CN105002162A - 一种用于转化不同菌株的外源质粒体外甲基化修饰的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于转化不同菌株的外源质粒体外甲基化修饰的方法。它是提取枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的细胞抽提液，用此细胞抽提液对外源质粒DNA进行体外甲基化修饰，由此得到已甲基化修饰的质粒DNA。本发明提出了一种使用枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的细胞抽提液(该细胞抽提液中含有菌株特异性甲基化酶)对外源质粒在体外进行甲基化修饰，从而可以使已甲基化修饰的质粒DNA转入存在限制修饰系统的受体菌，而不会被受体菌剪切降解，可用于不同的菌株以及未进行全基因组测序的新菌。本发明的方法，其操作简单。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种用于转化不同菌株的外源质粒体外甲基化修饰的方法。
背景技术
近些年，越来越多的研究发现，受体菌难于或不能被转化的一个重要阻碍因素是受体菌存在的限制修饰系统。主要原因是修饰限制系统能将进入细胞内的大部分甚至是全部的外源DNA在没有来得及行使功能就被剪切并降解，也就不能获得转化子或是转化子数量极少。目前主要有以下几种解决途径：
一、DNA的特异甲基化修饰
目前，由于有越来越多的菌株的全基因组测序工作已经完成，因此这些菌株遗传背景也相对更加清楚，而通过生物信息学以及其他一些分析手段就可以掌握菌株中修饰限制系统的存在情况，这就为DNA的体外甲基化提供了新的方法途径，即采用商业化的甲基化酶对DNA进行体外修饰，这种方法也在芽胞杆菌及其他种属的菌株中获得成功。
二、DNA序列人工修改
受体菌内在内切酶对DNA的剪切作用针对的是特异的靶序列，因此通过将DNA中存在的这些靶序列人工突变或删除则可以避免被剪切而保持完整性。Kim等实验发现受体菌中存在SacII限制修饰系统，为了避免质粒pYBamy59被SacII剪切而导致不能转化长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)菌株MG1，其突变pYBamy59中的SacII的识别序列，通过这种方式，质粒pYBamy59转化了B.longum MG1效率提高了8倍。
三、限制修饰系统的删除或突变
上述两种方式都是采用对DNA的修饰来避免或减弱被受体菌自身内切酶的剪切，都是间接的解决方法。而最根本的方法就是减少或全部删除受体菌中的限制性修饰系统，即将表达该系统特别是表达限制性内切酶的相关基因敲除，这样就能够获得易转化的工程菌株，便于今后的遗传学操作。Bian等通过定点突变的方式突变了齿垢密螺旋体(Treponema denticola)菌株ATCC 35405中预测表达II型核酸内切酶的TDE0911基因，实验表明突变菌株不会剪切未经甲基化修饰的质粒pBFC，并且能够直接转化未甲基化修饰的质粒。这种方法在包括丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)等多个菌株都获得成功。
由于上述方法都是基于菌株的基因组信息比较清楚的条件下进行，且进行的DNA序列修改或者限制修饰系统的删除或突变等操作都比较复杂，当研究的对象为尚未进行全基因组测序或者没有相应的商业化甲基化酶的菌株，上述方法无法开展。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于转化不同菌株的外源质粒体外甲基化修饰的方法。
本发明的用于转化不同菌株的外源质粒体外甲基化修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的细胞抽提液，用此细胞抽提液对外源质粒DNA进行体外甲基化修饰，由此得到已甲基化修饰的质粒DNA。
此已甲基化修饰的质粒DNA就可以转化到存在限制修饰系统的受体菌，已甲基化修饰的质粒DNA不会被受体菌剪切并降解，因此可以获得转化子。
所述的用此细胞抽提液对外源质粒DNA进行体外甲基化修饰，优选具体步骤为：
将细胞抽提液按以下体系配置，进行质粒DNA体外甲基化修饰：
细胞抽提液30μL、质粒DNA 12μg、500mM pH 8.0的EDTA 1μL、200μM SAM(s-腺苷甲硫氨酸)3μL、100mM DTT(二硫苏糖醇)1μL，再用ddH2O补齐至100μL；
该反应体系置于37℃孵育12-16h，这期间重新添加200μM SAM 2-3次，每次3μL，反应完后，加1×体积的异丙醇，-20℃沉淀过夜，4℃离心20min，弃去上清，加体积分数70％乙醇水溶液洗涤，晾干，溶解于ddH2O中，得到已甲基化修饰的质粒DNA。
所述的枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌ATCC9372。
所述的地衣芽孢杆菌优选为地衣芽孢杆菌ATCC14580。
与现有技术相比，本发明提出了一种使用枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的细胞抽提液(该细胞抽提液中含有菌株特异性甲基化酶)对外源质粒在体外进行甲基化修饰，从而可以使已甲基化修饰的质粒DNA转入存在限制修饰系统的受体菌，而不会被受体菌剪切降解，可用于不同的菌株以及未进行全基因组测序的新菌。本发明的方法，其操作简单。
附图说明：
图1是枯草芽孢杆菌ATCC9372和地衣芽孢杆菌ATCC14580的细胞抽提液分别对质粒pKSV7的限制性修饰分析图，其中M为Marker，pKSV7为质粒pKSV7，ATCC 9372指的是不同蛋白含量(5μg、500ng、50ng)的枯草芽孢杆菌ATCC9372的细胞抽提液与质粒pKSV7混合反应后的产物电泳图，ATCC 14580指的是不同蛋白含量(5μg、500ng、50ng)的地衣芽孢杆菌ATCC14580的细胞抽提液与质粒pKSV7混合反应后的产物电泳图。
图2是对外源质粒DNA进行体外甲基化修饰的样品的电泳图，其中M为Marker，pKSV7methylated with CFE/ATCC 9372/ATCC 14580指的是分别被枯草芽孢杆菌ATCC9372和地衣芽孢杆菌ATCC14580的细胞抽提液甲基化后的质粒pKSV7。
图3是分别被枯草芽孢杆菌ATCC9372和地衣芽孢杆菌ATCC14580的细胞抽提液甲基化后的质粒pKSV7分别转化枯草芽孢杆菌ATCC9372和地衣芽孢杆菌ATCC14580的转化子的PCR验证图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：菌株细胞提取液的获取；
将已活化的枯草芽孢杆菌ATCC9372和地衣芽孢杆菌ATCC14580分别转接到LB液体培养基中，30℃，200r/min培养至对数生长期；4℃，5000r/min离心10分钟收集菌体，并用预冷的去离子水洗涤两次；菌体重悬于原始菌液体积1/3的TNM(100mM Tris-HCl(pH 7.5)，50mM NaCl，5mM MgCl2)缓冲液中，使用ONE SHOT高压细胞破碎仪在压力30kpsi条件下进行样品破碎；4℃，5000r/min离心10分钟去除细胞碎片，收集离心的上清液，即为细胞抽提液(Cell free extracts,CFE)，立即使用或分装后置于-70℃保存备用。
实施例2：菌株限制性修饰系统的分析；
分别将获得的枯草芽孢杆菌ATCC 9372和地衣芽孢杆菌ATCC 14580细胞抽提液稀释，并按以下体系进行限制性实验：细胞抽提液(CFE)10μL、质粒DNA(pKSV7)400-500ng、ddH2O up to 20μL。
将上述反应体系充分混匀并置于37℃，2h，跑胶检测。枯草芽孢杆菌ATCC9372和地衣芽孢杆菌ATCC14580对质粒pKSV7的限制性修饰分析如图1所示，枯草芽孢杆菌ATCC9372和地衣芽孢杆菌ATCC14580的细胞抽提液都能够降解外源质粒pKSV7。
实施例3：对外源质粒DNA进行体外甲基化修饰；
分别将获得的枯草芽孢杆菌ATCC9372和地衣芽孢杆菌ATCC14580细胞抽提液按以下体系配置，进行质粒DNA体外甲基化修饰：
细胞抽提液(CFE)30μL
质粒pKSV712μg
EDTA(500mM,pH 8.0)1μL
SAM(s-腺苷甲硫氨酸)(200μM)3μL
DTT(二硫苏糖醇)(100mM)1μL
ddH2O up to 100μL(体系中的SAM提供甲基功能)
上述的反应体系置于37℃孵育12h，这期间重新添加SAM(200μM)2次，每次3μL，加1×体积的异丙醇，-20℃沉淀过夜，4℃离心20min，弃去上清，加1mL体积分数70％乙醇水溶液洗涤，超净台内晾干，重新溶解于20μL ddH2O中，由此得到甲基化修饰的质粒pKSV7。取适量样品进行限制性修饰系统的分析，如图2所示，甲基化修饰后的质粒pKSV7基本上不会被相应的CFE剪切。
实施例4：使用已甲基化修饰的质粒DNA转化相应的菌株。
4.1枯草芽孢杆菌ATCC 9372感受态制备及电转化
挑取经活化的枯草芽孢杆菌ATCC 9372单菌落至培养基3mL LB中，37℃，180rpm过夜培养，稀释16倍转接到生长培养基(LB含海藻糖0.5M、0.5M山梨醇)中，37℃，180rpm培养至OD600为0.85～0.95，冰浴20min后4℃，5000rpm离心5min，冰浴电击洗液(0.5M海藻糖，0.5M山梨醇，0.38M甘露醇，10％甘油)冲洗菌体2～3次，最后用电击洗液悬浮菌体，100μL每管分装。100μL感受态与1μL质粒(100ng/μL，实施例3中的甲基化修饰的质粒pKSV7或者未经甲基化修饰的质粒pKSV7)混匀后转入冰置电击杯(1mm)中，并与5min后进行电击(1800kV/cm，电击时间5ms)，电击后立即加入1mL恢复液(LB含0.5M海藻糖，0.5M山梨醇，0.38M甘露醇)，37℃，160rpm孵育3h后涂布含有17mg/mL氯霉素的LB平板上。
4.2地衣芽孢杆菌ATCC 14580感受态制备及电转化
挑取经活化的地衣芽孢杆菌ATCC 14580单菌落至培养基30mL LB中，30℃，180rpm培养至OD600≈0.8，冰浴20min后4℃，5000rpm离心5min，EP缓冲液(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇,10％甘油)冲洗菌体2～3次，最后用1mL EP缓冲液悬浮菌体，100μL每管分装。100μL感受态与1μL质粒(100ng/μL，实施例3中的甲基化修饰的质粒pKSV7或者未经甲基化修饰的质粒pKSV7)混匀后转入冰置电击杯(1mm)中，并与5min后进行电击(1800kV/cm，电击时间5ms)，电击后立即加入1mL复苏培养基(LB含0.5M山梨醇，0.38M甘露醇)，30℃，160rpm孵育4h后涂布含有17mg/mL氯霉素的LB平板上。
统计转化子发现，未经过甲基化修饰处理的质粒pKSV7电击转化枯草芽孢杆菌ATCC9372和地衣芽孢杆菌ATCC 14580后都没有获得转化子，而经过相应的细胞提取液进行甲基化修饰的pKSV7电击转化枯草芽孢杆菌ATCC 9372和地衣芽孢杆菌ATCC 14580后分别获得了2.2±0.2×103转化子/μg DNA和1.08±0.11×102转化子/μg DNA，分别随机挑取7个转化子进行菌落pcr验证，如图3所示，挑取的转化子皆是阳性克隆。
Claims (4)
1.一种用于转化不同菌株的外源质粒体外甲基化修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的细胞抽提液，用此细胞抽提液对外源质粒DNA进行体外甲基化修饰，由此得到已甲基化修饰的质粒DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的用此细胞抽提液对外源质粒DNA进行体外甲基化修饰，具体步骤为：
将细胞抽提液按以下体系配置，进行质粒DNA体外甲基化修饰：
细胞抽提液30μL、质粒DNA 12μg、500mM pH 8.0的EDTA 1μL、200μM SAM 3μL、100mM DTT 1μL，再用ddH2O补齐至100μL；
该反应体系置于37℃孵育12-16h，这期间重新添加200μM SAM 2-3次，每次3μL，反应完后，加1×体积的异丙醇，-20℃沉淀过夜，4℃离心20min，弃去上清，加体积分数70％乙醇水溶液洗涤，晾干，溶解于ddH2O中，得到已甲基化修饰的质粒DNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ATCC9372。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌ATCC14580。
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