CN103255114B - 改进向细菌细胞中导入dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及改进向细菌宿主细胞中导入DNA的方法。
Description
对生物材料保藏的引用
本申请包含对生物材料保藏的引用,所述保藏通过提述并入本文。
对序列表的引用
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发明背景
发明领域
本发明涉及改进向细菌宿主细胞中导入DNA的方法。
相关领域描述
II型限制性内切核酸酶据报道是将DNA导入细菌的有效屏障(Briggs等,1994,Applied and Environmental Microbiology60:2006-2010;Accetto等,2005,FEMS Microbiology Letters247:177-183)。已经在芽孢杆菌属中表征了很多II型限制性内切核酸酶,并且已从芽孢杆菌属菌种分离出很多商业上可得到的限制性内切核酸酶(Roberts,等,2005,Nucleic Acids Research33:230-232)。
由于宿主DNA受到相应的DNA甲基转移酶的修饰,所以宿主DNA受到保护,免受其天然限制性内切核酸酶的切割。限制性内切核酸酶和DNA甲基转移酶通常在基因组中彼此相邻,构成限制-修饰(R-M)系统。这些基因在转录上可以会聚(convergent)、发散(divergent)或顺序方式定向。虽然限制性内切核酸酶彼此之间只有很小的序列相似性(即使有的话),但已经在很多限制性内切核酸酶中发现了有限的氨基酸基序,PD…D/EXK(Pingoud和Jeltsch,2001,Nucleic Acids Research29:3705-3727)。相反,已经发现了DNA甲基转移酶的几个通常的基序(Kumar等,1994,Nucleic Acids Research22:1-10;Smith等,1990,Proceedings of the National Academy of Sciences USA87:826-830),其允许通过首先鉴定限制性内切核酸酶的更同源的相应DNA甲基转移酶来鉴定限制性内切核酸酶。
将DNA导入细菌宿主细胞,例如地衣芽孢杆菌,可为低效率的方法,其产生很少的转化体(即使有的话)。本领域中需要将DNA导入细菌宿主细胞的新方法,以改进获得包含所述DNA的转化体的效率。
本发明涉及将DNA导入细菌宿主细胞的改进的方法。
发明概述
本发明涉及选自下组的编码DNA甲基转移酶的分离的多核苷酸:(a)编码多肽的多核苷酸,所述多肽包含与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337具有至少60%序列同一性的氨基酸序列;(b)多核苷酸,其包含与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101具有至少60%序列同一性的核苷酸序列;(c)多核苷酸,其在至少中严紧性条件下与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101或其全长互补链杂交;和(d)多核苷酸,其编码包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ IDNO:4的氨基酸1至337的变体。
本发明还涉及选自下组的分离的DNA甲基转移酶:(a)多肽,其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337具有至少60%序列同一性的氨基酸序列;(b)多肽,其由包含与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码;(c)多肽,其由在至少中严紧条件下与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101或其全长互补链杂交的多核苷酸编码;和(d)变体,其包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:4的氨基酸1至337。
本发明还涉及选自下组的编码限制性内切核酸酶的分离的多核苷酸:(a)多核苷酸,其编码包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381具有至少60%序列同一性的多肽;(b)多核苷酸,其包含与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列;(c)多核苷酸,其在至少中严紧条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143或其全长互补链杂交;和(d)多核苷酸,其编码包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸1至381的变体。
本发明还涉及选自下组的分离的限制性内切核酸酶:(a)多肽,其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列;(b)多肽,其由包含与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码;(c)多肽,其由在至少中严紧条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143或其全长互补链杂交的多核苷酸编码;和(d)变体,其包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸1至381。
本发明还涉及产生细菌转化体的方法,其包括:
(a)将DNA导入第一细菌宿主细胞,所述细胞包含编码DNA甲基转移酶的多核苷酸,以将DNA甲基化;
其中编码DNA甲基转移酶的多核苷酸选自下组:(i)多核苷酸,其编码包含与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的多肽;(ii)多核苷酸,其包含与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101具有至少60%序列同一性的核苷酸序列;(iii)多核苷酸,其在至少中严紧条件下可与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101或其全长互补链杂交;和(iv)多核苷酸,其编码包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:4的氨基酸1至337的变体;和
其中DNA甲基转移酶与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337的DNA甲基转移酶具有相同的特异性(specificity)。
(b)将来自第一细菌宿主细胞的甲基化DNA转移入第二细菌宿主细胞;其中第二细菌宿主细胞包含能降解DNA但不能降解甲基化DNA的限制性内切核酸酶;和
(c)分离包含甲基化DNA的第二细菌宿主细胞的转化体。
本发明还涉及产生细菌转化体的方法,其包括:
(a)用DNA甲基转移酶将DNA体外甲基化,以产生甲基化DNA;
其中DNA甲基转移酶选自下组:(i)多肽,其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337具有至少60%序列同一性的氨基酸序列;(ii)多肽,其由包含与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码;(iii)多肽,其由在至少中严紧条件下与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101或其全长互补链杂交的多核苷酸编码;和(iv)变体,其包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:4的氨基酸1至337;和
其中DNA甲基转移酶与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337的DNA甲基转移酶有相同的特异性。
(b)将甲基化DNA导入细菌宿主细胞,其中细菌宿主细胞包含能降解DNA但不能降解甲基化DNA的限制性内切核酸酶;和
(c)分离包含甲基化DNA的细菌宿主细胞转化体。
本发明还涉及产生细菌转化体的方法,其包括:
(a)将DNA导入包含编码限制性内切核酸酶的多核苷酸的细菌宿主细胞中,所述多核苷酸是失活的(inactivated);
其中编码限制性内切核酸酶的多核苷酸选自下组:(i)多核苷酸,其编码包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的多肽;(ii)多核苷酸,其包含与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列;(iii)多核苷酸,其在至少中严紧条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143或其全长互补链杂交;和(iv)多核苷酸,其编码包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸1至381的变体。
其中限制性内切核酸酶与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381的限制性内切核酸酶有相同的特异性;和
其中编码限制性内切核酸酶的多肽的失活防止导入的DNA被限制性内切核酸酶消化,且无需在将DNA导入细菌宿主细胞前用DNA甲基转移酶将DNA甲基化;和
(b)分离包含DNA的细菌宿主细胞的转化体。
本发明还涉及产生具有生物活性的多肽的方法,其包括:
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养包含导入的DNA的细菌宿主细胞,所述DNA编码所述多肽或与所述多肽的表达有关;
其中在将导入细菌宿主细胞之前,通过选自下组的DNA甲基转移酶将DNA甲基化:(i)多肽,其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337具有至少60%序列同一性的氨基酸序列;(ii)多肽,其由包含与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码;(iii)多肽,其由在至少中严紧条件下与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101或其全长互补链杂交的多核苷酸编码;和(iv)变体,其包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:4的氨基酸1至337;
其中DNA甲基转移酶与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337的DNA甲基转移酶具有相同的特异性;和
其中甲基化防止导入的DNA被细菌宿主细胞的限制性内切核酸酶消化;和
(b)回收所述具有生物活性的多肽。
本发明还涉及产生具有生物活性的多肽的方法,其包括:
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养包含导入的DNA的细菌宿主细胞,所述DNA编码所述具有生物活性的多肽或与所述多肽表达有关;
其中细菌宿主细胞包含编码限制性内切核酸酶的多核苷酸,所述多核苷酸是失活的;
其中编码限制性内切核酸酶的多核苷酸选自下组:(i)多核苷酸,其编码包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的多肽;(ii)多核苷酸,其包含与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列;(iii)多核苷酸,其在至少中严紧条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143或其全长互补链杂交;和(iv)多核苷酸,其编码包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸1至381的变体。
其中限制性内切核酸酶与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381的限制性内切核酸酶有相同的特异性;和
其中编码限制性内切核酸酶的多核苷酸的失活防止导入的DNA被限制性内切核酸酶消化,且无需在将DNA导入细菌宿主细胞之前用DNA甲基转移酶将DNA甲基化;和
(b)回收所述具有生物活性的多肽。
本发明还涉及上述细菌宿主细胞。
本发明还涉及产生亲本细菌细胞的突变体的方法,其包括:
(a)向亲本细菌细胞中导入包含核酸构建体的DNA,以使亲本细菌细胞中编码多肽的基因失活,这产生与在相同条件下培养时的亲本细胞相比产生较少的所述多肽的突变体细胞;
其中细菌宿主细胞包含编码限制性内切核酸酶的多核苷酸,所述多核苷酸是失活的;
其中编码限制性内切核酸酶的多核苷酸选自下组:(i)多核苷酸,其编码包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的多肽;(ii)多核苷酸,其包含与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列;(iii)多核苷酸,其在至少中严紧条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143或其全长互补链杂交;和(iv)多核苷酸,其编码包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸1至381的变体。
其中限制性内切核酸酶与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381的限制性内切核酸酶有相同的特异性;和
其中编码限制性内切核酸酶的多核苷酸的失活防止导入的DNA被限制性内切核酸酶消化,且无需在将DNA导入亲本细菌细胞之前用DNA甲基转移酶将DNA甲基化;和
(b)分离突变体细胞。
本发明还涉及产生亲本细菌细胞的突变体的方法,其包括:
(a)向亲本细菌细胞中导入包含核酸构建体的DNA,以使亲本细菌细胞中编码所述多肽的基因失活,这产生与在相同条件下培养时的亲本细胞相比产生较少的所述多肽的突变体细胞;
其中在导入细菌宿主细胞之前,用选自下组的DNA甲基转移酶将DNA甲基化:(i)多肽,其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337具有至少60%序列同一性的氨基酸序列;(ii)多肽,其由包含与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码;(iii)多肽,其由在至少中严紧条件下与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101或其全长互补链杂交的多核苷酸编码;和(iv)变体,其包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:4的氨基酸1至337。
其中DNA甲基转移酶与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337的DNA甲基转移酶有相同的特异性;和
其中甲基化防止导入的DNA被亲本细菌细胞的限制性内切核酸酶消化;和
(b)分离突变体细胞。
附图简述
图1A和1B显示地衣芽孢杆菌M.Bli1904II限制性内切核酸酶的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:1和2)。
图2显示地衣芽孢杆菌Bli1904IIDNA甲基转移酶的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:3和4)。
图3显示地衣芽孢杆菌Bli1904II限制-修饰系统的基因组DNA序列(SEQID NO:5),其包含编码Bli1904II限制性内切核酸酶和M.Bli1904II DNA甲基转移酶的基因。Bli1904II限制性内切核酸酶编码区的反向互补体(reversecomplement)用双下划线表示,而M.Bli1904II DNA甲基转移酶编码区的反向互补体用单下划线表示。
图4显示pMDT138的限制图谱。
图5显示pKK223-3的限制图谱。
图6显示pNBT51的限制图谱。
图7显示pNBT52的限制图谱。
图8显示pNBT53的限制图谱。
图9显示pNBT54的限制图谱。
图10显示pNBT35的限制图谱。
图11显示pNBT30的限制图谱。
图12显示pNBT31的限制图谱。
图13显示pNBT36的限制图谱。
图14显示pMDT100的限制图谱。
图15显示pMDT156的限制图谱。
图16显示pMDT134的限制图谱。
图17显示pMDT131的限制图谱。
图18显示pMDT139的限制图谱。
定义
M.Bli1904II DNA甲基转移酶:术语“M.Bli1904II DNA甲基转移酶”在本文中定义为DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶(DNA(cytosine-5)-methyltransferase)(E.C.2.1.1.37),其催化甲基从S-腺苷-L-蛋氨酸转移至序列GCNGC中的DNA上,得到S-腺苷-L-高半胱氨酸和包含5-甲基胞嘧啶的DNA。就本发明而言,根据Pfeifer等,1983,Biochim.Biophys.Acta740:323-30所述的步骤测定DNA甲基转移酶活性。一个单位的DNA甲基转移酶活性是:在20μl的总反应体积中在1小时内针对相应限制性内切核酸酶的切割保护1μgλDNA所需的量。
本发明的DNA甲基转移酶具有下述多肽的DNA甲基转移酶活性的至少20%,优选至少40%,更优选至少50%,更优选至少60%,更优选至少70%,更优选至少80%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,和甚至最优选至少100%,所述多肽包含如下或由如下组成:如SEQ ID NO:4的氨基酸1至337所示的氨基酸序列。
Bli1904II限制性内切核酸酶:术语“Bli1904II限制性内切核酸酶”在本文中定义为II型限制性内切核酸酶,其催化DNA的位点特异性内溶核切割(endonucleolytic cleavage),以得到特定的双链DNA片段(EC3.1.21.4)。就本发明而言,根据已建立的用于II型限制性内切核酸酶的步骤(例如,Jeltsch和Pingoud,2001,Methods Mol.Biol.160:287-308)测定Bli1904II限制性内切核酸酶活性。根据定义,一个单位的限制性内切核酸酶活性将在37℃在60分钟内完全消化50μl反应液中的一μg底物DNA。
本发明的限制性内切核酸酶具有下述多肽的限制性内切核酸酶活性的至少20%,优选至少40%,更优选至少50%,更优选至少60%,更优选至少70%,更优选至少80%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,和甚至最优选至少100%,所述多肽包含如下或由如下组成:如SEQ ID NO:2的氨基酸1至381所示的氨基酸序列。
限制-修饰系统:术语“限制-修饰系统”在本文中定义为限制性内切核酸酶,保护DNA免受限制性内切核酸酶切割的相应的DNA甲基转移酶,和编码这两个酶的基因。
分离的多肽:术语“分离的多肽”用于本文中指由其来源分离的多肽。在优选的方面,所述多肽为至少1%纯,至少5%纯,更优选至少10%,更优选至少20%纯,更优选至少40%纯,更优选至少60%纯,甚至更优选至少80%纯,和最优选至少90%纯的,如通过SDS-PAGE测定的。
基本上纯的多肽:术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物,所述多肽制备物按重量计含有至多10%,优选至多8%,更优选至多6%,更优选至多5%,更优选至多4%,更优选至多3%,甚至更优选至多2%,最优选至多1%,并且甚至最优选至多0.5%的与其天然或重组结合的(associated)的其它多肽材料。因此,优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92%纯,优选至少94%纯,更优选至少95%纯,更优选至少96%纯,更优选至少96%纯,更优选至少97%纯,更优选至少98%纯,甚至更优选至少99%纯,最优选至少99.5%纯,并且甚至最优选100%纯的。本发明的多肽优选是基本上纯的形式,即,所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。这能够通过以下方式实现,例如,通过公知的重组方法或通过经典纯化方法来制备多肽。
同一性:参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言,两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定,如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular BiologyOpen Software Suite,Rice等,2000,Trends in Genetics16:276-277)的Needle程序中所执行的,优选使用3.0.0版或以后的版本。使用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10,缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5,和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性,并计算如下:(相同残基×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言,两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)测定,如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite,Rice等,2000,见上文)的Needle程序所执行的,优选使用3.0.0版或以后的版本。使用的可选参数为缺口开放罚分10,缺口延伸罚分0.5,和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性,并计算如下:(相同脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
多肽片段:术语“多肽片段”在本文中定义为从SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:2的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽,或其同源序列;其中所述片段分别具有DNA甲基转移酶或限制性内切核酸酶活性。在优选的方面,SEQ ID NO:2或其同源物的片段含有至少320个氨基酸残基,更优选至少340个氨基酸残基,并且最优选至少360个氨基酸残基。在另一个优选的方面,SEQ ID NO:4或其同源物的片段含有至少290个氨基酸残基,更优选至少305个氨基酸残基,并且最优选至少320个氨基酸残基。
亚序列:术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:1的5’和/或3’端缺失一个或多个核苷酸的核苷酸序列,或其同源序列;其中所述亚序列分别编码具有DNA甲基转移酶活性或限制性内切核酸酶的多肽片段。在优选的方面,SEQ ID NO:1或其同源物的亚序列含有至少960个核苷酸,更优选至少1020个核苷酸,并且最优选至少1080个核苷酸。在另一个优选的方面,SEQ ID NO:3或其同源物的亚序列含有至少870个核苷酸,更优选至少915个核苷酸,并且最优选至少960个核苷酸。
等位变体(allelic variant):术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生,并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
分离的多核苷酸:术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。在优选的方面,所述多核苷酸为至少1%纯,优选至少5%纯,更优选至少10%纯,更优选至少20%纯,更优选至少40%纯,更优选至少60%纯,甚至更优选至少80%纯,并且最优选至少90%纯的,如通过琼脂糖电泳测定的。
基本上纯的多核苷酸:术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指不含其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物,并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程的蛋白质生产体系中使用的形式。因此,基本上纯的多核苷酸按重量计含有至多10%,优选至多8%,更优选至多6%,更优选至多5%,更优选至多4%,更优选至多3%,甚至更优选至多2%,最优选至多1%,并且甚至最优选至多0.5%的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而,基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区,例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯,优选至少92%纯,更优选至少94%纯,更优选至少95%纯,更优选至少96%纯,更优选至少97%纯,甚至更优选至少98%纯,最优选至少99%,并且甚至最优选至少99.5%纯的。本发明所述多核苷酸优选为基本上纯的形式,即,所述多核苷酸制备物基本上不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的,或它们的任何组合。
核酸构建体:术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子,其分离自天然存在的基因,或将其修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时,术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
调控序列(control sequence):术语“调控序列”在本文定义为包括表达编码本发明多肽的多核苷酸所必需的所有组分。各种调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的,或各种调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况,调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可具有用于导入特异性限制位点的接头,所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。
可操作地连接:术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型,其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的合适位置,使得调控序列指导多肽的编码序列的表达。
编码序列:当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框确定,所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始,并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。
表达:术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤,其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体:术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子,其包含编码本发明多肽的多核苷酸,并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
宿主细胞:如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型,所述细胞类型对于使用核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导、接合(conjugation)等是易感的(susceptible)。
导入:术语“导入”及其变化形式在本文定义为将DNA转入细菌细胞。可以通过本领域任何已知方法完成向细菌细胞中导入DNA,所述方法包括,但不限于,转化、转染、转导、接合等。
转化:术语“转化”在本文定义为将纯化的DNA导入细菌细胞,使DNA作为染色体整合体或作为自复制的染色体外载体保留。术语“转化”通常应该理解为包括转染、转导、接合等。
转染:术语“转染”在本文定义为用病毒核酸转化细菌细胞。
转导:术语“转导”在本文定义为将来自第一细菌细胞的DNA包装入病毒颗粒,并通过用病毒颗粒感染第二细胞,将细菌DNA转入第二细菌细胞。
接合:术语“接合”在本文定义为通过细胞与细胞的接触,将DNA直接从一个细菌细胞转移至另一个细菌细胞。
转化体:术语“转化体”在本文定义为通常涵盖任何已经向其中导入DNA的细菌宿主细胞。因此,术语“转化体”包括转染体、接合体等。
供体细胞:术语“供体细胞”在本文定义为通过任何方法导入另一个细胞的DNA的来源细胞。
受体细胞:术语“受体细胞”在本文定义为DNA导入的细胞。
修饰:术语“修饰”在本文的意思是,对由SEQ ID NO:4的氨基酸1至337或SEQ ID NO:2的氨基酸1至381组成的多肽或其同源序列的任何化学修饰,以及对编码所述多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入,以及一个或多个(几个)氨基酸侧链的置换。
人工变体:当用在本文时,术语“人工变体”的意思是具有限制性内切核酸酶或DNA甲基转移酶活性的多肽,所述多肽分别由表达SEQ ID NO:1的核苷酸1至1043或SEQ ID NO:3的核苷酸1至1011或其同源序列的修饰的多核苷酸序列的生物体产生。所述修饰的多核苷酸序列通过人为干预(human intervention),通过修饰SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或其同源序列中公开的核苷酸序列来获得。
发明详述
本发明涉及产生细菌转化体的方法,其包括:(a)将DNA导入包含编码DNA甲基转移酶的多核苷酸的第一细菌宿主细胞,以将DNA甲基化;其中编码DNA甲基转移酶的多核苷酸选自下组:(i)多核苷酸,其编码包含与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的多肽;(ii)多核苷酸,其包含与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101具有至少60%序列同一性的核苷酸序列;(iii)多核苷酸,其在至少中严紧条件下与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101或其全长互补链杂交;和(iv)多核苷酸,其编码包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:4的氨基酸1至337的变体;并且其中DNA甲基转移酶与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337的DNA甲基转移酶具有相同的特异性;(b)将甲基化的DNA从第一细菌宿主细胞转移进第二细菌宿主细胞;其中第二细菌宿主细胞包含能降解DNA但不能降解甲基化DNA的限制性内切核酸酶;和(c)分离包含甲基化DNA的第二细菌宿主细胞的转化体。
本发明还涉及产生细菌转化体的方法,其包括:(a)在体外用DNA甲基转移酶将DNA甲基化,以产生甲基化的DNA;其中DNA甲基转移酶选自下组:(i)多肽,其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337具有至少60%序列同一性的氨基酸序列;(ii)多肽,其由包含与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码;(iii)多肽,其由在至少中严紧条件下与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101或其全长互补链杂交的多核苷酸编码;和(iv)变体,其包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:4的氨基酸1至337;并且其中DNA甲基转移酶与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337的DNA甲基转移酶具有相同的特异性;(b)将甲基化的DNA导入细菌宿主细胞;其中细菌宿主细胞包含能降解DNA但不能降解甲基化DNA的限制性内切核酸酶;和(c)分离包含甲基化DNA的细菌宿主细胞的转化体。
本发明还涉及产生细菌转化体的方法,其包括:(a)将DNA导入包含编码限制性内切核酸酶的多核苷酸的细菌宿主细胞,所述多核苷酸是失活的;其中编码限制性内切核酸酶的多核苷酸选自下组:(i)多核苷酸,其编码包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的多肽;(ii)多核苷酸,其包含与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1011具有至少60%序列同一性的核苷酸序列;(iii)多核苷酸,其在至少中严紧条件下与SEQ IDNO:1的核苷酸1至1143或其全长互补链杂交;和(iv)多核苷酸,其编码包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸1至381的变体;其中限制性内切核酸酶与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381的限制性内切核酸酶具有相同的特异性,并且其中编码限制性内切核酸酶的多核苷酸的失活防止导入的DNA被限制性内切核酸酶消化,且无需在将DNA导入细菌宿主细胞之前用DNA甲基转移酶将DNA甲基化,和(b)分离包含DNA的细菌宿主细胞的转化体。
在本发明的方法中,将DNA导入细菌宿主细胞可以通过下述方式完成:(1)将编码细菌宿主细胞的限制性内切核酸酶的多核苷酸失活,使导入的DNA不被限制性内切核酸酶降解或(2)在导入细菌宿主细胞之前用DNA甲基转移酶将DNA甲基化,使导入的甲基化DNA不被细菌宿主细胞的限制性内切核酸酶降解。DNA甲基转移酶或限制性内切核酸酶对于细菌宿主细胞可以是天然的或外源的。
在一个方面,可以在体外完成DNA的甲基化。例如,可以回收本发明的DNA甲基转移酶并将其用于在S-腺苷-L-甲硫氨酸存在的情况下将DNA甲基化,得到S-腺苷-L-高半胱氨酸和含5-甲基胞嘧啶的DNA。
在另一个方面,DNA的甲基化可以在体内完成。例如,可通过下述方式完成DNA的甲基化:从细菌宿主细胞(受体细胞)克隆编码DNA甲基转移酶的多核苷酸,并在另一个细菌细胞(供体细胞)中表达DNA甲基转移酶编码序列,其中将DNA导入并甲基化,然后将甲基化DNA转移或导入从中分离出DNA甲基转移酶编码序列的细菌宿主细胞(受体细胞)。在另一个方面,编码DNA甲基转移酶的多核苷酸可以获得自不是受体细胞的另一种生物体。在又一个方面,供体宿主细胞可以已经包含本发明编码DNA甲基转移酶的多核苷酸或其同源物。
将甲基化DNA导入细菌宿主细胞可以通过下述方式完成:由第一细菌细胞转移入第二细菌细胞,即,通过接合,或者从第一细菌细胞分离甲基化DNA,然后将分离的甲基化DNA导入第二细菌细胞,例如,通过转化。
与常规方法相比,本发明的方法将获得的转化体数目增加至至少10倍,优选至少100倍,更优选至少1000倍,甚至更优选至少10,000倍,并且最优选至少100,000倍,所述常规方法不将本发明的限制性内切核酸酶失活或不用本发明的DNA甲基转移酶将DNA甲基化。
限制性内切核酸酶基因和DNA甲基转移酶基因及它们的酶
在第一个方面,本发明涉及编码具有DNA甲基转移酶活性的多肽的分离的多核苷酸,所述多肽包含下述氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337具有至少60%,优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,并且甚至最优选至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性程度,所述多肽具有DNA甲基转移酶活性(下文中的“同源多肽”或“同源物”)。在优选的方面,所述具有DNA甲基转移酶活性的同源多肽包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337相差十个氨基酸,优选相差五个氨基酸,更优选相差四个氨基酸,甚至更优选相差三个氨基酸,最优选相差两个氨基酸,并且甚至最优选相差一个氨基酸。
本发明的分离的多核苷酸优选编码具有DNA甲基转移酶活性的多肽,所述多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其等位变体;或其具有DNA甲基转移酶活性的片段。在优选的方面,多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另一个优选的方面,多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸1至337,或其等位变体;或其具有DNA甲基转移酶活性的片段。在另一个优选方面,多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸1至337。在另一个优选方面,多肽由SEQ ID NO:4的氨基酸序列,或其等位变体;或其具有DNA甲基转移酶活性的片段组成。在另一个优选方面,多肽由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。在另一个优选方面,多肽由SEQ ID NO:4的氨基酸1至337,或其等位变体;或其具有DNA甲基转移酶活性的片段组成。在另一个优选方面,多肽由SEQ ID NO:4的氨基酸1至337组成。
本发明还涉及分离的多核苷酸,其包含编码具有DNA甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列。在优选的方面,所述核苷酸序列列于SEQ ID NO:3中。在另一个更优选的方面,核苷酸序列为包含于大肠杆菌NRRL B-41967中的质粒pMDT138所包含的序列。在另一个优选的方面,核苷酸序列是SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101。在另一个更优选的方面,核苷酸序列是包含于大肠杆菌NRRL B-41967中的质粒pMDT138所包含的SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101。本发明还包括编码具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列,其由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:3。本发明还涉及SEQ ID NO:3的亚序列,其编码具有DNA甲基转移酶活性的SEQ ID NO:4的片段。
在另一个第一方面,本发明涉及编码具有限制性内切核酸酶活性的多肽的分离的多核苷酸,所述多肽包含下述氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ IDNO:2的氨基酸1至381具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,并且甚至最优选至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性程度,所述多肽具有限制性内切核酸酶活性(在下文中“同源多肽”或“同源物”)。在优选的方面,所述具有限制性内切核酸酶活性的同源多肽包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381相差十个氨基酸,优选相差五个氨基酸,更优选相差四个氨基酸,甚至更优选相差三个氨基酸,最优选相差两个氨基酸,并且甚至最优选相差一个氨基酸。
本发明的分离的多核苷酸优选编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的具有限制性内切核酸酶活性的多肽或其等位变体;或其具有限制性内切核酸酶活性的片段。在优选的方面,多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另一个优选的方面,多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至381,或其等位变体;或其具有限制性内切核酸酶活性的片段。在另一个优选方面,多肽包含SEQID NO:2的氨基酸1至381。在另一个优选方面,多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列,或其等位变体;或其具有限制性内切核酸酶活性的片段组成。在另一个优选方面,多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。在另一个优选方面,多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸1至381,或其等位变体;或其具有限制性内切核酸酶活性的片段组成。在另一个优选方面,多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸1至381组成。
本发明还涉及分离的多核苷酸,其包含编码具有限制性内切核酸酶活性的多肽的核苷酸序列。在另一个优选的方面,所述核苷酸序列列于SEQ ID NO:1中。在另一个更优选的方面,核苷酸序列为包含于大肠杆菌NRRL B-41968中的质粒pMDT156所包含的序列。在另一个优选的方面,核苷酸序列是SEQID NO:1的核苷酸1至1143。在另一个更优选的方面,核苷酸序列是包含于大肠杆菌NRRL B-41968中的质粒pMDT156所包含的SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143。本发明还包括编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列,其由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:1。本发明还涉及SEQ ID NO:1的亚序列,其编码具有限制性内切核酸酶活性的SEQ ID NO:2的片段。
在第二方面,本发明涉及编码具有DNA甲基转移酶活性的多肽的分离的多核苷酸,所述多核苷酸在非常低严紧条件下,优选低严紧条件下,更优选中严紧条件下,更优选中-高严紧条件下,甚至更优选高严紧条件下,并且最优选非常高严紧条件下,与以下序列杂交:(i)SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101,(ii)(i)的亚序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor,New York)。SEQ ID NO:1的亚序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。此外,所述亚序列可编码具有DNA甲基转移酶活性的多肽片段。
在另一个第二方面,本发明涉及编码具有限制性内切核酸酶活性的多肽的分离的多核苷酸,所述多核苷酸在非常低严紧条件下,优选低严紧条件下,更优选中严紧条件下,更优选中-高严紧条件下,甚至更优选高严紧条件下,并且最优选非常高严紧条件下,与以下序列杂交:(i)SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143,(ii)(i)的亚序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,见上文)。SEQ ID NO:1的亚序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。此外,所述亚序列可编码具有限制性内切核酸酶活性的多肽片段。
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列或其亚序列,以及SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其片段,可用于设计核酸探针,以根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆编码具有限制性内切核酸酶活性或DNA甲基转移酶活性的多肽的DNA。具体而言,根据标准的Southern印迹方法,可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组DNA杂交,以鉴定和分离其中相应的基因。这些探针可明显短于完整序列,但长度上应为至少14,优选至少25,更优选至少35,并且最优选至少70个核苷酸。然而,优选所述核酸探针长度为至少100个核苷酸。例如,所述核酸探针长度上可以是至少200个核苷酸,优选至少300个核苷酸,更优选至少400个核苷酸,或最优选至少500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针,例如,长度是至少600个核苷酸,至少优选至少700个核苷酸,更优选至少800个核苷酸,或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如,用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针包含于本发明中。
因而,可从由这些其它生物体制备的基因组DNA文库中筛选DNA,所述DNA与上述探针杂交并且编码具有限制性内切核酸酶或DNA甲基转移酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳,或其它分离技术分离来自这些其它生物体的基因组DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或其亚序列同源的克隆或DNA,将所述载体材料用在Sounthern印迹中。
就本发明而言,杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严紧条件下与标记的核酸探针杂交,所述核酸探针对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列、它的全长互补链或其亚序列。可使用X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
在优选的方面,核酸探针是多核苷酸,其包含编码SEQ ID NO:2的多肽的核苷酸序列,或其亚序列。在另一个优选方面,核酸探针是SEQ ID NO:1或其全长互补链。在另一个优选方面,核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码区。在另一个优选方面,核酸探针是包含于大肠杆菌NRRL B-41967中的质粒pMDT138所包含的多核苷酸,其中所述其核苷酸序列编码具有限制性内切核酸酶的多肽。在另一个优选方面,核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-41967中的质粒pMDT138所包含的成熟多肽编码区。
在另一个优选的方面,核酸探针是多核苷酸,其包含编码SEQ ID NO:4的多肽的核苷酸序列,或其亚序列。在另一个优选方面,核酸探针是SEQ IDNO:3或其全长互补链。在另一个优选方面,核酸探针是SEQ ID NO:3的成熟多肽编码区。在另一个优选方面,核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-41968中的质粒pMDT156所包含的多核苷酸,其中所述其核苷酸序列编码具有DNA甲基转移酶活性的多肽。在另一个优选方面,核酸探针是包含于大肠杆菌NRRL B-41968中的质粒pMDT156所包含的成熟多肽编码区。
对于长度至少100个核苷酸的长探针,将非常低至非常高的严紧条件定义为在42℃,在5X SSPE、0.3%SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中,并且对于非常低和低严紧性为25%的甲酰胺、对于中和中-高严紧性为35%的甲酰胺、或对于高和非常高严紧性为50%的甲酰胺,根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针,使用2X SSC、0.2%SDS优选至少在45℃(非常低严紧性),更优选至少在50℃(低严紧性),更优选至少在55℃(中严紧性),更优选至少在60℃(中-高严紧性),甚至更优选至少在65℃(高严紧性),并且最优选至少在70℃(非常高严紧性)将载体材料最终洗涤三次,每次15分钟。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针,将严紧条件定义为在比根据Bolton和McCarthy计算法(1962,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA48:1390)得出的Tm低大约5℃至大约10℃,在0.9MNaCl,0.09M Tris-HCl pH7.6,6mM EDTA,0.5%NP-40,1×Denhardt溶液,1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate),1mM磷酸二氢钠(sodium monobasicphosphate),0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中,根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至24小时。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针,将所述载体材料在6×SSC加0.1%SDS中洗涤一次15分钟,并用6×SSC在比计算的Tm低5℃至10℃的温度下洗涤两次,每次15分钟。
在第三个方面,本发明涉及编码人工变体的分离的多核苷酸,所述人工变体包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4或其同源序列;或其成熟多肽。优选氨基酸改变对性质是较不重要的(ofa minor nature),即保守的氨基酸取代或插入,其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性;小缺失,通常缺失1至大约30个氨基酸;小的氨基或羧基末端延伸,例如氨基末端甲硫氨酸残基;多至大约20-25个残基的小接头肽;或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸(例如多组氨酸区(poly histidinetract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain))。
保守取代的实例是在以下组之内:碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的,并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,In,The Proteins,Academic Press,New York描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
除了20个基本氨基酸,非基本氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰,和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成,并且优选是商业上可获得的,包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸,和3,3-二甲基脯氨酸。
可选地,氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如,氨基酸改变可改进多肽的热稳定性,改变底物特异性,改变最适pH等。
能够根据本领域已知的方法,例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中,将单一丙氨酸突变导入到分子中的每个残基,并且测试所得突变分子的生物活性(即,限制性内切核酸酶或DNA甲基转移酶活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定,如通过以下这些技术:如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记,连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如deVos等,1992,Science255:306-312;Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断,所述多肽与根据本发明的多肽相关。
能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法,然后是有关的筛选方法,例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57;Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如,Lowman等,1991,Biochem.30:10832-10837;美国专利号5,223,409;WO92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene46:145;Ner等,1988,DNA7:127)。
诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子,并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速确定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性,并且能够应用于未知结构的多肽。
SEQ ID NO:4的氨基酸1至337的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10,优选9,更优选8,更优选7,更优选至多6,更优选5,更优选4,甚至更优选3,最优选2,并且甚至最优选1。
SEQ ID NO:2的氨基酸1至381的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10,优选9,更优选8,更优选7,更优选至多6,更优选5,更优选4,甚至更优选3,最优选2,并且甚至最优选1。
本发明还涉及选自下组的分离的甲基转移酶:(a)多肽,其包含与SEQ IDNO:4的氨基酸1至337具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,和甚至最优选至少96%,至少97%,至少98%,或者至少99%序列同一性的氨基酸序列;(b)多肽,其由包含与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,和甚至最优选至少96%,至少97%,至少98%,或者至少99%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码;(c)多肽,其由在优选至少中严紧条件下,更优选至少中-高严紧条件下,和最优选至少高严紧条件下,与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101或其全长互补链杂交的多核苷酸编码;和(d)变体,包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:4的氨基酸1至337。
本发明还涉及选自下组的分离的限制性内切核酸酶:(a)多肽,其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,和甚至最优选至少96%,至少97%,至少98%,或者至少99%序列同一性的氨基酸序列;(b)多肽,其由包含与SEQ IDNO:1的核苷酸1至1143具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,和甚至最优选至少96%,至少97%,至少98%,或者至少99%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码;(c)多肽,其由在优选至少中严紧条件下,更优选至少中-高严紧条件下,和最优选至少高严紧条件下,与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143或其全长互补链杂交的多核苷酸编码;和(d)变体,包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸1至381。
限制性内切核酸酶基因的失活
在本发明的方法中,可以通过将限制性内切核酸酶编码多肽失活而完成DNA向细菌宿主细胞的导入,所述多肽对于细菌宿主细胞是天然或外源的,从而导入的DNA不被限制性内切核酸酶降解。多核苷酸可以是限制-修饰系统的组分。
可以使用本领域公知的方法,例如基因的插入、破坏、置换或缺失,完成细菌宿主细胞中本发明的限制性内切核酸酶基因或其同源物的失活。待失活的基因部分可以是,例如,编码区或表达编码区所需的调节元件。这种调节或调控序列的实例可以是启动子序列或其功能部分,即,足以影响核苷酸序列表达的部分。用于可能的修饰的其他调控序列包括,但不限于,前导序列、前肽序列、信号序列、转录终止子和转录激活子。
通过基因缺失技术消除或减少基因的表达,可以实现将本发明的限制性内切核酸酶基因的失活。基因缺失技术能部分或全部去除基因,从而消除其表达。在这样的方法中,可以使用经过构建连续包含基因侧翼的5’和3’区的质粒,通过同源重组完成基因的缺失。可以将连续的5’和3’区导入细菌细胞,例如,在温度敏感质粒上,如pE194,其在许可的温度与选择性标记结合以允许质粒在细胞中建立。然后将细胞转移至不许可的温度,以选择质粒整合入染色体在同源侧翼区之一的细胞。通过选择选择性标记而选择质粒的整合。整合后,通过将细胞转移至许可温度培养几代而不进行选择来刺激在第二同源侧翼区的重组事件。涂布细胞以获得单菌落,检查菌落中选择性标记的丢失(参见,例如,Perego,1993,于A.L.Sonneshein,J.A.Hoch,和R.Losick编,Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria,第42章,American Societyof Microbiology,Washington,D.C.)。
也可通过在本发明的限制性内切核酸酶基因或其转录或翻译所必需的调控元件中导入、取代,或去除一个或多个核苷酸来完成所述基因的失活。例如,可以插入或去除核苷酸从而导致终止密码子的导入,起始密码子的去除,或开放阅读框的移码(frame-shift)。可按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变来完成这种修饰或失活。参见,例如,Botstein和Shortle,1985,Science229:1193-1201;Lo等,1984,Proceedings of the National Academy ofSciences USA81:2285-2289;Higuchi等,1988,Nucleic Acids Research16:7351-7367;Shimada,1996,Meth.Mol.Biol.57:157-165;Ho等,1989,Gene77:51-59;Horton等,1989,Gene77:61-68;及Sarkar和Sommer,1990,BioTechniques8:404-407。
也可通过将本发明的限制性内切核酸酶基因插入包含与该基因同源的核酸片段的整合型质粒,产生同源区的复制序列并且在复制区之间并入载体DNA,从而通过基因破坏技术来完成所述基因的失活。如果插入载体将基因的启动子与编码区相分开或者阻断编码序列从而得到无功能基因产物,这样的基因破坏就能够消除基因表达。破坏构建体可以仅为伴有与基因同源的5’和3’区的选择性标记基因。选择性标记使得能够鉴定包含破坏基因的转化体。
也可通过基因转换(gene conversion)的方法,完成本发明的限制性内切核酸酶的失活(参见,例如,Iglesias和Trautner,1983,Molecular General Genetics189:73-76)。例如,在基因转换方法中,将相应于基因的核苷酸序列在体外诱变以产生缺陷性核苷酸序列,随后将其转化入亲本细菌细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组,所述缺陷性核苷酸序列替代了所述基因。理想的是所述缺陷基因或基因片段还编码标记,其可用于选择包含缺陷基因的转化体。例如,可以将缺陷基因导入与选择性标记有关的非复制的或温度敏感型质粒。通过在不允许质粒复制的条件下对标记进行选择而选择质粒的整合。通过检查菌落中选择性标记的丢失和突变基因的获得,来选择导致基因替换的第二次重组事件(参见,例如,Perego,1993,见上文)。或者,缺陷性核酸序列可以包含基因的一个或多个核苷酸的插入、取代或缺失,如下所述。
也可以使用与本发明限制性内切核酸酶基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列通过确定的反义技术来完成所述基因的失活(Parish和Stoker,1997,FEMSMicrobiology Letters154:151-157)。更具体地,可通过导入与所述基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列来减少或消除细菌细胞的基因表达,所述互补的核苷酸序列可以在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂交。在允许所述互补反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下,由此减少或消除翻译的蛋白质的量。也可以通过RNA干扰技术完成失活(参见,例如,美国专利6,506,559)。
可以使用本领域公知的方法,通过随机或特异性诱变,进一步完成本发明的限制性内切核酸酶基因的失活,所述方法包括,但不限于,化学诱变(参见,例如,Hopwood,The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology(J.R.Norris和D.W.Ribbons编)363-433页,Academic Press,New York,1970)和转座(参见,例如,Youngman等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:2305-2309)。可以通过向亲本细胞施以诱变,并且选择其中已将所述基因的表达减少或消除的突变体细胞来进行基因的修饰。诱变可为特异性的或随机的,可以例如通过如下方式进行:使用合适的物理或化学诱变剂,使用合适的寡核苷酸,或将所述DNA序列进行PCR产生的诱变。此外,可以通过使用这些诱变方法的任何组合来进行诱变。
适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、N-甲基-N’-亚硝基胍(NTG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethyl methane sulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。当使用这些试剂时,通常通过如下方式来进行所述诱变:在合适条件下存在优选的诱变剂时温育待诱变的亲本细胞,并选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变体细胞。
在优选的方面,细菌宿主细胞中限制性内切核酸酶的失活未用选择性标记进行标记。
可通过在反-选择(counter-selection)培养基中培育突变体,来去除选择性标记基因。其中选择性标记包含其5’和3’末端侧翼的重复序列,所述重复序列将在对突变体细胞进行反-选择时,通过同源重组促进选择性标记基因的出环(loop out)。通过向突变体细胞导入包含缺陷基因的5’和3’区但缺少选择性标记基因的核酸片段,然后在反-选择培养基上选择,从而通过同源重组去除选择性标记基因。通过同源重组,用缺少选择性标记基因的核酸片段替代包含选择性标记基因的缺陷基因。也可以使用本领域其他已知方法。
核酸构建体
可以用许多方式操作编码本发明目的多肽,例如具有生物活性的多肽,或DNA甲基转移酶或限制性内切核酸酶的多核苷酸以用于多核苷酸在合适的细菌宿主细胞中的表达,例如使目的DNA甲基化或用于产生和回收DNA甲基转移酶,使其能用于体外甲基化。依赖于核酸构建体或载体或细菌宿主细胞,在将多核苷酸的核苷酸序列插入核酸构建体或载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用克隆方法修饰核苷酸序列的技术是本领域熟知的。
包含编码目的多肽的多核苷酸的核酸构建体与一个或多个调控序列可操作地连接,所述调控序列在细菌宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。
每个调控序列对于编码目的多肽的核苷酸序列可以是天然或外源的。这样的调控序列包括,但不限于,前导序列、启动子、信号序列和转录终止子。最少的情况,调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以提供有用于导入特异性限制位点的接头,所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。
调控序列可以是合适的启动子序列,其是由用于表达核苷酸序列的细菌宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导目的多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选细菌宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列,并可获得自指导与细菌宿主细胞同源或异源的具有生物活性的胞外或胞内多肽的合成的基因。
用于指导本发明的核酸构建体在细菌细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子:大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA75:3727-3731),以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proceedings of the National Academy ofSciences USA80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteins from recombinantbacteria"于Scientific American,1980,242:74-94中;和J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor,New York中描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列,是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码DNA甲基转移酶的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。在所选细菌宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明中。
调控序列还可以是合适的前导序列,其是对于细菌细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于指导具有生物活性的多肽合成的核苷酸序列的5’-末端。在所选细菌宿主细胞中有功能的任何前导序列都可用于本发明中。
调控序列还可以是信号肽编码区,其编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列,其可指导表达的多肽进入细胞的分泌途径。信号肽编码区对于所述多肽可为天然的或可从外部来源获得。核苷酸序列的编码序列的5’端可固有地包含信号肽编码区,其与编码分泌多肽的编码区片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可选地,编码序列5’端可含有信号肽编码区,其对于所述编码序列的部分来说是外源的且编码分泌的多肽。外源信号肽编码区在编码序列不通常地含有信号肽编码区时可能是必需的。或者,相对于与编码序列正常结合的天然信号肽编码区,外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以获得增强的多肽分泌。信号肽编码去可以获得自芽孢杆菌菌属菌种的淀粉酶或蛋白酶基因。然而,指导表达的多肽进入所选细菌宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区可用于本发明中。
对于细菌细胞例如芽孢杆菌属细胞有效的信号肽编码区是从如下获得的信号肽编码区:芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶(subtilisin)基因、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA基因。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57:109-137描述。
调控序列还可以是mRNA稳定序列。术语“mRNA稳定序列”在本文中定义为位于启动子区下游和多核苷酸的编码序列上游的序列,启动子区与其可操作地连接,使由启动子区合成的所有mRNA可以被加工以产生mRNA转录子,其5’末端具有稳定子序列。在mRNA转录子的5’末端存在这样的稳定子序列增加了它们的半衰期(Agaisse和Lereclus,1994,见上文,Hue等,1995,Journal of Bacteriology177:3465-3471)。mRNA加工/稳定序列与细菌16S核糖体RNA的3’末端互补。在优选的方面,mRNA加工/稳定序列产生基本单一长度的转录子,其5’末端有稳定序列。mRNA加工/稳定序列优选为与细菌16S核糖体RNA的3’末端互补的序列。参见美国专利6,255,076和5,955,310。
对于细菌细胞有效的mRNA加工/稳定序列是WO94/25612中公开的苏云金芽孢杆菌cryIIIA mRNA加工/稳定序列,或其部分,所述序列保持mRNA加工/稳定功能,或Hue等,1995,Journal of Bacteriology177:3465-3471中公开的枯草芽孢杆菌SP82mRNA加工/稳定序列,或其部分,所述序列保持mRNA加工/稳定功能。
然后可以使用本领域已知的方法或本文所述用于表达目的多肽的那些方法将核酸构建体导入细菌宿主细胞。
重组表达载体
在本发明的方法中,可以使用重组表达载体来重组产生多肽,所述重组表达载体包含编码目的多肽(例如,具有生物活性的多肽,或本发明的DNA甲基转移酶或限制性内切核酸酶)的多核苷酸,启动子,和转录和翻译终止信号。上述各种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体,所述载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代指导目的多肽合成的核苷酸序列。可选地,可通过将包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体插入合适的用于表达的载体中来表达核苷酸序列。在制备表达载体的过程中,将编码序列置于载体中,使得该编码序列与用于表达和可能的分泌的合适的调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体,其能够方便地进行重组DNA步骤,并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将导入该载体的细菌细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体,即,作为染色体外实体(entity)存在的载体,其复制独立于染色体复制,例如,质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者,载体可以是一种当被导入细菌细胞中时,整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。载体系统可以是单独的载体或质粒或两个或更多的载体或质粒,其共同含有待导入芽孢杆菌属细胞基因组的完整DNA(total DNA),或者转座子(transposon)。
当导入细菌细胞时,载体可以整合入细菌细胞基因组。为了整合入宿主细胞基因组,载体可依赖于编码目的多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者,载体可以含有额外的核苷酸序列,用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性,整合元件应该优选含有足够数目的核酸,如100至10,000碱基对,优选400至10,000碱基对,并且最优选800至10,000碱基对,其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列,其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外,整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面,可通过非同源重组将载体整合入宿主细胞基因组中。
为了自主复制,载体可以进一步包含复制起点,其使载体能够在所述的细菌细胞中自主地复制。细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点,和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。复制起点可以是具有突变使其在细菌细胞中的功能对温度敏感的复制起点(参见,例如,Ehrlich,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA75:1433-1436)。
可以将多于一个拷贝的指导目的多肽合成的核苷酸序列导入细菌细胞以增强核苷酸序列的表达。核苷酸序列的稳定扩增可通过如下方式获得:使用本领域公知的方法将至少一个额外拷贝的序列整合入细菌细胞基因组并选择转化体。WO94/14968中描述了用于实现基因组DNA序列扩增的方便的方法。
载体优选地含有一个或多个选择性标记,其允许简单选择经转化的细胞。选择性标记是基因,其产物提供杀生物剂抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或赋予抗生素抗性的标记,所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素或四环素抗性。此外,可以通过共转化完成选择,例如,如WO91/09129中所述,其中选择性标记在单独的载体上。
用于连接上述元件以构建重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见,例如,Sambrook等,1989,见上文)。
将DNA导入芽孢杆菌属细胞可,例如,通过如下实现:原生质体转化(参见,例如,Chang和Cohen,1979,Molecular General Genetics168:111-115),使用感受态细胞(参见,例如,Young和Spizizen,1961,Journal of Bacteriology81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,Journal of Molecular Biology56:209-221),电穿孔(参见,例如,Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(参见,例如,Koehler和Thorne,1987,Journal of Bacteriology169:5771-5278)。将DNA导入大肠杆菌细胞可,例如,通过如下实现:原生质体转化(参见,例如,Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580),或电穿孔(参见,例如,Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。将DNA导入链霉菌属细胞可,例如,通过如下实现:原生质体转化和电穿孔(参见,例如,Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405),接合(参见,例如,Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585),或转导(参见,例如,Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。将DNA导入假单胞菌属细胞可,例如,通过如下实现:电穿孔(参见,例如,Choi等,2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(参见,例如,Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。将DNA导入链球菌属细胞可,例如,通过如下实现:天然感受态(参见,例如,Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297),原生质体转化(参见,例如,Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207),电穿孔(参见,例如,Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见,例如,Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而,可以使用已知用于将DNA导入宿主细胞的任何方法。
细菌宿主细胞
本发明还涉及包含核酸构建体或重组表达载体的细菌宿主细胞,所述核酸构建体或重组表达载体包含编码目的多肽的多核苷酸,所述目的多肽为,例如,具有生物活性的多肽,或本发明的限制性内切核酸酶或DNA甲基转移酶。
本发明还涉及包含编码限制性内切核酸酶的多核苷酸的细菌宿主细胞,所述多核苷酸是失活的;
其中编码限制性内切核酸酶的多核苷酸选自下组:(a)多核苷酸,其编码包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,和甚至最优选至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性的氨基酸序列的多肽;(b)多核苷酸,其包含与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,和甚至最优选至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性的核苷酸序列;和(c)多核苷酸,其在至少中严紧条件下,更优选至少中-高严紧条件下,和最优选至少高严紧条件下,与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143或其全长互补链杂交;
其中限制性内切核酸酶与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381的限制性内切核酸酶具有相同的特异性;和
其中编码限制性内切核酸酶的多核苷酸的失活防止导入细菌宿主细胞的DNA被限制性内切核酸酶消化,且无需在导入宿主细胞之前用DNA甲基转移酶将DNA甲基化。
本发明还涉及包含核酸构建体或重组表达载体的细菌宿主细胞,所述核酸构建体或重组表达载体包含编码具有生物活性的多肽或与所述多肽表达有关的DNA,其中包含DNA的细菌宿主细胞通过本文所述的用于将DNA导入这种宿主细胞的方法之一获得。
细菌宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌,所述细菌包含限制-修饰系统,如本文所述。革兰氏阳性细菌包括,但不限于,芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)和Oceanobacillus属。革兰氏阴性细菌包括,但不限于,大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)和脲原体属(Ureaplasma)。
在本发明的方法中,细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。在本发明的应用中有用的芽孢杆菌属细胞包括,但不限于,嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
在优选的方面,细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在更优选的方面,细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另外的更优选方面,细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另外的更优选方面,细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另外的更优选方面,细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
在本发明的方法中,细菌宿主细胞可以是任何链球菌属细胞。在本发明的实践中有用的链球菌属细胞包括,但不限于,似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcusuberi)和马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)。
在优选的方面,细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选方面,细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选方面,细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另一个优选方面,细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。
在本发明的方法中,细菌宿主细胞可以是任何链霉菌属细胞。在本发明的实践中有用的链球菌属细胞包括,但不限于,不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)。
在优选的方面,细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选方面,细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选方面,细菌宿主细胞是天蓝色链霉菌细胞。在另一个优选方面,细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选方面,细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。
在本发明涉及用DNA甲基转移酶将目的DNA甲基化的方法中,用于甲基化的细菌细胞将可能与最终的宿主细菌细胞不同。用于甲基化的细菌细胞可以是细菌细胞,其中已导入对细胞是外源的本发明的DNA甲基转移酶基因,或是细菌细胞,其中DNA甲基转移酶基因对细胞是天然的。
在本发明另外的方面,细菌宿主细胞可以额外包含修饰,例如,其他基因的缺失或破坏,所述基因可能对目的多肽的生产、回收或应用有害。在优选的方面,细菌宿主细胞是蛋白酶缺陷型细胞。在更优选的方面,细菌宿主细胞,例如芽孢杆菌属细胞,包含aprE和nprE的破坏或缺失。在另一个优选方面,细菌宿主细胞不产生孢子。在另一个更优选方面,细菌宿主细胞,例如,芽孢杆菌属细胞,包含spoIIAC的破坏或缺失。在另一个优选方面,细菌宿主细胞,例如,芽孢杆菌属细胞,包含与表面活性素(surfactin)的生物合成有关的基因之一的破坏或缺失,例如srfA、srfB、srfC和srfD。参见,例如,美国专利No.5,958,728。其他基因,例如,amyE基因,其对目的多肽的产生、回收或应用有害,也可以破坏或缺失。
DNA
在本发明的方法中,导入细菌宿主细胞的DNA可以是任何目的DNA。DNA对于目的细菌宿主细胞可以是天然的或异源(外源)的。
DNA可以编码具有目的生物活性的任何多肽。多肽对于目的细菌宿主细胞可以是天然的或异源(外源)的。术语“异源多肽”在本文中定义为对宿主细胞不是天然的多肽;天然多肽,其中进行了结构修饰,例如,缺失、取代和/或插入,以使天然多肽改变;或作为通过重组DNA技术对编码多肽的DNA操作的结果,例如更强的启动子,而其表达在量上改变的天然多肽。多肽可以是下述多肽和杂合多肽的天然存在的等位变体和工程改造的变体。
术语“多肽”在本文并不指特定长度的编码产物,因此,包括肽、寡肽和蛋白质。术语“多肽”还包括杂合多肽,其包含获得自至少两个不同多肽的部分或全部多肽序列的组合,其中一个或多个多肽可以对真菌细胞是异源的。多肽进一步包括多肽的天然存在的等位变体和工程改造的变体。
在优选的方面,多肽是抗体、抗原、抗微生物肽、酶、生长因子、激素、immunodilator、神经递质、受体、报告蛋白质、结构蛋白质和转录因子。
在更优选的方面,多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。在最优选的方面,多肽是α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环式糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变构酶、氧化酶、果胶酸分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶或木聚糖酶。
在另一个优选方面,多肽是白蛋白、胶原、原弹性蛋白、弹性蛋白或明胶。
在另一个优选方面,多肽是杂合多肽,其包含获得自至少两个不同多肽的部分或完整多肽序列的组合,其中一个或多个多肽对于细菌宿主细胞可以是异源的。
在另一个优选的方面,多肽是融合多肽,其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码一种多肽的核苷酸序列(或其部分)与编码另一种多肽的核苷酸序列(或其部分)融合而产生融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的,且包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中,并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。
编码目的多肽的DNA可以获得自任何原核、真核或其他来源。就本发明而言,用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”,意思是多肽由所述来源产生,或由其中插入了来自所述来源的基因的细胞产生。
用于分离或克隆编码目的多肽的DNA的技术是本领域内已知的,且包括从基因组DNA分离,从cDNA制备,或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)实现从这种基因组DNA克隆目的多核苷酸。参见,例如,Innis等,1990,PCR Protocols:A Guide to Methods and Application,AcademicPress,New York。克隆步骤可以涉及包含编码多肽的核酸序列的期望核酸片段的切除与分离,向载体分子中插入片段,和将重组载体并入突变真菌细胞,其中将复制多个拷贝或克隆的核酸序列。DNA可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的,或它们的任意组合。
可以用许多方式操作编码目的多肽的DNA以提供DNA在合适的细菌宿主细胞中的表达。核酸构建体和用于编码目的多肽的DNA的重组表达载体的构建可以如本文在本发明的DNA甲基转移酶的表达中所述进行。
DNA还可以是调控序列,例如,启动子,用于操作目的基因的表达。调控序列的非限定性实例在本文中描述。
DNA可以进一步是用于将细菌细胞中目的基因失活的核酸构建体。
DNA不限定于上述公开的具体实例的范围,因为这些实例意欲作为本发明几个方面的说明。
产生方法
本发明还涉及产生具有生物活性的多肽的方法,其包括:
(a)在有益于产生多肽的条件下培养细菌宿主细胞,所述细胞包含导入的编码具有生物活性多肽或与所述多肽表达有关的DNA;
其中在导入宿主细胞之前用选自下组的DNA甲基转移酶将DNA甲基化:(i)多肽,其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,和甚至最优选至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性的氨基酸序列;(ii)多肽,其由包含与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,和甚至最优选至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码;(iii)多肽,其由在至少中严紧条件下,更优选至少中-高严紧条件下,和最优选至少高严紧条件下,与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101或其全长互补链杂交的多核苷酸编码;和(iv)变体,其包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:4的氨基酸1至337。
其中DNA甲基转移酶与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337的DNA甲基转移酶具有相同的特异性,并且对于细菌宿主细胞是天然的;和
其中甲基化防止导入的DNA被细菌宿主细胞的限制性内切核酸酶消化;和
(b)回收所述具有生物活性的多肽。
本发明还涉及产生具有生物活性的多肽的方法,其包括:
(a)在有益于产生多肽的条件下培养细菌宿主细胞,所述细胞包含导入的编码具有生物活性多肽或与所述多肽表达有关的DNA;
其中细菌宿主细胞包含编码限制性内切核酸酶的多核苷酸,所述多核苷酸是失活的;
其中编码限制性内切核酸酶的多核苷酸选自下组:(i)多核苷酸,其编码包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,和甚至最优选至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性的氨基酸序列的多肽;(ii)多核苷酸,其包含与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,和甚至最优选至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性的核苷酸序列;和(iii)多核苷酸,其在至少中严紧条件下,更优选至少中-高严紧条件下,和最优选至少高严紧条件下,与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143或其全长互补链杂交;
其中限制性内切核酸酶与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381的限制性内切核酸酶具有相同的特异性;和
其中编码限制性内切核酸酶的多核苷酸的失活防止导入的DNA被限制性内切核酸酶消化,且无需在将DNA导入细菌宿主细胞之前用DNA甲基转移酶将DNA甲基化;和
(b)回收所述具有生物活性的多肽。
本发明还涉及产生具有限制性内切核酸酶活性的多肽的方法,其包括:(a)在有益于产生多肽的条件下培养细菌宿主细胞,其中所述宿主细胞包含本发明的编码具有限制性内切核酸酶活性的多肽的多核苷酸;和(b)回收所述具有限制性内切核酸酶活性的多肽。
本发明还涉及用于产生具有DNA甲基转移酶活性的多肽的方法,包括:(a)在有益于产生多肽的条件下培养细菌宿主细胞,其中所述宿主细胞包含本发明的编码具有DNA甲基转移酶活性的多肽的多核苷酸;和(b)回收所述具有DNA甲基转移酶活性的多肽。
使用本领域已知的方法在适合于产生目的多肽的营养培养基中培养细菌宿主细胞。例如,可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离目的多肽的条件下进行的摇瓶培养,和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养,所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公布的组成制备(例如,在美国典型培养物保藏中心的目录中)。分泌的目的多肽能够从培养基中直接回收。
可以使用本领域已知的对于目的多肽是特异性的方法来检测所述多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、高效液相色谱、毛细管电泳、酶产物的形成、酶底物的消失或SDS-PAGE。例如,酶试验(enzyme assay)可用于测定酶的活性。对于很多酶,用于测定酶活性的方法在本领域中已知(参见,例如,D.Schomburg和M.Salzmann(编),Enzyme Handbook,Springer-Verlag,New York,1990)。用于测定本发明的限制性内切核酸酶或DNA甲基转移酶活性的试验在本文描述。
所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如,目的多肽可以通过常规方法从培养基中分离,所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。然后分离的多肽可以通过多种本领域已知的方法进一步纯化,所述方法包括但不限于层析(例如,离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如,制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如,硫酸铵沉淀)或提取(参见,例如,Protein Purification,J.-C.Janson和LarsRyden编,VCH Publishers,New York,1989)。
基因的失活
本发明还涉及产生亲本细菌细胞突变体的方法,其包括(a)将包含核酸构建体的DNA导入亲本细菌细胞,使亲本细菌细胞中编码多肽的基因失活,这产生与在相同条件下培养时的亲本细胞相比产生较少的所述多肽的突变体细胞;其中细菌宿主细胞包含编码限制性内切核酸酶的多核苷酸,所述多核苷酸是失活的,并且编码限制性内切核酸酶的多核苷酸选自下组:(i)多核苷酸,其编码包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,和甚至最优选至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性的氨基酸序列的多肽;(ii)多核苷酸,其包含与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,和甚至最优选至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性的核苷酸序列;和(iii)多核苷酸,其在至少中严紧条件下,更优选至少中-高严紧条件下,和最优选至少高严紧条件下,与SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143或其全长互补链杂交;和(iv)多核苷酸,其编码变体,所述变体包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸1至381;其中限制性内切核酸酶具有与SEQ ID NO:2的氨基酸1至381的限制性内切核酸酶相同的特异性,并且其中编码限制性内切核酸酶的多核苷酸的失活防止导入的DNA被限制性内切核酸酶消化,且无需在将DNA导入亲本细菌细胞之前用DNA甲基转移酶将DNA甲基化;和(b)分离突变体细胞。
本发明还涉及用于产生亲本细菌细胞突变体的方法,其包括(a)将包含核酸构建体的DNA导入亲本细菌细胞,使亲本细菌细胞中编码多肽的基因失活,这产生与在相同条件下培养时的亲本细胞相比产生较少的所述多肽的突变体细胞;其中在导入细菌宿主细胞之前通过选自下组的DNA甲基转移酶将DNA甲基化:(i)多肽,其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,和甚至最优选至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性的氨基酸序列;(ii)多肽,其由包含与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,和甚至最优选至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码;(iii)多肽,其由在至少中严紧条件下,更优选至少中-高严紧条件下,和最优选至少高严紧条件下,与SEQ ID NO:3的核苷酸1至1101或其全长互补链杂交的多核苷酸编码;和(iv)变体,其包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:4的氨基酸1至337;其中DNA甲基转移酶具有与SEQ ID NO:4的氨基酸1至337的DNA甲基转移酶相同的特异性,并且其中甲基化防止导入的DNA被亲本细菌细胞的限制性内切核酸酶消化;和(b)分离突变体细胞。
可以使用本文所述方法构建包含失活基因的突变体细胞。
这样构建的细菌突变体细胞作为用于表达对细胞天然或外源的多肽的宿主细胞特别有用。因此,本发明进一步涉及产生天然或外源多肽的方法,其包括:(a)在有益于多肽产生的条件下培养突变体细胞;和(b)回收所述多肽。术语“外源多肽”在本文定义为对于宿主细胞不是天然的多肽,其中经过修饰以改变天然序列的天然蛋白质,或作为通过重组DNA技术对宿主细胞操作的结果其表达在量上发生改变的天然蛋白质。
能在这样的突变体中表达的多肽的实例在本文描述。
用于培养和纯化目的产物的方法可以通过本领域已知和本文所述的方法进行。
通过下述实施例进一步描述本发明,但不应将下述实施例理解为对本发明范围的限制。
实施例
DNA测序
使用Applied Biosystems Model3130X Genetic Analyzer(3130X型遗传分析仪)(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA),利用染料终止子化学(Giesecke等,1992,Journal of Virol.Methods38:47-60)进行DNA测序。使用phred/phrap/consed(University of Washington,Seattle,WA,USA)用测序特定引物组装序列。
菌株
在枯草芽孢杆菌168Δ4中构建芽孢杆菌属质粒。枯草芽孢杆菌168Δ4源自枯草芽孢杆菌模式菌株(type strain)168(BGSC1A1,Bacillus Genetic StockCenter(芽孢杆菌属遗传保藏中心),Columbus,OH),并在spoIIAC、aprE、nprE和amyE基因中有缺失。这四个基因的缺失基本如针对枯草芽孢杆菌A164Δ5所述的进行,该方法在美国专利No.5,891,701中有详细描述。
培养基
LB培养基由每升10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl组成。
LB平板由LB培养基与每升15g细菌用琼脂组成。
LB氨苄青霉素培养基由LB培养基与每毫升100μg氨苄青霉素(过滤除菌,高压灭菌后加入)组成。
LB氨苄青霉素平板由LB氨苄青霉素培养基与每升15g细菌用琼脂组成。
VY培养基由每升25g小牛肉浸出液(veal infusion)(BD Diagnostics,Franklin Lakes,NJ,USA)和5g酵母提取物组成。
2X YT培养基由每升16g胰蛋白胨、10g酵母提取物和5g NaCl组成。
2X YT氨苄青霉素培养基由2X YT培养基和每毫升100μg氨苄青霉素(过滤除菌,高压灭菌后加入)组成。
2X YT氨苄青霉素平板由每升2X YT氨苄青霉素培养基和15g细菌用琼脂组成。
LBS培养基由LB培养基和0.5M山梨醇组成。
LBSM培养基由LBS培养基和0.38M甘露醇组成。
TBAB培养基由Difco Tryptose Blood Agar Base(胰眎蛋白血琼脂基础)(BD Diagnostics,Franklin Lakes,NJ,USA)组成。
TBAB氯霉素平板由TBAB培养基和每毫升5μg氯霉素组成。
TBAB新霉素平板由TBAB培养基和每毫升6μg新霉素组成。
TBAB红霉素/林可霉素平板由TBAB和每毫升1μg红霉素和25μg林可霉素组成。
TY培养基由下述物质组成:每升20g胰蛋白胨、5g酵母提取物、6mgFeCl2·4H2O、1mg MnCl2·4H2O和15mg MgSO4·7H2O。
TY平板由TY培养基和每升20g细菌用琼脂组成。
TY氯霉素平板由包含每毫升6μg氯霉素的TY平板培养基组成。
LBPG平板由包含0.01M K3PO4和0.4%葡萄糖的LB平板培养基组成。
实施例1:确定地衣芽孢杆菌菌株SJ1904的基因组序列
由使用454DNA测序技术(Margulies等,2005,Nature437:376-380)产生的重叠群(contig)确定地衣芽孢杆菌菌株SJ1904完整染色体的基因组序列,使用Sanger测序技术读出随机配对序列(random paired),并且,为了关闭缺口和解析重复序列,由基因组DNA的PCR片段读出。使用Phrap组装测序数据,并在Consed中编辑和查看。使用Glimmer(Delcher等,1999,Nucleic AcidsResearch27:4636-4641)由基因组DNA序列预测基因模型。使用E-值阈值为1X10-5的BLASTP,通过与无冗余数据库PIR-NREF(Wu等,2002,NucleicAcids Research30:35-37)的比较,对基因模型进行机器注解。
实施例2:地衣芽孢杆菌M.Bli1904II DNA甲基转移酶基因的鉴定
使用BLASTP(Altschul等,1997,Nucleic Acids Research25:3389-3402)将地衣芽孢杆菌菌株SJ1904基因模型的推定的氨基酸序列与来自REBASE(Roberts,R.J.,Macelis,M.,Rebase.2005)的蛋白质序列进行比较。因为DNA甲基转移酶具有中等水平的序列保守性,所以这项分析鉴定了这个基因组中所有推定的DNA甲基转移酶。使用Prints-S16版,如通过InterProScan v3.3版所实施的,鉴定M.Bli1904II中的胞嘧啶特异性DNA甲基转移酶特征(signature)。此外,发现存在于胞嘧啶特异性DNA甲基转移酶中的六个高度保守的基序(motif)在地衣芽孢杆菌M.Bli1904II DNA甲基转移酶中也是保守的。
实施例3:地衣芽孢杆菌M.Bli1904II DNA甲基转移酶基因的表征
地衣芽孢杆菌M.Bli1904II DNA甲基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)和推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)如图2A和2B中所示。编码序列为1014bp,其包括终止密码子。编码区为36.1%G+C。编码的预测蛋白质为337个氨基酸,分子量为38.5kDa。
使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文),如EMBOSS的Needle程序中所执行的,缺口开放罚分为10,缺口延伸罚分为0.5,使用EBLOSUM62矩阵,确定氨基酸序列的比较配对全局比对。比对显示,地衣芽孢杆菌M.Bli1904II DNA甲基转移酶的推定氨基酸序列与韦氏芽孢杆菌(Bacillus weihenstephanensis)C-5胞嘧啶特异性DNA甲基转移酶前体(UniRef100_Q2AVE0)具有64%的同一性,并且与Oceanobacillus iheyensis的胞嘧啶特异性DNA甲基转移酶(UniRef100_Q8EL98)具有47%的同一性。当使用Needle标记为“最长同一性”的输出结果作为百分比同一性并如下计算时:(相同的残基x100)/(比对长度-比对中缺口数目),地衣芽孢杆菌M.Bli1904II DNA甲基转移酶的推定氨基酸序列与韦氏芽孢杆菌C-5胞嘧啶特异性DNA甲基转移酶前体(UniRef100_Q2AVE0)具有68.5%的同一性,并且与Oceanobacillus iheyensis的胞嘧啶特异性DNA甲基转移酶(UniRef100_Q8EL98)具有55.9%的同一性。
实施例4:地衣芽孢杆菌Bli1904II II型限制性内切核酸酶基因的鉴定
II型限制性内切核酸酶彼此之间通常没有序列同一性,当它们具有相似的DNA限制性位点时也只有很小的同一性。此外,II型限制性内切核酸酶通常在指定的限制-修饰系统中位于其相应DNA甲基转移酶的旁边。此外,目前表征的所有限制性内切核酸酶基因都大于450bp(Kong,等,2000,NucleicAcids Research28:3216-3223)。使用这些标准,由地衣芽孢杆菌SJ1904经注解的基因模型鉴定出大于450bp并且位于地衣芽孢杆菌M.Bli1904II DNA甲基转移酶基因旁边的假定基因作为II型限制性内切核酸酶基因Bli1904II。
实施例5:地衣芽孢杆菌Bli1904II II型限制性内切核酸酶基因的表征
地衣芽孢杆菌Bli1904II II型限制性内切核酸酶基因的核苷酸序列(SEQID NO:1)和推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)示于图1。编码序列为1146bp,其包括终止密码子。编码区为36.3%G+C。编码的预测蛋白质为381个氨基酸,分子量为43.7kDa。
使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453),如EMBOSS的Needle程序中所执行的,缺口开放罚分为10,缺口延伸罚分为0.5,使用EBLOSUM62矩阵,确定氨基酸序列的比较配对全局比对。比对显示,地衣芽孢杆菌Bli1904II II型限制性内切核酸酶的推定氨基酸序列与韦氏芽孢杆菌假设蛋白质(UniRef100_Q2AVE3)具有45%的同一性,并且与嗜冷单胞菌菌种CNPT3假设蛋白质(UniRef100_Q1ZE16)具有32.6%的同一性。当使用Needle标记为“最长同一性”的输出结果作为百分比同一性并如下计算时:(相同的残基x100)/(比对长度-比对中缺口数目),地衣芽孢杆菌M.Bli1904II DNA甲基转移酶的推定氨基酸序列与韦氏芽孢杆菌假设蛋白质(UniRef100_Q2AVE3)具有47%的同一性,并且与嗜冷单胞菌CNPT3假设蛋白质(UniRef100_Q1ZE16)具有47.2%的同一性。
实施例6:地衣芽孢杆菌M.Bli1904II DNA甲基转移酶基因的克隆
为在枯草芽孢杆菌中表达而通过PCR克隆地衣芽孢杆菌M.Bli1904IIDNA甲基转移酶基因。
根据Pitcher等,1989,Lett.Appl.Microbiol.8:151-156的方法从地衣芽孢杆菌SJ1904分离基因组DNA。图3显示了包含编码Bli1904II限制性内切核酸酶和M.Bli1904II DNA甲基转移酶的基因的地衣芽孢杆菌染色体区域。使用如下所示的引物999611和999612,通过PCR从地衣芽孢杆菌SJ1904基因组DNA扩增地衣芽孢杆菌SJ1904染色体的约1043bp片段,其包括M.Bli1904II DNA甲基转移酶基因的核糖体结合位点和编码区,包含SEQ IDNO:5的核苷酸2019-3049(图3)。引物999611并入了SacI限制性位点,而引物999612并入了MluI限制性位点。
引物999611:
5′-GAGCTCTGCAAGGAGGTATAATTTTG-3′(SEQ ID NO:6)
引物999612:
5′-ACGCGTTTATTCAGCTATTGCATATTC-3′(SEQ ID NO:7)
使用PfxDNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)进行PCR。扩增反应液(50μl)由下述组成:1X Pfx扩增缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),1mM MgSO4,300μM每种dNTP,0.3μM每条引物,1.25单位Pfx DNA聚合酶,和约200ng模板DNA。使用40温度循环仪(Stratagene Corporation,La Jolla,CA,USA)进行反应,程序为95℃2分钟的1个循环;95℃1分钟、55℃1分钟和68℃1分钟的30个循环;和68℃3分钟的1个循环。
使用用于测序的ZEROPCR克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)将获得的约1043bp PCR产物克隆入载体pCR4Blunt,并根据制造商说明转化入ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞中。使用Plasmid Midi试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)从一个转化体分离质粒DNA,并通过用EcoRI、NcoI和SnaBI消化然后在TBE(50mM Tris碱-50mM硼酸-1mM EDTA二钠)中的0.8%琼脂糖电泳进行验证,用EcoRI消化获得3939bp和1061bp的期望片段;NcoI为3217bp和1783bp;而SnaBI为4165bp和835bp。通过DNA测序确定克隆的PCR片段的DNA序列。将这个质粒命名为pMDT138(图4)。
根据制造商说明,将质粒pMDT138转化入大肠杆菌XL1-Blue细胞(Stratagene Corporation,La Jolla,CA,USA),在37℃在2X YT氨苄青霉素平板上选择氨苄青霉素抗性。将一个转化体命名为MDT45,并按照布达佩斯条约的条款于2006年9月7日将其保藏在农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,NorthernRegional Research Center),1815University Street,Peoria,Illinois,61604,并且给予登录号NRRL B-41967。
实施例7:pMDT100的构建
质粒pMDT100是大肠杆菌复制子,其包含PamyL4199/P短共有amyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab三串联启动子,其驱动克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)的表达。这个aprH表达盒和pC194的cat基因(Horinouchi和Weisblum,1982,J.Bacteriol.150:804-814)两侧侧翼为枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(amyE)基因的片段,允许通过双同源重组经由两个amyE片段在枯草芽孢杆菌染色体的amyE基因座插入aprH表达盒和cat基因。用另一个基因替代pMDT100中的aprH基因允许将所述基因插入并在枯草芽孢杆菌中表达。pMDT100的构建如下所述。
质粒pNBT51。根据生产商的说明,使用质粒试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)从大肠杆菌宿主DH5α分离质粒pNBT10(xDG268MCS-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV;美国专利No.6,255,076),并用ClaI和ScaI消化。裂解发生在aprH编码序列约326密码子处的ClaI位点,而不是约23密码子处的ClaI位点,这是由于大肠杆菌Dam DNA甲基转移酶而通过甲基化阻断。使用Klenow片段(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA,USA)和dNTP,根据制造商的说明将ClaI末端平端化。通过TBE缓冲液中0.8%的琼脂糖电泳分析消化的质粒,并使用凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)纯化约6615bp的载体片段。用SalI和ScaI消化质粒pOS4301(Bacillus Genetic Stock Center,Ohio State Universit,Columbus,OH,USA),并使用Klenow片段和dNTP将SalI末端平端化,如上所述。通过TBE缓冲液中0.8%的琼脂糖电泳分析消化的质粒,并使用凝胶提取试剂盒纯化携带大肠杆菌rrnB转录终止子的约840bp片段。可以从载体pKK223-3(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)(图5)分离同样的840bp SalI/ScaI片段。根据制造商的说明,用T4DNA连接酶(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN,USA)将pNBT10载体片段和携带终止子的片段连接在一起,并根据制造商的说明,用连接物转化大肠杆菌DH5α(Gibco BRL,Gaithersburg,MD,USA),在37℃在2X YT氨苄青霉素平板上选择氨苄青霉素抗性。将得到的质粒命名为pNBT51(pDG268-PcryIIIA/cryIIIAstab/SAVΔ)(图6)。
质粒pNBT52。用SfiI消化质粒pNBT51,在11℃用T4DNA聚合酶(RocheDiagnostics Corporation,Indianapolis,IN,USA)和25μM每种dNTP温育20分钟,将末端平端化,然后75℃温育10分钟,将聚合酶热失活。然后用DraIII消化末端平端化的质粒,并通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳分析,使用凝胶提取试剂盒纯化约5920bp的载体片段。用DraIII和Ecl136II消化质粒pNBT20(pDG268MCS-P短共有amyQ/SAV;美国专利No.6,255,076),并且使用凝胶提取试剂盒纯化约1641bp的携带短共有amyQ启动子(P短共有amyQ)的片段。如上所述连接pNBT51载体片段和P短共有amyQ片段,并如上所述用连接物转化大肠杆菌DH5α,在37℃在2X YT氨苄青霉素平板上选择氨苄青霉素抗性。使用8小型制备试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA,USA)从几个转化体分离质粒DNA,用SphI消化,并通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳分析。将具有期望的约4873bp和2688bp的限制性片段的一个质粒命名为pNBT52(pDG268-P短共有amyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAVΔ)(图7)。
质粒pNBT53。用SfiI和SacI消化质粒pNBT6(pHP13amp-SAV;美国专利No.6,255,076),并通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳分析,使用凝胶提取试剂盒纯化约6438bp的载体片段。用SfiI和SacI消化质粒pNBT52,并通过TBE缓冲液中0.8%的琼脂糖电泳分析,并且使用凝胶提取试剂盒纯化约727bp的携带P短共有amyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab串联启动子的片段。如上所述连接pNBT6载体片段和P短共有amyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab片段,并如上所述用连接物转化大肠杆菌DH5α,在37℃在2X YT氨苄青霉素平板上选择氨苄青霉素抗性。使用8小型制备试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA,USA),从几个转化体分离质粒DNA,用PvuII消化,并通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳分析。将具有期望的约4903bp、1320bp和942bp的限制性片段的一个质粒命名为pNBT53(pHP13amp-P短共有amyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV)(图8)。
质粒pNBT54。用SfiI和BamHI消化质粒pNBT1(pDG268MCS;美国专利No.6,255,076),并通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳分析,使用凝胶提取试剂盒纯化约6040bp的载体片段。用SfiI和BamHI消化质粒pNBT53,并通过TBE缓冲液中0.8%的琼脂糖电泳分析,并且使用凝胶提取试剂盒纯化约1953bp的携带P短共有amyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV盒的片段。如上所述连接pNBT1载体片段和P短共有amyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV片段,并如上所述用连接物转化大肠杆菌DH5α,在37℃在2X YT氨苄青霉素平板上选择氨苄青霉素抗性。使用8小型制备试剂盒,从几个转化体分离质粒DNA,并通过用SfiI和BamHI同时消化,然后是TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳来分析。将具有期望的约6040bp和1953bp的限制性片段的一个质粒命名为pNBT54(pDG268MCS-P短共有amyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV)(图9)。
质粒pNBT35。用SfiI和BamHI消化质粒pNBT2(pDG268MCSΔ-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV;美国专利No.6,255,076),并通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳分析,使用凝胶提取试剂盒纯化约5394bp的载体片段。用SfiI和BamHI消化质粒pNBT54,并通过TBE缓冲液中0.8%的琼脂糖电泳分析,并且使用凝胶提取试剂盒纯化约1953bp的携带P短共有 amyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV盒的片段。如上所述连接pNBT2载体片段和P短共有 amyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV片段,并如上所述用连接物转化大肠杆菌DH5α,在37℃在2X YT氨苄青霉素平板上选择氨苄青霉素抗性。使用8小型制备试剂盒,从几个转化体分离质粒DNA,用NcoI消化,并通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳分析。将具有期望的约5492bp和1855bp的限制性片段的一个质粒命名为pNBT35(pDG268MCSΔ-P短共有 amyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV)(图10)。
质粒pNBT30。构建质粒pNBT30,以包含amyL基因启动子的amyL4199变体的PCR克隆(美国专利No.6,100,063)。根据Pitcher等,1989,见上文的方法分离地衣芽孢杆菌SJ1904的基因组DNA。使用如下所示的引物950872和991151,通过PCR从地衣芽孢杆菌SJ1904的基因组DNA扩增amyL4199启动子(PamyL4199)基因。引物950872并入SfiI限制性位点,而引物991151并入SacI限制性位点和PamyL4199的变体核苷酸。
引物950872:
5′-CCAGGCCTTAAGGGCCGCATGCGTCCTTCTTTGTGCT-3′(SEQ ID NO:8)
引物991151:
5′-GAGCTCCTTTCAATGTGATACATATGA-3′(SEQ ID NO:9)
根据制造商的推荐,使用Gold DNA聚合酶(AppliedBiosystems,Foster City,CA,USA)进行PCR,只是MgCl2浓度是3mM,而不是标准的1.5mM。扩增反应物(50μl)由下述组成:10mM Tris-HCl(pH8.3),50mM KCl,3.0mM MgCl2,200μM每种dNTP,0.5μM每条引物,0.25单位Gold DNA聚合酶,和约200ng模板DNA。在40温度循环仪中进行PCR,程序为95℃9分钟的1个循环;95℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟的30个循环;和72℃3分钟的1个循环。
使用TA克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)将得到的约625bp的PCR产物克隆入载体pCR2.1,并根据制造商的说明转化入ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。使用8微型制备试剂盒从几个转化体分离质粒DNA,并通过用EcoRI消化,然后是TBE缓冲液中0.8%的琼脂糖电泳来分析克隆的PCR片段的存在。将一个具有预期的约3913bp和640bp的限制性片段的质粒命名为pNBT30(pCR2.1-amyL4199)(图11)。通过DNA测序确认克隆的PCR片段的DNA序列。
质粒pNBT31。用SfiI和SacI消化质粒pNBT3(pDG268MCSΔneo-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV;美国专利No.6,255,076),并通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳分析,使用凝胶提取试剂盒纯化约7931bp的载体片段。用SfiI和SacI消化质粒pNBT30,并通过TBE缓冲液中0.8%的琼脂糖电泳分析,并且使用凝胶提取试剂盒纯化约612bp的携带PamyL4199的片段。如上所述连接pNBT3载体片段和PamyL4199片段,并根据制造商的说明用连接物转化大肠杆菌XL1-Blue细胞(Stratagene Corporation,La Jolla,CA,USA),在37℃在2X YT氨苄青霉素平板上选择氨苄青霉素抗性。使用8微型制备试剂盒从几个转化体分离质粒DNA,用NcoI消化,并通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳分析。将具有预期的约6802bp和1741bp的限制性片段的一个质粒命名为pNBT31(图12)。
质粒pNBT36。用SfiI消化质粒pNBT35,并使用T4DNA聚合酶和dNTP将末端平端化,如上所述。然后将末端平端化的质粒用DraIII消化,并通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳分析。使用凝胶提取试剂盒纯化约5808bp的载体片段。用DraIII和Eco136II消化质粒pNBT31,并通过TBE缓冲液中0.8%的琼脂糖电泳分析,并且使用凝胶提取试剂盒纯化约2150bp携带PamyL4199的片段。如上所述连接pNBT35载体片段和PamyL4199片段,并根据制造商的说明用连接物转化大肠杆菌细胞(Stratagene Corporation,LaJolla,CA,USA),在37℃在2X YT氨苄青霉素平板上选择氨苄青霉素抗性。使用8微型制备试剂盒从几个转化体分离质粒DNA,用NcoI消化,并通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳分析。将具有预期的约5492bp和2466bp的限制性片段的一个质粒命名为pNBT36(图13)。
质粒pMDT100。用DraIII和SacI消化质粒pNBT13(pDG268Δneo-PamyL/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV;美国专利No.6,255,076),并使用凝胶提取试剂盒纯化约6395bp的载体片段。用DraIII和SacI消化质粒pNBT36,并通过TBE缓冲液中0.8%的琼脂糖电泳分析,并且使用凝胶提取试剂盒纯化约2873bp的携带PamyL4199/PamyQ(sc)/PcryIIIA三串联启动子的片段。如上所述连接pNBT13载体片段和PamyL4199/PamyQ(sc)/PcryIIIA片段,并如上所述用连接物转化大肠杆菌细胞,在37℃在2X YT氨苄青霉素平板上选择氨苄青霉素抗性。使用8微型制备试剂盒从几个转化体分离质粒DNA,用ApaI消化,并通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖分析。将具有预期的约4974bp和4294bp的限制性片段的一个质粒命名为pMDT100(图14)。
实施例8:地衣芽孢杆菌M.Bli1904II DNA甲基转移酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达
将地衣芽孢杆菌M.Bli1904II DNA甲基转移酶基因插入枯草芽孢杆菌的染色体中,以在该宿主中表达DNA甲基转移酶,从而在枯草芽孢杆菌中使DNA甲基化。
用SacI和MluI消化质粒pMDT100并通过TBE缓冲液中0.8%的琼脂糖电泳分析,并使用凝胶提取试剂盒纯化约8100bp的载体片段。用SacI和MluI消化质粒pMDT138,并且使用凝胶提取试剂盒纯化约1033bp的携带M.Bli1904II基因的片段。如上所述连接pMDT100载体片段和M.Bli1904II基因片段。此连接将M.Bli1904II基因置于PamyL4199/P短共有 amyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab启动子的下游和aprH转录终止子的上游。根据Anagnostopoulos和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:741-746的方法用连接物转化枯草芽孢杆菌168Δ4,在37℃在TBAB氯霉素平板上选择氯霉素抗性的转化体。在37℃在TBAB新霉素平板上筛选对于新霉素敏感的抗氯霉素转化体,以确定是否通过双交换已将DNA插入到枯草芽孢杆菌染色体的amyE基因中。
使用如下所示的引物994112和999592(其分别在三串联启动子和M.Bli1904II DNA甲基转移酶基因中结合)和如下所示的引物999611和960456(其分别在M.Bli1904II DNA甲基转移酶基因和amyE基因中结合),通过PCR确认在amyE基因座存在M.Bli1904II DNA甲基转移酶表达盒。将在amyE基因座包含cat基因和M.Bli1904II DNA甲基转移酶表达盒的一个这样的转化体,命名为枯草芽孢杆菌MDT101。
引物994112:
5′-GCGGCCGCTCGCTTTCCAATCTGA-3′(SEQ ID NO:10)
引物999592:
5′-ATCGATCAGCTTGGATAAACCCTA-3′(SEQ ID NO:11)
引物999611:
5′-GAGCTCTGCAAGGAGGTATAATTTTG-3′(SEQ ID NO:12)
引物960456:
5′-CGTCGACGCCTTTGCGGTAGTGGTGCTT-3′(SEQ ID NO:13)
根据制造商的说明,使用Taq DNA聚合酶(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA,USA)进行PCR。扩增反应物(50μl)由下述组成:10mM Tris-HCl(pH8.3),50mM KCl,3.0mM MgCl2,200μM每种dNTP,0.5μM每条引物,0.25单位Taq DNA聚合酶,和约200ng基因组DNA。在40温度循环仪中进行PCR,程序为95℃2分钟的1个循环;95℃2分钟、55℃2分钟和72℃2分钟的30个循环;和72℃3分钟的1个循环。
为了证实克隆的M.Bli1904II DNA甲基转移酶能将DNA甲基化,从表达甲基转移酶的芽孢杆菌属菌株分离质粒DNA,并测试DNA甲基化。根据Anagnostopoulos和Spizizen,1961,见上文的方法,用质粒pCJ791(美国公开申请No.20030175902)转化枯草芽孢杆菌菌株168Δ4和MDT101,在34℃在TBAB红霉素/林可霉素平板上选择红霉素抗性。使用Plasmid Midi试剂盒,从枯草芽孢杆菌168Δ4和枯草芽孢杆菌MDT101的各一个转化体中分离质粒pCJ791DNA。
根据Xue等,1999,J.Microbiol.Methods34(3):183-191的方法,通过电穿孔用来自枯草芽孢杆菌MDT101转化体的pCJ791DNA转化地衣芽孢杆菌SJ1904。简而言之,使用1-5ml LBS培养基中生长的地衣芽孢杆菌的过夜培养液接种50ml新鲜LBS培养基,并在37℃和250rpm培育培养物。培养物生长至静止期,在缓慢生长期(指数生长期结束后1-3小时)后,当培养经历生长速率增加时,通过在6500x g离心收获细胞。用50ml冰冷的MSG(0.5M甘露醇,0.5M山梨醇,10%甘油)将细胞洗涤两次,并重悬于约750μl MSG中。如下转化细胞或将细胞在-20℃保存。在电极间距为1mm的电穿孔杯中,60μl电转化感受态细胞与质粒DNA混合,并使用设置为25μF、200Ω和1.0kV的GENE(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)施加于电脉冲。然后将电穿孔细胞转移至包含0.2μg红霉素每ml的950μl LBSM培养基,诱导红霉素抗性。在34℃和250rpm将转化体培育2.5-3小时,然后在34℃在TBAB红霉素/林可霉素平板上选择红霉素抗性。
使用Plasmid Midi试剂盒从一个地衣芽孢杆菌SJ1904转化体分离质粒pCJ791DNA。用Fnu4HI并用Sac I消化分离自枯草芽孢杆菌168Δ4、枯草芽孢杆菌MDT101和地衣芽孢杆菌SJ1904的质粒pCJ791DNA。质粒pCJ791具有12个Fnu4HI识别位点和三个Sac I识别位点。Fnu4HI切割序列GCNGC处的DNA,它能消化来自枯草芽孢杆菌168Δ4的pCJ791质粒DNA,但不能消化来自枯草芽孢杆菌MDT101或地衣芽孢杆菌SJ1904的pCJ791质粒DNA,说明来自后两种来源的质粒DNA在GCNGC位点甲基化。Sac I切割序列GAGCTC处的DNA,因此不受序列GCNGC甲基化的影响,能切割来自所有三种来源的pCJ791质粒DNA。
实施例9:地衣芽孢杆菌Bli1904II限制性内切核酸酶基因的克隆
通过PCR克隆地衣芽孢杆菌Bli1904II限制性内切核酸酶编码区。根据Pitcher等,1989,见上文的方法分离地衣芽孢杆菌SJ1904基因组DNA。图3显示地衣芽孢杆菌染色体区域,其包含编码Bli1904II限制性内切核酸酶和M.Bli1904II DNA甲基转移酶的基因。使用如下所示的引物060625和060626,通过PCR从地衣芽孢杆菌SJ1904基因组DNA扩增包括Bli1904II基因的编码区的地衣芽孢杆菌SJ1904染色体的约1158bp片段,其包含SEQ ID NO:5的核苷酸443-1588(图3)。引物060625并入Kpn I限制性位点,而引物060626并入Bam HI限制性位点。
引物060625:
5′-GGTACCATGTTCTATACTAATCAACC-3′(SEQ ID NO:14)
引物060626:
5′-GGATCCTTATTTGTTTTCATTTTCAA-3′(SEQ ID NO:15)
使用Pfx DNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)进行PCR。扩增反应物(50μl)由下述组成:1X Pfx扩增缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),1.5mM MgSO4,300μM每种dNTP,0.3μM每条引物,1.25单位PfxDNA聚合酶,和约200ng模板DNA。在40温度循环仪中进行反应,程序为95℃2分钟的1个循环;95℃1分钟、55℃1分钟和68℃1分钟的30个循环;和68℃3分钟的1个循环。
使用测序用ZeroPCR克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),将获得的约1158bp的PCR产物克隆入pCR4Blunt,并根据制造商的说明转化入ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞。使用Plasmid Midi试剂盒从一个转化体中分离质粒DNA,并通过用Eco RI消化,然后是TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳来确认,其产生期望的3939bp、897bp和279bp的片段。通过DNA测序确认克隆的PCR片段的DNA序列。将这个质粒命名为pMDT156(图15),并将包含该质粒的大肠杆菌TOP10转化体命名为MDT46。根据布达佩斯条约的条款于2006年9月7日将MDT46保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural ResearchService Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center),1815University Street,Peoria,Illinois,61604,并给予登录号NRRL B-41968。
实施例10:构建地衣芽孢杆菌Bli1904II限制性内切核酸酶基因的缺失型
通过PCR构建地衣芽孢杆菌Bli1904II限制性内切核酸酶的缺失型,以允许地衣芽孢杆菌中天然基因的缺失。
根据Pitcher等,1989,见上文的方法,从地衣芽孢杆菌SJ1904分离基因组DNA,通过PCR从Bli1904II染色体基因座扩增两个片段。
使用如下所述的引物999592和999593,通过PCR从地衣芽孢杆菌SJ1904基因组DNA扩增地衣芽孢杆菌SJ1904染色体中Bli1904II基因上游约505bp的片段,其中包含SEQ ID NO:5的核苷酸1616-2102。引物999592并入Cla I限制性位点。
引物999592:
5′-ATCGATCAGCTTGGATAAACCCTA-3′(SEQ ID NO:16)
引物999593:
5′-TTCACAAGATCTATTTCTTCTTTCAGACCC-3′(SEQ ID NO:17)
使用Pfx DNA聚合酶,如实施例6中所述进行PCR。
使用引物999594和999595,从地衣芽孢杆菌SJ1904基因组DNA扩增包括Bli1904II基因的最后42个密码子加下游DNA的地衣芽孢杆菌SJ1904染色体的约507bp片段,其包含SEQ ID NO:5的核苷酸1-487。引物999594并入Not I限制性位点。
引物999594
5′-AGAAATAGATCTTGTGAAATGGGTTCTTAT-3′(SEQ ID NO:18)
引物999595:
5′-GCGGCCGCTCATGTTCCCATATTCTT-3′(SEQ ID NO:19)
使用Pfx DNA聚合酶,如实施例6中所述进行PCR,除了MgSO4浓度为1.5mM。
引物999593(用于上游扩增)和引物999594(用于下游扩增)具有互补的5’末端。因此,两个扩增物具有互补的末端,允许两个PCR片段的融合,如下所述。根据制造商的说明,使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)从两个扩增物去除引物。使用两个扩增物作为第三次PCR的模板DNA,使用引物999592和999595,通过引物999593和999594序列提供的互补末端将两个片段融合。使用Pfx DNA聚合酶,如实施例6中所述进行PCR,只是模板DNA由各2μl的两个扩增物组成。
使用凝胶提取试剂盒纯化得到的约994bp PCR产物,并使用测序用ZeroPCR克隆试剂盒将其克隆入载体pCR4Blunt,并如实施例6中所述转化入ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞。使用9600(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)从几个转化体纯化质粒DNA,并通过用EcoRI和NotI消化,然后是TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳来测试克隆的PCR片段的存在和方向。将一个EcoRI片段为约3939bp和1012bp和NotI片段为约4931bp的质粒命名为pMDT134(图16),并将通过DNA测序验证克隆的PCR片段的DNA序列。
实施例11:构建地衣芽孢杆菌Bli1904II限制性内切核酸酶基因缺失质粒
构建温度敏感型质粒,以允许地衣芽孢杆菌中的Bli1904II限制性内切核酸酶基因的缺失。
构建质粒pMDT131,以产生可赋予氯霉素抗性的温度敏感型质粒。用EcoRI消化质粒pMRT074(美国公开申请2003/0175902),然后用T4DNA聚合酶加dNTP处理以产生平末端,如实施例7中所述。然后用NotI消化质粒,通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳分析,并使用凝胶提取试剂盒纯化约4355bp的载体片段。用Eco47III和NotI消化质粒pNBT1,通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳分析,并使用凝胶提取试剂盒纯化约1222bp的携带cat基因和多克隆位点的片段。使用T4DNA连接酶,如上所述连接pMRT074载体片段和pNBT1cat片段,并根据Anagnostopoulos和Spizizen,1961,见上文的方法,用连接物转化枯草芽孢杆菌168Δ4,在34℃在TBAB氯霉素平板上选择氯霉素抗性。使用Plasmid Midi试剂盒从一个转化体中分离质粒DNA,并通过用BamHI消化,然后是TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳来确认,其可产生期望的约3779bp和1802bp的片段。将得到的质粒命名为pMDT131(图17)。
构建质粒pMDT139,以产生适合从地衣芽孢杆菌染色体缺失Bli1904II基因的质粒。根据制造商的说明,用质粒pMDT134转化大肠杆菌SCS110(Stratagene Corporation,La Jolla,CA,USA),其对于DNA甲基转移酶Dam是缺陷的,在37℃在2X YT氨苄青霉素平板上选择氨苄青霉素抗性。使用Plasmid Midi试剂盒从一个转化体中分离质粒DNA,得到能用ClaI(在一定程度上受Dam甲基化抑制)消化的pMDT134质粒DNA。用ClaI和NotI消化质粒pMDT134DNA,并通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳分析,并使用凝胶提取试剂盒纯化携带缺失的Bli1904II基因的约986bp片段。用ClaI和NotI消化质粒pMDT131,并通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳分析,并使用凝胶提取试剂盒纯化约5569bp的载体片段。使用T4DNA连接酶,如上所述,连接pMDT131载体片段和缺失的Bli1904II基因片段,并根据Anagnostopoulos和Spizizen,1961,见上文的方法,用连接物转化枯草芽孢杆菌168Δ4,在34℃在TBAB氯霉素平板上选择氯霉素抗性。使用Plasmid Midi试剂盒从一个转化体中分离质粒DNA,并通过用PvuII消化而确认,其得到期望的约4334bp和2220bp的片段。将得到的质粒命名为pMDT139(图18)。
实施例12:地衣芽孢杆菌SJ1904中Bli1904II基因的缺失
从地衣芽孢杆菌SJ1904的染色体缺失地衣芽孢杆菌Bli1904II限制性内切核酸酶基因,以测试对将DNA导入地衣芽孢杆菌的作用。
如下从地衣芽孢杆菌SJ1904的染色体缺失Bli1904II基因。根据Xue等,1999,见上文的方法,如实施例8中所述,通过电穿孔用质粒pMDT139转化地衣芽孢杆菌SJ1904。在34℃和250rpm培育转化体2.5-3小时,然后在34℃在TBAB红霉素/林可霉素平板上选择红霉素抗性。
在50℃使一个这样的转化体在带有红霉素选择的TBAB平板上生长,以选择在Bli1904II基因座pMDT139整合入染色体的整合物。然后在无选择的条件下在34℃使一个这样的整合体在VY培养基中生长,以允许整合质粒的切除和丢失。在37℃将培养物涂布在LB平板上,测试菌落对红霉素的敏感性,说明质粒的丢失。如下使用EXTRACT-N-AMPTM植物PCR试剂盒(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA),用引物999592和999595(如上所述),通过PCR测试几个红霉素敏感的克隆。通过将菌落悬浮于来自试剂盒的50μl提取溶液并在95℃温育10分钟而裂解地衣芽孢杆菌细胞。然后每个裂解悬浮液与50μl来自试剂盒的稀释溶液混合,根据制造商的说明,在PCR中各使用4μl。将一个克隆命名为地衣芽孢杆菌MDT269,所述克隆中PCR扩增得到约994bp的片段,说明Bli1904II基因从染色体上缺失。
实施例13:地衣芽孢杆菌SJ1904和MDT269的转化
进行转化实验,以确定Bli1904II限制性内切核酸酶和甲基转移酶M.Bli1904II对将DNA导入地衣芽孢杆菌的影响。
如实施例8中所述,从枯草芽孢杆菌168Δ4、枯草芽孢杆菌MDT101和地衣芽孢杆菌SJ1904的转化体中分离质粒pCJ791。如实施例8中所述制备地衣芽孢杆菌菌株SJ1904和MDT269的电感受态细胞。用分离自三种芽孢杆菌来源的pCJ791质粒DNA转化两种地衣芽孢杆菌菌株。对于每个转化,在电极间距为1mm的电转化杯中,用200ng质粒DNA转化60μl电感受态细胞,其中使用GENE设定为25μF、200Ω和1.0kV。转化一式三份(in triplicate)进行。
转化结果示于表1。用来自枯草芽孢杆菌168Δ4(不表达甲基转移酶M.Bli1904II)的质粒DNA转化地衣芽孢杆菌SJ1904(具有野生型Bli1904II限制性内切核酸酶基因)时,得到很低的转化频率。然而,用由甲基转移酶M.Bli1904II(来自枯草芽孢杆菌MDT101或地衣芽孢杆菌SJ1904)甲基化的质粒DNA转化地衣芽孢杆菌SJ1904时,得到高的转化效率。此外,在用来自三种来源任一个的质粒DNA(无论是否被甲基转移酶M.Bli1904II甲基化)转化地衣芽孢杆菌MDT269(缺失Bli1904II限制性内切核酸酶基因)时,获得了高的转化效率。结果显示,通过从表达M.Bli1904II DNA甲基转移酶的宿主菌株分离质粒DNA(这修饰了质粒DNA),或者通过缺失受体地衣芽孢杆菌菌株中的Bli1904II限制性内切核酸酶基因,可以显著改进地衣芽孢杆菌通过用质粒DNA电穿孔的转化。
表1.用分离自枯草芽孢杆菌168Δ4、枯草芽孢杆菌MDT101和地衣芽孢杆菌SJ1904的pCJ791质粒DNA转化地衣芽孢杆菌SJ1904。1转化频率是三次重复的平均值±标准偏差。
实施例14:用体外甲基化的质粒DNA转化地衣芽孢杆菌
根据Alegre等,2004,FEMS Microbiology Letters241:73-77的方法制备地衣芽孢杆菌SJ1904的无细胞提取物(CFE)。如Alegre等,2004,见上文所述,通过用CFE和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)处理,将分离自枯草芽孢杆菌168Δ4的质粒pCJ791甲基化。此外,进行对照实验,其中CFE以用于制备CFE的缓冲液替代。处理后,用酚和氯仿提取DNA,用异丙醇沉淀,并重悬于20μl水中。然后如实施例8中所述,使用200ng pCJ791质粒DNA,或者如上所述处理或者未处理,通过电穿孔转化地衣芽孢杆菌SJ1904。转化一式三份进行。
转化结果示于表2。用已经由CFE加SAM处理的质粒DNA进行转化得到的转化频率是用未处理的质粒DNA或仅用SAM处理的质粒DNA进行转化的100倍以上。这些结果证实质粒DNA的体外甲基化改进了地衣芽孢杆菌的转化。
表2.用体外甲基化的pCJ791质粒DNA转化地衣芽孢杆菌SJ1904。质粒DNA分离自枯草芽孢杆菌168Δ4。1转化频率是三次重复的平均值±标准偏差。
质粒DNA的处理 | 转化体每μg DNA1 |
地衣芽孢杆菌SJ1904CFE+SAM | 6.9×103±1.2×103 |
CFE缓冲液+SAM | 30±20 |
未处理 | 50±20 |
实施例15:地衣芽孢杆菌限制-修饰系统对枯草芽孢杆菌中接合质粒转移(conjugal plasmid transfer)的影响
使用质粒pCJ791测试了地衣芽孢杆菌限制-修饰系统对接合质粒转移的影响,所述质粒由于存在转移起点oriT,可以通过接合从合适的供体细胞转移至受体细胞。一个这样的合适接合供体菌株是枯草芽孢杆菌PP289-5(WO96/029418),其在编码D-丙氨酸消旋酶的arl(dal)基因中具有缺失,并包含质粒pBC16(赋予四环素抗性)和pLS20,其可赋予使含oriT质粒移动的能力。
根据Anagnostopoulos和Spizizen,1961,见上文的方法,用分离自枯草芽孢杆菌MDT101的基因组DNA转化枯草芽孢杆菌PP289-5,在37℃在TY氯霉素平板上选择氯霉素抗性。将一个这样的转化体(其在amyE基因座包含cat基因和M.Bli1904II DNA甲基转移酶表达盒)命名为枯草芽孢杆菌AEB711。
根据Anagnostopoulos和Spizizen,1961,见上文的方法,用质粒pCJ791转化枯草芽孢杆菌PP289-5和AEB711,在34℃在TBAB红霉素/林可霉素平板上选择红霉素抗性。将一个PP289-5转化体命名为枯草芽孢杆菌MDT104,并将一个AEB711转化体命名为枯草芽孢杆菌MDT105。
通过接合,使用枯草芽孢杆菌供体菌株MDT104和MDT105将质粒pCJ791转移至地衣芽孢杆菌受体菌株SJ1904和MDT269。地衣芽孢杆菌SJ1904和MDT269在LBPG平板上在30℃生长过夜。地衣芽孢杆菌MDT104和MDT105在包含每ml100μg D-丙氨酸、10μg四环素和5μg红霉素的LBPG平板上在30℃生长过夜。然后将每个菌株的细胞重悬于TY培养基中,并测定450nm处的光密度(OD)。根据OD,使用OD450为50的100μl细胞悬浮液的等同物,将等量的一株供体菌株和一株受体菌株混合。将混合物涂布在含100μg D-丙氨酸每ml的LB平板上并在30℃温育。在这些条件下,供体和受体菌株都能生长,并且可以通过接合将质粒pCJ791从供体转移至受体。在温育6小时后,细胞悬浮与1ml TY培养基中,将等分试样涂布于包含2μg红霉素每ml的TY平板上,并将平板在30℃培育过夜。在这些条件下,只有地衣芽孢杆菌转移接合子(transconjugant)(已经通过接合转移接受了质粒pCJ791的受体细胞)能生长。缺乏D-丙氨酸使arl-阴性供体不能生长,而存在红霉素使原始受体不能生长。
对于供体和受体菌株的四种不同组合,比较了每次接合得到的转移接合子的数目。接合结果示于表3。当使用枯草芽孢杆菌MDT104(不包含M.Bli1904II DNA甲基转移酶)作为供体,地衣芽孢杆菌SJ1904(具有野生型Bli1904II限制性内切核酸酶基因)作为受体时,获得低的接合频率。然而,当使用枯草芽孢杆菌MDT105(表达M.Bli1904II DNA甲基转移酶)作为供体(无论哪种受体)或者当使用地衣芽孢杆菌MDT269(缺失Bli1904II限制性内切核酸酶基因)作为受体(无论哪种供体)时,获得高的接合频率。结果显示,通过使用表达M.Bli1904II DNA甲基转移酶的供体菌株(这修饰了质粒DNA),或者通过缺失受体地衣芽孢杆菌菌株中的Bli1904II限制性内切核酸酶基因,显著改进了地衣芽孢杆菌的接合。
表3.将质粒pCJ791从枯草芽孢杆菌供体菌株MDT104和MDT105接合转移至地衣芽孢杆菌菌株SJ1904和MDT269。列出了三次独立实验A、B和C中每次的转移接合子数目。
生物材料的保藏
依据布达佩斯条约的条款,下述的生物材料已经保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection),北区研究中心(Northern Regional Research Center),1815University Street,Peoria,Illinois,61604,并给出了下述的登录号:
保藏物 登录号 保藏日期
大肠杆菌MDT45(pMDT138) NRRL B-41967 2006年9月7日
大肠杆菌MDT46(pMDT156) NRRL B-41968 2006年9月7日
所述菌株于下述条件下保藏:确保在本专利申请未决期间,由专利与商标委员依据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授权的人能够获得该培养物。该保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了该申请的副本,或其后续文本的国家,依据该外国专利法律的要求,可以获得该保藏物。然而,应当理解,保藏物的可用性并不构成对实施本发明的许可,实施本发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。
本文描述的和要求保护的发明并不局限于本文所公开的具体实施方案的范围内,因为这些实施方案意欲作为本发明几个方面的说明。任何等同的实施方案意欲在本发明的范围内。事实上,从前面的说明中,除本文所显示和描述的之外,本发明的多种修改对于本领域技术人员将是显而易见的。这些修改也意欲落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下,以包括定义的本公开为准。
本文引用了许多参考文献,其公开的内容通过提述以其整体并入。
Claims (9)
1.一种分离的限制性内切核酸酶,其为SEQ ID NO:2的氨基酸1至381。
2.权利要求1的限制性内切核酸酶,其由SEQ ID NO:1的核苷酸1至1143的多核苷酸编码。
3.权利要求1的限制性内切核酸酶,其由包含于大肠杆菌NRRL B-41968中的质粒pMDT156包含的多核苷酸编码。
4.编码权利要求1-3中任一项的限制性内切核酸酶的分离的多核苷酸。
5.包含权利要求4的多核苷酸的核酸构建体或重组表达载体,其与在表达宿主中指导多肽产生的一个或多个调控序列可操作连接。
6.包含权利要求4的多核苷酸的重组宿主细胞。
7.产生限制性内切核酸酶的方法,其包括:(a)在有益于产生限制性内切核酸酶的条件下培养包含权利要求4的多核苷酸的重组宿主细胞;和(b)回收所述限制性内切核酸酶。
8.产生细菌转化体的方法,其包括:
(a)将编码目的多肽的DNA导入细菌宿主细胞中,所述细菌宿主细胞包含权利要求4的多核苷酸,所述多核苷酸是失活的;
其中编码限制性内切核酸酶的多核苷酸的失活使导入的DNA不被限制性内切核酸酶消化,且无需在将DNA导入细菌宿主细胞前用DNA甲基转移酶将DNA甲基化;和
(b)分离包含所述DNA的细菌宿主细胞的转化体。
9.通过权利要求8的方法获得的转化体。
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