ES2260757T3

ES2260757T3 - Secuencias de nucleotidos para el control de la expresion de secuencias de adn en un huesped celular.

Info

Publication number: ES2260757T3
Application number: ES94915589T
Authority: ES
Inventors: Didier Lereclus; Herve Agaisse
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1993-05-05
Filing date: 1994-05-05
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2014-05-05
Also published as: WO1994025612A2; EP0698105A1; FR2704860B1; US6555366B1; ATE320500T1; DE69434663T2; US20030166116A1; PT698105E; DK0698105T3; WO1994025612A3; JPH08509609A; CA2162158A1; DE69434663D1; FR2704860A1; US6140104A; EP0698105B1; US20060014942A1; AU693790B2; AU6724194A

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS DE BACTERIAS, PARTICULARMENTE DE BACTERIAS GRAM{SUP+} TALES COMO BACTERIAS DE TIPO BACILO Y MAS PARTICULARMENTE A SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS DEL GEN CRYIIIA PARA EL CONTROL DE LA EXPRESION DE SECUENCIAS DE ADN EN UN HUESPED CELULAR. LA INVENCION SE REFIERE PARTICULARMENTE A UN SISTEMA DE EXPRESION QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA DE ADN SUSCEPTIBLE DE INTERVENIR EN EL CONTROL DE LA EXPRESION DE UNA SECUENCIA CODIFICANTE DE NUCLEOTIDOS. ESTA SECUENCIA DE ADN COMPRENDE UN PROMOTOR, ASI COMO UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS LLAMADA "REGION CORRIENTE ABAJO", SITUADA ENTRE EL PROMOTOR Y LA SECUENCIA CODIFICANTE DEL GEN A EXPRESAR, Y SUSCEPTIBLE DE DESEMPEÑAR UN PAPEL A NIVEL POSTRANSCRIPCIONAL DURANTE LA EXPRESION DEL GEN. DE MANERA PREFERIDA, LA REGION CORRIENTE ABAJO COMPRENDE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA S" QUE COMPRENDE UNA REGION ESENCIALMENTE COMPLEMENTARIA EN EL EXTREMO 3'' DEL ARN 16S DE LOS RIBOSOMAS DE BACTERIAS DE TIPO BACILO.

Description

Secuencias de nucleótidos para el control de la expresión de secuencias de ADN en un huésped celular.

La invención tiene por objeto secuencias de nucleótidos de bacterias, particularmente de bacterias Gram^{+}, como las bacterias de tipo Bacillus y más particularmente, secuencias de nucleótidos del gen cryIIIA, para el control de la expresión de secuencias de ADN en un huésped celular.

El gen cryIIIA codifica una toxina específica de los coleópteros y que se expresa débilmente en Bacillus thuringiensis cuando es clonado en un plásmido con una escaso número de copias.

Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram positiva que produce cantidades significativas de proteínas cristalinas, con una actividad tóxica respecto de las larvas de los insectos. Se conocen dos grupos de proteínas cristalinas, establecidos según las secuencias de aminoácidos y las especificidades de toxicidad:

1): el tipo de toxinas Cry (I, II, III, etc....) que tienen similitudes de estructura;

2): el tipo de toxinas Cyt, que no está emparentado con el tipo cry (Höfte, H., et al, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255).

Estas toxinas de B. thuringiensis son interesantes de forma general con vistas a la elaboración de biopesticidas, e igualmente en la medida en que la síntesis de las proteínas cristalinas se conoce para coordinarse perfectamente con la fase de esporulación del organismo, haciendo interesante este organismo para el estudio de la regulación genética en las bacterias Gram^{+} esporulantes.

Se han descrito distintos mecanismos implicados en la regulación de la síntesis de las proteínas cristalinas de B. thuringiensis. El alto nivel de expresión de estas proteínas se atribuye, por lo menos en parte, a la estabilidad del ARNm. Ciertos autores han atribuido la estabilidad de este ARNm a la presencia corriente abajo del gen de la toxina, de una estructura que juega un papel de finalizador que podría actuar como un retro-regulador positivo protegiendo el extremo 3' del ARNm de la degradación por las nucleasas, aumentando de este modo la semivida biológica de los transcritos. (Wong, H.C. et al, 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3233-3237).

Se ha postulado igualmente la presencia de polipéptidos implicados en la síntesis de proteínas cristalinas, polipéptidos que actuarían dirigiendo el repliegue de la proteína bajo forma de una proteína con una conformación estable, o bien, para proteger estas proteínas de la degradación proteolítica.

Estudios con el microscopio electrónico y estudios bioquímicos de la esporulación de B. thuringiensis muestran que la producción de la proteína cristalina depende de la esporulación y se sitúa en el compartimiento de la célula madre (Ribier, J. et al, 1973, Ann. Inst.Pasteur 124A:311-344).

Recientemente, se aislaron y caracterizaron 2 factores sigma, sigma 35 y sigma 28, que dirigen específicamente la transcripción de los genes cryIA. Estas secuencias de aminoácidos muestran una identidad del 88 y del 85% con los factores sigma E y sigma K de Bacillus subtilis, respectivamente (Adams, L.F., 1991. J. Bacteriol. 173:3846-3854). Estos factores sigma se producen exclusivamente en las células esporulantes y pueden funcionar en el compartimiento de la célula madre, confirmando que la expresión de los genes de la proteína cristalina está controlada en el espacio y en el tiempo. De este modo, en la técnica anterior, se ha concluido que la expresión del gen a lo largo del tiempo está asegurada, por lo menos en parte, por la activación sucesiva de los factores sigma, específicos de la esporulación. Hasta ahora, se han identificado tres grupos de promotores. Dos de estos grupos comprenden promotores reconocidos por factores sigma determinados, y según la técnica anterior, los factores sigma relacionados con el tercer grupo de promotores (de los cuales el del gen cryIIIA), no se han identificado (Lereclus, D., et al 1989, American Society for Microbiology, Washington, D.C.).

Finalmente, el número de copias del plásmido que transporta el gen, parece constituir un factor importante para la expresión del gen cry en B. thuringiensis. En la cepa salvaje de B. thuringiensis los genes cry se localizan en plásmidos de gran tamaño, que se encuentran en un escaso número de copias.

La solicitud de patente europea EP 0 318 143 describe la presencia, en B. thuringiensis var. tenebrionis, de un fragmento BamHI de 5,9 kb, que lleva el gen de la \delta-endotoxina.

Experimentos de clonación de un fragmento HindIII de 3kb, clonado en un plásmido con un escaso número de copias, conducen a una producción escasa de toxinas en una cepa no cristalina (cry) de B. thuringiensis. Por el contrario, se sintetizan grandes cantidades de toxinas cuando el gen es clonado en plásmidos con un elevado número de copias (Arantes, O. et al, 1991). Gene 108:115-119).

Resumen de la invención

La invención tiene por objeto medios que permiten obtener un alto nivel de expresión de la proteína codificada por el gen cryIIIA, y más generalmente, medios que permiten controlar el nivel de expresión de secuencias de ADN que codifican una proteína de interés determinado, en cepas bacterianas, preferentemente cepas Gram^{+}, tales como cepas de Bacillus, pudiéndose obtener esta expresión cuando la secuencia codificante de ADN se sitúa en un vector, en particular en un plásmido con un escaso número de copias.

Generalmente, la invención se refiere a un sistema de expresión que comprende una secuencia de ADN, capaz de intervenir en el control de la expresión de una secuencia codificante de nucleótidos, y que se obtiene asociando dos secuencias de nucleótidos distintos y que intervienen de formas diferentes pero, preferentemente, no disociables, en el control de la expresión de la secuencia codificante. La primera secuencia de nucleótidos presenta una actividad promotora, mientras que la segunda, iniciada por la actividad promotora de la primera, interviene para aumentar la expresión del gen. La secuencia de ADN de la invención permite alcanzar un alto nivel de expresión de la parte codificante de un gen en una bacteria, particularmente una bacteria de tipo Gram^{+}.

La primera secuencia de nucleótidos del sistema de expresión de la presente invención, que se identifica en el ámbito de la presente solicitud como promotor, comprende el promotor de la cepa huésped en la que se introduce el gen que se tiene interés en expresar, o bien (se introduce) un promotor exógeno, funcional en el huésped utilizado. La segunda secuencia de nucleótidos del sistema de expresión de la invención, que se identifica en el ámbito de la presente solicitud como "región corriente abajo", designa cualquier secuencia, que se sitúe preferentemente entre el promotor y la secuencia codificante de un gen que vaya a expresarse, susceptible de jugar un papel, particularmente a nivel post-transcripcional, cuando el gen se exprese. Más particularmente, la región corriente abajo no actúa directamente en la traducción de la secuencia codificante que va a expresarse.

Preferentemente, la región corriente abajo comprende una secuencia nucleotídica, particularmente una secuencia S2 o análoga a S2, que incluye una región esencialmente complementaria del extremo 3' del ARN, particularmente del ARN 16S, de los ribosomas bacterianos, particularmente de las bacterias Gram^{+} de tipo Bacillus.

Los nucleótidos que componen la secuencia de ADN según la invención, pueden ser consecutivos o no en la cadena a partir de la cual se define la secuencia de ADN.

En el ámbito de la presente solicitud, la expresión "secuencia de ADN capaz de intervenir en el control de la expresión de una secuencia codificante de nucleótidos", traduce la capacidad de esta secuencia de ADN para iniciar o bloquear la expresión de la secuencia codificante, o de regular esta expresión, principalmente a nivel de la cantidad del producto expresado.

Una secuencia de ADN según la invención, es tal, que la secuencia codificante de nucleótidos que controla se sitúa inmediatamente corriente abajo, en fase de lectura con ella, o, por el contrario, está separada de esta secuencia de ADN por un fragmento de nucleótidos.

La invención se refiere, por tanto, a una secuencia de ADN de control de la expresión de una secuencia codificante de un gen en una célula huésped, caracterizándose dicha secuencia de ADN porque comprende un promotor, y una secuencia nucleótida o región corriente abajo, situada particularmente corriente abajo de dicho promotor y corriente arriba de dicha secuencia codificante. La secuencia nucleotídica o región corriente abajo incluye una región esencialmente complementaria con el extremo 3' de un ARN ribosómico bacteriano. La secuencia de ADN de la invención es capaz de intervenir para aumentar la expresión de la secuencia codificante, situada corriente abajo, en un huésped celular.

Los inventores han identificado una secuencia de ADN del tipo descrito anteriormente, capaz de intervenir en el control de la expresión de la secuencia codificante del gen cryIIIA, y que permite principalmente obtener un alto nivel de la expresión, cuando la secuencia codificante se sitúa en un plásmido con un escaso número de copias.

La invención se refiere, pues, igualmente, a una secuencia de ADN que se caracteriza por las propiedades siguientes:

-: está comprendida en una cadena de ADN de una longitud de aproximadamente, 1692 pb, delimitada por los sitios de restricción HindIII-PstI (fragmento H_{2}-P_{1}), como el obtenido por digestión parcial del fragmento BamHI de 6 kb, transportado por el gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis, cepa LM79;

-: es capaz de intervenir en el control de la expresión de una secuencia codificante de nucleótidos situada corriente abajo, en un huésped celular, particularmente un huésped celular bacteriano del tipo Bacillus thuringiensis o Bacillus subtilis.

Los sitios de restricción que se mencionan anteriormente se representan en la figura 1.

En el texto que sigue, su utilizarán las abreviaturas H_{n} para designar el sitio HindIII, que comprende la posición "n" con respecto al primer sitio HindIII del fragmento BamH1. Igualmente, la expresión P_{n} designa el sitio PstI en posición "n" con respecto al primer sitio PstI en el fragmento BamH1.

La secuencia de ADN definida anteriormente puede aislarse y purificarse, por ejemplo, a partir del plásmido que transporta el gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis.

El sistema de expresión de cryIIIA comprende una primera secuencia de nucleótidos, o promotor, situada entre los sitios TaqI y PacI (posiciones 907 a 990), y una segunda secuencia de nucleótidos o "región corriente abajo" comprendida entre los sitios XmnI y TaqI (posiciones 1179 a 1559), tal como se muestra en la Figura 6. La presencia de dos secuencias de este tipo se prefiere para obtener un nivel óptimo de expresión del gen cryIIIA o de otro gen situado bajo el control de este sistema de expresión.

Pertenece igualmente al ámbito de la invención un vector de expresión caracterizado porque está modificado en uno de sus sitios por una secuencia de ADN como la descrita anteriormente, de forma que dicha secuencia de ADN interviene en el control de la expresión de una secuencia codificante determinada de nucleótidos.

Un vector de la invención puede ser preferentemente un plásmido, por ejemplo, un plásmido de tipo replicativo.

Un vector particularmente ventajoso es el plásmido pHT7902'lacZ, depositado en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes-Paris- France) el 20 de abril de 1993, con el nº I-1301.

La invención tiene igualmente por objeto un huésped celular recombinante, caracterizado porque está modificado por una secuencia de ADN tal como la que se ha definido anteriormente, o por un vector de expresión recién descrito. Un huésped celular particularmente ventajoso es la cepa 407-OA::Km^{R} (pHT305P), depositada en la CNCM el 3 de mayo de 1994, con el nº I-1412.

Descripción detallada de la invención

La invención tiene por objeto una secuencia de ADN capaz de influenciar la expresión de la parte codificante de un gen, en una célula huésped bacteriana. Más particularmente, la invención se refiere a la asociación de dos secuencias de nucleótidos, es decir, de un promotor y una región corriente abajo, capaz de intervenir a nivel post-transcripcional, cuando tiene lugar la expresión de la parte codificante de un gen.

El sistema de expresión de la invención, que, como se describirá con mayor detalle a continuación, implica verdaderamente la hibridización de una parte de la región corriente abajo al extremo 3' del ARN 16S de un ribosoma bacteriano, puede utilizarse para la expresión de genes en diversas células huésped. Esta utilización extendida del sistema de expresión de la invención, es posible, dada la importante homología observada a nivel de los diversos ARN 16S de los ribosomas bacterianos. Habiendo determinado los inventores las regiones esenciales para su funcionamiento, el sistema de expresión de la presente invención puede utilizarse, pues, en cualquier tipo de bacterias huéspedes, formando parte de los conocimientos del experto en la materia, los ajustes necesarios.

De manera general, y sin querer implicarse, por razones que se harán evidentes más adelante, el sistema de expresión de la presente invención, cuando se utiliza para la expresión de genes en de bacterias Gram^{+} de tipo Bacillus, está situado corriente arriba de la parte codificante del gen que va a expresarse. Más particularmente, la región corriente abajo está situada de modo normal inmediatamente corriente arriba del gen, mientras que se puede considerar otra posición para este último. Se puede considerar el desplazamiento de la región situada corriente abajo, cuando el sistema se utiliza en una célula huésped de tipo E. coli, en la que los ARNm son degradados en sentido inverso. Se puede igualmente considerar la utilización de una región situada corriente abajo, corriente abajo y corriente arriba de la secuencia codificante, lo que permitiría la "protección" de la región codificante por un mecanismo que se describirá con mayor detalle a continuación.

Según una primera forma de realización preferida de la invención, la secuencia de ADN corresponde a la cadena HindIII-PstI (H_{2}-P_{1}) descrita anteriormente y que comprende dos secuencias de nucleótidos (un promotor y una región situada corriente abajo) que tienen funciones distintas.

Según una forma de realización particularmente ventajosa de la invención, la secuencia de ADN corresponde a la cadena de nucleótidos designados por la expresión SEC. Nº 1 y que corresponden al fragmento de ADN que comprende los nucleótidos 1 a 1692 de la secuencia que se representa en la figura 3.

El promotor y la región situada corriente abajo de la secuencia de ADN de la invención, se describen con mayor detalle a continuación.

Secuencias de nucleótidos que presentan una actividad promotora

Preferentemente, una secuencia de ADN de la invención, interviene a nivel del control de la transcripción.

Se trata aquí de secuencias de nucleótidos identificadas anteriormente como el promotor. De forma general, y tal como se ha mencionado precedentemente, el promotor se sitúa corriente arriba de la región situada corriente abajo, y por tanto, a una cierta distancia de la región codificante del gen. Sin embargo, se puede considerar el desplazamiento del promotor, de forma que permanece localizado corriente arriba de la región situada corriente
abajo.

En cuanto a la naturaleza del promotor, parece preferible utilizar un promotor que provenga de la célula huésped utilizada para la expresión del gen de interés. Sin embargo, puede estar indicado, en ciertas situaciones, utilizar un promotor exógeno. Por ejemplo, pueden utilizarse promotores tales como los promotores de los genes degQ, \lambdaPL, lacZ, CryI, cryIV, o del \alpha-amileno.

En el contexto de la presente invención, fragmentos particularmente preferidos y que comprenden una región promotora, son los siguientes fragmentos, representados en la figura 1:

-: la cadena delimitada por los sitios de restricción TaqI-PaqI; por razones de comodidad de lenguaje, se ha denominado por PacI el extremo de este fragmento, que se encuentra en realidad en el nucleótido 990 de la secuencia de la figura 3, mientras que el sitio PacI se termina en posición 985,

-: o cualquier fragmento de esta cadena, que conserve las propiedades de esta cadena respecto al control de la expresión de una secuencia codificante de nucleótidos.

Más particularmente, cualquier parte de por lo menos 10 nucleótidos naturalmente consecutivos, o no, de esta cadena, y capaz de intervenir en el control de la expresión de una secuencia codificante de nucleótidos, situada corriente abajo en un huésped celular, constituye una forma de realización preferida de la invención. Por ejemplo, en el interior de la secuencia mencionada anteriormente, se encuentran las secuencias -35 (TTGCAA) y -10 (TAAGCT) del promotor.

Según otra forma de caracterización de la invención, las secuencias de ADN "de control" y que comprenden el promotor, que se ha considerado anteriormente, se caracterizan por su cadena de nucleótidos. A este respecto, la invención tiene principalmente como objeto las secuencias de ADN que corresponden a las cadenas siguientes:

- la secuencia de ADN que corresponde a la cadena SEC nº 3 que corresponde al fragmento que comprende los nucleótidos 907 a 990 de la secuencia que se representa en la figura 3, o una variante que comprende los nucleótidos 907 a 985.

La invención tiene asimismo por objeto secuencias de ADN que se hibridizan en condiciones no rigurosas, tal como se definen a continuación, con una de las cadenas descritas anteriormente. En este caso, una de las cadenas que se han descrito anteriormente se utiliza como sonda.

Secuencias de la región situada corriente abajo

Una secuencia de la invención, que se incluye en la región situada corriente abajo, se selecciona por su capacidad para intervenir para aumentar la expresión de un gen, que se iniciaría por un promotor situado corriente arriba de esta secuencia. Se trata verdaderamente de una secuencia capaz de intervenir a nivel post-transcripcional cuando tiene lugar la expresión de una secuencia codificante.

Efectivamente, los resultados experimentales obtenidos por los inventores, parecen indicar que el efecto post-transcripcional de la región situada corriente abajo, definida anteriormente, resulta, por lo menos cuando tiene lugar la expresión del gen cryIIIA, de la hibridización entre el ARN ribosómico 16S de la célula huésped, y una secuencia S2 del ARN mensajero de cryIIIA. Parece que el ribosoma o una parte suya se fija sobre esta región situada corriente abajo, y protege de este modo al ARNm de una degradación exonucleásica iniciada en 5'. Esta fijación tendría, pues, como efecto, aumentar la estabilidad de los mensajeros y aumentar de esta forma el nivel de expresión del gen
clonado.

Uno de los fragmentos particularmente preferido en el ámbito de la realización de la invención, y que puede utilizarse como la región situada corriente abajo, es el fragmento siguiente, que se representa en la figura 1:

-: la cadena delimitada por los sitios de restricción XmnI-TaqI (posiciones 1179 a 1556),

-: o cualquier fragmento de esta cadena que conserve las propiedades de ésta, respecto al control de la expresión de una secuencia codificante de nucleótidos.

Según otra forma de caracterización de la invención, las secuencias de ADN "de control" que comprenden la región situada corriente abajo, que se ha considerado anteriormente, se caracterizan por su cadena de nucleótidos. A este respecto, la invención tiene principalmente por objeto las secuencias de ADN que corresponden a las cadenas siguientes:

-: la secuencia de ADN que corresponde a la cadena SEC nº 4 que corresponde al fragmento que comprende los nucleótidos 1179 a 1559 de la secuencia que se representa en la figura 3,

-: la secuencia de ADN que corresponde a la cadena SEC nº 5 que corresponde al fragmento que comprende los nucleótidos 1179 a 1556 de la secuencia que se representa en la figura 3,

-: la secuencia de ADN que corresponde a la cadena SEC nº 11 que corresponde al fragmento que comprende los nucleótidos 1413 a 1556 de la secuencia que se representa en la figura 3,

-: la secuencia de ADN que corresponde a la cadena SEC nº 8 que corresponde al fragmento que comprende los nucleótidos 1413 a 1461 de la secuencia que se representa en la figura 3,

-: la secuencia de ADN que corresponde a la cadena SEC nº 9 que corresponde al fragmento de ADN siguiente:

1

-: la secuencia de ADN que corresponde a la cadena SEC nº 10 que corresponde al fragmento de ADN siguiente:

2

La invención tiene asimismo por objeto secuencias de ADN que se hibridizan en condiciones no rigurosas, tal como se definen a continuación, con una de las cadenas descritas anteriormente. En este caso, una de las cadenas descritas anteriormente se utiliza como sonda.

Parece que la región situada corriente abajo comprende, en un primer tiempo, una región denominada "esencial", suficientemente complementaria con el extremo 3' de un ARN ribosómico 16S bacteriano, para permitir la fijación del ribosoma en esta región esencial. Corriente abajo de esta región esencial, llevando el sitio de fijación del ribosoma, se situaría una segunda región, que comprende una estructura suplementaria capaz de tener un efecto positivo adicional a nivel de la expresión de la secuencia codificante. Es posible que esta segunda secuencia impida el movimiento del ribosoma, una vez este último se haya fijado sobre la región esencial.

Por ejemplo, en el sistema de expresión del gen cryIIIA, parece que la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1413 y 1556 de la secuencia que se representa en la figura 3, comprende la región esencial de fijación al ribosoma, así como la segunda región corriente abajo del sitio de fijación. Aunque la segunda región no sea absolutamente esencial para obtener un aumento de la expresión de la secuencia codificante, parece que su supresión reduce los rendimientos de la expresión. Efectivamente, resultados experimentales han demostrado que la supresión de la región que se sitúa entre los nucleótidos 1462 y 1556 de la secuencia que se representa en la figura 3, conlleva una ligera disminución de la expresión de la secuencia codificante.

Parece que la longitud mínima de la secuencia de nucleótidos que permite una fijación adecuada del ribosoma, sea de aproximadamente 10 ácidos nucleicos. La invención tiene, pues, por objeto cualquier parte de por lo menos 10 nucleótidos naturalmente consecutivos o no, de la cadena H_{2}-P_{1,} capaz de controlar en un huésped celular de tipo Bacillus, la expresión de una secuencia codificante de nucleótidos situados corriente abajo de esta parte de la cadena H_{2}-P_{1}.

En el caso específico del sistema de expresión del gen cryIIIA, parecería que la secuencia de la región "esencial" que incluye el sitio de fijación, fuera la siguiente:

3

Es posible llevar a cabo modificaciones poco importantes en el sitio de fijación, en la medida en que la intensidad de la interacción entre el extremo 3' del ARN 16S del ribosoma, y esta región "esencial" sea suficientemente intensa para que haya hibridización entre el ribosoma y el sitio de fijación. A partir de cálculos de la energía de interacción que pueden llevarse a cabo por el experto en la materia, pueden considerarse modificaciones en el sitio de fijación si la intensidad de la unión es casi igual a la intensidad medida cuando se utiliza la región "esencial" natural.

En el caso del sitio de fijación que se ilustra precedentemente, es posible considerar ciertas modificaciones en los cuatro primeros nucleótidos, así como en el séptimo. Parece, sin embargo, que los nucleótidos en posiciones 5, 6, 8 y 9, sean importantes para asegurar una intensidad de interacción apropiada cuando tiene lugar la hibridización con el ARN 16S del ribosoma.

Conservándose relativamente bien, entre una especie bacteriana y otra, el extremo 3' del ARN 16S del ribosoma bacteriano, el sistema de expresión de la presente invención puede, pues, utilizarse en un gran número de huéspedes bacterianos sin tener que efectuar modificaciones sustanciales.

La invención tiene por objeto, igualmente, una secuencia de ADN caracterizada por las siguientes propiedades:

-: está contenida en una cadena de nucleótidos que se hibridiza en condiciones no rigurosas con el fragmento de ADN comprendido entre los nucleótidos 1413 y 1559 de la secuencia representada en la figura 3;

-: es susceptible de intervenir en el control de la expresión de una secuencia codificante, en una célula huésped, principalmente de una secuencia codificante de un polipéptido de Bacillus, tóxico respecto a los insectos, o de una secuencia codificante de un polipéptido que se expresa durante la fase estacionaria de Bacillus.

Una secuencia que codifica un polipéptido de Bacillus, tóxica respecto a las larvas de insectos, es, por ejemplo, una secuencia comprendida en el gen cryIIIB de B. thuringiensis.

Una secuencia de ADN que responde a esta definición, puede identificarse utilizando iniciadores oligonucleotídicos.

Una hibridización en condiciones no rigurosas entre la secuencia de ADN que se ensaya y el fragmento de ADN comprendido entre los nucleótidos 1413 y 1559 de la secuencia de la figura 3, utilizada como sonda, se realizará de la manera siguiente:

La sonda ADN y las secuencias fijadas sobre un filtro de nitrocelulosa o sobre un filtro de nylon se hibridizan a 42ºC durante 18 horas con agitación, en presencia de formamida (30%), de SSC 5X de la solución de Denhardt 1X, La solución de Denhardt 1X está compuesta de 0,02% ficoll, de 0,02% de polivinilpirrolidona y de 0,02% de suero de albúmina bovina. El SSC 1X está compuesto de NaCl 0,15 M y de citrato sódico 0,015 M. Después de la hibridización, el filtro se lava sucesivamente a 42ºC durante 10 minutos en cada de las soluciones siguientes:

-: Formamida (30%), SSC 5X

-: SSC 2X

-: SSC 1X

-: SSC 0,5X

Las condiciones de hibridización descritas anteriormente son las que son utilizadas para todas las aplicaciones de la presente invención, cuando es necesario.

Las secuencias de ADN según la invención pueden ser, llegado el caso, recombinadas entre ellas o asociadas sobre el vector, en sitios distintos. En particular, se asociarán ventajosamente bajo forma de una cadena única, el fragmento TaqI-PacI al fragmento XmnI-TaqI definidos anteriormente, o aún, el fragmento TaqI-PacI con la cadena SEC nº 8. Dichas secuencias tienen la propiedad ventajosa de permitir un alto nivel de expresión (hasta 60.000 unidades Miller) de la secuencia codificante de nucleótidos, nivel de expresión que puede constatarse con el gen de la \beta-galactosidasa.

Además, en el ámbito de realización de la invención, fragmentos particularmente preferidos son los que se representan en la figura 8B:

-: cadena delimitada por los sitios de restricción TaqI-TaqI,

-: o cualquier fragmento de estas cadenas que conserve las propiedades de estas cadenas respecto al control de la expresión de una secuencia codificante de nucleótidos.

Según otra forma de caracterización de la invención, las secuencias de ADN que se han considerado anteriormente, están caracterizadas por su cadena de nucleótidos. A este respecto, la invención tiene principalmente por objeto las secuencias de ADN q que corresponden a las cadenas siguientes:

-: la cadena SEC nº 2, que corresponde al fragmento que comprende los nucleótidos 907 a 1559 de la secuencia que se representa en la figura 3,

-: la secuencia de ADN que corresponde a la cadena SEC nº 6 que corresponde al fragmento que comprende los nucleótidos 907 a 1353 y 1413 a 1556 de la secuencia que se representa en la figura 3,

-: la secuencia de ADN que corresponde a la cadena SEC nº 7 que corresponde al fragmento que comprende los nucleótidos 907 a 990 y 1179 a 1559 de la secuencia que se representa en la figura 3.

La invención tiene asimismo por objeto secuencias de ADN que se hibridizan en condiciones no rigurosas, tal como se definen anteriormente, con una de las cadenas descritas anteriormente. En este caso, una de las cadenas mencionadas anteriormente, se utiliza como sonda.

Las secuencias de ADN de la invención pueden aislarse y purificarse a partir de Bacillus, principalmente de B. thuringiensis; pueden prepararse igualmente por síntesis, según las técnicas conocidas.

Pertenecen igualmente al ámbito de la invención, las secuencias de ARN que corresponden a las secuencias de ADN descritas anteriormente.

La invención tiene asimismo por objeto una secuencia de ADN recombinante caracterizada porque comprende una secuencia codificante determinada, bajo el control de una secuencia de ADN que responde a una de las definiciones anteriores.

La capacidad de los ADN de la invención para intervenir en el control de la expresión de secuencias de nucleótidos, puede comprobarse llevando a cabo el ensayo siguiente:

-: la secuencia de ADN de la invención de la que se quiere evaluar la capacidad para intervenir en el control de la expresión de una secuencia codificante, se inserta en un plásmido con un número escaso de copias, corriente arriba de una secuencia codificante de nucleótidos.

-: el plásmido preparado de esta forma se utiliza para transformar (por ejemplo, mediante electroporación), una cepa de Bacillus thuringiensis y por ejemplo una cepa de B. thuringiensis HD1 cry^{-}B;

-: la cepa de Bacillus transformada de esta manera se cultiva en condiciones que permiten la expresión de la secuencia codificante de nucleótidos;

-: se detecta el producto de expresión de esta secuencia codificante de nucleótidos, mediante técnicas habituales de medición cualitativa y/o cuantitativa.

Para llevar a cabo este ensayo, la secuencia codificante de nucleótidos será ventajosamente la secuencia codificante del gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis o, por ejemplo, una secuencia que codifique la \beta-galactosidasa.

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Huéspedes celulares

En el ámbito de la invención, pueden utilizarse distintos tipos de huéspedes celulares. Se citarán, como ejemplo, a Bacillus, por ejemplo, Bacillus thuringiensis o Bacillus subtilis. Asimismo, puede considerarse la utilización de células tales como E. coli.

En huéspedes celulares capaces de esporular, la secuencia codificante puede expresarse durante la fase vegetativa o la fase estacionaria de crecimiento, o durante la esporulación.

Un huésped celular interesante en el ámbito de la invención puede estar igualmente constituido por una célula vegetal o animal.

Si esto es necesario o se desea, según la naturaleza de la secuencia codificante de nucleótidos que se exprese, puede igualmente insertarse una secuencia señal en el vector de expresión de la invención, con el fin de que el producto de expresión de la secuencia codificante se exponga en la superficie del huésped celular, o sea exportado a partir de este huésped celular.

De forma igualmente interesante, se podrán utilizar, natural o mutacionalmente, cepas asporógenas de Bacillus, y en particular, cepas de Bacillus subtilis o Bacillus thuringiensis.

Habiendo los inventores puesto en evidencia que las secuencias de ADN de la invención permiten la expresión de una secuencia codificante determinada, independientemente de la fase de esporulación de cepas de tipo Bacillus, un huésped asporógeno puede presentar la ventaja de proporcionar medios de expresión de secuencias codificante capaces de formar parte de las composiciones biopesticidas, cuyos efectos negativos eventuales respecto al entorno, se atenuarían, o se suprimirían.

El huésped asporógeno seleccionado es particularmente ventajoso para expresar una secuencia codificante durante su fase estacionaria de crecimiento, cuando la secuencia codificante está bajo el control de una de las secuencias de la invención.

En el caso de cepas asporógenas de Bacillus obtenidas mediante mutación, un ejemplo que ilustra la eficacia particular de este tipo de cepa para la expresión de una secuencia codificante durante la fase estacionaria de crecimiento, es la construcción de una cepa de B. thuringiensis que ha sufrido mutación para el gen spoOA. Una cepa de B. thuringiensis cuyo gen spoOA se inactiva y que lleva un gen, por ejemplo, un gen de toxina insecticida CryI, cryII, cryIII o cryIV, o incluso, un gen de interés industrial, cuya expresión se pone bajo el control del sistema de expresión de CryIIIA, presenta características ventajosas. Principalmente, la cepa B. thuringiensis 407.0A::Km^{R} (pHT305P), cuya construcción se describe detalladamente más adelante, tiene por lo menos las ventajas siguientes:

a): superproducción de proteínas durante la fase estacionaria de crecimiento;

b): las proteínas (por ejemplo los biopesticidas)quedan incluidos en la célula y mostrarían, por tanto, un aumento de la persistencia en el entorno; y

c): se evitan de este modo los problemas potenciales relacionados con la diseminación de las esporas.

Otras características y ventajas de la invención se pondrán de manifiesto haciendo referencia a los dibujos adjuntos proporcionados a título de ejemplo:

Figura 1

Mapa esquemático de restricción de los plásmidos utilizados

(A) Mapa físico del vector lanzadera pHT304. Las flechas superiores Erm^{R} y Ap^{R} indican la dirección de transcripción de los genes ermC y bla, respectivamente. La flecha y la expresión LacZp indican la dirección de transcripción a partir del promotor del gen LacZ.

ori Bt es la región de replicación del plásmido pHT1030 de B. thuringiensis.

B) Mapa de restricción simplificada de fragmentos que implican el gen cryIIIA. El fragmento A es un fragmento de 6 kb BamHI de B. thuringiensis LM79; los fragmentos de restricción G, P y H se obtuvieron a partir de la digestión parcial mediante HindIII y C se obtuvo después de digestión total con HindIII a partir del fragmento A. Estos fragmentos se clonaron en pHT304 para dar lugar a los derivados pHT305A, pHT305G, pHT305P, pHT305H y pHT305C, respectivamente. El gen cryIIIA (cuadro rayado) y la dirección de la transcripción se indican. Los números bajo cada sitio indican su orden de izquierda a derecha.

Figura 2

Análisis de las proteínas de los transformantes de B. thuringiensis que expresan el gen CryIIIA. Se cargó en cada pocillo un volumen idéntico de muestras (20 \mul). Las líneas 1 a 4 y 6 a 8 de B. thuringiensis Kurstaki HD1 Cry^{-}Btransportan pHT305A, pHT305G, pHT305H, pHT305P, pHT305H\OmegaH_{2}-H_{3,} pHT305C y pHT304, respectivamente. La línea 5 corresponde a los marcadores de peso molecular (desde arriba hacia abajo 97, 66, 60, 43 y 30 kDa). Las flechas indican los componentes del cristal de 73 y 67 kDa.

Figura 3

Secuencia de nucleótidos del extremo 5' de la región corriente arriba del gen cryIIIA

(A) Mapa físico del fragmento H_{2}-P_{1} (H_{2}-H_{3}+H_{3}-P_{1}) en el sentido 5' hacia 3'. Se indican las posiciones de los nucleótidos de los dos sitios HindIII (H_{2} y H_{3}) que delimitan el fragmento señalado con color gris. El segundo segmento secuenciado (fragmento H_{3}-P_{1}) era el fragmento entre el tercer sitio HindIII y el sitio PstI (P_{1}). Se muestra un sitio ATG de iniciación de transcripción de la toxina CryIIIA. La numeración de los nucleótidos se indica respecto al fragmento secuenciado y no respecto al inicio de la transcripción.

(B) Secuencia de nucleótidos del fragmento H_{2}-P_{1}. El codon de iniciación ATG se indica en caracteres en negrita y el extremo del transcrito mayoritario sobre gel, específico del gen cryIIIA, corresponde a T localizado en posición 1413. Otro transcrito empieza en el nucleótido 983; es aparentemente minoritario sobre gel. La secuencia implica como mínimo dos repeticiones invertidas. La numeración de los nucleótidos empieza a partir del segundo sitio HindIII y acaba en el sitio PstI que se muestra en la figura 3A.

Figura 4

Representación de los plásmidos PAF1, pHT304'lacZ, pHT7901'lacZ y pHT7902'lacZ.

Figura 5

Perfil de la actividad \beta-galactosidasa

El crecimiento de las células Bt y las condiciones de procesamiento de las muestras, así como el ensayo, se describen en "Material y Métodos". El tiempo t_{0} indica el final de la fase exponencial y t_{n} es el número de horas antes (-) o después del tiempo cero.

Figura 6

Mapa detallado de restricción de los plásmidos pHT7902'lacZ, 7903'lacZ, 7907'lacZ, 7909'lacZ, 7930'lacZ y 7931'lacZ. Estos plásmidos se insertaron en B. thuringiensis, midiéndose la actividad \beta-galactosidasa en el tiempo t_{6} de esporulación (en unidades Miller). Se observan actividades respectivamente de 30.000, 30.000, 3.500, 2.000, 35.000 y 60.000.

Figura 7

Actividad \beta-galactosidasa en cepas de B. subtilis Spo^{-} y Spo^{+}; los cultivos se realizaron en medio SP.

Figura 8

Mapa esquemático de restricción de las construcciones utilizadas para medir la actividad transcripcional de las regiones del sistema de expresión de cryIIIA, en B. thuringiensis, cepa Kurstaki HD1 Cry^{-}B.

A: Mapa físico del vector pHT304-18Z. las flechas indican el sentido de transcripción de los genes ermC, bla, lacZ y del promotor placZ; y la orientación de la replicación en E. coli (oriEc). ori1030 indica la región de replicación del plásmido pHT1030 (Lereclus y Arantes, Mol. Microbiol. 1992, 7:35-46). SD indica el sitio de fijación de los ribosomas del gen spoVG situado delante del gen lacZ (Perkins y Youngman, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:140-144).

B: Representación física y actividad transcripcional de las diferentes regiones del sistema de expresión de cryIIIA fusionadas con el gen lacZ. La numeración de los nucleótidos se establece según la secuencia de ADN del fragmento H2-P1 que se ha presentado en la Fig. 3B. Las flechas indican la posición de los extremos 5' de los transcritos, tal como se identifican por la prolongación (realizada) por el iniciador. Los trazos con puntos indican la localización de los fragmentos suprimidos. la actividad \beta-galactosidasa de las distintas construcciones se midió en los tiempos t_{0} y t_{6} de la esporulación y se indica en unidades Miller.

Figura 9

Determinación del extremo 5' del transcrito -cryIIIA/lacZ producido por la cepa de B. thuringiensis que lleva el plásmido pHT7815/8'lacZ. El ARN total de las células se extrajo en t_{3} y se sometió a una experiencia de prolongación del iniciador en la transcriptasa inversa, utilizando como iniciador el oligonucleótido siguiente: 5'-CGTAATCTTACGTCAGTAACTTCCACAG-3'. Este oligonucléotido es complementario de la región localizada entre el sitio de fijación de los ribosomas del gen spoVG y el codon de iniciación del gen lacZ. El mismo oligonucleótido se utilizó para determinar la secuencia nucleotídica de la región correspondiente del plásmido pHT7815/8. El extremo 5' se ha numerado según la secuencia de ADN del fragmento H2-P1 que se presenta en la fig 3B.

Figura 10

Mapa físico esquemático de las construcciones utilizadas para medir la actividad post-transcripcional de la región corriente abajo del sistema de expresión de cryIIIA, en B. subtilis, cepa 168. La numeración de los nucleótidos se establece según la secuencia de ADN del fragmento H2-P1 que se ha presentado en la Fig 3B. La flecha indica la posición de inicio de la transcripción, localizado en la posición +984. El asterisco en posición 1421 indica el reemplazo de GGA por CCC. Los trazos con puntos indican la localización de los fragmentos de ADN suprimidos. La actividad \beta-galactosidasa de las distintas construcciones se midió en el tiempo t_{3} de la esporulación, y se indica en unidades Miller.

Figura 11

Secuencia de nucleótidos del gen spoOA de B. thuringiensis, cepa 407

A. Mapa esquemático de restricción del fragmento de ADN de 2,4 kb que lleva el gen spoOA. La flecha indica la orientación de la transcripción del gen spoOA.

B. Secuencia nucleotídica del marco abierto de lectura que implica la secuencia codificante del gen spoOA. El codon de iniciación GTG se indica en negrita. Los dos sitios HincII se subrayan. Los tres puntos representan el codon de detención.

Material y métodos Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento

Se utilizó Escherichia coli K-12 TG1 [\Delta(lac-proAB) supE thi hdsD (F' traD36 proA^{+} proB^{+} lacI^{q} lacZ\DeltaDM15)] Gibson, T.J. et al, 1984. tesis, University of Cambridge, Cambridge, como huésped para la construcción de los plásmidos representados en la figura 1B y para el bacteriófago M13.

Se utilizó E. coli MC1061 [hsdR mcrB araD139\Delta (araABC-leu) 7679 \Delta lacX74 galU galK rpsL thi] (Meissner, P.S. et al 1987. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 84:4171-4175) como huésped para la construcción de los plásmidos representados en la figura 7.

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B. thuringiensis cepa LM 79, que contiene el gen cryIIIA, se aisló y caracterizó por Chaufaux J. et al, 1991. Les colloques de L'INRA. 58:317-324.

Esta cepa pertenece al serotipo 8 y produce cantidades similares de toxinas a las producidas por otras cepas de B. thuringiensis que llevan el gen cryIIIA (Donovan, V.P., et al, 1988. Mol. Gen. Genet. 214:365-372. - Sekar, V., et al, 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7036-7040).

B. thuringiensis de la subespecie Kurstaki HD1 Cry^{-}B se ha utilizado como huésped para los estudios de regulación del gen cryIIIA. Las cepas E. coli se cultivaron a 37ºC en un medio Luria y se transformaron según el procedimiento descrito por Lederberg y Cohen (1974. Bacteriol. 119: 1072-1074).

La cepa B. thuringiensis, especie Kurstaki HD1 Cry^{-}B se cultivó y transformó mediante electroporación según la técnica descrita por Lereclus et al, (1989. FEMS Microbiol. Lett. 60:211-218).

Las concentraciones en antibióticos para la selección de las bacterias eran de 100 \mug/ml para la ampicilina y de 25 \mug/ml para la eritromicina.

Construcciones de plásmidos

El fragmento BamHI de 6 Kb que lleva el gen cryIIIA y las regiones adyacentes, se aisló a partir de B. thuringiensis LM79 y se insertó en el sitio único BamHI de pUC19 para producir pHT791, que se ha utilizado como fuente de ADN para la construcción de los distintos plásmidos utilizados aquí. El plásmido pHT305A se obtuvo mediante inserción del fragmento BamHI de 6 Kb en el sitio único BamHI del vector lanzadera pHT304 (Arantes, O y Lereclus D. 1991, Gene 108:115-119) (Figura 1A). Muestras del fragmento BamHI de 6 Kb se sometieron parcial o completamente a digestión con HindIII y los fragmentos resultantes se clonaron entre los sitios BamHI y HindIII o en el sitio HindIII de pHT304 para dar lugar a los derivados pHT305G, pHT305P, pHT305H y pHT305C (Figura 1). El plásmido pHT305H\OmegaH_{2}H_{3} se obtuvo insertando el fragmento H_{2}-H_{3} lleno en los extremos en el sitio SmaI de pHT305H (fragmento delimitado respectivamente por el segundo y tercer sitios HindIII del fragmento de 6 kb).

El fragmento SmaI-KpnI de 4,5 Kb del plásmido pTV32 (Perkins, J.B. et al, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:140-144) que contiene los genes lacZ ermC, se clonó en pEB111 (Leonhardt, H., et al, 1988. J. Gen. Microbiol. 134:605-609) para dar lugar al plásmido pMC11. El plásmido pHT304'lacZ, utilizado para construir las fusiones de transcripción, se obtuvo clonando el fragmento de restricción DraI-SmaI de 3,2 Kb que contiene el gen lacZ desprovisto de promotor, aislado a partir de pMC11, en el sitio único SmaI de pHT304. El plásmido pHT7901'lacZ se obtuvo clonando el fragmento H_{3}-P_{1} [(HindIII-PstI), ver Figura 3A] entre los sitios únicos HindIII y PstI de pHT304'lacZ. El plásmido pHT7902'lacZ se construyó clonando el fragmento H_{2}-H_{3} (Figura 3A) en el sitio único HindIII de pHT7901'lacZ. La orientación del fragmento H_{2}-H_{3} cartografiando los sitios de restricción HpaI y BalI con relación al sitio PstI. Dos sitios HpaI se localizaron en las posiciones nucleotídicas 50 y 392; el sitio BalI se localizó en la posición nucleotídica 670 (Figura 3). La estructura general de los plásmidos recombinantes que llevan la fusión lacZ se proporciona en la Figura 4.

Manipulaciones del ADN

Se han utilizado procedimientos estándar para extraer los plásmidos a partir de E. coli, para transfectar el ADN recombinante del fago M13 y para purificar el ADN monocatenario (Sambrook J, et al, 1989. A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory-Cold Spring Harbor, N.Y.). Las enzimas de restricción, la ligasa ADN T4 y la T4 polinucleótido quinasa se utilizaron según las recomendaciones del fabricante. El fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I y los desoxirribonucleósidos trifosfatos se utilizaron para que los extremos del fragmento H_{2}-H_{3} sean extremos libres. Los fragmentos de restricción de ADN se purificaron en geles de agarosa utilizando el equipo Prep A gen (Bio Rad). Las secuencias de nucleótidos se determinaron mediante el procedimiento didesoxi de finalización de cadena (Sanger, F., et al, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 175, 1993 USA 74:5463-5467), utilizando los fagos M13mp18 y M13mp19 como matrices, así como el equipo Sequenase versión 2.0 (US Biochemical. Cor. Cleveland, Ohio) y [\alpha-^{35}S] dATP (15 TBq; Amersham, United Kingdom).

Análisis informático

Las secuencias de ADN se analizaron utilizando los programas del Institut Pasteur en un ordenador general de datos MV10000.

Extracción del ARN, Prolongación de los iniciadores, Análisis Northern del ARN y análisis en transferencia puntual

La cepa B. thuringiensis, sub especie Kurstaki HD1 Cry^{-}B (pHT305P) se cultivó en un medio HCT (Lecadet et al, 1980. J. Gen. Microbiol. 121:203-212) a 30ºC con agitación. Las muestras se tomaron en los tiempos t_{0}, t_{3}, t_{6} y t_{9} (t_{0} se define como el principio de la esporulación y t_{n} indica el número de horas después del comienzo de la esporulación). Las células se recuperaron mediante centrifugación, se volvieron a suspender en un medio HCO (Lecadet, M.M., et al, 1980. J. Gen. Microbiol. 121:203-212) que contiene 50 mM de azida de sodio, congelándose inmediatamente a -70ºC hasta la extracción del ARN (Glatron, M.F., et al 1972, Biochimie 54:1291-1301). Para el ensayo de alargamiento del iniciador, se sintetizó un primer oligonucleótido de 39 unidades poliméricas (3'-CTT AGG CTT GTT AGC TTC ACT TGT ACT ATG TTA TTT TTG-5') complementario de la región 3'-1544 a 1583-5' del gen cryIIIA, y su extremo 5' se marcó con [\gamma-^{32}P] dATP (110 TB_{q}/mmol) mediante la T4 polinucleótido quinasa. El oligonucleótido de 39 unidades poliméricas se purificó en una columna Sephadex G-25 (Pharmacia) (incorporación de aproximadamente el 70%), mezclándose con 50 \mug de ARN total para ser utilizado como iniciador.

Un segundo oligonucleótido de 32 unidades poliméricas, complementario de la región que se localiza entre las posiciones 1090 y 1121, se utilizó igualmente como iniciador y ha permitido la detección de un segundo transcrito cuyo inicio de transcripción está situado en la posición 983. Este oligonucleótido corresponde a la secuencia 5'-GTTAGATAAGCATTTGAGGTAGAGTCCGTCCG-3'.

La hibridación (a 30ºC), la prolongación del iniciador y el análisis de los productos, se llevaron a cabo como se describe por Débarbouillé, M., et al (1983, J.Bacteriol. 153:1221-1227). Los iniciadores de 39 y 32 unidades poliméricas se han utilizado para el alargamiento del fragmento H_{3}-P_{1} clonado en M13-mp19 y para el alargamiento del fragmento H_{2}-P_{1} clonado en pHT7902'lacZ, respectivamente. Los productos que resultan de las reacciones, se situaron en geles en paralelo con los productos de transcripción, para determinar los extremos 5' de los transcri-
tos.

Se llevó a cabo un análisis de transferencia Northern con el ARN desnaturalizado, fraccionado mediante electroforesis en geles de agarosa que contenían formaldehído al 1,5%, transfiriéndose bajo vacío a membranas Hybond-N^{+} (Amersham) en 20 X SSC durante 1 hora (1 X SSC corresponde a 150 mM NaCl más 15 mM de citrato sódico, pH 7,0). El fragmento de restricción PstI-EcoRI de 874 bp (interno al gen cryIIIA) se marcó con ^{32}P, con un equipo de traducción de pinchado (Boehringer Mannheim), desnaturalizándose después y utilizándose como sonda. Se llevó a cabo una prehibridización a 42ºC durante 4 horas en un medio que contenía 50% de formamida-1M NaCl-sulfato dodecil sódico al 1% (SDS)-10 x solución de Denhardt-50 mM Tris-HCl (pH 7,5)-PP sódico al 0,1%, ADN espermático de salmón desnaturalizado (\geq 100 \mug/ml), añadiéndose la sonda marcada (10^{8} cpm/\mug) a la solución de prehibridización, prosiguiéndose durante toda la noche la incubación. Se lavó 2 veces la membrana a 65ºC, durante 30 minutos, en 2 X SSC-SDS al 0,5%, una vez en 2 X SSC-SDS al 0,5%, y una vez en 0,5 X SSC-SDS al 0,5%.

Cantidades iguales de ARN de cultivos síncronos de B. thuringiensis, sub especie Kurstaki HD1 Cry^{-}B, que llevan los plásmidos pHT305P o pHT305H, tomadas en el tiempo t_{3}, se depositaron sobre membranas Hybond-C Extra (Amersham), con un dispositivo colector (Schleicher & Schuel), utilizando el protocolo de transferencia puntual descrito por Sambrook et al (Sambrook, J. et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). La sonda y las condiciones de hibridización eran las descritas en los ensayos de transferencia Northern.

Preparación del cristal y análisis

Las células se cultivaron en un medio HCT a 30ºC con agitación, durante 48 horas y los cristales se prepararon según el procedimiento descrito en la publicación Lecadet, M.M., et al (1992. Appl. Environ. Microbiol. 58:840-849), con la excepción del hecho de que la concentración en NaCl era de 150 mM. Para la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (PAGE), se utilizaron 20 \mul de cada muestra (Lereclus, D., et al 1989. (FEMS Microbiol. Lett. 66:211-218).

Ensayo de detección de la \beta-galactosidasa

Las cepas de E. coli y B. thuringiensis que contenían las fusiones de transcripción lacZ, se detectaron depositando sobre el medio sólido, el substrato cromógeno, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido (X-Gal) (40 \mug/ml) y antibióticos apropiados. Las cepas aisladas se cultivaron como se ha indicado, y se recuperaron en los tiempos t_{-2}, t_{-1,} t_{0}, t_{-1,5}, t_{3}, t_{4,5,} t_{6} y t_{7,5.} Después de centrifugación, los sedimentos se congelaron inmediatamente a -70ºC (para prevenir la inactivación de la \beta-galactosidasa) y se descongelaron justamente antes del tratamiento mediante ultra sonidos, para detectar la \beta-galactosidasa (Msadek, T., et al, 1990. J. Bacteriol. 172:824.834). Las actividades específicas que se presentan (expresadas en unidades Miller por miligramo de proteína) corresponden a los medios de por lo menos dos experiencias independientes.

Resultados La expresión del gen cryIIIA requiere la presencia de un fragmento de ADN corriente arriba del gen

Arantes y Lereclus (1991. Gene 108:115-119) han mostrado que el gen cryIIIA se expresaba sólo débilmente en la cepa B. thuringiensis HD1 Cry^{-}B, cuando se clonaba en un vector con un número escaso de copias tal como el pHT304 (4 copias por cromosoma equivalente).

A partir de un fragmento BamHI de 6 kb que lleva el gen cryIIIA y las regiones adyacentes (figura 1B), aislado a partir de la cepa B. thuringiensis LM79 específica para los coleópteros, se investigó si las regiones corriente arriba del gen podían estar implicadas en la regulación de la expresión de este gen. El fragmento de 6 kb se clonó en el sitio único BamHI del vector pHT304 (figura 1A); los fragmentos obtenidos después de digestiones parciales o totales mediante HindIII del fragmento BamHI de 6 kb se insertaron igualmente de manera independiente en el mismo plásmido, para dar lugar a los derivados pHT305A, pHT305G, pHT305P, pHT305H y pHT305C (figura 1B). Los cinco plásmidos recombinantes se introdujeron a continuación en B. thuringiensis subespecie Kurstaki HD1 Cry^{-} B mediante electroporación, cultivándose los transformantes durante dos días a 30ºC en un medio HCT (Lecadet, M. M., et al, 1989. J. Gen. Microbiol. 121:202-212) que contiene 25 \mug de eritromicina por ml.

Se recuperaron preparaciones de esporas, a partir de los cultivos, que incluían cristales, y se examinaron mediante microscopía de contraste de fases y SDS-PAGE (figura 2). Las cepas recombinantes que llevan los vectores pHT305A, pHT305G y pHT305P (figura 2, líneas 1, 2, y 4, respectivamente) producían grandes cantidades de un cristal romboide plano característico de las cepas activas contra las larvas de coleópteros. Los componentes principales de estos cristales eran dos péptidos de aproximadamente 73 y 67 kDa, tales como los descritos previamente para las cepas de B. thuringiensis que llevan cryIIIA (Donovan, W.P. et al, 1988, Mol. Gen. Genet. 214:365-372).

De forma opuesta, no se ha detectado ninguna producción cristalina con las cepas que llevan pHT305H o pHT305C (figura 2, líneas 3 y 7 respectivamente). Se ha planteado la hipótesis de que estos plásmidos están desprovistos de ciertos elementos que se encuentran por el contrario, en los derivados pHT305A, pHT305G y pHT305P. Este elemento suplementario eventual está situado en un fragmento de ADN de 1kb, entre el segundo y el tercer sitio HindIII, designándose como H_{2}-H_{3} (figura 1B). Para ensayar si su efecto de activación dependía de su posición, se ha unido este fragmento H_{2}-H_{3} a un sitio SmaI de pHT305H. En el plásmido resultante (pHT305H\OmegaH_{2}H_{3}), el fragmento H_{2}H_{3} se localiza corriente abajo del gen cryIIIA. La síntesis de la toxina cryIIIA de pHT305H\OmegaH_{2}H_{3} se ha mostrado tan débil como con el plásmido pHT305H (figura 2, línea 6). Esta ausencia de efecto podría deberse a la nueva localización del fragmento H_{2}H_{3}, siendo ésta inapropiada, o bien a la desorganización de su estructura funcional. En este caso, el elemento funcional que se pone en marcha en el interior del fragmento H_{2}H_{3} se extendería a una región más allá del sitio HindIII descrito, y comprendería potencialmente la región del promotor.

Secuenciación del ADN y análisis

Se determinó la secuencia nucleótida del fragmento H_{2}-H_{3} de 979 pb del plásmido pHT791 (figura 3 B). Además, se determinó la secuencia de 713 pb que se extiende del tercer sitio HindIII al primer sitio PstI (fragmento H_{3}-P_{1}) (figura 3B). Este segundo fragmento lleva la región corriente arriba del promotor, el mismo promotor, el sitio potencial de unión al ribosoma, y los primeros 151 codones del gen cryIIIA (Sekar, V. et al, 1987 PNAS. USA 84:7036-7040). No hay diferencia entre la secuencia del fragmento H_{3}-P_{1} aislado a partir de la cepa LM79 y las regiones correspondientes de los genes cryIIIA aislados a partir de B. thuringiensis, sub especie tenebrionis, B. thuringiensis, sub especie san diego, y la cepa EG2158 (Donovan W.P. et al, Herrnstadt C. et al, Höfte H.J. et al, Sekar V. et al). No se ha encontrado ninguna secuencia potencialmente codificante para una proteína distinta que la correspondiente al extremo 5' de cryIIIA. Esta región muestra una fuerte proporción de bases A+T ( adenina más timina) que corresponde a aproximadamente un 81% entre las bases 770 y 990 y dos secuencias inversas repetidas. La primera secuencia inversa repetida es imperfecta (16 de los 17 pb son idénticos), con un centro de simetría en el nucleótido 858 y la segunda es una repetición inversa perfecta de 12 pb con un centro de simetría en el nucleótido 1379. las energías libres que conducen a la formación de las estructuras en eje bucle, calculadas según el procedimiento de Tinoco et al (Tinoco, J.J. et al, 1973. Nature (London) New Biol. 246:40-41), eran respectivamente de -57,7 y -66,1 kJ/mol.

Análisis del punto de inicio y de la duración de la transcripción en presencia del fragmento H_{2}-H_{3}

Sekar et al cartografiaron el sitio de comienzo de la transcripción del gen cryIIIA a partir de los ARN aislados a partir de células en fase precoz (estadio II) y en fase intermediaria (estadios II a IV) de esporulación), utilizando la nucleasa de habichuela (mung bean). Estos períodos de crecimiento corresponden a los tiempos t_{2} a t_{5}. La prolongación a partir de iniciadores se llevó a cabo sobre ARN extraídos de células en cultivo en los tiempos t_{0}, t_{3}, t_{6} y t_{9}, para determinar si otros puntos de iniciación intervienen en las fases precoces y tardías del crecimiento, y para determinar en qué estadio aparece la transcripción máxima. Un sitio de inicio de la transcripción apareció bajo forma de una señal débilmente radioactiva en las muestras de los tiempos t_{0} y t_{9,} habiéndose mostrado esta señal más intensa en las muestras de los tiempos t_{3} y t_{6.} Este sitio de iniciación de la transcripción se ha cartografiado un nucleótido corriente arriba del descrito por Sekar et al.

Estos resultados indican que el transcrito mayoritario tiene como extremo 5' la T localizada en posición 1413 (Fig.3). Sin embargo, la T localizada en posición 1413 (Fig 3) podría constituir el extremo de un mensajero estable, cuyo verdadero inicio se situaría corriente arriba.

Detección y análisis cuantitativo del ARNm específico de la toxina cryIII A en presencia del fragmento H_{2}-H_{3}

La transcriptasa inversa es satisfactoria para el alargamiento a partir de iniciadores para fragmentos que contienen sólo de 100 a 150 bases, en la medida en la que esta enzima puede detenerse o interrumpirse en regiones que implican importantes estructuras secundarias a nivel de la matriz de ARN. Para estudiar la presencia de un sitio potencial de iniciación de transcripción, localizado muy corriente arriba del extremo 5' del gen cryIIIA, se llevó a cabo un análisis de transferencia Northern. El ARN total de la cepa que llevaba pHT305P se recuperó en los tiempos t_{0}, t_{3}, t_{6} y t_{9.} Los ARN se separaron mediante electroforesis sobre geles de agarosa y se hibridizaron con una sonda que correspondía a los fragmentos internos de cryIIIA marcados (fragmento PstI-EcoRI de 874 pb). En todas las muestras, se detectó un transcrito principal de aproximadamente 2,5 kb. Esto es coherente con el tamaño del transcrito delimitado por el sitio de iniciación de transcripción descrito anteriormente y una secuencia de finalización potencial, localizada aproximadamente 400 pb corriente abajo del codon de detención de cryIIIA, descrita por Donovan et al.

Las cantidades relativas de ARNm, específicas de la toxina CryIIIA sintetizada por la cepa que lleva pHT305P y por la cepa que lleva pHT305H, se compararon mediante un procedimiento de transferencia puntual. Se inmovilizaron ARN aislados a partir de cultivos síncronos, y recuperados en el tiempo t_{3}, sobre una membrana de nitrocelulosa y se hibridizaron con un exceso de sonda PstI-EcoRI de cryIIIA. La cepa que lleva pHT305P contenía aproximadamente 10 a 15 veces más ARNm específico de cryIIIA que la cepa que contenía pHT305H.

Producción de \beta-galactosidasa a partir de la fusión H_{2}-H_{3}::lacZ

La síntesis relativa del transcrito cryIIIA en presencia y en ausencia del fragmento H_{2}-H_{3} indicó que este segmento de ADN regula la expresión del gen cryIIIA a nivel de la transcripción, más que a nivel de la traducción. Se llevó a cabo una fusión con el gen lacZ para ensayar el efecto sobre la transcripción producido por el fragmento H_{2}-H_{3}. El gen lacZ desprovisto de promotor se subclonó en el sitio SmaI de pHT304. El plásmido resultante pHT304'lacZ constituye un sistema que permite generar las transcripciones de fusión y de estudiar su expresión en B. thuringiensis en condiciones que se aproximan a las que tienen lugar de forma natural, con los genes cry (plásmido con escaso número de copias). En consecuencia, el fragmento H_{3}-P_{1} de 713 pb se clonó entre los sitios HindIII y PstI de pHT304'lacZ para dar lugar a pHT7901'lacZ. Finalmente, el fragmento H_{2}-H_{3} se clonó en el sitio HindIII de pHT7901'lacZ para dar lugar a pHT7902'lacZ, que lleva el fragmento H_{2}-H_{3} en su orientación de origen respecto al fragmento H_{3}-P_{1} (figura 4). Los plásmidos pHT304'lacZ, pHT7901'lacZ y pHT7902'lacZ se introdujeron en B. thuringiensis, sub especie Kurstaki HD1 Cry^{-}B mediante electroporación. El vector pHT304'lacZ presentaba un fenotipo azul atribuido potencialmente al promotor lacZ o a otra región de ADN de pUC19 que actuaba como promotor, localizada corriente arriba de los sitios de clonación. Se indujo la esporulación de cada cepa y se tomaron muestras en los tiempos t_{-2} y t_{-1} (2 horas y 1 hora antes del desencadenamiento de la esporulación, respectivamente) y en los tiempos t_{0} a t_{7,5} con una hora de intervalo, ensayándose respecto a la actividad \beta-galactosidásica (figura 5). La actividad \beta-galactosidasa de la sonda que lleva phT304'lacZ era constante, con aproximadamente 800 unidades Miller, de t_{-2} a t_{7,5}. El nivel de la producción de enzimas de la cepa que lleva pHT7901'lacZ ha sido de aproximadamente 250 unidades Miller en t_{-2}, hasta aproximadamente 1.200 unidades Miller en t_{7,5}, indicando un aumento pequeño pero significativo de la actividad de la \beta-galactosidasa durante la esporulación (no siendo este aumento aparente debido a la escala utilizada en la figura 5). Por el contrario, la cepa recombinante que lleva pHT7902'lacZ, produjo mucha \beta-galactosidasa (33.000 unidades Miller en los tiempos t_{6} y t_{7,5}). Su actividad \beta-galactosidasa aumentó aproximadamente 20 veces entre t_{0} y t_{6} (figura 5). La proporción de las actividades de las cepas que llevan pHT7901'lacZ y pHT7902'lacZ aumentó de 8 veces durante la fase de crecimiento vegetativa a aproximadamente 25 veces durante la fase tardía de la esporulación.

Los resultados que se han presentado anteriormente y, de modo más preciso, las Figuras 4 y 5, indican que el sistema de expresión de cryIIIA es funcional (con un número escaso de copias) si la región H_{2}-H_{3} se encuentra corriente arriba de la región H_{3}-H_{1}. Si esto sucede, se obtienen niveles muy altos de expresión, sea con el gen cryIIIA o con el gen lacZ.

1) Definición precisa de la región activadora

Deleciones del fragmento H_{2}-P_{1} (figura 3A) han mostrado que un fragmento TaqI-TaqI (posiciones 907 a 1559, Fig 3), era suficiente para obtener la intensa expresión del gen lacZ (plásmido pHT7930'lacZ, fig 6).

Además, una deleción interna del fragmento, entre los sitios PacI y XmnI (posiciones 990 a 1179), no reduce la expresión del gen lacZ.

Esta deleción interna ha hecho intervenir un adaptador entre los sitios PacI y XmnI.

Los dos oligonucleótidos siguientes se sintetizaron y se hibridizaron conjuntamente para construir una secuencia de ADN bicatenario que pudiera servir de adaptador entre los sitios PacI y XmnI:

4

El adaptador que aquí se utiliza, tiene una secuencia tal que cinco nucleótidos que se encuentran naturalmente después del sitio PacI, son reconstituidos en el plásmido pHT7931'lacZ.

En presencia de esta deleción, parece obtenerse una expresión mejor acercando las dos regiones TaqI-PacI (posiciones 907 a 990) y XmnI-TagI (posiciones 1179 a 1559) (plásmido pHT7931'lacZ, fig 6).

Se deduce que el sistema de expresión de cryIIIA requiere la asociación de dos secuencias distintas de ADN: una está comprendida entre los sitios TaqI y PacI (posiciones 907 a 990), y la otra está comprendida entre los sitios XmnI y TaqI (posiciones 1179 a 1559).

Esta conclusión se refuerza por el hecho de que en ausencia de la región XmnI-TaqI (posiciones 1179 a 1559), la región situada corriente arriba del sitio XmnI no es suficiente para obtener el alto nivel de expresión del gen lacZ (plásmido pHT7907'lacZ, fig 6). Efectivamente, la secuencia de ADN DraI-XmnI (posiciones 806 a 1179) situada corriente arriba del gen lacZ (plásmido pHT7907'lacZ) no permite obtener en Bt (B. thuringiensis) mas que una actividad \beta-galactosidasa de aproximadamente 3.500 unidades Miller (objeto de comparación con las 30.000 unidades Miller obtenidas con el plásmido pHT7902'lacZ y pHT7903'lacZ).

Este resultado confirma, pues, que la asociación de las dos secuencias TaqI-PacI (posiciones 907 a 990) y XmnI-TaqI (posiciones 1179 a 1559) es necesaria para que el sistema de expresión de cryIIIA funciones plenamente.

El experimento realizado con el fragmento DraI-XmnI corriente arriba de lacZ (plásmido pHT7907'lacZ) indica que una actividad promotora está incluida entre DraI y XmnI, o entre TagI y PacI (posiciones 907 a 990), ya que se obtiene una intensa actividad \beta-galactosidasa cuando el fragmento PacI-XmnI (posiciones 991 a 1179) está
ausente.

El análisis de los ARN mediante prolongación por iniciador, llevada a cabo utilizando un oligonucleótido complementario a la secuencia comprendida entre las posiciones 1090 y 1121, permite, en efecto, detectar un inicio de transcripción en esta región. Éste se localiza en posición 983 (Fig 3), o más probablemente, en posición 984. Se deduce que un promotor debe estar situado algunos pares de bases corriente arriba de este inicio. Aunque no existe una homología evidente con promotores conocidos, las secuencias -35 (TTGCAA) y -10 (TAAGCT) del promotor, se encontrarían entre las posiciones 945 a 980.

Un fragmento MunI-PstI de ADN (posiciones 952 a 1612) situado delante de lacZ (plásmido pHT7909'lacZ) confiere una débil actividad \beta-galactosidasa, comparable a la obtenida con el plásmido pHT7901'lacZ (Figura 4 y 5).

Este resultado sugiere que el promotor situado en las posiciones 945 y 980 puede ser inactivado en una construcción que empieza en MunI (posición 952). Se sabe, sin embargo, que la secuencia mínima necesaria para la expresión se ha definido como iniciadora en el sitio TaqI (posición 907).

Se deduce de estos distintos experimentos, que es necesaria una secuencia de ADN localizada entre los sitios TaqI y PacI (posiciones 907 a 990), para obtener una expresión intensa de lacZ y, consecuentemente, una transcripción intensa de cryIIIA.

Medición de la actividad del promotor que se encuentra corriente arriba del sistema de expresión de cryIIIA

Para medir la actividad del promotor corriente arriba, se construyó una fusión transcripcional con el fragmento de ADN que contenía este promotor y el gen lacZ. Para llevar esto a cabo, se construyó en primer lugar el vector de expresión pHT304-l8Z (Fig 8A). Se clonó a continuación el fragmento de ADN comprendido entre las posiciones 907 y 990 corriente arriba del gen lacZ para dar lugar al plásmido pHT7832'lacZ. La actividad \beta-galactosidasa es de 3.000 U/mg de proteínas en el tiempo t_{0} y de 13.000 U/mg de proteínas en el tiempo t_{6} (Fig 8B).

El papel del promotor corriente arriba en la actividad global del sistema de expresión de cryIIIA se evaluó analizando el efecto producido por su inactivación. Se llevó el sitio de restricción MunI mediante el fragmento Klenow de la ADN polimerasa, en presencia de desoxinucleótidos, para dar lugar al plásmido pHT7832\DeltaMunI'lacZ. Esto lleva a añadir 4 nucleótidos entre las regiones -35 y -10 del promotor (CAATTAATTG respecto a CAATTG). La actividad \beta-galactosidasa de la cepa que lleva pHT7832\DeltaMun'lacZ era de aproximadamente 10 U/mg de proteínas en el tiempo t_{0} y de aproximadamente 30 U/mg de proteínas en el tiempo t_{6} (Fig 8B). Este resultado indica que el promotor situado corriente arriba se inactiva entonces. El fragmento de ADN que contiene el sitio MunI modificado se introdujo en el plásmido pHT7830'lacZ para dar lugar al plásmido pHT7830\DeltaMunI'lacZ. La actividad \beta-galactosidasa de la cepa que lleva pHT7830\DeltaMunI'lacZ era de aproximadamente 25 U/mg de proteínas en el tiempo t_{0} y de aproximadamente 450 U/mg de proteínas en t_{6} (Fig 8B). Mediante comparación con la cepa que lleva el plásmido pHT7830'lacZ, resulta que el promotor situado corriente arriba es necesario para el funcionamiento óptimo del sistema de expresión de cryIIIA. El plásmido pHT7830'lacZ corresponde al vector pHT304-18Z en el cual está clonado el fragmento TaqI que contiene el sistema de expresión entero de cryIIIA.

Estudio del papel de la región situada corriente arriba del sistema de expresión de cryIIIA

Los resultados anteriores confirman que el promotor situado corriente arriba es necesario para el funcionamiento óptimo del sistema de expresión de cryIIIA; por el contrario, no es suficiente para responder de la máxima actividad del sistema completo. A este último aspecto se había aludido anteriormente (comparar la actividad \beta-galactosidasa de las cepas que llevan los plásmidos pHT7832'lacZ y pHT7831'lacZ (Fig 8B). El plásmido pHT7831'lacZ corresponde al plásmido pHT7830'lacZ cuyo fragmento interno PacI- XmnI se ha suprimido. Resulta que una región que se denomina situada corriente abajo es necesaria para explicar la actividad máxima del sistema de expresión de cryIIIA.

El sitio de inicio de la transcripción del gen cryIIIA se había localizado anteriormente en posición 1413, debiendo estar, pues, comprendidas las regiones -35 y -10 del promotor putativo entre los nucleótidos 1370 y 1412 (Sekar et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7036-7040). Para evaluar la eficacia de este promotor putativo, se construyó el plásmido pHT7815/8'lacZ en el que el fragmento de ADN comprendido entre los nucleótidos 1352 y 1412 se ha suprimido. La actividad \beta-galactosidasa de la cepa que lleva pHT7815/8'lacZ era de aproximadamente 3.000 U/mg de proteínas en t_{0} y de aproximadamente 42.000 U/mg de proteínas en t_{6} (Fig 8B). Este resultado indica que la región comprendida entre los nucleótidos 1362 y 1412 no juega ningún papel esencial en el sistema de expresión de cryIIIA y no puede considerarse, pues, como el promotor del gen cryIIIA.

Se llevó a cabo un experimento de prolongación de iniciador con los ARN totales extraídos en el tiempo t_{3} de una cepa de B. thuringiensis que lleva el plásmido pHT7815/8'lacZ. Se detectó el extremo 5' del transcrito mayoritario, como anteriormente, en posición 1413 (Fig 9). El conjunto de nuestros resultados demuestran, por tanto, que este extremo no corresponde a un inicio de la transcripción, sino a un extremo de un transcrito estable iniciado en posición 984 a partir de un promotor situado corriente arriba, que se localiza en la región de ADN comprendida entre los sitios TaqI y PacI (posiciones 907 a 990) y definido por las regiones -35 y -10; TTGCAA y TAAGCT. Ocupando el extremo 5' del transcrito mayoritario de cryIIIA invariablemente la posición 1413, en presencia o ausencia del fragmento de ADN comprendido entre las posiciones 1362 y 1412, resulta que este extremo está determinado por la presencia de una secuencia de ADN que se encuentra corriente arriba de la posición 1413. El papel de esta región se ejerce, pues, a un nivel post-transcripcional. El análisis de esta secuencia corriente arriba se realizó en B. subtilis mediante fusiones transcripcionales con el gen lacZ. Las distintas construcciones presentadas en la figura 10, han permitido delimitar de modo más preciso la región corriente abajo y medir su efecto post-transcripcional:

1. El fragmento de ADN comprendido entre los nucleótidos 1462 y 1556 se ha suprimido del plásmido
pHT7830'lacZ para dar lugar al plásmido pHT7816'lacZ. La actividad \beta-galactosidasa de la cepa que lleva
pHT7816'lacZ era de aproximadamente 25.000 U/mg de proteínas en t_{3}, mientras que la actividad \beta-galactosidasa de la cepa que lleva pHT7830'lacZ era de aproximadamente 50.000 U/mg de proteínas en t_{3} (Fig 10).

2. El fragmento de ADN comprendido entre los nucleótidos 1413 y 1556 se ha suprimido del plásmido
pHT7830'lacZ para dar lugar al plásmido pHT7805'lacZ. La actividad \beta-galactosidasa de la cepa que lleva
pHT7805'lacZ era de aproximadamente 5.000 U/mg de proteínas en t_{3} (Fig 10).

3. Los nucleótidos GGA en posición 1421-1423 se reemplazaron en el plásmido pHT7830'lacZ, por los nucleótidos CCC, para dar lugar al plásmido pHT7830Rm'lacZ. La actividad \beta-galactosidasa de la cepa que lleva pHT7830Rm'lacZ era de aproximadamente 5.000 U/mg de proteínas en t_{3.} (Fig 10).

4. Se llevó a cabo un experimento de prolongación mediante el iniciador con los ARN totales extraídos en el tiempo t_{3} de una cepa de B. thuringiensis que lleva el plásmido pHT7830Rm'lacZ. Se detectó el extremo 5' del transcrito mayoritario en posición 984 y no se detectó ningún transcrito que tuviera un extremo 5' en posición
1413.

Estos cuatro resultados indican que el efecto post-transcripcional de la región corriente abajo se debe principalmente a la secuencia nucleotídica comprendida entre los nucleótidos 1413 y 1461. Además, los nucleótidos GGA en posición 1421-1423 son importantes para conferir el efecto post-transcripcional y no podrían modificarse salvo considerando el reemplazo por una secuencia que asegure una intensidad de interacción con el ARN 16S del ribosoma parecida a la intensidad de interacción medida para los nucleótidos GGA. Por ejemplo, el reemplazo de los nucleótidos GGA por los nucleótidos CCC conduce a la desaparición completa del efecto post-transcripcional, que se explica por una intensa modificación de la intensidad de la interacción entre esta porción del segmento y el ARN 16S. La región situada corriente abajo, definida de este modo, tiene como particularidad notable incluir una secuencia nucleotídica complementaria del extremo 3' del ARN 16S de los ribosomas.

El efecto post-transcripcional de esta secuencia de ADN se evaluó a continuación utilizando un sistema de expresión heterólogo: la secuencia de ADN siguiente (S1):

5

se sintetizó y se clonó entre los sitios HindIII y PstI del vector pHT304'lacZ, para dar lugar al plásmido
pHT304\OmegaRS1'lacZ. Esta secuencia de ADN se intercala, pues, entre el promotor del gen lacZ y la secuencia codificante del gen lacZ. La actividad \beta-galactosidasa de la cepa 168 de B. subtilis que lleva pHT304\OmegaRS1'lacZ era de aproximadamente 4.000 U/mg de proteínas en t_{3}. Resulta que la secuencia descrita anteriormente aumenta un factor de 4 la expresión del gen lacZ. Este aumento es comparable con el aumento debido a la región comprendida entre los nucleótidos 1413 y 1461 que era de un factor 5 (comparar la actividad \beta-galactosidasa de las cepas de B. subtilis que contienen los plásmidos pHT7816'lacZ o pHT7805'lacZ). La región de ADN siguiente es pues, suficiente, para conferir el efecto post-transcripcional al sistema de expresión de cryIIIA):

\vskip1.000000\baselineskip

6

Esta secuencia posee una región complementaria del extremo 3' del ARN 16S de los ribosomas. Sin embargo, otros elementos característicos de la región corriente abajo del sistema de expresión de cryIIIA y que pueden acentuar este efecto, impidiendo principalmente el movimiento del ribosoma, se incluyen verdaderamente en la secuencia nucleotídica comprendida entre las posiciones 1462 y 1556. Su presencia parece explicar la diferencia de actividad \beta-galactosidasa observada entre la cepa de B. subtilis que contiene el plásmido pHT7830'lacZ (50000 U/mg de proteínas en t_{3}) y la cepa de B. subtilis que contiene el plásmido pHT7816'lacZ (25.000 U/mg de proteínas en t_{3}; véase la Fig 10).

Estos resultados parecen confirmar, pues, que el efecto post-transcripcional de la región corriente abajo resulta de la hibridización entre el ARN ribosómico 16S y la secuencia S2 del ARN mensajero de cryIIIA. Es pues probable que el ribosoma o una parte del ribosoma se fije sobre esta región corriente abajo del ARN y la proteja de este modo de una degradación exonucleásica iniciada en 5'. Tal como se ha mencionado anteriormente, esta fijación tendría por efecto, pues, aumentar la estabilidad de los mensajeros y aumentar así el nivel de expresión de un gen dado. Esto explica que el extremo 5' de los transcritos de cryIIIA esté invariablemente en posición 1413, cualquiera que sea la iniciación de la transcripción. Este mecanismo parece confirmado asimismo por el efecto positivo de la secuencia S1 sobre un sistema de expresión heterólogo (plásmido pHT304'\OmegaRS1lacZ en la cepa 168 de B. subtilis).

Introducción de la fusión [sistema de expresión CryIIIA-LacZ] en el cromosoma de Bacillus subtilis

El vector pAF1 (fig 4) no replicativo en B. subtilis permite introducir las fusiones con el gen informador LacZ en el cromosoma de B. subtilis en el locus amyE. (J. Bact. 1990, 172:835-844). El plásmido pHCl se obtiene por inserción del fragmento HindIII-SacI (2,7 kb) del pHT7901'LacZ entre los sitios HindIII-SacI del pAF1.

El plásmido pHC2 se obtiene por inserción del fragmento HindIII-SacI (3,7 kb) del pHT7902'LacZ entre los sitios HindIII y SacI del PAF1.

Las fusiones se introducen en la cepa B.s 168 trpC2 (Anagnostopoulos, C., y Spizizen, J. 1961. J. Bacteriol 81:741-746) (Bacillus subtilis 168) por transformación; el fenotipo [amy-] da cuenta de la integración mediante doble recombinación.

Estudio del sistema de expresión del gen cryIIIA en B. subtilis

Las cepas de B. subtilis obtenidas después de transformación e integración de los plásmidos pHC1 y pHC2, se denominan respectivamente:

Bs 168 [H]

\hskip0.5cm

y

\hskip0.5cm

Bs 168 [P]

La construcción que se contiene en el plásmido pHC2, es decir, que lleva el fragmento H_{2}-P_{1} corriente arriba de lacZ, se introduce asimismo en la cepa B. subtilis \Delta sigE.

La cepa \DeltasigE se obtiene transformado una cepa parental (Spo^{+}) con un plásmido no replicativo en las bacterias gram-positivas y que lleva un gen sigE, una región interna del cual está suprimida. El gen sigE se ha descrito por Stragier et al, 1984, Nature 312:376-378.

La cepa \DeltasigE se transformó con el plásmido pHC2 y la cepa resultante es \DeltasigE[P]. En esta cepa se ha suprimido el gen que codifica el factor sigma E específico de la esporulación. Esta cepa es pues asporógena, (Spo^{-}).

Igualmente, la cepa Bs 168 [P] se transformó con una "cassette Km^{R}" que interrumpe el gen SpoOA. La cepa de donde proviene el gen spoOA interrumpido por una "cassette KM^{R}", se obtiene transformando una cepa parental (Spo^{+}) con un plásmido no replicativo en las bacterias Gram positivas y que lleva un gen SpoOA (descrito por Ferrari, F.A et al, 1985, PNAS USA 82:2647-2651) interrumpido por un gen de resistencia a la kanamicina. El ADN cromosómico de esta cepa se utilizó para transformar la cepa Bs 168 [P].

De este modo, la cepa resultante Spo^{-} se ha denominado Bs168 SpoOA [P].

Parece, en primer lugar, que la producción de \beta-galactosidasa obtenida con la cepa de B. subtilis 168 [H] es muy débil (<100 uM) en comparación con la cepa 168 [P] (aproximadamente 15.000 uM). Estos resultados son similares a los obtenidos en Bt.

Además, se obtuvo un resultado muy sorprendente: la expresión en la cepa Bs\DeltasigE es idéntica a la expresión en la cepa Bs 168 salvaje. Este resultado indica que el gen cryIIIA no está controlado por un promotor específico del factor sigma E, como ocurre para el gen cryIA.

Todavía es más sorprendente que la expresión en la cepa Bs SpoOA [P] sea superior a la obtenida en la cepa Bs 168 [P]. Este s]resultado muestra que la expresión de cryIIIA es independiente de la esporulación, ya que el gen spoOA interviene en el primer estadio de la esporulación.

\newpage

Estos resultados son muy importantes para el desarrollo y las aplicaciones del sistema de expresión de cryIIIA. Indican, efectivamente, que se pueda considerar la producción de las toxinas insecticidas o de cualquier otra proteína de interés comercial en las cepas Spo^{-} de B. subtilis o de B. thuringiensis.

Análisis de la expresión de la fusión [sistema de expresión CryIIIA-lacZ = pHC2] en Bacillus subtilis en función del medio de cultivo

En lo que se refiere a la expresión de la fusión en los medios 1 a 5 respectivamente, cuya composición se proporciona a continuación, se pueden hacer las siguientes observaciones:

-: Existe expresión (Aunque débil) durante la fase vegetativa.

: La expresión aumenta al entrar en fase estacionaria.

-: La comparación de los medios 2 (carencia en fosfato) y 5 (carencia en aminoácidos) muestra que el sistema de expresión cryIIIA se activa por la carencia en aminoácidos.

-: La expresión en el medio 4 muestra que esta activación requiere la presencia de las sales: CaCl_{2}, MnnCl_{2}, CAF.

-: La activación es independiente de la esporulación:

: En medio de esporulación (medio Sp) 1, la expresión se detiene en t_{2.}

En el medio 5, las células no pueden esporular (la glucosa inhibe la esporulación), y la activación es máxima.

-: Cuando la única fuente de nitrógeno es NH+, la activación es menos importante, y la expresión permanece sin embargo importante (medio 3).

\vskip1.000000\baselineskip

1/ Medio Sp: medio de esporulación

: 8 g de caldo de cultivo nutriente (Difco) /litro

: 1 mM de MgSO_{4}

: 13 mM KCl

: 10 \muM MnCl_{2}

: 1 \muM FeSO_{4}

: 1 mM CaCl_{2}

\vskip1.000000\baselineskip

2/ Medio de carencia en fosfato

: Tampón HEPES, pH 7; 50 mM

: 1 mM MgSO_{4}

: 0,5 mM CaCl_{2}

: 10 \muM MnCl_{2}

: 4,4 mg/litro de citrato amonioférrico (CAF)

: 2% glucosa

: 10 mM KCl

: 100 mg/litro de cada aminoácido

: 50 mg/litro triptófano

: 0,45 mM tampón fosfato pH 7

3/ Medio mínimo

: 44 mM KH_{2}PO_{4}

: 60 mM K_{2}HPO_{4}

: 2,9 mM citrato tri Na

: 15 mM (NH_{4})_{2}SO_{4}

: 2% glucosa

\vskip1.000000\baselineskip

4/ Medio de carencia en aminoácidos sin CaCl_{2}, MnCl_{2, CAF}

: 44 mM KH_{2}PO_{4}

: 60 mM K_{2}HPO_{4}

: 2,9 mM citrato tri Na

: 2% glucosa

: 1 mM MgSO_{4}

: 50 mg/litro de triptófano

: 0,5 hidrolizado de caseína (HC)

\vskip1.000000\baselineskip

5/ idem 4 añadiendo

: 0,5 mM CaCl_{2}

: 10 \muM MnCl_{2}

: 4,4 mg/litro CAF

Construcción de una cepa de B. thuringiensis Sp^{-} Clonación del gen spoOA de B. thuringiensis

El ADN total de la cepa de B. thuringiensis 407 del serotipo 1, se purificó y se sometió a digestión por el enzima HindIII. Los fragmentos HindIII se unieron con el vector pHT304 digerido por HindIII y la mezcla de unión se utilizó para transformar la cepa 168 de B. subtilis. Los clones transformantes se seleccionaron respecto a la resistencia a la eritromicina. Se transformaron a continuación con el ADN total de la cepa 168 de B. subtilis, cuyo gen spoOA estaba interrumpido por una "cassette Km^{R}". Se estudiaron los clones transformantes que se convirtieron en resistentes a la kanamicina y presentaban siempre un fenotipo Spo^{+}. Uno de los clones llevaba un plásmido recombinado capaz de compensar la mutación spoOA de B. subtilis. Este plásmido estaba constituido por el vector pHT304 y por un fragmento HindIII de aproximadamente 2,4 kb (Fig 11A).

Determinación de la secuencia nucleotídica del gen spoOA de B. thuringiensis

Se determinó la secuencia nucleotídica del fragmento HindIII y reveló la presencia de un marco abierto de lectura de 804 pb capaz de codificar una proteína de 264 aminoácidos, homóloga a la proteína SpoOA de B. subtilis. La secuencia nucleotídica de 804 pb del gen spoOA de B. thuringiensis cepa 407, se representa en la Fig 11B.

Interrupción del gen spoOA de B. thuringiensis

Un fragmento de ADN de 1,5 kb que lleva un gen aphIII, que confiere resistencia a la kanamicina ("casette Km^{R}"), se insertó entre los dos sitios HincII del gen spoOA (Fig 11). Un fragmento de 40 pb comprendido entre las posiciones 267 y 307 del gen spoOA, se reemplazó, pues, por la "cassette Km^{R}". El fragmento de ADN HindIII de aproximadamente 3,9 kb que contiene el gen spoOA interrumpido por la “cassette Km^{R}”, se clonó en el vector termosensible pRN5101 (Villafane et al. 1987. J. Bacteriol. 169:4822-4829). El plásmido resultante(denominado pHT5120) se introdujo en la cepa de B. thuringiensis 407 Cry mediante electroporación. El gen spoOA de la cepa B. thuringiensis 407 Cry^{-} se reemplazó por la copia interrumpida con la "cassette Km^{R}" mediante recombinación genética in vivo, utilizando el protocolo descrito anteriormente (Lereclus et al. (1992), Bio/Technology 10:418-421). La cepa de B. thuringiensis resultante (denominada 407-OA::KM^{R}) es resistente a la kanamicina (300 \mug/ml) y no produce ninguna espora cuando se cultiva en medio HCT, favorable habitualmente a la esporulación de B. thuringiensis. Una experiencia de hibridización ADN/ADN, llevada a cabo con el fragmento HindIII de 2,4 kb como sonda, revela que el gen spoOA de la cepa B. thuringiensis 407 Cry^{-} ha sido reemplazado por la copia interrumpida con la "cassette KM^{R}".

Producción de la toxina CryIIIA en la cepa B. thuringiensis 407-OA::KM^{R}

El plásmido pHT305P, que lleva el gen cryIIIA, se introdujo en la cepa B. thuringiensis 407-OA::KM^{R} mediante electroporación. El clon recombinante obtenido se depositó en la CNCM el 3 de mayo de 1994, designándosele el número de registro I-1412. El clon recombinante obtenido se cultivó a 30ºC en medio HCT + glucosa 3 g/l o en un medio LB (NaCl, 5g/l; extracto de levadura, 5 g/l; Bacto triptona 10 g/l) para estimar la producción de toxinas. Después de aproximadamente 48 horas, las bacterias contenían un cristal visible mediante examen en microscopía óptica. Este cristal era de forma romboidal, característica de los cristales constituidos por la proteína CryIIIA. Los cristales producidos por la cepa B. thuringiensis 407-OA::Km^{R} [pHT315] son de tamaño importante y permanecen incluidos en las células varios días después que éstas hayan cesado de desarrollarse en medio HCT; en medio LB una parte de las células se lisan y los cristales son liberados. Los cristales están constituidos por proteínas de aproximadamente 70 kDa (cryIIIA) específicamente tóxicas para los coleópteros.

Claims

1. Secuencia de ADN de control de la expresión de una secuencia codificante de un gen en una célula huésped, caracterizada porque está constituida por:

a): un promotor y

b): una secuencia nucleotídica, que ejerce un papel a nivel post-transcripcional, constituida por una parte del fragmento de ADN de aproximadamente 1692 pb, delimitada por los sitios de restricción HindIII y PstI (fragmento H_{2}-P_{1}), que se representa en la figura 3A, y que comprende una región complementaria al extremo 3' de un ARN 16S ribosómico bacteriano, ejerciendo dicha secuencia un papel a nivel post-transcripcional estando situada corriente abajo y bajo el control de dicho promotor.

2. Secuencia de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque la cadena de ADN de aproximadamente 1692 pb, delimitada por los sitios de restricción HindIII- PstI (fragmento H_{2}-P_{1}), es el obtenido mediante digestión parcial del fragmento BamHI de 6 kb que lleva el gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis cepa LM79, siendo capaz además dicha secuencia de ADN de intervenir en el control de la expresión de una secuencia codificante de nucleótidos situada corriente abajo, en un huésped celular bacteriano, particularmente de tipo Bacillus thuringiensis y/o Bacillus subtilis.

3. Secuencia de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque corresponde a la cadena HindIII-PstI de una longitud de aproximadamente 1692 pb (fragmento H_{2}-P_{1}), representada en la figura 3A.

4. Secuencia de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque corresponde a la cadena de nucleótidos siguiente, designada por la expresión SEC nº 1, comprendida entre los nucleótidos 1 y 1692:

7

8

5. Secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque corresponde a una cadena delimitada por los sitios de restricción Taql-Taql.

6. Secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque corresponde a la cadena de nucleótidos siguiente, designada por la expresión SEC nº 2, comprendida entre los nucleótidos 907 y 1559 de la secuencia de la figura 3.

7. Secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque comprende el fragmento Taql-Pacl que responde a la cadena SEC nº 3, en asociación con el fragmento Xmnl-Taql que responde a la cadena SEC nº 4.

8. Secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque interviene en el control de la transcripción de la secuencia codificante de nucleótidos, y para aumentar la expresión de una secuencia codificante.

9. Secuencia de ADN según las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada por:

-: su capacidad de hibridización en condiciones no rigurosas con una cadena de nucleótidos seleccionada de entre las cadenas SEC nº 1, SEC nº 2, SEC nº 3 y SEC nº 4, y por

-: su capacidad para intervenir en el control de la expresión, en un huésped celular, particularmente del tipo bacillus, de una secuencia codificante de nucleótidos situada corriente abajo.

10. Secuencia según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha secuencia nucleotídica que ejerce un papel a nivel post-transcripcional es la secuencia S2 siguiente:

9

aislada de una bacteria, particularmente de una bacteria Gram^{+}, más particularmente de una bacteria del tipo bacillus, o una secuencia derivada de dicha secuencia S2, estando dicha secuencia S2 caracterizada porque comprende una región esencialmente complementaria en el extremo 3' del ARN 16S de un ribosoma bacteriano, y porque es capaz de intervenir a nivel post-transcripcional cuando se lleva a cabo la expresión de dicha secuencia codificante, principalmente sin actuar directamente sobre la traducción de la secuencia codificante que va a expresarse, particularmente cuando dicha secuencia S2 está situada entre dicho promotor y dicha secuencia codificante de un gen, con el fin de aumentar la expresión de dicha secuencia codificante en una bacteria, particularmente una bacteria del tipo bacillus.

11. Secuencia según la reivindicación 10, caracterizada porque comprende una primera región suficientemente complementaria en el extremo 3' del ARN 16S de un ribosoma bacteriano, particularmente de una bacteria Gram^{+}, más particularmente de una bacteria de tipo Bacillus, para que dicha primera región sea capaz de hibridizarse a un ribosoma bacteriano o a una parte de dicho ribosoma, y una segunda región corriente abajo de la primera región, comprendiendo dicha segunda región una secuencia capaz de tener un efecto positivo adicional a nivel de la expresión de la secuencia codificante.

12. Secuencia de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia nucleotídica que ejerce un papel a nivel post-transcripcional presenta las siguientes propiedades:

-: es susceptible de intervenir en el control de la expresión de la secuencia codificante de un gen en una célula huésped, principalmente de una secuencia codificante de un polipéptido de Bacillus tóxico respecto a los insectos, o de una secuencia codificante de un polipéptido que se expresa durante la fase vegetativa, durante la fase estacionaria o durante la esporulación de Bacillus.

13. Secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la secuencia nucleotídica que ejerce un papel a nivel post-transcripcional corresponde a una cadena delimitada por los sitios de restricción Xmnl-Taql.

14. Secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la secuencia nucleotídica que ejerce un papel a nivel post-transcripcional corresponde a la cadena SEC nº 4 comprendida entre los nucleótidos 1179 y 1559 de la secuencia de la figura 3, o porque corresponde a cualquier parte de por lo menos 10 nucleótidos naturalmente consecutivos o no de esta cadena, capaz de intervenir en el control de la expresión de una secuencia codificante de nucleótidos situada corriente abajo en un huésped celular.

15. Secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la secuencia nucleotídica que ejerce un papel a nivel post-transcripcional corresponde a la cadena SEC nº 5 que corresponde al fragmento que comprende los nucleótidos 1179 a 1556 de la secuencia que se representa en la figura 3.

16. Secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la secuencia nucleotídica que ejerce un papel a nivel post-transcripcional corresponde a la cadena SEC nº 11 que corresponde al fragmento que comprende los nucleótidos 1413 a 1556 de la secuencia que se representa en la figura 3.

17. Secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la secuencia nucleotídica que ejerce un papel a nivel post-transcripcional corresponde a la cadena SEC nº 8 que corresponde al fragmento que comprende los nucleótidos 1413 a 1461 de la secuencia que se representa en la figura 3.

18. Secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la secuencia nucleotídica que ejerce un papel a nivel post-transcripcional corresponde a la cadena SEC nº 9 que corresponde al fragmento de ADN siguiente:

10

19. Secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la secuencia nucleotídica que ejerce un papel a nivel post-transcripcional corresponde a la cadena SEC nº 10 que corresponde al fragmento de ADN siguiente:

11

20. Secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la secuencia nucleotídica que ejerce un papel a nivel post-transcripcional corresponde al fragmento de ADN siguiente:

12

21. Secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 A 20, caracterizada porque el promotor está incluido en la cadena delimitada por los sitios de restricción Taql-Pacl.

22. Secuencia de ADN según la reivindicación 21, caracterizada porque el promotor corresponde a la cadena SEC nº 3 comprendida entre los nucleótidos 907 y 990 de la secuencia de la figura 3, o una variante que comprende los nucleótidos 907 a 985, o caracterizada porque el promotor corresponde a cualquier parte de por lo menos 10 nucleótidos naturalmente consecutivos o no de esta cadena, capaz de intervenir en el control de la expresión de una secuencia codificante de nucleótidos situada corriente abajo en un huésped celular bacteriano.

23. Secuencia nucleotídica S2 de secuencia:

13

que comprende una región suficientemente complementaria en el extremo 3' del ARN 16S de un ribosoma bacteriano, particularmente de una bacteria Gram^{+}, más particularmente de una bacteria de tipo Bacillus para ser capaz de hibridizarse a un ribosoma bacteriano o a una parte de un ribosoma bacteriano.

24. Secuencia nucleotídica caracterizada porque está comprendida en la cadena SEC nº 5 que corresponde al fragmento que comprende los nucleótidos 1179 a 1556 de la secuencia representada en la figura 3, y porque comprende una región esencialmente complementaria en el extremo 3' del ARN 16S de un ribosoma bacteriano, siendo dicha secuencia capaz de intervenir a nivel post-transcripcional cuando se lleva a cabo la expresión de la secuencia codificante de un gen, principalmente sin actuar directamente sobre la traducción de la secuencia codificante que va a expresarse, estando dicha secuencia nucleotídica bajo el control de un promotor que controla dicha secuencia codificante.

25. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 24, caracterizada porque la secuencia nucleotídica corresponde a la cadena SEC nº 5 que corresponde al fragmento que comprende los nucleótidos 1179 a 1556 de la secuencia que se representa en la figura 3.

26. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 24 caracterizada porque la secuencia nucleotídica corresponde a la cadena SEC nº 11 que corresponde al fragmento que comprende los nucleótidos 1413 a 1556 de la secuencia que se representa en la figura 3.

27. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 24, caracterizada porque la secuencia nucleotídica corresponde a la cadena SEC nº 8 que corresponde al fragmento que comprende los nucleótidos 1413 a 1561 de la secuencia que se representa en la figura 3.

28. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 24, caracterizada porque la secuencia nucleotídica que ejerce un papel a nivel post-transcripcional corresponde a la cadena SEC nº 9 que corresponde al fragmento de ADN siguiente:

14

29. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 24, caracterizada porque la secuencia nucleotídica corresponde al fragmento de ADN siguiente:

15

30. Secuencia de ADN recombinante, caracterizada porque está constituida por:

a.: una secuencia codificante determinada,

b.: una secuencia nucleotídica constituida por un promotor y una secuencia que ejerce un papel a nivel post-transcripcional, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20,

estando situada dicha secuencia que ejerce un papel a nivel post-transcripcional corriente abajo de dicho promotor, y corriente arriba de dicha secuencia codificante.

31. Secuencia de ADN recombinante, caracterizada porque comprende:

a.: una secuencia codificante determinada, bajo el control de un promotor,

b.: una secuencia nucleotídica que ejerce un papel a nivel post-transcripcional según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29,

estando situada dicha secuencia que ejerce un papel a nivel post-transcripcional corriente abajo de dicho promotor y corriente arriba de dicha secuencia codificante.

32. Secuencia de ADN recombinante según la reivindicación 31, caracterizada porque comprende además una secuencia que ejerce un papel a nivel post-transcripcional, situada corriente arriba de dicha secuencia codificante.

33. Secuencia de ADN recombinante según una de las reivindicaciones 30 a 32, caracterizada porque la secuencia codificante de nucleótidos que contiene es una secuencia que codifica una enzima.

34. Secuencia de ADN recombinante según una de las reivindicaciones 30 a 32, caracterizada porque la secuencia codificante de nucleótidos que contiene es una secuencia que codifica un antígeno.

35. Secuencia de ADN recombinante según una de las reivindicaciones 30 a 32, caracterizada porque la secuencia codificante de nucleótidos que contiene es una secuencia tóxica respecto a los insectos y en particular una secuencia con actividad larvicida.

36. Vector de expresión obtenido mediante inserción de una secuencia de ADN constituida por una secuencia recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 32, de manera que dicha secuencia de ADN recombinante interviene en el control de la expresión de una secuencia codificante determinada de nucleótidos.

37. Vector de expresión según la reivindicación 36, caracterizado porque se trata de un plásmido, por ejemplo, de un plásmido integrativo o de un plásmido replicativo.

38. Vector de expresión según la reivindicación 37, caracterizado porque se trata del plásmido pHT7902'lacZ, depositado en la CNCM el 20 de abril de 1993 con el nº l-1301.

39. Huésped celular recombinante, caracterizado porque es modificado por una secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35 o por un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38.

40. Huésped celular según la reivindicación 39, caracterizado porque se trata de un Bacillus, por ejemplo de B thuringiensis o de B. subtilis.

41. Huésped celular según la reivindicación 40, caracterizado porque se trata de una cepa asporógena de Bacillus, por ejemplo, de una cepa de B. subtilis asporógena, en particular de una cepa capaz de expresar la secuencia codificante de la secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, durante la fase estacionaria de crecimiento.

42. Huésped celular, caracterizado porque se trata de la cepa 407-OA::Km^{R}(pHT305D) depositada en la CNCM el 3 de mayo de 1994 con el nº l-1412.

43. Procedimiento para la producción de una proteína recombinante codificada por una secuencia determinada de nucleótidos, estando caracterizado dicho procedimiento porque comprende:

-: la introducción en un huésped celular de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38,

-: el crecimiento de dicho huésped celular con condiciones que permitan la expresión de dicha secuencia determinada de nucleótidos, y

-: la recuperación de la proteína recombinante.

44. Utilización de una secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 1 a 22, para el control de la expresión de la secuencia codificante de un gen.

45. Utilización de una secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 1 a 22, para la obtención de un alto nivel de expresión de la secuencia codificante de un gen.

46. Utilización de una secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 23 a 29, para la regulación post-transcripcional del producto de transcripción de la secuencia codificante de un gen.

47. Utilización de una secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, para aumentar la cantidad de ARNm de una secuencia codificante de un gen.