CN115521380A - 靶向gpc3的抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种分离的抗原结合蛋白，其包含分离的抗原结合蛋白，所述分离的抗原结合蛋白包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。本申请所述的分离的抗原结合蛋白能够特异性结合GPC3。本申请还提供了所述抗原结合蛋白的制备方法及用途。

Description

靶向GPC3的抗原结合蛋白
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种能够特异性结合GPC3的抗原结合蛋白及嵌合抗原受体。
背景技术
Glypican3(GPC3)是一种70kd膜蛋白，属于Glypicans家族，高度且集中表达于胚胎发育期并且呈现组织特异性，表达之后会被furin酶切割产生N端40kd可溶性部分以及30kd部分通过GPI分子锚定于细胞膜的C端。基因组学和功能研究表明，GPC3对于维持Wnt通路、Hedgehogs通路的激活中有重要作用，例如GPC3偶联的硫酸乙酰肝素分子可以增强Wnts与其受体的结合从而对于维持Wnt通路有重要作用。GPC3表达于脑、消化道、膀胱，性腺和皮肤并高度表达于肝细胞癌表面；肝癌发生中Wnt通路起到了重要的作用，例如20％肝细胞癌β-Catenin通路突变以及Frizzled-7受体过度表达，GPC3在部分肝细胞癌发生过程中可能起到了促进作用。因此，亟需开发针对GPC3的治疗药物。
发明内容
本申请提供了一种靶向GPC3的抗原结合蛋白，其能够以较高亲和力特异性结合GPC3。所述抗原结合蛋白能结合人GPC3和鼠GPC3。另一方面，本申请还提供了包含所述抗原结合蛋白的嵌合抗原受体(CAR)，及CAR-T细胞，所述CAR-T细胞对HepG2细胞具有较强杀伤。
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ IDNO:12所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1和所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2和所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包括抗体重链恒定区。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述重链恒定区源自人IgG恒定区。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述重链恒定区源自人IgG1恒定区。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含VL中的至少一个CDR，所述VL包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含LCDR3，所述LCDR3包含SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含LCDR2，所述LCDR2包含SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1和所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2和所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR4，所述L-FR4的N端与所述LCDR3的C端直接或间接相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，所述L-FR1包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述L-FR2包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述L-FR3包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含抗体轻链恒定区。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述轻链恒定区源自人Igκ恒定区。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含VH和VL，所述VH包含SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，F(ab)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在某些实施方式中，所述抗体选自下组中的一种或多种：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白能够特异性结合磷脂酰肌醇蛋白多糖3(GPC3)。
在某些实施方式中，所述GPC3包含人GPC3和/或鼠GPC3。
另一方面，本申请还提供了一种嵌合抗原受体，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，所述抗原结合结构域包含所述分离的抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的所述抗原结合结构域包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的所述抗原结合结构域包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的所述抗原结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的所述抗原结合结构域包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的所述抗原结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的所述抗原结合结构域包含scFv。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的所述跨膜结构域包含源自选自下述蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α，β或ζ链、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的所述跨膜结构域为CD8α跨膜区。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的所述共刺激域包含选自下述蛋白的多肽：CD28、4-1BB、OX-40和ICOS。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的所述共刺激域为4-1BB胞质区。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的所述共刺激域包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的所述胞内信号传导结构域包含来自CD3ζ的信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的所述胞内信号传导结构域包含SEQ IDNO:38所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体还包含铰链区，所述铰链区包含CD8α铰链区。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述铰链区包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体还连接信号肽。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述信号肽包含CD8α信号肽。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述信号肽包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请还提供了一种免疫效应细胞，其包含所述嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包含T细胞。
另一方面，本申请还提供了一种多特异性抗原结合蛋白，其包含所述分离的抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，所述多特异性抗原结合蛋白包含靶向CD3的部分。
在某些实施方式中，所述CD3包含人CD3。
另一方面，本申请还提供了分离的核酸分子，其编码所述分离的抗原结合蛋白、所述嵌合抗原受体或所述多特异性抗原结合蛋白。
另一方面，本申请还提供了载体，其包含所述核酸分子。
另一方面，本申请还提供了宿主细胞，其包含所述核酸分子或所述载体。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其包含所述分离的抗原结合蛋白，所述嵌合抗原受体，所述免疫效应细胞或所述多特异性抗原结合蛋白，以及任选地药学上可接受的载剂。
另一方面，本申请还提供了制备所述分离的抗原结合蛋白、所述嵌合抗原受体、所述免疫效应细胞、所述多特异性抗原结合蛋白或所述药物组合物的方法。
另一方面，本申请还提供了所述分离的抗原结合蛋白、所述嵌合抗原受体、所述免疫效应细胞、所述多特异性性抗原结合蛋白或所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症包含肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤和/或血液瘤。
另一方面，本申请还提供了检测样品中GPC3存在和/或含量的试剂盒，所述试剂盒包括所述分离的抗原结合蛋白，所述嵌合抗原受体，所述免疫效应细胞，所述多特异性抗原结合蛋白，所述核酸分子，所述载体，所述宿主细胞和/或所述药物组合物。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是纯化后的本申请所述抗原结合蛋白的还原SDS-PAGE结果。
图2显示的是Jurkat细胞表型初步确定结果。
图3显示的是靶细胞HePG2的GPC3阳性率检测结果。
图4，图5和图6显示的是使用本申请所述的抗原结合蛋白得到的CAR-Jurkat细胞的CD69表达检测。
图7显示的是使用本申请所述的抗原结合蛋白得到的CAR-Jurkat细胞的CD69表达检测。
图8显示的是本申请所述CAR-T对靶细胞的杀伤作用检测。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“GPC3(Glypican3)”通常指磷脂酰肌醇蛋白多糖3。在本申请中，所述GPC3可以包含人GPC3，其序列信息可以见UniProtKB/Swiss-Prot accessionNo.P51654。在本申请中，所述GPC3可以包含鼠GPC3。在本申请中，该术语还涵盖其同源物、衍生物、变体及功能活性片段。
在本申请中，术语“分离的抗原结合蛋白”通常指脱离了其天然存在状态的具有抗原结合能力的蛋白。该“分离的抗原结合蛋白”可以包含结合抗原的部分和任选地，允许抗原结合部分采用促进所述抗原结合部分结合抗原的构象的框架或构架部分。抗原结合蛋白可以包含例如抗体来源的蛋白框架区(FR)或具有移植的CDR或CDR衍生物的备选蛋白框架区或人工框架区。此类框架包括，但不限于包含被引入例如以稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变的抗体来源的框架区以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成的框架区。
在本申请中，术语“CDR”也称“互补决定区”，通常指抗体可变结构域中的区域，其序列是高度可变的和/或形成结构定义环。通常，抗体包括六个CDR；在VH中三个(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和在VL中三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。在某些实施方案中，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在缺乏轻链的情况下，其功能也能够正常且稳定。参见，例如，Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff et al,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、AbM、Chothia、IMGT、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见，例如，http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。
在本申请中，术语“可变结构域”与“可变区”可以互换使用，通常指抗体重链和/或轻链的一部分。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“VH”和“VL”(或者分别称为“VH”和“VL”)。这些结构域通常是抗体的变化最大的部分(相对于相同类型的其它抗体)，且包含抗原结合位点。
在本申请中，术语“抗体”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论其是在体外还是体内产生的。该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的和移植的抗体。除非另外被术语“完整的”修饰，如在“完整的抗体”中，为了本发明的目的，术语“抗体”也包括抗体片段，比如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持抗原结合功能(例如，特异性结合GPC3)的其它抗体片段。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常指具有特异结合抗原(例如，GPC3)能力的一个或多个片段。在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在本申请中，术语“Fab”通常指抗体的抗原结合片段。如上所述，可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化后产生两个相同的抗原结合片段，即“Fab”片段，和残余的“Fc”片段(即Fc区，同上)。Fab片段可以由一条完整的L链与一条重链的可变区和该H链(VH)的第一恒定区(CH1)组成。在本申请中，术语“Fab′片段”通常指人单克隆抗体的单价抗原结合片段。例如，Fab′片段可以包括所有轻链，所有重链可变区以及重链的所有或部分第一和第二恒定区。例如，Fab′片段还可包括重链的部分或所有。在本申请中，术语“F(ab')2”通常指通过胃蛋白酶消化完整抗体所产生的抗体片段。F(ab')2片段含有由二硫键维持在一起的两个Fab片段和部分铰链区。F(ab')2片段具有二价抗原结合活性并且能够交联抗原。在本申请中，术语“Fv片段”通常指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括所有或部分重链可变区和轻链可变区，并且缺乏重链恒定区和轻链恒定区。重链可变区和轻链可变区包括例如CDR。在本申请中，术语“scFv”通常指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非特别说明，否则如本申请中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。在本申请中，术语“dAb”通常是指具有VH域、VL域或具有VH域或VL域的抗原结合片段，参考例如Ward等人(Nature,1989Oct 12；341(6242)：544-6)，参考Holt等人,Trends Biotechnol.,2003,21(11)：484-490；以及参考例如WO 06/030220、WO 06/003388和DomantisLtd的其它公布的专利申请。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指其中可变区源自一个物种，而恒定区源自另一个物种的抗体。通常，可变区源自实验动物诸如啮齿动物的抗体(“亲本抗体”)，且恒定区源自人类抗体，使得所得嵌合抗体与亲本抗体相比，在人类个体中引发不良免疫反应的可能性降低。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体的CDR区以外的部分或全部氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白(受体抗体)中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物)的CDR区残基替换。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。
在本申请中，术语“嵌合抗原受体”(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是抗原结合蛋白的可变区和T细胞信号分子的融合蛋白。CAR是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的核心部件，其包括肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号结构域。
在本申请中，术语“跨膜结构域”(Transmembrane Domain)通常是指CAR中穿过细胞膜的结构域，其与细胞内信号转导结构域相连接，起着传递信号的作用。
在本申请中，术语“共刺激结构域”通常是指可以提供免疫共刺激分子的胞内结构域，所述共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。所述共刺激结构域可包括CD28的共刺激结构域，还可包括TNF受体家族的共刺激结构域，例如OX40和4-1BB的共刺激结构域。
在本申请中，术语“胞内信号传导结构域”通常是指CAR位于细胞内信号传导的组分，其包含信号传导结构域和特异性结合所述受体组分的结构域，例如：其可选自CD3ζ胞内域和4-1BB胞内域。
在本申请中，术语“信号肽”(Signal peptide)通常是指引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短(长度约5-30个氨基酸)肽链。
术语“多特异性”通常指抗原结合分子能够特异性结合至少两种不同的抗原性决定簇。在本申请中，该术语可以涵盖双特异性的概念。通常，双特异性抗原结合蛋白包含两种抗原结合位点，其中每种特异于不同的抗原性决定簇。在某些实施方案中，双特异性抗原结合蛋白能够同时结合两种抗原性决定簇，特别是在两种不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。
在本申请中，术语“核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。
在本申请中，术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
在本申请中，术语“宿主细胞”通常指可以是或已经是受试者质粒或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物，其包括本发明所述的核酸分子或本发明所述的载体。细胞可以包括单个细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。细胞可包括用本申请所述的载体在体外转染的细胞。细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞。
在本申请中，术语“药物组合物”通常指用于预防/治疗疾病或病症的组合物。所述药物组合物可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选地对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常包括药剂学可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。
在本申请中，术语“特异性结合”或“特异性的”通常指可测量的和可再现的相互作用，例如靶标和抗体之间的结合，可在分子(包括生物分子)的异质群体存在的情况决定靶标的存在。例如，特异性结合靶标(其可以为表位)的抗体可以是以比它结合其它靶标更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更长的持续时间结合该靶标的抗体。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上的表位，所述表位在不同种属的蛋白质中是保守的。在某些实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他性地结合。该术语也适用于，如抗原结合蛋白对与多个抗原交叉反应的特定表位是有特异性的，其中，特异性的抗体能结合携带交叉反应表位的多种抗原。这种抗原结合蛋白的结合位点和/或具有特异性结合交叉反应表位的抗原结合蛋白，分别也被称为多特异性或交叉特异性结合位点的抗原结合蛋白。例如，抗原结合蛋白可具有与多个不同抗原交叉反应的表位特异性结合的多特异性结合位点。
在本申请中，涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列，还应理解为至少包含以下的范围：与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中，所述变体可以为，例如在所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合GPC3的抗体或其片段)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如，所述取代可以为保守取代。
在本申请中，所述同源物可以为与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合GPC3的抗体或其片段)的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
分离的抗原结合蛋白
抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、AbM、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见，例如，http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本领域技术人员可以根据抗体的序列和结构，用不同的编码系统确定出CDR区。使用不同的编码系统，CDR区可能存在差别。在本申请中，所述CDR涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也涵盖其变体，所述变体包括所述CDR的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸取代、缺失和/或插入；也涵盖其同源物，所述同源物可以为与所述CDR的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的氨基酸序列。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以通过IMGT定义。
一方面，本申请提供一种分离的抗原结合蛋白，其可以包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH可以包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的HCDR可以通过任何形式划分，只要VH与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列相同，以任何形式划分得到的HCDR都可落入本申请的保护范围内。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR3，所述HCDR3可以包含SEQID NO:10所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR2，所述HCDR2可以包含SEQID NO:11所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR1，所述HCDR1可以包含SEQID NO:12所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1和所述HCDR2之间，且所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2和所述HCDR3之间，且所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR4，所述H-FR4的N端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含VH，所述VH可以包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含抗体重链恒定区。例如，所述抗体重链恒定区可以源自任一种免疫球蛋白的重链恒定区，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。例如，所述抗体重链恒定区可以源自人IgG重链恒定区。在本申请中，所述免疫球蛋白的重链恒定区可以包含其突变体。在本申请中，所述抗体重链恒定区可以源自人IgG1-4中任一种的重链恒定区。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以源自人IgG1重链恒定区。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的LCDR可以通过任何形式划分，只要VL与SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列相同，以任何形式划分得到的LCDR都可落入本申请的保护范围内。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含LCDR3，所述LCDR3可以包含SEQID NO:18所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含LCDR2，所述LCDR2可以包含SEQID NO:19所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含LCDR1，所述LCDR1可以包含SEQID NO:20所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1和所述LCDR2之间，且所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2和所述LCDR3之间，且所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR4，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，且所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含VL，所述VL可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含抗体轻链恒定区。例如，所述轻链恒定区可以源自人抗体轻链恒定区。例如，所述轻链恒定区可以源自人Igκ恒定区。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含VH和VL，所述VH可以包含SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含抗体或其抗原结合片段。在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，F(ab)2，scFv，di-scFv和/或dAb。在本申请中，所述抗体可以包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。
此外，需要说明的是，本申请所述分离的抗原结合蛋白可以包含与其存在一个或多个保守序列修饰的重链和/或轻链序列。所谓“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请所述分离的抗原结合蛋白中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。在某些实施方式中，本申请所述分离的抗原结合蛋白的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换。
在本申请中，可以通过使用GPC3-Fc融合蛋白对小鼠进行免疫，获取小鼠脾细胞筛选具有GPC3抗原亲和力的抗原结合蛋白。
可以通过本领域已知的各种测定鉴别、筛选或表征本申请所述的抗原结合蛋白。
例如，可通过已知方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹(例如，蛋白质印迹)、流式细胞术(例如，FACS)、免疫组织化学、免疫荧光等来测试本申请抗原结合蛋白的抗原结合活性。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白能够特异性结合GPC3。在本申请中，所述GPC3可以包含人GPC3。在某些实施方式中，可以利用Octet K2分子互作分析仪对筛选到GPC3胞外段特异结合克隆的冻融上清进行分析。将生物素化的GPC3-huIgG1 Fc融合蛋白固化在SA探针上，以冻融上清作为分析物，进行亲和力测定。在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白可以以小于或等于约6×10-31/s、小于或等于约5.98×10-31/s、小于或等于约5.95×10-31/s、小于或等于约5.94×10-31/s、小于或等于约5.92×10-31/s、小于或等于约5.90×10-31/s、小于或等于约5.8×10-31/s、小于或等于约5.72×10-31/s、小于或等于约5.71×10-31/s、小于或等于约5.70×10-31/s、小于或等于约5.50×10-31/s、小于或等于约5.40×10-31/s、小于或等于约5.34×10-31/s、小于或等于约5.30×10-31/s、小于或等于约5.28×10-31/s、小于或等于约5.20×10-31/s、小于或等于约5.13×10-31/s、小于或等于约5.03×10-31/s、小于或等于约5.00×10-31/s、小于或等于约4.94×10-31/s、小于或等于约4.90×10-31/s、小于或等于约4.80×10-31/s、小于或等于约4.70×10-31/s、小于或等于约4.67×10-31/s、小于或等于约4.60×10-31/s、小于或等于约4.59×10-31/s、小于或等于约4.50×10-31/s、小于或等于约4.40×10-31/s、小于或等于约4.30×10-31/s、小于或等于约4.29×10-31/s、小于或等于约4.10×10-31/s、小于或等于约4.09×10-31/s、小于或等于约4.00×10-31/s、小于或等于约3.90×10-31/s、小于或等于约3.50×10-31/s、小于或等于约3.00×10-31/s、小于或等于约2.50×10-31/s、小于或等于约2.00×10-31/s、小于或等于约1.98×10-31/s、小于或等于约1.90×10-31/s、小于或等于约1.85×10-31/s、小于或等于约1.5×10-31/s、小于或等于约1.00×10-31/s的解离常数与所述GPC3结合。
嵌合抗原受体和免疫效应细胞
另一方面，本申请还提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR可以包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导域。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域可以包含本申请所述的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述CAR的抗原结合结构域可以包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CAR的抗原结合结构域可以包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CAR的抗原结合结构域可以包含HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CAR的抗原结合结构域可以包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CAR的抗原结合结构域可以包含VL，所述VL可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CAR的抗原结合结构域可以包含VH和VL，所述VH可以包含SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列且所述VL可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CAR的抗原结合结构域可以包含抗体或其抗原结合片段。
在本申请中，所述CAR的抗原结合结构域可以包含单链抗体(scFv)。
在本申请中，所述CAR的抗原结合结构域可以靶向GPC3抗原。
在本申请中，所述跨膜结构域可以包含源自选自下述蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α，β或ζ链、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
在本申请中，所述跨膜结构域可以包含CD8α跨膜区。在某些实施方式中，所述跨膜结构域为CD8α跨膜区。在某些实施方式中，所述跨膜结构域可以包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述共刺激结构域可以包含选自下述蛋白的多肽：CD28、4-1BB、OX-40和ICOS。
在本申请中，所述共刺激结构域可以包含4-1BB。在某些实施方式中，所述共刺激结构域可以为4-1BB的共刺激结构域。在某些实施方式中，所述共刺激结构域可以包含SEQID NO:37所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述胞内信号传导域可以包含来自CD3ζ的信号传导结构域。在某些实施方式中，所述胞内信号传导域为来自CD3ζ的信号传导结构域。在某些实施方式中，所述胞内信号传导域包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CAR还可以包含铰链区。在某些实施方式中，所述铰链区可以连接所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域。在某些实施方式中，所述铰链区包含SEQ IDNO:35所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CAR还可以包含信号肽。在某些实施方式中，所述信号肽包含CD8α信号肽。在某些实施方式中，所述信号肽包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CAR可以从N端到C端依次包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域、以及胞内信号传导域。例如，所述抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，所述跨膜结构域可以包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述共刺激结构域可以包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，且所述胞内信号传导域可以包含SEQ IDNO:38所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CAR可以从N端到C端依次包含抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域、以及胞内信号传导域。例如，所述抗原结合结构域可以包含SEQ IDNO:34所示的氨基酸序列，所述铰链区可以包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，所述跨膜结构域可以包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述共刺激结构域可以包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，且所述胞内信号传导域可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CAR可以从N端到C端依次包含信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域、以及胞内信号传导域。例如，所述信号肽可以包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，所述抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，所述铰链区可以包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，所述跨膜结构域可以包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述共刺激结构域可以包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，且所述胞内信号传导域可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CAR可以包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请还提供了免疫效应细胞，其可以包含本申请所述的CAR。在本申请中，所述免疫效应细胞可以包含T细胞。例如，α/β的T淋巴细胞和γ/δ淋巴细胞。在某些实施方式中，所述免疫效应细胞可以包括自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。
多特异性抗原结合蛋白
另一方面，本申请还提供了多特异性抗原结合蛋白。在本申请中，所述多特异性抗原结合蛋白可以包含靶向GPC3的部分和所述靶向CD3的部分。例如，所述靶向GPC3的部分可以包含本申请所述的任一分离的抗原结合蛋白。例如，所述靶向GPC3的部分可以包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQID NO:11所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。例如，所述靶向GPC3的部分可以包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述多特异性抗原结合蛋白可以包含双特异性抗原结合蛋白。在某些实施方式中，所述多特异性抗原结合蛋白可以包含双特异性抗体。
核酸分子、载体、细胞、药物组合物、制备方法
另一方面，本申请还提供了分离的核酸分子，其编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白或所述嵌合抗原受体。本申请所述的分离的一种或多种核酸分子可以为任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。
另一方面，本申请还提供了载体，其可以包含本申请所述的核酸分子。所述载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。例如，载体可以包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。又例如，所述载体可以含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，所述载体还可以含有复制起始位点。此外，所述载体还可以包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
另一方面，本申请还提供了宿主细胞，其可以包含本申请所述的核酸分子或所述载体。在本申请中，所述细胞可以包含本申请所述的免疫效应细胞。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、所述嵌合抗原受体、所述免疫效应细胞或所述多特异性抗原结合蛋白，以及任选地药学上可接受的载剂。在某些实施方式中，所述药物组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下对接收者无毒。本申请的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。在某些实施方式中，所述药学上可接受的载剂可以包括与所述抗原结合蛋白或所述免疫效应细胞相容的任何和所有的溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂，通常安全、无毒。
另一方面，本申请还提供了制备本申请所述的分离的抗原结合蛋白、所述的嵌合抗原受体、所述的免疫效应细胞、所述多特异性抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述宿主细胞、所述药物组合物的方法。
用途和应用
另一方面，本申请还提供了所述分离的抗原结合蛋白、所述嵌合抗原受体、所述免疫效应细胞、所述多特异性抗原结合蛋白和/或所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
另一方面，本申请还提供了所述分离的抗原结合蛋白、所述嵌合抗原受体、所述免疫效应细胞、所述多特异性抗原结合蛋白和/或所述药物组合物，其用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
另一方面，本申请还提供了预防和/或治疗疾病和/或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白、所述嵌合抗原受体、所述免疫效应细胞、所述多特异性抗原结合蛋白和/或所述药物组合物。
在本申请中，所述疾病和/或病症包括与GPC3相关的疾病和/或病症。
在本申请中，所述疾病和/或病症包括肿瘤。
在本申请中，所述肿瘤可以包括实体瘤和/或血液瘤。
在本申请中，所述受试者可以包括人类和非人类动物。例如，所述受试者可以包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
另一方面，本申请还提供了检测样品中GPC3的试剂盒，所述试剂盒可以包括本申请所述的分离的抗原结合蛋白、所述的嵌合抗原受体、所述的免疫效应细胞、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞、所述多特异性抗原结合蛋白和/或所述的药物组合物。
本申请还提供了以下技术方案：
1.分离的抗原结合蛋白，其包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
2.根据实施方案1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQID NO:10所示的氨基酸序列。
3.根据实施方案1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
6.根据实施方案4-5中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
7.根据实施方案4-6中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1和所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
8.根据实施方案3-7中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2和所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
9.根据实施方案2-8中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ IDNO:14所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体重链恒定区。
13.根据实施方案12所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区源自人IgG恒定区。
14.根据实施方案12-13中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区源自人IgG1恒定区。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
20.根据实施方案18-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
21.根据实施方案18-20中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1和所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
22.根据实施方案17-21中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2和所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
23.根据实施方案16-22中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR4，所述L-FR4的N端与所述LCDR3的C端直接或间接相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，所述L-FR1包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述L-FR2包含SEQID NO:22所示的氨基酸序列，所述L-FR3包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
25.根据实施方案1-24中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体轻链恒定区。
27.根据实施方案26所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述轻链恒定区源自人Igκ恒定区。
28.根据实施方案1-27中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，所述VH包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
29.根据实施方案1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体或其抗原结合片段。
30.根据实施方案29所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，F(ab)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
31.根据实施方案29-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自下组中的一种或多种：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
32.根据实施方案1-31中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其能够特异性结合磷脂酰肌醇蛋白多糖3(GPC3)。
33.根据实施方案32所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述GPC3包含人GPC3和/或鼠GPC3。
34.嵌合抗原受体，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，所述抗原结合结构域包含实施方案1-33中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
35.根据实施方案34所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
36.根据实施方案34-35中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
37.根据实施方案34-36中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
38.根据实施方案34-37中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
39.根据实施方案34-38中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域包含SEQID NO:34所示的氨基酸序列。
40.根据实施方案34-39中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
41.根据实施方案34-40中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域包含scFv。
42.根据实施方案34-41中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域包含源自选自下述蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α，β或ζ链、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
43.根据实施方案42所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域为CD8α跨膜区。
44.根据实施方案34-43中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
45.根据实施方案34-44中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激域包含选自下述蛋白的多肽：CD28、4-1BB、OX-40和ICOS。
46.根据实施方案45所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激域为4-1BB胞质区。
47.根据实施方案34-46中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激域包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
48.根据实施方案34-47中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域包含来自CD3ζ的信号传导结构域。
49.根据实施方案34-48中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
50.根据实施方案34-49中任一项所述的嵌合抗原受体，其还包含铰链区，所述铰链区包含CD8α铰链区。
51.根据实施方案50所述的嵌合抗原受体，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
52.根据实施方案34-51中任一项所述的嵌合抗原受体，其还连接信号肽。
53.根据实施方案52所述的嵌合受体，其中所述信号肽包含CD8α信号肽。
54.根据实施方案34-53中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述信号肽包含SEQID NO:33所示的氨基酸序列。
55.根据实施方案34-54中任一项所述的嵌合抗原受体，其包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
56.免疫效应细胞，其包含实施方案34-55中任一项所述的嵌合抗原受体。
57.根据实施方案56所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞包含T细胞。
58.多特异性抗原结合蛋白，其包含实施方案1-33中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
59.根据实施方案58所述的多特异性抗原结合蛋白，其包含靶向CD3的部分。
60.根据实施方案59所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述CD3包含人CD3。
61.分离的核酸分子，其编码实施方案1-33中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案34-55中任一项所述的嵌合抗原受体或实施方案58-60中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白。
62.载体，其包含实施方案61所述的核酸分子。
63.宿主细胞，其包含实施方案61所述的核酸分子或实施方案62所述的载体。
64.药物组合物，其包含实施方案1-33中任一项所述的抗原结合蛋白，实施方案34-55中任一项所述嵌合抗原受体、实施方案56-57中任一项所述的免疫效应细胞或实施方案58-60中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，以及任选地药学上可接受的载剂。
65.制备实施方案1-33中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案34-55中任一项所述的嵌合抗原受体、实施方案56-57中任一项所述的免疫效应细胞、实施方案58-60中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白或实施方案64所述的药物组合物的方法。
66.实施方案1-33中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案34-55中任一项所述的嵌合抗原受体、实施方案56-57中任一项所述的免疫效应细胞、实施方案58-60中任一项所述的双特异性抗原结合蛋白或实施方案64所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
67.根据实施方案66所述的用途，其中所述疾病和/或病症包含GPC3相关疾病和/或病症。
68.根据实施方案66-67中任一项所述的用途，其中所述疾病和/或病症包含肿瘤。
69.根据实施方案68所述的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤和/或血液瘤。
70.检测样品中GPC3存在和/或含量的试剂盒，所述试剂盒包括实施方案1-33中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案34-55中任一项所述的嵌合抗原受体、实施方案56-57中任一项所述的免疫效应细胞、实施方案58-60中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白、实施方案61所述的核酸分子、实施方案62所述的载体、实施方案63所述的宿主细胞和/或实施方案64所述的药物组合物。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的CDR序列可以使用IMGT方案进行划分。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的抗原结合蛋白、嵌合抗原受体、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1人磷脂酰肌醇蛋白多糖3(GPC3)与人IgG1 Fc区的融合蛋白(GPC3-huIgG1Fc)的表达载体构建与真核表达
1.合成GPC3 25位至599位氨基酸区间的基因序列及GPC3-huIgG1 Fc融合蛋白的表达载体构建
通过化学合成的方式合成人磷脂酰肌醇蛋白多糖3(GPC3)(UniProtKB/Swiss-Prot accession No.P51654)的第25位谷氨酰胺至第559位组氨酸区间的基因序列，该基因序列编码SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。通过化学合成的方式合成人IgG1重链恒定区(UniProtKB/Swiss-Prot accession No.P01857.1)的第99位谷氨酸至第330位赖氨酸氨酸区间的基因序列，该基因序列编码SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。化学合成含融合蛋白信号肽(SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列)基因序列的引物用于表达载体构建。通过分子克隆，将GPC3基因片段与人IgG1 Fc基因片段进行拼接。拼接产物用TaKaRa无缝克隆试剂盒克隆到pCDNA3.1(Thermo)中。
2.重组GPC3-huIgG1 Fc融合蛋白的表达与纯化
以此表达载体转染293T细胞(ATCC)5天后，收集培养上清，用AKTA avant(GE)纯化重组GPC3-huIgG1 Fc融合蛋白。由于糖基化修饰等原因，重组GPC3-huIgG1 Fc融合蛋白经还原SDS-PAGE电泳后通过考马斯亮蓝染色显示其大小约100-120k道尔顿左右，结果如图1所示。
实施例2抗人GPC3鼠源抗体的制备
1.免疫动物
将2mg/mL的GPC3-huIgG1 Fc融合蛋白作为抗原与等体积的完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)混合乳化，取10只6周大雌性Balb/c小鼠进行皮下免疫。在初次免疫后，每十天时间进行一次加强免疫，共执行四次皮下免疫，第五次免疫时直接用MSLN-huIgG1 Fc融合蛋白进行脾脏冲击免疫。
2.血清效价检测
每次加强免疫前尾静脉取血50uL，离心去除细胞，保留血清。ELISA微孔板中加入重组GPC3 50ng/孔，4℃包被过夜。PBS清洗三遍，加入1％BSA/PBS，200uL/孔，37℃封闭1小时。加入梯度稀释的小鼠血清，37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入HRP-山羊抗小鼠IgG 37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100uL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100uL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD450数值。
3.构建免疫文库
3.1小鼠脾细胞总cDNA获取
利用GPC3-huIgG1 Fc融合蛋白直接进行腹腔注射方式进行冲击免疫，四天后处死小鼠，取脾脏。用细胞筛网(BD)研磨整个脾脏，获取脾脏细胞。用PBS冲洗两遍后，1000g离心10分钟，获取脾脏细胞。使用Trizol RNA提取试剂盒抽提总RNA。
以所述RNA为模板，使用SuperScriptTMIV First-Strand Synthesis System试剂盒合成第一链cDNA。
3.2抗体基因扩增与轻重链拼接
以所述cDNA为模板，使用重链可变域上游引物和下游引物(VH-F、VH-R)PCR扩增重链可变域基因，使用轻链可变域上游引物和下游引物引物(VK-F、VK-R)PCR扩增卡帕链可变域基因。在50uL反应体系中，分别加入25uL phusion master mix，上游引物2.5uL(25pmol)，下游引物2.5uL(25pmol)，1.5uL DMSO，0.5uL cDNA和18uL ddH2O。按以下程序进行PCR反应：98℃预变性1分钟后进入温度循环，98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次，72℃最终延伸10分钟。
使用DNA胶回收试剂盒回收扩增得到的VH基因和VK基因。将等量的VH基因和VK基因混合后为模板，利用上游引物scFv-F和下游引物scFv-R通过重叠PCR扩增scFv基因。在50uL反应体系中，分别加入25uL phusion master mix，上游引物2.5uL(25pmol)，下游引物2.5uL(25pmol)，1.5uL DMSO，0.5uL cDNA和18uL ddH2O。按以下程序进行PCR反应：98℃预变性1分钟后进入温度循环，98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次，72℃最终延伸10分钟。
使用DNA胶回收试剂盒回收扩增得到的scFv基因片段。
3.3构建免疫文库
分别使用SfiI DNA内切酶消化scFv基因片段和pcomb3XTT载体(美国Scripps研究所)。在50uL反应体系中，分别加入SfiI 2uL，10x缓冲液5uL，DNA 3ug，加ddH2O至50uL。充分混匀后，50℃孵育3小时。
使用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的scFv基因片段和pcomb3X载体。使用T4连接酶环化酶切后的scFv基因片段和酶切后的pcomb3X载体。在50uL反应体系中，分别加入T4连接酶1uL，10x缓冲液5uL，scFv基因100ng，pComb3X载体500ng，加ddH2O至50uL。充分混匀后，4℃孵育16小时。取少量产物通过琼脂糖凝胶电泳验证连接效率。
将10uL上述连接环化产物加入自制的TG1电转化感受态中，然后使用电转仪进行电击转化。取出10ul电转化后的细菌通过合理的稀释并在含有氨苄青霉素的平板上划线，以此计数并统计噬菌体抗体文库的大小。剩余的电转化后的细菌加入含100ug/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖的2xYT培养基，置于加热培养箱培养。培养结束后在4℃以4000G离心10分钟，在沉淀菌中补充适量甘油储存于-80℃作为抗体菌种库。通过多次电转化积累获得scFv免疫文库。
4.鼠源免疫抗体噬菌体文库的筛选与鉴定
4.1GPC3-huIgG1 Fc融合蛋白的生物素化
应用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin对应标准操作程序对GPC3-huIgG1 Fc融合蛋白进行随机生物素化。用ELISA方法验证生物素化的GPC3-huIgG1 Fc融合蛋白与YP7嵌合阳性对照抗体(自制)的结合活性。
4.2生物淘选
以GPC3-huIgG1 Fc融合蛋白为目标蛋白应用生物淘选对上述鼠源免疫抗体文库进行生物淘选获得与GPC3-huIgG1 Fc融合蛋白(尤其是GPC3胞外域结合的抗体。将抗体菌种库复苏并生长至对数期后应用M13KO7辅助噬菌体挽救抗体文库，离心后用含有氨苄青霉素和卡那霉素的2xYT培养基重悬并在30℃过夜扩增。PEG/NaCl沉淀噬菌体，用甘油/PBST溶解噬菌体沉淀获得免疫库噬菌体悬液。酪蛋白封闭的噬菌体投入酪蛋白封闭的生物素化的huIgG1 Fc蛋白(自制)和酪蛋白封闭的Dynabeads M-270链霉亲合素共孵育体系中，收集上清噬菌体悬液。进一步，将收集到的噬菌体悬液投入酪蛋白封闭的生物素化的GPC3-huIgG1Fc融合蛋白和酪蛋白封闭的Dynabeads M-270链霉亲合素共孵育体系中，用PBST清洗磁珠去除无法与GPC3-huIgG1 Fc融合蛋白结合的噬菌体。用100mM三乙胺洗脱与磁珠结合的噬菌体后用1M Tris-HCl(pH＝6.4)中和。留取10ul洗脱的噬菌体溶液用于测定输出噬菌体总量，剩余噬菌体溶液用于感染对数增长的TG1，过夜扩增后视为下一轮淘选使用的抗体文库。生物淘选共执行三轮，GPC3-huIgG1 Fc抗原浓度分别为100nM、10nM和1nM。
4.3GPC3胞外域特异性结合克隆的筛选
将第三轮生物淘选结束后获得的抗体文库进行稀释涂布于含有氨苄青霉素的平板上获得单克隆，挑选单克隆在深孔板中过夜培养。次日利用-20℃冰箱对深孔板进行反复三次冻融，离心上清用于后续ELISA反应。ELISA反应利用山羊抗人IgG(Fab特异性的)过夜包被，依次加入离心上清，生物素化的GPC3-huIgG1 Fc融合蛋白和链霉亲合素-HRP进行阳性克隆筛选。该筛选步骤重复两次独立实验以保证数据准确。
为排除与huIgG1 Fc区结合的克隆，执行以下ELISA反应。利用山羊抗人IgG(Fab特异性的)过夜包被，依次加入离心上清，生物素化的huIgG1 Fc蛋白和链霉亲合素-HRP进行huIgG1区结合阳性克隆筛选。该筛选步骤重复两次独立实验以保证数据准确。
由以上两个步骤挑选出GPC3胞外域特异性结合克隆。
4.4利用解离速率常数koff进行亲和力排序
利用Octet K2分子互作分析仪对上述步骤筛选到GPC3胞外段特异结合克隆的冻融上清进行分析。将生物素化的GPC3-huIgG1 Fc融合蛋白固化在SA探针上，以冻融上清作为分析物，进行亲和力测定。分析步骤中只选取解离曲线计算koff数值，挑选P3H10(VH氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，VL氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)、P1C7(VH氨基酸序列如SEQID NO:3所示，VL氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)、P2G10(VH氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，VL氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)、P3A8(VH氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，VL氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)、P3G4(VH氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，VL氨基酸序列如SEQID NO:8所示)、P3D9(VH氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，VL氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示)、P4F12(VH氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，VL氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示)、P1F6(VH氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，VL氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示)进一步开展功能研究(如表1所示)。
表1解离速率常数测定
Figure BDA0003401066230000271
Figure BDA0003401066230000281
4.5鉴定各抗体与不同物种GPC3抗原结合的种属交叉反应
利用含上述八个抗体序列噬菌粒的单克隆菌进行scFv抗体的小量原核表达并利用ESLIA鉴定scFv抗体与不同种属的GPC3的结合能力。实验独立重复两次，第二次实验由于部分样品制备失败未获取ELISA读值。
svFv抗体的原核表达具体的操作步骤如下：将单克隆菌液按照1‰的接种量接种到3mL 2YT/Amp培养基中，37℃250rpm培养过夜活化。次日，将活化的菌液按照1％接种量接种到100mL 2YT/Amp培养基中，37℃250rmp培养至OD600为0.5。向10mL 2YT/Amp菌液中加入终浓度为1mM的IPTG,并于30℃250rpm过夜诱导。过夜菌液4000rpm离心10min弃上清，将沉淀菌体重悬于2ml冰1X TES buffer(0.2M Tris-HCl(pH＝8.0),0.5mM EDTA，0.5Msucrose)中并冰浴20min。接着加入3ml的0.2X TES buffer，冰浴30min后再进行反复冻融两次，离心取上清进行超滤浓缩至300ul左右。
scFv抗体与不同种属的GPC3结合ELISA反应具体的操作步骤如下：分别包被人GPC3-his(自制)和Mouse GPC3(自制)100ng每孔于ELISA板,4℃过夜；50ul的各抗体浓缩液和50ul 1X PBST(含1％的BSA)混合后加入ELISA板中作为一抗；加入二抗为Goat anti-Mouse IgG F(ab')2Secondary Antibody(1:4000稀释，稀释液为PBST)，100ul每孔；最终显色读值。通过ELISA反应确定P3A8、P3G4、P3D9同时与人和鼠的GPC3结合均很强，ELISA结果如表2所示。
表2种属交叉反应结果
Figure BDA0003401066230000291
实施例3含抗人GPC3嵌合抗原受体元件的慢病毒原液制备
1.含CAR元件的慢病毒包装主质粒制备
选取P3H10、P1C7、P2G10、P3A8、P3G4、P3D9、P4F12、P1F6克隆以及YP7克隆的抗体序列构建嵌合抗原受体。其中YP7克隆(Mitchell Ho，WO2013181543A1)是本发明的阳性对照抗体。通过分子克隆构建从N末端至C末端包含有以下结构的CAR元件慢病毒包装主质粒：CD8α信号肽，scFv抗体，CD8α铰链区，CD8α跨膜区，41BB胞质区和CD3z胞质区。挑选测序正确的克隆，接种菌液至300ml 2YT培养基中，过夜摇菌并利用质粒大提试剂盒(上海生工)完成大提质粒。
2.慢病毒包装
用阳离子聚合物PEI包装含慢病毒，流程如下：分别用无血清DMEM稀释PEI和第三代的慢病毒包装质粒(慢病毒主质粒、pMD2.G、pMDLg-pRRE、pRSV-Rev)；然后将PEI/DMEM加入质粒/DMEM混合物，涡旋震荡混匀，在室温下静置15分钟；将质粒-PEI复合物加入预先铺板的293T细胞。转染后16h换液，在48h后收集病毒上清，0.45um滤器过滤，将病毒原液以12000g过夜离心沉淀病毒，次日弃上清用PBS溶液重悬病毒，置于负八十度冰箱储存。
实施例4抗人GPC3嵌合抗原受体-Jurkat细胞的制备和嵌合抗原受体阳性率测定
1.病毒液的生物滴度检测
病毒液的生物滴度指每毫升中含有的具有感染能力的病毒颗粒数，准确确定病毒感染滴度有助于制备期望阳性率的嵌合抗原受体-Jurkat细胞。取24孔培养板，每孔加入梯度稀释的病毒原液，感染体积起始量为1ml，三倍倍比，五个梯度稀释，体积不足1ml，用培养基补足1ml后每孔中添加100μl含1×105个293T细胞的细胞悬液(含polybrene，终浓度为8μg/ml)，3天后采用流式细胞术对细胞的感染效率进行检测，使用荧光染料标记蛋白FITC-Labeled Human Glypican 3(ACRO biosystem)对细胞染色，以未感染的同步培养293T细胞作为阴性对照组(293T)。滴度计算公式为：Titer(TU/ml)＝感染细胞数×流式检测CAR表达比例/病毒液体积。生物滴度测定结果如表3所示。
表3生物滴度测定结果
质粒编号 包装体积 慢病毒滴度 慢病毒总量
P1F6 50ml 2.02E8 TU/ml 4.00E7 TU(0.2ml)
P2G10 50ml 3.60E8 TU/ml 7.21E7 TU(0.2ml)
P1C7 50ml 1.90E8 TU/ml 3.81E7 TU(0.2ml)
P3H10 50ml 6.17E7 TU/ml 1.234E6 TU(0.2ml)
P3D9 50ml 2.99E8 TU/ml 5.97E7 TU(0.2ml)
P3A8 50ml 3.78E8 TU/ml 7.56E7 TU(0.2ml)
P3G4 50ml 3.59E8 TU/ml 7.18E7 TU(0.2ml)
P4F12 50ml 1.38E8 TU/ml 2.76E7 TU(0.2ml)
YP7 50ml 8.30E8 TU/ml 1.66E8 TU(0.2ml)
2.Jurkat细胞表型初步确定
首先通过流式细胞术检测Jurkat细胞(中科院上海药物研究所)的表型，从液氮罐中复苏并培养Jurkat细胞，收集Jurkat细胞至1.5ml离心管中，1500rpm离心5min，弃上清，管中残留约50ul液体，轻弹重悬细胞。每管加入1ml PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，轻弹重悬细胞。200ul PBS重悬细胞，加入1ul(PerCP)CD8抗体(Biolegend,301030)和1ul APC CD3抗体(Biolegend,300312)，室温避光10min。每管加入1mlPBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，轻弹重悬细胞。流式上机检测APC/PC5.5通道的阳性率。与未染色组相比，Jurkat细胞的CD3+CD8-为93.63％，所述Jurkat细胞为CD4+T淋巴细胞。结果如图2所示。
3.抗人GPC3嵌合抗原受体-Jurkat细胞的制备
从液氮中复苏并培养Jurkat细胞，取Jurkat细胞使用自动计数仪检细胞密度及活率。取1E7的细胞用于Jurkat细胞铺板和病毒感染：取1E7的细胞加入1支15ml离心管，1000rpm 3min。弃上清，用10ml 1640完全培养基进行重悬。按照每孔加入1E6/2ml/孔Jurkat细胞铺6孔细胞板。每孔加入Polybrene(1mg/mL)，使终浓度为5ug/ml加入后轻轻混匀。每孔加入MOI＝5的RD2慢病毒。加入后轻轻混匀。37℃5％CO2静置培养24h，第二天观察细胞状态并向6孔培养板中补加培养基2000ul 1640完全培养基，继续置于37℃5％CO2培养箱静置培养。
4.抗人GPC3嵌合抗原受体-Jurkat细胞的CAR阳性率检测
病毒转导48h后进行CAR阳性率检测，使用荧光染料标记蛋白FITC-Labeled HumanGlypican 3(ACRO biosystem)对细胞染色。具体流程为：收集400ul细胞至1.5ml离心管中，每管加入1000ul PBS。1500rpm离心5min，弃上清，管中残留约50ul液体，轻弹重悬细胞。每管加入1ml PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，轻弹重悬细胞。200ul PBS重悬细胞，每管加入配制好的的FITC-Labeled Human Glypican 3 3ul(终浓度3ug/ml)，4摄氏度避光30min。每管加入1mlPBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，轻弹重悬细胞。300ul PBS重悬细胞上机检测。以未转导病毒的Jurkat细胞的FITC通道信号值作为阳性值域，判断各嵌合抗原受体-Jurkat细胞的阳性率。YP7-CAR Jurkat细胞阳性率为86.34％，P2G10-CARJurkat细胞阳性率为13.88％，P3G4-CAR Jurkat细胞阳性率为43.70％，P1F6-CAR Jurkat细胞阳性率为37.95％，P1C7-CAR Jurkat细胞阳性率为32.59％，P3H10-CAR Jurkat细胞阳性率为88.99％，P3D9-CAR Jurkat细胞阳性率为82.99％，P3A8-CAR Jurkat细胞阳性率为86.32％，P4F12-CAR Jurkat细胞阳性率为30.11％。
实施例5基于抗人GPC嵌合抗原受体-Jurkat细胞功能的抗体初筛
1.靶细胞GPC3阳性率检测
选用GPC3阳性的HePG2细胞系作为靶细胞。首先通过流式细胞术检测HePG2细胞(中科院上海药物研究所)的表型，从液氮罐中复苏并培养HePG2细胞，收集HePG2细胞至1.5ml离心管中，1500rpm离心5min，弃上清，管中残留约50ul液体，轻弹重悬细胞。每管加入1ml PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，轻弹重悬细胞。200ul PBS重悬细胞，加入2ulPE Anti-Glypican 3(Abcam,ab275697)，室温避光10min。每管加入1ml PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，轻弹重悬细胞。流式上机检测PE通道的阳性率。与未染色组相比，HePG2细胞的HePG2+为53.11％以上(由于分群不明显，圈门存在一定误差)。结果如图3所示。因此该HePG2细胞可以作为本研究靶细胞。
2.抗人GPC3嵌合抗原受体-Jurkat细胞激活实验
由于不同抗体克隆的CAR-jurkat细胞阳性率差异较大，因此根据GPC3-FITC测定的阳性率将细胞分为以下四组进行实验(用野生型jurkat细胞将对照YP7 CAR-jurkat细胞与各候选抗体CAR-jurkat细胞的阳性率调节一致)：
表4根据GPC3-FITC测定的阳性率将细胞进行分组
Figure BDA0003401066230000321
根据上表将对应的细胞加入15ml离心管，1000rpm 3min。弃上清，使用300ul的1640完全培养基继续重悬，用于各不同抗体克隆的CAR-Jurkat细胞的CD69表达的检测。
效靶细胞共孵育具体操作步骤如下：将重悬处理好靶细胞HepG2：5x105cells/1.25ml 1640/25wells完全培养基加入96孔细胞板中(每孔加入靶细胞50uL)。将重悬处理好效应细胞Jurkat或者Jurkat 1.2E6 cells/0.3ml 1640/6wells完全培养基按照不同效靶比加入96孔细胞板中(E：T＝10：1每孔加入效应细胞细胞50uL；对照效应细胞组每孔加入效应细胞细胞50uL+50uL1640完全培养基。加样完成后，轻轻混匀以保证效靶细胞充分接触。将细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。
Jurkat细胞表面CD69表达检测详细操作步骤如下：收集细胞至1.5ml离心管中，每管加入1000ul PBS。1500rpm离心5min，弃上清，轻弹重悬细胞。每管加入1mlPBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，轻弹重悬细胞。每管加入200ul PBS重悬细胞后，加入1ul APC抗人CD69抗体，室温避光染色10min。每管加入1mlPBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，轻弹重悬细胞。300ul PBS重悬细胞后上机检测。根据APC通道数值评估CD69表达水平。根据上述Mean APC作图，三组实验的结果分别如图4，图5和图6。
通过以上数据确定，只有P3D9的效靶比10:1样品的平均APC荧光强度与对照样品(无靶细胞)平均APC荧光强度的比值略高于YP7组，可以判断P3D9具更优的激活T细胞的能力。
进一步的，利用上述同样的方法再次制备了一批YP7 CAR-jurkat细胞(阳性率70.48％)和P3D9 CAR-jurkat(阳性率52.72％)。用野生型jurkat细胞将对照YP7 CAR-jurkat细胞的阳性率调节为52.72％，以效靶比10:1条件完成效靶细胞共孵育，两组Jurkat细胞表面CD69表达情况如图7所示。结果显示P3D9的效靶比10:1样品的平均APC荧光强度与对照样品(无靶细胞)平均APC荧光强度的比值高于YP7组，因此P3D9具更优的激活T细胞的能力。
实施例6基于抗人GPC嵌合抗原受体-T细胞功能的抗体验证
1.抗人GPC3嵌合抗原受体-T细胞制备
用来自于正常供体的T细胞(妙顺生物)以及实施例3.2中所述的含P3H10、P3D9和YP7抗体序列的慢病毒分别制备P3H10-CAR-T细胞、P3D9-CAR-T细胞和YP7-CAR-T细胞。
2.HepG2-luc-GFP靶细胞的构建
首先制备靶细胞构建所需的慢病毒：通过化学合成的方式，合成以内部核糖体进入位点(IRES)串联的萤光素酶和绿色荧光蛋白基因。通过分子克隆构建慢病毒包装主质粒(PCCL-LUC-GFP)并包装慢病毒。用上述慢病毒分别转染实施例5.1所述的HepG2细胞后，以绿色荧光蛋白作为标记筛选出绿色荧光蛋白高表达的HepG2-luc-GFP单细胞克隆，扩大培养作为CAR-T杀伤实验靶细胞。
3.抗人GPC3嵌合抗原受体-T细胞杀伤靶细胞
CAR-T杀伤实验通过检测CAR-T细胞体外对靶细胞的杀伤效果来评估CAR-T细胞的体外功能。以不同效靶比(以3E4个靶细胞为基准，效应细胞分别为两倍、五倍及十倍的靶细胞数)将T细胞与HepG2-LUC-GFP靶细胞共同培养，同时设置靶细胞和未转染CAR元件T细胞混合的阴性对照组(NT)。实验设置最大释放量孔，实验结束时通过反复冻融裂解细胞，取细胞上清检测荧光值即为最大释放量荧光值。18小时后在培养体系中加入萤光素酶反应底物，检测荧光值，通过以下公式计算杀伤效率：杀伤效率＝实验孔荧光值/最大释放量孔荧光值x100％。实验分组及结果见图8。实验数据显示，在各效靶比下，P3D9-CAR-T细胞对靶细胞的杀伤率均高于阳性对照YP7-CAR-T细胞，而P3H10-CAR-T细胞在效靶比为5:1和10:1时杀伤率均低于阳性对照YP7-CAR-T细胞。
实施例7GPC3×CD3双特异抗体对T细胞信号的激活能力检测
1.双特异性抗体制备
将下表所述抗体序列构建于pTT5真核表达载体，转染HEK293细胞，表达6天后收集上清通过protein A亲和层析纯化。SEC-HPLC检测显示两个抗体的单体含量均约为90％，可用于对T细胞信号激活能力的检测。
表5双特异性抗体序列
双特异性抗体名称 序列编号
实验系统对照双抗(PSMA×CD3) SEQ ID NO:47
P3D9双抗(GPC3×CD3) SEQ ID NO:48
YP7双抗(GPC3×CD3) SEQ ID NO:49
2.PSMA×CD3双特异抗体靶细胞构建
通过化学合成的方式合成人前列腺特异性膜抗原(PSMA)(UniProtKB/Swiss-Protaccession No.Q04609)的第1位甲硫氨酸至第750位丙氨酸区间的基因序列。通过分子克隆，将PSMA基因片段扩增产物用TaKaRa无缝克隆试剂盒克隆到慢病毒包装主质粒(PCCL-LUC-GFP)并包装慢病毒，转导HEK293T细胞。以GFP荧光标记通过流式分选仪(SONY SH800)挑选单克隆细胞系作为PSMA×CD3双特异抗体靶细胞。
3.构建jurkat-NFTA luc报告系统稳转细胞系
将pGL4.3[luc2P/NFAT-RE](Promega)质粒转染Jurkat细胞后用200ug/ml潮霉素加压筛选，长期培养后通过流式分选仪(SONY SH800)挑选单克隆细胞系作为Jurkat-NFATluc报告细胞。
4.T细胞信号刺激检测
双特异性抗体活性的定性分析拟采用终浓度为1E4 pM、1E3 pM、0pM三个浓度梯度进行试验，将1640完全培养基预先配置为5E4 pM和5E3 pM两个浓度。将靶细胞重悬为1E6个细胞/ml，按每孔40ul体积加入96孔板中，再将Jurkat-NFAT luc重悬为1E6个细胞/ml，按每孔40ul体积加入已有靶细胞的96孔板中，将各梯度含抗体的培养基按每孔20ul体积加入96孔板中(0pM组加入培养基)，混合共孵育五小时。
从培养箱中取出待测细胞培养板，室温放置20min左右，使培养板温度平衡至室温。每孔加入100μL平衡至室温的One-Lite TM检测试剂，等待约5min使细胞充分裂解，转移180ul到96孔白板中，酶标仪进行读数。选择酶标仪的发光检测模块，在加入检测试剂后的15min内完成读板。实验系统对照双抗组的荧光信号值随着抗体浓度的提高而显著提高表明jurkat T细胞信号受到了基于双抗的靶向刺激，在P3D9双抗组中荧光信号随着抗体浓度提高而升高证明该双抗能有效刺激Jurkat T细胞，在YP7双抗组中各浓度梯度均未观测到荧光信号的升高表明该抗体结构在所述浓度时无法有效刺激Jurkat T细胞。该实验通过定性分析确定P3D9双抗具生物学活性，实验结果详见下表：
表6T细胞信号刺激检测结果
Figure BDA0003401066230000351
序列表
<110> 天辰生物医药（苏州）有限公司
<120> 靶向GPC3的抗原结合蛋白
<130> 0125-PA-021
<160> 49
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3H10 VH
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Glu Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Ser Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3H10 VL
<400> 2
Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe His Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P1C7 VH
<400> 3
Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile His Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Glu Ile Thr Thr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P1C7 VL
<400> 4
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P2G10 VH
<400> 5
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Thr Gly Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ile Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Pro Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P2G10 VL
<400> 6
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3A8 VH
<400> 7
Gln Val Gln Met Lys Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Pro Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Arg Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3A8、P3G4 VL
<400> 8
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3G4 VH
<400> 9
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Pro Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Thr Gly Tyr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9 HCDR3
<400> 10
Ser Thr Met Val Ser Thr Lys Gly Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9 HCDR2
<400> 11
Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Asp Ile Tyr Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9 HCDR1
<400> 12
Asp Thr Tyr Met His
1 5
<210> 13
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9 H-FR1
<400> 13
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
20 25 30
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9 H-FR2
<400> 14
Trp Val Arg Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9 H-FR3
<400> 15
Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Phe Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg
20 25 30
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9 H-FR4
<400> 16
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9VH
<400> 17
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Asp Ile Tyr Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Phe Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Thr Met Val Ser Thr Lys Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9 LCDR3
<400> 18
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9 LCDR2
<400> 19
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9 LCDR1
<400> 20
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 21
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9 L-FR1
<400> 21
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9 L-FR2
<400> 22
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 23
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9 L-FR3
<400> 23
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9 L-FR4
<400> 24
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
1 5 10
<210> 25
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9 VL
<400> 25
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 26
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P4F12 VH
<400> 26
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Val Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Val Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 27
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P4F12 VL
<400> 27
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Gly
20 25 30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 28
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P1F6 VH
<400> 28
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Asp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 29
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P1F6 VL
<400> 29
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Ile Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ala Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Arg Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr Tyr Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 30
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GPC3序列25-559位
<400> 30
Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser
1 5 10 15
Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro
20 25 30
Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys
35 40 45
Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn
50 55 60
Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile
65 70 75 80
Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg
85 90 95
His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser
100 105 110
Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val
115 120 125
Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn
130 135 140
Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn
145 150 155 160
Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly
165 170 175
Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met
180 185 190
Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala
195 200 205
Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe
210 215 220
Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr
225 230 235 240
Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val
245 250 255
Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp
260 265 270
Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg
275 280 285
Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His
290 295 300
Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr
305 310 315 320
Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala
325 330 335
Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala
340 345 350
His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile
355 360 365
Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr
370 375 380
Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn
385 390 395 400
Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly
405 410 415
Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu
420 425 430
Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu
435 440 445
Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu
450 455 460
Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu
465 470 475 480
Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu
485 490 495
Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro
500 505 510
Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe
515 520 525
His Asn Leu Gly Asn Val His
530 535
<210> 31
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人IgG1重链恒定区99-330位
<400> 31
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 融合蛋白信号肽
<400> 32
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 33
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8α信号肽
<400> 33
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Thr Gly
20
<210> 34
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv抗体（P3D9）
<400> 34
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
130 135 140
Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
145 150 155 160
Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
165 170 175
Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Asp Ile Tyr Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
180 185 190
Gly Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Phe Ser Asn Thr Ala Tyr Leu
195 200 205
Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
Arg Ser Thr Met Val Ser Thr Lys Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
245
<210> 35
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8α铰链区
<400> 35
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
35 40 45
<210> 36
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8α跨膜区
<400> 36
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 37
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB胞质区
<400> 37
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
1 5 10 15
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
20 25 30
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
35 40 45
<210> 38
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3z胞质区
<400> 38
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
1 5 10 15
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
20 25 30
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
35 40 45
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
50 55 60
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
65 70 75 80
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
85 90 95
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 39
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基于P3D9序列的CAR的完整序列
<400> 39
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Thr Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ala
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu
145 150 155 160
Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly
165 170 175
Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Asp
180 185 190
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Asp Ile
195 200 205
Tyr Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr
210 215 220
Phe Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp
225 230 235 240
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Thr Met Val Ser Thr Lys Gly
245 250 255
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325 330 335
Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
340 345 350
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
355 360 365
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
370 375 380
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
385 390 395 400
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
405 410 415
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
420 425 430
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
435 440 445
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
450 455 460
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
465 470 475 480
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
485 490 495
Pro Arg
<210> 40
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基于P3H10序列的CAR的完整序列
<400> 40
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Thr Gly Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Phe His Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Ser
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu
145 150 155 160
Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly
165 170 175
Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Glu Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val
180 185 190
His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Ser Thr
195 200 205
Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys
210 215 220
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp
225 230 235 240
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly
245 250 255
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
260 265 270
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
275 280 285
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
290 295 300
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe
325 330 335
Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340 345 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355 360 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370 375 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
420 425 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450 455 460
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
465 470 475 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 41
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基于P2G10序列的CAR的完整序列
<400> 41
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Thr Gly Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu
20 25 30
Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu
50 55 60
Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser
65 70 75 80
Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu
145 150 155 160
Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly
165 170 175
Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly
180 185 190
Lys Gly Leu Gln Trp Met Gly Trp Ile Asp Thr Gly Thr Gly Glu Pro
195 200 205
Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Ile Ala Phe Ser Leu Glu Thr
210 215 220
Ser Ala Ser Thr Ala Phe Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp
225 230 235 240
Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Pro Trp Gly Gln Gly Thr Ser
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
275 280 285
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
290 295 300
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
305 310 315 320
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 42
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基于P1C7序列的CAR的完整序列
<400> 42
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Thr Gly Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
145 150 155 160
Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe
165 170 175
Thr Phe Thr Thr Tyr Thr Ile His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln
180 185 190
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile His Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ile
195 200 205
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
210 215 220
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
225 230 235 240
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Glu Ile Thr Thr Pro Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg
325 330 335
Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
340 345 350
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
355 360 365
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
370 375 380
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
385 390 395 400
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
405 410 415
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
420 425 430
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
435 440 445
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
450 455 460
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
465 470 475 480
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 43
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基于P1F6序列的CAR的完整序列
<400> 43
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Thr Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu
20 25 30
Thr Leu Ser Val Ile Ile Gly Gln Pro Ala Ala Ile Ser Cys Lys Ser
35 40 45
Ser Gln Arg Leu Leu Asn Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu
50 55 60
Phe Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser
65 70 75 80
Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr Tyr Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser
145 150 155 160
Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly
165 170 175
Asp Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly
180 185 190
Asn Lys Leu Glu Tyr Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr
195 200 205
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser
210 215 220
Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Asp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Ser
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
275 280 285
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
290 295 300
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
305 310 315 320
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 44
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基于P4F12序列的CAR的完整序列
<400> 44
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Thr Gly Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu
20 25 30
Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu
50 55 60
Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser
65 70 75 80
Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu
145 150 155 160
Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly
165 170 175
Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly
180 185 190
Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Val Thr Gly Glu Pro
195 200 205
Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr
210 215 220
Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp
225 230 235 240
Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Thr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
275 280 285
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
290 295 300
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
305 310 315 320
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 45
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基于P3G4序列的CAR的完整序列
<400> 45
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Thr Gly Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Glu
145 150 155 160
Val Val Arg Pro Gly Val Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly
165 170 175
Tyr Thr Phe Thr Asp Phe Pro Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala
180 185 190
Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asn Thr
195 200 205
Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys
210 215 220
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Asp Asp
225 230 235 240
Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ser Thr Gly Tyr Asp Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val
325 330 335
Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
340 345 350
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
355 360 365
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
370 375 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420 425 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435 440 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450 455 460
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
465 470 475 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 46
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基于P3A8序列的CAR的完整序列
<400> 46
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Thr Gly Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Met Lys Gln Ser Gly Pro Glu
145 150 155 160
Val Val Arg Pro Gly Val Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly
165 170 175
Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Pro Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala
180 185 190
Gln Ser Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr
195 200 205
Lys Tyr Asn Arg Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
210 215 220
Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp
225 230 235 240
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Leu Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val
325 330 335
Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
340 345 350
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
355 360 365
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
370 375 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420 425 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435 440 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450 455 460
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
465 470 475 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 47
<211> 986
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 实验系统对照双抗（PSMA×CD3）
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ile Ile
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Pro Leu Leu Arg His Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys
145 150 155 160
Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Val Tyr Trp
180 185 190
Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Tyr Asp Gln Gln Leu Ile Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala
260 265 270
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln
275 280 285
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr
290 295 300
Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr
305 310 315 320
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn
325 330 335
Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn
340 345 350
Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
355 360 365
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr
385 390 395 400
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly
405 410 415
Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly
420 425 430
Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly
435 440 445
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
450 455 460
Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val
465 470 475 480
Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
485 490 495
Val Leu Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
515 520 525
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
530 535 540
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
545 550 555 560
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu
565 570 575
Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
580 585 590
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
595 600 605
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
610 615 620
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
625 630 635 640
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
645 650 655
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
660 665 670
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
675 680 685
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
690 695 700
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
705 710 715 720
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
725 730 735
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
740 745 750
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
755 760 765
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
770 775 780
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
785 790 795 800
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
805 810 815
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu
820 825 830
Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu
835 840 845
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
850 855 860
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
865 870 875 880
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
885 890 895
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
900 905 910
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
915 920 925
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
930 935 940
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
945 950 955 960
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
965 970 975
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
980 985
<210> 48
<211> 989
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P3D9双抗 （GPC3×CD3）
<400> 48
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
130 135 140
Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
145 150 155 160
Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
165 170 175
Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Asp Ile Tyr Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
180 185 190
Gly Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Phe Ser Asn Thr Ala Tyr Leu
195 200 205
Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
Arg Ser Thr Met Val Ser Thr Lys Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
245 250 255
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu
260 265 270
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp
275 280 285
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg
290 295 300
Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp
305 310 315 320
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
325 330 335
Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg
340 345 350
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly
355 360 365
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
370 375 380
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro
385 390 395 400
Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser
405 410 415
Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln
420 425 430
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu
435 440 445
Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys
450 455 460
Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr
465 470 475 480
Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr
485 490 495
Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
500 505 510
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
515 520 525
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
530 535 540
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
545 550 555 560
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
565 570 575
Cys Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr
580 585 590
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
595 600 605
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
610 615 620
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
625 630 635 640
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
645 650 655
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
660 665 670
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
675 680 685
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
690 695 700
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
705 710 715 720
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly
725 730 735
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
740 745 750
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
755 760 765
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
770 775 780
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
785 790 795 800
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
805 810 815
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
820 825 830
Pro Cys Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu
835 840 845
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
850 855 860
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
865 870 875 880
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
885 890 895
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900 905 910
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
915 920 925
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930 935 940
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
945 950 955 960
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
965 970 975
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
980 985
<210> 49
<211> 987
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> YP7双抗 （GPC3×CD3）
<400> 49
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Val Val Ser Ile Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Met Val Gln Pro Glu Gly
130 135 140
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Asn
145 150 155 160
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ala Arg Ile Arg Asn Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
180 185 190
Ser Val Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
195 200 205
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Ile Glu Asp Thr Ala Met Tyr
210 215 220
Tyr Cys Val Ala Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
260 265 270
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
275 280 285
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys
290 295 300
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe
305 310 315 320
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn
325 330 335
Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly
340 345 350
Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
355 360 365
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu
385 390 395 400
Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr
405 410 415
Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro
420 425 430
Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro
435 440 445
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Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu
580 585 590
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
595 600 605
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
610 615 620
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
625 630 635 640
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
645 650 655
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
660 665 670
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
675 680 685
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
690 695 700
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
705 710 715 720
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
725 730 735
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
740 745 750
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
755 760 765
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
770 775 780
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
785 790 795 800
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
805 810 815
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys
820 825 830
Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val
835 840 845
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
850 855 860
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
865 870 875 880
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
885 890 895
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
900 905 910
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
915 920 925
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
930 935 940
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
945 950 955 960
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
965 970 975
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
980 985

Claims (10)

1.分离的抗原结合蛋白，其包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH包含SEQID NO:17所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VL中的至少一个CDR，所述VL包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其能够特异性结合磷脂酰肌醇蛋白多糖3(GPC3)。
4.嵌合抗原受体，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，所述抗原结合结构域包含权利要求1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
5.免疫效应细胞，其包含权利要求4所述的嵌合抗原受体。
6.分离的核酸分子，其编码权利要求1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求4所述的嵌合抗原受体。
7.载体，其包含权利要求6所述的核酸分子。
8.细胞，其包含权利要求6所述的核酸分子或权利要求7所述的载体。
9.药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的抗原结合蛋白，权利要求4中所述的嵌合抗原受体或权利要求5所述的免疫效应细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
10.权利要求1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求4中所述的嵌合抗原受体和/或权利要求5中所述的免疫效应细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症，其中所述疾病和/或病症包含肿瘤。
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