BRPI0609869A2 - anticorpo il-6 isolado, anticorpo humano isolado projetado, anticorpo humano isolado ou humano projetado, molécula e vetor de ácido nucléico isolado, método para a produção de um anticorpo il-6, composição compreendendo o anticorpo il-6 isolado, anticorpo ou fragmento antiidiótipo, uso do referido anticorpo, dispositivo médico que compreende um anticorpo il-6 e artigo fabricado para uso farmacêutico ou diagnóstico humano - Google Patents

anticorpo il-6 isolado, anticorpo humano isolado projetado, anticorpo humano isolado ou humano projetado, molécula e vetor de ácido nucléico isolado, método para a produção de um anticorpo il-6, composição compreendendo o anticorpo il-6 isolado, anticorpo ou fragmento antiidiótipo, uso do referido anticorpo, dispositivo médico que compreende um anticorpo il-6 e artigo fabricado para uso farmacêutico ou diagnóstico humano Download PDF

Info

Publication number
BRPI0609869A2
BRPI0609869A2 BRPI0609869-0A BRPI0609869A BRPI0609869A2 BR PI0609869 A2 BRPI0609869 A2 BR PI0609869A2 BR PI0609869 A BRPI0609869 A BR PI0609869A BR PI0609869 A2 BRPI0609869 A2 BR PI0609869A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
seq
antibody
amino acid
acid sequence
isolated
Prior art date
Application number
BRPI0609869-0A
Other languages
English (en)
Inventor
Yan Chen
Debra Gardner
David M Knight
Michael W Lark
Bailin Liang
David J Shealy
Xiao-Yu R Song
Susan H Tam
Sheng-Jiun Wu
Jing Yang
Eric Michael Smith
Alain Philippe Vasserot
Raymond W Sweet
David Matthew Marquis
Vedrana Stojanovic-Susulic
Original Assignee
Centocor Inc
Applied Molecular Evolution Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centocor Inc, Applied Molecular Evolution Inc filed Critical Centocor Inc
Publication of BRPI0609869A2 publication Critical patent/BRPI0609869A2/pt
Publication of BRPI0609869B1 publication Critical patent/BRPI0609869B1/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Microbiology (AREA)

Abstract

ANTICORPO IL-6 ISOLADO, ANTICORPO HUMANO ISOLADO PROJETADO, ANTICORPO HUMANO ISOLADO OU HUMANO PROJETADO, MOLéCULA E VETOR DE áCIDO NUCLéICO ISOLADO, MéTODO PARA A PRODUçãO DE UM ANTICORPO IL-6, COMPOSIçãO COMPREENDENDO O ANTICORPO IL-6 ISOLADO, ANTICORPO OU FRAGMENTO ANTIIDIõTIPO, USO DO REFERIDO ANTICORPO, DISPOSITIVO MéDICO QUE COMPREENDE UM ANTICORPO IL-6 E ARTIGO FABRICADO PARA USO FARMACêUTICO OU DIAGNóSTICO HUMANO. A presente invenção se refere a um anticorpo anti-IL-6, incluindo ácidos nuclélcos isolados que codificam pelo menos um anticorpo anti-IL-6, vetores, células hospedeiras, animais ou plantas transgênicas e métodos de fabricação e utilização destes têm aplicações em composições, métodos e dispositivos diagnósticos e/ou terapêuticos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para"COMPOSIÇÕES, MÉTODOS E USOS DE ANTICORPOS ANTI-IL-6".
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção está relacionada a anticorpos, incluindoporções ou variantes especificadas, específicos para pelo menos uma proteínaIL-6 ou fragmento desta, além de anticorpos antiidiótipo, e ácidos nucléicos quecodificam esses anticorpos anti-IL-6, ácidos nucléicos complementares,vetores, células hospedeiras e métodos de fabricação e utilização destes,incluindo formulações terapêuticas, administração e dispositivos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
IL-6 é uma citocina pró-inflamatória pleiotrópica produzida esecretada por uma ampla variedade de tipos celulares, principalmente célulasde apresentação de antígeno, células T e B. IL-6 está envolvida em atividadestão diversas quanto crescimento e diferenciação de células B, ativação decélulas T, hematopoiese, ativação de osteoclastos, crescimento dequeratinócitos, crescimento neuronal e ativação de hepatócitos. IL-6 se liga aoIL-6R transmembrana ou solúvel, e sinaliza através de gp130, que écompartilhada por várias outras citocinas.
IL-6 tem uma participação importante em anormalidades decélulas B, como demonstrado no lúpus eritematoso sistêmico, mieloma múltiploe distúrbios linfoproliferativos. Da mesma forma, IL-6 também está implicada napatogênese de doenças auto-imunes e inflamatórias, tais como artritereumatóide e osteoartrite. Recentemente, evidências indiretas sugerem umaassociação entre IL-6 e doença pulmonar obstrutiva crônica e resistência àinsulina no diabetes do tipo 2. IL-6 tem efeitos tanto pró-inflamatórios quantoantiinflamatórios no sistema imunológico, indicando que essa citocinaprovavelmente tem um papel central na regulação da resposta fisiológica àdoença. Portanto, o fato de se ter como objetivo a IL-6 pode potencialmentefornecer benefício terapêutico em várias áreas de doenças.
Foi observado um aumento na produção de IL-6 em diversasdoenças, incluindo: doença de Alzheimer, doenças auto-imunes, tais comoartrite reumatóide, inflamação, infarto do miocárdio, doença de Paget,osteoporose, tumores sólidos (carcinoma de células renais), cânceres depróstata e da bexiga, cânceres neurológicos e malignidades de células B(por exemplo, doença de Casteleman, certos linfomas, leucemia linfocíticacrônica e mieloma múltiplo). Pesquisas indicaram que IL-6 está ligada àpatogênese de muitas dessas doenças, particularmente ao câncer e,portanto, o bloqueio de IL-6 deve se traduzir em benefícios clínicos.
Foram desenvolvidos anticorpos anti-IL-6 murídeos, quiméricose outros anticorpos anti-IL-6 não-humanos; no entanto, eles podem serlimitados em sua potência e eficácia, podem freqüentemente desencadearuma resposta imunológica inaceitável (ou seja, imunogenicidade) e/ounecessitar de uma dosagem elevada (veja Tríkha e ai, Clin. Can. Res. 9,4.653-4.665, outubro de 2003, aqui incorporado por referência). Porexemplo, anticorpos contendo porções não-humanas freqüentemente dãoorigem a uma resposta imunológica em seres humanos. Conseqüentemente,a administração repetida do anticorpo é inadequada como terapia, e adepuração de anticorpos mediada por complexo imune da circulação podereduzir a potência/eficácia do anticorpo. A doença do soro e a anafilaxia sãoduas condições exemplares que podem ser causadas pela administraçãorepetida de anticorpos que possuem porções não-humanas. A esse respeito,é necessário um anticorpo anti-IL-6 com menos potencial paraimunogenicidade, ou seja, mais tolerável em seres humanos, e que sejamais potente de tal modo que necessite de uma dosagem menor quandocomparado com os anticorpos anti-IL-6 usados previamente.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece anticorpos anti-IL-6 humanos,isolados e projetados (também denominados anticorpos IL-6),imunoglobulinas, fragmentos, produtos de clivagem e outras porções evariantes especificadas destes, além de composições de anticorpo anti-IL-6,anticorpo antiidiótipo IL-6, ácidos nucléicos codificadores oucomplementares, vetores, células hospedeiras, composições, formulações,dispositivos, animais transgênicos, plantas transgênicas e seus métodos defabricação e utilização.A presente invenção fornece, em um aspecto, moléculas deácido nucleico isolado que compreendem um polinucleotídeo codificadorcomplementar ou que hibridiza para anticorpos anti-IL-6 ou anticorposantiidiótipo específicos, que compreendem pelo menos uma seqüência,domínio, porção ou variante especificada destes. A presente invenção aindafornece vetores recombinantes que compreendem as referidas moléculas deácido nucleico de anticorpo anti-IL-6, células hospedeiras que contêm taisácidos nucléicos e/ou vetores recombinantes, além de métodos defabricação e/ou utilização desses referidos ácidos nucléicos de anticorpo,vetores e/ou células hospedeiras.
A presente invenção também fornece pelo menos um métodopara a expressão de pelo menos um anticorpo anti-IL-6, ou anticorpoantiidiótipo IL-6, em uma célula hospedeira, que compreende o cultivo deuma célula hospedeira, como aqui descrita, sob condições nas quais pelomenos um anticorpo anti-IL-6 seja expresso em quantidades detectáveise/ou recuperáveis.
A presente invenção também fornece pelo menos umacomposição que compreende: (a) um ácido nucleico isolado codificador deanticorpo anti-IL-6 e/ou anticorpo, como aqui descritos; e (b) um veículo oudiluente adequado e/ou farmaceuticamente aceitável.
A presente invenção ainda fornece pelo menos um método oucomposição de anticorpo anti-IL-6 para a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz para modular ou tratar pelo menos uma condiçãorelacionada à IL-6 em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente e/ouantes, depois ou durante uma condição relacionada, como conhecido natécnica e/ou como aqui descrito.
A presente invenção também fornece pelo menos umacomposição, dispositivo e/ou método de liberação de uma quantidadeterapêutica ou profilaticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti-IL-6,de acordo com a presente invenção.
A presente invenção ainda fornece pelo menos um método oucomposição de anticorpo anti-IL-6 para o diagnóstico de pelo menos umacondição relacionada à IL-6 em uma célula, tecido, órgão, animal oupaciente e/ou antes, depois ou durante uma condição relacionada, comoconhecido na técnica e/ou como aqui descrito.
A presente invenção também fornece pelo menos umacomposição, dispositivo e/ou método de liberação para o diagnóstico de pelomenos um anticorpo anti-IL-6, de acordo com a presente invenção.
Também é fornecido um dispositivo médico que compreendepelo menos um anticorpo anti-IL-6 isolado mamífero da invenção, em que odispositivo é adequado para o contato ou administração daquele pelo menosum anticorpo anti-IL-6, anticorpo IL-6 antiidiotípico, molécula de ácidonucléico, composto, proteína e/ou composição.
Também é fornecido um artigo fabricado para uso farmacêuticoou diagnóstico humano, que compreende um material de embalagem e umrecipiente que compreende uma solução ou uma forma liofilizada de pelomenos um anticorpo anti-IL-6 isolado da presente invenção. O artigofabricado pode opcionalmente ter o recipiente como um componente de umdispositivo ou sistema de liberação.
A presente invenção ainda fornece qualquer invenção aquidescrita.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A figura 1 mostra a ligação de anticorpo anti-IL-6 humanoprojetado e quimérico ao complexo IL-6/IL-6R.
A figura 2 mostra o epítopo de ligação para o anticorpo humanoprojetado anti-IL-6 da presente invenção.
A figura 3 demonstra que o anticorpo humano projetado anti-IL-6 inibe a secreção de MCP-1 estimulada por IL-6 por células U937 comomedido por ELISA.
A figura 4 mostra que o anticorpo humano projetado anti-IL-6inibe a secreção de SAA estimulada por IL-6 e IL-1p por células HepG2como medido por ELISA.
As Figuras 5A e 5B mostram que o anticorpo humano projetadoanti-IL-6 bloqueia a fosforilação de stat3 mediada por IL-6, como medido poranálise Western Blot mostrada através de eletroforese em gel.
A figura 6 mostra a inibição por anticorpo anti-IL-6 humanoprojetado e quimerico da produção de SAA induzida por IL-6 humana emcamundongos Balb/C.
A figura 7 mostra a inibição de produção de auto-anticorpo anti-dsDNA por mAb anti-IL-6 em camundongos NZB/W F1.
A figura 8A mostra o efeito de IL-6 na presença e ausência deanticorpo humano projetado anti-IL-6 sobre a fosforilação de Akt induzida porinsulina.
A figura 8B mostra uma análise western blotúo efeito de IL-6 napresença e ausência de anticorpo humano projetado anti-IL-6 sobre afosforilação de Akt induzida por insulina.
A figura 9 mostra os resultados do ensaio de ligação ELISAdescrito no Exemplo 3.
A figura 10 mostra os resultados de um ensaio deantiproliferação usando a linhagem germinativa dependente de IL-6 descritano Exemplo 3.
A figura 11A mostra a ativação de PI3 quinase em hepatócitosde ratos tratados com insulina, proteína IL-6 e anticorpo anti-IL-6.
A figura 11B mostra o controle para o estudo da ativação de PI3quinase em hepatócitos de ratos.
A figura 12A mostra o efeito de IL-6 sobre a sinalização emhepatócitos de ratos com relação à fosforilação de IR induzida por insulina.
A figura 12B mostra o efeito de IL-6 sobre a sinalização emhepatócitos de ratos com relação à fosforilação de Akt induzida por insulina.
A figura 13A mostra o nível de glicose em camundongos DIOapós tratamento com anticorpo anti-IL-6.
A figura 13B mostra o nível de insulina em camundongos DIOapós tratamento com anticorpo anti-IL-6.
A figura 13C mostra o índice de avaliação de modelohomeostático (HOMA) em camundongos DIO após tratamento com anticorpoanti-IL-6.As Figuras 14A-F mostram níveis de lipídeos antes e depois detratamento com anticorpo anti-IL-6.
A figura 15 mostra o esquema de tratamento de camundongoscom mAb anti-IL-6 para um teste de tolerância à glicose intraperitoneal(ipGTT).
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece anticorpos humanos projetadosanti-IL-6 isolados, recombinantes e/ou sintéticos e anticorpos antiidiotipo IL-6para eles, além de composições e moléculas codificadoras de ácido nucleicoque compreendem pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menosum anticorpo anti-IL-6 ou anticorpo antiidiotipo. A presente invenção aindainclui, sem limitação, métodos de fabricação e utilização de tais ácidosnucléicos e anticorpos e anticorpos antiidiotipo, incluindo composições,métodos e dispositivos diagnósticos e terapêuticos.
Como aqui usado, um "anticorpo anti-IL-6", "anticorpo IL-6","porção de anticorpo anti-IL-6", ou "fragmento de anticorpo anti-IL-6" e/ou"variante de anticorpo anti-IL-6" e semelhante inclui qualquer moléculacontendo proteína ou peptídeo que compreenda pelo menos uma porção deuma molécula de imunoglobulina como, por exemplo, sem limitação, pelomenos uma região determinante de complementaridade (CDR) de umacadeia pesada ou leve ou uma porção de ligação de ligante desta, umaregião variável da cadeia pesada ou da cadeia leve, uma região constanteda cadeia pesada ou da cadeia leve, uma região estrutural ou qualquerporção destas, ou pelo menos uma porção de um receptor ou uma proteínade ligação de IL-6, que possam ser incorporados em um anticorpo dapresente invenção. Opcionalmente, tal anticorpo ainda afeta um liganteespecífico como, por exemplo, sem limitação, quando tal anticorpo modula,diminui, aumenta, antagoniza, agoniza, reduz, alivia, bloqueia, inibe,interrompe e/ou interfere com pelo menos uma atividade ou ligação de IL-6,ou com a atividade ou ligação do receptor de IL-6, in vitro, in situ e/ou in vivo.
Como exemplo não-limitante, um anticorpo anti-IL-6 adequado, porção ouvariante especificada da presente invenção pode ligar pelo menos umamolécula de IL-6, ou porções, variantes especificadas ou domínios desta.Um anticorpo anti-IL-6 adequado, porção especificada ou varianteopcionalmente também pode afetar pelo menos uma atividade ou função deIL-6 como, por exemplo, sem limitação, a síntese de RNA, DNA ou proteína,liberação de IL-6, sinalização do receptor de IL-6, clivagem de membrana IL-6, atividade de IL-6, produção e/ou síntese de IL-6.
O termo "anticorpo" visa ainda a englobar anticorpos,fragmentos de digestão, porções e variantes especificadas destes, incluindomiméticos de anticorpo ou que compreendem porções de anticorpos quemimetizam a estrutura e/ou função de um anticorpo ou de fragmento ouporção especificada deste, incluindo anticorpos de cadeia única efragmentos destes. Fragmentos funcionais incluem fragmentos de ligação deantígeno que se ligam a uma IL-6 mamífera. Por exemplo, fragmentos deanticorpo capazes de ligação à IL-6 ou a porções desta, incluindo, semlimitação, fragmentos Fab (por exemplo, por digestão com papaína), Fab'(por exemplo, por digestão com pepsina e redução parcial) e F(ab')2 (porexemplo, por digestão com pepsina), facb (por exemplo, por digestão complasmina), pFc' (por exemplo, por digestão com pepsina ou plasmina), Fd(por exemplo, por digestão com pepsina, redução parcial e reagregação), Fvou scFv (por exemplo, por técnicas de biologia molecular), estão englobadospela invenção (veja, por exemplo, Colligan, "Immunology", supra).
Tais fragmentos podem ser produzidos por clivagemenzimática, técnicas sintéticas ou recombinantes, como conhecido natécnica e/ou como aqui descrito. Anticorpos também podem ser produzidosde diversas formas truncadas com a utilização de genes de anticorpo nosquais um ou mais códons de parada foram introduzidos acima do sítio deparada natural. Por exemplo, um gene de combinação que codifica umaporção da cadeia pesada F(ab')2 pode ser projetado para incluir seqüênciasde DNA que codificam o domínio CHi e/ou a região de dobradiça da cadeiapesada. As várias porções de anticorpos podem ser reunidas quimicamentepor técnicas convencionais, ou podem ser preparadas como uma proteínacontígua com o uso de técnicas de engenharia genética.Como aqui usado, o termo "anticorpo humano projetado" é umanticorpo com pelo menos estruturas centrais e regiões constantestotalmente humanas (domínios CL, CH (por exemplo, CH1, CH2, CH3) e dedobradiça), e CDRs derivadas de anticorpos de ligação de antígeno.Estruturas centrais totalmente humanas compreendem estruturas centraisque correspondem a seqüências de linhagem germinativa humana, bemcomo seqüências com mutações somáticas. CDRs podem ser derivadas deuma ou mais CDRs que se ligam à IL-6 no contexto de qualquer estruturacentral de anticorpo. Por exemplo, as CDRs do anticorpo humano projetadoda presente invenção podem ser derivadas de CDRs que se ligam à IL-6 nocontexto de uma estrutura central de anticorpo de camundongo e depois sãoprojetadas para se ligarem à IL-6 no contexto de uma estrutura centraltotalmente humana. Freqüentemente, o anticorpo humano projetado ésubstancialmente não imunogênico em seres humanos.
Da mesma forma, anticorpos designados primatas (macaco,babuíno, chimpanzé etc), de roedor (camundongo, rato, coelho, porquinho-da-índia, hamster, e semelhantes) e outros mamíferos designam essesanticorpos específicos para espécies, subgênero, gênero, subfamília efamília. Além disso, anticorpos quiméricos podem incluir qualquercombinação dos citados acima. Tais alterações ou variações opcionalmentee de preferência retêm ou reduzem a imunogenicidade em seres humanosou em outras espécies em relação aos anticorpos não modificados. Dessaforma, um anticorpo humano projetado é diferente de um anticorpoquimérico ou humanizado.
Ressalta-se que um anticorpo humano projetado pode serproduzido por um animal não-humano ou por uma célula procariótica oueucariótica que seja capaz de expressar genes funcionalmente rearranjadoshumanos ou humanos projetados de imunoglobulina (por exemplo, cadeiapesada e/ou cadeia leve). Além disso, quando um anticorpo humanoprojetado é um anticorpo de cadeia única, ele compreende um peptídeovinculador que não é encontrado em anticorpos humanos nativos. Porexemplo, um Fv pode compreender um peptídeo vinculador, por exemplo,dois a cerca de oito resíduos de glicina ou de outro aminoácido, que conectaa região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve. Taispeptídeos vinculadores são considerados como sendo de origem humana.
Também podem ser usados anticorpos biespecíficos,heteroespecíficos, heteroconjugados ou similares que sejam monoclonais,de preferência, anticorpos humanos, humanos projetados ou humanizados,que tenham especificidades de ligação para pelo menos dois antígenosdiferentes. No presente caso, uma das especificidades de ligação é parapelo menos uma proteína IL-6, e a outra é para qualquer outro antígeno.
Métodos para a fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos natécnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorposbiespecíficos se baseia na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadas possuemespecificidades diferentes (Milstein e Cuello, Nature 305: 537 (1983)). Emfunção da distribuição aleatória de cadeias pesadas e leves deimunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma misturapotencial de 10 moléculas diferentes de anticorpo, das quais apenas umatem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta énormalmente feita por etapas de cromatografia por afinidade. Procedimentossimilares são descritos, por exemplo, em WO 93/08829, Patentes U.S. Nos,6.210.668, 6.193.967, 6.132.992, 6.106.833, 6.060.285, 6.037.453,6.010.902, 5.989.530, 5.959.084, 5.959.083, 5.932.448, 5.833.985,5.821.333, 5.807.706, 5.643.759, 5.601.819, 5.582.996, 5.496.549,4.676.980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker e ai, EMBOJ. 10: 3.655 (1991), Suresh e ai, Methods in Enzymology 121: 210 (1986),cada um deles aqui incorporado por referência em sua totalidade.
Anticorpos anti-IL-6 úteis nos métodos e nas composições dapresente invenção podem opcionalmente ser caracterizados por ligação dealta afinidade à IL-6 e, opcionalmente e de preferência como tendo baixatoxicidade. Em particular, um anticorpo, fragmento especificado ou varianteda invenção, no qual componentes individuais, tais como a região variável,região constante e estrutural, individual e/ou coletivamente, opcionalmente ede preferência possuam baixa imunogenicidade, é útil na presente invenção.Os anticorpos que podem ser usados na invenção são opcionalmentecaracterizados por sua habilidade para tratar pacientes por períodosprolongados com alívio mensurável de sintomas e toxicidade baixa e/ouaceitável. Imunogenicidade baixa ou aceitável e/ou alta afinidade, além deoutras propriedades adequadas, podem contribuir para os resultadosterapêuticos obtidos. "Baixa imunogenicidade" é aqui definida como aincidência de níveis tituláveis de anticorpos para o anticorpo anti-IL-6 empacientes tratados com anticorpo anti-IL-6 que ocorre em menos de 25% dospacientes tratados, de preferência, em menos de 10% dos pacientestratados com a dose recomendada pelo período recomendado de terapiadurante o período de tratamento.
Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem serusados para a produção de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 ou varianteespecificada deste, que podem ser usados para medir o efeito em umacélula, tecido, órgão ou animal (incluindo mamíferos e seres humanos), paradiagnosticar, monitorar, modular, tratar, aliviar, ajudar a evitar a incidência,ou reduzir os sintomas de, pelo menos uma condição por IL-6, selecionada,sem limitação, de pelo menos um de um distúrbio ou uma doença imune, umdistúrbio ou uma doença cardiovascular, um distúrbio ou uma doençainfecciosa, maligna e/ou neurológica, ou outra condição relacionada à IL-6conhecida ou especificada.
Um método como esse pode compreender a administração deuma quantidade eficaz de uma composição ou uma composiçãofarmacêutica que compreende pelo menos um anticorpo anti-IL-6 a umacélula, tecido, órgão, animal ou paciente que necessita de tal modulação,tratamento, alívio, prevenção ou redução de sintomas, efeitos oumecanismos. A quantidade eficaz pode compreender uma quantidade decerca de 0,001 a 500 mg/kg por administração única (por exemplo, em bolo),múltipla ou contínua, ou para se obter uma concentração sérica de 0,01-5.000 ug/ml por administração única, múltipla ou contínua, ou qualquer faixaou valor eficaz dela, da forma feita e determinada com a utilização demétodos conhecidos, como aqui descritos ou conhecidos nas técnicasrelevantes.
Anticorpos da presente invenção — produção e geração
Pelo menos um anticorpo anti-IL-6 da presente invenção podeser opcionalmente produzido por uma linhagem germinativa, uma linhagemgerminativa mista, uma célula imortalizada ou população clonal de célulasimortalizadas, como conhecido na técnica. Veja, por exemplo, Ausubel, e ai,ed., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc., NY,NY (1987-2001); Sambrook, e ai, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual",2ã Edição, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow e Lane, "Antibodies, aLaboratory Manual", Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, e ai, eds.,"Current Protocols in Immunology", John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan e ai, "Current Protocols in Protein Science", John Wiley &Sons, NY, NY, (1997-2001).
Anticorpos humanos projetados que são específicos paraproteínas IL-6 humanas ou fragmentos destas podem ser desenvolvidoscontra um antígeno imunogênico apropriado como, por exemplo, umaproteína IL-6 isolada e/ou uma porção desta (incluindo moléculas sintéticascomo, por exemplo, peptídeos sintéticos). Outros anticorpos mamíferosespecíficos ou gerais podem ser desenvolvidos de forma similar. Apreparação de antígenos imunogênicos e a produção de anticorpomonoclonal podem ser realizadas com o uso de qualquer técnica adequada.
Em uma abordagem, é produzido um hibridoma pela fusão deuma linhagem germinativa imortal adequada (por exemplo, uma linhagemgerminativa de mieloma como, sem limitação, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO,NS1, NS2, AE-1, L.5, L243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1,Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562,COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMALWA, NEURO 2A, ousemelhantes, ou heteromielomas, produtos de fusão destes, ou qualquercélula ou célula de fusão derivada delas, ou qualquer outra linhagemgerminativa adequada conhecida na técnica) (veja, por exemplo,www.atcc.org, www.lifetech.com., e semelhantes), com células produtorasde anticorpos como, por exemplo, sem limitação, células esplenicas isoladasou clonadas, do sangue periférico, linfaticas, da amigdala, ou outras célulasimunes ou que contêm células B, ou quaisquer outras células queexpressam seqüências constantes ou variáveis ou estruturais ou de CDR decadeia pesada ou leve, como ácido nucléico tanto endógeno quantoheterólogo, como DNA genômico, cDNA, rDNA, DNA ou RNA mitocondrial,DNA ou RNA de cloroplasto, hnRNA, mRNA, tRNA, recombinante ouendógeno, viral, bacteriano, de algas, procariótico, de anfíbios, de insetos,de répteis, de peixes, de mamíferos, de roedores, de eqüinos, ovinos, decabras, carneiros, primatas, eucarióticos, de fita simples, dupla ou tripla,hibridizado, e semelhantes, ou qualquer combinação destes. Veja, porexemplo, Ausubel, supra, e Colligan, Immunology, supra, capítulo 2, aquiincorporado por referência em sua totalidade.
Células produtoras de anticorpos também podem ser obtidas dosangue periférico ou, de preferência, do baço ou linfonodos, de sereshumanos ou de outros animais adequados que tenham sido imunizados como antígeno de interesse. Qualquer outra célula hospedeira adequadatambém pode ser utilizada para a expressão de ácido nucléico heterólogo ouendógeno que codifica um anticorpo, fragmento especificado ou variantedeste, da presente invenção. As células fundidas (hibridomas) ou célulasrecombinantes podem ser isoladas com o uso de condições de culturaseletivas ou outros métodos conhecidos adequados, e clonadas porlimitação da diluição ou classificação de células, ou outros métodosconhecidos. Células que produzem anticorpos com a especificidadedesejada podem ser selecionadas por um ensaio adequado (por exemplo,ELISA).
Métodos para o projeto ou humanização de anticorpos não-humanos ou humanos também podem ser usados e são bem-conhecidos natécnica. Um anticorpo humanizado ou projetado pode ter um ou maisresíduos de aminoácidos de uma fonte que seja não-humana, por exemplo,sem limitação, camundongo, rato, coelho, primata não-humano ou outromamífero. Esses resíduos de aminoácidos não-humanos são substituídospor resíduos que são freqüentemente denominados resíduos "importados",que são tipicamente retirados de um domínio variável constante ou outrodomínio "importado" de uma seqüência humana conhecida.
Seqüências conhecidas de Ig humana são reveladas, por exemplo, em www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;
www.ncbi.nih.gov/igblast; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php; www.kabatdatabase.com/top.html;ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat; www.sciquest.com; www.abcam.com;
www.anticorporesource.com/onlinecomp.html;www.public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html;
www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; www.hhrni.org/grants/lectures/1996/vlab;www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html;
mcb.harvard.eduBioLinks/lmmunology.html; www.immunologylink.com;pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html; www.appliedbiosystems.com; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody; www.mehime-u.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html;
www.biodesign.com; www.cancerresearchuk.org; www.biotech.ufl.edu;
www.isac-net.org; baserv.uci.kun.nl/~jraats/links1 .html; www.recab.uni-
hd.de/immuno.bme.nwu.edu; www.mrc-cpe.cam.ac.uk;www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; http://www.bioinf.org.uk/abs;
antibody.bath.ac.uk; www.unizh.ch; www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s;
www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.html;
www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TABBP.html; www.
ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html;www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.jerini.de; Kabat e ai,
Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983),cada um deles aqui incorporado por referência em sua totalidade.
Essas seqüências importadas podem ser usadas para reduzir aimunogenicidade ou para reduzir, intensificar ou modificar a ligação,afinidade, a taxa de ligação, taxa de desligamento, avidez, especificidade,meia-vida, ou qualquer outra característica adequada, como é conhecido natécnica. Em geral, os resíduos da CDR estão diretamente e maissubstancialmente envolvidos na influência sobre a ligação de antígeno.Conseqüentemente, parte de ou todas as seqüências de CDR não-humanasou humanas são mantidas, enquanto as seqüências não-humanas dasregiões variáveis e constantes podem ser substituídas por aminoacidoshumanos ou outros aminoacidos.
Anticorpos opcionalmente também podem ser anticorposhumanizados ou projetados ou humanos projetados com retenção deafinidade elevada para o antígeno e de outras propriedades biológicasfavoráveis. Para se atingir esse objetivo, anticorpos humanizados (ouhumanos) ou projetados podem ser opcionalmente preparados por umprocesso de análise das seqüências parentes e vários produtos conceituaishumanizados e projetados com a utilização de modelos tridimensionais dasseqüências parentes, projetadas e humanizadas. Modelos tridimensionais deimunoglobulina são normalmente disponíveis e são familiares para aquelesversados na técnica. Estão disponíveis programas de computador queilustram e exibem as estruturas tridimensionais conformacionais prováveisde seqüências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeçãodessas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos nofuncionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, ou seja, a análisede resíduos que influenciam a habilidade da imunoglobulina candidata parase ligar ao seu antígeno. Desse modo, resíduos estruturais (FR) podem serselecionados e combinados a partir das seqüências de consenso eimportadas, de tal forma que a característica desejada do anticorpo, porexemplo, afinidade aumentada pelo antígeno (s)-alvo, seja obtida.
Além disso, o anticorpo humano projetado IL-6 da presenteinvenção pode compreender uma estrutura central de cadeia leve delinhagem germinativa humana. Em modalidades específicas, a seqüência dacadeia leve da linhagem é selecionada de seqüências humanas VK queincluem, sem limitação, A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23,A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18,L19, 12, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, 01, 011, 012,014, 018, 02, 04 e 08. Em certas modalidades, essa estrutura central decadeia leve de linhagem germinativa humana é selecionada de V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7,VI-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4 e V5-6. VejaPCT WO 2005/005604 para uma descrição das diferentes seqüências dalinhagem germinativa.
Em outras modalidades, o anticorpo humano projetado IL-6 dapresente invenção pode compreender uma estrutura central de cadeiapesada de linhagem germinativa humana. Em modalidades específicas,essa estrutura central de cadeia pesada de linhagem germinativa humana éselecionada de VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58,VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16,VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74,VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51,VH6-1 e VH7-81. Veja PCT WO 2005/005604 para uma descrição dasdiferentes seqüências de linhagem germinativa.
Em modalidades específicas, a região variável da cadeia levee/ou região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural oupelo menos uma porção de uma região estrutural (por exemplo, contendo 2ou 3 subregiões como, por exemplo, FR2 e FR3). Em certas modalidades,pelo menos FRL1, FRL2, FRL3 ou FRL4 é totalmente humana. Em outrasmodalidades, pelo menos FRH1, FRH2, FRH3 ou FRH4 é totalmentehumana. Em algumas modalidades, pelo menos FRL1, FRL2, FRL3 ou FRL4é uma seqüência de linhagem germinativa (por exemplo, linhagemgerminativa humana) ou compreende seqüências humanas de consensopara a estrutura central em particular (facilmente disponível nas fontes deseqüências conhecidas de Ig humana descritas acima). Em outrasmodalidades, pelo menos FRH1, FRH2, FRH3, ou FRH4 é uma seqüênciade linhagem germinativa (por exemplo, linhagem germinativa humana) oucompreende seqüências humanas de consenso para a estrutura central emparticular. Em modalidades preferidas, a região estrutural é uma regiãoestrutural humana (por exemplo, as regiões estruturais humanas mostradasabaixo nas Tabelas 13 e 14). Em algumas modalidades, a região estruturalcompreende os IDS. DE SEQ. Nos: 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112,ou combinações destes.
A humanização ou o projeto de anticorpos da presenteinvenção pode ser realizado com a utilização de qualquer método conhecidocomo, por exemplo, sem limitação, aqueles descritos em Winter (Jones e ai,Nature 321: 522 (1986); Riechmann e ai, Nature 332: 323 (1988);Verhoeyen e ai, Science 239: 1.534 (1988)), Sims e ai, J. Immunol. 151:2.296 (1993); Chothia e Lesk, J. Moi Bioi 196: 901 (1987), Carter e ai,Proc. A/aí/. Acad. Sei. U.S.A. 89: 4.285 (1992); Presta e ai, J. Immunol. 151:2.623 (1993), Patentes U.S. Nos: 5.723.323, 5.976.862, 5.824.514,5.817.483, 5.814.476, 5.763.192, 5.723.323, 5.766.886, 5.714.352,6.204.023, 6.180.370, 5.693.762, 5.530..101, 5.585.089, 5.225.539;4.816.567, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939,US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443,WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, cada um deles aqui incorporadopor referência em sua totalidade, inclusive as referências neles citadas.
Em certas modalidades, o anticorpo compreende uma região Fcalterada (por exemplo, mutada). Por exemplo, em algumas modalidades, aregião Fc foi alterada para reduzir ou intensificar as funções efetoras doanticorpo. Em algumas modalidades, a região Fc é um isótipo selecionadode IgM, IgA, IgG, IgE, ou outro isótipo.
Alternativa ou adicionalmente, pode ser útil combinarmodificações de aminoácidos com uma ou mais modificações deaminoácidos adicionais que alteram a ligação de C1q e/ou a função decitotoxicidade dependente de complemento (CDC) da região Fc de umamolécula de ligação de IL-6. O polipeptídeo de partida de interesse particularpode ser aquele que se liga a C1q e exibe citotoxicidade dependente decomplemento. Polipeptídeos com atividade pré-existente de ligação de Clq,que opcionalmente ainda possui a habilidade para mediar CDC, podem sermodificados de tal modo que uma ou ambas essas atividades sejamintensificadas. Modificações de aminoácidos que alteram C1q e/ou quemodificam sua função de citotoxicidade dependente de complemento sãodescritas, por exemplo, em WO0042072, que é aqui incorporada porreferência.
Como descrito anteriormente, pode-se projetar uma região Fcdo anticorpo IL-6 humano projetado da presente invenção com funçãoefetora alterada, por exemplo, por modificação da ligação de C1q e/ou daligação de FcyR e, dessa forma, alteração da atividade CDC e/ou daatividade ADCC. "Funções efetoras" são responsáveis por ativação oudiminuição de uma atividade biológica (por exemplo, em um indivíduo).Exemplos de funções efetoras incluem, sem limitação: ligação de C1q;citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação do receptor Fc;citotoxicidade dependente de anticorpo mediada por células (ADCC);fagocitose; infra-regulação de receptores da superfície celular (por exemplo,receptor de célula B; BCR) etc. Tais funções efetoras podem necessitar quea região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, umdomínio variável de anticorpo), e podem ser avaliadas com a utilização devários ensaios (por exemplo, ensaios de ligação de Fc, ensaios de ADCC,ensaios de CDC etc).
Por exemplo, pode-se gerar uma região Fc variante doanticorpo humano projetado IL-6 com ligação de C1q aprimorada e ligaçãode FcyRIII aprimorada (por exemplo, que possui tanto atividade ADCCaprimorada quanto atividade CDC aprimorada). Alternativamente, caso sedeseje que a função efetora seja reduzida ou abolida, uma região Fcvariante pode ser projetada com atividade reduzida CDC e/ou atividadeADCC reduzida. Em outras modalidades, apenas uma dessas atividadespode ser aumentada e, opcionalmente, também a outra atividade reduzida(por exemplo, para gerar uma região Fc variante com atividade ADCCaprimorada, mas atividade CDC reduzida, e vice-versa).
Também podem ser introduzidas mutações de Fc no projetopara alterar sua interação com o receptor Fc neonatal (FcRn) e aprimorarsuas propriedades farmacocinéticas. Foi descrita uma coleção de variantesFc humanas com ligação aprimorada ao FcRn (Shields e ai, (2001). Omapeamento de alta resolução do sítio de ligação em lgG1 humana paraFcyRI, FcyRII, FcyRIII e FcRn, e o projeto de variantes de lgG1 com ligaçãoaprimorada ao FcyR, J. Biol. Chem. 276: 6.591-6.604).
Outro tipo de substituição de aminoácidos serve para alterar opadrão de glicosilaçao da região Fc do anticorpo humano projetado IL-6. Aglicosilaçao de uma região Fc é tipicamente por ligação-N ou por ligação-O.Ligação-N refere-se à adesão da porção carboidrato à cadeia lateral de umresíduo de asparagina. A glicosilaçao por ligação-0 refere-se à adesão deum dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a umhidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usadas. As seqüênciasde reconhecimento para adesão enzimatica da porção carboidrato àsseqüências peptídicas da cadeia lateral de asparagina são asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido, excetoprolina. Dessa forma, a presença de uma dessas seqüências peptídicas emum polipeptídeo cria um sítio de glicosilaçao potencial.
O padrão de glicosilaçao pode ser alterado, por exemplo, poreliminação de um ou mais sítios de glicosilaçao encontrados no polipeptídeo,e/ou por adição de um ou mais sítios de glicosilaçao que não-estejampresentes no polipeptídeo. A adição de sítios de glicosilaçao à região Fc deum anticorpo humano projetado IL-6 é convenientemente obtida através daalteração da seqüência de aminoácidos, de tal forma que ela contenha umaou mais das seqüências tripeptídicas descritas acima (para sítios deglicosilaçao por ligação -N). Uma variante de glicosilaçao exemplar tem umasubstituição de aminoácidos do resíduo Asn 297 da cadeia pesada. Aalteração também pode ser feita pela adição, ou substituição, de um ou maisresíduos de serina ou treonina à seqüência do polipeptídeo original (parasítios de glicosilaçao por ligação-O). Adicionalmente, uma troca de Ala porAsn 297 pode remover um dos sítios de glicosilaçao.
Em certas modalidades, o anticorpo humano projetado IL-6 dapresente invenção é expresso em células que expressam beta (1,4)-N-acetilglicosaminiltransferase III (GnT III), de forma que GnT III adicioneGlcNAc ao anticorpo humano projetado IL-6. Métodos para a produção deanticorpos desse modo são fornecidos em WO/9954342, WO/03011878,publicação de patente 20030003097A1, e Umana e ai, NatureBiotechnology, 17: 176-180, fevereiro de 1999.
Um anticorpo anti-IL-6 humano pode ser opcionalmente geradopor imunização de um animal transgênico (por exemplo, camundongo, rato,hamster, primata não-humano, e semelhantes) capaz de produzir umrepertório de anticorpos humanos, como aqui descrito e/ou como conhecidona técnica. Células que produzem um anticorpo anti-IL-6 humano podem serisoladas desses animais e imortalizadas com a utilização de métodosadequados, tais como os métodos aqui descritos.
Camundongos transgênicos que podem produzir um repertóriode anticorpos humanos que se ligam a antígenos humanos podem serproduzidos por métodos conhecidos (por exemplo, sem limitação, PatentesU.S. Nos: 5.770.428, 5.569.825, 5.545.806, 5.625.126, 5.625.825, 5.633.425,5.661.016 e 5.789.650 concedidas para Lonberg e ai; Jakobovits e ai WO98/50433, Jakobovits e ai WO 98/24893, Lonberg e ai WO 98/24884,Lonberg e ai WO 97/13852, Lonberg e ai WO 94/25585, Kucherlapate e aiWO 96/34096, Kucherlapate e ai EP 0463 151 B1, Kucherlapate e ai EP0710 719 Al, Surani e ai Patente U.S. Ne 5.545.807, Bruggemann e ai WO90/04036, Bruggemann e ai EP 0438 474 Bi, Lonberg e ai EP 0814 259 A2,Lonberg e ai GB 2 272 440 A, Lonberg e ai Nature 368:856-859 (1994),Taylor e ai, Int. Inzmunol. 6(4)579-591 (1994), Green e ai, Nature Genetics7: 13-21 (1994), Mendez e ai, Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Taylor eai, Nucleic Acids Research 20(23): 6.287-6.295 (1992), Tuaillon e ai, Proc.Natl. Acad. Sei USA 90(8) 3.720-3.724 (1993), Lonberg e ai, Int. Ver.Immunoi 13(1): 65-93 (1995) e Fishwald e ai, Nat. Biotechnol. 14(7): 845-851 (1996), cada um deles aqui incorporado por referência em suatotalidade). Geralmente, esses camundongos compreendem pelo menos umtransgene que compreende DNA de pelo menos um lócus de imunoglobulinahumana que é funcionalmente rearranjado, ou que pode ser submetido arearranjo funcional. Os loci endógenos de imunoglobulina nessescamundongos podem ser rompidos ou eliminados para erradicar acapacidade do animal para produzir anticorpos codificados por genesendógenos.
A triagem de anticorpos quanto à ligação específica paraproteínas ou fragmentos similares pode ser convenientemente obtido com ouso de bibliotecas de exibição de peptídeos. Esse método envolve a triagemde grandes coleções de peptídeos quanto a membros individuais quepossuem a função ou estrutura desejada. A triagem de anticorpos debibliotecas de exibição de peptídeos é bem-conhecido na técnica. Asseqüências peptídicas exibidas podem ter comprimento de 3 a 5.000 oumais aminoácidos, freqüentemente com comprimento de 5-100 aminoácidos,e freqüentemente com comprimento de cerca de 8 a 25 aminoácidos. Alémde métodos sintéticos químicos diretos para a geração de bibliotecaspeptídicas, foram descritos vários métodos de DNA recombinante. Um tipoenvolve a exibição de uma seqüência peptídica na superfície de umbacteriófago ou célula. Cada bacteriófago ou célula contém a seqüência denucleotídeos que codifica a seqüência peptídica exibida em particular. Taismétodos são descritos na Publicação de Patente PCT Nos 91/17271,91/18980, 91/19818, e 93/08278.
Outros sistemas para a geração de bibliotecas de peptídeostêm aspectos tanto de síntese química in vitro quanto de métodosrecombinantes. Veja a Publicação de Patente PCT Nos 92/05258, 92/14843 e96/19256. Veja também, Patentes U.S. Nos 5.658.754 e 5.643.768.Bibliotecas de exibição de peptídeos, vetores e kits de rastreamento sãodisponíveis comercialmente por fornecedores como Invitrogen (Carlsbad,CA) e Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). Veja, porexemplo, Patentes U.S. Nos 4.704.692, 4.939.666, 4.946.778, 5.260.203,5.455.030, 5.518.889, 5.534.621, 5.656.730, 5.763.733, 5.767.260,5.856.456, concedidas para Enzon; 5.223.409, 5.403.484, 5.571.698,5.837.500, concedidas para Dyax, 5.427.908, 5.580.717, concedidas paraAffymax; 5.885.793, concedida para Cambridge Antibody Technologies;5.750.373, concedida para Genentech, 5.618.920, 5.595.898, 5.576.195,5.698.435, 5.693.493, 5.698.417, concedidas para Xoma, Colligan, supra;Ausubel, supra; ou Sambrook, supra. Os anticorpos da presente invençãotambém podem ser preparados com o uso de pelo menos um ácido nucleicocodificador de anticorpo anti-IL-6 para fornecer animais ou mamíferostransgênicos, tais como cabras, vacas, cavalos, carneiros, coelhos esemelhantes, que produzem esses anticorpos em seu leite. Tais animaispodem ser produzidos com a utilização de métodos conhecidos. Veja, porexemplo, sem limitação, Patentes U.S. Nos 5.827.690, 5.849.992, 4.873.316,5.849.992, 5.994.616, 5.565.362, 5.304.489, e semelhantes, cada um delessendo aqui incorporado por referência em sua totalidade.
Os anticorpos da presente invenção podem adicionalmente serpreparados com o uso de pelo menos um ácido nucleico codificador deanticorpo anti-IL-6 para fornecer plantas transgênicas e células de plantascultivadas (por exemplo, sem limitação, tabaco e milho) que produzem essesanticorpos, porções ou variantes especificadas nas partes de plantas ou emcélulas cultivadas a partir delas. Como exemplo não-limitante, folhas detabaco transgênico que expressam proteínas recombinantes foram usadascom sucesso para fornecer grandes quantidades de proteínasrecombinantes, por exemplo, com a utilização de um promotor indutível.Veja, por exemplo, Cramer e ai, Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: 95-118(1999) e referências nele citadas. Além disso, milho transgênico foi usadopara expressar proteínas mamíferas em níveis comerciais de produção, comatividades biológicas equivalentes àquelas produzidas em outros sistemasrecombinantes, ou purificadas a partir de fontes naturais. Veja, por exemplo,Hood e al., Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147 (1999) e referências nelecitadas. Anticorpos também foram produzidos em grandes quantidades apartir de sementes de plantas transgênicas, incluindo fragmentos deanticorpo, tais como anticorpos de cadeia única (scFv's), incluindo sementesde tabaco e tubérculos de batata. Veja, por exemplo, Conrad e al., Plant Mol.Biol. 38: 101-109 (1998) e referências nele citadas. Dessa forma, osanticorpos da presente invenção também podem ser produzidos com o usode plantas transgênicas, de acordo com métodos conhecidos. Veja também,por exemplo, Fischer e ai, Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 99-108 (outubrode 1999), Ma e ai, Trenós Biotechnol. 13: 522-7 (1995); Ma e ai, PlantPhysiol. 109: 341-6 (1995); Whitelam e ai, Biochem. Soe. Trans. 22: 940-944 (1994); e referências neles citadas.
Os anticorpos da invenção podem se ligar à IL-6 humana comuma ampla gama de afinidades (KD). Em uma modalidade preferida, pelomenos um mAb humano da presente invenção pode opcionalmente se ligarà IL-6 humana com alta afinidade. Por exemplo, um mAb humano ouhumano projetado pode se ligar à IL-6 humana com uma KD igual ou menordo que cerca de 10"7 M como, por exemplo, sem limitação, 0,1-9,9 (ouqualquer faixa ou valor nessa faixa) X 10"7, 10"8 10"9 10"10 10"11, 10"12, 10"13,10"14, 10"15 ou qualquer faixa ou valor nessa faixa, como determinado porressonância de plasmônio de superfície ou pelo método Kinexa, comopraticado por aqueles versados na técnica.
A afinidade ou avidez de um anticorpo por um antígeno podeser determinada experimentalmente com a utilização de qualquer métodoadequado, (veja, por exemplo, Berzofsky, e ai, "Antibody-AntigenInteractions", Em Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press:Nova York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman e Company:Nova York, NY (1992); e métodos aqui descritos). A afinidade medida deuma interação antígeno-anticorpo específica pode variar caso seja medidasob condições diferentes (por exemplo, concentração de sal, pH). Dessaforma, as - medidas da afinidade e de outros parâmetros de ligação deantígeno (por exemplo, KD, Kon, K0f) são feitas, de preferência, com soluçõespadronizadas de anticorpo e antígeno, e um tampão padronizado como, porexemplo, o tampão aqui descrito.
Podem ser realizados ensaios competitivos com o anticorpo dapresente invenção a fim de determinar quais proteínas, anticorpos e outrosantagonistas competem pela ligação à IL-6 com o anticorpo da presenteinvenção e/ou compartilham a região de epítopo. Esses ensaios, como é doconhecimento daqueles versados na técnica, avaliam a competição entreantagonistas ou ligantes por um número limitado de sítios de ligação emuma proteína. A proteína e/ou o anticorpo é imobilizado ou tornado insoluvel,antes ou depois da competição, e a amostra ligada à IL-6 é separada daamostra não ligada, por exemplo, por decantação (em que aproteína/anticorpo foi anteriormente tornada insoluvel) ou por centrifugaçao(em que a proteína/anticorpo foi precipitada depois da reação competitiva).Além disso, a ligação competitiva pode ser determinada definindo-se se afunção é alterada pela ligação ou pela ausência de ligação do anticorpo àproteína, por exemplo, se a molécula de anticorpo inibe ou potencializa aatividade enzimática, por exemplo, um marcador. ELISA e outros ensaiosfuncionais podem ser usados, como é bem-conhecido na técnica.
Anticorpos anti-IL-6 preferidos da invenção possuem asseqüências mostradas nas Tabelas 1-5 e 12-14 abaixo. Por exemplo, umanticorpo anti-IL-6 da invenção tem uma das seqüências de CDR da cadeialeve mostradas na Tabela 1 (ou seja, CDRL1, CDRL2, e CDRL3) e uma dasseqüências de CDR da cadeia pesada mostradas na Tabela 2 (ou seja,CDRH1, CDRH2, e CDRH3). Mais especificamente, um anticorpo anti-IL-6(molécula AME-A9) tem a CDRL1 do ID. DE SEQ. Ne: 15, CDRL2 do ID. DESEQ. N9: 27, CDRL3 do ID. DE SEQ. N9: 35, CDRH1 do ID. DE SEQ. N9: 47,CDRH2 do ID. DE SEQ. N9: 61, CDRH3 do ID. DE SEQ. N9: 91.
Moléculas de ácido nucléico
Com o uso das informações aqui fornecidas, por exemplo, asseqüências de nucleotídeos que codificam pelo menos 70-100% dosaminoácidos contíguos de pelo menos uma das regiões variáveis da cadeialeve dos IDS. DE SEQ. Nos: 93, 97 e 101, entre outras seqüências aquireveladas, e pelo menos uma das regiões variáveis da cadeia pesada dosIDS. DE SEQ. Nos: 95, 99 e 103, entre outras seqüências aqui reveladas,fragmentos especificados, variantes ou seqüências de consenso destas, ouum vetor depositado que compreende pelo menos uma dessas seqüências,uma molécula de ácido nucléico da presente invenção que codifica pelomenos um anticorpo anti-IL-6 podem ser obtida com'a utilização dosmétodos aqui descritos ou como é conhecido na técnica.As moléculas de ácido nucléico da presente invenção podemestar na forma de RNA, por exemplo, mRNA, hnRNA, tRNA ou qualqueroutra forma, ou na forma de DNA, incluindo, sem limitação, cDNA e DNAgenômico obtidos por clonagem ou produzidos sinteticamente, ou qualquercombinações destes. O DNA pode ser de filamento triplo, de filamento duploou de filamento único, ou qualquer combinação destas. Qualquer porção depelo menos um filamento do DNA ou RNA pode ser a filamento codificadora,também conhecida como o filamento senso, ou ela pode ser o filamento nãocodificadora, também denominado filamento anti-sentido.
Moléculas de ácido nucléico isolado da presente invençãopodem incluir moléculas de ácido nucléico que compreendem um quadroaberto de leitura (ORF), opcionalmente, com um ou mais íntrons, porexemplo, sem limitação, pelo menos uma porção especificada de pelomenos uma CDR como, por exemplo, CDR1, CDR2 e/ou CDR3, de pelomenos uma cadeia pesada (por exemplo, IDS. DE SEQ. Nos: 38, 40, 42, 44etc.) ou cadeia leve (por exemplo, IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4, 6, 8 etc);moléculas de ácido nucléico que compreendem a seqüência codificadorapara um anticorpo anti-IL-6 ou região variável (por exemplo, regiõesvariáveis da cadeia leve dos IDS. DE SEQ. Nos: 94, 98, e 102, entre outrasseqüências aqui reveladas, e regiões variáveis da cadeia pesada dos IDS.DE SEQ. Nos: 96, 100 e 104); e moléculas de ácido nucléico quecompreendem uma seqüência de nucleotídeos substancialmente diferentedaquelas descritas acima, mas que, em função da degeneração do códigogenético, ainda codifica pelo menos um anticorpo anti-IL-6 como aquidescrito e/ou como conhecido na técnica. Evidentemente, o código genéticoé bem-conhecido na técnica. Dessa forma, seria rotineiro para aquelesversados na técnica a geração dessas variantes de ácido nucléicodegenerado que codificam os anticorpos anti-IL-6 específicos da presenteinvenção. Veja, por exemplo, Ausubel, e al., supra, e tais variantes de ácidonucléico estão incluídas na presente invenção.
Como aqui indicado, as moléculas de ácido nucléico dapresente invenção que compreendem um ácido nucléico que codifica umanticorpo anti-IL-6 podem incluir, sem limitação, aquelas que codificam aseqüência de aminoácidos de um fragmento de anticorpo, por ela própria; aseqüência codificadora para todo o anticorpo ou para uma porção deste; aseqüência codificadora para um anticorpo, fragmento ou porção, além deseqüências adicionais como, por exemplo, a seqüência codificadora de pelomenos um peptídeo sinalizador líder ou de fusão, com ou sem asseqüências codificadoras adicionais mencionadas anteriormente como, porexemplo, pelo menos um íntron, junto com seqüências não-codificadorasadicionais, incluindo, sem limitação, seqüências não codificadoras 5' e 3',tais como as seqüências transcritas, não-traduzidas, que participam datranscrição, processamento de mRNA, incluindo sinais de junção e depoliadenilação (por exemplo, ligação de ribossomo e estabilidade de mRNA);uma seqüência codificadora adicional que codifica aminoácidos adicionaiscomo, por exemplo, aquelas que fornecem funcionalidades adicionais.
Dessa forma, a seqüência que codifica um anticorpo pode ser fundida a umaseqüência marcadora, por exemplo, uma seqüência que codifica umpeptídeo que facilita a purificação do anticorpo fundido que compreende umfragmento ou uma porção de anticorpo.
Polinucleotídeos que hibridizam seletivamente para umpolinucleotídeo como aqui descrito
A presente invenção fornece ácidos nucléicos isolados quehibridizam sob condições seletivas de hibridização para um polinucleotídeoaqui-revelado. Dessa forma, os polinucleotídeos desta modalidade podemser usados para o isolamento, detecção e/ou quantificação de ácidosnucléicos que compreendem tais polinucleotídeos. Por exemplo, ospolinucleotídeos da presente invenção podem ser usados para identificar,isolar ou amplificar clones parciais ou de comprimento total em umabiblioteca depositada. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos sãoseqüências genômicas ou de cDNA isoladas, ou de alguma formacomplementares a um cDNA de uma biblioteca de ácidos nucléicoshumanos ou mamíferos.
De preferência, a biblioteca de cDNA compreende pelo menos80% de seqüências de comprimento total, de preferência, pelo menos 85%ou 90% de seqüências de comprimento total e, mais preferivelmente, pelomenos 95% de seqüências de comprimento total. As bibliotecas de cDNApodem ser normalizadas para aumentar a representação de seqüênciasraras. Condições de hibridização de rigor baixo ou moderado sãotipicamente, mas não exclusivamente, empregadas com seqüências quepossuem uma identidade de seqüência reduzida em relação às seqüênciascomplementares. Condições de rigor moderado e elevado podemopcionalmente ser empregadas para seqüências de identidade maior.
Condições de baixo rigor permitem a hibridização seletiva de seqüênciasque possuem cerca de 70% de identidade de seqüência e podem serempregadas para identificar seqüências ortólogas ou parálogas.
Opcionalmente, polinucleotídeos desta invenção codificarãopelo menos uma porção de um anticorpo codificado pelos polinucleotídeosaqui descritos. Os polinucleotídeos desta invenção englobam seqüências deácidos nucléicos que podem ser empregadas para a hibridização seletivapara um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da presente invenção.Veja, por exemplo, Ausubel, supra; Colligan, supra, cada um deles aquiincorporado por referência em sua totalidade.
Construção de ácidos nucléicos
Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem serfeitos com a utilização de: (a) métodos recombinantes, (b) técnicassintéticas, (c) técnicas de purificação e/ou (d) combinações destas, como ébem-conhecido na técnica.
Os ácidos nucléicos podem convenientemente compreenderseqüências, além de um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo,um sítio de clonagem múltipla que compreende um ou mais sítios derestrição de endonuclease pode ser inserido no ácido nucléico para ajudarno isolamento do polinucleotídeo. Além disso, podem ser inseridasseqüências traduzíveis para ajudar no isolamento do polinucleotídeotraduzido da presente invenção. Por exemplo, uma seqüência marcadora dehexa-histidina fornece um meio conveniente para a purificação de proteínasda presente invenção. O ácido nucléico da presente invenção, excluindo aseqüência codificadora, é opcionalmente um vetor, adaptador, ou vinculadorpara a clonagem e/ou expressão de um polinucleotídeo da presenteinvenção.
Seqüências adicionais podem ser acrescentadas a essasseqüências de clonagem e/ou expressão para otimizar sua função naclonagem e/ou expressão, para ajudar no isolamento do polinucleotídeo oupara aprimorar a introdução do polinucleotídeo em uma célula. O uso devetores de clonagem, vetores de expressão, adaptadores e vinculadores ébem-conhecido na técnica (veja, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook,supra).
Métodos recombinantes para a construção de ácidos nucléicos
As composições de ácido nucléico isolado desta invenção, taiscomo RNA, cDNA, DNA genômico, ou qualquer combinação destes, podemser obtidas a partir de fontes biológicas com o uso de uma das váriasmetodologias de clonagem conhecidas por aqueles versados na técnica. Emalgumas modalidades, são usadas sondas de oligonucleotídeos quehibridizam seletivamente, sob condições rigorosas, para os polinucleotídeosda presente invenção para identificar a seqüência desejada em umabiblioteca de cDNA ou de DNA genômico. O isolamento de RNA e aconstrução de cDNA e de bibliotecas genômicas são bem-conhecidos poraqueles versados na técnica (veja, por exemplo, Ausubel, supra; ouSambrook, supra).
Métodos de triagem e isolamento de ácidos nucléicos
Uma biblioteca de cDNA ou genômica pode ser rastreada coma utilização de uma sonda com base na seqüência de um polinucleotídeo dapresente invenção, tais como aquelas aqui descritos. Podem ser usadassondas para hibridizar com DNA genômico ou seqüências de cDNA paraisolar genes homólogos no mesmo organismo ou em organismos diferentes.
Aqueles versados na técnica observarão que vários graus de rigor dehibridização podem ser empregados no ensaio; e tanto o meio dehibridização quanto o de lavagem podem ser rigorosos. À medida que ascondições para a hibridização se tornam mais rigorosas, deve haver um graumaior de complementaridade entre a sonda e o alvo para que ocorra aformação de dúplex. O grau de rigor pode ser controlado por um ou mais detemperatura, força iônica, pH e a presença de um solvente parcialmentedesnaturante como, por exemplo, formamida. Por exemplo, o rigor dahibridização é convenientemente diverso alterando-se a polaridade dasolução de reagente através, por exemplo, da manipulação da concentraçãode formamida na faixa de 0% a 50%. O grau de complementaridade(identidade de seqüência) necessário para a ligação detectável irá variar deacordo com o rigor do meio de hibridização e/ou do meio de lavagem. Ograu de complementaridade otimamente será de 100% ou 70-100%, ouqualquer faixa ou valor incluído nessa faixa. No entanto, deve-se entenderque pequenas variações de seqüência nas sondas e nos iniciadores podemser compensadas pela redução do rigor do meio de hibridização e/ou domeio de lavagem.
Métodos de amplificação de RNA ou DNA são bem-conhecidosna técnica e podem ser usados de acordo com a presente invenção, semexperimentação desnecessária, com base nos ensinamentos e nas diretrizesaqui apresentadas.
Métodos conhecidos de amplificação de DNA ou RNA incluem,sem limitação, reação em cadeia de polimerase (PCR) e processos deamplificação relacionados (veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos 4.683.195,4.683.202, 4.800.159, 4.965.188, para Mullis, e ai; 4.795.699 e 4.921.794para Tabor, e ai; 5.142.033 para Innis; 5.122.464 para Wilson, e ai;5.091.310 para Innis; 5.066.584 para Gyllensten, e ai; 4.889.818 paraGelfand, e ai; 4.994.370 para Silver, e ai; 4.766.067 para Biswas; 4.656.134para Ringold) e amplificação mediada por RNA que utiliza RNA anti-sensopara a seqüência-alvo como um modelo para a síntese de DNA de fita dupla(Patente U.S. N9 5.130.238 para Malek, e ai, com o nome comercialNASBA), cujos conteúdos totais são aqui incorporados por referência (veja,por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra).Por exemplo, a tecnologia de reação em cadeia de polimerase(PCR) pode ser usada para amplificar as seqüências de polinucleotídeos dapresente invenção, e os genes relacionados, diretamente a partir debibliotecas de DNA genômico ou de cDNA. PCR e outros métodos deamplificação in vitro também podem ser úteis, por exemplo, para clonarseqüências de ácidos nucléicos que codificam proteínas a serem expressas,para a fabricação de ácidos nucléicos para serem usados como sondas paraa detecção da presença do mRNA de interesse em amostras, paraseqüenciamento de ácido nucléico ou para outras finalidades. Exemplos detécnicas suficientes para guiarem aqueles versados na técnica através demétodos de amplificação in vitro são encontrados em Berger, supra,Sambrook, supra e Ausubel, supra, bem como em Mullis, e ai, na PatenteU.S. NQ 4.683.202 (1987); e Innis, e ai, "PCR Protocols A Guide to Methodsand Applications", Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Kitsdisponíveis comercialmente para amplificação genômica por PCR sãoconhecidos na técnica. Veja, por exemplo, o Kit de PCR "Advantage-GCGenomic" (Clontech). Adicionalmente, por exemplo, a proteína 32 do geneT4 (Boehringer Mannheim) pode ser usada para aumentar o rendimento deprodutos de PCR longos.
Métodos sintéticos para a construção de ácidos nucléicos
Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem serpreparados por síntese química direta por métodos conhecidos (veja, porexemplo, Ausubel, e ai, supra). A síntese química geralmente produz umoligonucleotídeo de fita única, que pode ser convertido em DNA de fita duplapor hibridização com uma seqüência complementar, ou por polimerizaçãocom uma DNA polimerase com o uso de uma fita única como modelo.Aqueles versados na técnica reconhecerão que, embora a síntese químicade DNA possa se limitar a seqüências de cerca de 100 ou mais bases,seqüências mais longas podem ser obtidas pela ligação de seqüências maiscurtas.
Cassetes de expressão recombinante
A presente invenção ainda fornece cassetes de expressãorecombinante que compreendem um ácido nucléico da presente invenção.Uma seqüência de ácidos nucléicos da presente invenção, por exemplo, umcDNA ou uma seqüência genômica que codifica um anticorpo da presenteinvenção, pode ser usada para construir um cassete de expressãorecombinante que pode ser introduzido em pelo menos uma célulahospedeira desejada. Um cassete de expressão recombinantecompreenderá tipicamente um polinucleotídeo da presente invenção ligadooperacionalmente a seqüências reguladoras da iniciação da transcrição queirão dirigir a transcrição do polinucleotídeo na célula hospedeira desejada.
Podem ser empregados promotores tanto heterólogos quanto não-heterólogos (ou seja, endógenos) para dirigir a expressão dos ácidosnucléicos da presente invenção.
Em algumas modalidades, os ácidos nucléicos isolados queservem como promotor, intensificador ou outros elementos podem serintroduzidos na posição apropriada (acima, abaixo ou no íntron) de umaforma não heteróloga de um polinucleotídeo da presente invenção de modoa supra- ou infra-regular a expressão de um polinucleotídeo da presenteinvenção. Por exemplo, promotores endógenos podem ser alterados in vivoou in vitro por mutação, eliminação e/ou substituição.
Vetores e células hospedeiras
A presente invenção também está relacionada aos vetores queincluem moléculas de ácido nucléico isolado da presente invenção, célulashospedeiras que são projetadas geneticamente com os vetoresrecombinantes, e à produção de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 portécnicas recombinantes, como é bem-conhecido na técnica. Veja, porexemplo, Sambrook, e ai, supra; Ausubel, e ai, supra, cada um deles aquiincorporado por referência em sua totalidade.
Os polinucleotídeos podem opcionalmente ser unidos a umvetor que contém um marcador selecionável para a propagação em umhospedeiro. Geralmente, um vetor de plasmídeo é introduzido em umprecipitado, por exemplo, um precipitado de fosfato de cálcio, ou em umcomplexo com um lipídeo com carga. Caso o vetor seja um vírus, ele podeser compactado in vitro com o uso de uma linhagem germinativa decompactação apropriada, e depois transduzido em células hospedeiras.
A inserção de DNA deve estar ligada operacionalmente a umpromotor apropriado. Os constructos de expressão conterão ainda sítiospara a iniciação, terminação da transcrição e, na região transcrita, um sítiode ligação de ribossomo para tradução. A porção codificadora dostranscritos maduros expressos pelos constructos incluirá, de preferência, umcódon de iniciação da tradução, no começo, e um códon de terminação detradução (por exemplo, UAA, UGA ou UAG) posicionado adequadamente nofinal do mRNA a ser traduzido, com UAA e UAG sendo preferidos paraexpressão em células mamíferas ou eucarióticas.
Vetores de expressão incluirão, de preferência, masopcionalmente, pelo menos um marcador selecionável. Tais marcadoresincluem, por exemplo, sem limitação, resistência ao metotrexato (MTX),diidrofolato redutase (DHFR, Patentes U.S. Nos 4.399.216, 4.634.665,4.656.134, 4.956.288, 5.149.636, 5.179.017), ampicilina, neomicina (G418),ácido micofenólico ou glutamina sintetase (GS, Patentes U.S. Nos 5.122.464,5.770.359, 5.827.739) para cultura de células eucarióticas, e genes deresistência à tetraciclina ou ampicilina para o cultivo em E. coli e outrasbactérias ou procarióticos (as patentes acima são aqui incorporadas em suatotalidade por referência). Meios e condições de cultura apropriadas para ascélulas hospedeiras descritas acima são conhecidos na técnica. Vetoresadequados serão evidentes para aqueles versados na técnica. A introduçãode um constructo de vetor em uma célula hospedeira pode ser efetuada portransfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrana,transfecção mediada por lipídeo catiônico, eletroporação, transdução,infecção ou por outros métodos conhecidos. Tais métodos são descritos natécnica como, por exemplo, em Sambrook, supra, Capítulos 1-4 e 16-18;Ausubel, supra, Capítulos 1, 9, 13,15, 16.
Pelo menos um anticorpo da presente invenção pode serexpresso em uma forma modificada, por exemplo, uma proteína de fusão, epode incluir não somente sinais de secreção, mas também regiõesfuncionais heterólogas adicionais. Por exemplo, uma região adicional deaminoácidos, particularmente aminoácidos com carga, pode ser adicionadaao terminal N de um anticorpo para aumentar a estabilidade e a persistênciana célula hospedeira durante a purificação, ou durante a manipulação e aestocagem subseqüentes. Além disso, porções peptídicas podem seracrescentadas a um anticorpo da presente invenção para facilitar apurificação. Essas regiões podem ser removidas antes da preparação finalde um anticorpo, ou pelo menos um fragmento deste. Tais métodos sãodescritos em muitos manuais de laboratório padronizados, por exemplo,Sambrook, supra, Capítulos 17.29-17.42 e 18.1-18.74; Ausubel, supra,Capítulos 16, 17 e 18.
Aqueles versados na técnica têm conhecimento dos numerosossistemas de expressão disponíveis para a expressão de um ácido nucléicoque codifica uma proteína da presente invenção. Alternativamente, os ácidosnucléicos da presente invenção podem ser expressos em uma célulahospedeira ligando-se (por manipulação) uma célula hospedeira que contémDNA endógeno que codifica um anticorpo da presente invenção. Taismétodos são bem-conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito nasPatentes U.S. Nos 5.580.734, 5.641.670, 5.733.746 e 5.733.761, aquiincorporadas por referência em sua totalidade.
Células mamíferas são ilustrativas de culturas celulares úteispara a produção dos anticorpos, porções ou variantes especificadas destes.Sistemas de células mamíferas freqüentemente estarão na forma demonocamadas de células, embora suspensões de células mamíferas oubiorreatores também possam ser utilizados. Diversas linhagens de célulashospedeiras adequadas capazes de expressar proteínas glicosiladasintactas foram desenvolvidas na técnica, e incluem as linhagens celularesCOS-1 (por exemplo, ATCC CRL-1650), COS-7 (por exemplo, ATCC CRL-1651), HEK293, BBK21 (por exemplo, ATCC CRL-10), CHO (por exemplo,ATCC CRL-1610) e BSC-1 (por exemplo, ATCC CRL-26), Cos-7 células,CHO células, células hep G2, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, células 293,células HeLa e semelhantes, que são facilmente disponíveis, por exemplo,na "American Type Culture Collection", Manassas, Va (www.atcc.org).Células hospedeiras preferidas incluem células de origem linfoide como, porexemplo, células de mieloma e de linfoma. Células hospedeirasparticularmente preferidas são células P3X63Ag8.653 (Número de AcessoATCC CRL-1580) e células SP2/0-Ag14 (Número de Acesso ATCC CRL-1851). Em uma modalidade particularmente preferida, a célula recombinanteé uma célula P3X63Ab8.653 ou uma célula SP2/0-Ag14.
Vetores de expressão para essas células podem incluir uma oumais das seguintes seqüências de controle da expressão, por exemplo, semlimitação, uma origem de replicação; um promotor (por exemplo, promotoresSV40 tardios ou precoces), o promotor de CMV (Patentes U.S. Nos5.168.062; 5.385.839), um promotor HSV tk, um promotor pgk (fosfogliceratoquinase), um promotor EF-1 alfa (Patente U.S. N- 5.266.491), pelo menosum promotor de imunoglobulina humana; um intensificador e/ou sítios deprocessamento de informação, tais como sítios de ligação de ribossomo,sítios de junção de RNA, sítios de poliadenilação (por exemplo, um sítio deadição SV40 large T Ag poli A), e seqüências de terminação da transcrição.Veja, por exemplo, Ausubel e ai, supra; Sambrook, e ai, supra. Outrascélulas úteis para a produção de ácidos nucléicos ou de proteínas dapresente invenção são conhecidas e/ou disponíveis, por exemplo, no"American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas"(www.atcc.org) ou outras fontes conhecidas ou comerciais.
Quando são empregadas células hospedeiras eucarióticas,seqüências de poliadenilação ou de terminação da transcrição sãotipicamente incorporadas no vetor. Um exemplo de uma seqüência determinação é a seqüência de poliadenilação do gene do hormônio docrescimento bovino. Seqüências para uma junção precisa do transcritotambém podem ser incluídas. Um exemplo de uma seqüência de junção é oíntron VP1 de SV40 (Sprague, e ai, J. Virol. 45: 773-781 (1983)).
Adicionalmente, seqüências gênicas para o controle da replicação na célulahospedeira podem ser incorporadas no vetor, como é conhecido na técnica.Purificação de um anticorpo
Um anticorpo anti-IL-6 pode ser recuperado e purificado deculturas de células recombinantes por métodos bem-conhecidos queincluem, sem limitação, purificação de proteína A, precipitação com sulfatode amônio ou etanol, extração de ácido, cromatografia por troca aniônica oucatiônica, cromatografia com fosfocelulose, cromatografia por interaçãohidrofóbica, cromatografia por afinidade, cromatografia com hidroxilapatita ecromatografia com lectina. A cromatografia líquida de alto rendimento("HPLC") também pode ser empregada para purificação. Veja, por exemplo,Colligan, "Current Protocols in Immunology", ou "Current Protocols in ProteinScience", John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), por exemplo, Capítulos1, 4, 6, 8, 9, 10, cada um deles aqui incorporado por referência em suatotalidade.
Os anticorpos da presente invenção incluem produtosnaturalmente purificados, produtos de procedimentos químicos sintéticos eprodutos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiroeucariótico, incluindo, por exemplo, células de leveduras, de plantassuperiores, de insetos e de mamíferos. Dependendo do hospedeiroempregado no procedimento de produção recombinante, o anticorpo dapresente invenção pode ser glicosilado ou pode ser não-glicosilado, sendopreferido o anticorpo glicosilado. Tais métodos são descritos em muitosmanuais de laboratório padronizados, por exemplo, em Sambrook, supra,Seções 17.37-17.42; Ausubel, supra, Capítulos 10, 12, 13, 16, 18 e 20,Colligan, "Protein Science", supra, Capítulos 12-14, todos aqui incorporadospor referência em sua totalidade.
Anticorpos anti-IL-6
Um anticorpo anti-IL-6 de acordo com a presente invençãoinclui qualquer molécula que contenha proteína ou peptídeo quecompreenda pelo menos uma porção de uma molécula de imunoglobulinacomo, por exemplo, sem limitação, pelo menos uma porção de ligação deligante (LBP), por exemplo, sem limitação, uma região determinante decomplementaridade (CDR) de uma cadeia pesada ou leve ou uma porção deligação de ligante desta, uma região variável da cadeia pesada ou da cadeialeve, uma região estrutural (por exemplo, FR1, FR2, FR3, FR4 ou fragmentodestas, ou como mostrados nos IDS. DE SEQ. Nos: 105-112, queopcionalmente ainda compreendem pelo menos uma substituição, inserçãoou eliminação), uma região constante da cadeia pesada ou da cadeia leve(por exemplo, que compreende pelo menos uma CH1, hingel, hinge2,hinge3, hinge4, CH2 ou CH3, ou fragmento destas, que ainda opcionalmentecompreende pelo menos uma substituição, inserção ou eliminação), ouqualquer porção destas, que pode ser incorporada em um anticorpo dapresente invenção. Um anticorpo da invenção pode incluir ou ser derivadode qualquer mamífero como, por exemplo, sem limitação, um ser humano,um camundongo, um coelho, um rato, um roedor, um primata, ou qualquercombinação destes, e semelhantes.
Os anticorpos isolados da presente invenção compreendem asseqüências de aminoácidos do anticorpo aqui descritas codificadas porqualquer polinucleotídeo adequado, ou qualquer anticorpo isolado oupreparado. De preferência, o anticorpo humano ou fragmento de ligação deantígeno se liga à IL-6 humana e, dessa forma, neutraliza parcial ousubstancialmente pelo menos uma atividade biológica da proteína. Umanticorpo, ou porção especificada ou variante deste, que neutralizaparcialmente ou, de preferência, substancialmente pelo menos umaatividade biológica de pelo menos uma proteína ou fragmento de IL-6, podese ligar à proteína ou ao fragmento e, dessa forma, inibir atividadesmediadas através da ligação de IL-6 ao receptor de IL-6, ou através deoutros mecanismos dependentes ou mediados por IL-6. Como aqui usado, otermo "anticorpo neutralizante" refere-se a um anticorpo que pode inibir umaatividade dependente de IL-6 em cerca de 20-120%, de preferência em pelomenos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93,94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou mais, dependendo do ensaio. A capacidadede um anticorpo anti-IL-6 para inibir uma atividade dependente de IL-6 éavaliada, de preferência, por pelo menos um ensaio adequado de proteínaou receptor de IL-6, como aqui descrito e/ou como conhecido na técnica. Umanticorpo humano da invenção pode ser de qualquer classe (IgG, IgA, IgM,IgE, IgD etc.) ou isótipo, e pode compreender uma cadeia leve kapa oulambda. Em uma modalidade, o anticorpo humano compreende uma cadeiapesada de IgG ou fragmento definido, por exemplo, pelo menos um dosisótipos, lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4 (por exemplo, yl, y2, 73 ou y4).
Anticorpos desse tipo podem ser preparados com o emprego de umcamundongo transgênico ou de outro mamífero não-humano transgênicoque compreenda pelo menos um transgene de cadeia leve humana (porexemplo, IgG, IgA e IgM), como aqui descrito e/ou como conhecido natécnica. Em outra modalidade, o anticorpo humano anti-IL-6 humanacompreende uma cadeia pesada de lgG1 e uma cadeia leve de lgG1.
Pelo menos um anticorpo da invenção se liga a pelo menos umepítopo especificado, específico para pelo menos uma proteína IL-6,subunidade, fragmento, porção ou qualquer combinação destes. Esse pelomenos um epítopo pode compreender pelo menos uma região de ligação deanticorpo que compreende pelo menos uma porção da proteína, cujo epítopoé composto, de preferência, por pelo menos uma porção extracelular,solúvel, hidrofílica, externa ou citoplasmática da proteína. Esse pelo menosum epítopo especificado pode compreender qualquer combinação de pelomenos uma seqüência de aminoácidos de pelo menos 1-3 aminoácidos atétoda a porção especificada de aminoácidos contíguos do ID. DE SEQ. Ne:115, por exemplo, resíduos dos aminoácidos 151-178, maisespecificamente, os resíduos 171-182.
Geralmente, o anticorpo humano ou fragmento de ligação deantígeno da presente invenção compreenderá uma região de ligação deantígeno que compreende pelo menos uma região determinante decomplementaridade humana (CDR1, CDR2 e CDR3) ou variante de pelomenos uma região variável da cadeia pesada e pelo menos uma regiãodeterminante de complementaridade humana (CDR1, CDR2 e CDR3) ouvariante de pelo menos uma região variável da cadeia leve. As seqüênciasde CDR podem ser derivadas de seqüências de linhagem germinativahumana ou podem combinar intimamente com as seqüências de linhagemgerminativa. Por exemplo, as CDRs de uma biblioteca sintética derivada dasCDRs de camundongo originais podem ser usadas. Essas CDRs podem serformadas por incorporação de substituições conservadoras em relação àseqüência de camundongo original. Como exemplo não-limitante, oanticorpo ou a porção de ligação de antígeno ou variante pode compreenderpelo menos uma entre uma CDR3 da cadeia pesada que possui umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DESEQ. Nos: 79, 81, 83, 85, 87, 89 e 91 e/ou uma CDR3 da cadeia leve quepossui uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consistenos IDS. DE SEQ. Nos: 29, 31, 33 e 35. Em uma modalidade particular, oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno pode ter uma região deligação de antígeno que compreende pelo menos uma porção de pelomenos uma CDR da cadeia pesada (ou seja, CDR1, CDR2 e/ou CDR3) quepossui a seqüência de aminoácidos das CDRs 1, 2 e/ou 3 correspondentes(por exemplo, IDS. DE SEQ. Nos :37, 49 e 79). Em outra modalidadeparticular, o anticorpo ou a porção de ligação de antígeno ou variante podeter uma região de ligação de antígeno que compreende pelo menos umaporção de pelo menos uma CDR da cadeia leve (ou seja, CDR1, CDR2 e/ouCDR3) que possui a seqüência de aminoácidos das CDRs 1, 2 e/ou 3correspondentes (por exemplo, IDS. DE SEQ. Nos: 1, 17 e 29).
Em uma modalidade preferida, as três CDRs da cadeia pesadae as três CDRs da cadeia leve do anticorpo ou fragmento de ligação deantígeno possuem a seqüência de aminoácidos da CDR correspondente depelo menos um de mAb AME-A9, AME-1b, AME-18a, AME-22a, AME-20b,AME-23a e AME-19a, como aqui descritos. Tais anticorpos podem serpreparados unindo-se quimicamente as várias porções (por exemplo, CDRs,estrutura central) do anticorpo através do uso de técnicas convencionais,preparando-se e expressando-se uma (ou seja, uma ou mais) molécula deácido nucléico que codifica o anticorpo com o uso de técnicas convencionaisde tecnologia de DNA recombinante, ou pela utilização de qualquer outrométodo adequado.
O anticorpo anti-IL-6 pode compreender pelo menos uma deuma região variável da cadeia pesada ou leve que possui uma seqüência deaminoácidos definida. Por exemplo, em uma modalidade preferida, oanticorpo anti-IL-6 compreende pelo menos um de pelo menos uma regiãovariável da cadeia pesada, opcionalmente possuindo uma seqüência deaminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 95,99, 103, 118, 122, 126 e 130, e/ou pelo menos uma região variável dacadeia leve, possuindo opcionalmente uma seqüência de aminoácidosselecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 93, 97, 101, 116,120, 124 e 128. Anticorpos que se ligam à IL-6 humana e que compreendemuma região variável definida da cadeia pesada ou leve podem serpreparados com o uso de métodos adequados, tais como o método deexibição de fago (Katsube, Y., e ai, Int. J. Mol. Med, 1(5): 863-868 (1998))ou métodos que empregam animais transgenicos, como conhecidos natécnica e/ou como aqui descritos. Por exemplo, um camundongo transgênicoque compreende um transgene funcionalmente rearranjado da cadeiapesada da imunoglobulina humana e um transgene que compreende DNAde um lócus da cadeia leve de imunoglobulina humana pode ser submetidoa rearranjo funcional, pode ser imunizado com IL-6 humana ou umfragmento desta, para despertar a produção de anticorpos. Se desejado, ascélulas produtoras de anticorpos podem ser isoladas, e hibridomas ou outrascélulas imortalizadas produtoras de anticorpos podem ser preparadas comoaqui descrito e/ou como conhecido na técnica. Alternativamente, o anticorpo,porção especificada ou variante pode ser expresso com a utilização do ácidonucléico codificador, ou porção deste, em uma célula hospedeira adequada.
Códigos de aminoácidos
Os aminoácidos que constituem os anticorpos anti-IL-6 dapresente invenção são freqüentemente abreviados. As designações dosaminoácidos podem ser indicadas designando-se o aminoácido por seucódigo de uma letra, seu código de três letras, pelo nome, ou códon(s) denucleotídeos, como é conhecido na técnica (veja Alberts, B., e ai,"Molecular Biology of The Cell", Terceira Ed., Garland Publishing, Inc., NovaYork, 1994).Um anticorpo anti-IL-6 da presente invenção pode incluir umaou mais substituições, eliminações ou adições de aminoacidos, tanto demutações naturais quanto por manipulação humana, como aquiespecificado. Aminoacidos em um anticorpo anti-IL-6 da presente invençãoque são essenciais para a função podem ser identificados por métodosconhecidos na técnica como, por exemplo, mutagênese sítio-dirigida oumutagênese por varredura de alanina (por exemplo, Ausubel, supra,Capítulos 8, 15; Cunningham e Wells, Science 244: 1.081-.1085 (1989)).
Esse último procedimento introduz mutações únicas de alanina em cadaresíduo na molécula. As moléculas mutantes resultantes são então testadasquanto à atividade biológica como, por exemplo, sem limitação, pelo menosuma atividade neutralizante de IL-6. Sítios que são críticos para a ligação deanticorpo também podem ser identificados por análise estrutural, tais comocristalização, ressonância nuclear magnética ou marcação por fotoafinidade(Smith, e ai, J. Moi Biol. 224: 899-904 (1992) e de Vos, e ai, Science 255:306-312(1992)).
Os anticorpos anti-IL-6 da presente invenção podem incluir,sem limitação, pelo menos uma porção, seqüência ou combinaçãoselecionada de 5 a todos os aminoacidos contíguos de pelo menos um dosIDS. DE SEQ. Nos: 91, 93, 95, 97, 99 etc.
Variantes não-limitantes que podem intensificar ou manter pelomenos uma das atividades listadas incluem, sem limitação, qualquer um dospolipeptídeos acima, compreendendo ainda pelo menos uma mutação quecorresponde a pelo menos uma substituição nos resíduos diversos entre asseqüências de aminoacidos variantes descritas.
Um anticorpo anti-IL-6 pode ainda opcionalmente compreenderum polipeptídeo com uma seqüência de aminoacidos que varie em relação àseqüência dos aminoacidos contíguos de pelo menos um dos IDS. DE SEQ.Nos: 95, 99 e 103 etc. (por exemplo, uma ou mais substituiçõesconservadoras em relação às seqüências aqui fornecidas). Além disso, apresente invenção compreende variantes da seqüência de aminoacidos deuma região variável da cadeia leve dos IDS. DE SEQ. Nos: 93, 97 ou 101, ouda seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada dos IDS. DE SEQ. Nos:79, 81, 83, 85, 87, 89 ou 91.
Como observado por aqueles versados na técnica, a presenteinvenção inclui pelo menos um anticorpo biologicamente ativo da presenteinvenção. Anticorpos biologicamente ativos têm uma atividade específica depelo menos 20%, 30% ou 40% e, de preferência, pelo menos 50%, 60%, ou70% e, principalmente, pelo menos 80%, 90% ou 95%-1.000% ou maisdaquela do anticorpo nativo (não-sintético), endógeno ou relacionado econhecido. Métodos de avaliação e quantificação das medidas da atividadeenzimatica e especificidade de substrato são bem-conhecidos por aquelesversados na técnica.
Em outro aspecto, a invenção refere-se aos anticorposhumanos e fragmentos de ligação de antígeno, como aqui descritos, que sãomodificados pela adesão covalente de uma porção orgânica. Tal modificaçãopode produzir um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compropriedades farmacocinéticas aprimoradas (por exemplo, meia-vida séricain vivo aumentada). A porção orgânica pode ser um grupo poliméricohidrofílico linear ou ramificado, grupo ácido graxo ou grupo éster de ácidograxo. Em modalidades específicas, o grupo polimérico hidrofílico pode terum peso molecular de cerca de 800 a cerca de 120.000 Dáltons, e pode serum polialcano glicol (por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropilenoglicol (PPG)), polímero de carboidrato, polímero de aminoácido ou polivinilpirrolidona, e o grupo ácido graxo ou de éster de ácido graxo podecompreender de cerca de oito a cerca de quarenta átomos de carbono.
Os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno modificadosda invenção podem compreender uma ou mais porções orgânicas que sãoligadas covalentemente, direta ou indiretamente, ao anticorpo. Cada porçãoorgânica que é ligada a um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenoda invenção pode independentemente ser um grupo polimérico hidrofílico,um grupo ácido graxo ou um grupo éster de ácido graxo. Como aqui usado,o termo "ácido graxo" engloba ácidos monocarboxílicos e ácidosdicarboxílicos. Um "grupo polimérico hidrofílico", como o termo é aqui usado,refere-se a um polímero orgânico que é mais solúvel na água do que emoctano. Por exemplo, polilisina é mais solúvel na água do que em octano.Dessa forma, um anticorpo modificado pela adesão covalente de polilisina éenglobado pela invenção. Polímeros hidrofílicos adequados para amodificação de anticorpos da invenção podem ser lineares ou ramificados, eincluem, por exemplo, polialcano glicóis (por exemplo, PEG, monometóxi-polietileno glicol (mPEG), PPG e semelhantes), carboidratos (por exemplo,dextrana, celulose, oligossacarídeos, polissacarídeos e semelhantes),polímeros de aminoácidos hidrofílicos (por exemplo, polilisina, poliarginina,poliaspartato e semelhantes), óxidos de polialcano (por exemplo, oxido depolietileno, oxido de polipropileno e semelhantes) e polivinil pirrolidona. Depreferência, o polímero hidrofílico que modifica o anticorpo da invenção temum peso molecular de cerca de 800 a cerca de 150.000 Dáltons, como umaentidade molecular separada. Por exemplo, podem ser usados PEG5.0oo ePEG20.000, em que o subscrito é o peso molecular médio do polímero emDáltons. O grupo polimérico hidrofílico pode ser substituído com um a cercade seis grupos alquila, ácido graxo ou éster de ácido graxo. Polímeroshidrofílicos que são substituídos por um grupo ácido graxo ou de éster deácido graxo podem ser preparados com o emprego de métodos adequados.
Por exemplo, um polímero que compreende um grupo amina pode seracoplado a um carboxilato do ácido graxo ou éster de ácido graxo, e umcarboxilato ativado (por exemplo, ativado com N,N-carbonil di-imidazol) emum ácido graxo ou éster de ácido graxo pode ser acoplado a um grupohidroxil em um polímero.
Ácidos graxos e ésteres de ácido graxo adequados para amodificação de anticorpos da invenção podem ser saturados ou podemconter uma ou mais unidades de insaturação. Ácidos graxos que sãoadequados para a modificação de anticorpos da invenção incluem, porexemplo, n-dodecanoato (C12, laurato), n-tetradecanoato (C14, miristato), n-octadecanoato (Ci8, estearato), n-eicosanoato (C2o, araquidato), n-docosanoato (C22, behenato), n-triacontanoato (C30), n-tetracontanoato (C40),c/s-A9-octadecanoato (Cie, oleato), ali c/s-A,8,11,14-eicosatetraenoato (C2o,araquidonato), ácido octanodióico, ácido tetradecanodióico, ácidooctadecanodióico, ácido docosanodióico, e semelhantes. Esteres de ácidograxo adequados incluem monoesteres de ácidos dicarboxílicos quecompreendem um grupo alquil inferior linear ou ramificado. O grupo alquilinferior pode compreender de um a cerca de doze, de preferência um acerca de seis átomos de carbono.
Os anticorpos humanos e fragmentos de ligação de antígenomodificados podem ser preparados com a utilização de métodos adequados,tais como por reação com um ou mais agentes de modificação. Um "agentede modificação", como o termo é aqui usado, refere-se a um grupo orgânicoadequado (por exemplo, polímero hidrofílico, um ácido graxo, um éster deácido graxo) que compreende um grupo de ativação. Um "grupo de ativação"é uma porção química ou grupo funcional que pode, sob condiçõesapropriadas, reagir com um segundo grupo químico, formando, dessa forma,uma ligação covalente entre o agente de modificação e o segundo grupoquímico. Por exemplo, grupos de ativação reativos à amina incluem gruposeletrofílicos, tais como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, flúor, iodo),ésteres de N-hidroxissuccinimidila (NHS), e semelhantes. Grupos deativação que podem reagir com tióis incluem, por exemplo, maleimida,iodoacetila, acrilolila, bissulfetos de piridila, tiol de ácido 5-tiol-2-nitrobenzóico (TNB-tiol), e semelhantes. Um grupo funcional aldeído podeser acoplado às moléculas contendo amina ou hidrazida, e um grupo azidapode reagir com um grupo de fósforo trivalente para formar ligaçõesfosforamidato ou fosforimida. Métodos adequados para a introdução degrupos de ativação em moléculas são conhecidos na técnica (veja, porexemplo, Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: SanDiego, CA (1996)). Um grupo de ativação pode ser ligado diretamente aogrupo orgânico (por exemplo, polímero hidrofílico, ácido graxo, éster deácido graxo), ou através de uma porção vinculadora, por exemplo, um grupoC1-C12 divalente, em que um ou mais átomos de carbono podem sersubstituídos por um heteroátomo, por exemplo, oxigênio, nitrogênio ouenxofre. Porções vinculadoras adequadas incluem, por exemplo, tetraetilenoglicol, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- e -CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH-NH-. Agentes de modificação que compreendem uma porçãovinculadora podem ser produzidos, por exemplo, por reação de uma mono-Boc-alquildiamina (por exemplo, mono-Boc-etilenodiamina, mono-Boc-diaminohexano) com um ácido graxo na presença de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) para formar uma ligação amida entrea amina livre e o carboxilato de ácido graxo. O grupo de proteção Boc podeser removido do produto por tratamento com ácido trifluoracético (TFA) paraexpor uma amina primária que pode ser acoplada a outro carboxilato, comodescrito, ou pode ser reagido com anidrido maléico e o produto resultanteciclizado para produzir um derivado maleimido ativado do ácido graxo (veja,por exemplo, Thompson, e al., WO 92/16221, cujos ensinamentos são aquiintegralmente incorporados por referência).
Os anticorpos modificados da invenção podem ser produzidosreagindo-se um anticorpo humano ou um fragmento de ligação de antígenocom um agente de modificação. Por exemplo, as porções orgânicas podemser ligadas ao anticorpo de uma forma não sítio-específica pelo emprego deum agente de modificação reativo à amina, por exemplo, um éster de NHSde PEG. Anticorpos humanos ou fragmentos de ligação de antígenomodificados também podem ser preparados pela redução de ligaçõesbissulfeto (por exemplo, ligações bissulfeto intracadeia) de um anticorpo oufragmento de ligação de antígeno. O anticorpo ou fragmento de ligação deantígeno reduzido pode então ser reagido com um agente de modificaçãoreativo ao tiol para produzir o anticorpo modificado da invenção. Anticorposhumanos e fragmentos de ligação de antígeno modificados quecompreendem uma porção orgânica que está ligada a sítios específicos deum anticorpo da presente invenção podem ser preparados com o uso demétodos adequados como, por exemplo, proteólise reversa (Fisch e al.,Bioconjugate Chem., 3: 147-153 (1992); Werlen e al., Bioconjugate Chem.,5: 411-417 (1994); Kumaran e al., Protein Sei. 6(10): 2.233-2.241 (1997);Itoh e al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas e al., Biotechnol.Bioeng., 56(4): 456-463 (1997)) e os métodos descritos em Hermanson,G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996).Anticorpos antiidiótipo para as composições de anticorpo anti-IL-6
Além dos anticorpos monoclonais anti-IL-6, a presente invençãotambém é dirigida a um anticorpo antiidiotípico (anti-ld) específico para osanticorpos da invenção. Um anticorpo anti-ld é um anticorpo que reconhecedeterminantes únicos geralmente associados à região de ligação deantígeno de outro anticorpo. O anti-ld pode ser preparado por imunização deum animal da mesma espécie e tipo genético (por exemplo, cepa decamundongo) que a fonte do anticorpo Id com o anticorpo, ou uma regiãoque contém a CDR deste. O animal imunizado reconhecerá e responderáaos determinantes idiotípicos do anticorpo imunizante e produzirá umanticorpo anti-ld. O anticorpo anti-ld também pode ser usado como um"imunógeno" para induzir uma resposta imunológica ainda em outro animal,produzido o chamado anticorpo anti-anti-ld.
A presente invenção também fornece pelo menos umacomposição de anticorpo anti-IL-6 que compreende pelo menos um, pelomenos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelomenos seis ou mais anticorpos anti-IL-6 deste, como aqui descrito e/oucomo conhecido na técnica, que são fornecidos em uma composição,mistura ou forma de ocorrência não-natural. Tais composiçõescompreendem composições de ocorrência não-natural compostas de pelomenos uma ou duas variantes, domínios, fragmentos ou variantesespecificadas de comprimento total, eliminadas no terminal C e/ou N, daseqüência de aminoácidos do anticorpo anti-IL-6 selecionada do grupo queconsiste em 70-100% dos aminoácidos contíguos dos IDS. DE SEQ. Nos: 1-114 e 116-138, ou fragmentos especificados, domínios ou variantes destas.Composições preferidas de anticorpo anti-IL-6 incluem pelo menos um oudois fragmentos, domínios ou variantes de comprimento total, como pelomenos uma CDR ou porções contendo LBP da seqüência do anticorpo anti-IL-6 aqui descrita, por exemplo, 70-100% dos IDS. DE SEQ. Nos: 15, 27, 35,47, 61 e 91, ou fragmentos especificados, domínios ou variantes desta.Composições adicionalmente preferidas compreendem, por exemplo, 40-99% de pelo menos um de 70-100% dos IDS. DE SEQ. Nos: 93, 95, 97, 99,101, 103 etc, ou fragmentos especificados, domínios ou variantes destes.Essas percentagens da composição são por peso, volume, concentração,molaridade ou molalidade, como soluções líquidas ou secas, misturas,suspensão, emulsões, partículas, pó ou colóides, como conhecido na técnicaou como aqui descrito.
Composições de anticorpos que compreendemingredientes terapeuticamente ativos adicionais
As composições de anticorpo da invenção podemopcionalmente ainda compreender uma quantidade eficaz de pelo menos umcomposto ou uma proteína selecionada de pelo menos um entre um fármacoantiinfeccioso, um fármaco do sistema cardiovascular (CV), um fármaco dosistema nervoso central (SNC), um fármaco do sistema nervoso autônomo(SNA), um fármaco do trato respiratório, um fármaco do trato gastrointestinal(Gl), um fármaco hormonal, um fármaco para o equilíbrio hidro-eletrolítico,um fármaco hematológico, um antineoplásico, um fármaco deimunomodulação, um fármaco oftálmico, óptico ou nasal, um fármaco tópico,um fármaco nutritivo, ou semelhantes. Esses fármacos são bem-conhecidosna técnica, incluindo formulações, indicações, dosagem e administraçãopara cada um deles aqui apresentado (veja, por exemplo, "Nursing 2001Handbook of Drugs", 21 - edição, Springhouse Corp., Springhouse, PA,2001; "Health Professional's Drug Guide" 2001, ed., Shannon, Wilson,Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ; "PharmacotherapyHandbook", Wells e ai, ed., Appleton & Lange, Stamford, CT, cada um delesaqui incorporado por referência em sua totalidade).
O fármaco antiinfeccioso pode ser pelo menos um selecionadode amebicidas ou pelo menos um de antiprotozoários, anti-helmínticos,antifúngicos, antimaláricos, antituberculosos ou pelo menos um deantilepróticos, aminoglicosídeos, penicilinas, cefalosporinas, tetraciclinas,sulfonamidas, fluorquinolonas, antivirais, antiinfecciosos macrolídicos eantiinfecciosos diversos. O fármaco do CV pode ser pelo menos umselecionado de inotrópicos, antiarrítmicos, antianginosos, anti-hipertensivos,antilipêmicos, e farmacos cardiovasculares diversos. O fármaco do SNCpode ser pelo menos um selecionado de analgésicos não-narcóticos ou pelomenos um selecionado de antipiréticos, farmacos antiinflamatórios não-esteróides, narcótico ou pelo menos um de analgésico opióide, sedativos-hipnóticos, anticonvulsivantes, antidepressivos, farmacos ansiolíticos,antipsicóticos, estimulantes do sistema nervoso central, antiparkinsonianos efarmacos do sistema nervoso central diversos. O fármaco do SNA pode serpelo menos um selecionado de colinérgicos (parassimpaticomiméticos),anticolinérgicos, adrenérgicos (simpaticomiméticos), bloqueadoresadrenérgicos (simpaticolíticos), relaxantes de músculo esquelético ebloqueadores neuromusculares. O fármaco do trato respiratório pode serpelo menos um selecionado de anti-histamínicos, broncodilatadores,expectorantes ou pelo menos um de antitussígeno, e farmacos respiratóriosdiversos. O fármaco do trato Gl pode ser pelo menos um selecionado deantiácidos ou pelo menos um de adsorvente ou pelo menos um de farmacosantiflatulência, enzima digestiva ou pelo menos um de solubilizante de litíasebiliar, antidiarréicos, laxantes, antieméticos e farmacos antiulcerosos. Ofármaco hormonal pode ser pelo menos um selecionado de corticosteróides,androgênios ou pelo menos um de esteróide anabólico, estrogênio ou pelomenos um de progesterona, gonadotrofina, fármaco antidiabético ou pelomenos um de glucagon, hormônio tireoidiano, antagonista do hormôniotireoidiano, hormônio hipofisário e fármaco semelhante ao hormônio daparatireóide. O fármaco para equilíbrio hidro-eletrolítico pode ser pelo menosum selecionado de diuréticos, eletrólito ou pelo menos um de solução dereposição, acidificante ou pelo menos um alcalinizante. O fármacohematológico pode ser pelo menos um selecionado de hematínicos,anticoagulantes, derivados do sangue e enzimas trombolíticas. Osantineoplásicos podem ser pelo menos um selecionado de farmacosalquilantes, antimetabólitos, antineoplásicos antibióticos, antineoplásicos quealteram o equilíbrio hormonal, e antineoplásicos diversos. O fármaco deimunomodulação pode ser pelo menos um selecionado deimunossupressores, vacinas ou pelo menos um de toxóide, antitoxina oupelo menos um de antídoto, soro imune e modificador da resposta biológica.Os fármacos oftálmicos, ópticos e nasais podem ser pelo menos umselecionado de antiinfecciosos oftálmicos, antiinflamatórios oftálmicos,mióticos, midriáticos, vasoconstrictores oftálmicos, fármacos oftálmicos,ópticos e nasais diversos. O fármaco tópico pode ser pelo menos umselecionado de antiinfecciosos locais, escabicidas ou pelo menos um depediculicida ou corticosteróide tópico. O fármaco nutritivo pode ser pelomenos um selecionado de vitaminas, minerais ou energéticos. Veja, porexemplo, o conteúdo de Nursing 2001 Drug Handbook, supra.
Aquele pelo menos um amebicida ou antiprotozoário pode serpelo menos um selecionado de atovaquona, cloridrato de cloroquina, fosfatode cloroquina, metronidazol, cloridrato de metronidazol e isotionato depentamidina. Aquele pelo menos um anti-helmíntico pode ser pelo menosum selecionado de mebendazol, pamoato de pirantel e tiabendazol. Aquelepelo menos um antifúngico pode ser pelo menos um selecionado deanfotericina B, complexo de colesteril sulfato de anfotericina B, complexolipídico de anfotericina B, anfotericina B lipossômica, fluconazol, flucitosina,griseofulvina micronizada, griseofulvina ultramicronizada, itraconazol,cetoconazol, nistatina e cloridrato de terbinafina. Aquele pelo menos umantimalárico pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato decloroquina, fosfato de cloroquina, doxiciclina, sulfato de hidroxicloroquina,cloridrato de mefloquina, fosfato de primaquina, pirimetamina e pirimetaminacom sulfadoxina. Aquele pelo menos um antituberculoso ou antilepróticopode ser pelo menos um selecionado de clofazimina, cicloserina, dapsona,cloridrato de etambutol, isoniazida, pirazinamida, rifabutina, rifampina,rifapentina, e sulfato de estreptomicina. Aquele pelo menos umaminoglicosídeo pode ser pelo menos um selecionado de sulfato deamicacina, sulfato de gentamicina, sulfato de neomicina, sulfato deestreptomicina e sulfato de tobramicina. Aquela pelo menos uma penicilinapode ser pelo menos uma selecionada de amoxicilina/clavulanato potássico,trihidrato de amoxicilina, ampicilina, ampicilina sódica, trihidrato deampicilina, ampicilina sódica/sulbactam sódico, cloxacilina sódica,dicloxacilina sódica, mezlocilina sódica, nafcilina sódica, oxacilina sódica,penicilina G benzatina, penicilina G potássica, penicilina G procaína,penicilina G sódica, penicilina V potássica, piperacilina sódica, piperacilinasódica/tazobactam sódico, ticarcilina dissódica e ticarcilinadissódica/clavulanato potássico. Aquela pelo menos uma cefalosporina podeser pelo menos uma selecionada de ceíaclor, cefadroxil, cefazolina sódica,cefdinir, cloridrato de cefepima, cefixima, cefmetazol sódico, cefonicidsódico, cefoperazona sódica, cefotaxima sódica, cefotetan dissódico,cefoxitina sódica, cefpodoxima proxetil, cefprozil, ceftazidima, ceftibuteno,ceftizoxima sódica, ceftriaxona sódica, cefuroxima axetil, cefuroxima sódica,cloridrato de cefalexina, monohidrato de cefalexina, cefradina e loracarbef.Aquela pelo menos uma tetraciclina pode ser pelo menos uma selecionadade cloridrato de demeclociclina, doxiciclina cálcica, hiclato de doxiciclina,cloridrato de doxiciclina, monohidrato de doxiciclina, cloridrato de minociclinae cloridrato de tetraciclina. Aquela pelo menos uma sulfonamida pode serpelo menos uma selecionada de co-trimoxazol, sulfadiazina, sulfametoxazol,sulfisoxazol e sulfisoxazol acetila. Aquela pelo menos uma fluorquinolonapode ser pelo menos uma selecionada de mesilato de alatrofloxacina,ciprofloxacina, enoxacina, levofloxacina, cloridrato de lomefloxacina, ácidonalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina e mesilato detrovafloxacina. Aquela pelo menos uma fluorquinolona pode ser pelo menosuma selecionada de mesilato de alatrofloxacina, ciprofloxacina, enoxacina,levofloxacina, cloridrato de lomefloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina,ofloxacina, esparfloxacina e mesilato de trovafloxacina. Aquele pelo menosum antiviral pode ser pelo menos um selecionado de sulfato de abacavir,aciclovir sódico, cloridrato de amantadina, amprenavir, cidofovir, mesilato dedelavirdina, didanosina, efavirenz, famciclovir, fomivirsen sódico, foscarnetsódico, ganciclovir, sulfato de indinavir, lamivudina, lamivudina/zidovudina,mesilato de nelfinavir, nevirapina, fosfato de oseltamivir, ribavirina, cloridratode rimantadina, ritonavir, saquinavir, mesilato de saquinavir, estavudina,cloridrato de valaciclovir, zalcitabina, zanamivir e zidovudina. Aquele pelomenos um antiinfeccioso macrolídico pode ser pelo menos um selecionadode azitromicina, claritromicina, diritromicina, base de eritromicina, estolato deeritromicina, etilsuccinato de eritromicina, lactobionato de eritromicina eestearato de eritromicina. Aquele pelo menos um antiinfeccioso diverso podeser pelo menos um selecionado de aztreonam, bacitracina, cloranfenicol desuccinato sódio, cloridrato de clindamicina, palmitato cloridrato declindamicina, fosfato de clindamicina, imipenem e cilastatina sódica,meropenem, macrocristais de nitrofurantoína, microcristais denitrofurantoína, quinupristina/dalfopristina, cloridrato de espectinomicina,trimetoprim e cloridrato de vancomicina (veja, por exemplo, pp. 24-214 deNursing 2001 Drug Handbook).
Aquele pelo menos um inotrópico pode ser pelo menos umselecionado de lactato de amrinona, digoxina e lactato de milrinona. Aquelepelo menos um antiarrítmico pode ser pelo menos um selecionado deadenosina, cloridrato de amiodarona, sulfato de atropina, tosilato de bretílio,cloridrato de diltiazem, disopiramida, fosfato de disopiramida, cloridrato deesmolol, acetato de flecainida, fumarato de ibutilida, cloridrato lidocaína,cloridrato de mexiletina, cloridrato de moricizina, fenitoína, fenitoína sódica,cloridrato de procainamida, cloridrato de propafenona, cloridrato depropranolol, bissulfato de quinidina, gluconato de quinidina, poligalacturonatode quinidina, sulfato de quinidina, sotalol, cloridrato de tocainida e cloridratode verapamil. Aquele pelo menos um antianginoso pode ser pelo menos umselecionado de besilato de amlodipidina, nitrito de amila, cloridrato debepridil, cloridrato de diltiazem, dinitrato de isosorbida, mononitrato deisosorbida, nadolol, cloridrato de nicardipina, nifedipina, nitroglicerina,cloridrato de propranolol, verapamil e cloridrato de verapamil. Aquele pelomenos um anti-hipertensivo pode ser pelo menos um selecionado decloridrato de acebutolol, besilato de amlodipina, atenolol, cloridrato debenazepril, cloridrato de betaxolol, fumarato de bisoprolol, candesartancilexetil, captopril, cloridrato de carteolol, carvedilol, clonidina, cloridrato declonidina, diazóxido, cloridrato de diltiazem, mesilato de doxazosina,enalaprilat, maleato de enalapril, mesilato de eprosartan, felodipina, mesilatode fenoldopam, fosinopril sódico, acetato de guanabenz, sulfato deguanadrel, cloridrato de guanfacina, cloridrato de hidralazina, irbesartan,Isradipina, cloridrato de labetalol, lisinopril, losartan potássico, metildopa,cloridrato de metildopato, succinato de metoprolol, tartarato de metoprolol,minoxidil, cloridrato de moexipril, nadolol, cloridrato de nicardipina,nifedipina, nisoldipina, nitroprussiato de sódio, sulfato de penbutolol,perindopril erbumina, mesilato de fentolamina, pindolol, cloridrato deprazosin, cloridrato de propranolol, cloridrato de quinapril, ramipril,telmisartan, cloridrato de terazosin, maleato de timolol, trandolapril, valsartane cloridrato de verapamil. Aquele pelo menos um antilipêmico pode ser pelomenos um selecionado de atorvastatina cálcica, cerivastatina sódica,colestiramina, cloridrato de colestipol, fenofibrato (micronizado), fluvastatinasódica, gemfibrozil, lovastatina, niacina, pravastatina sódica e sinvastatina.
Aquele pelo menos um fármaco do CV diverso pode ser pelo menos umselecionado de abciximab, alprostadil, cloridrato de arbutamina, cilostazol,bissulfato de clopidogrel, dipiridamol, eptifibatida, cloridrato de midodrina,pentoxifilina, cloridrato de ticlopidina e cloridrato de tirofiban (veja, porexemplo, pp. 215-336 de Nursing 2001 Drug Handbook).
Aquele pelo menos um analgésico não-narcótico ou antipiréticopode ser pelo menos um selecionado de acetaminofeno, aspirina,trissalicilato de colina magnésio, diflunisal e salicilato de magnésio. Aquelepelo menos um fármaco antiinflamatório não-esteróide pode ser pelo menosum selecionado de celecoxib, diclofenaco potássico, diclofenaco sódico,etodolac, fenoprofeno cálcico, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina,trihidrato de indometacina sódica, cetoprofeno, cetorolac de trometamina,nabumetona, naproxeno, naproxeno sódico, oxaprozina, piroxicam, rofecoxibe sulindac. Aquele pelo menos um narcótico ou analgésico opióide pode serpelo menos um selecionado de cloridrato de alfentanila, cloridrato debuprenorfina, tartarato de butorfanol, fosfato de codeína, sulfato de codeína,citrato de fentanil, sistema transdérmico de fentanil, fentanil transmucoso,cloridrato de hidromorfona, cloridrato de meperidina, cloridrato de metadona,cloridrato de morfina, sulfato de morfina, tartarato de morfina, cloridrato denalbufina, cloridrato de oxicodona, pectinato de oxicodona, cloridrato deoximorfona, cloridrato de pentazocina, cloridrato de pentazocina e cloridratode naloxona, lactato de pentazocina, cloridrato de propoxifeno, napsilato depropoxifeno, cloridrato de remifentanil, citrato de sufentanil e cloridrato detramadol. Aquele pelo menos um sedativo-hipnótico pode ser pelo menosum selecionado de hidrato de cloral, estazolam, cloridrato de flurazepam,pentobarbital, pentobarbital sódico, fenobarbital sódico, secobarbital sódico,temazepam, triazolam, zaleplon e tartarato de zolpidem. Aquele pelo menosum anticonvulsivante pode ser pelo menos um selecionado deacetazolamida sódica, carbamazepina, clonazepam, clorazepato dipotássico,diazepam, divalproex sódico, etossuximida, fosfenitoína sódica, gabapentina,lamotrigina, sulfato de magnésio, fenobarbital, fenobarbital sódico, fenitoína,fenitoína sódica, fenitoína sódica (prolongada), primidona, cloridrato detiagabina, topiramato, valproato sódico e ácido valpróico. Aquele pelo menosum antidepressivo pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato deamitriptilina, pamoato de amitriptilina, amoxapina, cloridrato de bupropion,bromidrato de citalopram, cloridrato de clomipramina, cloridrato dedesipramina, cloridrato de doxepina, cloridrato de fluoxetina, cloridrato deimipramina, pamoato de imipramina, mirtazapina, cloridrato de nefazodona,cloridrato de nortriptilina, cloridrato de paroxetina, sulfato de fenelzina,cloridrato de sertralina, sulfato de tranilcipromina, maleato de trimipramina ecloridrato de venlafaxina. Aquele pelo menos um fármaco ansiolítico podeser pelo menos um selecionado de alprazolam, cloridrato de buspirona,clordiazepóxido, cloridrato de clordiazepóxido, clorazepato dipotássico,diazepam, cloridrato de doxepina, embonato de hidroxizina, cloridrato dehidroxizina, pamoato de hidroxizina, lorazepam, meprobamato, cloridrato demidazolam e oxazepam. Aquele pelo menos um fármaco antipsicótico podeser pelo menos um selecionado de cloridrato de clorpromazina, clozapina,decanoato de flufenazina, enantato de flufenazina, cloridrato de flufenazina,haloperidol, decanoato de haloperidol, lactato de halpperidol, cloridrato deloxapina, succinato de loxapina, besilato de mesoridazina, cloridrato demolindona, olanzapina, perfenazina, pimozida, proclorperazina, fumarato dequetiapina, risperidona, cloridrato de tioridazina, tiotixeno, cloridrato detiotixeno e cloridrato de trifluoperazina. Aquele pelo menos um estimulantedo sistema nervoso central pode ser pelo menos um selecionado de sulfatode anfetamina, cafeína, sulfato de dextroanfetamina, cloridrato de doxapram,cloridrato de metanfetamina, cloridrato de metilfenidato, modafinil, pemolinae cloridrato de fentermina. Aquele pelo menos um antiparkinsoniano podeser pelo menos um selecionado de cloridrato de amantadina, mesilato debenztropina, cloridrato de biperideno, lactato de biperideno, mesilato debromocriptina, carbidopa-levodopa, entacapona, levodopa, mesilato depergolida, dicloridrato de pramipexol, cloridrato de ropinirol, cloridrato deselegilina, tolcapona e cloridrato trihexifenidil. Aquele pelo menos umfármaco do sistema nervoso central diverso pode ser pelo menos umselecionado de cloridrato de bupropiona, cloridrato de donepezil, droperidol,maleato de fluvoxamina, carbonato de lítio, citrato de lítio, cloridrato denaratriptano, poliacrilex de nicotina, sistema transdérmico de nicotina,propofol, benzoato de rizatriptano, cloridrato monohidrato de sibutramina,succinato sumatriptano, cloridrato de tacrina e zolmitriptano (veja, porexemplo, pp. 337-530 de Nursing 2001 Drug Handbook).
Aquele pelo menos um colinérgico (por exemplo,parassimpaticomimético) pode ser pelo menos um selecionado de cloreto debetanecol, cloreto de edrofônio, brometo de neostigmina, metilsulfato deneostigmina, salicilato de fisostigmina e brometo de piridostigmina. Aquelepelo menos um anticolinérgico pode ser pelo menos um selecionado desulfato de atropina, cloridrato de diciclomina, glicopirrolato, hiosciamina,sulfato de hiosciamina, brometo de propantelina, escopolamina, butilbrometode escopolamina e bromidrato de escopolamina. Aquele pelo menos umadrenérgico (simpaticomiméticos) pode ser pelo menos um selecionado decloridrato de dobutamina, cloridrato de dopamina, bitartarato de metaraminol,bitartarato de norepinefrina, cloridrato de fenilefrina, cloridrato depseudoefedrina e sulfato de pseudoefedrina. Aquele pelo menos umbloqueador adrenérgico (simpaticolítico) pode ser pelo menos umselecionado de mesilato de diidroergotamina, tartarato de ergotamina,maleato de metisergida e cloridrato de propranolol. Aquele pelo menos umrelaxante de músculo esquelético pode ser pelo menos um selecionado debaclofeno, carisoprodol, clorzoxazona, cloridrato de ciclobenzaprina,dantroleno sódico, metocarbamol e cloridrato de tizanidina. Aquele pelomenos um bloqueador neuromuscular pode ser pelo menos um selecionadode besilato de atracúrio, besilato de cisatracúrio, cloreto de doxacúrio,cloreto de mivacúrio, brometo de pancurônio, brometo de pipecurônio,brometo de rapacurônio, brometo de rocurônio, cloreto de succinilcolina,cloreto de tubocurarina e brometo de vecurônio (veja, por exemplo, pp. 531-84 de Nursing 2001 Drug Handbook).
Aquele pelo menos um anti-histamínico pode ser pelo menosum selecionado de maleato de bronfeniramina, cloridrato de cetirizina,maleato de clorfeniramina, fumarato de clemastina, cloridrato deciproheptadina, cloridrato de difenidramina, cloridrato de fexofenadina,loratadina, cloridrato de prometazina, teoclato de prometazina e cloridrato detriprolidina. Aquele pelo menos um broncodilatador pode ser pelo menos umselecionado de albuterol, sulfato de albuterol, aminofilina, sulfato de atropina,sulfato de efedrina, epinefrina, bitartarato de epinefrina, cloridrato deepinefrina, brometo de ipratrópio, isoproterenol, cloridrato de isoproterenol,sulfato de isoproterenol, cloridrato de levalbuterol, sulfato de metaproterenol,oxtrifilina, acetato de pirbuterol, xinafoato de salmeterol, sulfato deterbutalina e teofilina. Aquele pelo menos um expectorante ou antitussígenopode ser pelo menos um selecionado de benzonatato, fosfato de codeína,sulfato de codeína, bromidrato de dexotrametorfano, cloridrato dedifenhidramina, guaifenesina e cloridrato de hidromorfona. Aquele pelomenos um fármaco respiratório diverso pode ser pelo menos um selecionadode acetilcisteína, dipropionato de beclometasona, beractant, budesonida,calfactant, cromolina sódica, dornase alfa, epoprostenol sódico, flunisolida,propionato de fluticasona, montelucast tsódico, nedocromil sódico,palivizumab, triamcinolona acetonida, zafirlucast e zileuton (veja, porexemplo, pp. 585-642 de Nursing 2001 Drug Handbook).
Aquele pelo menos um fármaco antiácido, adsorvente ouantiflatulência pode ser pelo menos um selecionado de carbonato dealumínio, hidróxido de alumínio, carbonato de cálcio, magaldrato, hidróxidode magnésio, oxido de magnésio, simeticona e bicarbonato de sódio. Aquelapelo menos uma enzima digestiva ou solubilizante de litíase biliar pode serpelo menos uma selecionada de pancreatina, pancrelipase e ursodiol.
Aquele pelo menos um antidiarreico pode ser pelo menos um selecionado deatapulgita, subsalicilato de bismuto, policarbofil de cálcio, diíenoxilatocloridrato e sulfato de atropina, loperamida, acetato de octreotida, tintura deópio e tintura de ópio (canforada). Aquele pelo menos um laxante pode serpelo menos um selecionado de bisocodil, policarbofil de cálcio, cascarasagrada, extrato líquido aromático de cascara sagrada, extrato líquido decascara sagrada, óleo de rícino, docusato de cálcio, docusato de sódio,glicerina, lactulose, citrato de magnésio, hidróxido de magnésio, sulfato demagnésio, metilcelulose, óleo mineral, polietileno glicol ou solução deeletrólitos, psílio, sena e fosfatos de sódio. Aquele pelo menos umantiemético pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato declorpromazina, dimenidrinato, mesilato de dolasetron, dronabinol, cloridratode granisetron, cloridrato de meclizina, cloridrato de metoclopramida,cloridrato de ondansetron, perfenazina, proclorperazina, edisilato deproclorperazina, maleato de proclorperazina, cloridrato de prometazina,escopolamina, maleato de tietilperazina e cloridrato de trimetobenzamida.
Aquele pelo menos um fármaco antiulceroso pode ser pelo menos umselecionado de cimetidina, cloridrato de cimetidina, famotidina, lansoprazol,misoprostol, nizatidina, omeprazol, rabeprozol sódico, citrato de ranitidinabismuto, cloridrato de ranitidina e sucralfato (veja, por exemplo, pp. 643-95de Nursing 2001 Drug Handbook).
Aquele pelo menos um corticosteróide pode ser pelo menos umselecionado de betametasona, acetato de betametasona ou fosfato debetametasona sódica, fosfato de betametasona sódica, acetato de cortisona,dexametasona, acetato de dexametasona, fosfato de dexametasona sódica,acetato de fludrocortisona, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona,cipionato de hidrocortisona, fosfato de hidrocortisona sódica, succinato dehidrocortisona sódica, metilprednisolona, acetato de metilprednisolona,succinato de metilprednisolona sódica, prednisolona, acetato deprednisolona, fosfato de prednisolona sódica, tebutato de prednisolona,prednisona, triamcinolona, triamcinolona acetonida e diacetato detriamcinolona. Aquele pelo menos um androgênio ou esteróide anabólicopode ser pelo menos um selecionado de danazol, fluoximesterona,metiltestosterona, decanoato de nandrolona, fenpropionato de nandrolona,testosterona, cipionato de testosterona, enantato de testosterona, propionatode testosterona e sistema transdérmico de testosterona. Aquele pelo menosum estrogênio ou progesterona pode ser pelo menos um selecionado deestrogênios esterificados, estradiol, cipionato de estradiol, sistematransdérmico de estradiol/acetato de noretindrona, valerato de estradiol,estrogênios (conjugados), estropipato, etinil estradiol, etinil estradiol edesogestrel, etinil estradiol e diacetato de etinodiol, etinil estradiol edesogestrel, etinil estradiol e diacetato de etinodiol, etinil estradiol elevonorgestrel, etinil estradiol e noretindrona, etinil estradiol e acetato denoretindrona, etinil estradiol e norgestimato, etinil estradiol e norgestrel, etinilestradiol e noretindrona e acetato e fumarato terroso, levonorgestrel, acetatode medroxiprogesterona, mestranol e noretindrona, noretindrona, acetato denoretindrona, norgestrel e progesterona. Aquela pelo menos umagonadotrofina pode ser pelo menos uma selecionada de acetato de ganirelix,acetato de gonadorelina, acetato de histrelina e menotropinas. Aquele pelomenos um antidiabético ou glucagon pode ser pelo menos um selecionadode acarbose, clorpropamida, glimepirida, glipizida, glucagon, gliburida,insulinas, cloridrato de metformin, miglitol, cloridrato de pioglitazona,repaglinida, maleato de rosiglitazona e troglitazona. Aquele pelo menos umhormônio tireoidiano pode ser pelo menos um selecionado de levotiroxinasódica, liotironina sódica, liotrix e tiróide. Aquele pelo menos um antagonistado hormônio tireoidiano pode ser pelo menos um selecionado de metimazol,iodeto de potássio, iodeto de potássio (solução saturada), propiltiouracil, iodoradioativo (iodeto de sódio I131) e solução forte de iodo. Aquele pelo menosum hormônio hipofisário pode ser pelo menos um selecionado decorticotropina, cosintropina, acetato de desmopressina, acetato deleuprolida, corticotropina de depósito, somatrem, somatropina evasopressina. Aquele pelo menos um fármaco semelhante ao hormônio daparatireóide pode ser pelo menos um selecionado de calcifediol, calcitonina(humana), calcitonina (de salmão), calcitriol, diidrotaquisterol e etidronatodissódico (veja, por exemplo, pp. 696-796 de Nursing 2001 Drug Handbook).
Aquele pelo menos um diurético pode ser pelo menos umselecionado de acetazolamida, acetazolamida sódica, cloridrato deamilorida, bumetanida, clortalidona, etacrinato sódico, ácido etacrínico,furosemida, hidroclorotiazida, indapamida, manitol, metolazona,espironolactona, torsemida, triamtereno e uréia. Aquela pelo menos umasolução eletrolítica ou de reposição pode ser pelo menos uma selecionadade acetato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio,glubionato de cálcio, gluceptato de cálcio, gluconato de cálcio, cálcio lactato,fosfato de cálcio (dibásico), fosfato de cálcio (tribásico), dextrana (alto pesomolecular), dextrana (baixo peso molecular), hetamido, cloreto de magnésio,sulfato de magnésio, acetato de potássio, bicarbonato de potássio, cloretode potássio, gluconato de potássio, solução de Ringer, solução de Ringer(com lactato) e cloreto de sódio. Aquele pelo menos um acidificante oualcalinizante pode ser pelo menos um selecionado de bicarbonato de sódio,lactato de sódio e trometamina (veja, por exemplo, pp. 797-833 de Nursing2001 Drug Handbook).
Aquele pelo menos um hematínico pode ser pelo menos umselecionado de fumarato ferroso, gluconato ferroso, sulfato ferroso, sulfatoferroso (seco), dextrana férrica, sorbitol férrico, complexo polissacarídeo-ferro e complexo sódio-gluconato férrico. Aquele pelo menos umanticoagulante pode ser pelo menos um selecionado de ardeparina sódica,dalteparina sódica, danaparóide sódico, enoxaparina sódica, heparinacálcica, heparina sódica e warfarin sódico. Aquele pelo menos um derivadodo sangue pode ser pelo menos um selecionado de albumina 5%, albumina25%, fator anti-hemofílico, complexo coagulante antiinibidor, antitrombina III(humana), fator IX (humano), complexo do fator IX e frações de proteínasplasmáticas. Aquela pelo menos uma enzima trombolítica pode ser pelomenos uma selecionada de alteplase, anistreplase, reteplase(recombinante), estreptoquinase e uroquinase (veja, por exemplo, pp. 834-66 de Nursing 2001 Drug Handbook).
Aquele pelo menos um fármaco alquilante pode ser pelo menosum selecionado de bussulfan, carboplatina, carmustina, clorambucil,cisplatina, ciclofosfamida, ifosfamida, lomustina, cloridrato de mecloretamina,melfalan, cloridrato de melfalan, estreptozocina, temozolomida e tiotepa.Aquele pelo menos um antimetabólito pode ser pelo menos um selecionadode capecitabina, cladribina, citarabina, floxuridina, fosfato de fludarabina,fluoruracil, hidroxiuréia, mercaptopurina, metotrexato, metotrexato sódico etioguanina. Aquele pelo menos um antineoplásico antibiótico pode ser pelomenos um selecionado de sulfato de bleomicina, dactinomicina, citrato dedaunorrubicina lipossômica, cloridrato de daunorrubicina, cloridrato dedoxorrubicina, cloridrato de doxorrubicina lipossômica, cloridrato deepirrubicina, cloridrato de idarrubicina, mitomicina, pentostatina, plicamicinae valrrubicina. Aquele pelo menos um antineoplásico que altera o equilíbriohormonal pode ser pelo menos um selecionado de anastrozol, bicalutamida,fosfato sódico de estramustina, exemestano, flutamida, acetato degoserelina, letrozol, acetato de leuprolida, acetato de megestrol, nilutamida,citrato de tamoxifeno, testolactona e citrato de toremifeno. Aquele pelomenos um antineoplásico diverso pode ser pelo menos um selecionado deasparaginase, bacilo de Calmette-Guerin (BCG) (intravesical vivo),dacarbazina, docetaxel, etoposida, fosfato de etoposida, cloridrato degemcitabina, cloridrato de irinotecan, mitotano, cloridrato de mitoxantrona,paclitaxel, pegaspargase, porfimer sódico, cloridrato de procarbazina,rituximab, teniposida, cloridrato de topotecan, trastuzumab, tretinoína, sulfatode vinblastina, sulfato de vincristina e tartarato de vinorelbina (veja, porexemplo, pp. 867-963 of Nursing 2001 Drug Handbook).
Aquele pelo menos um imunossupressor pode ser pelo menosum selecionado de azatioprina, basiliximab, ciclosporina, daclizumab,imunoglobulina linfocitária, muromonab-CD3, micofenolato mofetil, cloridratode micofenolato mofetil, sirolimus e tacrolimus. Aquela pelo menos umavacina ou toxóide pode ser pelo menos uma selecionada de vacina de BCG,vacina da cólera, toxoides difterico e tetânico (adsorvidos), toxoides diftericoe tetânico e vacina adsorvida acelular de pertussis, toxoides difterico etetânico e vacina de pertussis de célula inteira, vacinas conjugadas deHaemophilus b, vacina de hepatite A (inativada), vacina de hepatite B(recombinante), vacina do vírus da influenza trivalente dos tipos A & B de1999-2000 (antígeno de superfície purificado), vacina do vírus da influenzatrivalente dos tipos A & B de 1999-2000 (subvírion ou subvírion purificado),vacina do vírus da influenza trivalente dos tipos A & B de 1999-2000 (vírioninteiro), vacina do vírus da encefalite japonesa (inativado), vacina da doençade Lyme (OspA recombinante), vacina do vírus do sarampo e caxumba erubéola (vivo), vacina do vírus do sarampo e caxumba e rubéola (vivoatenuado), vacina do vírus do sarampo (vivo atenuado), vacina depolissacarídeo meningocócico, vacina do vírus caxumba (vivo), vacina dapraga, vacina pneumocócica (polivalente), vacina do vírus da pólio(inativado), vacina do vírus da pólio (vivo, oral, trivalente), vacina da raiva(adsorvido), vacina da raiva (célula diplóide humana), vacina do vírus darubéola e caxumba (vivo), vacina do vírus da rubéola (vivo, atenuado),toxóide tetânico (adsorvido), toxóide tetânico (líquido), vacina tifóide (oral),vacina tifóide (parenteral), vacina tifóide de polissacarídeo Vi, vacina do vírusda varicela e vacina da febre amarela. Aquela pelo menos uma antitoxina ouantídoto pode ser pelo menos uma selecionado de antídoto da aranha viúvanegra, antídoto de Crotalidae (polivalente), antitoxina diftérica (eqüina) eantídoto de Micrurus fulvius. Aquele pelo menos um soro imune pode serpelo menos um selecionado de imunoglobulina de citomegalovírus(intravenoso), imunoglobulina de hepatite B (humana), imunoglobulinaintramuscular, imunoglobulina intravenosa, imunoglobulina da raiva(humana), imunoglobulina intravenosa do vírus sincicial respiratório(humana), imunoglobulina Rh0(D) (humana), imunoglobulina intravenosaRh0(D) (humana), imunoglobulina tetânica (humana) e imunoglobulina davaricella-zoster. Aquele pelo menos um modificador da resposta biológicapode ser pelo menos um selecionado de aldesleucina, epoetina alfa,filgrastima, acetato de glatiramer para injeção, interferon alfacon-1, interferonalfa-2a (recombinante), interferon alfa-2b (recombinante), interferon beta-1a,interferon beta-1b (recombinante), interferon gama-1b, cloridrato delevamisol, oprelvecina e sargramostim (veja, por exemplo, pp. 964-1.040 deNursing 2001 Drug Handbook).
Aquele pelo menos um antiinfeccioso oftalmico pode serselecionado de bacitracina, cloranfenicol, cloridrato de ciprofloxacina,eritromicina, sulfato de gentamicina, ofloxacina 0,3%, sulfato de polimixina B,sulfacetamida sódica 10%, sulfacetamida sódica 15%, sulfacetamida sódica30%, tobramicina e vidarabina. Aquele pelo menos um antiinflamatóriooftalmico pode ser pelo menos um selecionado de dexametasona, fosfato dedexametasona sódica, diclofenaco sódico 0,1%, fluormetolona, flurbiprofenosódico, cetorolac trometamina, acetato de prednisolona (suspensão) efosfato de prednisolona sódica (solução). Aquele pelo menos um mióticopode ser pelo menos um selecionado de cloreto de acetilcolina, carbacol(intra-ocular), carbacol (tópico), iodeto de ecotiopato, pilocarpina, cloridratode pilocarpina e nitrato de pilocarpina. Aquele pelo menos um midriáticopode ser pelo menos um selecionado de sulfato de atropina, cloridrato deciclopentolato, epinefrina cloridrato de, borato de epinefril, hidrobrometo dehomatropina, cloridrato de fenilefrina, hidrobrometo de escopolamina etropicamida. Aquele pelo menos um vasoconstrictor oftalmico pode ser pelomenos um selecionado de cloridrato de nafazolina, cloridrato deoximetazolina e cloridrato de tetrahidrozolina. Aquele pelo menos umfármaco oftalmico diverso pode ser pelo menos um selecionado de cloridratode apraclonidina, cloridrato de betaxolol, tartarato de brimonidina, cloridratode carteolol, cloridrato de dipivefrina, cloridrato de dorzolamida, difumaratode emedastina, fluoresceína sódica, fumarato de cetotifeno, latanoprost,cloridrato de levobunolol, cloridrato de metipranolol, cloreto de sódio(hipertônico) e maleato de timolol. Aquele pelo menos um fármaco ópticopode ser pelo menos um selecionado de ácido bórico, peróxido decarbamida, cloranfenicol e polipeptídeo oleato-condensado detrietanolamina. Aquele pelo menos um fármaco nasal pode ser pelo menosum selecionado de dipropionato de beclometasona, budesonida, sulfato deefedrina, cloridrato de epinefrina, flunisolida, propionato de fluticasona,cloridrato de nafazolina, cloridrato de oximetazolina, cloridrato de fenilefrina,cloridrato de tetrahidrozolina, triamcinolona acetonida e cloridrato dexilometazolina (veja, por exemplo, pp. 1.041-97 de Nursing 2001 DrugHandbook).
Aquele pelo menos um antiinfeccioso local pode ser pelo menosum selecionado de aciclovir, anfotericina B, creme de ácido azeláico,bacitracina, nitrato de butoconazol, fosfato de clindamicina, clotrimazol,nitrato de econazol, eritromicina, sulfato de gentamicina, cetoconazol,acetato de mafenida, metronidazol (tópico), nitrato de miconazol, mupirocina,cloridrato de naftifina, sulfato de neomicina, nitrofurazona, nistatina,sulfadiazina de prata, cloridrato de terbinafina, terconazol, cloridrato detetraciclina, tioconazol e tolnaftato. Aquele pelo menos um escabicida oupediculicida pode ser pelo menos um selecionado de crotamiton, lindano,permetrina e piretrinas. Aquele pelo menos um corticosteróide tópico podeser pelo menos um selecionado de dipropionato de betametasona, valeratode betametasona, propionato de clobetasol, desonida, desoximetasona,dexametasona, fosfato de dexametasona sódica, diacetato de diflorasona,fluocinolona acetonida, fluocinonida, flurandrenolida, propionato defluticasona, halcionida, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato dehidrocortisona, valerato de hidrocortisona, furoato de mometasona etriamcinolona acetonida (veja, por exemplo, pp. 1.098-1.136 de Nursing 2001Drug Handbook).
Aquela pelo menos uma vitamina ou mineral pode ser pelomenos uma selecionado de vitamina A, complexo vitamínico B,cianocobalamina, ácido fólico, hidroxocobalamina, leucovorin cálcico,niacina, niacinamida, cloridrato de piridoxina, riboflavina, cloridrato detiamina, vitamina C, vitamina D, colecalciferol, ergocalciferol, análogo devitamina D, doxercalciferol, paricalcitol, vitamina E, análogo de vitamina K,fitonadiona, fluoreto de sódio, fluoreto de sódio (tópico), microelementos,cromo, cobre, iodo, manganês, selênio e zinco. Aquele pelo menos umenergético pode ser pelo menos um selecionado de infusões de aminoácidos(cristalinas), infusões de aminoácidos em dextrose, infusões de aminoácidoscom eletrólitos, infusões de aminoácidos com eletrólitos em dextrose,infusões de aminoácidos para insuficiência hepática, infusões deaminoácidos para alto estresse metabólico, infusões de aminoácidos parainsuficiência renal, dextrose, emulsões de gordura e triglicerídeos de cadeiamédia (veja, por exemplo, pp. 1.137-63 de Nursing 2001 Drug Handbook).
As composições de anticorpo anti-IL-6 da presente invençãopodem ainda compreender pelo menos uma de qualquer quantidadeadequada e eficaz de uma composição ou composição farmacêutica quecompreende pelo menos um anticorpo anti-IL-6 em contato ou administradoa uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente que necessita de talmodulação, tratamento ou terapia, opcionalmente ainda compreendendopelo menos um selecionado de pelo menos um antagonista de TNF (porexemplo, sem limitação, um antagonista de TNF químico ou protéico,anticorpo TNF monoclonal ou policlonal ou fragmento, um receptor solúvelde TNF (por exemplo, p55, p70 ou p85) ou fragmento, polipeptídeos defusão destes, ou um antagonista de TNF de pequena molécula, por exemplo,proteína de ligação de TNF I ou II (TBP-1 ou TBP-II), nerelimonmab,infliximab, etanercept, CDP-571, CDP-870, afelimomab, lenercept esemelhantes), um anti-reumático (por exemplo, metotrexato, auranofina,aurotioglicose, azatioprina, etanercept, tiomalato de ouro sódico, sulfato dehidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalazina), um relaxante muscular, umnarcótico, um fármaco antiinflamatório não-esteróide (NSAID), umanalgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, umbloqueador neuromuscular, um antimicrobiano (por exemplo,aminoglicosídeo, um antifúngico, um antiparasitário, um antiviral, umcarbapenem, uma cefalosporina, uma fluorquinolona, um macrolídeo, umapenicilina, uma sulfonamida, uma tetraciclina, outro antimicrobiano), umantipsoriático, um corticosteróide, um esteróide anabólico, um agenterelacionado ao diabetes, um mineral, um nutritivo, um agente da tireóide,uma vitamina, um hormônio relacionado ao cálcio, um antidiarréico, umantitussígeno, um antiemético, um antiulceroso, um laxante, umanticoagulante, uma eritropoietina (por exemplo, epoetina alfa), umafilgrastima (por exemplo, G-CSF, Neupogen), uma sargramostima (GM-CSF,Leukine), uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossupressor (porexemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), um hormônio docrescimento, um fármaco de reposição hormonal, um modulador do receptorde estrogênio, um midriático, um cicloplégico, um agente alquilante, umantimetabólito, um inibidor mitótico, uma substância farmacêutica radioativa,um antidepressivo, um agente antimaníaco, um antipsicótico, um ansiolítico,um hipnótico, um simpaticomimético, um estimulante, donepezil, tacrina,uma medicação para asma, um agonista beta, um esteróide inalado, uminibidor de leucotrieno, uma metilxantina, uma cromolina, uma epinefrina ouanálogo, dornase alfa (Pulmozyme), uma citocina ou um antagonista decitocina. Exemplos não-limitantes dessas citocinas incluem, sem limitação,qualquer um de IL-1 a IL-23 (por exemplo, IL-1, IL-2 etc). Dosagensadequadas são bem-conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Wells e ai,eds., "Pharmacotherapy Handbook", 2- Edição, Appleton e Lange, Stamford,CT (2000); "PDR Pharmacopoeia", "Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000",Edição de luxo, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), cada umadessas referências sendo aqui incorporada por referência em sua totalidade.
Esses agentes anticâncer ou antiinfecciosos também podemincluir moléculas de toxina que estão associadas, ligadas, co-formuladas ouco-administradas com pelo menos um anticorpo da presente invenção. Atoxina pode opcionalmente agir para matar seletivamente a célula ou tecidopatológico. A célula patológica pode ser uma célula de câncer ou outracélula. Tais toxinas podem ser, sem limitação, toxina purificada ourecombinante ou fragmento de toxina que compreende pelo menos umdomínio funcional citotóxico de toxina, por exemplo, selecionada de pelomenos uma de ricina, toxina diftérica, uma toxina de veneno ou uma toxinabacteriana. O termo toxina também inclui tanto endotoxinas quantoexotoxinas produzidas por qualquer bactéria ou vírus de ocorrência natural,mutante ou recombinante que possam causar qualquer condição patológicaem seres humanos e em outros mamíferos, incluindo choque toxêmico, oque pode resultar em morte. Tais toxinas podem incluir, sem limitação,enterotoxina termolábil de E. coli enterotoxigênica (LT), enterotoxina termo-estável (ST), citotoxina de Shigella, enterotoxinas de Aeromonas, toxina-1 desíndrome de choque toxêmico (TSST-1), enterotoxina estafilocócica A(SEA), B (SEB) ou C (SEC), enterotoxinas estreptocócicas e semelhantes.Tais bactérias incluem, sem limitação, cepas de uma espécie de E. colienterotoxigênica (ETEC), E. coli enterohemorrágica (por exemplo, cepas dosorotipo 0157:H7), espécies de Staphylococcus (por exemplo,Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), espécies de Shigella(por exemplo, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii eShigella sonnei), espécies de Salmonella (por exemplo, Salmonella typhi,Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), espécies de Clostridium (porexemplo, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum),espécies de Camphlobacter (por exemplo, Camphlobacter jejuni,Camphlobacter fetus), espécies de Heliobacter, (por exemplo, Heliobacterpylori), espécies de Aeromonas (por exemplo, Aeromonas sóbria,Aeromonas hidrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides,Yersina enterocolitica, espécies de Vibrios (por exemplo, Vibrios cholerae,Vibrios parahemolyticus), espécies de Klebsiella, Pseudomonas aeruginosae Streptococci. Veja, por exemplo, Stein, ed., "INTERNAL MEDICINE", 3§ed., pp 1-13, Little, Brown e Co., Boston, (1990); Evans e ai, eds., "BacterialInfections of Humans: Epidemiology and Control", 2- Ed., pp 239-254,Plenum Medicai Book Co., Nova York (1991); Mandell e ai, "Principies andPractice of Infectious Diseases", 3- Ed., Churchill Livingstone, Nova York(1990); Berkow e ai, eds., The Merck Manual, 16§ edição, Merck e Co.,Rahway, N.J., 1992; Wood e ai, FEMS Microbiology Immunology, 76: 121-134 (1991); Marrack e ai, Science, 248: 705-711 (1990), cujos conteúdossão aqui incorporados por referência em sua totalidade.
Compostos, composições ou combinações de anticorpo anti-IL-6 da presente invenção podem ainda compreender pelo menos uma dequalquer substância auxiliar adequada como, por exemplo, sem limitação,diluentes, ligantes, estabilizantes, tampões, sais, solventes lipofílicos,conservantes, adjuvantes, ou semelhantes. Preferem-se auxiliaresfarmaceuticamente aceitáveis. Exemplos não-limitantes e métodos depreparação dessas soluções estéreis são bem-conhecidos na técnica como,por exemplo, sem limitação, Gennaro, Ed., Remingtoris PharmaceuticalSciences, 18* Edição, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Podem serrotineiramente selecionados veículos farmaceuticamente aceitáveis quesejam adequados ao modo de administração, solubilidade e/ou estabilidadeda composição de anticorpo anti-IL-6, fragmento ou variante, como sãoconhecidos na técnica ou como são aqui descritos.
Excipientes e aditivos farmacêuticos úteis na presentecomposição incluem, sem limitação, proteínas, peptídeos, aminoácidos,lipídeos e carboidratos (por exemplo, açúcares, incluindo monossacarídeos,di-, tri-, tetra- e oligossacarídeos; açúcares derivatizados, tais como alditóis,ácidos aldônicos, açúcares esterificados e semelhantes; e polissacarídeosou polímeros de açúcar), que podem estar presentes isoladamente ou emcombinação, que compreendem isoladamente ou em combinação 1-99,99%por peso ou volume. Excipientes protéicos exemplares incluem albuminasérica como, por exemplo, albumina sérica humana (HSA), albuminahumana recombinante (rHA), gelatina, caseína, e semelhantes.
Componentes de aminoácidos/anticorpos representativos que tambémpodem funcionar em termos de tamponamento incluem alanina, glicina,arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína, lisina,leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame, esemelhantes. Um aminoácido preferido é glicina.
Excipientes de carboidrato adequados para uso na invençãoincluem, por exemplo, monossacarídeos, tais como frutose, maltose,galactose, glicose, D-manose, sorbose, e semelhantes; dissacarídeos, taiscomo lactose, sacarose, trehalose, celobiose, e semelhantes;polissacarídeos, tais como rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranas,amidos, e semelhantes; e alditóis, tais como manitol, xilitol, maltitol, lactitol,xilitol sorbitol (glucitol), mioinositol e semelhantes. Excipientes de carboidrato65
preferidos para uso na presente invenção são manitol, trehalose e rafinose.
As composições de anticorpo anti-IL-6 também podem incluirum tampão ou um agente para ajuste do pH; tipicamente, o tampão é um salpreparado a partir de um ácido ou base orgânica. Tampões representativosincluem sais de ácido orgânico, tais como sais de ácido cítrico, ácidoascórbico, ácido glucônico, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido succínico,ácido acético ou ácido ftálico; Tris, cloridrato de trometamina ou tampõesfosfato. Tampões preferidos para uso nas presentes composições são saisde ácido orgânico como, por exemplo, citrato.
Adicionalmente, as composições de anticorpo anti-IL-6 dainvenção podem incluir excipientes/aditivos poliméricos, tais comopolivinilpirrolidonas, ficóis (um açúcar polimérico), dextratos (por exemplo,ciclodextrinas como, por exemplo, 2-hidroxipropil-p -ciclodextrina), polietilenoglicóis, agentes flavorizantes, agentes antimicrobianos, adoçantes,antioxidantes, agentes antiestáticos, tensoativos (por exemplo,polissorbatos, tais como "TWEEN 20" e "TWEEN 80"), lipídeos (porexemplo, fosfolipídeos, ácidos graxos), esteróides (por exemplo, colesterol)e agentes quelantes (por exemplo, EDTA).
Esses e adicionais excipientes e/ou aditivos farmacêuticosconhecidos adequados para uso nas composições de anticorpo anti-IL-6,porção ou variante de acordo com a invenção são conhecidos na técnica,por exemplo, como listados em "Remington: The Science & Practice ofPharmacy", 19ê ed., Williams & Williams, (1995) e em "Physician's DeskReference", 52§ ed., Medicai Economics, Montvale, NJ (1998), cujasdescritos são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. Materiaistransportadores ou excipientes preferidos são carboidratos (por exemplo,sacarídeos e alditóis) e tampões (por exemplo, citrato) ou agentespoliméricos. Uma molécula transportadora exemplar é omucopolissacarídeo, ácido hialurônico, que pode ser útil para liberação intra-articular.
Formulações
Como observado anteriormente, a invenção forneceformulações estáveis, as quais, de preferência, compreendem um tampãofosfato com soro fisiológico ou um sal escolhido, além de soluções eformulações preservadas que contêm um conservante, bem comoformulações preservadas multiuso adequadas para uso farmacêutico ouveterinário, que compreendem pelo menos um anticorpo anti-IL-6 em umaformulação farmaceuticamente aceitável. Formulações preservadas contêmpelo menos um conservante conhecido ou opcionalmente selecionado dogrupo que consiste em pelo menos um de fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol,clorocresol, álcool benzílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldeído,clorobutanol, cloreto de magnésio (por exemplo, hexahidrato),alquilparabeno (metila, etila, propila, butila e semelhantes), cloreto debenzalcônio, cloreto de benzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal,polímeros ou misturas destes em um diluente aquoso. Qualquerconcentração ou mistura adequada pode ser usada, como conhecido natécnica como, por exemplo, cerca de 0,0015%, ou qualquer faixa, valor oufração incluída. Exemplos não-limitantes incluem, sem conservante, cerca de0,1-2% de m-cresol (por exemplo, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), cerca de 0,1 -3% de álcool benzílico (por exemplo, 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), cercade 0,001-0,5% de timerosal (por exemplo, 0,005, 0,01), cerca de 0,001-2,0%de fenol (por exemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0% dealquilparabeno(s) (por exemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005,0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9,1,0%), e semelhantes.
Como observado anteriormente, a invenção fornece um artigofabricado que compreende um material de embalagem e pelo menos umfrasco que compreende uma solução de pelo menos um anticorpo anti-IL-6com os tampões e/ou conservantes prescritos, opcionalmente em umdiluente aquoso, em que o referido material de embalagem compreende umrótulo que indica que essa solução pode ser mantida por um período de 1, 2,3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 horas ou mais. Ainvenção ainda compreende um artigo fabricado que compreende materialde embalagem, um primeiro frasco que compreende, liofilizado, pelo menosum anticorpo anti-IL-6, e um segundo frasco que compreende um diluenteaquoso de tampão ou conservante prescrito, em que o referido material deembalagem compreende um rótulo que instrui o paciente a reconstituiraquele pelo menos um anticorpo anti-IL-6 no diluente aquoso para formaruma solução que pode ser mantida por um período de vinte e quatro horasou mais.
Aquele pelo menos um anticorpo anti-IL-6 usado de acordo coma presente invenção pode ser produzido por meios recombinantes, incluindopor preparações de células mamíferas ou transgênicas, ou pode serpurificado a partir de outras fontes biológicas, como aqui descrito ou comoconhecido na técnica.
A faixa de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 no produto dapresente invenção inclui quantidades que geram, mediante reconstituição,caso em um sistema úmido/seco, concentrações de cerca de 1,0 ug/ml acerca de 1.000 mg/ml, embora concentrações menores e maiores sejamoperáveis e dependam do veículo de liberação desejado; por exemplo,formulações de solução diferirão de emplastro transdérmico, métodospulmonar, transmucoso ou osmótico ou de microbomba.
De preferência, o diluente aquoso opcionalmente aindacompreende um conservante farmaceuticamente aceitável. Conservantespreferidos incluem aqueles selecionados do grupo que consiste em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquilparabeno(metila, etila, propila, butila e semelhantes), cloreto de benzalcônio, cloretode benzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas destes. Aconcentração de conservante usada na formulação é uma concentraçãosuficiente para gerar um efeito antimicrobiano. Tais concentraçõesdependem do conservante selecionado e são facilmente determinadas poraqueles versados na técnica.
Outros excipientes, por exemplo, agentes de isotonicidade,tampões, antioxidantes e intensificadores de conservantes, podem seropcionalmente e, de preferência, adicionados ao diluente. Um agente deisotonicidade como, por exemplo, glicerina, é comumente usado emconcentrações conhecidas. De preferência, um tampão fisiologicamentetolerado é adicionado para fornecer um melhor controle do pH. Asformulações podem cobrir uma ampla gama de pHs, por exemplo, pH decerca de 4 a cerca de 10, e faixas preferidas de pH de cerca de 5 a cerca de9 e, como a faixa mais preferida, pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0. Depreferência, as formulações da presente invenção possuem um pH entrecerca de 6,8 e cerca de 7,8. Tampões preferidos incluem tampões fosfato,principalmente, fosfato de sódio, particularmente, soro fisiológico tamponadocom fosfato (PBS).
Outros aditivos, tais como solubilizantes farmaceuticamenteaceitáveis como Tween 20 (polioxietileno (20) sorbitano monolaurato),Tween 40 (polioxietileno (20) sorbitano monopalmitato), Tween 80(polioxietileno (20) sorbitano monooleato), Pluronic F68 (copolímeros embloco de polioxietileno polioxipropileno) e PEG (polietileno glicol) outensoativos não-iônicos, tais como polissorbato 20 ou 80 ou poloxâmero 184ou 188, polióis Pluronic®, outros copolímeros em bloco e quelantes, taiscomo EDTA e EGTA, podem opcionalmente ser adicionados às formulaçõesou composições para reduzir a agregação. Esses aditivos sãoparticularmente úteis caso seja usada uma bomba ou um recipiente plásticopara administrar a formulação. A presença de um tensoativofarmaceuticamente aceitável reduz a propensão para que a proteína sejaagregada.
As formulações da presente invenção podem ser preparadaspor um processo que compreende a mistura de pelo menos um anticorpoanti-IL-6 e um conservante selecionado do grupo que consiste em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquilparabeno,(metila, etila, propila, butila e semelhantes), cloreto de benzalcônio, cloretode benzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal ou misturas destes emum diluente aquoso. A mistura de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 e umconservante em um diluente aquoso é realizada com a utilização deprocedimentos convencionais de dissolução e mistura. Para a preparação deuma formulação adequada, por exemplo, uma quantidade medida de pelomenos um anticorpo anti-IL-6 em solução tamponada é combinada com oconservante desejado em uma solução tamponada, em quantidadessuficientes para fornecer a proteína e o conservante nas concentraçõesdesejadas. Variações desse processo serão reconhecidas por aquelesversados na técnica. Por exemplo, a ordem em que os componentes sãoadicionados, se são ou não-utilizados aditivos adicionais, a temperatura e opH nos quais a formulação é preparada, são todos fatores que podem serotimizados para a concentração e o meio de administração usados.
As formulações reivindicadas podem ser fornecidas aospacientes como soluções transparentes ou como dois frascos quecompreendem um frasco de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 liofilizado queé reconstituído com um segundo frasco contendo água, um conservantee/ou excipientes, de preferência, um tampão fosfato e/ou soro fisiológico, eum sal escolhido, em um diluente aquoso. Tanto um frasco único de soluçãoquanto um frasco duplo que exige reconstituição podem ser reutilizadosvárias vezes e podem ser suficientes para um único ciclo ou para múltiplosciclos de tratamento do paciente e, dessa forma, podem permitir um regimede tratamento mais conveniente do que o disponível atualmente.
Os presentes artigos fabricados reivindicados são úteis para aadministração por um período que varia do uso imediato até vinte e quatrohoras ou mais. Conseqüentemente, os artigos fabricados presentementereivindicados oferecem vantagens significativas para o paciente. Asformulações da invenção podem opcionalmente ser estocadas comsegurança em temperaturas de cerca de 2°C a cerca de 40°C, e retêm aatividade biológica da proteína por períodos de tempo prolongadospermitindo, desse modo, um rótulo na embalagem que indica que a soluçãopode ser mantida e/ou usada por um período de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, ou96 horas ou mais. Caso seja usado um diluente preservado, esse rótulopode incluir o uso por até 1-12 meses, 6 meses, 1 ano e meio e/ou doisanos.
As soluções de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 da invençãopodem ser preparadas por um processo que compreende a mistura de pelomenos um anticorpo em um diluente aquoso. A mistura é realizada com autilização de procedimentos convencionais de dissolução e mistura. Para apreparação de um diluente adequado, por exemplo, uma quantidade medidade pelo menos um anticorpo em água ou tampão é combinada emquantidades suficientes para fornecer a proteína e, opcionalmente, umconservante ou um tampão nas concentrações desejadas. Variações desseprocesso serão reconhecidas por aqueles versados na técnica. Por exemplo,a ordem em que os componentes são adicionados, se são ou não usadosaditivos adicionais, a temperatura e o pH nos quais a formulação épreparada, são todos fatores que podem ser otimizados para a concentraçãoe para o meio de administração usados.
Os produtos reivindicados podem ser fornecidos aos pacientescomo soluções transparentes ou como dois frascos que compreendem umfrasco de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 liofilizado que é reconstituídocom um segundo frasco que contém o diluente aquoso. Tanto um frascoúnico de solução quanto um frasco duplo que exige reconstituição podemser reutilizados várias vezes e podem ser suficientes para um único ciclo oupara múltiplos ciclos de tratamento do paciente e, dessa forma, podempermitir um regime de tratamento mais conveniente do que o disponívelatualmente.
Os produtos reivindicados podem ser fornecidos indiretamenteaos pacientes através de farmácias, clínicas ou outras instituições einstalações, como soluções transparentes ou dois frascos que compreendemum frasco de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 liofilizado que éreconstituído com um segundo frasco que contém o diluente aquoso. Asolução transparente, nesse caso, pode ter um volume de até um litro oumais, fornecendo um grande reservatório do qual porções menores dasolução de pelo menos um anticorpo podem ser retiradas uma ou váriasvezes para transferência para frascos menores e fornecidas pela farmáciaou clínica aos seus clientes e/ou pacientes.
Dispositivos reconhecidos que compreendem sistemas defrasco único incluem dispositivos com injetor em caneta para liberação deuma solução, tais como BD Pens, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®,B-D®Pen, AutoPen®, e OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®,Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, Iject®, J-tip Needle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, por exemplo, como feitos oudesenvolvidos por Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ,www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Suíça,www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon (www.bioject.com); NationalMedicai Products, Weston Medicai (Peterborough, UK, www.weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www. mediject.com), edispositivos similarmente adequados. Dispositivos reconhecidos quecompreendem um sistema de dois frascos incluem aqueles sistemas cominjetor em caneta para reconstituição de um fármaco liofilizado em umcartucho para liberação da solução reconstituída como, por exemplo, oHumatroPen®. Exemplos de outros dispositivos adequados incluem seringaspré-preenchidas, auto-injetores, injetores sem agulha e conjuntos de infusãoIV sem agulha.
Os produtos presentemente reivindicados incluem material deembalagem. O material de embalagem fornece, além das informaçõesnecessárias pelos órgãos reguladores, as condições sob as quais o produtopode ser usado. O material de embalagem da presente invenção forneceinstruções para o paciente para reconstituir o pelo menos um anticorpo anti-IL-6 no diluente aquoso para formar uma solução e para usar a solução porum período de 2-24 horas ou mais para o produto de dois frascos,úmido/seco. Para o produto de solução de frasco único, o rótulo indica queessa solução pode ser usada por um período de 2-24 horas ou mais. Osprodutos presentemente reivindicados são úteis para uso humano doproduto farmacêutico.
As formulações da presente invenção podem ser preparadaspor um processo que compreende a mistura de pelo menos um anticorpoanti-IL-6 e um tampão selecionado, de preferência, soro fisiológico contendotampão fosfato ou um sal escolhido. A mistura de pelo menos um anticorpoanti-IL-6 e tampão em um diluente aquoso é realizada com a utilização deprocedimentos convencionais de dissolução e mistura. Para a preparação deuma formulação adequada, por exemplo, uma quantidade medida de pelomenos um anticorpo em água ou tampão é combinada com o agente detamponamento desejado em água, em quantidades suficientes para fornecera proteína e o tampão nas concentrações desejadas. Variações desseprocesso serão reconhecidas por aqueles versados na técnica. Por exemplo,a ordem em que os componentes são adicionados, se são ou não usadosaditivos adicionais, a temperatura e o pH nos quais a formulação épreparada, são todos fatores que podem ser otimizados para a concentraçãoe para o meio de administração usados.
As formulações estáveis ou preservadas reivindicadas podemser fornecidas aos pacientes como soluções transparentes ou como doisfrascos que compreendem um frasco de pelo menos um anticorpo anti-IL-6liofilizado que é reconstituído com um segundo frasco que contém umconservante ou tampão e excipientes em um diluente aquoso. Tanto umfrasco único de solução quanto um frasco duplo que exige reconstituiçãopodem ser reutilizados várias vezes e podem ser suficientes para um únicociclo ou para múltiplos ciclos de tratamento do paciente e, dessa forma,podem permitir um regime de tratamento mais conveniente do que odisponível atualmente.
Outras formulações ou métodos de estabilização do anticorpoanti-IL-6 podem resultar em algo diferente de uma solução transparente depó liofilizado que compreende o anticorpo. Dentre as soluções não-transparentes estão formulações que compreendem suspensõesparticuladas, as referidas substâncias particuladas sendo uma composiçãoque contém o anticorpo anti-IL-6 em uma estrutura de dimensão variável econhecida diversamente como microesfera, micropartícula, nanopartícula,nanosfera ou lipossomo. Essas formulações particuladas relativamentehomogêneas, essencialmente esféricas, contendo um agente ativo, podemser formadas pelo contato de uma fase aquosa que contém o agente ativo eum polímero e uma fase não aquosa, seguida por evaporação da fase nãoaquosa até causar a coalescência de partículas da fase aquosa, comoensinado na Patente U.S. N9 4.589.330. Micropartículas porosas podem serpreparadas com o uso de uma primeira fase contendo agente ativo e umpolímero disperso em um solvente contínuo, e remoção do referido solventeda suspensão por liofilização ou diluição-extração-precipitação, comoensinado na Patente U.S. N9 4.818.542. Polímeros preferidos para taispreparações são copolímeros ou polímeros naturais ou sintéticosselecionados do grupo que consiste em gelatina, ágar, amido,arabinogalactana, albumina, colágeno, ácido poliglicólico, ácido polilático,glicolida-L(-)lactida poli(épsilon-caprolactona), poli(épsilon-caprolactona-CO-ácido lático), poli(épsilon-caprolactona-CO-ácido glicólico), poli(ácido p-hidróxi butírico), oxido de polietileno, polietileno, poli(alquil-2-cianoacrilato),poli(metacrilato de hidroxietila), poliamidas, poli(aminoácidos), poli(2-hidroxietil DLaspartamida), poli(éster uréia), poli(L-fenilalanina/etilenoglicol/1,6-diisocianatohexano) e poli(metacrilato de metila). Polímerosparticularmente preferidos são poliésteres, tais como ácido poliglicólico,ácido polilático, glicolideo-L(-)lactídeo, poli(épsilon-caprolactona),poli(épsilon-caprolactona-CO-ácido lático) e poli(épsilon-caprolactona-CO-ácido glicólico). Solventes úteis para a dissolução do polímero e/ou doagente ativo incluem: água, hexafluorisopropanol, cloreto de metileno,tetrahidrofurano, hexano, benzeno ou sesquihidrato de hexafluoracetona. Oprocesso de dispersão da fase que contém o agente ativo com uma segundafase pode incluir forçar sob pressão a referida primeira fase através de umorifício em um bocal para induzir a formação de gotículas.
Formulações de pó seco podem ser produzidas por outrosprocessos que não a liofilização, por exemplo, por secagem por atomizaçãoou extração de solvente por evaporação ou por precipitação de umacomposição cristalina, seguida por uma ou mais etapas para a remoção desolvente aquoso ou não aquoso. A preparação de uma preparação deanticorpo por secagem por atomização é ensinada na Patente U.S. N96.019.968. As composições de pó seco baseadas em anticorpo podem serproduzidas pela secagem por atomização de soluções ou misturas doanticorpo e, opcionalmente, excipientes, em um solvente sob condições queforneçam um pó seco respirável. Os solventes podem incluir compostospolares, tais como água e etanol, que podem ser facilmente secos. Aestabilidade do anticorpo pode ser aumentada realizando-se osprocedimentos de secagem por atomização na ausência de oxigênio como,por exemplo, sob uma manta de nitrogênio ou com o uso de nitrogênio comoo gás secante. Outra formulação relativamente seca é uma dispersão dediversas microestruturas perfuradas dispersas em um meio de suspensãoque tipicamente compreende um propelente de hidrofluoralcano, comoensinado em WO 9916419. As dispersões estabilizadas podem seradministradas ao pulmão de um paciente com a utilização de um inalador dedose metrificada. Equipamentos úteis na fabricação comercial demedicamentos secos por vaporização são produzidos por Buchi Ltd. ou NiroCorp.
Pelo menos um anticorpo anti-IL-6 nas formulações ou soluçõestanto estáveis quanto preservadas aqui descritas pode ser administrado aum paciente de acordo com a presente invenção através de diversosmétodos de liberação incluindo injeção subcutânea (SC) ou intramuscular(IM); administração transdérmica, pulmonar, transmucosa, por implante,bomba osmótica, cartucho, microbomba ou por outros meios observados poraqueles versados na técnica, como é bem-conhecido na técnica.
Aplicações terapêuticas
A presente invenção também fornece um método para amodulação ou o tratamento de pelo menos uma doença relacionada à IL-6em uma célula, tecido, órgão, animal, ou paciente, como é conhecido natécnica ou como aqui descrito, usando pelo menos um anticorpo IL-6 dapresente invenção, por exemplo, por administração ou contato da célula,tecido, órgão, animal ou paciente com uma quantidade terapêutica eficaz deanticorpo IL-6. A presente invenção também fornece um método para amodulação ou o tratamento de pelo menos uma doença relacionada à IL-6em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente incluindo, sem limitação,pelo menos um dentre obesidade, uma doença relacionada ao sistemaimunológico, uma doença cardiovascular, uma doença infecciosa, umadoença maligna ou uma doença neurológica.
A presente invenção também fornece um método para amodulação ou o tratamento de pelo menos uma doença relacionada aosistema imunologico relacionada à IL-6, em uma célula, tecido, órgão, animalou paciente incluindo, sem limitação, pelo menos um de artrite reumatóide,artrite reumatóide juvenil, artrite reumatóide juvenil de surgimento sistêmico,artrite psoriática, espondilite anquilosante, úlcera gástrica, artropatias soro-negativas, osteoartrite, osteólise, deslocamento asséptico de implantesortopédicos, doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa, lúpuseritematoso sistêmico, lúpus eritematoso cutâneo, nefrite lúpica, síndromeantifosfolipídeo, iridociclite/uveíte/neurite óptica, fibrose pulmonar idiopática,vasculite sistêmica/granulomatose de Wegener, sarcoidose,orquite/procedimentos de reversão de vasectomia, doençasalérgicas/atópicas, asma, rinite alérgica, eczema, dermatite alérgica decontato, conjuntivite alérgica, pneumonite por hipersensibilidade,transplantas, rejeição órgãos transplantados, doença enxerto versushospedeiro, síndrome de resposta inflamatória sistêmica, síndrome séptica,sépsis por gram-positivos, sépsis por gram-negativos, sépsis com culturanegativa, sépsis fúngica, febre neutropênica, urosépsis, meningococcemia,trauma/hemorragia, queimaduras, exposição à radiação ionizante,pancreatite aguda, síndrome do sofrimento respiratório do adulto, artritereumatóide, hepatite induzida por álcool, patologias inflamatórias crônicas,sarcoidose, doença de Crohn, anemia falciforme, diabetes, nefrose, doençasatópicas, reações de hipersensibilidade, rinite alérgica, febre do feno, riniteperene, conjuntivite, endometriose, asma, urticária, anafilaxia sistêmica,dermatite, anemia perniciosa, doença hemolítica, trombocitopenia, rejeição aenxerto de qualquer órgão ou tecido, rejeição a transplante renal, rejeição atransplante cardíaco, rejeição a transplante hepático, rejeição a transplantedo pâncreas, rejeição a transplante de pulmão, rejeição a transplante demedula óssea (BMT), rejeição a aloenxerto de pele, rejeição a transplante decartilagem, rejeição a enxerto ósseo, rejeição a transplante do intestinodelgado, rejeição ao implante de timo fetal, rejeição a transplante deparatireóide, rejeição de xenoenxerto de qualquer órgão ou tecido, rejeiçãode aloenxerto, reações de hipersensibilidade anti-receptor, doença deGraves, doença de Raynaud, diabetes do tipo B resistente à insulina, asma,miastenia gravis, citotoxicidade mediada por anticorpos, reações dehipersensibilidade do tipo III, síndrome POEMS (polineuropatia,visceromegalia, endocrinopatia, gamopatia monoclonal e síndrome dealterações cutâneas), polineuropatia, visceromegalia, endocrinopatia,gamopatia monoclonal, síndrome de alterações cutâneas, síndromeantifosfolipídeo, pênfigo, esclerodermia, doença mista do tecido conjuntivo,doença idiopática de Addison, diabetes melito, hepatite crônica ativa, cirrosebiliar primária, vitiligo, vasculite, síndrome de cardiotomia pós-MI,hipersensibilidade do tipo IV, dermatite de contato, pneumonite porhipersensibilidade, rejeição a aloenxerto, granulomas causados pororganismos intracelulares, sensibilidade a fármacos, metabólica/idiopática,doença de Wilson, hemocromatose, deficiência de anti-tripsina alfa-1,retinopatia diabética, tireoidite de Hashimoto, osteoporose, avaliação do eixohipotalâmico-hipófise-adrenal, cirrose biliar primária, tireoidite,encefalomielite, caquexia, fibrose cística, doença pulmonar neonatal crônica,doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), linfo-histiocitosehematofagocítica familiar, condições dermatológicas, psoríase, alopecia,síndrome nefrótica, nefrite, nefrite glomerular, insuficiência renal aguda,hemodiálise, uremia, toxicidade, pré-eclampsia, terapia com okt3, terapiaanti-cd3, terapia com citocina, quimioterapia, radioterapia (por exemplo,incluindo, sem limitação, astenia, anemia, caquexia, e semelhantes),intoxicação crônica por salicilato, e semelhantes. Veja, por exemplo, "TheMerck Manual", 12--17- Edições, Merck & Company, Rahway, NJ (1972,1977, 1982, 1987, 1992, 1999), "Pharmacotherapy Handbook", Wells e ai,eds., Segunda Edição, Appleton e Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000),cada um deles aqui incorporado por referência em sua totalidade.
A presente invenção também fornece um método para amodulação ou o tratamento de pelo menos uma doença cardiovascular emuma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, sem limitação, pelomenos um de síndrome de parada cardíaca, infarto do miocárdio,insuficiência cardíaca congestiva, acidente vascular cerebral, acidentevascular cerebral isquêmico, hemorragia, síndrome coronária aguda,arteriosclerose, ate roscle rose, re-estenose, doença aterosclerotica diabética,hipertensão, hipertensão arterial, hipertensão renovascular, síncope,choque, sífilis do sistema cardiovascular, insuficiência cardíaca, corpulmonale, hipertensão pulmonar primária, arritmias cardíacas, batimentosatriais ectópicos, flutter atrial, fibrilação atrial (sustentada ou paroxística),síndrome pós-perfusão, resposta inflamatória ao desvio cardiopulmonar,taquicardia atrial caótica ou multifocal, taquicardia regular com QRS estreito,arritmias específicas, fibrilação ventricular, arritmias do feixe de His, bloqueioatrioventricular, bloqueio de ramo do feixe, distúrbios miocárdicosisquêmicos, doença arterial coronariana, angina do peito, infarto domiocárdio, cardiomiopatia, cardiomiopatia congestiva dilatada,cardiomiopatia restritiva, doenças cardíacas valvulares, endocardite, doençapericárdicas, tumores cardíacos, aneurismas aórticos e periféricos,dissecção aórtica, inflamação da aorta, oclusão da aorta abdominal e seusramos, distúrbios vasculares periféricos, distúrbios arteriais oclusivos,doença aterosclerotica periférica, tromboangite obliterante, distúrbiosarteriais funcionais periféricos, fenômeno e doença de Raynaud,acrocianose, eritromelalgia, doenças venosas, trombose venosa, veiasvaricosadas, fístula arteriovenosa, linfedema, lipedema, angina instável,lesão por reperfusão, síndrome pós-bomba, lesão por isquemia-reperfusão,e semelhantes. Um método como esse pode compreender a administraçãode uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêuticaque compreende pelo menos um anticorpo anti-IL-6 a uma célula, tecido,órgão, animal ou paciente que necessita de tal modulação, tratamento outerapia.
A presente invenção também fornece um método para amodulação ou o tratamento de pelo menos uma doença infecciosarelacionada à IL-6 em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente,incluindo, sem limitação, pelo menos um de: infecção bacteriana aguda oucrônica, processos parasitários ou infecciosos agudos e crônicos, incluindoinfecções bacterianas, virais e fúngicas, infecção por HlV/neuropatia porHIV, meningite, hepatite (por exemplo, A, B ou C, ou semelhantes), artriteséptica, peritonite, pneumonia, epiglotite, E. coli 0157:h7, síndromehemolítica urêmica/púrpura trombocitopênica trombolítica, malária, febre dadengue hemorrágica, leishmaniose, lepra, síndrome de choque toxêmico,miosite estreptocócica, gangrena gasosa, tuberculose por micobactéria,Mycobacterium avium intracelular, pneumonia por Pneumocystis carinii,doença inflamatória pélvica, orquite/epididimite, legionela, doença de Lyme,influenza A, vírus de Epstein-Barr, síndrome hemofagocítica com associaçãoviral, encefalite viral/meningite asséptica, e semelhantes.
A presente invenção também fornece um método para amodulação ou o tratamento de pelo menos uma doença maligna relacionadaà IL-6 em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, semlimitação, pelo menos um de: leucemia, leucemia aguda, leucemialinfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica aguda, ALL de células B,células T ou FAB, leucemia mielóide aguda (AML), leucemia mielógenaaguda, leucemia mielocítica crônica (CML), leucemia linfocítica crônica(CLL), leucemia de célula pilosa, síndrome mielodisplásica (MDS), umlinfoma, doença de Hodgkin, um linfoma maligno, linfoma não-Hodgkin,linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, sarcoma de Kaposi, carcinoma cólon-retal, carcinoma pancreático, carcinoma nasofaríngeo, histiocitose maligna,síndrome paraneoplásica/hipercalcemia da malignidade, tumores sólidos,câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cólon-retal, câncer endometrial,câncer da cabeça, câncer do pescoço, câncer não-polipose hereditário,linfoma de Hodgkin, câncer hepático, câncer do pulmão, câncer do pulmãode célula não pequena, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer depróstata, carcinoma de células renais, câncer testicular, adenocarcinomas,sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, doença metastática,reabsorção óssea relacionada ao câncer, dor óssea relacionada ao câncer, esemelhantes.
A presente invenção também fornece um método para amodulação ou o tratamento de pelo menos uma doença neurológicarelacionada à IL-6 em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente,incluindo, sem limitação, pelo menos um de: doenças neurodegenerativas,esclerose múltipla, enxaqueca, complexo demencial da AIDS, doençasdesmielinizantes, tais como esclerose múltipla e mielite transversa aguda;distúrbios extrapiramidal e cerebelares, tais como lesões do sistemacorticospinal; distúrbios dos gânglios da base; distúrbios de movimentoshipercinéticos, tais como coréia de Huntington e coréia senil; distúrbios domovimento induzidos por fármacos, tais como aqueles induzidos porfármacos que bloqueiam os receptores de dopamina do SNC; distúrbios demovimentos hipocinéticos como, por exemplo, doença de Parkinson;paralisia supra-núcleo progressiva; lesões estruturais do cerebelo;degenerações espinocerebelares, tais como ataxia espinhal, ataxia deFriedreich, degenerações cerebelares corticais, degenerações de múltiplossistemas (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager e Machado-Joseph);distúrbios sistêmicos (doença de Refsum, abetalipoprotemia, ataxia,telangiectasia e distúrbio mitocondrial multissistêmico); distúrbios centraisdesmielinizantes, tais como esclerose múltipla, mielite transversa aguda; edistúrbios da unidade motora, tais como atrofias musculares neurogênicas(degeneração da célula do corno anterior como, por exemplo, escleroselateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal infantil e atrofia muscularespinhal juvenil); doença de Alzheimer; síndrome de Down na meia idade;doença difusa do corpo de Lewy; demência senil do tipo corpo de Lewy;síndrome de Wernicke-Korsakoff; alcoolismo crônico; doença de Creutzfeldt-Jakob; panencefalite esclerosante subaguda, doença de Hallerrorden-Spatz;demência pugilística; lesão neurotraumática (por exemplo, lesão medular,lesão cerebral, concussão, concussão repetitiva); dor; dor inflamatória;autismo; depressão; acidente vascular cerebral; distúrbios cognitivos;epilepsia; e semelhantes. Um método como esse pode opcionalmentecompreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composiçãoou composição farmacêutica que compreende pelo menos um anticorpo TNFou porção especificada ou variante a uma célula, tecido, órgão, animal oupaciente que necessita de tal modulação, tratamento ou terapia. Veja, por exemplo, "The Merck Manual", 16e Edição, Merck & Company, Rahway, NJ (1992).
A presente invenção também fornece um método para a modulação ou o tratamento de pelo menos uma ferida, trauma ou lesão tecidual ou condição crônica associada relacionadas à IL-6, em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, sem limitação, pelo menos um de: lesão corpórea ou um trauma associado à cirurgia oral incluindo cirurgia periodontal, extração(s) dentária, tratamento endodôntico, inserção de implantes dentários, aplicação e uso de próteses dentárias; ou em que a ferida é selecionada do grupo que consiste em feridas assépticas, feridas contusas, feridas incisas, feridas laceradas, feridas não penetrantes, feridas abertas, feridas penetrantes, feridas perfurantes, feridas puntiformes, feridas sépticas, infartos e feridas subcutâneas; ou em que a ferida é selecionada do grupo que consiste em úlceras isquêmicas, ulcerações por pressão, fístulas, mordidas graves, queimaduras térmicas e feridas do sítio doador; ou em que a ferida é uma ferida aftosa, uma ferida traumática ou uma ferida asscciãda ao nerpes.
Feridas e/ou úlceras são normalmente encontradas fazendo protrusão a partir da pele ou em uma superfície mucosa, ou como resultado de um infarto em um órgão ("acidente vascular cerebral"). Uma ferida pode ser resultado de um defeito de um tecido mole ou uma lesão de uma condição subjacente. No presente contexto, o termo "pele" relaciona-se à superfície mais externa do corpo de um animal, incluindo um ser humano, e engloba a pele intacta ou quase intacta, além de uma superfície cutânea lesionada. O termo "mucosa" relaciona-se à mucosa não danificada ou danificada de um animal, por exemplo, um ser humano, e pode ser a mucosa oral, bucal, aural, nasal, pulmonar, ocular, gastrointestinal, vaginal ou retal.
No presente contexto, o termo "ferida" denota uma lesãocorpórea com ruptura da integridade normal de estruturas teciduais. O termo também visa a englobar os termos "ulceração", "lesão", "necrose" e "úlcera."Normalmente, o termo "ulceração" é um termo popular para quase todas as lesões da pele ou de membranas mucosas, e o termo "úlcera" é um defeito local, ou escavação, da superfície de um órgão ou tecido, que é produzido pela remoção de tecido necrotico. Lesão geralmente relaciona-se a qualquer defeito tecidual. Necrose está relacionada a tecido morto em conseqüência de infecção, lesão, inflamação ou infartos.
O termo "ferida" usado no presente contexto denota qualquer ferida (veja abaixo uma classificação de feridas) e em qualquer estágio em particular no processo de cicatrização, incluindo o estágio anterior ao início de qualquer cicatrização, ou até mesmo antes de uma ferida específica, por exemplo, uma incisão cirúrgica, ser feita (tratamento profilático). Exemplos de feridas que podem ser evitadas e/ou tratadas de acordo com a presente invenção são, por exemplo, feridas assépticas, feridas contusas, feridas incisas, feridas laceradas, feridas não penetrantes (ou seja, feridas nas quais não há ruptura da pele, mas há lesão às estruturas subjacentes), feridas abertas, feridas penetrantes, feridas perfurantes, feridas puntiformes, feridas sépticas, feridas subcutâneas etc. Exemplos de ulcerações são ulcerações de decúbito, ulcerações dc câncer, ulcerações cremicas, ulcerações pelo frio, ulcerações por pressão etc. Exemplos de úlceras são, por exemplo, uma úlcera péptica, úlcera duodenal, úlcera gástrica, úlcera da gota, úlcera diabética, úlcera isquêmica hipertensiva, úlcera de estase, ulcus cruris (úlcera venosa), úlcera sublingual, úlcera submueosa, úlcera sintomática, úlcera trófica, úlcera tropical e úlcera venérea, por exemplo, causada por gonorréia (incluindo uretrite, endocervicite e proctite). Condições relacionadas às feridas ou ulcerações que podem ser tratadas com sucesso de acordo com a invenção são queimaduras, antraz, tétano, gangrena gasosa, escarlatina, erisipela, sicose da barba, foliculite, impetigo contagioso, ou impetigo bolhoso etc. Há freqüentemente a certa superposição entre o uso dos termos "ferida" e "úlcera" e "ferida" e "ulceração" e, além disso, os termos são usados freqüentemente de forma aleatória. Portanto, como mencionado anteriormente, no presente contexto, o termo "ferida" engloba os termos "úlcera", "lesão", "ulceração" e "infarto", eos termos são usados indiscriminadamente, a menos que seja indicado de forma diferente.
Os tipos de feridas a serem tratadas de acordo com a invenção também incluem: (i) feridas gerais, tais como, por exemplo, feridas cirúrgicas, traumáticas, infecciosas, isquêmicas, térmicas, químicas e bolhosas; (ii) feridas específicas para a cavidade oral, tais como, por exemplo, feridas pós-extração, feridas endodônticas, especialmente em relação ao tratamento de cistos e abscessos, úlceras e lesões de origem bacterianas, viral ou auto-imune, mecânicas, químicas, térmicas, infecciosas e liquenóides; úlceras herpéticas, estomatite aftosa, gengivite ulcerativa necrotizante aguda e síndrome da boca ardente são exemplos específicos; e (iii) feridas na pele, tais como, por exemplo, neoplasias, queimaduras (por exemplo químicas, térmicas), lesões (bacterianas, virais, auto-imunes), mordidas e incisões cirúrgicas. Outra forma de classificar as feridas é como:(i) pequena perda de tecido causada por incisões cirúrgicas, pequenas abrasões e pequenas mordidas, ou como (ii) perda significativa de tecido. Esse último grupo inclui úlceras isquêmicas, ulcerações por pressão, físíulas, lacerações, mordidas graves, queimaduras térmicas e feridas do sítio doador (em tecidos moles e sólidos) e infartos.
Outras feridas que são de importância em relação à presenteinvenção são feridas como úlceras isquêmicas, ulcerações por pressão, fístulas, mordidas graves, queimaduras térmicas e feridas do sítio doador. Úlceras isquêmicas e ulcerações por pressão são feridas que normalmente só cicatrizam muito lentamente e, especialmente nesses casos, um processo de cicatrização aprimorado e mais rápido é, evidentemente, de grande importância para o paciente. Além disso, os custos envolvidos no tratamento de pacientes que sofrem dessas feridas são acentuadamente reduzidos quando a cicatrização é aprimorada e ocorre mais rapidamente.
Feridas do sítio doador são feridas que ocorrem, por exemplo, em relação à remoção do tecido sólido de uma parte do corpo para outra parte do corpo, por exemplo, em relação aos transplantes. As feridas que resultam dessas operações são muito dolorosas e uma cicatrizaçãoaprimorada é, portanto, muito importante. O termo "pele" é usado em um sentido muito amplo, que engloba a camada epitelial da pele, nos casos onde a superfície da pele é mais ou menos danificada, e também a camada dérmica da pele. Com exceção do estrato córneo, a camada epidérmica da pele é a camada mais externa (epitelial) e a camada mais profunda de tecido conjuntivo da pele é chamada derme.
A presente invenção também fornece um método para a modulação ou o tratamento de osteoartrite, lúpus eritematoso sistêmico, lúpus eritematoso cutâneo, nefrite lúpica, diabetes melito do tipo II, e distúrbio pulmonar obstrutivo crônico, dentre outras doenças listadas acima como relacionadas à IL-6, em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente incluindo, sem limitação, pelo menos um entre uma doença relacionada ao sistema imunológico, doença cardiovascular, doença infecciosa, maligna e/ou neurológica. Um método como esse pode opcionalmente compreender a administração de uma quantidade eficaz de pelo menos uma composição ou composição farmacêutica que compreende pelo menos um anticorpo anti-IL-6 a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente que necessita de tal modulação, tratamento ou terapia.
Qualquer método da presente invenção pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica que compreende pelo menos um anticorpo anti-IL-6 a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente que necessita de tal modulação, tratamento ou terapia. Um método como esse pode opcionalmente ainda compreender a co-administração ou terapia de combinação para o tratamento dessas doenças ou distúrbios, em que a administração do referido pelo menos um anticorpo anti-IL-6, porção especificada ou variante deste, ainda compreende a administração, antes, concomitantemente e/ou depois, de pelo menos um selecionado de pelo menos um antagonista de TNF (por exemplo, sem limitação, um antagonista de TNF químico ou protéico, anticorpo TNF monoclonal ou policlonal ou fragmento, um receptor solúvel de TNF (por exemplo, p55, p70 ou p85) ou fragmento, polipeptídeos de fusão destes, ou um antagonista de TNF de pequena molécula, porexemplo, proteína de ligação de TNF I ou II (TBP-I ou TBP-II), nerelimonmab, infliximab, etanercept (Enbrel®), adalimulab (Humira®), CDP-571, CDP-870, afelimomab, lenercept, e semelhantes), um anti-reumático (por exemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglicose, azatioprina, tiomalato de ouro sódico, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalazina), um relaxante muscular, um narcótico, um fármaco antiinflamatório não-esteróide (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobiano (por exemplo, aminoglicosídeo, um antifúngico, um antiparasitário, um antiviral, umcarbapenem, uma cefalosporina, uma fluorquinolona, um macrolídeo, uma penicilina, uma sulfonamida, uma tetraciclina, outro antimicrobiano), um antipsoriático, um corticosteróide, um esteróide anabólico, um agente relacionado ao diabetes, um mineral, um nutritivo, um agente da tireóide, uma vitamina, um hormônio relacionado ao cálcio, um antidiarréico, umantitussígeno, um antiemético, um antiulceroso, um laxante, um anticoagulante, uma eritropoietina (por exemplo, epoetina alfa), uma filgrastima (por exemplo, G-CSF, Neupogen), uma sargramostima (GM-CSF, Leukine), uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossupressor (por exemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), um hormônio docrescimento, um fármaco de reposição hormonal, um modulador do receptor de estrogênio, um midriático, um cicloplégico, um agente alquilante, um antimetabólito, um inibidor mitótico, uma substância farmacêutica radioativa, um antidepressivo, agente antimaníaco, um antipsicótico, um ansiolítico, um hipnótico, um simpaticomimético, um estimulante, donepezil, tacrina, umamedicação para asma, um agonista beta, um esteróide inalado, um inibidor de leucotrieno, uma metilxantina, uma cromolina, uma epinefrina ou análogo, dornase alfa (Pulmozyme), uma citocina ou um antagonista de citocina. Dosagens adequadas são bem-conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Wells e ai, eds., "Pharmacotherapy Handbook", 2' Edição, Appleton eLange, Stamford, CT (2000); "PDR Pharmacopoeia", "Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000", Edição de luxo, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000); "Nursing 2001 Handbook of Drugs", 21 - edição, SpringhouseCorp., Springhouse, PA, 2001; "Health ProfessionaPs Drug Guide" 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ. Cada uma dessas referências é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
Antagonistas de TNF adequados para as composições, terapia de combinação, co-administração, dispositivos e/ou métodos da presente invenção (que ainda compreendem pelo menos um anticorpo, porção especificada e variante deste, da presente invenção), incluem, sem limitação, anticorpos anti-TNF (por exemplo, pelo menos um antagonista de TNF como definido acima), fragmentos de ligação de antígeno destes, e moléculas de receptor que se ligam especificamente ao TNF; compostos que evitam e/ou inibem a síntese de TNF, liberação de TNF ou sua ação sobre células-alvo, tais como talidomida, tenidap, inibidores da fosfodiesterase (por exemplo, pentoxifilina e rolipram), agonistas do receptor de adenosina A2b e intensificadores do receptor de adenosina A2b; compostos que evitam e/ou inibem a sinalização do receptor de TNF, tais como inibidores da proteína (MAP) quinase ativados por mitógeno; compostos que bloqueiam e/ou inibem a clivagem de TNF da membrana como, por exemplo, inibidores da metaloproteinase; compostos que bloqueiam e/ou inibem a atividade de TNF como, por exemplo, inibidores da enzima conversora de angiotensina (ACE)(por exemplo, captopril); e compostos que bloqueiam e/ou inibem a produção e/ou síntese de TNF como, por exemplo, inibidores da MAP quinase.
Como aqui usado, um "anticorpo de fator de necrose tumoral", "anticorpo TNF", "anticorpo TNFoc", ou fragmento e semelhantes, diminui,bloqueia, inibe, anula ou interfere com a atividade de TNFoc in vitro, in situ e/ou, de preferência, in vivo. Por exemplo, um anticorpo TNF humano adequado da presente invenção pode se ligar ao TNFa e inclui anticorpos anti-TNF, fragmentos de ligação de antígeno destes, e mutantes ou domínios especificados destes que se ligam especificamente ao TNFa. Umanticorpo TNF ou fragmento adequado também pode diminuir, bloquear, anular, interferir, evitar e/ou inibir RNA de TNF, DNA ou síntese de proteína, liberação de TNF, receptor de sinalização de TNF, clivagem de TNF demembrana, atividade de TNF, produção e/ou síntese de TNF.
Um exemplo de um anticorpo ou antagonista de TNF é o anticorpo quimérico cA2. Exemplos adicionais de anticorpos monoclonais anti-TNF que podem ser usados na presente invenção são descritos na técnica (veja, por exemplo, Patente U.S. Ne 5.231.024; Moller, A. e ai, Cytokine 2(3): 162-169 (1990); Pedido U.S. N9 07/943.852 (depositado em 11 de setembro de 1992); Rathjen e ai, Publicação Internacional N9 WO 91/02078 (publicado em 21 de fevereiro de 1991); Rubin e ai, Publicação de Patente EPO N9 0 218 868 (publicado em 22 de abril de 1987); Yone e ai, Publicação de Patente EPO N9 0 288 088 (26 de outubro de 1988); Liang, e ai, Biochem. Biophys. Res. Comm. 137: 847-854 (1986); Meager, e ai, Hybridoma 6: 305-311 (1987); Fendly e ai, Hybridoma 6: 359-369 (1987); Bringman, e ai, Hybridoma 6: 489-507 (1987); e Hirai, e ai, J. Immunol. Meth. 96:57-62(1987)).
Moléculas receptoras de TNF
Moléculas receptoras de TNF preferidas úteis na presente invenção são aquelas que se ligam ao TNFoc com alta afinidade (veja, por exemplo, Feldmann e ai, Publicação Internacional N9 WO 92/07076 (publicada em 30 de abril de 1992); Schall e ai, Ce//61: 361-370 (1990); e Loetscher e ai, Cell 61: 351-359 (1990), cujas referências são aqui incorporadas por referência em sua totalidade) e opcionalmente possuem baixa imunogenicidade. Em particular, os receptores de TNF da superfície celular de 55 kDa (p55 TNF-R) e de 75 kDa (p75 TNF- R) são úteis na presente invenção. Formas truncadas desses receptores, que compreendemos domínios extracelulares (ECD) dos receptores ou porções funcionais destes (veja, por exemplo, Corcoran e ai, Eur. J. Biochem. 223: 831-840 (1994)), também são úteis na presente invenção. Formas truncadas dos receptores de TNF, que compreendem os ECD, foram detectadas na urina e no soro como proteínas inibidoras da ligação de TNFoc de 30 kDa e 40 kDa(Engelmann, H. e ai, J. Bioi Chem. 265: 1.531-1.536 (1990)). Moléculas multiméricas receptoras de TNF e moléculas de fusão imunorreceptoras de TNF, e derivados e fragmentos ou porções destas, são exemplos adicionaisde moléculas receptoras de TNF que são úteis nos métodos e nas composições da presente invenção.
Moléculas multiméricas receptoras de TNF úteis na presente invenção compreendem todo ou uma porção funcional do ECD de dois ou mais receptores de TNF ligados por meio de um ou mais vinculadores polipeptídicos ou de outros vinculadores não peptídicos, tais como polietileno glicol (PEG). Um exemplo de uma molécula de fusão imunorreceptora de TNF como essa é a proteína de fusão receptora de TNF/lgG. Moléculas de fusão imunorreceptoras de TNF e métodos para sua produção foramdescritos na técnica (Lesslauer e ai, Eur. J. Immunol. 21: 2.883-2.886 (1991); Ashkenazi e ai, Proc. Nati Acad. Sei USA 88: 1.0535-1.0539 (1991); Peppel e ai, J. Exp. Med. 174: 1.483-1.489 (1991); Kolls e ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA 91: 215-219 (1994); Butler e ai, Cytokine 6(6): 616-623 (1994); Baker e ai, Eur. J. Immunol. 24: 2.040-2.048 (1994); Beutler e ai,Patente U.S. N- 5.447.851; e Pedido U.S. Ne 08/442,133 (depositado em 16 de maio de 1995), cada uma dessas referências é aqui incorporada por referência em sua totalidade). Métodos para a produção de moléculas de fusão imunoreceptoras podem ser encontrados em Capon e al., Patente U.S. Ne 5.116.964; Capon e al., Patente U.S. Ne 5.225.538; e Capon e ai, Nature337: 525-531 (1989), cujas referências são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
Citocinas incluem qualquer citocina conhecida. Veja, por exemplo, CopewithCytokines.com. Antagonistas de citocinas incluem, sem limitação, qualquer anticorpo, fragmento ou mimético, qualquer receptorsolúvel, fragmento ou mimético, qualquer antagonista de pequena molécula, ou qualquer combinação destes. Tratamentos terapêuticos
Qualquer método da presente invenção pode compreender um método para o tratamento de um distúrbio mediado por IL-6, quecompreende a administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica que compreende pelo menos um anticorpo anti-IL-6 a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente que necessita de talmodulação, tratamento ou terapia. Um método como esse pode opcionalmente ainda compreender a co-administração ou terapia de combinação para o tratamento de tais doenças ou distúrbios, em que a administração do referido pelo menos um anticorpo anti-IL-6, porção especificada ou variante deste, ainda compreende a administração antes, concomitantemente e/ou depois, de pelo menos um selecionado de um farmaco antiinfeccioso, um farmaco do sistema cardiovascular (CV), um farmaco do sistema nervoso central (SNC), um farmaco do sistema nervoso autônomo (SNA), um farmaco do trato respiratório, um farmaco do tratogastrointestinal (Gl), um farmaco hormonal, um farmaco para o equilíbrio hidro-eletrolítico, um farmaco hematológico, um antineoplásico, um farmaco de imunomodulação, um farmaco oftálmico, óptico ou nasal, um farmaco tópico, um farmaco nutritivo ou semelhantes, pelo menos um antagonista de TNF (por exemplo, sem limitação, um anticorpo TNF ou fragmento, umreceptor solúvel de TNF ou fragmento, .proteínas de fusão destes, ou um antagonista de TNF de pequena molécula), um anti-reumático (por exemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglicose, azatioprina, etanercept, tiomalato de ouro sódico, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalazina), um relaxante muscular, um narcótico, um farmaco antiinflamatório não-esteróide(NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobiano (por exemplo, aminoglicosídeo, um antifúngico, um antiparasitário, um antiviral, um carbapenem, uma cefalosporina, uma fluorquinolona, um macrolídeo, uma penicilina, uma sulfonamida, uma tetraciclina, outro antimicrobiano), umantipsoriático, um corticosteróide, um esteróide anabólico, um agente relacionado ao diabetes, um mineral, um nutritivo, um agente da tireóide, uma vitamina, um hormônio relacionado ao cálcio, um antidiarréico, um antitussígeno, um antiemético, um antiulceroso, um laxante, um anticoagulante, uma eritropoietina (por exemplo, epoetina alfa), umafilgrastima (por exemplo, G-CSF, Neupogen), uma sargramostima (GM-CSF, Leukine), uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossupressor (por exemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), um hormônio docrescimento, um fármaco de reposição hormonal, um modulador do receptor de estrogenio, um midriático, um cicloplegico, um agente alquilante, um antimetabólito, um inibidor mitótico, uma substância farmacêutica radioativa, um antidepressivo, agente antimaníaco, um antipsicótico, um ansiolítico, um hipnótico, um simpaticomimético, um estimulante, donepezil, tacrina, uma medicação para asma, um agonista beta, um esteróide inalado, um inibidor de leucotrieno, uma metilxantina, uma cromolina, uma epinefrina ou análogo, dornase alfa (Pulmozyme), uma citocina ou um antagonista de citocina. Esses fármacos são bem-conhecidos na técnica, incluindo formulações, indicações, dosagem e administração para cada um dos fármacos aqui apresentados (veja, por exemplo, "Nursing 2001 Handbook of Drugs", 21-edição, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; "Health ProfessionaFs Drug Guide" 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc., Upper Saddle River, NJ; "Pharmacotherapy Handbook", Wells e ai, ed., Appleton &Lange, Stamford, CT, cada um deles aqui incorporado por referência em sua totalidade).
Tipicamente, o tratamento de condições patológicas é efetuado pela administração de uma quantidade eficaz ou dosagem de pelo menos uma composição de anticorpo anti-IL-6 que varia no total, na média, em umafaixa de pelo menos cerca de 0,01 a 500 miligramas de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 por quilograma do paciente por dose e, de preferência, de pelo menos cerca de 0,1 a 100 miligramas de anticorpo/quilograma do paciente por administração única ou múltipla, dependendo da atividade específica do agente ativo contido na composição. Alternativamente, aconcentração sérica eficaz pode compreender uma concentração sérica de 0,1-5.000 |ig/ml por administração única ou múltipla. Dosagens adequadas são conhecidas pelos profissionais médicos e dependerão, evidentemente, do estado de doença específico, da atividade específica da composição que estiver sendo administrada e do paciente em particular submetido aotratamento. Em alguns casos, a fim de se obter a quantidade terapêutica desejada, pode ser necessária a realização de administrações repetidas, ou seja, administrações individuais repetidas de uma dose monitorada oumetrificada em particular, em que as administrações individuais são repetidas até que a dose diária ou o efeito desejado seja obtido.
As doses preferidas podem opcionalmente incluir cerca de 0,1-99 e/ou 100-500 mg/kg/administração, ou qualquer intervalo, valor ou fração desta, ou para se obter uma concentração sérica de cerca de 0,1-5.000 ng/ml de concentração sérica por administração única ou múltipla, ou qualquer intervalo, valor ou fração desta. Uma faixa de dosagem preferida para o anticorpo anti-IL-6 da presente invenção é de cerca de 1 mg/kg, até cerca de 3, cerca de 6 ou cerca de 12 mg/kg de peso corporal do paciente.
Alternativamente, a dosagem administrada pode variar, dependendo de fatores conhecidos, tais como das características farmacodinâmicas do agente em particular, e de seu modo e via de administração; da idade, saúde e peso do receptor; da natureza e extensão dos sintomas, tipo de tratamento atual, freqüência de tratamento e do efeitodesejado. Normalmente, uma dosagem de ingrediente ativo pode ser de cerca de 0,1 a 100 miligramas por quilograma de peso corporal. Comumente, 0,1 a 50 e, de preferência, 0,1 a 10 miligramas por quilograma por administração, ou em forma de liberação sustentada, é eficaz para obtenção dos resultados desejados.
Como exemplo não-limitante, o tratamento de seres humanosou animais pode ser fornecido como uma dosagem única ou periódica de pelo menos um anticorpo da presente invenção de cerca de 0,1 a 100 mg/kg ou qualquer intervalo, valor ou fração desta, por dia, em pelo menos um de 1-40 dias ou, alternativa ou adicionalmente, pelo menos um de 1-52 semanas ou, alternativa ou adicionalmente, pelo menos um de 1-20 anos, ou qualquer combinação destes, usando dose única, infusão ou doses repetidas.
Formas de dosagem (composição) adequadas para administração interna geralmente contêm de cerca de 0,001 miligrama a 30 cerca de 500 miligramas de ingrediente ativo por unidade ou recipiente. Nessas composições farmacêuticas, o ingrediente ativo normalmente estará presente em uma quantidade de cerca de 0,5-99,999% por peso, com baseno peso total da composição.
Para administração parenteral, o anticorpo pode ser formulado como uma solução, suspensão, emulsão, partícula, pó ou pó liofilizado em associação, ou fornecido separadamente, com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável. Exemplos de tais veículos são água, soro fisiológico, solução de Ringer, solução de dextrose e cerca de 1-10% de albumina sérica humana. Lipossomos e veículos não aquosos como, por exemplo, óleos fixos, também podem ser utilizados. O veículo ou o pó liofilizado pode conter aditivos que mantêm a isotonicidade (por exemplo, cloreto de sódio, manitol) e estabilidade química (por exemplo, tampões e conservantes). A formulação é esterilizada por técnicas conhecidas ou adequadas.
Veículos farmacêuticos adequados são descritos na edição mais recente de "Remington's Pharmaceutical Sciences", A. Osol, um texto de referência-padrão nesse campo. Administração alternativa
Muitos modos conhecidos e desenvolvidos podem ser usados de acordo com a presente invenção para a administração de quantidades farmaceuticamente eficazes de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 de acordo com a presente invenção. Embora a administração pulmonar seja usada na descrição seguinte, outros modos de administração podem ser usados de acordo com a presente invenção com resultados adequados. Os anticorpos IL-6 da presente invenção podem ser liberados em um veículo, como uma solução, emulsão, colóide ou suspensão, ou como um pó seco, usando qualquer um dos diversos dispositivos e métodos adequados para administração por inalação ou por outros modos aqui descritos ou conhecidos na técnica. Formulações e administração parenteral
Formulações para administração parenteral podem conter, como excipientes comuns, água estéril ou soro fisiológico, polialquileno glicóis como, por exemplo, polietileno glicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados e semelhantes. Suspensões aquosas ou oleosaspara injeção podem ser preparadas pela utilização de um emulsificante ou umidificante apropriado e um agente de suspensão, de acordo com métodos conhecidos. Agentes para injeção podem ser um agente diluente atóxico, administrável por via não oral, por exemplo, solução aquosa, uma solução ou suspensão injetável estéril, em um solvente. Como veículo ou solvente utilizáveis, água, solução de Ringer, soro fisiológico isotônico etc. são permitidos; como solvente ou solvente de suspensão comum, pode ser usado óleo não-volátil estéril. Para essas finalidades, qualquer tipo de óleo não-volátil e de ácido graxo pode ser usado, incluindo óleos graxos ou ácidos graxos naturais ou sintéticos ou semi-sintéticos; mono- ou di- ou triglicerídeos naturais ou sintéticos ou semi-sintéticos. A administração parental é conhecida na técnica e inclui, sem limitação, meios convencionais de injeções, um dispositivo de injeção sem agulha com gás pressurizado, como descrito na Patente U.S. NQ 5.851.198, e um dispositivo perfurador a laser, como descrito na Patente U.S. N- 5.839.446, aqui incorporada por referência em sua totalidade. Liberação alternativa
A invenção ainda relaciona-se à administração de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 por via parenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-articular, intrabrônquica, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitária, intracelíaca, intra-cerebelar, intracerebro-ventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intra-miocárdica, intra-óssea, intra-pélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intra-retal, intra-renal, intra-retiniana, intra-espinhal, intra-sinovial, intratorácica, intra-uterina, intravesical, intralesional, em bolo, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal ou transdérmica. Pelo menos uma composição de anticorpo anti-IL-6 pode ser preparada para uso parenteral (subcutânea, intramuscular ou intravenosa) ou qualquer outra administração, particularmente na forma de soluções ou suspensões líquidas; para uso em administração vaginal ou retal, particularmente em formas semi-sólidas como, por exemplo, sem limitação, cremes e supositórios; para administração bucal, ou sublingual,por exemplo, sem limitação, na forma de comprimidos ou cápsulas; ou intranasal, por exemplo, sem limitação, na forma de pós, gotas nasais ou aerossóis nasais ou certos agentes; ou transdérmica como, por exemplo, sem limitação, um gel, pomada, loção, suspensão ou sistema de liberação por emplastro com intensificadores químicos como, por exemplo, sulfoxido de dimetila, tanto para modificar a estrutura da pele quanto para aumentar a concentração de fármaco no emplastro transdérmico (Junginger, e ai. Em "Drug Permeation Enhancement;" Hsieh, D.S., Eds., pp. 59-90 (Mareei Dekker, Inc. Nova York 1994, aqui incorporado por referência em suatotalidade)), ou com agentes oxidantes que permitem a aplicação de formulações que contêm proteínas e peptídeos sobre a pele (WO 98/53847), ou aplicações de campos elétricos para criar vias de transporte transitórias, por exemplo, eletroporação, ou para aumentar a mobilidade de fármacos com carga através da pele, por exemplo, iontoforese, ou aplicação de ultra-som, por exemplo, sonoforese (Patentes U.S. Nos 4.309.989 e 4.767.402) (as publicações e patentes acima são aqui incorporadas por referência em sua totalidade).
Administração pulmonar/nasal
Para administração pulmonar, de preferência, pelo menos uma composição de anticorpo anti-IL-6 é liberada em um tamanho de partícula eficaz para alcançar as vias aéreas inferiores dos pulmões ou seios. De acordo com a invenção, pelo menos um anticorpo anti-IL-6 pode ser liberado por qualquer um dentre diversos dispositivos de inalação ou nasais conhecidos na técnica para administração de um agente terapêutico por inalação. Esses dispositivos capazes de depositar formulações em aerossol na cavidade sinusal ou alvéolos de um paciente incluem inaladores de dose metrificada, nebulizadores, geradores de pó seco, vaporizadores, e semelhantes. Outros dispositivos adequados para direcionamento da administração pulmonar ou nasal de anticorpos também são conhecidos na 30 técnica. Todos esses dispositivos podem usar formulações adequadas para a administração para a dispensa de anticorpos em um aerossol. Tais aerossóis podem ser compostos tanto por soluções (tanto aquosas quantonão aquosas) quanto por partículas sólidas.
Inaladores de dose metrificada como o inalador de dose metrificada Ventolin® tipicamente utilizam um gás propelente e exigem a ativação durante a inspiração (veja, por exemplo, WO 94/16970, WO 98/35888). Inaladores de pó seco como Turbuhaler® (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), inalador Spiros® (Dura), dispositivos comercializados por Inhale Therapeutics, e o inalador de pó Spinalador® (Fisons), usam ativação pela respiração de um pó misto (US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, aqui incorporados por referência em sua totalidade). Nebulizadores como AERx™ Aradigm, o nebulizador Ultravent® (Mallinckrodt) e o nebulizador Acorn II® (Marquest Medicai Products) (US 5404871 Aradigm, WO 97/22376), as referências acima são aqui incorporadas por referência em sua totalidade, produzem aerossóis a partirde soluções, enquanto inaladores de dose metrificada, inaladores de pó seco etc. geram aerossóis de partícula pequena. Esses exemplos específicos de dispositivos de inalação disponíveis comercialmente visam a ser representativos de dispositivos específicos adequados para a prática desta invenção, e não visam a limitar o escopo da invenção.
De preferência, uma composição que compreende pelo menosum anticorpo anti-IL-6 é liberada por um vaporizador ou inalador de pó seco. Há várias características desejadas de um dispositivo de inalação para a administração de pelo menos um anticorpo da presente invenção. Por exemplo, a liberação pelo dispositivo de inalação é vantajosamente confiável, reprodutível e precisa. O dispositivo de inalação pode opcionalmente liberar pequenas partículas secas, por exemplo, menores do que cerca de 10 um, de preferência, cerca de 1-5 jim, para uma boa respirabilidade.
Administração de composições de anticorpo IL-6 como um spray
Um spray que inclui a composição de anticorpo IL-6 pode serproduzido forçando-se uma suspensão ou solução de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 através de um bocal sob pressão. O tamanho e aconfiguração do bocal, a pressão aplicada e a taxa de alimentação de líquido podem ser escolhidos para se obter o rendimento e o tamanho de partícula desejados. Um eletrospray pode ser produzido, por exemplo, por um campo elétrico em conexão com uma alimentação capilar ou do bocal. Vantajosamente, partículas de pelo menos uma composição de anticorpo anti-IL-6 liberadas por um vaporizador têm um tamanho de partícula menor do que cerca de 10 um, de preferência, na faixa de cerca de 1 um a cerca de 5 um e, principalmente, cerca de 2 fim a cerca de 3 um.
As formulações de pelo menos uma composição de anticorpo anti-IL-6 adequadas para uso com um vaporizador tipicamente incluem a composição de anticorpo em uma solução aquosa em uma concentração de cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg de pelo menos uma composição de anticorpo anti-IL-6 por ml de solução ou mg/g, ou qualquer faixa, valor ou fração incluída. A formulação pode incluir agentes, tais como um excipiente, um tampão, um agente de isotonicidade, um conservante, um tensoativo e, de preferência, zinco. A formulação também pode incluir um excipiente ou agente para a estabilização da composição de anticorpo, por exemplo, um tampão, um agente redutor, uma proteína de volume ou um carboidrato. Proteínas de volume úteis na formulação de composições de anticorpo incluem albumina, protamina ou semelhantes. Carboidratos típicos úteis na formulação de composições de anticorpo incluem sacarose, manitol, lactose, trehalose, glicose, ou semelhantes. A formulação da composição de anticorpo também pode incluir um tensoativo, que pode reduzir ou evitar a agregação induzida na superfície da composição de anticorpo causada pela atomização da solução na formação de um aerossol. Podem ser empregados vários tensoativos convencionais, tais como ésteres e alcoóis de ácido graxo de polioxietileno e sorbitol ésteres de ácido graxo de polioxietileno. As quantidades geralmente variarão entre 0,001 e 14% por peso da formulação. Tensoativos especialmente preferidos para as finalidades desta invenção são polioxietileno sorbitano monooleato, polissorbato 80, polissorbato 20, ou semelhantes. Agentes adicionais conhecidos na técnica para a formulação de uma proteína, tais como osanticorpos IL-6, ou porções ou variantes especificadas destes, também podem ser incluídos na formulação.
Administração de composições de anticorpo IL-6 por um nebulizador
As composições de anticorpo da invenção podem ser administradas por um nebulizador como, por exemplo, um nebulizador de jato ou um nebulizador ultra-sônico. Tipicamente, em um nebulizador de jato, uma fonte de ar comprimido é usada para criar um jato de ar de alta velocidade através de um orifício. À medida que o gás se expande além do bocal, é criada uma região de baixa pressão, que puxa uma solução da composição de anticorpo através de um tubo capilar conectado a um reservatório de líquido. O jato de líquido proveniente do tubo capilar é dividido em filamentos e gotículas instáveis à medida que sai do tubo, criando o aerossol. Uma gama de configurações, taxas de fluxo e tipos de defletor pode ser empregada para se obter as características de desempenho desejadas para certo nebulizador de jato. Em um nebulizador ultra-sônico, é usada energia elétrica de alta freqüência para criar energia mecânica vibracional, tipicamente com o emprego de um transdutor piezelétrico. Essa energia é transmitida à formulação da composição de anticorpo, diretamente ou através de um líquido de acoplamento, criando um aerossol que inclui a composição de anticorpo. Vantajosamente, as partículas da composição de anticorpo liberadas por um nebulizador têm um tamanho de partícula menor do que cerca de 10 um, de preferência, na faixa de cerca de 1 um a cerca de 5 um e, principalmente, cerca de 2 um a cerca de 3 u.m.
Formulações de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 adequadas para uso com um nebulizador, tanto de jato quanto ultra-sônico, tipicamente incluem uma concentração de cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg de pelo menos uma proteína de anticorpo anti-IL-6 por ml de solução. A formulação pode incluir agentes, tais como um excipiente, um tampão, um agente deisotonicidade, um conservante, um tensoativo e, de preferência, zinco. A formulação também pode incluir um excipiente ou agente para a estabilização da composição de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 como,por exemplo, um tampão, um agente redutor, uma proteína de volume, ou um carboidrato. Proteínas de volume úteis na formulação de composições de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 incluem albumina, protamina, ou semelhantes. Carboidratos típicos úteis na formulação de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 incluem sacarose, manitol, lactose, trehalose, glicose, ou semelhantes. A formulação de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 também pode incluir um tensoativo, que pode reduzir ou evitar a agregação induzida na superfície do pelo menos um anticorpo anti-IL-6 causada pela atomização da solução na formação de um aerossol. Podem ser empregados vários tensoativos convencionais, tais como ésteres e alcoóis de ácido graxo de polioxietileno e sorbitol ésteres de ácido graxo de polioxietileno. As quantidades geralmente variarão entre cerca de 0,001 e 4% por peso da formulação. Tensoativos especialmente preferidos para as finalidades desta invenção são polioxietileno sorbitano monooleato, polissorbato 80,polissorbato 20, ou semelhantes. Agentes adicionais conhecidos na técnica para a formulação de uma proteína como, por exemplo, uma proteína de anticorpo, também podem ser incluídos na formulação. Administração de composições de anticorpo IL-6 por um inalador de dose metrificada
Em um inalador de dose metrificada (NIDI), um propelente, pelomenos um anticorpo anti-IL-6 e quaisquer excipientes ou outros aditivos são contidos em uma lata como uma mistura que inclui um gás comprimido liqüefeito. A ativação da válvula de metrificação libera a mistura como um aerossol, de preferência, contendo partículas na faixa de tamanho de menos do que cerca de 10 um, de preferência, cerca de 1 fim a cerca de 5 pm e, principalmente, cerca de 2 jim a cerca de 3 pm. O tamanho de partícula do aerossol desejado pode ser obtido com o emprego de uma formulação da composição de anticorpo produzida por vários métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo trituração por jato, secagem poratomização, condensação de ponto crítico, ou semelhantes. Inaladores de dose metrificada preferidos incluem aqueles fabricados por 3M ou Glaxo e que empregam um propelente hidrofluorcarbono. Formulações de pelomenos um anticorpo anti-IL-6 para uso com um dispositivo inalador de dose metrificada incluirão geralmente um pó finamente dividido contendo pelo menos um anticorpo anti-IL-6 como uma suspensão em um meio não aquoso, por exemplo, suspenso em um propelente com o auxílio de um tensoativo. O propelente pode ser qualquer material convencional empregado para essa finalidade, por exemplo, um clorofluorcarbono, um hidroclorofluorcarbono, um hidrofluorcarbono ou um hidrocarboneto, incluindo triclorofluormetano, diclorodifluormetano, diclorotetrafluoretanol e 1,1,1,2-tetrafluoretano, HFA-134a (hidrofluoralcano-134a), HFA-227(hidrofluoralcano-227), ou semelhantes. De preferência, o propelente é um hidrofluorcarbono. O tensoativo pode ser escolhido para estabilizar o pelo menos um anticorpo anti-IL-6 como uma suspensão no propelente, para proteger o agente ativo contra degradação química, e semelhantes. Tensoativos adequados incluem sorbitano trioleato, lecitina de soja, ácidooléico, ou semelhantes. Em alguns casos, são preferidos aerossóis em solução com o uso de solventes, por exemplo, etanol. Agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína também podem ser incluídos na formulação. Aqueles versados na técnica reconhecerão que os métodos da presente invenção podem ser obtidos por administraçãopulmonar de uma composição de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 através de dispositivos não descritos nesta especificação. Formulações e administração oral
As formulações para administração oral se baseiam na co-administração de adjuvantes (por exemplo, resorcinóis e tensoativos não-iônicos, tais como oleil éter de polioxietileno e n-hexadecilpolietileno éter) para aumentar artificialmente a permeabilidade das paredes intestinais, bem como a co-administração de inibidores enzimáticos (por exemplo, inibidores da tripsina pancreática, diisopropilfluorfosfato (DFF) e trasilol) para inibir a degradação enzimática. Formulações para liberação de agentes hidrofílicos,incluindo proteínas e anticorpos e uma combinação de pelo menos dois tensoativos destinados à administração oral, bucal, mucosa, nasal, pulmonar, vaginal transmembrana ou retal, são ensinadas na Patente U.S.6.309.663. O composto do constituinte ativo da forma de dosagem do tipo sólida para administração oral pode ser misturado com pelo menos um aditivo, incluindo sacarose, lactose, celulose, manitol, trehalose, rafinose, maltitol, dextrana, amidos, ágar, arginatos, quitinas, quitosanas, pectinas, goma tragacanto, goma arábica, gelatina, colágeno, caseína, albumina, polímero sintético ou semi-sintético e glicerídeo. Essas formas de dosagem também podem conter outro(s) tipo(s) de aditivos, por exemplo, agentes diluentes inativos, lubrificantes como, por exemplo, estearato de magnésio, parabeno, agentes conservantes como, por exemplo, ácido sórbico, ácido ascórbico, alfa-tocoferol, antioxidantes como, por exemplo, cisteína, desintegrante, ligantes, espessantes, agentes de tamponamento, agentes adoçantes, agentes flavorizantes, agentes perfumantes etc.
Comprimidos e pílulas podem ainda ser processados em preparações com revestimento entérico. As preparações líquidas paraadministração oral incluem preparações de emulsão, xarope, elixir, suspensão e solução adequadas ao uso médico. Essas preparações podem conter agentes diluentes inativos normalmente usados no referido campo, por exemplo, água. Lipossomos também foram descritos como sistemas de liberação de fármacos para insulina e heparina (Patente U.S. N9 4.239.754).
Mais recentemente, microesferas de polímeros artificiais de aminoácidos misturados (proteinóides) foram usadas para liberar substâncias farmacêuticas (Patente U.S. N9 4.925.673). Além disso, compostos transportadores descritos na Patente U.S. N9 5.879.681 e na Patente U.S. N9 5.871.753 e usados para liberar agentes biologicamente ativos oralmentesão conhecidos na técnica.
Formulações e administração mucosas
Uma formulação para a administração oral de um agente bioativo encapsulado em um ou mais excipientes de polímero ou copolímero biocompatível, de preferência, um polímero ou copolímero biodegradável, gerando microcápsulas que, em função do tamanho adequado das microcápsulas resultantes, fazem com que o agente alcance e seja captado pelos agregados de folículos linfáticos, também conhecidos como "placa dePeyer" ou "GALT" do animal sem perda de eficácia, já que o agente já ultrapassou o trato gastrointestinal. Agregados de folículos linfáticos similares podem ser encontrados nos tubos brônquicos (BALT) e no intestino grosso. Os tecidos mencionados acima são denominados, de forma geral, tecidos linforreticulares associados às mucosas (MALT). Para a absorção através de superfícies mucosas, as composições e os métodos de administração de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 incluem uma emulsão que compreende diversas partículas submícron, uma macromolécula mucoadesiva, um peptídeo bioativo e uma fase aquosa contínua, o quepromove a absorção através de superfícies mucosas pela obtenção de mucoadesão das partículas da emulsão (Patente U.S. NQ 5.514.670). Superfícies mucosas adequadas para a aplicação das emulsões da presente invenção podem incluir vias de administração corneana, conjuntival, bucal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomacal, intestinal e retal. Asformulações para administração vaginal ou retal, por exemplo, supositórios, podem conter como excipientes, por exemplo, polialquilenoglicóis, vaselina, manteiga de cacau, e semelhantes. Formulações para administração intranasal podem ser sólidas e conter como excipientes, por exemplo, lactose, ou podem ser soluções aquosas ou oleosas de gotas nasais. Paraadministração bucal, excipientes incluem açúcares, estearato de cálcio, estearato de magnésio, amido pré-gelatinizado, e semelhantes (Patente U.S. NB 5.849.695).
Formulações e administração transdérmica
Para administração transdérmica, pelo menos um anticorpo anti-IL-6 é encapsulado em um dispositivo de liberação, por exemplo, um lipossomo ou nanopartículas, micropartículas, microcápsulas, ou microesferas poliméricas (citadas coletivamente micropartículas, a menos que definido de forma diferente). Diversos dispositivos adequados são conhecidos, incluindo micropartículas feitas de polímeros sintéticos, tais 30 como ácidos polihidróxi, por exemplo, ácido polilático, ácido poliglicólico e copolímeros destes, poliortoésteres, polianidridos e polifosfazenos, e polímeros naturais, tais como colágeno, poliaminoácidos, albumina e outrasproteínas, alginato e outros polissacarídeos, e combinações destes (Patente U.S. Ne 5.814.599).
Administração e formulações prolongadas
Pode ser desejável liberar os compostos da presente invenção ao indivíduo ao longo de períodos de tempo prolongados, por exemplo, por períodos de uma semana a um ano por uma administração única. Várias formas de dosagem de liberação lenta, de depósito ou por implante podem ser utilizadas. Por exemplo, uma forma de dosagem pode conter um sal atóxico farmaceuticamente aceitável dos compostos que têm um grau de solubilidade baixo nos fluidos corpóreos, por exemplo, (a) um sal de adição ácido com um ácido polibásico, por exemplo, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido tânico, ácido pamóico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácidos naftaleno mono- ou dissulfônicos, ácido poligalacturônico, e semelhantes; (b) um sal com um cátion de metal polivalente como, por exemplo, zinco, cálcio, bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel, cádmio e semelhantes, ou com um cátion orgânico formado, por exemplo, por N,N'-dibenzil-etilenodiamina ou etilenodiamina; ou (c) combinações de (a) e (b), por exemplo, um sal de tanato de zinco. Adicionalmente, os compostos da presente invenção ou, de preferência, um sal relativamente insolúvel, tais como aqueles mencionados anteriormente, podem ser formulados em um gel, por exemplo, um gel de monoestearato de alumínio com, por exemplo, óleo de gergelim, adequado para injeção. Sais particularmente preferidos são sais de zinco, sais de tanato de zinco, sais de pamoato, e semelhantes. Outro tipo de formulação de depósito de liberação lenta para injeção conteria o composto ou sal disperso para encapsulação em um polímero não antigênico, de degradação lenta, atóxico como, por exemplo, um polímero de ácido polilático/ácido poliglicólico, por exemplo, como descrito na Patente U.S. N9 3.773.919. Os compostos ou, de preferência, sais relativamente insolúveis, tais como aqueles descritos acima, também podem ser formulados em péletes de silastic com matriz de colesterol, particularmente para uso em animais. Formulações de liberação lenta adicionais, de depósito ou para implante, porexemplo, lipossomos de gás ou líquido, são conhecidas na literatura(Patente U.S. N- 5.770.222 e "Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems", J.R. Robinson ed., Mareei Dekker, Inc., N.Y., 1978).
Após a invenção ter sido descrita de forma geral, a mesma serámais facilmente compreendida por referência aos exemplos seguintes, osquais são fornecidos como forma de ilustração, e não como limitantes dainvenção.
Indicações
Artrite reumatóide (AR)
A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória sistêmicacrônica com características auto-imunes. Várias das características da ARpodem ser explicadas através da ação da IL-6 desregulada.
As ações da IL-6 potencialmente relevantes na AR incluem aindução de hipergamaglobulinemia policlonal e a produção de auto-anticorpo(fator reumatóide), através das ações de IL-6 como um fator dediferenciação de células B; a promoção do desenvolvimento de células Tcitotóxicas, relacionado à IL-2; a produção de proteínas da fase aguda (CRP,SAA, fibrinogênio), através da atividade de estimulação de hepatócitos;ativação de osteoclastos, levando à osteoporose periarticular e destruiçãoóssea; a indução de trombocitose, através da ação como fator dediferenciação de megacariócitos; e a regulação de VEGF e, portanto,potencialmente da angiogênese, relacionada à IL-J3 e TNFa.
IL-6 é produzida por fibroblastos sinoviais da AR estimuladospor TNFa ou IL-1, e está presente em alta concentração tanto no líquidosinovial (LS) quanto no soro na AR. Existem correlações entre os níveisséricos e os índices clínicos/laboratoriais de atividade da doença.mAbs anti-IL-6/IL-6R foram estudados em vários estudosclínicos em pacientes com AR ativa. Os resultados até hoje são descritosresumidamente abaixo.
Estudos de fase l/lI
No primeiro desses estudos, um mAb anti-IL-6 murídeo (BE-8)foi administrado diariamente por 10 dias consecutivos em 5 pacientes comAR, e foi associado a uma melhora clínica e laboratorial transitória (9)(Wendling, D.; e ai 1993 J. Rheumatol. 20: 259). O mAb humanizado anti-IL-6R (80 kDa) (MRA; Chugai) foi testado em vários estudos de fase l/ll empacientes com AR. No primeiro desses estudos, MRA foi administrado porinfusão IV em doses de 1-50 mg uma vez ou duas vezes por semana, comtratamento de manutenção de 50 mg por semana por até 6 meses. Issoresultou em diminuições rápidas nas medidas da fase aguda, proteína C-reativa (CRP) e fibrinogênio, e em febre de grau baixo, fadiga eclassificações clínicas, tais como rigidez matinal e contagens de edema esensibilidade articulares. Também foram observadas melhoras na anemia,trombocitose e hipergamaglobulinemia. Em um estudo subseqüente, 45pacientes foram tratados com a infusão IV única de MRA em uma dose de0,1-10 mg/kg, e resultou em uma tendência de melhora nas classificaçõesclínicas em níveis de dose mais elevados, mais reduções nos reagentes dafase aguda.
Estudos de fase II
No primeiro desses estudos, 15 pacientes foram tratados comMRA (níveis de dose dè 2, 4 ou 8 mg/kg quinzenalmente por 24 semanas), emostraram respostas de ACR20 em 13/15 na 24§ semana, comnormalização de CRP/Amilóide sérico A (SAA). Embora não tenha havidopreocupações agudas de segurança, até dois terços dos pacientesapresentaram aumento acentuado dos níveis de colesterol LDL. Em umsegundo estudo de fase II, 164 pacientes com AR resistente aos DMARDsforam tratados com placebo ou MRA por infusão IV (níveis de dose de 4 ou 8mg/kg, dados a cada 4 semanas por 3 meses), e mostraram taxas deresposta de ACR20 na 12§ semana de 11%, 57% e 78% para placebo, 4 e 8mg/kg, respectivamente. Finalmente, 359 pacientes com AR ativa receberamMTX isoladamente (10-25 mg/semana), MRA isoladamente (níveis de dosede 2, 4 ou 8 mg/kg, administrados mensalmente por infusão IV) ou MTXmais MRA. MRA e MRA + MTX foram mais eficazes do que MTXisoladamente, como determinado pela resposta de ACR20.Lúpus eritematoso sistêmico (LES)
O lúpus eritematoso sistêmico é uma doença auto-imunecrônica, potencialmente fatal, com múltiplas manifestações multiformes. Aetiologia é desconhecida. Um ponto marcante da doença envolvehiperproliferação de células B, ativação e produção de auto-anticorposcontra diversos auto-antígenos.
IL-6 induz a diferenciação de células B em células produtorasde anticorpos. No LES, há uma produção aumentada de auto-anticorpos(ANA, anti-dsDNA) por essas células produtoras de anticorpos e deposiçãode complexo imune. IL-6 promove o desenvolvimento de células Tcitotóxicas, aumenta os reagentes hepáticos da fase aguda, a proliferaçãode células mesangiais, o crescimento de queratinócitos, a diferenciaçãomegacariocítica e trombose.
Os níveis de IL-6 estão elevados tanto em pacientes com LESquanto em modelos murídeos de LES. Foi demonstrado que a ligação doreceptor de IL-6 em células B induz a diferenciação terminal de células B emcélulas produtoras de auto-anticorpos. Linker-lsraeli e ai (Linker-lsraeli M. eai, 1991 J. Immunol. 147: 117-123) demonstraram diminuições na produçãoespontânea de anticorpo policlonal quando eram utilizados anticorposneutralizantes contra IL-6. Kitani e outros (Kitani A., e ai, 1992 Clin. Exp.Immunol. 88: 75-83) apoiaram esses achados ao demonstrarem que aprodução in vitro de células T de IL-6 dobrou em culturas de LES, e quecélulas B do LES tinham uma produção de IL-6 cinco vezes maior do quecélulas B de controle. No entanto, a produção patológica de auto-anticorposno LES não se limita apenas aos efeitos da IL-6. O papel do receptor de IL-6também foi estudado. Nagafuchi e outros demonstraram a supra-regulaçãodo receptor de IL-6 na maioria das células B do LES versus células Bnormais. O anticorpo anti-receptor de IL-6 inibiu a diferenciação terminaldessas células B em células produtoras de anticorpos. O papel do receptorsolúvel de IL-6 no LES ainda está para ser determinado.
Diabetes melito do Tipo II (DMT2)
A resistência à insulina (deficiência da ação da insulina) e adeficiência da função de células p (déficit funcional de células p pancreáticaspara secretar insulina) são consideradas como sendo as causas principaisdo desenvolvimento do DMT2. A resistência à insulina manifesta-se comouma incapacidade dos tecidos periféricos para responderemadequadamente ao ataque da insulina causando, dessa forma, um aumentonos níveis sangüíneos de glicose. O aumento da resistência à insulina e dosníveis sangüíneos de glicose é seguido por uma hiper-secreçãocompensatória de insulina por células p pancreáticas nos estágios iniciais dadoença. À medida que a DMT2 progride, a habilidade das células p parasecretar insulina se deteriora.
Os mecanismos subjacentes responsáveis pelodesenvolvimento de resistência à insulina não-estão claros. A condição maiscomumente associada ao desenvolvimento do DMT2 é a obesidade, e atémesmo uma pequena perda de peso melhora significativamente os níveis deglicose em pacientes com DMT2.
Tanto a obesidade quanto a resistência àinsulina/hiperinsulinemia, em combinação com dislipidemia, tolerânciaalterada à glicose e hipertensão, caracterizam a condição denominadaSíndrome Metabólica. A progressão natural da Síndrome Metabólica até oDMT2 predispõe os indivíduos ao desenvolvimento de alterações micro- emacrovasculares que podem levar à doença cardiovascular (CV) e, por fim,à morte. Sugeriu-se que a obesidade, a resistência à insulina e ahiperinsulinemia são as ligações mais prováveis entre DMT2 e doença CV.
O tecido adiposo foi identificado como um dos órgãos principaisque regulam o metabolismo, sendo tanto um depósito de estocagem deenergia quanto um órgão endócrino que secreta várias moléculas envolvidasna regulação da sensibilidade à insulina. Além de leptina, resistina,adiponectina e TNFoc, o tecido adiposo secreta IL-6, o que foi sugerido comorepresentando a ligação entre obesidade, inflamação, DMT2 e doençacardiovascular (CV).
Uma correlação positiva entre adiposidade e níveis de IL-6 foidocumentada. É possível que o tecido adiposo aumentado na obesidadepossa fornecer aumentos sustentados da IL-6 circulante, o que poderiadiminuir a sensibilidade à insulina ao promover a inflamação em tecidos querespondem à insulina ou causar resistência à insulina ao interferir com aatividade e a expressão de proteínas envolvidas na cascata de sinalizaçãoda insulina. Existem dados tanto in vitro quanto in vivo que apoiam ou seopõem ao papel potencial da IL-6 no desenvolvimento de resistência àinsulina.
Dados in vitro com o uso de sistemas celulares bem definidos,incluindo células hepáticas (HepG2)(44), de gordura (3T3L1) ou isoladas deilhota pancreática de rato, mostram um efeito negativo direto de IL-6 sobre asinalização de insulina, captação de glicose e secreção de insulina,respectivamente. Por outro lado, dados obtidos de experimentos feitos embiópsias de músculo esquelético sugerem que IL-6 pode aumentar acaptação de glicose no músculo em exercício.
Dados in vivo sobre a associação entre os níveis de IL-6 e asensibilidade à insulina são igualmente confusos. Modelos desuperexpressão ou ablação completa de IL-6 sugerem que a inibiçãocompleta da atividade de IL-6 talvez não tenha um efeito benéfico. Porexemplo, em camundongos transgênicos diabéticos não obesos (NOD), asuperexpressão de IL-6 humana retarda o surgimento do diabetes eprolonga a sobrevida. Além disso, dados de camundongos null para IL-6sugerem que IL-6 pode ter uma participação na regulação do equilíbrioenergético, uma vez que esses animais desenvolvem obesidade desurgimento tardio e níveis de glicose mais elevados.
Em seres humanos, uma mutação de ocorrência natural dentroda região do promotor de IL-6 leva a um aumento na taxa de secreção de IL-6. Essa mutação foi associada tanto a um aumento quanto a uma diminuiçãoda sensibilidade à insulina.
Em outro conjunto de experimentos, foi avaliado o efeito de IL-6exógena. Em indivíduos normais, a administração de IL-6 produz aumentosdos níveis de glicose, sem afetar concentrações plasmáticas de insulina,enquanto, em pacientes com câncer, a adição de IL-6 aumentou adisponibilidade de glicose. Além disso, foi examinada a correlação entre osníveis de IL-6 e a resistência à insulina. Dados desses experimentossugerem que, tanto em homens quanto em mulheres, níveis circulantes maiselevados de IL-6 foram correlacionados com uma maior resistência àinsulina, embora um relacionamento de causa e efeito ainda não tenha sidodeterminado.
Foi indicado que IL-6 tem uma participação importante nodesenvolvimento de resistência à insulina associada à obesidade. Noentanto, existem dados in vitro e in vivo conflitantes que tanto apoiam quantose opõem à sua participação potencial na resistência à insulina.
Osteoartrite ÍOA)
A osteoartrite é um distúrbio articular degenerativo crônicocaracterizado por perda de cartilagem articular e alterações relacionadas noosso subcondral. Embora sejam observados graus variáveis de inflamaçãosob artroscopia ou em amostras de biópsia sinovial, a doença não éprimariamente inflamatória. Em vez disso, acredita-se que se origine dealterações no metabolismo de condrócitos e/ou osteoblastos. TNF, IL-1 e IL-6 são as citocinas mais fortemente associadas a essas alterações.
IL-6 é detectável no líquido sinovial de pacientes com OA,embora em níveis substancialmente abaixo daqueles observados emartropatias inflamatórias (Bertazzolo, N. e al. 1994 Agents and Actions 41:90-92). IL-6 é reconhecida como sendo um estímulo primário para a sínteseda proteína hepática da fase aguda, e os níveis de CRP estão associados àpresença de AO do joelho, mesmo levando-se em conta a associaçãoconhecida entre CRP e obesidade (Mohtai, M. e al. 1996 J. OrthopedicResearch 14: 67-73).
IL-6 é expressa em condrócitos da cartilagem da OA, mas nãona cartilagem normal (Sowers, M. e al. 2002 Osteoarthritis and Cartilage 10:595-601). Em experimentos que testam os efeitos do estresse mecânicosobre a expressão in vitro de citocina por condrócito, o estresse decisalhamento induzido por líquidos supra-regulou acentuadamente o mRNAe a proteína de IL-6. Isso sugere que a expressão de IL-6 em cartilagem daOA pode ser resultado de sobrecarga mecânica. IL-6 também foi produzidaem resposta à ação de IL-1 sobre condrócitos (Dozin, B. e ai 2002 MatrixBiologylV. 449-459).
Em outros experimentos, a IL-6, em combinação com slL-6R,leva à inibição da síntese de proteoglicano por condrócitos articulareshumanos cultivados ex vivo, embora o efeito fosse modesto, comparado comIL-1 (Guerne, P. e ai 1999 Matrix Biology18: 253-260).
Doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)
A doença pulmonar obstrutiva crônica é um estado de doençacaracterizado por limitação do fluxo de ar que não é totalmente reversível. Alimitação do fluxo de ar é normalmente progressiva e associada a umaresposta inflamatória anormal dos pulmões às partículas e aos gasesnocivos (Pauwels R.A. e ai 2001 Am. J. Respir. Crit. Care Med 163: 1.256-1.276). A DPOC é caracterizada por aceleração no declínio normal dafunção pulmonar observada com o envelhecimento. A limitação lentamenteprogressiva do fluxo de ar leva à invalidez e à morte prematura. A DPOC éuma causa importante de morte e invalidez, mas apenas recentemente foiintensamente explorada por uma perspectiva celular e molecular (BarnesP.J. e ai 2003 Eur. Respir. J. 22: 672-688). Na DPOC, há uma inflamaçãocrônica que leva a um estreitamento fixo das pequenas vias aéreas e àdestruição alveolar (enfisema). A resposta inflamatória é caracterizada porum número aumentado de macrófagos, neutrófilos e linfócitos T citotóxicosalveolares e pela liberação de vários mediadores inflamatórios (quimiocinas,citocinas, fatores de crescimento e lipídeos). Um nível elevado de estresseoxidativo pode amplificar a inflamação. Também há aumento da elastólise eevidências de envolvimento de várias enzimas elastolíticas. A inflamação e aproteólise na DPOC é uma amplificação da resposta inflamatória normal aotabagismo. Ao contrário da asma, a inflamação parece ser resistente aoscorticosteróides (Barnes P.J. e ai 2003).
Em modelos animais, endotoxinas ou lipopolissacarídeosbacterianos (LPS) e a exposição à fumaça do cigarro induzem neutrofilia eprodução aumentada de IL-6 no líquido do lavado brônquio-alveolar (BAL)(Underwood D.C. e al. 2000 AJPLCMP 279: L895-902). A superexpressãode IL-6 nos pulmões de camundongo induz enfisema (Kuhn III Ch. e al. 2000AJRCMB 22: 289-295). Em seres humanos, o volume expiratório forçado emum segundo (FFV1) está inversamente relacionado aos níveis de IL-6, IL-8 eàs contagens de células polimorfonucleares no BAL (Soler N. e al. 1999 Eur.Respir. J. 14: 1.015-1.022). Os níveis plasmáticos de TNFa, IL-6 e CRPestão aumentados em indivíduos com DPOC de leve a grave (Yasuda N. eal. 1998 Respir. Med. 92: 993-999).
A exacerbação aguda da DPOC é definida como uma pioramantida da condição do paciente, a partir de um estado estável e além dasvariações normais do dia-a-dia, que é aguda em seu surgimento e necessitade uma mudança da medicação regular (Burge S. e al. 2003 Eur. Respir. J.21: Supl. 41, 46s-53s). Embora o agravamento dos sintomas e a piora dafunção pulmonar sejam uma causa comum de internação hospitalar(aproximadamente 500.000 por ano nos EUA), os mecanismos celulares emoleculares subjacentes ainda não foram amplamente investigados e sãopouco compreendidos (Wedzicha, J.A. 2002 Chest 121: 136S-141S). Asexacerbações agudas podem ser prolongadas e têm um efeito profundosobre a qualidade de vida e podem acelerar a progressão da DPOC (SotoF.J. e al. 2003 Pulm. Med. 9: 117-124). As infecções respiratórias são ascausas mais comuns de exacerbações da DPOC. A maioria dessasinfecções é causada por bactérias, mas muitas delas são produzidas porinfecções virais, particularmente rinovírus (Soto F.J. e al. 2003). Fatoresambientais, poluentes do ar e temperatura também podem ter umaparticipação.
Durante a exacerbação, há um aumento dos neutrófilos e dasconcentrações de IL-6, IL-8, TNFa e LTB4 no escarro de pacientes comDPOC. Alguns pacientes com DPOC de moderada a grave têm umatendência a apresentar exacerbações freqüentes (três ou maisexacerbações por ano). Esse grupo de pacientes ("com exacerbaçõesfreqüentes") tem um nível mais elevado de IL-6 e um nível menor de inibidorde protease de leucócito secretor, mesmo quando a DPOC está estável(Bhowmik A. e al. 2000 Thorax 55: 114-120; Gompertz S. e al. 2001 Thorax56: 36-41; Gompertz S. e al. 2001 Eur. Respir. J. 17: 1.112-1.119).
Vários outros mecanismos, tais como o estresse oxidativo e acolonização bacteriana, também foram implicados na fisiopatologia daexacerbação da DPOC.
Exemplo 1: Clonagem e expressão de anticorpo IL-6 em célulasmamíferas
Um vetor de expressão mamífero típico contém pelo menos umelemento promotor, que medeia a iniciação da transcrição de mRNA, aseqüência codificadora do anticorpo e sinais necessários para a terminaçãoda transcrição e poliadenilação do transcrito. Elementos adicionais incluemintensificadores, seqüências de Kozak e seqüências intervenientesflanqueadas por sítios doadores e receptores para junção de RNA. Umatranscrição altamente eficiente pode ser obtida com os promotores precocese tardios de SV40, as repetições terminais longas (LTRS) de retrovírus, porexemplo, RSV, HTLVI, HIVI, e o promotor precoce do citomegalovírus(CMV). No entanto, elementos celulares também podem ser usados (porexemplo, o promotor humano de actina). Vetores de expressão adequadospara uso na prática da presente invenção incluem, por exemplo, vetores, taiscomo pIRESIneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN ou pLNCX (ClonetechLabs, Paio Alto, CA), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) ou pcDNA3.1/Higro(+/-) (Invitrogen), PSVL e PMSG (Pharmacia, Uppsala, Suécia), pRSVcat(ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) e pBC12MI (ATCC 67109). Célulashospedeiras mamíferas e outras adequadas incluem células humanas Hela,293, H9 e Jurkat, células de camundongo NIH3T3 e C127, Cos 1, Cos 7 eCV 1, células de codorna QC1-3, células de camundongo L e células deovário de hamster chinês (CHO). Alternativamente, o gene pode serexpresso em linhagens celulares estáveis que contêm o gene integrado emum cromossomo. A co-transfecção com um marcador selecionável como,por exemplo, dhfr, gpt, neomicina ou higromicina, permite a identificação e oisolamento das células transfectadas.
O gene transfectado também pode ser amplificado paraexpressar grandes quantidades do anticorpo codificado. O marcador DHFR(diidrofolato redutase) é útil para o desenvolvimento de linhagens celularesque portam várias centenas ou mesmo vários milhares de cópias do gene deinteresse. Outro marcador de seleção útil é a enzima glutamina sintase (GS)(Murphy, e ai, Biochem. J. 227: 277-279 (1991); Bebbington, e ai,Bio/Technology 10: 169-175 (1992)). Com o uso desses marcadores, ascélulas mamíferas crescem em meio seletivo e as células com a maiorresistência são selecionadas. Essas linhagens celulares contêm o gene(s)amplificado(s) integrado em um cromossomo. Células de ovário de hamsterchinês (CHO) e NSO são usadas freqüentemente para a produção deanticorpos.
Os vetores de expressão pC1 e pC4 contêm o promotor forte(LTR) do vírus do sarcoma de Rous (Cullen, e ai, Mol. Celi Biol. 5: 438-447(1985)), mais um fragmento do intensificador de CMV (Boshart, e ai, Ce//41:
521-530 (1985)). Sítios de clonagem múltipla, por exemplo, com os sítios declivagem por enzima de restrição BamiHI, Xbal e Asp718, facilitam aclonagem do gene de interesse. Os vetores contêm, além do íntron 3', osinal de poliadenilação e de terminação do gene de pré-proinsulina de rato.Clonagem e expressão em células CHO.
O vetor pC4 pode ser usado para a expressão do anticorpo IL-6. O plasmídeo pC4 é um derivado do plasmídeo pSV2-dhfr (Ne de AcessoATCC 37146). O plasmídeo contém o gene de DHFR de camundongo sobcontrole do promotor precoce SV40. Células de ovário de hamster chinês ououtras células desprovidas de atividade de diidrofolato que são transfectadascom esses plasmídeos podem ser selecionadas por crescimento das célulasem um meio seletivo (por exemplo, alfa menos MEM, Life Technologies,Gaithersburg, MD) suplementado com o agente quimioterápico metotrexato.
A amplificação dos genes de DHFR em células resistentes ao metotrexato(MTX) foi bem documentada (veja, por exemplo, F.W. Alt, e ai, J. Biol.Chem. 253: 1.357-1.370 (1978); J.L Hamlin e C. Ma, Biochem. et Biophys.Acta 1.097: 107-143 (1990); e M.J. Page e M.A. Sydenham, Biotechnology9:64-68 (1991)). Células crescidas em concentrações crescentes de MTXdesenvolvem resistência ao fármaco por superprodução da enzima-alvo,DHFR, como resultado da amplificação do gene de DHFR. Se um segundogene estiver ligado ao gene de DHFR, ele será normalmente co-amplificadoe superexpresso. Sabe-se na técnica que essa abordagem pode ser usadapara o desenvolvimento de linhagens celulares que portam mais de 1.000cópias do gene(s) amplificado(s). Subseqüentemente, quando o metotrexatoé retirado, são obtidas linhagens celulares que contêm o gene amplificadointegrado em um ou mais cromossomos da célula hospedeira.
Promotores de alta eficiência diferentes do promotor forte darepetição terminal longa (LTR) do vírus do sarcoma de Rous também podemser usados para a expressão, por exemplo, o promotor humano de (3-actina,os promotores precoces ou tardios de SV40 ou as repetições terminaislongas de outros retrovírus, por exemplo, HIV e HTLVI. Os sistemas deexpressão gênica Tet-Off e Tet-On da Clontech e sistemas similares podemser usados para a expressão do anticorpo IL-6 de forma regulada em célulasmamíferas (M. Gossen, e H. Bujard, Proc. A/aí/. Acad. Sei. USA 89: 5.547-5.551 (1992)). Para a poliadenilação do mRNA, outros sinais, por exemplo,dos genes do hormônio do crescimento humano ou de globina, tambémpodem ser utilizados. Linhagens celulares estáveis que portam um gene deinteresse integrado nos cromossomos também podem ser selecionadasmediante co-transfecção com um marcador selecionável como, por exemplo,gpt, G418 ou higromicina. É vantajosa a utilização de mais de um marcadorselecionável no começo, por exemplo, G418 mais metotrexato. O plasmídeopC4 é digerido com enzimas de restrição e depois desfosforilado com o usode fosfatase intestinal de bezerro por procedimentos conhecidos na técnica.
O vetor é então isolado de um gel de agarose 1 %.
A seqüência de DNA que codifica o anticorpo IL-6 completo éusada, por exemplo, como apresentada nos IDS. DE SEQ. N°s: 98 e 96, quecorrespondem às regiões variáveis da HC e LC de um anticorpo IL-6 dapresente invenção, respectivamente, de acordo com etapas conhecidas dométodo. O ácido nucléico isolado que codifica uma região constante humanaadequada (ou seja, regiões da HC e LC) também é usado nessa construção.As regiões variável e constante isoladas que codificam o DNA e
0 vetor desfosforilado são então ligadas com T4 DNA ligase. Células de E.coli HB 101 ou XL-1 Blue são transformadas, e são identificadas as bactériasque contêm o fragmento inserido no plasmídeo pC4 com o uso, por exemplo,de análise de enzima de restrição.
Células de ovário de hamster chinês (CHO) desprovidas de umgene de DHFR ativo são usadas para transfecção. Cinco microgramas doplasmídeo de expressão pC4 são co-transfectados com 0,5 micrograma doplasmídeo pSV2-neo usando lipofectina. O plasmídeo pSV2neo contém ummarcador selecionável dominante, o gene neo de Tn5 que codifica umaenzima que confere resistência a um grupo de antibióticos que inclui G418.As células são semeadas em alfa menos MEM suplementado com 1micrograma/ml de G418. Após 2 dias, as células são tripsinizadas esemeadas em placas de clonagem de hibridoma (Greiner, Alemanha) emalfa menos MEM suplementado com 10, 25 ou 50 ng/ml de metotrexato mais1 micrograma/ml de G418. Após cerca de 10-14 dias, clones únicos sãotripsinizados e depois semeados em placas de Petri de 6 cavidades oufrascos de 10 ml com o uso de diferentes concentrações de metotrexato (50nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Os clones que crescem nas maioresconcentrações de metotrexato são então transferidos para novas placas de 6cavidades contendo concentrações ainda maiores de metotrexato (1 mM, 2mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). O mesmo procedimento é repetido, até quesejam obtidos clones que cresçam em uma concentração de 100-200 mM. Aexpressão do produto gênico desejado é analisada, por exemplo, por SDS-PAGE e Western blot, ou por análise HPLC de fase reversa.
Exemplo 2 - Construção e rastreamento de anticorpos anti-IL-6
Variantes do anticorpo IL-6 (clone AME-A9) foram construídas erastreadas quanto à atividade. Neste exemplo e em outras seções destaespecificação, as CDRs são como definidas por Kabat, com a exceção deCDRH1, que é a soma das definições de Kabat e Chotia. O comprimento deCDRH2 tornou necessária a construção de duas bibliotecas separadas paracobrir toda a região. Os clones de interesse foram seqüenciados eadicionalmente caracterizados por ELISA e em um ensaio baseado emcélula, e as constantes cinéticas foram determinadas.
Um exemplo de um ELISA feito com as IgGs purificadas émostrado na Figura 9. O ELISA geralmente utilizou placas de microtitulaçãoCostar 3366 revestidas com um anticorpo kapa anti-humano de cabra. Asdiluições de Fab (ou IgG) foram incubadas nas cavidades revestidas por 1hora a 22°C. As cavidades foram então lavadas com PBS, Tween 20 0,1% eIL-6 biotinilada a 200 ng/ml foi adicionada por 1 hora. Após lavagem, umconjugado de fosfatase alcalina de NeutrAvidin foi adicionado e incubado por1 hora a 22°C. Foi acrescentado um substrato colorimétrico após lavagemintensa, e a IL-6 ligada foi determinada. Uma variação desse ELISA incluiuuma etapa de lavagem prolongada em um béquer de PBS, BSA 0,01% a37°C, após a incubação da IL-6 biotinilada, por exemplo, uma etapa delavagem prolongada de 18 horas.
Vários dos anticorpos monoclonais IgG humanos projetadosreativos à IL-6 gerados da invenção possuem constantes de afinidade entre1 x 109 e 9 x 1012. As afinidades mais elevadas desses anticorposmonoclonais humanos projetados os tornam adequados para aplicaçõesterapêuticas em doenças, patologias ou condições relacionadasdependentes da IL-6.
Foram obtidas múltiplas variantes diferentes do anticorpohumano projetado anti-IL-6 alterando-se uma ou mais das regiões CDR doanticorpo. A Tabela 3 abaixo mostra um resumo das mutações benéficasque foram- encontradas nas bibliotecas de CDR individuais (mudanças deaminoácidos são relativas à variante AME-A9). Além disso, a Tabela 13abaixo mostra as seqüências de aminoácidos para as CDRs da cadeia levee da cadeia pesada, com as possíveis posições de substituição (marcadascomo "X").
Foi construída uma biblioteca "combinatória" com base nosmelhores clones (ou seja, variantes) encontrados nas bibliotecas de CDRindividuais. A Tabela 4 lista as mutações que foram incluídas na biblioteca"combinatória". A biblioteca combinatória foi rastreada e caracterizada comodescrito acima. As mutações encontradas em seis dos melhores clones sãomostradas na Tabela 5A abaixo, enquanto os números do ID. de seqüênciapara as CDRs nesses clones são mostrados na Tabela 5B.
Testes de IgGs anti-IL-6 em um ensaio com base em células
Os anticorpos quiméricos anti-IL-6 e humanos projetados anti-IL-6 (clone AME-19a) foram testados quanto à habilidade para evitar ocrescimento de uma linhagem celular dependente de IL-6. Células 7TD1foram plaqueadas em uma placa Costar 3610 de 96 cavidades a 200 célulaspor poço. Os anticorpos, diluídos em meio IMDM, foram adicionados àscavidades, seguido pela adição de IL-6 humana, até uma concentração finalde 500 pg/ml, e as placas foram incubadas em uma incubadora de cultura detecido por 64-72 horas. Nesse momento, 50 ul de tampão de lise celular dokit ATPlite (Packard Bioscience) foram adicionados a todos as cavidades, eas placas foram agitadas por 3 minutos. Foram acrescentados 50 ul desubstrato ATPlite, e as placas revestidas foram agitadas por 1 minuto. Aquimioluminescência foi determinada em um luminômetro.
Os resultados de um ensaio baseado em células são mostradosna Figura 10, com os valores da EC5o calculados mostrados na Tabela 6abaixo. O valor da EC5o do anticorpo quimérico anti-IL-6 é de 2,7 x 10"11 M(4,09 ng/ml) e o do anticorpo humano projetado anti-IL-6 (clone AME-19a) éde 2,7 x 10"12 M (0,41 ng/ml). O valor da EC50 do anticorpo humanoprojetado mostra um aumento de cerca de 10 vezes, embora seja possívelobter um aumento de cerca de 10 vezes a cerca de 60 vezes, incluindovalores intermediários, no valor da EC5o-
Exemplo 3 - Cinética de ligação de anticorpos humanos projetadosanti-IL-6 humana.
A análise por ELISA confirma que o anticorpo purificado a partirdessas células hospedeiras se liga à IL-6 de uma forma dependente daconcentração. Nesse caso, é medida a afinidade do anticorpo por seuantígeno (epítopo) cognato. As constantes de ligação quantitativa sãoobtidas com o uso de análise BlAcore e do instrumento KinExA 3000. Osresultados indicam que vários dos anticorpos monoclonais humanosprojetados têm afinidade muito elevada, com KD na faixa de 1 x 10'9 a 3 x 10"14.
Foi realizado um imunoensaio enzimático (EIA) que utilizaanticorpos monoclonais anti-IL-6 humana (AME-A9, AME-A16, AME-18a,AME-20b, AME-22a e AME-23a) e CNTO 328 usados como controle positivopara detectar a IL-6 ligada ao receptor solúvel de IL-6, slL-6R. O receptorsolúvel humano de IL-6, slL-6R, e IL-6 humana recombinante foram obtidosde R&D Systems (Minneapolis, MN) (Ne do Catálogo 227-SR-025 e 206-IL-010, respectivamente). IgG anti-humana de cabra ligada à peroxidase derábano silvestre (cadeia H+L) foi obtida de Jackson Immunoresearch (WestGrove, PA) (NQ do Catálogo 109-035-003). Peróxido de hidrogênio ecomprimidos OPD foram obtidos de Sigma (St. Louis, MO) (N9 do CatálogoH-1009 e P-8287, respectivamente).
Imunoensaio ligado à enzima para formação do complexo mAbsqp80/lL-6/anti-IL-6
Placas de EIA Costar (Corning/Costar, Acton, MA) (Ne doCatálogo 9018) foram revestidas com slL-6R (10 ug/ml em PBS, 100pl/poço) de um dia para o outro a 4°C. As placas foram lavadas com 0,15 Mde soro fisiológico contendo Tween 200,02% (v/v), e as cavidades forambloqueadas com BSA 1% (p/v) em PBS, 200 |il/poço por uma hora emtemperatura ambiente. As cavidades foram lavadas novamente, e depois, noformato seqüencial, incubados com 200 ng/ml de IL-6 humana (100 ul/poço)em PBS por uma hora em temperatura ambiente. Foi adicionado anticorpo atodas as cavidades em diluições seriais de 10 vezes a partir de umaconcentração de partida de 10 |ig/ml em 100 jil/poço por uma hora emtemperatura ambiente. Após lavagem, as cavidades foram incubadas comIgG de cabra anti-humana ligada a (H+L)-HRP, (10 pg/ml em PBS) por 30minutos em temperatura ambiente. As cavidades foram lavados, e 100uJ/poço de solução de substratos citrato-fosfato (0,1 M de ácido cítrico e 0,2M de fosfato de sódio, H202 0,01% e 1 mg/ml de OPD) foram adicionadospor 15 minutos em temperatura ambiente. A reação foi interrompida poradição de 25 |jJ/poço de 4 N de ácido sulfúrico, e a OD490 foi lida por meio deuma leitora automatizada de placa ELISA (Molecular Devices SpectromaxPlus, Sunnyvale, CA).
Para testar o efeito da pré-incubação de IL-6 com anticorposmonoclonais anti-hlL-6 ou CNTO 328, 200 ng/ml de IL-6 (100 foramincubados com diluições seriais de 10 vezes de anticorpo (100 ul),começando com 10 pg/ml por uma hora em temperatura ambiente. Essamistura pré-incubada foi então incubada com slL-6R por uma hora emtemperatura ambiente, e a detecção do complexo slL-6R/IL-6/anti IL-6-humana foi realizada com a utilização de IgG de cabra anti-humana ligada a(H+L)-HRP (10 pg/ml em PBS) por 30 minutos em temperatura ambiente. Orestante das condições do ensaio foi igual ao descrito no parágrafo anterior.
Estudos anteriores mostraram que CNTO 328 pode detectar IL-6 quando ele é capturado por slL-6R que é revestido em informes técnicosde EIA. Além disso, AME-A9, AME-A16, AME-18a, AME-20b, AME-22a eAME-23a podem detectar IL-6 ligada a sgp80 (slL-6R) de forma dose-dependente com o uso de EIA. Cada anticorpo humano projetado anti-IL-6foi avaliado em relação a CNTO 328. No entanto, a pré-incubação de IL-6 equalquer um desses anticorpos monoclonais anti-hlL-6 elimina a habilidadede slL-6R para se ligar à IL-6.
Medidas das constantes cinéticas para IgGs anti-IL-6
O instrumento KinExA 3000, fabricado por Sapidyne, foi usadopara medir a cinética de ligação. Resumidamente, IL-6 humana foi acopladacovalentemente a glóbulos de alzactona, e a ligação de IgG livre aosglóbulos foi detectada no instrumento. Para medir a KD, tubos individuaiscontendo uma concentração constante de 0,5, 1 ou 5 pM de IgG com IL-6humana diluída serialmente de forma decrescente foram incubados por 3-4dias a 20°C em BSA 0,1%, PBS. Um total de 13 tubos foi usado para cadadeterminação da KD. Por exemplo, o anticorpo quimérico anti-IL-6 foi usadoem uma concentração constante de 5 pM, e os tubos individuais foramincubados com 0-200 pM de IL-6. As incubações para as outras IgGs foramajustadas de forma similar. Após a incubação, a IgG livre em cada amostraequilibrada foi determinada no instrumento KinExA 3000 de acordo com asinstruções do fabricante. Os valores da KD foram determinados peloprograma de computador KinExA 3000 com a utilização do instrumentoKinExA 3000, como descrito com mais detalhe abaixo.
Para medir a kon, IgGs individuais a 200 pM foram misturadascom 100-200 pM de IL-6 humana e a IgG não ligada foi detectada porligação à IL-6 humana acoplada covalentemente a glóbulos de alzactona noinstrumento KinExA 3000. Foi feita uma série de medidas ao longo dotempo. Os dados resultantes foram usados para calcular a Kn com oprograma de computador KinExA 3000. A K>ff foi calculada com o uso dafórmula KD = IWkon. Um resumo das constantes cinéticas para as IgGs anti-IL-6 é mostrado na Tabela 7.
Exemplo 4: Caracterização in vitro do anticorpo anti-IL-6
Foram realizados estudos in vitro para caracterizar a seqüência,a especificidade do epítopo, a afinidade e a atividade biológica do anticorpoanti-IL-6.
mAb humano projetado
A análise de seqüência confirma que o anticorpo anti-IL-6 dapresente invenção (exemplificado em diferentes variantes/clones) contémestruturas centrais totalmente humanas. A Tabela 5a mostra um total de 10resíduos de aminoácidos alterados tanto na cadeia pesada quanto na cadeialeve de CDR1, 2 e 3 no anticorpo anti-IL-6 da presente invenção (emdiferentes variantes do anticorpo), como comparado com o anticorpoquimérico anti-IL-6 (descrito em PCT WO 04/039826).
Especificidade do epítopo
O anticorpo anti-IL-6 da presente invenção e o anticorpoquimérico anti-IL-6 reconhecem um epítopo similar na IL-6 humana. Essesanticorpos não competem com o mAb de camundongo anti-IL-6 humanacomercial de R&D Systems #MAB-206, o que sugere que eles reconhecemum epítopo que é singularmente diferente daquele do mAb anti-IL-6 de R&D.
O anticorpo anti-IL-6 da presente invenção e o anticorpo quimérico anti-IL-6não competem com mAb de rato anti-IL-6 humana da R&D.
IL-6 humana (200 ng/ml) foi capturada por mAb anti-IL-6 ligadoàs placas (mAb de camundongo anti-IL-6 humana, MAB-206, que foi usadoapenas como mAb ligado às placas para a captura de IL-6 humana) (10|ig/ml), e diluições seriais do anticorpo anti-IL-6 da presente invenção e doanticorpo quimérico anti-IL-6, como indicado ao longo do eixo X, foram entãoadicionadas à placa. A ligação à IL-6 foi medida como aumento da OD490 aolongo do eixo Y. Tanto o anticorpo anti-IL-6 da presente invenção quanto oanticorpo quimérico anti-IL-6 mostram ligação dose-dependente à IL-6.
Inversamente, o anticorpo anti-IL-6 da presente invenção e oanticorpo quimérico anti-IL-6 se ligam competitivamente à IL-6 humana, oque sugere que as duas moléculas compartilham um epítopo de ligaçãosimilar na IL-6. IL-6 humana (200 ng/ml) foi capturada por MAB-206 ligadoàs placas (10 jig/ml): Diluições seriais do anticorpo anti-IL-6 da presenteinvenção, como indicado ao longo do eixo X, e 50 ng/ml de anticorpoquimérico anti-IL-6 biotinilado, foram então adicionadas à placa. A ligação doanticorpo quimérico anti-IL-6 biotinilado à IL-6 foi detectada porestreptavidina-HRP e medida como leituras da OD490 ao longo do eixo Y.
Além disso, os anticorpos humanos projetados e os anticorposquiméricos exibem propriedades similares para ligação ao complexo sIL-6/slL-6R (Figura 1). O anticorpo anti-IL-6 da presente invenção se liga aocomplexo SIL-6/SIL-6R. O receptor solúvel de IL-6 (slL-6R) foi revestido naplaca em uma concentração de 10 ug/ml. IL-6 humana foi entãoacrescentada à placa em uma concentração de 200 ng/ml. Diluições seriaisdo anticorpo anti-IL-6 da presente invenção ou do anticorpo quimérico anti-IL-6, como indicado ao longo do eixo X, foram então adicionadas à placa, e aligação ao complexo IL-6/slL-6R foi detectada com o uso de IgG HRP-anti-humana e medida como leituras da OD490 ao longo do eixo Y.
Para confirmar ainda mais os achados acima, foi realizado umteste de reatividade entre espécies com o uso de sobrenadantecondicionado contendo IL-6 gerado por PBMCs estimulados por LPS e IFNyde espécies diferentes em um ensaio de proliferação baseado em células7TD1 (linhagem celular murídea de hibridoma dependente de IL-6).Demonstrou-se que o anticorpo humano projetado da invenção neutraliza aatividade dos sobrenadantes condicionados na estimulação de proliferaçãode células 7TD1 de diversas espécies de primatas, incluindo humano, mico,macaco cinomolgo, chimpanzé, macaco rhesus, babuíno, macacamenestrina {pigtail monkey) e macaco de cabeça branca (cotton topmonkey), e exibiu um padrão de reatividade entre espécies similar,comparado com o anticorpo quimérico (Tabela 8).
Finalmente, quando o mapeamento de epítopo foi realizadocom o uso de um método de digestão tríptica, foi observado o mesmoepítopo de ligação para os anticorpos humanos projetados e os anticorposquiméricos em IL-6 humana, e está localizado nos resíduos de aminoácidos168-184 que transpõem a Hélice D (Figura 3). Uma análise mutacionalrecente confirmou que os resíduos 179 e 182 são essenciais para que oanticorpo da invenção se ligue à IL-6. O epítopo (resíduos de aminoácidos168-184) foi identificado como a superfície de IL-6 que retinham deutério napresença de anticorpo humano projetado anti-IL-6.
Atividade biológica
A potência de neutralização de IL-6 do anticorpo humanoprojetado anti-IL-6 foi determinada por um bioensaio baseado em células7TD1. O anticorpo humano projetado anti-IL-6 demonstrou uma potência deneutralização 10 vezes maior, comparado com o anticorpo quimérico anti-IL-6 no ensaio de proliferação células 7TD1. As células 7TD1 foramestimuladas com 500 pg/ml de hlL-6 na presença de diluições seriais deanticorpo humano projetado anti-IL-6 ou de anticorpo quimérico anti-IL-6 oumAb de controle de isótipo por 72 horas. A proliferação celular foi medidacomo contagens por segundo, como indicado no eixo Y. As barras de erroindicam o desvio padrão (DP) de amostras em duplicata. Um círculo fechadoindica células sem IL-6; um círculo aberto indica células estimuladas com500 pg/ml de hlL-6.
O anticorpo humano projetado anti-IL-6 também inibe aprodução de proteína-1 de quimioatração de monócitos (MCP-1) induzidapor IL-6 por células U937 (Figura 3) e a produção de amilóide A séricoinduzida por IL6/IL-10 (SAA) por células de hepatoma humano HepG2(Figura 4). A figura 3 demonstra que o anticorpo humano projetado anti-IL-6inibe a secreção de MCP-1 estimulada por IL-6 por células U937. Foramtratadas 5 x 105 células/poço com 1 ng/ml de hlL-6 e diluições seriais deanticorpo humano projetado anti-IL-6 por 72 horas. Os sobrenadantes dacultura de células foram analisados em triplicatas por ELISA quanto àpresença de MCP-1.
A figura 4 mostra que o anticorpo humano projetado anti-IL-6inibe a secreção de SAA estimulada por IL-6 e 1L-1P por células HepG2.Foram estimuladas 2,25 x 105 células com 100 ng/ml de hlL-6, 200 ng/ml deslL-6R e 1 ng/ml de IL-ip na presença de diluições seriais de anticorpohumano projetado anti-IL-6 por 24 horas. Os sobrenadantes da cultura decélulas foram então analisados em duplicatas por ELISA quanto à presençade SAA.
Fosforilação de Stat3 dependente de IL-6
Para avaliar a habilidade do anticorpo humano projetado anti-IL-6 para bloquear a cascata de sinalização resultante da ligação de IL-6 ao IL-6R e gp130, foi realizado um ensaio de imunoprecipitação para testar oefeito sobre a fosforilação de STAT3 dependente de IL-6 em células THP-1,que expressam gp130 na superfície celular.
Os mAbs são filtrados de forma estéril e esterilizados por filtro eestocados em PBS a 4°C. Foram usadas IL-6 humana recombinante (206-IL-010) e SIL-6R (227-SR-025) de R&D Systems (Minneapolis, MN). MeioRPMI (11875-085), soro fetal bovino inativado por aquecimento (16000-069),L-Glutamina (25030-081), aminoácidos não essenciais (11140-050) epiruvato de sódio (11360-070) foram obtidos de Invitrogen (Carlsbad, CA).TBS (10 mM de Tris, pH 7,5, 100 mM de NaCI) também foi usado.
Células THP-1, uma linhagem celular de leucemia monocíticaaguda humana, recebidas de bancos de pesquisas de células, foramtestadas para serem negativas para micoplasma e livres de bactérias. Essascélulas foram cultivadas em meio RPMI contendo soro bovino fetal 10%, 2mM de glutamina e 1 mM de piruvato de sódio. As células foramsubcultivadas ou coletadas quando as culturas alcançavamaproximadamente 85% de confluência. As células foram rotineiramentedivididas 1:5 a cada três dias.
Para fosforilação de tirosina, as células cresceram até 80-90%de confluência em frascos T225. O meio foi removido e substituído por meiofresco sem soro, e incubado de um dia para o outro. Após ficaremdesprovidas de soro, as células foram coletadas de cada frasco, peletizadas,e uma concentração final de 20 x 106 células por condição foi ressuspensaem 0,5 ml de meio sem soro.
RhlL-6 (0,1 jag/ml) foi pré-incubada a 37°C por 15 minutos comos seguintes reagentes: 0,5 ml somente de meio, Ab anti-IL-6 (10 |ag/ml); eslL-6R (0,2 ug/ml). SIL-6R (0,2 ug/ml) e Ab anti-IL-6 (10 |ig/ml) foram entãoadicionados às células pré-incubadas com Ab anti-IL-6 e slL-6R,respectivamente, para incubação a 37°C por 15 minutos. As células foramentão combinadas com meio como controle negativo, e o complexo IL-6/Ab/slL-6R, e incubadas a 37°C por 6 minutos. As células foram lavadasduas vezes em TBS gelado e os péletes celulares foram processados comodescrito na Seção 5.4 ou estocados a -70°C.
Para imunoprecipitação, os péletes celulares foram lisados em1 ml de tampão de lise (50 mM de Tris, pH 7,5, 300 mM de NaCI, Triton-X-1000,5%) (T-9284, Sigma, St. Louis, MO) contendo comprimido de coquetelinibidor completo de protease (1697498, Roche, Basel, Suíça). As célulasforam turbilhonadas por 30 segundos e incubadas a -70°C por 20-60minutos. Os restos celulares foram removidos por centrifugação a 13.000rpm por 20 minutos. Para reduzir a coloração inespecífica de fundo, asamostras foram pré-clareadas por incubação com 2 (ig de IgG de coelho(I5006, Sigma, St. Louis, MO) mais 50 ul de agarose de Proteína A (SC-2001, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) por 1 hora a 4°C em ummisturador orbital. Os glóbulos de agarose foram removidos porcentrifugação a 2.500 rpm por 5 minutos. Os lisados clareados foramtransferidos para tubos de microcentrífuga e incubados com anti-STAT3 (2ug/ml) (SC-7179, Santa Cruz Biotechnology) de um dia para o outro a 4°Cem um misturador orbital, seguido por adição de 50 fig de glóbulos deagarose de Proteína A, e incubados por 2 horas a 4°C em um agitadororbital. Os glóbulos de agarose foram coletados por centrifugação a 2.500rpm por 5 minutos e lavados 5 vezes em TBS gelado a 4°C. Os glóbulos deagarose foram então ressuspensos em 40 ul de tampão de amostra Laemmlimais DTT (NP0007-465030, Invitrogen, Carlsbad, CA) e aquecidos a 95°Cpor 5 minutos.
As amostras foram resolvidas em um gel NuPage Bis-Tris 3-8%(EA0375BOX, Invitrogen, Carlsbad, CA) com tampão de execução (NP0002-465026, Invitrogen, Carlsbad, CA) a 100 V por 1 hora. As proteínas foramtransferidas para uma membrana de nitrocelulose (LC2001, Invitrogen,Carlsbad, CA) usando tampão de transferência (NP0006465029, Invitrogen,Carlsbad, CA) a 30 V por 1 hora. As membranas foram bloqueadas em leiteem pó sem gordura 10% (Nestle, Glendale, Califórnia) em TBS-T de um diapara o outro a 4°C. Após várias lavagens em TBS-T em temperaturaambiente, as membranas foram incubadas com Ab monoclonal decamundongo anti-p-STAT3 (SC-8059, Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA), que foi diluído 1:1.000 em TBS-T por 4 horas a 4°C em umagitador orbital. Após várias lavagens, as membranas foram entãoincubadas com IgG-HRP de asno anti-camundongo (1:1.000) (SC-2318,Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) em temperatura ambiente por 2horas em um misturador orbital. Após várias lavagens, as amostras foramdetectadas com a utilização do kit de reagentes e análise de detecçãowestern blot ECLpIus (RPN2108, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)seguindo o protocolo do fabricante, e visualizadas por exposição à películaECL. As membranas tiveram então o Ab removido ao serem submergidasem 100 mM de DTT, SDS 2%, 62,5% mM de Tris-HCI, pH 6,7 a 100°C por30 minutos com agitação. As membranas foram então lavadas em TBS-T ebloqueadas de um dia para o outro com o leite em pó sem gordura 10%. Asmembranas foram lavadas e incubadas com anti-STAT3 (1:1.000) (SC-7179,Santa Cruz Biotechnology) em TBS-T por 2 horas a 4°C, lavadas 5 vezes,seguido por uma incubação de 1 hora com IgG-HRP de cabra anticoelho(1:1.000) (SC2030, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), edetectadas com o uso de ECLpIus. Todas as membranas foramrotineiramente raspadas e resondadas com STAT3 para demonstrar apresença da proteína STAT3.
Os resultados mostraram que o anticorpo humano projetadoanti-IL-6 bloqueou a fosforilação de stat3 mediada por IL-6, um componentecrucial na via de sinalização de IL-6 (Figuras 5A e 5B). O anticorpo humanoprojetado anti-IL-6 (AME-19A) inibe a fosforilação de stat3 induzida por IL-6/slL-6R. A fosforilação de stat3 induzida por IL-6 humana recombinante/sIL-6R foi detectada em células THP-1 (Figura 5B). A adição de 10 ug/ml deanticorpo humano projetado anti-IL-6 (AME-19A) ou de anticorpo quiméricoanti-IL-6 inibiu completamente a fosforilação de stat3 (Figura 5B). A figura 5Amostra a presença de uma quantidade similar de proteína stat3 nãofosforilada em todas as amostras que correspondem aos diferentes cloneshumanos projetados anti-IL-6. Como aqui usado, CNT0328 (ou 328) designao anticorpo quimérico humano-murídeo (também denominado do tiposelvagem (WT)), 150 designa o clone AME-22a, 143 designa o clone AME-23a, 140 designa o clone AME-20b, 136 designa o clone AME-19a, 130designa o clone AME-18a, 106 designa o clone AME-A16, 104 designa oclone AME-A9.
Eficácia in vivo do anticorpo humano projetado anti-IL-6
A eficácia do anticorpo humano projetado anti-IL-6 foi avaliadaem dois modelos in vivo diferentes. Primeiro, os efeitos do anticorpo anti-IL-6humano projetado e do quimérico foram testados e comparados em umensaio de angiogênese induzida por IL-6 humana em Matrigel emcamundongos. Duzentos ng/ml de IL-6 humana foram incluídos no plug deMatrigel. Dois plugs de Matrigel foram injetados em cada camundongoatímico (nude). Grupos de seis camundongos receberam uma injeção i.v. de1, 3, ou 6 mg/kg de anticorpo anti-IL-6 humano projetado ou quimérico.Também foi injetado PBS ou um mAb de controle de isótipo para os gruposde controle. Os plugs foram removidos no 1- dia e a angiogênese foi medidapor teor de hemoglobina, comprimento do microvaso, e número demicrovasos nos plugs. Os resultados mostraram que IL-6 humana (grupo dePBS) estimulou angiogênese no modelo de plug de Matrigel, como medidopor todos os três parâmetros.
O anticorpo humano projetado anti-IL-6 (AME-19A) inibe onúmero médio de microvasos nos plugs de Matrigel. Além disso, o anticorpohumano projetado anti-IL-6 (AME-19A) inibe o comprimento médio dosmicrovasos em plugs de Matrigel. Além disso, o anticorpo humano projetadoanti-IL-6 (AME-19A) inibe o nível de hemoglobina em plugs de Matrigel.
Além disso, o anticorpo anti-IL-6 tanto humano projetado (AME-19A) quanto quimérico inibiram de forma dose-dependente a angiogênesemediada por IL-6 em camundongos atímicos. Finalmente, os anticorpos anti-IL-6 humano projetado e quimérico exibiram atividade comparável nainibição da angiogênese induzida por IL-6 a 6 mg/kg, a maior dose testada.
Embora o anticorpo quimérico anti-IL-6 tenha inibido significativamente aangiogênese induzida por IL-6 humana a 3 mg/kg, como medido pelocomprimento dos vasos e pelo número de vasos, não foram detectadasdiferenças estatisticamente significativas entre o anticorpo anti-IL-6 humanoprojetado e o quimérico nessas doses.
Foi desenvolvido um modelo in vivo adicional para avaliar aindamais o efeito do anticorpo humano projetado anti-IL-6 sobre a produção doreagente da fase aguda induzido por IL-6 humana, a proteína sérica amilóideA (SAA) em camundongos Balb/C. Os camundongos receberam umaadministração i.p. de 0,01, 0,5 ou 5 mg/kg de anticorpo humano projetadoanti-IL-6, 4 horas antes de uma administração i.v. de 5 ug/kg de IL-6 humana(Figura 6). Foram usados PBS e mAb de controle de isótipo como controles.
Os níveis séricos de SAA foram determinados em 16 horas após a injeçãode IL-6. Tanto o anticorpo anti-IL-6 humano projetado quanto o quiméricoinibiram significativamente a produção de SAA induzida por IL-6 humana emcamundongos Balb/C a 0,5 e 5 mg/kg, e o anticorpo humano projetado anti-IL-6 inibiu significativamente a produção de SAA na menor dose testada. Noentanto, não foram observadas diferenças estatisticamente significativasentre o anticorpo anti-IL-6 humano projetado e quimérico em todas as trêsdoses testadas (Figura 6).A figura 6 mostra que o anticorpo humano projetado anti-IL-6inibe produção de SAA induzida por IL6 humana. Cada ponto representa ovalor médio de SAA para cada animal, e a linha representa a média de todosos pontos de dados em cada grupo. Foi realizada comparação pareada eforam utilizados intervalos de confiança simultâneos de Tukey de 95% a fimde controlar o erro global do tipo I. (** p<0,001, *p<0,05).Exemplo 5 - Lógica terapêutica para mAb anti-IL-6Artrite reumatóide: efeito de mAb anti-IL-6 sobre a artrite induzida porcoláqeno (CIA)- um modelo animal de artrite reumatóide
Modelos in vivo de doença pré-clínica
A IL-6 tem sido alvo de vários modelos in vivo. Anticorpo anti-IL-6 de camundongo de rato foi usado em modelos murínos padronizados oumAb humanizado anti-IL-6R (80 kDa) (MRA; Chugai) foi usado em modelosde primatas e em um modelo de SCID (imunodeficiência combinada severa)humana/de camundongo. Na artrite murídea induzida por colágeno (CIA),anti-IL-6 foi eficaz na prevenção da doença, se usada precocemente (dia 0ou 39 dia pós-imunização com colágeno), mas não em pontos do tempoposteriores. No modelo de transplante em SCID humana/de camundongo,no qual tecido sinovial humano é transplantado em camundongosimunodeficientes, o tratamento com MRA levou a um encolhimento dosimplantes de tecido e à redução de células inflamatórias e osteoclastos. NaCIA em macacos cinomolgos, MRA inibiu o desenvolvimento de artrite emelhorou as medidas da fase aguda.
O efeito de um mAb anti-IL-6 de camundongo substituto sobre odesenvolvimento da doença foi avaliado em um modelo de CIA. Osresultados indicam que a administração i.p. de anti-IL-6 de camundongo a 1mg/camundongo/semana, antes da indução da doença, suprimiusignificativamente o desenvolvimento de artrite induzida por colágeno, o quese reflete na redução acentuada da gravidade da doença. A artrite foiinduzida em camundongos DBA/1 LacJ com 8 semanas de idade com 100ug de colágeno bovino do tipo II em adjuvante completo de Freund (FCA)por via intradérmica na base do rabo. Os camundongos foram monitoradosclinicamente diariamente quanto ao surgimento de doença. mAb anti-IL-6 oumAb de controle de isótipo foi administrado i.p. 2 dias antes da indução deCIA e depois semanalmente, a 1 mg/camundongo. A classificação da artritefoi determinada com base no edema, eritema e desfiguração da articulação.
Os dados histopatológicos confirmaram a observação clínica deque a injeção i.p. semanal de mAb anti-IL-6 de camundongo melhorousignificativamente os parâmetros da artrite induzida por colágeno. Todos osparâmetros de artrite examinados, incluindo a resposta inflamatória (sinovitee formação de pano) e as alterações erosivas (erosões e arquitetura articularglobal), foram significativamente melhorados nos camundongos tratadoscom anti-IL-6 de camundongo, como comparados com animais de controletratados com mAb. O mAb anti-IL-6 suprimiu a artrite no nívelhistopatológico. A sinovite foi classificada com base na espessura damembrana sinovial; a formação de pano foi classificada com base naextensão do pano em relação ao espaço articular; e as erosões foramclassificadas com base na extensão na cartilagem e no osso subcondral.
A perda de proteínas da matriz de cartilagem foisignificativamente reduzida em camundongos tratados com mAb anti-IL-6 decamundongo. Cortes articulares representativos obtidos dos animais decontrole e dos animais tratados com mAb anti-IL-6 ao final do estudo (53edia) foram examinados por coloração com azul de toluidina para a matriz dacartilagem.
A análise por Micro-TC apoiou a observação clínica de que oefeito da terapia com anti-IL-6 de camundongo era exercida no nível daprogressão da doença dentro da articulação individual. A inspeção visual deimagens típicas por TC tridimensional indica o grau acentuado de alteraçõeserosivas que ocorrem no grupo tratado com mAb de controle de isótipo,quando comparados com as alterações inflamatórias predominantementeleves de tecidos moles nas articulações dos animais tratados com anti-IL-6de camundongo. Os experimentos foram realizados com animaisrepresentativos tratados com mAb de controle e animais tratados com mAbanti-IL-6 de camundongo.Lúpus. Efeito de anti-IL-6 em camundonqos NZB/W F1
Modelos in vivo de doença pré-clínica
Existem modelos murídeos para o LES e eles possuem grandessemelhanças com a doença humana. Estudos de cepas MRL//pr e NZB/WF.1 demonstraram a hiperproliferação de células B, produção de auto-anticorpo e deposição de complexo imune que são muito parecidos com adoença humana. Demonstrou-se que mAb anti-IL-6 era eficaz na inibição daprodução de auto-anticorpo, redução de proteinúria e aumento da sobrevidaanimal em camundongos NZB/W F1.
O efeito de um mAb anti-IL-6 de camundongo substituto sobre odesenvolvimento da doença do lúpus foi avaliado em camundongos NZB/WF1. Os resultados preliminares demonstraram que a administração i.p. demAb anti-IL-6 de camundongo a 1 mg/camundongo/semana por 22 semanassuprimiu a produção de auto-anticorpo anti-dsDNA, um auto-anticorpopatogênico importante nesse modelo de doença (Figura 7). Os níveis deauto-anticorpo anti-dsDNA em animais tratados com mAb anti-IL-6 foramconsistentemente menores por todo o estudo, quando comparados comaqueles nos animais tratados com soro fisiológico e Ab de controle.
Como discutido anteriormente, a Figura 7 mostra a inibição daprodução de auto-anticorpo anti-dsDNA por mAb anti-IL-6 em camundongosNZBA/V F1. Um valor O.D. individual para cada amostra foi normalizado atéum soro de controle positivo e apresentado como % do controle positivo.Cada ponto representa o % do controle positivo de cada amostra e a linharepresenta a média de todos os pontos de dados em cada grupo. Umadiferença significativa é indicada como *p<0,01.
Além disso, mAb anti-IL-6 inibiu a proliferação de células B ereduziu o dano renal quando um pequeno subconjunto dos animais foiexaminado. Embora não haja diferenças significativas na proliferação decélulas T entre os diferentes grupos de tratamento ao final do estudo, aproliferação de células B induzida por anti-lgM e anti-CD40 foi mais lenta noscamundongos tratados com mAb anti-IL-6 comparada com a doscamundongos tratados com soro fisiológico ao longo do tempo,especificamente, após 34 semanas. Esse resultado é consistente com aprodução reduzida de auto-anticorpo anti-dsDNA relatada acima e sugereque células B auto-reativas possam ser os alvos diretos e dominantes para otratamento com mAb anti-IL-6.
A análise histopatológíca indicou que os animais no estudopodiam ser categorizados em 3 grupos quanto à gravidade da doença renal(leve, moderada e severa) (Tabela 9). A patologia da doença renal emcamundongos NZB/W F1 indica hiperplasia linfóide mista e deposição decomplexo imune na membrana basal glomerular.
Os animais tratados com mAb anti-IL-6 desenvolveram doençarenal menos severa. A hiperplasia linfóide mista perivascular e a deposiçãode proteína estavam ausentes nos animais tratados com mAb anti-IL-6,enquanto os animais tratados com soro fisiológico e Ab de controledesenvolveram hiperplasia linfóide mista perivascular moderada e severa edeposição de proteína. Além disso, a deposição de complexo imune namembrana basal glomerular foi leve nos animais tratados com mAb anti-IL-6,comparada com a ocorrida nos outros dois grupos de tratamento. Érealizado um detalhamento adicional do mecanismo de ação de mAb anti-IL-6 sobre as funções de células B, T e macrófagos, uma vez que essas célulastêm uma participação crucial na patogênese do LES.
Diabetes melito do Tipo II
Foi indicado que a IL-6 tem uma participação importante nodesenvolvimento de resistência à insulina associada à obesidade. Noentanto, os dados in vitro e in vivo gerados até hoje tanto apoiam quanto seopõem à sua participação potencial na resistência à insulina.
Experimentos in vitro
Foram realizados experimentos para melhor compreender osefeitos que IL-6 possa ter sobre a sinalização de insulina e sobre os efeitos ea função biológica da insulina, tais como captação de glicose, regulaçãogênica e mecanismos relacionados, com o uso de modelos in vitro detecidos que respondem à insulina (células 3T3 L1 para tecido adiposo,células HepG2 para células hepáticas, células C2C12 para músculoesquelético) e modelos in vivo de resistência à insulina e DMT2, tais comocamundongos db/db.
Os dados in vitro sugerem que IL-6 exerce seu efeito primáriosobre a sinalização de insulina no fígado. O tratamento de células HepG2com IL-6 leva à inibição da fosforilação de Akt induzida por insulina. Esseefeito inibidor da IL-6 sobre a sinalização de insulina é bloqueado por umanticorpo anti-IL-6. Foi sugerido que alterações no metabolismo da glicose enos efeitos da insulina no fígado são as causas principais dodesenvolvimento de resistência à insulina e T2D. São examinados os efeitosde IL-6 sobre a sinalização de insulina em células 3T3 L1 (linhagem celularde adipocitos) e C2C12 (linhagem celular de músculo esquelético) paradeterminar os mecanismos de IL-6 no T2D.
3T3 L1. Foram realizados experimentos com o uso da linhagemcelular de adipocitos de camundongo 3T3 L1. Em células 3T3 L1 90%diferenciadas, foi avaliado o efeito de IL-6 sobre a captação de glicoseinduzida por insulina. Nesses experimentos, o tratamento com 10 ng/ml deTNFa por 24 horas inibiu consistentemente a captação de glicose induzidapor insulina, enquanto 20 ng/ml de IL-6 não tiveram nenhum efeito. Essesdados sugerem que a atividade de IL-6 sobre o tecido adiposo não é omecanismo primário da resistência à insulina mediada por IL-6, mas, em vezdisso, o tecido adiposo pode ter uma fonte principal de IL-6 que entãointerfere com a sensibilidade à insulina no fígado e músculo. Os mesmosdados foram obtidos usando adipocitos humanos primários diferenciados dedepósito subcutâneo. Foram testados os efeitos da IL-6 sobre a captação deglicose com o uso de adipocitos humanos primários de um depósito degordura visceral, já que aquele depósito poderia ser mais relevante para aresistência à insulina associada à obesidade.
HepG2. As células HepG2 foram escolhidas como um modeloin vitro representativo do tecido hepático. As células HepG2 são células dalinhagem celular de hepatoma humano nas quais o efeito de IL-6 sobre asinalização de insulina foi previamente demonstrado. Nos experimentos, 20ng/ml de IL-6 bloquearam a fosforilação de Akt induzida por insulina, umaquinase crucial na via de sinalização de insulina, com o efeito máximo sendoobservado após 60 minutos de incubação; esse dado é consistente com osresultados relatados na literatura científica.
A fosforilação de Akt em células HepG2 subconfluentes emplacas de 10 cm foi medida após incubação de rh IL-6 (20 ng/ml) por 30, 60,90 e 120 minutos. Durante os últimos 5 minutos de incubação, 0,5 nM, 1 nMe 5 nM de insulina foram adicionados para induzir a fosforilação de Akt. Ascélulas foram usadas com o uso de tampão de lise RIPA modificado e afosforilação de Akt foi medida com a utilização de ELISA Ser-Phospho-Akt.
Os resultados foram obtidos usando kits ELISA pAkt e Akt (BioSource). Em60 minutos de tratamento com IL-6, na presença de uma concentraçãofisiológica de insulina (0,5-1 nM), a fosforilação de Akt foi inibida em -50%,comparada com o grupo de controle. As concentrações de proteína foramquantificadas com o kit de ensaio de proteína Pierce BCA.
Efeito do anticorpo IL-6
Foi medida a habilidade do anticorpo humano projetado anti-IL-6 para inibir os efeitos da IL-6 sobre a fosforilação de Akt induzida porinsulina. Vinte ug/ml de anticorpo humano projetado anti-IL-6 foram capazesde inibir os efeitos da IL-6 em células HepG2. As Figuras 8A e 8B mostram oefeito de IL-6 na presença e ausência de anticorpo humano projetado anti-IL-6 sobre a fosforilação de Akt induzida por insulina.
Na imagem superior (Figura 8A), os dados representam amédia +/- SEM. (*significativo comparado com (+) insulina, IL-6, P = 0,029; **significativo comparado com (+) insulina +IL-6, P = 0,02). Células HepG2subconfluentes foram tratadas com 20 ng/ml de IL-6 por 60 minutos. Duranteos últimos 5 minutos de tratamento, 1 nM de insulina foi adicionado e ascélulas foram lisadas com o uso de tampão RIPA modificado. As amostrasforam analisadas por ELISA que detecta a fosforilação em Ser 473 de Akt.Todos os dados foram normalizados até a Akt total medida por ELISA. Otratamento com AME-19a foi capaz de restaurar a sinalização normal de Akt.
Na imagem inferior (Figura 8B), é mostrado um western blotrepresentativo. As bandas superiores incluem amostras tratadas com IL-6(20 ng/ml, 60 minutos, 5 minutos com 1 nM de insulina), AME-19a (20 |ig/ml+/- IL-6 a 20 ng/ml por 60 minutos, 5 minutos com 1 nM de insulina) outampão. O ò/oífoi sondado com anticorpo antifosfo Ser/Akt (apinel superior)(pS473, Biosource). As bandas inferiores (o mesmo blot foi raspado eressondado com anti-Akt de BioSource) demonstram que proteínaequivalente foi carregada por raia.
Método: Células HEPG2 cresceram em placas de cultura de tecido de 100mm até a confluência. As células foram mantidas subalimentadas de um diapara o outro em DMEM-BSA 1%. AME-19a (20 p,g/ml) foi incubado nascélulas por aproximadamente 30 minutos, antes da adição de IL-6. IL-6 (20ng/ml) +/- AME-19a (20 ng/ml) foram incubadas por aproximadamente 30minutos, antes da adição às células. As amostras foram incubadas nascélulas por 60 minutos, a 37°C; a seguir, 1 nM de insulina (concentraçãofinal) foi adicionado às células por 5 minutos, em temperatura ambiente. Ascélulas foram lavadas imediatamente com 3 enxágües de PBS gelado. Asplacas foram congeladas até a lise. Fosfo Akt e Akt total foram determinadoscom a utilização de kits ELISA (BioSource e Sigma). Referência: J.J. Senn,P.J. Kover, I.A. Nowak e R.A. Mooney. "Interleukin 6 induces cellularresistence to insulin in hepatocytes". Diabetes. 51: 3.391-3.399, 2002.
Hepatócitos primários de ratos
Hepatócitos primários representam um sistema in vitroadequado mais relevante para o teste do efeito de IL-6 e anticorpos anti-IL-6(ou outros antagonistas de IL-6) sobre a sinalização de insulina e o efeito dainsulina sobre a produção hepática de glicose. Para determinar a ativação dePI3 quinase (PI3K) em hepatócitos de ratos tratados por insulina, IL-6 e/oumAb IL-6, células isoladas foram tratadas com insulina na presença eausência de 5 ng/ml de IL-6, e a fosforilação do receptor de insulina, IRS-1(Figura 12A) e Akt (Figura 12B) foi determinada usando ensaios ELISA eanálise Western blot. Além disso, os efeitos de IL-6 sobre a associaçãoIRS1/p85 estimulada por insulina foram examinados (Figuras 11A e B). Osexperimentos foram realizados da seguinte forma:
Hepatócitos primários de ratos (aproximadamente com 2 mesesde idade) em placas de 6 cavidades revestidas com colágeno foramequilibradas de um dia para o outro em meio Hepatoczyme. No dia seguinte,as células foram subalimentadas por 6 horas em DMEM- BSA 1%-pennstrep; a seguir, incubadas com hll_-6 (5 ng/ml); anticorpo anti-IL-6 (AME-19a)(20 ng/ml) ou anticorpo anti-IL-6 (AME-19a) + hlL-6 por 90 minutos a 37°C.As células foram pré-tratadas por 1 hora com anticorpo anti-IL-6 (AME-19a),antes da adição da combinação. A combinação também foi pré-incubadaantes da adição às células. Cinco nM de insulina (de BioSource) foramadicionados às células por 5 minutos; depois, as células foram aspiradas elisadas imediatamente com tampão de extração BioSource + inibidores deprotease. Os lisados foram centrifugados e os sobrenadantes foram diluídosa 1:10 e testados em ELISAs (de Biosource).Associação IRS1/p85:
Quantidades iguais de proteína (45 ug) foram incubadas de umdia para o outro com 2 ug de anticorpo policlonal anti-IRS-1 (de Upstate,Item # 06-248). As amostras foram então imunoprecipitadas com glóbulos deproteína A por 1 hora, e eluídas com tampão de amostra 3x para SDS-PAGE. As amostras de IP foram então processadas em SDS-Page gel 4-12% e depois transferidas para membrana para análise Western blot. Asmembranas foram sondadas com: (1) mAb p85 diluído 1:100 (de Upstate,Item # 05-217) para IRS-1 associado a p85, ou seja, a PI3K ativa (comomostrado na FIG. 11 A); e (2) mAb IRS-1 diluído 1:600 (de BD Biosciences,Item # 611395) para IRS-1 total como controle de carga (como mostrado naFIG. 11B).
Os dados indicam que o tratamento com IL-6 leva a umadiminuição da fosforilação induzida por insulina de IR, IRS-1 e Akt. Esseefeito da IL-6 era abolido quando as células foram pré-tratadas comanticorpo anti-IL-6 (clone AME-19a). Além disso, IL-6 inibiu a associaçãoinduzida por insulina de p85 (subunidades de PI3K) com IRS-1. Novamente,esse efeito da IL-6 era inibido por pré-tratamento com anticorpo anti-IL-6.
Experimentos in vivo
Os efeitos de IL-6 sobre a sensibilidade à insulina ainda nãoforam testados intensamente em animais. A fim de avaliar se a terapia comanti-IL-6 melhoraria a sensibilidade à insulina e DMT2, camundongos db/dbe C57/B16 machos em uma dieta rica em gordura foram tratados comanticorpo anti-IL-6 de camundongo comercial (obtido de R&D Systems).
Camundongos db/dB
Os efeitos do tratamento com anti-IL-6 foram testados usandocamundongos db/db de idades diferentes. Camundongos entre 8-10semanas de idade são caracterizados por hiperinsulinemia e resistência àinsulina e, dessa forma, representam os estágios iniciais da doença,enquanto os camundongos com 12-14 semanas de idade são caracterizadospor níveis de glicose elevados, além de hiperinsulinemia e, desse modo,representam estágios avançados do DMT2. Ambos os grupos etários decamundongos são usados para testar a habilidade da terapia com anti-IL-6para aumentar a sensibilidade à insulina e o controle glicêmico no teste detolerância à glicose intraperitoneal (ipGTT).
Os camundongos db/db possuem uma sinalização de leptinanão funcional em conseqüência da mutação dentro do receptor de leptina.Esses camundongos desenvolvem obesidade, hiperinsulinemia e resistênciaà insulina à medida que os camundongos envelhecem, com os primeirossintomas sendo detectados quando os camundongos estão com 6-8semanas de idade. Dois grupos de camundongos de idades diferentes — 8 e12 semanas de idade — foram tratados com 5 mg/kg de mAb anti-IL-6 e foirealizado um teste de tolerância à glicose intraperitoneal (ipGTT) 1 dia e 7dias pós-tratamento. O esquema de tratamento é mostrado na Figura 15.
Em animais com 8 semanas de idade, o tratamento com mAbanti-IL-6 não teve efeito sobre a depuração de glicose durante GTT. Otratamento com mAb anti-IL-6 produziu uma melhora da tolerância à glicose(GT) nos animais com 12 semanas de idade, embora o efeito não fosseestatisticamente significativo (p = 0,063). Essa melhora da GTT foiobservada no 7e dia pós-tratamento. Além disso, amostras de soro coletadasantes e depois do término do estudo foram analisadas quanto aos seusperfis de adipocina e adiponectina. Os níveis de IL-6, TNFoc e MCP-1estavam abaixo dos níveis de detecção. Esses dados, considerados emconjunto com os resultados do ipGTT, podem sugerir que: animais db/db nãosão um bom modelo para estudar os efeitos de anti-IL-6 sobre a resistênciaà insulina; e os níveis teciduais de IL-6 são mais relevantes para um possívelpapel que IL-6 possa ter no desenvolvimento de resistência à insulina eDMT2.
Obesidade induzida por dieta (PIO) — modelo animal para obesidade eresistência à insulina
Camundongos C57/B1 machos foram alimentados com umadieta que compreende 60% de gordura por 20-35 semanas. Elesdesenvolveram obesidade (o peso corporal médio foi de 50,5 gramas) e umaumento nos níveis sangüíneos de jejum de glicose (FBG > 145 mg/dl).
Além disso, eles têm uma GT alterada. Os animais DIO foram tratados com10 mg/kg de Ab anti-IL-6 murídeo (R&D Systems). No geral, eles receberam50 mg/kg de mAb anti-IL-6 ao longo do período de 3 semanas. O ipGTT foirealizado após as primeiras 2 doses (5e dia), após a A- dose (129 e 169 dias)e após a 5§ dose (23e dia). Ao mesmo tempo, foi coletado sangue paramedidas de adipocitocinas e adiponectina.
O tratamento com anti-IL-6 não melhorou a tolerância à glicoseno 5e e 122 dias; no entanto, quando realizado no 16e e 23Q dias, foiobservado um aumento da depuração de glicose e também na evolução dosníveis de glicose. Essa melhora alcançou significância estatística em 39, 60e 90 minutos durante GTT.
Em outro conjunto de experimentos, animais DIO foramtratados semanalmente (2 doses durante a primeira semana e 1 dose porsemana pelas 4 semanas subseqüentes) com 10 e 20 mg/kg de Ab anti-IL-6e 20 mg/kg de isótipo de IgG de controle por via i.p. Foram realizadosHOMA-IR (após 2, 4 e 6 semanas de tratamento), ipGTT, ipITT e perfil deadipocina (em 6 semanas de tratamento).
Análise HOMA-IR em animais DIO tratados com Ab Anti-IL-6:
Nesses estudos, houve uma diminuição na glicemia de jejum enos níveis de insulina em animais DIO tratados com 10 e 20 mg/kg de Abanti-IL-6 murídeo e controle de isótipo. Os animais tiveram seu sanguecoletado e foi feita a determinação da glicemia de jejum e dos níveis deinsulina com o uso de glicose Trace/DMA (ox) (thermo Electron Corp) e"Ultra Sensitive Rat Insulin Elisa" (Crystal Chem), respectivamente. Essesvalores foram usados para determinar HOMA-IR. O índice HOMA-IR refleteo status de sensibilidade à insulina e apresenta boa correlação com oachado do estudo da pinça. HOMA-IR é calculado pela fórmula: (glicose dejejum (mM) X insulina de jejum (mlU/l))/22,5 (Figuras 13A, B e C).
As melhoras de HOMA—IR foram observadas após 2, 4 e 6semanas de tratamento (as Figuras 13A-C mostram os dados após 6semanas de tratamento). Ao final do estudo foram realizados ipGTT e ipITT.
Em ambos os testes, o tratamento com anti-IL-6 (20 mg/ml) melhorousignificativamente tanto a evolução quanto a depuração da glicose, quandocomparado com os animais tratados com isótipo.
A análise de adipocina e citocina de amostras de soro deanimais de controle e tratados com anti-IL-6 indicou que a neutralização deIL-6 leva a uma diminuição na IL-6 circulante e nos níveis de TNFa, juntocom uma tendência de diminuição dos níveis de MCP-1 e resistina. Em outroconjunto de dados, os níveis de adiponectina foram aumentados com otratamento com anti-IL-6.
Foi realizada a análise histológica de amostras hepáticas dosgrupos de tratamento e de controle. As amostras foram coradas comcoloração "Oil Red O" para determinar o teor lipídico no parênquimahepático. O teor lipídico do fígado nos animais DIO era reduzido em respostaao tratamento pelo anticorpo anti-IL-6 muri.
A coloração revela que 34% das amostras hepáticas tratadascom veículo eram relacionadas aos lipídeos em animais não tratados, eapenas 8% nos animais tratados com 20 mg/kg de anti-IL-6 (Figuras 14A-F).
As Figuras 14A e D representam o grupo de controle; as Figuras 14B e Erepresentam os animais DIO não tratados; e as Figuras 14C e Frepresentam os animais tratados com anti-IL-6. O teor lipídico aumentado dofígado foi associado ao desenvolvimento de resistência à insulina e aodiabetes melito do Tipo 2. Dessa forma, é concebível que a neutralização deIL-6 leve a uma melhora da sensibilidade à insulina e do DMT2 ao afetar ometabolismo hepático de lipídeos. Esses dados em conjunto sugeremfortemente o papel de IL-6 na patologia do diabetes do Tipo 2 e que aneutralização de IL-6 poderia aumentar a sensibilidade à insulina.
Estudos adicionais
Os efeitos de IL-6 na presença ou ausência de anticorpohumano projetado anti-IL-6 sobre a fosforilação de IRS1 estimulada porinsulina, associação com p85/PI3K, fosforilação do receptor de insulina (IR),síntese de glicogênio e o envolvimento da sinalização de SOCS3 e STAT emcélulas HepG2 foram monitorados. Experimentos adicionais examinaram oefeito de IL-6 sobre a secreção de insulina induzida por glicose por ilhotaspancreáticas. Os dados publicados até hoje descrevem efeitos tantoinibidores quanto estimuladores de IL-6 sobre a secreção de insulina porilhotas de ratos. Ilhotas de rato recém-isoladas (de Liefscann) são tratadascom IL-6 e anticorpo humano projetado anti-IL-6 (AME- 19a) na presença ouausência de glicose. Foram medidos os níveis de insulina secretados pelasilhotas sob vários tratamentos.
C2C12. Células C2C12 foram usadas para o estudo do efeito da insulinasobre o músculo esquelético. Foram realizados experimentos para examinara expressão de IRS1 e Glut4, a fosforilação de IRS1 induzida por insulina eos efeitos de IL-6 sobre a ação de adiponectina.
Vantagens:
A inibição da atividade de IL-6 pelo anticorpo IL-6 da presenteinvenção poderia representar um avanço terapêutico significativo, uma vezque ela será capaz de aumentar a sensibilidade à insulina e o controlemetabólico, sem os efeitos colaterais dos agentes existentes. Além disso, asterapias atuais pouco fazem para o controle da inflamação sistêmica, a qualsugere-se seja a causa subjacente do DMT2 e das complicações diabéticasassociadas. Espera-se que uma substância terapêutica como o anticorpo IL-6 da presente invenção, além de aumentar a sensibilidade à insulina, inibiriaa inflamação sistêmica e evitaria o desenvolvimento de complicaçõesdiabéticas.
O número de pacientes afetados por DMT2 está emcrescimento e estima-se que chegue a 300 milhões de pessoas por volta de2025. Um anticorpo anti-IL-6 poderia ser usado como monoterapia ou emcombinação com outros antidiabéticos orais já existentes, tais comosulfoniluréias, biguanidas (por exemplo, Metphormin), tiazolidinadionas,meglitinida (por exemplo, repaglinida), inibidores da alfa-glicosidase (porexemplo, acarbose). Além disso, ele poderia ser usado em combinação cominsulina ou outras substâncias terapêuticas, de forma a aumentar asensibilidade à insulina e melhorar o controle glicêmico e evitar eventoshipoglicêmicos que estão associados ao tratamento com insulina. Espera-setambém que, além do aumento da sensibilidade à insulina e da regulaçãodos níveis de glicose em pacientes com DMT2 e Síndrome Metabólica, aterapia com anti-IL-6 teria um efeito benéfico sobre as alteraçõescardiovasculares freqüentemente observadas nesses pacientes. See Saltiel,A.R., e Kahn, CR. 2001. Nature 414: 799-806; Hansen, B.C, 1995. DiabetesCare 18: A2-A9; "Diabetes Prevention Program research group". 2002. NewEngl. J. Med., 346: 393-403; Hansen, B.C, 2000, Ann. New York Academyof Science,892: 1-24; Hsueh, W.A., e Quinones, M.J., 2003, Am. J.Cardiology, 93: 10J-17J; Resnick, H.E. e Howard, B.V., 2002, Ann. Rev.Med., 53: 245-267; Korner, J. e Aronne, L, 2003, J Clin. Invest, 111(5): 565-570; Skoog, T., e ai, 2001. Diabetologia, 44: 654:655; Fernandez-Real, J.M.,e Ricart W., 2003, Endocrine Reviews, 24(3): 278-301; Fernandez-Real,J.M., e al., 2001, J. Clin. Endocrinol. Metab., 86: 1.154-1.159.; 10a. Fried, S.,e al., 1998. J. Clin. Endocrinol. Metab., 83: 847-850; Senn, J.J., e al., 2002,Diabetes, 51: 3.391-3.399; Rotter, V., e al., 2003, JBC em impressão,Manus. #301977200; 12a. Stouthard, J.M., e ai, 1996, BBRC, 220: 241-245;Southern, C, e ai, 1990, Biochem J., 272: 243-245; Sandler, S., e ai, 1990,Endocrinology, 126: 1.288-1.294; Pedersen, B.K., e ai, 2001, J PhysioL,536: 329-337; DiCosmo, B.F., e ai, 1994, Int. Immunoi, 6: 1.829-1.837;Wallenius, V., e ai, 2002, Nature Medicine, 8: 75-79; Vozarova, B., e ai,2003, Human Genetic, 112: 409-413; Kubaszek, A., e ai, 2003, Diabetes,52: 558-461; Tsigos, C, e ai, 1997, J. Clin. Endocrinol. Metab, 82: 4.167-4.170; Stoutharad, J.M., e ai, 1995, Am. J. Physioi, 268; E813-E819; Kern,P.A., e ai, 2001, Am. J. Physioi Endocrinol. Metab., 280: E745-E751;Bastard, J.P., e ai, 2000, J. Clon. Endocrinol. Metab., 85: 3.338-3.342; eBastard, J.P., e ai, 2002, J. Clin. Endocrinol. Metab., 87: 2.084-2.089.
Ficará evidente que a invenção pode ser praticada de umaforma diferente da forma particularmente descrita na descrição e nosexemplos apresentados anteriormente. Várias modificações e variações dapresente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima e, portanto,estão dentro do escopo das reivindicações e anexo.
TABELA 1 - CDRs de cadeia leve
<table>table see original document page 140</column></row><table><table>table see original document page 141</column></row><table><table>table see original document page 142</column></row><table><table>table see original document page 143</column></row><table><table>table see original document page 144</column></row><table><table>table see original document page 145</column></row><table>TABELA 4 - Mutações incluídas na biblioteca combinatorial
<table>table see original document page 146</column></row><table>TABELA 5a - Clones de biblioteca positiva
<table>table see original document page 147</column></row><table><table>table see original document page 148</column></row><table>TABELA 7 — Constantes cinéticas para lgG's Anti-IL-6
<table>table see original document page 149</column></row><table><table>table see original document page 150</column></row><table>Tabela 9 - Impacto do tratamento com mAb anti-IL-6 sobre a patologiarenal em camundongos NZB/W F1
* Severo - A hiperplasia linfóide mista perivascular, hipercelularidademesangial, deposição de proteína, deposição de complexo imune namembrana basal glomerular
Moderado - Moderada hiperplasia linfóide mista perivascular, moderadahipercelularidade mesangial, deposição de complexo imune na membranabasal glomerular, nenhuma deposição de proteína
Leve - Hipercelularidade mesangial leve, leve deposição de complexo imunena membrana basal glomerular, nenhuma hiperplasia linfóide mistaperivascular, nenhuma deposição de proteína
TABELA 7 — Constantes cinéticas para lgG's Anti-IL-6
<table>table see original document page 151</column></row><table>
Tabela 10 - Seqüências de região variável de clones
<table>table see original document page 151</column></row><table><table>table see original document page 152</column></row><table><table>table see original document page 153</column></row><table><table>table see original document page 154</column></row><table><table>table see original document page 155</column></row><table>Tabela 11 - Seqüência de aminoácidos de uma região estrutural L6 decadeia leve humana com seqüências de CDR rotuladas intercaladas
(FRL1 - ID. DE SEQ. Ne: 105) CDRL1 (FRL2 - ID. DE SEQ. N9: 106)CDRL2
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCXXXXXXXXXXWYQQKPGQAPRLLIYXXXXXXX
(FRL3 - ID. DE SEQ. Ne: 107) CDRL3 (FRL4 - ID. DE SEQ. N9: 108)GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCXXXXXXXXXFGGGTKVEIK
Tabela 12 - Seqüência de aminoácidos de uma região estrutural VH3-7 decadeia pesada humana com seqüências de CDR rotuladas intercaladas
(FRH1 - ID. DE SEQ. N-: 109) CDRH1 (FRH2 - ID. DE SEQ. NQ: 110)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASXXXXXXXXXXWVRQAPGKGLEWVACDRH2 (FRH3 - ID. DE SEQ. Ne: 111)
XXXXXXXXXXXXXXXXXRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
CDRH3 (FRH4- ID. DE SEQ. Ne: 112)
XXXXXXXXXXWGQGTTVTVSS
Tabela 13 — Seqüências de CDR
<table>table see original document page 156</column></row><table>
*X denota qualquer aminoácido adequado com substituições de aminoácidosnao liitantes de exemplo mostradas nas seqüências reveladas nos IDS. DESEQ. Nos:1-92 das Tabelas 1 e 2 e nas Tabelas 3, 4, 5A e 8. Além disso, Xpode ter os seguintes valores:
Xi= A ou GX2 = S ou R
X3 = H, I.S.ouY
X4 = S ou Y
X5 = S ou F
X6 = F, L, M, ou T
X7 = N ou E
X8 = A ou T
X9 = M, C ou S
X10= Q ou C
Xn = T ou Q
X12 = F, SouT
X13 = S ou P
X-I4 = L ou M
Xi5 = A ou I
Xi6 = S ou P
X17 = Y ou W
X18 = T, E, ou Y
X19 = YouF
X2o = P, S, D, ou F
X2i = V ou D
X22 = T ou A
X23 = G ou P
X24 = S, Y, T, ou N
X25 = Y, T, F, ou I
IP. DE SEQ. Ng: 115 - SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDO DA PROTEÍNA DEIL-6
MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQK KAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM

Claims (90)

1. Anticorpo IL-6 isolado que compreende pelo menos umaregião determinante de complementaridade que possui uma seqüência deaminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 132--137, em que o referido anticorpo se liga à IL-6 humana ou a um fragmentodo mesmo.
2. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 1, em que Xié A ou G, X2 é S ou R, X3 é H, I, S ou Y, X4 é S ou Y, X5 é S ou F, X6 é F, L,M ou T, X7 é N ou E, X8 é A ou T, X9 é M, C, S ou Q, Xi0 é Q ou C, Xn é Tou Q, X12 é F, S ou T, X13 é S ou P, X14 é L ou M, X15 é A ou I, X16 é S ou P,X17 éYouW, Xis é T, E ou Y, X19 é Y ou F, X20 é P, S, D ou Y, X2i é V ou D,X22 é T ou A, X23 é G ou P, X24 é S, Y, T ou N, e X25 é Y, T, F ou I.
3. Anticorpo humano isolado projetado que compreende pelomenos uma região determinante de complementaridade, em que o referidoanticorpo se liga à IL-6 humana ou a um fragmento desta.
4. Anticorpo IL-6 isolado que compreende pelo menos umaregião variável da cadeia pesada que possui uma seqüência de aminoácidosselecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 95, 99, 103, 118,-122, 126 e 130 e/ou pelo menos uma região variável da cadeia leve quepossui uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consistenos IDS. DE SEQ. Nos: 93, 97, 101, 116, 120, 124 e 128.
5. Anticorpo IL-6 isolado que compreende pelo menos umaregião variável da cadeia leve, a referida região variável da cadeia levecompreendendo pelo menos um membro do grupo que consiste em:(a) uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve da regiãodeterminante de complementaridade 1 (CDRL1) selecionada do grupo queconsiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 1, 3, 5, 7, 9,11, 13 e 15;(b) uma seqüência de aminoácidos de CDRL2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 17,19, 21, 23, 25 e 27; e(c) uma seqüência de aminoácidos de CDRL3 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. N05: 29, 31, 33, 35 e 138.
6. Anticorpo IL-6 isolado que compreende pelo menos umaregião variável da cadeia pesada, a referida região variável da cadeiapesada compreendendo pelo menos um membro do grupo que consiste em:(a) uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada da regiãodeterminante de complementaridade 1 (CDRH1) selecionada do grupo queconsiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 37, 39, 41, 43, 45 e 47;(b) uma seqüência de aminoácidos de CDRH2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65,-67, 69, 71,73, 75, 77 e 113;e(c) uma seqüência de aminoácidos de CDRH3 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 e 114.
7. Anticorpo IL-6 isolado que compreende a região variável dacadeia leve de acordo com a reivindicação 5, e a região variável da cadeiapesada de acordo com a reivindicação 6.
8. Anticorpo IL-6 isolado de acordo com a reivindicação 7, queainda compreende pelo menos uma região estrutural humana adjacente apelo menos uma região determinante de complementaridade.
9. Anticorpo IL-6 isolado de acordo com a reivindicação 8, emque pelo menos uma região estrutural humana é selecionada dos IDS. DESEQ. Nos: 105-112.
10. Anticorpo IL-6 isolado de acordo com a reivindicação 5, quecompreende pelo menos uma região variável da cadeia leve, a referidaregião variável da cadeia leve compreendendo:(a) uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve da regiãodeterminante de complementaridade 1 (CDRL1) selecionada do grupo queconsiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15;(b) uma seqüência de aminoácidos de CDRL2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 17,19,21, 23, 25 e 27; e(c) uma seqüência de aminoácidos de CDRL3 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 29, 31, 33, 35 e 138.
11. Anticorpo IL-6 isolado de acordo com a reivindicação 6, quecompreende pelo menos uma região variável da cadeia pesada, a referidaregião variável da cadeia pesada compreendendo:(a) uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada da regiãodeterminante de complementaridade 1 (CDRH1) selecionada do grupo queconsiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 37, 39, 41, 43, 45 e 47;(b) uma seqüência de aminoácidos de CDRH2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65,-67, 69, 71, 73, 75, 77 e 113; e(c) uma seqüência de aminoácidos de CDRH3 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 e 114.
12. Anticorpo IL-6 isolado que compreende a região variável dacadeia leve de acordo com a reivindicação 10, e a região variável da cadeiapesada de acordo com a reivindicação 11.
13. Anticorpo IL-6 isolado de acordo com a reivindicação 12, queainda compreende, entremeada entre as regiões determinantes decomplementaridade, uma região estrutural da cadeia leve humana 1 (FRL1)do ID. DE SEQ. N9: 105, uma FRL2 do ID. DE SEQ. N9: 106, uma FRL3 doID. DE SEQ. N9: 107, uma FRL4 do ID. DE SEQ. N9: 108, uma regiãoestrutural da cadeia pesada humana 1 (FRH1) do ID. DE SEQ. Ne: 109, umaFRH2 do ID. DE SEQ. N9: 110, uma FRH3 do ID. DE SEQ. N9: 111 e umaFRH4 do ID. DE SEQ. N9: 112.
14. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 12, em quea região variável da cadeia leve compreende:(a) uma seqüência de aminoácidos de CDRL1 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15;(b) uma seqüência de aminoácidos de CDRL2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 17, 19, 21, 23, 25 e 27; e(c) a seqüência de aminoácidos de CDRL3 do ID. DE SEQ. N9: 29.
15. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 12, em quea região variável da cadeia leve compreende:(a) uma seqüência de aminoácidos de CDRL1 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15;(b) uma seqüência de aminoácidos de CDRL2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 17, 19, 21, 23, 25 e 27; e(c) a seqüência de aminoácidos de CDRL3 do ID. DE SEQ. N-:35.
16. Anticorpo isolado de acordo com as reivindicação 14 ou 15,que ainda compreende, entremeada entre as CDRLs, uma região estruturalda cadeia leve humana 1 (FRL1) do ID. DE SEQ. NQ: 105, uma FRL2 do ID.DE SEQ. Ne: 106, uma FRL3 do ID. DE SEQ. NQ: 107 e uma FRL4 do ID. DE SEQ. Ne: 108.
17. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 12, em quea região variável da cadeia pesada compreende:(a) uma seqüência de aminoácidos de CDRH1 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 37, 39, 41, 43, 45 e 47;(b) uma seqüência de aminoácidos de CDRH2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 e 113; e(c) a seqüência de aminoácidos de CDRH3 do ID. DE SEQ. Ne: 87.
18. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 12, em quea região variável da cadeia pesada compreende:(a) uma seqüência de aminoácidos de CDRH1 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 37, 39, 41, 43, 45 e 47;(b) uma seqüência de aminoácidos de CDRH2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 e 113; e(c) a seqüência de aminoácidos de CDRH3 do ID. DE SEQ. Ne: 89.
19. Anticorpo isolado da reivindicação 12, em que a regiãovariável da cadeia pesada compreende:(a) uma seqüência de aminoácidos de CDRH1 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 37, 39, 41, 43, 45 e 47;(b) uma seqüência de aminoácidos de CDRH2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65,-67,69,71,73,75,77 6 113:6(c) a seqüência de aminoácidos de CDRH3 do ID. DE SEQ. N9: 91.
20. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 12, em quea região variável da cadeia pesada compreende:(a) uma seqüência de aminoácidos de CDRH1 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 37, 39, 41, 43, 45 e 47;(b) uma seqüência de aminoácidos de CDRH2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65,-67, 69, 71, 73, 75, 77 e 113; e(c) a seqüência de aminoácidos de CDRH3 do ID. DE SEQ. N9: 114.
21. Anticorpo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 17-20, que ainda compreende, entremeada entre as CDRHs,uma região estrutural da cadeia pesada humana 1 (FRH1) do ID. DE SEQ.N9: 109, uma FRH2 do ID. DE SEQ. N9: 110, uma FRH3 do ID. DE SEQ. N9:-111 e uma FRH4 do ID. DE SEQ. N9: 112.
22. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 12, em quea CDRL1 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 7, aCDRL2 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 21, aCDRL3 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 29, aCDRH1 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 41, aCDRH2 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 75 e aCDRH3 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 87.
23. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 12, em quea CDRL1 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 3, aCDRL2 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 21, aCDRL3 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 29, aCDRH1 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 41, aCDRH2 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 75 e aCDRH3 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 89.
24. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 12, em quea CDRL1 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. Ne: 15,a CDRL2 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 27,a CDRL3 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. Ne: 35,a CDRH1 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 47,a CDRH2 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 61 ea CDRH3 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 91.
25. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 12, em quea CDRL1 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 15,a CDRL2 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 27,a CDRL3 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 35,a CDRH1 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 47,a CDRH2 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 57 ea CDRH3 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 91.
26. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 12, em quea CDRL1 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 15,a CDRL2 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 17,a CDRL3 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 29,a CDRH1 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. Ne: 45,a CDRH2 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. Ne: 59 ea CDRH3 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 89.
27. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 12, em quea CDRL1 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 7, aCDRL2 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 17, aCDRL3 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 29, aCDRH1 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. Nõ: 45, aCDRH2 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 77 e aCDRH3 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 87.
28. Anticorpo IL-6 isolado que compreende uma seqüência deaminoácidos da cadeia leve da região determinante de complementaridade 1(CDRL1) do ID. DE SEQ. N9: 3, uma seqüência de aminoácidos de CDRL2do ID. DE SEQ. N9: 21, uma seqüência de aminoácidos de CDRL3 do ID. DESEQ. N9: 29, uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada da regiãodeterminante de complementaridade 1 (CDRH1) do ID. DE SEQ. NQ: 39,uma seqüência de aminoácidos de CDRH2 do ID. DE SEQ. NQ: 59 e umaseqüência de aminoácidos de CDRH3 do ID. DE SEQ. Ng: 89.
29. Anticorpo IL-6 isolado que compreende pelo menos umaregião variável da cadeia leve, a referida região variável da cadeia levecompreendendo:(a) uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve da regiãodeterminante de complementaridade 1 (CDRL1) do ID. DE SEQ. N9: 132;(b) uma seqüência de aminoácidos de CDRL2 do ID. DE SEQ.N9:133;e(c) uma seqüência de aminoácidos de CDRL3 selecionada dogrupo que consiste no ID. DE SEQ. N9: 134, em que Xi é A ou G, X2 é S ouR, X3 é H, I, S ou Y, X4éS ou Y, X5 é S ou F, X6 é F, L, M ou T, X7 é N ou E,X8 é A ou T, X9 é M, C, S ou Q, e X10 é Q ou C.
30. Anticorpo IL-6 isolado que compreende pelo menos umaregião variável da cadeia pesada, a referida região variável da cadeiapesada compreendendo:(a) uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada da regiãodeterminante de complementaridade 1 (CDRH1) do ID. DE SEQ. Ne: 135;(b) uma seqüência de aminoácidos de CDRH2 do ID. DE SEQ.N9: 136; e(c) uma seqüência de aminoácidos de CDRH3 do ID. DE SEQ.N9: 137, em que Xn é T ou Q, X12 é F, S ou T, X13 é S ou P, Xu é L ou M,X15 é A ou I, X16 é S ou P, X17 é Y ou W, X18 é T, E ou Y, X19 é Y ou F, X20 éP, S, D ou Y, X2i é V ou D, X22 é T ou A, X23 é G ou P, X24 é S, Y, T ou N, eX25 é Y, T, F ou I.
31. Anticorpo IL-6 isolado que compreende a região variável dacadeia leve de acordo com a reivindicação 29 e a região variável da cadeiapesada de acordo com a reivindicação 30.
32. Anticorpo IL-6 isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 22-28 e 31 que ainda compreende, entremeada entre asregiões determinantes de complementaridade, uma região estrutural dacadeia leve humana 1 (FRL1) do ID. DE SEQ. Ne: 105, uma FRL2 do ID. DESEQ. N9: 106, uma FRL3 do ID. DE SEQ. N9: 107, uma FRL4 do ID. DESEQ. Ne: 108, uma região estrutural da cadeia pesada humana 1 (FRH1) doID. DE SEQ. N9: 109, uma FRH2 do ID. DE SEQ. N9: 110, uma FRH3 do ID.DE SEQ. N9: 111 e uma FRH4 do ID. DE SEQ. N9: 112.
33. Anticorpo IL-6 isolado que compreende pelo menos umaregião variável da cadeia leve, a referida região variável da cadeia levecompreendendo uma região estrutural da cadeia leve humana 1 (FRL1) doID. DE SEQ. N9: 105, uma FRL2 do ID. DE SEQ. N9: 106, uma FRL3 do ID.DE SEQ. N9: 107 e uma FRL4 do ID. DE SEQ. N9: 108 e regiões CDRentremeadas, as regiões CDR compreendendo:(a) uma seqüência de aminoácidos de CDRL1 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15;(b) uma seqüência de aminoácidos de CDRL2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 17, 19, 21, 23, 25 e 27; e(c) uma seqüência de aminoácidos de CDRL3 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. N08: 29, 31, 33, 35 e 138.
34. Anticorpo IL-6 isolado que compreende pelo menos umaregião variável da cadeia pesada, a referida região variável da cadeiapesada compreendendo uma região estrutural da cadeia pesada humana 1(FRH1) do ID. DE SEQ. N9: 109, uma FRH2 do ID. DE SEQ. N9: 110, umaFRH3 do ID. DE SEQ. N9: 111 e uma FRH4 do ID. DE SEQ. N9: 112 eregiões CDR entremeadas, as regiões CDR compreendendo:(a) uma seqüência de aminoácidos de CDRH1 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 37, 39, 41, 43, 45 e 47;(b) uma seqüência de aminoácidos de CDRH2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65,67, 69, 71, 73, 75, 77 e 113; e(c) uma seqüência de aminoácidos de CDRH3 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 e 114.
35. Anticorpo IL-6 isolado que compreende a região variável dacadeia leve de acordo com a reivindicação 33 e a região variável da cadeiapesada de acordo com a reivindicação 34.
36. Anticorpo humano isolado ou humano projetado que se ligacompetitivamente à IL-6 com pelo menos um anticorpo IL-6 isolado quecompreende pelo menos uma região variável da cadeia leve e pelo menosuma região variável da cadeia pesada, o referido anticorpo IL-6 isolado quecompreende regiões variáveis da cadeia leve e pesada selecionadas dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 93 e 95, IDS. DE SEQ. Nos: 97 e 99, IDS. DE SEQ. Nos: 101 e 103, IDS. DE SEQ. Nos: 116 e 118, IDS. DESEQ. Nos: 120 e 122, IDS. DE SEQ. Nos: 124 e 126, e IDS. DE SEQ. Nos: 128e130.
37. Anticorpo humano isolado ou humano projetado que se ligacompetitivamente à IL-6 com o anticorpo IL-6 isolado de acordo com areivindicação 12.
38. Anticorpo humano isolado ou humano projetado que se ligacompetitivamente a uma região que compreende os aminoácidos 168-184do ID. DE SEQ. Ng: 115.
39. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 36-38, em que o anticorpo é projetado humano.
40. Anticorpo IL-6 de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-39, em que o referido anticorpo se liga à IL-6 com pelomenos uma afinidade selecionada de pelo menos 10"9 M, pelo menos 10"10M, pelo menos 10"11 M e pelo menos 10"12 M, pelo menos 10"13 M, pelomenos 10"14 M e pelo menos 10"15 M, como determinado por ressonância deplasmôniode superfície ou pelo método de Kinexa.
41. Anticorpo IL-6 de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-40, em que o referido anticorpo modula substancialmentepelo menos uma atividade de pelo menos um polipeptídeo IL-6.
42. Molécula de ácido nucléico isolado que codifica pelo menosum anticorpo IL-6 isolado como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 -40.
43. Vetor de ácido nucléico isolado que compreende a moléculade ácido nucléico isolado como definida na reivindicação 42.
44. Célula hospedeira procariótica ou eucariótica quecompreende a molécula de ácido nucléico isolado como definida nareivindicação 42.
45. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 44, em quea referida célula hospedeira é pelo menos uma selecionada entre célulasCOS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293,HeLa, de mieloma ou de linfoma, ou qualquer célula derivada, imortalizadaou transformada desta.
46. Método para a produção de pelo menos um anticorpo IL-6que compreende a tradução da molécula de ácido nucléico como definido nareivindicação 42, sob condições in vitro, in vivo ou in situ, de tal forma que oanticorpo IL-6 seja expresso em quantidades detectáveis ou recuperáveis.
47. Composição que compreende pelo menos um anticorpo IL-6isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1-40, e pelomenos um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
48. Composição de acordo com a reivindicação 47, que aindacompreende pelo menos um composto ou polipeptídeo selecionado de umrótulo ou repórter dètectável, um antagonista de TNF, um fármacoantiinfeccioso, um fármaco para o sistema cardiovascular (CV), um fármacopara o sistema nervoso central (SNC), um fármaco para o sistema nervosoautônomo (SNA), um fármaco para o trato respiratório, um fármaco para otrato gastrointestinal (Gl), um fármaco hormonal, um fármaco para oequilíbrio hídrico ou eletrolítico, um fármaco hematológico, umantineoplásico, um fármaco para imunomodulação, um fármaco oftálmico,óptico ou nasal, um fármaco tópico, um fármaco nutricional, uma citocina, eum antagonista de citocina.
49. Anticorpo ou fragmento antiidiótipo que se ligaespecificamente a pelo menos um anticorpo IL-6 como definido em qualqueruma das reivindicações 1-40.
50. Método para diagnóstico ou tratamento de uma condiçãorelacionada à IL-6 em uma célula, tecido, órgão ou animal, que compreendeo contato ou a administração de uma composição quecompreende uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1-40, com ou para a referidacélula, tecido, órgão ou animal.
51. Método de acordo com a reivindicação 50, em que acondição relacionada à IL-6 é selecionada do grupo que consiste em artritereumatóide, osteoartrite, osteólise, deslocamento asséptico de implantesortopedicos, lúpus eritematoso sistêmico, lúpus eritematoso cutâneo, nefritelúpica, diabetes melito do tipo 2, doença pulmonar obstrutiva crônica ecarcinoma de célula renal.
52. Método de acordo com a reivindicação 50, em que a referidaquantidade eficaz é de cerca de 0,001-50 mg/quilograma das referidascélulas, tecido, órgão ou animal.
53. Método de acordo com a reivindicação 50, em que o referidocontato ou a referida administração é através de pelo menos um modoselecionado entre a administração parenteral, subcutânea, intramuscular,intravenosa, intra-articular, intrabrônquica, intra-abdominal, intracapsular,intracartilaginosa, intracavitária, intracelíaca, intracerebelar,intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intra-hepática,intramiocárdica, intra-óssea, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal,intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intra-retal, intra-renal, intra-retiniana, intramedular, intra-sinovial, intratorácica, intra-uterina, intravesical,intralesional, em bolo, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal etransdérmica.
54. Método de acordo com a reivindicação 50, que aindacompreende a administração, antes, concomitantemente ou depois doreferido contato ou administração, de pelo menos uma composição quecompreende uma quantidade eficaz de pelo menos um composto oupolipeptídeo selecionado de um rótulo ou repórter detectável, um fármacoantiinfeccioso, um fármaco para o sistema cardiovascular (CV), um fármacopara o sistema nervoso central (SNC), um fármaco para o sistema nervosoautônomo (SNA), um fármaco para o trato respiratório, um fármaco para otrato gastrointestinal (Gl), um fármaco hormonal, um fármaco para oequilíbrio hídrico ou eletrolítico, um fármaco hematológico, umantineoplásico, um fármaco para imunomodulação, um fármaco oftálmico,óptico ou nasal, um fármaco tópico, um fármaco nutricional, uma citocina eum antagonista de citocina.
55. Dispositivo médico que compreende um anticorpo IL-6 comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1-40, em que o referidodispositivo é adequado para o contato ou administração do referido anticorpoIL-6 por pelo menos um modo selecionado entre a administração parenteral,subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-articular, intrabrônquica, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitária, intracelíaca,intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica,intra-hepática, intramiocárdica, intra-óssea, intrapélvica, intrapericárdica,intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intra-retal, intra-renal, intra-retiniana, intramedular, intra-sinovial, intratorácica, intra-uterina,intravesical, intralesional, em bolo, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasale transdérmica.
56. Artigo fabricado para uso farmacêutico ou diagnósticohumano que compreende material de embalagem e um recipiente quecompreende uma solução ou uma forma liofilizada de anticorpo IL-6 comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 -40.
57. Artigo fabricado de acordo com a reivindicação 56, em que oreferido recipiente é um componente de um dispositivo ou sistema deliberação parenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-articular,intrabrônquica, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavi-tária, intracelíaca, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica,intracervical, intragástrica, intra-hepática, intramiocárdica, intra-óssea,intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática,intrapulmonar, intra-retal, intra-renal, intra-retiniana, intramedular, intra-sinovial, intratorácica, intra-uterina, intravesical, intralesional, em bolo,vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal ou transdérmica.
58. Método para a produção de anticorpo IL-6 isolado comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1-40, que compreende ofornecimento de uma célula hospedeira ou animal transgênica ou planta oucélula de planta transgênica capaz de expressar em quantidadesrecuperáveis o referido anticorpo.
59. Anticorpo IL-6 produzido pelo método como definido nareivindicação 58.
60. Molécula de ácido nucléico isolado que codifica um anticorpoIL-6 que compreende pelo menos uma região variável da cadeia leve, areferida região variável da cadeia leve compreendendo pelo menos ummembro do grupo que consiste em:(a) uma seqüência de nucleotídeos de cadeia leve da regiãodeterminante de complementaridade 1 (CDRL1) selecionada do grupo queconsiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16;(b) uma seqüência de nucleotídeos de CDRL2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 18, 20, 22, 24, 26 e 28; e(c) uma seqüência de nucleotídeos de CDRL3 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 30, 32, 34 e 36.
61. Molécula de ácido nucléico isolado que codifica um anticorpoIL-6 que compreende pelo menos uma região variável da cadeia pesada, areferida região variável da cadeia pesada compreendendo pelo menos ummembro do grupo que consiste em:(a) uma seqüência de nucleotídeos de cadeia pesada da regiãodeterminante de complementaridade 1 (CDRH1) selecionada do grupo queconsiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 38, 40, 42, 44, 46 e 48;(b) uma seqüência de nucleotídeos de CDRH2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66,-68, 70, 72, 74, 76 e 78; e(c) uma seqüência de nucleotídeos de CDRH3 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 80, 82, 84, 86, 88, 90 e 92.
62. Molécula de ácido nucléico isolado que codifica um anticorpoIL-6 que compreende a seqüência de nucleotídeos da região variável dacadeia leve de acordo com a reivindicação 60, e a seqüência denucleotídeos da região variável da cadeia pesada de acordo com areivindicação 61.
63. Molécula de ácido nucléico isolado que codifica um anticorpoIL-6 que compreende pelo menos uma região variável da cadeia leve, areferida região variável da cadeia leve compreendendo:(a) uma seqüência de nucleotídeos de cadeia leve da regiãodeterminante de complementaridade 1 (CDRL1) selecionada do grupo queconsiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16;(b) uma seqüência de nucleotídeos de CDRL2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 18, 20, 22, 24, 26 e 28; e(c) uma seqüência de nucleotídeos de CDRL3 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 30, 32, 34 e 36.
64. Molécula de ácido nucléico isolado que codifica um anticorpoIL-6 que compreende pelo menos uma região variável da cadeia pesada, areferida região variável da cadeia pesada compreendendo:(a) uma seqüência de nucleotídeos de cadeia pesada da regiãodeterminante de complementaridade 1 (CDRH1) selecionada do grupo queconsiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 38, 40, 42, 44, 46 e 48;(b) uma seqüência de nucleotídeos de CDRH2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 e 78; e(c) uma seqüência de nucleotídeos de CDRH3 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 80, 82, 84, 86, 88, 90 e 92.
65. Molécula de ácido nucléico isolado que codifica um anticorpoIL-6 que compreende a seqüência de nucleotídeos da região variável dacadeia leve de acordo com a reivindicação 63, e a seqüência denucleotídeos da região variável da cadeia pesada de acordo com areivindicação 64.
66. Molécula de ácido nucléico isolado de acordo com areivindicação 65, que ainda compreende, entremeadas entre as seqüênciasde nucleotídeos da região determinante de complementaridade, seqüênciasde nucleotídeos que codificam uma região estrutural da cadeia leve humana 1 (FRL1) do ID. DE SEQ. N9: 105, uma FRL2 do ID. DE SEQ. Ne: 106, umaFRL3 do ID. DE SEQ. Ne: 107, uma FRL4 do ID. DE SEQ. Ne: 108, umaregião estrutural da cadeia pesada humana 1 (FRH1) do ID. DE SEQ. NQ:-109, uma FRH2 do ID. DE SEQ. N9: 110, uma FRH3 do ID. DE SEQ. Ne: 111e uma FRH4 do ID. DE SEQ. N9: 112.
67. Molécula de ácido nucléico isolado de acordo com areivindicação 63, em que a região variável da cadeia leve compreende:(a) uma seqüência de nucleotídeos de CDRL1 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16;(b) uma seqüência de nucleotídeos de CDRL2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 18, 20, 22, 24, 26 e 28; e(c) a seqüência de nucleotídeos de CDRL3 do ID. DE SEQ. N9: 30.
68. Molécula de ácido nucléico isolado de acordo com areivindicação 63, em que a região variável da cadeia leve compreende:(a) uma seqüência de nucleotídeos de CDRL1 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16;(b) uma seqüência de nucleotídeos de CDRL2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 18, 20, 22, 24, 26 e 28; e(c) a seqüência de nucleotídeos de CDRL3 do ID. DE SEQ. N9: 36.
69. Molécula de ácido nucléico isolado de acordo com areivindicação 64, em que a região variável da cadeia pesada compreende:(a) uma seqüência de nucleotídeos de CDRH1 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 38, 40, 42, 44, 46 e 48;(b) uma seqüência de nucleotídeos de CDRH2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66,-68, 70, 72, 74, 76 e 78; e(c) a seqüência de nucleotídeos de CDRH3 do ID. DE SEQ. Ne: 86.
70. Molécula de ácido nucléico isolado de acordo com areivindicação 64, em que a região variável da cadeia pesada compreende:(a) uma seqüência de nucleotídeos de CDRH1 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 38, 40, 42, 44, 46 e 48;(b) uma seqüência de nucleotídeos de CDRH2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 e 78; e(c) a seqüência de nucleotídeos de CDRH3 do ID. DE SEQ. N9: 88.
71. Molécula de ácido nucléico isolado de acordo com areivindicação 64, em que a região variável da cadeia pesada compreende:(a) uma seqüência de nucleotídeos de CDRH1 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 38, 40, 42, 44, 46 e 48;(b) uma seqüência de nucleotídeos de CDRH2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 e 78; e(c) a seqüência de nucleotídeos de CDRH3 do ID. DE SEQ. N9: 90.
72. Molécula de ácido nucléico isolado de acordo com areivindicação 64, em que a região variável da cadeia pesada compreende:(a) uma seqüência de nucleotídeos de CDRH1 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 38, 40, 42, 44, 46 e 48;(b) uma seqüência de nucleotídeos de CDRH2 selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 e 78; e(c) a seqüência de nucleotídeos de CDRH3 do ID. DE SEQ. N9: 92.
73. Molécula de ácido nucléico isolado de acordo com areivindicação 65, que compreende a seqüência de nucleotídeos de CDRL1do ID. DE SEQ. N9: 8, a seqüência de nucleotídeos de CDRL2 do ID. DESEQ. N9: 22, a seqüência de nucleotídeos de CDRL3 do ID. DE SEQ. N9: 30,a seqüência de nucleotídeos de CDRH1 do ID. DE SEQ. N9: 42, a seqüênciade nucleotídeos de CDRH2 do ID. DE SEQ. N9: 76 e a seqüência denucleotídeos de CDRH3 do ID. DE SEQ. N9: 88.
74. Molécula de ácido nucléico isolado de acordo com areivindicação 65, que compreende a seqüência de nucleotídeos de CDRL1do ID. DE SEQ. N9: 4, a seqüência de nucleotídeos de CDRL2 do ID. DESEQ. N9: 22, a seqüência de nucleotídeos de CDRL3 do ID. DE SEQ. Ng: 30,a seqüência de nucleotídeos de CDRH1 do ID. DE SEQ. N9: 40, a seqüênciade nucleotídeos de CDRH2 do ID. DE SEQ. N9: 60 e a seqüência denucleotídeos de CDRH3 do ID. DE SEQ. N9: 90.
75. Molécula de ácido nucléico isolado de acordo com areivindicação 65, que compreende a seqüência de nucleotídeos de CDRL1do ID. DE SEQ. N9: 4, a seqüência de nucleotídeos de CDRL2 do ID. DESEQ. N9: 22, a seqüência de nucleotídeos de CDRL3 do ID. DE SEQ. N9: 30,a seqüência de nucleotídeos de CDRH1 do ID. DE SEQ. N9: 42, a seqüênciade nucleotídeos de CDRH2 do ID. DE SEQ. N9: 76 e a seqüência denucleotídeos de CDRH3 do ID. DE SEQ. N9: 90.
76. Molécula de ácido nucléico isolado de acordo com areivindicação 65, que compreende a seqüência de nucleotídeos de CDRL1do ID. DE SEQ. N9: 16, a seqüência de nucleotídeos de CDRL2 do ID. DESEQ. N9: 28, a seqüência de nucleotídeos de CDRL3 do ID. DE SEQ. N9: 36,a seqüência de nucleotídeos de CDRH1 do ID. DE SEQ. N9: 48, a seqüênciade nucleotídeos de CDRH2 do ID. DE SEQ. N9: 62 e a seqüência denucleotídeos de CDRH3 do ID. DE SEQ. N9: 92.
77. Molécula de ácido nucléico isolado de acordo com areivindicação 65, que compreende a seqüência de nucleotídeos de CDRL1do ID. DE SEQ. N9: 16, a seqüência de nucleotídeos de CDRL2 do ID. DESEQ. N9: 28, a seqüência de nucleotídeos de CDRL3 do ID. DE SEQ. N9: 36,a seqüência de nucleotídeos de CDRH1 do ID. DE SEQ. N9: 48, a seqüênciade nucleotídeos de CDRH2 do ID. DE SEQ. N9: 58 e a seqüência denucleotídeos de CDRH3 do ID. DE SEQ. N9: 92.
78. Molécula de ácido nucléico isolado de acordo com areivindicação 65, que compreende a seqüência de nucleotídeos de CDRL1do ID. DE SEQ. N9: 16, a seqüência de nucleotídeos de CDRL2 do ID. DESEQ. N9: 18, a seqüência de nucleotídeos de CDRL3 do ID. DE SEQ. N9: 30,a seqüência de nucleotídeos de CDRH1 do ID. DE SEQ. N9: 46, a seqüênciade nucleotídeos de CDRH2 do ID. DE SEQ. N9: 60 e a seqüência denucleotídeos de CDRH3 do ID. DE SEQ. N9: 90.
79. Molécula de ácido nucléico isolado de acordo com areivindicação 65, que compreende a seqüência de nucleotídeos de CDRL1do ID. DE SEQ. N9: 8, a seqüência de nucleotídeos de CDRL2 do ID. DESEQ. N9: 18, a seqüência de nucleotídeos de CDRL3 do ID. DE SEQ. Ne: 30,a seqüência de nucleotídeos de CDRH1 do ID. DE SEQ. N9: 46, a seqüênciade nucleotídeos de CDRH2 do ID. DE SEQ. N9: 78 e a seqüência denucleotídeos de CDRH3 do ID. DE SEQ. N9: 88.
80. Anticorpo IL-6 de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-39, em que o referido anticorpo tem um valor de EC50 decerca de 2,7 x 10"11 M ou menos.
81. Anticorpo de acordo com a reivindicação 80, em que o valorde EC50 é de cerca de 2,7 x 10"12 ou menos.
82. Anticorpo IL-6 isolado que compreende uma seqüência deaminoácidos da região variável da cadeia leve do ID. DE SEQ. N9: 93 e umaseqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do ID. DESEQ. N9: 95.
83. Anticorpo IL-6 isolado que compreende uma seqüência deaminoácidos da região variável da cadeia leve do ID. DE SEQ. Ne: 97 e umaseqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do ID. DESEQ. N9: 99.
84. Anticorpo IL-6 isolado que compreende uma seqüência deaminoácidos da região variável da cadeia leve do ID. DE SEQ. Ne: 101 euma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do ID.DE SEQ. N9: 103.
85. Anticorpo IL-6 isolado que compreende uma seqüência deaminoácidos da região variável da cadeia leve do ID. DE SEQ. N9: 116 euma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do ID.DE SEQ. N9: 118.
86. Anticorpo IL-6 isolado que compreende uma seqüência deaminoácidos da região variável da cadeia leve do ID. DE SEQ. N9: 120 euma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do ID.DE SEQ. N9: 122.
87. Anticorpo IL-6 isolado que compreende uma seqüência deaminoácidos da região variável da cadeia leve do ID. DE SEQ. N9: 124 euma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do ID.DE SEQ. N9: 126.
88. Anticorpo IL-6 isolado que compreende uma seqüência deaminoácidos da região variável da cadeia leve do ID. DE SEQ. N9: 128 euma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do ID.DE SEQ. N9: 130.
89. Anticorpo IL-6 isolado que compreende uma seqüência deaminoácidos da região variável da cadeia leve codificada por uma dasseqüências de nucleotídeos dos IDS. DE SEQ. Nos: 94, 98, 102, 117, 121,125 e 129 e uma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada codificada por uma das seqüências de nucleotídeos dos IDS. DESEQ. Nos: 96, 100, 104, 119, 123, 127 e 131.
90. Qualquer invenção aqui descrita.
BRPI0609869-0A 2005-04-29 2006-04-28 Anticorpo il-6 isolado, molécula e vetor de ácido nucléico isolado, célula hospedeira de microrganismo transgênico, método para produzir um anticorpo il-6, composição compreendendo o anticorpo il-6 isolado, dispositivo médico que compreende um anticorpo il-6 e artigo fabricado para uso farmacêutico ou diagnóstico humano BRPI0609869B1 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67649805P 2005-04-29 2005-04-29
US60/676,498 2005-04-29
US67731905P 2005-05-03 2005-05-03
US60/677,319 2005-05-03
PCT/US2006/016457 WO2006119115A2 (en) 2005-04-29 2006-04-28 Anti-il-6 antibodies, compositions, methods and uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BRPI0609869A2 true BRPI0609869A2 (pt) 2010-05-11
BRPI0609869B1 BRPI0609869B1 (pt) 2021-08-24

Family

ID=37308556

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0609869-0A BRPI0609869B1 (pt) 2005-04-29 2006-04-28 Anticorpo il-6 isolado, molécula e vetor de ácido nucléico isolado, célula hospedeira de microrganismo transgênico, método para produzir um anticorpo il-6, composição compreendendo o anticorpo il-6 isolado, dispositivo médico que compreende um anticorpo il-6 e artigo fabricado para uso farmacêutico ou diagnóstico humano

Country Status (38)

Country Link
US (11) US7560112B2 (pt)
EP (3) EP2842968B1 (pt)
JP (4) JP4763043B2 (pt)
KR (1) KR101340950B1 (pt)
CN (2) CN101415819B (pt)
AR (1) AR053370A1 (pt)
AU (1) AU2006242347B2 (pt)
BR (1) BRPI0609869B1 (pt)
CA (1) CA2606348C (pt)
CR (1) CR9551A (pt)
CY (1) CY1120739T1 (pt)
DK (2) DK1874351T3 (pt)
EA (1) EA015262B1 (pt)
EC (1) ECSP077888A (pt)
ES (2) ES2551985T3 (pt)
HK (2) HK1116398A1 (pt)
HN (1) HN2006016512A (pt)
HR (2) HRP20150740T1 (pt)
HU (2) HUE039116T2 (pt)
IL (3) IL186965A0 (pt)
JO (1) JO3058B1 (pt)
LT (1) LT2842968T (pt)
ME (1) ME02185B (pt)
MY (2) MY142835A (pt)
NI (1) NI200700278A (pt)
NO (1) NO342898B1 (pt)
NZ (3) NZ589820A (pt)
PA (1) PA8672101A1 (pt)
PE (1) PE20061324A1 (pt)
PL (2) PL2842968T3 (pt)
PT (2) PT2842968T (pt)
RS (2) RS57474B1 (pt)
SI (2) SI2842968T1 (pt)
SV (1) SV2006002513A (pt)
TR (1) TR201809676T4 (pt)
TW (1) TWI445546B (pt)
WO (1) WO2006119115A2 (pt)
ZA (1) ZA200710264B (pt)

Families Citing this family (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
AU2005269527B2 (en) 2004-07-26 2011-12-01 Pfenex Inc. Process for improved protein expression by strain engineering
PE20061324A1 (es) * 2005-04-29 2007-01-15 Centocor Inc Anticuerpos anti-il-6, composiciones, metodos y usos
AU2006300234B2 (en) 2005-10-14 2013-01-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agents for suppressing damage to transplanted islets after islet transplantation
KR101239051B1 (ko) 2005-10-21 2013-03-04 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 심장질환 치료제
AR057582A1 (es) 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
PE20070998A1 (es) 2005-12-09 2007-10-09 Ucb Pharma Sa Moleculas de anticuerpo que tienen especificidad para la il-6-humana
AR057227A1 (es) * 2005-12-09 2007-11-21 Centocor Inc Metodo para usar antagonistas de il6 con inhibidores del proteasoma
CN101346395A (zh) * 2005-12-30 2009-01-14 默克专利有限公司 阻止复合有IL-6Rα的IL-6与GP130结合的抗IL-6抗体
CN104189907A (zh) 2006-01-27 2014-12-10 学校法人庆应义塾 伴有脉络膜血管生成的疾病的治疗药
EP4001409A1 (en) 2006-03-31 2022-05-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
EP2025346B1 (en) 2006-04-07 2016-08-10 Osaka University Muscle regeneration promoter
EP2228450A1 (en) 2006-04-13 2010-09-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Taurine transporter gene
MX2008014692A (es) * 2006-05-19 2009-08-18 Alder Biopharmaceuticals Inc Metodo de cultivo para obtener una poblacion clonal de celulas b especificas de antigeno.
AU2007272970C1 (en) * 2006-07-11 2013-01-10 Roy C. Levitt Rhinosinusitis prevention and therapy with proinflammatory cytokine inhibitors
WO2008019061A2 (en) * 2006-08-03 2008-02-14 Vaccinex, Inc. Anti-il-6 monoclonal antibodies and uses thereof
WO2008042611A2 (en) * 2006-09-29 2008-04-10 Centocor, Inc. Method of using il6 antagonists with mitoxantrone for prostate cancer
TW200831528A (en) * 2006-11-30 2008-08-01 Astrazeneca Ab Compounds
MX2009007830A (es) 2007-01-23 2009-10-07 Univ Shinshu Inhibidor de rechazo cronico.
US20100233759A1 (en) 2007-03-15 2010-09-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for production of polypeptide
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
JP5444553B2 (ja) 2007-04-27 2014-03-19 フェネックス インコーポレイテッド 微生物宿主を迅速にスクリーニングして、異種タンパク質発現の収率および／または質が改善されている特定の株を同定する方法
US7906117B2 (en) 2007-05-21 2011-03-15 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat cachexia, weakness, fatigue, and/or fever
US9701747B2 (en) 2007-05-21 2017-07-11 Alderbio Holdings Llc Method of improving patient survivability and quality of life by anti-IL-6 antibody administration
TW201531484A (zh) 2007-05-21 2015-08-16 Alder Biopharmaceuticals Inc 抗ＴＮＦ-α之抗體及其用途
US20090238825A1 (en) * 2007-05-21 2009-09-24 Kovacevich Brian R Novel rabbit antibody humanization methods and humanized rabbit antibodies
US8062864B2 (en) 2007-05-21 2011-11-22 Alderbio Holdings Llc Nucleic acids encoding antibodies to IL-6, and recombinant production of anti-IL-6 antibodies
US8178101B2 (en) 2007-05-21 2012-05-15 Alderbio Holdings Inc. Use of anti-IL-6 antibodies having specific binding properties to treat cachexia
US8404235B2 (en) 2007-05-21 2013-03-26 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
WO2008144763A2 (en) * 2007-05-21 2008-11-27 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antibodies to il-6 and use thereof
AU2008254578B2 (en) * 2007-05-21 2013-06-06 Alderbio Holdings Llc Novel rabbit antibody humanization methods and humanized rabbit antibodies
US8252286B2 (en) 2007-05-21 2012-08-28 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
MX2009013410A (es) 2007-06-08 2010-03-22 Biogen Idec Inc Biomarcadores para predecir capacidad de respuesta anti-tnf o sin capacidad de respuesta.
AU2008276451A1 (en) * 2007-07-17 2009-01-22 Zalicus Inc. Treatments of B-cell proliferative disorders
US20090047243A1 (en) * 2007-07-17 2009-02-19 Richard Rickles Combinations for the treatment of b-cell proliferative disorders
WO2009014263A1 (ja) * 2007-07-26 2009-01-29 Osaka University インターロイキン６受容体阻害剤を有効成分とする眼炎症疾患治療剤
CA2695504C (en) * 2007-08-03 2017-05-30 Nucitec S.A. De C.V. Compositions and methods for treatment and prevention of osteoarthritis
DK2186905T3 (en) 2007-08-07 2016-09-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method of Preparation of Heterogeneous Protein
DK2202245T3 (en) 2007-09-26 2016-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of modifying an antibody isoelectric point VIA amino acid substitution in CDR
KR102467302B1 (ko) 2007-09-26 2022-11-14 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 정상영역 개변체
US9802993B2 (en) 2007-10-15 2017-10-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing a cell for protein production by treating a cell overexpressing a taurine transporter with methotrexate
JP5337044B2 (ja) * 2007-10-24 2013-11-06 中外製薬株式会社 異種タンパク質製造のための細胞及びそれを用いた製造方法
EP3521311A1 (en) 2008-04-11 2019-08-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
DK2297202T3 (en) 2008-05-13 2016-03-21 Novimmune Sa ANTI-IL-6 / IL-6R ANTIBODIES AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
US8277804B2 (en) * 2008-05-21 2012-10-02 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
US10717781B2 (en) 2008-06-05 2020-07-21 National Cancer Center Neuroinvasion inhibitor
WO2009151569A2 (en) * 2008-06-09 2009-12-17 Combinatorx, Incorporated Beta adrenergic receptor agonists for the treatment of b-cell proliferative disorders
US8188235B2 (en) * 2008-06-18 2012-05-29 Pfizer Inc. Antibodies to IL-6 and their uses
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
JP5789192B2 (ja) * 2008-11-13 2015-10-07 フェムタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＦｅｍｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． ヒト化抗ｉｌ−６抗体
US8323649B2 (en) 2008-11-25 2012-12-04 Alderbio Holdings Llc Antibodies to IL-6 and use thereof
US8992920B2 (en) 2008-11-25 2015-03-31 Alderbio Holdings Llc Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis
US9212223B2 (en) 2008-11-25 2015-12-15 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
US9452227B2 (en) 2008-11-25 2016-09-27 Alderbio Holdings Llc Methods of treating or diagnosing conditions associated with elevated IL-6 using anti-IL-6 antibodies or fragments
US8420089B2 (en) 2008-11-25 2013-04-16 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
EP2361095B1 (en) * 2008-11-25 2017-12-20 AlderBio Holdings LLC Antagonists of il-6 to raise albumin and/or lower crp
US8337847B2 (en) 2008-11-25 2012-12-25 Alderbio Holdings Llc Methods of treating anemia using anti-IL-6 antibodies
WO2010088444A1 (en) * 2009-01-29 2010-08-05 Medimmune, Llc Human anti-il-6 antibodies with extended in vivo half-life and their use in treatment of oncology, autoimmune diseases and inflammatory diseases
US20120071634A1 (en) 2009-03-19 2012-03-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody Constant Region Variant
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
JP5715050B2 (ja) 2009-04-22 2015-05-07 中外製薬株式会社 異種タンパク質を高生産する細胞の作製方法
US20120183539A1 (en) * 2009-07-31 2012-07-19 Shin Maeda Cancer Metastasis Inhibitor
EP2504030A4 (en) * 2009-11-24 2013-06-26 Alderbio Holdings Llc IL-6 ANTAGONISTS FOR INCREASING ALBUMIN AND / OR REDUCING CRP
US9775921B2 (en) 2009-11-24 2017-10-03 Alderbio Holdings Llc Subcutaneously administrable composition containing anti-IL-6 antibody
MX2012012063A (es) * 2010-04-16 2013-03-21 Medimmune Ltd Composiciones y metodos para tratar exacerbacion de la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (copd).
ES2932398T3 (es) 2010-05-28 2023-01-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Potenciador de la respuesta de las células T antitumorales
US8524215B2 (en) 2010-08-02 2013-09-03 Janssen Biotech, Inc. Absorbable PEG-based hydrogels
CN101993152B (zh) * 2010-09-21 2012-06-20 浙江大学 一种增强油脂降解菌降解能力的激活剂及其用途和使用方法
ES2847891T3 (es) 2010-11-23 2021-08-04 Vitaeris Inc Anticuerpos anti-IL-6 para el tratamiento de la mucositis oral
CA2819356C (en) 2010-11-30 2023-01-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
CA2823044C (en) 2010-12-31 2022-08-16 Jay M. Short Express humanization of antibodies
EP2683736B1 (en) 2011-03-09 2018-01-17 Cell Signaling Technology, Inc. Methods and reagents for creating monoclonal antibodies
CN104023743B (zh) 2011-10-25 2017-05-03 普罗西纳治疗有限公司 抗体制剂和方法
WO2013175276A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 Argen-X B.V Il-6 binding molecules
CN103772503B (zh) * 2012-10-22 2017-05-10 泉盛生物科技股份有限公司 介白素‑6抗体及其用途
EP2911693A4 (en) * 2012-10-25 2016-04-27 Medimmune Llc STABLE, LOW-VISIC ANTIBODY FORMULATION
JP6442404B2 (ja) 2013-06-11 2018-12-19 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 再発寛解型多発性硬化症（ｒｒｍｓ）患者の治療予後予測方法、及び新規治療適応判断方法
WO2015054427A1 (en) * 2013-10-10 2015-04-16 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Tm4sf1 binding proteins and methods of using same
US8916341B1 (en) * 2013-11-04 2014-12-23 Allied Innovative Systems, Llc Methods for improving analyte detection using photochemical reactions
RU2550262C1 (ru) * 2014-02-28 2015-05-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства Моноклональное антитело против интерлейкина-6 человека и гибридома, продуцирующая данное моноклональное антитело
TWI713453B (zh) 2014-06-23 2020-12-21 美商健生生物科技公司 干擾素α及ω抗體拮抗劑
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
AU2014403312A1 (en) * 2014-08-04 2017-02-16 Fabrizio De Silvestri Use in single pill/tablet/capsule of minocycline, fluconazole and atorvastatin in the treatment of multiple sclerosis
WO2016061562A2 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Kodiak Sciences Inc. Butyrylcholinesterase zwitterionic polymer conjugates
IL308212A (en) 2015-01-20 2024-01-01 Igm Biosciences Inc Tumor necrosis factor-α receptor binding molecules and their uses
BR112017014067B1 (pt) 2015-02-27 2021-01-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha usos de um anticorpo receptor de il-6 para no tratamento de doenças relacionadas a il-6
JP6875683B2 (ja) 2015-05-19 2021-05-26 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 多発性硬化症（ｍｓ）患者の新規治療適用判断方法
EP3329018B1 (en) 2015-07-31 2021-03-31 Medimmune Limited Il-6 antagonists for use in treating hepcidin-mediated disorders
KR20180050321A (ko) 2015-08-07 2018-05-14 이미지냅 인코포레이티드 분자를 표적화하기 위한 항원 결합 구조체
AU2016381964B2 (en) 2015-12-30 2024-02-15 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof
WO2017177032A2 (en) * 2016-04-07 2017-10-12 Janssen Biotech, Inc. Treatment of depression using agents that block binding of il-6 to il-6 receptor
EP3576790A4 (en) 2017-02-01 2020-12-23 Yale University TREATMENT OF DIURETIC RESISTANCE
WO2018182511A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 National University Of Singapore Stimulatory cell lines for ex vivo expansion and activation of natural killer cells
WO2018203545A1 (ja) 2017-05-02 2018-11-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法
EP3698808A4 (en) 2017-10-20 2021-07-14 Hyogo College Of Medicine MEDICAL COMPOSITION CONTAINING ANTI-IL-6 RECEPTOR ANTIBODIES FOR THE PREVENTION OF POSTOPERATIVE ADHESION
CA3087699A1 (en) 2018-01-05 2019-07-11 Corvidia Therapeutics, Inc. Methods for treating il-6 mediated inflammation without immunosuppression
AU2019227997A1 (en) * 2018-03-02 2020-09-24 Kodiak Sciences Inc. IL-6 antibodies and fusion constructs and conjugates thereof
CN108588030B (zh) * 2018-03-30 2020-07-14 四川迈克生物新材料技术有限公司 抗人IgM单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用
CA3093518A1 (en) * 2018-04-02 2019-10-10 National University Of Singapore Neutralization of human cytokines with membrane-bound anti-cytokine non-signaling binders expressed in immune cells
EP3817772A4 (en) * 2018-06-08 2022-03-16 Imaginab, Inc. BINDING CONSTRUCTS OF ANTIGEN TO CD4
WO2020178193A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method of treatment of sarcoidosis
CN109946129A (zh) * 2019-03-12 2019-06-28 江苏中济万泰生物医药有限公司 五分类血细胞分析仪用质控品制备方法
JP2022531331A (ja) 2019-05-01 2022-07-06 ノヴォ ノルディスク アー／エス 抗ｉｌ－６抗体製剤
EP3986481A2 (en) 2019-06-20 2022-04-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method of treatment with viral-based gene therapy
WO2021072265A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
WO2021119669A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 Loma Linda University Pathology Medical Group, Inc. Methods and compositions for treatment of acute myeloid leukemia
US20220017614A1 (en) * 2020-03-31 2022-01-20 Janssen Biotech, Inc. Anti-IL6 Agent for Treating Coronavirus Infection
WO2021236840A1 (en) * 2020-05-20 2021-11-25 The Regents Of The University Of California Rapid index for sab mortality kinetics ("risk") test
RU2745814C1 (ru) * 2020-06-05 2021-04-01 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Водная фармацевтическая композиция левилимаба и ее применение
WO2022005321A1 (en) * 2020-06-29 2022-01-06 Federal State Budgetary Institution Scientific center of biomedical technologies of Federal Medical and Biological Agency Inhaled tocilizumab for treating interleukin-6 related respiratory diseases
CN113409232B (zh) * 2021-06-16 2023-11-10 吉林大学 基于响尾蛇视觉成像的仿生假彩色图像融合模型及方法
CN113552116B (zh) * 2021-07-14 2023-08-18 四川农业大学 基于Ag@UiO-66-NH2/CsPbBr3的电致化学发光分子印迹传感器及应用

Family Cites Families (192)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4309989A (en) 1976-02-09 1982-01-12 The Curators Of The University Of Missouri Topical application of medication by ultrasound with coupling agent
FR2374910A1 (fr) 1976-10-23 1978-07-21 Choay Sa Preparation a base d'heparine, comprenant des liposomes, procede pour l'obtenir et medicaments contenant de telles preparations
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US5326859A (en) 1979-10-30 1994-07-05 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research DNA and recombinant plasmid
IL58765A (en) 1979-11-21 1986-09-30 Yeda Res & Dev Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta
US5554513A (en) 1979-11-21 1996-09-10 Yeda Research & Development Co. Ltd. Production of recombinant human interferon-beta2
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
GB2097032B (en) 1981-04-22 1984-09-19 Teron International Urban Dev A combined ceiling air and services distribution system mechanical chasse and structural roof member
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US5001116A (en) 1982-12-20 1991-03-19 The Children's Medical Center Corporation Inhibition of angiogenesis
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4818542A (en) 1983-11-14 1989-04-04 The University Of Kentucky Research Foundation Porous microspheres for drug delivery and methods for making same
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DE3590766C2 (pt) 1985-03-30 1991-01-10 Marc Genf/Geneve Ch Ballivet
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
SE448277B (sv) 1985-04-12 1987-02-09 Draco Ab Indikeringsanordning vid en doseringsanordning for lekemedel
US4766067A (en) 1985-05-31 1988-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene amplification
US4870163A (en) 1985-08-29 1989-09-26 New York Blood Center, Inc. Preparation of pure human tumor necrosis factor and hybridomas producing monoclonal antibodies to human tumor necrosis factor
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
SE453566B (sv) 1986-03-07 1988-02-15 Draco Ab Anordning vid pulverinhalatorer
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
EP0545913B1 (en) 1986-08-18 1999-02-24 Emisphere Technologies, Inc. Delivery systems for pharmacological agents
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
DE3631229A1 (de) 1986-09-13 1988-03-24 Basf Ag Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendung
US4921794A (en) 1987-01-14 1990-05-01 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US4795699A (en) 1987-01-14 1989-01-03 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
EP0288088B1 (en) 1987-04-24 1994-03-09 Teijin Limited Detection of tumor necrosis factor; monoclonal antibody and kit
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US4939666A (en) 1987-09-02 1990-07-03 Genex Corporation Incremental macromolecule construction methods
IL88375A (en) 1988-11-14 1995-07-31 Yeda Res & Dev Monoclonal antibodies that specifically bind interferon-bia 2 natural and recombinant and a natural and recombinant interferon-beta 2 purification method and method
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5142033A (en) 1988-09-23 1992-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Structure-independent DNA amplification by the polymerase chain reaction
US5091310A (en) 1988-09-23 1992-02-25 Cetus Corporation Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction
US5066584A (en) 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US6682896B1 (en) 1988-10-14 2004-01-27 Schering Aktiengesellschaft Peptides representing epitopic sites on r-IFN-β, antibodies thereto and uses thereof
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4994370A (en) 1989-01-03 1991-02-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA amplification technique
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5266491A (en) 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
DE3909708A1 (de) 1989-03-23 1990-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung bispezifischer antikoerper
AU652539B2 (en) 1989-05-16 1994-09-01 Medical Research Council Co-expression of heteromeric receptors
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
EP0399429A1 (en) 1989-05-22 1990-11-28 Toray Industries, Inc. Anti-human interleukin-6 monoclonal antibody
DK0479909T3 (da) 1989-06-29 1997-04-07 Medarex Inc Bispecifikke reagenser til AIDS-behandling
JP3443119B2 (ja) 1989-08-07 2003-09-02 ペプテック リミテッド 腫瘍壊死因子結合リガンド
DK0494955T3 (da) 1989-10-05 1998-10-26 Optein Inc Cellefri syntese og isolering af hidtil ukendte gener og polypeptider
WO1991008774A1 (en) 1989-12-15 1991-06-27 Cetus Corporation Cytokine antibody for the treatment of sepsis
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5942220A (en) 1990-03-16 1999-08-24 Chiron Corporation Inhibitor of cytokine activity and applications thereof
US5210075A (en) 1990-02-16 1993-05-11 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Interleukin 6 antagonist peptides
TW212184B (pt) 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
ATE160818T1 (de) 1990-06-01 1997-12-15 Chiron Corp Zusammensetzungen und verfahren zur identifizierung von molekülen mit biologischer wirksamkeit
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
WO1992000373A1 (en) 1990-06-29 1992-01-09 Biosource Genetics Corporation Melanin production by transformed microorganisms
US5580734A (en) 1990-07-13 1996-12-03 Transkaryotic Therapies, Inc. Method of producing a physical map contigous DNA sequences
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992005258A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 La Trobe University Gene encoding barley enzyme
GB9022648D0 (en) 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
DE69128253T2 (de) 1990-10-29 1998-06-18 Chiron Corp Bispezifische antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendungen
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
IE920562A1 (en) 1991-02-21 1992-08-26 Gilead Sciences Aptamer specific for biomolecules and method of making
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
SG89295A1 (en) 1991-03-15 2002-06-18 Amgen Inc Pegylation of polypeptides
RU2139351C1 (ru) 1991-04-25 1999-10-10 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Н- и l-цепи моноклонального антитела рм1 (монат) к рецептору il-6r человека и их v-области, модифицированная монат, его н- и l-цепи и их v-области, cdr- последовательности, днк-последовательности
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
JP3230056B2 (ja) 1991-07-02 2001-11-19 インヘイル・インコーポレーテッド 薬剤のエーロゾル化服用量を形成する装置
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US5766886A (en) 1991-12-13 1998-06-16 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
DE4207475A1 (de) 1992-03-10 1993-09-16 Goldwell Ag Mittel zum blondieren von menschlichen haaren und verfahren zu dessen herstellung
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
JPH05304986A (ja) 1992-04-28 1993-11-19 Tosoh Corp ｇｐ１３０蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体
AU4829593A (en) 1992-09-23 1994-04-12 Fisons Plc Inhalation device
AU5322494A (en) 1992-10-02 1994-04-26 Trustees Of Dartmouth College Bispecific reagents for redirected targeting of low density lipoprotein
SK279327B6 (sk) 1992-10-19 1998-10-07 Dura Pharmaceuticals Zariadenie na vytváranie aerosolu z práškového lie
CA2147466A1 (en) 1992-10-20 1994-04-28 Just P. J. Brakenhoff Interleukin-6 receptor antagonists
US5643252A (en) 1992-10-28 1997-07-01 Venisect, Inc. Laser perforator
WO1994012520A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US5849695A (en) 1993-01-13 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals
EP0680451B1 (en) 1993-01-19 1998-11-04 Glaxo Group Limited Aerosol dispenser and method of manufacture
CN1119876A (zh) 1993-02-12 1996-04-03 莱兰斯坦福初级大学评议会 被调节的靶向基因转录及其他生物学过程
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
US5770428A (en) 1993-02-17 1998-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site
US5888511A (en) 1993-02-26 1999-03-30 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Treatment of autoimmune diseases, including AIDS
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
TW458985B (en) 1993-05-31 2001-10-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Reconstructed human antibody against human interleukin-6
US5789552A (en) 1993-06-23 1998-08-04 Istituto Di Ricerche Di Biologica Molecolare P. Angeletti S.P.A. Interleukin-6 receptor antagonists
NZ511762A (en) 1993-07-19 2003-09-26 Univ British Columbia Anti-angiogenic compositions and methods of use
US5888510A (en) 1993-07-21 1999-03-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
FR2707882B1 (fr) 1993-07-23 1997-08-01 Immunotech Sa Nouveaux kits thérapeutiques anti-médiateurs protéiques, procédé de préparation et compositions pharmaceutiques les renfermant.
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
DE4337197C1 (de) 1993-10-30 1994-08-25 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur selektiven Herstellung von Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper mit hoher Zytotoxizität gegen humanes CD16-Antigen produzieren, sowie Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung derartiger monoklonaler Antikörper und des CD30-HRS-3-Antikörpers zur Therapie menschlicher Tumore
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
AU692239B2 (en) 1994-03-07 1998-06-04 Medarex, Inc. Bispecific molecules having clinical utilities
US5641657A (en) 1994-05-19 1997-06-24 Human Genome Sciences, Inc. DNA encoding an interleukin-6 splice variant
US8017121B2 (en) 1994-06-30 2011-09-13 Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
US5738931A (en) 1994-09-16 1998-04-14 Kabushiki Kaisha Toshiba Electronic device and magnetic device
DK0783893T3 (da) * 1994-10-07 2012-05-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Inhibering af unormal vækst af synovial-celler under anvendelse af il-6-antagonist som aktiv bestanddel
US5763733A (en) 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
IT1274782B (it) 1994-12-14 1997-07-24 Angeletti P Ist Richerche Bio Metodo per selezionare superagonisti, antagonisti e superantagonisti di ormoni del cui complesso recettoriale fa parte gp 130
US5549551A (en) 1994-12-22 1996-08-27 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Adjustable length balloon catheter
JP4079461B2 (ja) 1994-12-29 2008-04-23 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６アンタゴニストを含んでなる抗腫瘍剤の作用増強剤
ES2264135T3 (es) 1995-02-13 2006-12-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Inhibidor de la descomposicion de proteinas musculares que contienen anticuerpos frente al receptor de il-6.
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6037453A (en) 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
IT1276555B1 (it) 1995-04-28 1997-11-03 Angeletti P Ist Richerche Bio Antagonisti di interluchina-6 umana del tutto incapaci di formare un legame con gp 130, e loro uso per la preparazione di composizioni
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5871723A (en) 1995-06-06 1999-02-16 The Regent Of The University Of Michigan CXC chemokines as regulators of angiogenesis
GB9526100D0 (en) 1995-12-20 1996-02-21 Intersurgical Ltd Nebulizer
EA001237B1 (ru) 1996-01-03 2000-12-25 Глаксо Груп Лимитед Ингаляционное устройство
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
DE19624387C2 (de) 1996-06-19 1999-08-19 Hatz Motoren Kaltstartvorrichtung
US5854398A (en) 1996-07-25 1998-12-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) interleukin 6 (IL-6) and uses thereof
US6461604B1 (en) 1996-08-16 2002-10-08 Genetics Institute, Llc Crystalline IL-6 and models of the molecular structure of IL-6
ES2169299T3 (es) 1996-09-03 2002-07-01 Gsf Forschungszentrum Umwelt Procedimiento para la destruccion de celulas tumorales contaminantes en transplantes de celulas madre utilizando anticuerpos especificos.
ATE387495T1 (de) 1996-12-03 2008-03-15 Amgen Fremont Inc Vollkommen humane antikörper die egfr binden
US5879681A (en) 1997-02-07 1999-03-09 Emisphere Technolgies Inc. Compounds and compositions for delivering active agents
US5921447A (en) 1997-02-13 1999-07-13 Glaxo Wellcome Inc. Flow-through metered aerosol dispensing apparatus and method of use thereof
DE69839992D1 (de) * 1997-03-21 2008-10-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Vorbeugende- oder Heilmittel zur Behandlung von Multipler Sklerose, mit antagonistischen anti-IL6-Rezeptor Antikörpern als Wirkstoff
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
IL120943A (en) 1997-05-29 2004-03-28 Univ Ben Gurion A system for administering drugs through the skin
EP1019023B1 (en) 1997-09-29 2003-05-07 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Stabilized preparations for use in nebulizers
WO1999054342A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
US6309663B1 (en) 1999-08-17 2001-10-30 Lipocine Inc. Triglyceride-free compositions and methods for enhanced absorption of hydrophilic therapeutic agents
US6482411B1 (en) 1999-08-27 2002-11-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of reducing bone loss with CD40 ligand
GB0001448D0 (en) * 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
NZ520392A (en) 2000-02-10 2005-04-29 Abbott Lab Antibodies that bind human interleukin-18 and methods of making and using
ES2644275T3 (es) 2000-08-11 2017-11-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preparaciones estabilizadas que contienen anticuerpos
EP1334731B1 (en) 2000-10-25 2008-02-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventives or remedies for psoriasis containing as the active ingredient il-6 antagonist
ITPD20010108A1 (it) 2001-05-08 2002-11-08 Fidia Advanced Biopolymers Srl Biomateriali polimerici elettricamente conduttori, loro processo di preparazione ed impiego nel settore biomedico sanitario.
AU2002339845B2 (en) 2001-08-03 2009-03-26 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
DE10146643C1 (de) 2001-09-21 2003-08-14 Eads Deutschland Gmbh Verfahren zur Kalibrierung der Radarsignale an den Subaperturen der Antenne eines zweikanaligen SAR/MTI Radarsystems
KR20100120246A (ko) * 2001-11-14 2010-11-12 센토코 오르토 바이오테크 인코포레이티드 항 ｉｌ-6 항체, 조성물, 방법 및 용도
WO2003083061A2 (en) 2002-03-26 2003-10-09 Centocor, Inc. Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
US7371383B2 (en) 2002-04-12 2008-05-13 Medimmune, Inc. Recombinant anti-interleukin-9 antibodies
US7482436B2 (en) * 2002-08-30 2009-01-27 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Human antihuman interleukin-6 antibody and fragment of antibody
GB2401040A (en) 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
US20050033029A1 (en) 2003-06-30 2005-02-10 Jin Lu Engineered anti-target immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
EP1673396A1 (en) 2003-09-22 2006-06-28 BioVation GmbH & Co.KG. Use of antibodies for reducing the biological effectiveness of il-6
PE20061324A1 (es) * 2005-04-29 2007-01-15 Centocor Inc Anticuerpos anti-il-6, composiciones, metodos y usos
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
RU2013126477A (ru) 2010-11-08 2014-12-20 Дженентек, Инк. Вводимые подкожно антитела против рецептора il-6
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Also Published As

Publication number Publication date
HK1208035A1 (en) 2016-02-19
EA200702374A1 (ru) 2008-10-30
US9340613B2 (en) 2016-05-17
PE20061324A1 (es) 2007-01-15
ECSP077888A (es) 2008-03-26
HRP20150740T1 (hr) 2015-08-14
PT1874351E (pt) 2015-06-16
EP2842968B1 (en) 2018-05-23
US20160222104A1 (en) 2016-08-04
US20170253651A1 (en) 2017-09-07
CN102924596A (zh) 2013-02-13
EP1874351A4 (en) 2010-07-28
US8226611B2 (en) 2012-07-24
US7833755B2 (en) 2010-11-16
RS57474B1 (sr) 2018-09-28
AU2006242347B2 (en) 2012-07-12
HRP20181218T1 (hr) 2018-10-05
JP2008538931A (ja) 2008-11-13
SI2842968T1 (sl) 2018-10-30
CN101415819A (zh) 2009-04-22
CA2606348A1 (en) 2006-11-09
WO2006119115A2 (en) 2006-11-09
HUE025376T2 (en) 2016-02-29
NO20076024L (no) 2008-01-18
NZ562771A (en) 2011-03-31
JP2011201888A (ja) 2011-10-13
US20120045453A1 (en) 2012-02-23
CR9551A (es) 2009-07-30
DK1874351T3 (en) 2015-04-20
TW200716173A (en) 2007-05-01
JP5940565B2 (ja) 2016-06-29
NZ589820A (en) 2012-04-27
EP1874351A2 (en) 2008-01-09
US8623362B2 (en) 2014-01-07
US9631016B2 (en) 2017-04-25
IL186965A0 (en) 2008-02-09
ES2551985T3 (es) 2015-11-24
US20220048985A1 (en) 2022-02-17
US20140099311A1 (en) 2014-04-10
CN102924596B (zh) 2016-01-20
HN2006016512A (es) 2010-06-08
EP1874351B1 (en) 2015-04-08
EA015262B1 (ru) 2011-06-30
US20060257407A1 (en) 2006-11-16
HUE039116T2 (hu) 2018-12-28
HK1116398A1 (en) 2008-12-24
US20130017208A1 (en) 2013-01-17
US11180549B2 (en) 2021-11-23
WO2006119115A3 (en) 2008-01-03
USRE43672E1 (en) 2012-09-18
AU2006242347A1 (en) 2006-11-09
RS54133B1 (en) 2015-12-31
EP3421492A1 (en) 2019-01-02
US20200115445A1 (en) 2020-04-16
LT2842968T (lt) 2018-09-25
US8067003B2 (en) 2011-11-29
TWI445546B (zh) 2014-07-21
PT2842968T (pt) 2018-09-28
CN101415819B (zh) 2012-10-10
JP2014080427A (ja) 2014-05-08
CY1120739T1 (el) 2019-12-11
JP5898413B2 (ja) 2016-04-06
US20110081355A1 (en) 2011-04-07
IL211133A (en) 2015-03-31
US20090239258A1 (en) 2009-09-24
JP4763043B2 (ja) 2011-08-31
SV2006002513A (es) 2008-12-05
CA2606348C (en) 2012-12-11
KR20080017014A (ko) 2008-02-25
AR053370A1 (es) 2007-05-02
IL211132A0 (en) 2011-04-28
ES2676732T3 (es) 2018-07-24
SI1874351T1 (sl) 2015-10-30
PL2842968T3 (pl) 2019-05-31
JP2016117769A (ja) 2016-06-30
NI200700278A (es) 2013-01-29
MY143374A (en) 2011-04-29
EP2842968A1 (en) 2015-03-04
ME02185B (me) 2016-02-20
JO3058B1 (ar) 2017-03-15
DK2842968T3 (en) 2018-08-06
NO342898B1 (no) 2018-08-27
PA8672101A1 (es) 2006-12-07
KR101340950B1 (ko) 2013-12-31
IL211133A0 (en) 2011-04-28
PL1874351T3 (pl) 2015-10-30
US7560112B2 (en) 2009-07-14
BRPI0609869B1 (pt) 2021-08-24
MY142835A (en) 2011-01-14
NZ598657A (en) 2013-06-28
TR201809676T4 (tr) 2018-07-23
ZA200710264B (en) 2010-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11180549B2 (en) Methods of suppressing rheumatoid arthritis using an anti-IL-6 antibody
AU2012238199A1 (en) Anti-IL-6 antibodies, compositions, methods and uses
BRPI0612728B1 (pt) Anticorpos de il-23p19 isolados

Legal Events

Date Code Title Description
B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: APPLIED MOLECULAR EVOLUTION, INC. (US) , JOHNSON A

Free format text: TRANSFERIDO DE: CENTOCOR, INC.

B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B06H Technical and formal requirements: requirement cancelled [chapter 6.8 patent gazette]

Free format text: REF. A RPI NO 2150 DE 20/03/2012. ANULACAO DA EXIGENCIA 6.6 POR TER SIDO INDEVIDA. REQUERENTE NAO APRESENTOU RESPOSTA A EXIGENCIA CONFORME DISPOE A RESOLUCAO 207 DE 24/04/2009, ENTRETANTO, A RESPOSTA CONSTA NO FORMULARIO DE DEPOSITO.

B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 28/04/2006, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.