EA015262B1 - Выделенное антитело к il-6 и его применение - Google Patents

Выделенное антитело к il-6 и его применение Download PDF

Info

Publication number
EA015262B1
EA015262B1 EA200702374A EA200702374A EA015262B1 EA 015262 B1 EA015262 B1 EA 015262B1 EA 200702374 A EA200702374 A EA 200702374A EA 200702374 A EA200702374 A EA 200702374A EA 015262 B1 EA015262 B1 EA 015262B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
amino acid
human
hydrochloride
acid sequence
Prior art date
Application number
EA200702374A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200702374A1 (ru
Inventor
Янь Чэнь
Дебра Гарднер
Дэвид М. Найт
Майкл В. Ларк
Байлинь Лян
Дэвид Дж. Шили
Сяо-Юй Р. Сун
Ведрана Стоянович-Сусулик
Реймонд В. Свит
Сьюзан Х. Тэм
Шэн-Дзюн Ву
Цзин Ян
Дэвид Мэттью Маркис
Эрик Майкл Смит
Ален Филипп Вассеро
Original Assignee
Сентокор, Инк.
Эпплайд Молекьюлар Эволюшн, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сентокор, Инк., Эпплайд Молекьюлар Эволюшн, Инк. filed Critical Сентокор, Инк.
Publication of EA200702374A1 publication Critical patent/EA200702374A1/ru
Publication of EA015262B1 publication Critical patent/EA015262B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

Описано антитело к IL-6, а также содержащая его композиция и антиидиотипическое антитело, связывающееся с ним.

Description

Настоящее изобретение относится к антителам, включая их конкретные части или варианты, специфичные по меньшей мере к одному белку 1Ь-б или к его фрагменту; а также к антиидиотипическим антителам; к нуклеиновым кислотам, кодирующим указанные анти-ГЬ-б антитела; к комплементарным нуклеиновым кислотам; к векторам; клеткам-хозяевам и к способам их получения и применения, включая способ применения терапевтических композиций и устройства для их введения.
Предшествующий уровень техники
1Ь-б представляет собой плейотропный провоспалительный цитокин, продуцируемый и секретируемый многими клетками различных типов, особенно антигенпрезентирующими клетками, а именно Т- и В-клетками. 1Ь-б стимулирует различные функции, такие как рост и дифференцировка В-клеток, активация Т-клеток, гемопоэз, активация остеокластов, рост кератиноцитов, рост нервных клеток и активация гепатоцитов. 1Ь-б связывается с трансмембранным или растворимым 1Ь-б£ и передает сигналы посредством др130, который присутствует у некоторых других цитокинов.
1Ь-б играет важную роль в патогенезе В-клеток, как это происходит при системной красной волчанке, рассеянном склерозе и лимфопролиферативных расстройствах. Аналогичным образом 1Ь-б также участвует в патогенезе аутоиммунных и воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит и остеоартрит. Недавно на основании косвенных данных было сделано предположение о существовании взаимосвязи активности 1Ь-б с хронической обструктивной болезнью легких и инсулинорезистентностью при диабете типа 2. 1Ь-б обладает провоспалительным и противовоспалительным действием в иммунной системе, что указывает на то, что этот цитокин также играет центральную роль в регуляции физиологического ответа организма на развитие заболевания. Поэтому нацеливание терапевтических средств на 1Ь-б может оказывать благоприятное действие при различных заболеваниях.
Повышение уровня продуцирования 1Ь-б наблюдается при ряде заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, воспаление, инфаркт миокарда, болезнь Педжета, остеопороз, солидные опухоли (почечно-клеточная карцинома), рак предстательной железы и мочевого пузыря, рак нервной ткани и В-клеточные злокачественные заболевания (например, болезнь Кастельмана, некоторые лимфомы, хронический лимфоцитарный лейкоз и множественную миелому). Проведенные исследования показали, что 1Ь-б ассоциируется с патогенезом многих из этих заболеваний, в частности рака, поэтому блокирование 1Ь-б должно давать благоприятные клинические эффекты.
Были получены мышиные, химерные и другие нечеловеческие анти-1Ь-б антитела, однако они могут обладать ограниченной активностью и эффективностью, что может часто приводить к индуцированию нежелательного иммунного ответа (то есть иммуногенности) и/или к необходимости введения этих антител в высоких дозах (см. публикацию Тпкйа с1 а1., С1ш. Сап. Кек., 9, 4б53-4бб5, Ос1.. 2003, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки). Так, например, антитела, содержащие части нечеловеческого антитела, часто индуцируют иммунный ответ у человека. В соответствии с этим, повторное введение этого антитела в терапевтических целях является неприемлемым, а опосредуемое иммунным комплексом выведение антител из кровотока может приводить к снижению активности/эффективности данного антитела. Сывороточная болезнь и анафилаксия представляют собой два репрезентативных состояния, которые могут вызываться повторным введением антител, имеющих части нечеловеческих антител. Поэтому необходимо получить анти-1Ь-б антитело, которое будет обладать меньшей иммуногенностью, то есть будет лучше переноситься человеком и обладать большей активностью, что позволит вводить его в меньших дозах по сравнению с используемыми ранее анти-1Ь-б антителами.
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к выделенным сконструированным человеческим антителам к 1Ь-б (также называемым анти-1Ь-б антителами), а также к композициям анти-1Ь-б антител, к антиидиотипическим анти-1Ь-б антителам и к способам их получения и применения.
Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, включающей анти1Ь-б антитело, для введения терапевтически эффективного количества указанного антитела в целях модуляции или лечения по меньшей мере одного 1Ь-б-ассоциированного состояния в клетки, ткани, органы, организм животного или человека до, после или во время развития 1Ь-б-ассоциированного состояния, известного специалистам и/или описанного в настоящей заявке.
Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции для доставки терапевтически или профилактически эффективного количества по меньшей мере одного анти-1Ь-б антитела согласно изобретению.
Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, включающей антиГБ-б антитело, для диагностики по меньшей мере одного 1Ь-б-ассоциированного состояния клеток, ткани, органа или организма животного или человека до, после или во время развития ГЬ-б-ассоциированного состояния, известного специалистам и/или описанного в настоящей заявке.
Настоящее изобретение также относится к любому из описанных здесь вариантов.
- 1 015262
Описание чертежей
На фиг. 1 проиллюстрировано связывание сконструированного человеческого и химерного анти-1Ь6 антитела с комплексом 1Ь-6/1Ь-6В;
на фиг. 2 проиллюстрирован эпитоп, связывающийся со сконструированным человеческим анти-1Ь6 антителом согласно изобретению;
на фиг. 3 показано, что сконструированное человеческое анти-В-6 антитело ингибирует 1Ь-6стимулированную секрецию МСР-1 клетками И937, как было измерено с помощью ЕЬ1§Л;
на фиг. 4 показано, что сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело ингибирует 1Ь-6- и ΙΕ-Ιβ-стимулированную секрецию 8ЛЛ клетками НерО2, как было измерено с помощью ЕЫ8Л;
на фиг. 5А и 5В показано, что сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело блокирует 1Ь-6опосредуемое фосфорилирование 8ТАТ3, как было измерено с помощью вестерн-блот-анализа, проводимого посредством гель-электрофореза;
на фиг. 6 проиллюстрировано ингибирование индуцированного человеческим 1Ь-6 продуцирования 8АА у мышей Ва1Ь/С под действием сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела;
на фиг. 7 проиллюстрировано ингибирование продуцирования аутоантител против дцДНК под действием анти-1Ь-6 тАЬ у мышей ΝΖΒ/Α Е1;
на фиг. 8А проиллюстрировано влияние 1Ь-6 на инсулининдуцированное инсулином фосфорилирование Ак1 в присутствии и в отсутствие сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела;
на фиг. 8В проиллюстрирован вестерн-блот-анализ, проводимый для определения действия 1Ь-6 на индуцированное инсулином фосфорилирование Ак1 в присутствии и в отсутствие сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела;
на фиг. 9 представлены результаты ЕЬ18А-анализа на связывание, описанного в примере 3;
на фиг. 10 представлены результаты анализа на антипролиферативное действие с использованием 1Ь-6-зависимой клеточной линии, описанного в примере 3;
на фиг. 11А проиллюстрирована активация киназы ΡΙ3 в крысиных гепатоцитах, обработанных инсулином, белком 1Ь-6 и анти-1Ь-6 антителом;
на фиг. 11В представлен контроль в анализах на активацию киназы ΡΙ3 в крысиных гепатоцитах;
на фиг. 12 А проиллюстрировано влияние 1Ь-6 на передачу сигнала индуцированного инсулином фосфорилирования ΙΒ в крысиных гепатоцитах;
на фиг. 12 А проиллюстрировано влияние 1Ь-6 на передачу сигнала индуцированного инсулином фосфорилирования Ак1 в крысиных гепатоцитах;
на фиг. 13 А указан уровень глюкозы у мышей ΌΙΟ после их обработки анти-1Ь-6 антителом; на фиг. 13В указан уровень инсулина у мышей ΌΙΟ после их обработки анти-1Ь-6 антителом;
на фиг. 13С представлена оценка индекса гомеостаза глюкозы (НОМА) у мышей-моделей ΌΙΟ после их обработки анти-[к-6 антителом;
на фиг. 14А-Е указан уровень липидов до и после обработки анти-I^-6 антителом;
на фиг. 15 проиллюстрирована схема внутрибрюшинного введения 34™-^-/) тАЬ мышам для проведения теста на их толерантность к глюкозе (ίρΟΤΤ).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к выделенным, рекомбинантным и/или синтетически сконструированным человеческим анти-I^-6 антителам и к антиидиотипическим антителам против анти-I^-6 антител, а также к композициям и к кодирующим молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одно ομή-ΙΕ-6 антитело или антиидиотипическое антитело. Настоящее изобретение также включает, но не ограничивается ими, способы получения и применения таких нуклеиновых кислот, антител и антиидиотипических антител, включая диагностические и терапевтические композиции, способы и устройства.
Используемые здесь термины антитело против ΙΕ-6, ^1^4-^-6 антитело, часть анти-I^-6 антитела или фрагмент анти-В-6 антитела и/или вариант анти-I^-6 антитела и т.п. означают любую белок- или пептидсодержащую молекулу, которая включает по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, такую как, но не ограничивающуюся ими, по меньшей мере одну гипервариабельную область (комплементарность определяющую область (СОВ)) тяжелой или легкой цепи или ее лигандсвязывающую часть, вариабельную область тяжелой или легкой цепи, константную область тяжелой или легкой цепи, каркасную область или любую их часть или по меньшей мере одну часть ΙΕ-6-рецептора или связывающего белка, которые могут быть включены в антитело согласно изобретению. Указанное антитело, кроме того, но необязательно, взаимодействует со специфическим лигандом таким способом, но не ограничивающимся им, в результате которого указанное антитело модулирует, снижает, увеличивает, подавляет, стимулирует, уменьшает, ослабляет, блокирует, ингибирует, отменяет и/или предотвращает по меньшей мере одну активность или связывание ΙΕ-6 либо активность или связывание рецептора ΙΕ-6, ίη νίΐΓΟ, ίη κίΐιι и/или ίη νίνο. В качестве неограничивающего примера может служить подходящее анти-I^-6 антитело согласно изобретению или его конкретная часть или вариант согласно изобретению, которые могут связываться по меньшей мере с одной молекулой ΙΕ-6 или с ее конкретными частями, вариантами или доменами. Подходящее ομή-ΙΕ-6 антитело, его конкретная часть или вариант могут также, но необя
- 2 015262 зательно, влиять по меньшей мере на одну активность или функцию 1Ь-6, такие как, но не ограничивающиеся ими, синтез РНК, ДНК или белка, высвобождение 1Ь-6, передача сигнала рецептором 1Ь-6, расщепление мембранного 1Ь-6, активность 1Ь-6, продуцирование и/или синтез 1Ь-6.
Термин антитело, кроме того, охватывает антитела, их рестрикционные фрагменты, конкретные части и варианты, включая антитела-миметики или антитела, содержащие части антител, которые имитируют структуру и/или функцию антитела или его конкретного фрагмента либо конкретной части, включая одноцепочечные антитела и их фрагменты. Функциональными фрагментами являются антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с 1Ь-6 млекопитающего. Так, например, фрагментами антител, способными связываться с 1Ь-6 или с его частями, являются, но не ограничиваются ими, следующие фрагменты: ЕаЬ (например, образующийся в результате гидролиза папаином), ЕаЬ' (например, образующийся в результате гидролиза пепсином и частичного восстановления) и Е(аЬ')2 (например, образующийся в результате гидролиза пепсином), СасЬ (например, образующийся в результате гидролиза плазмином), рЕс' (например, образующийся в результате гидролиза пепсином или плазмином), Еб (например, образующийся в результате гидролиза пепсином, частичного восстановления и реагрегации), Εν или 5сЕ\г (например, полученные методами молекулярной биологии), которые входят в объем настоящего изобретения (см. выше, например, СоШдап, 1ттцио1оду).
Такие фрагменты могут быть продуцированы методом ферментативного расщепления, методом синтеза или рекомбинантными методами, известными специалистам и/или описанными в настоящей заявке. Антитела могут быть также продуцированы в виде различных усеченных форм с использованием генов антител, в которых один или несколько стоп-кодонов были введены в область, расположенную выше (по ходу транскрипции) от природного сайта терминации. Так, например, для встраивания ДНКпоследовательностей, кодирующих СН1-домен и/или шарнирную область тяжелой цепи, может быть сконструирован комбинированный ген, кодирующий Е(аЬ')2-фрагмент тяжелой цепи. Различные фрагменты антител могут быть присоединены друг к другу стандартными химическими методами, либо они могут быть получены в виде непрерывной белковой последовательности методами генной инженерии.
Используемый здесь термин сконструированное человеческое антитело означает антитело, содержащее, по меньшей мере, полностью человеческие каркасные области и константные области (СЪ,СНдомены (например, СН1, СН2, СН3) и шарнирную область), и СЭР, происходящие от антигенсвязывающих антител. Полностью человеческие каркасные области включают каркасные области, соответствующие человеческим последовательностям зародышевой линии, а также последовательностям с соматическими мутациями. СЭР могут происходить от одной или нескольких СЭР, которые связываются с 1Ь-6 в окружении каркасных областей любого антитела. Так, например, СЭР сконструированного человеческого антитела согласно изобретению могут происходить от СЭР, которые связываются с 1Ь-6 в любом окружении каркасных областей мышиного антитела, а затем их модифицируют так, чтобы они связывались с 1Ь-6 в окружении полностью человеческих каркасных областей. В большинстве случаев сконструированное человеческое антитело, по существу, является неиммуногенным для человека.
Аналогичным образом, антитела приматов (обезьяны, павианы, шимпанзе и т. п.), грызунов (мышей, крыс, кроликов, морских свинок, хомячков и т.п.) и других млекопитающих представляют собой антитела, специфичные для животных такого вида, подрода, рода, подсемейства и семейства. Кроме того, химерные антитела могут включать любую из вышеуказанных комбинаций. Такие модификации или варианты антител, по сравнению с немодифицированными антителами, необязательно, но предпочтительно, сохраняют или снижают иммуногенность у человека или других видов. Так, например, сконструированное человеческое антитело отличается от химерного или гуманизованного антитела.
Было показано, что сконструированное человеческое антитело может продуцироваться организмом животного, не являющегося человеком, или прокариотическими, или эукариотическими клетками, способными экспрессировать функционально реаранжированные гены человеческого или сконструированного человеческого иммуноглобулина (например, тяжелой цепи и/или легкой цепи). Кроме того, если сконструированное человеческое антитело является одноцепочечным, то оно может содержать линкерный пептид, не обнаруживаемый в природных человеческих антителах. Так, например, Εν может содержать линкерный пептид, такой как пептид, имеющий от двух и примерно до восьми глициновых остатков или других аминокислотных остатков, которые соединяют вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. Очевидно, что такие линкерные пептиды могут происходить и от человеческих антител.
Могут быть также использованы биспецифические, гетероспецифические, гетероконъюгированные или аналогичные им антитела, которые представляют собой моноклональные, а предпочтительно человеческие, сконструированные человеческие или гуманизованные антитела, специфически связывающиеся по меньшей мере с двумя различными антигенами. В данном случае, одной из специфичностей связывания является специфичность по меньшей мере к одному белку 1Ь-6, а другой специфичностью является специфичность к любому другому антигену. Методы получения биспецифических антител известны специалистам. Традиционный метод рекомбинантного продуцирования биспецифических антител основан на коэкспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, где указанные две тяжелые цепи обладают различными специфичностями (ΜίΗίοίη & Сие11о, НаФге, 305:537 (1983)). В результате
- 3 015262 случайной реаранжировки тяжелых и легких цепей иммуноглобулина эти гибридомы (квадромы) продуцируют смесь из десяти возможных различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистку такой правильной молекулы обычно осуществляют путем проведения постадийной аффинной хроматографии. Аналогичные процедуры описаны, например, в АО 93/08829, в патентах США №№ 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, в АО 91/00360, 92/00373, ЕР 03089, Тгаипескег е1 а1., ЕМВО 1., 10:3655 (1991), ЗигезЬ е1 а1., Ме11юб5 ίη Епхуто1оду. 121:210 (1986), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Анти-1Ь-6 антитела, используемые в способах и композициях согласно изобретению, могут, но необязательно, обладать высокой аффинностью связывания с 1Ь-6 и, необязательно, но предпочтительно, низкой токсичностью. В частности, в настоящем изобретении используется антитело, его конкретный фрагмент или вариант, в котором отдельные компоненты, такие как вариабельная область, константная область и каркасная область, взятые отдельно или в комбинации друг с другом, необязательно, но предпочтительно, имеют низкую иммуногенность. Антитела, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, характеризуются, но необязательно, своей способностью оказывать терапевтическое действие на пациентов в течение продолжительного периода времени со значительным ослаблением симптомов заболевания и низкой и/или приемлемой токсичностью. Низкая или приемлемая иммуногенность и/или высокая аффинность, а также другие желательные свойства могут вносить свой вклад в достигаемые терапевтические эффекты. Термин низкая иммуногенность определяется здесь как вероятность присутствия титруемых уровней антител против анти-1Е-6 антитела у менее чем 25% пациентов, подвергнутых лечению анти-1Ь-6 антителом, а предпочтительно у менее чем 10% пациентов, которым была введена рекомендуемая доза такого антитела во время проведения рекомендованного курса лечения.
Выделенные нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть использованы для продуцирования по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела или его конкретного варианта, которые могут быть использованы для определения частоты возникновения симптомов по меньшей мере одного 1Ь-6ассоциированного состояния, выбранного, но не ограничивающегося ими, из аутоиммунных расстройств или заболеваний, сердечно-сосудистых расстройств или заболеваний, а также инфекционных, злокачественных и/или нервных расстройств или заболеваний, или другого известного или конкретного 1Ь-6ассоциированного состояния клетки, ткани, органа или организма животного (включая млекопитающих и человека), или для определения воздействия указанных заболеваний или расстройств на указанные клетки, ткани, органы или организм животного (включая млекопитающих и человека), а также для диагностики, мониторинга, модуляции, лечения, ослабления, предотвращения возникновения или улучшения динамики развития симптомов по меньшей мере из одного из 1Ь-6-ассоциированных состояний.
Такой способ может включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-1Е-6 антитело, в клетку, в ткань, в орган и в организм животного или человека, нуждающегося в такой модуляции, лечении, ослаблении или предупреждении симптомов или в снижении уровня, эффектов или механизмов их развития. Такое эффективное количество может составлять примерно 0,001-500 мкг/кг на одно введение (например, введение ударной дозы), многократное введение или непрерывное введение, или количество, необходимое для достижения концентрации 0,001-5000 мкг/мл в сыворотке на одно введение, многократное введение или непрерывное введение, или любое эффективное количество в пределах указанного интервала или величину, входящую в этот интервал, как может быть осуществлено и определено известными методами, описанными в настоящей заявке или известными специалистам.
Антитела согласно изобретению. Продуцирование и генерация антител
По меньшей мере одно анти-1Е-6 антитело согласно изобретению может быть, но необязательно, продуцировано клеточной линией, смешанной клеточной линией, иммортализованной клеткой или клональной популяцией иммортализованных клеток, хорошо известных специалистам. См., например, Аи8иЬе1, е1 а1., еб., Сиггеп! Рго1осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, бо1т Айеу & Зопз, 1пс., ΝΥ, ΝΥ (1987-2001); ЗатЬгоок, е1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2пб Ебйюп, Со1б Зрппд НагЬог, ΝΥ (1989); Наг1о\х & капе, АпбЬоб1е8, а ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б Зрппд НагЬог, ΝΥ (1989); СоШдап, е1 а1., ебз., Сиггеп! Рго1осок т 1ттипо1оду, 1оЬп А11еу & Зопз, 1пс., ΝΥ (1994-2001); СоШдап е1 а1., Сиггеп! Рго1осо1з ш Рго1еш Зс1епсе, 1оЬп А11еу & Зопз, ΝΥ, ΝΥ, (1997-2001).
Сконструированные человеческие антитела, которые являются специфичными к человеческим белкам 1Ь-6 или к их фрагментам, могут вырабатываться против соответствующего иммуногенного антигена, такого как выделенный белок 1Ь-6 и/или его часть (включая синтетические молекулы, такие как синтетические пептиды). Аналогичным образом могут быть продуцированы и другие специфические или неспецифические антитела других млекопитающих. Получение иммуногенных антигенов и продуцирование моноклонального антитела может быть осуществлено с применением соответствующей технологии.
В одном из способов гибридому продуцируют путем слияния подходящей иммортализованной клеточной линии (например, миеломной клеточной линии, такой как, но не ограничивающейся ими, Зр2/0,
- 4 015262
8р2/0-АО14, N80, N81, N82, АЕ-1, Ь.5, Ь243, Р3Х63А§8. 653, 8р2 8Л3, 8р2 ΜΑΙ, 8р2 881, 8р2 8А5, И937, МЬА 144, АСТ IV, М0БТ4, ΌΑ-1, ЮККАТ, №ΕΗΙ, К-562, С08, КАЛ, ΝΙΗ 3Т3, НЬ-60, МЬА 144, ΝΑΜΑΡΑΧΑ, ΝΕυΚΟ 2 А или т.п., или гетеромиелом, их гибридных продуктов, или любой происходящей от них клетки, или любой другой подходящей клеточной линии, известной специалистам) (см., например, \у\у\у.а1се.огц. \у\у\у.1|Гс1се11.еот и т.п.) с антителопродуцирующими клетками, такими как, но не ограничивающимися ими, выделенные или клонированные клетки селезенки, периферической крови, лимфы, миндалин или другие иммунные клетки или В-клетки, либо с любыми другими клетками, экспрессирующими константные, вариабельные, каркасные области или СЭК-последовательности тяжелой или легкой цепи, либо эндогенные, либо гетерологичные нуклеиновые кислоты, такие как рекомбинантные или эндогенные, вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты водорослей, прокариотических организмов, амфибий, насекомых, рептилий, рыб, млекопитающих, грызунов, лошадей, овец, коз, баранов, приматов и эукариотических организмов; геномные ДНК, кДНК, рДНК, митохондриальные ДНК или РНК, ДНК или РНК хлоропластов, чРНК, мРНК, тРНК, одноцепочечные, двухцепочечные, трехцепочечные, гибридизованные ДНК и т.п., или любые их комбинации. См., например, публикации Аи8иЬе1, см. выше, и СоШдаи, 1ттипо1оду, см. выше, глава 2, которые полностью введены в настоящее описание посредством ссылки.
Антителопродуцирующие клетки могут быть также выделены из периферической крови или предпочтительно из селезенки либо лимфоузлов человека или других подходящих животных, которые были иммунизированы представляющими интерес антигеном. Для экспрессии гетерологичной или эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело согласно изобретению, его специфический фрагмент или вариант могут быть также использованы любые другие подходящие клетки-хозяева. Слитые клетки (гибридомы) или рекомбинантные клетки могут быть выделены в селективных условиях культивирования или другими подходящими известными методами и клонированы путем лимитирующего разведения или клеточного сортинга, либо другими известными методами. Клетки, продуцирующие антитела с нужной специфичностью, могут быть выбраны с помощью подходящего анализа (например, ЕБ18А).
Могут быть также использованы методы генного конструирования или гуманизации нечеловеческих или человеческих антител, и эти методы хорошо известны специалистам. Гуманизованное или сконструированное антитело может иметь один или несколько аминокислотных остатков, происходящих от источника, не являющегося человеком, например, такого как, но не ограничивающегося ими, мышь, крыса, кролик, примат, не являющийся человеком, или другое млекопитающее. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки заменяют остатками, которые часто называют импортными остатками, и эти остатки обычно происходят от импортного вариабельного, константного или другого домена известной человеческой последовательности.
Известные последовательности человеческого 1д описаны, например, на сайтах: \у\у\у.псЬгп11п.ш11.80у/еЩге//с.|иегу.Гсщ; \у\у\у.пеЫ.ш11.доу/щЫа51; ууу.а1сс.огд/рйаде/МЬ.Ыт1; ууу. тгеере.еат.ас.ик/АБ1СХМЕХТ8.рНр; \у\у\у.каЬа1йа1аЬа5е.сот/1ор.1ит1; йр.псЬгшй.доу/герокИогу/каЬа!; \у\у\у.5ск.|ие5ксо1п; \у\у\у.аЬеат.еот; \у\у\у.апиЬойуге5оигсе.сот/оп1тесотр.1итк ууу.риЬНслайа1е.ейи/~рейго/ге8еагсй_1оок.Ыт1; ууу. \\11Г геетап. еот/1ттипо1оду/СН05/киЬу05. 1Ит; ууу.кйт1.огд/дгап18/1ес1иге8/1996/у1аЬ; ууу.ра1й.сат.ас.ик/~тгс7/т1ке1таде8.Ыт1; тсЬ.йагуагй.ейи/ВюЕ1пк8/1ттипо1оду.Ыт1; ууудттипо1оду1шк.сот; ра1йЬох.уи811.ейи/~йсеп1ег/тйех.Ыт1; ууу.аррйейЬюкуйетк.сот; ууу.пакшйа.доу/аую/риЬк/апйЬойу; \у\у\у.т.е1ите-и.ас)р/~уа5и1Шо/ЕН5а.1ит1; \у\у\у.Ьюйечдп.сот; ууу.сапсеггекеагсйик.огд; \у\\уу.Ью1ес11.1.1П.ейи; \у\у\у.15ае-пекогд; Ьазегу. исгкш1п1/~|гаа15/1тк51.1ит1; \у\у\у.гесаЬ.1Щ|-11й.йе/|ттипо.Ьте.п\уи.ейи; ууу.тгс-сре.сат.ас.ик; умудЫ.ипат.тхМг/У_т1се.Ыт1;
Ьйр://ууу.ЬюшГ.огд.ик/аЬ8; апйЬойу.Ьа1й.ас.ик; \у\у\у.иш/11.с11; муу.ауй.ЬЬк.ас.ик/~иЬс§078;
ууу.штг.тге.ае.ик/СС/сеаеуд/есаеуд.Ыт1; \у\у\у.ра111.сат.ае.ик/~тге7/1шташ5а1юп/ТАННР.1ит1;
ууудЫ.ипат.тх/у1г/81гис1иге/81а1_а1т.Ыт1; \у\у\у.Ыо5скт155оип.е<1и/5тЦ1щр/тйех.1ит1; \у\у\у.)еппкйе;
КаЬа! е! а1., 8ес.|иепсе5 оГ Рго1еш8 оГ 1ттипо1од1са1 1п1еге81, υ.8. Эер1. НеаИй (1983), каждый из которых полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.
Такие импортные последовательности могут быть использованы для снижения иммуногенности или для снижения, усиления или модификации связывания, аффинности, скорости ассоциации, скорости диссоциации, авидности, специфичности, времени полужизни или любых других подходящих свойств, известных специалистам. Обычно остатки СЭК непосредственно влияют на связывание с антигеном и, по существу, участвуют в таком связывании. В соответствии с этим все нечеловеческие или человеческие СЭК-последовательности или их часть сохраняются, а аминокислоты нечеловеческих последовательностей вариабельной и константной областей могут быть заменены человеческими или другими аминокислотами.
Антитела могут быть также, но необязательно, гуманизованы или сконструированы, либо они могут представлять собой сконструированные человеческие антитела, которые сохраняют высокую аффинность связывания с данным антигеном и другие желательные биологические свойства. Для достижения этой цели гуманизованные (или человеческие) или сконструированные антитела могут быть, но необязательно, получены путем анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизованных и сконструированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных, сконструиро
- 5 015262 ванных и гуманизованных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов являются общедоступными и известны специалистам. Существуют компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают вероятные трехмерные конформационные структуры отобранных иммуноглобулиновых последовательностей-кандидатов. Исследование этих отображений позволяет проанализировать возможную роль данных остатков в функционировании иммуноглобулиновой последовательностикандидата, то есть проанализировать остатки, которые влияют на способность иммуноглобулинакандидата связываться с антигеном. Таким образом, каркасные остатки (ЕК) могут быть выбраны и объединены с консенсусными и импортными последовательностями так, чтобы данное антитело обладало нужными свойствами, такими как повышенная аффинность по отношению к антигену(ам)-мишени(ям).
Кроме того, человеческое сконструированное анти-1Ь-6 антитело согласно изобретению может содержать каркасную область легкой цепи человеческой зародышевой линии. В конкретных вариантах изобретения последовательность легкой цепи зародышевой линии выбрана из человеческих последовательностей УК, включая, но не ограничиваясь ими, А1, А10, А11, А14, А17, А18, А19, А2, А20, А23, А26, А27, А3, А30, А5, А7, В2, В3, Ь1, Ь10, Ь11, Ь12, Ь14, Ь15, Ь16, Ь18, Ь19, Ь2, Ь20, Ь22, Ь23, Ь24, Ь25, Ь4/18а, Ь5, Ь6, Ь8, Ь9, О1, О11, О12, О14, О18, О2, О4 и О8. В некоторых вариантах изобретения эта каркасная область легкой цепи человеческой зародышевой линии выбрана из Υ1-11, Υ1-13, Υ1-16, Υ1-17, Υ1-18, Υ1-19, Υ1-2, Υ1-20, Υ1-22, Υ1-3, Υ1-4, Υ1-5, Υ1-7, Υ1-9, Υ2-1, Υ2-11, Υ2-13, Υ2-14, Υ2-15, Υ2-17, Υ2-19, Υ2-6, Υ2-7, Υ2-8, Υ3-2, Υ3-3, Υ3-4, Υ4-1, Υ4-2, Υ4-3, Υ4-4, Υ4-6, Υ5-1, Υ5-2, Υ5-4 и Υ5-6. Описание различных последовательностей зародышевой линии можно найти в заявке РСТ АО 2005/005604.
В других вариантах изобретения сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело согласно изобретению может содержать каркасную область тяжелой цепи человеческой зародышевой линии. В конкретных вариантах изобретения эта каркасная область тяжелой цепи человеческой зародышевой линии выбрана из ΥΗ1-18, ΥΗ1-2, ΥΗ1-24, ΥΗ1-3, ΥΗ1-45, ΥΗ1-46, ΥΗ1-58, ΥΗ1-69, ΥΗ1-8, ΥΗ2-26, ΥΗ2-5, ΥΗ2-70, ΥΗ3-11, ΥΗ3-13, ΥΗ3-15, ΥΗ3-16, ΥΗ3-20, ΥΗ3-21, ΥΗ3-23, ΥΗ3-30, ΥΗ3-33, ΥΗ3-35, ΥΗ3-38, ΥΗ3-43, ΥΗ3-48, ΥΗ3-49, ΥΗ3-53, ΥΗ3-64, ΥΗ3-66, ΥΗ3-7, ΥΗ3-72, ΥΗ3-73, ΥΗ3-74, ΥΗ3-9, ΥΗ4-28, ΥΗ4-31, ΥΗ4-34, ΥΗ4-39, ΥΗ4-4, ΥΗ4-59, ΥΗ4-61, ΥΗ5-51, ΥΗ6-1 и ΥΗ7-81. Описание различных последовательностей зародышевой линии можно найти в заявке РСТ АО 2005/005604.
В конкретных вариантах изобретения вариабельная область легкой цепи и/или вариабельная область тяжелой цепи содержит каркасную область или по меньшей мере часть каркасной области (например, 2 или 3 подобласти, такие как ЕК2 и ЕК3). В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере ЕКЕ1, ЕКЕ2, ЕКЕ3 или ЕКЕ4 являются полностью человеческими. В других вариантах изобретения по меньшей мере ЕКИ1, ЕКИ2, ЕКИ3 или ЕКИ4 являются полностью человеческими. В некоторых вариантах изобретения по меньшей мере ЕКЕ1, ЕКЕ2, ЕКИ3 или ЕКЕ4 представляют собой последовательность зародышевой линии (например, человеческой зародышевой линии) или содержат человеческие консенсусные последовательности для конкретной каркасной области (которые могут быть легко получены из источников известных человеческих последовательностей 1д, описанных выше). В других вариантах изобретения по меньшей мере ЕКИ1, ЕКИ2, ЕКИ3 или ЕКИ4 представляют собой последовательность зародышевой линии (например, человеческой зародышевой линии) или содержат человеческие консенсусные последовательности для конкретной каркасной области. В предпочтительных вариантах изобретения каркасной областью является человеческая каркасная область (например, человеческие каркасные области, представленные ниже в табл. 11 и 12). В некоторых вариантах изобретения каркасная область содержит последовательности 8ЕО Ш N0:105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 или их комбинации.
Гуманизация или конструирование антител согласно изобретению могут быть осуществлены любым известным методом, таким как, но не ограничивающимся им, метод, описанный в публикациях А1п!ег (1опе§ е! а1., №11игс. 321:522 (1986); Кгесйтапп е! а1., №11игс. 332:323 (1988); СегНоеуеп е! а1., 8с1епсе, 239:1534 (1988)), 81т§ е! а1., 1. 1ттипо1., 151: 2296 (1993); (ΊιοίΙιια апб Ьекк, 1. Мо1. Бю1., 196:901 (1987), Сайег е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 89:4285 (1992); Ргейа е! а1., 1. 1ттипо1., 151:2623 (1993), в патентах США №№: 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, РСТ/: И8 98/16280, 96/18978, 91/09630, 91/05939, 94/01234, ОВ 89/01334, 91/01134, 92/01755; АО 90/14443, 90/14424, 90/14430, ЕР 229246, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки, включая цитируемые в них работы.
В некоторых вариантах изобретения антитело содержит модифицированную (например, мутированную) Ес-область. Так, например, в некоторых вариантах изобретения Ес-область была модифицирована в целях снижения или усиления эффекторых функций антитела. В некоторых вариантах изобретения Ес-область имеет изотип, выбранный из 1дМ, 1дА, 1дО, 1дЕ или другого изотипа.
Альтернативно или дополнительно может оказаться желательным объединение аминокислотных модификаций с одной или несколькими дополнительными аминокислотными модификациями, которые изменяют уровень связывания с С1с.| и/или комплементзависимую цитотоксичность (СИС) Ес-области 1Ь6-связывающей молекулы. Исходным полипептидом, представляющим особый интерес, может быть полипептид, который связывается с С1с| и обладает комплементзависимой цитотоксичностью. Полипепти
- 6 015262 ды, уже обладающие активностью связывания с С1с.| и, кроме того, но необязательно, обладающие способностью опосредовать СЭС, могут быть модифицированы в целях усиления одной или обеих из указанных активностей. Аминокислотные модификации, изменяющие уровень связывания с С1с.| и/или модифицирующие комплементзависимую цитотоксичность, описаны, например, в заявке \¥О 0042072, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Как описано выше, может быть создана Ес-область сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела согласно изобретению с измененной эффекторной функцией, например, путем изменения уровня связывания с С1с.| и/или связывания с ЕсуК и тем самым изменения СЭС-активности и/или АЭССактивности. Эффекторные функции ответственны за активацию или снижение биологической активности (например, у индивидуума). Примерами эффекторных функций являются, но не ограничиваются ими, связывание с С1с|. комплементзависимая цитотоксичность (СЭС); связывание с Ес-рецептором; антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (АЭСС); фагоцитоз; ингибирование рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора; ВСК) и т.п. Для осуществления таких эффекторных функций может потребоваться объединение Ес-области со связывающим доменом (например, с вариабельным доменом антитела), и такие эффекторные функции могут быть оценены с помощью различных анализов (например, анализов на Ес-связывание, анализов на АЭСС, анализов на СЭС и т.п.).
Так, например, может быть получен вариант Ес-области сконструированного человеческого анти1Ь-6 антитела, обладающий повышенной способностью связываться с С1с.| и с ЕсуКШ (например, обладающий повышенной АЭСС-активностью и СЭС-активностью). Альтернативно, если требуется снижение или элиминация эффекторных функций, то вариант Ес-области может быть сконструирован так, чтобы он обладал пониженной СЭС-активностью и/или пониженной АЭСС-активностью. В других вариантах изобретения может быть увеличена только одна из этих активностей и при этом, но необязательно, может быть также снижена другая активность (например, для получения варианта Ес-области с повышенной АЭСС-активностью, но с пониженной СЭС-активностью, и наоборот).
Ес-мутации могут быть также введены в конструкцию для изменения ее взаимодействия с неонатальным Ес-рецептором (ЕсКп) и для улучшения ее фармакокинетических свойств. Набор человеческих Ес-вариантов с улучшенной способностью связываться с ЕсКп был описан в литературе (8Ые1б5 е! а1., (2001), НЧдй геюйШоп шарршд ой 1йе Ыпбшд щ1е оп йцшап 1дС1 йог ЕсуКЙ, ЕсуКН, ЕсуКШ, апб ЕсКп апб беЧдп ой 1дС1 уапапЦ \νί11ι Чшргоуеб Ыпбшд 1о 1йе ЕсуК, 1. Вю1. СИет., 276:6591-6604).
Аминокислотные замены другого типа могут служить для изменения характера гликозилирования Ес-области человеческого сконструированного анти-1Ь-6 антитела. Гликозилирование Ес-области обычно является Ν-связанным или О-связанным. Ν-связанное гликозилирование означает присоединение углеводной группы к боковой цепи аспарагинового остатка. О-связанное гликозилирование означает присоединение одного из сахаров, таких как Ν-ацетилгалактозамин, галактоза или ксилоза, к оксиаминокислоте, обычно к серину или треонину, хотя могут быть также использованы и 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. Последовательностями распознавания ферментативного присоединения углеводной группы к пептидным последовательностям боковой цепи аспарагина являются аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина. Таким образом, присутствие любой из этих пептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования.
Характер гликозилирования может быть изменен, например, путем делеции одного или нескольких сайтов гликозилирования, присутствующих в полипептиде, и/или добавления одного или нескольких сайтов гликозилирования, отсутствующих в данном полипептиде. Присоединение сайтов гликозилирования к Ес-области сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела обычно осуществляют путем такой модификации аминокислотной последовательности, в результате которой эта аминокислотная последовательность будет содержать одну или несколько вышеописанных трипептидных последовательностей (для сайтов Ν-связанного гликозилирования). Репрезентативный вариант гликозилирования имеет аминокислотную замену в положении остатка Ащ 297 тяжелой цепи. Такая модификация может быть также осуществлена путем добавления одного или нескольких сериновых или треониновых остатков к последовательности исходного полипептида или их замены в последовательности исходного полипептида (для сайтов О-связанного гликозилирования). Кроме того, замена Ащ 297 на А1а может приводить к удалению одного из сайтов гликозилирования.
В некоторых вариантах изобретения сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело согласно изобретению экспрессируется в клетках, которые экспрессируют бета-(1,4)-Н-ацетилглюкозаминилтрансферазу III (СпТ III), в результате чего СпТ III присоединяет С1сЭАс к сконструированному человеческому анти-ЙЕ-6 антителу. Методы такого продуцирования антител описаны в ^0/9954342, ^0/03011878, в публикации патентной заявки 20030003097А1 и в публикации Этапа е! а1., №11иге Вю1есйпо1оду, 17:176-180, ЕеЬ. 1999.
Человеческое анти-ЙЕ-6 антитело может быть, но необязательно, продуцировано путем иммунизации трансгенного животного (например, мыши, крысы, хомячка, примата, не являющегося человеком, и т.п.), способного продуцировать репертуар человеческих антител, описанных в настоящей заявке и/или
- 7 015262 известных специалистам. Клетки, продуцирующие человеческое анти-1Ь-6 антитело, могут быть выделены из указанных животных и иммортализованы подходящими методами, такими как описанные здесь методы.
Трансгенные мыши, которые могут продуцировать репертуар человеческих антител, связывающихся с человеческими антигенами, могут быть получены известными методами (например, описанными, но не ограничивающимися ими, в патентах США №№: 5770428, 5569825, 5545806, 5625126, 5625825, 5633425, 5661016 и 5789650, выданных ЬоиЬегд е! а1.; 1акоЬоу1!к е! а1. АО 98/50433, 1акоЬоу1!к е! а1. АО 98/24893, ЬоиЬегд е! а1. АО 98/24884, ЬоиЬегд е! а1. АО 97/13852, ЬоиЬегд е! а1. АО 94/25585, КисНеЕара!е е! а1. АО 96/34096, Кисйег1ара!е е! а1. ЕР 0463151 В1, Кисйег1ара!е е! а1. ЕР 0710719 А1, 8игаш е! а1. патент США № 5545807, Вгцддешаии е! а1. АО 90/04036, Вгцддешаии е! а1. ЕР 0438474 В1, ЬоиЬегд е! а1. ЕР 0814259 А2, ЬоиЬегд е! а1. ОВ 2272440 А, ЬоиЬегд е! а1. Ыа!иге 368:856-859 (1994), Тау1ог е! а1., 1и!. 1ттиио1. 6(4)579-591 (1994), Огееи е! а1., Ыа!иге Оеиебск 7:13-21 (1994), Меибе/ е! а1., Ыа!иге Оеиебск 15:146-156 (1997), Тау1ог е! а1., №.1с1е1с Ас1бк ВекеагсН 20 (23):6287-6295 (1992), ТиаШои е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1 И8А 90(8):3720-3724 (1993), ЬоиЬегд е! а1., 1и!. Веу. 1ттиио1., 13(1):65-93 (1995) и ЕвЬ^аИ е! а1., №11. Вю1ес1то1.. 14(7):845-851 (1996), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки). Обычно эти мыши имеют по меньшей мере один трансген, содержащий ДНК, происходящую по меньшей мере от одного локуса человеческого иммуноглобулина, который является функционально реаранжированным или который может подвергаться функциональной реаранжировке. Эндогенные локусы иммуноглобулина у таких мышей могут быть разрушены или делетированы в целях элиминации способности такого животного продуцировать антитела, кодируемые эндогенными генами.
Скрининг антител на специфическое связывание с аналогичными белками или фрагментами может быть легко осуществлен с использованием библиотек пептидного представления. Этот метод включает скрининг большого набора пептидов для выявления отдельных членов, имеющих нужную функцию или структуру. Скрининг антител с использованием библиотек пептидного представления хорошо известен специалистам. Представленные пептидные последовательности могут иметь длину от 3 до 5000 или более аминокислот, а чаще 5-100 аминокислот, а еще чаще примерно 8-25 аминокислот. Помимо прямых методов химического синтеза, используемых для генерации пептидных библиотек, было описано несколько методов рекомбинантных ДНК. Один из таких методов включает представление пептидной последовательности на поверхности бактериофага или клетки. Каждый бактериофаг или клетка содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую конкретную представленную пептидную последовательность. Такие методы описаны в публикациях патентных заявок РСТ №№ 91/17271, 91/18980, 91/19818 и 93/08278.
Другие системы, используемые для создания пептидных библиотек, могут быть получены 1и уйго методами химического синтеза и рекомбинантными методами. См. публикации патентных заявок РСТ №№ 92/05258, 92/14843 и 96/19256. См. также патенты США №№ 5658754 и 5643768. Библиотеки пептидного представления, векторы и наборы для скрининга являются коммерчески доступными и поставляются компаниями 1иуйгодеи (Саг1кЬаб, СА) и С’атЬпбде АибЬобу Тес1то1ощек (СатЬббдекЫге, ИК). См., например, патенты США №№ 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, переуступленные Еп/оп; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, переуступленные Эуах; 5427908, 5580717, переуступленные Айутах; 5885793, переуступленный С’атЬпбде АибЬобу Тесйпо1од1ек; 5750373, переуступленный Оеиеи!есб; 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, переуступленные Хота, СоШдаи, см. выше; АикиЬе1, см. выше; или 8атЬгоок, см. выше. Антитела согласно изобретению могут быть также получены с использованием по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей анти-1Е-6 антитело, в целях генерирования трансгенных животных или млекопитающих, таких как козы, коровы, лошади, овцы, кролики и т.п., в молоке которых продуцируются такие антитела. Указанные животные могут быть получены известными методами. См., например, среди прочих, патенты США №№ 5827690; 5849992; 4873316; 5849992; 5994616; 5565362; 5304489 и т.п., каждый из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Кроме того, антитела согласно изобретению могут быть получены с использованием по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей анти-1Е-6 антитело, в целях генерирования клеток трансгенных растений и культурных растений (например, таких как, но не ограничивающихся ими, табак и кукуруза), которые продуцируют такие антитела или их конкретные фрагменты либо варианты в органах растений или в полученных от них клетках. В качестве неограничивающегося примера могут служить листья трансгенного табака, которые экспрессируют рекомбинантные белки и которые были успешно использованы для получения больших количеств рекомбинантных белков, например, с использованием индуцибельного промотора. См., например, публикацию Сгатег е! а1., Сигг. Тор. М1сгоЬо1. 1ттиио1., 240:95-118 (1999) и цитируемые в ней работы. Для экспрессии белков млекопитающих на промышленном уровне была также использована трансгенная кукуруза, биологическая активность которой эквивалентна активности, продуцируемой в других рекомбинантных системах или в других системах, выделенных из природных источников. См., например, Нооб е! а1., Абу. Ехр. Меб. Вю1., 464:127-147 (1999) и цитируемые там работы. Антитела, включая фрагменты антител, такие как одноцепочечные антитела
- 8 015262 (зсЕу), были также продуцированы в больших количествах из семян трансгенных растений, включая семена табака и клубни картофеля. См., например, Сопгаб е! а1., Р1аи1 Μοί. ΒίοΙ., 38:101-109 (1998) и цитируемые там работы. Таким образом, антитела согласно изобретению могут быть также продуцированы с использованием трансгенных растений известными методами. См. также, например, Изсйет е! а1., Βίο!ес1по1. Арр1. Вюсйет., 30:99-108 (Ос!., 1999), Ма е! а1., Ттепбз Вю!ееЬпо1., 13:522-7 (1995); Ма е! а1., Р1ап! РЬ.у8ю1., 109:341-6 (1995); \У1Ше1ат е! а1., Вюсйеш. 8ос. Ттаиз., 22:940-944 (1994) и цитируемые там работы.
Антитела согласно изобретению могут связываться с человеческим 1Ь-6 с широким диапазоном аффинностей (Кс). В предпочтительном варианте изобретения по меньшей мере одно человеческое тАЬ согласно изобретению может, но необязательно, связываться с человеческим 1Ь-6 с высокой аффинностью. Так, например, человеческое или сконструированное человеческое тАЬ может связываться с человеческим 1Ь-6 с величиной Кс, равной примерно 10-7 М или менее, например, с величинами Кс, такими как, но не ограничивающимися ими, 0,1-9,9 (или с величинами в любом интервале, входящем в указанный интервал, или с величиной в указанных интервалах)х10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15 или в любом интервале этих порядков величин, как было определено методом поверхностного плазмонного резонанса или методом Кинекса, обычно применяемыми специалистами.
Аффинность или авидность антитела по отношению к антигену может быть определена экспериментально любым подходящим методом (см., например, публикации ВегхоГзку. е! а1., АпбЬобу-Апбдеп 1п!егас!юп8, 1п Ецпбатеп!а1 1ттипо1оду, Раи1, ^.Е., Еб., Яагеп Ргезз: Уогк, ΝΥ (1984); КиЬу, 1ашз
1ттипо1оду, XV.Н. Ргеетап апб Сотрапу: №\ν Υο^к, ΝΥ (1992); и описанные там методы). Измеренная аффинность конкретного взаимодействия антитело-антиген может варьироваться в зависимости от различных условий (например, от концентрации соли и рН). Таким образом, измерение аффинности и других антигенсвязывающих параметров (например, Кс, Коп, КоГГ) предпочтительно проводят с использованием стандартизированных растворов антитела и антигена и стандартизированного буфера, такого как буфер, описанный в настоящей заявке.
Для того чтобы определить, что белки, антитела и другие антагонисты конкурируют с антителом согласно изобретению за связывание с 1Ь-6 и/или имеют общую эпитопную область, могут быть проведены анализы на конкурентное связывание с антителом согласно изобретению. Такие анализы, хорошо известные среднему специалисту в данной области, позволяют выявить конкуренцию между антагонистами или лигандами за связывание с ограниченным числом сайтов связывания на белке. Такой белок или антитело иммобилизуют или превращают в нерастворимую форму до или после такого анализа на конкурентное связывание, и образец, связанный с 1Ь-6, отделяют от несвязанного образца, например, путем декантирования (где белок/антитело предварительно превращают в нерастворимую форму) или путем центрифугирования (где белок/антитело осаждали после конкурентной реакции). Кроме того, конкурентное связывание может быть определено по изменению функции связывания или по отсутствию связывания антитела с белком, например, по типу активности молекулы антитела, то есть является ли эта активность ингибирующей или потенцирующей. При этом могут быть использованы ЕБ18А и другой функциональный анализ, хорошо известный специалистам.
Предпочтительные анти-1Е-6 антитела согласно изобретению имеют последовательности, представленные ниже в табл. 1-5 и 11-13. Так, например, анти-1Е-6 антитело согласно изобретению имеет одну из последовательностей СИЯ легкой цепи, представленную в табл. 1 (то есть СОЯЕ1, СЭЯЕ2 и СОЯЕ3), и одну из последовательностей СИЯ тяжелой цепи, представленную в табл. 2 (то есть СЭЯН1, СЭЯН2 и СИЯН3). Более конкретно, анти-1Ь-6 антитело (молекула АМЕ-А9) имеет СИРЫ, 8Е0 ГО N0:15; СОЯЕ2, 8Е0 ГО N0:27; СПЯЬ3, 81Т) ГО N0:35; СОЯН1, 8ЕС ГО N0:47; СЭЯН2, 8ЕС ГО N0:61; СОЯН3, 8ЕС ГО N0:91.
Молекулы нуклеиновой кислоты
С использованием приведенных здесь данных, например данных о нуклеотидных последовательностях, кодирующих по меньшей мере 70-100% смежных аминокислот по меньшей мере одной из вариабельных областей легкой цепи 8ЕД ГО N0:93, 97 и 101, а также других описанных здесь последовательностей, и по меньшей мере одной из вариабельных областей тяжелой цепи 8ЕД ГО N0:95, 99 и 103, а также других описанных здесь последовательностей, их фрагментов, вариантов или консенсусных последовательностей, или данных о депонированном векторе, содержащем по меньшей мере одну из указанных последовательностей, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующая по меньшей мере одно антитело против 1Ь-6, может быть получена методами, описанными в настоящей за явке или известными специалистам.
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть получены в форме РНК, такой как мРНК, чРНК, тРНК или в любой другой форме, либо в форме ДНК, включая, но не ограничиваясь ими, кДНК и геномную ДНК, полученные методами клонирования или синтеза, или любой их комбинацией. ДНК может представлять собой трехцепочечную, двухцепочечную или одноцепочечную ДНК или любую их комбинацию. Любая часть по меньшей мере одной цепи ДНК или РНК может представлять собой кодирующую цепь, также известную как смысловая цепь, либо она может представлять собой некодирующую цепь, называемую также антисмысловой цепью.
- 9 015262
Выделенными молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие открытую рамку считывания (ОРС), необязательно с одним или несколькими интронами, например, такими как, но не ограничивающимися ими, по меньшей мере одна конкретная часть по меньшей мере одной СЭЯ. а именно СЭЯ1. СЭЯ2 и/или СЭЯЗ по меньшей мере одной тяжелой цепи (например, 8ЕО ГО N0:38, 40, 42, 44 и т.п.) или легкой цепи (например, 8Е0 ГО N0:2, 4, 6, 8 и т.п.); молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие кодирующую последовательность для анти-1Ь-6 антитела или его вариабельную область (например, вариабельные области легкой цепи 8Е0 ГО N0:94, 98 и 102, а также другие описанные здесь последовательности и вариабельные области тяжелой цепи 8Е0 ГО N0:96, 100 и 104); и молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, которая, по существу, отличается от описанных выше последовательностей, но которая, из-за вырожденности генетического кода, еще кодирует по меньшей мере одно анти-1Ь-6 антитело, описанное в настоящей заявке и/или известное специалистам. Генетический код хорошо известен специалистам. Таким образом, каждый специалист может генерировать такие вырожденные варианты нуклеиновой кислоты, которые кодируют специфические анти-1Ь-6 антитела согласно изобретению, см. выше, например, Ли8иЬе1 с1 а1., и такие варианты нуклеиновой кислоты входят в объем настоящего изобретения.
Как указано в настоящем описании, молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которые включают нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-1Ь-6 антитело, могут быть, но не ограничиваются ими, молекулы, кодирующие аминокислотную последовательность фрагмента антитела, саму аминокислотную последовательность; кодирующую последовательность всего антитела или его части; кодирующую последовательность антитела, его фрагмента или части, а также дополнительные последовательности, такие как кодирующая последовательность по меньшей мере одного сигнального лидерного или гибридного пептида вместе с вышеупомянутыми дополнительными кодирующими последовательностями, или без них, такими как по меньшей мере один интрон вместе с другими некодирующими последовательностями, включая, но не ограничиваясь ими, некодирующие 5'- и З'-последовательности, такие как транскрибируемые нетранслируемые последовательности, которые играют определенную роль в транскрипции, в мРНК-процессинге, включая сигналы сплайсинга и полиаденилирования (например, связывания с рибосомой и стабильности мРНК), и дополнительную кодирующую последовательность, которая кодирует другие аминокислоты, такие как аминокислоты, обладающие дополнительными функциональными свойствами. Таким образом, последовательность, кодирующая антитело, может быть присоединена к маркерной последовательности, такой как последовательность, кодирующая пептид, облегчающий очистку гибридного антитела, содержащего фрагмент или часть антитела.
Полинуклеотиды, которые селективно гибридизуются с описанным здесь полинуклеотидом
Настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются с описанным здесь полинуклеотидом в условиях селективной гибридизации. Так, например, полинуклеотиды такого варианта изобретения могут быть использованы для выделения, детекции и/или количественной оценки нуклеиновых кислот, содержащих такие полинуклеотиды. Так, например, полинуклеотиды согласно изобретению могут быть использованы для идентификации, выделения или амплификации неполных или полноразмерных клонов в депонированной библиотеке. В некоторых вариантах изобретения указанные полинуклеотиды представляют собой выделенные геномные последовательности, или последовательности кДНК, или другие последовательности, комплементарные кДНК, полученные из библиотеки нуклеиновых кислот человека или млекопитающего.
Библиотека кДНК предпочтительно содержит по меньшей мере 80% полноразмерных последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 85 или 90% полноразмерных последовательностей, а более предпочтительно по меньшей мере 95% полноразмерных последовательностей. Библиотеки кДНК могут быть нормализованы на увеличение представительности редких последовательностей.
Обычно, но не исключительно, применяются условия гибридизации низкой или умеренной жесткости с использованием последовательностей, имеющих меньшую идентичность по отношению к комплементарным последовательностям. Для последовательностей с большей идентичностью могут быть, но необязательно, использованы условия гибридизации умеренной и высокой жесткостей. Условия низкой жесткости позволяют осуществлять селективную гибридизацию последовательностей, имеющих примерно 70%-ную идентичность, и могут быть использованы для идентификации ортологичных или паралогичных последовательностей.
Полинуклеотиды согласно изобретению кодируют, но необязательно, по меньшей мере часть антитела, кодируемого описанными здесь полинуклеотидами. Полинуклеотиды согласно изобретению включают последовательности нуклеиновой кислоты, которые могут быть использованы для селективной гибридизации с полинуклеотидом, кодирующим антитело согласно изобретению. См., например, публикации Лц8иЬе1, см. выше, и СоШдап, см. выше, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Конструирование нуклеиновых кислот
Выделенные нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть получены (а) рекомбинантными методами, (Ь) методами синтеза, (с) методами очистки или комбинированными методами, хорошо известными специалистам.
- 10 015262
Обычно нуклеиновые кислоты, помимо полинуклеотида согласно изобретению, могут содержать и другие последовательности. Так, например, для облегчения выделения данного полинуклеотида в нуклеиновую кислоту может быть встроен сайт множественного клонирования, содержащий один или несколько сайтов рестрикции эндонуклеазами. Кроме того, для облегчения выделения транслированного полинуклеотида согласно изобретению в него могут быть встроены транслируемые последовательности. Так, например, удобным средством для очистки белков согласно изобретению может служить гексагистидиновая маркерная последовательность. Нуклеиновой кислотой согласно изобретению, за исключением кодирующей последовательности, является, но необязательно, вектор, адаптер или линкер для клонирования и/или экспрессии полинуклеотида согласно изобретению.
В такие клонирующие и/или экспрессирующие последовательности могут быть добавлены и другие последовательности для оптимизации их функций при клонировании и/или экспрессии, для облегчения выделения полинуклеотида или для облегчения введения полинуклеотида в клетку. Использование клонирующих векторов, экспрессирующих векторов, адаптеров и линкеров хорошо известно специалистам (например, Аи8иЬе1, см. выше, или 8ашЬгоок, см. выше).
Рекомбинантные методы конструирования нуклеиновых кислот
Композиции выделенных нуклеиновых кислот согласно изобретению, таких как РНК, кДНК, геномная ДНК или любая их комбинация, могут быть получены из биологических источников методами клонирования, известными специалистам. В некоторых вариантах осуществления изобретения для идентификации нужной последовательности в библиотеке кДНК или геномных ДНК используются олигонуклеотидные зонды, которые селективно гибридизуются с полинуклеотидами согласно изобретению в жестких условиях. Выделение РНК и конструирование библиотек кДНК и геномных ДНК хорошо известны специалистам (например, Аи8иЬе1, см. выше, или 8ашЬгоок, см. выше).
Методы скрининга и выделения нуклеиновых кислот
Библиотека кДНК или геномных ДНК может быть скринирована с использованием зонда, полученного на основе последовательности полинуклеотида согласно изобретению, например, описанного в настоящей заявке. Зонды могут быть использованы для гибридизации с последовательностями геномных ДНК или кДНК в целях выделения гомологичных генов из тех же самых или различных организмов. Для каждого специалиста очевидно, что в данном анализе может быть осуществлена гибридизация с различными условиями жесткости; при этом степень жесткости условий гибридизации может определять либо среда для гибридизации, либо среда для промывки. По мере увеличения жесткости условий гибридизации должна увеличиваться степень комплементарности между зондом и мишенью для образования дуплекса. Степень жесткости может регулироваться одним или несколькими факторами, такими как температура, ионная сила, рН и присутствие частично денатурирующего раствора, такого как формамид. Так, например, жесткость гибридизации обычно варьируется в зависимости от изменения полярности реакционного раствора, например при изменении концентрации формамида в пределах от 0 до 50%. Степень комплементарности (идентичность последовательностей), необходимая для детектируемого связывания, будет варьироваться в зависимости от жесткости среды для гибридизации и/или среды для промывки. Оптимальная степень комплементарности равна 100% или составляет в пределах 70-100% или любой интервал или величину в указанных пределах. Однако следует отметить, что небольшие изменения в последовательностях зондов и праймеров могут компенсироваться за счет снижения жесткости среды для гибридизации и/или промывки.
Методы амплификации РНК или ДНК хорошо известны специалистам и могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением без излишнего экспериментирования, а лишь исходя из описания и рекомендаций, представленных в настоящей заявке.
Известными методами амплификации ДНК или РНК являются, но не ограничиваются ими, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и аналогичные способы амплификации (см., например, патенты США 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, МиШз, е! а1.; 4795699 и 4921794, ТаЬог, е! а1.; 5142033, Ιηηίκ; 5122464, №1кощ е! а1.; 5091310, Ιηηίκ; 5066584, Оу11епйеп, е! а1.; 4889818, ОеИапб, е! а1.; 4994370, 811уег, е! а1.; 4766067, ВШхгак; 4656134, Втдо1б) и РНК-опосредованная амплификация, в которой для последовательности-мишени используется антисмысловая РНК в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК (патент США № 5130238, Ма1ек е! а1., с торговым знаком ΝΑ8ΒΑ, полное содержание которого вводится в настоящее описание посредством ссылки) (см., например, Аи8иЬе1, см. выше, или 8ашЬгоок, см. выше). Так, например, технология полимеразной цепной реакции (ПЦР) может быть использована для амплификации полинуклеотидных последовательностей согласно изобретению и родственных генов, происходящих непосредственно из библиотек геномных ДНК или кДНК. ПЦР и другие методы ίη \йгоамплификации могут быть также применены, например, для клонирования последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих экспрессируемый белок, в целях получения нуклеиновых кислот, используемых в качестве зондов для детектирования присутствия нужной мРНК в образцах, для секвенирования нуклеиновых кислот и для других целей. Примеры методов ίη уйго-амплификации, которые могут быть осуществлены любым специалистом, можно найти у Вегдег, см. выше, 8ашЬгоок, см. выше, и Аи8иЬе1, см. выше, а также у Ми11й е! а1., патент США № 4683202 (1987), и Ιηηίδ е! а1., РСК Рго!осо1§ А Ошбе !о Ме!йоб8 аоб Аррйсайощ, Еб§., Асабеш1с Рге§8 1пс., 8аη О1едо, СА (1990). Коммерчески доступные набо
- 11 015262 ры для геномной ПЦР-амплификации известны специалистам. См., например, набор для ПЦР геномных последовательностей АбуагИаде-СС (С1оп1ес11). Кроме того, для увеличения выхода длинноцепочечных ПЦР-продуктов может быть использован ген 32 белка Т4 (Воейппдег Маппйснп).
Методы синтеза для конструирования нуклеиновых кислот
Выделенные нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть также получены путем прямого химического синтеза известными методами (например, см. выше, Ан5нЬе1 с1 а1.). Химический синтез позволяет, в основном, продуцировать одноцепочечный олигонуклеотид, который может быть превращен в двухцепочечную ДНК путем гибридизации с комплементарной последовательностью или путем полимеризации под действием ДНК-полимеразы с использованием одной цепи в качестве матрицы. Для каждого специалиста очевидно, что, хотя химический синтез ДНК может быть ограничен последовательностями длиной примерно в 100 или более оснований, однако могут быть получены и более длинные последовательности путем лигирования коротких последовательностей.
Кластеры для экспрессии рекомбинантных последовательностей
Настоящее изобретение также относится к кластерам для экспрессии рекомбинантных последовательностей, содержащим нуклеиновую кислоту согласно изобретению. Последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, например кДНК или геномная последовательность, кодирующая антитело согласно изобретению, может быть использована в целях конструирования кластера для экспрессии рекомбинантных последовательностей, который может быть введен по меньшей мере в одну нужную клетку-хозяина. Кластер для экспрессии рекомбинантных последовательностей обычно содержит полинуклеотид согласно изобретению, функционально присоединенный к последовательностям регуляции инициации транскрипции, которые регулируют транскрипцию полинуклеотида в нужной клетке-хозяине. Для регуляции экспрессии нуклеиновых кислот согласно изобретению могут быть использованы как гетерологичные, так и негетерологичные (то есть эндогенные) промоторы.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенные нуклеиновые кислоты, которые служат в качестве промотора, энхансера и других элементов, могут быть введены в соответствующее положение (выше, ниже или в интрон) негетерологичной формы полинуклеотида согласно изобретению так, чтобы они стимулировали или ингибировали экспрессию полинуклеотида согласно изобретению. Так, например, эндогенные промоторы могут быть модифицированы ίη νίνο или ίη νΐίτο посредством мутации, делеции и/или замены.
Векторы и клетки-хозяева
Настоящее изобретение также относится к векторам, включающим выделенные молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, к клеткам-хозяевам, генетически сконструированным с использованием таких рекомбинантных векторов, и к продуцированию по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела методами рекомбинантных ДНК, хорошо известными специалистам. См., например, публикации 8ашЬгоок еί а1. и Ан5нЬе1 еί а1. (см. выше), каждая из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Указанные полинуклеотиды могут быть, но необязательно, присоединены к вектору, содержащему селективный маркер для их амплификации в хозяине. В общих чертах плазмидный вектор вводят в преципитат, такой как преципитат фосфата кальция, или в комплекс с заряженным липидом. Если вектором является вирус, то он может быть упакован ίη νίΙΐΌ с использованием соответствующей упаковывающей клеточной линии, а затем он может быть перенесен в клетки-хозяева.
ДНК-вставка должна быть функционально присоединена к соответствующему промотору. Экспрессирующие конструкции, кроме того, содержат сайты инициации и терминации транскрипции, а в транскрибируемой области - сайт связывания с рибосомой для инициации трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых указанными конструкциями, предпочтительно включает в начале сайт инициации трансляции, а в конце кодон терминации (например, ИЛЛ, ИСА или ИАС), соответствующим образом расположенный на конце транслируемой мРНК, при этом для экспрессии в клетках млекопитающих или в эукариотических клетках предпочтительными являются кодоны ИАА и ИАС.
Экспрессирующие векторы предпочтительно, но необязательно, включают по меньшей мере один селективный маркер. Такими маркерами являются, но не ограничиваются ими, гены резистентности к метотрексату (МТХ), ген дегидрофолатредуктазы (ΌΗΕΚ, патенты США №№ 4399216, 4634665, 4656134, 4956288, 5149636, 5179017), гены резистентности к ампициллину, неомицину (С418), микофеноловой кислоте или глутамин-синтетазе (С8) (патенты США №№ 5122464, 5770359, 5827739) для культивирования эукариотических клеток и гены резистентности к тетрациклину или ампициллину для культивирования в Е.сой и в других бактериях или в прокариотах (все вышеупомянутые патенты вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Соответствующие культуральные среды и условия культивирования вышеописанных клеток-хозяев известны специалистам. Подходящие векторы могут быть легко получены специалистом. Введение векторной конструкции в клетку-хозяина может быть осуществлено путем трансфекции фосфатом кальция; трансфекции, опосредованной ПЕАЕ-декстраном; трансфекции, опосредованной катионным липидом; электропорации; трансдукции; инфекции или другими известными методами. Такие методы описаны в литературе, например, у 8ашЬгоок, см. выше, главы 1-4 и 16-18, и АшнЬе! см. выше, главы 1, 9, 13, 15, 16.
- 12 015262
По меньшей мере одно антитело согласно изобретению может экспрессироваться в модифицированной форме, такой как гибридный белок, и может включать не только сигналы секреции, но также и другие гетерологичные функциональные области. Так, например, для повышения стабильности и персистентности в клетке-хозяине во время очистки или в процессе последующей обработки и хранения к Ν-концу антитела может быть добавлена область из дополнительных аминокислот, а в частности из заряженных аминокислот. Кроме того, для облегчения очистки к антителу согласно изобретению могут быть добавлены пептидные молекулы. Такие области могут быть удалены перед конечным получением антитела или по меньшей мере одного его фрагмента. Такие методы описаны во многих известных лабораторных руководствах, таких как 8атЬтоок, см. выше, главы 17.29-17.42 и 18.1-18.74; АикиЬе1, см. выше, главы 16, 17 и 18.
Каждому специалисту известно множество экспрессирующих систем, подходящих для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей белок согласно изобретению. Альтернативно, нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть экспрессированы в клетке-хозяине путем модификации (путем манипуляции) в клетке-хозяине, которая содержит эндогенную ДНК, кодирующую антитело согласно изобретению. Эти методы хорошо известны специалистам и описаны, например, в патентах США №№ 5580734, 5641670, 5733746 и 5733671, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Примерами клеточных культур, подходящих для продуцирования антител, их конкретных фрагментов или вариантов, являются клетки млекопитающих. Клеточные системы млекопитающих часто имеют форму монослоев клеток, хотя могут быть также использованы и суспензии клеток млекопитающих или биореакторы. Специалистами был разработан ряд подходящих клеточных линий хозяев, способных экспрессировать интактные гликозилированные белки, и такими клеточными линиями являются СО8-1 (например, АТСС СКЬ 1650), СО8-7 (например, АТСС СКЬ 1651), НЕК293, ВНК21 (например, АТСС СКЬ-10), СНО (например, АТСС СКЬ 1610) и В8К-1 (например, АТСС СКЬ-26), клетки СО8-7, клетки СНО, клетки 11ерС2. Р3Х63Ад8.653, 8р2/0-Ад14, клетки 293, клетки НеЬа и т.п., которые могут быть взяты, например, из Американской коллекции типовых культур, Мапаккак, Уа (ет^ет.а1сс.отд). Предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки лимфоидного происхождения, такие как миеломные клетки и клетки лимфомы. Особенно предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки Р3Х63Ад8.653 (АТСС, рег. № СКЬ 1580) и клетки 8р2/0-Ад14 (АТСС, рег. № СКЬ 1851). В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения рекомбинантной клеткой является клетка Р3Х63Ад8.653 или клетка 8р2/0-Ад14.
Экспрессирующие векторы для этих клеток могут включать одну или несколько из нижеследующих последовательностей регуляции экспрессии, таких как, но не ограничивающихся ими, сайт инициации репликации, промотор (например, поздний или ранний промоторы 8У40, промотор СМУ (патенты США №№ 5168062, 5385839), промотор 1к Н8У, промотор рдк (фосфоглицераткиназы), промотор ΕΕ-1-альфа (патент США № 5266491), по меньшей мере один промотор человеческого иммуноглобулина, энхансер, и/или сайты инициации процессинга, такие как сайты связывания с рибосомой, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования (например, сайт присоединения ро1у А большого Т-антигена Ад 8У40) и последовательности терминации транскрипции. См., например, АикиЬе1, см. выше, или 8атЬтоок, см. выше. Другие клетки, которые могут быть использованы для продуцирования нуклеиновых кислот или белков согласно изобретению, известны специалистам и/или могут быть взяты из каталога Американской коллекции типовых культур клеточных линий и гибридом (те^ет.а1сс.отд) или из других известных или коммерчески доступных источников.
При использовании эукариотических клеток-хозяев в вектор обычно вводят последовательности полиаденилирования или терминации транскрипции. Примером последовательности терминации является последовательность полиаденилирования гена бычьего гормона роста. Могут быть также введены последовательности точного сплайсинга транскрипта. Примером последовательности сплайсинга является интрон УР1 вируса 8У40 (8ртадие е! а1., 1. Упо1., 45:773-781 (1983)). Кроме того, в вектор могут быть встроены генные последовательности для регуляции репликации в клетке-хозяине, известные специалистам.
Очистка антитела
Анти-1Ь-6 антитело может быть выделено и очищено из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными методами, включая, но не ограничиваясь ими, очистку с использованием белка А, преципитацию сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионообменную или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиапатитах и хроматографию на лектине. Для очистки может быть также использована высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). См. например, Со1йдаи, Сиггеп! Рго!осо1 ίη 1ттипо1оду, ог Сиггеп! Рго!осо1 ίη Рго1ет 8аепсе, 1о1т \УПеу & 8опк, ΝΥ, ΝΥ (1997-2001), например, главы 1, 4, 6, 8, 9, 10, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Антителами согласно изобретению являются природные очищенные продукты, продукты химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантными методами из эукариотического хозяина, включая, например, клетки дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от хо
- 13 015262 зяина, используемого в методе рекомбинантного продуцирования, антитело согласно изобретению может быть гликозилированным либо оно может быть негликозилированным, а предпочтительно гликозилированным. Такие методы описаны во многих известных лабораторных руководствах, таких как 8атЬгоок, см. выше, главы 17.37-17.42; Аи8иЬе1, см. выше, главы 10, 12, 13, 16, 18 и 20; СоШдап, Рго1еш 8с1епсе, см. выше, главы 12-14, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Анти-1Ь-6 антитела
Анти-1Ь-6 антитело согласно изобретению включает любой белок или пептид, содержащий молекулу, которая включает по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, такую как, но не ограничивающуюся ими, по меньшей мере одну лигандсвязывающую часть (ЬВР), такую как, но не ограничивающуюся ими, гипервариабельная область (СОВ) тяжелой цепи или легкой цепи или их лигандсвязывающая часть; вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи, каркасную область (например, ЕВ1, ЕВ2, ЕВ3, ЕВ4 или их фрагмент, или последовательность, представленную в 8ЕО Ш N0:105-112, которая также, но необязательно, содержит по меньшей мере одну замену, инсерцию или делецию), константную область тяжелой цепи или легкой цепи (например, содержащую по меньшей мере одну СН1, шарнирную область 1, шарнирную область 2, шарнирную область 3, шарнирную область 4, СН2 или СН3 или их фрагмент, также, но необязательно, содержащие по меньшей мере одну замену, инсерцию или делецию) или любая их часть, которые могут быть включены в антитело согласно изобретению. Антителом согласно изобретению может быть антитело любого млекопитающего, либо оно может происходить от любого млекопитающего, такого как, но не ограничивающегося ими, человек, мыши, кролики, крысы, грызуны, приматы или любые их комбинации и т. п.
Выделенные антитела согласно изобретению содержат аминокислотные последовательности описанного здесь антитела или любого выделенного или продуцированного антитела, кодируемые любым подходящим полинуклеотидом. Предпочтительно человеческое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с человеческим 1Ь-6 и тем самым частично или в значительной степени нейтрализует по меньшей мере одну биологическую активность указанного белка. Антитело или его специфическая часть или вариант, которые частично или предпочтительно в значительной степени нейтрализуют по меньшей мере одну биологическую активность по меньшей мере одного белка 1Ь-6 или его фрагмента, могут связываться с указанным белком или фрагментом и тем самым ингибировать активности, опосредуемые связыванием 1Ь-6 с рецептором 1Ь-6, или другими 1Ь-6-зависимыми или опосредуемыми механизмами. Используемый здесь термин нейтрализующее антитело означает антитело, которое может ингибировать 1Ь-6-зависимую активность примерно на 20-120%, а предпочтительно по меньшей мере примерно на 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более в зависимости от используемого анализа. Способность анти-1Ь-6 антитела ингибировать 1Ь-6зависимую активность предпочтительно оценивают с помощью анализа по меньшей мере на один подходящий белок 1Ь-6 или его рецептор, как описано в настоящей заявке и/или как известно специалистам. Человеческое антитело согласно изобретению может быть антителом любого класса (1дО, 1дА, 1дМ, 1дЕ, 1дИ и т.д.) или изотипа и может содержать легкую цепь каппа или лямбда. В одном из вариантов изобретения человеческое антитело содержит тяжелую цепь 1дО или ее конкретный фрагмент, например по меньшей мере одного из изотипов 1дС1, 1дС2, 1дО3 или 1дО4 (например, γ1, γ2, γ3 или γ4). Антитела этого типа могут быть получены с использованием трансгенной мыши или другого трансгенного животного, не являющегося человеком, содержащих трансгены по меньшей мере одной человеческой легкой цепи (например, 1дО, 1дА и 1дМ), описанные в настоящей заявке и/или известные специалистам. В другом варианте осуществления изобретения человеческое антитело против человеческого 1Ь-6 содержит тяжелую цепь 1дО1 и легкую цепь 1дС1.
По меньшей мере одно антитело согласно изобретению связывается по меньшей мере с одним конкретным эпитопом, специфичным по меньшей мере к одному белку 1Ь-6, к его субъединице, фрагменту, части или любой их комбинации. Указанный по меньшей мере один эпитоп может содержать по меньшей мере одну антителосвязывающую область, которая содержит по меньшей мере одну часть указанного белка, где указанный эпитоп предпочтительно состоит по меньшей мере из одной внеклеточной, растворимой, гидрофильной, внешней или цитоплазматической части указанного белка. Указанный по меньшей мере один конкретный эпитоп может содержать любую комбинацию по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 1-3 аминокислоты или всей конкретной части смежных аминокислот последовательности 8ЕО Ш N0:115, например аминокислотных остатков 151-178, а более конкретно остатков 171-182.
В основном человеческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению содержит антигенсвязывающую область, которая включает по меньшей мере одну человеческую гипервариабельную область (СИВ1, СИВ2 и СИВ3) или вариант по меньшей мере одной вариабельной области тяжелой цепи и по меньшей мере одну человеческую гипервариабельную область (СИВ1, СИВ2 и СИВ3) или вариант по меньшей мере одной вариабельной области легкой цепи. Последовательности СИВ могут происходить от последовательностей человеческой зародышевой линии или близкородственных последовательностей зародышевой линии. Так, например, могут быть использованы СИВ, происходящие от синтетической библиотеки, полученной из СИВ родительской мыши. Эти СИВ могут быть образованы
- 14 015262 путем введения в исходную мышиную последовательность консервативных замен. В качестве неограничивающего примера может служить антитело или его антигенсвязывающая часть или вариант, которые могут содержать по меньшей мере одну СИКЗ тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0:79, 81, 83, 85, 87, 89 и 91, и/или СИКЗ легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:29, 31, 33 и 35. В конкретном варианте изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут иметь антигенсвязывающую область, содержащую по меньшей мере часть по меньшей мере одной СИВ тяжелой цепи (то есть СЭВ1. СЭВ2 и/или СЭВ3). имеющей аминокислотную последовательность соответствующих СИВ1, 2 и/или 3 (например, 8Е0 ΙΌ N0:37, 49 и 79). В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть или вариант могут иметь антигенсвязывающую область, содержащую по меньшей мере часть по меньшей мере одной СИВ легкой цепи (то есть СЭВ1, СЭВ2 и/или СЭВ3), имеющей аминокислотную последовательность соответствующих СЭВ1, С1Ж2 и/или С1Ж.3 (например, 8ЕО ΙΌ N0:1, 17 и 29).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения три СИВ тяжелой цепи и три СИВ легкой цепи указанного антитела или антигенсвязывающего фрагмента имеют аминокислотную последовательность соответствующей СИВ по меньшей мере одного из шЛЬ АМЕ-А9, АМЕ-1Ь, АМЕ-18а, АМЕ-22а, АМЕ-20Ь, АМЕ-23а и АМЕ-19а, описанных в настоящей заявке. Такие антитела могут быть получены путем химического присоединения друг к другу различных частей антитела (например, СИВ, каркасной области) стандартными методами, либо путем продуцирования и экспрессии (то есть одной или нескольких) молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих указанное антитело, с использованием стандартной методики рекомбинантных ДНК, либо любым другим подходящим методом.
Лнти-1Ь-6 антитело может содержать по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой или легкой цепи, имеющую определенную аминокислотную последовательность. Так, например, в предпочтигельном варианте изобретения анти-1Ь-6 антитело содержит по меньшей мере одну вариабельную область по меньшей мере одной тяжелой цепи, необязательно имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:95, 99, 103, 118, 122, 126 и 130, и/или по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, необязательно имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:93, 97, 101, 116, 120, 124 и 128. Антитела, которые связываются с человеческим Ш-6 и которые содержат определенную вариабельную область тяжелой или легкой цепи, могут быть получены подходящими методами, такими как метод фагового представления (КайиЬе Υ. е! а1., Ιηΐ. 1. Мо1. Меб., 1(5):863-868 (1988)), или методами с использованием трансгенных животных, хорошо известными специалистам и/или описанными в настоящей заявке. Так, например, трансгенная мышь, содержащая функционально реаранжированный трансген тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина и трансген, который включает ДНК локуса легкой цепи человеческого иммуноглобулина и который может подвергаться функциональной реаранжировке, может быть иммунизована человеческим Ш-6 или его фрагментом для вырабатывания антител. Если это необходимо, то могут быть выделены антителопродуцирующие клетки и могут быть получены гибридомы или другие иммортализованные антителопродуцирующие клетки, как описано в настоящей заявке и/или как известно специалистам. Альтернативно, указанное антитело, его конкретная часть или вариант могут быть экспрессированы с использованием кодирующей нуклеиновой кислоты или ее части в подходящей клеткехозяине.
Коды аминокислот
Аминокислоты, которые составляют анти-[Е-6 антитела согласно изобретению, часто обозначаются аббревиатурами. Такие обозначения аминокислот могут быть представлены однобуквенным кодом, трехбуквенным кодом, их названием или кодоном(ами) из трех нуклеотидов, хорошо известными специалистам (см. А1Ьей8, В. е! а1., Мо1еси1аг Вю1оду о£ Тйе Се11., ТЫтб Еб., Оат1апб РиЬШЫпд, Ιηο., №\ν ΥοΑ, 1994).
Анти-I^-6 антитело согласно изобретению может включать одну или несколько замен, делеций или добавлений аминокислот, образующихся либо в результате природных мутаций, либо вносимых искусственно путем модификаций, как описано в настоящей заявке. Аминокислоты в анти-!Е-6 антителе согласно изобретению, которые играют главную роль в его функционировании, могут быть идентифицированы известными методами, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (например, Аи8иЬе1, см. выше, главы 8, 15; Сиппшдйаш & ^е1к, 8с1епсе, 244:1081-1085 (1989)). Проведение последней процедуры позволяет вводить единичные аланиновые мутации в каждом остатке молекулы. Затем полученные мутантные молекулы тестируют на биологическую активность, такую как, но не ограничивающуюся ею, по меньшей мере одна ΙΤ-6-нейтрализующая активность. Сайты, которые играют решающую роль в связывании с антителом, могут быть также идентифицированы с помощью структурного анализа, такого как кристаллизация, ядерный магнитный резонанс или фотоаффинное мечение (8шйЬ е! а1., 1. Мо1. Вю1., 224:899-904 (1992) и бе Уо§ е! а1., 8с1епсе, 255:306-312 (1992)).
Анти-I^-6 антитела согласно изобретению могут включать, но не ограничиваются ими, по меньшей мере одну часть, последовательность или комбинацию, включающую от 5 и более или все смежные аминокислоты по меньшей мере одной из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0:91, 93, 95, 97, 99 и т.п.
- 15 015262
Неограничивающими вариантами, которые могут усиливать или поддерживать по меньшей мере одну из перечисленных активностей, являются, но не ограничиваются ими, любой из вышеуказанных полипептидов, которые также имеют по меньшей мере одну мутацию, соответствующую по меньшей мере одной замене в остатках, отличающихся во всех описанных вариантах аминокислотных последовательностей.
Кроме того, анти-ГЬ-б антитело может, но необязательно, содержать полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, отличающуюся от последовательности, состоящей из смежных аминокислот по меньшей мере одной из 8Е0 ГО N0:95, 99 и 103 и т.п. (например, отличающуюся от описанных здесь последовательностей одной или несколькими консервативными заменами). Кроме того, настоящее изобретение включает варианты аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи 8Е0 ГО N0:93, 97 или 101 или аминокислотной последовательности тяжелой цепи 8Е0 ГО N0:79, 81, 83, 85, 87, 89 или 91.
Для каждого специалиста очевидно, что настоящее изобретение включает по меньшей мере одно биологически активное антитело согласно изобретению. Биологически активные антитела обладают удельной активностью, составляющей по меньшей мере 20, 30 или 40%, а предпочтительно по меньшей мере 50, б0 или 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80, 90 или 95-1000% или более от активности природного (несинтезированного), эндогенного, родственного и известного антитела. Методы анализа и количественной оценки ферментативной активности и специфичности к субстрату хорошо известны специалистам.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к человеческим антителам и к их антигенсвязывающим фрагментам, описанным в настоящей заявке, которые были модифицированы посредством ковалентного связывания с органической молекулой. В результате такой модификации могут быть продуцированы антитела или антигенсвязывающие фрагменты с улучшенными фармакокинетическими свойствами (например, с повышенным временем полужизни в сыворотке ίη νίνο). Органической молекулой может быть прямая или разветвленная гидрофильная полимерная группа, группа жирной кислоты или группа сложного эфира жирной кислоты. В конкретных вариантах изобретения гидрофильная полимерная группа может иметь молекулярную массу примерно от 800 до 120000 Да, и такой группой может быть полиалкангликоль (например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль (ИНГ)), углеводный полимер, аминокислотный полимер или поливинилпирролидон, а группа жирной кислоты или группа сложного эфира жирной кислоты может содержать примерно от восьми до сорока атомов углерода.
Модифицированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты согласно изобретению могут содержать одну или несколько органических молекул, которые ковалентно связаны, прямо или опосредованно, с данным антителом. Каждая органическая молекула, связанная с антителом или антигенсвязывающим фрагментом согласно изобретению, может независимо представлять собой гидрофильную полимерную группу, группу жирной кислоты или группу сложного эфира жирной кислоты. Используемый здесь термин жирная кислота охватывает монокарбоновые кислоты и дикарбоновые кислоты. Используемый здесь термин гидрофильная полимерная группа означает органический полимер, который является более растворимым в воде, чем в октане. Так, например, полилизин является более растворимым в воде, чем в октане. Таким образом, в объем согласно изобретению входит антитело, модифицированное путем ковалентного связывания с полилизином. Гидрофильными полимерами, подходящими для модификации антител согласно изобретению, могут быть прямые или разветвленные полимеры, и такими полимерами являются, например, полиалкангликоли (например, ПЭГ, монометокси-полиэтиленгликоль (мПЭГ), ИНГ и т.п.), углеводы (например, декстран, целлюлоза, олигосахариды, полисахариды и т.п.), полимеры гидрофильных аминокислот (например, полилизин, полиаргинин, полиаспартат и т.п.), полиалканоксиды (например, полиэтиленоксид, полипропиленоксид и т.п.) и поливинилпирролидон. Предпочтительно, чтобы гидрофильный полимер, который модифицирует антитело согласно изобретению, имел молекулярную массу примерно от 800 до 150000 Да в виде отдельной молекулярной частицы. Так, например, могут быть использованы ПЭГ5000 и ПЭГ20000, где нижний индекс означает среднюю молекулярную массу полимера в Да. Гидрофильная полимерная группа может быть замещена примерно 1-б алькильными группами, группами жирной кислоты или группами эфира жирной кислоты. Гидрофильные полимеры, замещенные группой жирной кислоты или группой сложного эфира жирной кислоты, могут быть получены подходящими методами. Так, например, полимер, содержащий аминогруппу, может быть связан с карбоксилатом жирной кислоты или эфиром жирной кислоты, а активированный карбоксилат (например, активированный Ν,Ν-карбонилдиимидазолом) на жирной кислоте или на сложном эфире жирной кислоты может быть связан с гидроксильной группой на полимере.
Жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот, подходящие для модификации антител согласно изобретению, могут быть либо насыщенными, либо они могут содержать одну или несколько ненасыщенных групп. Жирными кислотами, подходящими для модификации антител согласно изобретению, являются, например, н-додеканоат (С12, лаурат), н-тетрадеканоат (С14, миристат), н-октадеканоат (С18, стеарат), н-эйкозаноат (С20, арахидат), н-докозаноат (С22, бегенат), н-триаконтаноат (С30), н-тетраконтаноат (С40), цис-Д9-октадеканоат (С18, олеат), все цис-Д5,8,11,14-эйкозатетраеноаты (С20, арахидонат), октандионовая кислота, тетрадекандионовая кислота, октадекандионовая кислота, докозандионовая ки
- 1б 015262 слота и т.п. Подходящими сложными эфирами жирных кислот являются сложные моноэфиры дикарбоновых кислот, содержащие прямую или разветвленную низшую алкильную группу. Низшая алкильная группа может содержать примерно от одного до двенадцати, а предпочтительно примерно от одного до шести атомов углерода.
Модифицированные человеческие антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены подходящими методами, например, посредством взаимодействия с одним или несколькими модифицирующими агентами. Используемый здесь термин модифицирующий агент означает подходящую органическую группу (например, гидрофильный полимер, жирную кислоту, сложный эфир жирной кислоты), содержащую активирующую группу. Активирующая группа представляет собой химическую молекулу или функциональную группу, которая, в соответствующих условиях, может реагировать со второй химической группой, образуя тем самым ковалентную связь между модифицирующим агентом и второй химической группой. Так, например, реагирующими с амином активирующими группами являются электрофильные группы, такие как тозилат, мезилат, галоген (хлор, бром, фтор, йод), №гидроксисукцинимидиловые сложные эфиры (N48) и т.п. Активирующими группами, которые могут реагировать с тиолами, являются, например, малеимид, йодацетил, акрилоил, пиридилдисульфиды, 5-тиол-2нитробензойная кислота-тиол (ТИВ-тиол) и т.п. Альдегидная функциональная группа может быть присоединена к амино- или гидразидсодержащим молекулам, а азидная группа может реагировать с трехвалентной группой фосфористой кислоты с образованием фосфорамидатных или фосфоримидных связей. Подходящие методы введения активирующих групп в молекулы известны специалистам (см., например, Негтапкоп, 6.Т., В|осоп)ида1е Тесйшдиек, Асабетю Ргекк: 8ап П1едо, СА (1996)). Активирующая группа может быть непосредственно связана с органической группой (например, с гидрофильным полимером, жирной кислотой, сложным эфиром жирной кислоты), или она может быть связана посредством линкерной группы, например двухвалентной С1-С12-группы, где один или несколько атомов углерода могут быть заменены гетероатомом, таким как кислород, азот или сера. Подходящими линкерными группами являются, например, тетраэтиленгликоль, -(СН2)3-, -МН-(СН2)6-МН-, -(СН2)2-МН- и СН2-0-СН2-СН2-0СН2-СН2-0-СН-ЯН-.
Модифицирующие агенты, содержащие линкерную группу, могут быть продуцированы, например, посредством реакции взаимодействия моно-Вос-алкилдиамина (например, моно-Вос-этилендиамина, моно-Вос-диаминогексана) с жирной кислотой в присутствии 1-этил-3-(3-диметиаминопропил)карбодиимида (ЕЭС) с образованием амидной связи между свободным амином и карбоксилатом жирной кислоты. Защитная группа Вос может быть удалена из указанного продукта путем обработки трифторуксусной кислотой (ТЕА) с получением первичного амина, который может быть связан с другим карбоксилатом, как описано в настоящей заявке, либо он может быть подвергнут реакции с малеиновым ангидридом, после чего полученный продукт подвергают реакции циклизации с получением активированного малеимидо-производного жирной кислоты (см., например, заявку Тйотркоп е! а1., \¥0 92/16221, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки).
Модифицированные антитела согласно изобретению могут быть продуцированы путем реакции человеческого антитела или антигенсвязывающего фрагмента с модифицирующим агентом. Так, например, органические молекулы могут быть связаны с антителом несайтспецифическим способом, а с использованием реагирующего с амином модифицирующего агента, например МН8-эфира ПЭГ. Модифицированные человеческие антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут быть также получены путем восстановления дисульфидных связей (например, внутрицепьевых дисульфидных связей) антитела или антигенсвязывающего фрагмента.
Восстановленное антитело или восстановленный антигенсвязывающий фрагмент могут быть затем подвергнуты реакции с модифицирующим агентом, способным реагировать с тиолом, с продуцированием модифицированного антитела согласно изобретению.
Модифицированные человеческие антитела и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие органическую группу, связанную со специфическими сайтами антитела согласно изобретению, могут быть получены подходящими методами, такими как обратный протеолиз (Е1ксй е! а1., Вюсопщда!е Сйет., 3:147-153 (1992); \Уег1еп е! а1., В1осопщда!е Сйет., 5:411-417 (1994); Китагап е! а1., Рго!ет 8с1. 6(10): 2233-2241 (1997); 1!ой е! а1., Вюогд. Сйет., 24(1): 59-68 (1996); Саре11ак е! а1., Вю!есйпо1. Вюепд., 56 (4):456-463 (1997)), и методами, описанными Негтапкоп, 6.Т., В1осопщда!е Тесйтциек, Асабетю Ргекк: 8ап П1едо, СА (1996).
Антиидиотипические антитела против композиций анти-1Ь-6 антител
Помимо моноклональных анти-1Ь-6 антител настоящее изобретение также относится к антиидиотипическому (анти-1б) антителу, специфичному к указанным антителам согласно изобретению. Анти-1б антитело представляет собой антитело, которое распознает уникальные детерминанты, обычно ассоциированные с антигенсвязывающей областью другого антитела. Анти-1б антитело может быть получено путем иммунизации животного такого же вида и генетического типа (например, мышиной линии), как и источник анти-1б антитела, данным антителом или его СИЯ-содержащей областью. Иммунизованное животное будет распознавать и отвечать на идиодипические детерминанты иммунизирующего антитела, и продуцировать анти-1б антитело. Анти-1б антитело может быть также использовано в качестве имму
- 17 015262 ногена для индуцирования иммунного ответа у других животных с продуцированием так называемого анти-анти-1б антитела.
Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции анти-1Ь-6 антител, содержащей по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть или более анти-1Ь-6 антител, описанных в настоящей заявке и/или известных специалистам, которые присутствуют в виде не встречающейся в природе композиции, смеси или формы. Такие композиции включают неприродные композиции, содержащие по меньшей мере один или два полноразмерных, делетированных по С- и/или Ν-концу вариантов, доменов, фрагментов или конкретных вариантов аминокислотной последовательности анти-1Ь-6 антитела, выбранных из группы, состоящей из 70-100% смежных аминокислот последовательностей 8ЕО ГО N0:1114 и 116-138 или их конкретных фрагментов, доменов или вариантов. Предпочтительные композиции анти-1Ь-6 антител включают по меньшей мере один или два полноразмерных фрагмента, домена или варианта в виде по меньшей мере одной из СГОР или ЬВЯ-содержащих частей описанной здесь последовательности анти-1Ь-6 антитела, составляющих, например, 70-100% от 8Е0 ГО N0:15, 27, 35, 47, 61 и 91, или их конкретных фрагментов, доменов или вариантов. Более предпочтительные композиции включают, например, 40-99% по меньшей мере одной из последовательностей, которая составляет по меньшей мере 70-100% от последовательностей 8ЕЦ ГО N0:93, 95, 97, 99, 101, 103 и т.п. или их конкретных фрагментов, доменов или вариантов. Указанные проценты композиции даны по массе, объему, концентрации, молярности или моляльности жидких или сухих растворов, смесей, суспензий, эмульсий, частиц, порошков или коллоидов, известных специалистам или описанных в настоящей заявке.
Композиции антител, содержащие дополнительные терапевтически активные ингредиенты
Композиции антител согласно изобретению могут также содержать, но необязательно, эффективное количество по меньшей мере одного соединения или белка, выбранных из таких соединений, как противоинфекционное лекарственное средство; лекарственное средство, воздействующее на сердечнососудистую (СС) систему; лекарственное средство, воздействующее на центральную нервную систему (ЦНС); лекарственное средство, воздействующее на вегетативную нервную систему (ВНС); лекарственное средство для лечения заболеваний дыхательных путей; лекарственное средство для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖК); гормональное лекарственное средство; лекарственное средство для регуляции водно-солевого баланса; гематологическое лекарственное средство; противоопухолевое лекарственное средство; иммуномодулирующее лекарственное средство; офтальмическое лекарственное средство; лекарственное средство для лечения заболеваний уха или носа; лекарственное средство для местного применения; натуральное лекарственное средство или т.п. Такие лекарственные средства, а также состав, показания, дозы и способы введения каждого из этих лекарственных средств хорошо известны специалистам (см., например, публикации Шгыпд 2001 НапбЬоок оГ Лгцдк, 2Г’1 ебШоп, 8рппд1юи5е Согр., ЗргтдЬоике, РА, 2001; НеаИЪ РгоГекыопаГк Эгид Ошбе 2001, еб., 8Ьаппоп, ^бкои, 81апд, Ргеп1юе-На11, 1пс, Иррег 8абб1е Ргцег, N1; РЕагтсоШегару НапбЬоок, ^е11§ е1 а1., еб., Арр1е1оп & Ьапде, 81атГогб, СТ, каждая из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки).
Противоинфекционным лекарственным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из амебоцидов или антипротозойных средств, противоглистных средств, противогрибковых средств, противомалярийных средств, противотуберкулезных средств, средств против проказы или аминогликозидов, пенициллинов, цефалоспоринов, тетрациклинов, сульфонамидов, фторхинолонов, противовирусных средств, макролидных противоинфекционных средств и противоинфекционных средств смешанного действия. Сердечно-сосудистым (СС) лекарственным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из инотропных средств, средств против аритмии, средств против стенокардии, гипотензивных средств, средств против гиперлипемии и сердечно-сосудистых средств смешанного действия. Лекарственным средством, воздействующим на центральную нервную систему (ЦНС), может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из ненаркотических аналгетиков, или по меньшей мере одно средство, выбранное из антипиретиков, нестероидных противовоспалительных лекарственных средств, наркотических или опиоидных аналгетиков, седативно-гипнотических средств, противосудорожных средств, антидепрессантов, анксиолитических средств, антипсихотических средств, средств, стимулирующих центральную нервную систему, средств против паркинсонизма и лекарственных средств, оказывающих смешанное действие на центральную нервную систему. Лекарственным средством, воздействующим на вегетативную нервную систему (ВНС), может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из холинергических средств (парасимпатомиметиков), антихолинергических средств, адренергических средств (симпатомиметиков), адренергических блокаторов (симпатолитических средств), релаксантов скелетных мышц и нейромиоблокаторов. Лекарственным средством для лечения респираторных заболеваний может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из антигистаминов, бронходилататоров, отхаркивающих средств или средств от кашля и средств для лечения респираторных заболеваний смешанного действия. Лекарственным средством для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из антацидов, адсорбентов, ветрогонных средств, пищеварительных ферментов, растворителей желчных камней, средств против диареи, слабительных средств, противорвотных средств и средств против язвы. Гормо
- 18 015262 нальным лекарственным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из кортикостероидов, андрогенов, анаболических стероидов, эстрогенов, прогестинов, гонадотропинов, антидиабетических лекарственных средств, и по меньшей мере одно средство, выбранное из глюкагона, тиреотропных гормонов, антагонистов тиреотропных гормонов, гипофизарных гормонов и паратиреоидподобных лекарственных средств. Лекарственным средством для регуляции водно-солевого баланса может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из диуретиков, электролитов, растворовзаменителей, окислителей и подщелачивающих средств. Гематологическим лекарственным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из лекарственных средств, повышающих уровень гемоглобина в крови, антикоагулянтов, компонентов крови и тромболитических ферментов. Противоопухолевым лекарственным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из алкилирующих лекарственных средств, антиметаболитов, противоопухолевых антибиотиков, противоопухолевых средств, изменяющих гормональный баланс, и противоопухолевых средств смешанного действия. Иммуномодулирующим лекарственным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из иммунодепрессантов, вакцин, токсоидов, антитоксинов, противоядий, иммунных сывороток и модификаторов биологического ответа. Офтальмическим лекарственным средством и лекарственным средством для лечения заболеваний уха и носа может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из офтальмических противоинфекционных средств, офтальмических противовоспалительных средств, миотических средств, мидриатических средств, офтальмических сосудосуживающих средств и офтальмических средств и средств для лечения заболеваний уха и носа смешанного действия. Лекарственным средством для местного применения может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из противоинфекционных средств для местного применения, противочесоточных средств, средств против педикулеза и кортикостероидов для местного применения. Натуральным лекарственным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из витаминов, микроэлементов или калорийных веществ. См., например, руководство Νι.ΐΓ8ίη§ 2001 Эгид НаибЬоок, см. выше.
По меньшей мере одним амебоцидом или антипротозойным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из атоваквона, гидрохлорида хлорохина, фосфата хлорохина, метронидазола, гидрохлорида метронидазола и изетионата пентамидина. По меньшей мере одним противоглистным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из мебендазола, памоата пирантела и тиабендазола. По меньшей мере одним противогрибковым средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из амфотерицина В, комплекса амфотерицин В-холестерилсульфат, комплекса амфотерицин В-липид, липосомного афмотерицина В, флуконазола, флуцитозина, гризеофульвина в микроскопических количествах, гризеофульвина в ультрамикроскопических количествах, итраконазола, кетоконазола, нистатина и гидрохлорида тербинафина. По меньшей мере одним противомалярийным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида хлорохина, фосфата хлорохина, доксициклина, сульфата гидроксихлорохина, гидрохлорида мефлохина, фосфата примахина, пириметамина и пириметамина в комбинации с сульфадоксином. По меньшей мере одним противотуберкулезным средством или средством против проказы может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из клофазимина, циклосерина, дапсона, гидрохлорида этамбутола, изониазида, пиразинамида, рифабутина, рифампина, рифапентина и сульфата стрептомицина. По меньшей мере одним аминогликозидом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из сульфата амикацина, сульфата гентамицина, сульфата неомицина, сульфата стрептомицина и сульфата тобрамицина. По меньшей мере одним пенициллиновым составом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из калиевой соли амоксициллина/клавуланата, тригидрата амоксициллина, ампициллина, натриевой соли ампициллина, тригидрата ампициллина, натриевой соли ампициллина/натриевой соли сульбактама, натриевой соли клоксациллина, натриевой соли диклоксациллина, натриевой соли мезлоциллина, натриевой соли нафциллина, натриевой соли оксациллина, бензатинсодержащего пенициллина С, калиевой соли пенициллина С, прокаинсодержащего пенициллина С, натриевой соли пенициллина С, калиевой соли пенициллина V, натриевой соли пиперациллина, натриевой соли пиперациллина/натриевой соли тазобактама, динатриевой соли тикарциллина и динатриевой соли тикарциллина/калиевой соли клавуланата. По меньшей мере одним цефалоспорином может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из цефаклора, цефадроксила, натриевой соли цефазолина, цефдинира, гидрохлорида цефепима, цефиксима, натриевой соли цефметазола, натриевой соли цефоницида, натриевой соли цефоперазона, динатриевой соли цефотаксима, натриевой соли цефотетана, натриевой соли цефокситина, цефподоксим-проксетила, цефпрозила, цефтазидима, цефтибутена, натриевой соли цефтизоксима, натриевой соли цефтриаксона, цефуроксим-аксетила, натриевой соли цефуроксима, гидрохлорида цефалексина, моногидрата цефалексина, цефрадина, лоракарбефа. По меньшей мере одним тетрациклином может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида демеклоциклина, кальциевой соли доксициклина, гиклата доксициклина, гидрохлорида доксициклина, моногидрата доксициклина, гидрохлорида миноциклина и гидрохлорида тетрациклина. По меньшей мере одним сульфонамидом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из котримоксазола, сульфадиазина, сульфаметоксазола, сульфизоксазола и ацетилсульфизоксазола. По меньшей мере одним фторхинолоном может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из мезилата алатрофлоксацина, ципрофлоксацина, эноксацина, левофлоксацина, гидрохлори
- 19 015262 да ломефлоксацина, налидиксовой кислоты, норфлоксацина, офлоксацина, спарфлоксацина и мезилата тровафлоксацина. По меньшей мере одним противовирусным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из сульфата абакавира, натриевой соли ацикловира, гидрохлорида амантадина, ампренавира, цидофовира, мезилата делавирдина, диданозина, эфавиренца, фамцикловира, натриевой соли фомивирсена, натриевой соли фоскарнета, ганцикловира, сульфата индинавира, ламивудина, ламивудина/зидовудина, мезилата нелфинавира, невирапина, фосфата озелтамивира, рибавирина, гидрохлорида римантадина, ритонавира, саквинавира, мезилата саквинавира, ставудина, гидрохлорида валацикловира, зальцитабина, занамивира и зидовудина. По меньшей мере одним макролидным противоинфекционным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из азитромицина, кларитромицина, диритромицина, эритромицинового основания, эстолата эритромицина и этилсукцината эритромицина, лактобионата эритромицина, стеарата эритромицина. По меньшей мере одним противоинфекционным средством смешанного действия может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из астреонама, бацитрацина, натриевой соли сукцината хлорамфеникола, гидрохлорида клиндамицина, гидрохлорида пальмитата клиндамицина, фосфата клиндамицина, натриевой соли имипенема и циластатина, меропенема, макрокристаллов нитрофурантоина, микрокристаллов нитрофурантоина, хинупристина/далфопристина, гидрохлорида спектиномицина, триметоприма и гидрохлорида ванкомицина (см., например, р. 24-214, Ышьтд, 2001, Эгид НапбЬоок).
По меньшей мере одним инотропным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из лактата амринона, дигоксина и лактата милринона. По меньшей мере одним средством против аритмии может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из аденозина, гидрохлорида амиодарона, сульфата атропина, тозилата бретилия, гидрохлорида дилтиазема, дизопирамида, фосфата дизопирамида, гидрохлорида эсмолола, ацетата флекаинида, фумарата ибутилида, гидрохлорида лидокаина, гидрохлорида мексилетина, гидрохлорида морицизина, фенитоина, натриевой соли фенитоина, гидрохлорида прокаинамида, гидрохлорида пропафенона, гидрохлорида пропранолола, бисульфата хинидина, глюконата хинидина, полигалактуроната хинидина, сульфата хинидина, соталола, гидрохлорида токаинида, гидрохлорида верапамила. По меньшей мере одним средством против стенокардии может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из безилата амлодипидина, амилнитрита, гидрохлорида бепридила, гидрохлорида дилтиазема, динитрата изосорбида, мононитрата изосорбида, надолола, гидрохлорида никардипина, нифедипина, нитроглицерина, гидрохлорида пропранолола, верапамила и гидрохлорида верапамила. По меньшей мере одним гипотензивным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида ацебутолола, безилата амлодипина, атенолола, гидрохлорида беназеприла, гидрохлорида бетаксолола, фумарата бизопролола, кандесартанцилетексила, каптоприла, гидрохлорида картеолола, карведилола, клонидина, гидрохлорида клонидина, диазоксида, гидрохлорида дилтиазема, мезилата доксазоцина, эналаприлата, малеата эналаприла, мезилата эпросартана, фелодипина, мезилата фенолдопама, натриевой соли фозиноприла, ацетата гуанабенза, сульфата гуанадрела, гидрохлорида гуанфацина, гидрохлорида гидралазина, ирбесартана, исрадипина, гидрохлорида лабеталола, лизиноприла, калиевой соли лозартана, метилдопы, гидрохлорида метилдопата, сукцината метопролола, тартрата метопролола, миноксидила, гидрохлорида моэксипила, надолола, гидрохлорида никардипина, нифедипина, низолдипина, нитропруссида натрия, сульфата пенбутолола, периндоприлэрбумина, мезилата фентоламина, пиндолола, гидрохлорида празозина, гидрохлорида пропранолола, гидрохлорида хинаприла, рамиприла, телмисартана, гидрохлорида теразозина, малеата тимололпа, трандолаприла, валсартана и гидрохлорида верапамила. По меньшей мере одним средством против гиперлипемии может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из кальциевой соли аторвастатина, натриевой соли церивастатина, холестирамина, гидрохлорида колестипола, фенофибрата (измельченного в порошок), натриевой соли флувастатина, гемфиброзила, ловастатина, ниацина, натриевой соли правастатина и симвастатина. По меньшей мере одним сердечно-сосудистым (СС) средством смешанного действия может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из абциксимаба, алпростадила, гидрохлорида арбутамина, цилостазола, бисульфата клопидогреля, дипиридамола, эптифибатида, гидрохлорида мидодрина, пентоксифиллина, гидрохлорида тиклопидина и гидрохлорида тирофибана (см., например, р. 215-336, ΝιίΓδίηβ. 2001, Эгид НапбЬоок).
По меньшей мере одним ненаркотическим аналгетиком или антипиретиком может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из ацетаминофена, аспирина, магнийсодержащего трисалицилата холина, дифлунизала и салицилата магния. По меньшей мере одним нестероидным противовоспалительным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из целекоксиба, диклофенаккалия, диклофенак-натрия, этодолака, фенопрофен-кальция, флурбипрофена, ибупрофена, индометацина, натриевой соли тригидрата индометацина, кетопрофена, кеторолака, трометамина, набуметона, напроксена, напроксен-натрия, оксапрозина, пироксикама, рофекоксиба и сулиндака. По меньшей мере одним наркотическим или опиоидным аналгетиком может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида алфентанила, гидрохлорида бупренорфина, тартрата буторфанола, фосфата кодеина, сульфата кодеина, цитрата фентанила, фентанила для системного чрескожного введения, фентанила для введения через слизистую, гидрохлорида гидроморфона, гидрохлорида мепередина, гидрохлорида метадона, гидрохлорида морфина, сульфата морфина, тартрата морфина, гидрохлорида налбуфина, гидрохлорида
- 20 015262 оксикодона, пектината оксикодона, гидрохлорида оксоморфона, гидрохлорида пентазоцина, гидрохлорида пентазоцина и гидрохлорида налоксона, лактата пентазоцина, гидрохлорида пропоксифена, напсилата пропоксифена, гидрохлорида ремифентанила, цитрата суфентанила и гидрохлорида трамадола. По меньшей мере одним седативно-гипнотическим средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из хлоралгидрата, эстазолама, гидрохлорида флуразепама, пентобарбитала, пентобарбиталнатрия, фенобарбитал-натрия, секобарбитал-натрия, темазепама, триазолама, залеплона и тартрата золпидема. По меньшей мере одним противосудорожным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из ацетазоламид-натрия, карбамазепина, клоназепама, дикалиевой соли клоразепата, диазепама, дивалпроэкс-натрия, этосуксимида, фосфенитоин-натрия, габапентина, ламотригина, сульфата магния, фенобарбитала, фенобарбитал-натрия, фенитоина, фенитоин-натрия, фенитоин-натрия (пролонгированного действия), примидона, гидрохлорида тиагабина, топирамата, валпроата натрия и валпроевой кислоты. По меньшей мере одним антидепрессантом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида амитриптилина, памоата амитриптилина, амоксапина, гидрохлорида бупропиона, гидробромида циталопрама, гидрохлорида кломипрамина, гидрохлорида дезипрамина, гидрохлорида доксепина, гидрохлорида флуоксетина, гидрохлорида имипрамина, памоата имипрамина, миртазапина, гидрохлорида нефазодона, гидрохлорида нортриптилина, гидрохлорида пароксетина, сульфата фенелзина, гидрохлорида сертралина, сульфата транилципромина, малеата тримипрамина и гидрохлорида венлафаксина. По меньшей мере одним анксиолитическим средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из алпразолама, гидрохлорида буспирона, хлордиазэпоксида, гидрохлорида хлордиазэпоксида, дикалиевой соли клоразепата, диазепама, гидрохлорида доксепина, эмбоната гидроксизина, гидрохлорида гидроксизина, памоата гидроксизина, лоразепама, мефробамата, гидрохлорида мидазолама и оксазепама. По меньшей мере одним антипсихотическим средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида хлорпромазина, клозапина, деканоата флуфеназина, энантата флуфеназина, гидрохлорида флуфеназина, галоперидола, деканоата галоперидола, лактата галоперидола, гидрохлорида локсапина, сукцината локсапина, безилата мезоридазина, гидрохлорида молиндона, оланзапина, перфеназина, пимозида, прохлорперазина, фумарата кветиапина, рисперидона, гидрохлорида тиоридазина, тиотиксена, гидрохлорида тиотиксена и гидрохлорида трифторперазина. По меньшей мере одним стимулятором центральной нервной системы может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из сульфата амфетамина, кофеина, сульфата декстроамфетамина, гидрохлорида доксапрама, гидрохлорида метамфетамина, гидрохлорида метилфенидата, модафинила, пемолина и гидрохлорида фентермина. По меньшей мере одним средством против паркинсонизма может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида амантадина, мезилата бензтропина, гидрохлорида биперидена, лактата биперидена, мезилата бромкриптина, карбидопы-леводопы, энтакапона, леводопы, мезилата перголида, дигидрохлорида прамипексола, гидрохлорида ропинирола, гидрохлорида селегилина, толкапона и гидрохлорида тригексифенидила. По меньшей мере одним лекарственным средством, оказывающим смешанное действие на центральную нервную систему, может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида бупропиона, гидрохлорида донепезила, дроперидола, малеата флувоксамина, карбоната лития, цитрата лития, гидрохлорида наратриптана, никотинполакрилекса, никотина для системного чрескожного введения, пропофола, бензоата ризатриптана, моногидрата гидрохлорида сибутрамина, сукцината суматриптана, гидрохлорида такрина и золмитриптана (см., например, р. 337-530, №гкшд, 2001, Эгид НапбЬоок).
По меньшей мере одним холинергическим (например, парасимпатомиметическим) средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из хлорида бетанхола, хлорида эдрофония, бромида неостигмина, метилсульфата неостигмина, салицилата физостигмина и бромида пиридостигмина. По меньшей мере одним антихолинергическим средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из сульфата атропина, гидрохлорида дицикломина, гликопирролата, гиосциамина, сульфата гиосциамина, бромида пропантелина, скополамина, бутилбромида скополамина и гидробромида скополамина. По меньшей мере одним адренергическим (симпатомиметическим) средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлоридаа добутамина, гидрохлорида допамина, битартрата метараминола, битартрата норэпинефрина, гидрохлорида фенилэфрина, гидрохлорида псевдоэфедрина и сульфата псевдоэфедрина. По меньшей мере одним блокатором адренергических рецепторов (симпатолитическим средством) может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из мезилата дигидроэрготамина, тартрата эрготамина, малеата метизергида и гидрохлорида пропранолола. По меньшей мере одним релаксантом скелетной мышцы может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из баклофена, каризопродола, хлорзоксазона, гидрохлорида циклобензаприна, дантролен-натрия, метокарбамола и гидрохлорида тизанидина. По меньшей мере одним нейромышечным блокатором может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из безилата атракуриума, безилата цис-атракуриума, хлорида доксакуриума, хлорида мивакуриума, бромида панкурония, бромида пипекурония, бромида рапакурония, бромида рокурония, хлорида сукцинилхолина, хлорида тубокурарина и бромида векурония. (см., например, р. 531-84, №гкшд, 2001, Эгид НапбЬоок).
По меньшей мере одним антигистаминовым средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из малеата бромфенирамина, гидрохлорида цетризина, малеата хлорфенирамина, фумарата
- 21 015262 клемастина, гидрохлорида ципрогептадина, гидрохлорида дифенгидрамина, гидрохлорида фексофенадина, лоратадина, гидрохлорида прометазина, теоклата прометазина и гидрохлорида трипролидина. По меньшей мере одним бронходилататором может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из альбутерола, сульфата альбутерола, аминофиллина, сульфата атропина, сульфата эфедрина, эпинефрина, битартрата эпинефрина, гидрохлорида эпинефрина, бромида ипратропия, изопротеренола, гидрохлорида изопротеренола, сульфата изопротеренола, гидрохлорида левалбутерола, сульфата метапротеренола, окстрифиллина, ацетата пирбутерола, ксинафоата сальметерола, сульфата тербуталина и теофиллина. По меньшей мере одним отхаркивающим средством или средством против кашля может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из банзонатата, фосфата кодеина, сульфата кодеина, гидробромида декстраметорфана, гидрохлорида дифенилгидрамина, гвайфенезина и гидрохлорида гидроморфона. По меньшей мере одним лекарственным средством для лечения респираторных заболеваний смешанного действия может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из ацетилцистеина, дипропионата беклометазона, берактанта, будезонида, кальфактанта, кромолин-натрия, дорназы-альфа, эпопростенолнатрия, флунизолида, пропионата флутиказона, монтелукаст-натрия, недокромил-натрия, паливизумаба, ацетонида триамцинолона, зафирлукаста и зилейтона (см., например, р. 585-642, Шгктд, 2001, Эгид НапбЬоок).
По меньшей мере одним антацидом, адсорбентом или ветрогонным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из карбоната алюминия, гидроксида алюминия, карбоната кальция, магалдрата, гидроксида магния, оксида магния, симетикона и бикарбоната натрия. По меньшей мере одним гидролизующим ферментом или растворителем желчных камней может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из панкреатина, панкрелипазы и урсодиола. По меньшей мере одним средством против диареи может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из аттапульгита, субсалицилата висмута, поликарбофил-кальция, гидрохлорида дифеноксилата и сульфата атропина, лоперамида, ацетата октреотида, опийной настойки и опийной настойки с камфорой. По меньшей мере одним слабительным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из бизокодила, поликарбофил-кальция, саксага кадгаба (жостера Пурша), ароматического жидкого экстракта саксага кадгаба, жидкого экстракта саксага кадгаба, касторового масла, докузат-кальция, докузат-натрия, глицерина, лактулозы, цитрата магния, гидроксида магния, сульфата магния, метилцеллюлозы, минерального масла, полиэтиленгликоля или раствора электролита, псиллиума (подорожника блошиного), сенны и фосфатов натрия. По меньшей мере одним противорвотным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида хлорпромазина, дименгидрината, мезилата долазетрона, дронабинола, гидрохлорида гранисетрона, гидрохлорида меклизина, гидрохлорида метоклопроамида, гидрохлорида ондансетрона, перфеназина, прохлорперазина, эдисилата прохлорперазина, малеата прохлорперазина, гидрохлорида прометазина, скополамина, малеата тиэтилперазина и гидрохлорида триметобензамида. По меньшей мере одним средством против язвы является по меньшей мере одно средство, выбранное из циметидина, гидрохлорида циметидина, фамотидина, ланзопразола, мизопростола, низатидина, омепразола, рабепрозол-натрия, цитрата ранитидина-висмута, гидрохлорида ранитидина и сукралфата (см., например, р. 643-95, №гкшд, 2001, Эгид НапбЬоок).
По меньшей мере одним кортикостероидом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из бетаметазона, ацетата бетаметазона или фосфата бетаметазона-натрия, фосфата бетаметазона-натрия, ацетата кортизона, дексаметазона, ацетата дексаметазона, фосфата дексаметазона-натрия, ацетата флудрокортизона, гидрокортизона, ацетата гидрокортизона, ципионата гидрокортизона, фосфата гидрокортизона-натрия, сукцината гидрокортизона-натрия, метилпреднизолона, ацетата метилпреднизолона, сукцината метилпреднизолона-натрия, преднизолона, ацетата преднизолона, фосфата преднизолона-натрия, тебутата преднизолона, преднизона, триамцинолона, ацетонида триамцинолона и диацетата триамцинолона. По меньшей мере одним андрогеном или анаболическим стероидом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из даназола, флуоксиместерона, метилтестостерона, деканоата нандролона, фенпропионата нандролона, тестостерона, ципионата тестостерона, энантата тестостерона, пропионата тестостерона и тестостерона для чрескожного введения. По меньшей мере одним эстрогеном или прогестином может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из этерифицированных эстрогенов, эстрадиола, ципионата эстрадиола, ацетата эстрадиола/норэтиндрона для системного чрескожного введения, валерата эстрадиола, эстрогенов (конъюгированных), эстропипата, этинилэстрадиола, этинилэстрадиола и дезогестрела, этинилэстрадиола и этинодиолдиацетата, этинилэстрадиола и дезогестрела, этинилэстрадиола и этинодиолдиацетата, этинилэстрадиола и левоноргестрела, этинилэстрадиола и норэтиндрона, этинилэстрадиола и ацетата норэтиндрона, этинилэстрадиола и норгестимата, этинилэстрадиола и норгестрела, этинилэстрадиола и норэтиндрона и ацетата и фумарата железа(2), левоноргестрела, ацетата медроксипрогестерона, местранола и норэтиндрона, норэтиндрона, ацетата норэтиндрона, норгестрела и прогестерона. По меньшей мере одним гонадотропином может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из ацетата ганиреликса, ацетата гонадорелина, ацетата гистрелина и менотропинов. По меньшей мере одним средством против диабета или глюкагоном может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из акарбозы, хлорпропамида, глимепирида, глипизида, глюкагона, глибурида, инсулинов, гидрохлорида метформина, миглитола, гидрохлорида пиоглитазона, репаглинида, малеата розиглитазона
- 22 015262 и троглитазона. По меньшей мере одним тиреоидным гормоном может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из левотироксин-натрия, лиотиронин-натрия, лиотрикса и тиреоидного гормона. По меньшей мере одним антагонистом тиреоидного гормона может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из метимазола, йодида калия, йодида калия (насыщенного раствора), пропилтиоурацила, радиоактивного йода (йодида натрия, 1311) и концентрированного раствора йода. По меньшей мере одним гипофизарным гормоном может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из кортикотропина, козинтропина, ацетата десмопрессина, ацетата лейпролида, кортикотропина пролонгированного действия, соматрема, соматропина и вазопрессина. По меньшей мере одним лекарственным средством, действующим подобно паратиреоидному гормону, может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из кальцифедиола, кальцитонина (человеческого), кальцитонина (лососевого), кальцитриола, дигидротахистерола и динатриевой соли этидроната (см., например, р. 696-796, Ышътд, 2001, Бгид НапбЬоок).
По меньшей мере одним диуретиком может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из ацетазоламида, ацетазоламида натрия, гидрохлорида амилорида, буметанида, хлорталидона, этакрината натрия, этакриновой кислоты, фуросемида, гидрохлортиазида, индапамида, маннита, метолазона, спиронолактона, торсемида, триамтерена и мочевины. По меньшей мере одним электролитом или растворомзаменителем может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из ацетата кальция, карбоната кальция, хлорида кальция, цитрата кальция, глубионата кальция, глюцептата кальция, глюконата кальция, лактата кальция, фосфата кальция (двухосновного), фосфата кальция (трехосновного), декстрана (высокомолекулярного), декстрана (низкомолекулярного), гидроксиэтилированного крахмала и хлорида магния, сульфата магния, ацетата калия, бикарбоната калия, хлорида калия, глюконата калия, раствора Рингера для инъекций, раствора Рингера для инъекций (содержащего лактат) и хлорида натрия. По меньшей мере одним окислителем или подщелачивающим средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из бикарбоната натрия, лактата натрия и трометамина (см., например, р. 797-833, Ыигатд, 2001, Бгид НапбЬоок).
По меньшей мере одним лекарственным средством, повышающим уровень гемоглобина в крови, может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из фумарата железа(2), глюконата железа(2), сульфата железа(2), сульфата железа(2) (сухого), комплекса железо-декстран, комплекса железосорбит, комплекса полисахарид-железо и комплекса глюконат натрия-железо(3). По меньшей мере одним антикоагулянтом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из натриевой соли ардепарина, натриевой соли дальтепарина, натриевой соли данапароида, натриевой соли эноксапарина, кальциевой соли гепарина, натриевой соли гепарина и натриевой соли варфарина. По меньшей мере одним из компонентов крови может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из 5% альбумина, 25% альбумина, антигемофильного фактора, комплекса антиингибитор-коагулянт, антитромбина III (человеческого), фактора IX (человеческого), комплекса фактора IX и фракций белков плазмы. По меньшей мере одним тромболитическим ферментом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из альтеплазы, анистреплазы, ретеплазы (рекомбинантной), стрептокиназы и урокиназы (см., например, р. 834-66, Ышьтд, 2001, Бгид НапбЬоок).
По меньшей мере одним алкилирующим лекарственным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из бусульфана, карбоплатина, кармустина, хлорамбуцила, цисплатина, циклофосфамида, ифосфамида, ломустина, гидрохлорида мехлорэтамина, мелфалана, гидрохлорида мелфалана, стрептозоцина, темозоломида и тиотепы. По меньшей мере одним антиметаболитом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из капецитабина, кладрибина, цитарабина, флоксуридина, фосфата флударабина, фторурацила, гидроксимочевины, меркаптопурина, метотрексата, натриевой соли метотрексата, тиогуанина. По меньшей мере одним противоопухолевым антибиотиком может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из сульфата блеомицина, дактиномицина, липосомного цитрата даунорубицина, гидрохлорида даунорубицина, гидрохлорида доксорубицина, липосомного гидрохлорида доксорубицина, гидрохлорида эпирубицина, гидрохлорида идарубицина, митомицина, пентостатина, пликамицина и валрубицина. По меньшей мере одним противоопухолевым средством, влияющим на гормональный баланс, может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из анастрозола, бикалутамида, фосфата эстрамустин-натрия, экземестана, флутамида, ацетата гозерелина, летрозола, ацетата лейпролида, ацетата мегестрола, нилутамида, цитрата тамоксифена, тестолактона и цитрата торемифена. По меньшей мере одним противоопухолевым средством смешанного действия может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из аспарагиназы, бациллы Кальметта-Герена (БКГ) (живой, интравезикулярной), дакарбазина, доцетаксела, этопозида, фосфата этопозида, гидрохлорида гемцитабина, гидрохлорида иринотекана, митотана, гидрохлорида митоксантрона, паклитаксела, пегаспаргазы, порфимернатрия, гидрохлорида прокарбазина, ритуксимаба, тенипозида, гидрохлорида топотекана, трастузумаба, третиноина, сульфата винбластина, сульфата винкристина и тартрата винорелбина (см., например, р. 867-963, Ышьтд, 2001, Бгид НапбЬоок).
По меньшей мере одним иммунодепрессантом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из азатиоприна, базиликсимаба, циклоспорина, даклизумаба, лимфоцитарного иммуноглобулина, муромонаба-СБ3, микофенолатмофетила, гидрохлорида микофенолатмофетила, сиролимуса и такролимуса. По меньшей мере одной вакциной или одним токсоидом может быть по меньшей мере одно
- 23 015262 средство, выбранное из вакцины БКГ, холерной вакцины, дифтерийных и столбнячных токсоидов (адсорбированных), адсорбированных дифтерийных и столбнячных токсоидов и бесклеточной коклюшной вакцины, дифтерийных и столбнячных токсоидов и цельноклеточной коклюшной вакцины, конъюгированных вакцин НаеторЫ1ш8 Ь, вакцины против гепатита А (инактивированной), вакцины против гепатита В (рекомбинантной), трехвалентной противогриппозной вакцины 1999-2000 типа А и В (содержащей очищенный поверхностный антиген), трехвалентной противогриппозной вакцины 1999-2000 типа А и В (содержащей субвирион или очищенный субвирион), трехвалентной противогриппозной вакцины 19992000 типа А и В (содержащей целый вирион), вирусной вакцины против японского энцефалита (инактивированной), вакцины против болезни Лайма (содержащей рекомбинантный ОкрА), вакцины против кори, паротита и краснухи (живой), вакцины против кори, паротита и краснухи (живой, аттенюированной), коревой вакцины (живой, аттенюированной), менингококковой полисахаридной вакцины, вакцины против паротита (живой), противочумной вакцины, пневмококковой вакцины (поливалентной), полиовирусной вакцины (инактивированной), полиовирусной вакцины (живой, пероральной, трехвалентной), вакцины против бешенства (адсорбированной), вакцины против бешенства (содержащей человеческие диплоидные клетки), вакцины против краснухи и паротита (живой), вакцины против краснухи (живой, аттенюированной), столбнячного токсоида (адсорбированного), столбнячного токсоида (в жидкой форме), вакцины против тифа (пероральной), вакцины против тифа (парентеральной), вакцины против тифа на основе полисахарида вируса тифа, вирусной вакцины против ветряной оспы и вакцины против желтой лихорадки. По меньшей мере одним антитоксином или противоядием может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из антитоксической сыворотки против яда паука черная вдова, антитоксической сыворотки против яда Сго!а11бае (поливалентной), дифтерийного антитоксина (лошадиного) и антитоксической сыворотки против М1сгиги8 £и1уш8. По меньшей мере одной иммунной сывороткой может быть по меньшей мере одна сыворотка, выбранная из сыворотки, содержащей иммуноглобулин против цитомегаловируса (внутривенной), сыворотки, содержащей иммуноглобулин против гепатита В (человеческой), сыворотки для внутримышечного введения, содержащей иммуноглобулин, сыворотки для внутривенного введения, содержащей иммуноглобулин, сыворотки, содержащей иммуноглобулин против вируса бешенства (человеческой), и сыворотки для внутривенного введения, содержащей иммуноглобулин против респираторно-синцитиального вируса (человеческой), сыворотки, содержащей иммуноглобулин против вируса ΚΕο(Ό), сыворотки для внутривенного введения, содержащей иммуноглобулин против вируса Π1ι0(Ό) (человеческой), сыворотки, содержащей иммуноглобулин против вируса столбняка (человеческого), и сыворотки, содержащей иммуноглобулин против вируса опоясывающего лишая. По меньшей мере одним модификатором биологического ответа может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из альдеслейкина, эпоэтина-альфа, филграстима, ацетата глатирамера для инъекций, интерферона альфакон-1, интерферона альфа-2а (рекомбинантного), интерферона альфа-2Ь (рекомбинантного), интерферона бета-1а, интерферона бета-1Ь (рекомбинантного), интерферона гамма-1Ь, гидрохлорида левамизола, опрелвекина и сарграмостима (см., например, р. 964-1040, ΝυΓδίηβ, 2001, Эгид НанбЬоок).
По меньшей мере одним офтальмическим противоинфекционным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из бацитрацина, хлорамфеникола, гидрохлорида ципрофлоксацина, эритромицина, сульфата гентамицина, 0,3% офлоксацина, сульфата полимиксина В, 10% сульфацетамида натрия, 15% сульфацетамида натрия, 30% сульфацетамида натрия, тобрамицина и видарабина. По меньшей мере одним офтальмическим противовоспалительным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из дексаметазона, фосфата дексаметазон-натрия, 0,1% диклофенак-натрия, фторметолона, флубипрофен-натрия, кеторолак-трометамина, ацетата преднизолона (суспензии) и фосфата преднизолон-натрия (раствора). По меньшей мере одним митотическим средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из хлорида ацетилхолина, карбахола (для внутриглазного введения), карбахола (для местного применения), йодида эхотиофата, пилокарпина, гидрохлорида пилокарпина и нитрата пилокарпина. По меньшей мере одним мидриатическим средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из сульфата атропина, гидрохлорида циклопентолата, гидрохлорида эпинефрина, эпинефрилбората, гидробромида гоматропина, гидрохлорида фенилэфрина, гидробромида скополамина и тропикамида. По меньшей мере одним офтальмическим сосудосуживающим средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида нафазолина, гидрохлорида оксиметазолина и гидрохлорида тетрагидрозолина. По меньшей мере одним офтальмическим средством смешанного действия может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида апраклонидина, гидрохлорида бетаксолола, тартрата бримонидина, гидрохлорида картеолола, гидрохлорида дипивефрина, гидрохлорида дорзоламида, дифумарата эмедастина, флуоресцеин-натрия, фумарата кетотифена, латанопроста, гидрохлорида левобунолола, гидрохлорида метипранолола, хлорида натрия (гипотонического средства) и малеата тимолола. По меньшей мере одним средством для лечения заболеваний уха может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из борной кислоты, пероксида карбамида, хлорамфеникола и конденсата триэтаноламин-полипептид-олеат. По меньшей мере одним средством для лечения заболеваний носа может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из дипропионата беклометазона, будезонида, сульфата эфедрина, гидрохлорида эпинефрина, флунизолида, пропионата флутиказона, гидрохлорида нафазолина, гидрохлорида оксиметазолина, гидрохлорида фенилэфрина, гидро
- 24 015262 хлорида тетрагидрозолина, ацетонида триамцинолона и гидрохлорида ксилометазолина (см., например, р. 1041-97, Шгапд 2001 Эгид НапбЬоок).
По меньшей мере одним противоинфекционным средством для местного применения может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из ацикловира, амфотерицина В, крема на основе азелаиновой кислоты, бацитрацина, нитрата бутоконазола, фосфата клиндамицина, клотримазола, нитрата эконазола, эритромицина, сульфата гентамицина, кетоконазола, ацетата мафенида, метронидазола (для местного применения), нитрата миконазола, мупироцина, гидрохлорида нафтифина, сульфата неомицина, нитрофуразона, нистатина, серебряной соли сульфадиазина, гидрохлорида тербинафина, терконазола, гидрохлорида тетрациклина, тиоконазала и толнафтата. По меньшей мере одним противочесоточным средством или средством против педикулеза может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из кротамитона, линдана, перметрина и пиретринов. По меньшей мере одним кортикостероидом для местного применения может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из дипропионата бетаметазона, валерата бетаметазона, пропионата клобетазола, дезонида, дезоксиметазона, дексаметазона, фосфата дексаметазон-натрия, диацетата дифлоразона, ацетонида флуоцинолола, флуоцинонида, флурандренолида, пропионата флутиказона, галционида, гидрокортизона, ацетата гидрокортизона, бутирата гидрокортизона, валерата гидрокортизона, фуроата мометазона и ацетонида триамцинолона. (См., например, рр. 10981136, №гзшд 2001 Эгид НапбЬоок.)
По меньшей мере одним витамином или микроэлементом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из витамина А, комплекса витаминов В, цианокобаламина, фолиевой кислоты, гидроксокобаламина, лейковорин-кальция, ниацина, ниацинамида, гидрохлорида пиридоксина, рибофлавина, гидрохлорида тиамина, витамина С, витамина Э, холекальциферола, эргокальциферола, аналога витамина Э, доксекальциферола, парикальцитола, витамина Е, аналога витамина К, фитонадиона, фторида натрия, фторида натрия для местного применения, микроэлементов, хрома, меди, йода, марганца, селена и цинка. По меньшей мере одним калорийным веществом может быть по меньшей мере одно вещество, выбранное из растворов аминокислот (кристаллических), растворов аминокислот в декстрозе, растворов аминокислот с электролитами, растворов аминокислот с электролитами в декстрозе, растворов аминокислот для лечения печеночной недостаточности, растворов аминокислот для предотвращения тяжелых метаболических расстройств, растворов аминокислот для лечения почечной недостаточности, декстрозы, жировых эмульсий и триглицеридов со средней длиной цепи (см., например, р. 1137-63, №гзтд, 2001, Эгид НапбЬоок).
Композиции анти-1Ь-6 антител согласно изобретению могут также содержать по меньшей мере любое подходящее и эффективное количество композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-1Ь-6 антитело, подвергаемое контакту с клеткой, тканью, органом и организмом животного или человека, или вводимое в указанные клетку, ткань, орган и организм животного или человека, нуждающихся в такой модуляции, лечении или терапии, а также, но необязательно, содержащей по меньшей мере одно средство, выбранное по меньшей мере из таких средств, как антагонист ЮТ (например, такой как, но не ограничивающийся ими, антагонист Т№, являющийся химическим соединением или белком, моноклональное или поликлональное антитело или его фрагмент против ЮТ, растворимый рецептор ЮТ (например, р55, р70 или р85) или его фрагмент, гибридные полипептиды или небольшая молекула-антагонист 'Т№, например ЮТ-связывающий белок I или II (ТВР-Ι или ТВР-11), нерелимонмаб, инфликсимаб, этанерцепт, СЭР-571, СЭР-870, афелимомаб, ленерцепт и т.п.), противоревматическое средство (например, метотрексат, ауранофин, ауротиоглюкоза, азатиоприн, этанерцепт, тиомалат золота-натрия, сульфат гидроксихлорохина, лефлуномид, сульфазальцин), миорелаксант, наркотическое средство, нестероидное противовоспалительное средство (НСПВС), аналгетик, анестетик, седативное средство, анестетик для местного применения, нейромышечный блокатор, противомикробное средство (например, аминогликозид, противогрибковое средство, средство против паразитов, противовирусное средство, карбапенем, цефалоспорин, фторхинолон, макролид, пенициллин, сульфонамид, тетрациклин, другие противомикробные средства), средство для лечения псориаза, кортикостероид, анаболический стероид, средство для лечения диабета, микроэлементы, натуральное средство, средство для лечения щитовидной железы, витамин, кальций-ассоциированный гормон, средство против диареи, средство против кашля, противорвотное средство, средство против язвы, слабительное средство, антикоагулянт, эритропоэтин (например, эпоэтин-альфа), филграстим (например, С-С8Р, №иродеп), сарграмостим (СМ-С8Р, Ьеикте), средство для иммунизации, иммуноглобулин, иммунодепрессант (например, базиликсимаб, циклоспорин, даклизумаб), гормон роста, средство для гормон-заместительной терапии, модулятор рецептора эстрогена, мидриатическое средство, средство для лечения циклоплегии, алкилирующий агент, антиметаболит, ингибитор митоза, радиофармацевтическое средство, антидепрессант, средство против маниакальной депрессии, антипсихотическое средство, анксиолитическое средство, гипнотическое средство, симпатомиметик, стимулятор, донепезил, такрин, противоастматическое лекарственное средство, бета-агонист, стероид, вводимый путем ингаляции, ингибитор лейкотриена, метилксантин, кромолин, эпинефрин или его аналог, дорназа-альфа (РЫто/уте), цитокин или антагонист цитокина. Неограничивающими примерами таких цитокинов являются, но не ограничиваются ими, любой из 1Ь-1-1Ь-23 (например, 1Ь-1, 1Ь-2 и т.п.). Подходящие дозы таких средств хорошо известны специалистам.
- 25 015262
См., например, руководства Ае11к е! а1., ебк., РйагтасоФегару НанбЬоок. 2'1 Εάίΐίοη, Арр1еФп анб Банде. ЕбатГогб. СТ (2000); ΡΌΚ. Ркагтасорое1а, Тагаксог1 Роске! Ркагтасорое1а 2000, Эе1нхе Е66юп, Тагакеог! РиЬНзЬшд, Ьота Ьтба, СА (2000), каждое из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Такие противораковые или противоинфекционные средства могут также включать молекулы токсинов, которые могут быть ассоциированы, связаны, совместно приготовлены или совместно введены по меньшей мере с одним антителом согласно изобретению. Токсин может, но необязательно, селективно уничтожать патологические клетки или ткани. Такими патологическими клетками могут быть раковые или другие клетки. Указанными токсинами могут быть, но не ограничиваются ими, очищенный или рекомбинантный токсин или его фрагмент, содержащий по меньшей мере один функциональный цитотоксический домен токсина, выбранного, например, по меньшей мере из одного токсина, такого как рицин, дифтерийный токсин, токсин яда или бактериальный токсин. Термин токсин также включает эндотоксины и экзотоксины, продуцируемые любыми природными, мутантными или рекомбинантными бактериями или вирусами, которые могут вызывать любое патологическое состояние у человека и других млекопитающих, включая токсический шок, который может приводить к летальному исходу. Такими токсинами могут быть, но не ограничиваются ими, энтеротоксигенный термолабильный энтеротоксин Е.сой (ЬТ), термостабильный энтеротоксин (БТ), цитотоксин 8Ыде11а, энтеротоксины Аегато^^, токсин1, вызывающий синдром токсического шока (Т88Т-1), стафилококковый энтеротоксин А (8ЕА), В (8ЕВ) или С (8ЕС), стрептококковые энтеротоксины и т.п. Такими бактериями являются, но не ограничиваются ими, штаммы энтеротоксигенных бактерий Е.со11 (ЕТЕС), энтерогеморрагической Е.со11 (например, штаммы серотипа 0157:Н7), 31арйу1ососсик крр. (например, 31арйу1ососсик аигеик, 31арйу1ососсик руодепек), 8Ыде11а крр. (например, 8Ыде11а букейейае, 8Ыде11а Пех^й, 8Ыде11а Ьоубп и 8Ыде11а кοηпе^), За1тонеПа крр. (например, За^огеИа 1урЫ, За^огеНа сйо1ега-кшк, За^огеНа е^ейШ^), С1ок!йбшт крр. (например, С1ок!йбшт ρе^Г^^пдепк, С1ок1йбшт бШсбе, С1ок!йбшт Ьо!и1тит), СатрЫоЬас1ег крр. (например, СатрЫоЬас!ег|е|ит, СатрЫоЬас1ег Ге!ик), Не1юЬас!ег крр. (например, Не1юЬас!ег ру1ой), Леготоиак крр. (например, Ле^οтοпак коЬйа, Ле^οтοпак ЬубгорЫ1а, Ле^οтοпак сау1ае), Р1е1котогак кЫде11о1бек, Уегкта е^его^НИси, ^Ьйок крр. (например, ^Ьйок сйо1егае, ^Ьйок рагайето1уйсик), К1еЬк1е11а крр., Ρкеибοтοпак аегидтока и 3!гер!ососс1. См., например, публикации 3!ет, еб., ЮТЕВИАЬ МЕ^О^ГИЕ, 3гб еб., рр 1-13, Ый1е, Вгслуп амб Со., Вок!оп, (1990); Ενапк е! а1., ебк., Вас1епа1 IηГесйοпк оГ Нитамк: Ер1бет1о1оду ип6 Соп!го1, 2б. Еб., рр. 239-254, РФит Мебюа1 Воок Со., №\ν Уогк (1991); Маг1бе11 е! а1., Ртсркк аг1б Ргасйсе оГ Ι^^^ О1кеакек, 3б. Еб., СйигсЫН ^^ν^пдк!οпе, №\ν Уогк (1990); Вегко\у е! а1., ебк., Тке Мегск Мата!, 164Ь ебНю^ Мегск аг1б Со., Вакгау, ΝΣ., 1992; Аооб е! а1., ЕЕМЗ МюгоЬю1оду Iттипο1οду, 76:121-134 (1991); Маггаск е! а1., Заеме, 248:705-711 (1990), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Соединения анти-ББ-6 антитела, а также их композиции или комбинации согласно изобретению могут также содержать по меньшей мере одно из любых подходящих вспомогательных веществ, таких как, но не ограничивающихся ими, разбавитель, связующее вещество, стабилизатор, буферы, соли, липофильные растворители, консервант, адъювант или т.п. Предпочтительными являются фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества. Неограничивающие примеры таких стерильных растворов и методов их получения хорошо известны специалистам и описаны в руководствах, таких как, но не ограничивающихся ими, руководство Сеηпа^ο, Еб., ВештдЮгГк Ркагтасеийса1 Заемек, 184Ь Е6йюп, Маск РиЬНкктд Со. (Еик!оп, РА), 1990. С применением рутинного метода могут быть выбраны фармацевтически приемлемые носители, подходящие для данного способа введения и обеспечивающие растворимость и/или стабильность композиций анти-ББ-6 антитела, его фрагмента или варианта, как хорошо известно специалистам или как описано в настоящей заявке.
Фармацевтическими эксципиентами и добавками, которые могут быть использованы в композиции согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, белки, пептиды, аминокислоты, липиды и углеводы (например, сахара, включая моносахариды, ди-, три-, тетра- и олигосахариды; дериватизированные сахара, такие как альдиты, альдоновые кислоты, этерифицированные сахара и т.п., и полисахариды или полимеры сахаров), которые могут присутствовать отдельно или в комбинации друг с другом и составляют 1-99,99% по массе или объему композиции. Репрезентативными белковыми эксципиентами являются сывороточный альбумин, такой как альбумин человеческой сыворотки (НБА), рекомбинантный человеческий альбумин (гНА), желатин, казеин и т.п. Репрезентативными аминокислотами/компонентами, которые могут также обладать забуферивающей способностью, являются аланин, глицин, аргинин, бетаин, гистидин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, цистеин, лизин, лейцин, изолейцин, валин, метионин, фенилаланин, аспартам и т.п. Одной из предпочтительных аминокислот является глицин.
Углеводными эксципиентами, подходящими для использования в настоящем изобретении, являются, например, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, Ό-манноза, сорбоза и т.п.; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и т.п.; полисахариды, такие как раффиноза, мелезитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и т.п.; и альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит-сорбит (глюцит), миоинозит и т.п. Предпочтительными углеводными эксципи
- 26 015262 ентами, используемыми в настоящем изобретении, являются маннит, трегалоза и раффиноза.
Композиции, содержащие анти-1Ь-6 антитело, могут также включать буфер или рН-корректирующий агент, при этом типичным буфером является соль, полученная из органической кислоты или органического основания. Репрезентативными буферами являются соли органических кислот, такие как соли лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюконовой кислоты, угольной кислоты, винной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты или фталевой кислоты; трис, гидрохлорид трометамина или фосфатные буферы. Предпочтительными буферами, используемыми в композициях согласно изобретению, являются соли органических кислот, такие как цитрат.
Кроме того, композиции, содержащие анти-1Ь-6 антитело согласно изобретению, могут включать полимерные эксципиенты/добавки, такие как поливинилпирролидоны, фиколлы (полимерный сахар), декстраты (например, циклодекстрины, такие как 2-гидроксипропил-в-циклодекстрин), полиэтиленгликоли, ароматизаторы, противомикробные средства, подсластители, антиоксиданты, антистатики, поверхностно-активные вещества (например, полисорбаты, такие как твин 20 и твин 80), липиды (например, фосфолипиды, жирные кислоты), стероиды (например, холестерин) и хелатообразующие агенты (например, ЕЭТА).
Эти и другие известные фармацевтические эксципиенты и/или добавки, подходящие для использования в композициях, содержащих анти-1Ь-6 антитело согласно изобретению, его часть или вариант, известны специалистам и описаны, например, в руководствах КеттДоп: ТНе 8с1епсе & Ргасбсе оГ РНагтасу, 19'1' еб., АННапъ & АПЕатк, (1995) и РНуышап'к Эекк КеГегепсе, 52пб еб., Меб1са1 Есопоткк, Моп!уа1е, N1 (1998), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Предпочтительными носителями или эксципиентами являются углеводы (например, сахариды и альдиты) и буферы (например, цитрат) или полимерные агенты. Репрезентативной молекулой-носителем является мукополисахарид, гиалуроновая кислота, который может быть использован для внутрисуставного введения.
Составы
Как указано выше, настоящее изобретение относится к стабильным составам, которые могут предпочтительно включать фосфатный буфер, содержащий физиологический раствор или выбранную соль, а также, но необязательно, растворы-консерванты, и композиции, содержащие консерванты, а также к составам с длительным сроком хранения для многократного приема, пригодным для применения в медицине или ветеринарии и содержащим по меньшей мере одно анти-1Ь-6 антитело в фармацевтически приемлемой композиции. Составы с длительным сроком хранения содержат по меньшей мере один известный консервант или, но необязательно, консервант, выбранный из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, нитрита фенилртути, феноксиэтанола, формальдегида, хлорбутанола, хлорида магния (например, гексагидрата), алкилпарабена (метил-, этил-, пропил-, бутилпарабена и т.п.), хлорида бензалкония, хлорида бензэтония, дегидроацетата натрия и тимерозала, полимеров или их смесей в водном разбавителе. Как очевидно специалистам, может быть использована любая подходящая концентрация или смесь, составляющая примерно 0,001-5% или любой промежуточный интервал концентраций или любая концентрация в таком интервале или дробная концентрация. Неограничивающими примерами могут служить, но не ограничиваются ими: композиции, в которых консервант отсутствует, и композиции, содержащие примерно 0,1-2% м-крезола (например, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), примерно 0,1-3% бензилового спирта (например, 0,5, 0,9, 1,1,, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), примерно 0,001-0,5% тимерозала (например, 0,005, 0,01), примерно 0,001-2,0% фенола (например, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0% алкилпарабена(ов) (например, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%) и т.п.
Как указано выше, настоящее изобретение относится к промышленному изделию, содержащему упаковочный материал и по меньшей мере один сосуд, содержащий раствор по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела с описанными ранее буферами и/или консервантами, необязательно, в водном разбавителе, где указанный упаковочный материал имеет этикетку, в которой указано, что данный раствор может храниться в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 ч или более. Настоящее изобретение также относится к промышленному изделию, включающему упаковочный материал, первый сосуд, содержащий по меньшей мере одно лиофилизованное анти-1Ь-6 антитело, и второй сосуд, содержащий водный растворитель описанного ранее буфера или консерванта, где указанный упаковочный материал имеет этикетку, в которой приводится инструкция для пациента по разведению по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела в данном водном разбавителе для получения раствора, который может храниться в течение двадцати четырех часов или более.
По меньшей мере одно анти-1Ь-6 антитело, используемое в соответствии с настоящим изобретением, может быть продуцировано рекомбинантными методами с использованием клеток млекопитающих или трансгенных составов, либо оно может быть выделено из других биологических источников, описанных в настоящей заявке или известных специалистам.
Интервал количеств по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела в продукте согласно изобретению включает количества, полученные после их разведения, если они присутствуют в виде жидкой/сухой смеси, в концентрации примерно от 1,0 мкг/мл до 1000 мг/мл, хотя могут быть использованы более низкие и более высокие концентрации в зависимости от носителя, используемого для доставки; так, напри
- 27 015262 мер, жидкие составы в виде пластыря для чрескожного введения, составы для внутрилегочного введения, составы для введения через слизистую или составы для введения с помощью осмотического насоса или микронасоса будут отличаться по своей концентрации.
Предпочтительно водный разбавитель может дополнительно содержать, но необязательно, фармацевтически приемлемый консервант. Предпочтительными консервантами являются консерванты, выбранные из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метил-, этил-, пропил-, бутилпарабена и т.п.), хлорида бензалкония, хлорида бензэтония, дегидроацетата натрия и тимерозала или их смесей. Концентрация консерванта, используемого в составе, представляет собой концентрацию, достаточную для достижения противомикробного эффекта. Такие концентрации зависят от выбранного консерванта и могут быть легко определены средним специалистом в данной области.
В указанный разбавитель, необязательно, но предпочтительно, могут быть добавлены и другие эксципиенты, например вещества, придающие изотоничность, буферы, антиоксиданты и усилители консервантов. Вещество, придающее изотоничность, такое как глицерин, обычно используется в известных концентрациях. Физиологически приемлемый буфер предпочтительно добавляют для регуляции рН. Эти составы могут иметь рН в широком диапазоне, например приблизительно рН 4-10, предпочтительно примерно рН 5-9, а наиболее предпочтительно примерно 6,0-8,0. Предпочтительные составы согласно изобретению имеют рН примерно 6,8-7,8. Предпочтительными буферами являются фосфатные буферы, а наиболее предпочтительным - натрийфосфатный буфер, а в частности забуференный фосфатом физиологический раствор (РВ8).
Для снижения степени агрегации в указанные составы или композиции могут быть, но необязательно, добавлены и другие добавки, такие как фармацевтически приемлемые солюбилизиаторы, например твин 20 (полиоксиэтилированный (20) сорбитанмонолаурат), твин 40 (полиоксиэтилированный (20) сорбитанмонопальмитат), твин 80 (полиоксиэтилированный (20) сорбитанмонолеат), плюроник Р68 (блоксополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена) и ПЭГ (полиэтиленгликоль) или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат 20 или 80 или полоксамер 184 или 188, полиолы плюроники®, другие блок-сополимеры и хелатообразующие агенты, такие как БЭТА и ЕСТА. Такие добавки являются особенно подходящими в том случае, если для введения состава используется насос или пластиковый контейнер. Присутствие фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества снижает степень вероятности агрегации белка.
Составы согласно изобретению могут быть получены способом, включающим смешивание по меньшей мере одного анти-[Е-6 антитела с консервантом, выбранным из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метил-, этил-, пропил-, бутилпарабена и т.п.), хлорида бензалкония, хлорида бензэтония, дегидроацетата натрия и тимерозала или их смесей в водном разбавителе. Смешивание по меньшей мере одного анти-I^-6 антитела с консервантом в водном разбавителе осуществляют в соответствии со стандартными процедурами растворения и смешивания. Так, например, для получения подходящего состава измеренное количество по меньшей мере одного 34™-^-/) антитела в забуференном растворе объединяют с нужным консервантом в забуференном растворе в количестве, достаточном для получения нужных концентраций белка и консерванта. Варианты такого способа известны среднему специалисту в данной области. Так, например, порядок добавления компонентов, независимо от используемых добавок, температура и рН, при которых приготавливают данный состав, являются факторами, которые могут быть оптимизированы для получения нужной концентрации в соответствии с выбранным способом введения.
Заявленные составы могут поставляться пациентам в виде чистых растворов или в виде составов с двумя сосудами, где один сосуд включает лиофилизованное по меньшей мере одно 3^^-^-6 антитело, которое разводят содержимым второго сосуда, включающего воду, консервант и/или наполнители, а предпочтительно фосфатный буфер и/или физиологический раствор и выбранную соль в водном разбавителе. Состав, содержащий готовый раствор в одном сосуде, или состав, содержащий два сосуда, один из которых необходим для разведения содержимого другого сосуда, может быть использован несколько раз и может быть достаточным для проведения одного или нескольких курсов лечения пациента, а поэтому такой состав может оказаться более удобным для проведения курса лечения, чем современные составы.
Заявленные в настоящем изобретении промышленные изделия могут быть использованы для немедленного введения лекарственного средства или для его введения в течение двадцати четырех часов или более. В соответствии с этим заявленные в настоящем изобретении промышленные изделия имеют значительные преимущества для пациента. Составы согласно изобретению могут, но необязательно, храниться при температурах примерно от 2 до 40°С и сохраняют биологическую активность белка в течение продолжительного периода времени, а поэтому на этикетке, приклеенной к упаковке, должно быть указано, что данный раствор может храниться и/или может быть использован в течение 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 или 96 ч или более. Если используется разбавитель с консервантом, то на такой этикетке может быть указано, что состав годен к применению в течение по меньшей мере 1-12 месяцев, полугода, полутора лет и/или двух лет.
- 28 015262
Растворы по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела согласно изобретению могут быть получены способом, включающим смешивание по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела в водном разбавителе. Смешивание осуществляют в соответствии со стандартными процедурами, обычно применяемыми для растворения и смешивания. Так, например, для получения подходящего разбавителя измеряемое количество по меньшей мере одного антитела в воде или буфере объединяют с количеством, достаточным для получения нужных концентраций белка и, необязательно, консерванта или буфера. Варианты такого способа известны среднему специалисту в данной области. Так, например, порядок добавления компонентов независимо от используемых добавок, температура и рН, при которых приготавливают данный состав, являются факторами, которые могут быть оптимизированы для достижения нужной концентрации в соответствии с выбранным способом введения.
Заявленные продукты могут поставляться пациентам в виде чистых растворов или в виде состава с двумя сосудами, содержащими один сосуд, включающий лиофилизованное по меньшей мере одно анти1Ь-6 антитело, которое разводят содержимым второго сосуда, включающего водный разбавитель. Состав, содержащий готовый раствор в одном сосуде, или состав, содержащий два сосуда, один из которых необходим для разведения содержимого первого сосуда, может быть использован несколько раз и может быть достаточным для проведения одного или нескольких курсов лечения пациента, а поэтому такой состав может оказаться более удобным для проведения курса лечения, чем стандартные современные составы.
Заявленные продукты могут поставляться пациентам через аптеки, клиники или другие организации, такие как институты и фабрики, в виде готовых растворов или составов с двумя сосудами, содержащими один сосуд, включающий лиофилизованное по меньшей мере одно анти-1Ь-6 антитело, которое разводят содержимым второго сосуда, включающего водный разбавитель. В данном случае чистый раствор может быть получен в большом резервуаре объемом в один литр или даже в большем объеме, из которого могут быть взяты один или несколько раз небольшие порции по меньшей мере одного раствора антитела и расфасованы в более мелкие сосуды, для поставки в аптеки или клиники, а затем заказчикам и/или пациентам.
Известными устройствами, включающими такие системы в виде одного сосуда, являются инжекторы типа писчего пера для введения раствора, такие как ВИ Реик, ВИ Аи!о_)ес!ог®, Нцта_)ес!®, ИоуоРеи®, В-Э®Реи, Аи!оРеи® и ОрйРеи®, Се^Лор^еи®, 6еио!гоиогт Реи®, Нцтайо Реи®, ВесоРеи®, ВоГегои Реи®, Вю_)ес!ог®, Цес!®, безыгольный инжектор с 1-наконечником (1-йр Иееб1е-Ргее 1и)ес!ог®), 1и!га_)ес!®, МебМес!®, например, изготовленные или разработанные Вес!ои Июкеикеи (Ргаикби Ьакек, N1, ууу.Ьес!оибюкеикои.сот), Пйейошс (ВигдбогГ, ^й/епаиб, ууу.б18е!готс.сот); Вю)ес!, Рой1аиб, Огедои (ууу.Ью)ес!.сот); Иа1юиа1 Мебюа! Ргобис!к, Аек!ои Мебюа1 (Ре!егЬогоидй, ИК, ууу.уек!ои-тебюа1.сот), МебШес! Согр (Мхииеаройк, МИ, ууу, тебуес!.сот), и аналогичные подходящие устройства. Известными устройствами, включающими такие системы с двумя сосудами, являются системы инжекторов типа писчего пера, таких как НцтайоРеи®, предназначенные для разведения лиофилизованного лекарственного средства в картридже для доставки разведенного раствора. Примерами других подходящих устройств являются готовые к использованию шприцы, автоматические инжекторы, безыгольные инжекторы и наборы безыгольных шприцов для внутривенного вливания.
Продукты, заявленные в настоящем изобретении, включают упаковочный материал. Этот упаковочный материал, помимо информации, требуемой регуляторными органами, включает описание условий, при которых может быть использован данный продукт. В соответствии с настоящим изобретением в случае состава с двумя сосудами, содержащего продукт в виде раствора/порошка, такой упаковочный материал включает инструкции для пациента по разведению по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела в водном разбавителе для получения раствора и его использования в течение 2-24 ч или более. В случае одного состава с одним сосудом, то есть продукта в виде раствора, на этикетке должно быть указано, что такой раствор может быть использован в течение 2-24 ч или более. Продукты, заявленные в настоящем изобретении, являются эффективными фармацевтическими продуктами для введения человеку.
Составы согласно изобретению могут быть получены способом, включающим смешивание по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела и выбранного буфера, а предпочтительно фосфатного буфера, содержащего физиологический раствор или выбранную соль. Смешивание по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела в водном разбавителе осуществляют в соответствии со стандартными процедурами растворения и смешивания. Так, например, для получения подходящего состава измеряемое количество по меньшей мере одного антитела в воде или буфере объединяют с нужным забуферивающим агентом в воде в количестве, достаточном для получения нужных концентраций белка и буфера. Варианты такого способа известны специалисту в данной области. Так, например, порядок добавления компонентов независимо от используемых добавок, температура и рН, при которых приготавливают данный состав, являются факторами, которые могут быть оптимизированы для достижения нужной концентрации в соответствии с выбранным способом введения.
Заявленные стабильные составы или составы с консервантами могут поставляться пациентам в виде чистых растворов или в виде состава с двумя сосудами, содержащего один сосуд, включающий лиофили
- 29 015262 зованное по меньшей мере одно анти-ГЬ-б антитело, которое разводят содержимым второго сосуда, включающего консервант или буфер и наполнители в водном разбавителе. Состав с одним сосудом, содержащим один раствор, или состав с двумя сосудами, один из которых необходим для разведения содержимого первого сосуда, может быть использован несколько раз и может быть достаточным для проведения одного или нескольких курсов лечения пациента, а поэтому такой состав может оказаться более удобным для проведения курса лечения, чем стандартные современные составы.
В других композициях или методах стабилизации анти-ГЬ-б антитела может быть приготовлено в виде непрозрачного раствора лиофилизованного порошка, содержащего антитело. Такими непрозрачными растворами являются составы, содержащие суспензии частиц, где указанные частицы представляют собой композицию, содержащую анти-ГЬ-б антитело в структурах различных размеров, известных под разными названиями, такими как микросферы, микрочастицы, наночастицы, наносферы или липосомы. Такие относительно гомогенные составы, состоящие, в основном, из сферических частиц и содержащие активное вещество, могут быть получены путем контактирования водной фазы, содержащей активное вещество и полимер, с безводной фазой и последующим выпариванием безводной фазы, в результате чего происходит слияние частиц водной фазы, как описано в патенте США № 4589330. Пористые микрочастицы могут быть получены с использованием первой фазы, содержащей активное вещество и полимер, диспергированный в непрерывной фазе растворителя, с последующим удалением указанного растворителя из суспензии путем лиофилизации или разведения-экстракции-преципитации, как описано в патенте США 4818542. Предпочтительными полимерами для получения таких составов являются природные или синтетические сополимеры или полимеры, выбранные из группы, состоящей из желатинового агара, крахмала, арабиногалактана, альбумина, коллагена, полигликолевой кислоты, полимолочной кислоты, гликолид-Ь(-)лактида, поли(эпсилон-капролактона), поли(эпсилон-капролактон-СО-молочной кислоты), поли(эпсилон-капролактон-СО-гликолевой кислоты), полиф-гидроксимасляной кислоты), полиэтиленоксида, полиэтилена, поли(алкил-2-цианоакрилата), поли(гидроксиэтилметакрилата), полиамидов, полиаминокислот, поли(2-гидроксиэтил-ЭЬ-аспартамида), полиэфира мочевины, поли(Ь-фенилаланина/этиленгликоля/1,б-диизоцианатогексана) и поли(метилметакрилата). Особенно предпочтительными полимерами являются полиэфиры, такие как полигликолевая кислота, полимолочная кислота, гликолид-Ь(-)лактид, поли(эпсилонкапролактон), поли(эпсилонкапролактон-СО-молочная кислота) и поли(эпсилонкапролактон-СО-гликолевая кислота).
Растворителями, которые могут быть использованы для растворения полимера и/или активного вещества, являются вода, гексафторизопропанол, метиленхлорид, тетрагидрофуран, гексан, бензол или сесквигидрат гексафторацетона. Способ диспергирования фазы, содержащей активное вещество, во второй фазе может включать подачу под давлением указанной первой фазы через отверстие сопла для предотвращения образования капель.
Композиции в виде сухого порошка могут быть получены не путем лиофилизации, а другими способами, такими как сушка распылением или экстракция растворителем путем выпаривания или осаждения кристаллической композиции с последующим проведением одной или нескольких стадий удаления водного или безводного растворителя. Получение состава антитела путем сушки распылением описано в патенте США б0199б8. Антителосодержащие композиции в виде сухого порошка могут быть получены путем сушки распылением растворов или взвесей антитела и, необязательно, эксципиентов в растворителе в условиях, применяемых для получения сухого порошка для вдыхания. Растворителями могут быть полярные соединения, такие как вода и этанол, которые могут быть легко осушены. Стабильность антитела может быть повышена путем проведения процедур сушки распылением в отсутствии кислорода, например в потоке азота или с использованием азота в качестве осушающего газа. Другим относительно сухим составом является дисперсия, состоящая из множества перфорированных микроструктур, диспергированных в суспензионной среде, которая обычно содержит гидрофторалкановый пропеллент, описанный в АО 991б419. Стабилизированные дисперсии могут быть введены в легкие пациента с помощью ингалятора с дозирующим клапаном. Оборудование, подходящее для промышленного изготовления лекарственных составов, полученных путем сушки распылением, производится компаниями ВисЫ Ь1б. или Νίτο Согр.
По меньшей мере одно анти-ГЬ-б антитело, присутствующее в описанных здесь стабильных составах или растворах либо в составах или растворах с длительным сроком хранения, может быть введено пациенту в соответствии с настоящим изобретением различными методами доставки, включая к.с. или 1.т. инъекцию; а также чрескожное введение, внутрилегочное введение, введение через слизистую, введение с помощью имплантата, осмотического насоса, картриджа и микронасоса или другими методами, хорошо известными специалистам.
Терапевтические применения
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного ГЬ-б-ассоциировнного заболевания клетки, ткани, органа и организма животного или человека, как известно специалистам или как описано в настоящей заявке, с использованием по меньшей мере одного анти-ГЬ-б антитела согласно изобретению, например, путем введения терапевтически эффективного количества анти-ГЬ-б антитела в клетку, ткань, орган и организм животного или человека или контактиро
- 30 015262 вания указанного терапевтического эффективного количества ημη-ΙΕ-6 антитела с указанными клеткой, тканью, органом и организмом животного или человека. Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного ΙΕ-6-ассоциировнного заболевания клетки, ткани, органа и организма животного или человека, включая, но не ограничиваясь ими, по меньшей мере одно из таких заболеваний как ожирение, иммуноассоциированное заболевание, сердечно-сосудистое заболевание, инфекционное заболевание, злокачественное заболевание или нервное заболевание.
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного ΙΕ-6-иммуноассоциированного заболевания клетки, ткани, органа и организма животного или человека, включая, но не ограничиваясь ими, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, внезапно начавшийся системный ювенильный ревматоидный артрит, псориазный артрит, анкилозирующий спондилит, язву желудка, серонегативные артротопатии, остеоартрит, остеолиз, асептическое отторжение ортопедических имплантатов, воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, системную красную волчанку, кожную красную волчанку, волчаночный нефрит, антифосфолипидный синдром, иридоциклит/увеит/неврит зрительного нерва, идиопатический фиброз легких, системный васкулит/гранулематоз Вегенера, саркоидоз, орхит/повреждение, связанное с операцией по реверсивной вазоэктомии, аллергические/атопические заболевания, астму, аллергический ринит, экзему, аллергический контактный дерматит, аллергический конъюнктивит, аллергический пневмонит, трансплантаты, отторжение трансплантированного органа, реакцию трансплантат против хозяина, синдром системного воспалительного ответа, септический синдром, сепсис, вызванный грамположительными бактериями; сепсис, вызванный грамотрицательными бактериями, сепсис неинфекционного генеза, грибковый сепсис, нейтропеническую лихорадку, уросепсис, менингококцемию, травму/геморрагию, ожоги, облучение ионизирующим излучением, острый панкреатит, респираторный дистресс-синдром взрослых, ревматоидный артрит, алкогольный гепатит, хронические воспалительные патологии, саркоидоз, болезнь Крона, серповидно-клеточную анемию, диабет, нефроз, атопические заболевания, реакцию гиперчувствительности, аллергический ринит, сенную лихорадку, хронический ринит, конъюнктивит, эндометриоз, астму, крапивницу, системную анафилаксию, дерматиты, пернициозную анемию, гемолитическую болезнь, тромбоцитопению, отторжение любого трансплантированного органа или ткани, отторжение трансплантированной почки, отторжение трансплантированного сердца, отторжение трансплантированной печени, отторжение трансплантированной поджелудочной железы, отторжение трансплантированного легкого, отторжение транспланта костного мозга (ВМТ), отторжение аллотрансплантата кожи, отторжение хрящевого трансплантата, отторжение костного трансплантата, отторжение трансплантата тонкого кишечника, отторжение имплантата тимуса плода, отторжение трансплантата паращитовидной железы, отторжение ксенотрансплантата любого органа или ткани, отторжение аллотрансплантата, антирецепторные реакции гиперчувствительности, болезнь Грейвса, болезнь Рейно, инсулинрезистентный диабет типа В, астму, тяжелую миастению, опосредуемую антителом цитотоксичность, реакции гиперчувствительности типа ΙΙΙ, синдром Р0ЕМ8 (полинейропатию, органомегалию, эндокринопатию, гаммапатию, ассоциированную с дефицитом моноклональных антител, и синдром изменения кожи), полинейропатию, органомегалию, эндокринопатию, гаммапатию, ассоциированную с дефицитом моноклональных антител, и синдром изменения кожи, антифосфолипидный синдром, пузырчатку, склеродермию, смешанное заболевание соединительной ткани, идиопатическую болезнь Адиссона, сахарный диабет, хронический активный гепатит, первичный биллиарный цирроз, витилиго, васкулит, пост-МГкардиотомный синдром, гиперчувствительность типа Ιν, контактный дерматит, аллергический пневмонит, отторжение аллотрансплантата, гранулемы, вызываемые внутриклеточными микроорганизмами, чувствительность к лекарственным средствам, метаболическую/идиопатическую болезнь, болезнь Вильсона, гемахроматоз, дефицит альфа1-антитрипсина, диабетическую ретинопатию, тиреоидит Хашимото, остеопороз, нарушение системы гипоталамус-гипофиз-надпочечники, первичный билиарный цирроз, тиреоидит, энцефаломиелит, кахексию, кистозный фиброз, хроническое заболевание легких у новорожденных, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), наследственный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз, кожные заболевания, псориаз, алопецию, нефротический синдром, нефрит, гломерулярный нефрит, острую почечную недостаточность, гемодиализ, уремию, токсикоз, преэкламсию, нарушения, вызываемые ок!3-терапией, анти-сб3-терапией, цитокиновой терапией, химиотерапией и лучевой терапией (например, включая, но не ограничиваясь ими, астению, анемию, кахексию и т.п.), хроническую интоксикацию салицилатами и т.п. См., например, руководства Мегск Мапиа1, 12!й-17!й Ебйюпк, Мегск & Сотрапу, Вайгау, N1 (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), РйагтасоШегару НапбЬоок, \Уе115 е! а1., еб§., 8есопб Ебйюп, Арр1е!оп апб Ьапде, 8!атГогб, Сопп. (1998, 2000), каждое из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного сердечно-сосудистого заболевания клетки, ткани, органа и организма животного или человека, включая, но не ограничиваясь ими, по меньшей мере, синдром остановки сердца, инфаркт миокарда, застойную сердечную недостаточность, инсульт, ишемический инсульт, геморрагию, острый коронарный синдром, артериосклероз, атеросклероз, рестеноз, диабетическое атеросклеротическое заболевание, гипертензию, артериальную гипертензию, почечно-сосудистую гипертензию, обморок, шок, сифилис сердеч
- 31 015262 но-сосудистой системы, сердечную недостаточность, легочное сердце, первичную легочную гипертензию, сердечные аритмии, предсердные эктопические экстрасистолы, трепетание предсердий, фибрилляцию предсердий (устойчивую или пароксизмальную), постперфузионный синдром, воспалительный ответ на кардиопульмональное шунтирование, хаотическую или многоочаговую тахикардию предсердий, повторяющуюся тахикардию с выраженным сужением бВ8-комплекса, характерные аритмии, фибрилляцию желудочков, аритмию пучка Гиса, атриовентрикулярную блокаду, блокаду ножки пучка Гиса, ишемические нарушения миокарда, ишемическую болезнь сердца, стенокардию, инфаркт миокарда, кардиомиопатию, застойную кардиомиопатию, рестриктивную кардиомиопатию, порок клапана сердца, эндокардит, перикардит, опухоли сердца, аневризму аорты и периферической артерии, расслаивающую аневризму аорты, воспаление аорты, окклюзию брюшного отдела аорты и ее ветвей, заболевания периферических сосудов, окклюзивные заболевания артерий, атеросклероз периферических сосудов, облитерирующий тромбоангиит, функциональные расстройства периферических артерий, синдром и болезнь Рейно, акроцианоз, эритромелалгию, заболевания вен, тромбоз вен, варикозные вены, артериовенозные фистулы, лимфедему, жировой отек, нестабильную стенокардию, реперфузионные повреждения, постгемодиализный синдром, постишемическое реперфузионное повреждение и т.п. Такой способ может, но необязательно, включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-1Ь-6 антитело, в клетку, ткань, орган и организм животного или человека, нуждающихся в такой модуляции, лечении или терапии.
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного 1Ь-6-ассоциированного инфекционного заболевания клетки, ткани, органа и организма животного или человека, включая, но не ограничиваясь ими, по меньшей мере одно из таких заболеваний, как острая или хроническая бактериальная инфекция, острые и хронические паразитарные инфекции или инфекционные процессы, включая бактериальные, вирусные и грибковые инфекции, ВИЧ-инфекции/ВИЧневропатию, менингит, гепатит (например, А, В, С или т.п.), септический артрит, перитонит, пневмонию, эпиглоттит, инфекцию, вызываемую Е.сой 0157:й7, гемолитический уремический синдром/тромболитическую тромбоцитопеническую пурпуру, малярию, геморрагическую лихорадку Денге, лейшманиоз, лепру, синдром токсического шока, стрептококковый миозит, газовую гангрену, заболевание, вызываемое бактерией МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к, внутриклеточную инфекцию, вызываемую МусоЬас1егшт аушт, пневмонию, вызываемую Рпеитосусйк саппи, воспаление тазовых органов, орхит/эпидидимит, болезнь, вызываемую бактерией Ьедюпе11а, болезнь Лайма, грипп А, заболевание, вызываемое вирусом Эпштейна-Барра, вирусный гемафагоцитарный синдром, вирусный энцефалит/асептический менингит и т. п.
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного 1Ь-6-ассоциированного злокачественного заболевания клетки, ткани, органа и организма животного или человека, включая, но не ограничиваясь ими, по меньшей мере одно из таких заболеваний, как лейкоз, острый лейкоз, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), острый лимфоцитарный лейкоз, В-клеточный, Т-клеточный лейкоз или ЕАВ-ОЛЛ (по франко-американо-британской классификации лейкозов, ЕАВ), острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), острый миелогенный лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз (ХМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), ретикулоэндотелиоз, миелодисплазия (МД), лимфома, болезнь Ходжкина, злокачественная лимфома, не-ходжкинская лимфома, лимфома Беркитта, множественная миелома, саркома Капоши, карцинома ободочной кишки, карцинома поджелудочной железы, карцинома носоглотки, злокачественный гистиоцитоз, паранеопластический синдром/гиперкальцемия при злокачественных опухолях, солидные опухоли, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак эндометрия, рак головы и шеи, наследственный неполипоидный рак, ходжкинская лимфома, рак печени, рак легких, немелкоклеточный рак легких, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, почечно-клеточная карцинома, рак яичек, аденокарцинома, саркома, злокачественная меланома, гемангиома, метастазы, рак, ассоциированный с резорбцией кости, рак, ассоциированный с болями в кости и т. п.
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного 1Ь-6-ассоциированного нервного заболевания клетки, ткани, органа, организма животного или человека, включая, но не ограничиваясь ими, по меньшей мере одно из таких заболеваний, как нейродегенеративные заболевания; рассеянный склероз; мигрень; деменция, вызываемая СПИД-ассоциированным комплексом; демиелинизирующие заболевания, такие как рассеянный склероз и острый поперечный миелит; экстрапирамидные и церебеллярные расстройства, такие как поражение корково-спинномозговой системы; расстройства базальных ядер; гиперкинетические расстройства, такие как хорея Гентингтона и сенильная хорея; дискинезии, вызываемые употреблением лекарственных средств, например дискенизии, индуцируемые лекарственными средствами, блокирующими допаминовые рецепторы ЦНС; гипокинетические расстройства, такие как болезнь Паркинсона; прогрессирующий надъядерный паралич; структурные поражения мозжечка; дегенерации спинного мозга и мозжечка, такие как атаксия спинного мозга, атаксия Фридрейха, церебеллярные кортикальные дегенерации; множественные системные дегенерации (болезнь Менцеля, болезнь Дежерина-Томаса, синдром Шая-Дрейджера и болезнь Мачадо-Джозефа); системные расстройства (болезнь Рефсума, абеталипопротеинемия, атаксия, телангиэк
- 32 015262 тазия и митохондриальные общие системные расстройства); демиенилизирующие повреждения коры головного мозга, такие как рассеянный склероз, острый поперечный миелит; и болезни, связанные с поражением мотонейронов, такие как нейрогенные атрофии мышц (дегенерация ороговевших клеток передней доли гипофиза, такая как боковой амиотрофический склероз, детская атрофия мышц спинного мозга и ювенильная атрофия мышц спинного мозга), болезнь Альцгеймера, синдром Дауна среднего возраста; болезнь диффузных телец Леви; сенильная деменция, ассоциированная с болезнью диффузных телец Леви, синдром Вернике-Корсакова; хронический алкоголизм; болезнь Крейцфельда-Якоба; подострый склерозирующий панэнцефалит; болезнь Галлервордена-Шпаца; деменция боксеров; нейротравматическое повреждение (например, повреждение спинного мозга, повреждение головного мозга, сотрясение органов и повторное сотрясение органов); боли; воспалительные боли; аутизм; депрессия; инсульт; нарушение познавательной способности; эпилепсия и т.п. Такой способ может, но необязательно, включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-'ΓΝΕ антитело или его конкретную часть или вариант, в клетку, ткань, орган и организм животного или человека, нуждающихся в такой модуляции, лечении или терапии (см., например, Мегск Мапиа1, 1611' Ебйюп, Мегск & Сотрапу, Какгау, N1 (1992)).
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одной 1Ь-6-ассоциированной раны, травмы или поражения ткани или ассоциированного с ними хронического состояния клетки, ткани, органа и организма животного или человека, включая, но не ограничиваясь ими, по меньшей мере одно из телесных повреждений или травм, ассоциированных с хирургической операцией на органах ротовой полости, включая периодонтальную хирургию, удаление зуба (зубов), лечение пульпита, установку зубных протезов, протезирование и использование зубных протезов; где указанная рана выбрана из группы, состоящей из асептических ран, ран от ушибов, резаных ран, рваных ран, непроникающих ран, открытых ран, проникающих ран, сквозных ран, колотых ран, септических ран, ран после инфарктов и подкожных ран; или где указанная рана выбрана из группы, состоящей из ишемических язв, пролежней, фистул, глубоких укусов, тепловых ожогов и ран на донорских участках (при аутотрансплантации); или где указанной раной является афтозная рана, травматическая рана или рана, ассоциированная с герпесом.
Раны и/или язвы обычно возникают на коже или на поверхности слизистой, или в результате инфаркта органа (инсульта). Рана может образовываться в результате дефектов или поражения мягких тканей или ассоциированных с ними состояний. В контексте настоящего описания термин кожа означает внешнюю поверхность тела животного, включая человека, и охватывает неповрежденную или почти неповрежденную поверхность кожи, а также поврежденную поверхность кожи. Термин слизистая означает неповрежденную или поврежденную слизистую животного, такого как человек, и такой, слизистой может быть слизистая ротовой полости, щеки, уха, носа, легких, глаз, желудочно-кишечного тракта, влагалища или прямой кишки.
В контексте настоящего описания термин рана означает телесное повреждение с нарушением нормальной целостности тканевых структур. Этот термин также охватывает термины рана на коже, поражение, некроз и язва. Обычно термин рана на коже является самым распространенным термином, который означает почти любое поражение кожи или слизистых оболочек, а термин язва означает местное поражение или образование полости на поверхности органа или ткани, которая возникает в результате отторжения некротизированной ткани. Термин поражение обычно означает любой дефект ткани. Термин некроз означает омертвление ткани в результате инфекции, повреждения, воспаления или инфаркта.
Термин рана, используемый в контексте настоящего описания, означает любую рану (см. ниже классификацию ран) и любую конкретную стадию в процессе заживления ран, включая стадию до начала заживления возникшей раны или даже до возникновения раны, вызванной хирургическим вмешательством (профилактическим лечением). Примерами ран, которые могут быть предупреждены и/или устранены в соответствии с настоящим изобретением, являются асептические раны, раны от ушибов, резаные раны, рваные раны, непроникающие раны (то есть раны, при которых не происходит повреждения кожи, но образуются поражения подлежащих структур), открытые раны, проникающие раны, сквозные раны, колотые раны, септические раны, подкожные раны и т. п. Примерами ран на коже являются пролежни, афтозный стоматит, дисхромия кожи, пузырьковый лишай, компрессионная атрофия кожи и т. п. Примерами язв являются, например, пептическая язва, язва двенадцатиперстной кишки, язва желудка, подагрическая язва, диабетическая язва, язва, вызванная гипертензивной ишемией, варикозная язва, язва голени (венозная язва), подъязычная язва, подслизистая язва, симптоматическая язва, трофическая язва, тропическая язва и мягкий шанкр, например, вызываемый гонореей (включая уретрит, эндоцервицит и проктит). Состояниями, ассоциированными с ранами или повреждениями кожи, которые могут быть вылечены способами согласно настоящему изобретению, являются ожоги, сибирская язва, столбняк, газовая гангрена, скарлатина, ползучая эритема (рожа), сикоз в области бороды, фолликулит, контагиозное импетиго или буллезное импетиго и т.п. Термины рана и язва, а также рана и поражение кожи часто используются как синонимы, и, кроме того, эти термины часто используются произвольно. Поэтому, как упоминалось выше, в контексте настоящего описания, термин рана также охватывает термины язва,
- 33 015262 повреждение, поражение кожи и инфаркт, и эти термины являются взаимозаменяемыми, если это не оговорено особо.
Ранами, подвергаемыми лечению способами согласно настоящему изобретению, являются также раны таких типов, как (1) раны общего характера, например, такие как хирургические, травматические, инфекционные, ишемические, тепловые, химические и буллезные раны; (ίί) раны, характерные для полости рта, например, такие как раны, образующиеся после удаления зубов, раны пульпы и, в частности, раны, возникающие при удалении кист и абсцессов, язвы и поражения бактериального, вирусного или аутоиммунного происхождения, механические раны, химические раны, тепловые раны, инфекционные раны и лихеноидные раны; при этом конкретными примерами являются герпетические язвы, афтозный стоматит, острый некрозирующий язвенный гингивит и ожоги ротовой полости; и (ш) раны на коже, такие как, например, опухоли, ожоги (например, химические и тепловые), поражения, вызываемые заболеваниями (бактериальными, вирусными, аутоиммунными), укусы и хирургические раны. Другая классификация ран включает (1) незначительные потери ткани, вызываемые хирургическими операциями, небольшими ссадинами и неглубокими укусами, или (ίί) значительные потери ткани. Последняя группа включает ишемические язвы, пролежни, фистулы, рваные раны, глубокие укусы, тепловые ожоги, раны на донорских участках при аутотрансплантации (в мягких и твердых тканях) и инфаркты.
Другими ранами, которые имеют важное значение с точки зрения настоящего изобретения, являются ишемические язвы, пролежни, фистулы, глубокие укусы, тепловые ожоги и раны на донорских участках. Ишемическими язвами и пролежнями являются раны, которые в нормальных условиях заживают обычно очень медленно, и, разумеется, большое значение для пациента имеет, в частности, более эффективное и быстрое заживление раны. Кроме того, при эффективном и более быстром заживлении ран стоимость лечения пациентов, имеющих такие раны, заметно снижается.
Ранами на донорских участках являются раны, которые образуются, например, после удаления твердой ткани из части тела и ее переноса в другую часть тела, например при трансплантации. Раны, возникающие после таких операций, являются очень болезненными, а поэтому их ускоренное заживление является весьма желательным. Термин кожа употребляется здесь в очень широком смысле и охватывает эпидермальный слой кожи, а в тех случаях, когда поверхность кожи является более или менее поврежденной, то он относится также и к дермальному слою кожи. В отличие от рогового слоя эпидермальный слой кожи представляет собой внешний (эпителиальный) слой, а более глубокий слой соединительной ткани называется дермой.
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения остеоартрита, системной красной волчанки, кожной красной волчанки, волчаночного нефрита, сахарного диабета типа 2 и хронической обструктивной болезни легких, а также других заболеваний, перечисленных выше как 1Ь-6ассоциированные заболевания, поражающие клетку, ткань, орган и организм животного или человека, включая, но не ограничиваясь ими, по меньшей мере одно из таких заболеваний, как иммуннное заболевание, сердечно-сосудистое заболевание, инфекционное, злокачественное и/или нервное заболевание. Такой способ может включать, но необязательно, введение эффективного количества по меньшей мере одной композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-1Ь-6 антитело, в клетку, ткань, орган или организм животного или человека, нуждающихся в такой модуляции, лечении или терапии.
Любой способ согласно изобретению может включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-1Ь-6 антитело, в клетку, ткань, орган или организм животного или человека, нуждающихся в такой модуляции, лечении или терапии. Такой способ может также, но необязательно, включать совместное введение или комбинированную терапию для лечения указанных заболеваний или расстройств, где введение указанного по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела или его конкретной части или варианта также предусматривает одновременное введение или введение до и/или после введения по меньшей мере одного средства, выбранного по меньшей мере из таких средств, как антагонист ΤΝΡ (например, такой как, но не ограничивающийся ими, антагонист ΤΝΡ, являющийся химическим соединением или белком, моноклональное или поликлональное антитело или его фрагмент против ΤΝΡ, растворимый рецептор ΤΝΡ (например, р55, р70 или р85) или его фрагмент, гибридные полипептиды или небольшая молекула-антагонист ΤΝΡ, например ΤΝΡ-связывающий белок I или II (ΤΒΡ-Ι или ΤΒΡ-ΙΙ), нерелимонмаб, инфликсимаб, этанерцепт, (ЕпЬге1™), адалимумаб (Нишйа™), СИР-571, СИР-870, афелимомаб, ленерцепт и т.п.), противоревматическое средство (например, метотрексат, ауранофин, ауротиоглюкоза, азатиоприн, тиомалат золотанатрия, сульфат гидроксихлорохина, лефлуномид, сульфазальцин), миорелаксант, наркотическое средство, нестероидное противовоспалительное средство (НСПВС), аналгетик, анестетик, седативное средство, анестетик для местного применения, нейромышечный блокатор, противомикробное средство (например, аминогликозид, противогрибковое средство, средство против паразитов, противовирусное средство, карбапенем, цефалоспорин, фторхинолон, макролид, пенициллин, сульфонамид, тетрациклин и другие противомикробные средства), средство для лечения псориаза, кортикостероид, анаболический стероид, средство для лечения диабета, микроэлементы, натуральное средство, средство для лечения щитовидной железы, витамин, кальций-ассоциированный гормон, средство против диареи, средство против кашля,
- 34 015262 противорвотное средство, средство против язвы, слабительное средство, антикоагулянт, эритропоэтин (например, эпоэтин-альфа), филграстим (например, 6-С8Е, Ыеиродеп), сарграмостим (6М-С8Е, лейкин), средство для иммунизации, иммуноглобулин, иммунодепрессант (например, базиликсимаб, циклоспорин, даклизумаб), гормон роста, средство для гормонзаместительной терапии, модулятор эстрогеновых рецепторов, мидриатическое средство, средство для лечения циклоплегии, алкилирующий агент, антиметаболит, ингибитор митоза, радиофармацевтическое средство, антидепрессант, средство против маниакальной депрессии, антипсихотическое средство, анксиолитическое средство, гипнотическое средство, симпатомиметик, стимулятор, донепезил, такрин, противоастматическое лекарственное средство, бетаагонист, стероид, вводимый путем ингаляции, ингибитор лейкотриена, метилксантин, кромолин, эпинефрин или его аналог, дорназа-альфа (Ри1то/уте), цитокин или антагонист цитокина. Подходящие дозы таких средств хорошо известны специалистам. См., например, руководства Ае11з е! а1., ебз., РЬагтасо!Ьегару НапбЬоок, 2пб Ебйюп, Арр1е!оп апб Ьапде, 8!ат£огб, СТ (2000); РБК РЬагтасорое1а, Тагазсоп Роске! РЬагтасорое1а 2000, Бе1ихе Ебйюп, Тагазсоп РиЬШЫпд, Бота Ьшба, СА (2000); Ыигашд 2001 НапбЬоок о£ Бгидз, 2!’1 ебйюп, ЗргтдЬоизе Согр., ЗргтдЬоизе, РА, 2001; Неа1!Ь РгоЕеззюпаТз Бгид Сшбе 2001, еб., ЗЬаппоп, А1коп, 8!апд, Ргеп!юе-На11, 61с, Иррег Забб1е Кгуег, ΝΙ, каждое из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
Антагонистами ТИР, подходящими для получения композиций, комбинированной терапии, совместного введения и для использования в устройствах или способах согласно настоящему изобретению (также включая по меньшей мере одно антитело, его определенную часть и вариант настоящего изобретения), являются, но не ограничиваются ими, анти-ТМЕ антитела (например, по меньшей мере один антагонист ЮТ, определенный выше), его антигенсвязывающие фрагменты и рецепторные молекулы, которые специфически связываются с ΊΝΕ; соединения, которые предотвращают и/или ингибируют синтез ТХЕ, секрецию ТХЕ или их действие на клетки-мишени, например, такие соединения, как талидомид, тенидап, ингибиторы фосфодиэстеразы (например, пентоксифиллин и ролипам), агонисты аденозинового рецептора А2Ь и стимуляторы аденозинового рецептора А2Ь; соединения, которые предотвращают и/или ингибируют передачу сигнала рецептора ТКЕ, такие как активированные митогеном ингибиторы протеинкиназы (МАР); соединения, которые блокируют и/или ингибируют расщепление мембранного ТНЕ, такие как ингибиторы металлопротеиназы; соединения, которые блокируют и/или ингибируют активность ТНЕ, такие как ингибиторы ангиотензин-конвертирующего фермента (АСЕ) (например, каптоприл); и соединения, которые блокируют и/или ингибируют продуцирование и/или синтез ТНЕ, такие как ингибиторы МАР-киназы.
Используемые здесь термины антитело против фактора некроза опухоли, антитело против ЮТ, антитело против ТНЕа или его фрагмент и т.п. означают антитело, которое снижает, блокирует, ингибирует, отменяет или предотвращает активность ТНЕа т уйго, т зйи и/или предпочтительно ш у1уо. Так, например, подходящее человеческое анти-ТНЕ антитело настоящего изобретения может связываться с ТНЕа, и таким антителом являются анти-ТNΕ антитела, их антигенсвязывающие фрагменты и их конкретные мутанты или домены, которые специфически связываются с ЮТа. Подходящее анти-ТNΕ антитело или его фрагмент могут также снижать, блокировать, отменять, предотвращать, предупреждать и/или ингибировать синтез РНК, ДНК или белка ТNΕ, высвобождение ТNΕ, передачу сигнала рецептора ТNΕ, расщепление мембранного ТNΕ, активность ЮТ, продуцирование ТЯЕ и/или синтез ТЯЕ.
Примером анти-ТNΕ антитела или антагониста ЮТ является химерное антитело сА2. Другие примеры моноклональных анти-ТNΕ антител, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, описаны в литературе (см., например, патент США № 5231024; Мо11ег, А. е! а1., Су!окше 2(3): 162-169 (1990); заявка на патент США № 07/943852 (поданная 11 сентября 1992); Ра111)еп е! а1., публикация международной заявки № АО 91/02078 (опубликованной 21 февраля, 1991); КиЪш е! а1., СЬР-1, публикация патента № 0218868 (22 апреля, 1987); Υоηе е! а1., СБР-1 Р публикация патента № 0288088 (26 октября 1988); Ь1апд, е! а1., ВюсЬет. ВюрЬуз. Кез. Согат., 757:847-854 (1986); Меадег, е! а1., НуЬпбота, 6:305-311 (1987); Еепб1у е! а1., НуЬпбота, 6:359-369 (1987); Вппдтап, е! а1., НуЬпбота, 6:489-507 (1987); апб Нищ, е! а1., I. Iттиηо1. Ме!Ь., 96:51-62 (1987), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Молекулы ΤΝΕ-рецептора
Предпочтительными молекулами ТNΕ-рецептора, используемыми в настоящем изобретении, являются молекулы, которые связываются с ТПЕа с высокой аффинностью (см., например, Ее1бтапп е! а1., международную заявку № АО 92/07076 (опубликованную 30 апреля, 1992); ЗсЬа11 е! а1., Се11., 61:361-310 (1990) и публикацию ЬоейсЬег е! а1., Се11., 67:351-359 (1990), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки) и обладают, но необязательно, низкой иммуногенностью. В настоящем изобретении могут быть использованы ТПЕ-рецепторы клеточной поверхности, а в частности 55 кДа (р55 1^6-6) и 75 кДа (р75 ТNΕ-К.). В настоящем изобретении могут быть также использованы и усеченные формы ТNΕ-рецепторов, содержащие внеклеточные домены (ЕСБ) рецепторов или их функциональных частей (см., например, Согсогап е! а1., Еиг. I. ВюсЬет., 223:831-840 (1994)). Усеченные формы ТNΕ-рецепторов, содержащие ЕСБ, были обнаружены в моче и сыворотке в виде 30 кДа- и 40 кДа
- 35 015262 белков, ингибирующих связывание с ΤΝΡα (Еηде1таηη, Н. е! а1., 1. Вю1. СЕет., 265:1531-1536 (1990)). Мультимерные молекулы ΤΝΡ-рецептора и гибридные молекулы ΤΝΡ-иммунорецептора и их производные, фрагменты или части являются дополнительными примерами молекул ΤΝΡ-рецептора, которые могут быть использованы в способах и композициях согласно изобретению.
Мультимерные молекулы ΤΝΡ-рецептора, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, содержат весь внеклеточный домен (ЕС.'Э) или функциональную часть ЕСЭ двух или более ΤΝΡ-рецепторов, присоединенных посредством одного или нескольких полипептидных линкеров или других непептидных линкеров, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Примером такой гибридной молекулы ΤΝΡ-иммунорецептор является гибридный белок ΤNΕ-рецептор/IдС. Гибридные молекулы ΤΝΡ-иммунорецептор и методы их получения описаны в литературе (ЪекИаиег е! а1., Еиг. 1. Iттиηо1., 21:2883-2886 (1991); Α8Йкеηаζ^ е! а1., Ргос. Асаб. 8ск И8А, 88:10535-10539 (1991); Рерре1 е! а1., 1. Ехр. Меб., 774:1483-1489 (1991); Ко11з е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8οΐ. И8А, 91:215-219 (1994); Ви!1ег е! а1., Су!окте, 6(6):616-623 (1994); Вакег е! а1., Еиг. 1. ^тимк, 24:2040-2048 (1994); Веи!1ег е! а1., патент США № 5447851 и заявка на патент США 08/442133 (поданная 16 мая, 1995), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки). Методы продуцирования иммунорецепторных гибридных молекул можно также найти в патенте США № 5116964, в патенте США № 5225538, Сароη е! а1. и в публикации Сароη е! а1., №11иге 337:525-531 (1989), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Цитокинами являются любые известные цитокины. См., например, С.'оре\\т111С.'у1окте5.сот. Антагонистами цитокинов являются, но не ограничиваются ими, любое антитело, его фрагмент или миметик, любой растворимый рецептор, его фрагмент или миметик, любая небольшая молекула-антагонист или любые их комбинации.
Терапевтическое лечение
Любой способ согласно изобретению может включать лечение 1Ь-6-опосредуемого расстройства, где указанное лечение заключается во введении эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-1Ь-6 антитело, в клетку, ткань, орган или организм животного или человека, нуждающиеся в такой модуляции, лечении или терапии. Указанный способ может также, но необязательно, включать совместное введение или комбинированную терапию для лечения указанных заболеваний или расстройств, где указанное введение по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела или его конкретной части или варианта также предусматривает введение до, во время и/или после введения по меньшей мере одного средства, выбранного по меньшей мере из таких средств, как противоинфекционное лекарственное средство; лекарственное средство, воздействующее на сердечно-сосудистую (СС) систему; лекарственное средство, воздействующее на центральную нервную систему (ЦНС); лекарственное средство, воздействующее на вегетативную нервную систему (ВНС); лекарственное средство для лечения заболеваний дыхательных путей; лекарственное средство для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖК); гормональное лекарственное средство; лекарственное средство для регуляции водно-солевого баланса; гематологическое лекарственное средство; противоопухолевое лекарственное средство; иммуномодулирующее лекарственное средство; офтальмическое лекарственное средство; лекарственное средство для лечения заболеваний уха или носа; лекарственное средство для местного применения; натуральное лекарственное средство или т.п.; по меньшей мере одно средство, такое как антагонист ΤΝΡ (например, такой как, но не ограничивающийся ими, анти-ΤΝΡ антитело или его фрагмент, растворимый рецептор ΤΝΡ или его фрагмент, гибридные белки или низкомолекулярное соединение-антагонист ΤΝΡ); противоревматическое средство (например, такие как метотрексат, ауранофин, ауротиоглюкоза, азатиоприн, этанерцепт, тиомалат золота-натрия, сульфат гидроксихлорохина, лефлуномид, сульфазальцин); миорелаксант; наркотическое средство; нестероидное противовоспалительное средство (НСПВС); аналгетик; анестетик; седативное средство; анестетик для местного применения; нейромышечный блокатор; противомикробное средство (например, аминогликозид, противогрибковое средство, средство против паразитов, противовирусное средство, карбапенем, цефалоспорин, фторхинолон, макролид, пенициллин, сульфонамид, тетрациклин, другие противомикробные средства); средство для лечения псориаза; кортикостероид; анаболический стероид; средство для лечения диабета; микроэлементы; натуральное средство; средство для лечения щитовидной железы; витамин; кальцийассоциированный гормон; средство против диареи; средство против кашля; противорвотное средство; средство против язвы; слабительное средство; антикоагулянт; эритропоэтин (например, эпоэтин-альфа); филграстим (например, С-СЪЕ, №иродеи); сарграмостим (6М-С8Ρ, лейкин); средство для иммунизации; иммуноглобулин; иммунодепрессант (например, базиликсимаб, циклоспорин, даклизумаб); гормон роста; средство для гормонозаместительной терапии; модулятор рецептора эстрогена; мидриатическое средство; средство для лечения циклоплегии; алкилирующий агент; антиметаболит; ингибитор митоза; радиофармацевтическое средство; антидепрессант; средство против маниакальной депрессии; антипсихотическое средство; анксиолитическое средство; гипнотическое средство; симпатомиметик; стимулятор; донепезил; такрин; противоастматическое лекарственное средство; бета-агонист; стероид, вводимый путем ингаляции; ингибитор лейкотриена; метилксантин; кромолин; эпинефрин или его аналог; дорназаальфа (Ри1тохуте); цитокин или антагонист цитокина. Такие лекарственные средства, а также состав,
- 36 015262 показания, дозы и способы введения каждого из этих лекарственных средств хорошо известны специалистам (см., например, публикации Шгапд 2001 НапбЬоок оГ Лгцдк, 2Г’1 ебШоп, 8рппд1юи5е Согр., 8рппдйоике, РА, 2001; Неа11й РгоГекыопаГк Эгид Ошбе 2001, еб., 81аппоп, ^1коп, 81апд, Ргепбсе-На11, 1пс., Иррег 8абб1е РЬег, N1; РйагтсоШегару НапбЬоок, \Уе115 е1 а1., еб., Арр1е1оп & Ьапде, 81атГогб, СТ, каждая из которых полностью включена в настоящее описание посредством ссылки).
Обычно лечение патологических состояний осуществляют путем введения эффективного количества или дозы композиции по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела, которая в целом или в среднем составляет в пределах по меньшей мере примерно от 0,01 до 500 мг по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела на килограмм массы пациента на одну дозу, а предпочтительно по меньшей мере примерно от 0,01 до 100 мг антитела/килограмм массы пациента на разовую дозу или дробные дозы, в зависимости от удельной активности антитела, содержащегося в данной композиции. Альтернативно, эффективная сывороточная концентрация может составлять 0,1-5000 мгк/мл на вводимую разовую дозы или вводимые дробные дозы. Подходящие дозы могут быть установлены лечащим врачом и, как известно, зависят от конкретного патологического состояния, удельной активности вводимой композиции и от конкретного пациента, подвергаемого лечению. В некоторых случаях для достижения нужного терапевтического эффекта может оказаться необходимым повторное введение, то есть повторное введение индивидууму конкретно регулируемого или конкретно дозируемого количества, где такое введение индивидууму повторяют до тех пор, пока не будет установлена нужная суточная доза или не будет достигнут нужный эффект.
Предпочтительные дозы могут, но необязательно, составлять примерно 0,1-99 и/или 100-500 мг/кг на одно введение, или любой интервал, или целую величину или дробную величину в указанном интервале, либо, для достижения нужной концентрации в сыворотке, эти дозы могут составлять 0,1-5000 мг/мл сыворотки на одно разовое или многократное введение, или любой интервал, целую величину или дробную величину в указанном интервале. Предпочтительная доза анти-1Ь-6 антитела согласно изобретению составляет примерно от 1 мг/кг до 3-6 или 12 мг/кг массы тела пациента.
Альтернативно, вводимая доза может варьировать в зависимости от известных факторов, таких как фармакодинамические свойства конкретного агента, способ и путь его введения, возраст, состояние здоровья и масса реципиента; природа и тяжесть симптомов, вид сопутствующего лечения, режим лечения и желаемый эффект. Обычно доза активного ингредиента может составлять примерно 0,1-100 мг/кг массы тела. В основном для достижения нужных результатов эффективной является доза, составляющая 0,1-50, а предпочтительно 0,1-10 мг/кг на одно введение разовой лекарственной формы или введение лекарственной формы пролонгированного высвобождения.
Неограничивающим примером является лечение человека или животных, которое может быть осуществлено путем введения однократной дозы или периодического введения дозы по меньшей мере одного антитела согласно изобретению, составляющей 0,1-100 мг/кг или любой интервал, или целую величину или дробную величину в указанном интервале, в день и вводимой по меньшей мере в течение 1-40 дней, либо альтернативно или дополнительно по меньшей мере в течение 1-52 недель, либо альтернативно или дополнительно по меньшей мере в течение 1-20 лет или в любой их комбинации при введении разовой дозы, при вливании или введении многократных доз.
Лекарственные формы (композиции), подходящие для внутреннего введения, обычно содержат примерно от 0,001 до 500 мг активного ингредиента в одной разовой форме или в контейнере. В этих фармацевтических композициях активный ингредиент обычно присутствует в количестве примерно 0,5-99,999 мас.% всей композиции.
Для парентерального введения указанное антитело может быть приготовлено в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизованного порошка, взятого отдельно или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем для парентерального введения. Примерами таких носителей являются вода, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и примерно 1-10% альбумина человеческой сыворотки. Могут быть также использованы липосомы и безводные носители, такие как жирные масла. Указанный носитель или лиофилизованный порошок могут содержать добавки, поддерживающие изотоничность (например, хлорид натрия, маннит) и химическую стабильность (например, буферы и консерванты). Указанную композицию стерилизуют известными или подходящими методами.
Подходящие фармацевтические носители описаны в последнем новом издании руководства РеттдЮпГ РЬагтасеибса1 8с1епсе5, А. 0§о1, то есть стандартного руководства, используемого специалистами в данной области.
Альтернативное введение
Для введения фармацевтически эффективных количеств по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела согласно изобретению могут быть использованы многие известные и разработанные способы введения. Хотя ниже описано внутрилегочное введение, однако в соответствии с настоящим изобретением аналогичные результаты могут быть достигнуты и другими способами введения. Анти-1Ь-6 антитела согласно изобретению могут быть доставлены в носителе в виде раствора, эмульсии, коллоида или суспензии, либо в виде сухого порошка с применением любых устройств и способов, подходящих для введения путем ингаляции, или других способов, описанных в настоящей заявке или известных специалистам.
- 37 015262
Парентеральные составы и их введение
Составы для парентерального введения могут содержать стандартные наполнители, такие как стерильная вода или физиологический раствор, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, растительные масла, гидрогенизированные нафталины и т.п. Водные или масляные суспензии для инъекций могут быть получены с использованием соответствующего эмульгатора или увлажнителя и суспендирующего агента известными методами. Агентами для инъекций могут быть нетоксичные и не предназначенные для перорального введения разбавители, такие как водный раствор, стерильный раствор для инъекций или суспензия в растворителе. В качестве приемлемого носителя или растворителя могут быть использованы вода, раствор Рингера, изотонический физиологический раствор и т.п.; а в качестве стандартного или суспендирующего растворителя может быть использовано стерильное нелетучее масло. Для этих целей могут быть использованы нелетучее масло и жирная кислота любого вида, включая природные, синтетические или полусинтетические жирные масла или жирные кислоты, а также природные, синтетические или полусинтетические моно-, ди- или триглицериды. Способы парентерального введения известны специалистам, и такими способами являются, но не ограничиваются ими, стандартные способы инъекций, способы с использованием безыгольных устройств, работающих путем подачи сжатого газа, описанных в патенте США № 5851198, и лазерных перфораторов, как описано в патенте США № 5839446, где указанные патенты полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Альтернативная доставка
Настоящее изобретение также относится к доставке по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела путем парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, интраабдоминального, внутрикапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, внутрибрюшного, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного, внутрикишечного, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, интраперикардиального, внутрибрюшинного, интраплеврального, интрапростатического, внутрилегочного, интраректального, внутрипочечного, внутрисетчаточного, внутрипозвоночного, интрасиновиального, внутригрудного, внутриматочного и интравезикулярного введения, введения в пораженный участок, введения в виде болюса, а также вагинального, ректального, трансбуккального, подъязычного, интраназального или чрескожного введения. Для парентерального (подкожного, внутримышечного или внутривенного) или любого другого введения композиция, содержащая по меньшей мере одно анти-1Ь-6 антитело, может быть, в частности, получена в форме жидких растворов или суспензий; для вагинального или ректального введения эта композиция может быть, в частности, получена в полутвердых формах, таких как, но не ограничивающихся ими, кремы и суппозитории; для трансбуккального или подъязычного введения она может быть получена в таких формах, но не ограничивающихся ими, как таблетки и капсулы; для интраназального введения она может быть получена в таких формах, но не ограничивающихся ими, как порошки, капли в нос, аэрозоли или некоторые другие составы; для чрескожного введения она может быть получена в таких формах, но не ограничивающихся ими, как гель, мазь, лосьон, суспензия или система для доставки типа пластыря с химическими стимуляторами, такими как диметилсульфоксид, используемыми для модификации структуры кожи или для увеличения концентрации лекарственного средства в указанном чрескожном пластыре (см. работы Лшдтдег е! а1., 1п Эгид РегшеаНоп Епйапсетеп!; Нк1ей Ό.8. Ебк., р. 59-90 (Магсе1 Оеккег, 1пс. №\ν Уогк 1994, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки), либо с окислителями, используемыми для облегчения нанесения составов, содержащих белки и пептиды, на кожу (\У0 98/53847), или наложения электрических полей для создания путей кратковременного транспорта, например, при электропорации, либо для увеличения подвижности заряженных лекарственных средств, проходящих через кожу, например, при ионтофорезе, либо для обработки ультразвуком, например, при сонофорезе (патенты США №№ 4309989 и 4767402) (все вышеуказанные публикации и патенты полностью включены в настоящее описание посредством ссылки).
Внутрилегочное/интраназальное введение
Для внутрилегочного введения предпочтительно по меньшей мере одна композиция анти-1Ь-6 антитела доставляется в виде частиц, имеющих размер, эффективный для их доставки в нижние дыхательные пути легких или в синусы. В соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере одно анти1Ь-6 антитело может быть доставлено с помощью любых ингаляторов или устройств для интраназального введения, известных специалистам и используемых для введения терапевтического средства путем ингаляции. Такими устройствами, способными накапливать распыляемые композиции в синусовых пазухах или альвеолах пациента, являются ингаляторы с дозирующими клапанами для доставки, распылители, аэрозольные генераторы для сухих порошков, пульверизаторы и т. п. Специалистам также известны и другие устройства, подходящие для регуляции внутрилегочного или интраназального введения антител. Во всех указанных устройствах могут быть использованы композиции, подходящие для дозируемой доставки антитела, присутствующего в аэрозоле. Такие аэрозоли могут состоять либо из растворов (как водных, так и безводных), либо из твердых частиц.
В ингаляторах с дозируемой доставкой, таких как ингалятор с дозирующим клапаном Уеп!о1ш®, обычно используется газ-пропеллент, и эти ингаляторы приводятся в действие во время вдыхания (см.,
- 38 015262 например, \¥0 94/16970, 98/35888). Ингаляторы для сухих порошков, такие как ТигЬиМег™ (Айга), Ко1а11а1ег® (С1ахо), Эккик® (С1ахо), ингалятор 8р1г (Эига), устройства, имеющиеся в продаже под торговым знаком ^ак Тйегареийск, и инсуффлятор 8рт11а1ег® (Ещопк) приводятся в действие при вдыхании смешанного порошка (патент США № 4668218 Айга, ЕР 237507 Айга, XVО 97/25086 С1ахо, \УО 94/08552 Эига, патент США № 5458135 Iηйа1е, ν0 94/06498 Ещопк, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки). Распылители, такие как АЕКх™ АгабЧдт, распылитель Ь11гауеп1® (МаШпскгоб!) и распылитель Асогп II® (Магднек! Меб1са1 Ргобиск) (патент США 5404871 АгабЧдт, ν0 97/22376, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки) образуют аэрозоли из растворов, а ингаляторы с дозирующим клапаном, ингаляторы для сухих порошков и т.п. генерируют мелкодисперсные аэрозоли. Эти конкретные примеры коммерчески доступных ингаляторов приводятся лишь для иллюстрации конкретных устройств, подходящих для осуществления настоящего изобретения, и не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.
Предпочтительно композиция, содержащая по меньшей мере одно анти-I^-6 антитело, доставляется с помощью ингалятора для сухих порошков или распылителя. Для введения по меньшей мере одного антитела согласно изобретению устройство для ингаляции имеет несколько преимуществ. Так, например, доставка с использованием устройства для ингаляции является достаточно надежной, воспроизводимой и точной. С использованием устройства для ингаляции можно, но необязательно, осуществлять доставку небольших сухих частиц, например, размером примерно менее чем 10 мкм, а предпочтительно примерно 1-5 мкм, которые легко вдыхаются.
Введение композиции анти-1Ь-6 антитела в виде спрея
Спрей, включающий композицию анти-I^-6 антитела, может быть получен путем подачи суспензии или раствора по меньшей мере одного анти-I^-6 антитела через сопло под давлением. Для достижения нужного выхода и размера частиц необходимо выбрать соответствующие размеры и конфигурацию сопла, давление и скорость подачи жидкости. Электроспрей может быть продуцирован, например, путем наложения электрического поля при подачи жидкости через капилляр или сопло. Предпочтительно, чтобы частицы белка композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-I^-6 антитело и доставляемой с помощью распылителя, имели размер примерно менее чем 10 мкм, предпочтительно в пределах примерно 1-5 мкм, а наиболее предпочтительно примерно 2-3 мкм.
Составы композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-I^-6 антитело, подходящие для доставки с помощью распылителя, обычно включают композицию антитела в водном растворе в концентрации, составляющей примерно 0,1-100 мг по меньшей мере одной композиции анти-I^-6 антитела на 1 мл раствора или 1 мг/г, или любой интервал величин, целую величину или дробную величину в указанном интервале. Данный состав может включать такие агенты, как эксципиент, буфер, вещество, придающее изотоничность, консервант, поверхностно-активное вещество, а предпочтительно цинк. Указанный состав может также включать эксципиент или средство для стабилизации композиции антитела, такое как буфер, восстановитель, белок-наполнитель или углевод. Белками-наполнителями, используемыми для получения составов, содержащих композиции антител, являются альбумин, протамин или т.п. Типичными углеводами, используемыми для получения составов, содержащих композиции антител, являются сахароза, маннит, лактоза, трегалоза, глюкоза или т. п. Состав, содержащий композицию антител, может также включать поверхностно-активное вещество, которое может снижать или предотвращать поверхностно-индуцированную агрегацию композиции антител, вызываемую распылением раствора при образовании аэрозоля. При этом могут быть использованы различные стандартные поверхностно-активные вещества, такие как полиоксиэтилированные эфиры жирных кислот и спирты, а также полиоксиэтилированные эфиры сорбита и жирных кислот. Их количества обычно составляют в пределах от 0,001 до 14 мас.% состава. Для целей настоящего изобретения особенно предпочтительными поверхностноактивными веществами являются полоксиэтиленсорбитанмоноолеат, полисорбат 80, полисорбат 20 или т.п. Для получения составов белка, такого как анти-I^-6 антитело или его конкретные части или варианты, в данный состав могут быть также включены и другие агенты, известные специалистам.
Введение композиций анти-ЙЬ-6 антител с помощью аэрозольного ингалятора
Композиции антитела согласно изобретению могут быть введены с помощью аэрозольного ингалятора, такого как струйный ингалятор или ультразвуковой ингалятор. Обычно в струйном ингаляторе для создания высокоскоростной струи воздуха, поступающей через отверстие, используется источник сжатого воздуха. Поскольку газ распространяется за пределы сопла, то создается область низкого давления, которая направляет раствор композиции антитела через капиллярную трубку, присоединенную к резервуару с жидкостью. Поток жидкости из капиллярной трубки разделяется на нестабильные струйки и капельки на выходе из трубки, в результате чего образуется аэрозоль. Для получения нужных технологических характеристик данного струйного ингалятора могут быть использованы различные конфигурации, скорости потока и типы перегородок. В ультразвуковом ингаляторе для создания вибрационной механической энергии используется электроэнергия высокой частоты, обычно с применением пьезоэлектрического преобразователя. Эта энергия передается составу, содержащему композицию антител, либо непосредственно, либо через связующую жидкость, в результате чего образуется аэрозоль, содержащая ком
- 39 015262 позицию антитела. При этом предпочтительно, чтобы частицы композиции антитела, доставляемой с помощью распылителя, имели размер примерно менее чем 10 мкм, предпочтительно в пределах примерно 1-5 мкм, а наиболее предпочтительно примерно 2-3 мкм.
Составы, содержащие по меньшей мере одно анти-1Ь-6 антитело и подходящие для использования в струйном или ультразвуковом аэрозольном ингаляторе, обычно включают по меньшей мере один белок анти-1Ь-6 антитела, в концентрации примерно 0,1-100 мг на 1 мл раствора. Данный состав может включать такие компоненты, как эксципиент, буфер, средство, придающее изотоничность, консервант, поверхностно-активное вещество, а предпочтительно цинк. Указанный состав может также включать эксципиент или средство для стабилизации по меньшей мере одной композиции анти-1Ь-6 антител, такие как буфер, восстановитель, белок-наполнитель или углевод. Белками-наполнителями, используемыми для получения составов, содержащих по меньшей мере одну из композиций анти-1Ь-6 антитела, являются альбумин, протамин или т.п. Типичными углеводами, используемыми для получения по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела, являются сахароза, маннит, лактоза, трегалоза, глюкоза или т.п. Состав, содержащий по меньшей мере одно анти-1Ь-6 антитело, может также включать поверхностно-активное вещество, которое может снижать или предотвращать поверхностно-индуцированную агрегацию по меньшей мере одного анти-1Ь-6 антитела, вызываемую распылением раствора при образовании аэрозоля. При этом могут быть использованы различные стандартные поверхностно-активные вещества, такие как полиоксиэтилированные эфиры жирных кислот и спирты, и полиоксиэтилированные эфиры сорбита и жирных кислот. Их количества обычно составляют в пределах от 0,001 до 4 мас.% состава. Для целей настоящего изобретения особенно предпочтительными поверхностно-активными веществами являются полоксиэтиленсорбитанмоноолеат, полисорбат 80, полисорбат 20 или т.п. Для получения составов, содержащих белок, такой как белок антитела, в данный состав белка могут быть также включены и другие агенты, известные специалистам.
Введение композиций анти-1Ь-6 антител с помощью ингалятора с дозирующим клапаном
В ингаляторе с дозирирующим клапаном (ΜΌΙ) пропеллент, по меньшей мере одно анти-1Ь-6 антитело и любые наполнители или другие добавки содержатся в контейнере в виде смеси, включающей сжиженный газ под давлением. Приведение в действие дозирующего клапана приводит к высвобождению смеси в виде аэрозоля, содержащего частицы размером предпочтительно менее чем примерно 10 мкм, более предпочтительно примерно 1-5 мкм, а наиболее предпочтительно примерно 2-3 мкм. Аэрозольные частицы нужного размера могут быть получены с использованием состава композиции антител, приготовленного различными известными методами, включая размол на струйной мельнице, сушку распылением, конденсацию в критической точке и т.п. Предпочтительными ингаляторами с дозирующим клапаном являются ингаляторы, производимые 3М или С1ахо, в которых используется гидрофторуглеродный пропеллент. Составы, содержащие по меньшей мере одно анти-1Ь-6 антитело и вводимые с помощью ингалятора с дозирующим клапаном, обычно представляют собой тонкодисперсный порошок, содержащий по меньшей мере одно анти-1Ь-6 антитело в виде суспензии в безводной среде, например, суспендированной в пропелленте с помощью поверхностно-активного вещества. Таким пропеллентом может быть любой стандартный материал, используемый для этих целей, такой как хлорфторуглерод, хлорфторуглеводород, фторуглеводород или углеводород, включая трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,1,2-тетрафторэтан, НЕА-134а (гидрофторалкан-134а), НЕА-227 (гидрофторалкан-227) или т.п. Предпочтительным углеводородом является фторуглеводород. Поверхностноактивное вещество может быть выбрано так, чтобы оно стабилизировало по меньшей мере одно анти-1Ь-6 антитело, суспендированное в пропелленте, для защиты активного агента от химической деградации и т. п. Подходящими поверхностно-активными веществами являются сорбитантриолеат, лецитин сои, олеиновая кислота или т.п. В некоторых случаях аэрозоли растворов предпочтительно приготавливают с использованием растворителей, таких как этанол. Для получения состава белка в данный состав белка могут быть также включены и другие агенты, известные специалистам. Для каждого специалиста очевидно, что способы согласно изобретению могут быть осуществлены путем внутрилегочного введения композиций, содержащих по меньшей мере одну композицию анти-1Ь-6 антитела, с использованием других устройств, не описанных в настоящей заявке.
Пероральные составы и их введение
Составы для перорального введения основаны на совместном введении адъювантов (например, резорцинов и неионогенных поверхностно-активных веществ, таких как олеиловый эфир полиооксиэтилена и эфир н-гексадецилполиэтилена), используемых для искусственного усиления проницаемости стенок кишечника, а также на совместном введении ингибиторов ферментов (например, ингибиторов трипсина поджелудочной железы, диизопропилфторфосфата (ΌΕΕ) и тразилола) в целях ингибирования ферментативного расщепления. Составы для доставки гидрофильных агентов, включая белки, антитела и комбинацию по меньшей мере двух поверхностно-активных веществ для перорального введения, трансбуккального введения, введения через слизистую, интраназального введения, внутрилегочного введения, интравагинального или ректального введения, описаны в патенте США 6309663. Активное соединение, являющееся компонентом твердой лекарственной формы для перорального введения, может быть смешано по меньшей мере с одной добавкой, включая сахарозу, лактозу, целлюлозу, маннит, трегалозу,
- 40 015262 раффинозу, мальтит, декстран, крахмалы, агар, аргинаты, хитины, хитозаны, пектины, трагакантовую камедь, аравийскую камедь, желатин, коллаген, казеин, альбумин, синтетический или полусинтетический полимер и глицерид. Эти лекарственные формы могут также содержать добавки другого типа (типов), например неактивный разбавитель; замасливатель, такой как стеарат магния, парабен; консервант, такой как сорбиновая кислота, аскорбиновая кислота, альфа-токоферол; антиоксидант, такой как цистеин; дезинтегратор; связующий агент; загуститель; забуферивающий агент; подсластитель; отдушку; ароматизатор и т.п.
Таблетки и драже могут быть также изготовлены в виде препаратов с энтеросолюбильным покрытием. Жидкими препаратами для перорального введения являются эмульсии, сиропы, эликсиры, суспензии и растворы, пригодные для использования в медицине. Такие препараты могут содержать неактивные разбавители, обычно используемые специалистами в данной области, например вода. В качестве систем для доставки таких лекарственных средств, как инсулин и гепарин, также используются липосомы (патент США № 4239734). Совсем недавно для доставки фармацевтических средств были использованы микросферы из искусственных полимеров смешанных аминокислот (протеиноидов) (патент США № 4925673). Кроме того, для пероральной доставки биологически активных агентов используются соединения-носители, описанные в патентах США №№ 5879681 и 5871753 и известные специалистам.
Составы для введения через слизистую и их применение
Состав для перорального введения биоактивного вещества, инкапсулированного в одном или нескольких биосовместимых полимерных или сополимерных эксципиентах, а предпочтительно в биологически разлагаемом полимере или сополимере, представляет собой микрокапсулы, которые благодаря своему размеру позволяют указанному веществу достигать групповых лимфатических фолликул животного, иначе называемых пейеровыми бляшками или САЬТ, без снижения его эффективности благодаря прохождению такого агента через желудочно-кишечный тракт. Аналогичные групповые лимфатические фолликуллы могут присутствовать в бронхиолах (ВАЬТ) и в толстом кишечнике. Вышеуказанные ткани обычно называются лимфоретикулярными тканями слизистых оболочек (МАЬТ). Для абсорбции через поверхности слизистой в композициях и методах введения по меньшей мере одного ημη-ΙΕ-6 антитела используется эмульсия, которая содержит множество субмикронных частиц, мукоадгезивную макромолекулу, биологически активный пептид и водную непрерывную фазу и которая стимулирует абсорбцию через поверхности слизистой оболочки посредством адгезии эмульсионных частиц на поверхности слизистой оболочки (патент США № 5514670). Способами, подходящими для нанесения эмульсий согласно изобретению на поверхность слизистых оболочек, являются роговичное, конъюнктивальное, трансбуккальное, подъязычное, интраназальное, вагинальное, внутрилегочное, внутрижелудочное, интестинальное и ректальное введение. Составы для вагинального или ректального введения, например суппозитории, могут содержать эксципиенты, например полиалкиленгликоли, вазелин, маслокакао и т. п. Составы для интраназального введения могут быть твердыми и могут содержать в качестве эксципиента, например, лактозу либо они могут представлять собой водные или масляные растворы капель в нос. Для трансбуккального введения эксципиентами являются сахара, стеарат кальция, стеарат магния, предварительно желатинизированный крахмал и т.п. (патент США № 5849695).
Чрескожные композиции и их введение
Для чрескожного введения по меньшей мере одно 34^1-^-6 антитело инкапсулируют в системы для доставки, такие как липосома или полимерные наночастицы, микрочастицы, микрокапсулы или микросферы (имеющие общее название микрочастицы, если это не оговорено особо). Известно несколько подходящих систем, включая микрочастицы, изготовленные из синтетических полимеров, таких как полиоксикислоты, например полимолочная кислота, полигликолевая кислота и их сополимеры, полиортоэфиры, полиангидриды и полифосфазены, и природных полимеров, таких как коллаген, полиаминокислоты, альбумин и другие белки, альгинат и другие полисахариды и их комбинации (патент США № 5814599).
Пролонгированное введение и композиции
Иногда индивидууму желательно вводить соединения согласно изобретению в течение продолжительного периода времени, например в течение периода времени от одной недели до одного года в виде разовой дозы. Для этого могут быть использованы различные лекарственные формы для пролонгированного высвобождения, депо-формы или имплантаты. Так, например, лекарственная форма может содержать фармацевтически приемлемую нетоксичную соль соединений, обладающую низкой степенью растворимости в физиологических жидкостях, например (а) кислотно-аддитивную соль с полиосновной кислотой, такой как фосфорная кислота, серная кислота, лимонная кислота, винная кислота, дубильная кислота, памовая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталинмоно- или нафталиндисульфоновые кислоты, полигалактуроновая кислота и т.п.; (Ь) соль, образованную катионом поливалентного металла, такого как цинк, кальций, висмут, барий, магний, алюминий, медь, кобальт, никель, кадмий и т.п., или органическим катионом, образованным, например, НИ-дибензилэтилендиамином или этилендиамином; или (с) комбинацию (а) и (Ь), например цинковую соль дубильной кислоты. Кроме того, соединения согласно изобретению или предпочтительно его относительно нерастворимая соль, такая как вышеуказанные соли, могут быть приготовлены в виде геля, например геля, содержащего моностеа
- 41 015262 рат алюминия с добавлением, например, кунжутного масла для инъекции. Особенно предпочтительными солями являются соли цинка, цинковые соли дубильной кислоты, соли памовой кислоты и т.п. Другие типы депо-состава замедленного высвобождения, предназначенные для инъекций, могут содержать соединение или соль, диспергированную для инкапсуляции в медленно разлагающемся нетоксичном и неантигенном полимере, таком как полимер полимолочной кислоты/полигликолевой кислоты, например, описанный в патенте США № 3773919. Соединения или предпочтительно их относительно нерастворимые соли, например соли, описанные выше, могут быть также получены в виде силастических гранул с холестериновым матриксом, которые могут быть, в частности, использованы для введения животным. Другие составы для замедленного высвобождения, депо-формы или имплантаты, например газовые или жидкие липосомы, описаны в литературе (патент США № 5770222 и 8ик1а1пеб апб Соп1го11еб Ке1еаке Огцд Оейуегу 8уйетк, 1.К. КоЬткоп еб., Магсе1 Эеккег, Гпс., Ν.Υ., 1978).
Хотя выше представлено общее описание настоящего изобретения, однако для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приводятся конкретные примеры, которые служат лишь для иллюстрации изобретения и не должны рассматриваться как его ограничение.
Показания
Ревматоидный артрит (РА).
Ревматоидный артрит (РА) представляет собой хроническое системное воспалительное заболевание с аутоиммунными признаками. Некоторые признаки РА могут быть объяснены нерегулируемым действием ГЬ-б.
Действием ГЬ-б, играющим важную роль в развитии РА, является индуцирование поликлональной гипергаммаглобулинемии и продуцирование аутоантител (ревматоидного фактора), где ГЬ-б действует как фактор дифференцировки В-клеток; стимуляция развития цитотоксических Т-клеток, где ГЬ-б действует в сочетании с ГЬ-2; продуцирование белков острой фазы (СКР, 8ЛЛ, фибриногена) посредством гепатоцит-стимулирующей активности; активация остеокластов, приводящая к околосуставному остеопорозу и деструкции кости; индуцирование тромбоцитоза, где ГЬ-б действует как фактор дифференцировки мегакариоцитов; и регуляция УЕСР, которая может приводить к ангиогенезу, где ГЬ-б действует в сочетании с ГЬ-1 β и ΤΝΡα.
ГЬ-б продуцируется фибробластами в синовиальной жидкости индивидуумов с РА, стимулируемыми ΤΝΡα или ГЬ-1, и присутствует в высокой концентрации в синовиальной жидкости (СЖ) и в сыворотке индивидуумов с РА. Существует корреляция между уровнями ГЬ-б в сыворотке и клиническими/лабораторными показателями активности заболевания.
Анти-ГЬ-б/ГЬ-бК тЛЬк были исследованы в нескольких клинических испытаниях, проводимых с участием пациентов с активным РА. Полученные результаты вкратце приводятся ниже.
Испытания фазы Г/ГГ.
В первом из этих испытаний мышиное анти-ГЬ-б тАЬ (ВЕ-8) вводили ежедневно в течение 10 дней 5 пациентам с РА и такое введение давало временное улучшение по клиническим и лабораторным показателям (9) (Аепбйпд, Ό., е1 а1., 1993, 1. КНеитаЮЬ 20:259). Гуманизованное анти-ГЬ-бК (80 кДа) тАЬ (МКА; С1шд;ц) анализировали у пациентов с РА в нескольких испытаниях фазы Г/ГГ. В первом из этих испытаний МКА вводили путем ί.ν. вливания в дозах 1-50 мг один или два раза в неделю с применением поддерживающей терапии в дозе 50 мг в неделю в течение б месяцев. Это приводило к быстрому снижению признаков острой фазы заболевания, уровней С-реактивного белка (СКР) и фибриногена, а также к снижению субфебрильной температуры, устранению усталости и к улучшению клинических показателей, таких как утренняя скованность, опухание и болезненность суставов. Также наблюдалась положительная динамика в развитии анемии, тромбоцитоза и гипергаммаглобулинемии. В следующем испытании 45 пациентов подвергали лечению путем одного ί.ν. вливания МКА в дозе 0,1-10 мг/кг, что приводило к улучшению клинических показателей при более высоких уровнях доз и к снижению продуктов, являющихся признаками острой фазы заболевания.
Испытания фазы ГГ.
В первом из этих испытаний 15 пациентов подвергали лечению путем введения МКА (в дозах 2, 4 или 8 мг/кг, вводимых два раза в неделю в течение 24 недель), и через 24 недели были обнаружены АСК20-ответы у 13 из 15 пациентов, где полученные данные были нормализованы по СКР/сывороточному амилоиду А (8АА). Хотя основная проблема опасности, связанная с острой фазой заболевания, была устранена, однако у двух третей пациентов наблюдалось заметное увеличение уровней холестерина ЛПНП. Во втором испытании фазы ГГ 1б4 пациентам с РА, резистентным к ОМАКЭ, вводили плацебо или МКА путем ί.ν. вливания (в дозах 4 или 8 мг/кг, вводимых через 4 недели в течение 3 месяцев), и через 12 недель были обнаружены АСК20-ответы у 11, 57 и 78% пациентов, которым вводили плацебо, 4 и 8 мг/кг МКА соответственно. И, наконец, 359 пациентам с активным РА вводили только МТХ (10-25 мг/неделю), только МКА (в дозах 2, 4 или 8 мг/кг, вводимых ежемесячно путем ί.ν. вливания) или МТХ+МКА. МКА и МКА+МТХ были более эффективными, чем один МТХ, как было определено по АСК20-ответу.
Системная красная волчанка (СКВ).
- 42 015262
СКВ представляет собой хроническое, потенциально смертельное аутоиммунное заболевание с широким многообразием манифестаций. Этиология этого заболевания не ясна. Одним из признаков этого заболевания является гиперпролиферация и активация В-клеток, а также продуцирование аутоантител против различных аутоантигенов.
1Ь-6 индуцирует дифференцировку В-клеток с образованием антителопродуцирующих клеток. При СКВ наблюдается повышенный уровень продуцирования аутоантител (АNА, анти-дцДНК антител) такими антителопродуцирующими клетками и отложение иммунных комплексов. 1Ь-6 стимулирует развитие цитотоксических Т-клеток, увеличение уровней гепатоцитарных реагентов-индикаторов острой фазы, пролиферацию мезангиальных клеток, рост кератиноцитов, дифференцировку мегакератиноцитов и тромбоз.
У пациентов с СКВ и у мышей с моделью СКВ уровни 1Ь-6 увеличены. Было показано, что 1Ь-6рецептор, связывающийся с В-клетками, индуцирует конечную стадию дифференцировки В-клеток с образованием клеток, продуцирующих аутоантитела. Ыикег-1кгае11 и сотрудниками (Ыикег-1кгае11 М. е1 а1., 1991, 1. 1ттипо1. 147:117-123) было обнаружено снижение уровня спонтанного продуцирования поликлональных антител в присутствии нейтрализующих антител против 1Ь-6. Эти данные были подтверждены Кйаш и сотрудниками (Кйаш А., е1 а1., 1992 С1ш. Ехр. 1ттипо1., 88:75-83), которые показали, что уровень 1п νίΙΐΌ продуцирования 1Ь-6 Т-клетками удваивается в СКВ-культурах, и что В-клетки при СКВ продуцируют уровни 1Ь-6, в 5 раз превышающие уровни 1Ь-6, продуцируемые контрольными В-клетками. Однако патологическое продуцирование аутоантител при СКВ не ограничивается только действием 1Ь-6. Была также исследована роль 1Ь-6-рецептора. №1даГис1и и сотрудниками была обнаружена позитивная регуляция 1Ь-6-рецептора в большинстве В-клеток у пациентов с СКВ по сравнению с нормальными В-клетками. Антитело против 1Ь-6-рецептора ингибирует конечную стадию дифференцировки этих В-клеток с образованием антителопродуцирующих клеток. Роль растворимого 1Ь-6-рецептора при СКВ пока еще не установлена.
Сахарный диабет типа II (Τ2ΌΜ).
Считается, что основными причинами, вызывающими развитие сахарного диабета типа 2 (Τ2ΌΜ), являются инсулинорезистентность (нарушение действия инсулина) и нарушение функции β-клеток (функциональное нарушение секреции инсулина панкреатическими β-клетками). Инсулинорезистентность характеризуется неспособностью периферических тканей адекватно реагировать на поступление инсулина, что приводит к увеличению уровней глюкозы в крови. Увеличение инсулинорезистентности и уровней глюкозы в крови сопровождается компенсирующей гиперсекрецией инсулина панкреатическими β-клетками на ранних стадиях заболевания. По мере прогрессирования Τ2ΌΜ способность β-клеток секретировать инсулин снижается.
Механизмы, ответственные за развитие инсулинорезистентности, точно не установлены. Одним из состояний, наиболее часто ассоциированных с развитием Τ2ΌΜ, является ожирение, причем даже небольшое снижение веса приводит к значительному снижению уровней глюкозы у пациентов с Τ2ΌΜ.
Как ожирение, так и инсулинорезистентность/гиперинсулинемия в комбинации с дислипидемией, нарушенной толерантностью к глюкозе и гипертензией характеризуются состоянием, называемым метаболическим синдромом. Естественное прогрессирование метаболического синдрома с развитием предрасположенности у индивидуумов с Τ2ΌΜ приводит к микро- и макрососудистым изменениям, которые могут индуцировать развитие сердечно-сосудистых (СС) заболеваний и, в конечном счете, приводить к летальному исходу. Было высказано предположение, что ожирение, инсулинорезистентность и гиперинсулинемия, по всей вероятности, являются промежуточным звеном между Τ2ΌΜ и сердечно-сосудистым заболеванием (ССЗ).
Жировая ткань была идентифицирована как один из множества органов, которые регулируют метаболизм, и представляет собой депо для накопления энергии и эндокринный орган, который секретирует различные молекулы, участвующие в регуляции чувствительности к инсулину. Помимо лептина, резистина, адипонектина и ΤΝΕα жировая ткань секретирует 1Ь-6, продуцирование которого, как предполагается, является промежуточным звеном между развитием ожирения, воспаления, Τ2ΌΜ и сердечнососудистого заболевания (ССЗ).
Была также описана положительная корреляция между ожирением и уровнями 1Ь-6. Возможно, что увеличение образования жировой ткани при ожирении может способствовать стойкому увеличению уровней циркулирующего 1Ь-6, которое может приводить к снижению чувствительности к инсулину посредством стимуляции воспаления чувствительных к инсулину тканей или приводить к инсулинорезистентности в результате негативного влияния на активность и экспрессию белков, участвующих в каскаде реакций передачи инсулинового сигнала. Имеются ш νίΙΐΌ и ίπ у1уо данные, которые подтверждают или опровергают возможную роль 1Ь-6 в развитии инсулинорезистентности.
1п νίΙΐΌ данные, полученные с использованием хорошо изученных клеточных систем, включая клетки печени (НерС2)(44), жировые клетки (3Τ3Π) или выделенные у крыс клетки панкреатических островков, показали, что 1Ь-6 оказывает прямое негативное воздействие на передачу инсулинового сигнала, поглощение глюкозы и секрецию инсулина соответственно. С другой стороны, данные, полученные из
- 43 015262 экспериментов, проведенных на биоптатах скелетных мышц, позволяют предположить, что 1Ь-6 может повышать уровень поглощения глюкозы в работающей мышце.
Данные, полученные в экспериментах ш у1уо по взаимосвязи между уровнями 1Ь-6 и чувствительностью к инсулину, являются противоречивыми. Данные, полученные на моделях сверхэкспрессии 1Ь-6 или его полной элиминации, позволяют предположить, что полное ингибирование активности 1Ь-6 может не давать благоприятный эффект. Так, например, у трансгенных мышей с моделью диабета без ожирения (Ν0Ό), сверхэкспрессия человеческого 1Ь-6 приводит к замедлению развития диабета и к увеличению продолжительности жизни. Кроме того, данные, полученные от 1Ь-6-дефицитных мышей, позволяют предположить, что 1Ь-6 может играть определенную роль в регуляции энергетического баланса, поскольку у таких животных наблюдается позднее развитие ожирения и более высокие уровни глюкозы.
У людей природная мутация в области промотора 1Ь-6 приводила к увеличению уровней секреции 1Ь-6. Такая мутация ассоциировалась как с увеличением, так и со снижением чувствительности к инсулину.
В другой серии экспериментов оценивали действие экзогенного 1Ь-6. У нормальных индивидуумов введение 1Ь-6 приводило к увеличению уровней глюкозы без какого-либо влияния на концентрацию инсулина в плазме, тогда как у пациентов с раком добавление 1Ь-6 приводило к усилению поглощения глюкозы. Кроме того, была оценена корреляция между уровнями 1Ь-6 и инсулинорезистентностью. Данные, полученные из этих экспериментов, позволяют предположить, что у мужчин и женщин более высокие уровни 1Ь-6 в кровотоке коррелируют с более высокой инсулинорезистентностью, хотя их причинноследственная связь не была установлена.
Было показано, что 1Ь-6 играет важную роль в развитии инсулинорезистентности, ассоциированной с ожирением. Однако эксперименты ш У1!го и ш у1уо дают противоречивые данные, которые подтверждают или опровергают возможную роль 1Ь-6 в развитии инсулинорезистентности.
Остеоартрит (ОА).
ОА представляет собой хроническое, дегенеративное заболевание суставов, характеризующееся потерей ткани суставного хряща и аналогичными изменениями в подхрящевой кости. Хотя при артроскопии или в биоптатах синовиальной жидкости наблюдаются воспаления различной степени, однако это заболевание по своей первичной природе не является воспалительным. Более того, считается, что причиной этого заболевания являются изменения метаболизма хондроцитов и/или остеобластов. ΤΝΡ, 1Ь-1 и 1Ь-6 представляют собой цитокины, которые обнаруживают наиболее явную взаимосвязь с указанными изменениями.
1Ь-6 был детектирован в синовиальной жидкости пациентов с ОА, хотя и на уровнях, значительно более низких, чем уровни, наблюдаемые при воспалительных артропатий (ВеПаххоЛ N. е! а1., 1994, Адеп!к апб Ас!юпк, 41:90-92). Известно, что 1Ь-6 является главным стимулятором синтеза белков гепатоцитов острой фазы, а уровни СКР ассоциируются с остеоартритом (ОА) коленей, даже если принять во внимание известную взаимосвязь между СКР и ожирением (МоЕ!а1, М. е! а1., 1996, 1 ОйЕоребю КекеагсЕ, 14:67-73).
1Ь-6 экспрессируется в хондроцитах хряща при ОА, но не в нормальном хряще (8отегк, М. е! а1., 2002, Ок!еоаг!ЕпЕк апб СагЕ1аде, 10:595-601). В экспериментах, проводимых для анализа влияния механической нагрузки на экспрессию цитокинов в хондроцитах ш уйго, индуцированное жидкостью напряжение при сдвиге приводило к заметной стимуляции продуцирования мРНК и белка 1Ь-6. Это дает основание предположить, что экспрессия 1Ь-6 в хряще у пациентов с ОА может быть результатом механической нагрузки. 1Ь-6 может также продуцироваться в ответ на действие 1Ь-1 в хондроцитах (Оо/Й!, В. е! а1., 2002, Ма!г1х Вю1оду, 21:449-459).
В других экспериментах 1Ь-6 в комбинации с к1Ь-6К, приводит к ингибированию синтеза протеогликана человеческими хондроцитами суставов, культивированными ех у1уо, хотя такой эффект был гораздо более скромным по сравнению с эффектом 1Ь-1 (Сиете, Р. е! а1., 1999, МаЕтх Вю1оду, 18: 253-260).
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ).
ХОБЛ представляет собой патологическое состояние, характеризующееся ограничением проходимости дыхательных путей, которое не является полностью обратимым. Такое ограничение проходимости дыхательных путей обычно прогрессирует и ассоциируется с патологическим воспалительным ответом в легких на вредные частицы и газы (Раи^е1к К.А. е! а1., 2001, Ат. 1 КекрЕ Сп! Саге Меб., 163:1256-1276). ХОБЛ характеризуется ускорением естественного снижения функции легких, наблюдаемого в старости. Медленно прогрессирующее ограничение проходимости дыхательных путей приводит к инвалидности и к преждевременной смерти. ХОБЛ является лидирующей причиной смертности и инвалидности, однако исследования клеточных и молекулярных механизмов, вызывающих это заболевание, стали интенсивно проводиться лишь недавно (Вагпек Р.1. е! а1., 2003, Еиг. КекрЕ. I, 22:672-688). При ХОБЛ наблюдается хроническое воспаление, которое приводит к фиксированному сужению нижних дыхательных путей и альвеолярной деструкции (эмфиземе). Воспалительный ответ характеризуется увеличением альвеолярных макрофагов, нейтрофилов и цитотоксических Т-лимфоцитов и высвобождением множества медиаторов воспаления (хемокинов, цитокинов, факторов роста и липидов). Такое воспаление может усиливаться сильным окислительным стрессом. При этом также повышается эластолиз и имеются данные, ука
- 44 015262 зывающие на участие в этих процессах некоторых эластолитических ферментов. Воспаление и протеолиз при ХОБЛ характеризуются усилением нормального воспалительного ответа на сигаретный дым. В отличие от астмы такое воспаление, очевидно, является резистентным к кортикостероидам (Вагпек Р.1. е! а1., 2003).
У животных-моделей бактериальный эндотоксин или липополисахариды (ЛПС) и сигаретный дым индуцируют нейтрофилию и повышают уровень продуцирования 1Ь-6 в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ВАЬ) (Ипбетооб Э.С. е! а1., 2000, А1РБСМР 279:Ь895-902). Сверхэкспрессия 1Ь-6 в легких мышей индуцирует эмфизему (КиЬп III С1. е! а1., 2000 А1КСМВ 22:289-2 95). У людей объем форсированного выдоха за одну секунду (БЕУ1) обратно пропорционален уровням 1Ь-6 и 1Ь-8 и числу полиморфонуклеарных клеток в ВАЬ (8о1ег Ν. е! а1., 1999, Еиг. Кекрй. 1., 14:1015-1022). У индивидуумов с ХОБЛ средней тяжести и с тяжелой формой ХОБЛ наблюдаются повышенные уровни 'ΓΝΡα, 1Ь-6 и СКР ДаКапа Ν. е! а1., 1998, Кекрй. Меб., 92:993-999).
Обострение ХОБЛ определяют как стойкое ухудшение состояния пациента, находящегося в стабильной стадии заболевания, которое отличается от обычных суточных вариаций и которое имеет острое начало и требует регулярного введения лекарственных составов (Вигде 8. е! а1., 2003, Еиг. Кекрп. 1., 21: 8ирр1. 41, 46к-53к). Хотя усиление симптомов и ухудшение функции легких является наиболее распространенной причиной госпитализации (в США приблизительно 500000 человек в год), однако клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в их основе, пока еще хорошо не изучены и не совсем ясны (^еб/юка, 1.А., 2002, С1ек!. 121:1368-1418). Такое обострение может быть достаточно продолжительным и серьезно влиять на качество жизни пациента, а также ускорять прогрессирование ХОБЛ (8о!о Р.1. е! а1., 2003, Ри1т. Меб., 9:117-124). Наиболее распространенными причинами, вызывающими обострение ХОБЛ, являются респираторные инфекции. Большинство этих инфекций вызываются бактериями, но многие из них вызываются вирусными патогенами, а в частности риновирусами (8о!о Р.1. е! а1., 2003). Определенную роль могут также играть факторы окружающей среды, загрязнение воздуха и температура окружающей среды.
В процессе обострения наблюдается увеличение числа нейтрофилов и концентрации 1Ь-6, 1Ь-8, Т№а и ЬТВ4 в мокроте пациентов с ХОБЛ. У некоторых пациентов с ХОБЛ средней тяжести и с тяжелой ХОБЛ наблюдаются частые обострения (три или более обострений в год). У этой группы пациентов (с частыми обострениями) и даже у пациентов с ХОБЛ в стабильной фазе обнаруживаются более высокие уровни 1Ь-6 и более низкие уровни секреторных лейкоцитарных ингибиторов протеазы (В1ю\\'Щ|к А. е! а1., 2000, Ткогах, 55:114-120; Сошрейх 8. е! а1., 2001, Тйогах 56: 36-41; Сошрейх 8. е! а1., 2001, Еиг. Кекрй. 1., 17:1112-1119).
В физиологии обострения ХОБЛ также участвуют и другие механизмы, такие как окислительный стресс и бактериальная колонизация.
Пример 1. Клонирование и экспрессия анти-1Ь-6 антитела в клетках млекопитающих.
Типичный вектор для экспрессии в клетках млекопитающих содержит по меньшей мере один промоторный элемент, который опосредует инициацию транскрипции мРНК, антителокодирующую последовательность и сигналы, необходимые для терминации транскрипции и полиаденилирования транскрипта. Дополнительными элементами являются энхансеры, последовательности Козака и интронные последовательности, фланкированные донорными и акцепторными сайтами для РНК-сплайсинга. Высокоэффективная транскрипция может быть достигнута с использованием раннего и позднего промоторов 8У40, длинных концевых повторов (ЪТК8), происходящих от ретровирусов, например К8У, НТЬУ-1, ВИЧ-1 и раннего промотора цитомегаловируса (СМУ). Однако могут быть также использованы и клеточные элементы (например, промотор человеческого актина). Подходящими экспрессионными векторами, используемыми для осуществления настоящего изобретения, являются, например, такие векторы, как р1КЕ81пео, рЕейо-ОГГ, рВейо-Оп, Р^X8N или р^NСX (С1оп!ес1 ЬаЬк, Ра1о А1!о, СА), рс^NА3.1 (+/-), рс^NА/Ζео (+/-) или рс^NА3.1/Нудго (+/-) (1пубгодеп), Р8УЬ и РМ8С (Рйагтас1а, Иррка1а, 8^ебеп), рК8Уса! (АТСС 37152), р8У2бЫг (АТСС 37146) и рВС12М1 (АТСС 67109). Подходящими клетками млекопитающих и другими клетками-хозяевами являются человеческие клетки Не1а, 293, Н9 и клетки 1игка!, мышиные клетки МН3Т3 и С127, клетки Сок I, Сок 7 и СУ1, клетки ОС 1-3 перепелов, мышиные Ь-клетки и клетки яичника китайского хомячка (СНО). Альтернативно, ген может экспрессироваться в стабильных клеточных линиях, которые содержат ген, интегрированный в хромосому. Котрансфекция селективным маркером, таким как ген бЫг, ген др!, ген неомицина или гигромицина, позволяет идентифицировать и выделять трансфицированные клетки.
Трансфицированный ген может быть также амплифицирован для экспрессии больших количеств кодируемого антитела. Маркер ИНРИ (дигидрофолатредуктаза) может быть использован для выявления клеточных линий, несущих несколько сотен или даже несколько тысяч копий представляющего интерес гена. Другим подходящим селективным маркером является фермент глутаминсинтаза (С8) (Мигрйу е! а1., Вюскет. 1., 227:277-279 (1991); ВеЬЬшд!оп е! а1., Вю/ТесЬпо1оду, 10:169-175 (1992)). С использованием этих маркеров клетки млекопитающих культивируют в селективной среде и отбирают на наибольшую резистентность. Эти клеточные линии содержат амплифицированный(е) ген(ы), интегрированный(е) в
- 45 015262 хромосому. Для продуцирования антител часто используются клетки яичника китайского хомячка (СНО) и клетки N80.
Экспрессионные векторы рС1 и рС4 содержат сильный промотор (ΕΤΚ) вируса саркомы Рауса (Си11еп еί а1., Мо1ес. Се11. Вю1., 5:438-447 (1985)) плюс фрагмент СМУ-энхансера (Вокйай еί а1., Се11., 41:521530 (1985)). Сайты множественного клонирования, например сайты расщепления рестриктирующими ферментами ВатН1, ХЬа1 и Акр718, облегчают клонирование представляющего интерес гена. Эти векторы, помимо 3'-интрона, содержат сигнал полиаденилирования и стоп-сигнал гена крысиного препроинсулина.
Клонирование и экспрессия в клетках СНО.
Для экспрессии анти-1Ь-6 антитела может быть использован вектор рС4. Плазмида рС4 представляет собой производное плазмиды р8У2-бМг (АТСС рег. № 37146). Эта плазмида содержит мышиный ген ΌΗΡΚ, находящийся под контролем раннего промотора 8У40. Клетки яичника китайского хомячка или другие клетки, в которых отсутствует дигидрофолатная активность и которые были трансфицированы указанными плазмидами, могут быть отобраны путем культивирования этих клеток на селективной среде (например, на среде альфа--МЕМ, ЫЕе Τесйηο1οд^е8, СаййегкЬигд, МИ) с добавленным химиотерапевтическим средством, метотрексатом. Амплификация генов ΌΗΡΚ в клетках, резистентных к метотрексату (МТХ), была подробно описана в литературе (см., например, Р.^. АЙ, еί а1., 1. Вю1. Сйет., 253:1357-1370 (1978); 1.Ь. Нат1т & С. Ма, Вюсйет. еί Вюрйук. А^, 1097:107-143 (1990) и М.1. Раде & М.А. 8убепйат, В^есйпо1оду, 9:64-68 (1991)). В процессе роста клеток при возрастающих концентрациях МТХ у них развивается резистентность к лекарственному средству посредством сверхпродуцирования нужного фермента, ИНРК, что является результатом амплификации гена ИНРК. Если второй ген сцеплен с геном ИНРК, то он обычно коамплифицируется и сверхэкспрессируется. Известно, что такой подход может быть использован для выявления клеточных линий, несущих более чем 1000 копий амплифицированного(ых) гена(ов). Затем после удаления метотрексата получают клеточные линии, которые содержат амплифицированный ген, интегрированный в одну или несколько хромосом клетки-хозяина.
Кроме сильного промотора длинных концевых повторов (ΕΤΚ) вируса саркомы Рауса, для экспрессии могут быть также использованы и другие высокоэффективные промоторы, например промотор человеческого β-актина, ранний или поздний промоторы 8У40 или длинные концевые повторы, происходящие от других ретровирусов, например ВИЧ и 4ΤΕνί. Для экспрессии анти-1Е-6 антитела под контролем регуляторных последовательностей в клетках млекопитающих могут быть использованы системы экспрессии генов Τеί-0ίί и Τеί-0η С1оп1ес11 и аналогичные системы (М. Соккеп & Н. Вщагб, Ргос. Ν;·ι11. Асаб. 8с1. И8А, 89:5547-5551 (1992)). Для полиаденилирования мРНК могут быть также использованы и другие сигналы, например сигналы, происходящие от генов человеческого гормона роста или глобина. Стабильные клеточные линии, несущие представляющий интерес ген, интегрированный в хромосомы, могут быть также отобраны в результате котрансфекции с селективным маркером, таким как дрЬ С418 или гигромицин. При этом сначала предпочтительно использовать более чем один селективный маркер, например С418 плюс метотрексат. Плазмиду рС4 гидролизовали рестриктирующими ферментами, а затем дефосфорилирировали с использованием телячьей кишечной фосфатазы в соответствии с процедурами, известными специалистам. Затем вектор выделяли из 1% агарозного геля.
В соответствии со стадиями известного метода использовали ДНК-последовательность, кодирующую полноразмерное анти-1Ь-6 антитело, например, представленную в 8Е0 ΙΌ N0:98 и 96 и соответствующую вариабельным областям НС и ЬС анти-ЕЕ-6 антитела согласно изобретению соответственно. В этой конструкции также использовали выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую подходящую человеческую константную область (то есть области НС и ЬС).
Затем выделенную ДНК, кодирующую вариабельную и константную области, и дефосфорилированный вектор лигировали вместе с помощью ДНК-лигазы Т4. После этого клетки Е.со11 НВ 101 или ХЬ-1 В1ие трансформировали и идентифицировали бактерии, которые содержат фрагмент, встроенный в плазмиду рС4, с помощью, например, рестрикционного анализа.
Для трансфекции использовали клетки яичника китайского хомячка (СНО), в которых отсутствовал ген активной ИНРК. 5 мкг экспрессионной плазмиды рС4 котрансфицировали 0,5 мкг плазмиды р8У2пео с использованием липофектина. Плазмида р8У2-пео содержит доминантный селективный маркер, а именно ген пео от Τπ5, кодирующий фермент, который сообщает резистентность к группе антибиотиков, включая С418. Эти клетки высевали в среду альфа--МЕМ, в которую был добавлен 1 мкг/мл С418. Через два дня клетки трипсинизировали и высевали в планшеты для клонирования гибридом (Сгетег, Сегтапу) в среду альфа--МЕМ, в которую было добавлено 10, 25 или 50 нг/мл метотрексата плюс 1 мкг/мл С418. Примерно через 10-14 дней одиночные клоны трипсинизировали, а затем высевали в 6-луночные чашки Петри или в 10-мл колбы с различными концентрациями метотрексата (50, 100, 200, 400, 800 нМ). Затем клоны, выращенные при наибольших концентрациях метотрексата, переносили в новые 6-луночные чашки, содержащие еще большие концентрации метотрексата (1, 2, 5, 10, 20 мМ). Ту же самую процедуру повторяли до тех пор, пока не были получены клоны, которые росли при концентрации 100-200 мМ. Экспрессию нужного генного продукта анализировали, например, с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и вестерн-блоттинга или с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.
- 46 015262
Пример 2. Конструирование и скрининг анти-1Ь-6 антител.
Варианты анти-1Ь-6 антитела (клон АМЕ-А9) конструировали и скринировали на их активность. В этом примере и в других разделах СОВ определяли по Кэбату, за исключением области СЭВНЕ которую определяли по Кэбату и Чотия. Длина области СЭРН2 должна быть такой, чтобы можно было сконструировать две отдельных библиотеки, покрывающие всю область. Представляющие интерес клоны секвенировали и охарактеризовывали с помощью ЕЫ8А и клеточного анализа, после чего определяли кинетические константы.
Пример ЕЬ18А, проведенного с использованием очищенных 1дС, представлен на фиг. 9. В ЕЫ8А обычно используют микротитрационные планшеты Сок!аг 3366, сенсибилизированные козьим антителом против человеческой цепи каппа. Разведения РаЬ (или 1дС) инкубировали в сенсибилизированных лунках в течение 1 ч при 22°С. Затем лунки промывали РВ8, 0,1% твина 20 и в течение 1 ч добавляли биотинилированный 1Ь-6 при 200 нг/мл. После промывки добавляли конъюгат щелочной фосфатазы и авидина №и!гАу1бш и инкубировали в течение 1 ч при 22°С. После интенсивной промывки добавляли колориметрический субстрат и определяли уровень связанного 1Ь-6. Вариант такого ЕЫ8А включает более длительную стадию промывки в лабораторном стакане с РВ8, 0,01% В8А, при 37°С, после инкубирования биотинилированного 1Ь-6, например, эта стадия промывки продолжается 18 ч.
Некоторые из сконструированных человеческих реагирующих с 1Ь-6 моноклональных антител 1дС согласно изобретению имеют константы аффинности от 1х109 до 9х1012. Высокие аффинности таких сконструированных человеческих моноклональных антител позволяют использовать их в терапевтических целях для лечения 1Ь-6-зависимых заболеваний, патологий или ассоциированных с ними состояний.
Множество различных сконструированных вариантов человеческих анти-1Ь-6 антител было получено путем модификации одной или нескольких СОВ-областей антитела. В приведенной ниже табл. 3 в систематизированном виде даны предпочтительные мутации, которые были обнаружены в библиотеках СОВ индивидуумов (аминокислотные замены соответствуют варианту АМЕ-А9). Кроме того, в приведенной ниже табл. 13 представлены аминокислотные последовательности для СОВ легкой и тяжелой цепей с возможными положениями замен (обозначенными Х).
Комбинаторная библиотека была сконструирована на основе наилучших клонов (то есть вариантов), имеющихся в СОВ-библиотеках индивидуумов. В табл. 4 указаны мутации, которые были включены в такую комбинаторную библиотеку. Комбинаторную библиотеку скринировали и охарактеризовывали, как описано выше. Мутации, обнаруженные в шести из лучших клонов, представлены ниже в табл. 5 А, а номера 10 последовательностей для СОВ в этих клонах представлены в табл. 5В.
Оценка анти-1Ь-6 антител 1дС в клеточном анализе.
Химерное анти-1Ь-6 антитело и сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело (клон АМЕ-19а) тестировали на их способность предупреждать рост 1Ь-6-зависимой клеточной линии. Клетки 7ТЭ1 высевали в 96-луночный планшет Сок!аг 3610 при плотности 200 клеток на лунку. В эти лунки добавляли антитела, разведенные в среде 1М0М, а затем добавляли человеческий 1Ь-6 до конечной концентрации 500 пг/мл, и планшеты инкубировали в инкубаторе для культивирования тканей в течение 64-72 ч. На этой стадии во все лунки добавляли 50 мкл буфера для лизиса клеток, поставляемого с набором АТР11!е (Раскагб Вю8с1еисе), и планшеты встряхивали в течение 3 мин. Затем добавляли 50 мкл субстрата АТР11!е и сенсибилизированные планшеты встряхивали в течение 1 мин. Хемилюминесценцию определяли на люминометре.
Результаты клеточного анализа представлены на фиг. 10, а вычисленные величины ЕС50 представлены ниже в табл. 6. Величина ЕС50 для химерного анти-1Ь-6 антитела составляла 2,7х10-11М (4,09 нг/мл), а величина для сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела (клона АМЕ-19а) составляла 2,7х10-12М (0,41 нг/мл). Величина ЕС50 для сконструированного человеческого антитела была примерно в 10 раз выше, хотя может быть достигнуто примерно 10-60-кратное увеличение величины ЕС50, включая промежуточные величины.
Пример 3. Кинетика связывания сконструированных человеческих антител против человеческого 1Ь-6.
ЕЬ18А-анализ подтвердил, что антитело, выделенное из этих клеток-хозяев, связывается с 1Ь-6 в зависимости от концентрации. В данном случае была измерена аффинность антитела по отношению к его когнатному антигену (эпитопу). Количественные величины констант связывания получали с помощью анализа В1Асоге и с использованием оборудования КшЕхА 3000. Полученные результаты показали, что несколько сконструированных человеческих моноклональных антител имеют очень высокую аффинность при Кс в пределах от 1х 10-9 до 3х 10-14.
Для детектирования связывания 1Ь-6 с растворимым 1Ь-6-рецептором, 81Ь-6В, проводили иммуноферментный анализ (Е1А), в котором в качестве позитивного контроля использовали моноклональные антитела против человеческого 1Ь-6 (АМЕ-А9, АМЕ-А16, АМЕ-18а, АМЕ-20Ь, АМЕ-22а и АМЕ-23а) и СИТО 328. Растворимый человеческий 1Ь-6-рецептор, 81Ь-6В, и рекомбинантный человеческий 1Ь-6 получали от В&Л 8ук!ет8 (Ми^аро^, МИ) (Са!а1од #227-8В-025 и 206-1Ь-010 соответственно). Конъюгированное с пероксидазой хрена козье антитело против человеческого 1дС (цепь Н+Ь) получали от 1асккои
- 47 015262
Iттиηο^е8еа^сй (^е§! Стоме, РА) (Са!а1од # 109-035-003). Таблетки пероксида водорода и 0ΡΌ получали от 81дта (8!. Ьошк, М0) (Са!а1од # Н-1009 и Р-8287 соответственно).
Твердофазный иммуноферментный анализ на образование комплекса 8др80/I^-6/анти-I^-6 тАЬ.
Планшеты СоМаг ЕМ (Согшпд/Сойаг, Ас!оп, МА) (Са!а1од # 9018) покрывали 8ΙΕ-6Η (10 мкг/мл в РВ8, 100 мкл/лунку) в течение ночи при 4°С. Эти планшеты промывали 0,15 М физиологическим раствором, содержащим 0,02% (об./об.) твина 20, и лунки блокировали 1% (мас./об.) В8А в РВ8, 200 мкл/лунку, в течение одного часа при комнатной температуре. После этого лунки снова промывали, а затем инкубировали с 200 нг/мл человеческого ΙΕ-6 (100 мкл/лунку) в РВ8 в течение одного часа при комнатной температуре. После этого во все лунки добавляли 10-кратные серийные разведения антитела, начиная с концентрации 10 мкг/мл в 100 мкл/лунку в течение одного часа при комнатной температуре. После промывки лунки инкубировали с ПХ-конъюгированным козьим антителом против человеческого Ι§Ο (Н+Ь) (10 мкг/мл в РВ8) в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого лунки промывали и добавляли 100 мкл/лунку раствора цитратфосфатных субстратов (0,1М лимонная кислота и 0,2М фосфат натрия, 0,01% Н2О2 и 1 мг/мл 0РЭ) в течение 15 мин при комнатной температуре. Реакцию прекращали добавлением 25 мкл/лунку 4 N серной кислоты и 0Ό490 считывали на автоматическом ридере для ЕЫ8Апланшетов (Мо1еси1аг Пеукек 8рес!готах Р1и§, 8иппууа1е, СА).
Для оценки эффекта предварительного инкубирования ΙΕ-6 с моноклональными анти-йI^-6 антителами или СЫТ0 328, 200 нг/мл ΙΕ-6 (100 мкл) инкубировали с 10-кратными серийными разведениями антитела (100 мкл), начиная с 10 мкг/мл, в течение одного часа при комнатной температуре. Затем эту предварительно инкубированную смесь инкубировали с 5ΙΕ-6Β в течение одного часа при комнатной температуре, а детектирование комплекса 8I^-6Β/I^-6/антитело против человеческого ΙΕ-6 осуществляли с использованием ПХ-конъюгированного козьего антитела против человеческого ΙβΟ (Н+Ь), (10 мкг/мл в РВ8) в течение 30 мин при комнатной температуре. Остальные условия анализа были аналогичны условиям, описанным в предыдущем параграфе.
Проведенные ранее исследования показали, что СЫТ0 328 позволяет детектировать ΙΕ-6 при его захвате рецептором 8ΙΕ-6Η, который был нанесен на ЕМ-планшет, как описано в техническом отчете. Кроме того, антитела АМЕ-А9, АМЕ-А16, АМЕ-18а, АМЕ-20Ь, АМЕ-22а и АМЕ-23а позволяют детектировать дозозависимое связывание ΙΕ-6 с 5§р80 (8ГЕ-6В), проводимое с помощью ЕМ. Каждое сконструированное человеческое анти-ГЕ-6 антитело оценивали по сравнению с эталонным антителом СЫТ0 328. Однако предварительное инкубирование ΙΕ-6 и любого из этих моноклональных антител против ЫЬ-6 подавляло способность 5ΙΕ-6Β связываться с ΙΕ-6.
Измерение кинетических констант для анти-I^-6 Ι§Ο.
Для измерения кинетики связывания использовали оборудование КшЕхА 3000, изготовленное 8ар1бупе. Вкратце, человеческий ΙΕ-6 был ковалентно связан с алзактоновыми сферами, и с помощью вышеуказанного оборудования было детектировано связывание свободного Ι§Ο с указанными сферами. Для измерения Кс содержимое отдельных пробирок, включающих постоянную концентрацию 0,5, 1 или 5 пМ Ι§Ο со снижающимся серийным разведением человеческого ΙΕ-6, инкубировали в течение 3-4 дней при 20°С в 0,1% В8А, РВ8. Для определения каждой величины Кс было использовано всего 13 пробирок. Так, например, химерное анти-I^-6 антитело использовали при постоянной концентрации 5 пМ и отдельные пробирки инкубировали с 0-200 пМ ΙΕ-6. Инкубирование с другими Ι§Ο проводили аналогичным образом. После инкубирования уровень свободного Ι§Ο в каждом уравновешенном образце определяли на оборудовании К1пЕхА 3000 в соответствии с инструкциями производителя. Величины Кс определяли с помощью компьютерной программы К1пЕхА 3000 с использованием оборудования К1пЕхА 3000, как более подробно описано ниже.
Для измерения коп отдельные ΙβΟ при 200 пМ смешивали со 100-200 пМ человеческого ΙΕ-6, а несвязанный Ι§Ο детектировали по связыванию с человеческим ΙΕ-6, ковалентно присоединенным к алзактоновым сферам на оборудовании К1пЕхА 3000. Была проведена серия измерений. Полученные данные использовали для вычисления коп с помощью компьютерной программы КшЕхА 3000. коГГ вычисляли по формуле 1<и=ко[|/ко||. Кинетические константы для 3μη-ΙΕ-6 Ι§Ο систематизированы в табл. 7.
Пример 4. Ш У1!го характеризация ημη-ΙΕ^ антитела.
Ш У1!го исследования проводили для характеризации последовательности, специфичности к эпитопу, аффинности и биологической активности анти-I^-6 антитела.
Сконструированное человеческое тАЬ.
Анализ последовательности подтвердил, что анти-I^-6 антитело согласно изобретению (включая различные его варианты/клоны) содержит полностью человеческие каркасные области. В табл. 5а показано всего 10 аминокислотных остатков, замененных в СЭВ1, 2 и 3 тяжелой и легкой цепей ημη-ΙΕ^ антитела согласно изобретению (в различных вариантах антитела) по сравнению с остатками химерного ημή-ΙΕ^ антитела (описанного в РСТ \У0 04/039826).
Специфичность к эпитопу.
Анти-I^-6 антитело согласно изобретению и химерное анти-I^-6 антитело распознают аналогичные эпитопы на человеческом ΙΕ-6. Эти антитела не конкурируют с коммерчески доступными мышиными тАЬ против человеческого ΙΕ-6, поставляемыми компанией Η&Ό 8у§!ет5 #МАВ-206, что позволяет
- 48 015262 предположить, что такие антитела распознают эпитоп, который совершенно отличается от эпитопа, распознаваемого анти-1Ь-6 тАЬ Κ&Ό. Анти-1Ь-6 антитело согласно изобретению и химерное анти-1Ь-6 антитело не конкурируют с крысиным тАЬ против человеческого 1Ь-6 Κ&Ό.
Человеческий 1Ь-6 (200 нг/мл) захватывался связанным с планшетом анти-1Ь-6 тАЬ (мышиным тАЬ против человеческого 1Ь-6, МАВ-206, которое было использовано, только как связанное с планшетом тАЬ для захвата человеческого 1Ь-6) (10 мкг/мл), а затем в планшет добавляли серийные разведения анти-1Ь-6 антитела согласно изобретению и химерного анти-1Ь-6 антитела, как показано на оси X. Связывание с 1Ь-6 оценивали по увеличению величин 0П490, отложенных по оси Υ. Анти-1Ь-6 антитело согласно изобретению и химерное анти-1Ь-6 антитело связывались с 1Ь-6 в зависимости от дозы.
И наоборот, анти-1Ь-6 антитело согласно изобретению и химерное анти-1Ь-6 антитело конкурентно связывались с человеческим 1Ь-6, что позволяло предположить, что эти две молекулы имеют один и тот же эпитоп связывания на 1Ь-6. Человеческий 1Ь-6 (200 нг/мл) захватывался связанным с планшетом антителом МАВ-206 (10 мкг/мл). Затем в планшет добавляли серийные разведения анти-1Ь-6 антитела согласно изобретению, указанные на оси X, и 50 нг/мл биотинилированного химерного анти-1Ь-6 антитела. Связывание биотинилированного химерного анти-1Ь-6 антитела с 1Ь-6 детектировали с помощью стрептавидина-ПХ и измеряли как величины 0П490, отложенные по оси Υ.
Кроме того, сконструированные человеческие и химерные антитела обладают аналогичными способностями связываться с комплексом к1Ь-6/к1Ь-6Я (фиг. 1). Анти-1Ь-6 антитело согласно изобретению связывается с комплексом к1Ь-6/к1Ь-6Я. Растворимый 1Ь-6-рецептор (к1Ь-6Я) наносили на планшет при концентрации 10 мкг/мл. В этот планшет добавляли человеческий 1Ь-6 при концентрации 200 нг/мл. Затем в планшет добавляли серийные разведения анти-1Ь-6 антитела согласно изобретению или химерного анти-1Ь-6 антитела, указанные по оси X, после чего детектировали связывание с комплексом к1Ь-6/к1Ь-6Я с использованием ПХ-конъюгированного антитела против человеческих 1дС и выражали как величины 0Ό49ο, отложенные по оси Υ.
Для дополнительного подтверждения полученных выше результатов проводили тест на перекрестную межвидовую реактивность с использованием 1Ь-6-содержащего кондиционированного супернатанта, полученного от ЛПС- или ШЫу-стимулированных МКПК различных видов, в анализе на пролиферацию клеток 7ТО1 (1Ь-6-зависимой мышиной гибридомной клеточной линии). Было обнаружено, что сконструированное человеческое антитело согласно изобретению нейтрализует активность кондиционированных супернатантов, направленную на стимуляцию пролиферации клеток 7ТО1 у приматов различных видов, включая человека, игрунок, собакоподобных обезьян, шимпанзе, макак-резусов, павианов, свинохвостых макак и эдиповых тамаринов Жоффруа (с ватной макушкой), и обнаруживает перекрестную аналогичную межвидовую реактивность, сравнимую с химерным антителом (табл. 8).
И наконец, было обнаружено, что при картировании эпитопов методом гидролиза трипсином, сконструированное человеческое антитело и химерное антитело связывались с одним и тем же эпитопом на человеческом 1Ь-6, и этот эпитоп был локализован в положениях аминокислотных остатков 168-184 спирали Ό (фиг. 3). Недавно проведенный анализ на мутации подтвердил, что остатки 179 и 182 играют важную роль в связывании антитела согласно изобретению с 1Ь-6. Этот эпитоп (аминокислотные остатки 168-184) идентифицировали как поверхностный участок 1Ь-6, который удерживает дейтерий в присутствии сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела.
Биологическая активность.
Способность сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела нейтрализовать 1Ь-6 была определена в биоанализе с использованием клеток 7ТО1. В анализе на пролиферацию клеток 7ТО1 сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело обнаруживало нейтрализующую способность, которая в 10 раз превышала нейтрализующую способность химерного анти-1Ь-6 антитела. Клетки 7ТЭ1 стимулировали 500 пг/мл й1Ь-6 в присутствии серийных разведений сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела или химерного анти-1Ь-6 антитела либо тАЬ контрольного изотипа в течение 72 ч. Пролиферацию клеток измеряли как число клеток в секунду, отложенное по оси Υ. Величина ошибки означает среднее отклонение (8Ό) для образцов в дубликатах. Заштрихованными кружками показаны клетки без 1Ь-6; незаштрихованными кружками показаны клетки, стимулированные 500 пг/мл й1Ь-6.
Сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело также ингибирует 1Ь-6-индуцированное продуцирование моноцитарного белка-хемоатрактанта-1 (МСР-1) клетками И937 (фиг. 3) и 1Ь-6/1Ь-1 βиндуцированное продуцирование сывороточного амилоида А (8АА) клетками человеческой гепатомы НерС2 (фиг. 4). На фиг. 3 показано, что сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело ингибирует 1Ь-6-стимулируемую секрецию МСР-1 клетками И937. 5х105 клеток/лунку обрабатывали 1 нг/мл ЫЬ-6 и серийных разведений сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела в течение 72 ч. Супернатанты клеточной культуры анализировали с тремя повторами с помощью ЕЬ18А на присутствие МСР-1.
На фиг. 4 показано, что сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело ингибирует 1Ь-6- и 1Ь-1в-стимулируемую секрецию 8АА клетками НерС2. 2,25х105 клеток стимулировали 100 нг/мл ЫЬ-6, 200 нг/мл к1Ь-6Я и 1 нг/мл ГС-1 β в присутствии серийных разведений сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела в течение 24 ч. Затем супернатанты клеточной культуры анализировали в дубликатах
- 49 015262 с помощью ЕЫ8А на присутствие 8АА.
1Ь-6-зависимое фосфорилирование 8ТАТ3.
Для оценки способности сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела блокировать каскад реакций передачи сигнала связывания 1Ь-6 с 1Б-6К и др130 был проведен анализ методом иммунопреципитации для определения влияния на 1Ь-6-зависимое фосфориливание 8ТАТ3 в клетках ТНР-1, на поверхности которых экспрессируется др130.
тАЬ§ были стерильно отфильтрованы и стерилизованы на фильтре, после чего их хранили в РВ8 при 4°С. Были использованы рекомбинантный человеческий 1Ь-6 (206-1Б-010) и §1Ь-6К (227-8К-025) от Κ&Ό 8уЧет5 (М1ппеаро118, ΜΝ). Среду КРМ1 (11875-085), термоинактивированную фетальную бычью сыворотку (16000-069), Ь-глутамин (25030-081), несущественные аминокислоты (11140-050) и пируват натрия (11360-070) получали от 1пу11годеп (СагкЬай, СА). Был также использован ТВ8 (10 мМ трис, рН 7,5, 100 мМ №С1).
Человеческая клеточная линия острого моноцитарного лейкоза, ТНР-1, полученная из банков клеток Научно-исследовательских институтов, была протестирована на отсутствие микоплазмы и бактерий. Эти клетки культивировали в среде ΚΓΜΙ, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку, 2 мМ глутамина и 1 мМ пирувата натрия. Клетки субкультивировали или собирали, когда они достигали примерно 85%-ной конфлюэнтности. Затем через каждые три дня клетки разводили 1:5 рутинным способом.
Для фосфорилирования тирозина клетки культивировали до 80-90% конфлюэнтности в колбах Т-225. Затем среду удаляли и заменяли свежей бессывороточной средой, после чего клетки инкубировали в течение ночи. После выращивания клеток в бессывороточной среде их собирали из каждой колбы, осаждали и клетки в конечной концентрации 20х106 для каждого условия культивирования ресуспендировали в 0,5 мл бессывороточной среды.
КЫЬ-6 (0,1 мкг/мл) предварительно инкубировали при 37°С в течение 15 мин со следующими реагентами: 0,5 мл одной среды, анти-1Ь-6 АЬ (10 мкг/мл) и 81Б-6К (0,2 мкг/мл). Затем к клеткам, предварительно инкубированным с анти-1Ь-6 АЬ и 81Ь-6К, соответственно, добавляли 81Б-6К (0,2 мкг/мл) и анти1Ь-6 АЬ (10 мкг/мл), после чего инкубировали при 37°С в течение 15 мин. Затем клетки объединяли со средой, используемой в качестве негативного контроля, и с комплексом 1Ь-6/АЬ/81Т-6К, после чего инкубировали при 37°С в течение 6 мин. Клетки два раза промывали в охлажденном льдом ТВ8 и клеточный осадок либо обрабатывали, как описано в разделе 5.4, либо хранили при -70°С.
Для иммунопреципитации клеточный осадок лизировали в 1 мл буфера для лизиса (50 мМ трис, рН 7,5, 300 мМ №С1, 0,5% Тп1оп-Х-100) (Т-9284, 81дта, 81. Ьошк, МО), содержащего таблетку со смесью полного набора ингибиторов протеазы (1697498, КоеБе, Ва§е1, 8\\з1хег1апй). Клетки интенсивно встряхивали в течение 30 с и инкубировали при -70°С в течение 20-60 мин. Клеточный дебрис удаляли путем центрифугирования при 13000 об/мин в течение 20 мин. Для снижения уровня неспецифического фонового окрашивания образцы предварительно очищали путем инкубирования с 2 мкг кроличьего 1дС (15006, 81дта, 81. Ьоищ, МО) и 50 мкл белка А - агарозы (8С-2001, 8ап!а Сгих В1о1есЬпо1оду, 8ап!а Сгих, СА) в течение 1 ч при 4°С на орбитальном шейкере. Агарозные сферы удаляли путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 5 мин. Осветленные лизаты переносили в микроцентрифужные пробирки и инкубировали с анти-8ТАТ3 антителом (2 мкг/мл) (8С-7179, 8ап1а Сгих Вю1есЬпо1оду) в течение ночи при 4°С на орбитальном шейкере, а затем добавляли 50 мкл агарозных сфер с белком А и инкубировали в течение 2 ч при 4°С на орбитальном шейкере. Агарозные сферы собирали путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 5 мин и 5 раз промывали в охлажденном льдом ТВ8 при 4°С. Затем агарозные сферы ресуспендировали в 40 мкл буфера Лэммли для образцов плюс ОТТ (№0007-465030, 1пу11годеп, СагкЬай, СА) и нагревали при 95°С в течение 5 мин.
Образцы разделяли на 3-8% бис-трис-геле ШРаде (ЕА0375В0Х, 1пу11годеп, СагНЬай, СА) с использованием рабочего буфера (№0002-465026, 1пу11годеп, СагНЬай, СА) при 100 В в течение 1 ч. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (БС2001, 1пу11годеп, СагНЬай, СА) с использованием буфера для переноса (№0006-465029, 1пу11годеп, СагкЬай, СА) при 30 В в течение 1 ч. Эти мембраны блокировали в 10% обезжиренном сухом молоке (№§11е, 61епйа1е, СаНГогша) в ТВ8-Т в течение ночи при 4°С. После нескольких промывок в ТВ8-Т при комнатной температуре эти мембраны инкубировали с мышиным моноклональным АЬ против р-8ТАТ3 (8С-8059, 8ап1а Сгих В1о1есЬпо1оду, 8ап1а Сгих, СА), разведенным 1:1000 в ТВ8-Т, в течение 4 ч при 4°С на орбитальном шейкере. После нескольких промывок мембраны инкубировали с ПХ-конъюгированным ослиным антителом против мышиных 1дС (1:1000) (8С-2318, 8ап1а Сгих В1о1есЬпо1оду, 8ап1а Сгих, СА) при комнатной температуре в течение 2 ч на орбитальном миксере. После нескольких промывок образцы детектировали с использованием реагентов для детекции в вестерн-блот-анализе ЕСЬр1и8 и набора для анализа (№N2108, АтегаБат Вюкшепсек, Р18са1ауау, N1) в соответствии с инструкциями производителя, а затем визуализировали путем экспонирования с ЭХЛ-пленкой. Затем из мембран удаляли АЬ путем погружения в 100 мМ ОТТ, 2% ДСН, 62,5% мМ трис-НС1, рН 6,7, при 100°С в течение 30 мин при перемешивании. После этого мембраны промывали в ТВ8-Т и блокировали в течение ночи 10% обезжиренным сухим молоком. Мембраны промывали и инкубировали с анти-8ТАТ3 антителом (1:1000) (8С-7179, 8ап1а Сгих Вю1есЬпо1оду) в ТВ8-Т в течение 2 ч при 4°С, а затем 5 раз промывали и инкубировали в течение 1 ч с ПХ-конъюгированным
- 50 015262 козьим антителом против кроличьих 1дС (1:1000) (8С2030, 8аи!а Сгих В1о!есЬпо1оду, 8ап!а Сгих, СА), после чего проводили детектирующий анализ с использованием ЕСЬр1из. Все мембраны очищали рутинным способом и снова зондировали белком 8ТАТ3 для подтверждения присутствия белка 8ТАТ3.
Полученные результаты показали, что сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело блокировало 1Ь-6-опосредованное фосфорилирование 8ТАТ3, то есть ключевого компонента в пути передачи сигнала 1Ь-6 (фиг. 5А и 5В). Сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело (АМЕ-19А) ингибировало 1Ь-6/51Ь-6Я-индуцированное фосфорилирование 8ТАТ3. Фосфорилирование 8ТАТ3, индуцированное рекомбинантным человеческим 1Ь-6/51Ь-6Я, детектировали в клетках ТНР-1 (фиг. 5В). Добавление 10 мкг/мл сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела (АМЕ-19А) или химерного анти-1Ь-6 антитела приводило к полному ингибированию фосфорилирования 8ТАТ3 (фиг. 5В). На фиг. 5А продемонстрировано присутствие аналогичного количества нефосфорилированного белка 8ТАТ3 во всех образцах, соответствующих различным клонам сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела. Используемое здесь обозначение СNТ0328 (или 328) означает химерное антитело человек-мышь (также называемое антителом дикого типа (УТ)); 150 означает клон АМЕ-22а; 143 означает клон АМЕ-23а; 140 означает клон АМЕ-20Ь; 136 означает клон АМЕ-19а; 130 означает клон АМЕ-18а; 106 означает клон АМЕ-А16; а 104 означает клон АМЕ-А9.
1п у1уо эффективность сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела.
Эффективность сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела оценивали на двух различных моделях 1п у1уо. Сначала были протестированы эффекты сконструированного человеческого и химерного анти-1Ь-6 антител, после чего проводили их сравнительную оценку в анализе на ангиогенез, индуцированный человеческим 1Ь-6, где указанный анализ осуществляли в матриксном блоке Ма!пде1, вводимом мышам. В матриксный блок Ма!лде1 вводили 200 нг/мл человеческого 1Ь-6. Каждой голой мыши инъецировали два матриксных блока Ма!лде1. Группам из шести мышей ί.ν. инъецировали 1, 3 или 6 мг/кг сконструированного человеческого или химерного анти-1Ь-6 антитела. Контрольным группам также вводили РВ8 или тАЬ контрольного изотипа. На 7 день блоки удаляли и измеряли уровень ангиогенеза по содержанию гемоглобина, длине микрососудов и числу микрососудов в этих блоках. Полученные результаты показали, что человеческий 1Ь-6 (РВ8-группа) стимулировал ангиогенез в модели с матриксным блоком Ма!пде1, как было измерено по всем трем параметрам.
Сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело (АМЕ-19А) ингибировало образование микрососудов на среднем уровне в блоках Ма!пде1. Кроме того, сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело (АМЕ-19А) снижало среднюю длину микрососудов в блоках Ма!пде1. Сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело (АМЕ-19А) также снижало уровень гемоглобина в блоках Ма!пде1.
Кроме того, сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело (АМЕ-19А) и химерное анти-1Ь-6 антитело ингибировало 1Ь-6-опосредуемый ангиогенез у голых мышей в зависимости от дозы. И наконец, сконструированное человеческое и химерное анти-1Ь-6 антитела обладали сравнимой активностью, направленной на ингибирование 1Ь-6-индуцированного ангиогенеза при 6 мг/кг, то есть при наивысшей тестируемой дозе. Хотя химерное анти-1Ь-6 антитело в значительной степени ингибировало индуцированный человеческим 1Ь-6 ангиогенез при 3 мг/кг, как было измерено по длине и по числу сосудов, однако, какого-либо статистически значимого различия между сконструированным человеческим и химерным анти-1Ь-6 антителами при этих дозах не наблюдалось.
Для дополнительной оценки влияния сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела на индуцированное человеческим 1Ь-6 продуцирование продукта острой фазы заболевания, а именно сывороточного амилоидного белка А (8АА), у мышей Ва1Ь/С, была дополнительно разработана модель ш νί\Ό. Мышам 1.р. вводили 0,01, 0,5 или 5 мг/кг сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела за 4 ч до ί.ν. введения 5 мкг/кг человеческого 1Ь-6 (фиг. 6). В качестве контроля использовали РВ8 и тАЬ контрольного изотипа. Через 16 ч после инъекции 1Ь-6 определяли уровни 8АА в сыворотке. Сконструированное человеческое и химерное анти-1Ь-6 антитела значительно ингибировали индуцированное человеческим. 1Ь-6 продуцирование 8АА у мышей Ва1Ь/С при 0,5 и 5 мг/кг, причем сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело значительно ингибировало продуцирование 8АА при наименьшей тестируемой дозе. Однако какого-либо статистически значимого различия между сконструированным человеческим и химерным анти-1Ь-6 антителами при всех трех тестируемых дозах не наблюдалось (фиг. 6).
На фиг. 6 показано, что сконструированное человеческое анти-1Ь-6 антитело ингибирует индуцированное человеческим 1Ь-6 продуцирование 8АА. Каждая точка означает среднюю величину 8АА для каждого животного, а линия представляет собой среднее для всех частных значений в каждой группе. Затем для исключения общей ошибки I рода проводили попарное сравнение с использованием критерия Тьюки в целях определения 95% совместных доверительных интервалов (**р<0,001, *р<0,05).
Пример 5. Механизм терапевтического действия ημη-ΓΕ^ тАЬ. Ревматоидный артрит. Воздействие анти-ГГ-6 тАЬ на индуцированный коллагеном артрит (С!А) у животного с моделью ревматоидного артрита. Модели ш νί\Ό преклинической стадии заболевания.
В ряде 1п νί\Ό моделей в качестве мишени служил ГГ-6. В стандартных мышиных моделях использовали крысиное антитело против мышиных ΣΓ-6, либо, в случае моделей-приматов и моделей человек/мышь 8СГО, использовали гуманизованное анти-[Е-6Р тАЬ (80 кДа) (МЯА; Сйида1). У мышей с мо
- 51 015262 делью индуцированного коллагеном артрита (С1А) анти-1Ь-6 антитело было эффективным для предупреждения заболевания в том случае, когда оно использовалось на ранней стадии (на день 0 или 3 после введения коллагена), но не на более поздних стадиях. В модели трансплантата человек/мышь 8СГО, где иммунодефицитным мышам трансплантировали человеческую синовиальную ткань, МРА-обработка приводила к сжатию тканевых имплантатов и к снижению числа воспалительных клеток и остеокластов. У собакоподобных обезьян с индуцированным коллагеном артритом (С1А) МРА ингибировало развитие артрита и снижало уровень продуцирования продуктов острой фазы заболевания.
Влияние суррогатного тАЬ против мышиного 1Ь-6 на развитие заболевания оценивали на С1А-модели. Полученные результаты показали, что 1.р. введение антитела против мышиного 1Ь-6 при 1 мг/мышь в неделю до индуцирования заболевания приводило к значительному подавлению развития индуцированного коллагеном артрита, на что указывало заметное снижение тяжести заболевания. Артрит был индуцирован у 8-недельных мышей ЛВА/1 Ьас1 100 мкг бычьего коллагена типа II в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ), вводимого чрескожно в основание хвоста. Мышей подвергали ежедневному клиническому мониторингу на начало развития заболевания. Анти-1Ь-6 тАЬ или тАЬ контрольного изотипа вводили 1.р. за 2 дня до индуцирования С1А, а затем еженедельно в дозе 1 мг/мышь. Тяжесть течения артрита оценивали по опуханию, эритеме и выраженным порокам суставов.
Результаты гистопатологического анализа подтвердили клинические наблюдения, а именно показали, что еженедельная 1.р. инъекция тАЬ против мышиного 1Ь-6 приводила к значительному улучшению параметров течения индуцированного коллагеном артрита. Все оцениваемые параметры артрита, включая воспалительный ответ (синовит и образование паннуса) и эрозивные изменения (эрозии и изменения всей структуры сустава), значительно улучшались у мышей, обработанных антителом против мышиного 1Ь-6, по сравнению с животными, обработанными контрольным тАЬ. Анти-1Ь-6 тАЬ ингибировало развитие артрита на гистопатологическом уровне. Оценку синовита проводили, исходя из толщины синовиальной оболочки; образование паннуса оценивали по степени развития паннуса на поверхности сустава, а эрозию оценивали по степени поражения хряща и подхрящевой кости.
У мышей, обработанных тАЬ против мышиного 1Ь-6, наблюдалось значительное снижение потери белков хрящевого матрикса. Репрезентативные срезы суставов, полученные по окончании исследований (день 53) от контрольных животных и животных, обработанных анти-1Ь-6 тАЬ, оценивали на состояние хрящевого матрикса по окрашиванию толуидиновым синим.
Микро-КТ-анализ подтвердил клинические наблюдения и показал, что терапия с применением антитела против мышиного 1Ь-6 оказывает благоприятное воздействие на снижение уровня прогрессирования заболевания в отдельном суставе. Визуальная оценка типичных трехмерных (3Ό) изображений, сделанных с помощью компьютерной томографии (КТ), указывала на заметную степень эрозивных изменений, которые происходят у группы животных, обработанных тАЬ контрольного изотипа, по сравнению с преимущественно слабыми воспалительными изменениями мягкой ткани суставов у животных, обработанных антителом против мышиного 1Ь-6. Эти эксперименты проводили на репрезентативных животных, обработанных контрольным тАЬ, и животных, обработанных тАЬ против мышиного 1Ь-6.
Волчанка. Действие анти-1Ь-6 антитела у мышей NΖВ/\V Е1. Модели ш νί\Ό преклинической стадии заболевания.
Существуют мышиные модели с СКВ, и эти модели заболевания имеют близкое сходство с человеческим заболеванием. Исследования мышей МРЬ/1рг и NΖВ/\V Е1 продемонстрировали гиперпролиферацию В-клеток, продуцирование аутоантител и отложение иммунного комплекса, которые имеют очень близкое сходство с симптомами человеческого заболевания. Было показано, что анти-1Ь-6 тАЬ эффективно ингибирует продуцирование аутоантитела, снижает уровень протеинурии и повышает выживаемость мышей NΖВ/\V Е1.
Влияние суррогатного тАЬ против мышиного 1Ь-6 на развитие волчанки оценивали на мышах NΖВ/\V Е1. Результаты предварительных исследований показали, что 1.р. введение тАЬ против мышиного 1Ь-6 при 1 мг/мышь/неделю в течение 22 недель приводило к подавлению продуцирования антидцДНК аутоантитела, главного патогенного аутоантитела в этой модели заболевания (фиг. 7). Уровни аутоантител против дцДНК у животных, обработанных анти-1Ь-6 тАЬ, были стабильно ниже уровней у животных, обработанных физиологическим раствором и контрольным АЬ, во время всего исследования.
Как обсуждалось выше, на фиг. 7 показано ингибирование продуцирования аутоантител против дцДНК под действием анти-1Ь-6 тАЬ у мышей NΖВ/\V Е1. Величины 0.Л. для каждого отдельного образца нормализовали на величины, полученные для сыворотки позитивного контроля, и выражали в % от позитивного контроля. Каждое значение представляет собой % от позитивного контроля для каждого образца, а линия представляет собой среднее для всех частных значений в каждой группе. Значимое различие представлено как *р<0,01.
Кроме того, оценка небольшой субпопуляции животных показала, что анти-1Ь-6 тАЬ ингибировало пролиферацию В-клеток и снижало степень повреждения почек. По окончании исследования не наблюдалось какого-либо значимого различия в пролиферации Т-клеток у различных групп обработки, тогда как у мышей, обработанных анти-1Ь-6 тАЬ, по сравнению с мышами, обработанными физиологическим раствором, пролиферация В-клеток, индуцируемая анти-1дМ антителом и анти-СЛ40 антителом, снижа- 52 015262 лась с течением времени, а именно через 34 недели. Этот результат совпадал с полученным выше результатом, который указывал на снижение уровня продуцирования аутоантитела против дцДНК, что позволяет предположить, что аутореактивные В-клетки могут служить непосредственной и преимущественной мишенью для терапии с использованием анти-1Ь-6 тАЬ.
Гистопатологический анализ показал, что животные в этом исследовании могут быть подразделены на 3 группы по тяжести заболевания почек (слабое, умеренное и тяжелое) (табл. 9). Почечная патология у мышей Н2В/\У Ρ1 характеризовалась смешанной лимфоидной гиперплазией и отложением иммунных комплексов в гломерулярной базальной мембране.
У животных, обработанных анти-1Ь-6 тАЬ, развивалось менее тяжелое почечное заболевание. У животных, обработанных анти-1Ь-6 тАЬ, отсутствовали периваскулярная смешанная лимфоидная гиперплазия и отложение белка, а у животных, обработанных физиологическим раствором и контрольным АЬ, наблюдались умеренная и тяжелая форма периваскулярной смешанной лимфоидной гиперплазии и отложение белка. Кроме того, у животных, обработанных анти-1Ь-6 тАЬ, по сравнению с животными двух других групп обработки, наблюдалось незначительное отложение иммунных комплексов в гломерулярной базальной мембране. Для того чтобы определить, играют ли эти клетки решающую роль в патогенезе СКВ, был также проведен другой анализ механизма действия анти-1Ь-6 тАЬ на функции В-клеток, Т-клеток и макрофагов.
Сахарный диабет типа ΙΙ.
Было показано, что 1Ь-6 играет важную роль в развитии инсулинорезистентности, ассоциированной с ожирением. Однако результаты ίη уйго и ίη у1уо анализов как подтверждают, так и опровергают его возможную роль в развитии инсулинорезистентности.
Ιη уйго эксперименты.
Для лучшего понимания действия, которое может оказывать 1Ь-6 на передачу инсулинового сигнала и на биологические эффекты и функцию инсулина, такие как поглощение глюкозы, регуляция генов и связанные с ними механизмы, были проведены эксперименты с использованием ίη уйго моделей восприимчивых к инсулину тканей (клеток 3Т3 Ь1 жировой ткани, клеток НерС2 печени, клеток С2С12 скелетной мышцы) и ίη у1уо моделей инсулинорезистентности и сахарного диабета типа II (Τ2^М), таких как мыши бЬ/бЬ.
Данные ίη уйго анализа дают основание предположить, что основное действие 1Ь-6 направлено на передачу инсулинового сигнала в печени. 1Ь-6-обработка клеток НерС2 приводила к ингибированию индуцированного инсулином фосфорилирования Ак!. Такое ингибирующее действие 1Ь-6 на передачу инсулинового сигнала блокируется анти-1Ь-6 антителом. Изменение метаболизма глюкозы и действия инсулина в печени позволяет предположить, что они являются главной причиной развития инсулинорезистентности и Τ2Ό. Влияние 1Ь-6 на передачу инсулинового сигнала в клетках 3Т3 Ь1 (клеточной линии адипоцитов) и С2С12 (клеточной линии скелетной мышцы) оценивали для определения механизмов действия 1Ь-6 при Τ2Ό.
3Т3 Ь1. Эксперименты проводили с использованием клеточной линии мышиных адипоцитов 3Т3 Ь1. В 90% дифференцированных клеток 3Т3 Ь1 было оценено влияние 1Ь-6 на индуцированное инсулином поглощение глюкозы. В этих экспериментах обработка 10 нг/мл ΤΝΡα в течение 24 ч приводила к стабильному ингибированию индуцированного инсулином поглощения глюкозы, тогда как обработка 20 нг/мл 1Ь-6 не давала какого-либо эффекта. Эти данные позволяют предположить, что активность 1Ь-6 в жировой ткани не является главным механизмом 1Ь-6-опосредуемой инсулинорезистентности, и скорее сама жировая ткань может служить главным источником 1Ь-6, который затем оказывает негативное воздействие на чувствительность к инсулину в печени и в мышцах. Аналогичные данные были получены с использованием дифференцированных первичных человеческих адипоцитов, высвобождаемых из подкожно введенного депо. Влияние 1Ь-6 на поглощение глюкозы оценивали с использованием человеческих первичных адипоцитов, высвобождаемых из жирового депо внутренних органов, поскольку такое депо должно быть более подходящим для оценки инсулинорезистентности, ассоциированной с ожирением.
НерС2. Клетки НерС2 были выбраны в качестве репрезентативной ткани печени ίη уйго. Клетки НерС2 представляют собой клеточную линию человеческой гепатомы, в которой ранее наблюдалось влияние 1Ь-6 на передачу инсулинового сигнала. В этих экспериментах 20 нг/мл 1Ь-6 блокировали индуцированное инсулином фосфорилирование киназы Ак!, которая играет решающую роль в пути передачи инсулинового сигнала, причем максимальный эффект наблюдался после 60-минутного инкубирования, и полученный результат совпадал с результатами, сообщаемыми в научной литературе.
Фосфорилирование Ак! на субконфлюэнтных клетках НерС2 в 10-см чашках измеряли после инкубирования гЫЬ-6 (20 нг/мл) в течение 30, 60, 90 и 120 мин. В течение последних 5 мин инкубирования добавляли 0,5, 1 и 5 нМ инсулина для индуцирования фосфорилирования Ак!. Клетки подвергали лизису с использованием модифицированного буфера для лизиса КРРА и уровень фосфорилирования Ак! измеряли с помощью ЕЫ8А-анализа 8ег-фосфо-Ак!. Результаты получали с использованием наборов для ЕЫ8А рАк! и Ак! (Вю8оигсе). После 60-минутной 1Ь-6-обработки в присутствии физиологической концентрации инсулина (0,5-1 нМ) фосфорилирование Ак! ингибировалось на ~50% по сравнению с кон
- 53 015262 трольной группой. Концентрации белка количественно оценивали с помощью набора для анализа белка РЧегсе ВСА.
Действие 8^^-^-6 антитела.
Определяли способность сконструированного человеческого :^11-^-6 антитела ингибировать воздействие ГЕ-6 на индуцированное инсулином фосфорилирование Ак!
Сконструированное человеческое :^11-^-6 антитело в количестве 20 мкг/мл было способно ингибировать действие ^-6 в клетках НерС2. На фиг. 8А и 8В проиллюстрировано воздействие ^-6 на индуцированное инсулином фосфорилирование Ак! в присутствии и в отсутствии сконструированного человеческого 34^1-^-6 антитела.
Данные, указанные в верхней части снимка (фиг. 8А), представляют среднее ± ср. кв.от. (* - значимая величина по сравнению с (+) инсулином, ^-6, Р=0,029; ** - значимая величина по сравнению с (+) инсулином, +^-6, Р=0,02). Субконфлюэнтные клетки НерС2 обрабатывали 20 нг/мл ^-6 в течение 60 мин. В последние 5 мин обработки добавляли 1 нМ инсулина и клетки подвергали лизису с использованием модифицированного буфера ШРА. Образцы анализировали с помощью ЕМЗА, в котором было детектировано фосфорилирование Ак! в положении 8ег 473. Все данные нормализовали по общему Ак!, измеренному в ЕБКА. АМЕ-19а-обработка приводила к восстановлению нормального Ак!-сигнала.
В нижней части снимка (фиг. 8В) представлен репрезентативный вестерн-блот. Верхние полосы соответствуют образцам, обработанным ^-6 (20 нг/мл, 60 мин, 5 мин с 1 нМ инсулина), АМЕ-19а (20 мкг/мл, в присутствии или в отсутствии ^-6 при 20 нг/мл в течение 60 мин, 5 мин с 1 нМ инсулина) или буфером. Блоты зондировали антифосфо-8ег/Ак! антителом (верхняя панель) (р8473, Вюкоигсе). Нижние полосы (тот же самый блот был очищен и снова зондирован анти-Ак! антителом, полученным от В1о8оигсе) указывают на то, что на каждую дорожку был загружен эквивалентный белок.
Метод.
Клетки НЕРС2 культивировали в 100-мм чашках для культивирования тканей до достижения конфлюэнтности. Клетки выдерживали в минимальной среде ЭМЕМ-1%В8А в течение ночи. АМЕ-19а (20 мкг/мл) инкубировали на клетках в течение ~30 мин перед добавлением ^-6. ^-6 (20 нг/мл) в присутствии и в отсутствии АМЕ-19а (20 мкг/мл) инкубировали в течение ~30 мин, а затем добавляли к клеткам. Образцы инкубировали на клетках в течение 60 мин при 37°С; а затем к клеткам в течение 5 мин при комнатной температуре добавляли 1 нМ инсулин (в конечной концентрации). Клетки сразу 3 раза промывали охлажденным на льду РВ8. Планшеты замораживали до проведения лизиса. Уровень фосфо-Ак! и общего Ак! определяли с помощью наборов для ЕЕЧ8А (Вю8оигсе апб 81дта). Ссылки: Ч.Ч. 8епп, Р.Е Коуег, ГА. №\\Ы< апб К.А. Моопеу. Шебеикт 6 тбисек се11и1аг ткикп геЧЧапсе т НераЮсу!ек, Э1аЬе!е8., 51:3391-3399, 2002.
Первичные крысиные гепатоциты.
Первичные гепатоциты представляют собой наиболее релевантную ш νίΙΐΌ систему, подходящую для анализа влияния ^-6 и анти-I^-6 антител (или других антагонистов ^-6) на передачу инсулинового сигнала и влияния инсулина на продуцирование глюкозы в печени. Для определения активации киназы РШ (РЫК) в крысиных гепатоцитах, обработанных инсулином, ^-6 и/или анти-I^-6 тАЬ, выделенные клетки обрабатывали инсулином в присутствии и в отсутствии 5 нг/мл ^-6, и уровень фосфорилирования инсулинового рецептора ^8-1 (фиг. 12А) и Ак! (фиг. 12В) определяли с помощью ЕМЗА-анализов и вестерн-блот-анализа. Кроме того, оценивали влияние ^-6 на стимулированное инсулином связывание Ы81 с р85 (фиг. 11А и В). Эти эксперименты проводили следующим образом.
Первичные гепатоциты крыс (в возрасте ~2 месяца) в 6-луночных покрытых коллагеном планшетах уравновешивали в течение ночи в среде с гепатоэнзимом. На следующий день клетки на 6 ч помещали в минимальную поддерживающую среду ЭМЕМ, содержащую 1% В8А-пенициллин-стрептамицин; а затем инкубировали с ЫЕ-6 (5 нг/мл), с анти-I^-6 антителом (АМЕ-19а) (20 нг/мл) или с анти-I^-6 антителом (АМЕ-19а) + ЫЕ-6 в течение 90 мин при 37°С. Клетки предварительно обрабатывали в течение 1 ч анти-I^-6 антителом (АМЕ-19а), а затем добавляли комбинацию антител. Перед добавлением к клеткам эту комбинацию также предварительно инкубировали. К клеткам в течение 5 мин добавляли 5 нМ инсулин (Вю8оигсе), а затем клетки отсасывали и сразу подвергали лизису буфером для экстракции Вю8оигсе вместе с ингибиторами протеазы. Лизаты центрифугировали и супернатанты разводили 1:10 и тестировали в ЕЕЧ8А (Вюкоигсе).
Связывание Ш81 с р85.
Равные количества белка (45 мкг) инкубировали в течение ночи с 2 мкг поликлонального анти4К8-1 антитела (ирк1а!е, Йет #06-248). Затем образцы подвергали иммунопреципитации сферами белка А в течение 1 ч и элюировали 3х буфером для образцов в целях проведения электрофореза в ДСН-ПААГ. Затем Ш образцы подвергали электрофорезу в 4-12% ПААГ с ДСН, после чего переносили на мембраны для вестерн-блот-анализа. Эти мембраны зондировали: (1) разведенным 1:100 анти-р85 тАЬ (ирк!а!е, Пет #05-217) на ШБ-1, связанный с р85, то есть с активной РЫК (как показано на фиг. 11А); и (2) разведенным 1:600 анти-ЖБб тАЬ (ВЭ ВюксЧепсек, Пет #611395) на общий ^8-1, используемый в качестве контрольной загрузки (как показано на фиг. 11В).
- 54 015262
Эти данные показали, что ГЬ-6-обработка приводит к снижению индуцированного инсулином фосфорилирования 1В, 1В8-1 и Ак1. Если клетки были предварительно обработаны анти-1Ь-6 антителом (клоном АМЕ-19а), то это действие 1Ь-6 прекращалось. Кроме того, 1Ь-6 ингибировал индуцированное инсулином связывание р85 (субъединицы Р13К) с 1В8-1. И в этом случае предварительная обработка анти-1Ь-6 антителом приводила к ингибированию действия 1Ь-6.
1п у1уо эксперименты.
Влияние 1Ь-6 на чувствительность к инсулину не было хорошо исследовано на животных. Для того чтобы определить, приводит ли терапия анти-1Ь-6 антителом к повышению чувствительности к инсулину и к ослаблению симптомов Τ2ΌΜ, мышей бЬ/бЬ и самцов С57/В16, которым давали корм с высоким содержанием жира, обрабатывали коммерчески доступным антителом против мышиного 1Ь-6 (полученным от В&П 8ук!етк).
Мыши бЬ/бЬ.
Эффекты обработки анти-1Ь-6 антителом тестировали на мышах бЬ/бЬ различного возраста. У этих мышей в возрасте 8-10 недель наблюдалась гиперинсулинемия и инсулинорезистентность, которые являются характерными симптомами на более ранних стадиях заболевания, а у мышей в возрасте 12-14 недель помимо гиперинсулинемии наблюдались повышенные уровни глюкозы в крови, которые являются характерными признаками на более поздних стадиях Τ2ΌΜ. Обе эти возрастные группы мышей тестировали на возможность применения терапии анти-1Ь-6 антителом в целях улучшения чувствительности к инсулину и регуляции уровня сахара в крови в тесте на толерантность к внутрибрюшинно вводимой глюкозе (ιιιΩΤΤ^
У мышей бЬ/бЬ наблюдалась передача сигнала нефункционального лептина, что было обусловлено мутацией лептинового рецептора. У таких мышей с возрастом развивались ожирение, гиперинсулинемия и инсулинорезистентность, при этом первые симптомы наблюдались тогда, когда возраст мышей составлял 6-8 недель. Две группы мышей различных возрастов - 8 и 12 недель - были обработаны 5 мг/кг анти1Ь-6 тАЬ, и через один день и 7 дней после обработки проводили тест на толерантность к внутрибрюшинно вводимой глюкозе ^ΟΤΤ). Схема обработки представлена на фиг. 15.
У 8-недельных животных обработка анти-1Ь-6 тАЬ не оказывала какого-либо влияния на выведение глюкозы во время проведения теста на толерантность к глюкозе (ΟΤΤ). Обработка анти-1Ь-6 тАЬ приводила к повышению толерантности к глюкозе (ΟΤ) у 12-недельных животных, хотя этот эффект не был статистически значимым (р=0,063). Такое увеличение толерантности к глюкозе в тесте ΟΤΤ наблюдалось через 7 дней после обработки. Кроме того, пробы сыворотки, взятые до и после окончания исследований, были проанализированы на профили адипокинов и адипонектинов. Уровни 1Ь-6, ΤΝΕα и МСР-1 были ниже детектируемых уровней. Эти данные, взятые вместе с результатами теста, ιιιΩΤΈ дают основание предположить, что животные бЬ/бЬ не являются хорошими моделями для исследования влияния анти-1Ь-6 антитела на инсулинорезистентность, и что уровни 1Ь-6 в тканях являются более подходящими параметрами для изучения роли, которую может играть 1Ь-6 в развитии инсулинорезистентности и Τ2ΌΜ.
Ожирение, вызываемое кормом (ΌΙ0). Животное с моделью ожирения и инсулинорезистентности.
Самцам мышей С57/В1 давали корм, содержащий 60% жира, в течение 20-35 недель. В результате у этих мышей развивалось ожирение (средняя масса тела составляла 50,5 г) и возрастали уровни глюкозы в крови натощак (ЕВС>145 мг/дл). Кроме того, у этих мышей была нарушена толерантность к глюкозе (ΟΤ). Животных с ΌΙ0 обрабатывали 10 мг/кг мышиного анти-1Ь-6 АЬ (В&П 8ук!етк). В целом, им вводили 50 мг/кг анти-1Ь-6 тАЬ в течение 3 недель. После введения первых 2 доз (день 5), после введения 4 дозы (дни 12 и 16) и после введения 5 дозы (день 23) проводили тест ί|30ΤΤ. В то же самое время брали кровь для определения наличия адипоцитокинов и адипонектина.
Обработка анти-1Ь-6 антителом не приводила к повышению толерантности к глюкозе на дни 5 и 12; однако, после введения дозы в дни 16 и 23, наблюдалось увеличение клиренса глюкозы, а также усиление метаболизма глюкозы. Через 39, 60 и 90 мин после начала проведения теста на толерантность к глюкозе (ΟΤΤ) такое улучшение достигало статистической значимости.
В другой серии экспериментов животным с ΌΙ0 еженедельно (2 дозы в течение первой недели и 1 дозу каждую неделю в течение последующих четырех недель) 1.р. вводили 10 и 20 мг/кг анти-1Ь-6 АЬ и 20 мг/кг 1дС контрольного изотипа. Затем проводили анализ Н0МА-1В (через 2, 4 и 6 недель после введения доз), ιιιΩΤΈ ί|3ΐΤΤ и оценивали профиль адипокинов (через 6 недель после введения).
Анализ Н0МА-1В, проводимых на животных с ОГР, обработанных анти-1Ь-6 АЬ.
В этих исследованиях у животных с ΌΙ0, которым вводили 10 и 20 мг/кг мышиного анти-1Ь-6 АЬ и антитела контрольного изотипа, наблюдалось снижение уровней глюкозы и уровней инсулина в крови натощак. У этих животных брали кровь и определяли уровни глюкозы и инсулина натощак с помощью анализа на глюкозу с использованием индикатора глюкозы ^асе/ЭМА (ох) (Нетто Е1ес!гоп Согр) и анализа ЕБ18А на сверхчувствительность к крысиному инсулину (Сгук!а1 С1ет) соответственно. Эти величины были использованы для определения Н0МА-1В. Индекс Н0МА-1В определяет статус чувствительности к инсулину и хорошо коррелирует с данными исследований на агглютинацию. Н0МА-1В вычис
- 55 015262 ляли по формуле: уровень глюкозы натощак (мМ) х уровень инсулина натощак (мМЕ/л)/22,5 (фиг. 13А, В и С).
Улучшение индексов НОМА-ΙΒ наблюдалось после обработки в течение 2, 4 и 6 недель (на фиг. 13А-С представлены данные, полученные после 6-недельной обработки). По окончании исследования проводили тесты 1рСТТ и (рИТ. В этих тестах введение анти-I^-6 антитела (20 мг/мл) приводило к значительному улучшению метаболизма и клиренса глюкозы по сравнению с данными, полученными для животных, которым вводили антитело контрольного изотипа.
Анализ на профили адипокинов и цитокинов в пробах сыворотки, взятых у контрольных животных и у животных, которым вводили анти-I^-6 антитело, показал, что нейтрализация ΙΕ-6 приводит к снижению уровней циркулирующих ΙΕ-6 и ТИРа наряду со снижением общих уровней МСР-1 и резистина. Другая серия полученных данных указывала на повышение уровней адипонектина при введении анти-ΙΕ6 антитела.
Был проведен гистологический анализ образцов печени, взятых у животных группы обработки и у животных контрольной группы. Для определения содержания липидов в паренхиме печени образцы окрашивали масляным красным О. Содержание липидов в печени у животных с ΌΙΟ снижалось в ответ на введение мышиного анти-I^-6 антитела.
Такое окрашивание выявило содержание липидов в 34% от всех образцов печени, взятых у необработанных животных, то есть у животных, которым вводили носитель, и лишь в 8% образцов, взятых у животных, обработанных 20 мг/кг анти-[^-6 антитела (фиг. 14А-Б). На фиг. 14А и 14Ό представлена контрольная группа; на фиг. 14В и 14Е представлены необработанные животные с ΌΙΟ; а на фиг. 14С и 14Б представлены животные, обработанные анти-ГЕ-6 антителом. Повышенное содержание липидов в печени ассоциировалось с развитием инсулинорезистентности и сахарного диабета типа 2. Таким образом, считается, что нейтрализация ГБ-6 приводит к повышению чувствительности к инсулину и к ослаблению симптомов Т2ЭМ благодаря воздействию на метаболизм липидов в печени. В целом, эти данные дают все основания предположить, что ΙΕ-6 играет определенную роль в патогенезе диабета типа 2, и что нейтрализация ΙΕ-6 должна повышать чувствительность к инсулину.
Дополнительные исследования.
Был проведен мониторинг влияния ΙΕ-6 на стимулированное инсулином фосфорилирование ΙΒ31, связывание с р85/РКК, фосфорилирование инсулинового рецептора (ΙΒ), синтез гликогена и передачу 8ΟС83- и БТАТ-сигналов в клетках НерС2 в присутствии или в отсутствии сконструированного человеческого анти-I^-6 антитела. В дополнительных экспериментах оценивали влияние ΙΕ-6 на индуцированную глюкозой секрецию инсулина из панкреатических островков. Опубликованные в настоящее время данные указывают на то, что ΙΕ-6 как ингибирует, так и стимулирует секрецию инсулина из крысиных панкреатических островков. Свежевыделенные крысиные панкреатические островки (^^еГксаNΟ) обрабатывали ΙΕ-6 и сконструированным человеческим ομη-ΙΕ-6 антителом (АМЕ-19а) в присутствии или в отсутствии глюкозы. Затем измеряли уровни инсулина, секретируемого такими островками в различных условиях обработки.
С2С12. Для исследования влияния инсулина на скелетную мышцу были использованы клетки С2С12. Были проведены эксперименты по оценке экспрессии ΙΒ81 и С1и!4, индуцированного инсулином фосфорилирования ΙΒ81 и влияния ΙΕ-6 на действие адипонектина.
Преимущества.
Ингибирование активности ΙΕ-6 ομη-ΙΕ-6 антителом согласно изобретению должно давать значительное терапевтическое преимущество, поскольку такое ингибирование может приводить к повышению чувствительности к инсулину и регуляции метаболизма без каких-либо побочных эффектов, вызываемых существующими средствами. Кроме того, современные методы терапии лишь в небольшой степени подавляют системное воспаление, которое, как предполагается, является основной причиной развития ассоциированных с Т2ЭМ диабетических осложнений диабета. Предполагается, что терапия с использованием ομη-ΙΕ-6 антитела согласно изобретению должна помимо повышения чувствительности к инсулину ингибировать системное воспаление и предупреждать развитие осложнений диабета.
Число пациентов, страдающих Т2ЭМ, постоянно растет, и по оценкам специалистов к 2025 году это число достигнет 300 млн человек. Анти ΙΕ-6 антитело может быть использовано в качестве монотерапии или в комбинации с другими уже известными ΟА^, такими как сульфонилмочевины, бигуаниды (например, метформин), тиазолидиндионы, меглитинид (например, репаглинид), ингибиторы альфаглюкозидазы (например, акарбоза). Кроме того, это антитело может быть использовано в комбинации с инсулином или с другими терапевтическими средствами, такими как средства, повышающие чувствительность к инсулину и регулирующие уровень сахара в крови, что позволяет избежать развития гипогликемии, ассоциированной с введением инсулина. Также предполагается, что терапия с использованием ομη-ΙΕ-6 антитела, помимо повышения чувствительности к инсулину и регуляции уровней глюкозы у пациентов с Т2Э и метаболическим синдромом, должна оказывать благоприятное действие на изменения в сердечно-сосудистой (СС) системе, часто наблюдаемые у этих пациентов. См. 8а1Ете1, АШ, ип6 КцИп, СΒ, 2001, Иа!иге, 414:799-806; Напкеп, В.С., 1995. Э|аЬе1ек Саге, 18:А2-А9; Э|аЬе1ек Ρ^еνеп!^οп Ргодгаш
- 56 015262 гекеагсй дгоир, 2002, №\ν Епд1. 1 Меб., 34б:393-403; Напкеп, В.С., 2000, АNО №\ν Υο^к Асабету оГ 8с1епсе, 892:1-24; Нкие1, А. А., апб Оитопек, М.1., 2003, Ат. 1. Сагбю1оду, 93:101-171; Кекшск, Н.Е. апб Но^агб, В.У., 2002, АNО. Кео. Меб., 53:245-2б7; Когпег, 1. апб Агоппе, Ь., 2003, 1. Сйп. Г^ек!., 111(5):5б5-570; 8коод, Т., е! а1., 2001. П1аЬе!о1од1а, 44:б54:б55; Ретапбех-Кеак 1.М., апб Ккай А., 2003, Епбосппе Кеν^еνκ, 24(3):278-301; Ретапбек-Кеак 1.М., е! а1., 2001, 1. Сйп. Епбосйпо1 Ме!аЬ., 8б:11541159; 10а. Глеб, 8., е! а1., 1998, 1. Сйп. Епбосйпо1 Ме!аЬ., 83:847-850; 8епп, 1.1., е! а1., 2002, П1аЬе!ек, 51:3391-3399; Ко!!ег, V., е! а1., 2003, 1ВС ш ргекк, Мапик.#301977200; 12а. 8!ои!1агб, 1.М., е! а1., 199б, ВВКС, 220:241-245; 8ои1йет, С., е! а1., 1990, Вюсйет 1., 272:243-245; 8апб1ег, 8., е! а1., 1990, Епбосгто1оду, 12б: 1288-1294; Ребегкеп, В.К., е! а1., 2001, 1. Рйукю1., 53б:329-337; П1Сокто, В.Р., е! а1., 1994, Гп!. Гттипо1., б:1829-1837; Аа11ешик, V., е! а1., 2002, №11иге Мебкте, 8:75-79; ^/агоуа, В., е! а1., 2003, Нитап Сепейс, 112:409-413; КиЬак/ек, А., е! а1., 2003, П1аЬе!ек, 52:558-4б1; Тк1док, С., е! а1., 1997, 1. Сйп. Епбосгто1 Ме!аЬ., 82:41б7-4170; 8!ои!1агаб, 1.М., е! а1., 1995, Ат 1. Рйукю1., 2б8:Е813-Е819; Кет, Р.А., е! а1., 2001, Ат 1. Рйукю1. Епбосйпо1 Ме!аЬ., 280:Е745-Е751; Вак!агб, 1.Р., е! а1., 2000, 1. Сйп. Епбосйпо1 Ме!аЬ., 85:3338-3342; апб Вак!агб, 1.Р., е! а1., 2002, 1. Сйп. ЕпбосгтоР Ме!аЬ., 87:2084-2089.
Совершенно очевидно, что настоящее изобретение может быть осуществлено и другими способами, которые не были описаны в настоящем описании и в примерах. Несмотря на проиллюстрированные выше конкретные варианты осуществления изобретения, подразумевается, что в настоящее изобретение могут быть внесены различные модификация и изменения, не выходящие за рамки объема прилагаемой формулы изобретения.
Таблица 1
СОК легкой цепи
ЗЕО Ю ΝΟ Название СОК* Клон Последовательность
ЗЕО Ю ΝΟ:1 сокы 33 ЗАЗНЗУЗУМУ
ЗЕО ΙΟ N0:2 С0ВЬ1 33 АСТСССАБССАТАСТСТААСТТАСАТ6ТАС
5Е<2 Ю N0:3 совы 34 5Α3Ι3ν3ΥΜΥ
ЗЕО Ю N0:4 соны 34 АСТОССАеСАТТАСТеТААОТТАСАТСТАС
8Е0 Ю N0:5 СОВЫ 35 8ΑΒ33ν3ΥΜΥ
8Е0 Ю N0:6 соны 35 АСТ6ССС0СТСААСТСТАА6ТТАСАТ6ТАС
8Е0 Ю N0:7 сокы 36 3Α3Υ3ν3ΥΜΥ
ЗЕО 10 N0:8 СОВЫ 36 АСТСССАОСТАТАСТеТААСТТАСАТОТАС
ЗЕО Ю N0:9 совы 37 3Ά533νΓΥΜΥ
ЗЕО Ιϋ N0:10 совы 37 АСТСССАССТСААСТСТАТТТТАСАТСТАС
ЗЕО Ю N0:11 совы 39 3(353Υν3ΥΜΥ
ЗЕО Ю N0:12 сокы 39 АСТСССАССТСАТАТСТААСТТАСАТСТАС
ЗЕО Ю N0:13 СБНЫ 40 ЗАЬЗЗУЗУМУ
ЗЕО Ю N0:14 совы 40 АСТССССТСТСААСТСТААОТТАСАТБТАС
ЗЕО Ю N0:15 сокы А9 8Α388ν8ΥΜΥ
ЗЕО Ю N0:16 соны А9 АСТСССАССТСААСТСТААСТТАСАТСТАС
ЗЕО Ю N0:17 СЭВЕ2 41 0Е8ЫЬА5
ЗЕО Ю N0:18 С0КЕ2 41 6АСТТТТССААССТ66СТТСТ
ЗЕО Ю N0:19 С0ВЬ2 43 ОЬЗИЬАЗ
ЗЕО Ю N0:20 СОКЫ 43 САССТБТССААССТСССТТСТ
ЗЕО Ю N0:21 С0НЕ2 44 ОМЗЧЬАЗ
ЗЕО Ю N0:22 С0ВЬ2 44 САСАТСТССААССТеССТТСТ
ЗЕО Ю N0:23 С0ВЬ2 46 0Τ8Ν1.Τ3
ЗЕО Ю N0:24 С0Ш.2 46 САСАСАТССААССТ6АССТСТ
ЗЕО Ю N0:25 сэньг 48 ОТЗЕЪАЗ
ЗЕО Ю N0:26 С0ВЬ2 48 6АСАСАТСССАССТСССТТСТ
- 57 015262
ЗЕО 10 N0:27 СЫО.2 А9 ОТЗЫЬАЗ
ЗЕО Ю N0:28 С0КЕ2 А9 САСАСАТССААССТСССТТСТ
ЗЕГ) Ю N0:29 СОКЬЗ 49 Μ2Ν5ΕΥΡΥΤ
5Εζ> Ю N0:30 СОКЬЗ 49 АТССАСТОСАСТССТТАСССАТАСАСС
ЗЕО Ю N0:31 СОКЬЗ 50 00Η30ΥΡΥΤ
ЗЕГ) Ю N0:32 СОКЬЗ 50 ТСТСАСТССАСТССТТАСССАТАСАСС
ЗЕ<2 10 N0:33 СОКЬЗ 52 ЗСНЗСУРУТ
3ΕΩ Ю N0:34 СОКЬЗ 52 ТСТСТСТССА6Т6СТТАСССАТАСАС6
ЗЕО Ю N0:35 сокьз А9 ЗОИЗСУРУТ
ЗЕО Ю N0:36 СОКЬЗ А9 ТСТСАСТС6А6ТССТТАСССАТАСАСС
5Е0 10 N0:138 сокьз А1Ь. ООИЗБУРУТ
*СЭК определены по Кэбату, за исключением области СЭК.Н1, которая была определена по Кэбату и Чотия.
СБВ тяжелой цепи
Таблица 2
ЗЕГ) Ю N0 Название СОК* Клон Последовательность
ЗЕГ) 10 N0:37 С0КН1 4 СЕТЕЗЗГАЬЗ
ЗЕО Ю N0:38 С0КН1 4 СБАТТСАССТТТАСТАССТТТССССТТТ СТ
ЗЕГ) Ю N0:39 С0КН1 5 6ΕΤΕ5ΡΓΑΜ8
8Е<2 Ю N0:40 С0КН1 5 ССАТТСАССТТТАСТССТТТТСССАТСТ СТ
ЗЕО Ю N0:41 С0КН1 6 БРОЕЗЗЕАМЗ
ЗЕО Ю N0:42 ΟΏΚΗΙ 6 БСАТТССАБТТТАСТАССТТТСССАТБТ СТ
ЗЕ<2 Ю N0:43 СЬКН1 8 0ΕΤΤ35ΕΑΜ3
ЗЕО Ю N0:44 ΟϋΚΗΙ 8 ССАТТСАССАСТАСТАБСТТТОССАТБТ СТ
ΞΕΟ Ю N0:45 С0КН1 <2+ρ 6Е0ЕЗРЕАМЗ
ЗЕО Ю N0:46 ΟϋΚΗΙ 0+Ρ ББАТТССАСТТТА6ТССТТТТБССАТ6Т СТ
ЗЕО Ю N0:47 С0КН1 Α9 СЕТЕЙЗЕАМЗ
ЗЕО Ю N0:48 сэкн! Α9 ССАТТСАССТТТАСТАССТТТБССАТСТ СТ
ЗЕО Ю N0:49 С0КН2 10 ΚΑ33063ΥΤΥΥΡϋΤντσ
ЗЕО Ю N0:50 С0КН2 10 АААСССАСТАБТССТБББАСТТАСАССТ АСТАТССТСАСАСТСТСАСеССС
ЗЕО Ю N0:51 С0КН2 11 ΚΙ33003ΥΕΥΥΡ0τνΤ0
- 58 015262
ЗЕО Ιϋ N0:52 С0ВН2 11 ААААТТАСТАЕТСЕТЕЕЕАЕТТАСОАЕТ АСТАТССТЕАСАСТЕТЕАСЕЕЕС
ЕЕО Ю N0:53 С0КН2 12 ΚΙ33ΕΕ5ΥΥΥΎΡΌΤνΤΕ
ЕЕО Ю N0:54 С0КН2 12 ААААТТАЕТАЕТЕЕТЕЕЕАЕТТАСТАТТ АСТАТССТОАСАСТеТСАСССОС
5Е0 Ю N0:55 С0ЙН2 14 ΚΙΕΕΟΟΕΗΤΥΥΡϋΤνΤΟ
ЕЕО Ю N0:56 С0КН2 14 ААААТТАЕТАСТСОТСЕОАЕТТЕЕАССТ АСТАТССТ6АСАСТСТ0АСССЕС
ЕЕО Ю N0:57 С0ВН2 16 ΚΙ3Ρ063ΥΤΥΫΡ0ΤνΤ6
ЗЕО Ю N0:58 ΟϋΚΗ2 16 ААААТТАЕТССОССТЕЕЕАЕТТАСАССТ АСТАТССТЕАСАСТЕТЕАСЕЕЕС
ЕЕО Ю N0:59 С0КН2 Ρ+Ν+3 (18а, 19а) ΚΙΕΡ0Ε3ΚΤΥΥ30ΤνΤε
ЗЕО Ю N0:60 С0НН2 Ρ+Η+3 (18а, 19а) ААААТТАЕТССЕЕСТЕЕЕАЕТТЕЕАССТ АСТАТТСТЕАСАСТЕТЕАСССЕС
ЕЕО Ю N0:61 С0КН2 А9 ΚΙ33ΕΟ3ΥΤΥΥΡΟΤντε
ЗЕО Ю N0:62 С0КН2 А9 ААААТТАЕТА6ТЕЕТ6ЕЕА6ТТАСАССТ АСТАТССТСАСАСТСТСАСЕСЕС
ЗЕО Ю N0:113 С0ВН2 А1Х. ΕΙ55ΟΟ3ΥΤΥΥΡϋΤντε
ЗЕО Ю N0:63 ΟϋΚΗ2 17 ΚΙ33ΕΕ3ΥΤΥΕΡ0ΤνΤΕ
ЗЕО Ю N0:64 0ϋΒΗ2 17 ААААТТАСТАСТССТСССАСТТАСАССТ АСТТТССТСАСАСТЕТЕАСЕЕСС
ЗЕО Ю N0:65 СРКН2 19 КТЗЗСЕЗУТΥΥΡΟΤνΑΕ
ЗЕО Ю N0:66 С0ЕН2 19 ААААТТАОТАЕТСЕТЕЕСАЕТТАСАССТ АСТАТССТЕАСАСТЕТСЕСТЕСС
ЗЕО Ю N0:67 С0КН2 20 ΚΙ 33ΕΕ3ΎΤΥΥϋΟΤνΤΕ
ЗЕО Ю N0:68 ΟϋΚΗ2 20 ААААТТАЕТАЕТЕЕТСССАЕТТАСАССТ АСТАТСАТЕАСАСТЕТЕАСЕЕЕС
ЗЕО Ю N0:69 0ϋΚΗ2 21 ΚΙ33ΕΕ3ΥΤΥΥ3ϋΤνΤΕ
ЗЕО Ю N0:70 ΟϋΚΗ2 21 ААААТТАЕТАЕТЕСТЕСЕАЕТТАСАССТ АСТАТТСТЕАСАСТОТЕАСЕЕСС
ЗЕО 10 N0:71 С0В.Н2 22 ΚΙ53ΕΕ3ΥΤΥΥΡ0ΤνΤΡ
ЗЕО Ю N0:72 0ϋΒΗ2 22 ААААТТАСТАЕТЁЕТСЕЕАЕТТАСАССТ АСТАТССТСАСАСТСТСАССССС
ЗЕО Ю N0:73 С0КН2 23 ΚΙ33ΕΕ3ΥΤΥΥΡ0Τ0ΤΕ
ЗЕО Ю N0:74 ΟϋΚΗ2 23 ААААТТАСТАЕТСЕТЕбЕАЕТТАСАССТ АСТАТССТСАСАСТСАТАССССС
ЗЕО Ю N0:75 С0КН2 Р+3 (20Ь, 23а) ΚΙ3Ρ6Ε3ΥΤΥΥ30ΤνΤΕ
ЗЕО Ю N0:76 С0КН2 Р+3 (20Ь, 23а) ААААТТАСТССССЕТЕСЕАЕТТАСАССТ АСТАТТСТЕАСАСТЕТ6АССЕЕС
- 59 015262
ЗЕЙ Ю N0:77 С0КН2 Р+И+О (22а) ΚΙΞРООЗИТγγϋοτντο
ЗЕЙ 10 N0:78 С0КН2 κ+Η+ϋ (22а) ААААТТАбТССбСбТСССАетТбЗАССТ АСТАТОАТбАСАСТСТСАСЕССС
ЗЕЙ Ю N0:79 СОЕНЗ 25 ЙЬНСЗУАЬОУ
ЗЕЙ Ю N0:80 СО8.НЗ 25 САСТТАТСССССТССТАТССТСТТСАСТ АС
ЭЕЙ Ю N0:81 СОКНЗ 26 ЙЬНСУУАЬОТ
ЗЕЙ Ю N0:82 СОЕНЗ 26 САЙТТАТСССббТАСТАТССТСТТСАСА СЕ
ЗЕЙ Ю N0:83 СОКНЗ 29 ЙЬИСТУАЬОУ
ЗЕЙ Ю N0:84 СОЕНЗ 29 САСТТАТСССС0АСТТАТ6СТСТТСАСТ АС
ЗЕЙ Ю N0:85 СОННЗ 30 ΟΟΝΟΝΥΑΟϋΥ
ЗЕЙ 10 N0:86 СОЕНЗ 30 САСТТАТССОССААТТАТССТСТТСАСТ АС
ЗЕЙ Ю N0:87 СОКНЗ 31 йьиеууАьог
ЗЕЙ ΙΏ N0:88 СОЕНЗ 31 СА0ТТАТСССССТАСТАТ6СТСТТСАСТ ТТ
ЗЕЙ Ιϋ N0:89 СОКНЗ 32 ЙЬИ6УУАЬО1
ЗЕЙ Ю N0:90 СОКНЗ 32 САеТТАТСССОСТАСТАТССТСТТСАСА ТТ
ЗЕЙ Ю N0:91 СОКНЗ А9 ЙЕНСУУЛЕОУ
ЗЕЙ Ю N0:92 СОКНЗ А9 САСТТАТССС6СТАСТАТССТСТТ6АСТ АС
ЗЕЙ Ю N0:114 СОКНЗ А1Л. СЬИСУУАЕЭТ
*СЭК определены по Кэбату, за исключением области СЭК.Н1, которая была определена по Кэбату и Чотия.
Таблица 3 Мутации в библиотеках отдельных СИЯ
Клон С0КН1 Клон СОВЫ
4 М34Ь 33 327Н
5 331Р 34 3271
6 Т280 35 326В
8 Р2 9Т 36 327Υ
37 ЗЗОГ
Клон С0ВН2 38 3271
10 Ι51Α 39 А25С,328Υ
11 Т57Е 40 3261
- 60 015262
12 Τ57Υ
14 У56И Клон СЭРЬ2
16 352аР 41 Т51К
17 Υ59Ε 43 Т51Ь
19 Т64А 44 Т51М
20 ₽60β 46 А55Т
21 Р603 47 Т51Ь
22 С65Р 48 Ν53Ε
23 ν63ϋ
Клон СЭКЪЗ
Клон СШНЗ 49 289М
25 Υ993 50 О89С
26 Υ102Τ 52 <290С
27 Υ993
29 Υ99Τ
30 Υ99Ν
31 Υ102Ε
32 Υ102Ι
Таблица 4
Мутации, включенные в комбинаторную библиотеку
СОКН1 СТОН 2 стенз соки стеьг стеъз
Т280 352аР Υ102Γ 3271 Т51Г 08 9М
331Р Υ56Ν Υ102Ι 327Υ Т51М
Р603
ν63ϋ
- 61 015262
Таблица 5А
Позитивные клоны библиотеки
Легкая цепь 1 Тяжелая цепь
ΟϋΗ-> и 12 13 Η1 Η2 Η3
уут-> С61ТО328 6 т 1 1 1 О > 4 τ 8 Ε 5 Υ Р V ο Υ
Клон 27 51 I 89 ) 28 31 505>2а 56 6063 95 102
АМЕ-А9 ( 5 » ί К Ο
АМЕ-16 8 1 К Ρ Ο
АМЕ-18а Р Μ Ο Ρ К Ρ VI 3 0 I
АМЕ-19а 1 м Μ Ρ К Ρ νν 5 0 I
АМЕ-2ОЬ 1 м Μ 0 К Ρ 5 0 I
АМЕ-22а Υ Р Μ 0 Ρ К Ρ И/ ϋ 0 Ρ
АМЕ-23а Υ м Μ 0 К Ρ е 0 Γ
Таблица 5В
Клоны сконструированного человеческого анти-1Ь-6 антитела и соответствующие СЭР
ΟϋΡ.”> ы Ь2 ьз Н1 Н2 НЗ
ΑΜΕ-Α9 ЗЕО Ю:15 ЗЕО Ю:27 ЗЕО Ю:35 ЗЕГ) Ю:47 ЗЕ(2 Ю:61 ЗЕО 10:91
ΑΜΕ-16 ЗЕ2 10:15 ЗЕО Ю:27 ЗЕО Ю;35 ЗЕ<3 Ю:47 ЗЕО Ю:57 ЗЕО Ю:91
АМЕ-18а ЗЕО 10:15 5Е0 Ю:17 ЗЕ2 Ю:29 ЗЕ<2 Ю:45 ЗЕ<2 Ю:59 ЗЕО 10:89
ΑΜΕ-19а ЗЕ<2 Ю:3 ЗЕО Ю:21 ЗЕО 10:29 ЗЕО 10:39 ЗЕО Ю:59 ЗЕО Ю:89
ΑΜΕ-200 5Е<2 Ю:3 ЗЕО Ю:21 ЗЕС Ю:29 ЗЕ2 Ю:41 ЗЕ(2 10:75 ЗЕГ) Ю:89
АМЕ-22а ЗЕ<2 Ю:7 5Е0 10:17 ЗЕ<2 Ю:29 5Е<2 Ю:45 ЗЕу Ю:77 ЗЕО Ю:87
АМЕ-23а ЗЕО Ю:7 ЗЕС 10:21 ЗЕ<2 Ю: 29 ЗЕ<2 Ю:41 ЗЕу Ю:75 ЗЕО Ю:87
Таблица 6
Величины ЕС50
Клон Величина ЕС50
СЫТО328 2, 7х10’11М
АМЕ-19а 2,7χ10“ί2Μ (10-кратное увеличение)
Таблица 7
Кинетические константы для анти-1Ь-6 1дС
Клон Концентрация антитела (пМ) Кс (пМ) Увеличение отношения (по сравнению с химерным АЬ) γ ф о ϋ Увели- чение отноше НИЯ ^οίί (сек-1) (вычисленное ) Увеличение отноше НИЯ
Химерное антитело 5 3 1 4,4х10ь 1 1, 3«10’5 1
АМЕ-16 1 0,83 3, 6 ΙχΙΟ6 0,22 8,340'7 15, 7
АМЕ-18а 0,5 0, 12 25 2*107 4,4 2,4χ10_ί> 5,4
АМЕ-19а 0,5 0, 037 81,1 5,5*106 1,2 2*10-7 65
АМЕ-20Й 1 0, 78 3, 8 4,7*106 1 3,7* 10’6 3, 5
АМЕ-22а 1 0,18 16, 7 6*106 1,3 1, 1*10’“ 11, 8
АМЕ-23а 1 0, 006 500 7,4*106 1,6 4,4x10'“ 295
- 62 015262
Таблица 8
Межвидовая перекрестная реактивность сконструированного человеческого антитела и химерного антитела
Вид Ингибирование (химерное и сконструированное человеческое)
Перекрестная реактивность Человек
Игрунки +
Собакоподобные обезьяны +
Лимпанзе +
Макак резус +
Павиан +
Свинохвостые обезьяны 4-
Эдипов тамарин 4-
Неизвестно Кролик Ν/ϋ
Отсутствие реактивности Собака —
Мышь
Крыса -
Морская свинка -
Окатанская карликовая свинья
Межвидовая перекрестная реактивность сконструированного человеческого и химерного антитела.
Сконструированное человеческое антитело и химерное антитело обладали способностью нейтрализовать пролиферацию клеток 7ΊΌ1, которые были стимулированы кондиционированными супернатантами от культуры МКПК человека, игрунки, собакоподобной обезьяны, шимпанзе, макака резуса, павиана, свинохвостой обезьяны и эдипова тапарина. + положительный в анализе на нейтрализацию; отрицательный в анализе на нейтрализацию; Ν/Ώ - не определяли.
Таблица 9
Влияние анти-1Ь-6 тАЬ-обработки на почечную патологию у мышей ΝΖΕ/А Р1
Группа обработки Тяжелая форма* Заболевание средней тяжести* Легкая форма*
Физиологический раствор (п=10) 60% или 6/10 20% или 2/10 20% или 2/10
Крысиный 1дС (п=10) 70% или 7/10 30% или 3/10 0 или 0/10
Антитело против мышиного 1Ь-6 Κ&β(η=10) 10% или 1/10 3 0 % или 3/10 60% или 6/10
* Тяжелая форма заболевания - периваскулярная смешанная лимфоидная гиперплазия, повышенное содержание мезангиальных паренхиматозных клеток, отложение белка, отложение иммунных комплексов в гломерулярной базальной мембране.
Заболевание средней тяжести - умеренная периваскулярная смешанная лимфоидная гиперплазия, умеренное содержание мезангиальных паренхиматозных клеток, отложение иммунных комплексов в гломерулярной базальной мембране, отложение белка отсутствует.
Легкая форма заболевания - небольшое количество мезангиальных паренхиматозных клеток, небольшое отложение иммунных комплексов в гломерулярной базальной мембране, отсутствие периваскулярной смешанной лимфоидной гиперплазии, отсутствие отложения белка.
- 63 015262
Последовательности вариабельных областей клонов
Таблица 10
5ЕС 10 N0: Клон Вариабельная область {V) тяжелой цепи (Н) или легкой цепи (Ь) Последовательность
93 АЭ Аминокислоты Ь-цепи Е1УЬТ(ЗЗРАТЬЗЬ8РСЕВАТ1,ЗС5А353УЗ умуж^акрсоАРкьыуитБыьАзетРАн Γ$05<330ΤΡΕΤΙιΤΙ53ΙιΕΡΕ0ΓΑνΥΥα3ΏΗ βΟΥΡΥΤΡΟΟΘΤΚνΕΙΚ
94 Нуклеотиды, кодирующие Ь-цепь ЛЛаА<?ССА02СТС1^С1чСД.5Т^С?.СТ^ГСАЛСТетААСТТАСА'^АСТ ССТАССААСМА^С27Ха^САОагТСССАС(ХГГССТСАТСТАТОАС?.СА бАСАОАСТТСАСТСТСАССАТС^СаСКСТАбАСГССТОАМАТТтаХаиЗ гттАТТАСгет1^гСАатосАд^гсс?гТАс<хатАСАСбттсоас(?(МбСО АССААООТО(ЗАеАТСААА
95 Аминокислоты Н-цепи ЕУ0ЬУЕ8а0С1М?Р(ЭеЗЬВЬЗСААЗ<ЗРТРЗ ЗГАМЗИтаОАРСКОЬЕ^АКХЗЗСНЗЗУТПГ рОТТТОНРТТЗПШАгаТБЪУЬОЬ^ЗЬВАВР ΤΑνΥΥΟ?^ςπΜΟΓΏΓΑ[Λ\4\’ΟΟΟΊΤ'7Τν53
96 Нуклеотиды, кодирующие Н-цепь сАсат^сАсгт^^юсАОТ'^т^сйгАсюсттсотссА^стзесс&^тс ССГ6АалСТСТСС1<УГССА(ЗССТСТ1^АТТСАССТгтА^АвСт1»ССА тотсттаоота^СА13<ктссАоезАА®эо(х?кадА(урэээта9^ АТТАОТАО’ЮбТЙйСАОТТАСАССТАСТА'ГССТвАСАСТ'ЭТОАСОООССС АТТСАССАТСТССАСАСАСААССССААОАЧСТСАСТтЗТАТ’СГОСАААТСА АСА(К:СТСАОАССЮСАСОАСАСОаСТдгеТАТТАС1(г1«СйАОАСА&1ТА та®^ТА£ТАТССТС|ТТОАСТАСТССОа<ЮЛАСОаАОСАСС57ГСЛССбТ СТССХСА
97 19А Аминокислоты Ь-цепи Е1УЬТдЗРАТЬ8Ь8РбЕКМЪ8СЗА313УЗ У1т«552КР30АекЦЬ1УИ43Ы1А5<31РАК РЗОЗеЗОТСЕТЬТ133ЬЕ₽ЕПРАУУГСМ0И ЗЗУРУТРОСЗТКТЕШ
98 Нуклеотиды, кодирующие 11-цепь САААТТСТШТ'ЗАСАСАСТЮТССАОССАСЮСТедСЯТТ^ТСТгСЛ.ОСОаА М0А6ССАСССТСТССТССЛ<ЭтеС(^САТТА(51!СТААе1ТАСА.ТСТАСТ ОСТАССААСрЮАААССТСаССАСООГСССА(3<К^СС1ЮАТСТАТОАСАТ<3 ТССААССТеССГТТСТ1ЩЗСАТЮССАЗССА(Жт,СА<ПЮО<^СТЗ?ЗТЮТ13Й САСАСАСТТСАСТСТСАССАТСАбСАЗССТАСАйССТСААСАТтЮСАй Т1ГАТТАСЯетАТ©САСТС<ЗА(ЗТС(ОТАСССАТАаУХТТСХМСССА<^ АССААСетаЗА'ЗАТСААА
99 Аминокислоты Н-цепи ЕУОЬУЕЗ(3<За1|УОРО<38ЬКЬ5САА&ЗЕТРЗ РРАМЗИУКСАРЭКОЬЕИУАКТЗЕМЗазитТУ ЗГОТТОЙБТХЗКОМАККЗЬУЬОМПЗЬ^гАЕП ΤΑνΥΥ0ΑΕΏ^ΥΥΑΙιϋΐν^0ΤΤντν33
100 Нуклеотиды, кодирующие Н-цепь аАСбтас^юс^кзтсзАятютбООссАсзсттзстссАзсстюсзсззатс ССТ5АЗАСТ<^ССТСТЗСАО?СТСГ13САТТСАССТТТАЗТССТТТТЗССА тоте1тссотс(хзссАссстссАОо<ЗААосасстосАзтаэ0тсассААА АТОАОТСССОЗТО<ЙАС1ТО<?АССТАСТАТКЛ|САСАСТОТДАСааЗССО АТТСАССАТСТССАДА«ЗАСААССССААСААСТСАСТОТАТСТССАААТОА ΑϋΑ3ίΧ^Α^0Οθ3Α06ΑσΑς(30^ΰΤ(3ΤΑΤΤΑίΤαΤΐ3σ0ΑαΑ0ΑσΤ-ΤΑ 1ЮСЗО-ЗТА'37АТОСТХ?ГТЙАСАТТТХМСК?ССАА&ЗСАССАССС?ТСАСС<7Г СТССТСА
- 64 015262
101 2 ЗА Аминокислоты Ь-цели ЕХУЬТОЗРАТЬЗЬЗРОЁКАТЬЗСЗАЗУЗУЗ Ύϊ™ΤΟΟΚΡΟΟΑΡίαηΐΥΟΜ5ΐπΛ5ΐ3ΙΡΑΚ РЗД8й5аТОГТЬТ153ЬЕРЫЭРА7ГГСда 60ΥΡΥΤΪΌ35ΤΚνΈΙΚ
102 Нуклеотиды, кодирующие Ъ-цепь 9АААТТеТ<ЭТТ6АСАСА0ТС,ГССА<КХ^1СС^^ ААОАеСОАСССТСТЧХТОСАОТСССаОСТАТА(ЛОТАА<тАСАТОТАСТ сзтАССАА^слААСстсассАозстессАаостсстсАтстАтеАСАтс ТССА^ССТСССТТСТЗ<?САТСССА5ССАС^?7ТСА'ЗТаСгА(^ГЗС<?ТСТОТ <ЗАСАСАСТТСАСТСТСАССАТСАССА!ЗССТА0А<ЭССТ(ЗААСАТТТТОСАС 1Г7АтгАстетАтесАстаадет<зоэт АССАА®ЗТ00А0АТСААА
103 Аминокислоты Н-цели 2У0ЬУЕ5<Э&ЗЬУС₽а&ЗЬЕЦ13СААЗеР2Р5 3ΡΑΜ3ΜνΒΟΑΡΘΚ№ΕίίνΑΚΙ5ΡΟ(33ΥΤΥΥ 5ΟΤνΤ3ΗΡΤΙ3ΚηΝΑίζ^Ι1ΥΕΧ1№Τ5ΙιΗΑΕΟ ТАУУУСАНСШ(^АЬ^Е^£?СЗТГУТУ53
104 Нуклеотиды, кодирующие И-цепь <ЛАйстасАастазтазА1ЭТСта0азаА1ЭОСТТСОТСсАосстйй<э^тю СХЛ^АСАСТСТССТеТаСАСОСТе1ХЗОАТТССА0ТТ,ТА(Л'АОСТ?ГСК:СА татсттээ^тссоссдеастссАс^аААойэ<^Т(МАЗт<зб отооссааа АТТАСЗТССЗООТССЗ^ОТТАСАССТАСТАТТСТЗРХАС/ГЗТОАСЙЗОССЙ АТТСАССАТСГСС^ОА(?АС?ЛС13ССАА0ААСТСАСТСТАТСТССАААТЙА АСАСССте&&АОССвА®аАСАС0ОСТ(ЭТОТАТТАСТ©Т13С(зА!ЭАСадтТА ТеОсЗаОТАСТАТССТСТТСАСТТТ'К^бСС^ СТССТСА
116 АМЕ-16 Аминокислоты Ь-цепи Е1УЬТЗЗРАТЬЗЬ5Р<^КАТЬЗС5А$55У5 УгШ^РОКРСаАРКОДХУДТЗМЪАЗСХРАК реС503СТРРТЬТ?133ЬЕРЕДРАУХУС30И δσγρΎΤΡοαοτκνΕίκ
117 Нуклеотиды, кодирующие Ь-цель АТСХЗАА0ССОСА^ССАЙСТГСТСТТССТ^СТ<ЗСТАСТСтеСОтСССАСА ТАССЛССЧ?еАС?ЭУк1ТЮТОТТСАС71СА0Т2ТССАСК:сАСССТЭТСТТГОТ СТССА«305ОАААЭАОССАСС(ЛЮТССтеСАСТОССАйСТСАА(ЭТЭТААеТ ТАСАТетАСТО0ТАССААСАОАААССТССССА0ОСТСССА1ЭОСТССТСАТ СТАТОАСАСЛТССААССТС^СТТСТСаСАТСССАаССАетУТТ аТС0ОТСТ0СаАСА0АСТТСАСТСТСАССАТСА0СА<ЗССТА0АаССТОАА 0АТТ,1ТфСА£уГТТА,ГТАСТСТТ<?1САйТОБАСТ<ЗСТТАСССАТАСАС0'ГТ ССОСССАЭОСАССААООТООАОАТСААА
118 Аминокислоты Н-цепи ЕУ0ЬУЕЗОаБЬУ0Р£3<ЗЗЬЙЬЗСАА$<ЗГТРЗ ЗЕАМ5\Т№АРСКСьг^АТ'Д5РС-<ЗЗУТ¥У РОТУТБМ!иГ13ПЕ1ЫАК173ЬУЪ5ШЗЪРАЕП ТАУУУСАКОЬН(ГП'АЪОУИЗОетТ’иТ?УЗЗ
119 Нуклеотиды, кодирующие Н-цепь АТССА0Т?ТСаССТСАО21ОЗдТГТТССТТСТТЭСТАТТТТА0АА®ЗТСТ ссАстетсАоатесАСстсстооАОтстгасзсаАСссттзэтссАоссто од<ЭСВТСССТСА<ЗАСТСТССТСТСКГАОССТСГе0АТТСАССтаА$ТАСС ТТТ<ЗССАТСТСФТаЗСЛ?ССВССАОЗСТССАОЗСАА<ЗООЗСТ<3(ЗАОТЙ150Т ОСССАААДТТАОТСССЙЗТО’ЭСАЗТТАСАССТАСТАТССТОАСАСТОТСгА ССЗСаССЮАТТСАССАТСТССАСАаАСААСаССААСААСТСАСТОТАТСТб САААТБААСА0СС1^А<ЗМКСЗАайАСАСОасТБТ13ТАТТАСТОТ<ЗС<ЗА!3 АСаСТТАТ00бССТАСТАТ(Х?ГСтТОАСТАСГО0ОеССАА>3®ЗАССАСО0 ТСАССОТСТССТСА
120 АМЕ-18а Аминокислоты Ь-цели Е1УДТ$ЗРАТЬ5ЬЗРОЕЖА.ТГ»ЗСЗА388УЗ УМУШООКРСОАРНЬЬХТОЕаЯЬАЗаХРАН РЗе3050Т&рТЬТ133ЬЕРЕПРАУ¥УСМОИ ЗБГРГГГС613ТК7Е1К
- 65 015262
121 Нуклеотиды, кодирующие Ь-цепь АТОО^ССХХ^СЖАОСТТСТСТТССТССТ^ ТАССАССу<ЖЗМ1АТТдтСТТеАСАСА0ТгТССАСК!СЛСССТ(ЖПТГ0Т СГССАбСОСАААСАОССАСССТСГССЛ’ССАЗТдССДаСХМ^ДЮТААЭТ' ТАСАТСТАОТЮТАССМСАаАААССГаОССАООСТС^ЮАСОСТССТСАТ СТАТЭАС^СТССААССТО^ТТСТОаСАТСССАОССАОСТГСАСТСССА отоестсгеаддСАСАСгд^сгстсйссАТСА^ САТТТТССА0ТТТАТТАСТеТАТ0САО1ЧИА0П^^ТАСССАТАСАССТР ОЭОСОаА®ЗСАССАА<ЗСЗТе<^АТСААА
122 Аминокислоты Н-цепи ЕУ0Ъ7В5С(3(3]№РОС35ЪКЬ8САА5(ЗР0Рд РРАМЗ^^АРаКСЬЕИГУАКгЗРСКЭЗИТУУ БПТУТ^ТХЗКРИМСМЗЪУЬОККЗЬКАЕП ΤΑνγγ^^υ/κ3ΥΥΆΐ©τνίαοσΓτντν35
123 Нуклеотиды, кодирующие Н-цепь ΑΤθαΑΰτττοοοοτσΑΟσταβκΊΊ^ ссАагатаА«Э0тосА«хд^этоаАатстюсасвАэасттазтссАасстс ОООСОТСССТЗА®АСТСТССТСГгеСАаССТСТаСЗАТТССАОТТТА0ТССС ТТТ(ХЮАТ13ТСТТ1ЭаОТСС(К:САСССТССАв1МААОбОС1^(ЗАОТСС6Т ОЗССААЭкАТТАСТССССОТОООАСУ1Т<ГСА2СТАСТАТАС>2САСАСП,СГаА ССЗОССЗАТГСАССАТСТССАОАСАСААСОССААОААСТСАСТОТАТСТе САААТОААСдаССТСА<ЗАОСССА<Э(ЭАСАС<30СТ6Т$ТАТТАС1<ТГеС(зАВ АСА|ЗТТАТО2<ХХ^АСТАТССГСТ1^АСАТТТ<ХКСССАА'32<1пССАСаС ТСАСССТСТССТСА
124 АМЕ-20Ь Аминокислоты Ъ-цепи Е1УЬТОЗРАТЬЗЪЗРОВРАТЬЗСЗА51еУЗ УМУИУ00КХ30АРКЬЬ1УШ5ИЪА5(31₽А11 РЗбЗЗЗЗТОРТЬПЗЗЬЕРЕДРАУУГСМСИ ззургтрезаткУЕхк
125 Нуклеотиды, кодирующие Ь-цель АТОС ААЗССССАЕСЗСАССТТСТСТТС стсстс СТАСТСТОССТСССАСА ТАССАССОТАаАААТТОчХЭТТ(^САСА«?ГСТССйас<Ж!СС^ТСТТ,ГОТ СТССАСа№ААА(ЗАаССАСССТСТССТОСАОТСССАЙСАТТАЭТОТААОТ ТАСАТОТАСтеЭТАССААСАСАААССТОаССА<ЗОСТССЮАа0СТССТСАТ СТАТ0АСАТСГГССААССТ(Э0СТТСТ(а13САТССС&ЭССА<Э<ЗТТСА1ЭТ£а(ЭСА ОТЗОСЯСТаз^САСАСТТ^СТСТСАС^СА^ САТтТтеСА!ггаТАТТАСТСТАТССАСТ<^АСФЗСТТАСССАТАСАССТТ ССОСейАО®ЗАССААСОТО(ЗА13АТСААА
126 Аминокислоты Н-цепи Е^Ь72336еЬ73РССЗЬВ1, ЗСААЗЕРОРЗ 3ΡΑΜ3ΚνΚΏΑΡί3ΚΞ^Ε4νΑΚΙ3ΡΟ<33ΥΤϊΥ ЗДТЧТЗРРГ13КДЫАК118ЬУ1ДЭММ5ЬКШЭ ΤΑνΥΥΟΆΕ^ϋννωΎΑΌΟΤνΚιΟστΤντνΉΞ
127 Нуклеотиды, кодирующие Н-цепь АТЗЗАеТТТХХЭССТОАОСТСССЛТТТССТТОТТаСД'АТТТТАСААОйТОГ ССАОТ<Л^А$йТаСАОС7ХХУГаЗАС7СТ^^СМА1^СТТ0СТССАСССТС ФЗООЗТСССТдАСАСТСТСОГСТСЗСАСССТСТСаАТГССА'ЗТГТА.ОТА^г ТТОСОТОТСТТЭС^ССбССАОаСТССАаЭЭАА^ О^^СААААТ^АОГСССССТ^ЗССАаТТАСЛССТХСЯ'АТАССОАСАСТСТСА сааОСССАТТСАССАТСТССА^САСААССССААОМСТСАСТВТАТСТС САААТ^ВД5ССТОАСАССССАООАСАС(ЗОСТСТОТАТТАСТ6Г1ЭСВА<? АСА<ИТАТай(3<ЗСТАСТАТОСТеГ1^САТТТе(3<Э0ССААеааАССАС0Э ТСАССОТСТССТСА
128 АМЕ-22а Аминокислоты Ь-цепи ЕгУБТОЗРАТЬЗЬЗРСЕВАТЬЗСЗАЗУЗУЗ ΥΜϊΐίϊΟαΚΡΕΟΑΡΗΪιΒΙΥϋΡΒΝίΛΰΟίΡΑΚ ЕЗС5е5ОТДРТЬТ133ЬЕРВДРАУУУСМ2И зсурутраас-тктетк
129 Нуклеотиды, кодирующие Ь-цепь АТОЗААОССССАЗОЗСАССТТСТСТТССТССТОСТАСТСТСОСГСССАСА ТАССАСССйАСАААТТСТОТТОАСАСАСТСХССАСССАССС^ТСТГТСТ СТССАСОССАААОАОССАСССТСТССТОСАС1ЧЗССад(?ТАСАСТ(ЗТААСТ ТАСАТетАСтейТАССААСАОАААССТССССАСОСТСССАССЮТССТСАТ СТАТСАСТТСТССААССТСССТТСТСССАТСССАйССМЗЭТТСАОТСЮСА еТОаОТСГОЖЗАСАеАСГТСАСТСГСАССАТСАОСАССМЭТАОАвССТОА^ САТТТТ<ЗСЛа1ТТАТТАСТСТАТССА(?ГОЗА|ЗТС15ТТАССЮАТАСАССТТ СССССйАСССАССАА<ЗСТССАОАТСААА
130 Аминокислоты Н-цепи ЕудьУЕзсеа^ОРббзькьзСААзордрз ₽рАМ511тдАРвкйЦЕ«так.13Р£За5»туу Р1тУГСКРТ13КЖАКН5ЦУБ0МКВ1гПАЕ0 ТАтуусАндьиаууАБДЕиадзттутузз
131 Нуклеотиды, кодирующие Н-цепь АТОСАСТТТСЮССгеАЗСТОвОТТ'ТТССТТ^^ ссАэтотзАестссА<зсто(лтеАотстаоооеАсастге0тсхАссст(з ОеЭЭОТСССТбА^СТСД|ССтаТ(Х:А«Х:сТСТО(ЭАТТССАСТ,М,А1ЭТССС ТГгеССАТ<ПЧ?ГТЦ(3(^ОТСЮА«Э<ЗСТССАО<КЗАА^ <ЭДССААААТТД<ЗТССС^Т1^А(т>ЭаАССТАСТАТССТйАСАСТ<ЭАСА О^СССаАТТСАССАТСТОЗАаАгЩАСААССССААОААСТСАОГ^АТСТС САААТ<^ЛОАОССТЗА<^|Х5СдАОСАСАС'ЗОТ1?ГОТАТТАСгеТК:ОАС АСА<ЭТТАТй0{МОТАСТАТ(КН?СТТвАСТТСТв(Э<ЮССААйОбАССАС®3 ТСАСЙЗТСТССТСА
- 66 015262
Таблица 11 Аминокислотная последовательность каркасной области человеческой легкой цепи Ь6 со встроенными мечеными последовательностями СОЯ (ΗΚΙΛ-3Ε9 ГО N0:105) СРЕЫ (ЯЙЬ2-ЗЕО ГО N0:106) СРКР2
Е1УЪТ05РАТЬ5Ь5РОЕЖАТЪ5СХХХХХХХХХХИГУОВКРООАРЕЬЫУХХХХХХХ (РВБЗ-ЗЕОЮ N0:107) СРКЕЗ (ИЯД-ЗЕ<3 ПЭ N0:108)
0ΙΡΑΚΕ5Ο305ΟΤΡΓΤΡΤΙ5ΞΡΕΡΕΡΡΑνΥΥ0ΧΧΧΧΧΧΧΧΧΓΟΟ(3ΤΚνΞΙΚ
Таблица 12 Аминокислотная последовательность каркасной области человеческой тяжелой цепи УН3-7 со встроенными мечеными последовательностями СОЯ (ГШП - 5Е0 ГО N0:109) СРКШ (ЕКН2 - ЗЕС) ГО ΝΟ: 110)
ЕУ0ЬУЕ5(За(ЗЬУ0Р(ЗО5ЬЕЬЗСАА8ХХХХХХХХЮЗДУЕ0АРОКСЬЕИУА
СРКН2 (ЖНЗ - 5Е0 ГО N0:111)
ΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΙίΕΤΙ5ΕΡΝΑΚΝ8ΡΥΡ0ΜΝ3ΡΚΑΕΡΤΑνΥΥ0ΑΚ
СОКНЗ (РКН4-ЗЕ0 ГО N0:112)
ХХХХХХХХХХтеОВТТУТУ88
Таблица 13
Последовательности СОЯ
8Е0 Ю N0: СРВ Аминокислотная последовательность*
132 С ΡΕΕΙ δΧ,Χ,Χ^νΧ,ΥΜΥ
133 СРЕЪ2 ОХбЗХтЬХяЗ
134 СРКЬЗ Χ^ΨδΟΥΡΎΤ
135 СРЕН1 ОЕХцХ125Х^РА^48
136 СРКН2 ΚΧ153Χ1ίΟΟ8Χι7Χ18ΥΧ1,Χ20ΡΤΧϊ1Χ21Χ«
137 СРКНЗ ОиТОХмУАИЗХг;
*Х означает любую подходящую аминокислоту с репрезентативными неограничивающими заменами, указанными в последовательностях 8Ер ГО N0:1-92 в табл. 1 и 2 и в табл. 3, 4, 5 А и 8. Кроме того, X может иметь следующие значения:
- 67 015262
Х1 - А или (3
Хг = 3 ИЛИ к
Хз = Н, I, 3 или Υ
Х4 = 3 или Υ
Х5 = 3 или Е
Хб - Г, ь. М или т
Х7 = N ИЛИ Е
хе = А или Т
Хд = М, С ИЛИ 3
Хю = 0 или с
Хц = т или Ω
Х12 - г, 3 или
Х13 = 3 ИЛИ Р
Х14 = ь или м
Х15 = А или I
Х16 = 3 или Р
Х17 = У или и
Х18 = т. Е или
Хю = У ИЛИ Е
Х20 — Р, 3, С илиЕ
Х21 = V илиС
Х22 = Т илиΆ
Х23 = С илиР
Х24 = 3, Υ, Т илиN
Х25 = Υ, Т, Г илиI
3ΕΏ ΙΡ N0:115 - АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ БЕЛКА 1Ь-6
МЫЗЕЗТЗАЕСРУАЕЗЬСЬЬЬУЪРААГРАРУРРСЕОЗКОУААРНКОРЪТЗЗЕКЮКОТК У1ЪО613АЪККЕТСЫК5ЫМСЕЗЗКЕАЬАЕЫОЬЫЬРКМАЕКО6СЕОЗСГЫЕЕТСЬУКИТСЬЬЕ ЕЕУУЬЕУЬОНКГЕЗЗЕЕОАВАУСМЗТКУЫОЕЬОККАКЫЬОАТТТРОРТТИАЗЬЬТКЬОАОЫО ИЬООМТТНЪТЬНЗГКЕРЪСЗЗЬКАЬНОМ
- 68 015262
Список последовательностей <110> СепЬосОХ, 1ПС.
Арр1хеЦ МоХеацХах Ето1иЫоп, 1нс.
<120?· Анти-Щ-б антитела, композиции, способы их получения и применения <130> ΟΒΝ5094 РСТ <140> РСТ/и82006/016457 <141> 2006-04-28 <150> 60/676,498 <151> 2005-04-29 <150> 60/677,319 <151* 2005-05-03 <160> 138 <170> УазЪеВО £ог Μΐηάονθ УегвЛоп 4.0 <210> 1 <211> 10 <212> РЕТ <213> Нолю варАепэ <400> 1
Бег А1а Зег Ηΐβ Зег ¥а1 Зег Туг МеЪ Тух
10 <210> 2 <2Ц> 30 <212> ДНК <21з> Ното еа.р1еп5 <400> 2 адЬдссадсс аеадьдйаад ЬБасаЬдЬас <210> 3 <211> 10 <212 > РЙТ <213 > Нсяпо ©ар1еав <400> 3
Зег А1а Зег Не Зег νβΐ 5ех Туг МеЬ Туг
10 <210> 4 <211> 30 <212 > ДНК <213> Ното варАепз <400> 4 ад^дссадса ъъад^дЬаад ееасаЬдЬас <210> 5
- 69 015262 <211? 10 <212? РНТ <213? Ното вар!епз <400? 5
Зег А1а Агд Зег Зег Т7а1 Зег Туг МеЬ Туг
5 10 <210? 6 «211» 30 <212> ДНК <213? Ното еар1епэ <400? б адЪдсссддЪ саадйдйаад ЕкасайдЕас <210? 7 <211> 10 <212? ЕЙТ <213? Ното вар1епв <400> 7
Зег АХа Зег Туг Зег Уа1 Зег Туг МеЪ Туг
Ю <210? 8 <211> 30 <212> ДНК <213? Нолю вархепв <400? Э адЕдссадсс аЬадкдйаад йЪасайдйас <210? 9 <211? 10 <212? УНТ <213? Ното вар!епз <400> 9
Вег А1а бег Зег Зег Уа1 РЬе Туг Мей Туг
1510 <210? 10 <211? 30 <212? ДНК, <213? Ното вар!епв <400? 10 адЪдссадсй ааадЬдЪайй Ъкасайдйас30 <Э10> IX <2X1? 10 <212> РДТ <213? Ното еарЗ-епз <400? 11
Зег С1у Зег Зег Туг Уа1 Зег Туг Мей Туг
10
- 70 015262 <210> 12 <212 > ДНК <213 > Ното яар1епа <400> 12 адЪддсадск саСаЬдеаад ЬЕасаЬдеас 30 <210> 13 <211> 10 <212> РКТ <213> Ното зеф1епз <400 13
Зег А1а Ьви бег бег ν^Ι бег Туг МеЬ Туг
10 <210* 14 <211> 30 <212> ДНК <213> Ното вар1епа <400 14 адЪдсссСдХ саадЪдЪаад еъасайдЪаа <210> 15 <211> Ю <212> РНТ <213> Ното вар±ета <400 15
Зег А1а бег вег бег Уа1 бег Туг МеС Туг 15 Ю <210 16 <211> 30 <212> ДНК <213> Ното вар!епв <400> 16 адЬдссадсЬ саадЪдЪаад Ъ^асаСдъас 30 <210> 17 <211> 7 <212> РКТ <213> Ното зар!епв <400> 17
Аар РЬа бег Аеп Ьеи Ά1© бег
5 <210> 19 <211> 21 <212> ДНК <213> Ното вар1ецэ
- 71 015262 <400> 1В дасЕЫгЪсса ассЬддсЪЬс ъ <210> 19 <211> 7 <212> РЕТ <213> Ното еарлелэ <400> 19
Аар Ъеи Вег Ави Ъеи А1 а Вег
5 <210> 20 <212> 21 <212> ДНК «213> Ното вар1епэ <400 20 дассидЪсоа ассЬддсЬЪс е <2Ю> 21 <211> 7 <212> РЕТ <213> Ното вар!епв <400> 21
Аар Ней Вех* Аеп Ьеи А1а Вег
5 <210> 22 <211> 21 <212> ДНК <213> Ното вар1епв <40Оэ- 22 даса£д£сса асоЪддсСЬс Ь <210> 23 <211> 7 <212> РЕТ «213» Ното эар1эдв <400> 23
Азр ТИг Зег Азп Ъеч ТЬг Вес
5 <210> 24 <2Ц> 21 <212> ДНК <213> Ното варЛепв <400> 24 дасасаЬсса. ассЬдасдЕс Ъ <210> 25 <211> 7 <212> РЕТ
- 72 015262 <213 > Нолю зар!епв <400? 25
Авр ТЬх Зег дДи Беи А1а Зег
5 <210> 26 <211> 21 <212> ДНК <213> Ното еарХ&пз <400> 26 дасасаъссд адсЬддсьес Ь 21 <210> 27 <211> 7 <312> РКТ <213> Ното вар1епэ <400> 2?
Авр Ткг Зег Ави Деи А1а 5ег
5 <210> 28 <211> 21 <212> ДНК <213> Ното вар1еад <40О> 28 дасасаксса. асс£ддс££с ί 21 <210> 29 <211> 9 <212> РВТ <213> Ното вар1епа <400> 29
Мек <31п Тгр 5ег 01у Туг Рго Туг ТЬг
5 <210> 30 <211> 27 <212> ДНК <213> Ното вархепв <400> 30 аЬдоадкдда дкддккаесс акасасд 27 <210> 31 <211> 9 <212> РНТ <213> Ното варгепз <400> 31
Сув <Э1п Тгр Зег С1у Туг Рго Туг Ткг
5
- 73 015262 <210> 32 <211> 27 с212> ДНК <213> Исто зархепз <400* 32
ЪдЪсад^дда дсддспассс а^асасд 27 <210> 33 <211> Э <212> РНТ <213> Ното варАепв <4оо> за
Зег Суа Тгр 8ег 31у Тух Рю Туг ТЬх
5 <210> 34 <211> 27 <212> ДНК <213> Ното яар!епз <400> 34
ЪсЪдЬдЬдда дЪдд^Ьассс аЪасасд 27 <21О> 35 <211* 9 <212 > РЕТ <213* Ното аар1епа <400> 35
Зег О1п Тгр Вег 31у Туг Рго Туг ТЬг
5 <210> 36 <211* 27 <212> ДНК <213* Ното вар±епз <400* 36
ЪсЪсадЪдда дьддкЪассо а^асасд 27 <2Ю> 37 <211> 10 <212> РЕТ <213> Ното 8ар1епе <400> 37 □1у РНе ТЬг РЬе Зег Вег РЪе Ма Ъеи Вех*
10 <210> 38 <211> 30 <212> ДНК <213> Ното вар!епз <400> 38 ддайЬсассЪ Ь'Ьад^адсТС ЁдсссЬрЬсЬ 30
- 74 015262 <210* 39 <211* Ю <212* РЕТ <213* Ното еархепе <400* 39
С1у РНе ТЬх РЬе Зет Его РЪе А1а Мей Зег 15 10 <2Ю> 40 <211* 30 <212* ДНК <213* Ното аар!епе <400* 40 ддаЬйсасой ейадйссййй йдссайдйсй <210* 41 <211* 10 <212* РЙТ <213* Ното &ар1епе <400* 41
31у РЬе <Э1п Рке Зег Зег РЬе А1а Мей Зег
10 <210* 42 <211* 30 <212* ДНК <213* Ното зархеив <400* 42 ддаййссадй ййадйадсйй йдссайдйсй <2Ю> 43 <211* 10 <212* РЙТ <213* Ното еархепв <400* 43 <31у рЬе ТЕг Ткг Зег бет Рке А1а Мей Зег
10 <210* 44 <211* 30 <212* ДНК <213* Ното вар!епе <400* 44 ддаййоасса сйадйадсЬС: йдссайдйсй
<210* 45
<211* <212* <213* 10 РКТ нолю
<400* 45
- 75 015262 <31у РЬе βΐη ₽Ье Зег Рго РЬе А1а Зег
10 <210> 46 <211? 30 <212? ДНК <213? Ното еар!епв <400> 45 ддаЬЪссадЪ ЪЪадЪссЪЕй ЬдсааЪдЪак 30 <210? 47 <211> 10 <212 > РЕТ <213 > Ното еар1еП8 <400? 47 □1у рЬ.е ТЬх РЬе бег бег РЬ.е А1а МеЪ Зег
10 <210> 46 <211> 30 <212? ДНК <213> Ното варЯепе <400> 49 ддаЗДсассЪ ЪЪад£адс1± СдссаЪдЪск 30 <210> 40 <211> 17 <212> РЕТ <21Э> Ното 5ар1еид <400> 49
Ьуд А1а Зег бег Э1у Э1у Зег Туг ТЪг Туг Туг Рхо Авр ТЪх Уа1 ТЬг
Ю 15 (31у <210> 50 <211> 51 <212> ДНК <213> Ното зарГепа <400? 50 ааадсдадка д^ддЬдддад ЬЪасассЪас ЪаЬссЪдаса с^дЪдасддд с 51 <210? 51 <211? 17 <212> РЕТ <213> Ното еархепз <400> 51
Ьуя Х1е 8ег дег О1у С1у вех Туг б!и Туг Туг Его Авр ТЬг Уа1 ТЬг
10 15 <31у
- 76 015262
-=210 > 52 <211> 51 <212> ДНК <213 > Ното вар1епБ <400> 52 .
ааааййадйа дйддЬдддад ЪЪасдадйас ЪайасЬдаса сГдйдасддд с 51 <210> 53 <211? 17 <212> РЕП <213 > Нотпо еархепз <400> 53
Ъуз Це 9ег 5ег С1у 01у Зет Туг Туг Туг Туг Рго Авр ТМг Уа1 ТЬг 15 10 15 <31у <210? 54 <2Ц> 51 <212> ДНК <213> Нолю вар!епе <40О> 54 ааааЪЪадйа дыддйдддад ййасйайЬас йайссйдаса сЬдйдасддд с 51 <210? 55 <211> 17 <212> РК.Т <213> Ното зар1еп® <400? 55
Ьув Х1е Зег Зег 01у С1у Зег Тгр ТКг Туг Туг Рго Азр ТЪг Уа1 ТЬг
10 15 <31у <210? 55 <211> 51 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 55 аааайГадка дьддйдддад Ъйддассйас йайссЬдаса сйдйдасддд с 51 <210> 57 <211? 17 <212? РНТ <213? Ното вархелз <400> 57
Ьуз Не Зег Рго 01у 51у Зег Тут ТЬг Туг Туг Рго Авр тЬг Уа1 тЬг 15 10 15
01у
- 77 015262 <210> 58 <2Х1> 51 <212> ДНК <213 > Ното еар1епе <400> 58 ааааЪЪадСс сдддЬдддад ЪЪасасс^ао ЬаЬссЬдаса сЬдЪдасддд с 51 <210> 59 <211> 17 <212> ДНТ <2X3^ Ното яарХепе «400> 59
Ьуе Не Зег Рхо О1у ОХу Зег Тгр ТЬе Туг Туг Зег Авр ТЪх ν&1 ТЬг
10 15
О1у <210> 60 <211> 51 <212> днк <213> Ното эарХепэ <400> 60 ааааЪЪадис сдддЬдддад ЪЬддасс^ас ЬаЪЪсЪдаса с^дЪдасддд с 51 <2Ю> 61 <211> 17 <212> РЙТ <ЗХЗ> Ното аар1епэ <400> 61
Дув Не Зег Зег С1у <Э1у Зег Туг ТЬх Туг Туг Рго Азр ТЬг Уа1 Ткг 15 ю 15
О1у <2Х0> 62 <211> 51 <212> ДНК <213> Ното вартепя <400> 62 ааааЪЪадЪа д^дд^дддад ГЪасассЪас ЪаЪссЬдаса сЪдЬдаоддд с 51 <210> 63 <211> 17 <212> РКТ <213> Ното вархеив <400> 63
Ьуе 11е Зе* Зег <Э1у 61у Зег Туг ТЬх Туг Рке Рго Аар ТНг Уа1 Ήιτ
10 15
О1у <210> 64
- 78 015262 <211> 51 <212> ДНК <213 > Ното варХепэ <400> £4 ааааЬЬадса 9^99^9990-9 ЬЪасассбас ЪЬЬссЬдаса сЪдЬдасддд· с 51 <21й> 65 <211> 17 <212> РЕТ <213> Ното еархепв <400> 65
Дув Не 5езг Зег 31у <Э1у 8ег Туг Ткг туг Туг Рго Авр Ткг Уа1 А1а 15 10 15
С1у <210> 66 <2И> 51 <212> ДНК <213 > Ното вар!епа <400> 66 ааааЪЬадЬа дЕддЪдддад иъасассъас ЪаЪсаЬдаса сЪдЬддсЪдд с 51 <210> 67 <211> 17 <212> РЕТ <213> Ното еар1епв <400> 67
Ъуе Не Зег Зег (Пу О1у Зег Туг Ткг Туг Туг Аар Азр тЬг Уа1 тЪг
10 15 ©1у с210> 68 <211> 51 <212> ДНК <213> Ното еар1еп8 <400> 6в ааааЪЬадЪа дЪддЪдддад ИЪаоассЪас ЪаЬдаСдаса сЬдЪдасддд с 51 <210;> 69 <211> 17 <212> РЕТ <21з> Ното вар!еоз <400> 69
Ьуз Не Зег Зег (31у <31у Бег Туг Ни: Туг Туг Бег Азр ТКг Уа1 тЬг
10 15 (31у <210> 70 <211> 51
- 79 015262 <212? ДНК <213? Ното варХзпз <400 70 ааааЪЪадЬа 9*99*599*9 ЫхадассЬас ЪаЪЬсЪдаса сЪдЪдасддд с <210> 71 <2Ц> 17 <232> ИЯ?
<213? Нфию эард-епз <400> 71
Ьуз Не Зег бег 51у С1у 5ег Тух ТЪг Туг Туг Рго Азр ТЪг 7а1 ТЬт 15 10 15
Рго <210> 72 <311? 51 <212? ДНК <213? Нолю аар!епз <400? 72 ааааЪЪад^а дьддСдддад ЪкасассЬас ЬаЕасЪдааа сЬдЪдасдса д <21ф> 73 <2И> 17 <212> РКТ <213> Нотгю яар1епв <400? 73
Ъуе Це Зег Зег С1у С1у Зег Туг ТЬт Туг Туг Рго Авр ТИг Аэр ТЬх 15 10 15 а1у <210? 74 <211> 51 <212> ДНК <213> Нота Βπρίβηβ <400> 74 ааааЪЪадЪа д^дд^дддад Ъ^асасс^ас Ьа£сс£даса аЪднЪасддд с 51 <210> 75 <211> 17 <212> РКТ <213> Ното еарГепз <400? 75
1»уз 11е 8ех Ρϊό ©1у С1у 8ег Туг ТИг Тут Туг Зе* Аяр ТЬх· Уа1 ТЬг
10 15
31у <210? 76 <211> 51
- 80 015262 <212» ДНК <213 > Ното зархепн <400> 7Б ааааЭДадЬс сдддЪдддад ЪЪасассЪас еаЪЪс-кдаса сЪдЪдасддд с 51 <210> 77 <211» 17 <212> РЕТ <213> Ното еар1ейв <400> 77
Х>уа Не 5ех Рхо 01у <31у Вег Тгр ТЬт Тух Туг Авр Авр ТЬх Уа1 ТЬх
5 .10 15 <51у <210> 78 <211> 51 <212> ДНК <213» НОЛЮ вархепв <400> 7В ааааЪЪадЬс сдддЪдддад ЪЪддассЬас ЬаЪдаЪдаса сЬд^дасддд с <210> 79 <211> 10 <212» РЕТ <213> Нолю зар±епз <400» 79
О1п Ьеи тгр д1у Вес туг А1а Ьеи Авр Туг 15 Ю <210> 80 <211» 30 <212> ДНК <213> Нолю вар!епэ <4оо> ао садЪЬаЬддд дд^сдХаЬдс ЪсЪЬдасЬас <210> 81 <211» 10 <212» РЕТ <213> Ното вархеиз <400> 51 .
б1п 1>еи Тгр С1у Туг Тут А1а Ьеи Авр Тйт
Ю <210» 52 <211> 30 <212> дНК <213» Ното еархепз <400» 82 садЬЬаЬддд ддЬаеЪаСдо ке-Сдасасд <210> 83 <211> Ю <212 > РкТ <21Э> Нолю аарХепз <400> 83 е1п Деи Тгр С1у ткг Тут А1а Деи Авр Тут
10 <2Ю> 84 <2Ц> 30 <212> ДНК <213 > Ното вархездв <4 ОСЬ 84 оадЬЪаСддд ддасЬПаЪдс ЕсЬГдасЬас <210> 85 <211> 10 с212> РЯТ <213> Ното зарХемз <400> 85 θΐη Деи Ттр С1у Аеп Тут А1а Деи Авр Тут
10 <210> 86 <211> 30 <212> ДНК <213> Ното зархеде <400> 86 садЪЬаЬддд ддааЪЬакдс ссЪЬдасйас <210> 87 <211> 10 <212> РКТ <213> Нолю еар1епз <400> 87
З1п Деи тгр (31у Туг Туг А1а Деи Авр Рке
10 <210> 88 <211> 30 <212> днк <213> Нолю вараеяэ <400> 88 садЪкаЬддд ддкаскаЪдс Ъсккдаск^^ <210> 89 <211> 10 <212> РКТ <21Э> Ното вар£етв <4О0> 89
С1п Ьеи Тгр О1у Туг Туг А1а Ьеи Азр Не
Б 10 <210> 90 <211? 30 <212> днк «213* НогаО зарХвда <400> 90 садййакддд ддйасйайдс йсИйдасаЫ:
<210> 91 <211> 10 <212* РИТ <21з> Ното вараеив <400* 91 □1п Ьеи Тгр (Пу Туг Туг А1а Неи Авр Туг
10 <210> 92 <211> 30 <212* ДНК <213> Ното зархепз <400> 92 садййайддд ддйасйайдс ЬсййдасСас 30 <ЗЮ> 93 <2Ц> Ю5 <212* РЙТ <213> Ното еархепв <400* 93
С1и Не Уа1 Ьеи ТЬх θΐη. Эег РХО А1а ТЬх Ъеи Зег Ьеи Вег РХО <51у
1 5 10 15
<31и Ахд А1а ТНг Ьеи 8ег Суз Зег А1а Зег Зег Зех Уа1 Йех Тух Ней
20 25 30
Туг Тгр Тух О1Л <31п ьув ₽го с1у С1П А1а Рхо Ахд Деи ьеи Не тух
за 40 45
Авр ТЬх Зех Аеп Ьеи А1а Зег Е1у Не Рго Л1а Агд РЪе Вег <31у Зех
ВО 55 60
<Э1У 8ех <31у ТЬх Авр Рке ТЬг Ьеи ТЬх На Зег Ззх Ьеи О1и РГО в1и
65 70 75 во
Азр Рке А1а Уа1 туг Туг СУ® Зег Ολη Тгр Зех 31у Туг Рхо Туг ТЪг
65 90 95
РЬе С1у С1у О1у ТЬг Ьуя Уа1 <31и Не Ьуз
100 105 <210* 94 <211> 318 <213? ДНК <213* Ното зар1епз «00* 94
- 83 015262 дацаЫдкдЪ Ъдасасадка кесадссасс сСдЫЫЪдк Ыссадддда аададссаас 60 сксксс^дса дСдссадскс еадсдкаадк Ъасаедгаск ддгассаася дааасскддс 120 саддсЪссса ддысскаак сЪакдасаса кссаассгкдд еккскддсак сссадссадд 3.80 к^оадкддса дЪдддкскдд дасадасккс аскоксасса ксадсадсск ададсскдаа 240 даккЫдаад ЬЫаккаскд еъыеадкдд адкддккасс са^аоасдЪк сддсддаддд 300 асоааддЪдд адайсааа 318 <2Ю> 95 <211> 119 <212 > РЕТ <213> Ното зар!епз <400> 95
<31и Уа1 61л Деи Уа1 Э1и бег 01у е1у Шу Хеи Уа1 О1п ΡΧΌ е1у е1у
1 5 10 15
8ег Ъеи Агд Деи 5ег Сув А1а А1а Зег О1у РЪе тЬх ₽Ье Зег Зег РЬе
2Р 25 30
А1а Мее Вег Тгр ν&ι Агд О1тх А1а Рго О1у Дуз С1у Деи сз1и тгр ν&1
35 40 45
А1а ьуе Не Бег Зег <31у <31у Зег Туг ТЫ Туг Туг Рго Аар ТЫ ν&ι
50 65 60
ТЫ <31у Агд Рке ТЫ Не 8ег Агд Авр Авп А1а Ьуз Αδη Зег Деи Туг
65 70 75 80
Деи 61п Мек Ав η Йех Деи Агд А1а Ши Авр ты А1а Уа1 Туг Туг суя
85 90 95
А1а Игд <3111 Деи Тгр б!у Туг Туг А1а Деи Аэр Туг Ттр Шу αΐη С1у
100 105 110
ТЫ ТЬх Υ&1 ТЬг Уа1 Зег Вег
115 <210 > 96 <211> 357 <212> ДНК .
<213> Ното зар1епэ <400* 96 даддЪдоада Ъддкддадкс кдддддаддс ькддкссадс скддддддкс ооЪдадасЬс 60 ±ссЬдЪдсад сЫскддакк сассЫк-адк адсЬЫдссе кдксккдддк ссдссаддск 120 ссадддаадд ддскддадкд ддкддсса&а. зккадкад'кд дкдддадкка сассЬаскак 130 сакдасаокд ^дасдддасд акксаосакс кссададаоа асдссаадаа сксаскдкак 240 скдсааакда асадеокдад адседаддвс асддскдкдк вккасЪдкдс дадасадкЪа 300 ЪдддддЪаск акдсксЫда скаЫддддс саадддасса аддксаесдк сксскса 357 <2Ю> 97 <211* 105 <212* РКГ <213> Ното еар1епв <400* 97
С1и 11е Уа1 Деи ТЫ С1п бег Рго А1а ты Деи бег Деи Вег Рго Шу
1 5 10 15
Ши Агд «а ТЬг Деи Зег Суз Зег А1а 8ег Не Бег Уа1 Зег Туг Мек
20 25 30
Туг ТГр Туг С1п Ши Дув Рго Шу (31 η А1а Рго Агд Хеи Деи Не Туг
35 40 45
Авр ме€ 8ех Ави Деи А1а Зег (31у Не Рго А1а Агд РЬе Зег Шу Зег
50 55 60
Шу Бег 01у ТЬг Авр РНе ты Деи ты Не 3®г Зег Деи Ши Рго Ши
65 70 75 80
- 84 015262
Аэр РЬе А1а ν&1 Тут Туг Сув МеЬ Э1п. Тхр 5ег (31у Тут Рхо Тут ТЫ 65 90 95 ₽Ье <31у О1у (31у ТЬг Ьуз ν&Ι αΐυ 11а Ьуз
100 105 <210> 58 <211> 31В <212> ДНК <213> Нотпо йар!епе <400> 58 дазаЪйдСдЬ ^дасяаадсс Ьссадесасс сЬд&аССЬде аЬасадддда аададссаос 60 сЪЫсЫдса дЪдссадсаи иадъдеаадъ 1:аса1:дЪёмзЬ ддЪасоааса дааасаЬдди 120 саддсЬссса ддсСссЬсаС с^аСдасаЬд СссаасоСдд оЫЫддсае сссадссадд 180 Ысадйддса дСдддкаЪдд дасадасЬЪс асгс^сасса ЪсадсадссЪ ададссЬдаа 240 дабйЬЪдоад СЬйаСйасЬд еаЬдсадЬдд адеддъеасс саеасасд&Ь сддсддаддд 300 ассааддТдд ада^сааа 313 <210> 99 <311> 119 <212» РЯТ <213> Ното зардепз <400> 99
С1и Уа1 εΐη Ьеи Уа1 С1и Вех С1у О1у 01у Ьеи ν&ι αΐη Рго В1у 01у
1 5 10 15
Вег Ьеи Асд Ьеи Вех Суз А1а А1а Зег <Э1у РЪе ТЫ РЫ Зег Рто РНе
20 25 30
А1а МеИ 8ег Тгр Уа1 Агд (31п А1а Рго 01у Ьуа С31у ьеи (Пи тгр Уа1
35 40 45
А1а ъуе Не Эех Рта С1у 61у Зег Тгр ТЬг Туг Тут Вег Азр ты V»!
50 53 60
Т11Г <31у Агд РЬе ТЫ Не Йег Ахд Азр Анн А1а Ьув Абл Вег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ъеи (31л Ме-Ь Абл Зег Ьеи Агд А1а 01и Авр ТЫ А1а Уа1 тут Туг Суз
В5 50 95
А1а Агд С1д Ьеи Тгр ©1у Туг Тут А1а 1>еи Аар Не Тгр 61у (31л <31у
100 105 НО
ТЬх ТЫ Уа1 ТЫ ν&ι 8ех Зег
115
<210> 100 <211> 357 <212> ДНК <213 > Ното вараепв <400> 100 даддъдсадс ЪддЬддад^с ъдддддадда ЪЪддЬссадс ссддддддес сЫдадас&с 60
ЬссЬд&дсад сЫЫддаЫ саесЬЪЪадЬ ссЪЫЪдоаа ЪдЬсСйдддЪ содссаддеЪ 120 ссадддаадд ддсъддад1:д ддЬддссааа аЪЬадЪссдд д^дддадЪЪд дассеаскаЬ 180
ЬсЪдасасЬд йдасдддссд а-ЬЪаассаЪс Ъсоададаса асдссаадаа сгсас^д^ае 240 сбдсаааЪда асадсЫдад адссдаддас аоддЫдЬдЬ аЪЬас^дЬдс дадасадЪЬа 300
ЪдддддЪасъ аЪдсЪсЪЬда саЬ^еддддс саадддасаа сддТсассдЬ сСссиса 357 <210> 101 <211> 106 <212> ЙЙТ <213> Ното еар!елз
- 85 015262 <?400> 101
(31и Не уа1 Ьеи ТЬг <31п Зег Его А1а ТЬг Ьеи Йех Ьеи Зег Его 01У
1 5 10 15
Е1и Лхд А1а ТЬг Ьеи Зег Сув Зег А1а Зег Туг 8ег Уа1 Зег Туг Ийё
20 25 30
Тух Тхр туг □1п βΐη Ьуд Рго <31у (31η А1а Рго Атд Ьеи Ней Не Туг
35 40 45
Авр МеС бег А.5П Ьеи А1а 8ех 31у Не Его А1а Ахд РЪе Зег <31у Зег
50 55 60
01у Зег С1у ТЪг Азр РЪе ТЬг Ьеи ТЬг 11е бег 8ег Ьеи С1и Рго Й1и
65 70 75 ВО
Авр рЬе А1а Уа1 Тух* Туг сув Мее 01П Тхр бег 61у туг ЕГО Туг ТЬг
85 90 Э5
РЬе (31у 01у <31у ТЬг Ьуе Уа1 С1и Не Ьуз
100 105
<210> <211? <212> <213?
102
318
ДНК
Ното вархепв
102 <400> даааСЪдЪдЪ аЪоСасЛдса саддсСссса ССсадЬддса даШхЪдсад ассааддЬдд
Ьдасаеадгсс дЪдссадсСа ддсЪасСоаС дсдддСсЪдд ЬССа££асС.д адаъсааа
Ъссадссасс СадЪдСаадЪ сСаСдаааСд дасадасССс ЪаСдсадгдд сЬесадддда сЬдЪсссЪдС
СасаСдСаеС. ддсасеаааа СссаассСдд сССсСддсаС асСсСаасса ссадсадасс адСддЬСасс саСасасдЪЬ аададссаос дааассСддс сссадссадд ададооЪдаа сддсддаддд
120
180
0
300
318 <210> <211? <212?
<213?
103
119 РЕТ нота еархепв <400> 103
«31и Уа1 С1п Ьеи νβΐ 31и Зег <31у С1у С1у Ьеи Уа1 61п Рго 01у С1у
1 5 10 15
Зег 1*еи Ахд Ьеи Зег Суо А1а А1а бег 01у ₽Ьэ С1п РЬе Зег Зег РЬе
20 25 30
А1а Мес Зег Тгр Уа1 Агд □Ιη А1а Рго в!у Ьув <31у Ьеи 01и Тгр Уа1
35 40 45
А1а ьув 11е Зег Рго С31у С1у Зег Туг ТЬг Туг Туг Зег Авр ТЬг Уа1
50 55 60
ТЬг С1у Агд РЬе ТЬг 11е Бег Агд Аяр Ави А1а Ьуз Аец Бег Ьеи Тут
55 70 75 ВО
Ьеи С1п меЪ АЗП Бег Ьеи Агд А1а СХи Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
35 50 эз
А1а Агд (31п Ьеи Тгр С1у Туг Туг АЛ а Ьеи Азр РЬе Тгр (31у С1п 01у
100 105 НО
ТЬг ТЬг ν&ι ТЬг Уа1 Зег Зег
115 <210? 104 <211? 357 <212? ДНК <213> Ното вар!епз <400? 104
- 86 015262
сз!у 11е Рго А1а Агд РЬе Зег □1у Бег 01у зех (31у ТЬг Азр РЬе ТЬг
1 5 10 15
Хеи ТЪг 11© Зег Зег Хеи 01и Рю 61и Авр РЪе А1а Уа1 Тут Тузг Сун
20 25 30
Хеи Уа1 С1и Зег
5
Хеи 20 Зет Суз А1а
- 87 015262 <210> 110 <211> 14 <212> РКТ <213> Ното зарХепв <400* 110
Тгр ν&1 Лед а1п А1а Рго Э1у Ьуе 01у Ъёи С1и Тгр Уа1 А1а 13 Ю <23.0 > 111 <211> 32 <212> РКТ <213> Ното эар1еп» <400> 111
Агд Рке ТЫ Це Бег Агд Аар Авл А1а Ъув Авп 5ет Ьеи Туг Ьеи <31п
1 5 10 15
МеЪ Абп Бег ъеи Агд А1а О1и Азр ТЫ А1а Уа1 Туг Туг Сув А1а Агд
20 25 30
<210> 112 <211> 11 <212> РНТ <213? Ното вархепз <400> 112
Тгр С31у 61П О1у ТЬг ТЫ Уа1 ТЫ Уа1 йег Зет
1 5 10
<210> 113 <211> 17 <212> РНТ <213> Ното вархепБ <400> 113 31и Т1а Зег 8ез? 31у О1у Вег Пуг ТЬг Туг Туг Рхо лвр ТЫ Уа1 ТЫ
1 5 10 15
01у <210> 114 <211> 10 <212> РЯТ <213 > Ното аархепз <400?· 114
О1у Ьеи Тгр е1у Туг Туг А1а Ьеи Азр Туг
10 <2Ю> 115 <211> 212 <212> РНТ <213> Ното зархепз
- 88 015262 <400> 115
МвЬ АВП вех Рпе Зет ТЬг Зег А1а Рке 51у Рго Уа1 А1а ?п.е 8ег Ъеи
1 5 10 15
31у Ъец Ьеи Ъеи Уа1 Ъеи Рго А1а А1а РЬе РГО А1а Рго Уа1 Рго Рго
20 25 30
01у Ο1Ή лер Йет Ъуе Авр Уа1 А1а А1а Рго Н1е Ахд □1П Рго Ъеи Т1иг
35 40 45
Зег евг <31и Агд Не Авр Ъув С1п Не Агд Туг Не Ъеи Авр <31у Не
50 55 60
Зег А1а Ъеи Агд Ъуз <31и ТЪт Суз Азп Ъув Йег Аеп Мей Сув (Пи Зег
65 70 75 во
зег ьув βίο А1а Деи А1а 01и Ави Аеп ъеи Аеп Ъеи Рго Ъув Мей А1а
85 эо 95
О1и Ьуз Авр О1у Суз РЬе С1п Зег СПу Ави С1и □1и ТЬг Суд Ъеи
100 105 но
Уа1 Ьуе Не 11е Пп? 01у Ъеи Ъеи 61и РЪе С1и 7а1 туг Ъеи О1и Туг
115 120 125
Ьеи 01п Ави Атд РЬе σι-и бег 8ет 31и (31и 131в А1а Агд А1а ¥а1 <31п
130 135 140
Меь век Т11Г Ъуз ν&1 Ъеи Не С1П РЪе Ъеи □1а Ъу& Ъуе А1а Ъув А&п
145 150 155 160
Ъеи Азр А1а Не ТЬх ТЬт Рго Азр Рго ТЬт ΤΗχ Ави А1а Зег Ъеи Ъеи
155 170 175
ТИг Дув Деи <31и А1а <31п Αθίϊ 01и тхр ъеи (31 η Авр Мей Т11Г ТНг Н1в
1&0 185 190
Ъеи Не Ъеи Агд Зег РЬе Ьув С1и рПе ъеи Ши Зег Зег Ъеи Агд А1а
195 200 205
Ъеи Ахд 61п Мей
210
<210> ЦБ <211> 106 <212 > ЮТ <213> Ното &ар1епв
<400> 116 Ь1и Не 7а1 Деи ТИг 01й Зег Рго А1а ТЪг Ъеи Зег Ъеи Зег Рго О1у
1 5 10 15
01и Агд А1а Йие Ъеа Зех Сув Зег АД а бег Зег Зег Уа1 Зет Тут Мей
20 25 30
Тух Тгр туг 61п О1п Ъув Рго Й1у Й1и А1а Рго Агд Ъеи Ъеи Не Тут
35 40 45
Аар ТЬт Йех Азп. Деи АД а Зет Й1у Не Рго А1а Агд Рке Зет □1у Зег
50 55 ео
<31у Зег С1у ТЬк Азр РЬе ТЬг Ъеи ТЬх Не Зег Зег Ъеи С1и Рго □1и
65 70 75 во
Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз Йег 01и Тгр Йех С1у Туг Рго Туг ТЬх
55 90 95
РЬе О1у <31у (31у таг Ьуз Уа1 01и Не Ъув
100 105 <210» 117 <211> 37Θ <212> ДНК <213» Ното варХепв <400» 117 аЬддаадссе садсдаадсР РсРсЪЬсс^с ссдсЪасгсс ддсРссеада Ьассассдда 60
- 89 015262
01и Уа1 σΐη Ьеи Уа1 СЯи Зег З1у е1у б1у Неи Уа1 С1п Рха <31у (31у
1 5 10 15
Зех Веи Ахд Неи Зег Суй А1а А1а Зех 01у РЬе ТЬх ВЬе Зег 8ех РЪе
20 25 50
А1а мае 8ег Тгр Уа1 Атд ©Хи А1а Его 31у Нуз <з1у Неи И1Т1 Тхр Уа1
35 45
А1а Ьуз Не 8вх ₽ХО 01у О1у 8ех Тух ты Тух Туг Его Аер ГЬх Уа1
во 55 60
ТЬх <эгу Ахд РЪе ТЫ Не Зег Ахд Азр Абп А1а Ъув Леи 8ех Ьеи Тух
65 70 75 30
Ьеи С1п Мей Азл Зет 1еи Агд А1а 01и Авр ТЫ А1а Уа1 Тух Тух Суе
В5 90 95
А1а лхд αΐη Неи Тгр <31У Туг Тух А1а Неи Авр Тух Ттр Шу 01ь С1у
100 105 НО
тЬг ТЬх Уа1 ТЬг Уа1 бег Вех
115
а1и Не Уа1 Ьеи ты С1й Вех Рхо А1а ТЫ Ьеь Зег Ъеи Зет Его <31у
1 5 10 15
Я1и Агд А1а ТЪг Неи Зег Суз Зег А1а Вех аех Зег Уа1 Зег Туг МеЪ
20 25 30
Тух Тгр Туг В1П Ъув ₽Г0 <Э1у В1ц А1а Рхо Атд Ьеи Ьеи Не Тут
35 40 45
Аар РЪе Вег А.ЗП Неи А1а Зет 01у 11е Рто А1а Агд РЬе Зет <31у Зег
50 55 δο
аху 8ет <31у ТЬх Авр РЬе ТАГ Беи Тлг Не Зег Зег Ьеи еХи РГО <?1и
65 70 75 90
Αερ РЬе АХа УаХ Туг Туг Суя мет Б1п Тгр Йеэг С1у туг РТО туг ТЬг
85 90 95
РЪе <31у В1у 61у ТАг Ъув V·! <31и Не дуй
100 105
31и ν^ι 61л Деи 7а1 С1и Зег <31у <31у 61у Ьеи УаХ С1П Рхо Б1у 01у
1 5 10 15
8ег Ьеи Агд Деи Зег Суз АХа АХа Зег <31у Ейе 01ц РЬе Вег Рго РНе
20 25 30
АХа МеЬ Вах* Тгр Уа1 Агд ОХп А1а ЕГО (31у Ьуз □1у Ьеи С1и Тгр УаХ
35 40 45
А1а Дув Не 8ег Рго С1у <=1у Зег Тгр И1Г Туг Тут- Зег Авр ТПг УаХ
50 55 60
ТЬх СХу Агд РЬ® ТЫ Пе Вег Агд Авр Азп А1а Буз АЗП вех ьеи Туг
65 70 75 80
Деи О1п Мел Аап Вег Ьеи Агд АХа (31и Αερ ТЪг АХа Уа1 Туг Тут Суе
85 90 95
А1а Агд С1п Деи Тгр 61у Туг Туг АХа Ьеи Аер Не тгр СХу <31п Б1у
100 105 но
ТЬх ТЬг 7а1 ТЬт Уа1 Бег Зег
115
- 91 015262 <211? 105 <212> РЕТ <213> Ното <400> 124
αΐυ 11© Уа1 Хеи ТЬг <31п Зег его А1а ТЪ* Неи Зег Неи Зег Рхо <31у
1 5 10 15
0111 Агд Л1а 'Гйг Ьеи 8 аг Сув Зе* А1а бег 11е Зег ν&1 Зег Туг мв-е
30 23 30
Туг Тгр Туг 61η. 61п Нуз РГО С1у <31л А1а Рго А*д Деи Неи Не тух
35 40 45
Азр Меи вег Авп Ьеп А1а Вег Э1у Не Рго А1а Агд РЬе Зег С1у Зег
50 ББ СО
□1у 5ег 61у И1Г Авр РИе ТЪх Ьеи Тйг Це Эег Бег Неи 01и РХо О1и
65 70 75 30
Айр РЬе А1а V»! Туг Туг Сув Мей 31п Тгр Зег О1у Туг Рго Туг ТЬг
03 50 ЭЗ
Рйе <31у <ЗХу в!у тЬх Нуз ν«.ι □1и Пе Ьуз
100 105
<210? 125 <211> 378 <312? ДНК <213? Ното варХедв <400? 125 айддаадасс садсдсадсй исйсййссЬс сйдсЪасисЬ ддсЪессада Ъассассдда 60 даааЪЬдЬдЪ ЬдасасадЪс Ессадссасс сйдИсЬЪЕдк сЪссадддда аададссаскз 120 сЬсЬссЪдса дЬдссадсай ЪадЪдЪаадЬ йасаидйасй ддьассааса дааассЪддс 180 саддсЬссса ддс£сс±са£ сйаЪдасайд Ъссааесйдд сЬСсЪддсаЪ сссадссвдд 240 ^ЪсадЬддоа дйдддхс&дд дасадасейс аойсЬсасса Ьсадсадссй ададссЬдаа 300 даъеькдсад ъееаЫхасСд еайдсадйдд адЬддйЬасс сайасасдйй аддсддаддд Збо ассааддЪдд адайсааа 37В <210> 126 <211? 119 <212> РКТ <213> Ното вар1епз <400> 126
Э1и Уа1 <31п Неи ν&ι 51и Вег Э1у С1у С1у Неи Уа1 С1п Рго В1у «1у
1 5 10 15
Зег Хеи Ахд Беи Зог сув А1а А1а Зе* е1у РЬе О1п РЬе Зех Зег РИв
20 25 30
А1а МеГ Зег тгр Уа1 Агд 61л А1а Рхо 61у Нуе <31у Ъеи 61и Тгр Уа1
35 40 45
А1а Ьув Не Зег Рго Э1у 61у Вех Туг ТН* Туг Ту* Бег Авр ТЬг ν«ι
50 55 60
ТЪг В1у Агд Рае ТЬг Не Зег Агд Авр Αΰη А1а Нув Азп Зех Неи Туг
65 00 75 80
Х|©и <31п ИеЪ Аян 8е* Хеи Ахд А1а С1и Авр ТЬг А1а Уа1 туг Тут Сув
85 90 95
А1а АХд 01п Ьеи Тгр <31у Туг тух А1а Неи Авр Х1е Тхр 61у <ЗХи С1у
100 105 но
ТЪг ТЬх Уа1 ТЬг Уа1 Яех 5е*
115
<210> 127 <211> 414 <212> ДНК <213> Ното еар1епа <400> 127 аЪддадккЪд дсседадсЪд ддкЪеьссЪЪ дЪЪдскаЪеъ ЪадааддЬдЬ осадкдьдад 60 дкдсадскдд ЪддадксЪдд дддаддсЪЪд дкссадсскд дддддЪсссЬ дадаоЬскСО 130 Ъдкдсадсск с^ддакксса дъьъадеадс кикдссаДд!: съкдддкссд ссаддсксса 180 дддааддддс кддадЬдддк ддссаааакк адкесоддЬд ддадккасас скасСакадс 240 дасаскдЬда одддссдакЪ аасса^сксс ададасавсд ссаадаасЪс аскдЬакскд 300 саааЪдааса дсскдададс сдаддасасд дскдЬдкаЪе асъдкдсдад асадккакдд 360 дддкасЪаЪд сксЬЬдааак Ьсддддасаа дддассасдд ксассдкс^с скаа 414 <21О> 12В <211> 106 <212 > РКГ <213> Ното еарХепэ <400> 128
С1и Не Уа1 Беи ткг 01а Зег РГО А1а ТЬг Д$и Зег Ьеи Зек Рко 01у
1 5 10 15
(31и Акд Л1а ТЪг Деи Зег Суе Зег А1а Зег Туг Зег Уа1 Зек Тук МеС
20 25 30
Туг Тгр Тух 61л С1п Дуа Рго С1у С1и А1а Рго Ахд Ьеи Ьеи Не Тук
35 40 45
Аар РЬе Зег Аал Деи А1а Зег (31у Не Ρ1Ό А1а Агд РЬе Вег В1у Зек
50 55 50
□1у Зег 31у Ткг Азр 1Ъе Т11К Деи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи <51и Рго 01и
65 70 75 ВО
Авр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суе МеЪ <л!п. Тхр Зег 01У Туг его Тук ТЬк
85 90 95
РЬе 61у 01у 61у ΤΙ1Γ Дуэ Уа1 С1и Не Дуз
100 105
<21О> 129 <211> 37В <212> ДНК <213> Исто вархепэ <400> 129 акддаадссс садсдсадск ксесккесгДс даааккдкдк ЬдасасадЬс ксаадасаса скскссйдса дЪдссадска садкдкаадс саддскссса ддскссксаЬ схакдасккс ЪЪсадкддоа дЬдддкскдд дасадасккс дакЪЪкдсад ккьаккаскд ъакдсадкдд ассааддкдд адаксааа <210> 130 <211> 119 <212р РВТ <213?- Ното вархелв скдскаскс!: ддсксссада Ъассассдда 60 скдкок1:Ъд1: сксоадддда аададссаса 120 &асайдЬас± ддйассааса дааасскддс 180 кссаасскдд скЬскддсак сссадссадд 240 ааЪсксасса Ъсадоадаск ададсскдаа 300 адкддЪЬасс саЪасасдкк сддсддаддд 360
378 <400> 130
О1и Уа1 О1п Деи Уа1 б!и Зег е1у Й1у 01у Деи Уа1 С1п 1510
Бег Деи Агд Деи Бег Суя А1а А1а Зег С31у РЬе С1п РЬе
2025
А1а Мек 8ег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Дув С1у Деи 35 4045
Рго С1у <31у
Зег Рго РЬе <31и Тгр Уа1
- 93 015262
Мл ьуз Не Зег Рго О1у Й1у Зег Тгр ТЬг Туг Туг Рхо Аар ТЬг АВр
50 55 60
ТЬг <31у мд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Аер Азп А1а Ьув Ави Зег Ьеи Тух
65 70 75 80
Ьеи <Э1п мег Азп Вег Ъеи Агд А1а С1и Аэр ТЬг А1а Уа1 Туг Тут- Сув
85 90 95
А1а Агд Й1п Ьеи Тгр С1у Туг Туг А1а Ьег. Авр РЬе Тгр С1у σΐη С1у
100 105 110
ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 зег Эег
115
<210> 131 <211> 414 <212? ДНК <213> Ноше еарХапа <400> 131 айддадйййд деейдадейд ддЪкЬйссйй яЪЬдсЪаЪЪЕ йадааддЬдй ссадйдЪдад 60 дйдсадсйдд ЕддадСсЬдд дддаддоййд дйссадасйд дддддСсссй дадасйсйсс 120 Ъдьдсадссь съддаййсса дйййадйссс йййдссайдй сййдддйссд ссаддсйсса 180 дддааддддс йддадйдддй ддссаааайй адйсссддйд ддад&Сддас сЬасйайссй 240 даоаоЪдаса едддесдаЕЕ сассайсйсс ададасаасд ссаадаасйс асйдйайсйд 300 сааайдаааа деейдададс сдаддасасд дейдйдйайй асйдйдсдад всадййайдд 360 дддйаейайд сйсййдасЬй сйддддссаа дддасаасдд ЬсассдЪсйс сйса 414 <210> 132 <21Х> 10 <212 > РКТ <213> Ното еархепв <220?
<22ΐ> не определено <222? (2)(3)(4)(5)(7) <223> где Хаа может представлять собой любую одну из двадцати природных аминокислот <400? 132
Зег Хаа Хаа Хаа Хаа Уа1 Хаа Туг Мей Туг
10 <2105* 133 <211> 7 <212> РЯТ <213> Нолю зархеца <220>
<221? не определено <222> {2)(4}(6) <22з> где Хаа может представлять собой любую одну из двадцати природных аминокислот <400? 133
Авр Хаа Зег Хаа Деи Хаа Зег
5 <210? 134 <211? 9
- 94 015262 <212> ΡΚ.Τ <213 > Нолю еархепв <220>
<221> не определено =222» (1) (2)
<223> где Хаа может представлять аминокислот <400> 134 Хаа Хаа ТГр 31у Туг Рго Тут Т1гг собой любую одну из двадцати природных
1 5
<210> <211> <212» 135 10 ₽ят Ното эар!епв
<220» <221> <222> <223» не определено (3) (4) (6) О) где Хаа может представлять собой любую одну из двадцати природных
аминокислот <400= 135
С1у РЪа Хаа Хза Зех Хаа РЬе А1а Хаа Зег 15 10 <210= 136 <211= 17 <212= РНТ <213= Ноли варГепа <220= <221= не определено <222= (2) (4) (8) (9) (11) (12) (15) (16) (17) <223= где хаа может представлять сооой любую одну из двадцати природных аминокислот <400= 136 .
Ьуз Хаа Зег Хаа <31у Э1у Зег Хаа Хаа Туг Хаа Хаа Азр тЬг Хаа Хаа 1 Б 10 15
Хаа <210= 137 <211= 10 <212= РЕТ <213= Ното аараепа <220= <221= не определено <222= (5)(10) <223=где Хаа может представлять собой любую одну из двадцати природных аминокислот <400= 137 η Ьец Тгр О1у Хаа Туг А1а Ьеч Авр Хаа
10 <210= 138 <211> 9 <313> РИТ <213= Нолю вар1епв <400> 13В
Οΐιι С1п Тгр Эех 01у Тух Ргс· Тух тЪг

Claims (17)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенное антитело к ГЕ-6, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи 8Еф ГО NО:97 и/или аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8Еф ГО NО:99.
  2. 2. Выделенное антитело к ^-6, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи 8Еф ГО NО:97 и аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8ЕО ГО ^:99.
  3. 3. Выделенное антитело к ^-6, содержащее аминокислотную последовательность гипервариабельной области 1 легкой цепи (СОКЬ1) 8Еф ГО NО:3, аминокислотную последовательность СОКЬ2 8Е0 ГО NО:21, аминокислотную последовательность СОКЬ3 8Еф ГО NО:29, аминокислотную последовательность гипервариабельной области 1 тяжелой цепи (СОКН1) 8Еф ГО NО:39, аминокислотную по
    - 95 015262 следовательность СОВН2 8ЕР ΙΌ N0:59, аминокислотную последовательность СЭВН3 8ЕР ΙΌ N0:89.
  4. 4. Выделенное антитело к ΙΕ-6, включающее по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи и одну вариабельную область тяжелой цепи, причем указанная вариабельная область легкой цепи содержит:
    аминокислотную последовательность гипервариабельной области 1 легкой цепи (СОВЕ1) 8ЕР ΙΌ N0:132, содержащую последовательность §-Х1-Х2-Хз-Х4-У-Х5-¥-М-¥, где Х1 представляет собой А или С, Х2 представляет собой 8 или В, Х3 представляет собой Н, Ι, 8 или Υ, Х4 представляет собой 8 или Υ и Х5 представляет собой 8 или Е;
    аминокислотную последовательность СОНЬ 2 8 Ер ΙΌ N0:133, содержащую последовательность П-Х6-8-Х7-Ь-Х8-8, где Х6 представляет собой Е, Ь, М или Т, Х7 представляет собой N или Е и Х8 представляет собой А или Т;
    аминокислотную последовательность СЭВЕ2 8Ер ΙΌ N0:134, содержащую последовательность Хэ-Х^-ЭД-Б-С^-Р^-!’, где Х9 представляет собой М, С, 8 или р и Х10 представляет собой р или С;
    аминокислотную последовательность гипервариабельной области 1 тяжелой цепи (СОВН1) 8Ер ΙΌ N0:135, содержащую последовательность С-Е-Х11-Х12-8-Х13-Е-А-Х14-8, где Х11 представляет собой Т или р, Х12 представляет собой Е, 8 или Т, Х13 представляет собой 8 или Р и Х14 представляет собой Ь или М;
    аминокислотную последовательность СОВН2 8Ер ΙΌ N0:136, содержащую последовательность где Х15 представляет собой А или Ι, Х16представляет собой 8 или Р, Х17 представляет собой Υ или XV, Х18 представляет собой Т, Е или Υ, Х19 представляет собой Υ или Е, Х20 представляет собой Р, 8, Ό или Υ, Х21 представляет собой V или Ό, Х22 представляет собой Т или А и Х23 представляет собой С или Р;
    аминокислотную последовательность СОВН3 8Ер ΙΌ N0:137, содержащую последовательность Р-Е-ЭД-С-Х24^-А-Е-О-Х25, где Х24 представляет собой 8, Υ, Т или N и Х25 представляет собой Υ, Т, Е или Ι.
  5. 5. Выделенное антитело к ΙΕ-6 по п.4, которое дополнительно включает встроенные между гипервариабельными областями каркасную область 1 легкой цепи антитела человека (ЕВЕ1) 8Ер ΙΌ N0:105, ЕВЬ2 8Ер ΙΌ N0:106, ЕВЬ3 8Ер ΙΌ N0:107, ЕВЬ4 8Ер ΙΌ N0:108, каркасную область 1 тяжелой цепи антитела человека (ЕВН1) 8Ер ΙΌ N0:109, ЕВН2 8Ер ΙΌ N0:110, ЕВН3 8Ер ΙΌ N0:111 и ЕВН4 8ЕР ΙΌ N0:112.
  6. 6. Антитело к ΙΕ-6 по любому из пп.2-4, где указанное антитело связывается с ΙΕ-6 по меньшей мере с одной из аффинностей, выбранных из группы, состоящей из 10-9М, 10-10М, 10-11М, 10-12М, 10-13М, 10-14М и 10-15М, определяемых методом поверхностного плазмонного резонанса или методом Ктеха.
  7. 7. Антитело к ΙΕ-6 по любому из пп.1-4, где указанное антитело ингибирует активность полипепти- да ΙΕ-6, состоящего из аминокислотной последовательности, указанной в 8Ер ΙΌ N0:115, где указанная активность выбрана из группы, состоящей из связывания ΙΕ-6 с растворимым др80 (8ЕЕ-6В), ΙΕ-6-индуцированного продуцирования моноцитарного белка-хемоатрактанта-1 (МСР-1), ΙΕ-6 и [Е-ЦЗ-индуцированного продуцирования сывороточного амилоида А (8АА), ΙΕ-6-зависимого фосфорилирования сигнального трансдуктора и активатора транскрипции 3 (8ΤАΤ3) и снижения фосфорилирования протеинкиназы В (АкЕ), рецептора инсулина (ΙΚ.) на субконфлюэнтных клетках НерС2.
  8. 8. Антитело к ΙΕ-6 по п.7, где ΙΚ. представляет собой ΙΚ.-1.
  9. 9. Композиция, содержащая по меньшей мере одно выделенное антитело к ΙΕ-6 по любому из пп.1-4 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
  10. 10. Композиция по п.9, которая дополнительно содержит по меньшей мере одно соединение или полипептид, выбранные из детектируемой метки или репортера, антагониста ЮТ, противоинфекционного лекарственного средства; лекарственного средства, воздействующего на сердечно-сосудистую (СС) систему; лекарственного средства, воздействующего на центральную нервную систему (ЦНС); лекарственного средства, воздействующего на вегетативную нервную систему (ВНС); лекарственного средства для лечения заболеваний дыхательных путей; лекарственного средства для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖК); гормонального лекарственного средства; лекарственного средства для регуляции водно-солевого баланса; гематологического лекарственного средства; противоопухолевого лекарственного средства; иммуномодулирующего лекарственного средства; офтальмического лекарственного средства; лекарственного средства для лечения заболеваний уха или носа; натурального лекарственного средства, цитокина и антагониста цитокина.
  11. 11. Антиидиотипическое антитело или его фрагмент, которые специфически связываются по меньшей мере с одним антителом к ΙΕ-6 по любому из пп.1-4.
  12. 12. Антитело к ΙΕ-6, продуцируемое способом, включающим получение выделенной рекомбинантной не являющейся человеческой клетки-хозяина, способной экспрессировать в поддающихся выделению количествах указанное антитело, трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело к ΙΕ-6 по любому из пп.1-4, и выделение указанного антитела.
  13. 13. Антитело к ΙΕ-6 по любому из пп.2-4, где указанное антитело имеет величину ЕС50, составляю
    - 96 015262 щую примерно 2,7х10-11М или менее.
  14. 14. Антитело по п.13, где указанная величина ЕС50 составляет примерно 2,7х10-12 или менее.
  15. 15. Антитело к 1Ь-6 по любому из пп.1-4, где указанное антитело имеет константную область человека.
  16. 16. Выделенное антитело к 1Ь-6, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕД ΙΌ N0:98, и аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕД ΙΌ N0:100.
  17. 17. Выделенное антитело к 1Ь-6, содержащее аминокислотную последовательность гипервариабельной области 1 легкой цепи (СОЯЬ1), кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕД ΙΌ N0:4, аминокислотную последовательность СОЯЬ2, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕД ΙΌ N0:22, аминокислотную последовательность СОЯЬ3, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕД ΙΌ N0:30, аминокислотную последовательность гипервариабельной области 1 тяжелой цепи (СОЯН1), кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕД ΙΌ N0:40, аминокислотную последовательность СОЯН2, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕД ΙΌ N0:60, аминокислотную последовательность СПЯН3, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕД ΙΌ N0:90.
EA200702374A 2005-04-29 2006-04-28 Выделенное антитело к il-6 и его применение EA015262B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67649805P 2005-04-29 2005-04-29
US67731905P 2005-05-03 2005-05-03
PCT/US2006/016457 WO2006119115A2 (en) 2005-04-29 2006-04-28 Anti-il-6 antibodies, compositions, methods and uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200702374A1 EA200702374A1 (ru) 2008-10-30
EA015262B1 true EA015262B1 (ru) 2011-06-30

Family

ID=37308556

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200702374A EA015262B1 (ru) 2005-04-29 2006-04-28 Выделенное антитело к il-6 и его применение

Country Status (38)

Country Link
US (11) US7560112B2 (ru)
EP (3) EP2842968B1 (ru)
JP (4) JP4763043B2 (ru)
KR (1) KR101340950B1 (ru)
CN (2) CN101415819B (ru)
AR (1) AR053370A1 (ru)
AU (1) AU2006242347B2 (ru)
BR (1) BRPI0609869B1 (ru)
CA (1) CA2606348C (ru)
CR (1) CR9551A (ru)
CY (1) CY1120739T1 (ru)
DK (2) DK1874351T3 (ru)
EA (1) EA015262B1 (ru)
EC (1) ECSP077888A (ru)
ES (2) ES2676732T3 (ru)
HK (2) HK1116398A1 (ru)
HN (1) HN2006016512A (ru)
HR (2) HRP20150740T1 (ru)
HU (2) HUE039116T2 (ru)
IL (3) IL186965A0 (ru)
JO (1) JO3058B1 (ru)
LT (1) LT2842968T (ru)
ME (1) ME02185B (ru)
MY (2) MY143374A (ru)
NI (1) NI200700278A (ru)
NO (1) NO342898B1 (ru)
NZ (3) NZ562771A (ru)
PA (1) PA8672101A1 (ru)
PE (1) PE20061324A1 (ru)
PL (2) PL1874351T3 (ru)
PT (2) PT1874351E (ru)
RS (2) RS54133B1 (ru)
SI (2) SI2842968T1 (ru)
SV (1) SV2006002513A (ru)
TR (1) TR201809676T4 (ru)
TW (1) TWI445546B (ru)
WO (1) WO2006119115A2 (ru)
ZA (1) ZA200710264B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2745814C1 (ru) * 2020-06-05 2021-04-01 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Водная фармацевтическая композиция левилимаба и ее применение

Families Citing this family (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
KR20130019457A (ko) 2004-07-26 2013-02-26 다우 글로벌 테크놀로지스 엘엘씨 균주 조작에 의한 개선된 단백질 발현 방법
JO3058B1 (ar) * 2005-04-29 2017-03-15 Applied Molecular Evolution Inc الاجسام المضادة لمضادات -اي ال-6,تركيباتها طرقها واستعمالاتها
CA2625773C (en) 2005-10-14 2015-05-12 Fukuoka University Inhibition of interleukin-6 (il-6) receptor promotes pancreatic islet transplantation
BRPI0617664B8 (pt) 2005-10-21 2021-05-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd uso de um anticorpo que reconhece a il-6 para a produção de uma composição farmacêutica para tratar o enfarte do miocárdio ou suprimir a remodelagem ventricular esquerda depois do enfarte do miocárdio
AR057582A1 (es) 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
AR057227A1 (es) * 2005-12-09 2007-11-21 Centocor Inc Metodo para usar antagonistas de il6 con inhibidores del proteasoma
DK1960430T3 (da) 2005-12-09 2015-01-05 Ucb Pharma Sa Antistofmolekyler der har specificitet for humant il-6
JP2009521909A (ja) * 2005-12-30 2009-06-11 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒαの複合体のｇｐ１３０への結合を阻害する抗ＩＬ−６抗体
EP1990060B1 (en) 2006-01-27 2016-09-28 Keio University Therapeutic agents for diseases associated involving choroidal neovascularization
DK3056568T3 (da) 2006-03-31 2021-11-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fremgangsmåder til kontrollering af antistoffers blodfarmakokinetik
WO2007116962A1 (ja) 2006-04-07 2007-10-18 Osaka University 筋再生促進剤
ES2397383T3 (es) 2006-04-13 2013-03-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gen transportador de taurina
MX2008014692A (es) * 2006-05-19 2009-08-18 Alder Biopharmaceuticals Inc Metodo de cultivo para obtener una poblacion clonal de celulas b especificas de antigeno.
WO2008008373A2 (en) * 2006-07-11 2008-01-17 Arubor Corp Rhinosinusitis prevention and therapy with proinflammatory cytokine inhibitors
JP2009545319A (ja) * 2006-08-03 2009-12-24 バクシネックス，インコーポレーテッド 抗ｉｌ−６モノクローナル抗体およびその使用
US20080081041A1 (en) * 2006-09-29 2008-04-03 Jeffrey Nemeth Method of Using IL6 Antagonists with Mitoxantrone for Prostate Cancer
TW200831528A (en) * 2006-11-30 2008-08-01 Astrazeneca Ab Compounds
TWI438208B (zh) 2007-01-23 2014-05-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 抑制慢性排斥反應之藥劑
US20100233759A1 (en) 2007-03-15 2010-09-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for production of polypeptide
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
CN101688213A (zh) 2007-04-27 2010-03-31 陶氏环球技术公司 用于快速筛选微生物宿主以鉴定某些在表达异源蛋白质方面具有改善的产量和/或质量的菌株的方法
US8404235B2 (en) 2007-05-21 2013-03-26 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
US7906117B2 (en) * 2007-05-21 2011-03-15 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat cachexia, weakness, fatigue, and/or fever
US20090238825A1 (en) * 2007-05-21 2009-09-24 Kovacevich Brian R Novel rabbit antibody humanization methods and humanized rabbit antibodies
DK2164514T3 (en) * 2007-05-21 2017-02-27 Alderbio Holdings Llc Antibodies to IL-6 and its use
US8062864B2 (en) 2007-05-21 2011-11-22 Alderbio Holdings Llc Nucleic acids encoding antibodies to IL-6, and recombinant production of anti-IL-6 antibodies
WO2008144753A2 (en) 2007-05-21 2008-11-27 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antibodies to tnf alpha and use thereof
US8178101B2 (en) 2007-05-21 2012-05-15 Alderbio Holdings Inc. Use of anti-IL-6 antibodies having specific binding properties to treat cachexia
US8252286B2 (en) 2007-05-21 2012-08-28 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
US9701747B2 (en) 2007-05-21 2017-07-11 Alderbio Holdings Llc Method of improving patient survivability and quality of life by anti-IL-6 antibody administration
US20090104187A1 (en) * 2007-05-21 2009-04-23 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies
EP2617837A3 (en) 2007-06-08 2013-10-23 Biogen Idec MA Inc. Biomarkers for predicting anti-TNF responsiveness or non-responsiveness
US20090053168A1 (en) * 2007-07-17 2009-02-26 Richard Rickles Treatments of b-cell proliferative disorders
TW200914048A (en) * 2007-07-17 2009-04-01 Combinatorx Inc Combinations for the treatment of B-cell proliferative disorders
EP2174667B1 (en) * 2007-07-26 2017-01-04 Osaka University Agent for treatment of ophthalmia containing interleukin-6 receptor inhibitor as active ingredient
WO2009037583A2 (en) * 2007-08-03 2009-03-26 Nucitec S.A. De C.V. Compositions and methods for treatment and prevention of osteoarthritis
ES2591284T3 (es) 2007-08-07 2016-11-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método para la producción de proteínas heterogéneas
CL2008002886A1 (es) 2007-09-26 2009-12-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Region constante de un anticuerpo humano; anticuerpo anti-receptor de interleucina-6 (il-6) y composicion farmaceutica que la comprende.
CN106519025B (zh) 2007-09-26 2021-04-23 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
RU2486245C2 (ru) 2007-10-15 2013-06-27 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Способ получения клетки, способной продуцировать гетеропротеины с высоким выходом
US9068212B2 (en) 2007-10-24 2015-06-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing a polypeptide using a cell that overexpresses a bicarbonate transporter
KR102469853B1 (ko) 2008-04-11 2022-11-22 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
WO2009140348A2 (en) 2008-05-13 2009-11-19 Novimmune Sa Anti-il-6/il-6r antibodies and methods of use thereof
US8277804B2 (en) * 2008-05-21 2012-10-02 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
CA2728243C (en) 2008-06-05 2020-03-10 National Cancer Center Il-6 inhibitor for suppressing neuroinvasion in pancreatic cancer
WO2009151569A2 (en) * 2008-06-09 2009-12-17 Combinatorx, Incorporated Beta adrenergic receptor agonists for the treatment of b-cell proliferative disorders
US8188235B2 (en) * 2008-06-18 2012-05-29 Pfizer Inc. Antibodies to IL-6 and their uses
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
BRPI0921665A2 (pt) * 2008-11-13 2019-04-16 Femta Pharmaceuticals, Inc. humanizado anti-il-6 anticorpos
WO2010065079A2 (en) * 2008-11-25 2010-06-10 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antibodies to il-6 and use thereof
US8323649B2 (en) 2008-11-25 2012-12-04 Alderbio Holdings Llc Antibodies to IL-6 and use thereof
US8420089B2 (en) 2008-11-25 2013-04-16 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
US9212223B2 (en) 2008-11-25 2015-12-15 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
US9452227B2 (en) 2008-11-25 2016-09-27 Alderbio Holdings Llc Methods of treating or diagnosing conditions associated with elevated IL-6 using anti-IL-6 antibodies or fragments
US8337847B2 (en) 2008-11-25 2012-12-25 Alderbio Holdings Llc Methods of treating anemia using anti-IL-6 antibodies
US8992920B2 (en) 2008-11-25 2015-03-31 Alderbio Holdings Llc Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis
KR20110108398A (ko) * 2009-01-29 2011-10-05 메디뮨 엘엘씨 연장된 생체내 반감기를 갖는 인간 안티-ｉｌ-6 항체 및 종양학, 자가면역 질환 및 염증성 질환의 치료에 있어서의 이들의 용도
JP5787446B2 (ja) 2009-03-19 2015-09-30 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
US8741601B2 (en) 2009-04-22 2014-06-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing a cell capable of high-yield production of heteroproteins
SG10201404340TA (en) * 2009-07-31 2014-10-30 Shin Maeda Cancer metastasis inhibitor
US9775921B2 (en) 2009-11-24 2017-10-03 Alderbio Holdings Llc Subcutaneously administrable composition containing anti-IL-6 antibody
CN102740888B (zh) 2009-11-24 2016-10-12 奥尔德生物制药公司 Il-6抗体及其用途
US20130149312A1 (en) * 2010-04-16 2013-06-13 Mcmaster University Compositions and methods for treating copd exacerbation
EP4115906A1 (en) 2010-05-28 2023-01-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antitumor t cell response enhancer
US8524215B2 (en) 2010-08-02 2013-09-03 Janssen Biotech, Inc. Absorbable PEG-based hydrogels
CN101993152B (zh) * 2010-09-21 2012-06-20 浙江大学 一种增强油脂降解菌降解能力的激活剂及其用途和使用方法
WO2012071554A2 (en) 2010-11-23 2012-05-31 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-il-6 antibodies for the treatment of oral mucositis
AU2011337704B2 (en) 2010-11-30 2017-06-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
MX344595B (es) 2010-12-31 2016-12-20 Bioatla Llc Humanizacion rapida de anticuerpos.
EP2683736B1 (en) 2011-03-09 2018-01-17 Cell Signaling Technology, Inc. Methods and reagents for creating monoclonal antibodies
MX354988B (es) 2011-10-25 2018-03-28 Prothena Biosciences Ltd Formulaciones de anticuerpo y metodos.
WO2013175276A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Argen-X B.V Il-6 binding molecules
CA2889181C (en) * 2012-10-22 2021-12-07 Fountain Biopharma Inc. Antibodies to interleukin-6 and uses thereof
KR20150070384A (ko) * 2012-10-25 2015-06-24 메디뮨 엘엘씨 안정한 저점도 항체 제제
EP3009518B1 (en) 2013-06-11 2020-08-12 National Center of Neurology and Psychiatry Method for predicting post-therapy prognosis of relapsing-remitting multiple sclerosis (rrms) patient, and method for determining applicability of novel therapy
MX2016004579A (es) * 2013-10-10 2016-12-09 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Proteinas de union del miembro 1 de la familia de transmembrana 4 l-seis (tm4sf1) y metodos de uso de las mismas.
US8916341B1 (en) * 2013-11-04 2014-12-23 Allied Innovative Systems, Llc Methods for improving analyte detection using photochemical reactions
RU2550262C1 (ru) * 2014-02-28 2015-05-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства Моноклональное антитело против интерлейкина-6 человека и гибридома, продуцирующая данное моноклональное антитело
TWI713453B (zh) 2014-06-23 2020-12-21 美商健生生物科技公司 干擾素α及ω抗體拮抗劑
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
EP3154636A1 (en) * 2014-08-04 2017-04-19 Fabrizio De Silvestri Use in single pill/tablet/capsule of minocycline, fluconazole and atorvastatin in the treatment of multiple sclerosis
KR20210013299A (ko) 2014-10-17 2021-02-03 코디악 사이언시스 인코포레이티드 부티릴콜린에스테라제 양성이온성 중합체 컨쥬게이트
US10689449B2 (en) 2015-01-20 2020-06-23 Igm Biosciences, Inc. Multimeric death domain-containing receptor-5 (DR5) antibodies and uses thereof
TWI805046B (zh) 2015-02-27 2023-06-11 日商中外製藥股份有限公司 Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途
WO2016186154A1 (ja) 2015-05-19 2016-11-24 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 多発性硬化症（ｍｓ）患者の新規治療適用判断方法
JP2018529756A (ja) 2015-07-31 2018-10-11 メディミューン リミテッド ヘプシジン媒介性障害を治療するための方法
NZ739721A (en) 2015-08-07 2019-09-27 Imaginab Inc Antigen binding constructs to target molecules
RU2744860C2 (ru) 2015-12-30 2021-03-16 Кодиак Сайенсиз Инк. Антитела и их конъюгаты
US20170291942A1 (en) * 2016-04-07 2017-10-12 Janssen Biotech, Inc. Treatment of Depression Using Agents that Block Binding of IL-6 to IL-6 Receptor
EP3576790A4 (en) 2017-02-01 2020-12-23 Yale University TREATMENT OF DIURETIC RESISTANCE
EP3601537A4 (en) 2017-03-27 2021-01-13 National University of Singapore STIMULATING CELL LINES FOR EX VIVO EXPANSION AND ACTIVATION OF NATURAL KILLER CELLS
JP7185884B2 (ja) 2017-05-02 2022-12-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法
KR20200074160A (ko) 2017-10-20 2020-06-24 가꼬우호우징 효고 이카다이가쿠 항il-6 수용체 항체를 함유하는 수술 후의 유착을 억제하기 위한 의약 조성물
BR112020013519A2 (pt) 2018-01-05 2020-12-01 Corvidia Therapeutics, Inc método para tratamento de uma inflamação.
US20190270806A1 (en) * 2018-03-02 2019-09-05 Kodiak Sciences Inc. Il-6 antibodies and fusion constructs and conjugates thereof
CN108588030B (zh) * 2018-03-30 2020-07-14 四川迈克生物新材料技术有限公司 抗人IgM单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用
CN112533633A (zh) * 2018-06-08 2021-03-19 伊麦吉纳博公司 Cd4的抗原结合构建体
WO2020178193A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method of treatment of sarcoidosis
CN109946129A (zh) * 2019-03-12 2019-06-28 江苏中济万泰生物医药有限公司 五分类血细胞分析仪用质控品制备方法
EP3962942A1 (en) 2019-05-01 2022-03-09 Novo Nordisk A/S Anti-il-6 antibody formulation
JP2022537555A (ja) 2019-06-20 2022-08-26 武田薬品工業株式会社 ウイルスベースの遺伝子療法による治療方法
CA3157509A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
WO2021119669A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 Loma Linda University Pathology Medical Group, Inc. Methods and compositions for treatment of acute myeloid leukemia
WO2021198929A1 (en) * 2020-03-31 2021-10-07 Janssen Biotech, Inc. Anti-il6 agent for treating coronavirus infection
WO2021236840A1 (en) * 2020-05-20 2021-11-25 The Regents Of The University Of California Rapid index for sab mortality kinetics ("risk") test
WO2022005321A1 (en) * 2020-06-29 2022-01-06 Federal State Budgetary Institution Scientific center of biomedical technologies of Federal Medical and Biological Agency Inhaled tocilizumab for treating interleukin-6 related respiratory diseases
CN113409232B (zh) * 2021-06-16 2023-11-10 吉林大学 基于响尾蛇视觉成像的仿生假彩色图像融合模型及方法
CN113552116B (zh) * 2021-07-14 2023-08-18 四川农业大学 基于Ag@UiO-66-NH2/CsPbBr3的电致化学发光分子印迹传感器及应用

Family Cites Families (192)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4309989A (en) 1976-02-09 1982-01-12 The Curators Of The University Of Missouri Topical application of medication by ultrasound with coupling agent
FR2374910A1 (fr) 1976-10-23 1978-07-21 Choay Sa Preparation a base d'heparine, comprenant des liposomes, procede pour l'obtenir et medicaments contenant de telles preparations
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US5326859A (en) 1979-10-30 1994-07-05 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research DNA and recombinant plasmid
US5554513A (en) 1979-11-21 1996-09-10 Yeda Research & Development Co. Ltd. Production of recombinant human interferon-beta2
IL58765A (en) 1979-11-21 1986-09-30 Yeda Res & Dev Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
GB2097032B (en) 1981-04-22 1984-09-19 Teron International Urban Dev A combined ceiling air and services distribution system mechanical chasse and structural roof member
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US5001116A (en) 1982-12-20 1991-03-19 The Children's Medical Center Corporation Inhibition of angiogenesis
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4818542A (en) 1983-11-14 1989-04-04 The University Of Kentucky Research Foundation Porous microspheres for drug delivery and methods for making same
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
EP0229046B1 (fr) 1985-03-30 1994-05-04 BALLIVET, Marc Procede d'obtention d'adn, arn, peptides, polypeptides ou proteines, par une technique de recombinaison d'adn
SE448277B (sv) 1985-04-12 1987-02-09 Draco Ab Indikeringsanordning vid en doseringsanordning for lekemedel
US4766067A (en) 1985-05-31 1988-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene amplification
US4870163A (en) 1985-08-29 1989-09-26 New York Blood Center, Inc. Preparation of pure human tumor necrosis factor and hybridomas producing monoclonal antibodies to human tumor necrosis factor
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
SE453566B (sv) 1986-03-07 1988-02-15 Draco Ab Anordning vid pulverinhalatorer
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
CH671155A5 (ru) 1986-08-18 1989-08-15 Clinical Technologies Ass
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DE3631229A1 (de) 1986-09-13 1988-03-24 Basf Ag Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendung
US4921794A (en) 1987-01-14 1990-05-01 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US4795699A (en) 1987-01-14 1989-01-03 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
JP2647427B2 (ja) 1987-04-24 1997-08-27 帝人株式会社 被検者の病態の判定のための検出方法、モノクロ−ナル抗体および検出キット
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US4939666A (en) 1987-09-02 1990-07-03 Genex Corporation Incremental macromolecule construction methods
IL88375A (en) 1988-11-14 1995-07-31 Yeda Res & Dev Monoclonal antibodies that specifically bind interferon-bia 2 natural and recombinant and a natural and recombinant interferon-beta 2 purification method and method
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5091310A (en) 1988-09-23 1992-02-25 Cetus Corporation Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction
US5142033A (en) 1988-09-23 1992-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Structure-independent DNA amplification by the polymerase chain reaction
US5066584A (en) 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US6682896B1 (en) 1988-10-14 2004-01-27 Schering Aktiengesellschaft Peptides representing epitopic sites on r-IFN-β, antibodies thereto and uses thereof
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4994370A (en) 1989-01-03 1991-02-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA amplification technique
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5266491A (en) 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
DE3909708A1 (de) 1989-03-23 1990-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung bispezifischer antikoerper
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
WO1990014443A1 (en) 1989-05-16 1990-11-29 Huse William D Co-expression of heteromeric receptors
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
EP0399429A1 (en) 1989-05-22 1990-11-28 Toray Industries, Inc. Anti-human interleukin-6 monoclonal antibody
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
EP0486526B2 (en) 1989-08-07 2001-03-07 Peptech Limited Tumour necrosis factor binding ligands
ES2118066T3 (es) 1989-10-05 1998-09-16 Optein Inc Sintesis y aislamiento, exentos de celulas, de nuevos genes y polipeptidos.
EP0506855A1 (en) 1989-12-15 1992-10-07 Chiron Corporation Cytokine antibody for the treatment of sepsis
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US5942220A (en) 1990-03-16 1999-08-24 Chiron Corporation Inhibitor of cytokine activity and applications thereof
US5210075A (en) 1990-02-16 1993-05-11 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Interleukin 6 antagonist peptides
TW212184B (ru) 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
DE69128362T2 (de) 1990-06-01 1998-05-20 Chiron Corp Zusammensetzungen und verfahren zur identifizierung von molekülen mit biologischer wirksamkeit
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
JPH06500011A (ja) 1990-06-29 1994-01-06 ラージ　スケール　バイオロジー　コーポレイション 形質転換された微生物によるメラニンの製造
US5580734A (en) 1990-07-13 1996-12-03 Transkaryotic Therapies, Inc. Method of producing a physical map contigous DNA sequences
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
WO1992005258A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 La Trobe University Gene encoding barley enzyme
GB9022648D0 (en) 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
AU8727291A (en) 1990-10-29 1992-06-11 Cetus Oncology Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
WO1992014843A1 (en) 1991-02-21 1992-09-03 Gilead Sciences, Inc. Aptamer specific for biomolecules and method of making
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
SG47099A1 (en) 1991-03-15 1998-03-20 Amgen Boulder Inc Pegylation of polypeptides
ES2134212T3 (es) 1991-04-25 1999-10-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo humano reconstituido contra el receptor de la interleuquina 6 humano.
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
ATE359842T1 (de) 1991-07-02 2007-05-15 Nektar Therapeutics Abgabevorrichtung für nebelförmige medikamente
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
DK1024191T3 (da) 1991-12-02 2008-12-08 Medical Res Council Fremstilling af autoantistoffer fremvist på fag-overflader ud fra antistofsegmentbiblioteker
ES2202310T3 (es) 1991-12-13 2004-04-01 Xoma Corporation Metodos y materiales para la preparacion de dominios variables de anticuerpos modificados y sus usos terapeuticos.
DE4207475A1 (de) 1992-03-10 1993-09-16 Goldwell Ag Mittel zum blondieren von menschlichen haaren und verfahren zu dessen herstellung
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
JPH05304986A (ja) 1992-04-28 1993-11-19 Tosoh Corp ｇｐ１３０蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体
AU4829593A (en) 1992-09-23 1994-04-12 Fisons Plc Inhalation device
AU5322494A (en) 1992-10-02 1994-04-26 Trustees Of Dartmouth College Bispecific reagents for redirected targeting of low density lipoprotein
EP0665759B1 (en) 1992-10-19 1998-12-23 Dura Pharmaceuticals, Inc. Dry powder inhaler
AU687763B2 (en) 1992-10-20 1998-03-05 Central Laboratory Of The Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service Interleukin-6 receptor antagonists
US5643252A (en) 1992-10-28 1997-07-01 Venisect, Inc. Laser perforator
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US5849695A (en) 1993-01-13 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals
EP0680451B1 (en) 1993-01-19 1998-11-04 Glaxo Group Limited Aerosol dispenser and method of manufacture
WO1994018317A1 (en) 1993-02-12 1994-08-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Regulated transcription of targeted genes and other biological events
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
US5770428A (en) 1993-02-17 1998-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site
US5888511A (en) 1993-02-26 1999-03-30 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Treatment of autoimmune diseases, including AIDS
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
TW458985B (en) 1993-05-31 2001-10-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Reconstructed human antibody against human interleukin-6
US5891998A (en) 1993-06-23 1999-04-06 Istituto Di Ricerche Di Biologica Molecolare P. Angeletti S.P.A. Interleukin-6 receptor agonists
DK0797988T3 (da) 1993-07-19 2009-05-11 Univ British Columbia Anti-angiogene præparater og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US5888510A (en) 1993-07-21 1999-03-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
FR2707882B1 (fr) 1993-07-23 1997-08-01 Immunotech Sa Nouveaux kits thérapeutiques anti-médiateurs protéiques, procédé de préparation et compositions pharmaceutiques les renfermant.
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
DE4337197C1 (de) 1993-10-30 1994-08-25 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur selektiven Herstellung von Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper mit hoher Zytotoxizität gegen humanes CD16-Antigen produzieren, sowie Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung derartiger monoklonaler Antikörper und des CD30-HRS-3-Antikörpers zur Therapie menschlicher Tumore
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
AU692239B2 (en) 1994-03-07 1998-06-04 Medarex, Inc. Bispecific molecules having clinical utilities
US5641657A (en) 1994-05-19 1997-06-24 Human Genome Sciences, Inc. DNA encoding an interleukin-6 splice variant
US8017121B2 (en) 1994-06-30 2011-09-13 Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
US5738931A (en) 1994-09-16 1998-04-14 Kabushiki Kaisha Toshiba Electronic device and magnetic device
EP2077120A3 (en) * 1994-10-07 2009-07-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Rheumatoid arthritis remedy containing il-6 antagonist as active ingredient
US5763733A (en) 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
IT1274782B (it) 1994-12-14 1997-07-24 Angeletti P Ist Richerche Bio Metodo per selezionare superagonisti, antagonisti e superantagonisti di ormoni del cui complesso recettoriale fa parte gp 130
US5549551A (en) 1994-12-22 1996-08-27 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Adjustable length balloon catheter
KR100252743B1 (ko) 1994-12-29 2000-09-01 나가야마 오사무 Il-6 안타고니스트를 함유하는 항종양제의 작용증강제
CA2211578C (en) 1995-02-13 2010-09-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Muscle protein proteolysis inhibiting agent containing il-6 receptor antibody
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6037453A (en) 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
IT1276555B1 (it) 1995-04-28 1997-11-03 Angeletti P Ist Richerche Bio Antagonisti di interluchina-6 umana del tutto incapaci di formare un legame con gp 130, e loro uso per la preparazione di composizioni
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5871723A (en) 1995-06-06 1999-02-16 The Regent Of The University Of Michigan CXC chemokines as regulators of angiogenesis
GB9526100D0 (en) 1995-12-20 1996-02-21 Intersurgical Ltd Nebulizer
CZ212598A3 (cs) 1996-01-03 1998-11-11 Glaxo Group Limited Inhalační zařízení
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
DE19624387C2 (de) 1996-06-19 1999-08-19 Hatz Motoren Kaltstartvorrichtung
US5854398A (en) 1996-07-25 1998-12-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) interleukin 6 (IL-6) and uses thereof
US6461604B1 (en) 1996-08-16 2002-10-08 Genetics Institute, Llc Crystalline IL-6 and models of the molecular structure of IL-6
DK0826695T3 (da) 1996-09-03 2002-04-15 Gsf Forschungszentrum Umwelt Tilintetgørelse af kontaminerende tumorceller i stamcelletransplantater med bispecifikke antistoffer
DK1500329T3 (da) 1996-12-03 2012-07-09 Amgen Fremont Inc Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa
US5879681A (en) 1997-02-07 1999-03-09 Emisphere Technolgies Inc. Compounds and compositions for delivering active agents
US5921447A (en) 1997-02-13 1999-07-13 Glaxo Wellcome Inc. Flow-through metered aerosol dispensing apparatus and method of use thereof
DE69839992D1 (de) * 1997-03-21 2008-10-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Vorbeugende- oder Heilmittel zur Behandlung von Multipler Sklerose, mit antagonistischen anti-IL6-Rezeptor Antikörpern als Wirkstoff
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
IL120943A (en) 1997-05-29 2004-03-28 Univ Ben Gurion A system for administering drugs through the skin
JP2001517692A (ja) 1997-09-29 2001-10-09 インヘール セラピューティック システムズ， インコーポレイテッド ネブライザにおける使用のための安定化調製物
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6309663B1 (en) 1999-08-17 2001-10-30 Lipocine Inc. Triglyceride-free compositions and methods for enhanced absorption of hydrophilic therapeutic agents
US6482411B1 (en) 1999-08-27 2002-11-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of reducing bone loss with CD40 ligand
GB0001448D0 (en) * 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
TWI373343B (en) 2000-02-10 2012-10-01 Abbott Gmbh & Co Kg Antibodies that bind human interleukin-18 and methods of making and using
ES2644275T3 (es) 2000-08-11 2017-11-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preparaciones estabilizadas que contienen anticuerpos
ES2298273T3 (es) 2000-10-25 2008-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agentes preventivos o terapeuticos contra la psoriasis que contienen un antagonista de il-6 como su ingrediente activo.
ITPD20010108A1 (it) 2001-05-08 2002-11-08 Fidia Advanced Biopolymers Srl Biomateriali polimerici elettricamente conduttori, loro processo di preparazione ed impiego nel settore biomedico sanitario.
NZ592087A (en) 2001-08-03 2012-11-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
DE10146643C1 (de) 2001-09-21 2003-08-14 Eads Deutschland Gmbh Verfahren zur Kalibrierung der Radarsignale an den Subaperturen der Antenne eines zweikanaligen SAR/MTI Radarsystems
CN100374457C (zh) 2001-11-14 2008-03-12 森托科尔公司 抗il-6抗体、组合物、方法和用途
WO2003083061A2 (en) 2002-03-26 2003-10-09 Centocor, Inc. Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
JP2005535572A (ja) 2002-04-12 2005-11-24 メディミューン，インコーポレーテッド 組換え抗インターロイキン−９抗体
CN1678744B (zh) * 2002-08-30 2010-05-26 财团法人化学及血清疗法研究所 人的抗人白细胞介素-6抗体以及所述抗体的片段
GB2401040A (en) 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
US20050033029A1 (en) 2003-06-30 2005-02-10 Jin Lu Engineered anti-target immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
EP1673396A1 (en) 2003-09-22 2006-06-28 BioVation GmbH & Co.KG. Use of antibodies for reducing the biological effectiveness of il-6
JO3058B1 (ar) * 2005-04-29 2017-03-15 Applied Molecular Evolution Inc الاجسام المضادة لمضادات -اي ال-6,تركيباتها طرقها واستعمالاتها
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
EP3351559A3 (en) 2010-11-08 2018-10-31 F. Hoffmann-La Roche AG Subcutaneously administered anti-il-6 receptor antibody
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHIMAMURA et al. Analysis of interleukin-6 (IL-6)/IL-6 receptor system using monoclonal anti-IL-6 antibodies, Molecular Immunology, 1991, vol. 28, no. 11, pages 1155-1161, especially page 1156 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2745814C1 (ru) * 2020-06-05 2021-04-01 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Водная фармацевтическая композиция левилимаба и ее применение

Also Published As

Publication number Publication date
AU2006242347A1 (en) 2006-11-09
RS54133B1 (en) 2015-12-31
RS57474B1 (sr) 2018-09-28
US7560112B2 (en) 2009-07-14
JO3058B1 (ar) 2017-03-15
HRP20150740T1 (hr) 2015-08-14
HUE025376T2 (en) 2016-02-29
NZ589820A (en) 2012-04-27
PE20061324A1 (es) 2007-01-15
US20090239258A1 (en) 2009-09-24
BRPI0609869A2 (pt) 2010-05-11
ES2676732T3 (es) 2018-07-24
WO2006119115A2 (en) 2006-11-09
JP2016117769A (ja) 2016-06-30
US20160222104A1 (en) 2016-08-04
IL211133A0 (en) 2011-04-28
AR053370A1 (es) 2007-05-02
KR101340950B1 (ko) 2013-12-31
AU2006242347B2 (en) 2012-07-12
IL186965A0 (en) 2008-02-09
ES2551985T3 (es) 2015-11-24
HK1208035A1 (en) 2016-02-19
HK1116398A1 (en) 2008-12-24
CA2606348C (en) 2012-12-11
SI1874351T1 (sl) 2015-10-30
JP5898413B2 (ja) 2016-04-06
US20140099311A1 (en) 2014-04-10
PL1874351T3 (pl) 2015-10-30
US20170253651A1 (en) 2017-09-07
US8623362B2 (en) 2014-01-07
KR20080017014A (ko) 2008-02-25
US8067003B2 (en) 2011-11-29
TR201809676T4 (tr) 2018-07-23
CN101415819B (zh) 2012-10-10
HUE039116T2 (hu) 2018-12-28
US20220048985A1 (en) 2022-02-17
DK2842968T3 (en) 2018-08-06
ME02185B (me) 2016-02-20
WO2006119115A3 (en) 2008-01-03
EP1874351A4 (en) 2010-07-28
US9631016B2 (en) 2017-04-25
NO342898B1 (no) 2018-08-27
PA8672101A1 (es) 2006-12-07
LT2842968T (lt) 2018-09-25
CN102924596B (zh) 2016-01-20
US20130017208A1 (en) 2013-01-17
NZ598657A (en) 2013-06-28
NI200700278A (es) 2013-01-29
SV2006002513A (es) 2008-12-05
ZA200710264B (en) 2010-05-26
TW200716173A (en) 2007-05-01
EP1874351A2 (en) 2008-01-09
USRE43672E1 (en) 2012-09-18
US11180549B2 (en) 2021-11-23
MY142835A (en) 2011-01-14
EP2842968B1 (en) 2018-05-23
US20110081355A1 (en) 2011-04-07
JP5940565B2 (ja) 2016-06-29
HRP20181218T1 (hr) 2018-10-05
DK1874351T3 (en) 2015-04-20
NZ562771A (en) 2011-03-31
CR9551A (es) 2009-07-30
NO20076024L (no) 2008-01-18
JP2011201888A (ja) 2011-10-13
TWI445546B (zh) 2014-07-21
EP2842968A1 (en) 2015-03-04
EP3421492A1 (en) 2019-01-02
JP2008538931A (ja) 2008-11-13
BRPI0609869B1 (pt) 2021-08-24
US20120045453A1 (en) 2012-02-23
US9340613B2 (en) 2016-05-17
PT2842968T (pt) 2018-09-28
US8226611B2 (en) 2012-07-24
JP4763043B2 (ja) 2011-08-31
CN102924596A (zh) 2013-02-13
US20060257407A1 (en) 2006-11-16
PT1874351E (pt) 2015-06-16
CN101415819A (zh) 2009-04-22
CA2606348A1 (en) 2006-11-09
MY143374A (en) 2011-04-29
PL2842968T3 (pl) 2019-05-31
IL211132A0 (en) 2011-04-28
US20200115445A1 (en) 2020-04-16
US7833755B2 (en) 2010-11-16
IL211133A (en) 2015-03-31
EP1874351B1 (en) 2015-04-08
SI2842968T1 (sl) 2018-10-30
ECSP077888A (es) 2008-03-26
HN2006016512A (es) 2010-06-08
JP2014080427A (ja) 2014-05-08
CY1120739T1 (el) 2019-12-11
EA200702374A1 (ru) 2008-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015262B1 (ru) Выделенное антитело к il-6 и его применение
EA019476B1 (ru) АНТИТЕЛА ПРОТИВ IL-23p19 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
CN1894275B (zh) 模仿人epo的铰链核心模仿体、组合物、方法和用途
EA016022B1 (ru) Выделенное антитело млекопитающего против il-12 и способ изменения его активности
JP2006516084A (ja) Ｃｎｇｈ０００４ポリペプチド、抗体、組成物、方法および使用
KR20060054174A (ko) 항-아밀로이드 항체, 조성물, 방법 및 용도
US20100028351A1 (en) Anti-amyloid antibodies, compositions, methods and uses
EA011583B1 (ru) Миметические антитела glp-1 человека, композиции, способы и применения
KR20050033563A (ko) 포유동물 ｅｐｏ 모방 ｃｈ1 결실된 모방체, 조성물, 방법및 용도
WO2005091853A2 (en) Methods and compositions for treating il-13 related pathologies
EP2211886A2 (en) Human anti-amyloid antibodies, compositions, methods and uses
EP1684703A2 (en) Methods and compositions for treating mcp-1 related pathologies
JP2006512051A (ja) Ｃｎｇｈ０００５ポリペプチド、抗体、組成物、方法および使用
WO2006039631A2 (en) Methods and compositions for treating renal cell carcinoma related pathologies
JP2010513301A (ja) Ｉｌ−４若しくはｉｌ−１３関連の線維症関連の病状を処置するための方法および組成物