萃取脾臟細胞中的訊息核糖核酸(messenger ribonucleic acid, mRNA)； (C)由萃取出的mRNA合成互補去氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid, cDNA)； (D)以步驟(C)合成之cDNA作為模版，利用PCR分別擴增複數個用以編碼免疫球蛋白基因之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的第一核酸序列，以及複數個用以編碼免疫球蛋白基因之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的第二核酸序列； (E)分別將該些第一及第二核酸序列插入噬質體載體，以製備一噬菌體；以及 (F)對步驟(E)之噬菌體抗體庫進行定序分析。
在步驟(A)中，先以適量蛋白抗原(例如一自然蛋白或一合成多肽)使一宿主動物(例如小鼠、大鼠或兔子)免疫，以引發該宿主動物產生對該抗原具有專一性之抗體。依據本揭示內容一實施方式，是對該宿主動物投予一序列編號：224的融合蛋白，其係包含一MBP及一包含HER2之細胞外域(extracellular domain, ECD)中第203-262胺基酸殘基的多肽。一般來說，在使宿主動物免疫時，會將佐劑及抗原混合後一併投予至宿主動物體內。適用於本發明之例示性佐劑包含弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant, FCA)、弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant, FIA)、TiterMax及氫氧化鋁佐劑。依據本揭示內容一實施方式，是將序列編號：224的融合蛋白與TiterMax進行混合。免疫主要是將抗原以靜脈內注射、淋巴結內注射、皮下注射、腹腔內注射或肌肉內注射方式投予至宿主動物體內，使其產生相關免疫反應。依據本揭示內容另一實施方式，是將包含序列編號：224之融合蛋白及佐劑TiterMax的混合物投予至小鼠的腹股溝淋巴結（inguinal lymph node）內。每次投予的間隔時間並無特別限制。間隔時間可以是數天至數週；較佳是投予2次，且投予間隔時間為4週。依據本揭示內容一特定實施例，藉由對宿主動物投予序列編號：225 (包含HER2之ECD；即HER2/ECD)之多肽來增加宿主動物體內的免疫反應(即再免疫(re-immunization))。
在步驟(B)中，由步驟(A)製備之免疫宿主動物體內分離出脾臟細胞，並由該些脾臟細胞中萃取總mRNA；之後於步驟(C)中，利用反轉錄酶(reverse transcriptase)將mRNA反轉為cDNA。在習知技藝人士所熟知的萃取方法中，是先以高腐蝕性的化學溶液(例如酚(phenol)、三氯乙酸(trichloroacetic acid)/丙酮(acetone)及Trizol)來溶解由免疫宿主動物體內萃取的脾臟細胞，再以三氯甲烷(chloroform)進行中和。離心後，利用有機溶液(例如乙醇及異丙醇)來沉澱包含RNA檢體的水層。以乙醇洗滌RNA檢體以移除殘留蛋白後，乾燥(例如風乾及真空乾燥)RNA檢體，以得到RNA沉澱物。
在步驟(C)中，將步驟(B)得到之RNA沉澱物溶解於加入二乙基焦碳酸鹽(diethylpyrocarbonate, DEPC)之蒸餾水(DEPC H2 O)中，利用反轉錄法(reverse transcription, RT)將RNA反轉為對應的cDNA。一般來說，是將RNA與引子Oligo(dT)20 、三磷酸去氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate, dNTP；其係包含dATP、dGTP、dTTP及dCTP)、反轉錄酶、反應緩衝液及非必要性地，反轉錄酶之共因子(例如MgCl2 )均勻混合以進行RT。較佳的情況是，反應混合物更包含二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)，其係一種氧化還原劑，可穩定反轉錄酶；以及RNase抑制劑，藉以抑制RT過程中RNA的降解。
在步驟(D)中，將步驟(C)反轉之cDNA作為模版，以標的特定引子利用PCR反應擴增標的基因。在一實施方式中，標的基因是用以編碼一免疫球蛋白基因之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的第一核酸序列；在另一實施方式中，標的基因是用以編碼相同免疫球蛋白基因之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的第二核酸序列。依據本揭示內容某些實施方式，該免疫球蛋白是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM；較佳的情況是，該免疫球蛋白是IgG。以Barbas等人發表之引子混合物(G.J. Phage Display A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; 2001)分別擴增第一及第二核酸序列。本所屬領域習知技藝人士在不過度實驗的情況下，當可選用適當的引子由一免疫球蛋白中擴增特定的第一及第二核酸序列。
在步驟(E)中，將擴增的第一及第二核酸序列分別插入一噬質體載體中，以建立包含複數個可分別表現不同scFv之噬菌體的噬菌體抗體庫。依據Barbas等人所發表的方法(G.J. Phage Display A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; 2001)，是先將第一及第二核酸序列組合後，再插入該噬質體中，其中是利用交疊延伸聚合酶連鎖反應(overlap extension polymerase chain reaction, OE-PCR)來組合第一及第二核酸序列；OE-PCR亦稱為以交疊延伸聚合酶連鎖反應進行疊接反應(splicing by overlap extension PCR)或以突出延伸進行疊接反應(splicing by overhang extension)，上述二者皆簡稱為SOE-PCR。一般來說，需要4條引子進行OE-PCR，其中第一及第二引子分別為第一核酸序列的正向和反向引子，而第三及第四引子則分別為第二核酸序列的正向和反向引子。相較於其他PCR反應，OE-PCR所使用的引子需經特定設計，其中第二引子包含一3’端突出序列(互補序列1)，其係與第三引子的5’端突出序列(互補序列2)相互互補。在第一輪PCR反應中，先利用第一及第二引子擴增第一核酸序列，且以第三及第四引子擴增第二核酸序列；因此，互補序列1會插入第一核酸序列的3’端，而互補序列2則會插入第二核酸序列的5’端。在第二輪PCR反應中，混合二條經擴增的核酸序列，再僅以第一及第四引子進行PCR反應。由於互補序列1及互補序列2彼此相互互補，因此第一核酸序列的3’端會與第二核酸序列的5’端交疊，並形成一以第一及第四引子進行之PCR擴增反應的中間產物。基於此概念，在步驟(D)中擴增的第一核酸序列的3’端包含互補序列1 (即GGAAGATCTAGAGGAACCACC；序列編號：335)，而第二核酸序列的5’端則包含互補序列2 (即GGTGGTTCCTCTAGATCTTCC；序列編號：336)，其中二互補序列會形成一交疊區域，進而可利用序列編號：226及227的引子來組合第一及第二核酸序列。依據本揭示內容某些實施方式，序列編號：226及227的核酸序列分別包含第一及第二限制酶切點，藉以將組合產物插入噬質體載體的多選殖位點(multiple cloning site)，以製備一重組噬質體。在一實施方式中，第一限制酶切點是Sfi I，且第二限制酶切點是Not I。噬質體載體可以源自M13噬菌體或T7噬菌體；較佳是，噬質體載體是源自M13噬菌體。
之後將重組噬質體轉入一宿主細胞中。一般來說，可利用轉形法(transformation)或電穿孔法(electroporation)將噬質體轉入宿主細胞；較佳的情況是，利用電穿孔法將噬質體轉入宿主細胞。宿主細胞一般是一細菌細胞；例如大腸桿菌(Escherichia coli, E.coli )細胞。各轉形後的宿主細胞皆包含一重組噬質體，並可於培養基上形成一 菌落(colony)；因此，依據本揭示內容某些實施方式，步驟(E)可獲得約109 個獨立的菌落，將所有的菌落刮下後，冷凍於保存緩衝液中，即為噬菌體抗體庫。
在步驟(F)中，以定序試驗分析各個由步驟(E)之噬菌體抗體庫表現的scFv。首先，利用傳統DNA萃取技術由噬菌體抗體庫中萃取重組噬質體；舉例來說，酚/三氯甲烷萃取法及清潔劑(例如十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecyl sulfate)、妥文-20 (Tween-20)、NP-40及氚核X-100 (Triton X-100))/乙酸(acetic acid)萃取法。接者，利用焦磷酸定序法(shotgun sequencing)、單分子即時定序法(single-molecule real-time sequencing)或次世代定序法(next generation sequencing, NGS)來分析重組噬質體。依據一較佳實施例，是利用序列編號：228及229的引子來分析噬菌體抗體庫中的VL序列，且使用序列編號：230及231的引子來分析噬菌體抗體庫中的VH序列。
依據定序結果可發現，CDR-H1及CDR-H2主要的CS形態分別為第一型及第二型，而CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3主要的CS形態則分別為第二型、第一型及第一型；據此，依據該抗體架構(CDR-H1、CDR-H2、CDR-L1、CDR-L2及 CDR-L3的CS組合依序為1-2-2-1-1)來建構本發明由噬菌體表現之 scFv 抗體庫的抗體。因此，本揭示內容的一態樣是關於一種用以建立由噬菌體表現之scFv抗體庫的方法。該方法包含以下步驟： (1)合成一第一核酸序列，其係包含分別用以編碼一免疫球白基因之CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的一第一、一第二、一第三、一第四、一第五及一第六編碼序列； (2)將該第一核酸序列插入一第一噬質體載體中； (3)以定位點突變方法(site-directed mutagenesis)分別修飾該第一、第二及第三編碼序列以製備一變異輕鏈(VL)抗體庫，其係包含第一組由噬菌體表現之scFv，其中各scFv分別具有經修飾的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；以及以定位點突變方法分別修飾該第四、第五及第六編碼序列以製備一變異重鏈(VH)抗體庫，其係包含第二組由噬菌體表現之scFv，其中各scFv分別具有經修飾的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3； (4)利用蛋白L來篩選該VL抗體庫，由該VL抗體庫挑選第三組由噬菌體表現之scFv；且利用蛋白A來篩選該VH抗體庫，由該VH抗體庫挑選第四組由噬菌體表現之scFv； (5)由對應的噬菌體中擴增複數個第二核酸序列，其係用以編碼經修飾之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，且由對應的噬菌體中擴增複數個第三核酸序列，其係用以編碼經修飾之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；以及 (6)將該些第二及第三核酸序列插入第二噬質體載體以製備本發明由噬菌體表現之scFv抗體庫。
在步驟(1)中，先合成第一核酸序列，其係作為本發明scFv抗體庫之scFv的骨架。如習知技藝人士所熟知，合成步驟可於活體外進行，而不需起始的模版DNA檢體。依據本揭示內容某些實施方式，第一核酸序列至少90%相似於序列編號：1的核苷酸序列，其係用以編碼人類抗-VEGF抗體之CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。依據本揭示內容其他實施方式，第一核酸序列包含第一及一第二限制酶切點，藉以在步驟(2)中將合成的第一核酸序列插入第一噬質體載體中。在一實施方式中，第一限制酶切點是Sfi I，而第二限制酶切點是Not I。
在步驟(2)中，利用第一及第二限制酶切點將合成的第一核酸序列插入第一噬質體載體。依據本揭示內容一實施方式，第一噬質體載體可以源自M13噬菌體或T7噬菌體；較佳的情況是，第一噬質體載體是源自M13噬菌體。
為增加該些由噬菌體表現之scFv的多樣性，在步驟(3)中利用定位點突變方法分別修飾該些包含CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的第一到第六編碼序列；習知技藝人士皆知，定位點突變方法是一種常用以特定且刻意改變基因(即DNA及RNA)序列的方法。一般來說，定位點突變方法是利用一包含特定突變及與模版DNA突變位置附近之序列互補(藉此與特定基因雜合)的引子來進行；突變可以是單一鹼基改變(即點突變)、多鹼基改變、刪除或插入。在本揭示內容一實施方式中，分別利用具有序列編號：107-115、116-119及120-127核苷酸序列的DNA片段來修飾第一到第三編碼序列；較佳的情況是，同時修飾第一到第三編碼序列。經修飾後之第一編碼序列包含序列編號：2-10中任一核苷酸序列；經修飾後之第二編碼序列包含序列編號：11-14中任一核苷酸序列，而經修飾後之第三編碼序列則包含序列編號：15-22中任一核苷酸序列。包含經修飾之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之利用噬菌體表現的scFv即構成VL (變異輕鏈)抗體庫。
在本揭示內容一實施方式中，分別利用具有序列編號：128-131、132-133及134-211核苷酸序列的DNA片段來修飾第四到第六編碼序列；較佳的情況是，同時修飾第四到第六編碼序列。經修飾後之第四編碼序列包含序列編號：23-26中任一核苷酸序列；經修飾後之第五編碼序列包含序列編號：27或28之核苷酸序列，而經修飾後之第六編碼序列則包含序列編號：29-106中任一核苷酸序列。包含經修飾之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之利用噬菌體表現的scFv即構成VH (變異重鏈)抗體庫。
序列編號：2-211之核苷酸序列皆是依據本所屬領域習知技藝人士熟知之生物化學國際單位(international unit of biochemistry, IUB)編碼來表示，其中A代表腺嘌呤(adenine)；C代表胞嘧啶(cytosine)；G代表鳥糞嘌呤(guanine)；T代表胸嘧啶(thymine)；B代表C、G或T中任一核苷酸；D代表A、T或G中任一核苷酸；H代表A、C或T中任一核苷酸；K代表核苷酸G或T；M代表A或C；N代表A、T、C或G中任一核苷酸；R代表核苷酸A或G；S代表核苷酸G或C；V代表A、C或G中任一核苷酸；W代表核苷酸A或T；而Y則代表核苷酸C或T。
由於序列突變可能影響會scFv的折疊，步驟(4)進一步利用蛋白L及蛋白來分別篩選VL及VH抗體庫。如習知技藝人士所熟知，由馬格努斯消化鏈球菌(Peptostreptococcus magnus )分離之蛋白L對免疫球蛋白的輕鏈具有結合親和性；而由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )分離之蛋白A則對免疫球蛋白的重鏈具有結合親和性。操作時分別將蛋白L及蛋白A固定在一基質(例如瓊脂糖樹脂聚丙烯醯胺)上，再分別與VL及VH抗體庫之利用噬菌體表現的scFv進行混合。完整折疊的scFv可結合於固定蛋白上，進而利用沖提緩衝液(通常是甘胺酸(pH 2.2)等酸性溶液)破壞固定蛋白及由噬菌體表現之scFv間的鍵結，以收集該些完整折疊的scFv。因此，由VL抗體庫中可篩選出第三群之利用噬菌體表現的scFv，其係具有完整折疊的輕鏈且可結合至蛋白L；由VH抗體庫中可篩選出第四群之利用噬菌體表現的scFv，其係具有完整折疊的重鏈且可結合至蛋白A。
在步驟(5)中，以序列編號：212-215之引子利用OE-PCR來擴增第三及第四群噬菌體的核酸序列。具體來說，先以序列編號：212-213之引子由相對應的噬菌體擴增複數個用以編碼經修飾之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的第二核酸序列；以序列編號：214-215之引子由相對應的噬菌體擴增複數個用以編碼經修飾之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的第三核酸序列。須知，序列編號：213及214的核酸序列分別包含二互補序列(即GGAAGATCTAGAGGAACCACC及GGTGGTTCCTCTAGATCTTCC；分別為序列編號：335及336)，會分別插入第二核酸序列的3’端及第三核酸序列的5’端。利用二互補序列間的重疊區域，第二及第三核酸序列會形成一中間模版，之後可以序列編號：216及217的引子利用PCR反應來組合二核酸序列。
依據本揭示內容一實施方式，序列編號：216及217的核酸序列分別包含第一及第二限制酶切點(即Sfi I及Not I)；因此，在步驟(6)中，可利用上述二限制酶切點將組合產物插入第二噬質體載體的多轉殖位點，藉以製備一重組噬質體。第二噬質體載體可以源自M13噬菌體或T7噬菌體；較佳的情況是，第二噬質體載體是源自M13噬菌體。接著將該重組噬質體轉入一宿主細胞中。一般來說，可利用轉形法或電穿孔法將噬質體轉入宿主細胞；較佳的情況是，利用電穿孔法將噬質體轉入宿主細胞。各個轉形後的宿主細胞皆包含一重組噬質體，並可於培養基上形成一細胞群。依據一實施方式，宿主細胞一般是一細菌細胞；例如大腸桿菌細胞。步驟(6)共可獲得約109 個獨立的細胞群，將所有的細胞群刮下後，冷凍於保存緩衝液中，即為本揭示內容之由噬菌體表現之scFv抗體庫。
須知，第一及第二噬質體不必然是相同的噬質體。依據本揭示內容一實施方式，第一及第二噬質體皆源自M13噬菌體。
因此，本發明製備之由噬菌體表現之scFv抗體庫包含複數個由噬菌體表現之scFv，其中各個由噬菌體表現之scFv皆包含一CDR-H1、一CDR-H2、一CDR-H3、一CDR-L1、一CDR-L2及一CDR-L3，其中 各CDR-H1、CDR-L2及CDR-L3皆具有第一型之CS，且各CDR-H2及CDR-L1皆具有第二型之CS； 各CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中芳香族殘基的分佈與一天然抗體之對應CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中芳香族殘基的分佈相似。
依據本揭示內容某些實施方式，CDR-L1是由一包含序列編號：2-10中任一核酸序列之第一編碼序列編碼而成，CDR-L2是由一包含序列編號：11-14中任一核酸序列之第二編碼序列編碼而成， CDR-L3是由一包含序列編號：15-22中任一核酸序列之第三編碼序列編碼而成，CDR-H1是由一包含序列編號：23-26中任一核酸序列之第四編碼序列編碼而成，CDR-H2是由一包含序列編號：27-28中任一核酸序列之第五編碼序列編碼而成，且CDR-H3是由一包含序列編號：29-106中任一核酸序列之第六編碼序列編碼而成。
依據本揭示內容某些實施方式，本發明由噬菌體表現之scFv抗體庫中每個噬菌體皆帶有單一個噬質體。
在本揭示內容一實施方式中，至少一由噬菌體表現之scFv對蛋白抗原具有專一性，其中該蛋白抗原係選自由HER2、MBP、BSA、HSA、溶菌酶、IL-1β、HA、NP、VEGF、EGFR1、EGFR3、高血糖素受體、人類去氧核糖核酸水解酶、PD-L1、SIGLEC 3、IgG及利妥昔所組成的群組。依據本揭示內容某些實施方式，蛋白抗原HA是源自H1N1、H3N2或H5N1。依據本揭示內容其他實施方式，蛋白抗原NP是源自H3N2或H1N1。依據本揭示內容一實施例，至少一由噬菌體表現之scFv對HER2具有結合親和性及專一性；較佳的情況是，該HER2是源自於人類。在本揭示內容某些實施方式中，至少一由噬菌體表現之scFv可結合至HER2、EGFR1、EGFR3、PD-L1、SIGLEC 3及/或高血糖素受體的ECD。在本揭示內容其他實施方式中，至少一由噬菌體表現之scFv可結合至IgG的Fc區域。
依據一實施方式，由噬菌體表現之 scFv 抗體庫表現的scFv具有完整折疊的結構；較佳的情況是，該些scFv可表現於噬菌體表面，或是表現為可分泌之可溶形式。
本發明建構之由噬菌體表現之scFv抗體庫可有效製備一重組抗體，其係對一蛋白抗原具有結合親和性及專一性。具體來說，利用本發明由噬菌體表現之scFv抗體庫來製備重組抗體的方法包含以下步驟： (a)以該蛋白抗原篩選本發明由噬菌體表現之scFv抗體庫； (b)挑選複數個噬菌體，其中該些噬菌體會分別表現對該蛋白抗原具有結合親和性及專一性的scFv； (c)使步驟(b)挑選之該些噬菌體分別表現可溶形式之scFv； (d)由步驟(c)之scFv挑選一對該蛋白抗原具有高結合親和性及專一性的可溶形式scFv； (e)由會表現步驟(d)之可溶形式scFv的噬菌體中萃取一噬質體DNA； (f)以步驟(e)之噬質體DNA作為模版，利用PCR反應分別擴增用以編碼CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的第一核酸序列，及用以編碼CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的第二核酸序列； (g)將該第一及第二核酸序列插入表現載體中，其係包含第三及第四核酸序列，其中第三核酸序列係用以編碼免疫球蛋白之重鏈恒定區域，且第四核酸序列係用以編碼免疫球蛋白之輕鏈恒定區域；以及 (h) 將步驟(g)之包含該第一、第二、第三及第四核酸序列的表現載體轉染至宿主細胞，以製備該重組抗體。
在步驟(a)中，是先利用蛋白抗原來篩選本發明由噬菌體表現之scFv抗體庫。與前述方法步驟(4)之篩選方法相似，將蛋白抗原固定於基質(例如瓊脂糖樹脂聚丙烯醯胺)後，與本發明由噬菌體表現之scFv抗體庫進行混合。依據本揭示內容某些實施方式，該蛋白抗原可以是HER2、MBP、BSA、HA、溶菌酶、IL-1β、NA、VEGF、EGFR1、EGFR3、高血糖素受體或利妥昔。在一特定實施方式中，該蛋白抗原是HER2。
在步驟(b)中，以沖提緩衝液(通常是甘胺酸(pH 2.2)等酸性溶液)破壞固定蛋白及由噬菌體表現之scFv間的鍵結，進而收集該些對蛋白抗原具有結合親和性及專一性之由噬菌體表現之scFv。
在步驟(c)中，為排除上述鍵結是透過噬菌體(而非抗體)與蛋白抗原結合的可能性，進一步使步驟(b)篩選出的由噬菌體表現之scFv表現為可分泌之可溶形式。依據本揭示內容某些實施方式，於前述步驟(6)建構之包含於第二噬質體中的第二及第三核酸是由一乳糖操縱組(lactose operon, lac operon)所趨動；如本所屬領域具有通常知識者所熟知，添加異丙基-硫代β-D-半乳糖苷(isopropyl-thio-β-D-galactoside, IPTG)可引發乳糖操縱組表現，進而趨動下游基因(即第二及第三核酸序列)表現。產生的scFv因此會分泌至培養液之上清液中，習知技藝人士可由此收集該些scFv。
在步驟(d)中，是利用蛋白抗原來篩選步驟(c)所製備的scFv。與步驟(a)之篩選方法相似，先將蛋白抗原固定於基質(例如瓊脂糖樹脂聚丙烯醯胺)後，與scFv進行混合。接著挑選出對該蛋白抗原具有結合親和性及專一性的scFv。在一特定實施方式中，該蛋白抗原是HER2。
在步驟(e)中，將步驟(d)挑選之會表現可溶形式之scFv的噬菌體溶解後，萃取其噬質體DNA。可利用任何習知技藝人士所熟知的DNA萃取技術來溶解及萃取噬質體DNA；舉例來說，酚/三氯甲烷萃取法及清潔劑(例如十二烷基硫酸鈉、妥文-20、NP-40及氚核X-100)/乙酸萃取法。
在步驟(f)中，以步驟(e)萃取的噬質體DNA作為模版，利用序列編號：220及221的引子進行PCR反應來擴增包含 CDR-H1、CDR-H2及 CDR-H3的第一核酸序列，並利用序列編號：218及219的引子進行PCR反應來擴增包含 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的第二核酸序列。
在步驟(g)中，將擴增的第一及第二核酸序列插入表現載體中，其係包含第三及第四核酸序列，其中第三核酸序列係用以編碼一免疫球蛋白之重鏈恒定區域，而該第四核酸序列則係用以編碼該免疫球蛋白之輕鏈恒定區域。當可想見，該免疫球蛋白可以是IgG、IgA、IgD、IgE及IgM。在本揭示內容一較佳實施方式中，該免疫球蛋白是IgG。具體來說，第一及第二核酸序列是藉由一連接子來相互連接，其中該連接子是以pIgG載體作為模版，利用序列編號：222及223的引子進行PCR反應擴增而得。依據本揭示內容某些實施方式，該連接子依序包含以下序列：一輕鏈的恒定區(CL)、一牛生長激素之多腺苷酸化訊息片段(bovine growth hormone polyadenylation signal, BGA-polyA signal)、一人類細胞巨大病毒(cytomegalovirus, CMV)啟動子及一IgG重鏈的訊息胜肽(signal peptide)。利用第二核酸序列之3’端與連接子之5’端的互補序列(即TGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTT及AAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCA；分別為序列編號：337及338)，以及連接子之3’端與第一核酸序列之5’端的互補序列(即CTGCACTTCAGATGCGACACG及CGTGTCGCATCTGAAGTGCAG；分別為序列編號：339及340)，可以序列編號：218及221之引子進行PCR反應依序組合第二核酸序列、連接子及第一核酸序列，其中序列編號：218及221之引子分別包含限制酶切點Kpn I及Nhe I。接著利用該些限制酶切點將重組產物插入表現載體pIgG中。結構上，建構後之表現載體依序包含：第一人類CMV啟動子、IgG輕鏈之訊息胜肽、第二核酸序列、CL、第一BGH-polyA訊息片段、第二人類CMV啟動子、IgG重鏈之訊息胜肽、第一核酸序列、CH及第二BGH-polyA訊息片段，其中是利用第一人類CMV啟動子來趨動第二核酸序列及CL，以表現重組抗體的輕鏈，且利用第二人類CMV啟動子來趨動第一核酸序列及CH，以表現重組抗體的重鏈。
在步驟(h)中，是將步驟(g)建構的表現載體轉染至宿主細胞，以製備本發明重組抗體。常用的宿主細胞為哺乳動物細胞，例如HEK293 Freestyle細胞。可利用習知技藝人士熟知的方法進行轉染，包含化學方法(例如磷酸鈣、微脂體(liposome)及陽離子聚合物(cationic polymer))、非化學方法(例如電穿孔法、細胞擠壓法(cell squeezing)、聲孔法(sonoporation)、光轉染(optical transfection)、原生質體融合(protoplast fusion)及流體動力傳遞(hydrodynamic delivery))、顆粒法(例如基因槍(gene gun)、磁轉染(magnetofection)及穿刺轉染(impalefection))，以及病毒法(例如腺病毒載體(adenoviral vector)、辛得比斯病毒載體(sindbis viral vector)、及慢病毒載體(lentiviral vector))。製得的重組抗體會分泌到培養液之上清液中，習知技藝人士可利用任何熟知的方法由上清液中純化重組抗體；舉例來說，可利用與蛋白A或蛋白G的結合親和力來進行純化。
依據本揭示內容某些實施方式，本發明重組抗體對蛋白抗原具有結合親和性及專一性，其中該蛋白抗原是選自由HER2、MBP、BSA、HSA、溶菌酶、IL-1β、HA、NP、VEGF、EGFR1、EGFR3、高血糖素受體、人類DNase I、PD-L1、SIGLEC 3、IgG/Fc區域及利妥昔所組成的群組。依據本揭示內容某些實施方式，該蛋白抗原HA是源自H1N1、H3N2或H5N1。依據本揭示內容其他實施方式，該蛋白抗原NP是源自H3N2或H1N1。在本揭示內容某些實施方式中，至少一重組抗體可結合至HER2、EGFR1、EGFR3、PD-L1、SIGLEC 3及/或高血糖素受體的ECD。在本揭示內容其他實施方式中，至少一重組抗體可結合至IgG的Fc區域。
本發明方法可用以製備一重組抗體，其係對蛋白抗原具有結合親和性及專一性。依據本揭示內容某些實施方式，製成的重組抗體包含(1)一CDR-L1，其係具有第二型之CS，且係由一包含序列編號：2-10中任一核酸序列之第一編碼序列編碼而成；(2)一CDR-L2，其係具有第一型之CS，且係由一包含序列編號：11-14中任一核酸序列之第二編碼序列編碼而成；(3)一CDR-L3，其係具有第一型之CS，且係由一包含序列編號：15-22中任一核酸序列之第三編碼序列編碼而成；(4)一CDR-H1，其係具有第一型之CS，且係由一包含序列編號：23-26中任一核酸序列之第四編碼序列編碼而成；(5)一CDR-H2，其係具有第二型之CS，且係由一包含序列編號：27或28之第五編碼序列編碼而成；以及(6)一CDR-H3，其係由一包含序列編號：29-106中任一核酸序列之第六編碼序列編碼而成。依據本揭示內容某些實施方式，各CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中芳香族殘基的分佈與天然抗體之對應CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中芳香族殘基的分佈相似。在某些實施方式中，本發明重組抗體的離解常數約為10-7 至10-11 M。
依據本揭示內容一實施方式，製備的重組抗體包含一與序列編號：241-330中任一核酸序列至少有90%相似度的胺基酸序列；意即，重組抗體包含一胺基酸序列，其係90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相似於序列編號：241-330中任一胺基酸序列。在一較佳實施方式中，本發明重組抗體包含一與序列編號：241-330中任一核酸序列100%相似的胺基酸序列。
或者是，本揭示內容亦提供一種由HER2免疫之小鼠體內製備及純化的重組抗體。依據一實施方式，本發明重組抗體包含一與序列編號：233、237及331-334中任一核酸序列至少有90%相似度的胺基酸序列；意即，本發明重組抗體包含一胺基酸序列，其係90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相似於序列編號：233、237及331-334中任一胺基酸序列。在一較佳實施方式中，本發明重組抗體包含一與序列編號：233、237及331-334中任一核酸序列100%相似的胺基酸序列。
此外，所述源自小鼠的重組抗體亦可經人源化處理，因此包含一與序列編號：235至少有90%相似度的胺基酸序列；意即，本發明重組抗體包含一胺基酸序列，其係90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相似於序列編號：235的胺基酸序列。在一較佳實施方式中，本發明重組抗體包含一與序列編號：235完全相同的胺基酸序列。
在本揭示內容某些實施方式中，重組抗體可具專一性地結合至HER2的抗原決定位置。依據一實施方式，重組抗體會造成HER2表現量下降及內化，進而抑制與HER2相關的訊息傳遞路徑。
基於本發明重組抗體具有抑制HER2表現之功效，本揭示內容亦提供一種本發明重組抗體之用途，其係用以製備一藥物以治療一罹患或疑似罹患一種與HER2相關之疾病的個體。
HER2是人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor, HER, EGFR, ERBB)家族中的一員。已知該致癌基因的擴增或過量表現會導致某些侵犯型腫瘤(例如乳癌的生成及進程)。有鑑於本發明重組抗體可抑制HER2受體的功能，該重組抗體可用以製備一藥物，以治療由HER2過量表現所造成的疾病(例如腫瘤)。依據本揭示內容一實施方式，本發明重組抗體可抑制因HER2過量表現所造成的腫瘤。依據本揭示內容另一實施方式，該個體是一哺乳動物；較佳是一人類。
依據本揭示內容某些實施方式，用以治療與HER2相關之疾病的重組抗體包含一與序列編號：233、235、237及241-334中任一核酸序列至少有90%相似度的胺基酸序列。
本揭示內容的另一態樣是關於一種用以抑制HER2表現的組合物。依據本揭示內容一實施方式，該組合物包含第一重組抗體及第二重組抗體，其中該第一及第二重組抗體皆是以本揭示內容之方法製備而得，且該第一及第二重組抗體皆是IgG抗體。依據本揭示內容另一實施方式，該第一重組抗體會結合至HER2之第一抗原決定位置，且該第二重組抗體會結合至HER2之第二抗原決定位置，其中該第一及第二抗原決定位置是不同的抗原決定位置。
依據本揭示內容一實施方式，該第一重組抗體包含序列編號：253的胺基酸序列，且該第二重組抗體包含序列編號：274的胺基酸序列。依據本揭示內容另一實施方式，該第一重組抗體包含序列編號：253的胺基酸序列，且該第二重組抗體包含序列編號：301的胺基酸序列。
依據本揭示內容某些實施方式，本發明組合物會造成HER2受體被內化。依據本揭示內容其他實施方式，本發明組合物會抑制HER2受體的功能。
在本揭示內容某些實施方式中，該第一及第二重組抗體於抑制與HER2相關之訊息傳遞路徑時，會產生相加(additive)之功效；意即，本發明組合物所產生的功效等於個別抗體(即第一抗體及第二抗體)所產生之功效的總合。在本揭示內容其他實施方式中，該第一及第二重組抗體於抑制與HER2相關之訊息傳遞路徑時，會產生加乘性(synergistic)功效；意即，本發明組合物所產生的功效大於個別抗體(即第一抗體及第二抗體)所產生之功效的總合。
基於本發明組合物的抑制功效，本揭示內容提供了一種本發明組合物之用途，其係用以製備一藥物以治療一罹患或疑似罹患一種與HER2相關之疾病的個體。在本揭示內容一特定實施方式中，該疾病是腫瘤。依據本揭示內容一實施方式，該個體是一哺乳動物；較佳是一人類。在一較佳實施方式中， 本發明組合物包含二個重組抗體，其中一重組抗體包含序列編號：253的胺基酸序列，而另一重組抗體則包含序列編號：274或301的胺基酸序列。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。
實施例
材料及方法
細胞株及試劑
SKBR3細胞是購買自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection, ATCC)，並培養於包含10%胎牛血清及抗生素/抗真菌劑的RPMI 1640 (Gibco)細胞培養液中。調節蛋白Heregulin (HRG) 是購買R&D系統。使用於西方墨點分析之抗-磷酸化ERK抗體、抗-ERK抗體、抗-磷酸化AKT抗體及抗-AKT抗體是購買自Cell Signaling Technology；兔子抗-HER2抗體及抗-微管蛋白抗體則是購買自Sigma。
使小鼠免疫
將8-12週大的雌性BalbC/j小鼠飼育於經認證的SPF環境。依據免疫流程將小鼠分為四組：(1) m0組，為不接受免疫源刺激之小鼠，作為實驗對照組；於16週大時犠牲m0組之小鼠，之後收集其脾臟進行後續試驗分析；(2) m3組，先對該些小鼠投予序列編號：224之融合蛋白MBP-3 (包含MBP及源自人類HER2蛋白之第203-262胺基酸殘基的多肽)，使其產生免疫反應，之後再投予序列編號：225之多肽HER2/ECD，以增強小鼠體內的免疫反應；於第二次抗原刺激後5週將小鼠犠牲，之後取出其脾臟進行後續試驗分析；(3) m4組，先對該些小鼠投予融合蛋白MBP-3，再以多肽HER2/ECD增強小鼠體內的免疫反應；於第二次抗原刺激後12週將小鼠犠牲，之後取其脾臟進行後續試驗分析；以及(4) m6組，僅對該些小鼠投予多肽HER2/ECD，投予後14週將小鼠犠牲。
建立小鼠抗體群組
將已免疫之小鼠犠牲後，取出其脾臟並與2毫升之TRI試劑(Invitrogen)均勻混合。緊接著，將檢體均質化後置於1.5毫升之微管中(每管0.5 毫升)，冷凍於−80°C。利用QIAGEN RNeasy Plus Mini套組萃取解凍後檢體的RNA，平均四分之一的脾臟可獲得60-80微克的總RNA。依據使用操作手刪，以SuperScript III第一股合成系統(SuperScript III First-Strand Synthesis System, Invitrogen)將萃取的RNA進行反轉錄。反應如下：將包含10微克之總RNA、1微升之10 µM引子Oligo(dT)20 及1微升之10mM dNTP的混合物加入0.2毫升小管中，以0.1% DEPC水(加入二乙基焦碳酸鹽之蒸餾水)將體積調整至10微升。將混合物放置於65°C反應5分鐘後，立即放置於冰上降溫。每管加入10微升之cDNA合成混合物(2微升之 10X RT緩衝液、4微升之 20 mM MgCl2 、2微升之0.1 M 二硫蘇糖醇、1微升之 RNaseOut (每微升40 U)及1微升之SuperScript III RT (每微升200 U))。將混合物置於50°C反應50分鐘，以合成cDNA的第一股。將混合物置於85°C反應5分鐘以中止反應，再將小管維持於4°C。將1微升之RNase H加入檢體中，並置於37°C反應20分鐘，以移除殘存的RNA。測定 OD260 之濃度後，將檢體存放於-20°C以供後續PCR反應使用。
以二輪PCR反應建立小鼠抗體群組。在第一輪反應中，依據Barbas等人建立的步驟(G.J. Phage Display A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; 2001)，以cDNA作為模版，利用引子混合物分別擴增輕鏈κ及λ之變異區域(即Vκ及Vλ)及重鏈之變異區域(即VH)片段。PCR反應體積為50微升，其中包含MyTaq Hot熱起始聚合酶(MyTaq Hot Start polymerase, Bioline)、0.5微克之cDNA模版及0.3 µM之各引子混合物；反應25個循環(95°C：30秒、65°C：30秒、72°C：1分鐘)後，進行10分鐘最終合成步驟。利用瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)分析並純化PCR產物。
在第二輪PCR反應中，利用序列編號：226及227之交疊引子分別將Vκ及Vλ與VH進行組合。簡單來說，將100奈克之由第一輪PCR產物回收之Vκ、Vλ及VHPCR產物加入總體積為50微升的混合液中，該混合液包含MyTaq熱起始聚合酶(Bioline)及0.3 µM之各引子，反應30個PCR循環(95°C：30秒、65°C：30秒、72°C：1分30秒) 後，進行10分鐘最終合成步驟。以Sfi I及Not I (New England BioLabs)切割組合後的Vκ-VH或Vλ-VH片段，再將其轉殖至噬質體載體pCANTAB5E中。以電穿孔方法(3,000伏特)將10-5微克之接合產物轉形至大腸桿菌ER2738中。得到的小鼠抗體群組包含至少109 個scFv。
利用次世代定序分析小鼠抗體群組的 CS 組合
為分析各scFv表現抗體的VL及VH序列，利用序列編號：228-231之引子進行PCR反應，以製備次世代定序所需要的DNA檢體，其中序列編號：228及229之引子是分別位置VL序列的兩側，而序列編號：230及231之引子則是分別位置VH序列的兩側。依據鈦定序流程(titanium sequencing protocol)，以Roche 454 GS junior sequencer分析純化後之DNA片段的序列。
由次世代定序分別收集對照組小鼠及免疫小鼠之VH及VL序列的原始讀出數據。以Antibodyomics 1.0套裝軟體處理原始讀出數據，藉以過濾序列長度，並轉譯為各個胺基酸。在分析各抗體序列時，將分析序列與由357個抗體結構建立之重鏈特定或輕鏈特定的隱馬爾可夫模型(hidden Markov model, HMM)進行比對，藉以辨識各CDR。以MEGA程式及鄰接法(neighbor-joining method)建立親緣演化樹來分析VH及VL序列的親緣關係。利用abysis網站分析各CDR之CS。以WebLogo及未設定的背景概率與參數建立各CDR之序列標籤。
建立本發明由噬菌體表現之 scFv 抗體庫 (GH2)
製備模版 Av1
先以活體外方式合成用以編碼G6 抗-VEGF Fab之核酸序列(序列編號：1)，再將其轉殖至噬質體載體pCANTAB5E，以建立模版Av1。接著，將TAA終止密碼子轉入各CDR中，以確保唯有攜帶經修飾之基因的抗體可表現於噬菌體表面。以分別具有序列編號：107-127之核酸序列的21個DNA片段來修飾模版Av1中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的核酸序列，以建立VL抗體庫；以分別具有序列編號：128-154之核酸序列的27個DNA片段來修飾模版Av1中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的核酸序列，以建立VH2抗體庫；以分別具有序列編號：128-133及155之核酸序列的7個DNA片段來修飾模版Av1中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的核酸序列，以建立VH3抗體庫；以分別具有序列編號：128-133及156-157之核酸序列的8個DNA片段來修飾模版Av1中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的核酸序列，以建立VH4抗體庫；以分別具有序列編號：128-133及158-160之核酸序列的9個DNA片段來修飾模版Av1中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的核酸序列，以建立VH5抗體庫；以分別具有序列編號：128-133及161-164之核酸序列的10個DNA片段來修飾模版Av1中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的核酸序列，以建立VH6抗體庫；以分別具有序列編號：128-133及165-169之核酸序列的11個DNA片段來修飾模版Av1中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的核酸序列，以建立VH7抗體庫；以分別具有序列編號：128-133及170-175之核酸序列的12個DNA片段來修飾模版Av1中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的核酸序列，以建立VH8抗體庫；以分別具有序列編號：128-133及176-182之核酸序列的13個DNA片段來修飾模版Av1中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的核酸序列，以建立VH9抗體庫；以分別具有序列編號：128-133及183-192之核酸序列的16個DNA片段來修飾模版Av1中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的核酸序列，以建立VH11抗體庫；以分別具有序列編號：128-133及193-198之核酸序列的12個DNA片段來修飾模版Av1中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的核酸序列，以建立VH12抗體庫；以分別具有序列編號：128-133及199-201之核酸序列的9個DNA片段來修飾模版Av1中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的核酸序列，以建立VH13抗體庫；以分別具有序列編號：128-133及202-204之核酸序列的9個DNA片段來修飾模版Av1中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的核酸序列，以建立VH14抗體庫；以分別具有序列編號：128-133及205-207之核酸序列的9個DNA片段來修飾模版Av1中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的核酸序列，以建立VH15抗體庫；以分別具有序列編號：128-133及208-209之核酸序列的8個DNA片段來修飾模版Av1中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的核酸序列，以建立VH16抗體庫；以及以分別具有序列編號：128-133及210-211之核酸序列的8個DNA片段來修飾模版Av1中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的核酸序列，以建立VH17抗體庫。為修飾序列，先將與各CDR對應之DNA片段及T4多核苷酸激酶(New England BioLabs)加至包含70 mM Tris–HCl (pH 7.6)、10 mM MgCl2 、1 mM ATP及5 mM 二硫蘇糖醇的溶液中，均勻混合後置於37°C反應1小時以使各DNA片段進行磷酸化。將磷酸化之DNA片段與尿嘧啶化(uracilated)之單股DNA模版接合，兩者反應莫耳比為3：1 (寡核苷酸：ssDNA)，將混合物以熱循環儀加熱至90°C反應2分鐘，再以每分鐘1°C的速率逐漸降溫，直至溫度達20°C。接著，將模版-引子接合混合物與0.32 mM ATP、0.8 mM dNTP、5 mM DTT、600單位之T4 DNA接合酶及75單位之T7 DNA聚合酶(New England BioLabs)共同反應以於活體外合成DNA。於20°C反應至隔日後，以離心過濾管(centrifugal filter, Amicon® Ultra 0.5 mL 30K device)將dsDNA中的鹽類去除且進行濃縮，再以3,000伏特的電壓，以電穿孔法將處理後的dsDNA轉染至大腸桿菌ER2738。一般來說，1微克的dU-ssDNA約會產生107 -108 重組變異型(variant)(scFv變異型)，其中約75–90%之scFv 變異型同時包含三個經修飾的CDR。
以蛋白 A 及蛋白 L 篩選具有功能之 scFv 變異型
利用蛋白L篩選VL抗體庫(即具有經修飾之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的scFv變異型)，且以蛋白A篩選VH2-VH9抗體庫及VH11-VH17抗體庫(即具有經修飾之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的scFv 變異型)。在篩選時，先以20% PEG/NaCl沉澱VL、VH2-VH9及VH11-VH17抗體庫之各個scFv變異型後，使各scFv變異型再懸浮於磷酸鹽-緩衝生理食鹽水(phosphate-buffered saline, PBS)中；同時，將蛋白A及蛋白L分別塗佈於96孔Maxisorb免疫盤上(每孔洞包含100微升之PBS及1微克的蛋白A或L)，置於4°C至隔日；之後與5%之溶於PBS-T (包含0.05%妥文-20之PBS)之脫脂牛奶反應1小時。接著，每孔洞加入100微升之經懸浮的scFv變異型(每毫升1013 cfu)，溫和搖晃1小時。以200微升之PBST及200微升之PBS分別洗滌12次及2次。每孔洞加入100微升之0.1 M HCl/甘胺酸(pH 2.2)，以沖提收集附著之變異型，之後以8微升之2 M包含 Tris的緩衝液(pH 9.1)中和沖提液。將沖提後的scFv變異型與1毫升的大腸桿菌ER2738 (A 600 nm = 0.6)均勻混合，置於37°C培養15分鐘。將大腸桿菌滴定分析(titrate)後，置於50毫升之包含每毫升100微克之胺苄青黴素(ampicillin)的2倍酵母菌萃取物及胰化蛋白培養液(Yeast extract and Tryptone medium, YT medium)中，於37°C培養至隔日。離心後，重新懸浮細菌沉澱物，再以下述方法萃取其噬質體DNA。
將具有功能之 scFv 變異型組合為 GH2 抗體庫
以萃取自VL抗體庫變異型之噬質體DNA作為模版，利用具有序列編號：212之核酸序列的正向引子及具有序列編號：213之核酸序列的負向引子擴增VL的核酸序列；而以萃取自VH抗體庫(即VH2-VH9及VH11-VH17)變異型之噬質體DNA作為模版，利用具有序列編號：214之核酸序列的正向引子及具有序列編號：215之核酸序列的負向引子擴增VH的核酸序列。PCR反應體積為50微升，其係包含KOD熱啟動聚合酶(KOD Hot Start polymerase, Novagen)、100奈克之DNA模版及0.3 µM之各引子；反應25個循環(95°C：30秒、65°C：30秒、72°C：1分鐘)後，進行10分鐘最終合成步驟。以EcoR Ⅰ切割產物後，利用瓊脂糖凝膠電泳進行純化。
以另一PCR反應來組合VL及VH核酸序列；在該次反應中，二條引子分別具有序列編號：216及217的核酸序列。在第二輪的PCR反應中，將100毫微克之第一輪PCR反應產物(即經純化的VL及VH)加至總體積為50微升的混合液中，該混合液包含MyTaq熱啟動聚合酶及0.3 µM之各引子，反應30個PCR循環(95°C：30秒、65°C：30秒、72°C：1分30秒) 後，進行10分鐘最終合成步驟。以Sfi I及Not I (New England BioLabs)切割組合後的VL-VH片段，再將其轉殖至噬質體載體pCANTAB5E。以電脈衝穿孔方法(3,000伏特)將接合產物轉形至大腸桿菌ER2738中。
將得到的由噬菌體表現之scFv抗體庫分別命名為GH2 (generic human，第2版)-GH9及GH11-GH17，其係分別包含可表現特定VL及VH序列之噬菌體(如表1所示)。 表1 特定抗體庫之CDR序列
由 GH2-GH9 及 GH11-GH17 抗體庫製備重組抗體
以IgG形式進行表現，以萃取自GH2-GH9及GH11-GH17抗體庫之噬質體作為模版，利用PCR反應擴增其中用以編碼VH及VL的核酸序列，並將各序列轉殖至哺乳動物表現載體pIgG中。以具有合成校對功能(proof-reading)的DNA聚合酶(KOD 熱起始DNA聚合酶，Novagen)及序列編號：218及219的引子進行PCR反應擴增VL序列；利用序列編號：220及221的引子來擴增VH序列。PCR反應總體積為50微升，其係包含100毫微克的DNA模版及1微升之10 μM的各引子，反應30個循環 (95°C：30秒、56°C：30秒、72°C：30秒)後，於72°C進行10分鐘最終合成步驟。利用一連接子來連接VL及VH序列，其中該連接子是以序列編號：222及223的引子進行PCR反應由pIgG載體擴增而得。連接子依序包含以下序列：一輕鏈的恒定區(CL)、一牛生長激素之多腺苷酸化訊息片段(bovine growth hormone polyadenylation signal, BGA-polyA signal)、一人類CMV啟動子及一IgG重鏈的訊息胜肽。為連接VL序列、連接子及VH序列，利用序列編號：218及221的引子對進行PCR反應，共30個循環 (95°C：30秒、58°C：30秒、90°C：30秒)。將PCR產物轉殖至pIgG載體。簡單來說，將2微升(20毫微克)之線性化(linearized，先以Kpn I及Nhe I切割) pIgG載體、2微升(20毫微克)欲殖入的DNA及4微升之Gibson Assembly Master Mix (New England BioLabs Inc. Ipswich, MA, USA)均勻混合，並置於50°C反應1小時。之後，將一半體積之接合混合物轉形至大腸桿菌JM109勝任細胞。以限制酶切割位點及DNA定序來確認插入質體中之DNA序列是否正確。得到的構建體同時包含IgG的輕鏈及重鏈，其係分別以人類CMV啟動子來趨動表現。
將上述構建體轉染至HEK293 Freestyle (293-F, Life Technologies, USA) 細胞，並將其培養於無血清之Freestyle 293表現培養液(Freestyle 293 expression media, Life Technologies)中，溫和搖晃(110 rpm)並置於37°C之包含7% CO2培養箱(Thermo Scientific)中培養。若欲將構建體轉染至500毫升細胞培養液中，先將293-F細胞懸浮於2升Erlenmeyer三角瓶中，並將細胞密度調整為每毫升1.0 x 106 細胞。將質體DNA (500微克)溶於25毫升之無血清細胞培養液中，再0.2微米注射式過濾器過濾；之後，將處理後的質體DNA與25毫升之包含1毫克聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI, Polysciences)的細胞培養液劇烈混合。放置於室溫20分鐘後，將混合物加入細胞，並輕微搖晃之，接著將細胞置於37°C的環境中培養。轉染24小時後，加入最終濃度為0.5%的胰化蛋白N1 (Tryptone N1, ST Bio, Inc, Taipei, Taiwan)。培養5天後，以8000 xg的轉速離心30分鐘以收集上清液，再以0.8微米的膜式過濾器(Pall Corporation, Michigan)過濾。將上清液注入HiTrap蛋白A親和管柱(HiTrap Protein A affinity column, GE Healthcare, Uppsala, Sweden)中，以0.2 N之甘胺酸-HCl (pH 2.5)沖提進入十分之一體積之1 M Tris-HCl緩衝液(pH 9.1)。進一步利用Superdex 200凝膠過濾管柱(Superdex 200 gel filtration column, 10/300 GL, GE Healthcare, Uppsala, Sweden)移除高分子量凝集體，以純化IgG蛋白。
競爭型免疫分析 (Competition assay)
將溶於PBS緩衝液(pH7.4)之HER2/ECD 胜肽塗佈於NUNC 96孔洞Maxisorb免疫盤上(每孔洞0.2微克)，置於4°C至隔日，之後加入5%之溶於PBST的脫脂牛奶，反應1小時。接著，將1-3微克之經純化的scFv或IgG抗體加至各孔洞，輕微搖晃30分鐘，加入50微升之測試噬菌體後，培養1小時。以300微升PBST (包含0.05% (體積/體積)之Tween-20)洗滌各孔洞6次，再加入辣根過氧化物酶(horse-radish peroxidase)/抗-M13抗體共軛物(稀釋比例為1: 2000)及辣根過氧化物酶/抗-E-標籤抗體共軛物(稀釋比例為1: 3000)，反應30分鐘。以PBST及PBS緩衝液分別洗滌6次及2次後，加入3,3’,5,5’-四甲基-聯苯胺過氧化物酶受質(3,3’,5,5’-tetramethyl-benzidine peroxidase substrate, Kirkegaard & Perry Laboratories)反應5分鐘，以1.0 M HCl 停止反應，並讀取波長 450奈米(nm)時的光譜讀值。藉由比對不加入scFv抗體或IgG抗體之各對照組檢體來計算競爭型免疫分析值。利用R軟體之gplots組件來產生具有競爭結果之樹狀圖結構的熱圖(將競爭數值標準化為0到100)，以分析競爭數值。
BIAcore 試驗
利用BIAcore T200 (GE Healthcare)儀器來檢測抗體及抗原HER2/ECD之間的結合親和性及動力學參數。以胺共軛接合套組(amine coupling kit)將溶於10 mM乙酸鹽緩衝液(pH 5.0)之HER2/ECD固定在CM5感應晶片上，反應單位(response unit)為1000。在檢測IgG及HER2/ECD作用間的結合常數(kon )及解離常數 (koff )時，是利用PBST (包含0.05%之Tween-20)作為運行緩衝液(running buffer)，且將流速設定為每分鐘30微升。在注入新IgG抗體前，先以10 mM甘胺酸(pH 1.5)將感應晶片表面再生(regenerate)，將得到的訊號值減去參照值(未以配體(ligand)塗佈之孔道)。以Biaevaluation軟體(GE Healthcare)之1:1結合模式進行全域比對(global fitting)以決定結合動力學。
定位抗原決定位置 (Epitope mapping)
分別製備氘化抗原-抗體複合物、氘化抗原及非氘化抗原，以利用LC-串聯質譜測定氫氘交換法(hydrogen-deuterium exchange measured with LC-tandem mass spectroscopy, HDX-MS)分析抗原決定位置。在製備氘化抗原-抗體複合物時，將每毫升1.1毫克的HER2/ECD與每毫升6毫克的抗體混合後，置於室溫反應1小時，以製備一莫耳比為1:2之抗原-抗體複合物。將檢體與2微克之去聚醣酶-PNGase (P0704S, NEB)混合後，置於37°C 反應2小時，藉以對蛋白進行去醣化反應，並增加質譜分析的序列覆蓋率(sequence coverage)。將5微升之抗原或抗原-抗體複合物與20微升之氘化緩衝液(100% D2 O, 10 mM TRIS, 140 mM NaCl, pH 7.2)混合後，於室溫進行10分鐘的交換培養，使檢體氘化。加入75微升之冰淬熄溶液(包含0.15% 甲酸、8 M尿素及1 M TCEP，pH 2.5)來淬熄交換反應，再利用離心濃縮機(Vivaspin 500, 10 kDa, GE Healthcare)於0°C以7,500 rpm的轉速將檢體體積減少至20微升。加入40微升之預冷酸性溶液(包含0.15%甲酸及100 mM TCEP，pH 2.5)稀釋檢體以減少尿素濃度，之後再將檢體、3微升之胃蛋白酶(pepsin，每毫升5毫克)及3微升之第XIII型蛋白酶(protease type XIII，每毫升50毫克)置於冰上反應30分鐘。以液態氮冷凍反應後之檢體，再將其冷凍於-80°C。利用與上述相似之步驟(不需進行氘化步驟)來製備非氘化抗原。
為決定胜肽質量，將10微升之解凍後的檢體注入串聯式液相層析系統(tandem liquid chromatographic system, Accela pump, Thermo Scientific)及ESI質譜儀(Velos Pro LTQ, Thermo Scientific)以進行分離及分析。以C18 管柱(XBridge C18 , 3.5 μm, 1.0 x 150 mm, Waters)及由10%到60%之溶劑B (溶劑A：水及0.15%甲酸；溶劑B：乙腈及0.1%甲酸)之線性梯度進行分離，流速設定為每分鐘50微升，反應時間為30分鐘。將C18 管柱、注射器及離心管置於冰上，以減少逆交換(back-exchange)。由配有標準電噴霧離子源(standard electrospray ionization source)之質譜儀以解析度模式(resolution mode, m/z 300–2,000)來收集質譜數據。利用HX-Express 2檢測各胜肽同位素分佈(isotopic envelope)之質心值(centroid value)。 以式(1)計算源自抗原之各胜肽的氘化量： 氘化量(%) =(1) 其中，m(P)、m(N)及m(F)分別為氘化抗原-抗體複合物、非氘化抗原及氘化抗原的質心值。唯有當氘化量改變大於10%時，方將該位置視為結合位置。
抗體 - 抗原作用之 EC50
將抗體逐量加至固定之HER2/ECD ，以ELISA分析抗體的EC50 。簡單來說，將溶於PBS緩衝液(pH 7.4)的HER2/ECD胜肽塗佈於NUNC 96孔洞之Maxisorb免疫盤上(每孔洞0.2微克)，置於4°C至隔日；之後，加入5%之溶於PBST的脫脂牛奶，反應1小時。同時，以包含5%牛奶之PBST連續二倍稀釋抗體，最終產生11種不同濃度的抗體。之後，取100微升之不同濃度的稀釋抗體，將其分別加入孔洞中，輕微搖晃反應1小時。以300微升之PBST洗滌6次後，加入100微升之辣根過氧化物酶/抗-人類IgG抗體共軛物(溶於包含5%牛奶之PBST，稀釋比例為1:2000)，反應1小時。以PBST及PBS緩衝液分別洗滌6次及2次後，加入 3,3’,5,5’-四甲基-聯苯胺過氧化物酶受質(Kirkegaard & Perry Laboratories)反應3分鐘，之後以1.0 M HCl停止反應，並讀取波長 450奈米(nm)時的光譜讀值。依據Stewart及Watson法計算EC50 (每毫升之奈克)。
免疫螢光染色
將SKBR3細胞種植於Lab-Tek II腔室玻片(Nunc)上，生長至隔夜後，加入抗體置於37°C作用特定時間，再以甲醇進行固定。以TBS-Tx (包含0.1% 氚核X-100之TBS)使細胞膜穿孔(permeabilize)後，加入阻斷緩衝液(blocking buffer；包含2% BSA之TBS-Tx)，於室溫作用10分鐘。接著，加入溶於阻斷緩衝液之一級抗體，於4°C作用至隔日；洗滌後，加入溶於阻斷緩衝液之二級抗體 (與Alexa-488連接之山羊抗-兔子抗體，以及與Alexa-647連接之山羊抗-人類抗體，Invitrogen)，於室溫反應60分鐘；洗滌後，以包含DAPI (Life Technologies)之封固劑進行封固。以配有40倍及 100倍之複消色差物鏡(apochromat objectives)的TCS-SP5-MP-SMD共焦顯微鏡(Leica)觀察玻片。分別以Argon以及 NeHe雷射光於488奈米及647奈米波長激發Alexa螢光團。 以LAS AF軟體(Leica)分析所得影像。
西方墨點分析
將取自經抗體處理之細胞及對照組細胞的細胞溶解物分別注入SDS-PAGE，之後將其轉移至PVDF膜上。加入5%之溶於TBS(包含0.1% Tween-20)的脫脂牛奶反應30分鐘後，加入一級抗體，於4°C作用至隔日；之後加入與辣根過氧化物酶鍵結之二級抗體 (Amersham Biosciences, Piscataway)進行反應。利用Pierce ECL西方墨點受質(Thermo Fisher Scientific)及ImageQuant LAS-4000 (GE Healthcare)來觀察蛋白表現。
偽病毒中和試驗 (Pseudovirus neutralization assay)
將用以編碼螢光素酶(luciferase)之慢病毒核質體(lentiviral core plasmid)與用以編碼HA、NA及TMPRSS2蛋白(A/California/04/2009)之質體一起轉染至細胞中，以製備H1N1偽病毒。將293T細胞的最終濃度調整為每毫升2 × 105 個細胞。將50微升之293T細胞加至96孔洞盤中。因此，每孔洞包含10,000個細胞。將細胞置於 37°C CO2 培養箱中18個小時。藉由通過0.45微米之96孔洞過濾盤(PALL corp.)來製備無菌的scFv。將無菌的scFv連續稀釋於包含0.3% BSA的MEM細胞培養液(Gibco)中。將80微升之偽病毒與80微升之無菌的scFv共同培養於37°C CO2 培養箱45分鐘，以進行中和反應。測試前先移除培養18小時後之293T細胞的細胞培養液，將混合物加至細胞後，置於37°C CO2 培養箱培養10-12小時。之篒，以包含10% FBS(Gibco)之新鮮DMEM (Gibco)置換偽病毒/scFv混合物。繼續將細胞培養48小時。移除細胞培養液以偵測螢光素酶表現。每孔洞加入20微升之1倍的溶解緩衝液(Promega)，並搖晃15分鐘均勻混合以溶液細胞。將50微升之螢光素酶試劑(Promega)加至白色96孔洞盤(Griener Bio-one)之各孔洞中。將對應孔洞的細胞溶解物轉移至白色96孔洞盤。以Victor3 (Perkin Elmer)分析盤中螢光素酶的活性。
實施例 1 分析小鼠抗體群組
為分析小鼠抗體群組，分別萃取m0、m3、m4及m6組老鼠(如「材料及方法」所述)之mRNA，並將其反轉為對應的cDNA後，以cDNA作為模版來擴增VH及VL序列，其中VH序列包含VH -DH -JH DNA片段，Vκ序列包含Vκ-Jκ DNA片段，而Vλ序列則包含Vλ-Jλ DNA片段。分別將擴增後的VH及VL序列插入噬質體載體pCANTAB5E中，再將該噬質體載體轉形至大腸桿菌ER2738株以擴增該些會表現scFv的噬菌體。共可得到316個噬菌體，其會分別表現對胜肽HER2/ECD具有結合親和性的scFv，將該些噬菌體標記為S316。
利用NGS來分析各CDR的CS類型；分析結果指出，四組小鼠及S316之VH、Vκ及Vλ具有相似的CS類型，其中CDR-H1及CDR-H2之主要CS類型分別為第一型及第二型，CDR-Lκ1及CDR-Lκ2之主要CS類型分別為第二型及第一型，在CDR-Vλ序列中只能觀察到一種CS組合(結果未顯示)。該些結果亦暗示，不論是免疫化流程之差異或是抗體篩選之過程，皆不會影響抗體群組的分佈。已知小鼠抗體群組中的VL主要為Vκ，而 Vκ之CDR-L3的分佈主要集中在9個殘基的長度，其中CDR-L3主要為第一型之CS (結果未顯示)。因此，所有抗體群組之CS組合主要皆為：第一型之CS之CDR-H1、第二型之CS之CDR-H2、第二型之CS之CDR-L1、第一型之CS之CDR-L2及第第一型之CS之CDR-L3。至於CDR-H3，雖然未具有特定形式之CS類型，其長度分佈主要集中在11個殘基的長度。
該些結果指出，小鼠抗體群組包含至少109 scFv，其中CDR-H1及CDR-H2之主要CS類型分別為第一型及第二型，而CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之主要CS類型則分別為第二型、第一型及第一型。
實施例 2 建立本發明抗體庫 GH2-GH9 及 GH11-GH17
2.1 建構及修飾
基於實施例1之分析結果(即小鼠抗體群組之CDR-H1、CDR-H2、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有1-2-2-1-1的CS組合)，合成序列編號：1的核酸序列，其係可用以編碼G6抗-VEGF之Fab；將合成序列轉殖至噬菌體載體pCANTAB5E中，以製備重組噬質體Av1。重組噬質體Av1與分別源自四組小鼠(即m0、m3、m4及m6)、S316及發表於蛋白資料庫(Protein Data Bank)之584個抗體(標記為S584)的抗體群組之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，具有相似的芳香族殘基分佈(結果未顯示)。
由於CDR中，抗體-抗原作用表面之短鏈親水性殘基會藉由短程靜電作用及直接的氫鍵鍵結影響抗體對抗原辨識的專一性，因此以具有序列編號：107-127之核酸序列的21條DNA片段修飾抗體庫重組噬質體Av1之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的核酸序列，以建立一VL抗體庫；且以具有序列編號：128-211之核酸序列的84條DNA片段修飾抗體庫重組噬質體Av1之CDR-H1、 CDR-H2及CDR-H3的核酸序列，以建立一VH抗體庫(即VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH11、VH12、VH13、VH14、VH15、VH16或VH17 抗體庫)。分別以蛋白L及蛋白A篩選VL及VH抗體庫；由對蛋白L及蛋白A具有結合親和性之scFv變異型萃取噬質體DNA，並利用該些噬質體DNA作為模版來分別擴增VL及VH核酸序列。將該些擴增的核酸序列插入噬質體載體pCANTAB5E中，之後將該載體轉形至大腸桿菌ER2738株，以擴增該些會表現scFv的噬菌體。將由噬菌體表現得到的之scFv抗體庫分別命名為抗體庫GH2、GH3、GH4、GH5、GH6、GH7、GH8、GH9、GH11、GH12、GH13、GH14、GH15、GH16及GH17。
上述結果顯示，本發明抗體庫(即GH2、GH3、GH4、GH5、GH6、GH7、GH8、GH9、GH11、GH12、GH13、GH14、GH15、GH16及GH17)包含複數個由噬菌體表現之scFv，該些scFv具有以下特徵：(1)特定的CS組合，其中CDR-H1、CDR-L2及CDR-L3具有第一型之CS，而CDR-H2及CDR-L1則具有第二型之CS；(2)特定的芳香族殘基分佈，其係與一天然抗體之芳香族殘基分佈相似；以及(3)各CDR中特定的核酸序列，其中CDR-L1係由一包含序列編號：2-10中任一核酸序列之序列編碼而成，CDR-L2係由一包含序列編號：11-14中任一核酸序列之序列編碼而成，CDR-L3係由一包含序列編號：15-22中任一核酸序列之序列編碼而成，CDR-H1係由一包含序列編號：23-26中任一核酸序列之序列編碼而成，CDR-H2係由一包含序列編號：27-28之序列編碼而成，而CDR-H3則係由一包含序列編號：29-106中任一核酸序列之序列編碼而成。
2.2 確認抗體庫 GH2-GH9 及 GH11-GH17
由以下試驗分析確認實施例2.1建立之抗體庫GH2-GH9及GH11-GH17：(1) 競爭型免疫分析，其係用以決定一抗原之抗原決定位置；(2) EC50 及BIAcore試驗方法，其係用以評估抗原-抗體間的結合親和性；以及(3)定位抗原決定位置，其係用以分析抗體辨識之抗原分子的抗原決定位置。
由GH2抗體庫隨機挑選90個抗-HER2/ECD scFv (標示為S90抗體)，其中三個主要抗原結合位置為：抗原結合位置M32-M62、抗原結合位置M63-M64及抗原結合位置M41-M61 (結果未顯示)。以競爭型免疫分析評估抗體S316及6種小鼠抗體(即M32、M41、M61、M62、M63及M64；該些抗體皆是直接由免疫小鼠體內取得，且具有不同的基因片段)對胜肽HER2/ECD的結合親和性；在本實驗中，四種已知對HER2具有專一性的抗體(即A21、Fab37、帕妥珠單抗(pertuzumab)及曲妥珠單抗(trastuzumab))作為對照組。在結構分析資料中，已知胜肽HER2/ECD可分為四個蛋白域(domain；即蛋白域I、II、III及IV)，其中能被A21、Fab37、帕妥珠單抗及曲妥珠單抗辨識的抗原決定位置分別位於蛋白域I、III、II及IV；而能被抗原結合位置M32-M62、M63-M64及M41-M61辨識的抗原決定位置則分別位於蛋白域I、III及IV (結果未顯示)。至於競爭型免疫分析指出，部分抗原結合位置M32-M62會與A21之抗原結合位置重疊；抗原結合位置M63-M64會與Fab37之抗原結合位置重疊；而抗原結合位置M41-M61則不會與任何已知抗體的抗原結合位置重疊(結果未顯示)。抗原決定位置定位結果指出，可為抗原結合位置M32-M62辨識之抗原決定位置E1與可為A21辨識的抗原決定位置相鄰，但二抗原決定位置並無重疊；而可為抗原結合位置M41-M61辨識的抗原決定位置E3是位於一表面塊(surface patch)上，其係位於可為曲妥珠單抗辨識之抗原決定位置的遠端。
因此，該些結果顯示GH2抗體庫包含多種可辨識一抗原(即胜肽HER2/ECD)之不同抗原決定位置的scFv；且可為GH2抗體庫辨識之抗原決定位置可能不同於該些可為已知抗體辨識之抗原決定位置。
實施例 3 由抗體庫 GH2-GH9 及 GH11-GH17 製備重組抗體
3.1 由抗體庫 GH2 製備及分析重組抗體
為製備對抗原HER2具有結合親和性之重組抗體，對抗體庫GH2進行2-3輪挑選/擴增步驟，以挑選出可結合至胜肽HER2/ECD的scFv變異型。使挑選出的scFv變異型表現為可溶形式之scFv後，以相同胜肽HER2/ECD進行篩選。為將重組抗體製備為免疫球蛋白形式，依據「材料與方法」之步驟，將與HER2/ECD結合之scFv轉換為IgG抗體。利用ELISA及BIAcore評估重組抗體，以決定重組抗體對胜肽HER2/ECD的EC50 及抗原結合親和性。
由實施例2.2之S90抗體隨機挑選29個scFv，並將該些scFv表現為IgG形式(即GH2-3、GH2-7、GH2-8、GH2-13、GH2-14、GH2-16、GH2-18、GH2-21、GH2-23、GH2-36、GH2-40、GH2-42、GH2-54、GH2-59、GH2-60、GH2-61、GH2-65、GH2-66、GH2-72、GH2-75、GH2-78、GH2-81、GH2-87、GH2-91、GH2-95、GH2-96、GH2-98、GH2-102及GH2-104)，以下標示為S29 IgG。6個抗體(即M32、M41、M61、M62、M63及M64)及一商品化抗體-曲妥珠單抗在本實驗作為對照組。如表2所示，比對S29 IgG與親和力成熟(affinity-matured)之抗體(即M32、M41、M61、M62、M63、M64及曲妥珠單抗)的EC50 下限。值得注意的是，S29 IgG中有12個IgG抗體的EC50 低於曲妥珠單抗的EC50 。至於結合親和性，BIAcore測量結果指出，S29 IgG之KD 的下限約為10-11 M，該數值與親和力成熟之抗體(即M32、M41、M61、M62、M63、M64及曲妥珠單抗)的KD 下限相似。 表2 分析S29 IgG、6小鼠之親和力成熟抗體、人源化抗體及商品化抗體
此外，亦分析S29 IgG、6小鼠之親和力成熟抗體、人源化抗體及商品化抗體的CDR序列，分別將其定為序列編號：233、235、237及241-334，其中抗體M32是由序列編號：232之核酸序列編碼而成；抗體M62是由序列編號：236之核酸序列編碼而成；而人源化抗體H32的CDR序列則是由序列編號：234之核酸序列編碼而成。
除了胜肽HER2/ECD，亦利用GH2抗體庫製備對其他抗原具有結合親和性之重組抗體。與實施例3.1第一段相似的操作步驟，利用22種不同的蛋白抗原來篩選GH2抗體庫，其中20種蛋白抗原可被GH2製備之抗體辨識(表3)。 表3 GH2抗體庫對特定蛋白抗原的結合專一性 a 比例是指在總分析單一群中，對相對應之抗原具有陽性反應的陽性株。b 比例是指在所有經定序之陽性株中，序列具有獨特性之陽性株。C ECD：受體之細胞外域。
整體來看，該結果指出GH2抗體庫可用以製備不同的重組抗體，其係對不同抗原具有高結合親和性(約10-7 至10-11 M)，且該些重組抗體具有與親和力成熟或商品化抗體相似的抗原結合親和性。
3.2 分析由抗體庫 GH3-GH9 及 GH11-GH17 製備的重組抗體
本實施例將進一步分析檢測由抗體庫GH3-GH9及GH11-GH17製備的重組抗體。
表4-17分別闡述由抗體庫GH3-GH9及GH11-GH17製備之重組抗體對特定蛋白抗原的結合專一性。 表4 GH3抗體庫對特定蛋白抗原的結合專一性 a 比例是指在總分析單一群中，對相對應之抗原具有陽性反應的陽性株。b 比例是指在所有經定序之陽性株中，序列具有獨特性之陽性株。C ECD：受體之細胞外域。 表5 GH4抗體庫對特定蛋白抗原的結合專一性 a 比例是指在總分析單一群中，對相對應之抗原具有陽性反應的陽性株。b 比例是指在所有經定序之陽性株中，序列具有獨特性之陽性株。C ECD：受體之細胞外域。 表6 GH5抗體庫對特定蛋白抗原的結合專一性 a 比例是指在總分析單一群中，對相對應之抗原具有陽性反應的陽性株。b 比例是指在所有經定序之陽性株中，序列具有獨特性之陽性株。C ECD：受體之細胞外域。 表7 GH6抗體庫對特定蛋白抗原的結合專一性 a 比例是指在總分析單一群中，對相對應之抗原具有陽性反應的陽性株。b 比例是指在所有經定序之陽性株中，序列具有獨特性之陽性株。C ECD：受體之細胞外域。 表8 GH7抗體庫對特定蛋白抗原的結合專一性 a 比例是指在總分析單一群中，對相對應之抗原具有陽性反應的陽性株。b 比例是指在所有經定序之陽性株中，序列具有獨特性之陽性株。C ECD：受體之細胞外域。 表9 GH8抗體庫對特定蛋白抗原的結合專一性 a 比例是指在總分析單一群中，對相對應之抗原具有陽性反應的陽性株。b 比例是指在所有經定序之陽性株中，序列具有獨特性之陽性株。C ECD：受體之細胞外域。 表10 GH9抗體庫對特定蛋白抗原的結合專一性 a 比例是指在總分析單一群中，對相對應之抗原具有陽性反應的陽性株。b 比例是指在所有經定序之陽性株中，序列具有獨特性之陽性株。C ECD：受體之細胞外域。 表11 GH11抗體庫對特定蛋白抗原的結合專一性 a 比例是指在總分析單一群中，對相對應之抗原具有陽性反應的陽性株。b 比例是指在所有經定序之陽性株中，序列具有獨特性之陽性株。C ECD：受體之細胞外域。 表12 GH12抗體庫對特定蛋白抗原的結合專一性 a 比例是指在總分析單一群中，對相對應之抗原具有陽性反應的陽性株。b 比例是指在所有經定序之陽性株中，序列具有獨特性之陽性株。C ECD：受體之細胞外域。 表13 GH13抗體庫對特定蛋白抗原的結合專一性 a 比例是指在總分析單一群中，對相對應之抗原具有陽性反應的陽性株。b 比例是指在所有經定序之陽性株中，序列具有獨特性之陽性株。C ECD：受體之細胞外域。 表14 GH14抗體庫對特定蛋白抗原的結合專一性 a 比例是指在總分析單一群中，對相對應之抗原具有陽性反應的陽性株。b 比例是指在所有經定序之陽性株中，序列具有獨特性之陽性株。C ECD：受體之細胞外域。 表15 GH15抗體庫對特定蛋白抗原的結合專一性 a 比例是指在總分析單一群中，對相對應之抗原具有陽性反應的陽性株。b 比例是指在所有經定序之陽性株中，序列具有獨特性之陽性株。 表16 GH16抗體庫對特定蛋白抗原的結合專一性 a 比例是指在總分析單一群中，對相對應之抗原具有陽性反應的陽性株。b 比例是指在所有經定序之陽性株中，序列具有獨特性之陽性株。C ECD：受體之細胞外域。. 表17 GH17抗體庫對特定蛋白抗原的結合專一性 a 比例是指在總分析單一群中，對相對應之抗原具有陽性反應的陽性株。b 比例是指在所有經定序之陽性株中，序列具有獨特性之陽性株。C ECD：受體之細胞外域。
該些結果指出，由GH3-GH9及GH11-GH17分別製備的重組抗體對不同的蛋白抗原(包含IL-1β、HA、NP、EGFR1、EGFR 2、EGFR3、人類DNase I、PD-L1及SIGLEC 3)皆具有結合專一性。
3.3 分析重組抗體之生物功能
利用功能性試驗來評估6種直接取自HER2/ECD免疫小鼠之抗體(即M32、M41、M61、M62、M63及M64)及由 GH2抗體庫製備之重組抗體 的生物功能。相較於曲妥珠單抗及帕妥珠單抗，抗體M32會結合至HER2/ECD之蛋白域I的新穎抗原決定位置(結果未顯示)，並造成HER2被內化，進而減少會過量表現HER2之SKBR3細胞表面的受體表現量(第1A圖及第2圖)。抗體M62與M32具有相似的抗原決定位置(結果未顯示)，且與M32具有相似之減少細胞表面HER2表現量之功效(第1A圖及第2圖)。抗體M63及M41分別會結合至HER2之蛋白域III及蛋白域IV的抗原決定位置，二者皆不會減少HER2的表現量(結果未顯示).
至於重組抗體，雖然重組抗體GH2-42及GH2-75會辨識相似的抗原決定位置且與M32 具有相似的結合親和性(約~10-10 M，表2)，然而重組抗體GH2-42及GH2-75並不像M32會造成HER2的表現量減少 (第1B圖及第2圖)。合併投予GH2-42及曲妥珠單抗或GH2-18(一個與曲妥珠單抗具有相似的抗原結合位置的重組抗體)，會造成HER2表現量下降。此外，合併投予GH2-75及GH2-18亦會造成HER2被內化(第1B圖及第2圖)。該些結果暗示若抗體同時結合至HER2/ECD的蛋白域I及IV會造成HER2表現下降，而同時結合至HER2之蛋白域II及IV則不會產生此功效。
由於HER2參與了不同的訊息傳遞路徑，接著分析本發明之不同抗體與HER2結合是否會影響下游基因的表現或活化。如第2圖之西方墨點分析結果所示，與HER2不同抗原決定位置結合之各種抗體會不同程度地抑制AKT及ERK的活化。
該些結果指出，以本發明GH2抗體庫製備的重組抗體具有多樣性，可辨識一抗原之不同抗原決定位置，因此，產生不同的生物功能。
3.4 分析由 GH2-GH9 及 GH11-GH17 抗體庫製備之重組抗體的結合及中和特性
依據ELISA試驗得到的重組HA結合結果，經源自A/ 加州/2009 H1N1之HA進行三次篩選，得到125個獨特的scFv。利用FACS及H1N1 CA/09假病毒中和試驗來分析該些scFv與天然HA蛋白的結合特性。在本實施例中，是利用F10 scFv (一個已知可強效中和H1N1流感病毒的抗體)作為正對照組；S40作為另一正對照組；而AV1則作為負對照組。
由總數為125個獨特的scFv中挑選出14個scFv，相較於F10 scFv，該些scFv具有更佳的中和能力(約為1500 RLU~3000 RLU；第3A圖)。進一步分析對天然蛋白的結合能力及中和結果發現，14個scFv中有12個scFv可具高專一性地結合至天然蛋白。推測其他二個scFv有可能是由於分泌至細胞培養液的數量較少，致使結合效果不佳。
分別利用FACS分析及ELISA試驗來評估14個scFv對天然HA及合成HA的結合親和性。如第3B圖所示，有一半於ELISA試驗中呈陽性反應的scFv無法結合至天然HA蛋白。有趣的是，14個scFv於ELISA及FACS分析結果係呈現正相關性。該結果反應出在細胞培養液中不同的scFv含量及親和性。
綜合上述，本揭示內容提供了一種由噬菌體表現之scFv抗體庫(即GH2抗體庫)其包含複數個由噬菌體表現之scFv，該些scFv具有特定的CS組合、特定分佈於CDR的芳香族殘基，以及特定的CDR序列。本揭示內容GH2抗體庫可用以有效製備複數個重組抗體，其對特定抗體具有高度結合親和性。製備出之重組抗體具有多樣性之CDR，因此可結合至特定抗原之不同的抗原決定位置，藉以產生不同的生物功效。本揭示內容據此提供一種方法，可因應不同的實驗研究及/或臨床應用即時製備不同之具有抗原專一性的抗體。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1A圖是依據本揭示內容實施例3所繪示之SKBR3細胞螢光染色照片，其中該細胞是分別以特定的抗體進行處理；比例尺代表25微米(μm)； 第1B圖是依據本揭示內容實施例3所繪示之SKBR3細胞螢光染色照片，其中該細胞是分別以特定的抗體進行處理；比例尺代表25微米； 第2圖是依據本揭示內容實施例3所繪示之西方墨點分析結果，其係關於SKBR3細胞的蛋白表現量，其中該些細胞是分別以特定抗體進行處理後，分別利用抗-磷酸化HER2 (anti-phosphorylated HER2, p-HER2)抗體、抗-HER2抗體、抗磷酸化AKT (anti-phosphorylated AKT, p-AKT)抗體、抗-AKT抗體、抗-磷酸化ERK (anti-phosphorylated ERK, p-ERK)抗體、抗-ERK抗體及抗-微管蛋白(anti-tubulin)抗體來偵測蛋白的表現； 第3A圖是依據本揭示內容實施例3所繪示之結果，其係關於由噬菌體表現之 scFv 抗體庫製備的重組抗體，其對H1N1中和能力及天然HA結合親和性的關聯性；以及 第3B圖是依據本揭示內容實施例3所繪示之結果，其係關於由噬菌體表現之 scFv 抗體庫製備的重組抗體，其對天然HA結合親和性及對重組HA結合親和性的關聯性。
根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。
＜110＞ 中央研究院 ＜120＞ 一種由噬菌體表現之單鏈變異片段抗體庫 ＜130＞ P2848-TW ＜160＞ 340 ＜170＞ BiSSAP 1.3 ＜210＞ 1 ＜211＞ 798 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 人類抗-VEGF Fab ＜400＞ 1 atggccgata ttcaaatgac ccagagcccg agcagcctga gcgcgagcgt gggagatcgc 60 gtgaccatta cctgccgtgc gagccaggat gttagcacgg cggtcgcatg gtatcagcag 120 aaaccaggca aagcgccgaa acttctgata tactctgcgt ccttcctgta tagcggcgtg 180 ccgtcgcgtt tttcgggcag tggcagcggc acggacttta ccctgacgat atcttcctta 240 caaccggagg attttgcgac ctactactgt caacagcatt ataccacacc gccgaccttc 300 ggtcaaggca ccaaagtgga aatcaaacgc ggagggggag gtagcatcga gggccgtagc 360 ggaggtggcg ggagcgaagt gcagctggtg gaatcgggag gcggtctggt gcaacctggc 420 ggcagccttc gtctgagctg tgcggcgagc gggttcacca ttagcgatta ctggattcat 480 tgggtgcgtc aagctcccgg caaggggctg gagtgggtcg cgggcattac gcccgctggc 540 ggttacacat attatgccga cagcgtgaaa ggtcgcttta cgattagtgc ggacaccagc 600 aaaaataccg cgtacctgca gatgaatagc ctgcgtgcgg aagacacagc ggtgtattat 660 tgcgcgcgtt tcgtgttttt tctgccgtat gcgatggatt attgggggca gggcaccctt 720 gttaccgtga gctcggcgtc agcggccgca ggtgcgccgg tgccgtatcc ggatccgctg 780 gaaccgcgtg ccgcatag 798 ＜210＞ 2 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-1 ＜400＞ 2 gaccattacc tgccgtgcga gccaggatgt tthythythy gtcgcatggt atcagcagaa 60 acca 64 ＜210＞ 3 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-2 ＜400＞ 3 gaccattacc tgccgtgcga gccaggatgt tthythykgg gtcgcatggt atcagcagaa 60 acca 64 ＜210＞ 4 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-3 ＜400＞ 4 gaccattacc tgccgtgcga gccaggatgt tthykggkgg gtcgcatggt atcagcagaa 60 acca 64 ＜210＞ 5 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-4 ＜400＞ 5 gaccattacc tgccgtgcga gccaggatgt tthykggthy gtcgcatggt atcagcagaa 60 acca 64 ＜210＞ 6 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-5 ＜400＞ 6 gaccattacc tgccgtgcga gccaggatgt tkggthythy gtcgcatggt atcagcagaa 60 acca 64 ＜210＞ 7 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-6 ＜400＞ 7 gaccattacc tgccgtgcga gccaggatgt tkggthykgg gtcgcatggt atcagcagaa 60 acca 64 ＜210＞ 8 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-7 ＜400＞ 8 gaccattacc tgccgtgcga gccaggatgt tkggkggkgg gtcgcatggt atcagcagaa 60 acca 64 ＜210＞ 9 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-8 ＜400＞ 9 gaccattacc tgccgtgcga gccaggatgt tkggkggthy gtcgcatggt atcagcagaa 60 acca 64 ＜210＞ 10 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-9 ＜400＞ 10 gaccattacc tgccgtgcga gccaggatgt trryrryrry gtcgcatggt atcagcagaa 60 acca 64 ＜210＞ 11 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L2-1 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,33 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 11 ggcaaagcgc cgaaacttct gatathythy ncnvsythyc tgtatagcgg cgtgccgtcg 60 cgtttttcg 69 ＜210＞ 12 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L2-2 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,33 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 12 ggcaaagcgc cgaaacttct gatathythy ncnvsykggc tgtatagcgg cgtgccgtcg 60 cgtttttcg 69 ＜210＞ 13 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L2-3 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,33 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 13 ggcaaagcgc cgaaacttct gatathykgg ncnvsykggc tgtatagcgg cgtgccgtcg 60 cgtttttcg 69 ＜210＞ 14 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L2-4 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,33 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 14 ggcaaagcgc cgaaacttct gatathykgg ncnvsythyc tgtatagcgg cgtgccgtcg 60 cgtttttcg 69 ＜210＞ 15 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L3-1 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 43,45 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 15 gattttgcga cctactactg tcaacagthy thyrrythyc cgntnacctt cggtcaaggc 60 accaaagtgg 70 ＜210＞ 16 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L3-2 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 43,45 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 16 gattttgcga cctactactg tcaacagthy thyrrykggc cgntnacctt cggtcaaggc 60 accaaagtgg 70 ＜210＞ 17 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L3-3 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 43,45 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 17 gattttgcga cctactactg tcaacagthy kggrrykggc cgntnacctt cggtcaaggc 60 accaaagtgg 70 ＜210＞ 18 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L3-4 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 43,45 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 18 gattttgcga cctactactg tcaacagthy kggrrythyc cgntnacctt cggtcaaggc 60 accaaagtgg 70 ＜210＞ 19 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L3-5 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 43,45 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 19 gattttgcga cctactactg tcaacagkgg thyrrythyc cgntnacctt cggtcaaggc 60 accaaagtgg 70 ＜210＞ 20 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L3-6 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 43,45 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 20 gattttgcga cctactactg tcaacagkgg thyrrykggc cgntnacctt cggtcaaggc 60 accaaagtgg 70 ＜210＞ 21 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L3-7 ＜220＞ ＜221＞ V_region ＜222＞ 43,45 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 21 gattttgcga cctactactg tcaacagkgg kggrrykggc cgntnacctt cggtcaaggc 60 accaaagtgg 70 ＜210＞ 22 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L3-8 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 43,45 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 22 gattttgcga cctactactg tcaacagkgg kggrrythyc cgntnacctt cggtcaaggc 60 accaaagtgg 70 ＜210＞ 23 ＜211＞ 65 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H1-1 ＜400＞ 23 gagctgtgcg gcgagcgggt tcaccattrr yrrythythy attcattggg tgcgtcaagc 60 tcccg 65 ＜210＞ 24 ＜211＞ 65 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H1-2 ＜400＞ 24 gagctgtgcg gcgagcgggt tcaccattrr yrrythykgg attcattggg tgcgtcaagc 60 tcccg 65 ＜210＞ 25 ＜211＞ 65 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H1-3 ＜400＞ 25 gagctgtgcg gcgagcgggt tcaccattrr yrrykggthy attcattggg tgcgtcaagc 60 tcccg 65 ＜210＞ 26 ＜211＞ 65 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H1-4 ＜400＞ 26 gagctgtgcg gcgagcgggt tcaccattrr yrrykggkgg attcattggg tgcgtcaagc 60 tcccg 65 ＜210＞ 27 ＜211＞ 84 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H2-1 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 33,35 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 27 gcaaggggct ggagtgggtc gcgkggattk ggncnthykg gggtthyaca thytatgccg 60 acagcgtgaa aggtcgcttt acga 84 ＜210＞ 28 ＜211＞ 84 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H2-2 ＜220＞ ＜221＞ V_region ＜222＞ 33,35 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 28 gcaaggggct ggagtgggtc gcgthyattk ggncnthykg gggtthyaca thytatgccg 60 acagcgtgaa aggtcgcttt acga 84 ＜210＞ 29 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-1 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,29,32,35,38 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 29 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwynw ynwynwynwy kggkggatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 30 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-2 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,29,32,35,41 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 30 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwynw ynwynwykgg nwykggatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 31 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-3 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,29,32,38,41 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 31 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwynw ynwykggnwy nwykggatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 32 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-4 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,29,35,38,41 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 32 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwynw ykggnwynwy nwykggatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 33 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-5 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,38,41 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 33 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwykg gnwynwynwy nwykggatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 34 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-6 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 29,32,35,38,41 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 34 agcggtgtat tattgcgcgc gtttckggnw ynwynwynwy nwykggatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 35 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-7 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,29,32,35,44 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 35 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwynw ynwynwykgg kggnwyatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 36 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-8 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,29,32,38,41,44 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 36 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwynw ynwykggnwy nwynwyatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 37 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-9 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,29,35,38,41,44 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 37 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwynw ykggnwynwy nwynwyatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 38 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-10 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,38,41,44 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 38 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwykg gnwynwynwy nwynwyatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 39 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-11 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 29,32,35,38,44 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 39 agcggtgtat tattgcgcgc gtttckggnw ynwynwynwy kggnwyatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 40 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-12 ＜220＞ ＜221＞ V_region ＜222＞ 26,29,32,41,44 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 40 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwynw ynwykggkgg nwynwyatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 41 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-13 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,29,35,41,44 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 41 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwynw ykggnwykgg nwynwyatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 42 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-14 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,41,44 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 42 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwykg gnwynwykgg nwynwyatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 43 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-15 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 29,32,35,41,44 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 43 agcggtgtat tattgcgcgc gtttckggnw ynwynwykgg nwynwyatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 44 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-16 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,29,38,41,44 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 44 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwynw ykggkggnwy nwynwyatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 45 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-17 ＜220＞ ＜221＞ V_region ＜222＞ 26,32,38,41,44 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 45 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwykg gnwykggnwy nwynwyatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 46 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-18 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 29,32,38,41,44 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 46 agcggtgtat tattgcgcgc gtttckggnw ynwykggnwy nwynwyatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 47 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-19 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,35,38,41,44 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 47 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwykg gkggnwynwy nwynwyatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 48 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-20 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 29,35,38,41,44 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 48 agcggtgtat tattgcgcgc gtttckggnw ykggnwynwy nwynwyatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 49 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-21 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 32,35,38,41,44 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 49 agcggtgtat tattgcgcgc gtttckggkg gnwynwynwy nwynwyatgg attattgggg 60 gcagggcacc cttg 74 ＜210＞ 50 ＜211＞ 71 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH3-H322 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,41 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 50 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ytmytmyrgy nwyatggatt attgggggca 60 gggcaccctt g 71 ＜210＞ 51 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH4-H323 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,47 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 51 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ytmyrgytmy tmyrgynwya tggattattg 60 ggggcagggc acccttg 77 ＜210＞ 52 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH4-H324 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,47 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 52 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ytmytmyrgy tmyrgynwya tggattattg 60 ggggcagggc acccttg 77 ＜210＞ 53 ＜211＞ 83 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH5-H325 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,47,53 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 53 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynayrgytmy tmyrgynayr gynwyatgga 60 ttattggggg cagggcaccc ttg 83 ＜210＞ 54 ＜211＞ 83 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH5-H326 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,47,53 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 54 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaytmyrgy tmytmynayr gynwyatgga 60 ttattggggg cagggcaccc ttg 83 ＜210＞ 55 ＜211＞ 83 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH5-H327 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,47,53 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 55 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaytmytmy rgytmynayr gynwyatgga 60 ttattggggg cagggcaccc ttg 83 ＜210＞ 56 ＜211＞ 89 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH6-H328 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,53,59 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 56 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynayrgytmy tmytmytmyr gynayrgynw 60 yatggattat tgggggcagg gcacccttg 89 ＜210＞ 57 ＜211＞ 89 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH6-H329 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,50,53,59 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 57 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynayrgy tmytmyrgyn aynayrgynw 60 yatggattat tgggggcagg gcacccttg 89 ＜210＞ 58 ＜211＞ 89 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH6-H330 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,50,53,59 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 58 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynaytmy rgytmytmyn aynayrgynw 60 yatggattat tgggggcagg gcacccttg 89 ＜210＞ 59 ＜211＞ 89 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH6-H331 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,50,53,59 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 59 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynaytmy tmyrgytmyn aynayrgynw 60 yatggattat tgggggcagg gcacccttg 89 ＜210＞ 60 ＜211＞ 95 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH7-H332 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,38,53,59,65 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 60 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynayrgynay tmytmytmyt mynayrgyna 60 yrgynwyatg gattattggg ggcagggcac ccttg 95 ＜210＞ 61 ＜211＞ 95 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH7-H333 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,56,59,65 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 61 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynayrgy tmytmytmyt myrgynayna 60 yrgynwyatg gattattggg ggcagggcac ccttg 95 ＜210＞ 62 ＜211＞ 95 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH7-H334 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,38,53,56,59,65 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 62 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynaynay rgytmytmyr gynaynayna 60 yrgynwyatg gattattggg ggcagggcac ccttg 95 ＜210＞ 63 ＜211＞ 95 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH7-H335 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,38,53,56,59,65 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 63 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynaynay tmyrgytmyt mynaynayna 60 yrgynwyatg gattattggg ggcagggcac ccttg 95 ＜210＞ 64 ＜211＞ 95 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH7-H336 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,38,53,56,59,65 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 64 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynaynay tmytmyrgyt mynaynayna 60 yrgynwyatg gattattggg ggcagggcac ccttg 95 ＜210＞ 65 ＜211＞ 101 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH8-H337 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,38,41,56,59,65,71 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 65 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynayrgynay naytmytmyt mytmynayna 60 yrgynayrgy nwyatggatt attgggggca gggcaccctt g 101 ＜210＞ 66 ＜211＞ 101 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH8-H338 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,41,56,62,65,71 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 66 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynayrgy naytmytmyt mytmynayrg 60 ynaynayrgy nwyatggatt attgggggca gggcaccctt g 101 ＜210＞ 67 ＜211＞ 101 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH8-H339 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,38,59,62,65,71 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 67 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynaynay rgytmytmyt mytmyrgyna 60 ynaynayrgy nwyatggatt attgggggca gggcaccctt g 101 ＜210＞ 68 ＜211＞ 101 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH8-H340 ＜220＞ ＜221＞ V_region ＜222＞ 26,32,35,38,41,56,59,62,65,71 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 68 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynaynay nayrgytmyt myrgynayna 60 ynaynayrgy nwyatggatt attgggggca gggcaccctt g 101 ＜210＞ 69 ＜211＞ 101 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH8-H341 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,38,41,56,59,62,65,71 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 69 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynaynay naytmyrgyt mytmynayna 60 ynaynayrgy nwyatggatt attgggggca gggcaccctt g 101 ＜210＞ 70 ＜211＞ 101 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH8-H342 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,38,41,56,59,62,65,71 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 70 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynaynay naytmytmyr gytmynayna 60 ynaynayrgy nwyatggatt attgggggca gggcaccctt g 101 ＜210＞ 71 ＜211＞ 107 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH9-H343 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,38,41,44,59,62,65,71,77 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 71 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynayrgynay naynaytmyt mytmytmyna 60 ynaynayrgy nayrgynwya tggattattg ggggcagggc acccttg 107 ＜210＞ 72 ＜211＞ 107 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH9-H344 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,41,44,59,62,68,71,77 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 72 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynayrgy naynaytmyt mytmytmyna 60 ynayrgynay nayrgynwya tggattattg ggggcagggc acccttg 107 ＜210＞ 73 ＜211＞ 107 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH9-H345 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,38,44,59,65,68,71,77 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 73 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynaynay rgynaytmyt mytmytmyna 60 yrgynaynay nayrgynwya tggattattg ggggcagggc acccttg 107 ＜210＞ 74 ＜211＞ 107 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH9-H346 ＜220＞ ＜221＞ V_region ＜222＞ 26,32,35,38,41,62,65,68,71,77 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 74 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynaynay nayrgytmyt mytmytmyrg 60 ynaynaynay nayrgynwya tggattattg ggggcagggc acccttg 107 ＜210＞ 75 ＜211＞ 107 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH9-H347 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,38,41,44,59,62,65,68,71,77 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 75 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynaynay naynayrgyt mytmyrgyna 60 ynaynaynay nayrgynwya tggattattg ggggcagggc acccttg 107 ＜210＞ 76 ＜211＞ 107 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH9-H348 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,38,41,44,59,62,65,68,71,77 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 76 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynaynay naynaytmyr gytmytmyna 60 ynaynaynay nayrgynwya tggattattg ggggcagggc acccttg 107 ＜210＞ 77 ＜211＞ 107 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH9-H349 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,32,35,38,41,44,59,62,65,68,71,77 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 77 agcggtgtat tattgcgcgc gtttcnwyrg ynaynaynay naynaytmyt myrgytmyna 60 ynaynaynay nayrgynwya tggattattg ggggcagggc acccttg 107 ＜210＞ 78 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H350 ＜400＞ 78 cacagcggtg tattattgcg cgcgtkggth ythykggthy thythygatt attgggggca 60 gggcaccctt gttac 75 ＜210＞ 79 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H351 ＜400＞ 79 cacagcggtg tattattgcg cgcgtkggth ythythykgg thythygatt attgggggca 60 gggcaccctt gttac 75 ＜210＞ 80 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H352 ＜400＞ 80 cacagcggtg tattattgcg cgcgtkggth ythythythy kggthygatt attgggggca 60 gggcaccctt gttac 75 ＜210＞ 81 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H353 ＜400＞ 81 cacagcggtg tattattgcg cgcgtkggth ythythythy thykgggatt attgggggca 60 gggcaccctt gttac 75 ＜210＞ 82 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H354 ＜400＞ 82 cacagcggtg tattattgcg cgcgtthykg gthythykgg thythygatt attgggggca 60 gggcaccctt gttac 75 ＜210＞ 83 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H355 ＜400＞ 83 cacagcggtg tattattgcg cgcgtthykg gthythythy kggthygatt attgggggca 60 gggcaccctt gttac 75 ＜210＞ 84 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H356 ＜400＞ 84 cacagcggtg tattattgcg cgcgtthykg gthythythy thykgggatt attgggggca 60 gggcaccctt gttac 75 ＜210＞ 85 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H357 ＜400＞ 85 cacagcggtg tattattgcg cgcgtthyth ykggthythy kggthygatt attgggggca 60 gggcaccctt gttac 75 ＜210＞ 86 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H358 ＜400＞ 86 cacagcggtg tattattgcg cgcgtthyth ykggthythy thykgggatt attgggggca 60 gggcaccctt gttac 75 ＜210＞ 87 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H359 ＜400＞ 87 cacagcggtg tattattgcg cgcgtthyth ythykggthy thykgggatt attgggggca 60 gggcaccctt gttac 75 ＜210＞ 88 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH12-H360 ＜400＞ 88 cacagcggtg tattattgcg cgcgtkggth ythykggthy thygattatt gggggcaggg 60 cacccttgtt ac 72 ＜210＞ 89 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH12-H361 ＜400＞ 89 cacagcggtg tattattgcg cgcgtkggth ythythykgg thygattatt gggggcaggg 60 cacccttgtt ac 72 ＜210＞ 90 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH12-H362 ＜400＞ 90 cacagcggtg tattattgcg cgcgtkggth ythythythy kgggattatt gggggcaggg 60 cacccttgtt ac 72 ＜210＞ 91 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH12-H363 ＜400＞ 91 cacagcggtg tattattgcg cgcgtthykg gthythykgg thygattatt gggggcaggg 60 cacccttgtt ac 72 ＜210＞ 92 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH12-H364 ＜400＞ 92 cacagcggtg tattattgcg cgcgtthykg gthythythy kgggattatt gggggcaggg 60 cacccttgtt ac 72 ＜210＞ 93 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH12-H365 ＜400＞ 93 cacagcggtg tattattgcg cgcgtthyth ykggthythy kgggattatt gggggcaggg 60 cacccttgtt ac 72 ＜210＞ 94 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH13-H366 ＜400＞ 94 cacagcggtg tattattgcg cgcgtkggth ythykggthy gattattggg ggcagggcac 60 ccttgttac 69 ＜210＞ 95 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH13-H367 ＜400＞ 95 cacagcggtg tattattgcg cgcgtkggth ythythykgg gattattggg ggcagggcac 60 ccttgttac 69 ＜210＞ 96 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH13-H368 ＜400＞ 96 cacagcggtg tattattgcg cgcgtthykg gthythykgg gattattggg ggcagggcac 60 ccttgttac 69 ＜210＞ 97 ＜211＞ 78 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH14-H369 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,46 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 97 gcggaagaca cagcggtgta ttattgcgcg nggkggthyk ggthynayta ttgggggcag 60 ggcacccttg ttaccgtg 78 ＜210＞ 98 ＜211＞ 78 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH14-H370 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,46 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 98 gcggaagaca cagcggtgta ttattgcgcg nggkggthyt hykggnayta ttgggggcag 60 ggcacccttg ttaccgtg 78 ＜210＞ 99 ＜211＞ 78 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH14-H371 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,46 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 99 gcggaagaca cagcggtgta ttattgcgcg nggthykggt hykggnayta ttgggggcag 60 ggcacccttg ttaccgtg 78 ＜210＞ 100 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH15-H372 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,43 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 100 gcggaagaca cagcggtgta ttattgcgcg nggkggthyt hynaytattg ggggcagggc 60 acccttgtta ccgtg 75 ＜210＞ 101 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH15-H373 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,43 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 101 gcggaagaca cagcggtgta ttattgcgcg nggthykggt hynaytattg ggggcagggc 60 acccttgtta ccgtg 75 ＜210＞ 102 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH15-H374 ＜220＞ ＜221＞ V_region ＜222＞ 31,43 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 102 gcggaagaca cagcggtgta ttattgcgcg nggthythyk ggnaytattg ggggcagggc 60 acccttgtta ccgtg 75 ＜210＞ 103 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH16-H375 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,40 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 103 gcggaagaca cagcggtgta ttattgcgcg nggkggthyn aytattgggg gcagggcacc 60 cttgttaccg tg 72 ＜210＞ 104 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH16-H376 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,40 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 104 gcggaagaca cagcggtgta ttattgcgcg nggthykggn aytattgggg gcagggcacc 60 cttgttaccg tg 72 ＜210＞ 105 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH17-H377 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 105 gcggaagaca cagcggtgta ttattgcgcg nggkggnayt attgggggca gggcaccctt 60 gttaccgtg 69 ＜210＞ 106 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH17-H378 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 106 gcggaagaca cagcggtgta ttattgcgcg nggthynayt attgggggca gggcaccctt 60 gttaccgtg 69 ＜210＞ 107 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-1之引子 ＜400＞ 107 tggtttctgc tgataccatg cgacrdarda rdaaacatcc tggctcgcac ggcaggtaat 60 ggtc 64 ＜210＞ 108 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-2之引子 ＜400＞ 108 tggtttctgc tgataccatg cgacccmrda rdaaacatcc tggctcgcac ggcaggtaat 60 ggtc 64 ＜210＞ 109 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-3之引子 ＜400＞ 109 tggtttctgc tgataccatg cgacccmccm rdaaacatcc tggctcgcac ggcaggtaat 60 ggtc 64 ＜210＞ 110 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-4之引子 ＜400＞ 110 tggtttctgc tgataccatg cgacrdaccm rdaaacatcc tggctcgcac ggcaggtaat 60 ggtc 64 ＜210＞ 111 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-5之引子 ＜400＞ 111 tggtttctgc tgataccatg cgacrdarda ccmaacatcc tggctcgcac ggcaggtaat 60 ggtc 64 ＜210＞ 112 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-6之引子 ＜400＞ 112 tggtttctgc tgataccatg cgacccmrda ccmaacatcc tggctcgcac ggcaggtaat 60 ggtc 64 ＜210＞ 113 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-7之引子 ＜400＞ 113 tggtttctgc tgataccatg cgacccmccm ccmaacatcc tggctcgcac ggcaggtaat 60 ggtc 64 ＜210＞ 114 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-8之引子 ＜400＞ 114 tggtttctgc tgataccatg cgacrdaccm ccmaacatcc tggctcgcac ggcaggtaat 60 ggtc 64 ＜210＞ 115 ＜211＞ 64 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L1-9之引子 ＜400＞ 115 tggtttctgc tgataccatg cgacryyryy ryyaacatcc tggctcgcac ggcaggtaat 60 ggtc 64 ＜210＞ 116 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L2-1之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 37,39 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 116 cgaaaaacgc gacggcacgc cgctatacag rdarsbngnr dardatatca gaagtttcgg 60 cgctttgcc 69 ＜210＞ 117 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L2-2之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 37,39 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 117 cgaaaaacgc gacggcacgc cgctatacag ccmrsbngnr dardatatca gaagtttcgg 60 cgctttgcc 69 ＜210＞ 118 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L2-3之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 37,39 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 118 cgaaaaacgc gacggcacgc cgctatacag ccmrsbngnc cmrdatatca gaagtttcgg 60 cgctttgcc 69 ＜210＞ 119 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L2-4之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 37,39 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 119 cgaaaaacgc gacggcacgc cgctatacag rdarsbngnc cmrdatatca gaagtttcgg 60 cgctttgcc 69 ＜210＞ 120 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L3-1之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,28 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 120 ccactttggt gccttgaccg aaggtnancg grdaryyrda rdactgttga cagtagtagg 60 tcgcaaaatc 70 ＜210＞ 121 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L3-2之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,28 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 121 ccactttggt gccttgaccg aaggtnancg gccmryyrda rdactgttga cagtagtagg 60 tcgcaaaatc 70 ＜210＞ 122 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L3-3之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,28 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 122 ccactttggt gccttgaccg aaggtnancg gccmryyccm rdactgttga cagtagtagg 60 tcgcaaaatc 70 ＜210＞ 123 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L3-4之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,28 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 123 ccactttggt gccttgaccg aaggtnancg grdaryyccm rdactgttga cagtagtagg 60 tcgcaaaatc 70 ＜210＞ 124 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L3-5之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,28 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 124 ccactttggt gccttgaccg aaggtnancg grdaryyrda ccmctgttga cagtagtagg 60 tcgcaaaatc 70 ＜210＞ 125 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L3-6之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,28 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 125 ccactttggt gccttgaccg aaggtnancg gccmryyrda ccmctgttga cagtagtagg 60 tcgcaaaatc 70 ＜210＞ 126 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L3-7之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,28 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 126 ccactttggt gccttgaccg aaggtnancg gccmryyccm ccmctgttga cagtagtagg 60 tcgcaaaatc 70 ＜210＞ 127 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-L3-8之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 26,28 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 127 ccactttggt gccttgaccg aaggtnancg grdaryyccm ccmctgttga cagtagtagg 60 tcgcaaaatc 70 ＜210＞ 128 ＜211＞ 65 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H1-1之引子 ＜400＞ 128 cgggagcttg acgcacccaa tgaatrdard aryyryyaat ggtgaacccg ctcgccgcac 60 agctc 65 ＜210＞ 129 ＜211＞ 65 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H1-2之引子 ＜400＞ 129 cgggagcttg acgcacccaa tgaatccmrd aryyryyaat ggtgaacccg ctcgccgcac 60 agctc 65 ＜210＞ 130 ＜211＞ 65 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H1-3之引子 ＜400＞ 130 cgggagcttg acgcacccaa tgaatrdacc mryyryyaat ggtgaacccg ctcgccgcac 60 agctc 65 ＜210＞ 131 ＜211＞ 65 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H1-4之引子 ＜400＞ 131 cgggagcttg acgcacccaa tgaatccmcc mryyryyaat ggtgaacccg ctcgccgcac 60 agctc 65 ＜210＞ 132 ＜211＞ 84 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H2-1之引子 ＜400＞ 132 tcgtaaagcg acctttcacg ctgtcggcat ardatgtrda accccmrdag ggccmaatcc 60 mcgcgaccca ctccagcccc ttgc 84 ＜210＞ 133 ＜211＞ 84 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H2-2之引子 ＜400＞ 133 tcgtaaagcg acctttcacg ctgtcggcat ardatgtrda accccmrdag ggccmaatrd 60 acgcgaccca ctccagcccc ttgc 84 ＜210＞ 134 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-1之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 37,40,43,46,49 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 134 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatcc mccmrwnrwn rwnrwnrwng aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 135 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-2之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 34,40,43,46,49 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 135 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatcc mrwnccmrwn rwnrwnrwng aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 136 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-3之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 34,37,43,46,49 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 136 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatcc mrwnrwnccm rwnrwnrwng aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 137 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-4之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 34,37,40,46,49 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 137 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatcc mrwnrwnrwn ccmrwnrwng aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 138 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-5之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 34,37,40,43,49 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 138 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatcc mrwnrwnrwn rwnccmrwng aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 139 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-6之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 34,37,40,43,46 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 139 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatcc mrwnrwnrwn rwnrwnccmg aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 140 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-7之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,40,43,46,49 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 140 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nccmccmrwn rwnrwnrwng aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 141 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-8之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,43,46,49 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 141 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nccmrwnccm rwnrwnrwng aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 142 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-9之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,46,49 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 142 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nccmrwnrwn ccmrwnrwng aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 143 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-10之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,43,49 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 143 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nccmrwnrwn rwnccmrwng aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 144 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-11之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,43,46 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 144 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nccmrwnrwn rwnrwnccmg aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 145 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-12之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,34,43,46,49 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 145 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrwnccmccm rwnrwnrwng aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 146 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-13之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,34,40,46,49 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 146 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrwnccmrwn ccmrwnrwng aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 147 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-14之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,34,40,43,49 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 147 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrwnccmrwn rwnccmrwng aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 148 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-15之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,34,40,43,46 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 148 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrwnccmrwn rwnrwnccmg aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 149 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-16之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,34,37,46,49 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 149 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrwnrwnccm ccmrwnrwng aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 150 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-17之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,34,37,43,49 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 150 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrwnrwnccm rwnccmrwng aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 151 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-18之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,34,37,43,46 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 151 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrwnrwnccm rwnrwnccmg aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 152 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-19之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,34,37,40,49 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 152 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrwnrwnrwn ccmccmrwng aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 153 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-20之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,34,37,40,46 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 153 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrwnrwnrwn ccmrwnccmg aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 154 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CDR-H3-21之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,34,37,40,43 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 154 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrwnrwnrwn rwnccmccmg aaacgcgcgc 60 aataatacac cgct 74 ＜210＞ 155 ＜211＞ 71 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH3-H322之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,46 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 155 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrkarka rcyrwngaaa cgcgcgcaat 60 aatacaccgc t 71 ＜210＞ 156 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH4-H323之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,52 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 156 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrkarka rcyrkarcyr wngaaacgcg 60 cgcaataata caccgct 77 ＜210＞ 157 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH4-H324之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,52 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 157 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrkarcy rkarkarcyr wngaaacgcg 60 cgcaataata caccgct 77 ＜210＞ 158 ＜211＞ 83 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH5-H325之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,52,58 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 158 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrcy rkarkarcyr tnrcyrwnga 60 aacgcgcgca ataatacacc gct 83 ＜210＞ 159 ＜211＞ 83 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH5-H326之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,52,58 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 159 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrka rkarcyrkar tnrcyrwnga 60 aacgcgcgca ataatacacc gct 83 ＜210＞ 160 ＜211＞ 83 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH5-H327之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,52,58 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 160 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrka rcyrkarkar tnrcyrwnga 60 aacgcgcgca ataatacacc gct 83 ＜210＞ 161 ＜211＞ 89 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH6-H328之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,58,64 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 161 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrcy rkarkarkar karcyrtnrc 60 yrwngaaacg cgcgcaataa tacaccgct 89 ＜210＞ 162 ＜211＞ 89 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH6-H329之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,55,58,64 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 162 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rcyrkarkar cyrtnrtnrc 60 yrwngaaacg cgcgcaataa tacaccgct 89 ＜210＞ 163 ＜211＞ 89 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH6-H330之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,55,58,64 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 163 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rkarkarcyr kartnrtnrc 60 yrwngaaacg cgcgcaataa tacaccgct 89 ＜210＞ 164 ＜211＞ 89 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH6-H331之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,55,58,64 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 164 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rkarcyrkar kartnrtnrc 60 yrwngaaacg cgcgcaataa tacaccgct 89 ＜210＞ 165 ＜211＞ 95 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH7-H332之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,43,58,64,70 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 165 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrcy rtnrkarkar karkartnrc 60 yrtnrcyrwn gaaacgcgcg caataataca ccgct 95 ＜210＞ 166 ＜211＞ 95 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH7-H333之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,61,64,70 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 166 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rcyrkarkar karkarcyrt 60 nrtnrcyrwn gaaacgcgcg caataataca ccgct 95 ＜210＞ 167 ＜211＞ 95 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH7-H334之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,43,58,61,64,70 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 167 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rtnrcyrkar karcyrtnrt 60 nrtnrcyrwn gaaacgcgcg caataataca ccgct 95 ＜210＞ 168 ＜211＞ 95 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH7-H335之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,43,58,61,64,70 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 168 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rtnrkarkar cyrkartnrt 60 nrtnrcyrwn gaaacgcgcg caataataca ccgct 95 ＜210＞ 169 ＜211＞ 95 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH7-H336之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,43,58,61,64,70 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 169 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rtnrkarcyr karkartnrt 60 nrtnrcyrwn gaaacgcgcg caataataca ccgct 95 ＜210＞ 170 ＜211＞ 101 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH8-H337之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,43,46,61,64,70,76 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 170 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrcy rtnrtnrkar karkarkart 60 nrtnrcyrtn rcyrwngaaa cgcgcgcaat aatacaccgc t 101 ＜210＞ 171 ＜211＞ 101 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH8-H338之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,46,61,67,70,76 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 171 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rcyrtnrkar karkarkart 60 nrcyrtnrtn rcyrwngaaa cgcgcgcaat aatacaccgc t 101 ＜210＞ 172 ＜211＞ 101 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH8-H339之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,43,64,67,70,76 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 172 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rtnrcyrkar karkarkarc 60 yrtnrtnrtn rcyrwngaaa cgcgcgcaat aatacaccgc t 101 ＜210＞ 173 ＜211＞ 101 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH8-H340之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,43,46,61,64,67,70,76 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 173 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rtnrtnrcyr karkarcyrt 60 nrtnrtnrtn rcyrwngaaa cgcgcgcaat aatacaccgc t 101 ＜210＞ 174 ＜211＞ 101 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH8-H341之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,43,46,61,64,67,70,76 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 174 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rtnrtnrkar karcyrkart 60 nrtnrtnrtn rcyrwngaaa cgcgcgcaat aatacaccgc t 101 ＜210＞ 175 ＜211＞ 101 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH8-H342之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,43,46,61,64,67,70,76 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 175 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rtnrtnrkar cyrkarkart 60 nrtnrtnrtn rcyrwngaaa cgcgcgcaat aatacaccgc t 101 ＜210＞ 176 ＜211＞ 107 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH9-H343之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,43,46,49,64,67,70,76,82 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 176 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrcy rtnrtnrtnr karkarkark 60 artnrtnrtn rcyrtnrcyr wngaaacgcg cgcaataata caccgct 107 ＜210＞ 177 ＜211＞ 107 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH9-H344之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,46,49,64,67,73,76,82 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 177 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rcyrtnrtnr karkarkark 60 artnrtnrcy rtnrtnrcyr wngaaacgcg cgcaataata caccgct 107 ＜210＞ 178 ＜211＞ 107 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH9-H345之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,43,49,64,70,73,76,82 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 178 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rtnrcyrtnr karkarkark 60 artnrcyrtn rtnrtnrcyr wngaaacgcg cgcaataata caccgct 107 ＜210＞ 179 ＜211＞ 107 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH9-H346之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,43,46,67,70,73,76,82 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 179 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rtnrtnrcyr karkarkark 60 arcyrtnrtn rtnrtnrcyr wngaaacgcg cgcaataata caccgct 107 ＜210＞ 180 ＜211＞ 107 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH9-H347之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,43,46,49,64,67,70,73,76,82 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 180 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rtnrtnrtnr cyrkarkarc 60 yrtnrtnrtn rtnrtnrcyr wngaaacgcg cgcaataata caccgct 107 ＜210＞ 181 ＜211＞ 107 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH9-H348之引子 ＜220＞ ＜221＞ V_region ＜222＞ 31,37,40,43,46,49,64,67,70,73,76,82 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 181 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rtnrtnrtnr karkarcyrk 60 artnrtnrtn rtnrtnrcyr wngaaacgcg cgcaataata caccgct 107 ＜210＞ 182 ＜211＞ 107 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH9-H349之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 31,37,40,43,46,49,64,67,70,73,76,82 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 182 caagggtgcc ctgcccccaa taatccatrw nrcyrtnrtn rtnrtnrtnr karcyrkark 60 artnrtnrtn rtnrtnrcyr wngaaacgcg cgcaataata caccgct 107 ＜210＞ 183 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H350之引子 ＜400＞ 183 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcr dardardacc mrdardaccm acgcgcgcaa 60 taatacaccg ctgtg 75 ＜210＞ 184 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H351之引子 ＜400＞ 184 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcr dardaccmrd ardardaccm acgcgcgcaa 60 taatacaccg ctgtg 75 ＜210＞ 185 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H352之引子 ＜400＞ 185 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcr daccmrdard ardardaccm acgcgcgcaa 60 taatacaccg ctgtg 75 ＜210＞ 186 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H353之引子 ＜400＞ 186 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcc cmrdardard ardardaccm acgcgcgcaa 60 taatacaccg ctgtg 75 ＜210＞ 187 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H354之引子 ＜400＞ 187 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcr dardaccmrd ardaccmrda acgcgcgcaa 60 taatacaccg ctgtg 75 ＜210＞ 188 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H355之引子 ＜400＞ 188 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcr daccmrdard ardaccmrda acgcgcgcaa 60 taatacaccg ctgtg 75 ＜210＞ 189 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H356之引子 ＜400＞ 189 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcc cmrdardard ardaccmrda acgcgcgcaa 60 taatacaccg ctgtg 75 ＜210＞ 190 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H357之引子 ＜400＞ 190 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcr daccmrdard accmrdarda acgcgcgcaa 60 taatacaccg ctgtg 75 ＜210＞ 191 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H358之引子 ＜400＞ 191 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcc cmrdardard accmrdarda acgcgcgcaa 60 taatacaccg ctgtg 75 ＜210＞ 192 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH11-H359之引子 ＜400＞ 192 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcc cmrdardacc mrdardarda acgcgcgcaa 60 taatacaccg ctgtg 75 ＜210＞ 193 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH12-H360之引子 ＜400＞ 193 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcr dardaccmrd ardaccmacg cgcgcaataa 60 tacaccgctg tg 72 ＜210＞ 194 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH12-H361之引子 ＜400＞ 194 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcr daccmrdard ardaccmacg cgcgcaataa 60 tacaccgctg tg 72 ＜210＞ 195 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH12-H362之引子 ＜400＞ 195 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcc cmrdardard ardaccmacg cgcgcaataa 60 tacaccgctg tg 72 ＜210＞ 196 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH12-H363之引子 ＜400＞ 196 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcr daccmrdard accmrdaacg cgcgcaataa 60 tacaccgctg tg 72 ＜210＞ 197 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH12-H364之引子 ＜400＞ 197 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcc cmrdardard accmrdaacg cgcgcaataa 60 tacaccgctg tg 72 ＜210＞ 198 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH12-H365之引子 ＜400＞ 198 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcc cmrdardacc mrdardaacg cgcgcaataa 60 tacaccgctg tg 72 ＜210＞ 199 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH13-H366之引子 ＜400＞ 199 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcr daccmrdard accmacgcgc gcaataatac 60 accgctgtg 69 ＜210＞ 200 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH13-H367之引子 ＜400＞ 200 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcc cmrdardard accmacgcgc gcaataatac 60 accgctgtg 69 ＜210＞ 201 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH13-H368之引子 ＜400＞ 201 gtaacaaggg tgccctgccc ccaataatcc cmrdardacc mrdaacgcgc gcaataatac 60 accgctgtg 69 ＜210＞ 202 ＜211＞ 78 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH14-H369之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 33,48 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 202 cacggtaaca agggtgccct gcccccaata rtnrdaccmr daccmccncg cgcaataata 60 caccgctgtg tcttccgc 78 ＜210＞ 203 ＜211＞ 78 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH14-H370之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 33,48 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 203 cacggtaaca agggtgccct gcccccaata rtnccmrdar daccmccncg cgcaataata 60 caccgctgtg tcttccgc 78 ＜210＞ 204 ＜211＞ 78 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH14-H371之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 33,48 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 204 cacggtaaca agggtgccct gcccccaata rtnccmrdac cmrdaccncg cgcaataata 60 caccgctgtg tcttccgc 78 ＜210＞ 205 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH15-H372之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 33,45 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 205 cacggtaaca agggtgccct gcccccaata rtnrdardac cmccncgcgc aataatacac 60 cgctgtgtct tccgc 75 ＜210＞ 206 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH15-H373之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 33,45 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 206 cacggtaaca agggtgccct gcccccaata rtnrdaccmr daccncgcgc aataatacac 60 cgctgtgtct tccgc 75 ＜210＞ 207 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH15-H374之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 33,45 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 207 cacggtaaca agggtgccct gcccccaata rtnccmrdar daccncgcgc aataatacac 60 cgctgtgtct tccgc 75 ＜210＞ 208 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH16-H375之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 33,42 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 208 cacggtaaca agggtgccct gcccccaata rtnrdaccmc cncgcgcaat aatacaccgc 60 tgtgtcttcc gc 72 ＜210＞ 209 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH16-H376之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 33,42 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 209 cacggtaaca agggtgccct gcccccaata rtnccmrdac cncgcgcaat aatacaccgc 60 tgtgtcttcc gc 72 ＜210＞ 210 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH17-H377之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 33,39 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 210 cacggtaaca agggtgccct gcccccaata rtnccmccnc gcgcaataat acaccgctgt 60 gtcttccgc 69 ＜210＞ 211 ＜211＞ 69 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ GH17-H378之引子 ＜220＞ ＜221＞ variation ＜222＞ 33,39 ＜223＞ /note="n is A, T, C, or G" ＜400＞ 211 cacggtaaca agggtgccct gcccccaata rtnrdaccnc gcgcaataat acaccgctgt 60 gtcttccgc 69 ＜210＞ 212 ＜211＞ 47 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 第三NC放大-F ＜400＞ 212 gggcccagcc ggccatggcc gatattcaaa tgacccagag cccgagc 47 ＜210＞ 213 ＜211＞ 51 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 第三NC放大-R ＜400＞ 213 ggaagatcta gaggaaccac cgcgtttgat ttccactttg gtgccttgac c 51 ＜210＞ 214 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 第四NC放大-F ＜400＞ 214 ggtggttcct ctagatcttc ctcctctggt ggcggtggct cgggcggtgg tggggaagtg 60 cagctggtgg aatcggg 77 ＜210＞ 215 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 第四NC放大-R ＜400＞ 215 cctgcctgcg gccgctgacg ccgagc 26 ＜210＞ 216 ＜211＞ 48 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 交疊引子-F ＜400＞ 216 gaggaggagg aggaggaggc ggggcccagc cggccatggc cgatattc 48 ＜210＞ 217 ＜211＞ 40 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 交疊引子-R ＜400＞ 217 gaggaggagg aggaggagcc tgcctgcggc cgctgacgcc 40 ＜210＞ 218 ＜211＞ 59 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 重組抗體-VL引子-F ＜400＞ 218 caggtgcacg atgtgatggt accgatattc aaatgaccca gagcccgagc agcctgagc 59 ＜210＞ 219 ＜211＞ 36 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 重組抗體-VL引子-R ＜400＞ 219 tgcagccacc gtacgtttga tttccacctt ggtgcc 36 ＜210＞ 220 ＜211＞ 36 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 重組抗體-VH引子-F ＜400＞ 220 cgtgtcgcat ctgaagtgca gctggtggaa tcggga 36 ＜210＞ 221 ＜211＞ 48 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 重組抗體-VH引子-R ＜400＞ 221 gaccgatggg cccttggtgc tagccgagct cacggtaaca agggtgcc 48 ＜210＞ 222 ＜211＞ 39 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 重組抗體-連接子-F ＜400＞ 222 aaggtggaaa tcaaacgtac ggtggctgca ccatctgtc 39 ＜210＞ 223 ＜211＞ 33 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 重組抗體-引子-R ＜400＞ 223 ctgcacttca gatgcgacac gcgtagcaac agc 33 ＜210＞ 224 ＜211＞ 475 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 免疫化MBP-3 ＜400＞ 224 Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala 50 55 60 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile 65 70 75 80 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu 100 105 110 Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 Ser Ser Leu His His His His His His Ser Leu His His His His His 370 375 380 His Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile 385 390 395 400 Glu Gly Arg Ile Ser Glu Phe Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp 405 410 415 Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys 420 425 430 Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly 435 440 445 Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn 450 455 460 His Ser Gly Leu Glu His His His His His His 465 470 475 ＜210＞ 225 ＜211＞ 670 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 免疫化HER2/ECD ＜400＞ 225 Asp Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys 1 5 10 15 Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His 20 25 30 Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr 35 40 45 Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val 50 55 60 Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu 65 70 75 80 Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr 85 90 95 Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro 100 105 110 Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser 115 120 125 Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln 130 135 140 Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn 145 150 155 160 Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys 165 170 175 His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser 180 185 190 Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys 195 200 205 Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys 210 215 220 Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu 225 230 235 240 His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val 245 250 255 Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg 260 265 270 Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu 275 280 285 Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln 290 295 300 Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys 305 310 315 320 Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu 325 330 335 Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys 340 345 350 Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp 355 360 365 Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe 370 375 380 Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro 385 390 395 400 Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg 405 410 415 Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu 420 425 430 Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly 435 440 445 Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val 450 455 460 Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr 465 470 475 480 Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His 485 490 495 Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys 500 505 510 Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys 515 520 525 Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys 530 535 540 Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys 545 550 555 560 Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp 565 570 575 Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu 580 585 590 Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln 595 600 605 Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys 610 615 620 Gly Cys Pro Ala Glu Gln Asp Ile Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala 625 630 635 640 Met Ala Ala Ala Ala Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 645 650 655 Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His 660 665 670 ＜210＞ 226 ＜211＞ 47 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 延長引子-F ＜400＞ 226 gaggaggagg aggaggaggc ggggcccagc cggccatggc cgagctc 47 ＜210＞ 227 ＜211＞ 40 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 延長引子-R ＜400＞ 227 gaggaggagg aggaggagcc tgcctgcggc cgcactagtg 40 ＜210＞ 228 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 小鼠VL定序引子-F ＜400＞ 228 gcccagccgg ccatggc 17 ＜210＞ 229 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 小鼠VL定序引子-R ＜400＞ 229 gccaccgcca ccagagga 18 ＜210＞ 230 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 小鼠 VH 定序 引子-F ＜400＞ 230 gggtggttcc tctagatctt cc 22 ＜210＞ 231 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 小鼠VH定序引子-R ＜400＞ 231 cacctgcggc cgcactagt 19 ＜210＞ 232 ＜211＞ 792 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 抗體M32-核?酸序列 ＜400＞ 232 atggccgagc tcggcattga gctgacccaa tctcaaaaat tcatgtccac atcagtagga 60 gacagggtca gcatcacctg caaggccagt cagaatgtgg gtactgctgt agcctggtat 120 caacagaaac caggacaatc tcctaaacta ctgatttact cggcatccaa tcggtacact 180 ggagtccctg atcgcttcac aggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcagc 240 aatatgcagt ctgaagacct ggcagattat ttctgccagc aatatagcag ctatcctcta 300 gcgttcggag gggggaccaa actggaaata aaatcctctg gtggcggtgg ctcgggcggt 360 ggtgggggtg gttcctctag atcttccctc gaggtgcagc tggtggagtc tggggctgag 420 cttgtgaggc caggggcctt agtcaagttg tcctgcaaag cttctggctt caacattaaa 480 gactacttta tgtactgggt gaagcagagg cctgagcagg gcctggagtg ggttggatgg 540 attgatcctg agaatggtaa tactatatat gacccgaagt tccagggcaa ggccagtata 600 acagcagaca catcctccaa cacagcctac ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac 660 actgccgtct attactgtac tagagggtac tacggtagta gagtgcttgc tatggactat 720 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagccaaaa caacaccccc atctgtcact 780 agtgcggccg ca 792 ＜210＞ 233 ＜211＞ 264 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 抗體M32-胺基酸序列 ＜400＞ 233 Met Ala Glu Leu Gly Ile Glu Leu Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser 1 5 10 15 Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn 20 25 30 Val Gly Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser 85 90 95 Ser Tyr Pro Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser 115 120 125 Ser Leu Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro 130 135 140 Gly Ala Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 145 150 155 160 Asp Tyr Phe Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu 165 170 175 Trp Val Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro 180 185 190 Lys Phe Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr 195 200 205 Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Leu Ala Met Asp Tyr 225 230 235 240 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro 245 250 255 Pro Ser Val Thr Ser Ala Ala Ala 260 ＜210＞ 234 ＜211＞ 747 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 抗體H32-核?酸序列 ＜400＞ 234 gatattcaaa tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggaga tcgcgtgacc 60 attacctgca aggccagtca gaatgtgggt actgcggtcg catggtatca gcagaaacca 120 ggcaaagcgc cgaaacttct gatatactct gcatccaatc ggtacactgg cgtgccgtcg 180 cgtttttcgg gcagtggcag cggcacggac tttaccctga cgatatcttc cttacaaccg 240 gaggattttg cgacctacta ctgtcaacag tatagcagct atcctctagc gttcggtcaa 300 ggcaccaaag tggaaatcaa acgcggaggg ggaggtagca tcgagggccg tagcggaggt 360 ggcgggagcg aagtgcagct ggtggaatcg ggaggcggtc tggtgcaacc tggcggcagc 420 cttcgtctga gctgtaaagc ttctggcttc aacattaaag actactttat gtactgggtg 480 cgtcaagctc ccggcaaggg gctggagtgg gtcggatgga ttgatcctga gaatggtaat 540 actatatatg acccgaagtt ccagggtcgc tttacgatta gtgcggacac cagcaaaaat 600 accgcgtacc tgcagatgaa tagcctgcgt gcggaagaca cagcggtgta ttattgcact 660 agagggtact acggtagtag agtgcttgcg atggattatt gggggcaggg cacccttgtt 720 accgtgagct cggcgtcagc ggccgca 747 ＜210＞ 235 ＜211＞ 249 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 抗體H32-胺基酸序列 ＜400＞ 235 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg 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236 atggccgagc tcgatattca gatgatacag tctcaaaaat tcatgtccac atcagtagga 60 gacagggtca gcgtcacctg caaggccagt cagaatgtgg gtactaatgt agcctggtat 120 caacagaaac cagggcaatc tcctaaagca ctgattcact cggcatccta ccggtacagt 180 ggagtccctg atcgcttcac aggcagtgga tccgggacag atttcactct caccatcagc 240 aatgtgcagt ctgaagactt ggcagagtat ttctgtcagc aatataacag ctatcctctc 300 acgttcggtg ctgggaccaa actggaaatc aaatcctctg gtggcggtgg ctcgggcggt 360 ggtgggggtg gttcctctag atcttccctc gaggtccagc tgcaacagtc tggaactgaa 420 ctggcgaggc ccggggcttc agtgaagttg tcctgtaagg cttctggcta caccttcatt 480 gactactata taacctgggt gaaacagagg actggacagg gccttgagtg gattggagag 540 atttatcctg gaggtggtaa tccttactat aatgataact tcaagggcaa ggcctcgctg 600 actgcagaca aatcctccaa cacagtctac atgcagctca gcagcctgac atctgaggac 660 tctgcagtct atttctgtgc aagatcctat aagtacgacg tttctgttta ctggggccaa 720 gggactctgg tcactgtctc tgcagccaaa acaacacccc catctgtcac tagtgcggcc 780 gca 783 ＜210＞ 237 ＜211＞ 276 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 抗體M62-胺基酸序列 ＜400＞ 237 Met 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ctatgggggt 540 tacacatttt atgccgacag cgtgaaaggt cgctttacga ttagtgcgga caccagcaaa 600 aataccgcgt acctgcagat gaatagcctg cgtgcggaag acacagcggt gtattattgc 660 gcgcgtttca attatctcaa cctcgggggg atggattatt gggggcaggg cacccttgtt 720 accgtgagct cggcgtcagc ggccgca 747 ＜210＞ 239 ＜211＞ 753 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 抗體GH2-42-核?酸序列 ＜400＞ 239 atggccgata ttcaaatgac ccagagcccg agcagcctga gcgcgagcgt gggagatcgc 60 gtgaccatta cctgccgtgc gagccaggat gttagcagtg gcgtcgcatg gtatcagcag 120 aaaccaggca aagcgccgaa acttctgata tccgggccta ctgggctgta tagcggcgtg 180 ccgtcgcgtt tttcgggcag tggcagcggc acggacttta ccctgacgat atcttcctta 240 caaccggagg attttgcgac ctactactgt caacagtatt atgattggcc gttgaccttc 300 ggtcaaggca ccaaagtcaa acgcggtggt tcctctagat cttcctcctc tggtggcggt 360 ggctcgggcg gtggtgggga agtgcagctg gtggaatcgg gaggcggtct ggtgcaacct 420 ggcggcagcc ttcgtctgag ctgtgcggcg agcgggttca ccattagcaa ttgggggatt 480 cattgggtgc gtcaagctcc cggcaagggg ctggagtggg tcgcggggat tgggccctac 540 gggggttata catcttatgc cgacagcgtg aaaggtcgct ttacgattag tgcggacacc 600 agcaaaaata ccgcgtacct gcagatgaat agcctgcgtg cggaagacac agcggtgtat 660 tattgcgcgc gtttcgggtt ttattttgac gggatcatgg attattgggg gcagggcacc 720 cttgttaccg tgagctcggc gtcagcggcc gca 753 ＜210＞ 240 ＜211＞ 735 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 抗體GH2-75-核?酸序列 ＜400＞ 240 atggccgata ttcaaatgac ccagagcccg agcagcctga gcgcgagcgt gggagatcgc 60 gtgatcatta cctgccgtgc gagccaggat gtttctgggt atgtcgcatg gtatcagcag 120 aaaccaggca aagcgccgaa acttctgata tactctagcg gcgtgccgtc gcgtttttcg 180 ggcagtggca gcggcacgga ctttaccctg acgatatctt ccttacaacc ggaggatttt 240 gcgacctact actgtcaaca gtactataat tggccggtaa ccttcggtca aggcaccaaa 300 gtggaaatca aacgcggagg gggaggtagc atcgagggcc gtagcggagg tggcgggagc 360 gaagtgcagc tggtggaatc gggaggcggt ctggtgcaac ctggcggcag ccttcgtctg 420 agctgtgcgg cgagcgggtc caccattggc aactccggga ttcattgggt gcgtcaagct 480 cccggcaagg ggctggagtg ggtcgcgtat attgggccct acgggggtta cacatcctat 540 gccgacagcg tgaaaggtcg ctttacgatt agtgcggaca ccagcaaaaa taccgcgtac 600 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Thr Val Glu Lys Ser Ser Thr Thr 195 200 205 Val Tyr Leu Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Ala Arg Arg His Asp Gly Tyr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro 245 250 255 Ser Val Thr Ser Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro 260 265 270 Leu Glu Pro Arg Ala Ala 275 ＜210＞ 332 ＜211＞ 278 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 抗體M61-胺基酸序列 ＜400＞ 332 Met Ala Glu Leu Asp Ile Lys Ile Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 1 5 10 15 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 20 25 30 Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr 85 90 95 Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ser 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser 115 120 125 Ser Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Thr Phe Thr 145 150 155 160 Thr Tyr Pro Ile Glu Trp Met Lys Gln Asn His Gly Lys Ser Leu Glu 165 170 175 Trp Ile Gly Asn Phe His Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu 180 185 190 Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Val Glu Lys Ser Ser Ser Thr 195 200 205 Val Tyr Leu Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Ala Arg Arg Asn Asp Gly Tyr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro 245 250 255 Ser Val Thr Ser Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro 260 265 270 Leu Glu Pro Arg Ala Ala 275 ＜210＞ 333 ＜211＞ 260 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 抗體M63-胺基酸序列 ＜400＞ 333 Met Ala Glu Leu Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr 1 5 10 15 Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Thr 20 25 30 Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His 35 40 45 Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Asn Arg Ala Pro Gly Val 50 55 60 Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr 65 70 75 80 Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu 85 90 95 Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 100 105 110 Leu Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Ser Arg Ser Ser Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 130 135 140 Val Arg Pro Gly Asp Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 145 150 155 160 Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Val His Trp Val Lys Arg Ser His Gly Lys 165 170 175 Ser Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Ile Tyr Tyr Asp Asn Ile Asn 180 185 190 Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser 195 200 205 Ser Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser 210 215 220 Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Pro Gly 225 230 235 240 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Thr 245 250 255 Ser Ala Ala Ala 260 ＜210＞ 334 ＜211＞ 275 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 抗體M64-胺基酸序列 ＜400＞ 334 Met Ala Glu Leu Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser His Lys Phe Met Ser 1 5 10 15 Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 20 25 30 Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 85 90 95 Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser 115 120 125 Ser Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 145 150 155 160 Asn Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu 165 170 175 Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro 180 185 190 Lys Leu Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr 195 200 205 Ala Tyr Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Val Pro Tyr Tyr Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Gln Ser Phe Pro Asn Val Thr 245 250 255 Ser Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro 260 265 270 Arg Ala Ala 275 ＜210＞ 335 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 互補序列1 ＜400＞ 335 ggaagatcta gaggaaccac c 21 ＜210＞ 336 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 互補序列2 ＜400＞ 336 ggtggttcct ctagatcttc c 21 ＜210＞ 337 ＜211＞ 30 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 第二核酸序列之3端的互補序列 ＜400＞ 337 tgcagccacc gtacgtttga tttccacctt 30 ＜210＞ 338 ＜211＞ 30 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 連接子之5端的互補序列 ＜400＞ 338 aaggtggaaa tcaaacgtac ggtggctgca 30 ＜210＞ 339 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 連接子之3端的互補序列 ＜400＞ 339 ctgcacttca gatgcgacac g 21 ＜210＞ 340 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 第一核酸序列之5端的互補序列 ＜400＞ 340 cgtgtcgcat ctgaagtgca g 21

Claims (30)

  1. 一種由噬菌體表現之單鏈變異片段(phage-displayed single-chain variable fragment,scFv)抗體庫，包含複數個由噬菌體表現之scFv，其中各該些由噬菌體表現之scFv皆包含一第一重鏈互補性決定區域(heavy chain complementarity determining region,CDR-H1)、一第二重鏈CDR(CDR-H2)、一第三重鏈CDR(CDR-H3)、一第一輕鏈CDR(CDR-L1)、一第二輕鏈CDR(CDR-L2)及一第三輕鏈CDR(CDR-L3)，其中，各該CDR-H1、CDR-L2及CDR-L3具有一第一型之正則結構(canonical structure,CS)，且各該CDR-H2及CDR-L1具有一第二型之CS；其中該CDR-L1是由一包含序列編號：2-10中任一核酸序列之第一編碼序列編碼而成，該CDR-L2是由一包含序列編號：11-14中任一核酸序列之第二編碼序列編碼而成，該CDR-L3是由一包含序列編號：15-22中任一核酸序列之第三編碼序列編碼而成，該CDR-H1是由一包含序列編號：23-26中任一核酸序列之第四編碼序列編碼而成，該CDR-H2是由一包含序列編號：27-28中任一核酸序列之第五編碼序列編碼而成，且該CDR-H3是由一包含序列編號：29-106中任一核酸序列之第六編碼序列編碼而成。
  2. 如請求項1所述之由噬菌體表現之scFv抗體庫，其中該噬菌體是一M13噬菌體或一T7噬菌體。
  3. 如請求項1所述之由噬菌體表現之scFv抗體庫，其中在該些由噬菌體表現之scFv中，至少一由噬菌體表現之scFv對一蛋白抗原具有專一性，其中該蛋白抗原係選自由第二型之人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)、麥芽糖結合蛋白質(maltose-binding protein,MBP)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、人類血清白蛋白(human serum albumin,HSA)、溶菌酶(lysozyme)、介白素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)、流感病毒之血球凝集素(hemagglutinin of influenza virus,HA)、流感病毒之核蛋白(nucleoprotein of influenza virus,NP)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、第一型之表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor 1,HER1,EGFR)、第三型表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor 3,HER3)、高血糖素受體(glucagon receptor)、人類去氧核糖核酸水解酶(human DNase I)、第一型之程序性死亡配體(programmed death-ligand 1,PD-L1)、第三型唾液酸結合免疫球蛋白相似凝集素(sialic acid-binding Ig-like lectin 3,SIGLEC 3)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)的結晶片段區域(fragment crystallizable region,Fc region)及利妥昔(rituximab)所組成的群組。
  4. 一種用以製備請求項1之由噬菌體表現之scFv抗體庫的方法，包含：(1)合成一第一核酸序列，其係包含分別用以編碼一免疫球蛋白基因之CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的一第一、一第二、一第三、一第四、一第五及一第六編碼序列；(2)將該第一核酸序列插入一第一噬質體(phagemid)載體中；(3)以定位點突變方法(site-directed mutagenesis)分別修飾該第一、第二及第三編碼序列以製備一變異輕鏈(VL)抗體庫，其係包含一第一組由噬菌體表現之scFv，其中各scFv分別具有經修飾的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；以及以定位點突變方法分別修飾該第四、第五及第六編碼序列以製備一變異重鏈(VH)抗體庫，其係包含一第二組由噬菌體表現之scFv，其中各scFv分別具有經修飾的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；(4)利用一蛋白L來篩選該VL抗體庫，由該VL抗體庫挑選一第三組由噬菌體表現之scFv；且利用一蛋白A來篩選該VH抗體庫，由該VH抗體庫挑選一第四組由噬菌體表現之scFv；(5)由對應的噬菌體中擴增複數個第二核酸序列，其係用以編碼經修飾之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，且由對應的噬菌體中擴增複數個第三核酸序列，其係用以編碼經修飾之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；以及(6)將該些第二及第三核酸序列插入一第二噬質體載體以製備請求項1之由噬菌體表現之scFv抗體庫。
  5. 如請求項4所述之方法，其中在步驟(3)中，該第一、第二及第三編碼序列是分別以序列編號：107-115、116-119及120-127的核酸序列進行修飾，且該第四、第五及第六編碼序列是分別以序列編號：128-131、132-133及134-211的核酸序列進行修飾。
  6. 如請求項4所述之方法，在步驟(3)前更包含一步驟，其係將該免疫球蛋白基因之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中芳香族殘基的分佈與一天然抗體之對應CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中芳香族殘基的分佈進行比對。
  7. 如請求項4所述之方法，其中步驟(1)之該免疫球蛋白基因係用以編碼一對VEGF具有專一性的抗體。
  8. 如請求項4所述之方法，其中該第一及第二噬質體載體皆是源自M13噬菌體。
  9. 一種利用請求項1之由噬菌體表現之scFv抗體庫製備一重組抗體的方法，其中該重組抗體對一蛋白抗原具有結合親和性及專一性；該方法包含：(1)以該蛋白抗原篩選請求項1之由噬菌體表現之scFv抗體庫；(2)挑選複數個噬菌體，其中該些噬菌體會分別表現對該蛋白抗原具有結合親和性及專一性的scFv；(3)使步驟(2)挑選之該些噬菌體分別表現可溶形式之scFv；(4)由步驟(3)之scFv中挑選一對該蛋白抗原具有高結合親和性及專一性之可溶形式scFv；(5)由會表現步驟(4)之可溶形式scFv的噬菌體中萃取一噬質體DNA；(6)以步驟(5)之噬質體DNA作為模版，利用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)分別擴增一用以編碼CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的第一核酸序列，及一用以編碼CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的第二核酸序列；(7)將該第一及第二核酸序列插入一表現載體中，其係包含一第三及一第四核酸序列，其中該第三核酸序列係用以編碼一免疫球蛋白之重鏈恒定區域(constant region)，且該第四核酸序列係用以編碼該免疫球蛋白之輕鏈恒定區域；以及(8)將步驟(7)之包含該第一、第二、第三及第四核酸序列的表現載體轉染至一宿主細胞，以製備該重組抗體。
  10. 如請求項9所述之方法，其中該第一核酸序列是位於該第三核酸序列的上游，且該第二核酸序列是位於該第四核酸序列的上游。
  11. 如請求項9所述之方法，其中該免疫球蛋白係選自由免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白D(immunoglobulin D,IgD)、免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)及免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)所組成的群組。
  12. 如請求項9所述之方法，其中該宿主細胞是一哺乳動物細胞。
  13. 如請求項9所述之方法，其中該蛋白抗原是HER2、MBP、BSA、HSA、溶菌酶、IL-1β、HA、VEGF、EGFR1、EGFR3、高血糖素受體或利妥昔。
  14. 一種由請求項1之由噬菌體表現之scFv抗體庫製備的重組抗體，包含：一CDR-L1，其係具有一第二型之CS，且係由一包含序列編號：2-10中任一核酸序列之第一編碼序列編碼而成；一CDR-L2，其係具有一第一型之CS，且係由一包含序列編號：11-14中任一核酸序列之第二編碼序列編碼而成；一CDR-L3，其係具有一第一型之CS，且係由一包含序列編號：15-22中任一核酸序列之第三編碼序列編碼而成；一CDR-H1，其係具有一第一型之CS，且係由一包含序列編號：23-26中任一核酸序列之第四編碼序列編碼而成；一CDR-H2，其係具有一第二型之CS，且係由一包含序列編號：27或28之第五編碼序列編碼而成；以及一CDR-H3，其係由一包含序列編號：29-106中任一核酸序列之第六編碼序列編碼而成。
  15. 如請求項14所述之重組抗體，其中該重組抗體的離解常數(dissociation constant,KD)約為10-7至10-11M。
  16. 如請求項14所述之重組抗體，其中該重組抗體包含一與序列編號：241-330中任一核酸序列至少有90%相似度的胺基酸序列。
  17. 如請求項14所述之重組抗體，其中該重組抗體可具專一性地結合至HER2之一抗原決定位置(epitope)。
  18. 如請求項17所述之重組抗體，其中該重組抗體會引發HER2受體被內化(internalization)。
  19. 如請求項17所述之重組抗體，其中該重組抗體會抑制HER2受體的功能。
  20. 一種如請求項14之重組抗體的用途，其係用以製備一藥物以治療一罹患或疑似罹患一種與HER2相關之疾病的個體。
  21. 如請求項20所述之用途，其中該重組抗體包含一與序列編號：241-330中任一核酸序列至少有90%相似度的胺基酸序列。
  22. 如請求項20所述之用途，其中該與HER2相關之疾病是一腫瘤。
  23. 一種用以治療一與HER2相關之疾病的組合物，包含一第一重組抗體及一第二重組抗體，其係分別由請求項1之由噬菌體表現之scFv抗體庫製備而得。
  24. 如請求項23所述之組合物，其中該第一重組抗體包含序列編號：253的胺基酸序列，且該第二重組抗體包含序列編號：274或301的胺基酸序列。
  25. 如請求項23所述之組合物，其中該第一重組抗體會結合至HER2之第一抗原決定位置，且該第二重組抗體會結合至HER2之第二抗原決定位置。
  26. 如請求項25所述之組合物，其中該組合物會引發HER2受體被內化。
  27. 如請求項25所述之組合物，其中該組合物會抑制HER2受體的功能。
  28. 一種請求項23之組合物的用途，其係用以製備一藥物以治療一罹患或疑似罹患一種與HER2相關之疾病的個體。
  29. 如請求項28所述之用途，其中該第一重組抗體包含序列編號：253的胺基酸序列，且該第二重組抗體包含序列編號：274或301的胺基酸序列。
  30. 如請求項28所述之用途，其中該與HER2相關之疾病是一腫瘤。
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